KR20060111536A - 생물학적 활성 메틸렌 블루 유도체(２)의 개발 - Google Patents

생물학적 활성 메틸렌 블루 유도체(２)의 개발 Download PDF

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KR20060111536A
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카산드라 클레어 오'그라디
존 그리피스
커스트 조안 멜리쉬
리차드 조지 툰스탈
데이비드 존 하워드 로버츠
데이비드 이안 베르논
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Abstract

본 발명은 미생물 감염 예방을 위한 항미생물제로서 사용되는 R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 임의로 치환된 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 그룹이거나, R1 및 R2 또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하고; XP -는 카운터음이온이고; P는 1, 2, 또는 3인 화학식(I)의 페노티아지늄 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 페노티아지늄 화합물을 포함하는 조성물, 선택된 화합물 및 약제로서, PDT제로서, 광진단제로서의 이의 용도, 페노티아지늄 화합물 및 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물, 빛을 조명하면서 유체를 컨쥬게이트 또는 복합물상에 통과시키는, 유체를 멸균시키는 방법에 관한 것이다. 화합물은 광세포독성이 강하고 광역학 요법(PDT)의 영역에서, 의학적 이상의 진단 및 검출을 위해, 광화학 내재화에서의 관련된 용도로, 암 백신의 생산에서, 미생물 감염의 치료 및 예방에서, 및 광소독 또는 광멸균에서 적용을 갖는, 생물학적으로 활성인 감광제이다.

Description

생물학적 활성 메틸렌 블루 유도체(２)의 개발{DEVELOPMENTS IN BIOLOGICALLY ACTIVE METHYLENE BLUE DERIVATIVES(２)}
본 발명은 광세포독성이 강하고 광역학 요법(photodynamic therapy(PDT)) 영역에서 적용되는 생물학적으로 활성인 감광제, 이의 조성물, 특히 암 치료 및 미생물 감염의 치료 및 예방에서 약제로서의 이의 용도, 의학적 질환의 진단 및 검출에서의 용도 및 광화학 내재화, 암 백신의 생산 및 광소독 또는 광멸균에서의 관련된 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 광소독 또는 광멸균에 사용할 수 있는 감광제의 컨쥬게이트 및 복합물(composite)에 관한 것이다.
특정 유기 화합물("감광제")은 산소의 존재하에서 빛 흡수에 의해 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 세포독성 효과로서 I형 및/또는 II형 광산화를 포함한다. 상기 감광제는 빛을 사용한 암 및 다른 질환 또는 감염의 치료(광역학 요법) 및 미생물의 광-유도성 파괴에 의한 표면 및 유체의 멸균(소독 포함)에서 사용된다. 이와 관련하여, 용어 멸균은 특정 상황하에서 미생물을 감소시키거나 제거시키는 것을 의미한다.
특정의 착색된 페노티아지늄 화합물(예: 메틸렌 블루)은 I형 및/또는 II형 광산화 공정에 관여할 수 있지만, 이러한 타입의 화합물은 광역학 요법에 대한 감작제로서는 부적절하거나 감작제로서는 효능이 낮다고 입증되었거나, 낮은 광화학 항미생물 활성을 나타내거나, Ames 양성이기 때문에 사용시 잠재적인 문제점을 갖는다.
PDT에 적용하기 위한 우수한 감작제는 하기 성질중 적어도 일부 및 바람직하게는 모두를 가져야 한다:
· 빛(바람직하게는, 파장 약 600-800nm) 노출시 표적 세포(예를 들면, 종양 세포 또는 세균 세포)를 효율적으로 파괴시켜야 한다;
· 표적 및 정상 조직 사이에 고도의 특이성을 나타내어야 한다;
· 상대적으로 암(dark) 독성을 거의 나타내지 않아야 한다;
· 환자에서 피부 감광성을 거의 유발하지 않거나 전혀 유발시키지 않아야 한다;
· 환자 및 병원의 편의를 위함과 동시에 치료 비용을 최소화하기 위하여 단기간의 약물 대 광 시간 간격(drug to light intervals)을 가져야 한다;
· 생체내 사용에 적절하여야 하고, 특히, 돌연변이유발성은 아니어야 한다;
· 광멸균에 적용하기 위한, 우수한 감작제는 이상적으로 주변광을 사용하여 광범위한 미생물에서 강력한 광독성 효능을 나타내어야 하고, 쉽게 광표백되어서는 안된다.
암연구에서는 수개의 상이한 타입의 감광제를 사용하여 중공기관, 예로서 식도 및 담낭의 고형 종양 및 얇은(thin) 종양을 치료해 왔다. 그러나, 부분적으로 는 종양 및 건강한 조직 사이의 특이성이 부족하고, 부분적으로는 피부 감광성이 지속되기 때문에 상기 감광제의 사용이 제한되어 왔다. 피부 감광성을 거의 유발하지 않거나 전혀 유발하지 않고 종양 세포를 특이적으로 파괴시키는 신규한 감광제가 필요시 되고 있다.
종래에는 종양 치료에 PDT가 사용되었지만, 세균 및 다른 미생물에 의해 유발된 감염에 대해서는 임상적으로 사용된 바 없었다. 통상 사용되는 항생제, 예로서 테트라사이클린 및 베타-락탐에 대한 다수의 세균 종의 내성 증가에 기인하여 세균 감염을 치료하기 위한 항생제의 사용에 대해 이의가 제기되고 있다. 항생제 내성의 병원감염, 예로서 MRSA는 특히 문제시되고 있다. 광역학적 항균 치료법이 국소 치료용 항생제에 대한 전도유망한 대체요법이다.
항균제 개발시 극복해야 할 주요 문제점은 세균 세포내로의 약물 흡수이다. 그램 음성 및 그램 양성 세균은 이의 외피 조성이 상이하고, 항미생물제에 대하여, 특히 흡수와 관련하여 상이하게 반응한다. 고도의 음전하로 대전된 그램 음성 세균 표면 때문에 가장 보편적으로 사용되는 감광제를 포함하는 중성 또는 음이온성 약물에 대해서는 상대적으로 불투과성이다. 그램 음성 세균 뿐만 아니라 그램 양성 세균에 대해 유효한 항미생물 감광제의 개발은 내성으로 인해 유효성이 점차 감소되고 있는 통상적으로 사용되는 항생제 및 약물을 대체시키는데 매우 유익할 것이다.
세균에서 다수의 상이한 타입의 감광제가 연구되었다. 이들은 페노티아지늄 화합물, 프탈로시아닌, 클로린 및 자연발생된 감광제를 포함한다. 그램 음성 세균 내로의 흡수를 위해 양이온성 유도체가 가장 효능이 있다고 인정받게 되었다.
페노티아지늄 화합물은 최대 흡수 파장이 600 내지 700nm 사이인 청색 염료이다. 비광역학적 항균 성질에 대하여 연구되었지만, 메틸렌 블루 및 톨루이딘 블루와는 별개로 거의 광역학적으로 연구된 바 없었다.
웨인라이트 등(Wainwright et al 1998)은 종양 세포주 및 세균에서 일련의 페노티아지늄 메틸렌 블루 유도체의 효능에 대하여 연구하였다. 신규한 메틸렌 블루(NMB) 및 디메틸 메틸렌 블루(DMMB)는 MRSA를 불활성화시키는데 효능이 있었고, 색소흑색종 세포주에 대하여 작용할 경우 메틸렌 블루보다는 더욱 효능 있는 감광제인 것으로 나타났다. 와그너 등(Wagner et al 1998)은 외피보유 바이러스의 불활성화에 대하여 상기 염료 및 추가의 소수성 유도체를 연구하였다.
메틸렌 블루의 정확한 항균 작용 모드는 공지되어 있지 않지만, 이의 입체화학성에 의해 DNA내로 내재될 수 있다는 가설, 및 광역학 작용이 DNA를 손상시킬 수 있다는 가설이 존재한다. 메틸렌 블루 그 자체는 항종양제로서는 효능이 없는 것으로 나타났다. 추가로, 메틸렌 블루는 광표백되기 쉽고, 이는 일부 적용에서 심각한 단점이 될 수 있다고 공지되어 있다. 메틸렌 블루의 한계가 인정되었기 때문에 항종양성 PDT 및 항미생물 PDT 둘 모두는 신규한 페노티아지늄-기초 감광제의 개발로부터 이익을 얻게 될 것이다.
PCT 출원 PCT/GB02/02278에는 생물학적으로 활성인 특정의 페노티아지늄 화합물이 기술되어 있고, 일련의 N,N,N,N 테트라 n-C1 -6 알킬 유도체에서 테트라 n-부 틸 유도체는 쇄중 탄소의 갯수가 증가함에 따라 신속하게 활성이 감소하는 바 가장 활성인 것으로 제시되었다.
현재 놀랍게도, 생물학적으로 활성이고 특히, 미생물 감염 예방 및 암 및 미생물 감염 치료에서 약제로서 사용하기에 적절한 추가의 페노티아지늄 화합물 유도체가 발견되었다.
본 발명에 따라, 미생물 감염 예방을 위한 항미생물제로서 사용되는 하기 화학식(I)의 페노티아지늄 화합물을 제공한다:
Figure 112006037310880-PCT00001
상기 식에서,
R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 임의로 치환된 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 그룹이거나, R1 및 R2 또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하고;
XP -는 카운터음이온이고;
P는 1, 2, 또는 3이다.
상처 감염을 예방하기 위하여 상처 부위를 멸균시키고, 본 명세서에서 멸균은 유효한 상처 치유를 증진시키는데 도움이 되거나 상처 감염이 발생될 수 있는 기회를 최소화시키는 것으로 상처 부위상에, 상처 부위내 또는 상처 부위 주변의 세균 부하를 현저히 감소시키는 것을 의미한다.
감염 예방을 위한 화학식(I)의 화합물의 사용은 바람직하게는 화합물을 상처 부위에 적용시킨 후 빛을 적용시키는 PDT에 의한 것이다. 통상의 항미생물제는 감염 예방을 위해서는 수명이 짧고 이의 효능을 유지시키기 위해서는 스왑과 같은 반복적인 적용을 필요로 한다는 난점을 갖고 있다. 화학식(I)의 화합물은 예방 효과가 화합물을 재투여할 필요없이 추가로 빛을 적용시킴으로써 필요에 따라 재활성화될 수 있고 연장되기 때문에 종래의 공지되어 있고 사용되어 왔던 항미생물제보다 개선된 성질을 갖는다. 적절한 파장의 빛에 연속적으로 노출시키거나 필요한 때 적절한 파장의 빛을 간헐적으로 사용하여 상처 부위를 멸균 상태로 유지시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 특징에 따라, 항바이러스제로서 사용되는, 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 임의로 치환된 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 그룹이거나, R1 및 R2 또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하고; XP -는 카운터음이온이고; P는 1, 2, 또는 3인 화학식(II)의 페노티아지늄 화합물을 제공한다.
미생물 감염을 예방하고 항바이러스제로서 사용하기 위하여 R1, R2, R3 및 R4로서 나타낸 선형 및 분지쇄 탄화수소 그룹은 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유한다. R1, R2, R3 및 R4로서 나타낸 탄화수소 그룹이 동일한 화합물에서는 각각이 선형 또는 분지형이고 4 또는 5개의 탄소 원자를 함유하는 것이 바람직하다. R1=R2 및 R3=R4이고 R1/R2는 R3/R4과 상이한 화합물에서는 각각이 선형 또는 분지형이고 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 것이 바람직하고, 추가로, R1, R2, R3 및 R4의 탄소 원자의 총 갯수는 8 내지 18개인 것이 바람직하다.
본 발명의 추가의 특징에 따라, 미생물 감염 치료에서 항미생물제로서 사용되는, 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7 -12-알킬이다);
ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있으며, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않다);
iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1 -12-알킬로부터 선택되고 R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하는 화학식(III)의 페노티아지늄 화합물을 제공한다.
본 발명의 추가의 특징에 따라, 약제로서 사용되거나 항암제로서 사용되는, 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7-12-알킬이다);
ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않으며, R1 및 R2가 둘 모두 HO(CH2)2-이고, R3 및 R4가 둘 모두 n-부틸 또는 n-펜틸인 화합물은 제외된다);
iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-12-알킬로부터 선택되고, R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하며(여기서, R1 및 R2가 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 모르폴리노 환을 형성하고 R3 및 R4가 둘 모두 n-부틸인 화합물은 제외된다);
XP -는 카운터음이온이고;
P는 1, 2, 또는 3인 화학식(IV)의 페노티아지늄 화합물을 제공한다.
본 발명의 추가의 특징에 따라, 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7-12-알킬이다);
ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않으며, R1 및 R2가 둘 모두 HO(CH2)2-이고, R3 및 R4가 둘 모두 n-부틸 또는 n-펜틸인 화합물은 제외된다);
iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1-12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1-12-알킬로부터 선택되고, R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하며(여기서, R1 및 R2가 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 모르폴리노 환을 형성하고 R3 및 R4 둘 모두가 n-부틸인 화합물은 제외된다);
XP -는 카운터음이온이고;
P는 1, 2, 또는 3인 화학식(V)의 페노티아지늄 화합물을 제공한다.
일반적으로 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나에서 R1, R2, R3 및 R4로 나타낸 선형 및 분지쇄 탄화수소 그룹은 하나 이상의 불포화 링크, 예를 들면, 하나 이상의 알켄 그룹을 포함하고, H, F, Cl, Br, I, -OH, -OC1 -6-알킬, -CN, -OCOC1-6-알킬 또는 아릴, 예로서 페닐로부터 선택되는 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다. 상기 선형 및 분지쇄 탄화수소 그룹은 바람직하게는 치환되지 않고 바람직하게는 포화된 탄화수소 그룹이다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나에서 R1, R2, R3 및 R4로 나타낸 사이클릭 탄화수소 그룹은 3 내지 8개의 탄소 원자, 바람직하게는 4 내지 6개의 탄소 원자 및 더욱 바람직하게는 6개의 탄소 원자를 함유한다. 상기 사이클릭 탄화수소 그룹은 하나 이상의 불포화 링크를 포함할 수 있고, 임의로 치환될 수 있고 임의로 헤테로원자, 예로서 질소를 포함할 수 있다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나에서 R1 및 R2 및/또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께, 다른 헤테로원자를 포함할 수 있고 임의로 치환될 수 있는 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 헤테로원자는 바람직하게는 N, O 또는 S로부터 선택된다. 헤테로원자가 S일 때, O로 치환될 수 있고, 헤테로원자가 N일 때, H, -CO C1 -6-알킬 또는 -OH로 임의로 치환된 C1 -6-알킬로 치환될 수 있고, 바람직한 치환된 헤테로원자는 SO2, NH, NCH3, NC2H5, NCH2CH2OH 및 NCOCH3으로부터 선택된다. 임의의 환 치환체는 -C1 -6-알킬, -OH, -OC1 -6-알킬, -OC OC1-6-알킬로부터 선택될 수 있다. 예로서 하기를 포함한다:
Figure 112006037310880-PCT00002
상기 식에서, Z는 CH2, CH2-C1 -6-알킬, O, S, SO2, NH, NCH3, NC2H5, NCH2CH20H, 또는 NCOCH3이다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나에서 XP -로 나타낸 카운터음이온은 유기 또는 무기 카운터음이온일 수 있고, 바람직하게는 F-, Br-, Cl-, I-, N03 -, SCN-, Cl03 -, Cl04 -, I03 -, BF4 -, HS04 -, H2P04 -, CH3S04 -, N3 -, SO4 2 -, HPO4 2 -, PO4 3 -, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글리콜레이트, 글리세레이트, 글루타메이트, β-하이드록시글루타메이트, 글루쿠로네이트, 글루코네이트, 말레이트 및 아스파테이트로부터 선택된다. 바람직하게는, 카운터음이온은 Cl-, Br-, I-, F-, N03 -, HS04 -, CH3C02 -, SO4 2 -, HPO4 2 -, PO4 3 -를 포함하는 그룹부터 선택되거나, Cl-, Br-, I-, 아세테이트, 락테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글리콜레이트, 글리세레이트, 글루타메이트, β-하이드록시글루타메이트, 글루쿠로네이트, 글루코네이트, 말레이트, 아스파테이트를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는, Cl-, Br-, I-를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 바람직한 하위 그룹에서 R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고 R1 및 R2로 나타낸 알킬 측쇄에서 탄소 원자의 총 합계는 14 내지 40개, 바람직하게는 16 내지 36개, 및 더욱 바람직하게는 18 내지 30개, 특히 18 내지 24개이다.
추가로, 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 바람직한 하위 그룹에서 R1, R2, R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고 R1 및 R2로 나타낸 알킬 측쇄에서 탄소 원자의 총 합계는 16 내지 20개, 바람직하게는 18 내지 20개이다.
화학식(I) 내지 (V)의 페노티아지늄 화합물은 하기와 같이 합성할 수 있다:
1) R1 및 R2 = R3 및 R4인 대칭형 페노티아지늄 화합물
a) 먼저, 페노티아진을 빙초산중 브롬으로 브롬화하여 3,7-디브로모페노티아진-5-이움 브로마이드를 수득하고, 형성된 현탁액을 여과하여 수거한다.
b) 3,7-디브로모페노티아진-5-이움 브로마이드를 클로로포름중 N-헤테로사이클 또는 R1R2NH(R1 및 R2는 상기 정의된 바와 같다)로 나타낸 아민에 첨가한다. 형성된 고체를 여과하여 수거하고, 예를 들면 클로로포름, 클로로포름/메탄올(98/2) 및 이어서 클로로포름/메탄올(90/10)을 사용하여 실리카겔 60상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피하여 정제한다. 추가로, 페트롤륨 에테르(b.p. 60 내지 80℃)를 사용하여 클로로포름로부터 침전시켜 추가로 산물을 정제시킬 수 있다.
2) R1 및 R2 ≠ R3 및 R4이거나, R1 ≠ R2 및/또는 R3 ≠ R4인 비대칭형 페노티아지늄 화합물
a) 클로로포름중 페노티아진을 5℃ 이하로 냉각시키고 클로로포름중 요오드 용액을 첨가한다. 형성된 고체를 여과하여 수거하고, 요오드가 제거될 때까지 클로로포름으로 세척한 후, 실온에서 진공하에서 밤새도록 유지시켜 페노티아진-5-이움 테트라요오다이드 하이드레이트를 수득한다.
b) 메탄올중 페노티아진-5-이움 테트라요오다이드 하이드레이트를 메탄올중 아민 R1R2NH(R1 및 R2는 상기 정의된 바와 같다) 용액에 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반하고, 증발시켜 감소시키고 방치시켜 냉각시킨다. 형성된 고체를 여과하여 수거하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조시킨다.
c) 디클로로메탄중 트리에틸아민, 이어서 디클로로메탄중 상이한 두번째 아민 R3R4NH(R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같다) 용액을 디클로로메탄중 상기 b)로부터의 고체 용액에 첨가한다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반하고, 유기층을 묽은 염산 및 물로 세척하고 분리시키고 MgS04 상에서 건조시킨다. 대다수의 용매를 증발시키고 디에틸에테르를 첨가하여 산물을 침전시키고, 이를 여과하여 수거하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조시킨다. 필요한 경우, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 산물을 추가로 정제시킬 수 있다.
화학식(V)의 화합물과 함께 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(각각은 약제학적 조성물의 최적의 제형화를 허용하는 특정의 특징에 대해 선택됨)를 포함하는 조성물은 본 발명의 추가적인 특징을 형성한다. 본 발명의 조성물은 또한 2개 이상의 화학식(I) 내지 (V)의 화합물을 포함하는 것 및 하나 이상의 화학식(I) 내지 (V)의 화합물과 하나 이상의 상이한 치료제 또는 활성제를 포함하는 것을 포함한다. 조성물은 리포솜, 나노입자, 콜로이드성 현탁액, 미셀, 마이크로에멀젼, 베지클(vesicle) 및 나노스피어(nanosphere)를 포함한다.
조성물은 또한 추가의 성분, 예로서 통상의 전달 비히클 및 부형제, 예를 들면, 용매, 예로서, 알코올(예를 들면, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 또는 n-부탄올), 디메틸 설폭시드, 물, 염수, 가용화제, 예로서, 캐스터 오일 유도체, 예를 들면, 에톡실화된 캐스터 오일, 예로서, 크레모포르(Cremophor) EL(상표명 BASF AG) 또는 트윈(Tween)(상표명, ICI Americas Inc.) 타입 또는 솔루톨(Solutol) HS15(Solutol은 BASF AG의 상표명이다), 등장화제, 예로서, 우레아, 글리세롤, 아미노에탄올, 프로필렌 글리콜, pH 조절제, 염료, 겔화제, 농후제, 완충제, 및 이들의 배합물을 포함할 수 있다.
전형적으로, 적절한 온도, 전형적으로 15℃ 내지 65℃에서, 적절한 pH, 전형적으로 pH 3 내지 9 및 바람직하게는, 생리학적으로 허용가능한 pH, 예로서, pH 6.5 내지 7.5에서 화학식(I)의 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 조성물을 제조한다.
하나 이상의 화학식(I) 내지 (V)의 화합물을 포함하는 조성물에서, 조성물중 화합물의 농도는 화합물의 감광 능력에 좌우되고, 바람직하게는 국소 사용을 위해서는 0.0005 내지 20% 범위이고, 정맥내 사용을 위해서는 100μM 내지 30mM 범위이다.
사용전 재구성될 수 있는 건성 조성물 또한 본 발명에서 제공한다. 조성물의 고체 성분을 건식 혼합하거나, 일반적으로 온화한 조건하의 진공하 또는 낮은 온도의 오븐에서 건조증발된 액상 조성물을 제조함으로써 제조할 수 있다.
화학식(IV)의 화합물 및 이의 조성물은 감염 및 암을 포함하는 다양한 질환의 치료; 피부, 눈, 심혈관, 부인과 및 치과적 질환의 치료; 및 감염 예방에서 약제로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약제로서의 용도는 항암제, 항균제, 항진균제 및 항바이러스제로서이다. 인간 또는 동물에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일례로 화학식(I) 내지 (V)중 어느 하나의 화합물은 PDT제 또는 광진단제로서 사용된다.
다양한 화학식(I) 내지 (V)의 화합물 및 이의 조성물의 용도의 일례는 바레트 식도, 음문 상피내 신생물(VIN) 및 자궁 상피내 신생물(CIN), 담낭암, 결장암, 비흑색종 피부암, 빛 각화증, 흑색종, 뇌-뇌하수체암, 뇌-신경교종, 췌장암, 두경부암, 폐암, 특히, 비소 세포, 중피종, 식도암, 위암, 피부 T-세포 림프종을 포함하는 암 및 전암성 질환을 치료하거나; 전신 및 국소 감염을 치료, 예를 들면, 피부 및 상처 감염, 예로서 화상 상처를 위한 항미생물 및 항진균 치료에서, 궤양, 특히 다리 궤양, 더욱 특히, 감염된 만성 다리 궤양, 손톱 감염의 치료에서 사용하거나; 기생충 감염, 위 감염, 말라리아, 나병을 위하거나; 세균 및 진균 포자 불활성화를 위하거나; 프리온 및 바이러스 감염, 예로서 HIV의 치료를 위하거나; 귀, 코 및 목 감염, 감염을 위하거나; 성적 전파 질환(STD), 헤르페스를 위하거나; 예를 들면, 모발, 손톱 및 표피의 칸디다 국소감염, 예로서, 무좀 및 칸디다 음문질염의 치료를 위하거나; 및 감염 예방제, 예로서 외과적 상처의 멸균, 피부 이식 멸균, 줄기 세포 멸균, 이식편대 숙주 질환에 사용하거나; 안과 질환, 예로서 황반변성, 잠재성 맥락막혈관신생(CNV), 병적 근시에 기인한 CNV, 잠재성 연령관련황반변(AMD), 당뇨성 황반부종을 치료하거나; 혈관 문제, 예로서 심혈관 질환, 동맥경화증 및 재협착을 위하거나; 자가면역 질환, 예로서 류마티스 관절염을 위하거나; 피부 질환, 예로서 건선, 여드름, 백반증 및 습진 및 다른 피부 질환, 예로서 다모증, 및 일광에 의한 손상, 다른 악성 질환, 예로서 자궁내막증 및 월경과다를 위하거나; 치과적 세균 질환, 예로서 잇몸 종기, 잇몸 질환, 치은염의 치료를 위하고, 플라크 균막의 제거, 불활성화 또는 사멸시키기 위한 PDT용 감광제 약물로서이다.
본 화합물은 이의 감광 성질을 통해 광화학 내재화(약물의 흡수 및 세포내 국소화를 돕기 위한 감광제의 용도)에 사용될 수 있고, 이의 형광 성질을 통해, 예를 들면 광진단과 같은 비치료적 용도로 사용될 수 있다. 후자의 접근법은 감광제는 주변의 건강한 조직에서보다 종양에서 더욱 농축된다는 사실, 및 형광으로 유도되었을 때(청색광 적용에 의해) 종양은 주변 조직보다 더욱 강력하게 형광을 나타낸다는 사실을 이용한다. 적용의 부위의 일례로서 경구 질환 및 담낭, 폐 및 피부 질환의 진단을 포함한다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물 및 이의 조성물은 수의학적 적용에서, 예를 들면 암, 예로서 고양이의 귀암 치료에서, 항진균, 항균 및 항바이러스 치료제로서, 동물의 상처 멸균을 위해, 동물의 안과적 치료를 위해, PDT용 감광 약물로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 화학식(I) 내지 (V)의 화합물 및 이의 조성물의 용도는 인간 및 동물에서 국소 및/또는 조기 암 및/또는 전암성 병변 치료; 또는 인간 및 동물의 상처 또는 피부의 치료 및/또는 예방에 있다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물은 특히, 예로서 암, 전암성 질환, 눈 질환, 혈관 질환, 자가면역 질환, 및 피부 및 다른 기관의 증식성 질환과 같이, 치료법이 원치 않는 조직 또는 세포의 제거, 불활성화, 또는 사멸을 필요로 하는 질환의 PDT용 감광 약물로서 유용하다. 이들 물질의 특이적이고 예측밖의 잇점은 전신 투여(사용하는 특정 감작제에 의존) 후 상이한 시점에 표적 조직에 대하여 광활성인 이들의 능력, 따라서, 예를 들면, 혈관계 또는 종양 세포로 직접 표적화되는 이들의 능력에 관한 것이다. 또한, 전신 투여되었을 때 주변광에 대하여 피부를 감작시키는 경향이 낮고 피부를 착색시키는 경향이 낮다.
일반적으로, 화학식(I) 내지 (V)의 화합물 및 이의 조성물을 전신, 국소, 또는 국부 투여한 후, 적절한 용량 및 파장 또는 파장 범위의 빛을 적용시켜 상기 기술한 다양한 질환 및 질병의 치료에 사용할 수 있다.
전신 투여시 화합물은, 예를 들면 정맥내, 경구, 피하, 근육내, 환부 조직 및 기관으로 직접, 복강내, 종양으로 직접, 진피내 또는 임플란트를 통해 전달될 수 있다.
국소 또는 국부 투여시 화합물은 다양한 수단, 예를 들면 스프레이, 로션, 현탁제, 에멀션, 겔, 연고, 고약, 스틱, 비누, 액상 에어로졸, 분말 에어로졸, 드롭제 또는 페이스트를 통해 전달될 수 있다.
본 발명의 화합물은 600 내지 800nm 범위의 적절한 파장, 바람직하게는 630nm 내지 700nm의 파장의 백색광을 포함하는 빛에 의해 활성화된다.
광원은 적절한 광원, 예로서 레이저, 레이저 다이오드 또는 비간접성(non-coherent) 광원일 수 있다.
PDT 동안 투여되는 광용량(light dose)은 다양할 수 있지만 바람직하게는 1 내지 200J/㎠, 더욱 바람직하게는 20 내지 100J/㎠이다.
광노출은 약물의 최초 투여후 어느 시점 또는 약물 투여후 48시간 이하에 제공될 수 있고, 상기 시간은 치료하고자 하는 질환, 약물 전달 방법 및 사용하는 특정 화학식(I) 내지 (V)의 화합물에 따라 적합화될 수 있다. 광노출은 바람직하게는 약물의 최초 투여후 3시간 이하의 어느 시점, 더욱 바람직하게는 최초 투여후 1시간 이하의 어느 시점, 특히 10분 이하의 어느 시점에 제공될 수 있다.
광용량의 세기를 증가할 경우 일반적으로 노출 시간은 감소된다.
광노출은 종양이 치료되어야 하는, 치료하고자 하는 부위/영역으로 제한하는 것이 바람직하고, 종양 그 자체로만 제한하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일례에서, 화학식(I) 내지 (V)의 화합물 또는 이의 조성물은 치료를 필요로 하는 피검체에게 투여하는 것이 바람직하고, 광노출은 약물의 최초 투여후 10분 이내로 제공한다.
본 발명의 추가의 바람직한 일례로, 광노출은 약물의 최초 투여후 1분 이내로 제공한다.
더욱 바람직하게는, 광노출은 약물 투여 시점에 제공한다.
본 발명의 화합물은 다른 페노티아지늄 감광제와 비교하여 세포-파괴 활성 수행시 세포의 핵을 표적하지 않기 때문에 세포가 돌연변이유발성으로 형질전환될 위험이 매우 낮다는 잇점을 갖는다.
미생물 감염
화학식(I), (II) 및 (III)의 화합물은 세균, 진균 및 바이러스 감염을 포함하는 미생물 감염의 예방 및 치료에서 다수의 잇점을 갖는다:
ㆍ 그램 양성 및 그램 음성 세균, MRSA 및 진균 감염을 포함하여 광범위한 미생물의 탈활성화에 매우 효과적이다.
ㆍ 휴지기/증식 정지기 세균에 대해 활성이다.
ㆍ 숙주 세포에 대해 손상이 최소로 작고 미생물에 대한 선택성이 높다.
ㆍ 예상외로 광표백 수준이 낮다.
화학식(I), (II) 및 (III)의 화합물은 세균, 진균 및 바이러스 감염을 포함하는 미생물 감염의 예방 또는 치료를 위해, 피부 및 다른 국소 감염의 치료를 위해, 화상 및 다른 병변의 멸균을 위해, 궤양 치료를 위해, 피부 이식을 포함하는 기관 이식시 수혜 조직 및 공여 조직 모두의 멸균을 위해, 및 치아 미생물 질환의 치료를 위해, 광활성화가능한 항균제로서 PDT에서 사용할 경우, 치료학적 유효량의 상기 화합물을 치료하고자 하는 부위에 전신, 국소 또는 국부적으로 투여하여(상기 기술된 수단에 의해) 적용시키고 상기 부위를 광노출시켜 화합물을 활성화시킨다.
화학식(I)의 화합물은 상처에 비복제성 유기체가 존재하는 상처 오염; 상처에 복제성 유기체가 존재하는 상처 집락화; 및 숙주를 손상시키는 복제성 유기체가 존재하는 상처 감염을 포함하는 어느 단계의 감염을 예방하기 위하여 적용될 수 있다. > 105 CFU/g으로 조직에 존재할 때 패혈증의 발생 가능성은 더욱 높다.
시험관내 세균 세포 사멸을 위해 사용되는 농도는 0.1 내지 100μM, 바람직하게는 1 내지 50μM 및 더욱 바람직하게는 5 내지 20μM 범위, 특히 10μM이다.
일례에서, 미생물 감염의 예방은, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4가 동일하거나 상이할 수 있고, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, i-펜틸, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노 및 사이클로헥실로부터 독립적으로 선택되는 화학식(I)의 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
일례에서, 미생물 감염의 치료는 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4가 동일하거나 상이할 수 있고, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, 사이클로헥실, MeO(CH2)2- 또는 HO(CH2)2-로부터 독립적으로 선택되고, R1 및 R2 및/또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 피페리디노, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노 또는 모르폴리노 환을 형성하는 화학식(III)의 화합물을 투여하되, 단, R1 = R2 = R3 = R4 = 메틸, 에틸 또는 n-헥실인 화합물, 및 R1 = R2 = HO(CH2)2-이고 R3 = R4 = n-부틸인 화합물은 제외하는 단계를 포함한다.
미생물 감염의 예방에서 사용하거나 항바이러스제로서 사용되는 바람직한 부위는 하기와 같다:
3,7-(테트라-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3,7-(테트라-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3,7-(테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3,7-(테트라-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-에틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움;
3,7-디(피페리디노)-페노티아진-5-이움;
3-(2-에틸피페리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(2-메틸피롤리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디메톡시에틸아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움; 및 3,7-(테트라-벤질아미노)-페노티아진-5-이움. 상기 화합물은 바람직하게는 Cl-, Br- 또는 I-인 카운터음이온으로서 할라이드를 포함한다.
특히, 미생물 감염의 예방에서 사용하거나 항바이러스제로서 사용되는 바람직한 부분은 하기와 같다:
3,7-(테트라-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3,7-(테트라-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움; 및
3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움.
화학식(I) 및 (III)의 화합물은 바람직하게는 세균에 대하여 사용되고, 더욱 바람직하게는 화합물은 항생제 내성 세균에 대하여 사용된다.
항암제
화학식(IV)의 화합물은 암 치료에 대하여 다수의 잇점을 갖는다:
· 메틸렌 및 에틸렌 블루에 비해 광활성이 극도로 강하다.
· UV/청색광 영역에서 광흡수도가 낮다. 이로 인해 피부 감광성이 더욱 낮아지는 경향이 있다.
· 피부 청소가 신속하다.
· 종양에 대한 선택성이 높다.
· 암독성이 낮다.
· 메틸렌 블루에 비해 DNA가 손상될 가능성이 낮다.
· 현존 PDT 약물에 비해 약물-대-광 시간 간격이 매우 짧다.
본 발명의 화합물을 포유 동물 세포 및 종양에 대한 PDT제로서 사용할 경우, 상기 기술된 조성물을 사용하여 다양한 방법으로, 예로서 전신, 국소 또는 국부(상기 기술된 수단에 의해) 투여할 수 있고, 단독으로 사용하거나 다른 성분 및 약물과의 성분 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
종양 치료를 위해 인간에게 정맥 투여하는 화학식(IV)의 화합물의 투여 속도는 0.01 내지 10μmol(마이크로몰)/kg 범위, 바람직하게는 0.1 내지 2.0μmol(마이크로몰)/kg 범위이다. 70kg의 환자에서 2μmol(마이크로몰)/kg의 투여량을 얻기 위해서는 70ml의 2mM 용액, 또는 27mM의 농도로 5ml(16mg/ml) 또는 2.8ml의 50mM 용액을 주사하여야 한다. 전형적인 주사량은 0.1 내지 100ml, 바람직하게는 5 내지 50ml 범위이다.
일례로, 암을 치료하는 방법은 R1, R2, R3 및 R4가 에틸, n-프로필, n-부틸, i-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노, 사이클로헥실, 벤질 및 HO(CH2)2으로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4가 에틸, n-프로필, n-부틸, i-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노 및 벤질로부터 독립적으로 선택되는 화학식(IV)에 따른 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
약제로서 사용하거나 항암제로서 사용되는 화학식(IV)의 페노티아지늄 화합물에서, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 에틸, n-프로필, n-부틸, i-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노, 사이클로헥실, 벤질 및 HO(CH2)2으로부터 독립적으로 선택되고, 더욱 바람직하게는 R1, R2, R3 및 R4는 에틸, n-프로필, n-부틸, i-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실, 2-에틸피페리디노, 2-메틸피롤리디노 및 벤질로부터 독립적으로 선택된다.
물품/표면의 멸균/소독
본 발명의 추가의 특징에 따라, 화학식(V)의 화합물은 표면 및 유체의 일반적인 멸균을 위한 항균제, 항진균제 및 항바이러스제를 포함하는 광활성화된 항미생물제로서 사용될 수 있고, 예를 들면, 특히 코팅되거나 주입되는 외과용 임플란트 및 스텐트를 멸균시키기 위하여, 직물, 예로서 붕대 및 드레싱, 및 IV 라인 및 카테터를 멸균시키기 위하여, 감염 전달을 예방하기 위한 물, 대기, 혈액, 혈액 산물, 및 음식물 및 음식물 패키징을 멸균시키기 위하여, 및 일반적인 가사 용품, 병원 및 사무실 청소를 위해 사용할 수 있다. 화합물을 표면 및 유체에 직접 적용시키거나 이와 접촉시키고 광노출에 의해 화합물을 활성화시킬 수 있다. 추가로, 멸균시키고자 하는 표면을 화합물의 혼합물 또는 용액에 침지시킬 수 있거나 멸균시키고자 하는 유체를 화합물 또는 화합물을 포함하는 용액 또는 혼합물과 혼합시킬 수 있다.
현존하는 공지된 항미생물 감광제에 비해 특이적인 본 화합물의 잇점은 광표백될 경향이 낮음과 동시에 낮은 광수준에서도 높은 광세포독성을 나타낸다는 점이다.
본 발명은 추가로 화학식(V)의 화합물과 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물(composite)을 제공한다. 본 원에서 사용되는 바와 같은 용어 복합물은 본 발명의 화합물이 폴리머에 함몰되거나 매트릭스 또는 기질내로 물리적으로 폐쇄되거나 그 위에 흡착되는 상태를 언급한다. 폴리머는 생물학적 폴리머, 예로서 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 바람직한 폴리머는 안하이드라이드 및/또는 에스테르 그룹을 갖는 것을 포함한다. 폴리머와 함께 컨쥬게이트 또는 복합물을 형성하는 바람직한 화학식(V)의 화합물은 R1 및 R2 및/또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 피페라지닐 그룹을 형성하는 것이다.
본 발명은 화학식(V)의 화합물과 클로로트리아진 유도체 사이의 반응에 의해 형성된 화합물을 추가로 제공한다. 클로로트리아진 유도체는 이에 결합하는 클로로트리아진 그룹을 갖는 폴리머일 수 있다.
적절한 화학식(V)의 화합물은 물품의 표면, 특히 폴리머 표면에 직접 결합할 수 있거나, 화학식(V)의 화합물과 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물에 의해, 또는 클로로트리아진 유도체에 의해, 공유 결합으로 영구적으로 또는 분자사이의 상호작용에 의해 가역적으로 결합할 수 있다. 본 발명은 빛 적용에 의해 필요할 때마다 멸균될 수 있는 표면을 제공하고, 특히, 예를 들면 환자에게 정맥내 라인을 사용하는 경우 및 관련 표면의 장기간 멸균의 유지가 문제되는 봉합 및 카테터 및 정맥내 라인에서 유용하다. 광표백에 대한 화합물의 내성은 발색단의 안정성이 연장될 필요가 있는 적용에 유리하다.
따라서, 본 발명은 추가로 화학식(V)의 화합물이 결합하는 하나 이상의 표면을 갖는 물품을 제공한다.
바람직하게는, 물품은 의료 기기로서, 예를 들면 정맥, 뇨 또는 풍선 카테터, 봉합, 정형외과용 또는 인공 이식물, 심장 판막, 외과용 스크류 또는 핀, 심작박동조율기 리드, 영양관 또는 호흡관, 혈관 스텐트, 인공수정체 또는 소관절 교체기이다. 물품은 또한 상처 보호에서, 및 의료용 물질, 예를 들면 의료 장치용 물질의 패키징용으로 또한 유용할 수 있다.
화학식(V)의 화합물을 병원의 벽, 바닥 및 천정, 임상 표면, 예를 들어 수술대, 도살장 및 과학실험실의 무균실, 직물, 편물 또는 부직 텍스타일 물품, 예를 들어 걸레, 와이프, 수술복, 베드 리넨, 상처 드레싱 및 붕대로 전환로 전환될 수 있는 섬유에 적용시키거나 이와 접촉할 수 있다. 화합물은 직접 또는 폴리머 종과의 결합을 통해 적용될 수 있다.
화합물을 벽, 바닥, 천정 및 작업대에 적용시키고자 할 경우, 상기 화합물, 필름 형성 폴리머(가교결합될 수 있거나 가교결합 될 수 없다), 및 적절한 용매와 함께 임의로 건조제 및 다른 발색단을 포함하는 페인트 또는 래커의 성분으로서 사용될 것을 포함한다. 표면 코팅은 용액 또는 물-기초 현탁액의 형태를 취할 수 있다.
대안적으로, 본 물품은 식음료 산업에 사용되는 것이고 패키징, 포장지 또는 보관 상자 또는 공정 장치의 부품일 수 있다. 당해 물품은 냉장고, 자동판매기, 얼음제조기, 식당 장치의 부품 또는 기타 부엌용품일 수 있다.
본 발명은 추가로 화학식(V)의 화합물을 표면 또는 유체와 접촉시키거나 그에 적용시키고 빛에 의해 화합물을 활성화시키는 것을 포함하는, 표면 또는 유체를 멸균시키기 위한 화학식(V)의 화합물의 용도를 제공한다. 화학식(V)의 화합물은, 예를 들면 스프레이, 리퀴드, 액제, 현탁제, 기포제, 크림제, 겔제 또는 에멀션제와 같은 수단에 의해 접촉되거나 적용될 수 있다.
본 발명의 추가의 특징에 따라, 유체를 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나, 또는 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나와 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물과 접촉시키고, 동시에 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 복합물에 조명을 가하는, 유체를 멸균시키기 위한 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 용도를 제공한다.
유체는 리퀴드 또는 기체 또는 증기일 수 있다. 리퀴드 멸균을 위해, 예를 들면 물, 또는 의학적으로 사용되는 리퀴드, 예로서 비경구용 리퀴드, 예를 들면 염수 또는 글루코오스의 멸균을 위해, 및 특히 생물학적 리퀴드, 예로서 혈액, 혈액 산물, 적혈구, 골수 세포, 및 줄기 세포의 멸균에 상기 방법이 적용될 수 있다. 또한 상기 방법은 기체, 예로서 공기, 특히 냉난방장치 시스템에 사용되는 공기 및 의학적으로 사용되는 산소의 멸균에 적용될 수 있다. 본 방법은 특히 여과 방법에 의해 용이하게 멸균될 수 없는 물질을 멸균시키는데 유용하다.
본 방법은 바람직하게는 물, 또는 의학적으로 사용되는 리퀴드, 예로서 비경구용 리퀴드, 예를 들면 염수 또는 글루코오스의 멸균을 위해, 생물학적 리퀴드, 예로서 골수 세포, 및 줄기 세포의 멸균을 위해 사용된다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나 및 이의 컨쥬게이트 또는 복합물은 미세 분할된 형태 또는 비드 또는 플레이트 형태와 같이 극대화된 표면적을 갖는 것으로서 바람직하게 사용될 수 있거나, 예로서 유리, 유리솜, 세라믹, 플라스틱, 금속 및 금속 산화물과 같이 큰 표면적을 제공하는 지지체 물질상에서 또는 이와 결합하여 사용될 수 있는 있다. 바람직하게는, 지지체 물질은 빛에 대하여 투과성이거나 이를 통해 빛을 통과시킬 수 있다. 지지체 물질을 사용할 경우, 컨쥬게이트 또는 복합물에 의해 커버링되는 표면적을 극대화시킬 수 있도록 배열되고, 비드, 플레이트, 칼럼 또는 튜브의 거대 표면, 기포 또는 섬유의 형태일 수 있다.
화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나 및 이의 컨쥬게이트 또는 복합물에 바람직하게는 상기 기술된 광용량 및 파장에서 연속적으로 조명을 가한다.
바람직한 화학식(I) 내지 (V)의 화합물은 멸균 방법에서 바람직한 것이다.
본 발명의 일면의 특정 일례로, 단독 또는 지지체 물질상의 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나 또는 이의 컨쥬게이트 또는 복합물은 전형적으로 빛에 대하여 투과성인 물질, 예로서 석영 유리 또는 합성 섬유로 제조된 칼럼내로 패킹된다. 멸균을 필요로 하는 유체를 칼럼의 한쪽 끝 내부로 통과시키고 전체 칼럼에 연속적으로 조명을 가하고 멸균된 물질은 칼럼의 다른 한쪽 끝으로부터 유출된다.
본 발명의 특정의 신규한 부분은 하기 화합물을 포함한다:
3,7-(N,N-테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3,7-(N,N-테트라-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-에틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-옥틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움;
3,7 디-(피페리디노)-페노티아진-5-이움;
3-(2-에틸피페리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(2-메틸피롤리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
3-(N,N-디메톡시에틸아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움; 및 3,7-(N,N-테트라-벤질아미노)-페노티아진-5-이움.
바람직하게는, 상기 화합물은 바람직하게는 Cl-, Br- 또는 I-인 카운터음이온으로서 할라이드를 포함한다.
본 발명의 신규한 부분은 PCT/GB02/02778에 기술된 화합물에 비해 예상외의 잇점을 나타낸다.
예를 들면,
3,7-(N,N-테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움은 놀랍게도 n-부틸 유사체와 비교할 때, 항암제로서 사용시 조직을 최소로 손상시키고 Ames 음성이고;
3,7-(N,N-테트라-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움은 놀랍게도 n-펜틸 유사체와 비교할 때, 단기간의 약물 대 광 시간 간격으로 효능이 있고;
3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라메틸 및 테트라 n-프로필 유도체 둘 모두와 비교할 때, 개선된 항균 활성을 갖고;
3-(N,N-디-에틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라에틸 및 테트라 n-프로필 유도체 둘 모두와 비교할 때, 개선된 항균 활성을 갖고;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 n-프로필 유도체와 비교할 때 우수한 항균 활성 및 우수한 Ames 수행능을 갖고 놀랍게도 다소 악화될 것으로 예측될 때 테트라 n-부틸 유도체의 항균 활성 및 Ames 수행능과 동일하고;
3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 n-프로필 유도체와 비교할 때 우수한 항균 활성 및 우수한 Ames 수행능을 갖고 놀랍게도 다소 악화될 것으로 예측될 때 테트라 n-펜틸 유도체의 항균 활성 및 Ames 수행능과 동일하고;
3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 n-헥실 및 테트라 n-프로필 유도체 둘 모두와 비교할 때 우수한 항균 활성을 갖고, 항암제로서 테트라 n-헥실 유도체보다 우수한 수행능을 갖고 테트라 n-프로필 유도체의 투여 속도의 1/2에서 항암제로서 동일한 수행능을 갖고;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움은 다소 악화될 것으로 예측될 때 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 테트라 n-펜틸 유도체보다 우수한 활성을 갖고 테트라 n-부틸에 대해서는 거의 동일한 활성을 갖고;
3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움은 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대하여 테트라 n-부틸 및 테트라 n-펜틸 유도체 둘 모두보다 우수한 활성을 갖고;
3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-옥틸아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 메틸 유도체보다 우수한 항종양 활성을 갖고 항암제로서 사용될 때 정상 조직을 최소로 손상시키고;
3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움은 테트라 에틸 유도체보다 우수한 항종양 활성을 갖고 테트라 에틸 및 테트라 n-헥실 유도체와 비교할 때 우수한 항균 활성을 갖고;
3-(2-에틸피페리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 n-펜틸 유도체와 비교할 때 단기간의 약물 대 광 시간 간격으로 효능이 있고;
3-(2-메틸피롤리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 n-펜틸 유도체와 비교할 때 단기간의 약물 대 광 시간 간격으로 효능이 있고;
3,7-(N,N-테트라-벤질아미노)-페노티아진-5-이움은 테트라 메틸 유도체보다 우수항 항종양 활성을 갖는다.
1) 화학식(I)의 대칭형 페노티아지늄 브로마이드의 일반 합성법
(여기에서, R1 = R2 = R3 = R4이거나, R1 및 R2, 및/또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 N-헤테로사이클을 형성하고; P = 1, XP -= Br-이다).
a) 3,7-디브로모페노티아진-5-이움 브로마이드의 제조
강하게 교반하면서 무산소 빙초산(150㎤)중 페노티아진(2.00g, 0.01mol)(노트 1) 용액에 무산소 빙초산(100㎤, 10% v/v Br2)중 브롬 용액을 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물은 흑색 고체를 형성하면서 흑색이 되었다. 1분 동안 계속하여 교반한 후, 현탁액이 적색이 되었을 때 물(400㎤)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 진공에서 여과하여 흑색 고체 및 갈색 여과액을 수득하였다. 고체를 에테르로 세척하고 1시간 동안 진공하에서 건조(40℃, 50mmHg)시켜 붉은 벽돌색의 산물을 수득하였다. 고체 질량 = 3.63g 수율 = 83%.
b) 대칭형 페노티아지늄 브로마이드의 제조
강하게 교반하면서 질소하에서 클로로포름(200㎤)중 적절한 아민 R1R2NH 또는 N-헤테로사이클(32.4mmol) 용액에 3,7-디브로모페노티아진-5-이움 브로마이드(2.0g, 4.6mmol)를 한번에 첨가하였다. 반응 혼합물은 청색이 되었고, 3시간 동안 질소하에서 교반하였다. 클로로포름 용액을 HBr(2% aq., 2x50㎤) 및 물(2x50㎤)로 연속하여 세척한 후, MgS04상에서 건조시켰다. 여과시킨 후, 회전식 증발에 의해 대부분의 용매를 제거하고, 과량의 디에틸 에테르를 첨가한 후, 반응 혼합물을 방치시켰다. 몇시간 후, 다량의 무색 고체가 형성되었다. 여과하여 이 물질을 제거 하였다. 여과액을 증발건조시키고, 잔류 미정제 산물을 클로로포름, 클로로포름/메탄올(98/2) 및 최종적으로 클로로포름/메탄올(90/10)의 이동상을 연속적으로 사용하여 실리카겔 60상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 청색의 크로마토그래피 분획을 혼합하고 회전식 증발에 의해 용매를 제거하였다. 암청색 산물을 최소량의 디클로로메탄(1O㎤)에 용해시키고, 과량의 페트롤륨 에테르를 첨가하여(b.p. 60-80℃) 최종 산물을 결정질 형태로 침전시켰다. 여과하여 고체를 수거하고, 에테르로 세척하고 대기 건조시켰다.
박층 크로마토그래피에 의해 각 산물의 순도를 확인하고(단일 검출가능한 청색 스팟을 나타냄), 전기분무 질량분광법 및 UV/가시광선 분광법에 의해 구조를 확인하였다.
2) 화학식(I)의 비대칭형 페노티아지늄 요오다이드의 일반 합성법
(여기에서, R1R2N ≠ R3R4N이거나, R1 및 R2, 및/또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 N-헤테로사이클을 형성하고; P = 1, XP -= I-이다).
a) 페노티아진-5-이움 테트라요오다이드 하이드레이트의 제조
얼음 배쓰에서 5℃ 미만으로 냉각된 클로로포름(100㎤)중 페노티아진(10mmole) 교반액에 클로로포름(400㎤)중 요오드(33mmole) 용액을 1.5시간에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고 생성된 침전물을 여과하여 수거하고, 요오드가 제거될 때까지 클로로포름으로 세척한 후 밤새도록 진공하에서 실온에 유지시켜 산물을 수득하였다.
b) 비대칭형 페노티아진-5-이움 요오다이드 제조
메탄올(300㎤)중 페노티아진-5-이움 테트라요오다이드 하이드레이트(1.4mmole)의 교반 용액에 메탄올(50㎤)중 적절한 아민 R1R2NH(3.6mmole) 용액을 60분의 기간 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물의 용량은 증발시켜 감소시키고 뜨거운 용액은 방치시켜 냉각시켰다. 형성된 고체를 여과에 의해 수거하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조시켰다.
c) 디클로로메탄(100㎤)중 상기 고체(0.34mmol) 용액에 디클로로메탄(5㎤)중 트리에틸아민(0.40mmol) 용액에 이어서, 디클로로메탄(50㎤)중 상이한 두번째 아민 R3R4NH(1.4mmol) 용액을 60분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 이어서, 유기층을 묽은 염산(4x25㎤)에 이어 물(2x25㎤)로 세척하였다. 이어서, 유기층을 MgS04 상에서 건조시켰다. 회전식 증발에 의해 다수의 용매를 제거하고 과량의 디에틸 에테르를 첨가하여 고체를 침전시켰다. 고체를 여과에 의해 수거하고, 디에틸 에테르로 세척하고 건조시켰다. 필요한 경우, 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 화합물을 추가로 정제하였다.
각 산물의 순도를 박층 크로마토그래피(단일 검출가능한 블루 스팟)에 의해 확인하였다. 전기분무 질량분광법 및 UV/가시광선 분광법에 의해 구조를 확인하였다.
하기의 특정 화합물을 상기 방법에 의해 제조하였다:
Figure 112006037310880-PCT00003
화합물 1 R1 - R4 = n-C3H7: 테트라-n-프로필
화합물 2 R1 - R4= n-C4H9: 테트라-n-부틸
화합물 3 R1 - R4 = n-C5H11: 테트라-n-펜틸
화합물 4 R1 - R4 = n-C6H13 : 테트라-n-헥실
메틸렌 블루(R1-R4 = n-CH3) 화합물 5 및 에틸렌 블루(R1-R4 = n-C2H5) 화합물1-6은 비교 목적으로 조사하였다. 화합물 1 내지 6은 요오다이드 카운터음이온을 갖는다.
화합물 7, 7a, 8, 8a, 8b 및 14-29는 유사한 방법에 의해 제조하였다.
화합물 9: 3-( N,N -디메틸아미노)-7-( N,N - 디프로필아미노 )-페노티아진-5-이움 요오다이드 (20%)
3-(N,N-디프로필아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디메틸아민 하이드로클로라이드로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법: C20H26N30S는 m/z = 340을 요함; 측정치 m/z= 340(I- 는 질량분광법에 의해 검출되지 않음).
화합물 10: 3-( N,N - 디에틸아미노 )-7-( N,N - 디프로필아미노 )-페노티아진-5- 이움 요오다이드 (15%)
3-(N,N-디프로필아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디에틸아민으로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법: C22H30N30S는 m/z = 368을 요함; 측정치 m/z = 368(I- 는 질량분광법에 의해 검출되지 않음).
화합물 11: 3-( N,N - 디부틸아미노 )-7-( N,N - 디프로필아미노 )-페노티아진-5- 이움 요오다이드( 19%)
3-(N,N-디프로필아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디부틸아민으로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법: C26H38N3OS는 m/z = 424를 요함; 측정치 m/z = 424(I- 는 질량분광법에 의해 검출되지 않음).
화합물 12: 3-( N,N - 디펜틸아미노 )-7-( N,N - 디프로필아미노 )-페노티아진-5- 이움 요오다이드( 20%)
3-(N,N-디프로필아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디펜틸아민으로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법: C28H42N30S는 m/z = 452를 요함; 측정치 m/z = 452(I- 는 질량분광법에 의해 검출되지 않음).
화합물 13: 3-( N,N - 디헥실아미노 )-7-( N,N- 디프로필아미노 )-페노티아진-5- 이움 요오다이드( 22%)
3-(N,N-디프로필아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디헥실아민으로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법 :C30H46N30S는 m/z = 480를 요함; 측정치 m/z = 480(I- 는 질량분광법에 의해 검출되지 않음).
화합물 28: 3-( N,N - 디에탄올아미노 )-7-( N,N - 디펜틸아미노 )-페노티아진-5- 이움 요오다이드 (23%)
3-(N,N-디펜틸아미노)-페노티아진-5-이움 트리요오다이드를 분리한 후, 디에탄올아민으로 처리하여 본 화합물을 수득하였다. 디에틸 에테르를 첨가하여 디클로로메탄으로부터 침전시켜 보라색의 광택성 결정을 수득하였다. 질량분광법:C26H38N302S는 m/z = 456을 요함; 측정치 m/z = 456(I- 는 질량분광법에 의해 검출되 지 않음).
추가의 화합물을 합성하고 표 A에 요약한다.
화합물 5 및 6은 본 발명의 화합물이 아니고 비교 목적을 위해 포함된다.
감광제 저장액을 물 및/또는 DMSO중에서 제조하고 필요시까지 암실에 저장하였다. 시험 용액은 필요에 따라 완충액 또는 용매 또는 생물학적 배지 중에서 제조되었다.
페노티아지늄 화합물의 스펙트럼 및 물리적 특성
메탄올중 페노티아지늄 화합물의 스펙트럼 데이타(표 1)는 모든 화합물이 650-700nm 영역에서 흡수도 피크를 갖지만, 정확한 피크 위치에 대해서는 다수의 변수가 존재한다는 것을 나타낸다.
표 1
Figure 112006037310880-PCT00004
Figure 112006037310880-PCT00005
상기 표 및 본 명세서에서 Me, Et, Pr, Bu, Pent, Hex, Hept, Oct는 각각 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 및 옥틸을 나타내고 n- 및 i-는 각각 노말 및 이소 알킬 쇄를 언급한다.
암 치료
화학식(I)의 화합물을 배양액중 RIF-1 뮤린섬유육종 세포에서 PDT 효능에 대하여 평가하였다. 세포를 1시간 동안 페노티아지늄과 함께 인큐베이션시킨 후, PBS로 3회 세척하고 신선한 배양 배지를 첨가하였다. 이어서, 다이오드 레이저를 사용하여 18J/㎠(10mW/㎠) 665nm 빛을 세포에 조명을 가했다. 동시에 암독성(Dark toxicity)을 측정하였다. MTT 에세이를 사용하여 처리후 24시간째, 세포 생육성을 평가하였다. 페노티아지늄과 1시간 인큐베이션시킨 후 형광 현미경을 사용하여 RIF-1 세포에서 세포하 위치 측정하였다. 광노출 전 및 그 후에 위치를 측정하였다. 상기 화합물에 대한 샘플 데이타를 표 2에 나타낸다.
표 2 RIF-1 세포에서 예시되는 페노티아지늄의 광독성, 암독성 및 세포하 위치
PDT LD50 (μM) 비 PDT: 암 LD50 세포하 위치 측정
-광 +광
테트라 메틸 디메틸 디프로필 디에틸 디프로필 디부틸 디프로필 디펜틸 디프로필 디헥실 디프로필 13.1 0.22 0.11 0.09 0.12 0.19 9 119 159 54 40 47 리소좀 리소좀 리소좀 리소좀 리소좀 리소좀 핵 리소좀 리소좀 미토콘드리아 미토콘드리아 미토콘드리아
상기 데이타는 수개의 비대칭형 페노티아지늄 유도체(여기에서, R1=R2 ≠ R3=R4이다)가 절대 활성, 및 광(light) 대 암(dark) 독성 비 둘 모두에 의해 메틸렌 블루에 비해 감광제로서 우수한 성질을 갖는다는 것을 제시한다. 추가로, 메틸렌 블루와 달리 상기 화합물들은 세포 핵으로부터 배출된다.
생체내 항종양 효능
피하 CaNT 종양을 수반하는 CBA/gy 마우스에서 종양 파괴를 평가하였다. 16.7μmol/kg의 투여량으로 감광제를 정맥내 투여하였다. 이환율 또는 사망율이 고수준으로 관찰되거나 용해도가 한정되어 있는 경우, 투여량을 8.35μmol/kg으로 감소시켰다. 감광제 투여후 다양한 시점에 660±15nm 필터를 사용하여 패터슨(Paterson) 램프로부터 60J/㎠, 50 mW/㎠ 빛을 사용하여 종양에 표면상으로 조명을 가하였다. 약물-광 시간 간격은 O시간(실제로, 1-2분)로부터 96시간까지의 범위였다. 조명을 가한 후 72시간째에, 입사광에 평행한 종양의 중심으로부터 횡단면 슬라이스를 분리하고, 상기 이미지를 캡쳐하고 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 육안으로 괴사 부위를 검정하였다. 전체 종양 슬라이스중 면적(%)으로 괴사를 표시하였다. 대조군 종양의 종양 괴사(%)는 일반적으로 < 10%였다. 항종양 활성을 하기와 같이 분류하였다: 없음 0-10%의 종양 괴사, 낮음 11-39% 종양 괴사, 중간 40- 69%의 종양 괴사, 높음 70-100%의 종양 괴사.
최적의 용량 및 약물-광 시간 간격에서의 각 화합물에 대한 항종양 활성을 표 4에 나타낸다.
마우스의 내부 기관, 예로서 신장 및 간에 대한 피하 종양의 밀접한 근접성에 기인하여, 상기 모델의 PDT 이후에는 상기 내부 기관에 대한 손상이 자주 관찰된다. PDT 후 내부 기관에 대한 손상을 표 3과 같이 점수화하였다.
표 3: 내부 기관에 대한 손상의 점수화 시스템
점수 손상에 대한 설명
0 없음
1 최소: 신장/간을 포함하는 부검상에 명확하게 나타나는 최소의 손상
2 중간: 부검상에 명확하게 나타나는 중간 정도의 손상/일시적인 체중 감소/일시적인 활성 저하: 신장/간/사두근 포함
3 중증: 빈사 상태, 사멸을 요함
하기 화합물: 테트라헥실, 디펜틸 디에탄올아민은 정상 조직의 손상 없이(평균 점수 = 0) 상대적으로 높은 항종양 활성을 나타내었다. 하기 화합물: 테트라 이소부틸, 디헥실 디프로필, 비스 메틸 옥틸은 정상 조직에서 최소의 손상(평균 점수 < 1)을 갖는 상대적으로 높은 항종양 활성을 나타내었다.
표 4 최적의 용량 및 약물-광 시간 간격으로 정맥 투여한 후, 10μM의 감광제를 사용하여 대수 증식기(log phase)의 E. 콜라이(E. coli) 및 C. 알비칸스(C. albicans)의 광활성화 및 3.2J/㎠의 용량으로 665nm 레이져 빛을 조명을 가한 후의 CBA/gy 마우스에서의 PDT 유도성 종양 괴사(단, 화합물 1, 4, 5, 6의 경우에는 1.3J/㎠의 용량으로 조명을 가함)
Figure 112006037310880-PCT00006
Figure 112006037310880-PCT00007
Figure 112006037310880-PCT00008
Ames 시험 결과에서, P=양성, N=음성, WP=약한 양성 및 n.d.=
본 화합물은 현재 이용가능한 화합물, 예로서 포토프린(Photofrin)(상표명, Axcan Pharma PDT Inc) 및 포스칸(Foscan)(상표명, Bioscience Technology Investment Holdings Limited)에 비해 다수의 잇점을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 상대적으로 간단한 방법에 의해 생산되는 단일 이성체 유리 화합물인 반면, 포토프린은 포르피린 유도체의 복합 혼합물이다. 치료시 병원에서 환자의 편의 및 시간 및 관련 비용 둘 모두와 관련하여 단기간의 약물 투여-대-광 시간 간격이 바람직할 수 있다. 단기간의 약물-광 시간 간격에서는 종양을 둘러싼 정상 조직에 대하여 허용되지 않는 손상이 발생하기 때문에 포토프린은 장기간의 약물-광 시간 간격, 전형적으로 48시간을 요한다. 본 발명의 화합물은 단기간의 약물-광 시간 간격에서 종양을 둘러싼 정상 조직을 손상시키지 않으면서 활성을 나타낸다. 예를 들면, 디부틸 디프로필 유도체는 투여후 즉시 조명을 가하였을 때 98%의 종양 괴사를 유발한다.
종양을 덮는(overlying) 피부에 대한 손상 비교(옴 형성에 의해 평가)에서 본 발명의 모든 화합물은 단기간의 약물 대 광 시간 간격에서는 옴을 전혀 형성시키지 않는 것으로 관찰된 반면, 포토프린은 단기간의 약물 대 광 시간 간격(0-3 시간)에서는 25% 이하의 옴을 형성하였고, 48시간의 장기간의 약물 대 광 시간 간격에서는 옴은 형성시키지 않고 종양 괴사만 50% 존재하였다.
또다른 이용가능한 화합물인 포스칸의 경우, 암 세포내 축적될 시간을 허용하기 위하여 혈류내로의 주입과 레이저 광에 의한 활성화 사이에 4일간의 지연 기 간이 있었다. 포스칸의 투여로 인해 환자는 대략 15일간의 감작 기간을 갖음과 동시에 빛에 대하여 고도로 감수화되었다.
광- 항미생물 활성
1) 일반 방법
미생물 세균 광비동화(photoinactivation) 실험 방법
a) 감광제 표준 제조법
디메틸설폭시드(DMSO)중 5mM 이하로 감광제 저장액을 제조하였다. 추가로 5mM 저장액을 DMSO중에서 1mM의 실험 농도로 희석시켰다. 필요시까지 모든 감광제를 실온에서 호일로 커버링된 바이알에 저장하였다.
b) 미생물의 표준 제조법
다양한 실험 파라미터의 변수를 연구하기 위하여 하기 요약된 표준 프로토콜을 적절하게 수정하였다.
아가 플레이트로부터의 단일 세균 콜로니를 사용하여 1ℓ의 삼각플라스크중 100ml의 영양 배지(0.5 % 효모 추출물: 1.0 % 트립톤 w/v)를 무균 접종시켰다. C. 알비칸스(C. albicans)의 경우, 단일 진균 콜로니를 1ℓ의 삼각플라스크중 100ml의 사브로덱스트로오스 배지에 접종시켰다. 37℃에서 밤새도록 진탕 배양기에서 배양물을 인큐베이션시켰다. 인큐베이터를 1분당 250의 스트로크(stroke)로, 2.5cm 써클의 회전으로 세팅하였다. 상기 배양액은 표준 증식기 실험을 위해 사용하였다. 대수 증식기의 세균 실험을 위해 밤새 배양한 배양물을 사용하여 200ml의 영양 배지(2ℓ의 기울어진 플라스크(bevelled flask)중)에 접종시키고 C. 알비칸스(C. albicans)의 경우, 200ml의 사브로덱스트로오스 배지에 접종시키고, 상기 둘 모두는 600nm에서 광밀도가 0.1이 되도록 하였다. 대수 증식중기까지 미생물을 배양한 후 수거하고 재현탁시켰다.
c) PDT 를 위한 미생물 제조
원심분리하여 대수 증식기 또는 증식 정지기의 세포를 수거하고 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중에서 2회 세척하였다. 세척 후, 세포를 650nm에서 흡광도 0.87이 되도록 동일한 완충액에서 재현탁시켰다. E. 콜라이(E. coli), S. 아우레우스(S. aureus), MRSA 및 P. 아에루기노사(P. aeruginosa)에 대한 흡광도는 3.5 x 108 CFU/ml 또는 8.5 log10CFU/ml과 동일하였다. C. 알비칸스(C. albicans)에 대해서는 1.O x 107 CFU/ml 또는 7.0 log10CFU/ml로 보정하였다. 배지중 E. 콜라이(E. coli)의 광활성화를 위해 상기 단계에서 세균을 영양 배지에 재현탁시켰다.
미생물 세포 광비동화 실험
감광제를 이용한 표준 인큐베이션
25ml의 제조된 세포 현탁액을 250ml의 멸균 호일로 커버링된 삼각 플라스크중 0.25ml의 1mM 감광제 저장액(최종 농도 10μM)과 함께 인큐베이션시켰다. 현탁액을 250rpm으로 37℃의 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다.
백색광원으로부터의 조명
10μM의 페노티아지늄 화합물과 함께 인큐베이션시킨 후, 현탁액을 75cm 거리를 두고 500W 할로겐 램프로 60분 동안 조명을 가하고, 램프의 전력은 조명 시간당 4.68J/㎠를 발생하는 1.3mW/㎠ 였다.
665 nm 레이저로부터의 조명
10μM의 페노티아지늄 화합물과 함께 인큐베이션시킨 후, 10ml의 세균 배양액을 무균 세포로 무균 이동시켰다. 이는 광섬유가 배치될 수 있는 삽입된 봉인 모세관을 지니는 봉인 바이알을 포함하였다. 3cm의 분산 팁(diffusing tip)을 지니는 광섬유를 사용하는 세람 옵테크(Ceram Optec) 다이오드 레이저(665nm)로 100mW로 조명을 가하였다. E. 콜라이(E. coli)에서 페노티아지늄 화합물 시리즈를 비교하는 실험을 위해 4분 동안 샘플에 조명을 가하였다. 조명된 실린더의 면적을 18.86㎠로 가정하여 플루언스율은 5.3mW/㎠와 동일하였다. 4분간 조명을 가한 후, 전체 플루언스는 1.3J/㎠이었다. 다른 시험에서는 10분간 조명을 가하고 0, 1, 2, 4, 8 및 10분간 조명을 가한 후 50㎕의 샘플을 CFU 분석을 위해 분리하였다. 상기 조명 시간은 각각 하기의 플루언스와 동일하였다: 0 J/㎠; 0.32J/㎠; 0.64J/㎠; 1.3J/㎠; 2.5J/㎠ 또는 3.2J/㎠. 산소 전극 추적(trace)을 통해 산소는 조명 기간 동안 제한되지 않는다는 것을 나타내었다. 상이한 세균에 대한 테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 화합물의 효능을 비교하기 위한 실험에서 조명은 광용량 3.2J/㎠를 제공하기 위해서 단지 10분 동안의 레이저 셋업을 사용하였다. 광용량은 또한 화합물 17-29를 비교하기 위한 실험을 위해 사용하였다. 결과를 상기 표 5 및 하기 표 5에 표로 제시한다.
세균 및 효모 생존 분석
조명을 가하거나 가하지 않은 샘플 현탁액 50ml을 분리하고 0.1M pH 7.0 인산칼륨 완충액에 희석시켰다. 50㎕의 희석된 현탁액을 세균에 대해서는 영양 아가(0.5% 효모 추출물, 1.0% 트립톤, 2.0% 아가 w/v)상에, C. 알비칸스(C. albicans)에 대해서는 사브로덱스트로오스 아가상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 30 내지 300 사이의 다수의 집락형성단위를 수득하였다. 이어서, 세포 비활성화를 측정하였다.
페노티아지늄 화합물은 사용하지 않지만 0.25ml의 DMSO를 사용한 인큐베이션 단계 30분 전후 세균으로부터 플레이팅함을 포함하는 대조군 연구에서는 CFU/ml에 변화가 전혀 없는 것으로 나타났다. 페노티아지늄 화합물은 사용하지 않지만 0.25ml의 DMSO를 사용하는 세균 배양액에 빛의 조명을 통해서도 CFU에 변화가 전혀 없는 것으로 나타났다. 영양 배지에 조명을 가한 경우, 대조군 시험은 조명 시간당 0.2의 CFU/ml으로 log10 증가를 나타내었다.
세균 세포 증식에 대한 페노티아지늄 화합물의 효능 측정
호일 커버링된 250ml의 삼각 플라스크중 200ml의 영양 배지(0.5% 효모 추출물 1.0% 트립톤 w/v)를 완전히 배양된 세균 배양액(E. 콜라이(E. coli)) 10ml로 무균 접종하였다. 추가로, 페노티아지늄 화합물은 포함하지 않지만 1.0ml의 DMSO를 포함하는 대조군과 별개로, 배지는 10μM의 최종 농도로 1.0ml의 1mM 페노티아지늄 화합물 저장 현탁액을 포함하였다.
현탁액을 250rpm으로 37℃의 진탕 인큐베이터에서 암실에서 인큐베이션시켰다. 1ml의 샘플을 매 6시간마다 채취하고 빛 산란에 의해 유발되는, 550nm에서의 겉보기 광밀도에 기초한 혼탁도를 측정하였다. 대조군 연구는 상기 파장이 감광제 흡광도 영역밖이라는 것을 제시한다. 광밀도 판독 후, 1.0ml의 샘플을 MSE 마이크로-센토(Micro-Centaur) 원심분리기(10,000g x 5분)에서 회전시키고 상등액의 흡광도 스펙트럼을 분광 광도법으로 판독하였다.
테트라-n-부틸 유도체에 대해서만, 감광제를 사용하지 않고 3시간 동안 세균을 배양한 후, 페노티아지늄 화합물을 첨가하여 유사한 실험을 수행하였다. 광 및 암실에 노출시킨 것에 대하여 시간 함수로서 차후 배양을 모니터하였다.
E. 콜라이(E. coli)내로의 감광제 흡수
세균을 감광제와 함께 인큐베이션시킨 후, 벤치탑 센토(Benchtop Centaur) 5 원심분리기(1500 g x 10분)를 사용하여 2ml의 빛으로 조명되지 않은 세균 배양액을 침전시켰다. 세균 펠릿을 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)을 사용하여 2회 세척하여 세포외로 느슨하게 결합된 감광제를 제거하였다. 마지막으로, 펠릿을 재현탁시키고 1ml의 0.1M NaOH 2%(w/v) SDS에서 볼텍싱시키고 24시간 이상 암실에 방치하였다. 콘트론(Kontron) SFM-25 분광 광도계를 사용하여 형광을 판독하였다. 표준 곡선의 내삽법으로부터 세포내 샘플중 페노티아지늄 화합물의 농도를 측정하였다.
광표백 0.25ml의 1mM 감광제 용액, 0.25ml의 1OmM 트립토판을 25ml의 60% 메탄올, 40% 인산칼륨 완충액(pH7.0)에 첨가하였다. 트립토판의 부재하에서 0.25ml의 60% 메탄올, 40% 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 대체하고 실험을 수행하였다.
상기 세포 불활성화 실험에서와 같이 60분 동안 혼합물에 조명을 가하고(1.3mW/㎠), 샘플을 매 15분마다 채취하고 스펙트럼을 500 내지 700nm 사이의 UV-가시광선 분광 광도계로 기록하였다. 높은 광용량의 경우, 60분 동안 9mW/㎠ 으로 조명을 가하였다.
결과
페노티아지늄 유도체의 항균 성질
다수의 항생제는 비증식 또는 증식 정지기 세균에 대해 거의 효과가 없고 증식 정지기 세균을 비활성화시키는 페노티아지늄 화합물의 능력을 평가하는 것이 중요하다. 증식 정지기 동안에 세포는 펩티도글리칸 세포 벽이 더 두꺼워지고 단백질 대사에도 차이가 생겨 광역학 효과에 덜 영향을 받을 수 있다.
감광제가 세균성 지질다당류 막보다 세포외 단백질에 우선적으로 결합할 수 있기 때문에 세균의 비활성화는 치료 환경에서 더욱 이의 제기되고 있다. 이는 감광제 결합을 위해 세균 세포와 경쟁할 수 있는 다수의 인자들을 함유하는 영양 배지에 세균을 재현탁시켜 시험하였다.
레이저 원의 잠재된 잇점은 광용량의 정확도 증가 및 단기간의 조명 시간이다.
세균 세포내로의 감광제의 흡수는 광활성 측정에 명백히 중요하다.
S. 아우레우스(S. aureus)는 두꺼운 외부 펩티도글리칸 층을 갖고 외부 지질다당류는 전혀 없다는 점에서 그램 음성 세균과 상이한 그램 양성 세균이다. 세균 구조는 거의 모든 통상적으로 사용되는 항생제에 내성인 MRSA(메티실린 내성 S. 아우레우스(S. aureus))에서와 동일하다. 데이터는 조명을 가한 후 단지 1분째에 약 99%의 세균이 비활성화되고 10분 후에 약 5 log의 세포 사멸을 나타내는데, 이는 그램 양성 세균에 대한 테트라-n-부틸 유도체의 매우 높은 광활성을 제시하는 것이다.
감광제가 또한 항생제 내성 형태, MRSA에 대해서도 활성인지를 측정하는 것이 중요한데, 이는 건강 및 산업용으로 사용되기 때문이다.
페노티아지늄 유도체의 항진균성
빛속에서 진균 세포를 사멸시키는 화학식(I)의 화합물의 능력을 시험하기 위해 감광제를 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 세포와 함께 인큐베이션시키고, 상기 기술한 바와 같이 배양액에 레이저 광을 적용시켰다. 따라서, 상기 감광제는 또한 많은 통상의 감염, 예를 들어 아구창에 원인이 되는 진균성 유기체에 대해서도 매우 높은 광활성을 나타낸다.
세균 세포 대 포유 동물 조직의 선택성
숙주 조직은 최소로 손상시키면서 미생물을 파괴하는 것이 치료학적 목적으로 매우 중요하다. 이를 시험하는데, 화학식(I)의 화합물의 용액을 실험용 마우스의 귀에 적용시키고, 총 용량이 세균 또는 진균 제거를 위해 필요한 양의 약 20배가 되는 조건하에서 조명을 가함으로써 수행하였다. 숙주 조직에 대한 가능한 효과를 귀 두께의 증가를 측정함으로써 평가하였다. 이는 피부에서의 광역학 반응을 탐지하기 위한 표준 모델이다.
장기간의 피부 반응을 유발하는 것으로 공지되어 있는 포토프린에 상응하는 약물인 PHP의 정맥내 투여로부터 수득된 결과와 비교하였다. PHP로부터의 반응이 매우 강한 반면, 화학식(I)의 화합물로부터의 반응은 거의 없거나 전혀 없었고, 이는 포유 동물 조직이 항미생물 처리 동안 손상되지 않았음을 제시하는 것이다.
광표백
광표백은 감광제로부터 검출가능한 색상을 제거하여 이를 비활성화시키고, 이는 광 및 환원 또는 산화에 대한 이의 불안정성의 결과이다. 이러한 광표백은 잠재된 적용에 따라 잇점 또는 단점을 가질 수 있다. 예를 들어, 광표백은 라인 및 카테터의 코팅에서 바람직하지 않을 수 있다. 상기에서 기재한 바와 같이 트립토판의 사용 및 미사용하에 하나는 높은 광용량(9.0mW/㎠)에서 다른 하나는 낮은 광용량(1.3mW/㎠)에서 두 세트의 실험을 수행하였다. 트립토판의 사용 및 미사용하에 낮은 광용량에서 흡수 스펙트럼은 페노티아지늄 화합물의 어느 것에도 변화가 일어나지 않았는데, 이는 이러한 용량에서 안정함을 입증하는 것이다. 높은 광용량에서 스펙트럼 변화는 메틸렌 블루에 대해 관찰되었는데, 이는 광표백을 의미하는 것이다. 1시간 동안 조명을 가하여 최대 흡광도가 감소했고 파장 피크는 이동하였다. 이러한 변화는 트립토판의 사용 및 미사용하에 동일한 정도로 일어났다. 그러나, 다른 페노티아지늄 화합물의 그 어느 것도 이러한 퇴행을 나타내지 않았고 높은 광용량에서 광표백에 대해 안정한 상태로 유지되었다.
테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움의 항균 성질을 표 6에 제시한다.
감광제 세균/효모 성장기 세포 사멸 (대수 감소( CFU / ml )) 평균의 표준 오차
테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 P. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 대수 증식기 3.88 0.27
증식 정지기 1.28 0.22
S. 아우레우스 (S. aureus) 대수 증식기 4.21 0.22
증식 정지기 3.17 0.04
MRSA 대수 증식기 3.80 0.34
증식 정지기 1.85 0.16
C. 알비칸스 (C. albicans) 대수 증식기 3.61 0.36
표 6 10μM 감광제와의 인큐베이션 및 플루언스율 3.2J/㎠에서 665nm 레이저 광에 의한 조명 후의 대수 증식기 및 증식 정지기에서의 세균 및 효모의 광비동화.
상기 표의 데이타는 10μM 감광제와 함께 인큐베이션되고, 플루언스율 3.2J/㎠로 10분 동안 665nm 레이저를 사용하여 조명을 가한 세균 또는 효모에서의 대수 감소(CFU/ml)를 나타낸다.
페노티아지늄 매개된 PDT에 대한 세균의 감수성은 세균이 그램-양성인지 그램-음성인지에 따라 달라질 수 있다. 그램-양성 세균(S. 아우레우스(S. aureus), MRSA)은 두께가 약 25nm인 고도로 가교 결합된 펩티도글리칸 세포벽을 갖는다. 그램 음성 세균(E. 콜라이(E. coli), P. 아에루기노사(P. aeruginosa))는 더욱 얇은 5nm의 세포벽을 갖고 유일한 리포폴리사카라이드 외막을 갖는다. 외막의 존재를 통해 그램 음성 세균은 다수의 항균제에 대한 내성을 증가시킨다.
조명을 가한 후, 테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 화합물은 그램 음성(E. 콜라이(E. coli), P. 아에루기노사(P. aeruginosa)) 및 그램 양성 세균(S. 아우레우스(S. aureus), MRSA) 둘 모두의 대수 증식기에 대하여 > 3 대수 감소(CFU/ml)시켰다.
다수의 항생제는 증식 정지기에서 세균에 대하여 낮은 활성을 갖는다. 2개의 증식기에서 세균은 생리학적으로 형태학적으로 상이하다. 증식 정지기 세포는 덜 활성이고 환경 스트레스에 대하여 더욱 내성을 나타내고, 따라서, 페노티아지늄 매개된 PDT에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 상기 표는 테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 화합물의 효능이 대수 증식기 세포와 비교하여 증식 정지기 세포에 대하여 단지 미세하게 감소되었음을 제시하고 있다.
S. 아우레우스(S. aureus)의 MRSA, 항생제 내성 균주가 원내 감염의 주요 원인이다. MRSA 및 S. 아우레우스(S. aureus)는 테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 화합물 매개 항미생물 PDT에 대하여 동일하게 감수성이다. 테트라-n-펜틸-3,7-디아미노페노티아진-5-이움 화합물을 사용할 때 대수 증식기의 MRSA에 대하여 3.80 log10CFU/ml으로 대수 감소하였다.
Ames 시험
GC 및 AT 부위 둘 모두에서 염기쌍 치환 돌연변이원이 검출된 S. 티피머리움(S. typhimurium) 혼합 균주(TA7001, TA7002, TA7003, TA7004, TA7005 및 TA7006), 및 프레임쉬프트 돌연변이원이 검출된 균주 TA98(Gee et al, Proc Natl Acad Sci, 91, 11606-11610,1994)에서 Ames 시험을 수행하였다(Discovery Partners International로부터의 키트 사용). 2회의 세포 분열 동안 충분한 히스티딘을 포함하는 배지중 약 107개의 세균을 6개의 시험 약제 농축물, 용매 대조군 및 양성 대조군과 함께 90분 동안 250rpm으로 37℃에서 인큐베이션(3회)시켰다. 명조건 및 암조건 둘 모두에서, 대사를 활성화 및 활성화시키지 않고, S9 래트 간 추출물(4.5%)을 사용하여 인큐베이션을 수행하였다. 광원은 7개의 실배니아 그롤룩스(Sylvania Grolux) 30W 광 튜브 뱅크(bank)였다. 독성 농도인 최대 농도(즉, 프리스크린에서 육안으로 표시되는 바 세포수를 감소시키는 농도) 또는 최대 가용 농도를 갖는 시험 약제의 2배 희석액 시리즈를 사용하였다. S9의 부재하에서 양성 대조군은 4-니트로퀴놀린-N-옥사이드(500ng/ml) 및 2-니트로플루오렌(2㎍/ml)의 혼합물이었다. S9 존재하의 양성 대조군은 2-아미노안트라센(10㎍/ml)이었다. 90분 동안 인큐베이션시킨 후, 히스티딘이 결여된 pH 지시 배지로 세균을 희석시키고 384개의 웰 플레이트로 이동시켜 농도당 48개의 웰을 3중으로 수득하였다. 플레이트를 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 양성 웰(his+ 역돌연변이주가 pH를 감소시켜 보라색으로부터 황색으로 변색되는 웰)을 계수하였다. 결과는 48개당 양성 웰(평균± SD)로서 나타났다. 양성 반응은 짝이 없는 양측 스튜던트 t-시험(unpaired two-tailed Student's t-test)을 사용하여 평가된 통계학적 유의성으로, 하나 이상의 시험 약제 농도에서 음성 대조군과 비교하여 양성 웰 갯수의 현저한 증가 및 양성 웰 갯수의 농도 관련 증가로서 정의하였다. 반응 범위는 최적 시험 약제 농도에서 배경 돌연변이의 배수(fold) 증가를 산출하여 평가하였다(< 10 의 배수 증가는 약한 양성 반응으로 분류하였다).
혼합 균주에서, 모든 시험 화합물은 4개의 모든 조건(±빛, ±S9)에서 음성이었다. 균주 TA98에서, 모든 시험 화합물은 S9 부재하에서(±빛) 음성이었다. S9 존재하에서(±빛) 일부 화합물은 균주 TA98에서 양성 반응을 보였고, 이는 프레 임쉬프트 돌연변이원(삽입제(intercalating agent))으로 대사적으로 활성화된다는 것을 제시한다. 균주 TA98(+S9, -빛)의 결과를 상기 표5에 나타내었다.
폴리머내로의 봉입 또는 폴리머 표면과의 결합 또는 그 상에서의 흡착에 적절한 화학식(I)의 화합물
(a) 폴리머내로의 봉입
일례
0.01g의 화학식(Ⅴ)의 화합물, 예로서 3,7-(N,N-테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움을 디클로로메탄(10㎤)중 셀룰로오스 트리아세테이트(0.5g)의 투명한 용액에 첨가하고 화합물이 완전히 용해될 때까지 교반하는 것으로 설명될 수 있다. 유리 플레이트상에 용액을 캐스팅하고 서서히 건조시켜 투명한 필름을 수득하였다. 필름은 광노출시 전형적인 단일 산소 발생 특성을 나타내었고, 예를 들면 필름을 포함하는 톨루엔중 테트라페닐사이클로펜타디에논(특징적인 단일 산소 검출기)의 통기의(aerated) 적색 용액은 40W 텅스텐 필라멘트 램프로부터의 광노출에 신속하게 표백되었다. 필름의 부재하에서 동일한 기간 동안 조사하였을 때 동일한 용액은 표백을 나타내지 않았다.
(b) 폴리머상의 흡착성
하기 반응 도식에 따라 제조될 수 있는 페노티아지늄 화합물(Ia)에 의해 설명될 수 있다:
Figure 112006037310880-PCT00009
상기 식에서, 두개의 R 그룹 모두 n-펜틸이다.
본 화합물은 극도로 염기성이고 묽은 산중에서 용이하게 수소화되어 하기의 (IIa)을 제공하며, 이는 폴리머 표면, 예로서 폴리아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레탄상에 강력하게 흡착될 수 있고, 물 또는 용매에 의한 제거에 강력하게 영향을 받지 않을 수 있다. 대안적으로, (Ia)는 산성 표면상에 직접 흡착되어 직접 그에 상응하는 양이온 염을 제공할 수 있다.
Figure 112006037310880-PCT00010
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Claims (17)

  1. 미생물 감염 예방을 위한 항미생물제로서 사용되는 하기 화학식(I)의 페노티아지늄 화합물:
    Figure 112006037310880-PCT00011
    상기 식에서,
    R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 임의로 치환된 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화수소 그룹이거나;
    R1 및 R2 또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하고;
    XP -는 카운터음이온이고;
    P는 1, 2, 또는 3이다.
  2. 항바이러스제로서 사용되는 화학식(Ⅱ)의 페노티아지늄 화합물로서, 상기 화학식(Ⅱ)의 화합물이 제 1항의 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만, R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로, 임의로 치환된 선형, 분지형 또는 사이클릭 탄화 수소 그룹이거나;
    R1 및 R2 또는 R3 및 R4는 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하고;
    XP -는 카운터음이온이고;
    P는 1, 2, 또는 3인 화학식(Ⅱ)의 페노티아지늄 화합물.
  3. 미생물 감염의 치료에서 항미생물제로서 사용되는 화학식(Ⅲ)의 페노티아지늄 화합물로서, 상기 화학식(Ⅲ)의 화합물이 제 1항의 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
    i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7 -12-알킬이다);
    ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
    iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있으며, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않다);
    iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
    v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1 -12-알킬로부터 선택되고, R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하는 화학식(Ⅲ)의 페노티아지늄 화합물.
  4. 약제로서 사용되거나 항암제로서 사용되는 화학식(Ⅳ)의 페노티아지늄 화합물로서, 상기 화학식(Ⅳ)의 화합물이 제 1항의 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
    i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7 -12-알킬이다);
    ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
    iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않으며, R1 및 R2가 둘 모두 HO(CH2)2-이고, R3 및 R4가 둘 모두 n-부 틸 또는 n-펜틸인 화합물은 제외된다);
    iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
    v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1 -12-알킬로부터 선택되고, R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하며(여기서, R1 및 R2가 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 모르폴리노 환을 형성하고 R3 및 R4가 둘 모두 n-부틸인 화합물은 제외된다);
    XP -는 카운터음이온이고;
    P는 1, 2, 또는 3인 화학식(Ⅳ)의 페노티아지늄 화합물.
  5. 화학식(Ⅴ)의 페노티아지늄 화합물로서, 상기 화학식(Ⅴ)의 화합물이 제 1항의 화학식(I)의 화합물과 동일한 구조식을 갖지만,
    i) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(단, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 C7 -12-알킬이다);
    ii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1, R2, R3 및 R4중 하나 이상은 분지쇄 또는 사이클릭이다);
    iii) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고 R3 및 R4는 동일하거나 상이할 수 있고, 단, R1 및 R2중 하나 이상은 R3 및 R4중 하나 이상과 동일하지 않으며, R1 및 R2가 둘 모두 HO(CH2)2-이고, R3 및 R4가 둘 모두 n-부틸 또는 n-펜틸인 화합물은 제외된다);
    iv) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 C1 -12-알킬로부터 선택되거나(여기서, R1 및 R2가 상이하거나, R3 및 R4가 상이하다);
    v) R1, R2, R3 및 R4는 각각 독립적으로 C1 -12-알킬로부터 선택되고, R1 및 R2, 또는 R3 및 R4중 하나 이상은 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 임의로 치환된 5-원, 6-원 또는 7-원 환을 형성하며(여기서, R1 및 R2가 이들이 결합되어 있는 N 원자와 함께 모르폴리노 환을 형성하고 R3 및 R4 둘 모두가 n-부틸인 화합물은 제외된다);
    XP -는 카운터음이온이고;
    P는 1, 2, 또는 3인 화학식(Ⅴ)의 페노티아지늄 화합물.
  6. 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 화학식(V)의 화합물을 포함하는 조성물.
  7. 제 4항에 정의된 바와 같은 화학식(IV)의 화합물의 약제로서의 용도.
  8. 제 1항 내지 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 PDT제 또는 광진단제로서의 용도.
  9. 제 1항 내지 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 수의학적 적용에서 PDT용 감광 약물로서의 용도.
  10. 치료법이 원치 않는 조직 또는 세포의 제거, 불활성화, 또는 사멸을 필요로 하는 질환의 PDT용 감광 약물로서의 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 용도.
  11. 미생물 감염의 예방에서, 또는 항바이러스제로서 사용되는 하기 화합물의 용도:
    3,7-(테트라-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3,7-(테트라-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3,7-(테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3,7-(테트라-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-에틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움;
    3,7-디(피페리디노)-페노티아진-5-이움;
    3-(2-에틸피페리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(2-메틸피롤리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-모르폴리노-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디메톡시에틸아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움; 및 3,7-(테트라-벤질아미노)-페노티아진-5-이움.
  12. 표면 및 유체의 일반 멸균을 위한 항균제, 항진균제 및 항바이러스제를 포함하는 광활성화된 항미생물제로서의 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(V)의 화합물의 용도.
  13. 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(V)의 화합물 및 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물.
  14. 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(V)의 화합물 및 클로로트리아진 유도체 사이의 반응에 의해 형성된 화합물.
  15. 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(V)의 화합물을 표면 또는 유체와 접촉시키거나 그에 적용시키고 빛에 의해 상기 화합물을 활성화시키는 것을 포함하는, 표면 또는 유체를 멸균시키기 위한 화학식(V)의 화합물의 용도.
  16. 제 1항 내지 제 5항에 정의된 바와 같은 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나, 또는 화학식(I) 내지 (V)의 화합물중 어느 하나와 폴리머 사이에 형성된 컨쥬게이트 또는 복합물에 조명을 가하며 유체를 상기 화합물 또는 컨쥬게이트 또는 복합물과 접촉시키는, 유체를 멸균시키기 위한 화학식(I) 내지 (V)의 화합물의 용도.
  17. 하기 부분:
    3,7-(N,N-테트라-이소-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3,7-(N,N-테트라-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-에틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-펜틸아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-헥실아미노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-n-부틸아미노)-7-(N,N-디-이소-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디-메틸아미노)-7-(N,N-디-n-옥틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-((N-에틸-N-사이클로헥실)아미노)-7((-N-에틸)-N-사이클로헥실)아미노-페노티아진-5-이움;
    3,7 디-(피페리디노)-페노티아진-5-이움;
    3-(2-에틸피페리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(2-메틸피롤리디노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-프로필아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(모르폴리노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디에탄올아미노)-7-(N,N-디-n-펜틸아미노)-페노티아진-5-이움;
    3-(N,N-디메톡시에틸아미노)-7-(N,N-디-n-부틸아미노)-페노티아진-5-이움; 및 3,7-(N,N-테트라-벤질아미노)-페노티아진-5-이움.
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