JP2004512312A - 微生物学的な殺菌およびターゲッテッドアポトーシスのための増強剤 - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の背景】
【0002】
【技術の分野】
本発明は、医学領域における病原生物(disease organism)および 悪性細胞の殺傷、並びに、特に既知の抗菌(antimicrobial), 殺菌(disinfection) および 抗新生物(antineoplastic)に関する薬剤(agents)の活性を大きく高める薬剤に関する。
【0003】
【従来技術の記載】
様々な化学物質剤を、細菌 および ウイルスなどの感染媒介生物の殺傷に、さもなければそれらの生育を制限することに使用できることが以前から知られている。同様に、毒性化学物質が、癌細胞などの疾病細胞を殺傷できることも知られている。最初の殺菌物質の多くは、微生物病原説が流布した時代の初期にリスターにより使用された「石炭酸」 (フェノール)などの、活性がある、というよりむしろ腐食性(caustic)の化学物質であった。先の世紀において、ペニシリンなどの生物由来の抗感染剤が、発見され、そして広く活用された。感染症を治療するために使用される抗生物質薬は、増加し、第二次世界大戦後に先進国で自由に使用された。これらの薬は、病気を治療するためのみならず、大抵は低水準の「工場畜産場(factory farm)」条件で飼育される家畜の生育の増強を得るために広く使用される。このような種類の過剰使用および患者による誤用の結果として、多くの新規の抗生物質耐性生物が進化した。製薬会社および研究者は、これらの耐性病原生物に対抗する新規化合物を熱心に探索している。しかしながら、彼等の研究の多くは、これらの生物に作用する単一の化合物もしくは化合物の併用療法の発見を目的としている。また、早期の抗新生物剤は、一般に細胞毒物であった。後の抗癌剤は、大抵は核酸複製を阻止するか、または紡錘糸形成を阻害するかの何れかの様式で細胞分裂の機構を攻撃するものである。いくつかの抗癌剤は、感受性細胞のプログラム細胞死 (アポトーシス)を促進することにより実際に機能することがこれまで示されている。
【0004】
抗生物質の併用療法は、「Combination Antibiotic Therapy in the Compromised Host”, edited by J. Klastersky and MJ Staquet, New York, Raven Press, 1982」という本で示されているように以前から存在している。併用療法のより最近の別の研究は、フルオロキノロン(fluoroquinolones)(Meyer, RD, J. Antimicrob. Chemother., 1991,28,623)に関してなされた研究である。併用療法の一般観念は、相乗的な薬物併用を開発すること、或いは既知の抗生物質またはある種の他の殺菌剤もしくは抗感染剤の活性を何らかの形で増強することである。多くの事例で併用療法が耐性病原生物を打ち負かす方法として求められた。例えば、ペニシリン(最初に広く使用された抗生物質)は、耐性生物のためにその有用性の多くを現在失っている。ペニシリン耐性の一形態は、病原生物によるペニシリンを破壊する酵素(ペニシリナーゼ) の産生に関連するものである。従って、併用療法の一形式は、ペニシリナーゼを阻害する化合物とペニシリンとを併用することである。このアプローチは、ペニシリンに対する耐性生物の感受性を多大に復活させる。
【0005】
抗生物質は、大抵は細菌もしくは真菌に由来する天然の生物学的な化合物である。我々の薬物の多くは、植物由来である。従って、多くの研究が、ハーブ、果物抽出物および植物由来の他の物質の抗菌性質を研究する分野において現在行われていることは驚くことではない。会社および研究者は、主に植物性素材(plant materials)の抽出物単独の有効性、または植物性素材抽出物の特定の精製分子の有効性を研究している。Walker等による一連の特許(合衆国特許番号 5,474,774, 5,525,341, 5,646,178, および 5,650,432) は、抗菌物として使用する特定の化合物をクランベリーから単離および精製したことを記載している。特に、これらの薬剤が、尿道の上皮細胞への細菌の接着を妨害することが示された。本発明者は、クランベリーおよび他の植物性素材から抗菌性の有色化合物(colored compounds)を精製した。これらの化合物は、合衆国特許番号6,093,401に記載されているような静菌性(bacteriostatic)に加えて殺菌性(bactericidal)および殺ウイルス性(virucidal)の活性を実際に有している。
【0006】
本発明者は、血液および血液製剤の殺菌に以前から興味をもっていた。このような興味から、抗菌植物生産物に関する興味が生じた。血液の分別および血液製剤(blood products)の生産における長年の経験から、本発明者は、血液 および 血液製剤における抗凝固剤としての様々な 化学物質の使用に非常に精通していた。一般的な抗凝固剤は、EDTA, ヘパリン, シュウ酸, クエン酸およびそれらの塩である。それらのうちヘパリンを除く全ては、カルシウムイオンのレベルを減少させることにより主に機能する。発明者は血液血漿を殺菌する実験において、抗凝固剤として使用するクエン酸 (実際はクエン酸ナトリウム)をうっかり除いてしまい、結果として前記血漿の沈殿 (凝固)が生じた。余分なクエン酸を追加することでこの問題を解決する試みがなされた。これによって、クエン酸の予期しなかった特性の発見に至り、これが本発明の本質を形成するものである。
【0007】
輸血および他の医学療法に使用される血液 および 血液製剤の殺菌に関して差し迫った必要性があることを理解すべきである。まず第一に、採取した血液は、血液提供者の皮膚に常在する細菌で事実上は常に汚染される。献血に使用される針は、それらの生物を拾い上げ、献血した血液にそれらを混入させる。特に、細菌生育のために現在は耐用期間(useful life)が5日間に限定される濃縮血小板(platelet concentrates)において、これらの細菌は問題を起すが、その濃縮血小板の生物学的な耐用期間は少なくとも数日の付加的期間を有している。現在は献血の供給が不足しており、濃縮血小板の期限が早く切れてしまうことは、特に問題である。
【0008】
殺菌の別の理由は、血液の安全性に関係する多くの人々が想起すること、即ち血液から伝播する病気に関連する理由である。血液提供者がウイルスもしくは他の病原菌に感染している場合、感染が輸血または感染血液から作出された血液製剤の投与を介して広がる可能性がある。現在、界面活性剤に基ずく処理(本発明者による)が、血液血漿に存在する多くのウイルスの不活性化に使用されている。この処理は、血漿 および その血漿から作出された血液製剤をより安全なものとする。しかしながら、 界面活性剤は、全血液に対して使用することができない、なぜならそれらは血球を損傷もしくは破壊するからである。従って、全血液およびその細胞分画を殺菌する方法が必要とされている。更に、現行の界面活性剤処理は、全ての危険な血液伝播ウイルスを不活性化しない。従って、血漿の殺菌を改良する差し迫った必要性も存在する。
【0009】
本発明者は、抗凝固において通常使用されるよりも高いレベルのクエン酸塩の増加濃度が、血液および血液画分における細菌および細菌生育の顕著な減少を生じることを発見した。更に、 クエン酸塩は、ヨウ素とクランベリーブドウなどに由来する天然植物生産物とを含む広範囲の抗生物質、 抗菌、殺菌、および抗新生物剤と併用した際に予期しなかった相乗効果を示す。クエン酸塩は、歯の洗浄剤に使用されており、また抗凝固剤および食物、医薬および洗浄用物質の緩衝剤として広く使用されている。しかしながら、クエン酸塩の抗菌相乗効果は、これまで報告されていない。
【0010】
【発明の概要】
単純カルボン酸、特にクエン酸などのジカルボン酸が、広範囲の殺菌剤 および/または抗生物質剤の抗菌力を増強するという予期しなかった能力を示す。1%程度のクエン酸塩は、抗生物質耐性株を含む広範囲の細菌種を殺傷または阻害する抗生物質の能力を大いに増強する。クエン酸塩 単独は、濃縮血小板および赤血球懸濁液中の細菌生育の阻止に効果的である。クエン酸塩の効果的濃度は、血球に対し、たとえ損傷を与えるとしても軽微な損傷を生じる程度である。抗生物質の効力を増強することに加えて、クエン酸塩は、クリスタル・バイオレット(crystal violet)およびメチレン・ブルー(methylene blue)などの殺菌有機染料(disinfectant organic dyes)の抗菌特性をも増強する。加えて、クエン酸塩は、植物由来のポリフェノールの抗菌特性を増強する。ヨウ素に基づく殺菌剤も、蛋白質変性を増強することなしに増強される。この増強は、抗新生物剤にまでさえも適用される。クエン酸塩の添加は、抗癌薬物の活性を増大させる。この現象は、異常細胞の感受性が皮質ステロイドに対して著しく増強しているリンパ系癌(lymphoid cancers)において、特に顕著である。
【0011】
【発明の詳細記述】
以下の記載は、如何なる当業者も本発明を作出して使用できるように提供され、自身の発明を実施している発明者が意図する最良の形態が記載される。しかしながら、様々な本発明の修飾が残っていることは当業者に明白である。なぜなら抗生物質、 植物天然産物、殺菌化学物質および抗新生物剤の抗菌効果を大きく増強する方法を提供する本発明の一般的な原理が、本明細書中にに定義されるからである。
【0012】
[血小板および赤血球におけるクエン酸塩効果]
血小板に富んだ血漿の2つの50mlのアリクウォットを、遠心分離で調製した。サンプルの1つは、重量で2%クエン酸にした。上記に説明したように、ヒト濃縮血小板は、通常ヒトの皮膚の細菌で汚染される。これらの細菌は、たとえ濃縮血小板が低温度に維持されたとしても生育する。かかる細菌生育は、これらの血小板調製物の耐用期間(useful life)を著しく短くする。この実験において、溶液はローテーター上で室温でインキュベーションされた。かかる条件は、血小板機能の保存に理想的であるが、細菌生育にも最適である。サンプルを各日採取し、血小板の状態を決定するためにカウントした。これらのレベルのクエン酸塩が、細菌を殺傷または阻害するのに非常に効果的であったことは他の実験において既に決定されていた。問題は、クエン酸塩が血小板に害を与えるかどうかであった。
【0013】
【表1】
これらの結果は、血小板が2% クエン酸塩に暴露後に明らかな損傷を呈さないことを示している。血小板カウントは、クエン酸塩の有無の何れでもほぼ同様であるように思われる。時間が経過すると、血小板の数は徐々に減少する。しかしながら、その減少は、クエン酸塩の存在下で遅延し、この薬剤が実際に血小板を安定化または保存するだろうことを示唆している。他の研究は、血小板が少なくとも7日間十分な機能を維持するが、溶液は過剰な細菌生育のために5日間を越えては使用されないことを示している。
【0014】
同様に、 2% クエン酸塩は、赤血球(RBCs)を損傷しないようには思われない。通常、赤血球(red cells)は、添加された薬剤に非常に感受性がある。赤血球膜に対する損傷は、溶血(hemolysis、細胞からのヘモグロビンの漏出)またはカリウム(K+)もしくは乳酸脱水素酵素 (LDH)の増加(その双方は損傷赤血球からの漏出物)として観察可能である。この実験において、クエン酸塩 (2%)の添加もしくは非添加の何れかの血液サンプルを、7日間の期間で抽出した。
【0015】
【表2】
これらの結果は、増大したクエン酸塩が、赤血球に対して非常に軽微な効果を有するだろうことを示している(「増大した」としているのは通常は0.5% クエン酸塩が、抗凝固剤として使用されるからである)。しかしながら、これは、赤血球の殺菌に試みられてきた多くの他の薬剤よりもより害が少ないものである。従って、クエン酸塩は、赤血球の損傷の増大を伴う他の殺菌用の薬剤と併用できる。重要なポイントは、添加したクエン酸塩が、陰イオン交換物質で容易に減少または除去され得ることである。
【0016】
[クエン酸塩および抗生物質]
細菌学的なブロス(broth)における5% および 8% (W/V; weight by volume)クエン酸の効果を調査した。各々のケースにおいて、前記ブロスのpHは、もし必要であれば、NaOHで通常の生育範囲に調整した。生育量を、最少 (+) から最大(4+)までランク分けした。もし生育しなければ、その処理を「NG」とマークする。各ブロスサンプルに、バンコマイシン 耐性 Enterococcusを1x103 播種した。播種したブロスを、35℃で2時間インキュベーションし、そして生育培地にまいて、最適な生育条件下で一晩インキュベーションした。
【0017】
【表3】
これらの結果は、8% クエン酸塩または250 μg/ml バンコマイシン単独の何れかが、細菌生育の若干の阻害を生じることを示している。非耐性細菌の感染を完全に阻害するのに十分であろう、このバンコマイシンのレベルが選択された。クエン酸塩とバンコマイシンとの併用は、耐性細菌を完全に阻害する。これは、クエン酸塩とバンコマイシンの相乗効果が、細菌の耐性に打ち勝つのに十分であることを示している。
【0018】
クエン酸塩は、細菌/抗生物質の他の併用においても効果的である。以下の実験において、1x103 細胞/mlの肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)の懸濁液を、トリプシケース大豆ブロス(trypsicase soy broth)中に調製した。10mlのアリクウォットを、クエン酸塩 および/または 抗生物質で処理した。室温で2時間インキュベーション後、各処理の0.1mlサンプルを大豆トリプシケースブロス寒天上に塗布し、35℃で一晩インキュベートした。そしてプレートの細菌生育を採点した結果が以下である:
【表4】
これらの結果は、抗生物質とクエン酸塩効果が、単一の抗生物質と細菌種の併用を越えて拡大することを示している。追加実験 (データ示さず)は、野生型および抗生物質耐性型の双方の、多数の細菌の種および株に対する広範囲の抗生物質の活性を、クエン酸塩が増強することを示している。
【0019】
[抗菌色素のクエン酸塩増強]
様々な有機染料が抗菌特性を示すことが以前から知られている。近代の抗生物質の発見に先んじて、これらの化合物に関して多くの研究がなされた。クリスタル(ゲンチアン)バイオレットなどの「殺菌」染料のいくつかは、いまだ使用されている。私は、他の研究において、2つの殺菌染料の併用(即ち クリスタル・バイオレット プラス メチレン・ブルー)が広範囲の細菌の生育の阻止に特に効果的であることを見出している。私は、ブドウワインの熟成の間に沈殿するポリフェノール色素〔オリ(lees)と称される〕が、抗細菌特性を呈することも以前から見出している。以下の実験は、クエン酸塩の相乗的特性が、かかる抗菌色素(antimicrobial pigments)にまで拡大されるかどうかについて調べるために実施された。アスコルビン酸もこのような抗菌に関してある種の相乗的特性を示すだろうことについて、文献中にいくつかの示唆が存在する。それ故、 アスコルビン酸ナトリウムも試験した。
【0020】
メチレン・ブルー および クリスタル・バイオレット の等重量の水性溶液(各々0.0057%) を調製した。赤ワインのオリの水性懸濁液(0.25%) も調製した。クエン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸ナトリウムの何れかを1.5重量%までストック溶液から加えることにより、処理溶液を調製した。コントロール・アリクウォットは、クエン酸塩もアスコルビン酸塩も含有しないものを使用した。
【0021】
試験目的で各サンプルに、Escherichia coliまたはStaphylococcus epidermidisのうち何れかの1x104 細胞を播種した。次に、前記サンプルを、撹拌しながら室温で60分間インキュベーションした。インキュベーション期間の終了時に、前記サンプルをTSA 生育培地上に蒔き、そして35℃で一晩インキュベーションした。次に、前記プレートを、「生育なし」を示すNGおよび最高の生育(maximal growth)を示す4+によりコロニー数に関して採点した。
【0022】
【表5】
これらの結果は、染料混合物およびオリの双方とも顕著な抗細菌特性を呈したことを示している。染料またはオリの何れかが1.5% クエン酸ナトリウムと混合された場合、全ての細菌細胞が殺傷されるか、またはその更なる生育が阻止された。アスコルビン酸塩は、染料混合物の効果を高めるある種の能力を呈するが、オリに関しては明白な効果を有していない。
【0023】
[クエン酸塩とEDTAとの比較]
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid、
エチレンジアミン四酢酸) は、ある種の抗菌活性を有することが知られているカルシウム・キレーティング 抗凝固剤である。二酢酸ナトリウム(Sodium diacetate)は、既知の抗菌 および 抗凝固特性を有する、別のカルシウムキレーティング物質である。最適条件下で100μlの懸濁液 (潜在的には100細胞)と12時間インキュベーションする60分間前に、前記キレーティング剤を、ヒト血漿中でEscherichia coliまたはStaphylococcus epidermidisの1x103 細胞/mlの懸濁液と、60分間室温でインキュベーションすることにより比較した。ヒト血漿は、栄養に富んだ生育培養液を代表しており、多大な細菌生育が期待される。全ての添加された化合物は、重量パーセントとして表される。
【0024】
【表6】
これらの結果は、抗凝固に使用されるよりも更にかなり高い濃度でEDTA、シュウ酸ナトリウム および ヘパリンナトリウムが、限定的な抗細菌特性を呈することを示している。8%の高レベルで二酢酸ナトリウムは、完全にE. coliの生育を阻止する。8%でクエン酸ナトリウム および クエン酸の双方は、細菌生育を完全に阻止する。2%でクエン酸ナトリウムは、E. coliのかなりの阻害を生じる。このパーセンテージは、それでも抗凝固に使用される通常量の若干4倍であることに留意すべきである。EDTA、シュウ酸塩およびクエン酸塩の双方の抗凝固能力はカルシウムイオンをキレートするこれらの化合物の能力に関連するので、クエン酸塩の抗細菌効果が、そのカルシウムイオンへの効果、少なくともそのカルシウムイオンへの効果のみによるものではないことは明らかなようだ。クエン酸塩と同様に二酢酸塩(diacetate)は、分子ごとに複数のカルボン酸基を有する。
【0025】
[ポビドンヨードにおけるクエン酸塩効果]
細菌生育ブロス中に2%(重量)クエン酸3ナトリウムの50ml アリクウォットを調製し、そしてEscherichia coli (1x103 細胞/ml)を混合した。混合ブロスを、6つの8ml アリクウォットに分けた。クエン酸塩なしの混合ブロスの25ml アリクウォットを、コントロールとして使用した。コントロールアリクウォットを、3つの8mlサンプルに分けた。そのアリクウォットを室温でインキュベーションしている間、サンプルを、30分間, 6時間 および 24時間で採取した。ヨウ素サンプルに対し、400μlの10% ポピドンヨウ素 (PVP−I)を、サンプリングの5分前にサンプルに添加した。そのサンプルを、トリプシケース大豆寒天 (TSA)上に蒔き、計数の前に最適条件下で一晩生育させた。再調査のため、前記30分間 サンプルを30分間生育させた。その後、PVP−Iを適切なサンプルに添加し、プレーティングのため有形物質(material)を5分後に除去した。前記6時間 サンプルを、PVP−I添加の前に6時間生育させ、プレーティングした、 前記24時間 サンプルをPVP−I添加の前に24時間生育させた。
【0026】
【表7】
これらの結果は、クエン酸塩がPVP−Iの殺傷力を高めること、および/または、クエン酸塩の存在下で生育した細胞が弱くなり且つヨウ素に対してより感受性となることを示唆している。
【0027】
[ヨウ素に基づくウイルス不活性化におけるクエン酸塩効果]
以下の実験は、クエン酸塩効果の発見に至る最初のヨウ素実験の改良を示すものである。ヨウ素 不活性化方法は、長年の研究の結果である。一般観念は、ウイルスで汚染した溶液(ここではヒト血漿)のサンプルを、活性ヨウ素の供給源に暴露し、次に繊細な蛋白質に損傷がおよぶ前にそのヨウ素を除くことである。血漿の場合、蛋白質変性をチェックする目的で感受性の高い血液凝固酵素をモニターすることが可能である。開発された方法は、溶液にヨウ素を供給するヨウ素 含有樹脂、並びに前記ヨウ素 および如何なる生じたヨウ化物をも除去するためのヨウ素/ヨウ化物結合樹脂の使用を伴うものである。この関連の研究の驚くべき発展は、ヨウ素を供与する樹脂およびヨウ素/ヨウ化物を吸着する樹脂の混合カラムを介する反復した通過(passage)が、血液凝固酵素の活性を保持した状態での、ウイルスの不活性化に特に効果的であるということであった。この研究は現在の米国特許番号6.045,787であり、これは参照により本明細書中に援用される。
【0028】
本実験において、ヒト血漿の1500mlサンプルに、ブタパルボウイルス(PPV; Porcine Parvo Virus)を約 1X106粒子、およびウシウイルス性下痢ウイルス(BVDV; Bovine Viral Diarrhea Virus)を約5x105粒子混合した。次に前記血漿を8% クエン酸ナトリウムの濃度にした。
【0029】
次に前記血漿を、ヨウ素 および ヨウ素捕捉混合樹脂 (1: 8)の大カラムを介して4回循環した。各パス(通過)の後に、余剰のヨウ素 (I2) および ヨウ化物 (I−)を、ヨウ化物感受性電極(Orion Research Instruments)を使用して測定した。前記電極は、ヨウ化物濃度を直接読み取る。アスコルビン酸ナトリウムを、ヨウ素濃度を決定するため各サンプルに添加した。ヨウ化物の読み取りにおいて検出された如何なる増加も、アスコルビン酸塩による、ヨウ素のヨウ化物への還元を示すものであった。カラム内でヨウ素/ヨウ化物結合樹脂が大過剰であるため、たとえ存在するとしても多くのヨウ素またはヨウ化物が存在することは予想しなかった。
【0030】
【表8】
様々な ウイルスの濃度を、ウイルス終点アッセイ(VEPA)を使用して決定した。簡単に説明すると、試験するサンプルを、適切な細胞(即ち、特定のウイルスの宿主細胞)の単層(monolayer)上に蒔いた。インキュベーション期間後、ウイルスの存在をプラーク形成により決定した。各サンプルを、連続的な2倍希釈濃度範囲(a range of serial two−fold dilutions)で試験し、プラーク形成を呈する最大希釈を決定することができた。この希釈アッセイにより、ウイルス力価を公知の公式を使用して計算した。
【0031】
過去の研究で認められたように、前記カラム処理は前記ウイルスに対してある種の潜在的な損傷を生じさせた。細胞培養へのプレーティング24時間前まで前記サンプルを維持(holding)することにより、ウイルスの不活性化の増加を生じることが認められた。
【0032】
【表9】
これらの結果は、BVDVがPPVより幾分か感受性が高いことを示し、そして、もしサンプルを細胞培養にプレーティングする24時間前までインキュベーションするならば、両ウイルスの殺傷の増加が生じることを示している。クエン酸塩なしの初期の実験において、これらの非常に耐性であるウイルスを完全に殺傷するには少なくとも6回のパスを行い、且つ24時間インキュベーションする必要があった。また、ヨウ素/ヨウ化物捕捉に使用される樹脂も、クエン酸塩に対してある種の親和性を有するが、クエン酸塩はヨウ素/ヨウ化物の捕捉に干渉しないように思われる。全てのクエン酸塩部位(citrate sites)が初回のパスの間に飽和したように思われる。その後、ヨウ化物は、捕捉プロセスの間にクエン酸塩と単に交換される。
【0033】
上記実験を、2% クエン酸ナトリウム サンプルから8% クエン酸ナトリウム サンプルを添加した2000 ml 血漿 サンプルで繰り返した。また、VEPA 細胞アッセイにプレーティングする前、サンプルを48時間までインキュベーションした。
【0034】
ヨウ化物/ヨウ素測定の結果は、基本的に前と同様であった。
【0035】
【表10】
【0036】
【表11A】
【0037】
【表11B】
これらの結果は、8% クエン酸塩が、2% クエン酸塩と比べて劇的により効果的であることを示している。クエン酸塩 および ポビドンヨードの混合物が、恐らくヨウ素によるクエン酸塩の酸化からヨウ化物形成を生じることを鑑みると、このクエン酸塩の結果は他と比べて矛盾している。このことは、クエン酸塩がウイルスの蛋白質または核酸の代わりに酸化されることから、添加されたクエン酸塩がヨウ素殺菌のブロックを生じることを期待させる。1つの可能性は、酸化したクエン酸塩が、活性化した中間型化合物のある種のタイプを供給することである。該化合物は、ウイルスの成分と優先的に反応する。もしこのようなことであれば、この中間型は、核酸とのみ反応するはずである。なぜなら凝固酵素アッセイ(示さず)は、増大したクエン酸塩濃度が増大した蛋白質変性を生じないことを示しているからである。予備的な結果は、ヨウ素または他の殺菌剤の添加前にクエン酸塩とプレインキュベーションすることは利益があるだろうことを示している。
【0038】
[異常(癌)細胞へのクエン酸塩効果]
驚くべきことに、クエン酸塩増強効果は、癌細胞などの異常細胞を、殺傷または阻害する「殺菌」化合物にまで拡大適用される効果である。新生細胞(neoplastic cells)が、正常細胞と比べて代謝的差異を有することは長く仮定されてきた。これらの差異は、抗新生物(抗癌)薬物により利用されている。多くの抗癌薬は、悪性細胞の高い分裂指数(mitotic index)を利用する薬物であり、核酸 複製をブロックするか、または紡錘糸形成などの細胞分裂における必須のステップに干渉する薬物である。最近、ある種の悪性細胞が、幼弱段階において、「貼り付くstuck」ことが実証されている。細胞に成熟することを「強いる」ある種の誘導剤の適用は、プログラム細胞死 (アポトーシス)を誘導する。
【0039】
グルココルチコイド ホルモン(GC) は、「リンパ球溶解(lympholytic)」効果を有することが広く知られている。そのようなものとして、それらは、活性リンパ球の数を顕著に減少化することにより炎症 および 他の不適切な免疫応答(例えば、自己免疫)を制御するために頻繁に使用される。明らかにGCは、リンパ球系細胞に急速な細胞死を生じさせる。残念ながら、GCの慢性投与は、毒となりえる。リンパ球アポトーシスを、より低濃度のGC投与で達成することは多大なる有益性がある。
【0040】
実験を、新鮮な全血液の1単位を使用して実施した。前記血液を、10mlのアリクウォットに分け、そのうちのいくつかにクエン酸3ナトリウム (重量で1%)および デキサメタゾン(250または500 μg/mlの何れか)を添加した。前記サンプルを96時間インキュベーションし、副サンプルをGC添加後の2時間, 24時間, 48時間, および 96時間で採取した。
【0041】
前記副サンプルを、完全血液カウント(CBC;complete blood counts)および 白血球差異カウント(white cell differential counts)に供試した。早期のタイムポイントでトータル白血球カウント(WBC)は、副サンプルごとに少々変化しているようであった。しかしながら、前記白血球差異は、好中球と比較してリンパ球の明瞭な増加を2時間で示した。48時間までに、好中球の劇的な増加(実際には、好中球とリンパ球の比の増加)を示した。この変化は、96時間までになおさら著しいものとなり、この際まさに非常に少数のリンパ球が血液塗抹標本(blood smear)中に認められた。早期のタイムポイントでのリンパ球の明白な増加は、恐らく縮退するリンパ球(アポトーシスしている)が、多形核顆粒球 (好中球)と混同されたことによるものであった。
【0042】
コントロールの副サンプルは、4,500 細胞/μlのWBCを示した。好中球とリンパ球の大まかな比は、60/30であった。デキサメタゾンの高レベルにおいて、48時間でWBCの25%の低下が認められた。同時に好中球/リンパ球比は、80/20に変化した。0.6または1% クエン酸塩の何れかを添加することにより、WBCカウントは、低濃度のデキサメタゾンで30%減少した。比は、87/8に変化した。高濃度のデキサメタゾンによって、WBCは約0%に減少したが、比は90/5であった。目標は、できる限り少量のGCでリンパ球を、できる限り減少化させることであり、クエン酸の中等度濃度がGCの低濃度で低いリンパ球カウントを生じ得ることは明白である。
【0043】
リンパ系細胞(lymphoid cell)におけるクエン酸塩の効果は、標的として新生物性のリンパ系細胞株を使用した際になおさら著しい。この場合もやはり、クエン酸3ナトリウムの濃度は、0.6と1.0%(W/V; weight by volume)の間の濃度が使用された。この実験において、様々な細胞株のサンプルは、GC (デキサメタゾン)の存在または非存在下で培養される前に、2時間クエン酸塩に前暴露(pre−exposed)された。様々なクエン酸塩溶液は、pHを調整されおり、それらは全て中性pHを示した。培養細胞を、縮退したアポトーシス細胞の形質膜の内側表面を視覚化する蛍光標識 Annexin−Vと、核酸を視覚化するプロピディウムイオダイド(PI; propidium iodide)とを使用したフローサイトメトリーにより検査した。細胞生存度も、トリパンブルー染色後に血球計算板で決定した。また、上清を、死につつある細胞によって放出される乳酸脱水素酵素 (LDH)に関して解析した。細胞形態学も、ライト染色で処理された伝統的な塗抹標本で評価した。
【0044】
次のヒト 細胞株を実験プロトコールに供試した、即ち CEM, H9 および Jurkat (T−細胞)、Raji および WIL2−NS (B−細胞)、K562 (リンパ芽球性細胞)、U937 (組織球性の細胞) 並びに HL−60 (前骨髄球性の細胞)である。全ての細胞株は、事実上全ての細胞を殺傷するのに十分である8μg/mlのデキサメタゾンに非常に感受性があると判明した。しかしながら、4μgなどの低濃度のデキサメタゾンは、前記細胞に軽微な効果を示した。アポトーシスがフローサイトメトリーで確認され、トリパンブルー染色および ライト染色による形態学も、細胞の変性および死亡を検出した。LDH測定は、細胞死と相関していた。デキサメタゾンの効果用量は、500〜600 国際単位/mlのLDHを放出させた。0.6 から 1% クエン酸塩(pH変化を避けるように調整された溶液)での前処理は、ほんの4μg/ml デキサメタゾン(クエン酸塩なしの非効果濃度)により80%以上の顕著な殺傷を生じた。8 μg/mlのデキサメタゾンは600 国際単位/mlのLDHを放出するが、4μg/mlのデキサメタゾンは0.6% クエン酸3ナトリウムに前暴露された細胞を処理した際に800 国際単位/mlを越えるLDHを放出した。
【0045】
【表12】
【表13】
クエン酸塩は、新生細胞に対して増感(sensitizing)またはプライミングする効果を有しているように見える。クエン酸塩は、実際のGC処理の間に存在していなければならないということはない。正常細胞の生存度が比較的高く一時的なクエン酸塩への暴露により影響されないのに対し、新生細胞はクエン酸塩暴露後に増殖および生存度の減少を呈したことをも試験は示した。このことは、リンパ球性新生物の治療に使用されるGCおよび他の新生物剤を増強するクエン酸塩の使用の魅力的な可能性を提起する。正常細胞に顕著に影響することなく、薬物に対する新生細胞の感受性を増大する目的でクエン酸塩を使用し得るように思われる。
【0046】
全てのクエン酸塩効果を説明する統一経路があると想像することは魅惑的である。しかしながら、これが何であるかを理解することは非常に困難である。クエン酸は、酸化的代謝のトリカルボン酸経路の重要な構成物(part)である。一般的に、クエン酸塩が、急速に代謝されることは知られている。恐らく、細菌と共に過剰のクエン酸塩が存在と、その細菌を、特に抗生物質および殺菌染料に感受性にする、ある種の代謝的不均衡を生じさせる。また、大抵の細菌は、クエン酸塩などの代謝産物を取り込む活発な膜輸送系を有している。恐らく、クエン酸塩を取り込む同一の輸送プロセスは、抗生物質、染料または植物生産物(ワインポリフェノールのような)の細胞内への蓄積を生じる。このことから抗生物質耐性微生物におけるクエン酸塩効果が説明されるだろう。
【0047】
どんな機構であれ、カルボン酸効果は、薬物耐性感染の処理への恩恵(boon)となり、そして血小板などの血液画分の耐用期限を延長するはずである。抗生物質のクエン酸塩増強は静脈内で作用するであろうが、クエン酸塩のキレート効果と同様にクエン酸塩の急速な代謝が、この使用を不可能とするであろう。しかしながら、クエン酸塩は、不測の感染を阻止する透析処理への使用に理想的である。クエン酸塩増強は、抗感染剤の軟膏および他の局所投与における使用にも理想的である。抗生物質のクエン酸塩増強は、火傷患者のための抗細菌洗浄剤(antibacterial washes)として特に効果的であると証明されるはずである。血液 および 血液製剤などの生物製剤の場合、過剰なクエン酸塩はイオン交換により容易に除去でき、または、補足的なカルシウムをキレート化に対抗するために添加できる。混合ヨウ素/捕捉樹脂カラムとの組み合わせにおいて、クエン酸塩は、不安定な蛋白質に対して無視し得る程度に影響するが、混入したウイルスの破壊に劇的な改善をもたらす。クエン酸塩の添加に帰する増強した殺傷力は、プリオンおよび他のいまだ不可解な病原体の不活性化を可能にするように思われる。
【0048】
本発明は、「クエン酸塩」またはジカルボン酸に関して記載される。本発明の正確な機構は、いまだ理解されていない。その効果は、比較的効果のないように思われる酒石酸などの全てのジカルボン酸にまで拡大されないようだ。イソクエン酸などの他の類似するカルボン酸は調査中である。
【0049】
本願の特許請求の範囲に記載される請求項は、上記で具体的に説明および記載された発明、概念上の均等な発明、明らかに置換できる発明、および本発明の基本的な概念を実質上援用した発明をも含むと理解される。上記に記載された好適な態様の様々な適用および修正が、本発明の範囲から逸脱することなく設定されることを当業者は理解する。説明された態様は、例示の目的のみに記載されるものであり、本発明を限定するものではない。従って、本発明は、本願の特許請求の範囲の範囲内において、本明細書中に具体的に記載される事項以外においても実施できる。
Claims (18)
- 抗菌剤(antimicrobial agents)の有効性を増強する方法であって、前記抗菌剤と、クエン酸 および/または塩の一定量或いは1〜15重量%のクエン酸3ナトリウムと同等のクエン酸塩濃度を与えるクエン酸、とを混合する工程を含む方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記抗菌剤が、抗生物質, ポビドンヨード, ヨウ素, 植物由来のポリフェノール, および 殺菌有機染料からなる群から選択される方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記殺菌有機染料が、メチレン・ブルー および クリスタル・バイオレットからなる群から選択される方法。
- 濃縮血小板の耐用期限を延長し、且つその中の細菌の繁殖を阻止する方法であって、1〜15重量%のクエン酸3ナトリウム濃度と同等のクエン酸塩を、前記濃縮血小板に添加する工程を含む方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記クエン酸塩を除去する工程を更に含む方法。
- 請求項4に記載の方法であって、抗菌剤を前記濃縮血小板に添加する工程を更に含む方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記抗菌剤が、抗生物質, ポビドンヨード, ヨウ素, 植物由来のポリフェノール, および 殺菌有機染料からなる群から選択される方法。
- 請求項7に記載の方法であって、前記殺菌有機染料が、メチレン・ブルー および クリスタル・バイオレットからなる群から選択される方法。
- 赤血球を含有する溶液を殺菌する方法であって、1〜15重量%のクエン酸3ナトリウムと同等の濃度までのクエン酸塩を、前記溶液に添加する工程を含む方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記クエン酸塩を除去する工程を更に含む方法。
- 請求項9に記載の方法であって、抗菌剤を前記溶液に添加する工程を更に含む方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記抗菌剤が、抗生物質, ポビドンヨード, ヨウ素, 植物由来のポリフェノール, および 殺菌有機染料からなる群から選択される方法。
- 請求項12に記載の方法であって、前記殺菌有機染料が、メチレン・ブルー および クリスタル・バイオレットからなる群から選択される方法。
- 抗菌剤と前記抗菌剤の抗菌作用を増強させるのに十分なクエン酸塩濃度とを含む局所用製剤(topical preparation)。
- 請求項14に記載の製剤であって、前記抗菌剤が、抗生物質, ポビドンヨード, ヨウ素, 植物由来のポリフェノール, および 殺菌有機染料からなる群から選択される製剤。
- 請求項15に記載の製剤であって、前記殺菌有機染料が、メチレン・ブルー および クリスタル・バイオレットからなる群から選択される製剤。
- リンパ球性細胞(lymphocytic cells)のアポトーシスを増大させる方法であって、前記細胞を、少なくとも0.6重量%のクエン酸3ナトリウムと同等のクエン酸塩濃度に暴露する工程を含む方法。
- 請求項17に記載の方法であって、前記細胞を、グルココルチコイドホルモンに暴露する工程を更に含む方法。
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