JP2001524081A - 生きた生物学的物質の保存用組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物学的活性の損失を最小としながら、器官、組織、細胞を長期間にわたり保存可能とする、生きた生物学的物質保存用の溶液と方法を提供する。本発明の溶液は、保存すべき生物学的物質と実質的に等張であり、かつ、リン酸二水素塩、重炭酸塩、硝酸塩、重硫酸塩およびヨウ化物を実質的に含まない。多くの生きた生物学的物質の保存のために、本発明の溶液は、好ましくは、硫酸カルシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択されるカルシウム塩を含有する。一つの好ましい実施態様において、本発明の溶液はラフィノース、酸化トリメチルアミン、クエン酸ナトリウムおよび塩化カルシウムを含む。別の好ましい実施態様において、本発明の溶液は酸化トリメチルアミン、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 生きた生物学的物質の保存用組成物およびその使用方法発明の技術分野 本発明は生きた生物学的物質の保存分野に関し、特に哺乳類、海洋生物および 植物からの生きた器官、組織および細胞の保存用の組成物とその方法に関する。発明の背景 生物学的物質の保存方法は、器官、組織および細胞等の生きた物質が採取され 、使用前のある期間インビトロで保存される、多くの臨床的および獣医学的用途 に用いられる。そのような用途の例として、器官の保存および移植、同原および 異質遺伝学的な骨髄移植、全血移植、血小板移植、胚の転移、人工授精、インビ トロ受精、皮膚移植および診断目的の組織生検物の保存が挙げられる。保存技術 は、病院、工業界、大学および他の研究実験室での実験利用のための細胞系の保 存にも重要である。 細胞性の生物学的物質の保存に現在用いられている方法として、塩溶液系の培 地への浸漬、凍結温度よりも僅かに高い温度での保存、約−８０℃の温度での保 存；および液体窒素中、約−１９６℃の温度での保存が挙げられる。これらすべ ての技術の目標は、通常の生物学的構造と機能の損失を最小としながら、生きた 生物学的物質を長期間にわたって保存することである。 ０℃未満の温度での心臓、腎臓等の器官の保存は、多くの細胞の損失をしばし ばもたらし、該器官の生存能力がそれに対応して減少 する。したがって、そのような複雑な生物学的物質は典型的には、凍結温度より も高い温度、典型的には４℃程度で塩溶液系の水性培地で保存される。塩溶液系 培地は、典型的には、細胞外環境に似せるように、ナトリウム、カリウム、カル シウム、マグネシウム、塩化物、リン酸塩および重炭酸塩等の低濃度の多様な無 機イオンを加えることにより改良された等張塩溶液（０．１５４Ｍの塩化ナトリ ウム）からなる。グルコース、ラクトース、アミノ酸およびビタミン等の少量の 化合物がしばしば代謝物質として加えられる。生物学的物質の保存に用いられる すべての塩溶液系培地は高い電導度を有する。生物学的物質の保存に現在用いら れている培地の例として、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、Ｍ−２(マウス用ヘ ペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝培養培地)、リンガー液およびクレブス重炭酸塩緩衝培 地が挙げられる。 塩溶液系培地に保存された生物学的物質の生存能力は時間とともに徐々に減少 する。生存能力の損失は、毒性のある排出物の蓄積、並びに継続する代謝活性に より引き起こされる代謝物および他の支持化合物の損失によるものと考えられる 。従来の塩溶液系培地を用いると、生きた組織は比較的短い期間しかうまく保存 することができない。その上限期間まで保存した器官の微細構造を調べると、心 筋のミトコンドリア等の分解が見られ、いったん置き換わった器官の能力が相当 に損なわれる。例えば、ヒトの心臓は、ドナーからの摘出後、冷イオン性溶液に わずかに約５時間しか保存することができず、そのため、摘出した心臓を輸送で きる距離が著しく制限される。 生物学的物質を保存するために凍結技術を用いる場合、凍結中の 氷結晶の形成により細胞に対して引き起こされる損傷の量を制限するために、高 濃度（約１０容量％）の凍結保護剤、例えばグリセロール、ジメチルスルホキシ ド(ＤＭＳＯ)、グリコール類またはプロパンジオールが凍結前の物質にしばしば 導入される。凍結保護剤の選択および濃度、凍結保護剤の添加の時間の経過およ び凍結保護剤か導入される温度は、すべて保存手順の成功に重要な役割を果たす 。さらに、細胞の損失を減少させるために、凍結の速度と時間経過、解凍の速度 と時間経過および室温もしくは体温までの加温等の変数、並びに組織物中での凍 結保護剤溶液の生理学的塩溶液への置換を注意深く調節することが臨界的に重要 である。凍結技術で必要とされる多数の処理工程は細胞の損失を高める。生物学 的物質の保存に現在用いられている凍結技術は、技術的に損傷を与えるものであ ると同時に時間がかかるものである。凍結によって生物学的物質を保存する他の 欠点として、細胞の生存能力の減少、再注入の際に患者に対する凍結保護剤の潜 在的な毒性効果、および処理と保存の高い費用が挙げられる。 例として、通常、凍結保護剤としてＤＭＳＯの添加を含む凍結保存が、例えば 高用量の化学療法または放射線療法後の、移植法での使用に集めた骨髄を保存す るために現在用いられている。同原移植体において、骨髄は数週間から数ヶ月に わたる長い期間保存しなければならない。しかし、この技術は、斡細胞回収率で ５０％以下という低いレベルまでの顕著な減少をもたらす。この技術のさらに別 の欠点は、多様な成熟細胞に対する顕著な損傷が起こりえることであり、それに より凍結前にこれらの細胞をさらに除く処理を必要とすることである。最後に、 ＤＭＳ〇の使用は、保存骨髄の再注入の 際に、患者に対して中程度から激しい程度までの毒性をもたらす。 よって、当分野において、生きた生物学的物質の保存のための改良された方法 に対する必要性が依然として存在する。要約 本発明は、生物学的活性の損失を最小としながら、長期間にわたって器官、組 織、細胞などの物質の保存を可能とする、生きた生物学的物質の保存用の組成物 と方法を提供する。 一つの態様において、本発明は、少なくとも約３３５の分子量および少なくと も約０．３Ｍの水中での溶解度を有し、正味の電荷を持たない第一の中性溶質、 並びに約２００未満の分子量を有する第二の中性溶質を含んでなり、該第二の中 性溶質は親水性部分および疎水性部分を両方ともさらに有するものである、生き た生物学的物質の生存能力（生育性）を保存する溶液を提供する。 本発明の保存溶液は１種類以上のイオンを含有してもよい。カルシウム塩、好 ましくはＣａＳＯ₄またはＣａＣｌ₂が、ほとんどの生物学的物質の保存のための 溶液中、約２ｍＭ未満の濃度で用いられる。さらに別のイオンを、アニオンまた はカチオンのホフマイスター系列でのそれらの特性位置にしたがって選択してよ い。具体的には、タンパク質を安定化するホフマイスター系列の両末端からのイ オンを本発明の保存溶液に含有させてよい。適当なイオンおよび選択の基準は後 で詳細に説明する。 好ましい一実施態様において、第一の中性溶質は、好ましくはラフィノース、 トレハロース、スクロース、ラクトースおよびそれらの類似体からなる群から選 択される二糖または三糖のいずれかである。該類似体は天然または合成のいずれ であってもよい。第二の中 性溶質は、好ましくは酸化トリメチルアミン(ＴＭＡＯ)、ベタイン、タウリン、 サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リボース、ガラクトース 、ソルビトール、マンニトール、イノシトールおよびそれらの類似体からなる群 から選択される。最も好ましくは、第一の中性溶質はラフィノースおよびトレハ ロースからなる群から選択され、第二の中性溶質は酸化トリメチルアミン（ＴＭ ＡＯ）およびベタインからなる群から選択される。一実施態様において、本発明 の方法で用いられる保存溶液は、硫酸ナトリウムおよびカルシウムをも含んでな り、該カルシウムは好ましくは硫酸カルシウムまたは塩化カルシウムとして約１ ．５ｍＭを超えるか、または約２．０ｍＭ未満の濃度で存在する。好ましくは、 該塩化カルシウムは約１．５ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度、最も好ましくは約１． ７５ｍＭで存在する。 生物学的物質の保存のために好ましい溶液は保存すべき具体的な生物学的物質 に依存するが、一つの態様では、ラフィノースおよびＴＭＡＯ、またはトレハロ ースおよびＴＭＡＯのいずれかを含有する溶液が多くの生物学的物質の保存に特 に有効であることがわかった。一実施態様において、本発明の溶液はラフィノー スとＴＭＡＯを約２．０：１未満または約１．１：１を超えるモル比で含有する 。好ましくは、この点での保存溶液はラフィノースとＴＭＡＯを約１．１：１〜 約２．０：１、より好ましくは約１．４：１〜約１．８：１、最も好ましくは約 １．６：１のモル比で含有する。好ましくは、本発明の溶液は約６０％〜約８０ ％のラフィノースとＴＭＡＯ、約４０％〜約２０％の硫酸ナトリウム、および約 １．５ｍＭ〜約２．０ｍＭの硫俊カルシウムを含有し、該ラフィノースとＴＭＡ Ｏは約 １．６：１の比率で存在する。最も好ましくは、該溶液は約７０％のラフィノー スとＴＭＡＯ、約３０％の硫酸ナトリウム、および約１．７５ｍＭの硫酸カルシ ウムを含有し、該ラフィノースとＴＭＡＯは約１．６：１の比率で存在する。 別の実施態様において、本発明の保存溶液は上記のように第一の中性溶質と第 二の中性溶質、好ましくはラフィノースとＴＭＡＯを、等浸透量のクエン酸ナト リウムおよび塩化カルシウムと組み合わせて含有し、該塩化カルシウムは好まし くは約１.５ｍＭを超えるか、または２．０ｍＭ未満の濃度、より好ましくは約 １.５ｍＭ〜約２．０ｍＭ、最も好ましくは約１．７５ｍＭで存在する。好まし くは、該溶液は約１０％を超え、及び約３０％未満のクエン酸ナトリウム、より 好ましくは約１０％〜約３０％クエン酸ナトリウムを含有する。 別の態様において、本発明は、ＴＭＡＯ、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウ ムを含む、生きた生物学的物質の生存能力を保存する溶液を提供する。一実施態 様において、該保存溶液は、好ましくは約６０％を超えるか、または約８０％未 満のＴＭＡＯ、約２０％を超えるか、または約４０％未満の塩化ナトリウム、約 １．５ｍＭを超えるか、または約２．０ｍＭ未満の塩化カルシウムを含有する。 より好ましくは、該溶液は、約６０％〜約８０％のＴＭＡＯ、約４０％〜約２０ ％の塩化ナトリウム、約１．５ｍＭ〜約２．０ｍＭの塩化カルシウムを含有する 。最も好ましくは、該保存溶液は、約３０％の塩化ナトリウム、約７０％のＴＭ ＡＯ、約１．７５ｍＭの塩化カルシウムを含有する。 さらなる態様において、本発明は、酸化トリメチルアミン、クエン酸ナトリウ ムおよび塩化ナトリウムを含む、生きた生物学的物質 の保存用溶液を提供し、該ＴＭＡＯは、好ましくは約１５０ｍＭを超えるか、ま たは２２０ｍＭ未満の濃度、より好ましくは約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、最も 好ましくは約１８４ｍＭの濃度で存在し；該クエン酸ナトリウムは、好ましくは 約１.５ｍＭよりも高いか、または約２．５ｍＭ未満の濃度、より好ましくは約 １．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、最も好ましくは約１.９６ｍＭの濃度で存在し；お よび該塩化ナトリウムは、好ましくは約３５ｍＭを超えるか、または約５５ｍＭ 未満の濃度、より好ましくは約３５ｍＭ〜約５５ｍＭ、最も好ましくは約４５． ８ｍＭの濃度で存在する。 さらに別の態様において、白血病の治療方法が提供され、該方法は、患者から 骨髄を除去し、白血病細胞の骨髄を除くために、該骨髄を本発明の保存組成物も しくは溶液と少なくとも約３日間、約０℃未満の温度、より好ましくは約−４℃ 〜約−８０℃、最も好ましくは約−８０℃の温度で接触させ、そして、除かれた 該骨髄を患者に戻すことを含む。 以下詳細に説明するように、本発明の溶液および方法を用いて、細胞、組織お よび器官等の生物学的物質の生存能力を、従来の保存方法で通常可能であるより も長い期間にわたって保持できることが分かり、それによって器官移植および骨 髄移植等の用途に用いられる、生物学的物質の改良された促存時間と輸送時間を 提供する。 本発明の保存方法は、生物学的物質の保存に典型的に用いられる多くの方法よ りも複雑ではないので、コストを低減し、保存法の使用の簡便性と利用性を高め る。さらに、本発明の組成物は毒性が低いので、移植器官等の生物学的物質が患 者に戻されるときに悪い副作用をほとんどもたらさない。 本発明の上記特徴と付加的な特徴およびそれらを達成する方法は明らかとなり 、添付の図面と合わせて読めば、下記のさらに詳細な説明を参照することによっ て本発明は最もよく理解されるであろう。図面の簡単な説明 図１Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、スクロースおよ び多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃の１、２および３日間の保存後のマウ ス胚の生存をそれぞれ示す。 図２Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、ラクトースおよ び多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日間の保存後のマ ウス胚の生存をそれぞれ示す。 図３Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、トレハロースお よび多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日間の保存後の マウス胚の生存をそれぞれ示す。 図４Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、ラフィノースお よび多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日間の保存後の マウス胚の生存をそれぞれ示す。 図５Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有し、ＴＭＡＯに対する ラフィノースの異なるモル比を有する水溶液中、４℃での１、２および３日間の 保存後のマウス胚の生存をそれぞれ示す。 図６は、ラフィノース／ＴＭＡＯ中、４℃、２〜３日間の保存後のマウス胚生 存のＣａ²⁺依存性を示す。 図７Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有するラフィノース／Ｔ ＭＡＯおよびＮａ₂ＳＯ₄の混合物中、１、２および３日間、４℃での保存後のマ ウス胚の生存をそれぞれ示す。図７Ｄは、異なる浸透度の溶液７０／３０中、１ 、２、３および４日の保存後 のマウス胚の生存の平均およびＳＥＭを示す。 図８Ａ、ＢおよびＣは、ＰＢＳ中、室温で１０、２０または３０分間の５、１ ０または１５ｍＭの酪酸ナトリウムによる前処理後、溶液７０／３０中、４℃の １、２および３日間の保存後に後期胚盤胞段階に到達したマウス胚の比率をそれ ぞれ示す。図８Ｄ、ＥおよびＦは、ＰＢＳ中、室温で１０、２０または３０分間 の５、１０または１５ｍＭの酪酸ナトリウムによる前処理後、溶液７０／３０中 、４℃の１、２および３日間の保存後に生存したマウス胚の比率をそれぞれ示す 。 図９は、ＰＢＳ中、７０ｍＭ酪酸での前処理を行ったか、行わずに、ＰＢＳ、 ラフィノース／ＴＭＡＯ（１．６：１の比）、または溶液７０／３０中の４℃で の保存後のマウス胚の生存をそれぞれ示す。 図１０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＰＢＳ中の２５ｍＭ酪酸ナトリウムでの５、１ ０または１５分間の前処理後、溶液７０／３０中、１、２、３および４日間の保 存後のマウス胚の生存をそれぞれ示す。 図１１は、血漿または無Ｃａ²⁺溶液７０／３０のいずれかで４℃での保存後の 血小板の生存を示す。 図１２Ａ、ＢおよびＣは、ハンクス緩衝塩溶液、ラフィノース／ＴＭＡＯ、ト レハロース／ベタインまたは溶液７０／３０のいずれかでの保存後の患者１から の骨髄中の、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−陽性細胞の数とコロニー形成単位をそ れぞれ示す。 図１３Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有するラフィノース／ ＴＭＡＯ中またはＭ−２中のいずれかで４℃での保存後の患者２からの骨髄中の 、コロニー形成単位、ＣＤ３４−とＣＤ４５−陽性細胞率をそれぞれ示す。 図１４Ａは、４℃または−８０℃のＰＢＳまたは溶液７０／３０で保存された マウス骨髄細胞の回収率を示す。図１４Ｂは、溶液７０／３０中、８日間、−８ ０℃で保存された解凍マウス骨髄細胞の注入の８日後に致死照射されたマウスの 脾臓に見られた細胞コロニーの数を示す。 図１５は、新鮮なマウス骨髄細胞、溶液７０／３０中で−８０℃にて４日間保 存したマウス骨髄細胞、ＰＢＳ中で−８０℃にて４日間保存したマウス骨髄細胞 、または細胞を有さない０．１ｍｌの溶液７０／３０のいずれかの注入の９日後 に致死照射されたマウスの脾臓に見られた細胞コロニーの数を示す。 図１６は、新鮮なマウス骨髄細胞、溶液７０／３０中で−８０℃にて７日間保 存したマウス骨髄細胞、ＰＢＳ中で−８０℃にて７日間保存したマウス骨髄細胞 、または細胞を有さない０．１ｍｌの溶液７０／３０のいずれかの注入の１０日 後に致死照射されたマウスの脾臓に見られた細胞コロニーの数を示す。 図１７は、新鮮なマウス骨髄細胞、溶液７０／３０中で−８０℃にて１０日間 保存したマウス骨髄細胞、ＰＢＳ中で−８０℃にて１０日間保存したマウス骨髄 細胞、または細胞を有さない０．１ｍｌの溶液７０／３０のいずれかの注入の１ ０日後に致死照射されたマウスの脾臓に見られた細胞コロニーの数を示す。 図１８は、溶液７０／３０中、−８０℃での４日間の保存後、マウス骨髄細胞 、白血病ＳＰ２／０細胞、およびマウス骨髄細胞とＳＰ２／０細胞との混合物に よるトリチウム化チミジンの取込みを示す。 図１９は、溶液７０／３０中の４℃での４時間の保存後のラット 心臓の圧力変換器の記録を示す。 図２０は、塩溶液または本発明の保存溶液中で４８時間までの４℃での保存後 に、トリチウム化チミジンの取込みにより評価されたジャーカット（Ｊｕｒｋａ ｔ）細胞（急性Ｔ細胞白血病）の増殖を示す。 図２１は、塩溶液または本発明の保存溶液中で４８時間までの４℃での保存後 に、トリチウム化チミジンの取込みにより評価されたＫ５６２慢性骨髄性白血病 細胞の増殖を示す。 図２２は、ＰＢＳまたは本発明の多様な保存溶液中で４℃での保存後のマウス 骨芽細胞のコンフルエンスまでの増殖を示す。 図２３は、ＰＢＳまたは溶液７０／３０中での保存後のマウス角質細胞系Ｔ７ Ｔの回収率を示す。 図２４は、ＰＢＳまたは溶液７０／３０中での保存後のマウス３Ｔ３線維芽細 胞の回収率を示す。 図２５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＰＢＳ、溶液７０／３０、またはラフィノース 、ＴＭＡＯ、クエン酸ナトリウムおよび塩化カルシウムの混合物いずれかで１、 ２、３または４日間、４℃での保存後のマウス胚の生存をそれぞれ示す。 図２６Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、塩化カルシウムをプラスしたＮａＣｌとＴ ＭＡＯの混合物範囲で１、２、３、４または５日間、４℃での保存後のマウス胚 の生存をそれぞれ示す。 図２７は、ＰＢＳ中、または塩化カルシウムをプラスした３０％ＮａＣｌ／７ ０％ＴＭＡＯ（溶液７０／３０Ｂと称する）のいずれかでの４℃での保存後のマ ウス胚の生存を示す。 図２８は、新しく切除したラット心臓に関する圧力変換器の記録 （上の記録）および溶液７０／３０Ｂ中、４℃での保存後のラット心臓の記録（ 下の記録）を示す。 図２９ＡおよびＢは、チューブ中での調製と、ジクロロジメチルシランで被覆 されたガラスチューブ中の溶液７０／３０Ｃ２中、４℃での保存後の血小板の計 数およびそれらのトロンビン凝集率をそれぞれ示す。 図３０ＡおよびＢは、バック中での調製、およびジクロジメチルシランで被覆 された単一のガラスビン中、溶液７０／３０Ｃ２での４℃の保存後の、血小板の 回収率およびそれらのトロンビン凝集率をそれぞれ示す。 図３１ＡおよびＢは、バック中での調製および溶液７０／３０Ｃ２を含有する 同バックでの４℃の保存後、血小板の回収率およびそれらのトロンビン凝集率を それぞれ示す。 図３２は、栄養ブイヨン中、４℃で生育する二種類の微生物が溶液７０／３０ Ｃ２中、４℃での血小板の保存中に生育できなかったことを示す。 図３３ＡおよびＢは、血漿または溶液７０／３０Ｃ２のいずれかで保存された 血小板のトロンビン凝集率をそれぞれ示し、該両溶液は、被覆チューブまたはバ ック中に分量を変えたＤＭＳＯ濃度を含有する。血小板は−１４０℃で迅速に凍 結し、水浴中３７℃で迅速に解凍した。 図３４ＡとＢは、溶液７０／３０Ｂ中で凍結したジャーカット細胞による、生 存能力度（％）および凍結前の取込み率としてのトリチウム化チミジンの取込み をそれぞれ示す。細胞は−１４０℃で迅速に凍結し、水浴中３７℃で迅速に解凍 した。ハロタンを細胞の遠 心および溶液７０／３０Ｂへの取込み前に示された濃度で加えた。細胞はＰＢＳ 中での同様の処理では生存しなかった。 図３５は、ＰＢＳ、溶液７０／３０Ｂ、または１．７５ｍＭのＣａＣｌ₂を含 有するＴＭＡＯ（０．２９ＯｓＭ）中のいずれかで−１４０℃で迅速に凍結し、 ３７℃で迅速に解凍したジャーカット細胞による、凍結前の取込み率としてのト リチウム化チミジンの取込みを示す。ベンジルアルコールは、遠心の損傷から細 胞を保護する試みにおいて遠心および凍結溶液中の取り込み前の懸濁液に加えた 。詳細な説明 本発明の溶液と方法は、哺乳動物、植物および海洋生物の細胞、細胞系、組織 および器官等の生きた生物学的物質の保存に用いることができる。生きた生物学 的物質が保存されているとき、その生存能力は長期間にわたってインビトロで保 持されるので、該物質は保存物から出された際にその正常な生物学的活性を取り 戻す。よって、保存中、生物学的物質は休眠の可逆的状態に維持されており、代 謝活性は通常よりも実質的に低い。例えば、心臓は保存中では鼓動を停止するの が観察される。本発明により保存できる哺乳動物の生物学的物質の例として、心 臓、腎臓、肺および肝臓等の器官；造血幹細胞、骨髄、胚、血小板、骨芽細胞、 精子、顆粒細胞、赤血球、樹枝状細胞、卵母細胞等の細胞および組織；および組 織培養で確立された多様な動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。 ヒトの生物学的物質の保存に加えて、本発明の溶液と方法は獣医学利用および植 物と海洋生物の組織の保存に用いてもよい。 本発明の保存溶液はすぐに使用できる形にあるか、または例えば粉末または錠 剤等の使用前に水で再構成される固体などの濃縮され た形で提供されてもよい。本発明の溶液は使用者による希釈のために濃縮された 液体形で提供されてもよい。従来の保存溶液と同じように、本発明の溶液は無菌 である。 本発明の溶液は保存すべき生物学的物質と実質的に等張である。等張溶液中の 細胞は実質的に収縮も膨張もしない。好ましくは、本発明の保存溶液は保存すべ き生物学的物質と実質的に等しい浸透度を有する。しかし、これは本発明のすべ ての溶液の要件ではない。なぜならば、溶液の浸透度を上げるが、半透性膜を自 由に通過でき、細胞膜の両面で等しく浸透圧を上げる一種類以上の成分を一部の 溶液は含有してもよいからである。 以下、詳細に説明するように、約２８０ｍＯｓＭ〜約３２０ｍＯｓＭの浸透度 が哺乳動物の生物学的物質の保存用溶液に適することが分かった。海洋生物の生 物学的物質の保存には約９００ｍＯｓＭ〜約１０００ｍＯｓＭの浸透度、植物の 生物学的物質の保存には約７０ｍＯｓＭ〜約８０ｍＯｓＭの浸透度がそれぞれ適 する。 本発明の溶液はオキシアニオン、例えばリン酸二水素塩、重炭酸塩、硝酸塩、 亜硝酸塩、重硫酸塩、塩素酸塩、過塩素酸塩、臭素酸塩、過マンガン酸塩、ヨウ 素酸塩、過ヨウ素酸塩、トリクロロ酢酸塩、ブロモ酢酸塩および亜リン酸二水素 塩を約１０^-5Ｍ未満の濃度で含有してよい。しかし、保存溶液中の一価のオキシ アニオンの存在は保存中に代謝活性のレベルを高めうることが観察された。例え ば、ＨＳＯ₄を含有する保存溶液では、ラットの心臓が遅くかつ弱く打つことが 観察されたが、一画のオキシアニオンを含まない保存溶液では、鼓動はまったく 観察されなかった。ほとんどの用途において、本発明の保存溶液は好ましくは保 存中の代謝活性のレベルを 可逆的に抑制し、好ましくは一価オキシアニオンを実質的に含まない。同様に、 ヨウ化物イオンの存在は保存溶液の有効性を減少させることがわかったので、本 発明溶液は好ましくはヨウ化物を実質的に含まない。ここで用いられる「実質的 に含まない」という用語は、イオンの濃度が、保存すべき物質の代謝活性を保存 中上げるために必要とされるよりも低いことを意味する。 一つの態様において、本発明の溶液は、少なくとも約３３５の分子量と少なく とも約０．３Ｍの水中での溶解度を有する第一の中性溶質(以下、クラスＩ溶質 と称する)、および約２００未満の分子量を有する第二の中性溶質（以下、クラ スＩＩ溶質と称する）を含んでなり、該第二の中性溶質は親水性部分と疎水性部 分の両方をさらに有する。通常、クラスＩ溶質は通常大きすぎて細胞膜を通過す ることができず、主に本発明溶液の浸透度を高めるために働く。好ましくは、ク ラスＩ溶質は二糖類または三糖類である。そのような溶質の例としては、ラフィ ノース、トレハロース、スクロース、ラクトースおよびそれらの合成または天然 の類似体が挙げられ、ラフィノースとトレハロースが好ましいクラスＩ溶質であ る。 クラスＩＩ溶質は通常は細胞膜を受動的に通過しないが、浸透的障害に応じて 細胞によって能動的に取り込まれうる。それらは細胞内浸透分解物として多くの 細胞により用いられる。そのような溶質の例として、ＴＭＡＯ、ベタイン、タウ リン、サルコシン、グルコース、マンノース、フルクトース、リホース、ガラク トース、ソルビトール、マンニトールおよびイノシトールならびにそれらの合成 または天然の類似体が挙げられ、ＴＭＡＯとベタインが好ましいクラスＩＩ溶質 である。ＴＭＡＯは多くの生物学的物質のために最も 好ましいクラスＩＩ溶質である。好ましくは、本発明の溶液は、（ａ）ラフィノ ースとＴＭＡＯを、好ましくは約１．１：１を超えるか、または約２．０：１未 満のモル比で、より好ましくは約１．４：１〜約１．８：１のモル比で、最も好 ましくは約１．６：１のモル比で含有するか；（ｂ）トレハロースとＴＭＡＯを 、好ましくは約１．１：１を超えるか、または約１．４：１未満のモル比で、よ り好ましくは約１．１：１〜約１．４：１のモル比で、最も好ましくは約１．３ ：１のモル比で含有するか；（ｃ）ラフィノースとベタインを、好ましくは約１ ．７：１未満か、または約１．３：１を超えるモル比で、より好ましくは約１． ３：１〜約１．７：１のモル比で、最も好ましくは約１．４：１〜約１．６：１ のモル比で含有するか；または（ｄ）トレハロースとベタインを、好ましくは約 １．７：１未満か、または約１．３：１を超えるモル比で、より好ましくは約１ ．３：１〜約１．７：１のモル比で、最も好ましくは約１．４：１〜約１．６： １のモル比で含有する。 本発明の溶液はさらに一種類以上のイオンを含有してよいが、上記のように、 一価のオキシアニオンおよびヨウ化物を実質的に含まない。ＣａＳＯ₄やＣａＣ ｌ₂等のカルシウム塩は多くの用途において保存溶液中で約２ｍＭ未満の濃度で 用いられる。他のイオン種はアニオンおよび／またはカチオンのホフマイスター 系列でそれらの特性位置にしたがって選択してよい。アニオンおよびカチオンの ホフマイスター系列はタンパク質および膜の安定化を減少させる順序で分類付け られる（ホフマイスター(Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ、Ｆ.)、『塩の効果の理解につ いて。第二レポート。塩の析出効果の際の規則とそれらの生理学的挙動に対する 関係について。』Ｎａｕｎｙｎ− Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈｉｖ ｆｕｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌｌｅ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｕｎｄ Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｃ ．（ライプ チヒ）１４：２４７−２６０，１９８８；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｋ．Ｄ. ）およびワシャバウ(Ｗａｓｈａｂａｕｇｈ、Ｍ．Ｗ.)、『ホフマイスター効果 と界面での水の挙動。』Ｑｕａｒｔｅｒｙ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． １８： ３２３−４２２，１９８５)。アニオンの分類順序は次の通りである：クエン酸 塩＞酢酸塩＞リン酸水素塩＞硫酸塩＞水酸基＞フッ化物＞塩化物＞臭化物＞ヨウ 化物＞リン酸二水素塩＞重炭酸塩＞重硫酸塩＞硝酸塩。カチオンの分類順序は次 の通りである：テトラメチルアンモニウム＞アンモニウム＞セシウム＞ルビジウ ム＞カリウム＞ナトリウム＞リチウム＞カルシウム＞マグネシウム。 一価オキシアニオンおよびヨウ化物を除くイオンは、それらの分類順序を考慮 することなく、約２ｍＭ未満の濃度で本発明の保存溶液に含有してよい。約２ｍ Ｍを超えるイオン濃度では、下記の選択基準が適用される： （ｉ）塩化物の左側の各アニオンは中性塩中でナトリウムまたはナトリウムの右 側のカチオンと組み合わされる； （ｉｉ）塩化物の右側のアニオンは除外される；および （ｉｉｉ）ナトリウムの右側のカチオンは塩化物とのみ組み合わせることができ る。 よって、臭化物は、一般的には約２ｍＭを超える濃度では、重炭酸のカリウムま たはアンモニウム塩と同じく本発明の溶液から除外される。マグネシウムは約２ ｍＭ未満の濃度では好ましいカチオンである。 以下詳細に説明するように、血小板は例外として、生物学的物質の効果的な保 存時間はカルシウムを該保存組成物に加えることにより延びることが分かった。 これは、細胞膜に見られるリン脂質二層を安定化させ、細胞間付着を安定化させ るカルシウムの能力によるものであろう。好ましくは、カルシウムは硫酸カルシ ウムまたは塩化カルシウムとして存在し、約１．５ｍＭを超えるか、または約２ ．０ｍＭ未満の濃度、より好ましくは約１．５ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度、最も 好ましくは約１．７５ｍＭで存在する。硫酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウ ムのいずれかの添加も多くの生物学的物質の効果的な保存時間を延長させる。 下記成分からなる溶液は多くの生物学的物質を保存するのに特に効果的である ことがわかった：約６０％〜約８０容量％、好ましくは約７０％のラフィノース とＴＭＡＯの溶液；約４０％〜約２０容量％、好ましくは約３０％の硫酸ナトリ ウムの溶液；および約１．７５ｍＭの硫酸カルシウム、ここで該ラフィノースと ＴＭＡＯは約１．６：１の比率で存在し、ラフィノースとＴＭＡＯとの該溶液お よび硫酸ナトリウムの該溶液の両方が保存すべき物質と等張である。本発明のこ の実施態様における溶質の濃度は好ましくは以下の通りである：ＴＭＡＯ、約７ ０〜７５ｍＭ、最も好ましくは約７２ｍＭ；ラフィノース、約１２０〜１３０ｍ Ｍ、最も好ましくは約１２６ｍＭ；硫酸ナトリウム、約３５〜４５ｍＭ、最も好 ましくは約３９ｍＭ；および硫酸カルシウム、約１．５〜２．０ｍＭ、最も好ま しくは約１．７５ｍＭ。 本発明の保存溶液は、各溶液が所望の浸透度を有する各成分の各溶液を最初に 作ることによって、都合よく調製することができる。 次に、各溶液を所望の比率で混合して本発明の溶液を提供する。例えば、哺乳動 物の生物学的物質の保存用の好ましい実施態様の本発明溶液（溶液７０／３０と 称する）を調製するために、下記濃度を有するＴＭＡＯ、ラフィノース、硫酸ナ トリウムおよび塩化カルシウムの各溶液を最初に調製する： ＴＭＡＯ二水和物 29.7g/l ラフィノース 147.1g/l 無水硫酸ナトリウム 18.6g/l 塩化カルシウム二和物 17.1g/l これらの各溶液は２９０ｍＯｓＭの浸透度を有する。次に、これらの溶液を下記 の量で混合して下記の最終濃度を得た： 体積(ml) 最終濃度(g/l) 最終濃度(mM) ＴＭＡＯ 134.5 7.88 71 ラフィノース 215.5 62.5 124 硫酸ナトリウム 150 5.5 38.7 塩化カルシウム 7 0.24 1.6 これにより、ラフィノース：ＴＭＡＯ：硫酸ナトリウムの１：０．６２：０．７ ０の比率が得られる。非哺乳類の生物学的物質との使用の場合、該溶液は海洋性 物質については約９００ｍＯｓＭ〜約１０００ｍＯｓＭの浸透度、植物物質につ いては約７０ｍＯｓＭ〜約８０ｍＯｓＭの浸透度で作ってよく、同じ比率で混合 してよい。 ラフィノース、ＴＭＡＯ、クエン酸ナトリウムおよび塩化カルシウムを含む組 成物もまた、生物学的物質の保存にかなり効果的であることがわかった。一実施 態様において、そのような溶液は、保存すべき物質に等浸透度の量で、ラフィノ ースおよびＴＭＡＯを約１． １：１を超えるか、または約２．０：１未満、好ましくは約１.１：１〜約２． ０：１、より好ましくは約１．４：１〜約１．８：１、最も好ましくは約１．６ ：１のモル比で；また、保存すべき物質に対して等浸透量のクエン酸ナトリウム ；および約１.５ｍＭを超えるか、または約２．０ｍＭ未満、好ましくは約１． ５ｍＭ〜約２．０ｍＭの塩化カルシウムを含有する。好ましくは、該塩化カルシ ウムは約１．７５ｍＭの濃度で存在し、該クエン酸ナトリウムは、保存すべき物 質に対して等浸透度の溶液の好ましくは約１０％を超えるか、または３０容量％ 未満、より好ましくは約１０％〜約３０％の量で存在する。好ましくは、クエン 酸ナトリウムは約５ｍＭを超えるか、または約２０ｍＭ未満、より好ましくは約 １０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する。 一実施態様において、そのような溶液はＴＭＡＯ、ラフィノース、クエン酸ナ トリウムおよび塩化カルシウムの各保存（ストック）溶液から作られ、各溶液が 保存すべき物質に対して等浸透度を有する。例えば、０．２９０ｓＭの浸透度の 哺乳動物組織に対して、各保存溶液は以下のものを含有する： ＴＭＡＯ二水和物 29.7g/l ラフィノース 147.1g/l クエン酸ナトリウム二水和物 29.0g/l 塩化カルシウム二水和物 17.1g/l 使用されるこれらの溶液の体積および溶質の最終濃度は下記の通りである： 体積(ml) 最終濃度(g/l) 最終濃度(mM) ＴＭＡＯ 173〜134.6 10.2〜7.9 91.9〜71.7 ラフィノース 276〜215 80.1〜63.3 159〜125 クエン酸ナトリウム 50〜150 2.9〜8.7 9.9〜17 塩化カルシウム 7 .25 1.7 別の態様において、本発明の組成物は、クラスＩＩ溶質を、塩化ナトリウムと カルシウム塩、好ましくは塩化カルシウムと組合せて含んでなる。好ましくは、 そのような組成物は、約１．５ｍＭを超えるか、または約２．０ｍＭ未満、より 好ましくは約１．５ｍＭ〜約２．０ｍＭ、最も好ましくは約１．７５ｍＭの濃度 の塩化カルシウムとともに、保存すべき物質に対して等浸透の塩化ナトリウムと ＴＭＡＯを含む。好ましくは、該溶液は、保存すべき物質と同じ浸透度を有する 溶液の約６０容量％を超えるか、または約８０容量％未満、より好ましくは約６ ０％〜約８０％、最も好ましくは約７０％の量でＴＭＡＯを含有する。該塩化ナ トリウムは、保存すべき物質と同じ浸透度を有する溶液の、約４０容量％未満か 、または約５容量％を超える量、より好ましくは約４０％〜約２０％の量、最も 好ましくは約３０％の量で好ましく存在する。該塩化ナトリウムは好ましくは約 ３０ｍＭ〜約６５ｍＭの濃度で、より好ましくは約４０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度 で、最も好ましくは約４６．８ｍＭの濃度で存在する。したがって、本発明の組 成物中の塩化ナトリウムの濃度は、典型的には１４５ｍＭの塩化ナトリウムを含 有する従来の塩溶液系培地よりも顕著に低い。 ０．２９ＯｓＭの浸透度の哺乳動物組織の保存のために、例えば、該溶液は下 記のものを含有する各保存溶液から調製してもよい： ＴＭＡＯ二水和物 29.7g/l 塩化ナトリウム 9.08g/l 塩化カルシウム二水和物 17.1g/l 使用されるこれらの溶液の体積および溶質の最終濃度は下記の通りである： 体積(ml) 最終濃度(g/l) 最終濃度(mM) ＴＭＡＯ 300〜400 7.8〜23.8 161〜214 塩化ナトリウム 200〜100 3.6〜1.82 62〜31 塩化カルシウム 7 .25 1.7 さらに別の態様において、本発明は、酸化トリメチルアミン、クエン酸ナトリ ウムおよび塩化ナトリウムを含んでなる、生きた生物学的物質の保存用溶液を提 供し、該ＴＭＡＯは、好ましくは約１５０ｍＭを超えるか、または２２０ｍＭ未 満の濃度、より好ましくは約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭ、最も好ましくは約１８ ４ｍＭの濃度で存在し；該クエン酸ナトリウムは、好ましくは約１．５ｍＭを超 えるか、または約２．５ｍＭ未満の濃度、より好ましくは約１．５ｍＭ〜約２． ５ｍＭ、最も好ましくは約１．９６ｍＭの濃度で存在し；および該塩化ナトリウ ムは、好ましくは約３５ｍＭを超えるか、または約５５ｍＭ未満の濃度、より好 ましくは約３５ｍＭ〜約５５ｍＭ、最も好ましくは約４５．８ｍＭの濃度で存在 する。以下に詳細に説明するように、この溶液が血小板の保存に特に効果的であ ることがわかった。 本発明の組成物中に包含させてよい他の成分として、微生物抑制のために抗生 物質、および胚等の生物学的物質が表面に結合するのを抑制するためのウシ血清 アルブミン等のタンパク質を挙げることができる。心臓の保存等のある種の用途 のために、保存溶液は使用前に酸素で飽和させてよい。本発明保存組成物への緩 衝液の添加は 通常は必要でないことがわかった。実際、上記のように、多くの従来の緩衝液に 見られる一価オキシアニオンの添加は本保存組成物の有効性を低下させる。した がって、好ましい実施態様において本発明の組成物は緩衝性がない。 生物学的物質の保存に典型的に用いられる多くの組成物とは異なり、本発明の 組成物は従来（常用）の凍結保護剤を必要とせず、実際、５％を超える濃度の従 来の凍結保護剤は、それらのよくある毒性の副作用のために、存在しないことが 好ましい。ここで用いられる「従来の凍結保護剤」という用語は二種類の化合物 をいう。最初のものとしては、水溶性が高く細胞膜を受動的に通過拡散する、Ｄ ＭＳＯ、グリセロール、エタノール、メタノールおよびプロパン−ジオールが挙 げられる。これらの化合物は従来の塩水培地に高濃度で使用され、凍結すべき細 胞中の内部で同様に高い濃度に達する。これらは水の凝固点を低下させることに よって作用すると考えられる。第二の種類の凍結保護剤は細胞膜を通過できない 水溶性高分子からなる。この種類の凍結保護剤の例としては、ポリエチレングリ コール(分子量８，０００または２０，０００)、ヒト血清アルブミン、ポリビニ ルピロリドン(分子量３０，０００)、デキストラン(分子量１０，０００〜５０ ，０００)、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ、分子量７０，０００）およびヒドロキ シエチルデンプンが挙げられる。そうした化合物はおそらく結晶氷よりも不定形 氷を誘導することによって凍結による損傷からの保護をしていよう。 理論によって縛られることを欲しないが、本発明者らは、本発明の保存溶液は 、イオンチャンネルが開くのを妨ぐことにより、細胞膜を経て運ばれる外部の刺 激シグナルから細胞を孤立させて、それ により細胞を休眠状態に保つものと考えている。 保存すべき生物学的物質は標準的な技術により集め、本発明の水性保存溶液に 、接触させ、好ましくは浸す。生物学的物質は、所望により、浸す前に保存溶液 ですすいでよい。生物学的物質は、約−１９６℃の低温度を含み、凍結以下の温 度で保存してもよいが、便利には約４℃の温度で保存してもよい。保存後、保存 溶液を該物質から除去して標準的な塩溶液系培地に置き換えるか、または保存物 質をその保存溶液中に直接に用いてもよい。生物学的物質を凍結温度以下の温度 で保存する場合、効果的な濃度の凍結保護剤を、当業者によく知られた技術を用 いて保存溶液に加えることができるが、上記のように、約５％を超える濃度での 従来の凍結保護剤はないことが通常好ましい。よって、本発明の溶液は生きた生 物学的物質の長期、短期のいずれの保存に用いてよい。 以下詳細に説明するように、生物学的物質は、該物質を本発明の保存溶液に室 温で浸し、次に該物質を−１９６℃の液体窒素に入れるか、または−１４０℃の フリーザーに置くこと等により該物質を凍結以下の温度にすばやく置くことによ り効果的に保存することができることが見い出された。保存後、該物質を、例え ば３７℃の水浴で解凍することにより室温に迅速に戻す。この方法は従来の低温 保存法で用いられる調節された遅い凍結および再加温に対する必要性をなくして 、費用および時間な要件の減少をもたらす。 下記の例２で詳細に説明するように、胚等の一部の生物学的物質の保存時間は クラスＩＩ媒質または酪酸ナトリウムのいずれかによる前処理により延長できよ う。 本明細書で温度（℃）を示すとき用いられる「約」との言葉は、 言及された温度から２０°までの変動を意図する。本明細書で分子量をいうとき に用いられる「約」との言葉は、言及された分子量から１０％までの変動を意図 する。溶質の溶解度または溶液のモル量をいうときに用いられる「約」との言葉 は、言及されたモル量から５％までの変動を意図する。比をいうときに用いられ る「約」との言葉は、該比のいずれかの側で０．２までの変動を意図する。溶液 組成百分率をいうときに用いられる「約」との言葉は、言及された百分率から１ ０％までの変動を意図する。溶液の浸透度をいうときに用いられる「約」との言 葉は、言及された浸透度から１０％までの変動を意図する。 下記の例は説明のために示されるものであって、限定するためのものではない 。 例１ マウス胚の保存における本発明の溶液の効能を以下の通り調べた。胚は速く分 裂する細胞からなるので、成長を阻止するのが難しく、よって保存溶液の感受性 試験を提供する。また、胚は、保存中の生存がその後の培養中においてその孵化 能力により１〜５日後に評価できる利点を有する。 生存可能なマウス胚を、ＰＢＳ中で、またはラフィノース、トレハロース、ス クロースもしくはラクトース（クラスＩ溶質）の何れかと、酸化トリメチルアミ ン(ＴＭＡＯ)、ベタイン、タウリン、サルコシン、グルコース、マンノース、フ ルクトース、リボース、ガラクトース、ソルビトール、マンニトール、イノシト ールおよびタウリンからなる群から選択される溶質（クラスＩＩ溶質）との１． ６：１のクラスＩ溶質：クラスＩＩ溶質の比の水溶液中で、１、２ または３日間の期間で４℃にて保存した。各クラスＩ／クラスＩＩ溶液は硫酸カ ルシウムも１．７５ｍＭの濃度で含有した。該溶液は０．１〜１％のウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）および２５ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンも含有した。すべて の試薬はシグマケミカル社（ミズリー州、セントルイス）から入手した。胚の生 存はダルベッコの改良イーグル培地(ニューヨーク、グラントアイランドのライ フテクノロジーからのＤＭＥＭ)中でのその後の培養により評価し、保存後に存 在する生きた胚の数および３７℃の培養の４８時間後に孵化した胚の数の両方で 表わした。スクロース、ラクトース、トレハロースおよびラフィノースの溶液に 関するこれらの実験の結果を、ＨＢ＋ＬＢが孵化または後期胚盤胞段階に到達し た胚の比率を表わしている図１〜４にそれぞれ示す。具体的には、図１Ａ、Ｂお よびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、スクロースおよび多様なクラス ＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日間のそれぞれの保存後のマウス 胚の生存を示し；図２Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、 ラクトースおよび多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日 間のそれぞれの保存後のマウス胚の生存を示し；図３Ａ、ＢおよびＣは、１．７ ５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、トレハロースおよび多様なクラスＩＩ溶質の水溶 液中、４℃での１、２および３日間のそれぞれの保存後のマウス胚の生存を示し ；および図４Ａ、ＢおよびＣは、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄とともに、ラフィノ ースおよび多様なクラスＩＩ溶質の水溶液中、４℃での１、２および３日間のそ れぞれの保存後のマウス胚の生存を示す。 顕著な比率の胚が溶質のほとんどの組合せ中の１日間の保存後に 孵化したが、次の３日間後では、高い比率の孵化がラフィノース、トレハロース またはスクロースのＴＭＡＯとの組合せを用いてのみ得られた。ラフィノースが 最も良いクラスＩ溶質であり、ＴＭＡＯが最も良いクラスＩＩ溶質であることが わかり、トレハロースとベタインがそれぞれそれに次ぐ良いクラスＩ溶質とクラ スＩＩ溶質であることがわかった。マウス胚の保存に関してクラスＩ／クラスＩ Ｉ溶液の最適な全浸透度は０．３０ＯｓＭであることがわかった。 次に、クラスＩとクラスＩＩ溶質の三種類の最良の組合せを再試験して、クラ スＩＩ溶質に対するクラスＩ溶質の最適モル比を決定した。１．７５ｍＭのＣａ ＳＯ₄を用いたラフィノースとＴＭＡＯに関するこの研究の結果を図５Ａ〜Ｃに 示し、ここで図５Ａは１日間の保存後の生存を示し、図５Ｂは２日間の保存後の 生存を示し、図５Ｃは３日間の保存後の生存を示す。試験されたこれらの３種類 の溶液のうち、１．６：１モル比のラフィノース：ＴＭＡＯが最大の胚生存率と なった。二番目に高い生存率は１．３：１モル比のトレハロース：ＴＭＡＯを用 いて得られた。三番目に高い生存率は１．４：１モル比のラフィノース：ベタイ ンを用いて得られた。 １．６：１のモル比のラフィノース：ＴＭＡＯと多様な濃度のＣａ²⁺を含有す る溶液中、２〜３日間、４℃での保存後に孵化化する胚の比率を図６に示す。Ｃ ａ²⁺は胚の保存に必要なことがわかり、非線形の濃度依存性があった。次に、１ ．７５ｍＭのＣａＳＯ₄濃度をすべての溶液中で、ほとんどの生物学的物質とと もに用いた。一つの例外は、Ｃａ²⁺を含有しない溶液中で最もよく生存すること がわかった単離血小板であった。 次に、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有するラフィノース／ＴＭＡ Ｏの１．６：１溶液を、１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有する０．３０ＯＳＭのＮ ａ₂ＳＯ₄の溶液と異なる比で混合した。１、２および３日間、４℃でのこれらの 溶液中での保存後、培養基中で孵化するマウス胚の比率を図７（ｉ）Ａ、Ｂおよ びＣにそれぞれ示す。孵化した胚の最大比が、７０％ラフィノース／ＴＭＡＯ( １．６：１)、３０％のＮａ₂ＳＯ₄および１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄（以下、溶液 ７０／３０と称する）を用いて得られた。図７（ｉｉ）は、多様な浸透度の溶液 ７０／３０中で、４℃での１、２、３および４日間の保存後の胚の生存を示す。 最適浸透度は３００ｍＯｓＭに近いようであるが、臨界的な重要性はないようで ある。溶液７０／３０を続いて多くの用途に用いて、骨髄幹細胞、心臓、赤血球 および骨芽細胞等の多くの生物学的物質に効果的な保存溶液であることが証明さ れた。Ｃａ²⁺を含まない溶液７０／３０は血小板の保存に好ましい溶液であるこ とがわかった。 その後の研究で、マウスの胚は、ラフィノースおよびＴＭＡＯが１．６：１の 範囲で存在する、クエン酸ナトリウムおよびラフィノース／ＴＭＡＯの等浸透溶 液の混合物の範囲で４℃で保存された。図２５Ａ〜Ｄは、ＢＰＳまたは溶液７０ ／３０のいずれかでの保存後に孵化化されたものと比較して、１、２、３または ４日間の該溶液中での保存後の培養で孵化した胚の比率を示す。これらの結果は 、クエン酸ナトリウム、ラフィノースおよびＴＭＡＯを含む溶液がＰＢＳまたは 溶液７０／３０よりも胚の長期保存に対してさらに効果的でありうることを示し ている。 図２６Ａ〜Ｅは、塩化カルシウムをプラスしたＮａＣｌとＴＭＡＯの混合物の 範囲で１、２、３、４または５日間、４℃での保存後、 ３７℃での３日間の培養後に孵化したマウス胚の比率を示す。約２０〜約４０％ のＮａＣｌを含有する溶液は胚の生存能力を保存するのにかなり効果的であるこ とがわかった。図２７は、１．７５ｍＭの塩化カルシウムをプラスした３０％ ＮａＣｌ／７０％ ＴＭＡＯ（溶液７０／３０Ｂと称する）中、６日間までの４ ℃でのマウス胚の保存の結果をＰＢＳ中での保存と比較する。これらの結果は、 マウス胚の生存能力を保存するのに溶液７０／３０ＢはＰＢＳよりもさらに効果 的であることを示している。 例２ 下記のように、マウス胚の保存における生存は、クラスＩＩ溶質または酪酸ナ トリウムのいずれかによる前処理により大きく増強されることがわかった。 マウス胚を、溶液７０／３０中、５日間以内の４℃での保存に先立って、酪酸 ナトリウムまたはクラスＩＩ溶媒のいずれかとともに、室温、３０℃または４℃ でインキュベートした。酪酸ナトリウム濃度（５〜７０ｍＭ）と室温での前処理 時間（５〜３０分間）との多くの異なる組合せにより顕著に向上した保存期間が 得られた。ＰＢＳ中の塩化ナトリウムの代わりに酪酸ナトリウムを同じ濃度で置 き換えた。図８Ａ、ＢおよびＣは、１０、２０または３０分間の５、１０または １５ｍＭの濃度の酪酸ナトリウムによる前処理後の保存で１、２および３日間後 に孵化したマウス胚の比率を示す。図８Ｄ、ＥおよびＦは、１０、２０または３ ０分間の５、１０または１５ｍＭの濃度の酪酸ナトリウムによる前処理後の保存 で１、２および３日後に生存したマウス胚の比率を示す。酪酸ナトリウムによる 前処理は、溶液７０／３０中の３日間の保存後、８０％までの胚が孵化 することを可能とした。高濃度の酪酸ナトリウムによる前処理後、溶液７０／３ ０中の５日間の保存後、未処理の２％に比べて７０％までの胚が孵化した(図９ を参照)。前処理なしでＰＢＳで保存された胚は３日を超えて生存することはな かった。酪酸塩なしのＰＢＳによる胚への前処理によって、胚は顕著に損失した 。図１０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、室温での５、１０または１５分間の２５ｍＭ酪 酸ナトリウムによる前処理後、溶液７０／３０中、４℃での４日間までの保存後 のマウス胚の生存を示す。 例３ 全血保存における溶液７０／３０の効能を以下の通りに調べた。 全血を、血漿、Ｃａ²⁺を含有する溶液７０／３０、またはＣａ²⁺を含有しない 溶液７０／３０で１：１の容量で希釈し、４℃で２８日間まで保存した。クエン 酸系の抗凝固溶液の存在下、血小板は１８日でそれらの最初の数の約３０％まで 減少した。ＥＤＴＡを抗凝固剤として用いたとき、血小板の数は、Ｃａ²⁺を含有 しない溶液７０／３０では通常の範囲（すなわち約６０％生存に近い）にあった が、Ｃａ²⁺を含有する溶液７０／３０または血漿中では通常の範囲になかった。 同じ試験において、白血球はクエン酸系凝固剤中で血小板よりも良好に生存す ることはほとんどなかった。Ｃａ₂₊を含有しない溶液７０／３０、血漿の保存に 比べて、血液をＥＤＴＡを含有するバッグ中に集めて、Ｃａ²⁺を含有する溶液７ ０／３０により１：１の容量で希釈したときに１８日後の最大生存率が得られた 。これは白血球の保存に必要なＣａ²⁺を置き換え、クエン酸の有害な効果を回避 した。例４ この例では、凍結以上の温度での単離血小板の保存における本発明の保存溶液 の効能を示す。 血液をＥＤＴＡ中に集め、標準的な遠心技術を用いて血小板を単離した。血小 板に富む最終的なペレットを、血漿、またはＣａ²⁺を含まない溶液７０／３０の いずれかの５０ｍｌに希釈した。図１１は８０％の血小板が４℃での２８日間の 保存後に生存したことを示す。保存後の生存率は血漿中よりも有意に高く、血小 板が典型的に２１℃に保持された５日間よりもかなり良好であった。無Ｃａ²⁺の 溶液７０／３０の４℃での保存とともに、血液をＥＤＴＡ中へ集めることおよび クエン酸塩を避けることの利点は非常に明らかである。 血小板は便利にはクエン酸抗凝固剤中に集められた血液から単離する。そのよ うな方法にしたがって調製される血小板を効果的に保存するために、４５．８ｍ ＭのＮａＣｌ、１８４ｍＭのＴＭＡＯおよび１．９６ｍＭのクエン酸ナトリウム を０．２９ＯｓＭの全浸透度で含有する保存溶液を調製した(以下、溶液７０／ ３０ｃ２と称する)。４℃での血小板の保存のこの溶液の有効性は、血小板数を 計測し、トロンビンによる刺激に対する応答でそれらの凝集を測定することによ り評価した。 予備実験は、プラスチックまたは無被覆ガラスでの保存に比べてジクロロジメ チルシランで被覆されたガラスチューブ中での保存が血小板を安定化することを 示した。最初の実験において、血小板をチューブの中で最初に処理し、次にジク ロロジメチルシランで被覆されたガラスチューブ中、４℃での溶液７０／３０ｃ ２にて保存した。図２９ＡとＢに示されているように、血小板は高いレベルのト ロンビン凝集を受けながら１４日間生存することがわかった。第二の実験におい て、血小板はプラスチックバッグ中で処理され、溶液７０／３０ｃ２中で４℃で の保存のために単一のジクロロジメチルシラン被覆ガラスビンに移した。図３０ ＡおよびＢに示されているように、血小板の計数とトロンビンの凝集レベルは１ ８日間高く保たれた。図３１ＡとＢは長期間にわたる４℃バッグでの溶液７０／ ３０ｃ２中の血小板保存の結果を示す。血小板の数は２６日後高く保たれたが、 トロンビン活性化にはあまりよく応答せず、プラスチック表面は好ましくないこ とを示唆した。 例５ この例では、ヒト骨髄の保存の本発明の溶液の効能を示す。 骨髄を二人の異なる患者からヘパリン中に集めて、本発明の溶液または標準的 な塩溶液(ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）か塩溶液系マウス培養培地(Ｍ−２)) で容量で１：１に希釈した。骨髄を４℃で、２８日までの範囲の期間保存し、こ の時点で白血球細胞の計測と生存能力、コロニー形成単位の数、およびＣＤ３４ とＣＤ４５細胞の群を測定した。 図１２Ａ、ＢおよびＣは、患者１から集め、ＨＢＳＳ、ラフィノース／ＴＭＡ Ｏ、トレハロース／ベタインまたは溶液７０／３０のいずれかで２８日間まで保 存した、骨髄からのＣＤ−４５陽性およびＣＤ−３４陽性細胞の数およびコロニ ー形成単位をそれぞれ示す。図１３Ａ、ＢおよびＣは、患者２から集めて、Ｎ− ２中、または１．７５ｍＭのＣａＳＯ₄を有するラフィノース／ＴＭＡＯ中のい ずれかで４℃で保存された、骨髄からのコロニー形成単位、ＣＤ４５陽性細胞と ＣＤ３４陽性細胞の数をそれぞれ示す。該ラフィノース／ ＴＭＡＯ溶液は１．６：１のモル比を有し、該トレハロース／ベタイン溶液は１ ．４：１のモル比を有した。溶液７０／３０は骨髄幹細胞の保存に特に効果的で あり、コロニー形成単位の数、ＣＤ４５およびＣＤ３４陽性細胞の数はコントロ ール溶液のいずれよりもかなり高く、時間とともに相対的な向上が高まった。図 １３Ａ、ＢおよびＣは、コロニー形成単位の数、ＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ４ ５陽性細胞の数は、塩溶液培地Ｍ−２での保存に比較して、溶液７０／３０での 保存後に顕著に高かったことを示す。骨髄を２〜３週間の期間凍結せずに保存す る能力は骨髄移植において特に有利である。なぜなら、それは凍結保存において ＤＭＳＯの使用に関連する毒素を避け、再注入前の全身照射等の治療方法の時間 を可能とするからである。 例６ マウスの骨髄細胞の保存に関する本発明溶液の効能を次の通りに調べた。 マウスの骨髄を溶液７０／３０中、またはＰＢＳ中に直接に集めた。得られた 溶液を４℃または−８０℃で保存した。図１４Ａは、溶液７０／３０で４℃で保 存されたマウスの骨髄が１４日間後に２８％の回収率を示したが、ＰＢＳで１４ 日間４℃で保存された骨髄細胞は生存しなかったことを示す。−８０℃での溶液 ７０／３０で凍結された骨髄は８日および１４日後に２０％の回収率を示したが 、−８０℃でＰＢＳ中で２、６、８および１４日間凍結された骨髄細胞は生存し なかった。 図１４Ｂは、溶液７０／３０中で−８０℃で８日間凍結され、解凍され、次に 致死照射（１０００Ｒ）された有性生殖マウスに注入 されたマウス骨髄が、注入の８日後に分析されたときに脾臓コロニーを発達させ たことを示す。５０，０００個の骨髄細胞が注入されたマウスは１６個のコロニ ーを発達させ、１０，０００個の細胞が注入されたマウスは４個のコロニーを発 達させ、２，０００個の骨髄細胞が注入された一匹のマウスは２個のコロニーを 発達させた。 図１５、１６および１７は、致死照射されたマウスへの注入の９〜１０日後に 脾臓コロニーを形成する能力により決定された、造血幹細胞の生存に対する溶液 ７０／３０またはリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中でマウス骨髄を−８０℃で４ 〜１０日間凍結する効果を示す。骨髄は、ドナーの６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマ ウスの大腿骨から１５ｍｌの滅菌ポリプロピレン遠心チューブ中の、溶液７０／ ３０中か、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中に直接に集められた。これらのチュ ーブは−８０℃のフリーザーに置かれた。４日後(図１５)、７日後（図１６）お よび１０日後(図１７)、溶液７０／３０またはＰＢＳ中に骨髄を含有するチュー ブをフリーザーから出して、室温で解凍した。生存可能な細胞数を測定した。 凍結および解凍された骨髄において造血幹細胞の活性を測定するために、宿主 ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢）に致死量の放射線を照射し、各グループが ４匹のマウスからなる４グループに分けた。さらに、新しい骨髄を健康なドナー ＢＡＬＢ／ｃマウスから溶液７０／３０に集めた。該４グループの照射受容マウ スに０．１ｍｌの以下のものを静脈内に注入した。 グループ１：溶液７０／３０に直接集められた新鮮な骨髄細胞； グループ２：溶液７０／３０に集められ、−８０℃で凍結し た同一数の骨髄細胞； グループ３：ＰＢＳに集められ、−８０℃で凍結した同一数の骨髄細胞； グループ４：骨髄細胞を欠く溶液７０／３０。 注入された骨髄細胞の数を各図に示した。これらのデーターは、マウスの造血幹 細胞が−８０℃で１０日間までの期間にわたって溶液７０／３０中の凍結に耐え て、インビボで脾臓のコロニー形成性を保持することを示す。 以下のマウスおよびヒト造血腫瘍細胞系を溶液７０／３０に再懸濁し、−８０ ℃で２〜１０日間の期間にわたって凍結した：Ｐ３(マウスプラスマサイトーマ) ；ＳＰ２／０(マウスプラスマサイトーマ)；ＥＬ４(マウスＴ細胞リンパ腫)；ジ ャーカット(ヒトＴ細胞リンパ腫)；ＨＬ６０（ヒト単球腫瘍)；およびＫ５６２( ヒト初期造血腫瘍)。室温での解凍、およびトライパン・ブルーの取込みによる かまたはウシ胎児血清を補った哺乳動物組織培養培地で３７℃で生育する能力に よる生存可能な細胞の分析で、細胞は−８０℃での凍結では生存できないことが 観察された。 白血病細胞のマウス骨髄を取り除く本発明溶液の能力は以下の通り示された。 ＢＡＬＢ／ｃマウスからの新しい骨髄細胞は溶液７０／３０中に１ｍｌあたり１ ０⁷個の細胞濃度で集められた。ＳＰ２／０細胞も溶液７０／３０中に１ｍｌあ たり１０⁷個の細胞濃度で調製された。下記の３グループの細胞を−８０℃での 凍結のために調製した： グループ１：溶液７０／３０中の骨髄細胞； グループ２：溶液７０／３０中の等量の骨髄とＳＰ２／０細 胞の混合物；及び グループ３：溶液７０／３０中のＳＰ２／０細胞のみ。４日後に、細胞を 室温で解凍し、遠心により集め、５％ウシ胎児血清、２０ｎｇ／ｍｇのマウス顆 粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および２０ｎｇ／ｍｌの インターロイキン−３（ＩＬ−３）を含有する哺乳動物組織培養培地に再懸濁し た。細胞を３７℃で、１０％ＣＯ₂の空気が供給されたインキユベーターでイン キュベートした。４日後、細胞を１ｍｌあたり１μＣ放射性チミジンとともに２ ４時間インキュベートし、取込みを測定し、１分あたりの計数として表わした。 図１８に示されているように、骨髄細胞単独は溶液７０／３０中、−８０℃での 保存で生き延びたが、ＳＰ２／０細胞はこれらの条件下の保存で生き延びなかっ た。骨髄細胞とＳＰ２／０細胞の混合物では、骨髄細胞のみが生き延びた。 例７ 心臓の保存に関する本発明溶液の効能を下記の通り測定した。 ラットの心臓を外科的に摘出し、溶液７０／３０またはラフィノース／ＴＭＡ Ｏ（モル比１．６：１）を４℃で大動脈に灌流させて、この間に心拍数は１分あ たり約３００拍から１分あたり約１８０拍まで低下した。次に、心臓を同じ溶液 中で４〜２４時間保存し、この間に心臓は鼓動を停止した。続いて、心臓をカニ ューレに再設置し、最初は室温で２０分間で３７℃まで上がるクレブス溶液で再 灌流した。灌流溶液の重力のみによる送り込みを用いる４時間保存後の心臓の回 復は良好で、心拍数と現れた圧力の両方が正常の範囲にあった(心拍数は１７０ 拍／分、圧力９８ｍｍ水銀：図１９を参照)。ポンプを灌流に用いた場合、変動 性のある結果が得られた。一般的 に、心臓がポンプから受ける圧力は損傷を与えることがわかり、その損傷はしば しば回復不能であった。 ４時間を超える時間の保存は、冷溶液７０／３０またはラフィノース／ＴＭＡ Ｏによる灌流と４℃での保存前にクレブス溶液中の２５ｍＭタウリンで心臓を１ ０分間、３８℃で前処理することにより達成された。最初の灌流および再灌流で 重力による送り込みによってのみ、２４時間保存された心臓は正常な範囲の心拍 数と正常なレベルの約半分の圧力を回復した。その後の実験は、外因性タウリン の流出を妨げるために約０．２ｍＭのタウリンを保存溶液に加えることによりタ ウリンによる前処理を行わないことができることを示した。 さらなる研究において、ラットの心臓を切除して３０％の２９０ｍＯｓＭ Ｎ ａＣｌ、７０％の２９０ｍＯｓＭ ＴＭＡＯおよび１．７５ｍＭ ＣａＣｌ₂（溶 液７０／３０Ｂ）の４℃の溶液に直接に入れ、切り揃え、次に大動脈にカニュー レを入れて血液が置き換わるまで、酸素を供給した溶液７０／３０Ｂを４℃で灌 流した。心臓を迅速に４℃の２０ｍｌの酸素供給溶液７０／３０Ｂ中に置き、２ ５ｍｌの空気で加圧した。これらのすべての工程は無菌条件下で行った。４℃で １７〜２０時間の保存後、大動脈において心臓にカニューレを再度入れ、１００ ｍｌの水の圧力による重力での送り込みを用いてクレブス溶液を３７℃で灌流し た。大動脈がすぐに目で見えるように打ち始めた。心室はそれよりも遅く鼓動を 開始し、約３０分間かけて経時的に鼓動が強くなり、その時点で圧力変換器を挿 入し、心拍と心室圧をグラスレコーダーで記録した。この操作に供された心臓は 少なくとも２時間にわたって打ち続けた。図２８は新し く切除された心臓に関する記録（上の記録）および１７時間、４℃て溶液７０／ ３０Ｂで保存された心臓の記録（下の記録）を示す。４つの心臓は正常な範囲内 、または正常な範囲の近くで同様な記録を与えた。より速い鼓動を有し、強い心 室圧を有するように思われた５番目の心臓は、圧力誘導用カテーテルの挿入によ り損傷を受けたので、その記録を得ることはできなかった。 本発明の保存溶液を用いて得られた結果は、心臓が、生物学的機能の許容され ない悪化のためにわずかに５時間以下しか保存できない、冷塩溶液系培地中で心 臓を保存する従来技術の方法に比べて、より適したものである。悪化のない２４ 時間の心臓の保存により、世界的な移植のためのその輸送時間が可能となるであ ろう。 例８ ヒトのリンパ球白血病ジャーカットおよびＫ５６２慢性骨髄性白血病細胞系を 含む多様な腫瘍細胞系の４℃での保存に関する本発明溶液の効能を、上記の例５ および６でヒト骨髄の保存について調べられた溶液を用いて調べた。図２０およ び２１は、塩溶液または本発明溶液中で４℃での保存後に、トリチウム化チミジ ンの取込みによって評価されたジャーカットとＫ５６２細胞の増殖をそれぞれ示 す。骨髄始原細胞とは対照的に、腫瘍細胞系は完全な細胞死の前、本発明溶液中 、わずかに２日間生き残っただけであった。よって、本発明の保存溶液中、４℃ で、３日間を超える期間の骨髄の保存は、骨髄の生存能力を維持しなから白血病 細胞の骨髄を取り除くだろう。 例９ 本発明溶液の骨芽細胞の保存における効能が次の通り示された。 マウス骨芽細胞を切除し、Ｄ−ＭＥＭ培養培地中、３８℃でコン フルエンス近くまで成長させた。次に、該細胞を、Ｃａ²⁺もＭｇ²⁺も含有しない リン酸塩緩衝塩溶液中でトリプシンを用いて分散させ、Ｄ−ＭＥＭに再接種した 。さらに培養した後、培地を吸引により除去し、ＰＢＳ、ベタイン、ガラクトー ス、ソルビトール、マンノース、トレハロース、ラフィノース、ラフィノース／ ＴＭＡＯ(１．６：１の比)、ラフィノース／ベタイン(１．６：１の比)、トレハ ロース／ＴＭＡＯ（１．６：１の比）およびトレハロース／ベタイン（１．６： １の比）のいずれか一つの溶液と置き換えた。４℃での異なる時間間隔での保存 後、保存溶液をアスピレーターで除去してＤ−ＭＥＭと置換した。骨芽細胞がそ の後コンフルエンスまで成長したものを成功した保存とした。図２２に示されて いるように、骨芽細胞はＰＢＳ中におけるよりも本発明の溶液中の保存でさらに かなり長い期間生き延びた。骨芽細胞は胚よりも浸透度での変動に対してより耐 性があることがわかった。 例１０ マウスＴ７Ｔケラチノサイト腫瘍細胞の保存における本発明の溶液の効能を次 の通り調べた。培養培地を、５％血清を補ったＤ−ＭＥＭで生育するＴ７Ｔの付 着培養物から吸引により除去し、４℃での保存前にＰＢＳまたは溶液７０／３０ と置換した。４、７、１２および１４日後に、これらの溶液を除去し、付着細胞 をトリプシン化処理により除去して、回収率を調べた。図２３は、生存可能なＴ ７Ｔ細胞はＰＢＳ中で生き延びなかったが、生存可能なＴ７Ｔ細胞は溶液７０／ ３０中で１４日間以内の保存後に回収されたことを示す。 例１１ マウス３Ｔ３線維芽細胞の保存における本発明の溶液の効能が次の通り示され た。 ５％血清を補ったＤ−ＭＥＭで成長する３Ｔ３細胞の付着培養物から培地を吸 引で除去し、４℃での保存前にＰＢＳまたは溶液７０／３０で置き換えた。１、 ７および１４日後に、これらの溶液を除去し、付着細胞をトリプシン化処理によ り除去して、回収率を測定した。図２４に示されているように、生存可能な３Ｔ ３細胞はＰＢＳ中で生き延びなかったが、生存可能な３Ｔ３細胞は溶液７０／３ ０中で１４日間以内の保存後に回収された。 例１２ この例は凍結以下の温度での血小板の保存における本発明溶液の有効性を示す 。 生きた細胞は、典型的には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の高濃度（ 約１０容量％）の凍結保護剤を含有する溶液中でゆっくりと凍結する。プログラ ミングされたフリーザーは、すべての水が凍結したと思われるまで温度を調節さ れた速度で低下させて、その時点で細胞は液体窒素に浸される。解凍も比較的ゆ っくりと行われる。これは、ＤＭＳＯが細胞に対して有毒であるという深刻な欠 点を有する冗長で費用のかかる方法である。 対照的に、本発明の溶液に置かれた細胞は液体窒素に浸されるか、または−１ ４０℃のフリーザーに置かれ、温度をできるだけ速く低下させた。それらを３７ ℃の水浴中でできるだけ速く解凍した。図３３ＡおよびＢは血小板を用いたこの 方法の成功を示す。血小板は血漿中に懸濁させるか、または凍結用バッグまたは 被覆されたガラスチューブのいずれかに入れられた溶液７０／３０ｃ２中に懸濁 さ せた。ＤＭＳＯを濃度を変えて、該溶液に加えた。チューブおよびバッグを−１ ４０℃に６日間置いた。次に、それらを迅速に解凍し、血小板の数とトロンビン 凝集について評価した。チューブおよびバッグに関する結果は連続した曲線上に あるので、表面効果は凍結において無視できることがわかった。最もよい結果が ＤＭＳＯを添加しなかった溶液７０／３０ｃ２で得られた。これにより平均でほ ぼ１００％のトロンビン凝集と５０％の血小板回収率が得られた。添加されたＤ ＭＳＯはほとんど違いをもたらさなかった。この迅速な凍結および解凍技術によ り、血漿さえも、ＤＭＳＯなしにほぼ５０％の凝集を与えた；これは添加された ＤＭＳＯによりほぼ１００％まで増加した。このトロンビン凝集のレベルを達成 するために加えられたＤＭＳＯ濃度は通常用いられる濃度のわずかに約１／５だ けであった。凍結のこの方法は多くの利点を有する：それは毒性のある化合物を 用いず、高価な装置を必要とせず、かつ、以下に示されるように、凍結からの回 復の困難な細胞においてもうまく利用可能である。 理論によって縛られることを欲しないが、細胞は、温度が低下するにしたがっ て通常の水とは異なる挙動をする分離された高密度が低密度の水の集団を通常含 有することから、上記技術が効果的であると本出願人は考える。高密度水は非常 に低い凍結点（−８０℃未満）を有し、遅い凍結および解凍プロセス中、液体の ままであり続け高い反応性を保ち続ける。したがって、それは細胞にとって非常 に損傷性を有し、細胞はほとんど死滅する。低密度水も凍結しないが、低密度で 不活性の液体から低密度で不活性のガラス状固体に移行する。氷は形成されない 。細胞が液体窒素に浸されるとき、該細 胞は高密度水がまだ液体で反応性がある温度範囲を非常に速く通過するので、細 胞損傷が起るには時間が十分でない。再び、迅速な解凍により、細胞はこの危険 な温度範囲を迅速に通過する。成功する凍結と解凍に対する他の要件は、イオン チャンネルが閉じ続けていとである。これは塩溶液系の溶液よりも本発明の保存 溶液を用いることにより達成される。 例１３ この例では、凍結以下の温度でのジャーカット細胞の保存における本発明の溶 液と方法の有効性を示す。 ジャーカット細胞は凍結するのが困難であると知られているヒト腫瘍細胞系で ある。ジャーカット細胞は典型的には１０％ＤＭＳＯと９０％ウシ胎児血清中で 凍結させる。その時でさえ、回収率はしばしば低い。ＤＭＳＯを有さない血漿中 で凍結すると、すべてのジャーカット細胞は死滅する。同様に、溶液７０／３０ Ｂ中でゆっくりと凍結すると、該細胞はすべて死滅する。図３４ＡおよびＢは、 溶液７０／３０Ｂ中、−１４０℃で急速に凍結させ、水浴中３７℃で急速に解凍 させたジャーカット細胞のトリチウム化チミジンの取込み率として測定された、 生存可能な細胞の回収率と細胞増殖をそれぞれ示す。細胞を遠心による損傷から 保護する試みで、遠心により細胞を成長培地から分離する前にハロタンを多様な 濃度で加えた。しかし、この保護は必要ではないことがわかった：ハロタンがな くとも生存可能な細胞の回収率はほぼ１００％であり、これらのうちチミジン取 込みは凍結前のほぼ７５％であった。 図３５は、ベンジルアルコールの添加によってジャーカット細胞を遠心による 損傷から保護した実験の結果を示す。該細胞は、１． ７５ｍＭのＣａＣｌ₂を含有する酸化トリメチルアミン(０．２９ＭＯｓＭ)、溶 液７０／３０またはＰＢＳのいずれか中で−１４０℃で急速に凍結させ、３７℃ で急速に解凍させた。細胞が遠心前に低い代謝状態にあったこの実験において、 添加された該アルコールは低濃度で有益な効果を有するように思えた。 これらの結果は、本発明の保存溶液と組み合わされた急速凍結解凍法の利用が 、凍結温度より低い温度での生きた生物学的物質の保存に非常に効果的であるこ とを明らかに示す。 例１４ この例は、本発明の溶液中では微生物の生育がないことを示す。 生きた生物学的物質の効果的な保存のためには、保存溶液中で微生物が生育し ないことが好ましい。溶液７０／３０ｃ２中の血小板懸濁液に、栄養ブイヨン中 、４℃で生育することが知られている２種類の微生物(イエルシニア・エンテロ コリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）とリステリア・ モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ))を接種し た。次に、血小板と微生物を４℃で３週間保存した。図３２に示されるように、 ２種類の微生物のいずれも持続的な成長を示さなかった。 本発明を特定の実施態様を用いて説明してきたが、変更および改良は、添付の 請求の範囲の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲から離れるこ となく実施できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ワトソン、ジェームズ ディー ニュージーランド オークランド リデル ロード 769

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生きた生物学的物質の保存用溶液であって、 （ａ）ラフィノース； （ｂ）酸化トリメチルアミン；および （ｃ）クエン酸ナトリウム を含んでなり、 保存すべき物質と等張であり、かつ、ヨウ化物、リン酸二水素塩、重炭酸塩、硝 酸塩および重硫酸塩を実質的に含まない溶液。 ２．該ラフィノースと酸化トリメチルアミンが約１．１：１〜約２．０：１のモ ル比で存在する請求項１に記載の溶液。 ３．該クエン酸ナトリウムが約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する請求項１に 記載の溶液。 ４．さらにカルシウムイオンを含有する請求項１に記載の溶液。 ５．該カルシウムイオンが、硫酸カルシウムおよび塩化カルシウムからなる群か ら選択される化合物からのものである請求項４に記載の溶液。 ６．保存すべき生物学的物質が哺乳動物物質であり、該溶液が約２８０ｍＯｓＭ 〜約３２０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１に記載の溶液。 ７．保存すべき生物学的物質が値物物質であり、該溶液が約７０ｍＯｓＭ〜約８ ０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１に記載の溶液。 ８．保存すべき生物学的物質が海洋物質であり、該溶液が約９００ｍＯｓＭ〜約 １０００ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１に記載の溶液。 ９．生きた生物学的物質の保存用溶液であって、酸化トリメチルアミノおよび塩 化ナトリウムを含んでなり、保存すべき物質と等張であり、かつ、ヨウ化物、リ ン酸二水素塩、重炭酸塩、硝酸塩および重硫酸塩を実質的に含まない溶液。 １０．さらに、カルシウムイオンを含む請求項９に記載の溶液。 １１．該カルシウムイオンが、硫酸カルシウムおよび塩化カルシウムからなる群 から選択される化合物からのものである請求項１０に記載の溶液。 １２．該酸化トリメチルアミンが、保存すべき物質と等張である酸化トリメチル アミン溶液の約６０％〜約８０容量％の量で存在し、該塩化ナトリウムが、保存 すべき物質と等張である塩化ナトリウム溶液の約４０％〜約２０容量％の量で存 在する請求項９に記載の溶液。 １３．保存すべき生物学的物質が哺乳動物物質であり、該溶液が約２８０ｍＯｓ Ｍ〜約３２０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項９に記載の溶液。 １４．保存すべき生物学的物質が植物物質であり、該溶液が約７０ｍＯｓＭ〜約 ８０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項９に記載の溶液。 １５．保存すべき該溶液が海洋物質であり、該溶液が約９００ｍＯｓＭ〜約１０ ００ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項９に記載の溶液。 １６．生きた生物学的物質の保存用溶液であって、酸化トリメチルアミン、クエ ン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含んでなり、保存すべき物質と等張であ り、かつ、ヨウ化物、リン酸二水素塩、重炭酸塩、硝酸塩および重流酸塩を実質 的に含まない溶液。 １７．該酸化トリメチルアミンが約１５０ｍＭ〜約２２０ｍＭの濃 度で存在し、該クエン酸ナトリウムが約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭの濃度で存在 し、該塩化ナトリウムが約３５ｍＭ〜約５５ｍＭの濃度で存在する請求項１６に 記載の溶液。 １８．保存すべき生きた生物学的物質が哺乳動物物質であり、該溶液が約２８０ ｍＯｓＭ〜約３２０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１６に記載の溶液。 １９．保存すべき生きた生物学的物質が植物物質であり、該溶液が約７０ｍＯｓ Ｍ〜約８０ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１６に記載の溶液。 ２０．保存すべき生きた生物学的物質が海洋物質であり、該溶液が約９００ｍＯ ｓＭ〜約１０００ｍＯｓＭの浸透度を有する請求項１６に記載の溶液。 ２１．水性液体の添加により、請求項１、９および１６のいずれか一項に記載の 溶液を形成する濃縮された液体溶液。 ２２．水性液体の添加により、請求項１、９および１６のいずれか一項に記載の 溶液を形成する固体の集合体。 ２３．生物学的物質の生存能力を保存する方法であって、該物質を請求項１、９ および１６のいずれか一項に記載の溶液と接触させる工程を含んでなる方法。 ２４．生きた生物学的物質の生存能力を保存する方法であって、 （ａ）該生物学的物質を請求項１、９および１６のいずれか一項に記載の溶液と 接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質を約４℃未満の温度で保持する 各工程を含んでなる方法。 ２５．生きた哺乳動物の生物学的物質の生存能力を保存する方法で あって、 （ａ）該生物学的物質を請求項６、１３および１８のいずれか一項に記載の溶液 と接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質を約４℃未満の温度に保持する 各工程を含んでなる方法。 ２６．生きた哺乳動物の生物学的物質が、器官、組織および細胞からなる群から 選択される請求項２５に記載の方法。 ２７．生きた哺乳動物の生物学的物質が、心臓、腎臓、肺、肝臓、幹細胞、骨髄 、胚、全血、血小板、顆粒細胞、赤血球、樹枝状細胞、卵母細胞、骨芽細胞およ び皮膚細胞からなる群から選択される請求項２５に記載の方法。 ２８．該生物学的物質が約０℃未満の温度で保持される請求項２５に記載の方法 。 ２９．生きた植物の生物学的物質の生存能力を保存する方法であって、 （ａ）該生物学的物質を請求項７、１４および１９のいずれか一項に記載の溶液 と接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質を約４℃未満の温度に保持する 各工程を含んでなる方法。 ３０．該生物学的物質が約０℃未満の温度で保持される請求項２９に記載の方法 。 ３１．生きた海洋性の生物学的物質の生存能力を保存する方法であって、 （ａ）該生物学的物質を請求項８、１５および２０のいずれか一項に記載の溶液 と接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質を約４℃未満の温度に保持する 各工程を含んでなる方法。 ３２．該生物学的物質が約０℃未満の温度に保持される請求項３１に記載の方法 。 ３３．生物学的物質の生存能力を保存する方法であって、 （ａ）該生物学的物質を請求項１、９および１６のいずれか一項に記載の溶液と 接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質と溶液の温度を約−８０℃以下の温度まで低下させ、それ により該生物学的物質と溶液を凍結する 各工程を含んでなる方法。 ３４．該生物学的物質の温度を約−１４０℃以下の温度まで低下させる請求項３ ３に記載の方法。 ３５．凍結された生物学的物質と溶液を迅速に解凍することをさらに含んでなる 請求項３３に記載の方法。 ３６．該溶液が従来の凍結保護剤を実質的に含まない請求項３３に記載の方法。 ３７．従来の凍結保護剤の非存在下において凍結温度で生物学的物質の生存能力 を保存する方法であって、 （ａ）該生物学的物質を請求項１、９および１６のいずれか一項に記載の溶液と 接触させ；そして （ｂ）該生物学的物質と溶液の温度を迅速に約−８０℃以下の温度まで低下させ 、それにより該生物学的物質と溶液を凍結する 各工程を含んでなる方法。 ３８．生物学的物質の温度を約−１４０℃以下の温度まで低下させる請求項３７ に記載の方法。 ３９．凍結された生物学的物質と溶液を迅速に解凍することをさらに含む請求項 ３７に記載の方法。