Publlshcd: For twc-leuer cades and ot tr abbrrviatiom, rtfer to the "Guid- — wiih iruernaiionol starch rtpori anee N oies on Codes andA bbrtviations " appearing at tht begin- ning of ta h regular issue of tht PCT Gaztut. (88) Date of publlcation of the International icarch report: 25 July 200:
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DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DE UN MICROBIO O SUSTANCIA
RELACIONADA EN UNA UBICACIÓN
Campo de la Invención La presente invención proporciona un nuevo indicador para la detección in situ de la presencia de una sustancia o microbio en una ubicación, y métodos para su uso y construcción. Antecedentes de la Invención Para una variedad de aplicaciones, es importante ser capaces de detectar la presencia de microbios en una ubicación de erminada, por ejemplo, para determinar si los productos alimenticios son seguros para su consumo o si una herida se ha infectado. Actualmente hay una variedad de métodos para la detección de la presencia o ausencia de contaminación microbiana. Sin embargo, generalmente estos métodos requieren una valoración de pasos múltiples para llevarse a cabo en un laboratorio u otras instalaciones clínicas y no directamente en la ubicación en donde puede existir la contaminación microbiana. Durante el proceso de cicatrización, normalmente existe un serio peligro de que los microbios entren en el sitio de la herida, multiplicándose de esta forma y resultando en infección de la herida. Actualmente sólo hay
REF.146052 métodos clínicos indirectos para determinar esta condición. Esto es normalmente en un momento en el cual la infección ya se ha reafirmado y se considera que es seriamente dañino para el paciente. En casos extremos, esto resultará en septicemia. Por otra parte, se sabe bien que un cambio demasiado frecuente de los apósitos del paciente conlleva a una cicatrización subóptima de la herida. Se han propuesto una variedad de sistemas que pretenden otorgar al personal de enfermería una advertencia anterior del exudado que sobresale a través de la superficie o los bordes de un apósito y de esta forma se proporciona una indicación de cuándo deberá reemplazarse un apósito. Estos incluyen los apósitos SigmaDress (marca comercial) , disponible de Bristol Myers Squibb, el cual tiene una película de cubierta transparente sobre la cual se imprime una línea circular. Cuando el exudado de la herida se absorbe por el apósito, es evidente un área de humedad a través de la hoja cobertura, y su dispersión hacia la línea indica que el apósito deberá cambiarse. El documento EP-A-0541251 describe una almohadilla que incluye un sustrato que permite que se pueda observar a través de ésta, la extensión o magnitud de la absorción del exudado de la herida. El documento WO-A-99/12581 describe un aposito para heridas que incluye una capa indicadora que contiene un colorante que cambia su color al momento de hacer contacto con el agua.
Se han propuesto otros sistemas, que pretenden darle al personal de enfermería una indicación de cuándo ae ha de reemplazar un apósito. Por ejemplo, el documento EP-A-0430608 describe un apósito para heridas que incluye una película de cristal líquido sensible a la temperatura (termosensible) ; no hay medios evidentes para distinguir las posibles causas de un incremento en la temperatura, que pueden ser o no ser indicativos de la necesidad de cambiar el apósito. El manejo actual de las heridas se lleva a cabo principalmente en una base enteramente subjetiva. Ninguno de los sistemas propuestos anteriormente proporciona una indicación de la condición de la herida o de la presencia de la contaminación microbiana en el sitio de la herida. En las industrias del cuidado personal, nutrición clínica, farmacéuticas, productos lácteos, bebidas y alimentos, existen métodos microbiológicos rápidos y tradicionales para monitorear la calidad de los productos durante e inmediatamente después del proceso de producción. Sin embargo, esta metodología tiene la desventaja que estas pruebas se llevan a cabo sobre una pequeña selección aleatoria del lote de la producción total, y por lo tanto solamente son útiles para indicar problemas de contaminación en bruto en el lugar de fabricación. No se proporciona ninguna información sobre la actividad microbiana al usuario final hasta el punto en el cual el producto está considerado que ha llegado al final de su vida en anaquel . Más aún, una vez que el empaque ha sido violado, por ejemplo la violación por la acción de abrirlo y una reutilización subsecuente del producto, los organismos oportunistas pueden contaminar el producto. La presencia de estos microorganismos pueden poner en peligro la calidad y características organolépticas del producto, comprometer su desempeño y acortar su tiempo de vida en anaquel. También, los métodos tradicionales de la detección microbiana tienden a ser selectivos y pueden fallar en la detección de ciertas especies de organismos. Los microorganismos de una particular preocupación incluyen las pseudomonas oportunistas que son organismos ambientales hallados en el suelo y en el agua. Estas bacterias tienen unas necesidades nutricionales mínimas y pueden metabolizar y crecer casi en cualquier parte. Otros organismos peligrosos de preocupación para los consumidores incluyen COPIAR en la carne de res, E.coli, listeria en los quesos suaves y salmonella en los productos avícolas. Las formas particularmente vulnerables de productos alimenticios incluyen los productos lácteos COPIAR (con tratamiento ultratérmíco) /ESL (con vida en anaquel extendida), productos para cocinar y enfriar y carnes crudas. Los consumidores se están volviendo más demandantes y esperan que los productos contengan más ingredientes naturales con menos conservadores, junto con los requerimientos adicionales de tener una vida en anaquel más larga y la habilidad de sobresalir bajo condiciones difíciles. Estas tendencias de los clientes son poderosas y pueden incrementar el riesgo de contaminación tanto en el lugar de fabricación y mientras que el producto se encuentra en uso en las manos del cliente. Por lo tanto, está clara la necesidad de un método para proporcionar una verificación continua sobre el nivel de biocarga en estos productos. Descripción de la Invención Según la invención, se proporciona un indicador adecuado para detectar la presencia de una sustancia o un microbio en una ubicación, este indicador comprende: a) una capa la cual es susceptible a la degradación por la sustancia o microbio o una primera sustancia asociada con el microbio; y b) una capa señalizadora que está adaptada para producir una señal detectable, en donde esta sustancia señalizadora indica la presencia de una sustancia o microbio o una segunda sustancia asociada con el microbio u otra sustancia que está sustancialmente en la misma ubicación que la sustancia o el microbio; en donde, durante el uso, la capa de señalización (b) está por lo menos inicialmente protegida del contacto con la sustancia o el microbio, o la segunda sustancia asociada con el microbio o la otra sustancia que está sustancialmente en la misma ubicación que la sustancia o el microbio por la capa (a) . La capa señalizadora puede adaptarse para producir una señal detectable cuya potencia inicial es proporcional a la cantidad de la sustancia, microbio o la segunda sustancia asociada con el microbio, que esté presente. Por lo tanto, cuando hay comparativamente una gran cantidad de la sustancia, microbio o de la segunda sustancia asociada con el microbio presente, la señal detectable es inicialmente fuerte o cuando hay comparativamente una pequeña cantidad de la sustancia, microbio o la segunda sustancia asociada con el microbio presente, la señal detectable es inicialmente débil. Se ha de entender que esta fuerza inicial de la señal es importante debido a que para algunas sustancias o microbios, la actividad de la sustancia o el microbio no se extingue al ponerse en contacto con la capa señalizadora. De este modo, luego de un período, incluso cuando la cantidad de la sustancia o el microbio es comparativamente pequeña, ha de actuar sobre la capa señalizadora hasta que la totalidad de la capa esté produciendo la señal detectable con el resultado de que la señal final detectable es fuerte. Una ventaja de la invención es que puede producir una indicación de cuándo la cantidad de una sustancia o microbio en una ubicación particular haya alcanzado la cantidad predeterminada, por ejemplo un nivel peligroso o, en el caso de un microbio en donde la ubicación es una herida en un humano o animal, un nivel en el cual pudiera desarrollarse la infección. Por ejemplo, cuando la ubicación está en un producto alimenticio, la cantidad de microbio a ser detectada puede ser una cantidad en la cual el producto alimenticio sea peligroso de ingerir. Otra ventaja de la invención es que puede cuantificar la respuesta corporal a la presencia de microbios en lugar de a los microbios en sí mismos. Por lo tanto, la invención proporciona una indicación más relevante de un problema clínico. Otra ventaja de la invención es que mientras que los métodos tradicionales de detección microbiológica tienden a ser selectivos y pueden fallar para detectar ciertas especies de microbios, la invención actual tiene la ventaja sobre estos métodos tradicionales de que produce una cuantificación de contaminación microbiana general y no específica . Otra ventaja de la invención es que el nivel ambiental de una primera sustancia que puede estar presente en una ubicación permitirá una señal positiva en el indicador sin importar de sí la sustancia contaminante o un microbio están presentes. El período requerido para que ocurra esta reacción es significativamente mayor que el período requerido para que ocurra una reacción cuando un microbio o sustancia contaminante están presentes, y por lo tanto puede proporcionarle al usuario una indicación de cuándo el producto ha alcanzado el final de su vida útil. La sensibilidad del indicador según la invención está determinada por la naturaleza de la capa (a) . Puede observarse que mientras más gruesa es la capa (a) , mientras más elevada es la cantidad de la sustancia, microbio o la primera sustancia asociada con el microbio, o mientras mayor es el período que la capa (a) está expuesta a la sustancia o microbio o a la primera sustancia asociada con el microbio, tendrá que ser antes de que la capa (a) se degrade lo suficiente para permitir que la sustancia o microbio o la segunda sustancia asociada con el microbio o la otra sustancia que está sustancialmente en la misma ubicación a la sustancia o microbio se puedan poner en contacto con el indicador . El grosor de la capa (a) el material utilizado para hacerla se seleccione preferiblemente según la ubicación a la cual el indicador se ha de utilizar, de manera tal que cuando el indicador esté diseñado para detectar la presencia de un microbio o sustancias asociadas con un microbio, la capa (a) se estructure de manera tal que la capa señalizadora produzca una señal detectable antes de que la concentración del microbio alcance un nivel peligroso. Por otra parte, la capa 9
(a) deberá ser lo suficientemente gruesa para que el período requerido antes de que se degrade por el nivel ambiental de un microbio o de una primera sustancia asociada con un microbio sea lo suficientemente largo para que el indicador tenga un período de vida útil. El grosor de la capa (a) el material utilizado para hacerla se pueden determinar fácilmente mediante ensayo y error por la persona de destreza en la técnica, cuando se conozca la ubicación en la cual el indicador se ha de utilizar y el tipo de microbio que probablemente estará presente. El indicador según la invención puede, opcionalmente , tener una gama de formas físicas dependiendo de la ubicación en la cual ha de colocarse. Por ejemplo, puede estar en forma de un disco que comprende dos capas (a) y (b) en una forma sustancialmente plana o la capa (b) puede estar en una forma sustancialmente plana y la capa (a) puede ser por lo menos una capa parcialmente o totalmente encapsulada (por ejemplo, al estar en forma acopada de manera tal, que una de las caras y los lados de la capa (b) están cubiertos por la capa (a) ) . Alternativamente, el indicador según la invención puede estar en forma tubular en donde el núcleo del tubo comprende la capa (b) y este núcleo está recubierto por la capa (a) . Un ejemplo de una forma tubular adecuada para el indicador según la invención es un hilo recubierto .
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La ubicación en la cual se ha de detectar la cantidad de una sustancia o microbio puede ser una ubicación en un humano o animal, particularmente en un cuerpo viviente de humano o animal, por ejemplo, en una herida; una ubicación doméstica, por ejemplo, una cocina o baño; una ubicación de laboratorio; una ubicación industrial, por ejemplo, un esterilizador o maquinaria o la superficie involucrada en la producción de productos farmacéuticos o productos alimenticios; o un producto alimenticio o un producto para el cuidado personal . La capa (a) está preferiblemente adaptada para que durante su uso, se coloque próxima a la ubicación. Puede ser, por ejemplo, de manera tal que separe la ubicación de la capa señalizadora. La capa (a) es preferiblemente una capa de biopolímero. Los ejemplos de los biopolímeros adecuados para utilizarse en la capa (a) incluyen quitina, quitosana, sulfato de queratán, ácido hialurónico, condroitina, polihidroxibutirato , amidas de poliéster, succinato de politrimetileno, polivinilpirrolidona , reticulada con albúmina y dextrano. La primera y la segunda sustancia asociadas con el microbio son opcionalmente la misma o diferentes; preferiblemente, son diferentes. Por ejemplo, la capa (a) puede ser susceptible a la degradación por una sustancia producida por la ubicación en respuesta microbio y la capa 11
señalizadora pueda adaptarse para indicar la presencia de una sustancia producida por el microbio. Alternativamente, la capa (a) puede ser susceptible a la degradación por un microbio y la capa señalizadora puede adaptarse para indicar la presencia de una sustancia asociada con el microbio o la capa (a) puede ser susceptible a la degradación por una sustancia asociada con un microbio y luego los medios de señalización pueden adaptarse para indicar la presencia de un microbio . La primera y la segunda sustancia asociadas con el microbio es una sustancia que se produce generalmente en la ubicación en donde está un microbio. Por ejemplo, puede ser un subproducto microbiano, una parte de los contenidos celulares del microbio o una sustancia asociada con la respuesta de la ubicación al microbio en donde la ubicación es un cuerpo vivo de humano o animal . Un ejemplo adecuado de un subproducto microbiano para utilizarse como la primera o segunda sustancia asociada con un microbio es una enzima, particularmente una oxidasa, lipasa, triptofanasa, beta-lactamasa o esterasa, deshidrogenasa , cinasa, hidrolasa, proteasa, nucleasa, fosfatasa, descarboxilasa y/o carboxilasa. El subproducto microbiano también puede ser un fosfato orgánico que ocurre naturalmente como el trifosfato de adenosina (ATP) , un nucleótido de piridina como la nicotinamida adenina dinucleótida (NADH) o una flavina como la flavina adenina dinucleótida (FADH) . Un ejemplo adecuado de una sustancia asociada con la respuesta de la ubicación a un microbio en donde la ubicación es un cuerpo vivo de un humano o animal es una célula inmunitaria, un subproducto de célula inmunitaria o una enzima como la lisozima, pepsina o dextranasa. Un ejemplo adecuado de una célula inmunitaria para utilizarse como la segunda sustancia asociada con el microbio es un neutrófilo, basófilo o eosinófilo. En particular, cuando la capa (a) comprende quitosana, la primera sustancia asociada con el microbio puede ser lisozima, cuando comprende una amida de poliéster, la primera sustancia asociada con el microbio puede ser una proteasa, cuando comprende succinato de politrimetileno, la primera sustancia asociada con el microbio puede ser una lipasa, cuando comprende polivinilpirrolidona reticulada con albúmina, la primera sustancia asociada con el microbio puede ser pepsina, y cuando comprende dextrano, la primera sustancia asociada con el microbio puede ser dextranasa. La capa señalizadora puede adaptarse para indicar la presencia de otra sustancia encontrada sustancialmente en la misma ubicación a la sustancia o microbio. Por lo tanto, la señal se producirá cuando la sustancia o microbio o la primera sustancia asociada con el microbio hayan degradado lo suficientemente a la capa (a) para permitir que la otra 13
sustancia se ponga en contacto con el indicador. En consecuencia, la señal indica la presencia de la sustancia o el microbio. Un e emplo adecuado de la otra sustancia encontrada sustancialmente en la misma ubicación a la sustancia o el microbio, es una sustancia generalmente encontrada en el medio ambiente, como el agua. Alternativamente, un microbio por sí mismo puede actuar directamente tanto sobre la capa (a) como la capa señalizadora produciendo de esta forma la señal detectable. Por ejemplo, el microbio es un microorganismo, por ejemplo una bacteria, levadura u hongo. La capa señalizadora indica preferiblemente la presencia de un subproducto metabólico de un microbio o con mayor particularidad, de una célula bacteriana. Generalmente mientras va pasando el tiempo, la cantidad de microbios se multiplica y se incrementa la concentración del subproducto metabólico. Preferiblemente, la capa señalizadora indica la presencia de una enzima, con mayor particularidad de una enzima que es una esterasa, oxidasa, deshidrogenas , cinasa, hidrolasa, proteasa, nucleasa, fosfatasa, descarboxilasa y/o carboxilas . La señal detectable opcionalmente es visualmente detectable, audiblemente detectable o eléctricamente detectable; preferiblemente, es una señal visualmente detectable, por ejemplo, un cambio en el color. Por ejemplo, 14
la capa señalizadora comprende un colorante, tinte, una sustancia indicadora y/o un sustrato cromogénico o fluorogénico . En una modalidad, la capa señalizadora comprende un indicador sensible a la humedad como sílice o cloruro de cobalto. Preferiblemente, el colorante, tinte o sustrato son inicialmente de un primer color, pero al ponerse en contacto con una sustancia, microbio, una sustancia asociada con un microbio u otra sustancia que está ubicada sustancialmente en la misma ubicación a la sustancia del microbio, cambia de color. Los ejemplos de un colorante, tinte, sustancia indicadora o sustrato adecuado se incluyen el azul de metileno, azul de meldola, rojo fenol, fosfato de bromo-cloro-indolilo, amidoacridona de alanina, diacetato de fluoresceína y/o una sal de tetrazolio. Cuando la ubicación es una herida, es posible que la capa señalizadora cuantifique un incremento en células inmunitarias como neutrófilos, basófilos o eosinófilos como una respuesta a la infección. Esto puede lograrse haciendo que la capa señalizadora indique su presencia directamente o la presencia de sus subproductos químicos acompañantes. En consecuencia, la capa señalizadora puede comprender una valoración de anticuerpos o biovaloración como sea apropiado. Alternativamente, la capa señalizadora puede comprender un reactivo que cambia de color en presencia de un 15
cierto microbio. Las técnicas actuales de tinción en el laboratorio permiten la observación directa de microbios (particularmente de bacterias) . También es posible un sondeo de búsqueda de bacterias utilizando anticuerpos específicos para el antígeno, conjugados con un marcador apropiado para visualizar indirectamente a las células bacterianas, en la capa señalizadora. Alternativamente, la capa señalizadora comprende un indicador de pH que detecta así el pH en la ubicación se encuentra dentro de una cierta gama. Generalmente se sabe que la presencia de bacterias reduce el pH del medio en donde están presentes. Por ejemplo, el pH de un exudado de una herida ha de cambiar conforme la concentración de microbios en la herida se incrementa. La capa señalizadora se forma preferiblemente a partir de un material de membrana, por ejemplo, PVDF, nitrocelulosa , polisulfona, acetato celulósico, nailon, o un polímero con un componente hidrófilo. El indicador está opcionalmente adaptado de manera tal que durante su uso, la capa (a) se coloque de manera adyacente a la ubicación o la capa (a) se separe de la ubicación por una o más capas adicionales. Los ejemplos de las capas adicionales adecuadas incluyen una capa absorbente, una capa no adhesiva o una capa adhesiva y/o una capa protectora separable que protege la capa (a) del daño antes 16
de usarse (por ejemplo, puede tener la forma de una capa de papel aluminio separable) . Opcionalmente , el indicador está provisto con una capa protectora que cubre la capa señalizadora y la protege de la degradación debido a una sustancia externa, microbio o sustancia asociada con un microbio. Preferiblemente, la capa protectora es sustancialmente transparente a la señal detectable producida por la capa señalizadora. Cuando la señal detectable es una señal eléctricamente detectable, la capa protectora preferiblemente comprende porciones eléctricamente conductoras a fin de conectarse con la capa señalizadora. Opcionalmente, la capa protectora es lo suficientemente rígida para dar sostén al indicador y para conferirle rigidez estructural . Opcionalmente, el indicador está provisto con un collar para darle soporte y/o rigidez estructural. El collar puede opcionalmente estar provisto con una punta o medios adhesivos a fin de fijar el indicador en la ubicación. Preferiblemente, el indicador es para usarse en un ambiente en donde la capa señalizadora del indicador está protegida del contacto con el medio ambiente, por lo menos al inicio. El medio ambiente es preferiblemente un líquido, con mayor preferencia un ambiente acuoso; por ejemplo, un medio de cultivo tisular o un producto alimenticio. El indicador según la invención puede ser incluido de manera útil en un apósito para una herida o sutura. Según la invención, además, se proporciona un apósito para una herida, que comprende una capa de apósito y un indicador según la invención. Para los propósitos de esta especificación, el término "apósito" incluye vendas, es decir en donde la parte del sistema que se pone en contacto con la herida es parte de un producto mayor. Una ventaja de incluir un indicador según la invención en un apósito para una herida, es que puede indicar cuándo la herida necesita cambiarse. Esto es debido a que el indicador indicará cuando la infección en la herida alcanza un nivel predeterminado. Generalmente, este nivel se selecciona de manera tal que sustancialmente no hay riesgo de que el paciente se enferme. Por otro lado, el nivel es lo suficientemente elevado para que el apósito no sea reemplazado con demasiada frecuencia. La capa del apósito opcionalmente puede tener cualquier forma que se conozca generalmente en la técnica. Una descripción completa de los apósitos y del manejo de heridas, incluyendo los diversos tipos de capas para apósitos que pueden utilizarse en esta invención, puede encontrarse en "A Prescriber's Guide to Dreesings and Wound Management Materials" (marzo 1996) National Health Service, Wales; el contenido de este documento se incorpora en la presente por referenci .
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Por ejemplo, la capa del apósíto puede ser una almohadilla de gasa que tiene una o más capas, un aposito no adhesivo tipo gel como un hidrogel, un apósito de tipo gel adhesivo, un apósito hidrocoloide interactivo con fluidos capaz de adherirse tanto a superficies secas o húmedas de la piel o un apósíto hidrocoloide que incluye una capa de espuma polimérica . El apósito según la invención puede incluir opcionalmente otras capas como una capa adhesiva y/o una capa protectora separable. El apósito según la invención también puede estar provisto con un indicador sensible a la humedad adaptado para indicar cuando el apósito esté saturado con humedad. Un indicador sensible a la humedad adecuado es, por ejemplo, el cloruro de cobalto que cambia de azul y rosa en presencia de la humedad. El indicador está preferiblemente incluido dentro del apósito según la invención mediante moldeado, soldado o pegado a la capa del apósito. Cuando el indicador está en forma de un tubo o hilo, puede opcionalmente incluirse en el apósito según la invención al ser bordado junto con la capa del apósito. Opcionalmente, el indicador forma una parte integral del apósito de manera tal que la capa señalizadora está impregnada en un área de la capa textil del apósito a la cual la capa degradable está unida de manera tal que sus bordes y los bordes de la capa señalizadora están sellados. Una manera adecuada de llevar a cabo esto es la de recubrir una fibra o una capa textil primero junto con la capa señalizadora (b) y luego con la capa degradable (a) . El aposito según la invención además, puede opcionalmente comprender, por ejemplo en la capa del apósito, un componente convencional como un agente antiséptico, un agente antibacteriano y/o un emoliente. Según la invención, además se proporciona una sutura que comprende un indicador según la invención. El indicador puede unirse a un hilo o cable. En particular, el indicador puede incluirse en la sutura mediante moldeado, soldado o pegado o, cuando el indicador está en forma de un tubo o hilo, puede bordarse junto con la sutura. Según la invención, además se proporciona un empaque para el producto alimenticio o un producto del cuidado personal, este empaque comprende una capa del contenedor y un indicador según la invención. Preferiblemente, durante el uso, la capa (a) del indicador está en contacto con el producto alimenticio o el producto para el cuidado personal. Preferiblemente, el empaque según la invención está adaptado de manera tal que, durante el uso, una parte o la totalidad de la capa señalizadora está visible.
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La capa del contenedor utilizada en el empaque según la invención puede comprender un material que se conozca generalmente en la técnica. Por ejemplo, puede comprender una o más capas de materiales políméricos, plásticos o de papel, por ejemplo, material polimérico laminado, plásticos o papel. Preferiblemente, el indicador esté incluido dentro de la capa del contenedor, por ejemplo, mediante moldeado, soldado o pegado. Alternativamente, el indicador puede formar una unidad por separado que está unida o insertada directamente en el producto. Una ventaja del empaque es una invención es que puede dar una indicación visual de cuándo el producto alimenticio no es apto e incluso inseguro para el consumo debido a que el nivel de contaminación microbiana del producto alimenticio está inaceptablemente elevado. Esto es evidentemente más seguro que confiar en las fechas convencionales de "úsese antes de" que generalmente están impresas en el empaque de los productos alimenticios, bebidas Y productos para el cuidado personal . Otra ventaja del indicador según la invención es que puede monitorear la actividad microbiana a través de toda la vida útil del producto, otorgando una indicación continúa de si la biocarga ha alcanzado un nivel inaceptable y por lo tanto es una medida sobre la eficacia o aptitud continua del producto para utilizarse o consumirse.
Los aspectos de la invención están ilustrados con referencia a las siguientes figuras que no pretenden limitar el alcance de la invención descrita: La Figura 1 es una vista esquemática en perspectiva de una lisozima y microbios; La Figura 2 es una vista esquemática en perspectiva de los microbios bajo el ataque de una lisozima y liberando NADH (forma reducida de nicotinamida adenina dinucleótida) ; La Figura 3 es una vista esquemática en perspectiva de una lisozima degradando una capa de quitoaana; La Figura 4 es una vista esquemática en perspectiva del NADH reaccionando con una capa indicadora; La Figura 5 es una vista esquemática en perspectiva del NADH causando un cambio de color en la capa indicadora; La Figura 6 es una vista esquemática en perspectiva de un indicador según la invención; La Figura 7 es una vista esquemática de la sección transversal de un apósito tipo isla que incorpora el indicador según la invención que se muestra en la Figura 6 ; La Figura 8 es una vista esquemática en perspectiva del apósito tipo isla que se muestra en la Figura 7; La Figura 9 es una vista esquemática en perspectiva del apósito tipo isla que se muestra en la Figura 7, en donde la capa señalizadora del indicador está produciendo una señal visual detectable;
La Figura 10 es una vista de la sección transversal de un aposito tipo poliuretano que comprende el indicador según la invención que se muestra en la Figura 6 ; La Figura 11 es una vista en perspectiva del aposito tipo poliuretano que se muestra en la Figura 10; La Figura 12 es una vista en perspectiva de otro indicador según la invención que está en forma de un hilo recubierto ; La Figura 13 es una vista en perspectiva de un aposito textil incorporando el indicador según la invención que se muestra en la Figura 12, en donde la capa señalizadora del indicador est produciendo una señal visual detectable; La Figura 14 es una vista en perspectiva de otro indicador según la invención; La Figura 15 es una vista en perspectiva del indicador que se muestra en la Figura 14 junto con un producto alimenticio; La Figura 16 es una vista en perspectiva del indicador y del producto alimenticio que se muestra en la Figura 15, en donde la capa señalizadora del indicador está produciendo una señal visual detectable,- La Figura 17 es una vista en perspectiva de otro indicador según la invención adecuado para utilizarse con el envase para un alimento líquido; La Figura 18 es una vista en perspectiva del indicador que se muestra en la Figura 17 unido a un envase para un alimento líquido. La Figura 19 es una vista en perspectiva del indicador y el envase del alimento líquido que se muestra en la Figura 18, en donde la capa señalizadora del indicador está produciendo una señal visual detectable; La Figura 20 es una vista en perspectiva de otro indicador según la invención; La Figura 21 es una vista en sección transversal del indicador que se muestra en la Figura 20; La Figura 22 es una vista en perspectiva de un producto alimenticio que contiene el indicador que se muestra en las Figuras 20 y 21; La Figura 23 es una vista en perspectiva del producto alimenticio y del indicador que se muestra en la Figura 22, en donde la capa señalizadora de indicador está produciendo una señal detectable; Las Figuras 1 a 5 muestran de manera esquemática los principios bioquímicos que apuntalan un aspecto de la invención en donde la ubicación es una herida en un cuerpo vivo de humano o animal y la primera sustancia asociada con un microbio es una lisozima y la segunda sustancia asociada con el microbio es NADH. En estas Figuras, los microbios 1 se muestran siendo atacados por la lisozima 2 de manera tal que se libera NADH 3; la lisozima 2 degrada la capa 4 de 24
quitosana de manera que el NADH 3 puede reaccionar con la capa 5 indicadora que luego cambia de color como se muestra en la Figura 5. La Figura 6 muestra una primera modalidad de un indicador según la invención. El indicador 6 comprende una capa señalizadora en forma de un disco 7 y una capa 8 acopada biopolimérica. La capa 8 biopolimérica está acopada a fin de que una de sus caras y borde del disco 7 indicador esté cubierto por la capa. Las Figuras 7 a 9 muestran la aplicación del indicador 6 de la invención a un apósito 9 para heridas tipo isla que comprende una hoja 10 transparente superior, una almohadilla 11 del apósito y un indicador 6 (ó 6b cuando se activa y la capa señalizadora está produciendo una señal detectable) que comprende una capa 7 señalizadora y una capa 8 biopolimérica. La capa 7 señalizadora del indicador 6,6b es visible a través de la hoja superior transparente 10 del apósito 9. Las Figuras 10 y 11 muestran un apósito 12 tipo poliuretano que comprende una hoja 13 de apósito que tiene una ventana 14 por debajo que se coloca el indicador 6 que comprende la capa 7 señalizadora y la capa 8 biopolimérica. La Figura 12 muestra una segunda modalidad del indicador según la invención. El indicador 15 comprende una capa señalizadora que está en forma de un hilo 16 que está recubierto por la capa 17 biopolimérica. La Figura 13 un apósito 18 de tejido que comprende el indicador 15 que está bordado en la capa 19 del apósito. La Figura 14 muestra una tercera modalidad del indicador según la invención. El indicador 20 comprende una capa 21 señalizadora, una capa 22 biopolimérica y un collar 23 de soporte. Las Figuras 15 y 16 muestran un producto alimenticio 24 al cual está unido el indicador 20,20b por medio de un collar 23 de soporte. En la Figura 16, la capa señalizadora del indicador 20b está produciendo una señal visual detectable. La Figura 17 muestra una cuarta modalidad del indicador según la invención. El indicador 25 comprende una capa 26 biopolimérica, una capa 27 señalizadora y un collar 28 de soporte. Las Figuras 18 y 19 muestran un producto alimenticio 29 al cual está unido el indicador 25,25b por medio de un collar 28 de soporte. En la Figura 19, la capa señalizadora del indicador 25b está produciendo una señal visual detectable. Las Figuras 20 y 21 muestran una quinta modalidad del indicador según la invención. El indicador 30 comprende una capa 31 biopolimérica y una 32 señalizadora. Las Figuras 22 y 23 muestran un producto alimenticio 33 en un contenedor 34 en el cual se haya indicado el indicador 30,30b. En la Figura 23, la capa señalizadora del indicador 30b está produciendo una señal visual detectable. Se ha de entender que las Figuras se incluyen a manera de ejemplo solamente y que la invención cubre cualquier variante de las modalidades expuestas. La presente invención se ilustra aún más por medio de los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Ejemplo 1 - Formación de una Capa (a) Se forma una membrana de quitosana (poli (D-glucosamina) de la fórmula I)
Formula I para utilizarse como la capa (a) utilizando el método descrito a continuación: - Se prepara una solución homogénea de 1% (p/p) de quitosana al 60% purificado en 1% ácido acético mediante agitación continua durante la noche a 22°C (temperatura ambiente) . - Se transfieren 20 gramos de la solución a una placa de petri de poliestireno estéril (120 x 120 x 17mm) que se coloca en una superficie nivelada a 30°C durante varios días hasta que la solución se seca y se forma una membrana uni forme . - La membrana resultante se retira cuidadosamente y se neutraliza sumergiéndola durante un período de 1 hora en 100ml 2% (p/v) de solución de hidróxido de sodio. Luego, la película se lava en agua destilada varias veces durante un período de 1 hora. - La película hinchada luego se coloca entre placas de vidrio y se colocan en un horno de desecación hasta secar. - Luego, la película se retira de las placas de vidrio . Se utiliza quitosana deacetilado al 60% ya que se determinó de manera experimental que este nivel de deacetilación produce un material que tiene las características mecánicas y bioquímicas requeridas, es decir, un material que es lo suficientemente resistente para manejarse y que se degrada en presencia de lísozima. Ejemplo 2 - Determinación de la Concentración de la Sustancia Señalizadora Se seleccionaron para utilizarse como indicadores el azul de eldola (fórmula (II) y nitro azul de tetrazolio (fórmula III) .
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Formula III
El azul de Meldola ( 8 -dimetilamino-2 , 3 -benzofenoxazina) actúa como un donante de electrones para las sales de tetrazolio, como el nitro azul de tetrazolio para formar un producto insoluble de formazano. Este producto se colorea y se precipita fuera de la solución, produciendo una indicación visual de la presencia de donantes de electrones como NADH. La reacción se muestra a continuación: 2e" + 2H+ MB MBH2 MB¾ + Colorante de Tetrazolio TetH2 + MB
Los experimentos de optimización se llevaron a cabo para determinar las concentraciones de azul de meldola y nitro azul de tetrazolio a fin de que la formación del producto de formazano (y por lo tanto de color) se incrementara, lo que permitió que el azul de meldola se reciclara con inuamente. El NADH se utilizó como el donante de electrones. Las concentraciones de azul de meldola (cristales azules) y nitro azul de tetrazolio (solución amarilla translúcida) se mantuvieron tan bajo como fue posible para que su presencia; (i) no coloreara la mezcla de reacción al inicio del experimento, pero (ii) fuera lo suficientemente alta para detectar la presencia de concentraciones bajas de NADH. Por lo tanto, se determinó que con ??µp??? NADH como el donante de electrones, la velocidad de formación del color fue mayor con 50 µp??? de azul de meldola y 0.0025% de nitro azul de tetrazolio. La velocidad de reacción se determinó en 0.043 unidades de absorbencia (A) por minuto. Cuando el NADH fue reemplazado con suero fetal bovino, como se esperaba, no hubo producción de color, ya que no había un donante de electrones presente. Las suspensiones de células de S.aureus a una 30
concentración de aproximadamente 10 células/ml en suero fetal bovino, con 50 µ???? de azul de meldola y 0.0025% de nitro azul de tetrazolio, fueron capaces de inducir la producción de color a una velocidad de aproximadamente 0.04A/minuto . Para imitar las situaciones debidas, 10a células/ml de S.aureus celis cultivadas en suero fetal bovino se lisaron mediante varios métodos diferentes y se analizó como un donante de electrones. (i) Las células Usadas mediante un tratamiento por sonido y/o presión elevada (Célula a Presión Francesa) para liberar los componentes celulares, tuvieron velocidades de reacción de aproximadamente 0.06A/minuto . (ii) El tratamiento con penicilina de las células hasta durante un periodo de 1 hora, hicieron que la velocidad de reacción se incrementara a 0. llA/minuto. (iii) Exposición de las células a lisozima durante un período de hasta 1 hora resultó en una velocidad equivalente a 0.14A/minuto . En ausencia de azul de meldola, la velocidad de reacción fue de aproximadamente 0.036A/minuto . La formulación química para este modelo para cuantificar de manera efectiva de ??µp??? NADH por lo tanto se determinó en:
Azul de meldola 50µ?t??1 NBT 0.0025%
Ejemplo 3 - Presencia Señalizadora de una Sustancia Se estructuró una célula simple con dos cámaras separadas por una pared vertical de quitosana como se produjo en el Ejemplo 1 para demostrar la degradación del quitosana en forma dependiente del tiempo en presencia de lisozima. La cámara de la izquierda se llenó con un colorante azul al cual se agregó lisozima. La cámara derecha contiene agua. El quitosana entre las dos cámaras previene el flujo del líquido entre éstas. La difusión del color entre las cámaras se examinó durante un período de hasta 30 minutos. Se hicieron pruebas en los testigos apropiados donde no estaba presente la lisozima . Se utilizaron dos concentraciones de lisozima (25 y 50 g por mi) , y la intensidad del color visible en la segunda cámara hasta un período de 30 minutos fue determinada. Y de esta forma se determinó una estimación aproximada de la velocidad relativa de degradación del quitosana por la lisozima. Los resultados se presentan en la siguiente tabla, mientras más intenso se observó el color, más resultados positivos fueron indicados. No hubo lisozima presente, no se observó difusión del color.
Tiempo (mins) Concentración de lisozima (mg/ml) 0 25 50 0 - - - 10 - + ++ 30 - ++ ++++
Se demostró claramente en este modelo, que se pueden discriminar de una manera cualitativa dos niveles de lisozima . Luego se repitió el modelo experimental, utilizando azul de meldola y nitro azul de tetrazolio para señalizar la presencia de NADH. El trabajo experimental optimizó los niveles de NADH, NBT y azul de meldola requerido para producir una discriminación similar en este experimento del transcurso de tiempo. En este caso, la cámara izquierda se llenó con una solución de NADH y lisozima, mientras que la cámara derecha se llenó con una solución de azul de meldola y NBT. Este montaje fue una aproximación cercana al formato visualizado del producto final, y los resultados una vez más demostraron que el sistema podía discriminar entre los diferentes niveles de lisozima en una forma dependiente del iempo . Ejemplo 4 - Método para la Producción del Indicador La Patente de EE.UU. No. 5 911 937 (Capítol Specialty Plastics Inc) , el contenido de la cual se incorpora 33
por referencia, que detalla un método que permite la creación de canales microscópicos transmisores de interconexión a través de un polímero sólido e insoluble en agua. Estos canales proporcionan vías que facilitan la difusión de sustancias a través del polímero. Los canales se forman primero al mostrar un polímero, un agente de formación de canales y un componente activo, calentando la mezcla por arriba de la temperatura de difusión del polímero y luego permitir que se enfríe. La matriz polimérica resultante contiene una red estructural de canales interconectados que van desde la superficie de las partículas activas entrampadas. El material polimérico puede moldearse o conformarse en hojas o fibras. Los agentes adecuados para la formación de canales incluyen el poliglicol, polietilenglicol , EVOH, o glicerina. Cualquier material termoplástico puede utilizarse, incluyendo pero no limitándose a, polipropileno, polietileno, A S, poliestireno, policarbonato, nailon, FVC, elastómeros termoplásticos , poliéster y materiales termo aguables . Para producir un indicador de la presente invención como se muestra en la Figura 6, la capa señalizadora se moldea a partir de una mezcla de un polímero, un agente de formación de canales y las sustancias indicadoras, el azul de meldola y el nitro azul de tetrazolio para producir una matriz polimérica en forma del disco 7 mediante el método descrito anteriormente. La capa 8 del biopolímero acopado, se produce al: a) Moldear o hacer un vaciado de la condición del quitosana en forma de una copa con un grosor adecuado y con dimensiones internas adecuadas para proporcionar un ajuste de interferencia con el disco 7. El indicador 6 se ensambla al presionar el disco 7 en la capa 8 de biopolímero acopado a fin de que una de las caras y el reborde del disco indicador
6 esté en contacto con, y cubierto por, la capa del biopolímero . o b) Recubrir mediante aspersión con quitosana con un grosor adecuado en una de las caras y el borde del disco
7. Las dimensiones físicas del disco 7 y la cantidad de la sustancia indicadora retenida dentro, y el grosor y la composición química de la capa 8 biopolimérica son dependientes de la aplicación para el manejo de la herida para la cual se pretende utilizar el indicador. Ejemplo 5 - Segundo Método para la Producción de Indicador Para producir un indicador de la presente invención como se muestra en la Figura 6, las sustancias indicadoras, el azul de meldola y el nitro azul de tetrazolio se reviste mediante maculación, atomiza o recubre en una hoja de membrana de nitrocelulosa . La nitrocelulosa retiene las moléculas del indicador mediante cargas electrostáticas y de esta forma se previene la lixiviación de los reactivos a partir del indicador a través de la capa del biopolímero y hacia, por ejemplo, la herida. La capa señalizadora del indicador 6 luego se corta de la ho a de membrana de nitrocelulosa para formar el disco 7. La capa 8 de biopolímero acopado se produce al: a) Moldear o vaciar la fundición de quitosana en la forma de una copa de grosor adecuado y con dimensiones internas adecuadas para proporcionar un ajuste por interferencia con el disco 7. El indicador 6 se ensambla al presionar el disco 7 en la capa B de biopolímero acopado a fin de que una cara y el borde del disco 6 indicador esté en contacto con, y cubierto por, la capa de biopolímero. b) Recubrir por aspersión el quitosana en un grosor adecuado en una de las caras y el borde del disco 7. Las dimensiones físicas del disco 7, la cantidad de las sustancias indicadoras unidas a la membrana de nitrocelulosa y el grosor y la composición química de la capa 8 de biopolímero son dependientes de la aplicación para el manejo de la herida para la cual se pretende utilizar el indicador . Ejemplo 6 - Tercer Método para la Producción del Indicador Para producir un indicador de la presente invención como se muestra en la Figura 12, la capa señalizadora se 36
forma a partir de una mezcla de un polímero, un agente de formación de canales y las sustancias indicadoras, el azul de meldola y el nitro azul de tetrazolio, utilizando el método descrito en el Ejemplo 4 para producir una matriz polimérica en forma de un hilo 16. La capa 17 de biopolímero se produce al: a) Recubrir por aspersión el quitosana con un grosor adecuado sobre la superficie del hilo 16 o b) Sumergir el hilo 16 en un baño de quitosana para producir un recubrimiento con un grosor adecuado. El grosor del hilo 16 y la cantidad de la sustancia indicadora retenida dentro y el grosor y la composición química de la capa 17 de biopolímero son dependientes de la aplicación para el manejo de la herida para la cual se prefiere utilizar el indicador. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.