MXPA03001727A - Polipeptidos y polinucleotidos y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a enzimas novedosas que convierten la sacarosa a isomaltulosa. Mas particularmente la presente invencion desarrolla isomerasas de sacarosas novedosas, polinucleotidos que codifican estas isomerasas de sacarosa, metodos para aislar tales polinucleotidos y construcciones de acido nucleico que expresan estos polinucleotidos. Tambien son desarrollas celulas, celulas de bacterias o plantas particularmente transformadas y plantas diferenciadas que comprenden a las celulas las cuales contienen estas construcciones de acido nucleico. Metodos para la produccion de isomaltulosa que son el uso de los tambien desarrollados para polipeptidos, polinucleotidos, de las celulas y de las plantas de la invencion.

Description

POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Está invención se refiere generalmente a enzimas que convierten la sacarosa a isomaltulosa . Más particularmente, la presente invención se relaciona a isomerasas de sacarosa novedosas, a los polinucleótidos que codifican estas isomerasas de 'sacarosa, a los métodos para el aislamiento de tales polinucleótidos y a las construcciones del ácido nucleico que expresan estos polinucleótidos. La invención también se refiere a células, células de plantas o bacterias particularmente transformadas, y a las plantas diferenciadas que comprenden las células, las cuales contienen estas construcciones de ácido nucleico. La invención se relaciona además al uso de los polipéptidos , polinucleótidos, a las células y a las plantas de la invención para la producción de isomaltulosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El substituto de azúcar acariogénica , isomaltulosa (palatinosa) , es un eterodi s acárido compuesto de glucosa y fructuosa, enlazados juntos a través de un enlace de a-1, 6-glucósido. La isomaltulosa se puede producir en una gran escala mediante el re-arreglo enzimático de la sacarosa usando la isomerasas de sacarosa de enzima bacterial.

Inicialmente, la producción en gran escala, de la isomaltulosa se facilita- usando las células bacteriales inmovilizadas que producen naturalmente las enzimas de isomerasa de sacarosa (por ejemplo las especies de Protaminobacter rubrum, Erwinia rhapontisi y Serratia plymu thi ca) . Recientemente , rendimientos más elevados de la isomaltulosa han sido logrados usando técnicas recombinantes . En este aspecto Mattes y col. (Patente de E.U.A. Serie No. 5,786,140) desarrolla polinucleótidos aislados que codifican las enzimas de isomerasas de sacarosa de longitud completa o parcial, a partir de Protaminobacter rubrum (CBS 547,77) , Erwinia rhapontici (NCPPB 1578) , el microorganismo SZ 62 [Enterobacter especies) y el microorganismos MX-45 (FERM 11808 o FERM BP 3619) . Mattes y col., desarrollan las secuencias de los aminoácidos conservados, de los cuales los oligonucleótidos degenerados pueden ser designados para la clonación de los polinucleótidos que codifica la isomerasa de sacarosa mediante la reacción en cadena de polimerasa (RCP) .

En el trabajo que conduce la presente invención, los oligonucleótidos degenerados, basados en las secuencias de los aminoácidos conservados desarrollados por Mattes y col, son usados para amplificar a los polinucleó tidos que codifican la isomerasa de la sacarosa mediante la RCP a partir de Erwinia rhapontici (Número de acceso WAC2928), y de los 30 aislados independientes de bacterias negativas de isomerasa-sacarosa . La amplificación de la RCP proporciona los productos de ADN múltiples a partir de la mayoría de las bacterias probadas. Sin embargo estos productos se aprecia que no codifican la isomerasa de sacarosa. El análisis de la secuencia del ácido nucleico de los 12 productos separados de RCP, incluyendo los 6 productos amplificados de Erwinia rhapontici , revelan que ninguno de los productos de ADN tienen identidad de secuencia significativa para los genes de isomerasa de sacarosa. En su lugar la mayoría de estos productos muestran la identidad de secuencia elevada que conocen los genes de glucosidasa. Por lo tanto se concluye que las secuencias conservadas de Mattes y col., no son especificas para las isomerasas de sacarosa, pero que son comunes para otras clases de enzimas incluyendo las glucosidasas . No obstante lo anterior, los presentes inventores desarrollaron un ensayo de selección funcional novedoso para el aislamiento y la caracterización de los de las enzimas de isomerasa de sacarosa que produce la isomaltulosa que codifica los polinucleótidos novedosos Varios polinucleó tidos novedosos son clonados usando- este ensayo y algunos de estos se encuentra que codifican los polipéptidos con la actividad de la isomerasa de sacarosa superior en relación a aquellos mencionados por Mattes y col. La comparación de las secuencias del polipéptido deducido con la isomerasa de sacarosa conocida o las secuencias del polipéptido de la glucosidasa revelan un número de motivos conservadores, los cuales son únicos para las isomerasa de sacarosa, y que pueden por lo tanto ser usados ínter, alia para designar a los olí gonucl eótido s específicos de isomerasa de sacarosa. Tales oligonucleótidos son ventajosos porque proporcionan al mismo tiempo el fácil aislamiento de los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa, usando las técnicas de amplificación del ácido nucleico.

Los inventores han reducido los descubrimientos anteriores para poner en práctica las moléculas aisladas novedosas, las células r ecombinantes y las plantas para la producción de la isomaltulosa como se ya se ha descrito. De conformidad a esto, en un aspecto de la invención, se proporciona un método para el aislamiento de polinucleótidos novedosos que codifican las enzimas de la isomerasa de sacarosa que produce la isomaltulosa, este método comprende: (a) la obtención de una muestra ambiental a partir de una localización en que los organismos, capaces de convertir la sacarosa a isomaltulosa, tienen una ventaja selectiva; (b) la selección para los organismos que producen la isomaltulosa a partir de la sacarosa; y (c) el aislamiento de los polinucleótidos que codifican las enzimas de la isomerasa de la sacarosa que produce la isomaltulosa a partir de los organismos que producen la isomaltulosa, usando una prueba especifica para los polinucleótidos que codifican la isomerasa de la sacarosa, o una molécula de enlazamiento de antigeno especifica para las enzimas de isomerasa de sacarosa, en donde la prueba hibridiza bajo al menos las condiciones rigurosas bajas a los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa pero que no ibridizan bajo las mismas condiciones para los polinucleótidos que codifican la glucosidasa, y en donde la molécula que enlaza el antigeno es inmuno - inter-reactiva con las enzimas de la isomerasa de la sacarosa, aunque no es inmuno ínter- re activa con las glucosidasas . Adecuadamente, los polinucleótidos son aislados usando una prueba que consiste esencialmente de una secuencia de ácido nucleico que corresponde o es complementario a una secuencia de nucleotido que codifica una secuencia de consenso de isomerasa de sacarosa que se manifiesta en cualquiera de una de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 Y 24, o una variante de la misma, la cual preferiblemente tiene al menos 80% de la identidad de la secuencia de la misma. La secuencia del nucleotido comprende adecuadamente la secuencia que se manifiesta en cualquiera de una de SEQ ID NO: 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 o la variante de la secuencia del nucleótido de la misma la cual preferiblemente tiene al menos 60% de la identidad de la secuencia de la mi sma . Preferiblemente, la variante de la secuencia del nucleótido es capaz de hibidrizar a una de cualquiera de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 bajo al menos las condiciones rigurosas bajas. Adecuadamente, los polinucleótidos son aislados usando una molécula que enlaza al antigeno que es inmuno inter-reactiva específicamente con la secuencia del aminoácido seleccionados de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24, o una variante de la secuencia que tiene al menos el 80% de la identidad de la secuencia de la misma. De preferencia, el método comprende además, la selección o de otra manera el enriquecimiento para los organismos metabólicos de -isomaltulosa y sacarosa, que son capaces de usar tanto la sacarosa como la isomaltulosa como fuente de carbono para el crecimiento . Apropiadamente, la selección utiliza un ensayo que cuantifica la producción de isomaltulosa mediante un organismo.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende: (a) la secuencia del aminoácido que se manifiesta en SEQ ID NO: 8 o 10; o (b) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual es de por lo menos de 20 aminoácido en longitud; (c) una variante de (a) que tienen al menos 75% de la identidad de la secuencia de la misma; o (d) un derivado de cualquiera de (a) a (c) Preferiblemente, la variante tiene al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y aún más preferiblemente al menos 95% de la identidad de la secuencia para cualquiera de las secuencias de los aminoácidos como se manifiesta en SEQ ID NO: 8 y 10. De preferencia, la variante comprende la secuencia del consenso que se manifiesta en cualquiera de uno o más de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24 o variante de la misma. Apropiadamente, la variante de la secuencia de consenso tiene al menos 80%, de preferencia al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y aún más preferiblemente al menos 95% de la identidad de la secuencia en cualquiera de las secuencias de los aminoácido que se manifiestan en SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, y 24. En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido como se ha descrito antes ampliamente. De preferencia el polinucleótido comprende: (i) la secuencia del nucleótido que se manifiesta en SEQ ID NO: 7 y 9; o (ii) un fragmento activo . biológicamente de (a) el cual tiene, al menos 24 nucleótidos en longitud; o (iii) una variante del polinucleótido (a) que tiene al menos 70 % de la identidad de secuencia de 1 a mi sma . En una modalidad, la variante del polinucleótido tiene al menos 80%, y más preferiblemente al menos 90% de la identidad de la secuencia en cualquiera de uno de los polinucleótidos que se manifiestan en SEQ ID NO: 7 y 9. En otra modalidad, la variante del polinucleótido es capaz de hibridizar a cualquiera de uno de los polinucleótidos identificados por SEQ ID NO: 7 o 9, bajo al menos condiciones severas bajas, de preferencia bajo al menos condiciones severas medias, y más preferiblemente condiciones severas elevadas. De preferencia, la variante del polinucleó tido comprende una secuencia del nucleótido que codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en 5 cualquiera de uno o mas de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 2 . Apropiadamente, la secuencia de consenso es codificada mediante la secuencia del nucleótido que se manifiesta en cualquiera de una de SEQ ID NO: 27, ¦10· 28 , 29, -30, 31, 32, 33, 34 , 35 y 36 o de la variante de la secuencia del nucleótido de la misma. En una modalidad variante de la secuencia del nucleótido tiene al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, y aún más preferiblemente al menos 90% de 15 la identidad de la secuencia para cualquiera de una de las secuencias que se manifiestan en SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36. En otra modalidad, la variante de la secuencia del nucleótido es capaz de hibidrizar a cualquiera de 20 una de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27,28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, y 36 bajo al menos condiciones severas bajas, de preferencia bajo al menos condiciones severas medias, y más preferiblemente bajo condiciones severas elevadas. 25 En otro aspecto, la invención caracteriza un vector de expresión que comprende un polinucleótido, como se ha descrito antes, en donde el polinucleótido se enlaza funci onalmente como un polinucleótido re gul ador . En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula clonada que contiene un vector de expresión . Apropiadamente, la célula clonada es una bacteria u otra procarióta, o una planta celular u otra eucarióta . De preferencia, la planta es caña de azúcar (S accharum sp) u otras especies capaces de sintetizar y/o acumular sacarosa (por ejemplo remolacha) . La invención también se caracteriza por un método para la producción del polipéptido re combinante , como se ha descrito antes, ampliamente, que comprende: cultivar una célula clonada que contiene un vector de expresión como se ha descrito ampliamente, con anterioridad, tal que el polipéptido recombinante se exprese a partir del polinucleótido ; y aislar el polipéptido recombinante. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la producción de un fragmento activo biológicamente como se ha descrito antes, que compr ende : la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa asociada con un fragmento de un polipéptido de conformidad a SEQ ID NO: 8 o 10, la cual indica que el fragmento es un fragmento activo biológicamente. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la producción de un fragmento activo biológicamente como se ha descrito antes, ampliamente, que comprende: la introducción de un pol inucl eótido del cual un fragmento de un polipéptido de conformidad a SEQ ID NO: 8 o 10, se produce en una célula; y la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa, la cual indica que el fragmento es un fragmento activo biológicamente. En aún un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la producción de una variante del polipéptido de un polipéptido principal que comprende la secuencia que se manifiesta en SEQ ID NO: 8 o 10, o el fragmento activo biológicamente de la misma, que comprende: la producción del polipéptido modificado cuya secuencia se distingue del polipéptido principal mediante la substitución, eliminación o adición de al menos un aminoácido; y la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa asociada con el polipéptido modificado el cual indica que el polipéptido modificado es una variante del polipéptido. En otro aspecto, la invención contempla un método de producción de una variante del polipéptido de un polipéptido principal que comprende la secuencia que se manifiesta en SEQ ID NO: 8 o 10, o el fragmento activo biológicamente del mismo que comprende : la producción de un polinucleótido a partir del cual un polipéptido modificado como se ha descrito antes, se puede producir; la introducción del polinucleótido en una célula; y - la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa, la cual es indicativa del polipéptido modificado que es una variante del polipéptido. De conformidad, a otro aspectote la invención, se proporciona un método para la producción de isomaltulosa a partir de la sacarosa, método que comprende poner en contacto la sacarosa o un substrato que contiene la sacarosa, con el polipéptido como se ha descrito ampliamente con anterioridad, o con una célula clonada como se ha descrito ampliamente con anterioridad, por un determinado tiempo bajo condiciones suficientes para la producción de la i s omaltulos a . En otro aspecto la invención se basa en una molécula de enlazamiento del antigeno que es inmuno inter-reacti a específicamente con el polipéptido de la presente invención. En aún otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de enlazamiento del antígeno que es inmuno int er-reac tiva con una isomerasa de sacarosa aunque no es inmuno inter-r eactiva con una glucosidasa . De preferencia, la molécula de enlazamiento de antígeno es inmuno inter-reactiva con cualquiera de una secuencia de un aminoácido que se manifiesta en SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. Otro aspecto de la invención es proporcionar un método para la detección de un polipéptido y polinucleótidos específicos, que comprende la detección de la secuencia de: (a) SEQ ID NO: 8 ó 10, o un fragmento activo biológicamente del mismo con al menos 20 aminoácido de longitud, o una variante de estos que tienen al menos 75% de la identidad de la secuencia de la misma; o (b) Un polinucleotido que codifica (a) . En una modalidad .preferida, la secuencia de (b) se selecciona de SEQ ID NO: 7 ó 9 o un fragmento activo biológicamente activo del mismo con al menos 24 nucleótidos en la longitud, o una variante del polinucleotido de estos que tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia de la misma. De conformidad a otro aspecto de la invención, se proporciona un método de detección de la isomerasa de sacarosa en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con una molécula de enlazamiento del antígeno como se ha descrito ampliamente con anterioridad; y - la detección de la presencia de un complejo que comprende la molécula de enlazamiento del antigeno y el polipéptido, fragmento, variante o derivado en la muestra de contacto. En aún otro aspecto de la invención, se proporciona un método para la detección de un polipéptido, fragmento, variante o derivado como se ha descrito ampliamente con anterioridad, que comprende: la detección de la expresión en una célula de un polinucleotido que codifica el polipéptido, el fragmento, variante o derivado como se ha descrito ampliamente con anterioridad. En aún otro aspecto de la invención se proporciona una prueba para la interrogación del ácido nucleico para la presencia de un polinucleótido de codificación de isomerasa de sacarosa, que comprende una secuencia del nucleótido el cual se hibridiza bajo al menos condiciones severas bajas, a los polinucleótidos que codifican la isomerasa de la sacarosa, aunque no hibridiza bajo las mismas · condiciones a los polinucleótidos que codifican la glucosidasa . De preferencia la prueba consiste esencialmente de una secuencia del ácido nucleico el cual corresponde o es complementario a una secuencia del nucleótido que codifica una secuencia de consenso .de la isomerasa de la sacarosa que se manifiesta en cualquiera de una de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. Aún un aspecto adicional de la invención es para proporcionar una prueba que comprende una secuencia del nucleótido el cual es capaz de hibridizar al menos una porción de una secuencia del nucleótido que codifica SEQ ID NO: 8 y 10 bajo al menos condiciones severas bajas, de preferencia bajo condiciones severas medias, y más preferiblemente bajo condiciones severas elevadas. En una modalidad preferida, la prueba comprende una secuencia del nucleótido la cual es capaz de hibridizar al menos una porción de SEQ ID NO: 7 y 8, bajo al menos condiciones severas bajas. De conformidad a otro aspecto de la invención, se proporciona una célula de planta transformada que contiene un vector de expresión como se ha descrito ampliamente con anterioridad. En una modalidad preferida, la planta es. caña de azúcar (Saccharum sp) . En un aspecto aún adicional, la invención proporciona una planta diferenciada que comprende las células de las plantas que contiene un vector de expresión como se ha descrito ampliamente con anterioridad . En aún otro aspecto, la invención proporciona la is omaltulos a cultivada de una planta diferenciadas como se ha descrito ampliamente con anterioridad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS. La Figura 1. Conversión de la sacarosa isomaltulosa en bacteria aislada. Picos: 1-sacarosa, 2-isomaltulosa, 3-fructuosa, 4-glucosa. El el ect ro for etogr ama "de puntos" es sacarosa y estándares de isomaltulosa. La Figura 2. Conversión de la sacarosa a la isomaltulosa en E. coli que expresa los genes de isomerasa de sacarosa clonados en el vector de SuperCos™. Picos: 1-sacarosa, 2-isomaltulosa, 3-fructuosa, 4-glucosa. El electroforetog ama de "puntos" es sacarosa y los estándares de isomaltulosa . La figura 3. La secuencia del nucleótido de la isomerasa de sacarosa clonada de Erwinia rhapontici. La Figura 4. La secuencia del nucleótido de la isomerasa de la sacarosa clonada de 68J. La figura 5. La secuencia del aminoácido predecible de la isomerasa de sacarosa clonada de Erwinia rhaponzici. La figura 6. La secuencia · del aminoácido predecible de la isomerasa de sacarosa clonada de 68 J. La figura 7. La eficiencia de la conversión de la sacarosa a isomaltulosa mediante E. coli que expresa los genes de isomerasa de sacarosa clonados. Los resultados son los promedios ± errores estándar derivados de tres réplicas. La Figura 8. La conversión de la sacarosa a isomaltulosa en tejido leñoso de caña de azúcar transformada estable que expresa los genes de isomerasa de sacarosa clonada. Picos: l-sacarosa, 2-isomal tulosa, 3-fructuosa, 4-glucosa. Trazas: a -pUbi Er + 2.5 mM de isomaltulosa, b - pUBi Er, c - pUbi 14S, d - 2.5 mM de sacaros y estándares de isomaltulosa, e - pUbi 68J, f- pUbi 68J + 2.5 mM de isomaltulosa .

BEREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS: TABLA SUMARIA . TABLA A Número ID de Secuencia Longi tud secuencia SEQ ID NO : 1 Secuencia que codifica la isomerasa 1899 bases de sacarosa de longitud total a partir de Erwinia rhapon fcici (No. de Acceso WAC2928) SEQ ID NO : 2 Secuencia de polipéptido de S32 residuos . isomerasa de sacarosa de longitud total a partir de Erwínia rhapontici (No. de Acceso WAC2928) SEQ ID NO : 3 Isomerasa de sacarosa madura que 1791 bases codifica la secuencia de pol i nu ele óti do a partir de Erwinia rhapontici (No. de Acceso WAC2928) SEQ ID NO : 4 Secuencia de polipéptido de 596 residuos isomerasa de sacarosa madura a partir de Erwinia rhapontici (No. de Acceso "WAC2928 ) SEQ ID NO : 5 Señal de péptido que codifica la 108 b ses relación de secuencia a la isomerasa de la sacarosa a partir de Erwinia rhapontici (No. de Acceso WAC2928) SEQ ID NO : 6 Relación del péptido de señal a la 36 residuos isomerasa se sacarosa de Erwinia rhapontici (No. de Acceso WAC2928) SEQ ID NO : 7 Secuencia de codificación de 1797 base s isomerasa de sacarosa de longitud total a partir del aislado bacterial 68 J SEQ . ID . NO : 8 Secuencia del polipéptido de 598 residuos somerasa de sacarosa de longitud total a partir del aislado bacterial 60 J SEQ . ID . NO : 9 Secuencia de p ol i n u ele ó tido que 1698 bases codifica la isomerasa de sacarosa madura a partir del aislado bacterial 68J SEQ . ID . NO: 10 Secuencia de polipéptido de 555 residuo isomerasa de sacarosa madura a partir del aislado bacterial 6SJ SEQ. ID . NO: 11 Relación de la secuencia de 99 base codificación del péptido de señal a partir del aislado bacterial 68J SEQ . ID . NO : 12 Relación del péptido de señal a la 33 residuos isomerasa de sacarosa a partir del aislado bacterial 6BJ Número ID de S e cuenca a longitud s ecuenci a SEQ ID NO : 13 Iniciador del 5' oligonucléotido 34 bases para la amplificación del aislado de 68 J SEQ ID NO : 14 Iniciador del 3' oligonucléotido 30 bas es para la amplificación del aislado de 68 J SEQ ID . NO: 15 Iniciador del 5' oligonucléotido 35 bases para la amplificación de Erwinia rhapontici (NO. de Acceso WAXC2928 ) SEQ ID NO: 16 Iniciador del 3' oligonucléotido 28 bases para la amplificación de Erwinia rhapontici (NO. de Acceso WAXC2928 ) SEQ ID NO : 17 Iniciador del 5' oligonucléotido 35 bases para la amplificación del aislado de 14S SEQ ID NO : 18 Iniciador del 3' oligonucléotido 30 bas es para la amplificación del aislado de 14S SEQ ID NO : 19 Secuencia de consenso de la 7 esiduo isomerasa de sacarosa SEQ ID NO : 20 Secuencia de consenso de la 10 res iduos isomerasas de sacarosa SEQ ID NO : 21 Secuencia de consenso de la 6 res i dúos i s ome rasas de sacarosa SEQ ID NO : 22 Secuencia de consenso de la 6 residuos isomerasas de sacarosa SEQ ID NO : 23 Secuencia de consenso de la 13 res iduos isomerasas de sacarosa SEQ ID NO : 24 Secuencia de consenso de la 16 residuos isomerasas de sacarosa SEG ID NO : 25 Secuencia de polinucle ótido que 594 bases codifica la porción terminal de carboxilo novedosa de la isomerasa de sacarosa a partir de Erwinia rhapontici (NO. de Acceso WAXC2928 ) SEQ ID NO : 26 Secuencia de polipéptido de la 197 residuos porción terminal de carboxilo novedoso de isomerasa de sacarosa a partir de Erwinia rhapontici (NO. de Acceso WAXC2928 SEQ ID NO : 27 Sub-s ecuencia de SEQ ID NO: 1 que 21 bases codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 19 Número ID de ? e cuencia Longitud s e cuenci a SEQ ID NO : 28 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 30 bas es codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO : 29 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 18 bas es codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO : 30 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 39 bas es codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO : 31 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 48 bases codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO : 32 Sub-secuenci de SEQ ID NO: 1 que 21 bases codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO : 33 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 30 bas es codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO : 34 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 18 bases codi6ica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO : 35 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 39 bases codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO : 36 Sub-secuencia de SEQ ID NO: 1 que 48 bas es codifica la secuencia de consenso que se manifiesta en SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO : 37 Péptido de banco Geys en 8 residuos SEQ ID NO : 38 Iniciador delantero en lo basado 17 bases por Mattes SEQ ID NO : 39 Iniciador reverso de base de 19 bases Mattes DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Definiciones Sin que se mencione de otra manera, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entienden comúnmente como aquellos de la técnica ordinaria a la cual la invención pertenece. Aunque cualquiera de los métodos o equivalentes a aquellos descritos se pueden usar en la práctica o en las pruebas de la presente invención, los métodos preferidos y los materiales son descritos. Para los fines de la presente invención, los siguientes términos son definidos abajo.

Los artículos "un" "una" son usados en la presente para hacer referencia a que uno o más de uno (por ejemplo al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por vía de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un el emento . El término "alrededor de" se usa en la presente para referirse a las secuencias que varían por tanto como 30%, de preferencia tanto como 20%, y más preferiblemente tanto como el 10% al término de una cantidad de referencia, nivel, valor, dimensión, longitud, posición, tamaño o cantidad. "Producto de amplificación" se refiere al producto del ácido nucleico generado por las técnicas de la amplificación del ácido nucleico. Por "molécula de enlazamiento del antigeno" significa una molécula que tiene afinidad de enlazamiento para un antigeno de blanco. Se entenderá que este término se extiende a las inmunoglobulinas , a los fragmentos de las inmunoglobulinas, y en las estructuras de proteínas derivadas de inmunoglobulinas que tienen actividad de enlazamiento del antígeno. Como se usa en la presente, el término" "enlazado específicamente " y lo similar se refiere a las moléculas de enlazamiento del antigeno que se enlaza a los fragmentos de polipéptido o al polipéptido, de la invención aunque no se enlacen significativamente a los polipéptidos homólogos de la técnica anterior. Por "fragmento activo biológicamente" significa un fragmento de un polipéptido principal de longitud total el cual fragmento retiene la actividad del polipéptido principal. " Un fragmento activo biológicamente por lo tanto comprende la actividad de la isomerasa de sacarosa, la cual se- convierte a la is omaltulos a . En otra modalidad, un fragmento activo biológicamente será un fragmento inmuno inter-e-activo como se define abajo. Como se usa en la presente, el término "fragmento activo biológicamente" incluye la eliminación de mutantes y péptidos pequeños, por ejemplo de al menos 8, de preferencia de al menos 10, más preferiblemente de al menos 20, y aún más preferiblemente al menos 30 aminoácidos contiguos, lo cual comprende las actividades anteriores. Los péptidos de este tipo se pueden obtener a través de la aplicación de las técnicas del ácido nucleico recombinante o ser sintetizados usando las técnicas de síntesis de fase sólida o de líquida convencional. Por ejemplo, se puede hacer referencia a la síntesis de solución o la síntesis de fase sólida como se ha descrito, por ejemplo, en el Capítulo 9, titulado "Síntesis de Péptidos " por Atheron and Shephard lo cual está incluido en la publicación bajo el título de " Synthetic Vaccines" editado por Nicholson y publicado por Blackwell Scientific Publications . Alternativamente, los péptidos se pueden producir sometiéndolos a la digestión de un polipéptido de la invención con proteinasas tales como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C y s taphylococcus V8-proteasa.

Los fragmentos que se sometieron a digestión se pueden purificar mediante, por ejemplo, las técnicas de cromatografía de líquidos de elevada realización (HPLC) . A través de esta descripción, sin que se mencione de otra manera en el contexto, las palabras "comprenden", "comprende" "comprendiendo" se entenderá que implica la inclusión de una etapa indicad o elemento o un grupo o etapas o elementos pero no la exclusión de cualquier otro tipo ¦ o elemento o el grupo de etapas o elementos. Por "corresponde a" o "correspondiendo a" significa un polinucl eó tido (a) que tiene una secuencia de nucleótido que es idéntica subs tancialmente o complementaria a todo o a una parte de una referencia de la secuencia de un pol inucl e óti do o (b) la codificación de una secuencia de un aminoácido idéntico a una secuencia de un aminoácido en un péptido o en una proteína. Esta frase también incluye dentro de su alcance un péptido o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es idéntica substancialménte a una secuencia de los aminoácidos en un péptido de referencia o de proteína. Por "derivado" significa un polipéptido que ha sido derivado de la secuencia básica mediante la modificación, por ejemplo mediante la conjugación o la formación de complejos con otras fracciones químicas o mediante las técnicas de modificación de post- traducción como debe entenderse en la técnica. El término "derivado" también incluye dentro de su alcance, las alteraciones que se hacen a las secuencias principales que incluyen las adiciones, o las eliminaciones que se proporcionan para las moléculas equivalentes funcionalmente . De conformidad a esto, el término derivado comprende las moléculas que tendrán la actividad de la isomerasa de sacarosa.

" Hibridiz ación" que se usa en la presente significa formar pares de las secuencias del nucleótido complementarias para la producción de un híbrido de ADN-ADN o de un híbrido de ADN-ARN. Las secuencias de las bases complementarias son aquellas secuencias que están relacionadas por las reglas del acoplamiento de base. En el ADN, los pares A con los pares T y C con G. En el ARBN, los pares U con los pares A y C con G. En este aspecto, los términos "adaptado" y "no adaptado" como se usa en la presente se refiere a la hibridación potencial de los nucleótidos en pares en las cadenas del ácido nucleico complementario. Los nucleótidos adaptados eficientemente hibridi zados , tales como los pares de base de A-T y G-C clásicos mencionados antes. Los no adaptados son otras combinaciones de nucleótidos que no hibridizan eficientemente. La referencia que se hace en la presente a "inmuno-interreactiva" se refiere a cualquier interacción, reacción u otra forma de asociación entre las moléculas y en particular en don una de las moléculas es, o por imitación un componente del - sistema inmune. Por "fragmento inmuno-ínterreactivo" significa un fragmento del polipéptido que se manifiesta en SEQ ID NO: 8 o 10, fragmento que causa una respuesta inmune, incluyendo la producción de los elementos que específicamente enlazan al polipéptido, o variante o derivado del mismo. Como se usa en la presente, el término "fragmento inmuno-interreactivo" incluye la eliminación de mutantes, y péptido pequeños, por ejemplo al menos 6, de preferencia al menos 8 y más preferiblemente al menos 20 aminoácidos contiguos, los cuales comprenden los determinantes antigénicos o epitopes. Varios de tales fragmentos pueden estar j u to s . Por "aislado" significa el material que esta substancialmente o esencialmente libre de componentes que lo acompañan normalmente en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado" como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido , el cual ha sido purificado de las secuencias en cuyo limite esta en un estado que ocurre naturalmente, por ejemplo el fragmento de ADN el cual ha sido eliminado de las secuencias las cuales están normalmente adyacente al fragmento. Por "gene marcador" se entenderá un gene que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan el gene marcador y por lo tanto permite que tales células transformadas sean distinguidas de las células que no tienen el marcador. Un gene marcador seleccionado confiere una característica para la cual puede ? seleccionarse ' basado en la resistencia del agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico, radiación, calentamiento u otro tratamiento que dañe a las células sin transformar) . Un gene marcador seleccionado (o un gene informador) proporciona una característica que uno puede identificar a través de la observación o de la prueba, por ejemplo mediante la selección (por ejemplo ß-glucoronidasa, luciferasa, u otras actividades enzimáticas no presentes en las células no transformadas) .

Por "obtenido " significa que una muestra tal como por ejemplo, un extracto de ácido nucleico se aisle a partir de o se derive de, una fuente particular. Por ejemplo, el extracto puede estar aislado directamente de cualquier organismo que metabolice sacarosa, de preferencia de un microorganismo que metabolice sacarosa, más preferiblemente de microorganismos de los géneros Agrobacterium, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Leuconostoc , Protaminobacter, Pseudomonas y Serxatia o de un microorganismo obtenido de un lugar en donde los organismos sean capaces de convertir la sacarosa a isomaltulosa, que tienen una ventaja selectiva como por ejemplo la descrita antes.

El término " oligonucleótido" como se usa en la presente se refiere a un polímero compuesto de una multiplicidad de unidades de nucleótido ( de s oxi rribonucl eóti do s , ribonucleótidos , o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos), unidos mediante los enlaces de fosfodiéster (o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos) . Por lo tanto, mientras que el término "oligonucleótido" típicamente se refiere a un polímero del nucleótido en el cual, los nucleótidos y los enlaces entre los mismos ocurren naturalmente, se entenderá que el término también incluye dentro de su alcance, varios análogos, que comprenden, aunque no restringidos a los ácidos nucleicos de péptido (ANPs), fosforamidatos, fos foro tioa tos , fosfonatos de metilo, ácidos de 2-0-itietil-ribonucl eicos , y lo similar. El tamaño exacto de la molécula puede variar dependiendo de la aplicación particular. Un ol i gonucl eótido es típicamente más corto en longitud, generalmente de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos, pero el término puede referirse a la moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucl eó ti do " o "ácido nucleico" es típicamente usando para oligonucleótidos grandes. Por "enlazado funcionalmente" se entiende que los ácido nucleicos reguladores de traducción y de transcripción son colocados en relación a un polinucleótido que codifica el polipéptido en una manera tal que el polinucleótido se transcribe y opcí onalmente el polipéptido se traduce. Como se usa en la presente "planta" y "planta diferenciada" se refiere a una planta completa o a una parte de la planta que contiene los tipos de célula de planta diferenciadas, tejidos y/o sistemas de órganos. Las plantas y las semillas están también incluidas dentro del significado de los términos mencionados. Las plantas incluidas dentro de la invención son cualquiera de las plantas dóciles a las técnicas de transformación, incluyendo las angiospermas , gimospermas, monodicotiledóneas y dicotiledóneas . El término células de planta''' como se usa en la presente se refiere a protopl as tos , o a otras células derivadas, de plantas, células de producción de gametos, y células que se regeneran en la planta completa. Las células de las plantas incluyen las células · en las plantas así también como los protoplastos u otras células en cultivo. Por "tejido de planta" significa tejido sin diferenciar y diferenciado a partir de raíces, tallos, polen, semillas, tejidos de tumor, tales como tumor de la raíz, y varias formas de agregación de células de plantas en cultivo, tales como embriones y te j ido leñoso . "Activador esencial" se refiere al activador que dirige la expresión de una secuencia de transcripción enlazada en la mayoría o en todos los tejidos de una pl anta . Por "activador específico de tallo", significa un activador que dirige pref erencialmente la expresión de una secuencia de transcripción que se enlaza funcionalment e en la caña o en el tejido del tallo de una planta, según se compare a la expresión en la hoja, raíz, o de otros tejidos de las plantas. El termino "polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa en la presente designa al mARN, ARN, cARN, cADN, o ADN . El término típicamente se refiere a los oligonucleótidos mayores que nucleótidos de longitud . El término" "variante de polinucleótido" y "variante " se refiere a los polinucleótidos que - tienen identidad de secuencia substancial con una secuencia de polinucleótido de referencia o polinucleótidos que hibridizan don una secuencia de referencia bajo condiciones severas, que son definidas después. Estos términos comprenden los polinucleótidos en los cuales uno o más de los nucleótidos han sido adicionados o eliminados, o reemplazados con nucleótidos diferentes. En este aspecto, se entenderá en la técnica que ciertas alteraciones inclusive, las mutaciones, adiciones, eliminaciones y substituciones se pueden hacer a un polinucleótido de referencia con lo cual el polinucleótido alterado retiene la función biológica o la actividad del polinucleótido de referencia. Los términos "variante del polinucleótido" y "variante " también incluye variantes alélicas que ocurren naturalmente . "polipéptido" r "péptido", y "proteína" son usados sin cambios en la presente para referirse a un polímero de los residuos de aminoácidos y a las variantes y a los análogos sintéticos del mismo. Por lo tanto estos términos se aplican a los polímeros de los aminoácidos en les cuales uno o más de los residuos de los aminoácidos es un aminoácido que ocurre no-natural o sintético, tal como un análogo químico, del aminoácido correspondiente que ocurre naturalmente, así también como a los polímeros del aminoácido que ocurren naturalmente. El término "variante del polipéptido" se refiere a los polipéptidos en los cuales uno o más de los aminoácidos han sido reemplazados por aminoácidos diferentes. También se entenderá en la técnica que algunos de los aminoácidos se pueden cambiar a otros, con propiedades similares ampliamente, sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido (substituciones conservadoras), como se ha descrito antes . Estos términos también comprenden a los polipéptidos en los cuales uno o más de los aminoácidos han sido adicionados o eliminados, o reemplazados con aminoácido diferentes . De conformidad a esto, las variantes de los polipéptidos como se usa en la presente comprende a los polipéptidos que tienen la actividad de la isomerasa de sacarosa. Por "iniciador" se entenderá un oligonucleótido el cual cuando se acopla a una cadena del ADN es capaz de iniciar la síntesis del producto de extensión del iniciador en la presencia de un agente de polimerización adecuado. El iniciador es de preferencia de una sola cadena, para la eficiencia máxima, aunque puede ser alternativamente de una doble cadena. Un iniciador debe ser lo suficientemente largo para iniciar la síntesis de los productos de extensión en la presencia del agente de polimerización. La longitud del iniciador depende de varios factores, incluyendo, la aplicación, la temperatura para ser empleada, las condiciones de reacción de los patrones, otros agentes, y la fuente de los iniciadores. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia de blanco, el iniciador del oligonucleótido típicamente contiene de 15 a 35 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Los iniciadores pueden ser polinucleótidos largos, tales como de desde aproximadamente 200 nucleótidos a varias kilobases o más. Los iniciadores pueden ser seleccionados para estar "complementario sub s tancialment e " , a la secuencia en los patrones a los cuales se les designa para hibridizar y sirven como un sitio para la iniciación de la síntesis. Por "complementario substancialmente" significa que el iniciador es complementario suficientemente para hibridizar con una secuencia de nucleótido de blanco. De preferencia el iniciador no contiene desadaptaciones con el patrón al cual se designa para hibridizar aunque esto no es esencial. Por ejemplo, los nucleótidos no complementarios, se pueden unir en el extremo 5' del iniciador, con el resto de la secuencia del iniciador que es complementaria al patrón. Alternativamente, los nucleótidos no complementarios o una reducción de los nucleótidos no complementarios pueden estar int er-esparcidos en un iniciador, con la condición de que la secuencia del iniciador tiene compl ementari edad suficiente con la secuencia del patrón para hibridizar con el y por lo tanto formar un patrón para la síntesis del producto de extensión de 1 ini ci ador . "Prueba" se refiere a una molécula que enlaza a una secuencia específica o sub-secuencia u otra fracción de otra molécula. Sin que se indique de otra manera, el término "prueba" se refiere típicamente a una prueba de polinucleótido que enlaza a otro ácido nucleico, llamado frecuentemente el "ácido nucleico de blanco" a través de las bases complementarias en pares. Las pruebas pueden enlazar los ácidos nucleicos de blanco que les falta la complementariedad de la secuencia completa. Con la prueba, dependiendo de la severidad de las condiciones de la hibridi zación . Las pruebas pueden ser marcadas directamente o indirectamente. El término "polinucleótido re combinante" como se usa en la presente se refiere a un polinucleótido formado in vitro mediante la manipulación del ácido nucleico en una forma no normalmente encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, el polinucleótido recombinante puede estar en la forma de un vector de expresión. Generalmente, -tales vectores de expresión incluyen el ácido nucleico regulador de traducción y de transcripción enlazado funci onalment e a la secuencia del nucleótido. Por "polipéptido recombinante" se entenderá un polipéptido que usa las técnicas recombinantes , por ejemplo a través de la expresión de un polinucleótido re combinante . El término n regeneración" como se usa en la presente en relación a los materiales de las plantas significa el crecimiento de una planta diferenciada o completa de una célula de planta, o un grupo de células de plantas, o una parte de una planta (incluyendo las semillas) , o una parte de una planta 5 (por ejemplo, los protoplastos , el tejido leñoso, o una parte del tejido) Por "molécula informador"' como se usa en la presente descripción significa una molécula que por su naturaleza química, proporciona una señal •10· identifieable analíticamente que permite la detección de un complejo que comprende una molécula de enlazamiento e antígeno y su antígeno de blanco. El término" molécula informador" también se extiende al uso de de la aglutinación celular o de la 15 inhibición de la aglutinación de tales células de sangre sobre bolitas de látex y lo similar. Los términos usados para describir la secuencia se relaciona entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos que incluyen la "secuencia de 20 referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de la identidad de secuencia" e "identidad substancial". Una secuencia de referencia" es de al menos 12, pero preferiblemente de 15 a 18 y frecuentemente de al menos 25 unidades 25 del monómero, inclusive, de los nucleótidos y de los residuos de los aminoácidos, en la longitud. Debido a que los dos polinucleotidos pueden comprender (1) una secuencia (por ejemplo solo una porción de la secuencia del polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleotidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleotidos, las comparaciones de la secuencia entre dos (o más) polinucleotidos están típicamente realizadas mediante la comparación de las secuencias de dos -polinucleotidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de la similitud de la secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 60, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia se compara a una secuencia de referencia del mismo número de las posiciones contiguas después de dos secuencias que están alineadas opcionalmente . La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (por ejemplo, espacios) de aproximadamente 20% o menos según se compare a la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones), para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de las secuencias para la alinear una ventana de comparación se puede conducir mediante herramientas de computación de algoritmos (GAP, BESTFIT , FASTA y TFASTA, en el isconsin Genetics Sofware Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group. 575 Science drive Madison, I , USA), o mediante la inspección y la mejor alineación (por ejemplo, el resultado en la similitud del porcentaje más alto sobre la ventana de comparación) generado por cualquiera de los varios métodos seleccionados. La referencia también se puede hacer a la familia de BLAST de programas como por ejemplo los desarrollados por Altchul y col., 1997, Nucí, Acids . Res 25:3389. Una discusión detallada del análisis de la secuencia se puede encontrar en Unit 19.3 de Ausol y col., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc. 1994-1998, Capitulo 15) . El término "identidad de secuencia" como se usa en la presente se refiere al grado en que las secuencias son idénticas sobre una base de nucí eótido-por nucleótido o una base de amino-ácido-por-aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, " un porcentaje de la identidad de secuencia" se calcula por la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente sobre la ventana de comparación, determinado el número de posiciones a las cuales la base del ácido nucleico idéntico (por ejemplo A, T, C, GG, I) o el residuo del aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, pro, Thr, Gli, Val, Leu, lie, Phe, Tir, Trp, Lis, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cis, y Met) ocurre en ambas secuencias con lo cual se obtiene el número de posiciones adaptadas, dividiendo el número de posiciones adaptadas por el número total de las posiciones en la ventana de comparación (por ejemplo, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 con lo cual se obtiene el porcentaje de la identidad de la secuencia. Para tales fines, de la presente invención, "identidad de secuencia" se entenderá que significa el "porcentaje adaptado" calculado por el programa de computación de DNASIS (Versión 2.25 para Windows, disponible de Hitachi Software engineering Co . , Ltd, South San Francisco, California, USA), usando las fallas estándar como se usa en el manual de referencia que acompaña al software. "similitud" se refiere al número de porcentaje de los aminoácidos que son idénticos o constituyen substituciones conservadoras como en define en la Tabla B infra. La similitud puede ser determinada usando los programas de comparación de secuencia tale scomo GAP (Deveraux y col., 1S84, Nucleic Acíds Research 12, 387-395). De esta manera, las secuencias de una longitud diferente similar o substancialmente a aquellas citadas en la presente pueden ser comparadas, mediante la inserción de gaps, en el alineamiento, tales gaps son determinados, por ejemplo, mediante la comparación del algoritmo usado por GAP. "Severidad" como se usa en la presente, se refiere a la temperatura, y las condiciones de concentración iónica y a la presencia o ausencia de ciertos disolventes orgánicos, durante la ibri di z a ci ón y los procedimientos de lavado. La mayor severidad, el mayor grado será complementaria entre las secuencias del nucleótido de blanco inmovilizado y las secuencias del polinucleótido de la prueba marcada que permanece hibridizada al blanco después de lavado. "Condiciones severas" se refiere a temperatura y a las condiciones iónicas bajo lo cual solo las secuencias de los nucleótidos tienen una frecuencia elevada de las bases complementarias que hibridiza. La severidad requerida es la secuencia del nucleótido dependiente y que depende de los varios componentes presentes en la hibridi zación y de los lavados subsecuentes, y el tiempo permitido para estos procedimientos. Generalmente, con el fin de maximizar el rango de hib idi zación , las condiciones de 5 hibridi zación no-severas son seleccionadas: a aproximadamente 20 a 25°C más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) . La Tm es la temperatura a la cual el 50% de la secuencia de blanco especifico de blanco a una prueba complementaria perfectamente en solución •10. a una concentración iónica definida y pH . Generalmente, con el fin de requerir al menos aproximadame te el 85 % de la compl ementari edad del nucleótido de las secuencias hibri di z ada s , las condiciones de lavado altamente severas, son 15 seleccionadas a aproximadamente 5 a 15°C más bajo que la Tm. Con el fin de requerir al menos aproximadamente el 70% de la complementariedad del nucleótido de las secuencias hibri di z ada s , las condiciones de lavados moderadamente severas, son seleccionadas para estar a 20 aproximadamente 15 a 30°C más abajo que la Tm . Las condiciones de lavado permitidas altamente severidad baja) pueden ser tan bajas como 50°C por debajo de la Tm que permite un nivel elevado de sin adaptación entre las secuencias hibridizadas . 25 Para aquellos expertos en la técnica, reconocerán que otros parámetros químico y físicos en la hibridización y las etapas de lavado pueden ser alteradas para afectar el éxito de la señal de hibridización detectable a partir del nivel específico de la compl ementariedad entre las secuencias de blanco y de prueba. Otros ejemplos de las condiciones severas son descritos en la sección 3.3. El término "transformación" significa la -alteración del genotipo de un organismo, por ejemplo una bacteria o una planta, mediante la introducción de un ácido nucleico endógeno o exterior. Por " transgenote" significa un producto intermedio de un procedimiento de transformación. Por "vector" significa la molécula del ácido nucleico, de preferencia una molécula derivada de ADN, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, o virus de una planta, en donde el ácido nucleico se puede insertar o clonar. Un vector preferiblemente uno o más sitios de restricción únicos, y pueden ser capaces de la replicación autónoma en una célula clonada definida incluyendo una célula de blanco o tejido o una célula del progenitor o un tejido del mismo, o ser integrada con el genoma de la célula clonada definida tal que la secuencia clonada es r eproducible . De conformidad a esto, el vector puede ser un vector de replicación autónomo, por ejemplo un vector que existe como una entidad extracromo somal , la replicación del cual es independiente de la replicación cromosomal, por ejemplo, un plásmido circulizado cerrado o lineal, un elemento extracromosomal , un mi ni cromo soma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la auto-replicación . Alternativamente, el vector puede ser uno, el cual, cuando se introduce en una célula, se integra en el genoma de la célula receptora, y replica junto con el (los) cromosoma(s) en la cual ha sido integrada. Un sistema de vector puede comprender un solo vector o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, los cuales contienen juntos el ADN total para que se introduzcan en el genoma de la célula clonada, o de un trasnposon. La selección del vector dependerá de la compatibilidad del vector con la célula en la cual el vector se puede introducir. El vector puede también incluir un marcador de selección tal como un gene resistente al antibiótico que se puede usar para la selección de los transformantes adecuados. Los ejemplos de tales genes de resistencia son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. 2. Polipéptldos aislados , fragmentos activos biológicamente , variante de polipéptido y derivados . 2.1 Polipéptido de la Invención La presente invención se refiere en parte a la determinación de la secuencia de una isomerasa de sacarosa a partir de Erwinia rhapontici (NO. de Acceso WAC2928) y la secuencia de la longitud total de una isomerasa de sacarosa novedosa a partir de aislado bacterial designado como 68J. La secuencia de del aminoácido de longitud completa de la isomerasa de sacarosa de Erwinia rhapontici , extiende 632 residuos e incluye 197 residuos adicionales de la secuencia terminal de carboxilo (que se manifiesta en SEQ ID NO: 26) , en relación a la secuencia mencionada por Mattes y col . r (supra) . El polipéptido de E. rhapontici incluye un guiador o un péptido de señal, que se manifiesta en SEQ ID NO: 6, el cual se extiende de los residuos 1 a aproximadamente 36 de la SEQ ID NO: 2. El péptido de péptido es necesaria solamente para la localización correcta del polipéptido maduro en una compartimiento de la célula particular (por ejemplo, la membrana exterior, en la membrana interior o en el espacio periplásmico entre la membrana exterior y la membrana interior) . El polipéptido maduro, se manifiesta en SEQ ID NO: 4, que se extiende desde aproximadamente el residuo 37 al residuo 632. De conformidad a esto en una de las modalidades, la invención proporciona un polipéptido precursor aislado de conformidad a SEQ ID NO: 2, el cual comprende un péptido guia de conformidad a SEQ ID NO: 6 que se une en un marco .con un polipéptido de conformidad a SEQ ID NO 4. En otro aspecto, la invención proporciona un polipéptido maduro aislado que comprende la secuencia que se manifiesta en SEQ ID NO: 4. La secuencia del amino ácido de longitud total de la isomerasa de sacarosa de 68J se extiende 598 residuos que se manifiestan en SEQ ID NO: 8, y comprende un péptido de señal, que se manifiesta en SEQ ID NO: 12, que se extiende de los residuos 1 a aproximadamente 33 de SEQ IDF NO: 8. El polipéptido maduro que se manifiesta en SEQ ID NO: 10, se extiende de aproximadamente el residuo 34 de SEQ ID NO: 8. Por lo en una modalidad, la presente invención se caracteriza por un polipéptido del precursor aislado de conformidad a SEQ ID NO: 8, el cual comprende un péptido guiador de conformidad a SEQ ID NO: 12, que se une en el marco con un polipéptido de conformidad a SEQ ID NO: 12 que se une en la estructura con el polipéptido de conformidad a SEQ ID 5 NO: 10. En otro aspecto, la invención contempla un polipéptido maduro aislado, que comprende la secuencia que se manifiesta en SEQ ID NO: 10. 2.2 Fragmentos activos biológicamente Los fragmentos activos biológicamente se pueden ¦10· producir- de conformidad a cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método adecuado puede incluir primero, la producción de un fragmento del polipéptido y luego probar el fragmento para la actividad biológica 15 apropiada. En un aspecto, el fragmento se puede probar parea la actividad de la isomerasa de sacaros. Cualquier ensayo que detecta o que mide preferiblemente la actividad de la isomerasa de sacarosa está contemplado por la presente invención. 20 De preferencia, la actividad de la isomerasa de sacarosa se determina por un ensayo de anilina/dif enilamina y la electroforesis capilar como se ha descrito antes. En otro aspecto, la actividad biológica del 25 fragmento se prueba mediante la introducción de un polinucleótido a partir, del cual un fragmento del polipéptido puede ser traducido en una células y la detección de la actividad de la isomerasa de sacaros, la cual es indicativa de que el fragmento es el fragmento activo biológicamente. La invención también contempla, los fragmentos activos biológicamente de los polipéptidos anteriores de al menos 6 y de preferencia de al menos 8 aminoácidos en la longitud, lo cual puede -proporcionar una respuesta inmune en un animal, para la producción de anticuerpos, que son inmuno- interreactivos con la enzima de la isomerasa de sacarosa de la invención. Por ejemplo, los fragmentos del polipéptido ejemplares de 8 residuos en longitud, los cuales pueden dar una respuesta inmune , incluyen, pero nci s e limitan a . los residuos 1-8, 9- 16, 17.24, 25-32, 33-¦40, 41-48 , 49--56, 57-64, 65-72, va80, 81-88, 97- 104, 105. 112 , 113- 120, 121- 128, 129- lse 137-144, 145-152, 153-160, 161-168, 169-176, 177 -184, 185-192, 193 -200, 201- 201, 109-216, 217-224 , 225 -232, 223-240, 241 -248 , 249- 256, 257-264 , 265-272, 273 -280, 281-288, 289 -296, 297- 303, 305-312 , 313-320 , 321 -328, 329-336, 337 -344 , 345- 352, 353-360 , 361-368, 369 -376, 377-384, 385 -392 , 393- 400, 401-408 , 409-416, 417 -424, 425-432, 423 -440, 441- 448, 449-456, 457-464, 465 -472, 473 -480 , 481-488 , 489-496, 497 -504 , 505- 512 , 513 -520, 521 -528 , 529-536, 537-544 , 545 -552 , 553- 560 , 561 -588, 569 -576, 577-584, 585-592, y ! 589-596 de SEQ ID NO: 2 o los residuos 1--8, 9-16, 17- 24, 25 -32, 33- 44, 41-48, 49-56, 57-64, 65-72, 73 -80, 81-88 , 89 -96, 97- 104 , 105- 112, 113-120, 121-128, 129 -136, 137- 144 , 145 -152, 153 -160, 161-168 , 169-176, 177 -184 , 185- 192 , 193 -200, 201 -208 , 209-216, 217-224, 225 -232 , 223- 240, 241 -248, 249 -256, 257-264 , 265-272, 273 -280 , 281- 288 , 289 -296, 297 -304 , 305-312 , 313-320, 321 -328 , 329- 336, 337 -344, 345 -352 , 353-360, 361-368, 369 -376, 377- 384 , 395 -392, 393 -400 , 401-408', 409-416, 417 -424 , 425- 432 , 423 -444, 441 -448 , 449-456, 457-464, 465 -472 , 473- 480 , 481 -488 , 48 -496, 497-504, 505-512, 513 -520 , 521- 528 , 529 -536, 537 -544, 545-552 , 553-560 y 559-566 de la SEQ ID NO: 4. En una modalidad preferí da de este tipo, el fragmento activo biológicamente comprende al menos una secuencia de consenso de isomerasa de sacarosa seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, o 24. 2.3 Variantes del polipéptido. La invención también contempla las variantes del polipéptido de la invención, en donde las variantes tienen la actividad de la isomerasa de sacarosa. Los métodos- adecuados de la producción de las variantes de polipéptido incluyen, por ejemplo, la producción del polipéptido modificado cuya secuencia se distingue de un polipéptido principal mediante la substitución, eliminación y/o la adición de al menos un aminoácido, en donde el polipéptido principal comprende una secuencia que pertenece a SEQ ID NO: 2,4, 8 y 10 o un fragmento activo biológicamente del mismo. El polipéptido modificado luego se prueba para la actividad de la isomerasa de sacarosa, en donde la presencia de tal actividad indica que el polipéptido modificado es la variante. En otro aspecto, una variante del polipéptido se produce mediante la introducción en una célula, un polinucleótido del cual un polipéptido modificado se puede traducir, y detectar la actividad de la isomerasas se sacarosa asociada con la célula, la cual es indicativa del polipéptido modificado que es la variante del polipéptido. En general, las variantes, tiene al menos el 60% , más adecuadamente al menos el 80%, de preferencia al menos el 805, y más preferiblemente al menos el 90% de similitud a un polipéptido, como por ejemplo se muestra en SEQ ID NO: 2,4, 8 y 10, o los fragmentos activos biológicamente del mismo. Es preferido, que las variantes tengan al menos 60 %, más adecuadamente al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y aún más preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia, con un polipéptido como por ejemplo que se muestra en SEQ ID NO: 2,4,8 y 10, o los fragmentos activos biológicamente de los mismos. En este aspecto, la ventana de comparación se espacia de preferencia aproximadamente la longitud total del polipéptido o del fragmento activo biológicamente. Las variantes adecuadas se pueden obtener a partir de cualquier organismo que metabolice sacarosa adecuada. De preferencia, las variantes, se obtienen a partir de las bacterias que metabolizan sacarosa como se describe en la -sección 3.3 infra. 2.4 Métodos para la producción de variantes de polipéptido . 2.4.1 Mutagénesis Las variantes del polipéptido de conformidad a la invención se pueden identificar ya sea racionalmente o mediante los métodos establecidos de mutagénesis (ver, por ejemplo, Watson, J.D. y col., "MOLECUALR BIOLOGY OF THE GENE", 4a edición, Benj amin/Cummings , Menlo Park, Calif . 1987) . Significativamente, una investigación de mut agéne s i s al azar requiere no una información a priorí acerca de la secuencia del gene que está para estar mutado. Esta investigación tiene 5 la ventaja de que se ensaya lo que es deseable de un mutante en particular basado en su función, y por lo tanto no requiere de un entendimiento de cómo o porque la proteina mutante resultante tiene adoptado una conformación particular. No obstante, la mutación "10" al azar de las secuenciad del gene de blanco han sido una investigación usada para obtener las proteínas mutantes que tienen las características deseadas (Leat erbarrow, R. 1986, J. Prot. Eng 1 : 7-16; Knowles, J. R., 1987, Science 236: 1252- 1258; Shaw, 15 W.V., 1987, Biochem J. 246: 1-17, Gerit, J. a. 1987, Chem. Rev. 87: 1079- 1105) . Alternativamente, en donde la alteración de la secuencia particular se desea, los métodos de mutagénesis directa de sitio pueden ser empleados. 20 Por lo tanto, tales métodos pueden ser usados para alterar selectivamente solo aquellos aminoácidos de la proteína que se piensan que son importantes (Craik, C.S., 1985, Science 228: 291-297; Cronin, y col., 1988, Biochem. 27: 4572- 4579; Wilks, y col. , 25 1988, Science 242: 1541-1544) Los péptidos variantes o los polipéptidos , que resultan de los métodos establecidos o racionales de la mutagénesis o de los métodos químicos de combinación, como se describen después, pueden comprenderlas substituciones de los aminoácidos de una manera conservadora. Los ejemplos de la substituciones co servador s en un polipéptido o en un fragmento de polipéptido de conformidad a la invención se pueden hacer de acuerdo a la siguiente "tabla: TABLA B Residuo Original Substituciones modelo Ala Ser Arg Lis Asn Gln, His Asp Glu Cis Ser Gln Asn Glu Asp Gli Pro His Asn. Gln lie Leu, Val Leu lie, Val Lis Arg, Gln, Glu Met Leu, lie Phe Met, Leu, Tir Ser Thr Thr Ser Trp Tir Tir Trp, Phe Val lie. Leu Los cambios substanciales en función se hacen mediante la selección de las substituciones que son menos conservadoras que aquellas que se muestran en la TABLA B. Otros re emp 1 a z ami e to s serán substituciones no conservadora, y relativamente más pocas de estas pueden ser toleradas. Generalmente, las substituciones que son similares para la producción de cambios mas grandes en las propiedades de los polipéptidos son aquellas en donde 8a) el residuo idrofílico (por ejemplo Ser o Thr) se substituye para , o por un residuo hidrofóbico (por ejemplo Ala, Leu, lie, Phe, o Val); (b) la cisteina o la prolina está substituida para o por cualquier otro residuo; (c) un resisado como una cadena lateral electropositiva (por ejemplo Arg, His, o Lis) se substituye para, o por un residuo electronegativo (por ejemplo Glu, o Asp) o (d) un residuo que tiene una cadena lateral de volumen (por ejemplo Phe o Trp) se substituye para, o por uno que tiene una cadena lateral mas pequeña (por ejemplo, ala, Ser) o sin cadena lateral (por ejemplo Gli) . Que constituyentes de las variantes adecuadas pueden ser determinados mediante las técnicas convencionales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de conformidad a SEQ ID NO: 2,4, 8 y 10 que se puede mutar usando ya sea una mutagénesis al azar por ejemplo usando la mutagénesis " de transposon, o la mutagénesis directa de sitio como se describe, por ejemplo en la Sección 3.3 infra . 2.4.2 Bancos de péptidos producidos mediante métodos químicos de combinación. Un gran número de tecnologías de combinación fáciles pueden ser utilizadas para la síntesis de los bancos moleculares con una diversidad inmensa. En el caso presente, las variantes de un polipéptido, o de preferencia de un fragmento de polipéptido de conformidad a la invención, se puede sintetizar usando tales tecnologías. Las variantes pueden ser seleccionadas subsecuentemente usando los métodos descritos en la Sección 2.3. De preferencia, los bancos de combinación del péptido sintético soluble (BCPSs) que se producen ofrecen la ventaja de trabar con los péptidos libres en solución, por lo tanto permite el ajuste de la concentr ción del péptido para tener un sistema de ensayo particular. Los BCPSs están adecuadamente preparados como exámeros . En este aspecto, una mayoría de sitios de enlazamiento se conocen para desarrollar cuatro a seis residuos. La cisterna es de preferencia excluida de las posiciones de la mezcla para evitar la formación de disulfuros y más dificultosa para definir a los polímeros. Los métodos modelo para la producción de los BCPSs son mencionados por Houghten y col., (1991, Nature 354; 84-86, 1992, Biotechniques 13 ; 412-421, Appel y col. (1992, Inmuno ethods 1: 17-23) y Pinilla y col. (1992, Biotechniques 13: 901-905; 1993, Gene 128, 71-76) . La preparación de los bancos de péptido sintético de combinación pueden ser empleados ya sea por los métodos químicos de t-butoxi carbonilo (t-Boc) o 9-flurofenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), (ver Capítulo 9.1, de Coligan y col., supra; Stewart and Young, 1984 , solid Phase Peptide , síntesis 2a- ed. Pierce Chemical Co . , Rockford, III, y Atheron and Sheppard, 1989, solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford), de preferencia, aunque no exclusivamente, usando algunas de dos investigaciones diferentes . La primera de estas investigaciones, terminan adecuadamente el méto-do de "síntesis fraccionada" o ,pr ocedimiento-f raccionado-r ecombinant e " , que es descrito primero por Furka y col., (1998, 14 ed. Int. Congr. Biochem, Praga Checoslovaquia 5: 47:1991, Int. J. Pept . Protein Res. 37: 487-493) y Lam y col., (1991, Nature 354: 82-84) , y revisada después por Eichler y col., (1995, Medicine Research Reviews 15(6) : 481-496) y Balkenhold y col., (1996, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 35 2288-2337) . Ampliamente, el método de síntesis fraccionado desarrolla la división de una pluralidad de soportes sólidos tales como perlas de polímero en n fraccione.s iguales representativas del número de los aminoácidos disponibles para cada una de las etapas de la síntesis (por ejemplo 20 L-amino ácidos ) , el acoplamiento de un solo aminoácido respectivo para cada uno de las perlas del polímero de la fracción correspondientes, y luego mezcla vigorosamente las perlas del polímero de todas las fracciones de una manera conjunta. Este procedimiento se repite por un total de x ciclos para la obtención de un conjunto probable de hasta Nx compuestos diferentes. El banco del péptido así producido se puede seleccionar para la actividad de la i-somerasa de sacarosa. Después de de la detección, algunas de las perlas positivas son seleccionadas para la secuencia de identidad del péptido activo. Tal péptido puede estar dividido subsiguientemente a partir de perlas, y se vuelve a ensayar como se ha mencionados antes. La segunda investigación, el método de la proporción química, se refiere a la preparación de las resinas de péptido mezcladas empleando una proporción específica de los- aminoácidos definidos empíricamente con lo cual se obtiene una incorporación equimolar de cada uno de los aminoácidos en cada una de las etapas de acoplamiento. Cada una de las perlas de resina contiene una mezcla de péptidos . La representación equimolar aproximada se puede confirmar mediante el análisis de los aminoácidos (Dooley y Houghten, 1993, Proct. Nati. Acad.Sci U.S. A. 90:10811-10815: Eichler y Houghten, 1993, Biochemistry 32: 11035- 11041) . De preferencia, el banco de péptidos sintéticos se produce en barras de polietileno, o ganchos, como un soporte sólido, como lo ha desarrollado por ejemplo Geysen y col (1986. Mol. Immunol. 23: 709-715) . Un banco de péptidos modelos de este tipo puede consistir de octapéptidos en los cuales la posición tercera y cuarta representan los aminoácidos definidos seleccionados d los aminoácidos naturales y no naturales, y en los cuales el resto de las 6 posiciones representan una mezcla aleatoria de los 5 aminoácidos. Este banco de péptidos puede estar representado por la fórmula Ac-XXOi02XXXX- S s [SEQ ID NO: 37], en donde S es el soporte sólido. La mezcla de los péptidos permanece en los ganchos para los fines de ensayo. Por ejemplo, un banco de péptido es '10' primero ' seleccionado para la disponibilidad de convertir la sacarosa a isomaltulos . La mayoría de los péptidos activos son luego seleccionados por una etapa adicional de ensayos que comprende el enlazamiento, al péptido de partida, un residuo 15 adicional (o mediante la modificación interna de los componentes del péptido de partida original) y luego la selección de este conjunto de candidatos para la actividad de la isomerasa de sacaros. Este procedimiento es repetido hasta que el 20 péptido con la actividad de la isomerasas de sacarosa desea este identificado. Uno identificando, la identidad del péptido unido al soporte de fase sólida, se puede determinar por la secuencia del péptido . 25 2.4.3 Mutagénesis de exploración de Alanina.

En una realización, la invención presente utiliza un análisis sistemático de un polipéptido o de un fragmento de polipéptido de conformidad a la invención para determinar los residuos en el polipéptido o en el fragmento que son desarrollados en la catálisis de la sacarosa a la i s omal tul os a . Tales análisis se realizan convenientemente usando la -tecnología del ADN recombinante . En general una secuencia del ADN que codifica al polipéptido o fragmento es clonada y manipulada de manera que pueda ser expresado en una célula clonada conveniente. La codificación del ADN al polipéptido o al fragmento se puede obtener a partir del banco genómico, a partir del cADN derivado del mARN en las células de expresión del polipéptido o del fragmento, o mediante la construcción sintética de la secuencia del ADN (Sambrook y col, supra; Ausubel y col, supra) . El ADN del tipo silvestre que codifica al polipéptido o al fragmento luego se inserta en un plásmido apropiado o vector como se ha descrito antes. En particular, las procariótas son preferidas para la clonación y la expresión de las secuencias del ADN con lo que se obtienen las variantes del polipéptido o el fragmento. Por ejemplo, E. coli K12 cepa 294 (ATTC NO. 31446) se puede usar, asi también como E. coli B , E. coli X1776 (ATTC NO. 31537) , y E. coli c600 y c600hfl, y E . coli W 3110 ( F" , ?" , prototrópi ca , ATTC No. 27325) , bacilos tales como Bacillus subtitlis, y otros enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens y varias especies de Pseudomonas . Una procariótica preferida es E. coli W3110 (ATCC No. 27325) . Una vez que el polipéptido o el fragmento esta clonado, la mutagénesis del sitio especifico como por ejemplo, lo descrito por Cárter y col., (1986, Nucí. Acids. Res. 13: 4331) o por Zoller y col., (1987, Nucí. Acids. Res. 10: 6487) , la mutagénesis de cásete como por ejemplo, la descrita por Wells y col., (1985, Gene, 34: 315) , la mutagénesis de selección de restricción, la descrita por ejemplo por Wells y col (1986, Philos. Trans R. Soc. London SerA, 317: 415) , o de otras técnicas conocidas pueden ser realizadas en el ADN clonado con el fin de obtener la variante del ADN que codifica para los cambios en la secuencia el aminoácido definida por los residuos que están substituidos. Cuando se enlazan f ncionalmente , a los polinucleótidos reguladores en un vector de expresión apropiado, los polipéptidos variantes son obtenidos.

En algunos casos, la recuperación de la variante puede ser facilitada mediante la expresión y la selección de tales moléculas a partir de la célula clonada de expresión mediante el uso una secuencia de señal apropiada enlazada funcionalmente a la secuencia del ADN que codifica la variante. Tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, otros métodos pueden ser empleados para la obtención de tales polipéptidos o fragmentos tales como la síntesis química in vitro de la variante del polipéptido deseado (Barany y col. En The Peptids, eds . E. Gross y J. Meienhofer (Academia Press: N.Y. 1979), Vol . 2, pp 3-254) Una vez que las variantes diferentes son producidas, se ponen en contacto con la sacarosa o con un substrato que contiene la sacarosa y la conversión a la isomaltulosa, si hay se determina por cada una de las variantes. Estas actividades de la isomerasa de la sacarosa son comparadas a la actividad del polipéptido principal o al fragmento para determinar en cual de aminoácido existe en el sitio activo una afectación en la isomerización de la sacarosa . La actividad de la isomerasa de la sacarosa de la principal y de la variante, respectivamente, se pueden medir por cualquiera de los ensayos convenientes como por ejemplo, los descritos en la presente. Mientras que cualquier número de mediciones analíticas se pueden usar para comparar las actividades, uno conveniente para la actividad enzimática es el de la constante Km de Michaelis de la variante según se compare al Km para el polipéptido principal o el fragmento. Generalmente, un incremento o una reducción de dos veces en Kra por el residuo análogo reemplazado por la substitución indican que el residuo o los residuos substituidos es o son activos en la interacción del polipéptido principal o fragmento con el substrato. Cuando un residuo del aminoácido conocido o esperado se somete al análisis de exploración del aminoácido, los residuos del aminoácido adyacentes al mismo serán analizados. El aminoácido analizado usado en tal análisis puede ser cualquier aminoácido diferente a partir del substituido, por ejemplo cualquiera de otros 19 aminoácidos que ocurren naturalmente. Tres polipéptidos substituidos por residuo se puede obtener. Uno contiene un aminoácido analizado, preferiblemente alanina en la posición N que es el aminoácido activo conocido o esperado. Los otros dos contienen el aminoácido analizado en la posición N+l y N-l . Si cada uno de los polipéptidos substituidos o fragmentos originan uno mayor que aproximadamente dos veces el efecto sobre la Km para el substrato, la exploración del aminoácido está 5 substituido en la posición N+ 2 y N-2. Esto se repite hasta al menos uno, y de preferencia cuatro, residuos que son idénticos en cada dirección, la cual tiene menos que aproximadamente un efecto doble sobre Km o hasta que ya sea de los extremos del polipéptido ¦10· principal o del fragmentos sean alcanzados. En esta manera, a lo largo de la secuencia el aminoácido continuo, uno o más de los aminoácidos que son desarrollados en la catálisis de la sacarosa a la isomaltulosa se pueden identificar. 15 El residuo del aminoácido activo identificado por el aminoácido analizado es típicamente uno que contacta la sacarosa directamente. Sin embargo, loas aminoácido activos pueden también contactar indirectamente la sacarosa a través de los. puentes 20 formados con otros o moléculas pequeñas tales como H2O o residuos iónicos tales como Na+, Ca2+ , Mg2+, o Zn2+. En algunos casos, la substitución del aminoácido analizado, en uno o más residuo resulta en un polipéptido substituido-residuo el cual no se expresa 25 a los niveles que permitan el aislamiento de las cantidades suficientes para llevar a cabo el análisis de su actividad de la isomerasa de sacarosa. En tales casos, un aminoácido analizado diferente, de preferencia un aminoácido isostérico se puede usar. Entre los aminoácidos analizados preferidos, son aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteina. La alanina en el aminoácido analizado -preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos similar para alterar la confirmación de la cadena principal de la variante. La alanina es también preferida debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en posiciones expuestas y enmascaradas (Creighton, The Proteins, W. H. Freeman & Co . , N.Y.; Chotia, 1976, J. Mol. Biol. 150: 1) . Si la substitución de la alanina no da cantidades adecuadas de la variante, el aminoácido isostérico se puede usar. Alternativamente, los siguientes aminoácidos en orden decreciente se preferencia se pueden usar: Ser, Asn, y Leu. Una vez que los residuos de los aminoácidos sean identificados, los aminoácidos isostéricos pueden ser substituidos. Tales substituciones isostéricas necesariamente no ocurren en todos los ejemplos y pueden ser realizadas. Antes de cualquier aminoácido sea identificado. Tal substitución del aminoácido isostérico se realiza para reducir los efectos disruptivos potenciales en la conformación de que algunas substituciones pueden originarse. Los aminoácidos isostéricos son mostrados en la tabla de ab aj o : TABLA C Aminoácido polipéptido Exploración isostérica de aminoácido Ala (A) Ser, Gli Glu (E) Gln, Asp Gln (Q) Asn, Glu Asp (D) Asn, Glu Asn (N) Ala, Asp Leu (L) Met, lie Gli (G) Pro, Ala Lis (K) Met, Arg Ser (S) Thr, Ala Val (V) lie, Thr Arg (R) Lis, Met, Asn Thr (T) Ser, Val Pro (P) Gli lie (I) Met, Leu, Val Het (M) lie, Leu Phe (F) Tir Ti (Y) Phe Cis (C) Ser, Ala Trt (W) Phe His (H) Asn, Gln El método de la presente se puede usar para la detección de los residuos de los aminoácidos dentro de los dominios diferentes de un polipéptido o de un fragmento de conformidad a la invención. Una vez que se hace esta identificación, varias modificaciones para el polipéptido principal o el fragmento se pueden hacer para modificar la interacción entre el polipéptido principal o el fragmento y su substrato. 2.4.4 Bancos de péptido y polipeptldo producidos mediante la exhibición de fago. La identificación de variantes pueden ser facilitada a través del uso de un sistema de selección de ligando de proteina de exhibición de fago (o fagémido) como el descrito por Lowman, y col (1991, Biochem. 30: 10832- 10832), Markland y col., (1991, Gene 109 13-19), Roberts y col. (1992, Proc. Nati. Acad. Sci (USA) 89: 2429-2433), Smith, G.P. (1985), Science 248: 1126-1128) y Lardner y col.-, (Patente de E.U.A. 5,223, 409) . En general, este método desarrolla la expresión de una proteina de unión en la cual el ligando de la proteina deseada se une al N-terminal de una proteina revestida viral (tal como la proteina revestida de M13 Gene III, o e una proteina revestida de lamba) . En una realización, un banco del fago es clonado para tener péptido novedosos dentro de las secuencias de proteínas revestidas de fago. Las secuencias del péptido novedosas, son generadas por la mutagénesis aleatoria de los fragmentos del gene codifican un polipéptido de la invención o un fragmento activo biológicamente usando una RCP con tendencia al error, o mediante la mutación in vivo de las células mutantes E.coli. Los péptidos novedosos tienen sobre la superficie del fago que están colocados en contacto con la sacarosa o con el substrato que contiene sacarosa. El fago que exhibe la proteina revestida tiene péptidos que es capaz de isomerizar 5 la sacarosa a isomaltulosa luego ' que son seleccionados. El fago seleccionado se puede amplificar y el ADM codifica sus proteínas revestidas que se pueden tener en secuencia. De esta manera, la secuencia del aminoácido del péptido embebido o '10· polipéptido puede ser deducido. En mayor detalle, el método desarrolla (a) la construcción de un vector de expresión replicable que comprende un primer gene de codificación de un polipéptido o fragmento de la invención, un segundo 15 gene que codifica al menos una porción de una proteína revestida de fago del tipo silvestre o natural, en donde los genes primero y segundo son heterólogos, y un elemento regulador de transcripción, que se enlaza funcionalmente a los 20 genes primero y segundo, con lo cual se forma una unión del gene que codifica una proteína de unión ; (b) la mutación del vector a una o más posiciones seleccionadas dentro del primer gene con lo cual se forma una familia de plásmidos relacionados; (c) la 25 transformación de las células clonadas adecuadas con los plásmidos; (d) la infección de las células clonadas transformadas con un fago sujetador que tiene un gene que codifica la proteina revestida del fago; (e) el cultivo de las células clonadas infectadas transformadas, bajo condiciones adecuadas para la formación de las partículas del fagémido recombinantes que contienen al menos una porción del plásmido y capaces de la transformación de la célula clonada, las condiciones ajustadas de manera que no "mas que una cantidad mínima de las partículas del fagémido tengan más de una copia de la proteína de unión sobre la superficie de la partícula; (f) poner en contacto las partículas del fagémido con la sacarosa o un substrato que contiene la sacarosa; y (g) la separación de las partículas del fagémido que isomerizan la sacarosa a isomaltulosa de estos que no son. De preferencia, el método comprende además, la transformación de las células clonadas adecuadas con las partículas del fagémido recombinante que isomeriza la sacarosa a isomaltulosa y la repetición de las etapas (d) a (g) uno o más veces. Preferiblemente, en este método el plásmido que está bajo control hermético del elemento regulador de transcripción, las condiciones del cultivo son ajustadas de manera que la cantidad o número de las partículas del fagémido exhiben más de una copia de la proteína de unión sobre la superficie de la partícula que es menos que aproximadamente 20%. Más preferiblemente, el número de las partículas del fagémido que exhiben más de una copia de la proteína de unión es menor que el 10% del número de las partículas del fagémido que exhibe una sola copia de la proteína de unión. Más preferiblemente, el número es menor que 1 % . Típicamente en este método, el vector de expresión contiene además, una secuencia de señal secreta que se une al ADN que codifica cada una de las sub-unidades del polipéptido y el elemento regulador de transcripción que será un sistema activador. Los sistemas de activación preferidos son seleccionados de lac Z, APL, tac, polimerasa T7, triptofano, y activadores de fosfatasa alcalina, y las combinaciones de los mismos. Normalmente, el método también puede emplear un fago auxiliar seleccionado de M13 07, M13R408, M13-VCS, y Phi X 174. El fago auxiliar preferido es M13K07, y la proteína revestida preferida es la proteína revestida de M13 del gene de fago III. La célula clonada preferida es E. coli, y las cepas deficientes de proteasa de E.coli.

Los ciclos repetidos de la selección de variante son usados para la seleccionar el enlazamiento de afinidad mayor y mayor mediante la selección del fagémido de los cambios del aminoácido múltiple que son seleccionados mediante los ciclos de selección múltiple. En seguida, una primera etapa de la selección del fagémido, que comprende una primera región o selección de los aminoácidos en el polipéptido del ligando, las etapas adicionales de la selección del fagémido en otras regiones de los aminoácidos del ligando del polipéptido son conducidos. Los ciclos de la selección del fagémido son repetidos hasta las propiedades de la afinidad deseada del polipéptido son logradas. Se apreciará que los residuos de los aminoácidos que forman el sitio activo del polipéptido o del fragmento pueden no estar enlazados s ecuencialmente y puede residir en subunidades diferentes del polipéptido o del fragmento. Esto es, el dominio de enlazamiento rastrea con la estructura secundaria particular el sitio activo y no la estructura primaria. Por lo tanto, generalmente, las mutaciones serán introducidas en los codones que codifican los aminoácidos dentro de una estructura secundaria particular en sitios dirigidos desde el interior del polipéptido de manera que puedan tener el potencial para interactuar con la sacarosa o el substrato que contiene la sacarosa. El método que exhibe el fagémido en la presente, contempla la unión de un polinucleótido que codifica el polipéptido o el fragmento (polinucleótido 1) a un segundo polinucleótido (polinucleótido 2) tal que una proteina de unión se genera durante la transcripción. El polinucleótido 2 es típicamente un gene de proteína revestido de un fago,- y de preferencia es la proteína revestida III del gene M13 del fago, o un fragmento de la misma. La unión de los polinucleótidos 1 y 2, se puede realizar mediante la inserción del polinucleótido 2 en un sitio particular en un plásmido que contiene el polinucleótido 1, o mediante la inserción del polinucleótido 1, en un sitio particular en un plásmido que contiene el polinucleótido 2. Entre el polinucleótido 1, y el polinucleótido 2, el ADN que codifica un codón de terminación puede estar insertado, tales codones de terminación son UAG (ámbar), UAA (ocre), y UGA (opel) (ver por ejemplo, Davis y col., Microbiology (Harper y Row, New York, 1980) páginas 237, 245-247 y 274) . El codón de terminación expresado en células clonadas del tipo silvestre se obtiene en la síntesis del producto de la proteína del polinucleótido 1 sin la proteína del polinucleótido 2 unido. Sin embargo, el crecimiento en una célula clonada del eliminador se obtiene en la 5 síntesis de la s cantidades detectables de la proteína unida. Tales células clonadas del eliminador contienen un tARN modificado parta insertar un aminoácido en la posición del codón de terminación del mARN, con, o cual se obtiene en la producción de •10· las cantidades detectables de la proteína de unión. Las células del eliminador de este tipo, son bien conocidas y se describe, tal como en la cepa del eliminador del E. coli, tal como JM101 o XLl-Blue (Bullock y col., 1987, Biotechniques , 5: 376-379) . 15 Cualquier método aceptable que se puede usar para colocar tal codón de terminación en el mARN codifica el polipéptido de unión. El codón de eliminación, puede estar insertado entre el polinucleótido que codifica el polipéptido o 20 fragmento y un segundo polinucleótido que codifica al menos una porción de una proteína revestida del fago. Alternati amente, el codón de terminación de eliminación se puede insertar adyacente al sitio de unión mediante el reemplazamiento de al menos un 25 triplete del aminoácido en el polipéptido/fragmento o el primer aminoácido en la proteina revestida de fago. Cuando el fagémido que contiene el codón eliminador que crece en una célula clonada del eliminador, resulta en la producción detectable de una polipéptido de unión que contiene el polipéptido o fragmento y la proteina revestida. Cuando el fagémido crece en una célula clonada sin eliminador, el polipéptido o el fragmento es sintetizado substanci almente sin la unión a la proteina revestida - del fago debido a la terminación en la codificación del triplete de eliminación insertado UAG, UAA o UGA . En la célula sin eliminador el polipéptido se sintetiza y se oculta desde la célula clonada debido a la ausencia de la proteina revestida de fago unida, la cual se otra manera se une en la célula clonada. El polipéptido o el fragmento se pueden alterar en al menos uno o más de los codones seleccionados. Una alteración se define como una substitución, eliminación o la inserción de uno o más codones en el gene que codifica el polipéptido o el fragmento que resulta en un cambio en la secuencia del aminoácido según se compara con la secuencia nativa o sin alterar del polipéptido o del fragmento. De preferencia, las alteraciones serán pos substitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en una o mas regiones de la molécula. Las alteraciones se pueden producir mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo, las descritas en la Sección 2.3 y 2.4.1. Estos métodos incluyen pero se limitan a, la mutagénesis regulada de oligonucleótidos y a la mutagénesis de cásete como se describe para el ejemplo mencionado en la presente . El banco de las partículas del fagémido luego se pone en contacto con la .sacarosa o con el substrato que contiene la sacaros bajo condiciones adecuadas. Normalmente, las condiciones, incluyen el pH, la concentración iónica, la temperatura, y lo similar y las condiciones fisiológicas semejantes. Las partículas del fagémido que tienen la activad de la isomerasa de sacarosa elevada luego son seleccionadas desde aquellas que tienen actividad baja. Las células clonadas adecuadas, son infectadas con las partículas del fagémido seleccionado y el fago auxiliar, y las células clonadas son cultivadas bajo condiciones adecuadas para la amplificación de las partículas del fagémido. Las partículas del fagémido luego son recogidas y el proceso de selección se repite una o más veces hasta que los enlazadores tengan la afinidad deseada para la molécula de blanco son seleccionadas. 2.4.5 Diseño de droga Racional. Las variantes de conformidad a un polipéptido aislado de conformidad a la invención, o de un fragmento activo biológi amente del mismo, también se pueden obtener usando los principios de un diseño de droga racional o convencional como por ejemplo, lo descrito por Andrews y col., (En: v PROCEDIMIENTOS DEL SIMPOSIO DE ALFRED BENZON", volumen 28, pp 145-165, Munksgaard, Copenhague, 1990), McPherson, A. (1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-24) , Hol . , y col, (En: "MOLECULAR RECOGNITION: CHEMICAL AND B I OCHEMI CAL PROBLEMS", Roberts, S.M. 8ed); Royal Society of Chemistry; pp 84-93, 1989) ; Hol, W.G.J. (1989, Arzneim-Forsch. 39: 1016- 1018), Hol, W.G.J. (1986, Agnew Chem. Int. ed. Engl. 25: 767-778) . De conformidad con los métodos del diseño de las drogas convencionales, las moléculas de la variante deseada, se obtienen mediante las moléculas de prueba aleatorias cuyas estructuras tienen un atributo en compon con la estructura de un polipéptido principal o el fragmento de la actividad biológicamente de conformidad a la invención. La participación cuantitativa que resulta de un cambio en un grupo particular de una molécula de enlazamiento se puede determinar por la medición de la capacidad de la competencia o de la cooperación entre el polipéptido principal o el fragmento del polipéptido y la variante del polipéptido del candidato. En una realización del diseño de la droga racional, la variante del polipéptido está diseñada para distribuir un atributo de la conformación de tres-dimensiones más estables de un polipéptido o un fragmento de un polipéptido- de conformidad a la invención. Por lo tanto la variante puede estar designada para tener grupos químicos que están orientados en una manera suficiente para originar inter-reacciones iónica, hidrofóbicas o de van der Waals que son similares a aquellas que se exhiben por el polipéptido o por el fragmento del polipéptido de la invención. En un segundo método, del diseño racional, la capacidad de un polipéptido particular o de un fragmento del polipéptido experimenta "la revelación" de la configuración que es explotada. Tal "revelación" se presenta de una manera reversa y transitoria de una configuración molecular diferente - que es un fenómeno bien apreciado, y resulta a partir de las factores de la temperatura y termodinámico s , y de la actividad catalítica de la molécula. El conocimiento de la estructura de tres dimensiones del polipéptido o del fragmento del polipéptido facilita tal evaluación. Una evaluación de los cambios estructurales naturales de un 5 polipéptido o de un fragmento del polipéptido facilita el reconocimiento de sitios articulados, sitios potenciales en el cual el enlace del hidrógeno, los enlaces iónicos o los enlaces de van der Waals forman o pueden estar eliminados debido a '10" la revelación de la molécula. Tal reconocimiento permite la identificación de las estructuras adicionales que el polipéptido o el fragmento del polipéptido puede tener, y facilita el diseño racional y la producción de lasa variantes del 15 polipéptido semejante que distribuye tales estructuras . El método preferido para la realización del diseño semejante racional emplea un sistema de computadora capaz de formar una representación de la 20 estructura de tres dimensiones del polipéptido o del fragmento del polipéptido (tales como aquellos obtenidos que usan RIBBO (Priestle, J.1988, J. Mol Graphics 21: 572) , QUANATA (polígono) , Insite (Biosyn) , o Nanovision (American Chemical Society) . 25 Tales análisis son ejemplificados por Hol y col., (En: MOLECULAR RECOGNITION: CHEMICAL AND BI OCHEMI CAL PROBLEMS" supra, Hol . W.G.J. (1989, supra) , and Hol .G.J., (1986 supra) . En lugar de tales evaluaciones comparativas directas de las variantes de los polipéptidos candidatos, los ensayos de selección pueden ser usados para la identificación de tales moléculas. Tales ensayes preferiblemente explotan la capacidad de la variante para catalizar la conversión de la "sacarosa a i s oiual tulo s a . 2.5 Derivados de Polipéptido. Con referencia a los derivados adecuados de la invención, tales derivados incluyen las eliminaciones y/o las adiciones del aminoácido a un polipéptido, -fragmento o variante de la invención, en donde los derivados catalizan la conversión de la sacarosa a isomaltulosa. "Jas adiciones" de los aminoácidos pueden incluir la unión de los polipéptidos, fragmentos y variantes del polipéptido de la invención con otros polipéptidos o proteínas. Por ejemplo se apreciará que tales polipéptidos, fragmentos o variantes pueden ser incorporados en polipéptidos más largos, y que tales polipéptidos pueden ser esperados para catalizar la conversión de la sacarosa a isomaltulosa como se ha mencionado antes . Los polipépt idos , fragmentos o variantes de la invención se pueden unir a una proteina adicional, por ejemplo, la cuál no se deriva de la célula clonada original . La proteina adicional puede ayudar en la purificación de la proteina de unión. Por ejemplo un tag de polihistidina o una proteina de enlazamiento de maltosa puede ser usada en este aspecto como se describe en mayor detalle abajo. Otras proteínas de unión posibles son aquéllas que producen una respuesta inmunoreguladora los ejemplos particulares de tales proteínas incluyen: proteína A, Glutaniona S- transferasa (GST) . Otros derivados contemplados por la invención incluyen, pero no se limitan a modificación a las cadenas laterales, incorporación de los aminoácidos no naturales y sus derivados durante la síntesis de péptido, polipéptido o proteína y al uso de los enlazadores y otros métodos los cuales tienen restricciones estructurales sobre los polipéptidos , fragmentos y variantes de la invención. Los ejemplos de las modificaciones de la cadena contemplados por al presente invención incluyen las modificaciones de los grupos de aniño tales como por la acilación con el anhídrido acético; la acilación de los grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidrof tálico ; la amidación con acetimidato de metilo; la carbomil ación de los grupos aminos con cianato; la piridoxilación de la lisina con piridoxal- 5- fos fato seguido por la reducción con NaBH4 ; la alquilación reductiva' mediante la reacción con un aldehido seguido por la reducción con NaBH4; y la trinitrobencilación de los grupos amino con ácido 2 , 4 , 6-trinitrobencenosul fónico (TNBS) . El grupo carboxilo puede ser modificado mediante la activación de carbodiimida mediante la formación de O-acilisourea seguido por la derivación subsiguiente, por vía de ejemplo a una amida correspondiente. El grupo guanidina de los residuos de arginina puede ser modificado mediante la formación de los productos de condensación heterocí clicos con reactivos tales como 2 , 3-butanodiona , fenilglioxal y glioxal . Los grupos sulfihidrílo pueden ser modificados mediante los métodos tales como la oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteíco; la formación de los derivados de mercurio usando el ácido 4-cl oromercuri fenil sul fóni co , 4-mercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenos , cloruro fenilmercúrico , y otros compuestos de mercurio. La formación de disulfuros mezclados con otros compuestos de etiol; la reacción con maleimida; anhídrido maléico u otra maleimida sustituida; la carboxime ti 1 ación con ácido yodoacético o yodo acetamida; y la carbamoilación con cianato a pH alcalino. Los residuos de triptofano pueden ser modificados/ como por ejemplo mediante la alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o halogenuros de sulfonilo o mediante la oxidación con N-bromo succinimida . Los residuos de tirosina pueden ser modificados mediante la nitración con tetrani trometano para formar un derivado de 3-nitro tirosina . El anillo de imidazol de un residuo de histidina puede ser modificado por la N-carboxilación con dietilpirocarbonato o mediante la alquilación con derivados de ácido yodoacético. Los ejemplos de los aminoácidos no naturales y los derivados durante la síntesis del péptido incluyen pero no se limitan al uso de ácido 4-aminobutí rico , ácido 6-amino-hexanóico, ácido 4-amino-3-hidroxi- 5-fenilpentanóico, ácido 4-amino-3-hidroxi~ 6-me tilhept anoí co , t-butil gli ciña , norleucina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, 2-tienilalanina y/o los D-isómeros de los aminoácidos.

Una lista de los aminoácidos no naturales contemplados por la presente invención se muestra en la tabla D.

Aminoácido no Aminoácido no convencional convencional Ácido o¡-aminobutirico L-N-metil alaniña a-amino-oí-metilbutirato L-N-metilarginina Carboxilato de L-N-metil aspa ra gina aminoci c1 opropano Ácido aminoisobutírico Ácido L-N-metilaspártico Carboxilato de L-N-metilci steina aminonorborní lo Ciclohexilalanina L-N-me tilglutamina Ci el opentilal aniña Ácido L-N-metilglutámico L-N-metilisoleucina L-N-metilhistidina D-alanina L-N-meti11 eucina D-arginina L-N-metil lisina Ácido D-aspártico L-N-metilmeti onina D-ci steina L-N-metilnorl euci a D-glutamato L-N-metilnorvalina Ácido D-glutámico L-N-metil ornitina D-histidina L-N-metil fenil al ani a D-isoleucina L-N-metilprolina D-leucina L-N-medil seriña D-li sina L-N-metil treonina D-metionina L-N-metiltrip to fano D-ornitina L-N-metiltirosina D-fenilalanina L-N-metiIvalina D-pr olina L-N-metil etil glicina D-serina L-N-metil-t-buti 1 glicina D- treonina L-norleucina D- tripto fano L-norvalina D- tirosina a-metil-aminoi s obutirato D-valina a-metil-Y-aminobutirato D-a-metilalanina a-metilei elohexil lanina D- -metilarginina -metilcilcop entilalanina D- a-metilasparagina c¡-metil-a-na tilalanina D—a-metilaspartata a-metilp enici11 amina D-a-metilcisteína ?- ( -aminobutil ) glicina D- a-metil glutamina ?- (2-aminoetil ) glicina D-a-metilhistidina ?- (3-aminopropil) glicina D-a-metilisoleucina ?- amino-x-metilb irat o D-a-metilleucina a-na tilalanina D-a-metillisina ?-bencil glicina D-a-metilmeti onina ?- ( 2-carbamil edil ) glicina También es contemplado el uso de los enlazadores, por ejemplo para estabilizar las estructuras 3D de los polipéptidos , fragmentos o variantes de la invención usando enlazadores homo-bif ncionales tales como los ásteres de imido bifuncional que tienen grupos espaciadores (CH2)n con n=l a N=6, glutaraldehí do e ásteres de N-hidroxi succinimida y reactivos het ero-bi funci onal e s los cuáles usualmente contienen una fracción reactiva de amino tal como N-hidroxisuccimida y otro grupo de fracción reactiva tal como maleimido o la fracción ditio o carbodiimida . Además los péptidos pueden ser restringidos es tructur almente , por ejemplo, mediante la introducción de dobles enlaces entre los átomos Ca Cp de los aminoácidos, mediante la incorporación de los ácidos Ca y Na-ineti lamino , y mediante la formación de los péptidos cíclicos o análogos mediante la introducción de enlaces covalentes tales como la formación de un enlace amida entre los extremos N y C entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el N o C-terminal de los péptidos a análogos . Por ejemplo la referencia se puede hacer a: Marlowe · (1993, Biorganic & Medicinal Chemistry Letters 3: 437-44) quién describe la ciclización del péptido sobre la resina TFA usando el éster de trimetilsililo (ETMS) como un grupo de protección ortogonal; Tallin y Tam (1995, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 2021-2022) quién describe la ciclización de los péptidos sin proteger en solución acuosa mediante la formación de oxima; Algin y col (1994 Tetrahedron Letters 35.-9633- 9636) quién desarrolla la síntesis de fase-sólida de los péptidos cíclicos cabeza-a-cola mediante la unión de la cadena lateral de lisina. Kates y col (1993, Tetrahedron Letters 34:1549-1552) quién describe la producción de los péptidos cíclicos cabe z a-a- co la mediante la estrategia de fase sólida de 3 dimensiones; Tumelty y col (1994, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1067-1068) quién describe la síntesis de los péptidos cíclicos a partir de los compuestos intermedios activados inmovilizados, en donde la activación del péptido inmovilizado se lleva a cabo con el grupo de N-protección intacto y el grupo N-protección es subsiguientemente eliminado mediante la ciclización; McMurray y col (1994, Peptide Research 7:195-206) quién desarrolla la ciclización de los péptidos cabeza-a-cola unidos a los soportes insolubles por medio de las cadenas laterales del ácido aspártico y ácido glutámico; Hruby y col (1994, Reactive Polymers 22: 231-241) quién enseña un método alterno para la ciclización de los péptidos mediante los soportes sólidos, y Schmidt y Langer (1997, J. Peptide Res. 49:67-73) quién desarrolla un método para la síntesis del ciclotetrapéptidos y ciclopentapéptidos . Los métodos antes mencionados se pueden usar para la obtención de los polipéptidos restringidos es ructur alment e que catalizan la conversión de la sacarosa a isomaltulosa. La invención también contempla los polipéptidos, fragmentos o variantes de la invención que han sido modificados usando técnicas biológicas moleculares ordinarias de manera que mejoran su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para obtenerlos mas adecuados como un agente inmunogénico. 2.6 Métodos de preparación de los Polipéptidos de la Invención. Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados mediante cualquier procedimiento adecuado conocido por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo los polipéptidos pueden ser preparados mediante un procedimiento que incluyen las etapas de: (a) la preparación de un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia que pertenece a cualquiera de uno de SEQ ID No: 2,4,8 y 10 o variante o derivados de estos, secuencia de nucleótido que se enlaza funcionalmente al ácido nucleico regulador de traducción y de transcripción; (b) la introducción de polinucleótido recombinante en una célula clonada adecuada; (c) el cultivo de la célula clonada para expresar el polipéptido recombinante a partir del polinucleótido recombinante; y (d) el aislamiento del polipéptido recombinante .Adecuadamente la secuencia del nucleótido comprende la secuencia que pertenece a cualquiera de 3EQ ID No: 1, 3, 7 y 9. El polinucleótido recombinante esta preferiblemente en forma de un vector de expresión que puede ser un vector extra-cromosómico de auto-repli cación tal como un plásmido, o de un vector que se integra en un genoma clonado. El ácido nucleico regulador de traducción y de transcripción generalmente necesitará para ser apropiado para la célula clonada usada para la expresión. Tipos numerosos de los vectores de expresión apropiado y secuencias reguladoras adecuadas son conocidas en la técnica para una variedad de células clonadas.. Típicamente el ácido nucleico regulador de traducción y de transcripción puede incluir pero no se limita a secuencias del activador, secuencias de señal o de guía sitios de enlazamiento ribosomales secuencias de inicio y de final de transcripción secuencias de inicio y de terminación de traducción y secuencias de un activador o incrementador . Los activadores deducibles o de formación son bien conocidos en la técnica los cuáles son contemplados por la invención. Los activadores pueden ser que ocurran ya sea naturalmente o activadores híbridos que combinan los elementos de mas de un activador. En una modalidad preferida, el vector de expresión contiene un gene marcador seleccionado que permite la selección de las células clonadas transformadas. Los genes marcadores seleccionados son bien conocidos en la técnica y variaran con la célula clonada usada.

El vector de expresión puede también incluir un patrón de unión (proporcionado típicamente por el vector de expresión) de manera que el polipéptido recombinante de la invención s exprese como un polipéptido de unión con el patrón de unión. La ventaja principal de las parejas de unión se refiere a que asisten la identificación y/o la purificación del polipéptido de unión. Con el fin de expresar el polipéptido de unión es necesario enlazar un polinucl eótido de conformidad a la invención en el vector de expresión de manera que los marcos de lectura de traducción de la pareja de unión y del pol inucl eóti do coincidan. Loe ejemplos bien conocidos de las parejas de unión incluyen pero no se limitan a: glutaniona-S-transferasa (GST), la poción FC de IgG humano, la proteína de enlace de maltosa (PEM) y la hexahistidina (HIS)6 los cuales son particularmente útiles para el aislamiento del polipéptido de unión mediante la cromatografía de afinidad. Para los fines de la purificación del polipéptido de unión mediante cromatografía de afinidad, matrices relevantes para la cromatografía de afinidad incluyen, pero no se restringen a glutaniona-amilosa-y resinas conjugadas de cobalto o de níquel-. La mayoría de las matrices están disponibles en una forma de "paquete", tal como el sistema QIAexpress™ (Qiagen) útil con las parejas de unión (HIS)g y el sistema de purificación GST de Pharmacia. En una modalidad preferida, el polinucleótido recombinante se expresa en el pFLAG del vector comercial como se ha descrito más completamente anteriormente. - Otra pareja de unión bien conocida en la técnica es la proteína fluorescente verde (PFV) esta pareja de unión sirve como un "tag" fluorescente, que permite la unión del polipéptido de la invención para ser identificado mediante microscopía fluorescente o mediante citometría de flujo. La PFV tag es útil cuando se prueba la localización subcelular del polipéptido de unión de la invención o para el aislamiento de las células que expresan el polipéptido de unión de la invención. Los métodos citométricos de flujo tal como la selección de la célula activada fluorescente (SCAF) que son particularmente útiles en esta solicitud. Preferiblemente las parejas de unión también pueden tener sitios de división de proteasa, tal como el factor Xa o trombina lo cuál permite a la proteasa relevante digerir parcialmente al polipéptido de unión de la invención y por lo tanto liberar el polipéptido recombinante de la invención. El polipéptido libre puede ser después aislado a partir de la pareja de unión mediante la subsiguiente separación cromatográfica . Las parejas de unión de conformidad a la invención también incluyen dentro de su alcance "epitope tags" las cuáles son usualmente secuencias de péptidos cortos por lo cuál un anticuerpo especifico es adecuado. Los ejemplos bien conocidos de epitope tags para lo cual los anticuerpos monoclonales específicos son fácilmente disponibles incluyendo c-Myc virus de la influenza, hemaglutinina y FLAG tags. La etapa de la introducción en la célula clonada del polinucleótido recombinante puede ser efectuada mediante cualquier método adecuado incluyendo la transfección y la transformación, la selección de lo cuál dependerá de la célula clonada empleada. Tales métodos son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica . Los polipéptidos recombinantes de la invención pueden ser producidos mediante el cultivo de una célula clonada transformada con un vector de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica un polipéptido, un fragmento activo biológicamente variante o derivado de conformidad a la invención. Las condiciones apropiadas para la expresión de la proteina variaran con la selección del vector de expresión y de la célula clonada. Esto es acertado fácilmente por un experto en la técnica a través de experimentación rutinaria. Las células clonadas adecuadas para la expresión pueden ser procari óti ca s o eucarióticas . Una célula clonada preferida para la expresión de un polipéptido de conformidad a la invención es una bacteria: La bacteria usada puede ser Escherichia coli. Alternativamente la célula clonada puede ser una célula de insecto tal como por ejemplo las células SF9 que pueden ser utilizadas con un sistema de expresión de baculovirus. La proteina recombinante puede ser preparada convenientemente por una persona experta en la técnica usando los protocolos estándar como por ejemplo los descritos en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989) ; en particular las secciones 16 y 17; Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc. 1994-1998) , en particular los capítulos 10 y 16 y Voligan y col., CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John iley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular los capítulos 1,5 y 6. Alternativamente el polipéptido , los fragmentos variantes o derivados de la invención pueden ser sintetizados usando la síntesis de solución o la síntesis de fase sólida como se describe por ejemplo, en el capítulo 9 de Atherton and Shephard (supra) and in Roberge y col (1995, Science 269:202) . 3. Polinucleótidos de la invención. 3.1 Método de aislamiento de polinucleótidos que codifican las enzimas de isomerasa de sacarosa para la producción de isomaltulosa .

La presente invención se caracteriza por un método para el aislamiento de polinucleótidos novedosos que codifican las enzimas de isomerasa de sacarosa para la producción de isomaltulosa. El método comprende la obtención de una muestra ambiental a partir de un lugar en el cuál los organismos capaces de convertir la sacarosa a isomaltulosa tienen una ventaja selectiva. La muestra ambiental puede comprender, por ejemplo suelo o materia de plantas incluyendo superficies o tejidos de plantas (por Ejemplo flores) . La muestra ambiental se obtiene de preferencia de un lugar que se somete a una disponibilidad constante o periódica de 5 concentraciones de sacarosa substancial incluyendo, pero que no se restringe a una fábrica que comprende en su proceso o almacenaje plantas que contienen azúcar o partes de la plante y un campo que contiene los remanentes de las plantas cultivadas que '10· contienen azúcar. De preferencia aunque no exclusivamente la planta que contiene azúcar es la remolacha o caña de azúcar. El método comprende además preferiblemente la selección o de otra manera el enriquecimiento para 15 los organismos dobles que metabolizan sacarosa-e- isomaltulosa que son capaces de usar tanto la sacarosa como la isomaltulosa como fuentes de carbono para el crecimiento. Por ejemplo los organismos pueden crecer en un medio que contiene isomaltulosa 20 por un determinado tiempo y con condiciones suficientes para seleccionar o enriquecer los organismos que metabolizan isomaltulosa. Por lo tanto los organismos seleccionados o enriquecidos que pueden crecer subsiguientemente en un medio que 25 contiene sacarosa por un determinado tiempo y bajo condiciones suficientes para selecciona o enriquecer para los organismos dobles que metabolizan la sacarosa y la isomaltulosa . El fin en el cuál los organismos crecen en el medio anterior pueden ser reversible si se desea. Los organismos son seleccionados por aquellos que producen la isomaltulosa a partir de la sacarosa usando al menos un ensayo que cuantifica la producción de isomaltulosa. De preferencia, pero no - exclusivamente el ensayo es uno de anilina/difenilamina tal como por ejemplo el que se menciona en los E emplo 3 y 4 infra. Alternativamente o en adición del mismo, un ensayo es preferiblemente empleado el cual cuantifica la conversión de sacarosa a isomaltulosa. Un ensayo adecuado de este tipo puede cuantificar el producto de la isomaltulosa en relación a los metabolitos relacionados y/o sacarosa. Por Ejemplo el ensayo de electroforesis capilar descritos en los Ejemplo 5 y 6 infra pueden ser usados en este aspecto. Los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa luego son aislados a partir de los organismos que producen isomaltulosa este aislamiento comprende de preferencia la selección de un banco de ácido nucleico derivado de un organismo que produce isomaltulosa y opcionalmente los subclones de este banco para los polinucl eótidos codifican las enzimas de isomerasa de sacarosa para la producción de isomaltulosa. La selección es facilitada adecuadamente usando los iniciadores o pruebas que son especificas para los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa, como por Ejemplo los mencionados en la presente. El banco del ácido nucleico es preferiblemente un banco de expresión el cuál se produce adecuadamente a partir del ácido nucleico genómico o del cAD . Los polinucleótidos deseados pueden ser detectados usando ensayos que cuantifican la producción de isomaltulosa tal como por ejemplo lo descrito anteriormente un protocolo modelo para la selección funcional de los polinucleótidos se describe en los ejemplos 7 a 12.

Los clones de prueba positiva para la producción de isomaltulosa pueden ser luego sometidos a un análisis de la secuencia del ácido nucleico para identificar los genes y/o los productos del gene novedosos en relación a las isomerasas de sacarosa conocidas. Las actividades enzimáticas, los rendimientos y las purezas de los productos deseados luego pueden ser comparados a las enzimas de referencia conocidas bajo condiciones adecuadas para identificar los polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos con actividad de isomerasa de sacarosa superior . 3.2 Polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. La invención proporciona además un polinucl eótido que codifica un polipéptido, fragmento, variante o derivado como se define antes. En una realización, el polinucleótido comprende la secuencia completa de nucleótidos que pertenece a SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO .1 que corresponde a la secuencia que codifica a la isomerasa de sacarosa de E. rhapontici 1899 bp de longitud completa. Esta secuencia define: (1) una primera región que codifica un péptido de señal, a partir del nucleótido 1 a través de aproximadamente el nucleótido 108; (2) una segunda región que codifica una enzima de isomerasa de sacarosa madura a partir de aproximadamente el nucleótido 109 al nucleótido 1899. Adecuadamente, el polinucleótido comprende la secuencia que pertenece a SEQ ID NO.3 la cuál define la región que codifica el polipéptido de isomerasa de sacarosa madura sin la secuencia de señal. La codificación de la secuencia de la presente invención comprende un 594 bp adicional de la secuencia en la terminal 3' con relación al polinucleótido que codifica la isomerasa de sacarosa de E. rhapontici de Mattes y col. (supra) . En otra realización, el polinucleótido comprende la secuencia completa de los nucleótidos que pertenecen a SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 8, que corresponde a la secuencia que codifica la isomerasa de sacarosa de longitud total 1791 bp del aislado de bacterias 68J. La SEQ ID NO: 12, define: (1) una primera región que codifica un péptido de señal, a partir del nucleótido 1, a alrededor del nucleótido 99; y (2) una segunda región que codifica la enzima de isomerasa de sacarosa madura a partir del nucleótido 100 al nucleótido 1791. Adecuadamente, el polinucleótido comprende la secuencia que pertenece a: SEQ ID NO: 10, la cual define la región que codifica el polipéptido de isomerasa de sacaros sin la señal de secuencia. 3.3 Variantes del Polinucleótido. En general, las variantes del polinucleótido de conformidad a la invención comprenden las regiones que muestran al menos 60%, más adecuadamente al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, y más preferiblemente al menos 90% de a identidad de la secuencia sobre la secuencia del polinucleótido de referencia del tamaño idéntico ("ventana de comparación") o cuando se compara a una secuencia alineada en la cual, la alineación se realiza mediante un programa de similitud de computadora, conocido en la técnica. Lo que constituye las 5 variantes adecuadas, pueden ser determinadas mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, un polinucleó tido de conformidad a uno de SEQ ID NO: 1, 3, 7 y 9, que se puede mutar usando, mutagénesis aleatoria (por ejemplo mutagénesis de transposon) , ¦10· mutagénesis regulada por oligonucleótido (o sitio- directo), mutagénesis de RPC y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o de una versión sin variante de un activador natural aislado de conformidad a la invención. 15 La mutagénesis regulada de oligonucleótido es un método preferido para la preparación de las variantes de la substitución de nucleótido de un polinucleó tido de la invención. Esta técnica es bien conocida por los expertos como lo describe por ejemplo Adelman y 20 col (1983, ADN 2:183) . Brevemente un polinucleótido de conformidad a cualquiera de una de SEQ ID NO: 1, 3 7 o 9 se altera mediante la hibridación de un oligonucleótido que codifica la codificación deseada a un ADN patrón, en donde el patrón es la forma de 25 una sola cadena de un plásmido o de una bacteriófago que contiene la secuencia del ADN principal o sin alterar. Después de la hibridación la polimerasa del ADN se usa para la síntesis de una segunda cadena complementaria del patrón que por lo tanto incorporará al iniciador del oligonucleótido y codificara para la alteración seleccionada en la secuencia del ADN principal . En general los oligonucl eótidos de al menos 25 nucleótidos en su longitud son usados. Un · oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que son totalmente complementarios del patrón sobre el lado del nucleótido que codifica para la mutación. Esto asegura que él oligonucleótido hibridiza apropiadamente a la molécula del patrón del ADN de una sola cadena. El patrón del ADN puede ser generado por aquéllos vectores que son ya sean derivados de los vectores M13 del bacteriófago, o de aquellos vectores que contienen un origen de fago de una sola cadena de replicación, como lo describe Viera y col (1987, Methods Enzymol. 153:3) . Por lo tanto el ADN que esta para estar mutado puede ser insertado en uno de los vectores para generar el patrón de una sola cadena. La producción del patrón de una sola cadena se describe, por ejemplo en las secciones 4.21-4.41 de Sambrook y col (1989 , supra) . Alternati amente el patrón de una sola cadena puede ser generado mediante la desnaturalización del plásmido de cadena doble (o de otro ADN) que usa técnicas estándar. Por la alteración de la secuencia del ADN nativo, el oligonucl eótido se hibridiza a un patrón de una sola cadena bajo condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima de polimerización del ADN usualmente el fragmento Klenow de la polimerasa 1 del ADN luego se adiciona para sintetizar la cadena complementaria del patrón usando el oligonucleótido como un iniciador para la síntesis. Una molécula heteroduplex es asi formada tal que una cadena del ADN codifica la forma mutada del polipéptido o del fragmento bajo prueba, y la otra cadena (el patrón original) codifica la secuencia sin alterar nativa del polipéptido o del fragmento bajo prueba. Esta molécula heteroduplex luego s transforma en una célula clonada adecuada usualmente una procarióta tal como E.coli. Después las células crecen luego se colocan en placas de agarosa y se seleccionan usando el iniciador del oligonucleótido que tiene una marca detectable para identificar las colonias de las bacterias que tienen el ADN mutado . Los fragmentos del ADN mutado resultantes son luego clonados en células clonadas de expresión adecuadas tales como E.coli usando tecnologías convencionales y clones que retienen la actividad de la isomerasa de la sacarosa deseada los cuales son detectados . Cuando los clones han sido derivados usando técnicas de mutagénesis aleatoria, los clones positivos tienen que estar en secuencia con el fin de detectar la mutación. Alternativamente la mutagénesis de exploración del enlazador del ADN puede ser usado para introducir conjuntos de mutaciones de puntos a través de una secuencia de interés que ha sido clonada en un vector de plásmido como por ejemplo se puede hacer referencia a Ausubel y col., supxa (en particular capítulo 8.4) el cuál describe un primer protocolo que usa los oligonucleótidos complementarios y requiere un sitio de restricción único adyacente a la región que esta para ser mutado. Una serie de mutaciones de eliminación es primero generada en esta región. Un par de oligonucleótidos complementarios es sintetizado para llenar el espacio en la secuencia de interés entre el enlazador y el punto final de eliminación y el sitio de restricción cercano. La secuencia del enlazador actualmente proporciona los conjuntos deseados de las mutaciones de punto como se mueve o como "explora" a través de la región mediante su posición en los puntos finales variados de las series de mutación de eliminación. Un protocolo alternativo también se describe en Ausubel y col., supra el cuál emplea el uso del sitio dirigido a los procedimientos de mutagénesis para introducir conjuntos pequeños de mutaciones de punto a través de la región de blanco. También las mutaciones se introducen en una secuencia mediante la fusión de un ol i gonucl eóti do que contiene · uno o más desajustes para la secuencia de interés clonada en un vector de M13 de una sola cadena. Este patrón crece en una capa de E.coli dut ung", la cual permite la incorporación del uracilo en la cadena del patrón. Los oligonucleótidos son fundidos al patrón purificado y se extiende con la polimerasa de ADN T4, para crear un heteroduplo de doble cadena. Finalmente el heteroduplo se introduce en una cepa de E. coli del tipo silvestre lo cual previene la replicación de la cadena del patrón debido a la presencia del uracilo en la cadena del patrón, con lo cual resulta en las placas que contienen solo el ADN mutado. La mutagénesis especifica de región y la mutagénesis directa que usa la RCP también se' puede emplear para la construcción de las variantes del polinucleótido de conformidad a la invención, en esta aspecto, la referencia se puede hacer, por ejemplo a Ausubel y col., supra, en particular a los capítulos 8.2A y 8.5. 5 Alternati amente, las variantes de la secuencia del polinucleótido de la invención se pueden preparar de conformidad al procedimiento siguiente: (i) la creación de los iniciadores los cuales son opcionalmente degenerados en donde cada uno comprende '10' una porción de un polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido de referencia o un fragmento de la invención, de preferencia, la codificación de la secuencia que se están en cualquiera de SEQ ID NO: 1, 3, 7o 9; (ii) la obtención de un extracto del 15 ácido nucleico a partir de un organismos que metabolice la sacarosa, el cual es de preferencia una bacteria, más preferiblemente a partir de las especies de un lugar en el cual el organismo es capaz de convertir la sacarosa a isomaltulosa obteniendo 20 una ventaja selectiva como se describe en la presente; y (iii) us ndo los iniciadores para la amplificación, mediante las técnicas de amplificación del ácido nucleico , al menos un producto de amplificación a partir del extracto del ácido 25 nucleico en donde el producto de amplificación corresponde a una variante del polinucleótido . Las técnicas de amplificación del ácido nucleico adecuadas son bien conocidas por los expertos e incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) como por ejemplo descritos en Ausubel y col., (supra); la amplificación del desplazamiento de cadena a (ADC) descrito por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5,452,252; la replicación circulizada de enrollamiento (RCR) descrita por ejemplo en Liu y - col., (1996, J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 y la Solicitud Internacional WO 92/01813) y Lizardi y col., (Solicitud Internacional WO 97/19193) la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (ABSAN) descrita por ejemplo por Sooknanan y col., (1994, Biotechniques 17:1077-1080) ; y la amplificación de la replicasa Q-ß como para el ejemplo descrito por Tyagy y col., (1996, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:5395-5400) . Típicamente las variantes del polinucleótido que son complementarias sub s tancialmente a un polinucleótido de referencia son identificadas mediante las técnicas de mancha que incluyen una etapa en la cuál los ácidos nucleicos están inmovilizados sobre una matriz (de preferencia una membrana sintética tal como ni trocelulosa ) seguido por la etapa de hibridación y una etapa de detección. La técnica de mancha de Southern se usa para identificar una secuencia del ADN complementaria. La mancha Northern se usa para identificar una secuencia del ARN complementario las manchas de ranura y de punto pueden ser usadas para identificar las secuencias del polinucleótido del ADN/ADN, ADN/ARN o ARN/ARN complementarios. Tales técnicas son bien conocidas por los expertos y se describen en Ausubel y col., (1994-1998, supra en las páginas 2.9.1 a 2.9.20) De conformidad a tales métodos la técnica de manchas de Southern comprenden la separación de las moléculas de ADN de conformidad al tamaño mediante electroforesis de gel, transferir el ADN separado por tamaño a una membrana sintética e hibridizar el ADN enlazado a la membrana a una secuencia del nucleótido complementario marcado radioacti amente, enzimáticamente o fluorocromá ticamente en las manchas de puntos y en las manchas de rayas las muestras de ADN se aplican directamente a una membrana sintética antes de la hibridación como se ha mencionado antes.

Una etapa de mancha alternativa se usa cuando se identifica los polinucleótidos complementarios en un banco de cADN o un banco del ADN genómico, tal como a través del proceso de hibridación de placa o de colonia. Una muestra típica de este procedimiento se describe en Sambrook y col ("Molecular ClonÍJig. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Press, 1989) Capítulos 8-12. Típicamente él procedimiento general siguiente puede ser usado para determinar las condiciones de hibridación. Los polinucleótidos son manchados /trans ferido a una membrana sintética como se describe antes. ün polinucleótido de referencia tal como un polinucleótido de la invención se marca como se ha descrito antes, y la habilidad de este polinucleótido marcado para hibridizar con un polinucleótido inmovilizado se analiza. Un técnico experto reconocerá que un número determinado de factores influyen la hibridación. La actividad específica de la secuencia del polinucleótido marcado radioacti amente típicamente será mayor o igual aproximadamente 108 dpm/mg para proporcionar una señal detectable una secuencia del nucleótido radiomarcada de actividad específica de 108 a 109 dpm/mg puede detectar aproximadamente 0.5 pg del ADN . Es bien conocido en la técnica que el ADN suficiente debe estar inmovilizado en la membrana para permitir la detección es deseable tener el ADN inmovilizado en exceso usualmente 10 g. La adición de un polímero inerte tal como sulfato de dextrano al 10% (p/v) (peso molecular 500 000) o polietileno glicol 6000 durante la hibridación también puede incrementar la sensibilidad de hibridación (ver Ausu el supra en 2.10.10) Para lograr resultados exitosos de la hibridación entre un polinucleótido inmovilizado sobre una membrana y un polinucleótido marcado una cantidad suficiente del polinucleótido marcado debe ser hibridizado al polinucleótido inmovilizado seguido por el lavado. El lavado asegura que le polinucleótido lavado esta hibridizado solo para el polinucleótido inmovilizado con un grado deseado de complementari edad al polinucleótido marcado. Se entenderá que las variantes del polinucleótido de conformidad a la invención hibridizan a un polinucleótido de referencia bajo al menos condiciones severas bajas. La referencia en la presente para las condiciones severas bajas incluyen y comprenden por al menos aproximadamente 1% v/v a aproximadamente 15% v/v de formamida y de al menos aproximadamente 1M a al menos aproximadamente 2M de la sal para la hibridación a 42°C. Y al menos aproximadamente 1M a al menos aproximadamente 2M de la sal para le lavado a 42°C. Las condiciones severas bajas también incluyen albúmina de suero de bovino al 1% (ASB), lmM EDTA, 0.5 M NaHP04 (pH 7.2), 7% SDS para la hibridación a 65°C y (i) 2xSSC, 0.1% SDS; o (ii) 0.5% ASB , lmM EDTA, 40 mM NaHP04 (pH 7.2), 5% SDS para lavar a la temperatura ambiente. Adecuadamente las variantes del polinucleótido hibridizan a un polinucleótido de referencia bajo al menos condiciones severas medias. Las condiciones severas medias incluyen y comprenden por al menos 16% v/v a al menos aproximadamente 30% v/v de formamida y de al menos aproximadamente 0.5 M a aproximadamente 0.9 M de la sal para la hibridación a 42°C y al menos aproximadamente 0.1 M a al menos aproximadamente 0.2M de la sal para lavar a 55°C. Las condiciones severas medias también pueden incluir albúmina de suero de bovino al 1% (ASB), lmM EDTA, 1.5 M NaHP04 (pH 7.2), 7% SDS para la hibridación a 65°C, y (i) 2xSSC, 0.1% SDS; o (ii) =.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHP04 /pH 7.2), 5% SDS para el lavado a 60-65°C. De preferencia las variantes del polinucleótido hibridizan a un polinucleótido de referencia bajo condiciones severas elevadas . Las condiciones severas elevadas incluyen y comprenden de al menos aproximadamente 31% v/v al menos aproximadamente 50 % v/v de formamida y de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente a 0.15 M de la sal para la hibridación a 42°C, y aproximadamente 0.01 M aproximadamente 0.02 M de la sal, para lavar a 55°C. Las condiciones severas elevadas también pueden incluir ASB al 1%, lmM EDTA, 0.5 M NaHP04 (pH 7.2), 7% SDS para la hibridación a 65°C, (i) 0.2x SSC, 0.1% SDS; o (ii) 0.5% ASB, lmM EDTA, 40 mM NaHP0 (pH 7.2), 1% SDS para lavar a una temperatura en exceso de S5CC. Otras condiciones severas son bien conocidas en la técnica. Un técnico experto reconocerá que varios factores pueden ser manipulados para optimizar lo especifico de la hibridación. La optimización de las características severas del lavado final puede servir para asegurar un grado elevado de hibridación. Para ejemplos detallados ver Ausubel y col., supra en las páginas 2.10.1 a 2.10.16 y Sambrook y col (1989, supra) en las secciones 1.101 a 1.104. Mientras que en los lavados severos son típicamente llevados a cabo a temperaturas de aproximadamente de 42°C a 68°C un experto en la técnica apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para las condiciones severas. El intervalo de hibridación máximo típicamente ocurre a aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de Tm para la formación de un híbrido ADN-ADN es bien conocido en la técnica que Tm es la temperatura de fusión o una temperatura a la cuál dos secuencias del polinucleótido complementario se disocian. Los métodos para la estimación de Tra son bien conocidos en la técnica ver Ausubel y col., supra en la página 2.10.8) . En general la Tm de un duplo que se adapta perfectamente del ADN se puede indicar como una aproximación mediante la fórmula: Tm=81.5+16.6 (logioM) + 0.41(%G+C)- 0.63 (% de formamida) - ( 600/longitud) En donde: M es la concentración de Na+, de preferencia en el rango de 0.01 molar a 0.4 molar, % de G + c es la suma de las bases de guanosina y de citosina como un porcentaje del número total de las bases, dentro del intervalo de 30% y 75% de G + C; % de formamida es la concentración de la formamida en % por volumen; longitud es el número de pares de base en el duplo ADN. La Tm de un duplo de ADN disminuye mediante aproximadamente 1°C con cada uno de los incrementos del 1% en el número de pares de bases no adaptadas aleatorio. El lavado generalmente se lleva a cabo a Tm -15°C para la reacción severa elevada, o Tm para la reacción severa moderada. En un procedimiento- de hibridación preferido, una membrana (por ejemplo una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene el ADN inmovilizado se hibridiza durante la noche a 42°C, en una solución reguladora de hibridación (50 % de formamida desionizada 5x SSC, 5 x solución de Denhardt (0.1 % de ficolli, 0.1 % de - polivinilpirrolidona, 0.1 de albúmina de suero de bovino) , 0.1% de SDS y 200 mg/ml de ADN del esperma de salmón desnaturalizado ) que contiene la prueba marcada. La membrana luego se somete a dos lavados severos medios continuos (por ejemplo 2 x SSC, 0.1 % ¦ desde por 15 minutos a 45°C, seguido por 2 x SSC, 0.1 % de SDS por 15 minutos a 50°C), seguido por dos lavados severos elevados continuos (por ejemplo 0.1% SDS, por 12 minutos, a 55°C, seguido por 0.2 x SSC y de la solución de 0.1 % de SDS por 12 minutos a 65- 68 ° C . Los métodos para la detección del polinucleótido marcado hibridizado a un polinucleótido inmovilizado son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen la autoradiografia , la fo s foroimagen y quimiluminis cencía, y la detección fluorescente y colorimétric . 4. Moléculas de enlazamiento de antígeno . La invención también contempla las moléculas de enlazamiento de antigeno que se unen específicamente a los polipéptidos , a los fragmentos, variantes y derivados antes mencionados. De preferencia, una molécula de enlazamiento de antigeno de conformidad a la invención es inmuno-interreactiva con cualquiera de una o más de las secuencias de los aminoácidos que se mencionan para SEQID NO: 2, 4, 8, 10, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 o variante de los mismos. Por ejemplo, las moléculas de enlazamiento del antígeno, puede comprender los anticuerpos clónales completos. Tales anticuerpos pueden ser preparados, por ejemplo, mediante la inyección de un polipéptido, fragmento, variante o derivado de la invención, en una producción de especies, que incluye , ratones o conejos, para la obtención del anti-suero policlonal. Los métodos para la producción de los anticuerpos policlonales son bien conocidos en la técnica. Los protocolos modelos los cuales pueden ser usados como se describe en por ejemplo Coligan y col., CURRENT PROTOCOLS IN IM UNOLOGY, (JOhn Wiley & Sons, Inc, 1991), y Ausubel y col., (1994-1998, supra), en particular en la Sección III del capítulo 11.

En lugar del antisuero policlonal obtenido en las especies de producción, los anticuerpos mono el ona 1 e s se pueden obtener usando el método estándar como se describe, por ejemplo, por Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495-497), o mediante modificaciones más reciente del mismo, como lo describe, por ejemplo en Coligan y col., (1991, supra) , mediante el bazo perpetuo u otro anticuerpo que producen células derivadas de una producción de especies, los que han sido inoculados con uno o más de los polipéptidos , fragmentos, variantes, o derivados de la invención. La invención también contempla como moléculas de enlazamiento de antigeno, fragmento de inmunoglobulina Fv, Fab, Fab' y F(ab' )2- Alternativamente, la molécula del enlazamiento del antigeno, comprende un fragmento FV estabilizado sintético. Los fragmentos modelo de este tipo incluyen los fragmentos FV de una sola cadena, (scFv frecuentemente terminado de sFv) en donde un enlazador del polipéptido se usa para formar un puente del N terminal o del C terminal de un dominio de VH con el C-terminal o el N-t erminal , respectivamente, de un dominio VL . L falta de SCFv de todas las partes constantes de los anticuerpos completos no son las adecuadas para activar el complemento. Los enlazadores de péptido adecuado para la unión de los dominios VH y L son aquellos que permiten que los dominios VH y VL se cierren en una sola cadena de polipéptido que tiene un sitio de enlazamiento de antigeno con una estructura de tres dimensiones similar a la del sitio de enlazamiento de antigeno de un anticuerpo completo a partir del cual el fragmento Fv se deriva. Los enlazadores que tienen las propiedades deseada se pueden obtener mediante los métodos mencionados e la Patente de USA NO. 4,946,778. Sin embargo, en algunos casos, un enlazado está ausente. Los SCFvs se pueden preparar, por ejemplo, de conformidad a los métodos mencionados en Kreber y col. (Kreber y col., 1997, J. Immunol . Methods; 201 (1) : 35-55) . Alternativamente, se pueden preparar mediante los métodos descritos en la Patente de USA No. 5,091,513, en la Patente Europea No. 239,400 o en los Artículos de Winter and Milstein (1991, Nature 349: 293) y en Plückthum y col. (1996, En Antibody engineering : A practical approach. 203-252) . Alternativamente, el fragmento Fv estabilizado sintético comprende un Fv de disulfuro estabilizado (dsFv) en el cual, los residuos de la cisterna son introducidos en los dominios VH y VL tal que en la molécula de Fv cerrada totalmente, los dos residuo forman un enlace de disulfuro entre los mismos. Los métodos adecuados para la obtención de dsFv son descritos por ejemplo en ( Glo cks cuher y col., Biochem. 2 69 : 18327-18331, Reiter y col., 1994, Biochem. 33: 5451-5459; Reiter y col., 1994. Cáncer Res. 54 : 2714-2718; Webber y col., Mol. Immunol. 32 : 249-258) . También la invención se refiere a las moléculas de enlazamiento de antigeno que son dominios de región variable únicos (terminados de dAbs) como por ejemplo los mencionados en Ward y col., (1989, Nature 34 1 : 544- 546) ; Hamers-Cas terman y col., (1993, Nature, 363; 446-448); Davis & Riechmann (1994, FEBS Lett. 339 : 285-290) . Como una forma alternativa, la molécula de enlazamiento de antigeno, puede comprende un "minicuerpo". En este aspecto, los minicuerpos son versiones pequeñas, de los anticuerpos completos, los cuales codifican una sola cadena, los elementos esenciales de un anticuerpo completo Adecuadamente, el minicuerpo comprende los dominios de VH y VL del anticuerpo nativo unido a las regiones articuladas del dominio · CH3 de la molécula de inmunogl obulina como, por ejemplo, la mencionada en la patente de USA No. 5,837,821. En una modalidad de alternativa, la molécula de enlazamiento del antigeno puede comprender los derivados sin inmunoglobulinas , los procesos de proteínas. Por ejemplo, la referencia se puede hacer a Ku & Schultz (1995, Nati. Acad. Sel. USA 92 : 652- 6556), el cual desarrolla citocroma de proteína de cuatro hélices enrolladas b562 que tiene dos lazos aleatorios para formar las regiones de determinación - complementaria (CDRs), las cuales han sido seleccionadas para el enlazamiento del antígeno. La molécula de enlazamiento del antígeno, puede ser multivalente (por ejemplo tener mas de una sitio de enlazamiento del antigeno) . Tales moléculas muí tivalentes pueden ser específicas por uno o más antígenos . Las moléculas muí tival ente s de este tipo pueden ser preparadas mediante dimerización de dos fragmentos de anticuerpo a través del péptido que contiene cisteinilo, como por ejemplo, el mencionado por Adm. Y col., (1993, Cáncer Res. 53: 4026-4034) y Comer y col. (1992, J. Immunol . 149: 120-126) . De una forma alternativa, la dimerización se puede facilitar mediante la unión de los fragmentos del anticuerpo a las hélices amfifílicas que dimerizan naturalmente (Pack P. Plünckthum, 1992, Bíochem. 311579-1584) , o mediante el uso de los dominios (tales como cierres j un y fos de leucina) que heterodime ri z an pref erenci almente ( ostelny y col., 148: 1547-1553) . En una realización de alternativa, la molécula multivalente, puede comprende un anticuerpo de una sola cadena multivalente (multi-scFv) , que comprende al menos dos scFv que se enlazan mediante un enlazado de péptido. En este aspecto, los dimeros de scFv enlazados coval ent emente o no-covalentemente terminados en "dicuerpos" pueden ser usados. Los multi-scFv pueden ser bi-especificos o mayores que dependiendo del número de scFv empleados que tienen diferentes características específicas de enlazamiento del antígeno. Los multi-scFV se pueden preparar por ejemplo, mediante los métodos mencionados en la Patente de USA No. 5,892,020. Las moléculas del enlazamiento del antígeno, de la invención se pueden usar mediante la cromatografía de afinidad, en el aislamiento de un polipéptido recombinante o natural o un fragmento activo biológicamente de la invención. Por ejemplo, se puede hacer referencia a los procedimientos de cromatografía de inmuno-actividad, descritos en el Capítulo 9.5 de Coligan y col., (1995.1997, supra) . Las moléculas de enlazamiento de antígeno se puede usar para seleccionar los bancos de expresión para los polipéptidos variantes de la invención se describen en la presente. También se pueden usar para la detección y/o el aislamiento de los poli éptidos, los fragmentos, las variantes o los derivados de la invención. Por lo tanto, la invención también comprende el uso de las moléculas de enlazamiento del antigeno para aislar las enzimas de isomerasa se sacarosa usando, por ejemplo, cualquier método basado de inmunoafinidad adecuado, incluyendo, pero no se limita a, la inmunocromatografia y a la inmunoprecipitación . Un método preferido utiliza la adsorción de fase sólida en el cual las moléculas del enlazamiento del antigeno de isomerasa de sacarosa se unen a una cadena adecuada, la resina esta en contacto con una muestra que se espera que contenga las isomerasas de sacarosa, y las isomerasas de sacarosa sin existen, son subsiguientemente eluidas desde la resina. Las resinas preferidas incluyen: Sepharosetm (Pharmacia) , resinas Porostm (Roche Biochemicals , Indianápolis ) , resinas de Actigel Superflow™ (Sterogene Bioseparations INC. Carlsbad Calif) y las resinas de Dynabeads™ (Dynal Inc, Lake Succes, N.Y.) 5. Métodos de detección. 5.1 Detección de los polipéptidos de conformidad a la invenci ón La invención también se refiere a un método para la detección en una muestra un fragmento de un polipéptido, variante o derivado como se ha descrito antes, que comprende poner en contacto la muestra con una molécula de enlazamiento del antigeno, como se describe en la Sección 4, y la detección de la presencia de un complejo que comprende la molécula de enlazamiento del antigeno y el polipéptido, fragmento, variante o derivado en la muestra de contacto . Cualquier técnica adecuada para la determinación de la formación de un complejo se puede usar. Por ejemplo, una molécula del enlazamiento del antígeno, de conformidad a la invención, tiene una molécula de información asociada con el mismo, que se puede utilizar en los inmunoensayos . Tales inmunoens ayo s incluyen, pero no se limitan a, los radioinmunoensayos (RIEs) , los ensayos inmunoabs orbent es enlazados a la enzima (ELISAs) , y las técnicas de inmunocromatograf ia (ICTs) , las técnicas de las manchas de Western, las cuales son bien conocidas en la técnica por lo expertos. Por ejemplo, se puede hacer referencia a "CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY" (1994, supra) , el cual desarrolla una variedad de inmunoensayos , que se pueden usar de conformidad con la presente invención. Los inmunoensayos pueden incluir los ensayos competitivos como se entiende en la técnica o, como por ejemplo, los descritos infra. Se entenderá que a presente invención, comprende los inmunoensayos cualitativos y cuantitativos. Las técnicas de los inmunoensayos, son descrito por ejemplo en las Patentes de USA Nos. 4,016,043, 4.24,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto los ensayos de un solo-sitio como el de dos-sitios, de los tipos no-competitivos, asi como también los ensayos del enlazamiento competitivo tradicional. Estos ensayos también incluyen el enlazamiento directo de una molécula de enlazamiento de antigeno marcada a un antigeno de blanco. Los ensayos de dos sitios particularmente favorecen para que se usen en la presente invención. Un determinado número de variaciones de estos ensayos existe, todos de los cuales se entenderá que acompañan a al presente invención. En pocas palabras, es un ensayo típico, una molécula de enlazamiento del antígeno sin marcar, tal como el anticuerpo son marcar se inmoviliza en un substrato sólido y la muestra que se va a probar se pone en contacto con la molécula enlazada. Después de un periodo adecuado, de incubación, por un periodo de un tiempo suficiente, se permite la formación de un complejo del antigeno- anticuerpo, otra molécula del enlazamiento del antígeno, adecuadamente un segundo anticuerpo especifico al antigeno, marcado con un molécula de información capaz de la producción de una señal - detectable luego se adiciona y se incuba, dejando el tiempo suficiente para la formación de otro complejo del anticuerpo-marcado-de-antigeno-anticuerpo .

Cualquier material sin reaccionar se lava fuera y la presencia del antigeno se determina mediante la observación de una señal que se produce por la molécula de información. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos por simple observación de la señal visible o puede ser cuantificados mediante la comparación con una muestra de control que contiene las cantidades conocidas, del antigeno. Las variaciones en el ensayo siguiente incluyen un ensayo simultáneo, en el cual tanto la muestra y el anticuerpo marcado se adiciona simultáneamente al anticuerpo enlazado. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos expertos en la materia, incluyendo variaciones menores como serán evidentes realmente. De conformidad con la presente invención, una muestra es una que puede contener una isomerasa de sacaros tal como una a partir de un organismo que metabolice sacarosa. De preferencia, el organismo que metaboliza sacarosa es una bacteria, la cual se obtiene adecuadamente a partir e un lugar en el cual los organismos que son capaces de convertir la sacarosa a isomaltulosa tienen una ventaja selectiva. En el ensayo siguiente. típico, un primer anticuerpo que tiene características específicas para el antígeno o para las partes del antígeno del mismo, es ya sea covalente o pasivamente enlazado a la superficie sólida. La superficie . sólida es típicamente vidrio o un polímero, los polímeros usados más comúnmente son celulosa, poliacr ilamida , nylon, pol i e s ti eno , cloruro de polivinilo, o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en la forma de tubos, perlas, discos o microplatos, o cualquier otra superficie adecuada para la conducción del inmunoens ayo . Los procedimientos se enlazamiento con bien conocidos en la técnica y generalmente consisten del entrelazado, el enlazamiento covalente o el de adsorción física. El complejo de polímero-anticuerpo se lava en la preparación para la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra para ser probada luego se adiciona al complejo de la fase sólida y se incuba por un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones adecuadas para permitir el enlazamiento de cualquier antígeno presente al anticuerpo. En seguida del periodo de incubación, el complejo del anticuerpo-antígeno se lava y se seca y se incuba en un segundo anticuerpo- especifico para una porción del antígeno. El segundo anticuerpo tiene generalmente una molécula se información asociada con el mismo que se usa para indicar el enlazamiento del segundo anticuerpo al antígeno. La cantidad del anticuerpo marcado que se enlaza según se determina por la molécula informante asociada es proporcional la cantidad del antígeno enlazado al primer anticuerpo inmovilizado. Un método de alternativa, desarrolla la inmovilización del antígeno en la muestra biológica y luego se expone al antígeno inmovilizado al anticuerpo específico que puede o no puede estar marcado con una molécula de información. Dependiendo de la cantidad del blanco y de la concentración de la señal de la molécula de información, un antígeno de enlazamiento puede estar detectable por el marcado directo con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, especifico al primer anticuerpo se expone al complejo del anticuerpo del primer blanco, para formar un complejo terciario del anticuerpo del segundo anticuerpo del primer blanco. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula de información. A partir de loa anterior, se apreciará que la molécula de información asociada con la molécula de enlazamiento del antigeno puede incluir lo siguiente: (a) la unión directa de la molécula de información- a una molécula de enlazamiento de antigeno; (b) la unión indirecta de la molécula de información a la molécula de enlazamiento del antigeno; por ejemplo, la unión de la molécula de información a otros de los reactivos de ensayo el cual su stanci almente se enlaza a la molécula de enlazamiento del antigeno; y (c) la unión del producto de la reacción subsiguiente de la molécula de enlazamiento del antigeno. La molécula de información se puede seleccionar de un grupo que incluye un cromógeno, un catalizador, una enzima, un fluorocromo, una molécula de quimiluminiscencia, un ión lantánido, tal como el europio (Eu3 ), un radioisótopo, y una marca visual directa.

En el caso de un marca visual directa, se puede hacer de una partícula no-metálica o metálica coloidal, una partícula seca, una enzima, o un substrato, un polímero orgánico, una partícula de látex, una liposoma, u otro vehículo que contiene una sustancia de producción de al señal y lo similar. Una gran cantidad de enzimas adecuadas para usarse como las moléculas de información se mencionan en las descripciones de la Patentes de los EÜA. 4,366,242, 4,843,000, 4,849.338. Las enzimas adecuadas, útiles en la presente invención incluyen la fosfatasa alcalina, peroxidasa de cola de caballo, luciferasa. B- gal cto s ida s a , oxidasa de glucosa, lisozima, malato dehidrogenasa, y lo similar. Las enzimas se pueden usar solas o en combinación con una segunda enzima que está en solución. Los fluorocromos adecuados incluyen pero no se limitan a, isotiocianato de fluore s ceína , (FITC), isocianato de tetrametilrodamina (TRITC), R-ficoertrina (RPE), el rojo texas . Otros fluorocromos modelos incluyen aquellos mencionados por Dower y col., (Publicación Internacional WO 93/06121), Se hace también referencia a los fluorocromos descritos en las Patentes de USA 5, 573, 909 (Singer y col), 5.326,692 (Brinkley y col. Alternati amente, se pueden hacer referencia a los fluorocromos descritos en las Patentes de USA Nos. 5227,487, 5,274,113, 5,405,975, 5,433, 896, 5,442,045, 5,451,663, 5,453,517, 5,459,276, 5,5616,864, 5,648,279, y 5, 723, 218. En el caso del inmunoens ayo de la enzima, una enzima se conjuga al segundo anticuerpo, generalmente por medio del glutaraldehxdo o del peryodato . Sin embargo como es fácilmente reconocido, una amplia - variedad de técnicas de conjugación diferentes existen, las cuales son fácilmente disponibles por aquellos expertos en la técnica. Los substratos que pueden se usan con las enzimas especificas son generalmente seleccionadas por la producción de la hidrólisis, mediante la enzima correspondiente, un cambio de color detectable. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen aquellas descritas supra. También es posible emplear los substratos fluorogénicos , lo cuales producen un producto fluorescente mejor que los substratos cromogénicos anotados arriba. En todos los casos, el anticuerpo marcado de enzima se adiciona al primer complejo del antigeno-anticuerpo. Luego se dejan que se enlacen y el exceso del reactivo se elimina mediante el lavado. Una solución que contiene el substrato apropiado luego se adiciona al complejo del anticuerpo-antigeno- anti cuerpo . El substrato se hace reacciona con la enzima que se enlaza al segundo anticuerpo, proporcionando, una señal visual cualitativa, la cual puede además ser cuanti ficada, usualmente espectrof otométricamente , con lo cual se proporciona una indicación de la cantidad del antigeno que está en la muestra . Los compuestos fluorescentes, tales como la f luoresceina, rodamina y el lantánido Europio (Eu) , se pueden alternadamente acoplar químicamente a los a los anticuerpos sin alterar su capacidad de enlazamiento . Cuando se activan mediante la iluminación con luz de una longitud de onda en particular, el anticuerpo marcado-f lurocromo adsorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitación en la molécula, seguido por la emisión de la luz a un color ca cterístico visualmente detectable con el microscopio de luz. El anticuerpo marcado-fluorescente se deja que se enlace al primer complejo del antí geno-anticuerpo . Después de lavar el reactivo sin enlazar, el complejo terciario restante luego se expone a luz de una longitud de onda apropiada. La fluorescencia observada indica la presencia del antígeno de interés . Los ensayos inmunofluorométricos (EIFM) son bien establecidos en la técnica. Sin embargo, las moléculas del informador tales como el radioisótopo, las moléculas quimiluminiscentes o bioliuminiscentes también se pueden emplear. 5.2 detección del polinucleó tido de conformidad a la invención ¦ En otra modalidad característica, el método para la detección comprende la detección de expresión en una célula de un polinucleótido que codifica el polipéptido, fragmento, variante o derivado. La expresión del polinucleótido se puede determinar usando cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, el polinucleótido marcado que codifica un miembro que se puede utilizar como una prueba en una mancha de Northern de un extracto de ARN que se obtiene de la célula de músculo. De preferencia, un extracto del ácido nucleico del animal se utiliza en relación con los iniciadores del oligonucleótido que corresponden a las secuencias de sentido y contra-sentido de un polinucleótido que codifica el miembro, una secuencia de flanco del mismo, en la reacción de amplificación del ácido nucleico tal como RT RCP. Una variedad de las técnicas de fase-sólida automatizadas también es apropiada. Por ejemplo, los conjuntos de iniciadores inmovilizados a escala muy grande, (VLSIPS™) son usados para la detección del ácido nucleico como lo describe por ejemplo en Fodor y col (1991, Science 251: 767-777) y Kazal y col (1996, Nature Medicine 2: 753-759) . Las técnicas genéricas anteriores son bien conocidas por personas expertas en la técnica. 6. Cons rucciones de ácido nucleico imaginarias. 6.1 Expresión procarióta La presente invención se refiere a además a la construcción del ácido nucleico imaginaria designado para la transformación genética de las células procariótas que comprende un polinucleótido , fragmento, o variantes de conformidad a la invención que se enlazan funcionalmente a la secuencia del iniciador. De preferencia, la construcción imaginaria es funcionable en una célula procarióta gram-negativa. Una variedad de los vectores de expresión procariótas, .los cuales pueden ser usados como una base para la construcción de la construcción del ácido nucleico imaginaria, pueden ser utilizadas para expresar un polinucleótido, fragmento, o variante de conformidad a la invención. Esto incluye pero no se limita a los vectores cromosomales (por ejemplo un bacteriófago, tal como un bacteriófago ?) , un vector extracromosomal (por ejemplo un plásmido o un vector de expresión del cosmid) . El vector de expresión típicamente también contiene un origen de replicación, que permite la replicación autónoma del vector, u uno o más genes que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. Cualquier número 'de las secuencias del iniciador adecuado, incluyen las secuencias del iniciador deducibles y formadoras, que se pueden usar en el vector de expresión (ver por ejemplo, Bitter, y col. , 1987, Methods in Enzymology 153: 516-544) . Por ejemplo, los indicadores deducibles tales como pL del bacteriófago ?, el iniciador del híbrido plac, ptrp, ptac, ptrp-lac y lo similar se puede usar. La construcción del ácido nucleico imaginaria luego se puede usar para transformar la célula clonada procarióta deseada, para la producción de una célula clonada procariota recombinante para la obtención de un polipéptido recombinante como se ha descrito antes, o para la obtención de la i somal tulos a , como se ha descrito ant e s . 6.2 Expresión eucarióta.

La invención también contempla la construcción del ácido nucleico imaginaria designada para la expresión de un polinucleótido, fragmento o variante de la invención en una célula clonada eucarióta. Una variedad de los sistemas de vector de expresión- clonada eucarióta pueden ser utilizada en este aspecto. Estos incluyen, pero no se limitan a - levadura transformada con los vectores de expresión de levadura recombinante, sistemas de células insecto infectadas con los vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) , o lo sistemas de célula de animal infectados con los vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo retrovirus, adenovirus, virus de vacuna), o los sistema de célula animal transformada genéticamente para la expresión estable. De preferencia, la construcción del ácido imaginaria se designa par la transformación genética de las plantas como se describe ante s . 6.3 Expresión de planta.

En una modalidad preferida, un polinucleótido , fragmento, o variante de conformidad a la invención se une a la secuencia del iniciador, y una secuencia 3'-sin traducir para crear una construcción del ADN imaginaria, designada para la transformación genética de las plantas. 6.3.1 Activadores de plantas.

Las secuencias del activador, contempladas por la presente invención pueden ser nativas para la planta clonada, para ser transformada o se pueden ser derivadas de una fuente de alternativa, en donde la región es funciona en la planta clonada. Otras fuentes incluyen los genes del T-ADN de Agrobacterium, tales como los activadores para la biosintesis de la nopalina, octapina, manopina, u otros activadores de opina, los activadores de plantas tales como los activadores de ubiquitina, activadores específicos de tejido (por ejemplo la Patente de E.U.A. No. 5, 495, 252 a Conkling y col., WO 91/13992 para Advanced Technologies); activadores de los virus (incluyendo los virus específicos clonados ), o los activadores sintéticos parcial o completamente. Numerosos activadores que son funcionales en las plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas , son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Greve, 1983, J. M01. Appl. Genet 1:499-511/ Salomón y col., 1984, EMBO J. 3: 141-146; Garfinkel y col., 1983, Cell 27; 143-153: Barrer y col., Plant Mol. Biol. 2: 235-350); incluyendo varios activadores de las plantas (tales como el activador Ubi del maíz gene ubi-1, Christensen and Quail, 1966) (ver por ejemplo la Patente de USA No. 4, 962, 028) y los virus (tales como el activador del virus del mosaico de la coliflor, CaMV 35S) . Las secuencias de los activadores pueden incluir las regiones las cuales regulan la transcripción, en donde la regulación comprende, por ejemplo, la represión o la inducción física o química (por ejemplo la regulación basada en los metabolitos, luz, u otros factores fisicoquímicos ; ver por ejemplo la solicitud Internacional O 93/06710, que desarrolla un activador de respuesta a nemátodo), o la regulación basada en la diferenciación celular (tal como la asociada con las hojas, raíces, semillas o lo similar en las plantas, ver por ejemplo la Patente de USA NO. 5,459,252, que desarrolla un activador específico de la raíz) . Por lo tanto, la región del activador, o la porción de regulación de tal región, se obtienen de un gene apropiado que está para ser regulado. Por ejemplo el gene de carboxilasa de bifosfato de de 1,5-ribulosa que se induce mediante luz y se puede usar para la iniciación de la transcripción. Otros genes son bien conocidos los cuales son inducidos por el estrés, la temperatura, llaga en la corteza, efectos patogénicos, etc. El activador preferido para la expresión en las células cultivadas es un activador de formación fuerte, o un activador que responde a un inductor especifico (Gatz and Lenk, 1998, Trends . Planta Science 3: 352-8) . El activador especifico para la expresión en las plantas intactas es un activador que se expresa en los tejidos de almacén de sacarosa (tal como los tallos maduros de la caña de azúcar y los tubérculos de la remolacha) , o de una activador deducible para impulsar la conversión de la sacarosa a isomaltulosa, en un etapa tarde antes de la cosecha con el rompimiento mínimo de otras plantas de crecimiento y procesos de desarrollo. 6.2.3. Región 3' -sin traducir La construcción del gene imaginaria de la presente invención puede comprender una secuencia 3' -sin traducir. Una secuencia del 3' -sin traducir se refiere a que la porción de un gene comprende un segmento del ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal de regulación capaz de efectuar el proceso del mARN o el gene de expresión. La señal de poliadenilación está caracterizada por efectuar la adición de de la región del ácido poliadénilico en la terminal 3' del activador del mARN. Las señales de poliadenilación son comúnmente reconocidas por la presencia de la homología de la forma catalogada 5'AATAAA-3' aunque las variaciones no son comunes. La secuencia el ADN de regulación 3' sin traducir de preferencia incluye aproximadamente 50 a 1,000 pares de bases nucleótidos y puede contener la secuencia de terminación de traducción y de transcripción de planta en adición a una señal de poliadelinación y cualquiera de otras señales de regulación capaces de efectuar el proceso del mARN o el gene de expresión. Los ejemplos de las secuencias 3'-sin traducir son las regiones de 3'-sin traducir y sin transcripción que contienen una señal de poliadenilación a partir del gene de la sintasa de nopalina (nos) de Agroba. cteri um tumefaciens (Bevan y col, 1983, Acid Res., 11: 369) y el finalizador de la transcripción T7 a partir del gene de la sintasas de octopina de Agrobacterium turnefaciens .

Alternati amente, las secuencias de 3' -sin traducir adecuadas se pueden derivar de los genes de las plantas tales como el 3'-terminal de los genes I o II del inhibidor de la proteasa de la papa y del tomate, los genes de la proteina de almacén de la soya y la subunidad pequeña de E9 del gene del guisante de carboxilasa de xibulosa- 1 , 5-bi fosfato ( s sRUBI SCO) , aunque otros elementos de 3' conocidos - por aquellos expertos de la técnica también se pueden emplear. Alternativamente, las secuencia de regulación del 3'-sin traducir se pueden obtener de novo, como por ejemplo, a partir de los que describe en (1987, Methods in Enzimology, 153: 292) lo cual se incorpora en la presente como referencia. 6.3.3 Secuencias opcionales La construcción del ADN imaginaria de la presente invención, puede además incluir los intensificadores, ya sea los intensificadores de transcripción y de traducción, según se requieran. Estas regiones de intensificación son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, y pueden incluir el codón de iniciación del ATG y las secuencias adyacentes. El codón de iniciación debe estar en fase con el narco de lectura de la secuencia de codificación en relación a la secuencia del ADN endógena y exterior para asegurar la traducción de la secuencia completa. Las señales de control de la traducción y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto natural como sintética Las regiones de iniciación de traducción pueden ser proporcionados además de la fuente de la región de iniciación de transcripción, o de la secuencia del ADN endógena o del exterior. La secuencia también se puede derivar de la fuente del activador seleccionado para impulsar la transcripción, y puede estar modificada específicamente de manera que incremente la traducción del mARN . Los ejemplos de los intensificadores de la transcripción, aunque no se restrinjan a, los elementos del activador CaMV 35S y de los genes de la sintasa de octopina como por ejemplo los descritos por Last y col (Patente de USA No. 5, 290, 924 , la cual se incorpora solo como referencia) . Se propone que el uso del elemento intensificador tal como el elemento oes, y particularmente las copias múltiples del elemento, que actúan para incrementar el nivel de la transcripción a partir de los activadores adyacentes cuando - se aplica en el contexto de la transformación de la planta. Alternativamente, la secuencia de omega derivada del gene de proteina revestido del virus de mosaico de tabaco (Gallie y col., 1987), se puede usar para aumentar la traducción del mARN que se transcribe del polinucleótido de conformidad a la invención. Como la secuencia del ADN se inserta entre el sitio de iniciación de la transcripción y el inicio de la · codificación de la secuencia, por ejemplo, la secuencia de la guia sin traducir, puede influenciar la expresión del gene, uno también puede emplear una secuencia guia en particular. Las secuencia de guia preferida incluye aquellas que comprenden las secuencias seleccionadas para dirigir la expresión óptima de la secuencia del ADN endógena o exterior. Por ejemplo tales secuencias guias incluyen una secuencia de consenso preferida, la cual puede incrementar o mantener la estabilidad del mARN y prevenir la iniciación inapropiada de la traducción como por ejemplo lo descrito pos Joshi (1987, Nucleic Acid. Res. 15: 6643), que se incorpora solo como referencia. Sin embargo otras secuencias guias por ejemplo la secuencia guia de RTBV, tiene un grado elevado de la estructura secundaria que s espera para reducir la estabilidad del mARN y/o reduce la traducción de mAR . Por lo tanto, las secuencias de guías (i) que no tienen un grado elevado de la estructura secundaria, (ii) que tienen un grado elevado de la estructura secundaria, en donde la estructura secundaria no inhibe la estabilidad del mARN y/o reduce la traducción, o (iii) que son derivados de los genes que son altamente expresados en las plantas, que son más preferidas. Los elementos de regulación tales como el intrón de sintasa de sacarosa, que se describe en por ejemplo Vasil y col., (1980, Plant Physiol., 91: 5175), el intron Adh como por ejemplo, descrito en Callis y col., ( 1987 , Genes Develop., II) o el elemento omega de TMV como por ejemplo, descrito por Gallie y col., (1989, The Plant Cell, 1:301), pueden también estar incluidos según se desee. Otros elementos de regulación útiles en la práctica de la invención son conocidos por aquellos expertos en la materia. Adicionalmente, las secuencias de blanco se pueden emplear para un blanco de un producto de proteína de la secuencia el ADN endógeno o exterior a un compartimiento intracelular dentro de las células de las plantas a un ambiente extracelular. Por ejemplo una secuencia de ADN que codifica una secuencia de señal de péptido o transitoria, puede enlazarse funci onalment e a una secuencia que codifica una proteina deseable tal que cuando se traduce, el péptido de señal o transitoria puede transportar la proteina a un destino extracelular o intracelular particular y puede estar eliminada post . -traducción . Los péptidos de señal o transitoria actúan para facilitar el transporte de las proteínas a través de le membranas intracelulares, por ejemplo retículo endoplásmico, vacuola, vesícula, plástido, membranas mitocondriales y plasmalema. Por ejemplo la secuencia de blanco, se puede dirigir a una proteína deseada a un órgano en particular tal como una vacuola o plástico (por ejemplo, un cloroplasto ) , mejor que al citosol. Por lo tanto, la construcción del ADN imaginaria, puede además comprender un péptido transitorio de plástico que codifica la secuencia del ADN que se enlaza funcionable entre una región del activador o una variante del activador de conformidad a la invención y a las secuencias del ADN endógena o exterior. Por ejemplo la referencia que se hace en Heijne y col., (1989, Ann Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 40: 471) el cual solo se menciona como re f erenci a . La construcción del ADN imaginaria también se puede introducir en un vector, tal como un plásmido. Los vectores del plásmido incluyen las secuencias del ADN adicional que se proporciona para la selección fácil, la amplificación, y la transformación del cásete de expresión en las células eucariótas y procariótas , por ejemplo los vectores derivados de pUC, los vectores derivados de pSK, los vectores derivados de pGEM, los vectores derivados de pBS . Las secuencias del ADN adicional incluyen los orígenes de la replicación para proporcionar la replicación autónoma del vector, los genes del marcador seleccionable, de preferencia la codificación del antibiótico, resistencia al herbicida, sitios de clonación múltiples únicos, que se proporcionan para los sitios múltiples para insertar las secuencias del ADN., o los genes codificados en la construcción del ADN imaginaria y la secuencias que intensifican la transformación de las células procariótas y eucariótas . El vector de preferencia contiene un elemento (s) que permite ya sea la integración estable del vector en el genoma de la célula clonada o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula. El vector puede estar integrado en el genoma de la célula clonada cuando se introduce en una célula clonada. Para la integración, el vector puede estar en una secuencia del ADN endógena o exterior presente en la misma, o en cualquiera de otros elementos, del vector, para la integración 5 estable del vector en el genoma mediante la recombinación homologa. Alternativamente, el vector puede contener las secuencias del ácido nucleico adicionales, para la dirección de la integración por la recombinación homologa en el genoma de la célula '10- clonada. ' Las secuencias del ácido nucleico adicionales adecuadas al vector pueden estar integradas en el genoma de la célula clonada en un lugar preciso en el cromosoma. Para incrementar la probabilidad de integración en un lugar preciso los 15 elementos de integración de preferencia contienen un número suficiente de ácidos nucleicos tal como de 100 a 1500 pares de base, de preferencia de 400 a 1500 pares de bases, y mas preferiblemente de 800 a 1500 pares de base los cuáles son homólogos elevadamente 20 con la secuencia de blanco correspondiente para incrementar la probabilidad de la recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia de blanco en el genoma de la célula clonada. Además 25 los elementos de integración pueden ser secuencias de ácido nucleico codificadas o sin codificar. Para los fines de clonación y de sub-clonación el vector comprende además un origen de replicación adecuado al vector para replicar de una manera autónoma en una célula clonada, tal como una célula bacterial. Los ejemplos de los orígenes bacteriales de replicación son los orígenes de replicación de los plasmidos pBR322, pUC19, pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E.coli y en pUBUO, pE194, - pTA1060 y ???ß? que permiten la replicación en j acíllus. El origen de la replicación puede ser uno que tenga una mutación para hacer su función sensible a la temperatura en una célula de Bacillus (ver por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1433) . 6.3.4 Genes marcadores. Para facilitar la identificación de los transformantes, la construcción imaginaria del ADN comprende deseablemente un gene marcador seleccionado o que se puede seleccionar como, o en adición a, una secuencia de polinucleótido de conformidad a la invención. La selección actual de un marcador no es crucial tanto como en su función (por ejemplo selectivo) en la combinación con las células de las plantas de selección. El gene marcador y la secuencia del ADN endógena y exterior de interés no tiene que estar enlazada debido a su co- transformación de los genes sin enlazar como por ejemplo lo que se describe en la patente de Estados Unidos No. 4,399,216 que es también un procedimiento eficiente en la transformación de las plantas. Se incluye dentro de los términos los genes del marcador seleccionado o que se puede seleccionar a los genes que codifican un "marcador oculto" cuya propiedad de ocultamiento- puede ser detectada como un medio de identificación o selección para las células transformadas. Los ejemplos incluyen los marcadores que codifican un antigeno oculto que puede ser identificado mediante la interreación del anticuerpo o las enzimas ocultas que pueden ser detectadas por su actividad catalítica. Las proteínas ocultas incluyen, aunque no se restringen a las proteínas que se insertan o se atrapan en la pared celular (por ej emplo proteínas que incluyen una secuencia guía tal como la que se encuentra en la unidad de expresión del PR-S del tabaco o de la extensión) ; proteínas que se difunden, pequeñas detectables, por ejemplo mediante ELISA; y las enzimas activas pequeñas detectables en una solución extra celular (por ejemplo a-amilasa, ß-lactamasa, acetiltransferasa de fosfinotricina) 6.3.5 Marcadores selecclonables . Los ejemplos de los marcadores sel eccionables bacteriales son los de los géneros dal a partir de. Bacillus subtílis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tales como ampicilina, kanamicina, eritromicina, cloramfenicol o tetraciclina . Los marcadores seleccionables modelos para la selección de los transformantes de plantas incluyen, pero no se limitan a gene hyg el cual codifica la resistencia B de higromicina, un (neo) gene de fosfotransferasa de neomicina que proporciona resistencia a la kanamicina, paromomicina, G418 y lo similar como por ejemplo lo descrito por Potrykus y col (1985, Mol. Gen. Genet 199:183) un gene de glutaniona-S-transferasa del hígado del ratón que proporciona resistencia a los herbicidas derivados de glutaniona como por ejemplo lo que se describe en EP-A 256 233 , un gene de sintasa de glutamina que proporciona después de la sobre expresión, la resistencia a los inhibidores de la sintasa de glutamina tales como la fosfinotricina como por e emplo lo descrito en O87/05327, un gene de transferasa de acetilo a partir de Streptomyces viridochromogene s que proporcionan resistencia al agente selectivo de fosfinotricina como por ejem lo lo descrito en EP-A 275 p57, un gene que codifica una sintasa de 5-enolsiquimato-3-fosfato (EPSPS) que proporciona tolerancia a la N- fos fornetil glicina como por ejemplo lo descrito por Hinchee y col (1988. Biotech. , 6:915) , un gene barra que proporciona resistencia contra bialafos como por ejemplo lo descrito en WO91/02071, un gene de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que proporciona resistencia al bromoxinil (Stalker y col., 1988, Science, 242:419) ; un gene de reductasa de dihidrofol ato (DHFR) que proporciona resistencia al metotrexato (Thillet y col 1988 , J. Biol. Chem. , 263:12500) ; un gene de sintasa de acetolactato mutante (ALS ) , el cuál proporciona resistencia a imidazolinona, fulfonilurea u otros agentes químicos que inhiben ALS (EP-A-154 204) ; un gene de sintasa de antranilato mutado que proporciona resistencia al 5-metil triptof ano ; o un gene de dihalogenasa de dalapon que proporciona resistencia al herbicida. 6.3.6 Marcadores que se pueden seleccionar. Los marcadores que se pueden seleccionar preferidos incluyen aunque no se limitan a un gene uidA que codifica una enzima de ß- glucuronidas a (GUS) para la cuál varios substratos cromogénicos son conocidos, un gene ß- gal acto s i das a que codifica una enzima para la cual los substratos cromogénicos son conocidos; un gene aequorin (Prasher y col., 1985, Biochem. 5 Bíophys. Res. Comm. , 126:1259) , el cuál puede ser empleado en la detección de la bi olumini s cenci a sensible al calcio; un gene de proteina fluorescente verde (Niedz y col., 1995 Plant Cell Reports, 14:403) ; un gene de luciferasa {luc) (Ww y col., •10- 1986, Science, 234:856) , que permite la detección de la biolu iniscencia, un gene de ß-lactamasa (Sutcliffe, 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3737) el cual codifica una enzima para lo cual varios substratos cromogénicos son conocidos (por ejemplo 15 PADAC, una cefalosporina cromogénica ) ; un gene R- locus que codifica un producto que regula la producción de los pigmentos antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta y col., 1988, in Chromosome Structure and Function, pp . 263-282) ; un 20 gene de a-amilasa (Ikuta y col., 1990, Biotech. , 8:241) un gene de tirosinasa (Katz y col. ,1983, J. Gen Microbiol 129:2703) el cuál codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a dopa y dopaquinona la cual en turno condensa para formar la melanina 25 compuesto fácilmente detectable; un gene xylE (Zukowsky y col. 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:1101), el cual codifica una dioxigenasa de catecol que puede ser convertida a los catecoles cromogéni eos . 7. Introducción de la construcción Imaginaria en células de plantas Un cierto número de técnicas son disponibles para la introducción del ADN en una célula clonada de planta. La mayoría de las técnicas de la " transformación de plantas son bien conocidas por los expertos en la técnica, y nuevas técnicas son continuamente conocidas. La selección particular de una tecnología de transformación se determina por su eficiencia para transformar ciertas especies de plantas así como también como la experiencia y la preferencia de las personas expertas que practican la invención con una metodología particular de selección. Será evidente para aquéllos expertos en la técnica que la selección particular de un sistema de transformación para introducir una construcción imaginaria de ADN en las células de plantas no es esencial a o una limitación de la invención con la condición de que se logre un nivel aceptable de la transferencia del ácido nucleico. La guía en la implementación práctica de los sistemas de transformación para la planta mejorada es proporcionada por Birch (1997, ???? . Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48:297-326) . En principio ambas plantas dicotiledóneas y monocotil edóneas que se pueden cambiar para la transformación pueden ser modificadas mediante la introducción de una construcción imaginaria del ADN de conformidad a la invención en una célula que recibe y que crece una nueva planta que forma y expresa un polinucleó tido de conformidad a la invenció . La introducción y expresión de la secuencia imaginaria o exterior del ADN en plantas dicotiledóneas (de hoja amplia) tal como el tabaco, papa y alfalfa han mostrado que usan posiblemente el t-ADN del plásmido de inducción de tumor (TI) de Agrobacterium turnefaciens (Ver por ejemplo , Umbeck, Patente de Estados Unidos No.5, 004, 863 y de la Solicitud Internacional PCT/US 93 / 02 80 ) una construcción de la invención se puede introducir en una célula de planta que utiliza a A. turnefaciens que contiene el plásmido TI . En el empleo de un cultivo de A. turnefaciens como un vehículo de transformación es más ventajoso usar una cepa no oncogénica del Agrobacterium como el portador del vector de manera que la diferencia no oncogénica normal de los tejidos transformados es posible. Se prefiere que el Agrobacterium forme un sistema de plásmido binario TI. Tal sistema binario comprende (1) un Primer plásmido TI que tiene una región con virus esencial para la introducción del ADN transferido (T-ADN) en las plantas y (2) un plásmido imaginario. El plásmido imaginario contiene al menos una región de borde de la región T-ADN, del plásmido de TI de tipo silvestre con el · flanco de ácido nucleico que se va ha transferir los sistemas de plásmido binario TI han mostrado ser efectivos para transformar las células de plantas como por ejemplo lo descrito por De Framond (1983, Biotechnology , 1:262) y Hoekema y col. (19836, Nature 303:179) . Tal sistema binario es preferido Inter. alia debido a que no requiere de integración en el plásmido TI en Agrobacterium. Los métodos comprenden el uso del Agrobacterium que incluyen pero que no se limitan a: (a) co-cultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados de cultivo; (b) la transformación de las células o tejidos de planta con Agrobacterium; o (c) la transformación de las semillas, ápices o meritillos con Agrobacterium.

Recientemente el arroz y el maíz que son monocotiledóneas han mostrado ser susceptibles a la transformación mediante Agrobacterium . Sin embargo muchas otras plantas de cosecha monocotiledoneas importantes incluyendo avenas, sorgo, mijo y centeno no han sido exitosamente transformadas usando la transformación regulada- Agrobacterium . Sin embargo el plásmido TI puede ser manipulado en un futuro para actuar como un vector para éstas otras plantas monocotiledoneas. Adi cionalmente usando el plásmido TI como un Sistema modelo, puede ser posible construir artificialmente vectores de transformación para estas plantas. Los plásmidos TI también se pueden introducir en las plantas monocotiledoneas mediante métodos artificiales tales como la micro inyección, o la unión entre protoplastos de la planta monocotil edónea y los es f eroplastos bacteriales que contienen la región T la cuál luego se puede integrar en el ADN nuclear de la planta. Además el gene de transferencia puede ser realizado mediante la transformación in sit por Agrobacterium como se describe por Bechtold y col., (1993 , C.R. Acad. Sci . París. 316:1194) esta investigación se basa en la infiltración al vacio de una suspensión de las células de Agrobacterium . Alternativamente la construcción imaginaria se puede introducir usando los plásmidos de inducción de raíz (Ri) del Agrobacteri um como los vectores. El virus del mosaico de la coliflor (CaMV) también se puede usar como un vector para la introducción de los ácidos nucleicos exógenos en las células de las plantas (Patente USA No. 4,407,956) . El genoma del ADN CaMV se inserta en un plásmido bacterial principal creando una molécula del ADN recombinante que puede estar propagada en la bacteria. Después de la clonación el plásmido recombinante otra vez puede ser clonado y modificado además mediante la introducción de la secuencia del ácido nucleico deseado. La porción viral modificada del plásmido recombínate luego se excita a partir del plásmido bacterial principal, y se usa para inocular las células de las plantas o las plantas . La construcción imaginaria del ácido nucleico también se puede introducir en las células de las plantas mediante la electroporación como por ejemplo lo descrito por Fromm y col. ( 1985 , Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 82:5824) y Shimamoto y col (1989, Nature 338:274-276) . En esta técnica los protoplastos de la planta son electroporados en la presencia de vectores de los ácidos nucleicos que contienen la secuencia del ácido nucleico importante. Los pulsos eléctricos de las membranas permeables reversibles de concentración de campo elevado permiten la introducción de los ácidos nucleicos. Los protoplastos de la planta electroporada reforman la pared celular, dividen y forman el tejido leñoso de las plantas . Otro método para la introducción de la construcción imaginaria del ácido nucleico en una célula de la planta es de penetración balística de velocidad elevada mediante partículas pequeñas (también conocida como bombardeo de partículas o bombardeo de micro-proyectiles) con el ácido nucleico que se va ha introducir contenido ya sea dentro de la matriz de perlas pequeñas o partículas o sobre la superficie del mismo como por ejemplo lo descrito por Klein y col (1987, Nature 327:70) . Aunque solo típicamente una sola introducción de una secuencia nueva de ácido nucleico se requiere, este método particularmente se proporciona para introducciones múltiples. Alternati amente la construcción imaginaria de ácido nucleico se puede introducir en una célula de la planta mediante el contacto de la célula de la planta usando medios químicos o mecánicos. Por ejemplo un ácido nucleico puede ser transformado mecánicamente mediante la micro-inyección directamente en la células de las plantas mediante el uso de micropipetas . Alternati amente un ácido nucleico puede ser transferido en la célula de la planta mediante el uso de polietileno glicol el cuál forma un complejo de precipitación con el material genético que esta tomado por la célula. Existe una variedad de métodos conocidos comúnmente para la transformación para las plantas monocotiledóneas . Actualmente los métodos preferidos para la transformación de las plantas monocotiledóneas son el bombardeo de micro-proyectiles de explantas o células en suspensión, y tomar o electroporación del ADN directo como por ejemplo lo describe Shimamoto y col (1989, supra) , las plantas de maíz transgénico han sido obtenidas mediante la introducción de Streptomyces hygroscopicus bar gene en las células embriónicas de un cultivo de suspensión de maíz mediante el bombardeo de microproyectiles (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell , 2:603-618) . La introducción del material genético en los protoplastos de aleurona de otras cosechas de monocotiledóneas tales como el trigo y la cebada han sido informadas (Lee, 1989, PLant Mol. Biol 13:21-30) . Las plantas de trigo han sido regeneradas del cultivo de suspensión embriónico mediante la selección solamente del tejido leñosos embriónico nodular y compacto de un cierto tiempo para establecer los cultivos de solución embriónicos (Vasil, 1990, Bio/Technol. 8:429-434) . La combinación con los sistemas de transformación para estas cosechas adecuada para la aplicación de la presente invención a monocotiledóneas . Estos métodos también se pueden aplicar para la transformación y regeneración de di otiledóneas. Las plantas de la caña de azúcar transgénica han sido regeneradas desde el tejido leñoso embriónico, por ejemplo descrito por Bower y col. (1996, Molecular Breeding 2:239-249) . Alternativamente una combinación de técnicas diferentes pueden ser empleadas para aumentar la eficiencia de los procesos de transformación, por ejemplo el bombardeo con micro partículas revertidas de Agrobacterium (EP-A-486234 ) o el bombardeo de mi croproy ec ti 1 e s para inducir el enrollamiento seguido por el co-cultivo con Agrobacterium (EP-A-486233) . 8. Producción y caracterización de plantas transgénicas diferenciadas . 8.1 Regeneración. Los métodos usados para regenerar las células transformadas en plantas diferenciadas no son críticos para esta invención, y cualquier método adecuado para una planta de blanco se puede emplear. Normalmente una célula de planta se regenera para obtener una planta total seguido por un procedimiento de transformación. La regeneración de los protoplastos varia de especie a especie de las plantas aunque generalmente una suspensión de protoplastos se hace primero. En ciertas especies la formación de embrión puede ser -inducido a partir de la suspensión del protoplasto, en la etapa de maduración y germinación como embriones naturales . El medio de cultivo contiene generalmente varios aminoácidos y hormonas, necesarios para el crecimiento y regeneración. Los ejemplos de las hormonas utilizadas incluyen auxinas y citoquininas . Es ventajoso algunas veces adicionar ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies como maíz y alfalfa. La regeneración eficiente depende del medio sobre el genotipo y la historia del cultivo. Si estas variables son reguladas, la regeneración es reproducibl e . La regeneración también ocurre a partir del tejido leñoso de las plantas, explantas, órganos o partes. La transformación se puede realizar en la re- generación de la parte de la planta o del órgano como por ejemplo lo descrito en Methods in Enzymology , Vol.118 y Klee y col (1987, Annual Review of Plant Physiology, 38:467) , utilizando la hoja del método de re generación- trans formación-di s co de Horsch y col (1985, Science, 227:1229, incorporado en la presente por referencia) , los discos son cultivados en un medio selectivo seguido por la formación de vástagos en aproximadamente de 2 a 4 semanas. Los vástagos que se desarrollan son cortados del tejido leñoso y transplantados un medio, selectivo de inducción de raíz apropiado. Las plantas con raíz son transplantadas al suelo tan pronto como sea posible después de que aparecen las raices. Las plantas pueden ser colocadas en recipientes según se requiere hasta que alcancen la madurez . En cosechas propagadas vegetativamente, las plantas transgénicas maduras son propagadas mediante la toma de corte o mediante las técnicas de cultivo de tejido para producir plantas idénticas múltiples. La selección de los transgénicos deseables y nuevas variedades se obtienen y se propagan vegetativamente para uso comercial. En las cosechas de propagación de semilla, las plantas transgénicas maduras puede ser auto-cruzadas para producir una planta natural de homocigoto. La planta natural produce semilla que contiene el gene exterior introducido nuevamente. Estas semillas pueden crecer para producir las plantas. que producirán el genotipo seleccionado, por ejemplo la floración temprana. Las partes obtenidas de la planta regenerada tales como flores, semillas, hojas, ramas fruta y lo similar están incluidas en la invención, con la condición de que estas partes comprenden células que han sido transformadas como se ha descrito. La progenie y las variantes y los imitantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, con la condición de que estas partes comprenden las secuencias del ácido nucleico introducido. Se apreciará que en la literatura se describen numerosas técnicas para la regeneración de los tipos específicos de plantas y son más continuamente conocidas. Estos de ordinario expertos en la técnica puede referirse a la literatura para los detalles y seleccionar técnicas adecuadas con experimentación indebida . 8.2 Caracterización. Para confirmar la presencia del polinucl eótido de la invención en la regeneración de plantas, una variedad de ensayos puede ser realizado. Tales ensayos incluyen por ejemplo los ensayos "biológicos moleculares" que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica tal como la técnica de mancha de Southern y Northern y la RCP; una proteína expresada por el polinucleótido de la invención puede ser ensayada para la actividad de la isomerasa de sacarosa como el ejemplo descrito en la presente. 9. Producción de isomaltulosa . La invención presente se relaciona además a un procedimiento de la producción de la isomaltulosa usando las secuencias de polipéptido o polinucleótido descritos en la presente, o usando variantes o fragmentos del mismo. El procedimiento comprenden poner en contacto la sacarosa o un medio o sustrato que contiene sacarosa con al menos un miembro seleccionado de (a) un organismo el cuál se transforma con un secuencia de ADN codificando una proteína con la actividad de la isomerasa de sacarosa, por ejemplo una bacteria o planta modificada genéticamente; (b) un extracto celular o un producto extracelular a partir de tal célula u organismo; y (c) una proteína con la actividad de la isomerasa de sacarosa en forma aislada, bajo condiciones tales que la sacarosa esta al menos parcialmente convertida por la isomerasa de sacarosa en i s omaltulo s a . Subsiguientemente se obtiene la isomal tulosa a partir del medio o del organismo como se conoce en la técnica. Los métodos para la 5 producción industrial de la i somal tulo s a , por ejemplo usando células inmovilizadas o isomerasas de sacarosa en contacto con un medio que contiene sacarosa que es bien conocido (C eer am y col. 1985, Biotech. Bioeng. 27:471-481; Takazoe, 1989, la Palatinosa-un producto '10· isomérico alternativo a la sacarosa. In Progress in Sweeteners (editorial Grenby, T.H.,) Parking: Elsevier, p . 143-167 y las referencias respectivamente en la presente) . La presente invención mejora estos métodos mediante la provisión 15 de isomerasas de sacarosa novedosas con propiedades benéficas incluyendo una eficiencia más elevada de la producción de isomaltulosa . Además la presente invención revela para un primer tiempo la capacidad para producir isomaltulosa 20 directamente en las plantas. Esto es altamente ventajoso debido a que evita lo caro de la extracción de sacarosa de las plantas y proporciona esto como un substrato para la conversión a isomaltulosa por otros organismos, extractos o enzimas aisladas a través de 25 la fermentación industrial. Por ejemplo la sacarosa producida por fotosíntesis genéticamente modificadas como se describe en la presente se convierte a isomaltulosa por la actividad de la isomerasa de sacarosa en el tejido de la planta. La isomaltulosa resultante luego se cosecha usando procedimientos bien establecidos para la cosecha de otros azúcares, particularmente sacarosa de las plantas. Los materiales de las plantas con isomaltulosa son primero cosechados, luego molidos para extraer el - jugo que contiene la isomaltulosa y/o pasarlo a través de un aparato de difusión para extraer la isomaltulosa soluble de los materiales de planta insolubles. La isomaltulosa luego se purifica mediante tratamientos para eliminar las impurezas y concentrar mediante las etapas de cristalización y evaporación bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (Cooke y Scout, 1993, The Sugar Beet Crop : science into practice. London : Chapman & Hall; Meade, 1977, Cañe Sugar Handbook . New Cork: Wiley, y las referencias respectivamente) . En el orden de la invención se puede entender fácilmente y colocarlos en efectos prácticos las modalidades preferidas particulares que son descritas por via de los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Aislamiento de los polinucl eótidos de isomerasa de sacarosa que usan los iniciadores de oligonucleótido basados en las regiones especificas de Mattes y col Esta estrategia se prueba en una bacteria de expresión de isomerasa de sacarosa conocida ( Erwinia rhapontici con número de acceso WAC2928) y 30 aislados bacteriales independientes adicionales. Los iniciadores de RCP degenerados son designados en base en las regiones, especificadas por Mattes y col {supra) como regiones conservadas a partir de su análisis de los genes de isomerasa de sacarosa conocidos . El iniciador delantero consiste de la secuencia de extensión de los nucleótidos 139-155 de SEQ ID NO: l,5'-tgg tgg aa ( a , g ) ga ( g , a ) ge t gt-3' [SEQ ID No:38] El iniciador de reversa consiste de la secuencia extendida de los nucleótidos 625-644 SEQ ID ??:1,5'-tec cag tta g(g,a)t ceg gct g-3' [SEQ ID No.39] Los AD ' s genómicos bacteriales son usados como patrones para la RCP. Los ADNs genómicos son extraídos de conformidad a Ausubel y col (1989, supra) . La reacción de CP se lleva a cabo en un volumen final de 50µ1 que comprende 100 ng de ADN, 5 µL de 10x1a solución reguladora de RCP (promega) , 2 µL de NTPS (5 mM de cada NTP) , el iniciador delantero y el iniciador reverso de 250 ng cada uno, la polimerasa Taq 1 µ?? (promega) . 3 RCP paralelas se realiza mediante el uso de 3 temperaturas de fusión diferentes: 46°C, 50°C o 53°C. Después de 1 minuto inicial a 94°C, se realizan 35 ciclos que consisten de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a la temperatura de fusión y 1 minuto a 72°C. Después de correr los productos de RCP sobre gel de agarosa al 1%, las bandas dentro del intervalo de tamaño de 0.3 a 1.0 kb son recuperadas y clonadas en el vector pCR® usando un paquete de clonación® TOPOMRTA (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del paquete. Los insertos del plásmido se forman en secuencia en Australian Genomic Research Facility usando el ABI PRISM Big Dye Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, empleando los iniciadores universales del M13 reverso o del M13 delantero disponibles sobre el vector. La base de datos del GenBank son buscados por el programa FASTA a través de ANGIS, usando el ADNs en secuencia como entradas. El empleo de los iniciadores a partir de "regiones conservadas" especificadas por Mattes y col (supra) los productos de RCP son amplificados a partir de Erwinia rhapontici y también de las bacterias encontradas subsiguientemente para ser negativas por la actividad de la isomerasa de sacarosa. Los patrones de los productos de RCP revelados por la el e ctro fo re s i s de gel de agarosa incluyen: sin banda de los dos aislados, una banda de 3 aislados y bandas múltiples de otras bacterias que incluyen Erwinia rhapontici. Los ADNs en doce bandas incluyen 6 bandas amplificadas de Erwinia rhapontici que son clonadas y formadas en secuencia. Ninguna de estas bandas de secuencia muestran identidad significativa a las isomerasas de sacarosa incluyendo la región del gene de Erwinia rhapontici mencionado por Mattes y col. La mayoría de las bandas de secuencia muestran identidades elevadas para conocer los genes de glucosidasa. De acuerdo a esto se concluye que las secuencias conservadas especificadas por Mattes y col., no son específicas a las isomerasas de sacarosa si no que son comunes a otras clases de enzimas incluyendo glucosidasas . Como una consecuencia estas secuencias conservadas no son de uso directo para la clonación de isomerasas de sacarosa sin la experimentación honerosa con las condiciones de RCP y seleccionando por otros medios para distinguir los clones de i s omeras a .

EJEMPLO 2 Selección funcional para bacterias qrue convierten sacarosa a isomaltulosa Aislamiento y colección de bacterias . 5 Las muestras bacteriales son recolectadas de un rango de sitios ambientales seleccionados por su potencial para obtener bacterias que metabolizan sacarosa novedosa. En particular los sitios son sujetos seleccionados •10- para la -disponibilidad de la sacarosa periódica que puede favorecer organismos adecuados para convertir la sacarosa a isómeros almacenados tales como isomaltulosa. Cerca de 100 muestras de los sitios en Southeast Queensland son recolectados en un cultivo 15 de medio MIM . MIM es 0.2% isomaltulosa ( 6-O-a-D- Glucopiranosil-D-Fructofuranosa) más MM (medio mínimo que contiene 1.5% Na2P04 , 0-45% KH2P04, 0.1% MH4C1, 0.05% MgSCu, 7 H20, 0.005% de citrato de amonio férrico y 0.0005& CaCL2. ) . Siguiendo el crecimiento en 20 un agitador orbital a 200 rpm por 2 horas a la temperatura ambiente, muestras de 100 ]iL se agitan en placas de agar MSM (MM más 4% de sacarosa) y se dejan crecer durante la noche a 28°C. Después de este enriquecimiento de 2 etapas, las colonias 25 morfológicamente diferentes se aislan en placas recientes separadas de LB o MSM para el crecimiento adicional (578 colonias en total) . Después de la agitación para asegurar la pureza de los aislados de una sola colonia, se transfieren en duplicado tanto en una placa de replica y un tubo universal de 30ral que contiene 5 mi de SLB (LB contiene 4% de sacarosa para la selección funcional adicional en un ensayo que revela pr e f erencialment e los organismos con capacidad más elevada para la producción de - isomaltulosa . EJEMPLO 3 Preparación de la muestra para el ensayo anilina/di fenil amina .

Los cultivos crecen durante la noche en 5 mi de SLB los cuales se centrifugan a una velocidad de 10,0000 x g por 10 minutos a la temperatura ambiente. El sobrenadante se vacia cuidadosamente y se le adiciona 2 mi de una solución se sacarosa al 50% en citrato/solución reguladora de pH6) Las células se vuelve a suspender gentilmente y se incuba a 28°C por 48 horas. Después de la incubación, 1.5 mi del cultivo se cambian a un tubo de Eppendor, se hierven por 15 minutos a 100°C, y se centrifugan a 16,000 x 20 minutos a la temperatura ambiente. Sin ponerlo en contacto con el granulo, el sobrenadante se coloca en un tubo recién preparado para el ensayo de anilina/difenilanilina y se somete a la electroforesis capilar EJEMPLO 4 Ensayo de la anilina/difenilamina Las muestras se colocan alrededor de un papel filtro Whatman # 1, con un control negativo (de Erwinia rhapontici) y un control negativo (de Escheríchia coli) colocadas en el centro. Después las muestras se sujetan en el papel filtro, se dejan secar por 15 minutos mientras se prepara el reactivo que desarrolla el color.

El reactivo de prepara como sigue: a. 4 mi de la anilina hasta 100 mi, usando acetona a . R. b. 4 g de la difenilamina hasta 100 mi de la acetona A.R. c. 20 mi de ácido ortofosfórico al 85% Los componentes (a) y (b) son preparados por separado en un campana asegurando el mezclado completo/disolución de la anilina/dif enilamina respecti amente en acetona antes de que se combinen en un recipiente de vidrio, después de lo cual se le adiciona el ácido. Después de la adición inicial del ácido, una precipitado blanco turbio se forma, el cual se disuelve después de una agitación vigorosa con lo cual se obtiene una solución café clara. Los filtros preparados se pasan a través de un "desarrollador" asegurando que cada uno de los filtros reciban la exposición igual y pareja. Los filtros se dejan que se sequen en sobre el papel en la campana por 15 minutos, y se calienta en un horno a 80°C por 10 minutos. Los resultados (color de las manchas) ser registran y se les toman fotografías usando una cámara digital.

Si está presente la isomaltulosa, la reacción da una mancha de color amarillo a amarillo café debido al 1, 6-enlazado de glucosacárido, en donde la glucosa da una mancha gris obscura, la fructuosa da un mancha gris-plata, y la sacarosa da un mancha púrpura- café debido al enlace 1,2. La intensidad del color depende de la concentración de los azúcares presentes. 12 candidatos son seleccionados de las 578 colonias como se indica por la prueba de ensayo de anilina/dif enilamina . La identidad del producto de la isomaltulosa de los aislados seleccionados luego son verificados mediante el análisis cuantitativo usando la electroforesis capilar para resolver e identificar los metabolitos relacionados.

EJEMPLO 5 Preparación de la muestra para la electroforesis capilar .

Los materiales iónicos en el sobrenadante usado para el ensayo de la anilina/difenilamina necesario para ser eliminando antes de cargar al capilar para un análisis adicional. Este se hace mediante el paso a través de una columna de Intercambio de catión fuerte (Bond Elut -SCX, 12109-2013) y una de Intercambio de anión fuerte (Bond Elut-SCX, 1210.2017) que se compra en Varian. Las columnas se pre-acondicionan mediante el lavado con un volumen de metanol, seguido por una cantidad de agua, haciendo los lavados con la ayuda de una jeringa. El sobrenadante bacterial se diluye 150 veces usando agua Milli-Q (SMQ) estéril, antes del proceso primero a través de una columna de SCX y luego a través de una columna SAX . Un mi del sobrenadante diluido se coloca en una columna SCX. La muestra se pasa a través de una columna con la ayuda de una jeringa de 50 mi. El eluido se recoge directamente en la columna SAX. La muestra se pasa similarmente con el eluido final recogido en un tubo de Eppendorf de 1.5 mi .

E JEMPLO 8 Electroforesis capilar La separación mediante la electroforesis capilar de alta resolución (HPCE) se realiza usando un Sistema de CE. de la Serie P/ACE 5000 Beckman, utilizando una fuente de luz de 190 a 380 ni de una-lámpara de deuterio con un Detector de Absorbancia de UV P/ACE de Beckman (254 nm[± 10 nm] de rueda de filtro) para la detección de la muestra. Los capilares son de silica fundida de barra con un D.I. 50 µ?a, de D.O: 363 µp?, (Supelco con el No. de cat. 70550-U) . La longitud total del capilar es de 77 cm . Y la longitud interna de la ventana del detector es de 69 cm. La ventana del detector capilar se hace mediante el quemado y el revestimiento del capilar usando la adaptación y la limpieza con metanol . Para lograr la máxima reproducibilidad de los tiempos de migración, el capilar se vuelve a reacondicionar cada uno en las mañanas y en las noches usando el rocedimiento de lavado siguiente : 2 min con SMQ, 10 min con HC1 0.1M, 2 min con SMQ, 10 min. Con NaOH 0.1M, 2 min con -SMQ, 15 min con amoniaco 0.5M y 2 min con SMQ. Todas la soluciones se disuelven/diluyen en SMQ y se filtran a través de un papel filtro de Microporo 0.45 ]i . El electrolito de sulfato de cobre alcalino con la detección directa basado en la absorbancia de UV se emplea para resolver y detectar las concentraciones bajas de sacarosa y el isómero de i s omal tul os a , además de otros azúcares incluyendo la glucosa y la fructuosa, que se espera en los extractos de la célula. Usando un electrolito que consiste de sulfato de cobre (II) 6 rum, amoniaco de 500 Mm, de pH 11.6, ambos para la separación y la detección de UV directa de los azúcares neutros que se logra mediante la reacción de quelación con el cobre (II) bajo condiciones alcalinas. La solución reguladora el electrolito de (EB) se prepara al inicio de cada dia y se desgasifica 15 minutos antes de usarse. Después del acondicionamiento, el capilar se lava con EB por 15 minutos. El capilar también se lava con EB por 10 minutos entre las separaciones de la muestra. Los parámetros programados para cada una de las pruebas se mencionan en la Tabla 1. UN control positivo y negativo como se describe antes se incluye en cada una de las muestras. Además, los estándares (que consisten de sacaros e isomaltulosa) se hacen antes de la primera y después de la última muestra, de manera que las diferencia en él tiempo de migración debido a los factores tales como la restricción de EB, el calentamiento del capilar, etc. Pueden ser medidos y corregidos . TABLA 1 Parámetros para cada etapa que realiza la electroforesis capilar . Función Duración Vial Vial interno externo Lavado 5 min 11 10 Delantero con EB 1.4 kg/cm2 Inyección 5 seg . 11 10 Del ant ero de 1.4 presión Kg/cm2 separado 30 min 12 1 25KV, 254 nm Lavado 5 min 13 10 Delantero con EB 1.4 Kg/cm2 Los tres productos que se aislaron como J49J, 14s, y 68J, son confirmados según la habilidad que tengan para convertir la sacarosa a isomaltulosa . Los sobrenadantes diluidos de estos tres aislados se vuelve a probar después de que son no seleccionados separadamente con ya sea sacarosa 5nM, 0.05 mM de isomaltulosa, 0.05 mM de fructuosa o 0.05mM de glucosa para verificar la identidad de los picos en la muestra basada en conjunto con el azúcar conocida.

EJEMPLO 7 Construcción del Banco Genómico Bacterial. El vector Cosmid SuperCos 1 (Stratageno) se usa para la construcción del Banco Genómico de un aislado australiano de Erwinia rhapontici (Número de acceso WAC2928), y de los aislados bacterianos 14S, 68J y 349 J. Los vectores disponen los fragmentos ADN genómicos que varían de 30 a 45 kb .

EJEMPLO 8. Preparación del inserto ADN Genómico. Debido a que son requeridos grandes fragmentos para la clonación en el vector SuperCos 1, el ADN genómico se extrae esencialmente mediante el método de Priefer y col. /1984, Cloning with cosmids . In Advanced Molecular Genetics (editorial Pühler, A. and Timmis, K.N.) Berlin: Springer-Veri ag, pp . 190-201) para obtener pesos moleculares elevados (~150 kb ) del ADN antes de someterse a digestión. El ADN sujeto se disuelve en una solución reguladora TE a 65°C por tres horas a 4°C por 2 días sin agitación. El tamaño molecular se estima mediante la verificación sobre un gel de agarosa al 0.4%. Con el fin de clonar en el sitio BamE I del vector Super Cos I, el ADN - cromosomal se somete a digestión parcialmente con la restricción de Sau 3A endonucl eas a . Una serie de pruebas de la digestión parcial se conduce para determinar las condiciones ideales para la obtención del rango del tamaño del inserto deseado. 10 µg del ADN genómico en una reacción con un volumen de 135 yL usando una solución reguladora IX Sau 3A se preequilibra a 37 °C por 5 minutos. Luego se adicionan 0.05 unidades de Sau 3A y después de 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 minutos, alícuotas (15 ]x ) se eliminan y la reacción se detiene inmediatamente a 68°C por 20 minutos. Las alícuotas se colocan en gel de agarosa al 0.5% para la electroforesis. El período de digestión óptimo se determina por el tamaño del fragmento promedio de 50kb. La reacción se lleva a cabo hasta que se obtenga 50 ]ig del ADN genómico en un volumen total de 675 . Después de la digestión se adicionan 13 de EDTA, al 0.5 M de pH 8.0 a la muestra. Después de la extracción con. fenol/cloroformo el ADN se precipita mediante la adición de 1/10 por volumen del acetato de sodio ( 3M pH 5.2) y el volumen de 2.5 de etanol de conformidad a Sambrook y col. (1989) . El granulo se vuelve a suspender en 450 de una solución reguladora de IX CIAP y el ADN se trata con CIAP por 60 min a 37°C otra extracción con fenol / cloroformo se repite al ADN tratado con CIAP. El ADN finalmente se disuelve en 30 ]ih de la solución reguladora TE para la unión.

EJEMPLO 9. Preparación del vector ADN Después de que el vector SuperCos 1 de 20 g se sometió a digestión mediante Xba I a 37 °C por 3 horas, una unidad de CIAP por µg del ADN se adiciona a la reacción y se incuban por otra hora a 37°C. La extracción de fenol/cloroformo y la precipitación de etanol del ADN tratado usando el método descrito antes se realiza. El Xba I/CIAP tratado con SuperCos ADN se vuelve a suspender en la solución reguladora TE y se verifica sobre gel de agarosa al 0.8% para ver la banda lineal de señal con un tamaño de 7.6 kb .

El vector del ADN se somete a digestión además con BamE I, se extrae con fenol/cloroformo, se precipita con etanol se vuelve a suspender en una solución reguladora TE a un 1 µg/ µL para la unión. EJEMPLO 10 Enlazamiento y empacamiento del ADN En un volumen de 15 µ??, 2.5 µg de Sau 3A del ADN genómico bacterial parcialmente sometido a digestión y 1.0 µg del ADN del vector SuperCos 1 tratado con Xba I /CIAP/Ba Í I se calienta a 70°C por 5 minutos luego 2 µ?. de ATP 10 mM, 2 µL de la solución reguladora de enlazamiento 10X y 1 µ? de la ligasa del ADN T4 (Invitrogen) se adicionan con lo cuál se obtienen 20 µ?. del volumen total. Después de 4 horas de incubación a la temperatura ambiente el enlazamiento se realiza a 4°C durante la noche. La eficiencia del enlazamiento se ve mediante la prueba de la reacción de 2 \i contra la mezcla sin enlazar del vector y de los ADNs insertados en un gel de agarosa al 0.8%. Una cuarta del proceso del enlazamiento se empacan In vitro de conformidad a las instrucciones del fabricante (Gigapack III Gold Packaging Extract, S tratagene ) . Las células clonadas de E.coli NM554 (Stratagene) crecen en un medio LB con maltosa al 0.2% y MgSO,j a 37 °C con agitación a partir de una sola colonia a un valor de ODeoo de 1.0. Las células se cosechan mediante centrifugación a 2000 por g a 4°C por 10 minutos, y luego se vuelven a suspender gentilmente en MgSC>4 10 mM a un valor de OD6oo de 0.5. Después 10 µL del Banco cosmid empacado se mezclan con 50 µ? de las células NM554 en un tubo de 1.5 mL, luego se incuban a la temperatura ambiente por 30 minutos, luego se adicionan 400 µ?. de LB al tubo. Para permitir la expresión de la resistencia antibiótica, las células se incuban a 37°C por otra hora con agitación suave una vez cada 15 minutos . Las células se centrifugan por 30 segundos y se vuelven a suspender suavemente en 100 µL del caldo LB recién preparado. 50 µL se rocían sobre la placa LB con 50 g/mL de ampicilina.

EJEMPLO 11 Selección f ncional de los bancos de Cosmid. Después de la selección funcional de 600 colonias de cada uno de los 4 bancos de cosmid, el ensayo de anilina/dif enilamina y CE como se describen antes, 4 clones de Erwinia xhapontici 4 clones de 14S, 3 clones de 349J, y de 3 clones de 68J muestran la disponibilidad de conversión de sacarosa a isomaltulosa . EJEMPLO 12 Subclonación y formación de secuencia . 5 Los ADNs cosmid de las colonias positivas son preparadas siguiendo el método de Sambrook y col. (1989) . Para encontrar los fragmentos funcionales más pequeños que contienen isomerasa de sacarosa, el inserto subclonado del ADN cosmid se prepara mediante •10· la diges-tión parcial, mediante .EcoR, BamE I o Hind III. El vector 2 de pZerO™ que se sometió a digestión recientemente (Invitrogen) mediante EcoR, BamE I o Hind III son usados para enlazarse con los insertos. Todos los procedimientos de clonación tales como el 15 enlazamiento y transformación en la cepa Top 10 E. coli siguiendo las instrucciones p oporcionadas por (Invitrogen) . 200 transformantes de cada uno de los enlazamientos son sujetados colocados y crecen para la selección funcional mediante el ensayo de anilina- 20 fenilamina como se ha descrito antes . Los subclones positivos funci onalme te son confirmados además mediante el análisis CE. Los ADNs del plásmido se aislan a partir del CE confirmados positivos para verificar el patrón de digestión sobre EcoR, BamE I o 25 Hind III. Los fragmentos que se sometieron a digestión del inserto cosmid son además subclonados en el 2-vector pZerO™, se ensaya y se calcula como se ha descrito antes para obtener los clones funcionales con insertos mas pequeños para la formación de la secuencia. Los insertos del plásmido son formados en secuencias en Australian Genomic Research Facility, usando ABI PRISM Big Dye Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Para la primera secuencia - redonda, los iniciadores universales (sp6, T7, M13 reverso o M13 delantero) que parten de los sitios disponibles sobre 2-vector pZerO™ son usados, luego los iniciadores acostumbrados se usan para la extensión de la secuencia. La secuencia se conducen y se confirman en ambas cadenas del ADN .

EJEMPLO 13 Exprésión de los 3 genes de isomerasa de sacarosa en E . coli . Basado en las secuencias de los genes clonados mediante la selección funcional como se ha descrito antes, tres pares de iniciadores son designados para subclonacion de 3 genes de isomerasa de sacarosa en el vector de expresión PET 24b. Mediante la RCP, la región sin codificar y las secuencias de guia son eliminadas y un codón de inicio artificial se incorpora. Cada uno de los iniciadores delanteros: 1) incluyen un codón de inicio, 2) crean un contexto similar a la planta para le inicio de traducción, 3) incorporan un sitio de restricción Bamñ I para fácilmente clonar y adaptar la marca de lectura abierto del gene. Cada uno de los iniciadores reversos incluyen el sitio de restricción Kpn I e incluyen un codón de tope. Los pares de base del iniciador son como sigue : Erwinia rhapontici 5'-gga tcc aac aat ggc cgt tea gca delantero: ate aaa tg-3 ' [SEQ ID NO:15] 14 S delantero: 5'-gga tcc acc aat gee aac cgt tea caá gga aag tg-3 ' [SEQ ID NO:17] 68J delantero: 5'-gga tcc aac aat ggc aac gaa tat acá aaa gtc c-3' [SEQ ID NO:13] Erwinia. rhapontici 5 '-ata ggt acc ctt aaa cgc gtg gat reversa : g-3 ' [SEQ ID NO : 16] 14S reversa: 5 '-ata ggt acc tta ceg cag ctt ata cae acc-3 ' [SEQ ID NO:18] 68 J reve sa : 5 '-ata ggt acc tea gtt cag ctt ata gat ccc-3' [SEQ ID NO : 1 ] El pfu de polimerasa del ADN de alta fidelidad (Estratageno) se usa para RCP los productos de la RCP son direct mente clonados en el vector pCR®2.1 usando TOPO TA (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del paquete . Los 3 genes de isomerasa de sacarosa en el vector pCR®2.1 se cortan y se clonan en pGEM®-3Zf(+) luego en el vector pET 24b (Novagen) para la expresión en la cepa de E.coli BL21(DE3) . 5 mi del medio LB con 50 ug/mL de kanami ciña se usa para el cultivo de la célula BL21(DE3) . 15 cultivos por construcción se tienen inicialmente. Las células crecen a 28°C en agitación a 225 rpm. De 6 a 10 cultivos en construcción, con OD6oo 1.000± 0.005, son seleccionados para inducción adicional. Después 0. 5 mi se muestra desde cada uno de los cultivos, el IPTG se adiciona al cultivo a una concentración final de l.OmM. La incubación de los cultivos se continúa por otras 3 horas. Los cultivos se inducen solo con ODeoo 1.750+ 0.005 que son además seleccionados para la medición de la proteina y del análisis de la conversión de la sacarosa, siguiendo el análisis de las tres cultivos replicados por construcción DE cada uno de los cultivos de IPTC-inducidos seleccionados, 1. 5 mi se muestrea para la cuanti ficación de la proteina, 0. 5 mi para la proteina de SDS-PAGE, 1.0 mi para la cuanti ficación de la eficiencia de la conversión de la sacarosa en la isomal tulosa .

EJEMPLO 14 Ensayo De Proteína Las células son cosechadas mediante la centrifugación (3, 000 x g, 4°C, 10 min) . El granulo de la célula se vuelve a suspender en 50 µ? de 50mM de Tris-HCl, pH 8.0, y 2 mM de EDTA, luego se vuelve a centrifugar. El granulo de las células se congela inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacena a -70°C. Las células se suspenden en una solución reguladora de extracción 0.5 mi (20mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM MaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de azida, 10 mM de ß-mercaptoetanol) , luego se somete a lisis mediante sonicación (9x15 s de pulso a 50 watts a partir de una microprueba de 450 en un sonificador Branson) , y se centrifuga (10, 000 x g, 4°C, por 10 min) . El sobrenadante se filtra a través de una unidad de filtro de membrana de Acrodisc® 32 Super® 0.45 µ?? (GelmanScience) . La proteina se ensaya de conformidad a Bradford (1976, Anal Biochem. 72:248-254) usando albúmina de suero de bovino como un estándar. 10 µL de la extracción de la proteína descrita antes se mezcla con 90 µ?; de NaCl 0.15 M y 1 mL de la solución azul brillante Cumasina (100 mg de azul brillante Cumasina G-250 en 50mL de etanol al 95%+ 100 mL de ácido fosfórico al 85% + 850 mL de SMQ) . Se determina A595 y el contenido de proteina se calcula a partir de la curva estándar.

EJEMPLO 15 SDS-PAGE: Los geles de poliacrilamida SDS son polimeri s ados y se corren como se describen en Laemmli (1970, Nature 227:680-685) . Las muestras de la proteína se calienta a 100°C por 5 mín, en un solución reguladora de la muestra lx SDS-PAGE (25 mM Tris-HCl pH 6.8, 1% (w/v) SDS, 5% (v/v) ß-mercap toetanol al 5% (v/v) , glicerol al 10% (v/v) , azul de bromofenol al 0.05% (v/v) , se centrifugan a 12,000 x g por un minuto y los sobrenadantes se aplican sobre los geles. Cada una de las muestras se coloca en 2 vías adyacentes después de la prueba una vía del gel se tiñe en el azul de Cumasina R-250 al 0.025% (p/v) , se destiñe el metanol al 30% (v/v) , ácido acético al 10% (v/v) , luego se expresa la isomerasa de sacarosa que se separa de la vía sin teñir que corresponde a la posición de migración relativa de la vía de gel teñida. La proteina de isomerasa de sacarosa se eluye en un placa de gel mediante la inmersión en una solución reguladora de extracción durante la noche a 4°C con agitación suave. La isomerasa de sacarosa eluida se cuantifica usando un método de cuanti fi ca ción de proteina como se ha descrito antes.

EJEMPLO 16 - Intervalo de conversión de la sacarosa en isomaltulosa mediante la isomerasa de sacarosa expresada en E.coli 1.0 mL del cultivo se centrifuga y luego se vuelve a suspender en una solución reguladora de citrato/fosfato (pH 6.0), solución de sacarosa el 50% y se ensaya para la conversión de isomaltulosa mediante el análisis CE como se ha descrito antes. El intervalo de conversión se calcula mediante el área de pico de la sacarosa y el área del pico de la isomaltulosa normalizados contra los estándares de la concentración conocida, usando el software de System CE Series P/ACE 5000 de Beckman.

EJEMPLO 17 Construcción de la preparación del ADN.

El inserto del gene (IS) de la isomerasa de sacarosa en el vector pET 24b se clona además entre el activador Ubi del gene de maíz (Christensen and Q ail, 1996, Transgen. Res. 5: 215-218) y el finalizador Agrobacterium nos (Bevan y col., 1983, Nature 304:183-187) para impulsar la expresión en el tejido leñoso de la caña de azúcar. Los plásmidos con los genes de isomerasa de sacarosa (pU32Erw, pU3Z14s o pU3Z68J) y pEmuKN (del plásmido de construcción), a aph A (como un marcador seleccionable ) son aislados mediante la extracción alcalina (Sambrook y col., 1989, supra) , y se disuelve en una solución reguladora TE. El plásmido manipulado y con ausencia del ADN o RNA genómico se verifica mediante electroforesis de gel y la concentración se mide mediante espectrofotometria . La construcción del gene de isomerasa de sacarosa (UbiSi) y la construcción del marcador seleccionable se co-precipi tan en microproyectiles de tungsteno y se introduce en el tejido leñoso de la caña de azúcar, seguido por la selección del tejido leñoso transformado y la regeneración de las plantas transgénicas esencialmente descritas por Bower y col. (1996, Molec. Breed. 2:239-249) EJEMPLO 18 Bombardeo de partículas. Las reacciones de precipitación se conducen mediante la adicción de los siguiente a 4°C a un tubo de microfugas de 1.5 mL, 5 µ?, del ADN del plásmido pEmuKN (1 mg/mL) , 5 µ?. del ADN del plásmido UbiSi (1 µg/µL) , 50 µ?, de tungsteno (Bio-Rad MIO, 100 µg/ µ?,) , 50 µ? CaCl2 (2.5M), 20 µL de espermidina (100 mM de la base libre) . La preparación se mezcla inmediatamente después de la adicción de cada uno de los reactivos, con la eliminación mínima entre la adición de CaCl2 y la espermidina. El tungsteno se deja reposar por 5 minutos en hielo, antes de la eliminación de 10 µL del sobrenadante y la re- suspensión del tungsteno mediante la prueba de la base del tubo a través de un conjunto de tubos. Las suspensiones son usadas dentro de los 15 minutos en una carga de 4 µL/bombardeo con la resuspensión de las partículas inmedia amente antes de la eliminación de cada una de las alícuotas teniendo el ADN completo se precipita durante la reacción, esto es equivalente a 1.3 µg del ADN/bomba deo en 667 µg de tungs teño /bombardeo . El tejido leñoso embriogénico a partir del azúcar de caña Q117 se usa para el bombardeo. Las partículas son aceleradas mediante la entrada directa, en un pulso de gas de helio, a través de la reducción de un sujetador de filtro de jeringa en el tejido leñoso de blanco en una cámara al vacio como se describe en Bo er y col. (1996, supra) el tejido se condiciona osmóticamente por 4 · horas antes y después del bombardeo. Después de 48 horas de recuperación en el medio sólido sin antibióticos, el tejido leñoso bombardeado se transforma al medio con 45 mg/L de Geneticina para la selección, el desarrollo del tejido leñoso y la regeneración de la planta. EJEMPLO 19 Funcionab ilidad de los trans formantes en la conversión de sacaros a . Las muestras se recogen a partir del tejido leñoso transgénico independiente y crecen bajo nitrógeno liquido. También, el tejido leñoso Q117 sin transformar y el tejido leñoso transformado con Ubi-luc se usan como controles negativos. El tejido cultivado se centrifuga a 16,000 x g a 4°C al granulo de la célula de desecho. El sobrenadante se diluye 10 veces en SMQ, luego hierve por 20 minutos. Después de otra centrifugación para eliminar las proteínas desnaturalizadas, el sobrenadante se pasa a través del análisis de Bond Elut™ SCX y SAX . Que se ha realizado como se ha descrito antes.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN CON RELACIÓN A LOS EJEMPLO. 5 Tres cepas bacteriales con actividad de isomerasa de sacarosa son aisladas .

Un aislado australiano de Erwinia rhapontici No. de acceso: WAC2928 se usa como un control positivo '10- para la' producción de isomaltulosa, debido a que estas especies han sido mostradas previamente para producir una enzima de isomerasa de sacarosa que convierte la sacarosa a isomaltulosa (Cheetham, 1985, supra) de un total de 578 bacterias aisladas a través 15 de un procedimiento enriquecido, 3 cepas obtenidas de la reacción en color amarillo diferentes a la isomaltulosa en el ensayo de a il ina / di f eni 1 amina y un pico novedoso en el ensayo CE que corresponde a la isomaltulosa estándar y a la Erwinia rhapontici estas 20 cepas designadas 14S, 61J y 249J son bacterias Gram- negativas adecuados para usarse ya sea para la sacarosa o la isomaltulosa como una sola fuente de carbono. Las 3 cepas crecen bien a 22-30°C y las 68J también crecen lentamente a 4°C. 25 Tres genes de isómeras a de sacarosa son funcionalmente clonadas y formados en secuencia. La selección funcional de los bancos cosmid genómicos de Erwínia rhapontici, 14S, 349J y 68J en E.coli dan clones capaces de convertir la sacarosa a isomaltulosa (Figura 2) . Después de varios ciclos de subclonación en el 2-vector pZerO™ y la selección funcional, los insertos funcionales más pequeños en 2-vector pZerO™ varían de 3 a 5 kb . - La secuencia de Erwinia rhapontici (Figura 3) muestra un ORF 1899 bp que codifica 632 aminoácidos (Figura 5) . La primera secuencia de cadena revela un gene en el subclón 349J con una identidad del 99% para esta Erwinia rhapontici ORF, de manera que la secuencia de 349J se detiene. La secuencia de 14S revela un ORF 1797 bp que codifica 598 aminoácidos. La base de datos investiga para FASTA que muestra que 1305 bp del gene SI de Erwinia rhapontici y la longitud total del gene SI de 14S ha sido mencionado por Mattes y col. (supra) la secuencia de 68J (Figura 4) indica un gene SI novedoso con un ORF 1797 bp . En el nivel del nucleótido tiene menos que 70% de identidad para las isomerasas de sacarosa conocidas ya sea con o sin el fragmento guía (Tabla 2) . En el nivel del aminoácido, la identidad para otras isomerasas de sacarosa esta entre 63.4% a 70.6% con la guia o 64.6% a 73.7% sin la guia. El 68J predice el producto del gene SI que es una proteina con 598 aminoácidos (Figura 6), Mr de 69291 y el punto isoeléctrico 7.5 debido a 78 residuos de aminoácido básico y 69 residuos de aminoácido acidico. El análisis filogénico de las secuencias de los aminoácidos permite la relación entre el gene 68J SI y los genes conocidos. Todos los genes de isomerasa de sacarosa y las glucosidasas distribuidas conservan los productos de los dominios para el enlazamiento de la azúcar. Como un resultado de las secuencias conservadas y de los iniciadores correspondientes descritos por Mattes y col. (supra) no son específicos para las isomerasas de sacarosa y se pueden obtener la mayoría de genes sin SI a partir de organismos diferentes. El gene SI de 68J muestra cercanamente el mismo nivel de la identidad del nucleótido a varias glucosidasas como se conoce para los genes SI de Pseudomonas mesoacidophila .

TABLA 2. Comparación entre las características de 68J, otras isomerasas de sacarosa , fragmentos de isomerasa de sacarosa y una glncosidas .

Comparación entre 68J y fragmentos no funcionales de los genes de isomerasa sacarosa incompleta. Sudz # secuencias que son desarrolladas en la patente a Sudzucker (Mattes y col) .

Isomerasa de sacarosa de 68J que muestra la eficiencia de conversión más elevada entre las isomerasas probadas . Cuando los genes SI de Erwinia rhapontici 14S y 68J son dispuestos para la expresión usando el mismo vector (el mismo activador, codón de inicio y secuencias de terminación) no existe diferencias significativ s en el contenido de proteina total o en nivel de expresión de las isomerasas de sacarosa alrededor del 10% de la proteina total (Tabla 3) sin embargo la eficiencia de conversión de la sacarosa a isomaltulosa mediante el producto del gene 68J clonado es 10 veces mas que la Erwini a rhapontici y 18 veces que los productos del gene 14S (Figura 7) . Además la isomerasa de sacarosa del 68J genera relativamente proporciones más pequeñas de glucosa y fructuosa que el 14S y Erwinia rhapontici . Otros factores durante el gene de expresión y la cuantificación de la actividad de la enzima son idénticos : el mismo codón de inicio ATG es para la construcción del gene, el mismo vector pET 24b, la misma cepa de célula clonada BL"21(DE3) , las mismas condiciones de cultivo, la misma densidad celular antes y después de la inducción de IPTG, la misma cantidad de células usadas para la conversión de sacarosa, la misma cantidad de la proteína total colocada sobre SDS-PAGE y el mismo volumen del sobrenadante con el mismo contenido de proteina total colocado al CE. El experimento se realiza tres veces con las mismas condiciones. Los resultados experimentales muestran el potencial elevado de la isomerasa de sacarosa de 68J inaplicaciones industriales para la producción de isomaltulosa . ???S? 3. Contenidos de proteina total y contenidos de pro teína de isomerasa de sacarosa asumidos en las células de E.coli con un gene SI Ervinla rhaponticl , 14S o 68J* .

Los resultados son errores estándar ± promedios derivados de 3 réplicas *Incluye los antecedentes de aproximadamente proteínas al 2% que emigran con la isomerasa de sacarosa .

Tejido leñoso transgénico de caña de azúcar con isomerasa de sacarosa 68J que también muestran el intervalo de conversión más elevado entre las construcciones del gene de isomerasa de sacarosa probadas . · La isomaltulosa se puede encontrar en los extractos celulares del tejido leñoso de la caña de azúcar que expresa los genes de isomerasa de sacarosa. Existen 3 líneas transgénicas 68J probadas que muestran el pico de isomaltulosa más elevado que el pico de sacarosa en el electrógrafo CE (figura 8A) .Al contrario existen 3 de 7 líneas transgénicas 14S probadas que muestran el pico de isomaltulosa más pequeño que el pico de sacarosa (figura 8B) . La isomaltulosa no puede ser detectada en el tejido leñoso de las otras 4 líneas transgénicas 14S probadas. La isomaltulosa no puede ser detectada en el tejido leñoso de las otras 4 líneas transgénicas 14S probadas. El tejido leñoso transgénico con el gene Erwinia rhapontici muestra aún niveles de i s omal tul os a inferiores que las líneas 14S (figura 8C) . Estos resultados muestran para el primer tiempo la facilidad de producción de isomaltulosa mediante la expresión de isomerasa de sacarosa en las plantas, y el potencial elevada de isomerasa de sacarosa 68J para estos fines. La exposición de cada una de las patentes, la solicitud de la patente y la publicación citada en la presente se incorporan solo como referencia. A través de la descripción la ayuda ha sido para describir las realizaciones preferidas de la invención sin limitarla a cualquiera de las realizaciones o de la colección especifica de modalidades. Para aquellos expertos en la técnica por lo tanto se apreciara que para aclarar la descripción de la presente, varias modificaciones y cambios se pueden hacer en las modalidades particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance de la presente invención. Todas las modificaciones y cambios se entenderán que se incluyen dentro del alcance y de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIA. <110> La Universidad de Queensland (Todos lo estados designados, excepto U.S) Birch, Robert (U.S únicamente) <120> Polipéptidos y polinuc 1 eótido s novedosos y el uso de los mismos . <130> Isomerasas de sacarosa. <140> Aún no asignado. <141> 2001-08-29 <150> AU PQ9788/00 <151> 2000-08-29 <160> 39 <170> Patentln versión <210> 1 <211> 1899 <212> ADN <213> Erwinia rhaponti <220> <221> CDS <222> (1) .. (1896) <223> <220> <221> sig_peptido <222> (109) .. (1899) <223> <220> <221> modalidad <222> (707) .. (707) <223> n= nucleótido desconocido. <220> <221> modalidad <222> (1347) .. (1347) <223> n= nucleótido desconocido <400> 1 atg tcc tct caa gaa ttg aaa gcg gct gct gct att ttt ctt gca acc 48 Met Ser Ser Gln Glu Leu Lis Ala Ala Val Ala lie Phe Leu Ala Thr -35 -30 -25 act ttt tct gcc acá tcc tat cag gcc tgc agt gcc ggg cea gat acc 96 Thr Phe Ser Ala Thr Ser Tir Gln Ala Cis Ser Ala Gli Pro Asp Thr -20 -15 -10 -5 gcc ecc tea etc acc gtt cag caa tea aat gcc ctg ecc acá tgg tgg 144 Ala Pro Ser Leu Thr Val Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Thr Trp Trp -1 1 5 10 aag cag gct gtt ttt tat cag gta tat cea cgc tea ttt aaa gat acg 192 Lis Gln Ala Val Phe Tir Gln Val Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Thr 15 20 25 aat ggg gat ggc att ggg gat tta aac ggt att att gag aat tta gac 240 Asn Gli Asp Gli lie Gli Asp Leu Asn Gli lie lie Glu Asn Leu Asp 30 35 40 tat ctg aag aaa ctg ggt att gat cgc att tgg ate aat cea cat tac 288 Tir Leu Lis Lis Leu Gli lie Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir 45 50 55 60 gat teg ceg aat acg gat aat ggt tat gac ate cgg gat tac cgt aag 336 Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Arg Asp Tir Arg Lis 65 70 75 ata atg aaa gaa tac ggt acg atg gaa gac ttt gac cgt ctt att tea 384 lie Met Lis Glu Tir Gli Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu lie Ser 80 85 90 gaa atg aag aaa cgc aat atg cgt ttg atg att gat att gtt ate aac 432 Glu Met Lis Lis Arg Asn Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn 95 100 105 cae acc age gat cag cat gcg tgg ttt gtt cag age aaa teg ggt aag 480 His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp Phe Val Gln Ser Lis Ser Gli Lis 110 115 120 aac aac ecc tac agg gac tat tac ttc tgg cgt gac ggt aag gat ggc 528 Asn Asn Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Asp Gli 125 130 135 140 cat gcc ecc aat aac tat ecc tcc ttc ttc ggt ggc tea gcc tgg gaa 576 His Ala Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Glu 145 150 155 aaa gac gat aaa tea ggc cag tat tac ctc cat tac ttt gcc aaa cag Lis Asp Asp Lis Ser Gli Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Lis Gln 160 1S5 170 caá ccc gac ctc aac tgg gac aat ccc aaa gtc cgt caá gac ctg tat Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Gln Asp Leu Tir 175 180 185 gac atg ctc cgc ttc tgg tta gat aaa ggc gtt tnt ggt tta cgc ttt Asp Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Xaa Gli Leu Arg Phe 190 195 200 gat acc gtt gcc acc tat tea aaa ate ceg aac ttc ect gac ctt age 768 Asp Thr Val Ala Thr Tir Ser Lis lie Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser 205 210 215 220 caá cag cag tta aaa aat ttc gcc gag gaa tat act aaa ggt ect aaa 816 Gln Gln Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Glu Tir Thr Lis Gli Pro Lis 225 230 235 att cae gac tac gtg aat gaa atg aac aga gaa gta tta tec cae tat 864 lie His Asp Tir Val Asn Glu Met Asn Arg Glu Val Leu Ser His Tir 240 245 250 gat ate gcc act gcg ggg gaa ata ttt ggg gtt ect ctg gat aaa teg 912 Asp lie Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Leu Asp Lis Ser 255 260 265 att aag ttt ttc gat cgc cgt aga aat gaa tta aat ata gcg ttt acg 960 lie Lis Phe Phe Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr 270 275 280 ttt gat ctg ate aga ctc gat cgt gat gct gat gaa aga tgg cgg cga 1008 Phe Asp Leu lie Arg Leu Asp Arg Asp Ala Asp Glu Arg Trp Arg Arg 285 290 295 300 aaa gac tgg acc ctt teg cag ttc cga aaa att gtc gat aag gtt gac 1056 Lis Asp Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Lis lie Val Asp Lis Val Asp 305 310 315 caá acg gca gga gag tat ggg tgg aat gcc ttt ttc tta gac aat cae 1104 Gln Thr Ala Gli Glu Tir Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His 320 325 330 gac aat ccc cgc gcg gtt tet cae ttt ggt gat gat cga cea caá tgg 1152 Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gli Asp Asp Arg Pro Gln Trp 335 340 345 cgc gag cat gcg gcg aaa gca ctg gca acá ttg acg ctg acc cag cgt 1200 Arg Glu His Ala Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Arg 350 355 360 gca acg ccg ttt ate tat cag ggt tea gaa etc ggt atg acc aat tat 1248 Ala Thr Pro Phe lie Tir Gln Gli Ser Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir 365 370 375 380 ecc ttt aaa aaa ate gat gat ttc gat gat gta gag gtg aaa ggt ttt 1296 Pro Phe Lis Lis lie Asp Asp Phe Asp Asp Val Glu Val Lis Gli Phe 385 390 - 395 tgg caá gac tac gtt gaa acá ggc aaa gtg aaa gct gag gaa ttc ctt 1344 Trp Gln Asp Tir Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu 400 405 410 can aac gta cgc caá acc age cgt gat aac age aga acc ecc ttc cag 1392 Thr Asn Val Arg Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln 415 420 425 tgg gat gca age aaa aat gcg ggc ttt acc age gga acc ect tgg tta . 1440 Trp Asp Ala Ser Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu 430 435 440 aaa ate aat ecc aat tat aaa gaa ate aac age gca gat cag att aac. 1488 Lis lie Asn Pro Asn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn 445 450 455 460 aat cea aat tec gta ttt aac tat tat aga aag etc att aac att cgc 1536 Asn Pro Asn Ser Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg 465 470 475 cae gac ate ect gee tta acc tac ggc agt tat att gat tta gct ect 1584 His Asp lie Pro Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro 480 485 490 gac aac aat tea gtc tat gct tac act cga acg ttt ggc gct gaa aaa 1632 Asp Asn Asn Ser Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis 495 500 505 tat ctt gtg gtc att aat ttt aaa gaa gaa gtg atg cae tac acc ctg 1680 Tir Leu Val Val lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu 510 515 520 ect ggg gat tta tec ate aat aag gtg att act gaa aac aac agt cae 1728 Pro Gli Asp Leu Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His 525 530 535 540 act att gtg aat aaa aat gac gta gaa gat ect cgt ggg gct acá age 1176 Thr lie Val Asn Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gli Ala Thr Ser 545 550 555 gtt tgt age ccc ttc cag gct caa aaa agg cct ggc gac ccg ggt tac 1824 Val Cis Ser Pro Phe Gln Ala Gln Lis Arg Pro Gli Asp Pro Gli Tir 560 565 570 tet gct gee cat teg att cgg ttc ttg ccc cgg ttt ttc gct tea tac 1872 Ser Ala Ala His Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir 575 580 585 agg ggc gac ate cae gcg ttt aag taa 1899 Arg Gli Asp lie His Ala Phe Lis 590 595 <210> 2 <211> 632 <212> PRT <213> Erwinia rhapontici <220> <221> modalidad <222> (200).. (200) <223> El 'Xaa' en el lugar 200 se representan por Tir, Cis, Ser, o Phe <220> <221> modalidad <222> (707) . . (707) <223> n = nucleótido desconocido <220> <221> modalidad <222> (1347) .. (1347) <223> n = nucleótido desconocido <400> 2 Met Ser Ser Gln Glu Leu Lis Ala Ala Val Ala lie Phe Leu Ala Thr -35 -30 -25 Thr Phe Ser Ala Thr Ser Tir Gln Ala cis Ser Ala Gli Pro Asp Thr -20 -15 -10 -5 Ala Pro Ser Leu Thr Val Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Thr Trp Trp -1 1 5 10 Lis Gln Ala Val Phe Tir Gln Val Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Thr 15 20 25 Asn Gli Asp Gli lie Gli Asp Leu Asn Gli lie lie Glu Asn Leu Asp 30 35 40 Tir Leu Lis Lis Leu Gli lie Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir 45 50 55 60 Asp Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Arg Asp Tir Arg Lis 65 70 75 lie Met Lis Glu Tir Gli Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu lie Ser 80 85 90 Glu Met Lis Lis Arg Asn Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn 95 100 105 His Thr Ser Asp Gln His Ala Trp Phe Val Gln Ser Lis Ser Gli Lis 110 115 120 Asn Asn Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Asp Gli 125 130 135 140 His Ala Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Glu 145 150 155 Lis Asp Asp Lis Ser Gli Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Lis Gln 160 165 170 Gln Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Gln Asp Leu Tir 175 180 185 Asp Met Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Xaa Gli Leu Arg Phe 190 195 200 Asp Thr Val Ala Thr Tir Ser Lis lie Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser 205 210 215 220 Gln Gln Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Glu Tir Thr Lis Gli Pro Lis 25 230 235 lie His Asp Tir Val Asn Glu Met Asn Arg Glu Val Leu Ser His Tir 240 245 250 sp lie Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Leu Asp Lis Ser 255 260 265 lie Lis Phe Phe Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr 270 275 280 Phe Asp Leu lie Arg Leu Asp Arg Asp Ala Asp Glu Arg Trp Arg Arg 285 290 295 300 Lis Asp Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Lis lie Val Asp Lis Val Asp 305 310 315 Gln Thr Ala Gli Glu Tir Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His 320 325 330 Asp Asn Pro Arg Ala Val Ser His Phe Gli Asp Asp Arg Pro Gln Trp 335 340 345 Arg Glu His Ala Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Arg 350 355 360 Ala Thr Pro Phe lie Tir Gln Gli Ser Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir 365 370 375 380 Pro Phe Lis Lis lie Asp Asp Phe Asp Asp Val Glu Val Lis Gli Phe 385 390 395 Trp Gln Asp Tir Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu 400 405 410 Thr Asn Val Arg Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln 415 420 ¦ 425 Trp Asp Ala Ser Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu 430 435 440 Lis lie Asn Pro Asn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn 445 450 455 460 Asn Pro Asn Ser Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg 465 470 475 His Asp lie Pro Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro 480 485 490 Asp Asn Asn Ser Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis 495 500 505 Tir Leu Val Val lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu 510 515 520 Pro Gli Asp Leu Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His 525 530 535 540 Thr lie Val Asn Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gli Ala Thr Ser 545 550 555 Val Cis Ser Pro Phe Gln Ala Gln Lis Arg Pro Gli Asp Pro Gli Tir 560 565 570 Ser Ala Ala His Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir 575 580 585 Arg Gli Asp lie His Ala Phe Lis 590 595 <210> 3 <211> 1791 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <220> <221> CDS <222> (1) .. (1788) <220> <221> itiat_peptido <222> (1) .. (1791) <223> <220> <221> modalidad <222> (599) . . (599) <223> n == nucleótido desconocido <220> <221> modalidad <222> (1239) .. (1239) <223> n = nucleótido desconocido <400> 3 acc gtt cag caá tea aat gee ctg ecc acá tgg tgg aag cag gct gtt Thr Val Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Thr Trp Trp Lis Gln Ala Val 1 5 10 15 ttt tat cag gta tat cea cgc tea ttt aaa gat acg aat ggg gat ggc Phe Tir Gln Val Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Thr Asn Gli Asp Gli 20 25 30 att ggg gat tta aac ggt att att gag aat tta gac tat ctg aag aaa lie Gli Asp Leu Asn Gli lie lie Glu Asn Leu Asp Tir Leu Lis Lis 35 40 45 ctg ggt att gat gcg att tgg ate aat cea cat tac gat teg ceg aat Leu Gli lie Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir Asp Ser Pro Asn 50 55 60 acg gat aat ggt tat gac ate cgg gat tac cgt aag ata atg aaa gaa Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Arg Asp Tir Arg Lis lie Met Lis Glu 65 70 75 80 tac ggt acg atg gaa gac ttt gac cgt ctt att tea gaa atg aag aaa 288 Tir Gli Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu lie Ser Glu Met Lis Lis 85 90 95 cgc aat atg cgt ttg atg att gat att gtt ate aac cae acc age gat 336 Arg Asn Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn. His Thr Ser Asp 100 105 110 cag cat gcg tgg ttt gtt cag age aaa teg ggt aag aac aac ecc tac 384 Gln His Ala Trp Phe Val Gln Ser Lis Ser Gli Lis Asn Asn Pro Tir 115 120 125 agg gac tat tac ttc tgg cgt gac ggt aag gat ggc cat gee ecc aat 432 Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Asp Gli His Ala Pro Asn 130 135 140 aac tat ecc tec ttc ttc ggt ggc tea gee tgg gaa aaa gac gat aaa 480 Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Glu Lis Asp Asp Lis 145 150 155 160 tea ggc cag tat tac etc cat tac ttt gee aaa cag caá ecc gac etc 528 Ser Gli Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Lis Gln Gln Pro Asp Leu 165 170 175 aac tgg gac aat ecc aaa gtc cgt caá gac ctg tat gac atg etc cgc 576 Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Gln Asp Leu Tir Asp Met Leu Arg 180 185 190 ttc tgg tta gat aaa ggc gtt tnt ggt tta cgc ttt gat acc gtt gee 624 Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Xaa Gli Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala 195 200 205 acc tat tea aaa ate ceg aac ttc ect gac ctt age caá cag cag tta 672 Thr Tir Ser Lis lie Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Gln Gln Gln Leu 210 215 220 aaa aat ttc gee gag gaa tat act aaa ggt ect aaa att cae gac tac 720 Lis Asn Phe Ala Glu Glu Tir Thr Lis Gli Pro Lis lie His Asp Tir 225 230 235 240 gtg aat gaa atg aac aga gaa gta tta tec cae tat gat ate gee act 768 Val Asn Glu Met Asn Arg Glu Val Leu Ser His Tir Asp lie Ala Thr 245 250 255 gcg ggg gaa ata ttt ggg gtt ect ctg gat aaa teg att aag ttt ttc 816 Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Leu Asp Lis Ser lie Lis Phe Phe 260 265 270 gat cgc cgt aga aat gaa tta aat ata gcg ttt acg ttt gat ctg atc 864 Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe Asp Leu lie 275 280 285 aga ctc gat cgt gat gct gat gaa aga tgg cgg cga aaa gac tgg acc 912 Arg Leu Asp Arg Asp Ala Asp Glu Arg Trp Arg Arg Lis Asp Trp Thr 290 295 300 ctt tcg cag ttc cga aaa att gtc gat aag gtt gac caá acg gca gga 960 Leu Ser Gln Phe Arg Lis lie Val Asp Lis Val Asp Gln Thr Ala Gli 305 310 315 320 gag tat ggg tgg aat gcc ttt ttc tta gac aat cae gac aat ecc cgc 1008 Glu Tir Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg 325 330 335 gcg gtt tet cae ttt ggt gat gat cga cea caá tgg cgc gag cat gcg 1056 Ala Val Ser His Phe Gli Asp Asp Arg Pro Gln Trp Arg Glu His Ala 340 345 350 gcg aaa gca ctg gca acá ttg acg ctg acc cag cgt gca acg ceg ttt 1104 Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe 355 360 365 atc tat cag ggt tea gaa ctc ggt atg acc aat tat ecc ttt aaa aaa 1152 lie Tir Gln Gli Ser Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro Phe Lis Lis 370 375 380 atc gat gat ttc gat gat gta gag gtg aaa ggt ttt tgg caá gac tac 1200 lie Asp Asp Phe Asp Asp Val Glu Val Lis Gli Phe Trp Gln Asp Tir 385 390 395 400 gtt gaa acá ggc aaa gtg aaa gct gag gaa ttc ctt can aac gta cgc 1248 Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu Thr Asn Val Arg 405 410 415 caá acc age cgt gat aac age aga acc ecc ttc cag tgg gat gca age 1296 Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Ala Ser 420 42 430 aaa aat gcg ggc ttt acc age gga acc ect tgg tta aaa atc aat ecc 1344 Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu Lis lie Asn Pro 435 440 445 aat tat aaa gaa atc aac age gca gat cag att aac aat cea aat tec 1392 Asn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn Asn Pro Asn Ser 450 455 460 gta ttt aac tat tat aga aag ctc att aac att cgc cae gac atc ect 1440 Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg His Asp lie Pro 465 470 475 480 gcc tta acc tac ggc agt tat att gat tta gct cct gac aac aat tca 1488 Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro Asp Asn Asn Ser 485 490 495 gtc tat gct tac act cga acg ttt ggc gct gaa aaa tat ctt gtg gtc 1536 Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis Tir Leu Val Val 500 505 510 att aat ttt aaa gaa gaa gtg atg cae tac acc ctg cct ggg gat tta 1584 lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu Pro Gli Asp Leu 515 520 525 tec ate aat aag gtg att act gaa aac aac agt cae act att gtg aat 1632 Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His Thr lie Val Asn 530 535 540 aaa aat gac gta gaa gat cct cgt ggg gct acá age gtt tgt age ecc 1680 Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gli Ala Thr Ser Val Cis Ser Pro 545 550 555 560 ttc cag gct caá aaa agg cct ggc gac ceg ggt tac tet gct gcc cat 1728;_, Phe Gln Ala Gln Lis Arg Pro Gli Asp Pro Gli Tir Ser Ala Ala His 565 570 575 teg att cgg ttc ttg ecc cgg ttt ttc gct tca tac agg ggc gac ate 1776 Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir Arg Gli Asp lie 580 585 590 cae gcg ttt aag taa 1791 His Ala Phe Lis 595 <210> 4 <211> 596 <212> PRT <213> Erwinia rhapontici <220> <221> modalidad <222> (200) . . (200) <223> El 'Xaa1 en el lugar 200 se representan por Tir, Cis, Ser, o Phe <220> <221> modalidad <222> (599) .. (599) <223> n = nucleótido desconocido <220> <221> modalidad <222> (1239) .. (1239) <223> n = nucleótido desconocido. <400> 4 Thr Val Gln Gln Ser Asn Ala Leu Pro Thr Trp Trp Lis Gln Ala Val 1 5 10 15 Phe Tir Gln Val Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Thr Asn Gli Asp Gli 20 25 30 lie Gli Asp Leu Asn Gli lie lie Glu Asn Leu Asp Tir Leu Lis Lis 35 40 45 Leu Gli lie Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir Asp Ser Pro Asn 50 55 60 Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Arg Asp Tir Arg Lis lie Met Lis Glu 65 70 75 80 Tir Gli Thr Met Glu Asp Phe Asp Arg Leu lie Ser Glu Met Lis Lis 85 90 95 Arg Asn Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn His Thr Ser Asp 100 105 110 Gln His Ala Trp Phe Val Gln Ser Lis Ser Gli Lis Asn Asn Pro Tir 115 120 125 Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Asp Gli His Ala Pro Asn 130 135 140 Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Glu Lis Asp Asp Lis 145 150 155 160 Ser Gli Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Lis Gln Gln Pro Asp Leu 165 170 175 Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Gln Asp Leu Tir Asp Met Leu Arg 180 185 190 Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Xaa Gli Leu Arg Phe Asp Thr Val Ala 195 200 205 Thr Tir Ser Lis lie Pro Asn Phe Pro Asp Leu Ser Gln Gln Gln Leu 210 215 220 Lis Asn Phe Ala Glu Glu Tir Thr Lis Gli Pro Lis lie His Asp Tir 225 230 235 240 Val Asn Glu Met Asn Arg Glu Val Leu Ser His Tir Asp lie Ala Thr 245 250 255 Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Leu Asp Lis Ser lie Lis Phe Phe 260 265 270 Asp Arg Arg Arg Asn Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe Asp Leu lie 275 280 285 Arg Leu Asp Arg Asp Ala Asp Glu Arg Trp Arg Arg Lis Asp Trp Thr 290 295 300 Leu Ser Gln Phe Arg Lis lie Val Asp Lis Val Asp Gln Thr Ala Gli 305 310 315 320 Glu Tir Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn Pro Arg 325 330 335 Ala Val Ser His Phe Gli Asp Asp Arg Pro Gln Trp Arg Glu His Ala 340 345 350 Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Thr Leu Thr Gln Arg Ala Thr Pro Phe 355 360 365 lie Tir Gln Gli Ser Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro Phe Lis Lis 370 375 380 lie Asp Asp Phe Asp Asp Val Glu Val Lis Gli Phe Trp Gln Asp Tir 385 390 395 400 Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu Thr Asn Val Arg 405 410 415 Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Ala Ser 420 425 430 Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu Lis lie Asn Pro 435 440 445 Asn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn Asn Pro Asn Ser 450 455 460 Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg His Asp lie Pro 465 470 475 480 Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro Asp Asn Asn Ser 485 490 495 Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis Tir Leu Val Val 500 505 510 lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu Pro Gli Asp Leu 515 520 525 Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His Thr lie Val Asn 530 535 540 Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gli Ala Thr Ser Val Cis Ser Pro 545 550 555 560 Phe Gln Ala Gln Arg Pro Gli Asp Pro Gli Tir Ser Ala Ala His 570 575 Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir Arg Gli Asp lie 580 585 590 His Ala Phe Lis 595 <210> 5 <211> 108 <212> ADN <213> Er inia rhapontici <220> <221> CDS <222> (1) ..(108) <223> <220> <221> sig_peptido <222> (1) .. (108) <223> <400> 5 atg tcc tct caá gaa ttg aaa gcg gct gtc gct att ttt ctt gca acc 48 Met Ser Ser Gln Glu Leu Lis Ala Ala Val Ala lie Phe Leu Ala Thr 1 5 10 15 act ttt tct gcc acá tcc tat cag gcc tgc agt gcc ggg cea gat acc 96 Thr Phe Ser Ala Thr Ser Tir Gln Ala Cis Ser Ala Gli Pro Asp Thr 20 25 30 gcc ccc tea ctc 108 Ala Pro Ser Leu 35 <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Erwinia rhapontici <400> 6 Met Ser Ser Gln Glu Leu Lis Ala Ala Val Ala lie Phe Leu Ala Thr 1 5 10 15 Thr Phe Ser Ala Thr Ser Tir Gln Ala Cis Ser Ala Gli Pro Asp Thr 20 25 30 Pro Ser Leu 35 <210> 7 <211> 1797 <212> ADN <213> Aislado Bacterial 68J <220> <221> CDS <222> (1) ..(1794) <223> <220> <221> sigjpeptido <222> (1) .. (99) <223> <220> <221> mat_peptido <222> (100) .. (1797) <223> <220> <221> modalidad <222> (1478) .. (1478) <223> n = nucleótido desconocido n <400> 7 atg ttt ctt aat gga ttt aag aca gtt att gct ctg act atg gca agc 48 Met Phe Leu Asn Gli Phe Lis Thr Val He Ala Leu Thr Met Ala Ser -30 -25 -20 tcg ttt tat ctt gcc gcc age ceg tta act aag cea teg acc ect att 96 Ser Phe Tir Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lis Pro Ser Thr Pro lie -15 -10 -5 gcc gca acg aat ata caá aag tec gct gat ttt ecc att tgg tgg aaa 144 Ala Ala Thr Asn He Gln Lis Ser Ala Asp Phe Pro He Trp Trp Lis -1 1 5 10 15 cag gca gta ttt tac cag att tat ecc cgc tea ttt aaa gat age aat 192 Gln Ala Val Phe Tir Gln He Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Ser Asn 20 25 30 ggt gat ggt ate ggc gat att ecc ggt ate att gag aaa ctg gac tat 240 Gli Asp Gli He Gli Asp He Pro Gli He He Glu Lis Leu Asp Tir 35 40 45 tta aaa atg ctg gga gtt gat gct ate tgg ata aac ceg cae tat gag 288 Leu Lis Met Leu Gli Val Asp Ala He Trp He Asn Pro His Tir Glu 50 55 60 tet ect aac acc gac aat ggt tac gat att agt gat tat cgt aaa ate 336 Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp He Ser Asp Tir Arg Lis He 65 70 75 atg aag gag tac ggc age atg gct gac ttt gac cgt ctg gtt gcc gaa 384 Met Lis Glu Tir Gli Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu 80 85 90 95 atg aat aaa cgt ggt atg cgc ctg atg att gat att gtt ate aat cat 432 Met Asn Lis Arg Gli Met Arg Leu Met He Asp He Val He Asn His 100 105 110 acc age gat cgt cae cgc tgg ttt gtg cag age cgt tea ggt aaa gat 480 Thr Ser Asp Arg His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gli Lis Asp 115 120 125 aat ect tac cgc gac tat tat ttc tgg cgt gat ggt aaa cag gga cag 528 Asn Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Gln Gli Gln 130 135 140 gct ccc aat aac tat ccc tct ttc ttt ggc ggt tca gcc tgg caa ctg 576 Ala Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Gln Leu 145 150 155 gat aaa cag act gac cag tat tat ctg cae tat ttt gca cea cag cag 624 Asp Lis Gln Thr Asp Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Pro Gln Gln 160 165 170 175 ceg gat ctg aac tgg gat aac cea aaa gtt cgg gct gaa etc tac gat 672 Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Ala Glu Leu Tir Asp 180 185 190 att ctg cgt ttc tgg ctg gat aaa ggc gta tec gga cta cgt ttt gat 720 lie Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Ser Gli Leu Arg Phe Asp 195 200 205 acc gtg gct act ttc tec aaa att ect ggc ttc ceg gac ctg tca aaa 768 Thr Val Ala Thr Phe Ser Lis lie Pro Gli Phe Pro Asp Leu Ser Lis 210 215 220 gcg cag ctg aag aat ttt gcc gaa gct tat act gag ggg ceg aat att 816 Ala Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Ala Tir Thr Glu Gli Pro Asn lie 225 230 - 235 cat aaa tat ate cat gaa atg aac cgc cag gta ctg tct aaa tat aat 864 His Lis Tir lie His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lis Tir Asn 240 245 250 255 gtt gcc acc gct ggt gaa ate ttc ggt gtg cea gtg agt gct atg ceg 912 Val Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Val Ser Ala Met Pro 260 265 270 gat tat ttt gac cgg cgg cgt gaa gaa etc aat att gct ttc acc ttt 960 Asp Tir Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe 275 280 285 gat ttg ate agg etc gat cgt tat ccc gat cag cgc tgg cgt cgt aaa 1008 Asp Leu lie Arg Leu Asp Arg Tir Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lis 290 295 300 cea tgg acá tta age cag ttt cgt caa gtt ate tct cag act gac cgt 1056 Pro Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val lie Ser Gln Thr Asp Arg 305 310 315 gcc gcc ggt gaa ttt ggc tgg aac gcc ttt ttc ctt gat aac cat gat 1104 Ala Ala Gli Glu Phe Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp 320 325 330 335 aac ceg cgc cag gtc tca cae ttt ggt gac gac age cea caa tgg cgc 1152 Asn Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gli Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg 340 345 350 gaa cgc tcg gca aaa gca ctg gca acg ctg ctg ctg acg cag cgt gcc 1200 Glu Arg Ser Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala 355 360 365 acg ccg ttt ate ttt cag ggg gcg gag ttg gga atg act aat tac ecc 1248 Thr Pro Phe lie Phe Gln Gli Ala Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro 370 375 380 ttt aaa aat ata gag gaa ttt gat gat att gag gtt aaa ggc ttc tgg 1296 Phe Lis Asn lie Glu Glu Phe Asp Asp lie Glu Val Lis Gli Phe Trp 385 390 395 aac gac tat gta gcc age gga aaa gta aac gct gct gaa ttt tt3 cag 1344 Asn Asp Tir Val Ala Ser Gli Lis Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln 400 405 410 415 gag gtt cgc atg acc age cgc gat aac age cga acá cea atg cag tgg 1392 Glu Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp 420 425 430 aac gac tet gtt aat gcc gga ttc acc cag ggc aaa ecc tgg ttt cae 1440 Asn Asp Ser Val Asn Ala Gli Phe Thr Gln Gli Lis Pro Trp Phe His 435. 440 445 etc aat ecc aac tat aag caá ate aat gcc gcc agg gng gtg aat aaa 1488 Leu Asn Pro Asn Tir Lis Gln lie Asn Ala Ala Arg Xaa Val Asn Lis 450 455 460 ecc gac tcg gta ttc agt tac tac cgt caá ctg ate aac ctg cgt cae 1536 Pró Asp Ser Val Phe Ser Tir Tir Arg Gln Leu lie Asn Leu Arg His 465 470 475 cag ate ccg gca ctg acc agt ggt gaa tac cgt gat etc gat ccg cag 1584 Gln lie Pro Ala Leu Thr Ser Gli Glu Tir Arg Asp Leu Asp Pro Gln 480 485 490 495 aat aac cag gtc tat gcc tat acc cgt ata ctg gat aat gaa aaa tat 1632 Asn Asn Gln Val Tir Ala Tir Thr Arg lie Leu Asp Asn Glu Lis Tir 500 505 510 ctg gtg gta gtt aat ttt aaa ect gag cag ctg cat tac gct ctg cea 1680 Leu Val Val Val Asn Phe Lis Pro Glu Gln Leu His Tir Ala Leu Pro 515 520 525 gat aat ctg act att gcc age agt ctg ctg gaa aat gtc cae caá cea 1728 sp Asn Leu Thr lie Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro 530 535 540 tea ctg caá gaa aat gcc tec acg ctg act ctt gct ccg tgg caá gcc 1776 Ser Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala 545 550 555 ggg ate tat aag ctg aac tga Gli lie Tir Lis Leu Asn 560 565 <210> 8 <211> 598 <212> PRT <213> Aislado Bacterial 68J <220> <221> modalidad <222> (460).. (460) <223> El 'Xaa' en el lugar 460 se representan por Glu, Gli, Ala o Val <220> <221> modalidad <222> (1478).. (1478) <223> n= nucleótido desconocido <400> 8 Met Phe Leu Asn Gli Phe Lis Thr Val lie Ala Leu Thr Met Ala Ser -30 -25 -20 Ser Phe Tir Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lis Pro Ser Thr Pro lie -15 -10 -5 Ala Ala Thr Asn lie Gln Lis Ser Ala Asp Phe Pro lie Trp Trp Lis -1 1 5 10 15 Gln Ala Val Phe Tir Gln lie Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Ser Asn 20 25 30 Gli Asp Gli lie Gli Asp lie Pro Gli lie lie Glu Lis Leu Asp Tir 35 40 45 Leu Lis Met Leu Gli Val Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir Glu 50 55 60 Ser Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Ser Asp Tir Arg Lis lie 65 70 75 Met Lis Glu Tir Gli Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu 80 85 90 95 Met Asn Lis Arg Gli Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn His 100 105 110 Thr Ser Asp Arg His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gli Lis Asp 115 120 125 Asn Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Gln Gli Gln 130 135 140 Ala Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Gln Leu 145 150 155 Asp Lis Gln Thr Asp Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Pro Gln Gln 160 165 170 175 Pro Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Ala Glu Leu Tir Asp 180 - 185 190 lie Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Ser Gli Leu Arg Phe Asp 195 200 205 Thr Val Ala Thr Phe Ser Lis lie Pro Gli Phe Pro Asp Leu Ser Lis 210 215 220 Ala Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Ala Tir Thr Glu Gli Pro Asn lie 225 230 235 His Lis Tir lie His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lis Tir Asn 240 245 250 255 Val Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Val Ser Ala Met Pro 260 265 270 Asp Tir Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe 275 280 285 Asp Leu lie Arg Leu Asp Arg Tir Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lis 290 295 300 Pro Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val lie Ser Gln Thr Asp Arg 305 310 315 Ala Ala Gli Glu Phe Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp 320 325 330 335 Asn Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gli Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg 340 345 350 Glu Arg Ser Ala Lis Ala" Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala 355 360 365 Thr Pro Phe He Phe Gln Gli Ala Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro 370 375 380 Phe Lis Asn He Glu Glu Phe Asp Asp He Glu Val Lis Gli Phe Trp 385 390 395 Asn Asp Tir Val Ala Ser Gli Lis Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln 400 405 410 415 Glu Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Ser Val Asn Ala Gli Phe Thr Gln Gli Lis Pro Trp Phe His 435 440 445 Leu Asn Pro Asn Tir Lis Gln He Asn Ala Ala Arg Xaa Val Asn Lis 450 455 460 Pro Asp Ser Val Phe Ser Tir Tir Arg Gln Leu He Asn Leu Arg His 465 470 475 Gln He Pro Ala Leu Thr Ser Gli Glu Tir Arg Asp Leu Asp Pro Gln 480 485 490 495 Asn Asn Gln Val Tir Ala Tir Thr Arg He Leu Asp Asn Glu Lis Tyi 500 505 510 Leu Val Val Val Asn Phe Lis Pro Glu Gln Leu His Tir Ala Leu Pro 515 520 525 Asp Asn Leu Thr lie Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro 530 535 540 Ser Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala 545 550 555 Gli He Tir Lis Leu Asn 560 565 <210> 9 <211> 1698 <212> ADN <213> Aislado Bacterial 68J <221> CDS <222> (1).. . (1695) <223> <220> <221> modalidad <222> (1379) .. (1379) <223> n= nucleótido desconocido <220> <221> mat_peptido <222> (1).. (1698) <223> <400> 9 gca acg aat ata caa aag tcc gct gat ttt ccc att tgg tgg aaa cag 48 Ala Thr Asn lie Gln Lis Ser Ala Asp Phe Pro lie Trp Trp Lis Gln 1 5 10 15 gca gta ttt tac cag att tat ccc cgc tea ttt aaa gat ge aat ggt 96 Ala Val Phe Tir Gln lie Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Ser Asn Gli 20 25 30 gat ggt ate ggc gat att ccc ggt ate att gag aaa ctg gac tat tta 144 Asp Gli lie Gli Asp lie Pro Gli lie lie Glu Lis Leu Asp Tir Leu 35 40 45 aaa atg ctg gga gtt gat gct ate tgg ata aac ceg cae tat gag tet 192 Lis Met Leu Gli Val Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir Glu Ser 50 55 60 ect aac acc gac aat ggt tac gat att agt gat tat cgt aaa ate atg 240 Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Ser Asp Tir Arg Lis lie Met 65 70 75 80 aag gag tac ggc age atg gct gac ttt gac cgt ctg gtt gee gaa atg 288 Lis Glu Tir Gli Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met 85 90 95 aat aaa cgt ggt atg cgc ctg atg att gat att gtt ate aat cat acc 336 Asn Lis Arg Gli Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn His Thr 100 105 110 age gat cgt cae cgc tgg ttt gtg cag age cgt tea ggt aaa gat aat 384 Ser Asp Arg His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gli Lis Asp Asn 115 120 125 cct tac cgc gac tat tat ttc tgg cgt gat ggt aaa cag gga cag gct 432 Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Gln Gli Gln Ala 130 135 140 ccc aat aac tat ccc tct ttc ttt ggc ggt tca gcc tgg caa ctg gat 480 Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Gln Leu Asp 145 150 155 160 aaa cag act gac cag tat tat ctg cae tat ttt gca cea cag cag ceg 528 Lis Gln Thr Asp Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Pro Gln Gln Pro 165 170 175 gat ctg aac tgg gat aac cea aaa gtt cgg gct gaa etc tac gat att 576 Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Ala Glu Leu Tir Asp lie 180 185 190 ctg cgt ttc tgg ctg gat aaa ggc gta tec gga cta cgt ttt gat acc 624 Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Ser Gli Leu Arg Phe Asp Thr 195 200 205 gtg gct act ttc tec aaa att cct ggc ttc ceg gac ctg tca aaa gcg 672 Val Ala Thr Phe Ser Lis lie Pro Gli Phe Pro Asp Leu Ser Lis Ala 210 215 220 cag ctg aag aat ttt gcc gaa gct tat act gag ggg ceg aat att cat 720 Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Ala Tir Thr Glu Gli Pro Asn lie His 225 230 235 240 aaa tat ate cat gaa atg aac cgc cag gta ctg tct aaa tat aat gtt 768 Lis Tir lie His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lis Tir Asn Val 245 250 255 gcc acc gct ggt gaa ate ttc ggt gtg cea gtg agi gct atg ceg gat 816 Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp 260 265 270 tat ttt gac cgg cgg cgt gaa gaa etc aat att gct ttc acc ttt gat 864 Tir Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe Asp 275 280 285 ttg ate agg etc gat cgt tat ccc gat cag cgc tgg cgt cgt aaa cea 912 Leu lie Arg Leu Asp Arg Tir Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lis Pro 290 295 300 tgg acá tta age cag ttt cgt caa gtt ate tct cag act gac cgt gcc 960 Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val lie Ser Gln Thr Asp Arg Ala 305 - 310 315 320 gcc ggt gaa ttt ggc tgg aac gcc ttt ttc ctt gat aac cat gat aac 1008 Ala Gli Glu Phe Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn 325 330 335 ccg cgc cag gtc tea cae ttt ggt gac gac age cea caá tgg cgc gaa 1056 Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gli Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu 340 345 350 cgc teg gca aaa gca ctg gca acg ctg ctg ctg acg cag cgt gcc acg 1104 Arg Ser Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr 355 360 365 ccg ttt ate ttt cag ggg gcg gag ttg gga atg act aat tac ecc ttt 1152 Pro Phe lie Phe Gln Gli Ala Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro Phe 370 375 380 aaa aat ata gag gaa ttt gat gat att gag gtt aaa ggc ttc tgg aac 1200 Lis Asn lie Glu Glu Phe Asp Asp lie Glu Val Lis Gli Phe Trp Asn 385 390 395 400 gac tat gta gcc age gga aaa gta aac gct gct gaa ttt tta cag gag _ 1248 Asp Tir Val Ala Ser Gli Lis Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu 405 410 415 gtt cgc atg acc age cgc gat aac age cga acá cea atg cag tgg aac. 1296 Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn 420 425 430 gac tet gtt aat gcc gga ttc acc cag ggc aaa ecc tgg ttt cae etc 1344 Asp Ser Val Asn Ala Gli Phe Thr Gln Gli Lis Pro Trp Phe His Leu 435 440 445 aat ecc aac tat aag caá ate aat gcc gcc agg gng gtg aat aaa ecc 1392 Asn Pro Asn Tir Lis Gln lie Asn Ala Ala Arg Xaa Val Asn Lis Pro 450 455 460 gac teg gta ttc agt tac tac cgt caá ctg ate aac ctg cgt cae cag 1440 Asp Ser Val Phe Ser Tir Tir Arg Gln Leu lie Asn Leu Arg His Gln 465 470 475 480 ate ccg gca ctg acc agt ggt gaa tac cgt gat etc gat ccg cag aat 1488 lie Pro Ala Leu Thr Ser Gli Glu Tir Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn 485 490 495 aac cag gtc tat gcc tat acc cgt ata ctg gat aat gaa aaa tat ctg 1536 Asn Gln Val Tir Ala Tir Thr Arg lie Leu Asp Asn Glu Lis Tir Leu 500 505 510 gtg gta gtt aat ttt aaa ect gag cag ctg cat tac gct ctg cea gat 1584 Val Val Val Asn Phe Lis Pro Glu Gln Leu His Tir Ala Leu Pro Asp 515 520 525 aat ctg act att gcc agc agt ctg ctg gaa aat gtc cae caá cea tea 1632 Asn Leu Thr lie Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser 530 535 540 ctg caá gaa aat gcc tcc acg ctg act ctt gct ceg tgg caá gcc ggg 1680 Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gli 545 550 555 560 ate tat aag ctg aac tga 1698 lie Tir Lis Leu Asn 565 <210> 10 <211> 565 <212> PRT <213> Aislado Bacterial 68J <220> <221> modalidad <222> (460) .. (460) <223> El 'Xaa' en el lugar 460 se representan por Glu, Gli, Ala o Val <220> <221> modalidad <222> (1379) .. (1379) <223> n= nucleótido desconocido <400> 10 Ala Thr Asn lie Gln Lis Ser Ala Asp Phe Pro lie Trp Trp Lis Gln 1 5 10 15 Ala Val Phe Tir Gln lie Tir Pro Arg Ser Phe Lis Asp Ser Asn Gli 20 25 30 Asp Gli lie Gli Asp lie Pro Gli lie lie Glu Lis Leu Asp Tir Leu 35 40 45 Lis Met Leu Gli Val Asp Ala lie Trp lie Asn Pro His Tir Glu Ser 50 55 60 Pro Asn Thr Asp Asn Gli Tir Asp lie Ser Asp Tir Arg Lis lie Met 65 70 75 80 Lis Glu Tir Gli Ser Met Ala Asp Phe Asp Arg Leu Val Ala Glu Met 85 90 95 Asn Lis Arg Gli Met Arg Leu Met lie Asp lie Val lie Asn His Thr 100 105 110 Ser Asp Arg His Arg Trp Phe Val Gln Ser Arg Ser Gli Lis Asp Asn 115 120 125 Pro Tir Arg Asp Tir Tir Phe Trp Arg Asp Gli Lis Gln Gli Gln Ala 130 135 140 Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp Gln Leu Asp 145 150 155 160 Lis Gln Thr Asp Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Ala Pro Gln Gln Pro 165 170 175 Asp Leu Asn Trp Asp Asn Pro Lis Val Arg Ala Glu Leu Tir Asp lie 180 185 190 Leu Arg Phe Trp Leu Asp Lis Gli Val Ser Gli Leu Arg Phe Asp Thr 195 200 205 Val Ala Thr Phe Ser Lis lie Pro Gli Phe Pro Asp Leu Ser Lis Ala 210 215 220 Gln Leu Lis Asn Phe Ala Glu Ala Tir Thr Glu Gli Pro Asn lie His 225 230 235 240 Lis Tir lie His Glu Met Asn Arg Gln Val Leu Ser Lis Tir Asn Val 245 250 255 Ala Thr Ala Gli Glu lie Phe Gli Val Pro Val Ser Ala Met Pro Asp 260 265 270 Tir Phe Asp Arg Arg Arg Glu Glu Leu Asn lie Ala Phe Thr Phe Asp 275 280 285 Leu lie Arg Leu Asp Arg Tir Pro Asp Gln Arg Trp Arg Arg Lis Pro 290 295 300 Trp Thr Leu Ser Gln Phe Arg Gln Val lie Ser Gln Thr Asp Arg Ala 305 310 315 320 Ala Gli Glu Phe Gli Trp Asn Ala Phe Phe Leu Asp Asn His Asp Asn 325 330 335 Pro Arg Gln Val Ser His Phe Gli Asp Asp Ser Pro Gln Trp Arg Glu 340 345 350 Arg Ser Ala Lis Ala Leu Ala Thr Leu Leu Leu Thr Gln Arg Ala Thr 355 360 365 Pro Phe lie Phe Gln Gli Ala Glu Leu Gli Met Thr Asn Tir Pro Phe 370 375 380 Lis Asn lie Glu Glu Phe Asp Asp lie Glu Val Lis Gli Phe Trp Asn 385 390 395 400 Asp Tir Val Ala Ser Gli Lis Val Asn Ala Ala Glu Phe Leu Gln Glu 405 410 415 Val Arg Met Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Met Gln Trp Asn 420 425 430 Asp Ser Val Asn Ala Gli Phe Thr Gln Gli Lis Pro Trp Phe His Leu 435 440 445 Asn Pro Asn Tir Lis Gln lie Asn Ala Ala Arg Xaa Val Asn Lis Pro 450 455 460 Asp Ser Val Phe Ser Tir Tir Arg Gln Leu lie Asn Leu Arg His Gln 65 470 475 480 lie Pro Ala Leu Thr Ser Gli Glu Tir Arg Asp Leu Asp Pro Gln Asn 485 490 495 Asn Gln Val Tir Ala Tir Thr Arg lie Leu Asp Asn Glu Lis Tir Leu 500 505 510 Val Val Val Asn Phe Lis Pro Glu Gln Leu His Tir Ala Leu Pro Asp 515 520 525 Asn Leu Thr lie Ala Ser Ser Leu Leu Glu Asn Val His Gln Pro Ser 530 535 540 Leu Gln Glu Asn Ala Ser Thr Leu Thr Leu Ala Pro Trp Gln Ala Gli 545 550 555 560 lie Tir Lis Leu Asn 565 <210> 11 <211> 99 <212> ADN <213> Aislado Bacterial 68J <220> <221> CDS <222> (1) .. (99) <223> <220> <221> sigjpeptido <222> (1) .. (99) <223> <400> 11 atg ttt ctt aat gga ttt aag acá gtt att gct ctg act atg gca agc 48 Met Phe Leu Asn Gli Phe Lis Thr Val lie Ala Leu Thr Met Ala Ser 1 5 10 15 tcg ttt tat ctt gcc gcc age ccg tta act aag cea tcg acc ect att Ser Phe Tir Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lis Pro Ser Thr Pro lie 20 25 30 gcc Ala <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Aislado Bacterial 68J <400> 12 Met Phe Leu Asn Gli Phe Lis Thr Val lie Ala Leu Thr Met Ala Ser 1 5 10 15 Ser Phe Tir Leu Ala Ala Ser Pro Leu Thr Lis Pro Ser Thr Pro lie 20 25 30 Ala <210> 13 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 5' oligonucleotido para la amplificación del aislado 68J. <400> 13 ggatccaaca atggcaacga atatacaaaa gtcc <210> 14 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 3' oligonucleotido para la amplificación del aislado 14S. <400> 14 ataggtacct cagttcagct tatagatccc <210> 15 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 5' oligonucleotido para la amplificación de Erwinia rhapontici (Acceso No WAC2928) <400> 15 ggatccaaca atggcaaccg ttcagcaatc aaatg <210> 16 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 3' oligonucleotido para la amplificación de Erwinia rhapontici (Acceso No WAC2928) <400> 16 ataggtacct tacttaaacg cgtggatg <210> 17 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 5' oligonucleótido para la amplificación del aislado 14S. <400> 17 ggatccaaca atggcaaccg ttcacaagga aagtg <210> 18 <211> 30<212> ADN <213> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: iniciador de 3' oligonucleótido para la amplificación del aislado 14?. <400> 18 ataggtacct taccgcagct tatacacacc <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa <400> 19 Asp Leu lie Arg Leu Asp Arg 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa <220> <221> MODALIDAD <222> (7) .. (7) <223> X= cualquier aminoácido <40O> 20 Glu Val Lis Gli Phe Trp Xaa Asp Tir Val 1 5 10 <210>. 21 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa <400> 21 Arg Pro Gln Trp Arg Glu <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa <400> 22 Ser Pro Gln Trp Arg Glu 1 5 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa 400> 23 Pro Asn Asn Tir Pro Ser Phe Phe Gli Gli Ser Ala Trp 1 5 10 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso de isomerasa sacarosa <220> <221> MODALIDAD <222> (8) .. (8) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (9).. (9) <223> X = cualquier aminoácido <400> 24 Gln Tir Tir Leu His Tir Phe Xaa Xaa Gln Gln Pro Asp Leu Asn Trp 1 5 10 15 <210> 25 <211> 594 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <220> <221> CDS <222> (1) .. (594) <223> <220> <221> modalidad <222> (42) (42) <223> n = nucleótido desconocido <400> 25 tac gtt gaa acá ggc aaa gtg aaa gct gag gaa ttc ctt can aac gta Tir Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu Thr Asn Val 1 " 5 10 15 cgc caá acc age cgt gat aac age aga acc ccc ttc cag tgg gat gca Arg Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Ala 20 25 30 age aaa aat gcg ggc ttt acc age gga acc ect tgg tta aaa ate aat Ser Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu Lis lie Asn 35 40 45 ccc aat tat aaa gaa ate aac age gca gat cag att aac aat cea aat Pro Asn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn Asn Pro Asn 50 55 60 tcc gta ttt aac tat tat aga aag etc att aac att cgc cae gac ate Ser Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg His Asp lie 65 70 75 80 ect gee tta acc tac ggc agt tat att gat tta gct ect gac aac aat Pro Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro Asp Asn Asn 85 90 95D tea gtc tat gct tac act cga acg ttt ggc gct gaa aaa tat ctt gtg Ser Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis Tir Leu Val 100 105 110 gtc att aat ttt aaa gaa gaa gtg atg cae tac acc ctg ect ggg gat Val lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu Pro Gli Asp 115 120 125 tta tcc ate aat aag gtg att act gaa aac aac agt cae act att gtg Leu Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His Thr lie Val 130 135 140 aat aaa aat gac gta gaa gat ect cgt ggg gct acá age gtt tgt age Asn Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gli Ala Thr Ser Val Cis Ser 145 150 155 160 ecc ttc cag gct caá aaa agg ect ggc gac ceg ggt tac tel gct gee Pro Phe Gln Ala Gln Lis Arg Pro Gli Asp Pro Gli Tir Ser Ala Ala 165 170 175 cat teg att cgg ttc ttg ecc cgg ttt ttc gct tea tac agg ggc gac His Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir Arg Gli Asp 180 185 190 ate cae gcg ttt aag taa 594 lie His Ala Phe Lis 195 <210> 26 <211> 197 <212> PRT <213> Erwinia rhapontici <220> <221> modalidad <222> (42) .. (42) <223> n = nucleótido desconocido <400> 26 Tir Val Glu Thr Gli Lis Val Lis Ala Glu Glu Phe Leu Thr Asn Val 1 5 10 15 Arg Gln Thr Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Pro Phe Gln Trp Asp Ala 20 25 30 Ser Lis Asn Ala Gli Phe Thr Ser Gli Thr Pro Trp Leu Lis lie Asn 35 40 45 Pro ¾sn Tir Lis Glu lie Asn Ser Ala Asp Gln lie Asn Asn Pro Asn 50 55 60 Ser Val Phe Asn Tir Tir Arg Lis Leu lie Asn lie Arg His Asp lie 65 70 75 80 Pro Ala Leu Thr Tir Gli Ser Tir lie Asp Leu Ala Pro Asp Asn Asn 85 90 95 Ser Val Tir Ala Tir Thr Arg Thr Phe Gli Ala Glu Lis Tir Leu Val 100 105 110 Val lie Asn Phe Lis Glu Glu Val Met His Tir Thr Leu Pro Gli Asp 115 120 125 Leu Ser lie Asn Lis Val lie Thr Glu Asn Asn Ser His Thr lie Val 130 135 140 Asn Lis Asn Asp Val Glu Asp Pro Arg Gln Ala Thr Ser Val Cis Ser 145 150 - 155 160 Pro Phe Gln Ala Gln Lis Arg Pro Gln Asp Pro Gln Tir Ser Ala Ala 165 170 175 His Ser lie Arg Phe Leu Pro Arg Phe Phe Ala Ser Tir Arg Gln Asp 180 185 190 lie His Ala Phe Lis 195 <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <400> 27 gatctgatca gactcgatcg t <210> 28 <211> 30 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <400> 28 gaggtgaaag gtttttggca agactacgtt <210> 29 <211> 18 <212> ADN <213> Er inia rhapontici <400> 29 cgaccacaat ggcgcgag 18 <210> 30 <211> 39 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <400> 30 cccaataact atccctcctt cttcggtggc tcagcctgg 39 <210> 31 <211> 48 <212> ADN <213> Erwinia rhapontici <400> 31 cagtattacc tccattactt tgccaaacag caacccgacc tcaactgg 48 <210>..32 <211>..21 <212>..ADN <213>..Aislado bacterial 68J <400> 32 gatttgatca ggctcgatcg t 21 <210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Aislado bacterial 68J <400> 33 gaggttaaag gcttctggaa cgactatgta 30 <210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Aislado bacterial 68J <400> 34 agcccacaat ggcgcgaa 18 <210> 35 <211> 3S <212> ADN <213> Aislado bacterial 68J <400> 35 cccaataact atccctcttt ctttggcggt tcagcctgg 39 <210> 36 <211> 48 <212>..ADN <213> Aislado bacterial 68J <400> 36 cagtattatc tgcactattt tgcaccacag cagccggatc tgaactgg 48 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213>.. Sintético <220> <221> MOD_RES <222> (1) .. (1) <223> ACETILACIÓN <220> <221> MODALIDAD <222> (1)..(1) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (2) .. (2) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (3) .. (3) <223> X = aminoácido definido <220> <221> MODALIDAD <222> (4) .. (4) <223> X = aminoácido definido <220> <221> MODALIDAD . <222> (5).. (5) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (6).. (6) <223> X == cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (7) .. (7) <223> X = cualquier aminoácido <220> <221> MODALIDAD <222> (8) .. (8) <223> X = cualquier aminoácido <400> 37 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa <210> 38 <211> 17 <212> ADN <213> Sintético <400> 38 tggtggaarg argctgt 17 <210> 39 <211> 19 <212> ADN <213> Sintético <400> 39 tcccagttag rtccggctg

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un método para el aislamiento de polinucleotidos novedosos que codifican las enzimas de la isomerasa de sacarosa que produce la isomaltulosa, método que comprende: (a) La obtención de una muestra ambiental de un lugar en el cual los organismos, capaces de convertir la sacarosa isomaltulosa, tiene una ventaja selectiva; (b) La selección de los organismos que produce -isomaltulosa a partir de sacarosa; y (c) El aislamiento de los polinucleotidos que codifican las enzimas de isomerasa de sacarosa para la producción de isomaltulosa a partir de organismos que producen isomaltulosa, usando una prueba especifica para los polinucleotidos que codifica la isomerasa de sacarosa o una molécula de enla zamiento de antigeno especifico para las enzimas de isomerasa de sacarosa, en donde la prueba se hibridiza bajo al menos condiciones severas bajas a los polinucleotidos que codifica la isomerasa de sacarosa pero que no hibridizan bajo las mismas condiciones a los polinucleotidos que codifican glucosidasa, y en donde la molécula de enlazamiento de antigeno es inmuno- int err eactiva con las enzimas de isomerasa de sacarosa pero no inmuno-interreactiva con glucosidasas . 2.- El método de conformidad con la rei indicación 1, en donde los polinucleótidos son aislados usando una prueba que consiste esencialmente de una secuencia de ácido nucleico el cual corresponde o es complementario a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia consenso de isomerasa de sacarosa que pertenece a una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21, 22, 23, 24. 3.- El método .de conformidad con la reivindicación 2 en donde la secuencia del nucleótido comprende la secuencia que pertenece a una de SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32,. 33, 34, 35 y 36 o la variante de la secuencia del nucleótido del mismo. 4. - El método de conformidad a la reivindicación 3, en donde de la variante de la secuencia del nucleótido tiene a 1 menos 70% de la identidad de la secuencia en cualquiera de las secuencia s que pertenecen a SEQ ID NO: 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36. 5.- El método de conformidad a la reivindicación 3, en donde la variante de la secuencia de nucleótido es capaz de ibridizar a cualquiera de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 bajo al menos condiciones severas bajas . 6. - El método de conformidad a la reivindicación 1, en donde los pol inucl eóti do s son aislados usando una molécula de enlazamiento de antigeno que es inmundo-interreactiva específicamente con una secuencia de aminoácido seleccionado de SEC ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 0 24. 7. - El método de conformidad a la reivindicación 1, que comprende además seleccionar o de otra manera enriquecer a los organismos que metabolizan sacarosa-e isomaltulosa-que son capaces de usar tanto la sacarosa como la isomaltulosa como fuentes de carbono para el crecimiento. 8. - El método de conformidad a la eivindicación 7, en donde la selección o el enriquecimiento comprende organismos de crecimiento de la muestra ambiental sobre un medio que contiene isomaltulosa por un tiempo y bajo condiciones suficientes para seleccionar o enriquecer para los organismos que metabolizan isomaltulosa y el crecimiento de los organismos que metabolizan isomaltulosa o un medio que contiene sacarosa por un tiempo y bajo condiciones suficientes para seleccionar o enriquecer para los organismos que metabolizan la isomaltulosa y sacarosa. 9. - El método de conformidad a la reivindicación 7, en donde la selección o enriquecimiento comprende el crecimiento de organismos de la muestra ambiental sobre un medio que contiene sacarosa por un tiempo y 5 bajo condiciones suficientes para seleccionar o enriquecer para los organismos que metabolizan sacarosa y el crecimiento de los organismos que metabolizan sacarosa en un medio que contiene isomaltulosa por un tiempo y bajo condiciones • 10· suficientes para seleccionar o enriquecer para los organismos que metabolizan sacarosa e isomaltulosa. 10. - El método de conformidad a la reivindicación 1, en donde la selección utiliza un ensayo que cuantifica la producción de isomaltulosa por un 15 organismo . 11. - El método de conformidad a la reivindicación 10, en donde el ensayo es un ensayo de anilina/difenilamina . 12. - El método de conformidad a la reivindicación 20 1, en donde la muestra ambiental comprende suelo o material de planta. 13. - El método de conformidad a la rei indicación 1, en donde la muestra ambiental se obtiene de un lugar que se somete a la disponibilidad periódica o 25 constante de concentraciones de sacarosa sustanciales . 14. - El método de conformidad a la rei indicación 13, en donde el lugar se selecciona de un fábrica en donde se desarrolla el proceso o el almacenaje de plantas que contienen azúcar o partes de una planta o un campo que contiene restos de plantas que contienen azúcar de cosecha. 15. - El método de conformidad a la reivindicación 14, en donde la planta que contiene azúcar es - remolacha o caña de azúcar. 16. - El método de conformidad a la reivindicación 14, en donde la planta que contiene azúcar es caña de a zúcar . 17. - Un polipéptido aislado que comprende: (a) La secuencia de aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10; o (b) Un fragmento activo biológicamente de (a) el cual tiene al menos 20 aminoácidos en longitud; o (c) Una variante de (a) que tiene al menos 75% .de la identidad de la secuencia de la misma o (d) Un derivado de cualquiera de (a) a (c) . 18. - El polipéptido de conformidad a la reivindicación 17, en donde el fragmento activo biológicamente comprende al menos una secuencia de consenso seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24. 19. - El polipéptido de conformidad a la reivindicación 17 en donde la variante comprende la secuencia de consenso que pertenece a una o más de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. 20. - El polipéptido a la rei indicación 19, en donde la variante de secuencia de consenso tiene al menos el 80% de la identidad de la secuencia a una de las secuencias que pertenecen a SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. 21. - Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 18. 22. - Un polinucleótido aislado -que comprende: (i) La secuencia del nucleótido que pertenece a SEQ ID NO: 7 y 9 o (ii) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual tiene al menos 24 nucleótidos en longitud; o (iii) una variante de polinucleótido de (a) que tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia del mi smo . 23. - El polinucleótido de conformidad a la reivindicación 22, en donde la variante del polinucleótido es capaz de hibridizar a uno de los pol inucleótido s identificados por SEQ ID NO: 7 y 9 bajo al menos condiciones severas moderadas. 24. - El polinucleótido de conformidad a la reivindicación 22, en donde la variante del polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de consenso que pertenece a uno más de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. 25. - El polinucleótido de conformidad a la reivindicación 24, en donde la secuencia del nucleótido se selecciona de SEQ ID NO: 27 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 o la variante de secuencia del nucleótido del mismo. 26. - El polinucleótido de conformidad a la reivindicación 25, en donde la variante de secuencia del nucleótido tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia a la secuencia del nucleótido seleccionado de SEQ ID NO: 27 , 28 , 29, 30, 31, 32, 33 , 34 , 35 o 36. 27. - El polinucleótido de conformidad a la i reivindicación 25, en donde la variante de secuencia del nucleótido es capaza de hibridizar a la secuencia del nucleótido seleccionado de SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36, bajo al menos condiciones severas mejoradas. 28. - Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de conformidad a la reivindicación 21 que se enlace funci onalment e a un polinucleótido regul ador . 29.- Un vector de expresión que incluye un polinucleótido que comprende: (i) la secuencia del nucleótido que pertenece a SEQ ID NO: 7 y 9; o (ii) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual tiene al menos 24 nucleótidos en longitud; o (iii) una variante del polinucleótido de (a) el cual tiene al menos 24 nucleótidos en longitud. 30.- Una célula clonada que contiene el vector de expresión de conformidad a las reivindicaciones 28 o 29. 31. - La célula clonada de conformidad a la reivindicación 30 la cual es' una bacteria u otra procarióta. 32. - La célula clonada de conformidad a la reivindicación 30 la cual es una célula de planta u otra eucarióta. 33. - Una célula de planta que contiene el vector de expresión de conformidad a la reivindicaciones 28 o 29; en donde la planta es una especie capaz de sintetizar y/o acumular sacarosa. 34. - La célula de la planta de conformidad a la reivindicación 33, en donde la planta se selecciona de caña de azúcar o remolacha. 35. - La célula de la planta de conformidad a la reivindicación 33, en donde la planta es caña de azúcar . 36. - Un método para la producción de un 5 polipéptido recombinante que comprende: (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10; o (b) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual tiene al menos 20 aminoácidos en longitud o ¦10· (c)una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de secuencia del mismos; o (d) un derivado de (a) o (b), método que comprende : cultivar una célula clonada que contiene el 15 vector de expresión de conformidad a la reivindicación 28 tal que el polipéptido recombinante se exprese del polinucl eótido ; y - aislar el polipéptido recombinante. 37. - Un método para la producción de un fragmento 20 activo biológicamente de un polipéptido que comprende : (a) la secuencia del aminoácido que pertenece SEQ ID NO: 8 o 10, o (b) una variante de (a) que tiene al menos 75% de 25 la identidad de la secuencia del mismo; o (c) un derivado de (a) a (b), método que comprende: la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa asociada con un fragmento del polipéptido, el cual indica que el fragmento es un fragmento activo biológicamente. 38.- Un método para la producción de un fragmento activo biológicamente de un polipéptido que comprende : (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10, o (b) una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de la secuencia de la misma; o (c) un derivado de (a) a (b), método que comprende: la introducción en un célula de un polinucleótido del fragmento del polipéptido que es obtenible, y la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa lo cual indica que el fragmento es un fragmento activo biológicamente. 39.- Un método para la producción de una variante de polipéptido de un polipéptido principal que comprende la secuencia que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10, o un fragmento activo biológicamente del mismo el cual tiene al menos 20 aminoácidos en longitud, método que comprende: - la producción de un polipéptido modificado cuya secuencia se distingue del polipéptido principal mediante la sustitución, eliminación o adición de al menos un aminoácido; y - la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa asociada con el polipéptido mejorado lo cual indica que el polipéptido modificado es una variante del polipéptido. 40.- Un método para la. producción de una variante de polipéptido de un polipéptido principal que comprende la secuencia que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10, o un fragmento activo biológicamente del mismo el cual tiene al menos 20 aminoácidos en longitud, método que comprende: la producción de un polinucleótido del cual un polipéptido modificado se puede producir, el polipéptido modificado tiene la secuencia que se distingue del polipéptido principal mediante la sustitución, eliminación o adición de al menos un aminoácido . -la introducción del polinucleótido en una célula y -la detección de la actividad de la isomerasa de sacarosa la cual indica que el polipéptido modificado es una variante del polipéptido. 41.- Un método para la producción de isomaltulosa a partir de sacarosa, método que comprende poner en contacto la sacarosa o un substrato que contiene sacarosa con el polipéptido de la reivindicación 18, o con la célula clonada de la reivindicación 30 por un tiempo y bajo condiciones suficientes para producir isomaltulosa. 42.- Una molécula de enlazamiento de antigeno que es inmuno-reactiva específicamente con un polipéptido que comprende: (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SE Q ID NO: 8 o 10 o (b) una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de la secuencia del mismo; o (c) un derivado de (a) o (b) . 43. - La molécula del enlazamiento del antigeno de conformidad con la reivindicación 42 la cual es inmuno-interreactiva específicamente con una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24. 44. - Una molécula de enlazamiento de antígeno que es inmuno-interreactiva con una glucosidasa. 45. - Una prueba para preguntar al ácido nucleico para la presencia de un polinucleótido que codifica isomerasa de sacarosa, que comprende una secuencia de nucleótido la cual hibridiza bajo al menos condiciones severas bajas a los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa pero que no hibridiza bajo las mismas condiciones a los polinucleótidos que codifican glucosidasa. 46. - La prueba de conformidad a la reivindicación 45, que consiste esencialmente de una secuencia de ácido - nucleico la cual corresponde o es complementaria a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de consenso de isomerasa de sacarosa como pertenece a SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 2 . 47. - La prueba de conformidad a la reivindicación 46, en donde la secuencia del nucleótido comprende la secuencia que se menciona en una de SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 o una variante de la secuencia del nucleótido de la misma. 48. - La prueba de conformidad a la reivindicación 47 en donde la variante de la secuencia del nucleótido tiene al menos 70% de la identidad de secuencia para una de las secuencias que pertenecen a SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35 y 36. 49. - La prueba a la conformidad a la reivindicación 47, en donde la variante de la secuencia del nucleótido es capaz de hibridizar a cualquiera de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35 y 36, bajo al menos condiciones de severidad moderadas. 50. - un método para la detección de un polipéptido 5 o polinucl eótido especifico, que comprende la detección de la secuencia de: (a) la SEQ ID NO: 8 o 10 o un fragmento activo biológicamente del mismo al menos 29 aminoácidos en longitud, o una variante de estos que tienen al menos •10- 75% de la identidad de secuencia del mismo; o (b) un polinucl eótido que codifica (a) . 51. - El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde la secuencia de (b) se selecciona de SEQ ID NO: 7 o 9, o un fragmento activo biológicamente 15 del mismo de al menos 24 nucleótidos de longitud, o una variante del polinucleótido que tiene al menos 70% de la identidad de secuencia del mismo. 52. - El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde el polipéptido especifico se detecta 20 usando una molécula de enlazamiento de antigeno que es específicamente inmuno- interreactiva con un polipéptido que comprende: (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10; o 25 (b) una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de la secuencia de la misma, o (c) un derivado de (a) o (b) . 53. - El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde el polipéptido especifico se detecta usando una molécula de enlazamiento de antigeno que es inmuno-interreactiva con una isomerasa de sacarosa pero que no es inmuno-interreactiva con una glucosidasa . 54. - El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde el polipéptido especifico se detecta usando una molécula de enlazamiento que es específicamente inmuno-interreactiva con una secuencia de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 o 24. 55.- El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde el polinucleótido especifico se detecta usando una prueba que comprende una prueba de nucleótido la cual hibridiza bajo al menos condiciones de severidad bajas a los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa pero que no hibridiza bajo las mismas condiciones a los polinucleótidos que codifican glucosidasa. 56.- El método de conformidad a la reivindicación 50, en donde el polinucleótido especifico se detecta usando una prueba que consiste esencial mente de una secuencia de ácido nucleico la cual corresponde o es complementaria a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de consenso de isomerasa de sacarosa que pertenece a una de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 y 24. 57. - El método de conformidad a la reivindicación 56, en donde la secuencia del nucleótido comprende la secuencia que pertenece a una de SEQ ID NO: 27 , 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, o una variante de la secuencia del nucleótido del mismo. 58. - El método de conformidad a la reivindicación 56, en donde la variante de la secuencia del nucleótido tiene al menos el 70% de la identidad de la secuencia para una de las secuencias que pertenecen a SEQ ID NO: 27 , 28 , 29, 30 , 31 , 32, 33, 34 , 35 y 36. 59. - El método de conformidad a la rei indicación 56, en donde la variante de secuencia del nucleótido es capaz de hibridizar a una de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, bajo al menos condiciones severas moderadas . 60. - Un método para la detección de isomerasa de sacarosa en una muestra que comprende: - poner en contacto la muestra con la molécula de enl a z ami ento de antígeno de conformidad a las reivindicaciones 42 o 44; detectar la presencia de un compleja que comprende la molécula de enlazamiento de antígeno y un polipéptido en la muestra que se ha puesto en contacto, en donde el polipéptido comprende: (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10; o (b) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual es de al menos 20 aminoácidos en longitud, o (c) una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de secuencia del mismo; o (d) un derivado de uno de (a) a (c) 61. - Un método para la detección de una isomerasa de sacarosa en una muestra que comprende: (a) la secuencia del aminoácido que pertenece a SEQ ID NO: 8 o 10; o (b) un fragmento activo biológicamente de (a) el cual es de al menos 20 aminoácidos en longitud; o (c) una variante de (a) que tiene al menos 75% de la identidad de la secuencia del mismo; o (d) un derivado de cualquiera de una de (a) a (c) 62. - El método de conformidad a la reivindicación 61, en donde la expresión se detecta usando una prueba que comprende una secuencia del nucleótido la cual hibridiza bajo al menos condiciones severas bajas a los polinucleótidos que codifican la isomerasa de sacarosa, pero que no hibridizan bajo las mismas condiciones a los polinucleótidos que codifica glucosidasa. 63. - El método de conformidad a la reivindicación 61, en donde la expresión se detecta usando una prueba que consiste esencialmente de una secuencia de ácido nucleico la cual corresponde o es complementaria a una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de consenso de isomerasa de sacarosa la cual pertenece a una SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23 Y 24. 64. - El método de conformidad a la reivindicación 63, en donde la secuencia del nucleótido comprende la secuencia que pertenece a SEQ ID NO: 27 , 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 o la variante de la secuencia del nucleótido del mismo. 65. - El método de conformidad a la reivindicación 64, en donde la variante de secuencia del nucleótido tiene al menos 70% de la identidad de la secuencia de una de las secuencias que pertenecen a SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36. 66. - El método de conformidad a la reivindicación 64, en donde la variante de secuencia del nucleótido es capaz de hibridizar a una de las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36 bajo al menos condiciones severas moderadas . 5 67.- Una prueba que comprende una secuencia de nucleótido la cual es capaz de hibridiza al menos una porción de una secuencia de nucleótido que codifica SEQ ID NO: 8 o 10, La cual tiene al menos 24 nucleótidos en longitud, bajo al menos condiciones '10- severas moderadas. 68. - Una prueba que comprende una secuencia de nucleótido la cual es capaz de hibridizar al menos una porción de SEQ ID NO: 7 o 9, el cual es de al menos 24 nucleótidos en longitud bajo al menos 15 condiciones severas moderadas. 69. - Un método para el aislamiento de isomerasa de sacarosa de una muestra que comprende: - poner en contacto la muestra con la molécula de enlazamiento del antigeno de la reivindicación 42 o 20 44 para formar un complejo que comprende la isomerasa de sacarosa y la molécula de enlazamiento de antigeno; y - la separación de la isomerasa de sacarosa del complej o . 25 70.- Una célula de planta transformada que contiene el vector de expresión de las reivindicaciones 28 o 29. 71. - La célula de la planta de conformidad a la reivindicación 70 en donde la planta es una especie capaz de sintetizar y/o acumular sacarosa. 72. - La célula de la planta de conformidad a la reivindicación 70, en donde la planta se selecciona de caña de azúcar o remolacha. 73. - La célula de la planta de conformidad a la "reivindicación 70, en donde la planta es caña de azúcar. 74. - Una planta diferenciada que comprende células de planta que contienen el vector de expresión según las reivindicaciones 28 o 29. 75.- Un método para la producción de isomaltulosa, que comprende: el cultivo de una planta diferenciada que comprende células de planta que contienen el vector de expresión de conformidad a las reivindicaciones 28 o 29; y la cosecha de isomaltulosa de la planta cultivada . 76.- Isomaltulosa cosechada de una planea diferenciada que comprende células de planta que contienen el vector de expresión de conformidad a las