MXPA03001043A - Deteccion de analitos en ambientes acuosos. - Google Patents

Deteccion de analitos en ambientes acuosos.

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MXPA03001043A
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Abstract

La invencion se refiere a moleculas indicadoras para detectar la presencia o concentracion de un analito en un medio, tal como un liquido, y a metodos para lograr dicha deteccion; muy particularmente, la invencion se refiere a macromoleculas de copolimero que contienen monomeros de componente indicador relativamente hidrofobos, y monomeros hidrofilos, de tal manera que la macromolecula es capaz de usarse en un ambiente acuoso.

Description

DETECCIÓN DE ANALITOS EN AMBIENTES ACUOSOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud con No. de serie 09/632,624, presentada el 4 de agosto de 2000.
DECLARACIÓN RELACIONADA CON INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO AUSPICIADA POR EL GOBIERNO FEDERAL No aplicable ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la invención Esta inv?nción se refiere a moléculas indicadoras para detectar la presencia o concentración de un analito en un medio, tal como un liquido, y a métodos para lograr dicha detección. Muy particularmente, la invención se refiere a macromolóculas de copolímero que contienen monómeros de componente indicador relativamente hidrófobos, y monómeros hidrófilos, de tal manera que la macromolócula es capaz de usarse en un ambiente acuoso. 2. Descripción de la técnica relacionada Se conocen moléculas indicadoras para detectar la presencia o concentración d? un analito en un medio. Infortunadamßnt?, muchos de estos indicadores son insolubles o escasamente solubles en agua. Por ejemplo, la patente de E.U.A. 5,503,770 (James, et al.) describe un compuesto que contiene ácido borónico fluorescente que emite fluorescencia de alta intensidad al unirse a sacáridos, incluyendo glucosa. El compuesto fluorescente tiene una estructura molecular que comprende un fluoróforo, por lo menos una porción de ácido fenilborónico y por lo menos un átomo de carbono que provee amina en donde el átomo de nitrógeno está dispuesto en la vecindad de la porción de ácido fenilborónico para interactuar intramoleculamri?nt? con el ácido borónico. Dicha interacción por lo tanto hace que el compuesto emita fluorescencia al unirse al sacárido. Véase también T. James, et ai, J. Am. Chem. Soc. 1 17 (35) : 8982-87 (1995). Sin embargo, el compuesto descrito en el ejemplo 2 d? la patente de E.U.A. No. 5,503,770 (que tiene la fórmula (6)) es sustancialmente soluble en agua, y como un asunto práctico, requiere la presencia de un solvente orgánico tal como metanol a fin de funcionar en un ambiente líquido. La falta de suficiente solubilidad acuosa es un problema severo cuando se trata con aplicaciones en un ambiente acuoso, por ejemplo, en aplicaciones ín vivo. Por lo tanto, persiste una gran necesidad de adaptar indicadores insolubles o escasamente solubles para usarse en ambientes acuosos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, ia presente invención está dirigida a una macromolócula indicadora para detectar la presencia o concentración de un analito en un ambiente acuoso, dicha macromolócula comprendiendo un copolímero de: a) uno o más monómeros de componente indicador que individualmente no son suficientemente solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho analito; y b) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolócula es capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para la producción de una macromolécula indicadora para detectar la presencia o concentración de un anallto en un ambiente acuoso, dicho método comprendiendo la copolimerización de: a) uno o más monómeros de componente indicador que Individualmente no son solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho analito; y b) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolécula es capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso. En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para detectar la presencia o concentración de un analito en una muestra que tiene un ambiente acuoso, dicho método comprendiendo: a) exponer la muestra a una macromolécula indicadora, dicha macromolócula comprendiendo un copolímero de: i) uno o más monómeros de componente indicador que individualmente no son suficientemente solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho anallto; y Ü) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolécula resultante es capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso, y en donde la macromolécula indicadora tiene una calidad detectable que cambia de una manera dependiente de la concentración cuando dicha macromolécula es expuesta al analito; y b) medir cualquier cambio en la calidad detectable para determinar así la presencia de concentración de dicho analito en la muestra. En otro aspecto, la presente invención provee una macromolécula que es capaz de presentar un efecto de excímero, que comprende un copolímero de: a) uno o más monómeros formadores de excímero, cuyos constituyentes moleculares son capaces de presentar un efecto de excímero cuando se orientan adecuadamente unos con respecto a otros; y b) uno o más monómeros adicionales; de tal manera que la macromolécula resultante presenta dicho efecto de excímero. En otro aspecto más, la presente invención provee un método para producir una macromolócula que es capaz de presentar un efecto de excímero, dicho método comprende la copolimerización de; a) uno o más monómeros formadores de excímero, cuyos constituyentes moleculares son capaces de presentar un efecto de excímero cuando se orientan adecuadamente unos con respecto a otros; y b) uno o más monómeros adicionales; de tal manera que la macromolécula resultante presenta dicho efecto de excímero. En otro aspecto más, la presente invención provee un método para detectar la presencia o concentración de un anaiito en una muestra, dicho método comprendiendo: a) exponer la muestra a una macromolécula indicadora, dicha macromolócula comprendiendo un copolímero de: i) uno o más monómeros de componente indicador, cuyas moléculas son capaces de presentar un efecto de excímero cuando se orientan adecuadamente unas con respecto a otras, y también son capaces de detectar la presencia o concentración de un analito; y ii) uno o más monómeros adicionales; d? tal manera que la macromolócula resultante presenta dicho efecto d? excímero y en donde la macromolócula indicadora tiene una calidad detectabl? que cambia de una manera dependiente de la concentración cuando la macromolócula es expuesta al analito; y b) medir cualquier cambio en la calidad detectable para determinar asi la presencia o concentración de dicho analito en la muestra.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1-2 ilustran los espectros de emisión de varias macromoléculas indicadoras de la presente invención como se describe en el ejemplo 2. La figura 3 ilustra la emisión de fluorescencia normalizada (I/lo @ 427 nm) de un indicador como se describe en el ejemplo 5. La figura 4 ilustra la emisión de fluorescencia normalizada (I/lo @ 428 nm) de un indicador como se describe en el ejemplo 6. La figura 5 ilustra ia emisión de fluorescencia normalizada (I/lo @ 427 nm) de un indicador como se describe en el ejemplo 6. La figura 6 ilustra espectros de absorbancia de un indicador como se describe en el ejemplo 7. Las figuras 7-8 ilustran la relación de la absorbancia (450 nm/530 nm) de un indicador como se describe en el ejemplo 7.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención provee una forma para utilizar, en un ambiente acuoso, componentes indicadores que por sí mismos son insolubles o escasamente solubles en un ambiente acuoso. Dichos indicadores son, de hecho, copolimerizados con uno o más monómeros que son suficientemente hidrófilos de tal manera que la molécula indicadora resultante es suficientemente hidrófila en general para superar la contribución hidrófoba de los monómeros de componente indicador. Los componentes indicadores adecuados incluyen moléculas indicadoras que son insolubles o escasamente solubles en agua, y cuyo analito es por lo menos escasamente soluble en agua. Los analitos adecuados incluyen glucosa, fructosa y otros dioles vicinales; a-hidroxiácidos; p-cetoácidos; oxígeno; dióxido de carbono; varios iones tales como zinc, potasio, hidrógeno (medición de pH), carbonato, toxinas, minerales, hormonas, etc. Se apreciará que dentro del alcance del monómero del componente indicador como se usa aquí se incluyen mezclas de dos o más monómeros individuales (por lo menos uno de los cuales no es suficientemente soluble para funcionar adecuadamente en un ambiente acuoso) que, como se incorporan en las macromolóculas de la presente invención, funcionen como un indicador. Muchos de esos componentes indicadores son conocidos. Por ejemplo, los compuestos ilustrados en la patente de E.U.A. 5,503,770 son útiles para detectar sacáridos tales como glucosa, pero son escasamente solubles a Insolubles en agua. Otras clases de indicadores incluyen los quelatos de lantánido descritos en la solicitud de E.U.A. copendiente con serie No. 09/265,979 presentada el 11 de marzo de 1999 (y publicada como solicitud internacional del PCT WO 99/46600 el 16 de septiembre de 1999), incorporada aquí por referencia; hidrocarburos poliaromáticos y sus derivados; los indicadores descritos en la solicitud copend lente con serie No. 09/754,217 presentada el 5 de enero de 2001 y la solicitud con serie No. 60/269,887 presentada el 21 de febrero de 2001 , ambas describen indicadores que tienen dos elementos de reconocimiento capaces de discriminar entre la glucosa y los a-hidroxiácidos; ß-dicetonas, etc., de interferencia. Los componentes indicadores de ia presente invención generalmente tendrán una cantidad detectable que cambia de una manera dependiente de la concentración cuando la macromolócula es expuesta al analito que se va a medir. Muchas de esas cualidades son conocidas y se pueden usar en la presente invención. Por ejemplo, el indicador puede incluir una porción luminiscente (fluorescente o fosforescente) o quimioluminiscente, una porción basada en absorbancia, etc. El indicador puede incluir una porción donadora de energía y una porción aceptora de energía, cada una espaciada de tal manera que hay un cambio detectable cuando la macromolécula interactúa con el analito. El indicador puede incluir un fluoróforo y un extinguidor, configurado de tal manera que el fluoróforo sea extinguido por el extinguidor cuando esté ausente el analito. En esa situación, cuando está presente el analito el indicador sufre un cambio de configuración que provoca que el extinguidor se mueva suficientemente lejos del fluoróforo de modo que se emite fluorescencia. Por el contrario, el fluoróforo y el extinguidor pueden ser configurados de tal manera que en ausencia del analito, sean suficientemente separados y el fluoróforo emita fluorescencia; al interactuar con el analito, el fluoróforo y el extinguidor son movidos en suficiente proximidad para causar extinción. El concepto de cambio de configuración se describe con más detalle en la solicitud copendiente con serie No. 09/754,219, presentada el 5 de enero de 2001 , titulada "Detection of Analytes", incorporada aquí por referencia. Otras porciones detectables incluyen aquellas cuya fluorescencia es afectada por interacción del analito por medio de transferencia de electrones fotoinducida o efectos inductivos. Estos incluyen los quelatos de lantánidos descritos en la solicitud de E.U.A. copendiente con serle No. 09/265,979, presentada el 11 de marzo de 1999 (y publicada como solicitud internacional del PCT WO 99/46600 el 16 de septiembre de 1999), incorporada aquí por referencia; hidrocarburos poliaromáticos y sus derivados; cuomarinas; BODIPY® (Molecular Probes, Eugene, OR); dansilo; catecol?s; etc. Otra clase de porciones incluyen aquellas cuyo espectro de absorbancia cambia al interactuar el compuesto indicador con el analito, incluyendo rojo de alizarina, etc. Otra clase de porciones incluyen aquellas cuya fluorescencia es modulada por efectos de proximidad, v.gr., pares donadores/aceptores de energía tales como dansilo/dabsilo, etc. Preferiblemente, la calidad detectable es un cambio óptico o espectral detectabl?, tales como cambios en las características de absorción (v.gr., capacidad d? absorción y/o desplazamiento espectral), en el tiempo de descomposición fluorescente (determinado por la medición del dominio de tiempo o dominio de frecuencia), intensidad fluorescente, anisotropía fluorescente o polarización; un desplazamiento espectral del espectro de emisión; un cambio en la descomposición de anisotropía resuelta en el tiempo (determinada por mediciones de dominio de tiempo o dominio de frecuencia), etc. Los monómeros hidrófilos adecuados deben ser suficientemente hidrófilos para superar la suma de los monómeros de componente indicador hidrófobos, de tal manera que la macromolécula indicadora resultante sea capaz de funcionar en un ambiente acuoso. Será fácilmente evidente que una amplia variedad de monómeros hidrófilos sean adecuados para usarse en la presente invención. Por ejemplo, los monómeros hidrófilos adecuados incluyen metacrilamidas, metacrilatos, ácido metacrflico, dimetilacrílamida, TMAMA, vinilos, polisacáridos, poliamidas, poliaminoácidos, silanos o siloxanos hidrófilos, etc., así como mezclas de dos o más monómeros diferentes. Los monómeros hidrófilos adecuados para una aplicación dada variarán de acuerdo con un número de factores, incluyendo la temperatura de operación, salinidad, pH, presencia e identidad de otros solutos, resistencia iónica, etc. Sería fácilmente evidente que el grado de carácter hidrófilo de la macromolócula indicadora pueda ser incrementado añadiendo constituyentes funcionales adicionales tales como iones (v.gr., sulfonato, amina cuaternaria, carboxllo, etc.), moléculas polares (v.gr., hidroxilo, sulfhidrilo, aminas, carbonilo, amidas, etc.), halógenos, etc. Se apreciará que la relación molar de monómero hidrófilo a monómero de componente indicador puede variar ampliamente dependiendo de la solicitud específica deseada. Las relaciones preferidas de monómero hidrófilo: monómero de componente indicador varían de alrededor de 2:1 a aproximadamente 1000:1 , muy preferiblemente de alrededor de 5:1 a aproximadamente 50:1. Las macromolóculas indicadoras de la presente invención generalmente se pueden sintetizar copolimerizando simplemente por lo menos un monómero de componente indicador con por lo menos un monómero hidrófilo. Las condiciones óptimas de polimerización (tiempo, temperatura, catalizador, etc.) variarán de acuerdo con los reactivos específicos y la aplicación del producto final, y pueden ser fácilmente establecidos por un experto en la técnica. Se apreciará que las macromoléculas indicadoras de la presente invención pueden tener cualquier grado deseado de solubilidad en agua. Por ejemplo, la macromolócula Indicadora de los ejemplos 1 y siguientes es muy soluble, disolviéndose fácilmente en solución acuosa. Por otra parte, las macromoléculas indicadores contienen, por ejemplo, el monómero hidrófilo HEMA (metacrilato de hidroxietilo) u otros constituyentes de hidrogel comunes, pueden ser no solubles pero hidrófilos. Las macromoléculas indicadoras solubles se pueden usar directamente en solución si así se desea. Por otra parte, si la aplicación deseada así lo requiere, la macromolócula indicadora puede ser inmovilizada (tal como mediante trampa mecánica, unión covalente o iónica u otros medios) sobre o dentro de una superficie insoluble o matriz tal como vidrio, plástico, materiales polimóricos, etc. Cuando la macromolécula indicadora es atrapada dentro de, por ejemplo, otro polímero, el material de captura preferiblemente deberá ser suficientemente permeable al analito para permitir la interacción adecuada entre el analito y los componentes Indicadores en la macromolécula. Existen muchos usos para las macromoléculas indicadoras de la presente invención, incluyendo usos como indicadores en el campo de energía, medicina y agricultura. Por ejemplo, las macromolóculas indicadoras se pueden usar como moléculas indicadoras para detectar subniveles o supraniveles de glucosa en la sangre, tejidos, orina, etc., proveyendo así información valiosa para diagnosticar o monitorear enfermedades tales como la diabetes e insuficiencia suprarrenal. La producción médica/farmacéutica de glucosa para aplicación terapéutica humana requiere monitoreo y control. Los usos para la presente invención en la agricultura incluyen niveles de detección de una analito tal como glucosa en frijol de soya y otros productos agrícolas. La glucosa debe ser cuidadosamente monitoreada en decisiones de cosecha críticas para productos altamente valiosos tales como uvas para vino. Puesto que la glucosa es la fuente de carbono más costosa y el material de abastecimiento en proceso de fermentación, el monitoreo de la glucosa para control de tasa de alimentación de reactor óptima es importante en la producción de alcohol de potencia. El mezclado en reactor y el control de la concentración de glucosa también es crítico para el control de calidad durante la producción de gaseosas y bebidas fermentadas, lo que consume la mayor cantidad de glucosa y azúcares fermentables a nivel Internacional. Cuando las macromoléculas indicadoras incorporan sustituyentes indicadores fluorescentes, también se conocen varias técnicas de detección que pueden usar las macromolóculas de la presente invención. Por ejemplo, las macromoléculas de la invención se pueden usar en dispositivos de detección fluorescente (v. gr., patente de E.U.A. No. 5,517,313) o se pueden unir a materiales polimóricos u otros sustratos tales como papel de prueba para inspección visual. Esta última técnica permitiría, por ejemplo, la medición de glucosa de una manera análoga a la determinación del pH con una tira de papel tornasol. Las macromoléculas que aquí se describen también se pueden utilizar como reactivos simples con instrumentación analítica de banco estándar tales como espectrofluorómetros o analizadores clínicos como los hechos por Shlmadzu, Hitachi, Jasco, Beckman y otros. Estas moléculas también proveerían transducción de señal química/óptica especifica de analito para sensores basados en fibra óptica y fluorómetros analíticos como los hechos por Ocean Optics (Dunedin, Florida), u Orlel Optics. La patente de E.U.A. 5,517,313, cuya descripción se incorpora aquí por referencia, describe un dispositivo de detección de fluorescencia en el cual las macromolóculas de la presente invención se pueden usar para determinar la presencia o concentración de un analito tal como glucosa u otro compuesto de cís-diol en un medio líquido. El dispositivo de detección comprende una disposición estratificada de una matriz que contiene molécula indicadora fluorescente (de aquí en adelante "matriz fluorescente"), un filtro de paso alto y un fotodetector. En este dispositivo, una fuente de luz, preferiblemente un diodo emisor de luz ("LED"), está ubicado por lo menos parcialmente dentro del material indicador, o en la guía de onda sobre la cual está dispuesta la matriz indicadora, de tal manera que la luz incidente de la fuente de luz hace que las moléculas del indicador emitan fluorescencia. El filtro de paso alto permite que la luz emitida alcance un fotodetßctor, mientras filtra la luz incidente dispersa desde la fuente de luz. La fluorescencia de las moléculas indicadoras empleadas en el dispositivo descrito en la patente de E.U.A. 5,517,313 es modulada, v. gr., atenuada o incrementada, por la presencia local de un analito tal como glucosa u otro compuesto de cis-diol. En el sensor descrito en la patente de E.U.A. 5,517,313 el material que contiene la molécula indicadora es permeable al analito. Por lo tanto, el anaiito se puede difundir en el material desde el medio de prueba circundante, afectando así la fluorescencia emitida por las moléculas indicadoras. La fuente de luz, material que contiene molécula indicadora, filtro de paso alto y fotodetector se conjugan de tal manera que por lo menos una porción de la fluorescencia emitida por las moléculas indicadoras tienen impacto sobre el fotodetector, generando una señal eléctrica que es indicativa de la concentración del analito (v. gr., glucosa) en el medio circundante. De acuerdo con otras modalidades posibles para usar las macromoléculas indicadoras de la presente invención, se describen también dispositivos de detección en las patentes de E.U.A. Nos. 5,910,661 , 5,917,605 y 5,894,351 , todas Incorporadas aquí por referencia. Las macromolóculas de la presente invención también se pueden usar en un dispositivo implantable, por ejemplo para monitorear continuamente un analito in vivo (tal como niveles de glucosa en la sangre o tejido). Los dispositivos adecuados se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente de E.U.A. copendiente serie No. 09/383,148, presentada el 26 de agosto de 1999, así como las patentes de E.U.A. Nos. 5,833,603, 6,002,954 y 6,011 ,984, todas incorporadas aquí por referencia. Las macromoléculas de la presente invención tienen ventajas únicas. Por ejemplo, la absorbancia de una muestra es directamente proporcional tanto a la concentración del absorbedor como la longitud de trayectoria de la muestra. Por lo tanto, en una prueba basa en absorbancia, es evidente que para un nivel de absorbancia, la longitud de trayectoria de la muestra se puede reducir en gran medida si la concentración del absorbedor se incrementa en gran medida. Este incremento deseable en la concentración se puede lograr reduciendo la relación de monómero hidrófilo:monómero de componente indicador. En efecto, la presente invención permite la concentración localizada de un componente mucho más absorbedor en un espacio limitado, incrementando asi la absorbancia por unidad de espesor. Por lo tanto, la presente invención además permit? el uso de equipo mucho más pequeño cuando se realizan pruebas basadas en absorbancia. También será evidente que para cualquier prueba ópticamente basada, incluyendo pruebas basadas en fluorescencia, la capacidad para incrementar en gran medida la concentración local del componente indicador ofrece varias ventajas. Por ejemplo, una concentración local más alta del componente indicador puede permitir la utilización de capas más delgadas de macromolócula indicadora, que a su vez puede reducir en gran medida el tiempo de respuesta de la macromolécula a la presencia o concentración del analito. Además, puede dar como resultado una extinción más alta de la luz de excitación, que puede reducir considerablemente la incidencia de autofluorescencia cuando se trabaja en sistemas de tejido o soluciones fisiológicas. Por ejemplo, cuando se trabaja con una macromolécula basada en fluorescencia, la luz de excitación no absorbida puede interactuar, v. gr., con NADH, triptofano, tirosína, etc., que pueden estar presentes en el tejido o soluciones fisiológicas dando como resultado emisión fluorescente de interferencia no deseable desde esas porciones. Teniendo una concentración alta de componente indicador con alta absorción se puede reducir esa emisión de interferencia no deseada. Además, cuando se utiliza una macromolócula basada en absorbancia en tejido o soluciones fisiológicas, es conveniente reducir la cantidad de la radiación de fuente que es reflejada en cantidades potencialmente variables por componentes en el tejido o fluido circundante, tales como por ejemplo bilirrubina. Por lo tanto, teniendo una concentración local alta de componente indicador con alta absorción ST pu?d? reducir TST efecto no deseado. Como un aspecto adicional de la presente invención, se ha descubierto que ciertas macromoléculas presentan un efecto de excímero. A manera de fondo, cuando dos moléculas planas con estructura aromática (tal como es común con fluoróforos) son concentradas a un punto en donde sus lóbulos orbitales de electrones pi se traslapan, puede entonces ocurrir una condición de resonancia para algunas especies en donde la resonancia de traslape da por resultado una estructura híbrida (pareada) que es energía favorable y estable. Estas dos moléculas planas se orientan en una configuración coplanar como dos rebanadas de pan en un emparedado con sus nubes de electrones traslapándose entre las mismas. Para especies planas fluorescentes, ocurre emisión de campo bajo característico en relación con las especies no pareadas a una longitud de onda sustancialmente de menor energía que las especies progenitoras. Las moléculas capaces de formar dichas configuraciones resonantes favorables se conocen como exclmeros. Como se usa aquí, un efecto de excímero se refiere a la emisión de longitud de onda más larga característica de los excímeros. Algunos ejemplos de hidrocarburos poliaromáticos formadores de excímero típicos incluyen antraceno y pireno. Existen muchos otros. Un ejemplo es el derivado de antraceno (incluido el boronato), el componente indicador usado en los ejemplos 1 y 2 de la presente solicitud. Aunque se sabe que el antraceno forma excímeros en solución, puede concentrar la molécula a niveles suficientemente altos para observar algún carácter de excímero. En el caso del derivado de antraceno de los ejemplos 1 y 2, la molécula es insoluble en agua e insuficientemente soluble en un solvente tal como metanol para observar características del excímero. En los presentes ejemplos, la concentración relativa del monómero derivado de antraceno se Incrementó en proporción al monómero hidrófilo en el copolímero de 500:1 , 400:1 , 200:1 , 100:1 , 50:1 , 25.1 , 15:1 y después 5:1. Todos tienen la emisión azul característica a 417 nm del derivado de antraceno excepto en la relación de 5:1, una emisión verde aparece repentinamente. Esta emisión verde es la de un híbrido de excímero y la emisión ha sido desplazada campo abajo en aproximadamente 100+ nanómetros (-515-570 nm, verde). La concentración de la solución global no necesita ser alta ya que la distancia entre la especie plana es controlada al colocarse a lo largo de la estructura de base del polímero más que la concentración soluble en espacio tridimensional. De manera sorprendente, se ha encontrado que la región de emisión de excímero no responde a cambios en la concentración de analito, sino que responde a todos los demás aspectos del sistema analizado, tales como intensidad de excitación, temperatura y pH. Como resultado, las presentes macromoléculas indicadoras pueden servir como un indicador y una como una referencia interna. Por ejemplo, un esquema de referencia ideal es uno en donde la intensidad de emisión a la longitud de onda del indicador (es decir, la longitud de onda influenciada por el anallto) se divide ópticamente usando filtros de paso de banda selectos, por la intensidad de emisión a la longitud de onda del excímero. El valor resultante corrige factores de interferencia que afectan las propiedades de emisión fluorescente, tales como extinción de fluorescencia, v. gr., por oxígeno, derivación y error en pH, factores de potencia y derivación que afecta la intensidad del LED, excursiones de temperatura ambiente, etc. Se apreciará fácilmente que las macromolóculas de la presente invención que presentan un efecto de excímero serán útiles tanto en ambientes acuosos como no acuosos. De manera consecuente, esas moléculas, así como los monómeros componentes (monómero formador de excímero y otro monómero), pueden variar de hidrófilos a hidrófobos, dependiendo de la aplicación deseada. También, cuando las macromoléculas de excímero de la presente invención se usan para detectar la presencia o concentración de un analito, la macromolécula se puede usar directamente en solución o puede ser inmovilizada como se describió antes. Las macromoléculas de la presente invención pueden ser preparados por un experto en la técnica sin mucha experimentación usando mecanismos de reacción y reactivos fácilmente conocidos, incluyendo mecanismos de reacción que son consistentes con los procedimientos generales que se describen a continuación.
EJEMPLO 1 a) Preparación de 9-fmetacrllollamlnopr?Dilamlno)metin-antraceno (A) Fase uno A una suspensión de clorhidrato de N-(3-aminopropil)-metacrilamida (Polysciences, #21200) (11.82 g, 0.066 moles, 3.0 eq) y una traza de inhibidor DBMP (2,6-di-t-butil-4-metilfenol) (10 mg) en cloroformo (250 ml) agitado en un baño de agua con hielo, se añadió diisopropiletilamina (25 ml, 18.55 g. 0.144 moles, 6.5 eq) gota a gota durante 20 minutos. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se enfrió nuevamente en un baño de agua con hielo. Se añadió gota a gota una solución clara de 9-clorometilantraceno (5.0 g, 0.022 moles) en cloroformo (100 ml) durante 1 hora. Se llevó a cabo a 25°C durante 1 hora, 50°C durante 12 horas y después a 70°C durante 2 horas. La mezcla se lavó con agua (60 ml x 4) y la capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2S04, se separaron y el solvente se removió bajo presión reducida a 40°C. El material crudo se cromatografió después sobre gel de sílice con 2-5% de metanol en cloruro de metiieno para dar 2.44 g (33.4%) del producto como un sólido.
CCD (gel de sílice): Rf 0. 39 (MeOH/CH2CI2 = 1/9), un solo punto.
(B) Fase-dos A una solución clara de clorhidrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida (788 mg, 4.41 mmoles, 10 eq) y una traza de inhibidor MEHQ (éter metílico de hidroquinona) (2 mg) en una mezcla de agua (30 ml) y tetrahidrofurano (30 ml) agitados en un baño de agua con hielo. Un regulador de pH de Na2C?3/NaHCO3 (66 ml; 0.2 M, f 10) se añadió en 1 hora y se añadió una solución de 9-clorometilantraceno (100 mg, 0.441 mmoles) en cloroformo (100 ml) en 3 horas. Se llevó a cabo a 25°C durante 7 horas y después a 55°C durante 12 horas. La capa orgánica se separó, se lavó con agua (50 ml x 4), y las capas acuosas se extrajeron con cloruro de metiieno. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SÜ4, se separaron y el solvente se removió bajo presión reducida a 45°C. El material crudo (270 mg) se cromatografió después sobre gel de sílice con 10-20% de metanol en cloruro de metileno para dar 28.7 mg (19.6% de producto como un sólido CCD (gel de sílice): R( 0.77 (MeOH/CH2CI2 = 3/7), un solo punto. b) Preparación de 9-rrN-mßtacrilollamlnopropll-N-(o-borono- bencIDamlnolmetlIlantraceno A una solución del producto obtenido en el paso a) anterior (2.440 g, 0.00734 moles) y una traza de inhibidor DBMP (10 mg) en cloroformo, (200 ml) agitados en un baño de agua con hielo, se añadió DIEA (diisopropiletilamina) (2.846 g, 3.84 ml„ 0.022 moles, 3.0 eq) en porciones durante 10 minutos, y después se añadió una solución de 2,2-dimetilpropan-1,3 diil[o-(bromometil)fenil]boronato (2.492 g, 0.00881 moles, 1.2 eq) en cloroformo (15 ml) durante 30 minutos. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 20 horas. La mezcla se lavó con agua, se separó y las capas acuosas se extrajeron con cloruro de metileno. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2S04, se separaron y el solvente se removió con presión reducida a 25°C. El semisólido (4.75 g) se cromatografió después sobre gel de sílice con 2-5% de metanol en cloruro de metileno para dar 2.50 g (76.3%) del producto como un sólido cristalino amarillo claro, pf 72-73°C CCD (gel de sílice): Rf 0.36 (MeOH/CH2CI2 = 1/9). Es soluble en CH2CI2, CHCI3, THF, CH3OH y C3H5OH. Solubilidad limitada en H20 y éter. c) Preparación de soluciones de copolfmero solubles en agua de MAPTAC v 9-fN-metacrilollamlnopropll-N-f o-boronobenclOamlnol- metillantra-ceno Solución (50:1): A una solución del monómero (42.3 mg, 0.0908 mmoles) en etapol (100%, 1.5 ml), se añadió MAPTAC cloruro de [3-(m?tacriloilamino)propiljtrimetllamonio (2.0 ml, 1.0 g, 4.54 mmoles, 50 eq) y una solución etanólica de AIBN (azobisisobutilnitrilo) (0.183 M, 0.2 ml) como iniciador de radical, se obtuvo una solución clara. Se saturó con nitrógeno y después se calentó a 70°C en 1 hora, y se mantuvo a 70°C durante 8 horas y se obtuvo un líquido viscoso. El líquido obtenido se trató con agua (26 ml) y se filtró a través de un microfiltro (0.45 um) para dar una solución clara. Después de la diálisis a través de una membrana de acetato de celulosa (MWCO 3500) con agua 5 I x 4), se concentró con polietilenglicol (PM 20 K) a una solución clara (34.54 g). Concentración: 24.0 mg de sólido en 1.0 g de solución, 829 mg total de sólido, rendimiento 79.5%. Se aplicaron procedimientos similares para preparar soluciones copoliméricas de relaciones molares de 500:1, 400:1 , 200:1, 100:1 , 50:1 , 25:1, 15:1, y 5:1 de monómero hldrófilo:indicador.
Modulación de glucosa de copolímeros de 50:1 v 25:1 La modulación de la fluorescencia de las macromoléculas indicadoras de 50:1 y 25:1 por soluciones de glucosa que tienen varias concentraciones se muestra a continuación en los cuadros 1 y 2. El cuadro 1 muestra los resultados usando dos diferentes concentraciones (15 mg/ml y 25 mg/ml) de la macromolécula indicadora de 25:1 de este ejemplo con cuatro diferentes concentraciones de glucosa. El cuadro 2 muestra los resultados usando dos concentraciones diferentes (10 mg/ml y 20 mg/ml) de la macromolócula indicadora de 50:1 de este ejemplo con cuatro concentraciones diferentes de glucosa. En ambos cuadros, l/lo es la relación de las intensidades emitidas a 420 nm antes y después de la exposición a la glucosa (excitación de 365 nm).
CUADRO 1 CUADRO 2 EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra un efecto de excímero sorprendente y útil presente en conexión con la macromolécula indicadora 5:1 preparada en el ejemplo 1. La figura 1 ilustra los espectros de emisión de macromolécula indicadora 5:1 cuando se expone a tres concentraciones de glucosa (0 mM, 30 mM y 60 mM) después de ser excitada por la luz a 365 nm. También se muestra en la región sombreada de la figura 1 la emisión de la macromolécula indicadora 25:1 sin excímero del ejemplo 1. La región de emisión de excímero muestra una "región isosbóstica" más que un punto isosbóstico. Se puede ver a partir de la figura 1 que la región de emisión de excímero (la región en donde las líneas de glucosa 0 mM, 30 mM y 60 mM se traslapan) no responde a cambios en la concentración de glucosa (como un punto isosbéstico). La reglón de emisión de excímero empieza aproximadamente 100 nm campo debajo de la longitud de onda de la respuesta pico de la modulación de derivado de antraceno. Excepto por la glucosa, el exclmero responde a todos los demás aspectos del sistema, tales como intensidad de excitación, temperatura y pH. Por lo tanto, un esquema de referencia ideal es uno en donde la amplitud o valor de señal a 415 nm se divide electrónicamente entre la amplitud o valor de señal a 515 nm u otra longitud de onda o intervalo de longitudes de onda dentro de la región de emisión de excímero, y el valor resultante será corregido para desviación y error en el pH, factores de potencia e intensidad de LED que afecta la desviación, excursiones de temperatura ambiente, etc. Esto se demuestra a continuación.
Demostración de intensidad de excitación, temperatura y corrección de pH La modulación de glucosa de la macromolécula indicadora 5:1 se midió con tres soluciones de glucosa diferentes (0 mM, 100 mM y 200 mM). Los espectros de emisión se determinaron para cada una de las soluciones de glucosa en tres configuraciones de ranura de espectrofotómetro diferentes para la fuente y luz emitida (1.5 siendo más estrecha y 3 siendo más ancha). Los datos se muestran en el cuadro 3. En el cuadro, la relación de la intensidad de emisión a 420 nm con respecto a la intensidad de emisión a 550 nm es relativamente independiente de la configuración de ranura.
CUADRO 3 Se determinó la estabilidad a la temperatura de la macromolécula indicadora de excímero 5:1. La relación de las emisiones a 420 nm y 550 nm para 1 mg/ml de solución de la macromolócula indicadora de excímero 5:1 expuesta a 200 mM de glucosa (pH 7.5) fue de 7.57 a temperatura ambiente y 7.53 a aproximadamente 60°C. También se determinó la estabilidad al pH de la macromolócula indicadora de excfmero 5:1 también. Se determinó la relación de las emisiones a 420 nm y 550 nm para 1 mg/ml de solución de la macromolócula indicadora de excímero 5:1 a tres niveles de pH diferentes (6.5, 7.0 y 7.5) (luz de excitación a 370 nm, ranuras 1.5,3), y se muestra en el cuadro 4. Los espectros de emisión completa se muestran en la figura 2. La variación en el intervalo probado fue estadísticamente insignificante.
CUADRO 4 Se cree que ia estabilidad del complejo de excímero (supuestamente a través de la nube de pi) excede la del derivado de antraceno sin excímero, y que la característica de reconocimiento de boronato, que es capaz de perturbar las propiedades del derivado sin excímero, y por lo tanto hacer un buen indicador, no puede perturbar al complejo de excímero más estable y por lo tanto el excímero hace un indicador de referencia muy bueno. La molécula de referencia es estructuralmente inalterada desde el indicador de canal de lectura. La matriz de polímero puede ser la misma, y en este ejemplo es de hecho la misma macromolécula. El elemento de reconocimiento es abierto e intacto, pero la influencia de energía inductiva entre el elemento de reconocimiento y el centro del fluoróforo ha sido mutada. Lo anterior es muy importante, ya que puede eliminar la necesidad de ambientes físicos y/o químicos separados entre el indicador y moléculas de referencia.
EJEMPLO 3 La síntesis de un monómero de componente indicador de quelato de lantánido se ilustra en el esquema 1. Los compuestos (1) y (2) están comercialmente disponibles de Macrocyclics, Richardson, TX (el compuesto (2) se conoce como p-NHrBz-DOTA). El producto flnal (9) puede ser co-pollmerizado con uno o más de otros monómeros para formar una macromolécula indicadora. o EJEMPLO 4 Monómero de metacrllamlda individual de bls-boronato-antraceno A. Sal de clorhidrato de 9-clorometil-10-rí2-(2-hidroxietoxD?tilaminol-metinantraceno A una suspensión de 9,10-bis(clorometil)antraceno (5.18 g, 18.8 mmoles, 3.99 equiv.) en 200 ml de NMP se añadió 2-(2-aminoetoxi)etanol (0.495 g, 0.475 ml, 4.71 mmoles). La mezcla se agitó en la oscuridad durante 17 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se concentró a ~ 50 ml bajo vacío a 50°C. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (150 g gel de sílice de grado de gravedad, 0-10% CH3OH/CH2CI2) para dar 0.425 g (24%) de un sólido amarillo/anaranjado. CCD: 60 placas de gel de sílice de Merck, Rf 0.72 con 70/30 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366), tinción con ninhidrlna. CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2 ml/min, detección de 370 nm, A = agua (0.1% de HFBA) y B = MeCN (0.1% de HFBA), gradiente 10% de B 2 mln, 10-80% de B durante 18 mln, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 16.1 min.
B. 9-ff2^(2-hidroxietoxi)etilamino1met¡l1-10-íí(3-m?tacrilamldo)-propilaminolmetinantraceno A una suspensión de sal de clorhidrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida (3.08 g, 17.2 mmoles, 4.2 equiv.), DIEA (5.19 g, 7.00 ml, 40.1 mmoles, 9.8 equiv.) y ~ 3 mg de BHT en 125 ml de CHCI3 a 23°C, se añadió gota a gota una solución de sal de clorhidrato de 9-clorometll-10-[[2-(2-hidroxi?toxi)?t¡lamino]metil]antraceno (1.56 g, 4.10 mmoles) en 25 ml de CHCI3. La mezcla se agitó subsecuentemente en la oscuridad durante 92 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se filtró y se lavó con 2 x 40 ml de NaHCOa (solución acuosa saturada). El extracto orgánico se secó sobre Na2S0 anhidro, se filtró y se concentró para dar un sólido anaranjado viscoso el cual se purificó por cromatografía en alúmina (50 g de alúmina neutra activada, 0-5% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0.364 g (20%) de un sólido anaranjado. CCD: 60 placas de gel de sílice de Merck, Rf 0.16 con 70/30 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366), tinción con ninhidrina. CLAR: cromatógrafo HP 1 100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2 ml/min, 370 nm de detección, A = agua (0.1% de HFBA) y B = M?CN (0.1% d? HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 16.85 min.
C. 9-rN-r2-(5.5-d¡m?tilbor¡nan-2-ll)b?nc¡l1-N-r3-(matacrllamido propilamino1m?t¡l1-10-fN-f2-(5.5-dim?tilborinan-2-il)b?ncin-N-r2-(2-hidroxietoxn-etilaminolmetillantraceno (Monómero de metacrllamida individual) Una solución de 9-[[2-(2-hidroxietoxi)et¡lamino]metil]-10-[[(3-metacrllamido)propilamino]metll]-antraceno (0.343 g, 0.763 mmoles), DIEA (0.965 g, 1.30 ml, 9.8 equiv.) y óster neopentílico de ácido (2-bromometilfeni)borónico (1.09 g, 3.85 mmoles, 5.0 equiv.) en 20 ml de CHCI3 a 23°C se agitó en la oscuridad durante 25 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se concentró inicialmente por evaporación giratoria, después se usó una bomba de vacío para remover DIEA. El residuo se purificó por cromatografía en columna de alúmina (40 g de alúmina neutral activada, 0- 10% d? CH3OH/CH2CI2) para dar 0.299 g (46%) de un sólido amarillo-anaranjado. Este producto se pued? copolimerizar con uno o más de los otros monómeros para formar una macromolócula indicadora. Los grupos boronato deben ser desprotegidos antes de usarse. FAB EM: Calculado para C5?H?5B2N307 [M]+ 854; Encontrado [M + 1]+ 855. CCD: placas de alúmina básica de Merck, Rf 0.35 con 95/5 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366). CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, inyección de 0.100 ml, 2 ml/min, detección de 370 nm, A = agua (0.1% de HFBA) y B = MeCN (0.1 % de HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 19.7 min.
EJEMPLO 5 Monómero de metacrllamlda doble de bls-boronato-antraceno A. 9.10-bisr3-(metacrilamido)propilam¡no1m?til-antraceno Una suspensión de 9,10-bis(clorometil)antraceno (1.5 g, 5.45 mmoles), DIEA (28.17 g, 38.00 ml, 218 mmoles, 40 equiv.), sal de clorhidrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida (9.76 g, 54.5 mmoles, 10.0 equiv.) y ~ 5 mg de BHT en 200 ml de CHCI3 a 23°C se agitó en la oscuridad durante 4 días a 40°C. En este tiempo, la temperatura se incrementó a 45°C y la mezcla se agitó durante 3 días más. En este tiempo, se había formado un precipitado. La mezcla se filtró y el producto sólido se disolvió en la cantidad mínima de CH2CI2. Un sólido amarillo cristalino, la sal de bis-clorhidrato del producto deseado, formado durante la noche (3.15 g, cuantitativo). CCD: placas de alúmina básica de Merck, Rf 0.31 con 90/10 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366). CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna de C18 Waters 5 x 100 mm NovaPak HR, 0.100 ml de inyección, 0.75 ml/min, 360 nm de detección, A = agua (0.1% de HFBA) y B = MeCN (0.1% de HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 15.0 min.
B. 9.10-bisrN-f2-(5.5-dimet¡lborinan-2-ínbencin-N-r3-(metacril-amido)prop¡lamino1metilantraceno Una solución de 9,10-bis[3-(metacrilamido)-propllamido]-metilantraceno (0.650 g, 1.34 mmoles de la amina libre), DIEA (0.612 g, 0.825 ml, 4.74 mmoles, 3.55 equlv.), áster neopentílico de ácido (2-bromom?t¡lfenil)borónico (1.34 g, 4.74 mmoles, 3.55 equiv.) y BHT (5 mg como inhibidor) en 20 ml de CHCI3 a 23°C se agitaron en la oscuridad durante 5 días. En este tiempo, la mezcla de reacción se concentró bajo vacío y el residuo se purificó por cromatografía en alúmina (200 g de alúmina neutra activada, 0-2% de CH3OH/CH2CI2) para dar 0.465 g (39%) de a un aceite amarillo muy viscoso. CCD: placas de alúmina básica de Merck, Rf 0.59 con 90/10 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366). CLAR: cromatógrafo HP 1 100 para CLAR, columna C18 Waters 5 x 100 mm NovaPak HR, 0.050 ml de inyección, 0.75 ml/min, 360 nm de detección, A = agua (0. 1 % de HFBA) B = MeCN (0. 1 % de HFBA) , gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 16.9 min.
C. Preparación de hidroael N.N-dimetlIacrilamida con indicador de glucosa: Una solución de N.N-dimetilacrilamida (40% en peso) y N.N'-metilenbisacrilamida (0.8% en peso) en etilenglicol se preparó. 9,10-bis[N-[2- (5,5-dimetilborinan-2-il)-b?ncil]-N-[3-(m?tacrilamido)propilamino]-metllantra-ceno (17.8 mg, 2x10"5 moles) y 40 µl de persulfato de amonio acuoso (5% en peso) se combinaron con 1 ml de solución de monómero de etilenglicol. La solución resultante se colocó en una caja con guantes purgada con nitrógeno. Una solución acuosa de N.N.N'.N'-t?trametil?tilendiamina (80 µl, 5% en peso) se añadió a la formulación de monómero para acelerar la polimerización. La formulación resultante se vació en un molde construido a partir de portaobjetos de microscopio y un separador de acero inoxidable de 100 mieras. Después de mantenerse durante 8 horas en atmósfera de nitrógeno, el molde se colocó en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) (10 mM PBS, pH=7.4), los portaobjetos de microscopio se separaron y el hidrogel se removió. El hidrogel se lavó con 100 ml de PBS que contenía 1 mM de sal de sodio de laurilsulfato y 1 mM de sal de sodio de EDTA durante 3 días, la solución siendo cambiada cada día, seguido por lavado con DMF/PBS (10/90 por vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (pH=7.4, 3 x 100 ml). El polímero de hidrogel resultante se almacenó en PBS (10 mM PBS, pH=7.4) que contenía 0.2% en peso de azida de sodio y 1 mM de sal de sodio de EDTA.
D. Modulación de fluorescencia con glucosa, lactato y acetolactato La modulación de la fluorescencia de la macromolócula indicadora (que contiene dos elementos de reconocimiento) preparada en este ejemplo por glucosa, lactato y acetolactato se determinó. La figura 3 muestra la emisión de fluorescencia normalizada (l/lo @ 427 nm) del hidrogel de este ejemplo en 10 mM PBS, pH 7.4 que contenía 0.2% de NaN3 y 1 mM de EDTA que contenía varias cantidades de L-lactato de sodio, acetoacetato de litio o a-D-glucosa. Los datos se registraron usando un espectro-fluorómetro Shimadzu RF-5301 con excitación a @365 nm (ranura = 3 nm) y emisión a 427 nm (ranura = 3 nm) a baja sensibilidad a 37°C usando un contenedor de muestra controlado por temperatura. Los recipientes que contenían 3 ml de la solución deseada se equilibraron a 37°C durante 15 minutos antes de la medición. Cada muestra de hidrogel se midió en cuatro muestras independientes. Las barras de error son desviación estándar con valores cuadriplicados para cada punto de datos. Los hidrogeles que contenían una molécula de reconocimiento de glucosa se prepararon como se describió anteriormente. Los hidrogeles se montaron sobre portaobjetos de vidrio y se cubrieron con malla de poliéster en recipientes de PMMA a 45°C hasta la luz incidente. Soluciones de 1 , 5, 10 y 20 mM de L-lactato de sodio [Aldrich], 5, 10 y 20 mM de acetoacetato de litio [Aldrich] y 1 , 2, 4, 5, 10 y 20 mM de a-D-glucosa se prepararon en 10 mM de PBS, pH 7.4 que contenía 0.2% de NaN3 y 1 mM de EDTA. La fluorescencia del copolímero fue afectada por la presencia de glucosa, pero no por la presencia de lactato o acetoacetato.
EJEMPLO 6 Monómeros de metacrllato Individuales v dobles de bls-boropato- antraceno A. 9.10-b¡síí2-(2-hidroxietoxi)?tllamino1m?t¡p-antraceno A una solución de 2-(2-aminoetoxi)?tanol (31.4 g, 30.0 ml, 299 mmoles, 20.9 equlv.) en 40 ml de CHCI3 a 23°C se añadió 9,10-bis(clorometil)antraceno (3.94 g, 14.3mmoles). La solución se agitó en la oscuridad durante 67 horas. En este tiempo, se añadieron 100 ml de CH2CI2 y la solución se lavó con porciones de 1 x 50 ml y 2 x 100 ml de NaHC03 (solución acuosa saturada). El extracto orgánico se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró y se concentró para dar 4.67 g (79%) de un polvo amarillo. Producto (-85 % puro por RP-CLAR) se llevó a cabo como tal. Condiciones de CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2 ml/min, 370 nm de detección, A = agua (0.1% de HFBA) B = MeCN (0.1% de HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 mln, 100% de B 2 min, tiempo de retención 15.6 min.
B. 9.10-blsrN-r2-(5.5-d¡metilborinan-2-il)bencil1-N-r2(2-hidroxi-etoxi)etilaminolmetil1antraceno Una solución de 9,10-bis[[2-(2-hidroxietoxi)etilamino]-metil]antraceno (4.02 g, 9.75 mmoles), DIEA (12.6 g, 17.0 ml, 97.5 mmoles, 10.0 equiv.) y áster neopentílico de ácido (2-bromometllfenil)borónico (13.7 g, 48 mmoles, 4. 9 equiv.) en 125 ml de CHCI3 a 23°C se agitó en la oscuridad durante 46 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se concentró inicialmente por evaporación giratoria, después usando una bomba de vacío para remover el DIEA. El residuo se purificó por cromatografía en columna de alúmina (150 g de alúmina neutral activada, 0-3% de CH3OH/CH2CI2) para dar 5.67 g (70%) de un aceite viscoso el cual se solidificó durante el reposo. Producto (~85 % puro por RP-CLAR) se llevó a cabo como tal. CCD: placas de alúmina básica de Merck, Rf 0.33 con 95/5 de CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366). Condiciones de CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2 ml/min, 370 nm de detección, A = agua (0.1% de HFBA) y B = MeCN (0.1% de HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 18.8 min.
C. 9-rN-r2-(5.5-dim?t¡lborinan-2-íl)b?ncil1-N-r2-(2-metacroiloxi-etoxi)etilamino1m?till-10-rN-r2-(5.5-dÍmetllborinan-2-il)b?nc¡ll-N-r2-(2-hldroxi?toxi)et¡lamino1m?til]antraceno. (Monómero de metacrilato individual) Una solución de 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncil]-N- [2-(2-hidroxietoxi)etilamino]m?t¡l]-antraceno (0.298 g, 0.359 mmoles), ácido metacrílico (0.304 g, 0.300 ml, 3.53 mmoles, 9.84 equiv.), DCC (0.965 g, 4.68 mmoles, 13.0 equiv.) y N.N-dimetilaminopiridina (0.020 g, 0.16 mmoles, 0.46 equiv.) en 15 ml de CH2CI2 a 23°C se agitó en la oscuridad durante 4 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se filtró y se concentró por evaporación giratoria. El residuo se purificó por cromatografía en columna de alúmina (50 g de alúmina neutra activada, 0-4% de CH3OH/CH2CI ) para dar 0.150 g (47%) de un sólido amarillo.
FAB EM: Calculado para C52HßßB2N209 [M]+ 885; Encontrado [M + 1]+ 886. CCD: placas de alúmina básica de Merck, Rf 0.45 con 95/5 de CH2CÍ2/CH3OH, ver con UV (254/366). CLAR: cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2 ml/min, 370 nm de detección, A = agua (0.1 % de HFBA) y B = MeCN (0.1% de HFBA), gradiente 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención 21 min.
D. Copolímero soluble en agua de 9-ÍN-í2-(5.5-dimetilborinan-2-il)benc¡n-N-r2-(2-m?tacroiloxi-etoxi)etilam¡nolmetill-10-ÍN-r2-(S.B-dim?tilborinan-2-il)bencil3-N-í2-(2-hldroxi?tox¡)?t¡laminolm?till-antraceno v TMNA (relación molar de 1 :50) A una solución de cloruro de [2-(metacriloxi)?tll]trim?til-amonio (solución acuosa de TMAMA, 70 % en peso, 0.344 g de monómero, 1.66 mmoles, 50 equiv.) en 0.600 ml de agua se añadió una solución de 9-[N-[2-(5,5-dim?tllborinan-2-il)b?ncil]-N-(2-(2-metacroiloxietoxi)etilamino)-metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)bencÍI]-N-[2-(2-hidroxi?toxi)etilamino]metil]-antraceno (0.029 0.033 mmoles) en 3.00 ml de MeOH. A esta mezcla se añadió ácido 4,4'-azobis(4-cianovalórico) (0.0075 g, 0.027 mmoles, 1. 6 % molar del total de monómero). La solución se filtró a través de un filtro de membrana de 0.45 µ, se purgó con nitrógeno gaseoso y después se calentó en la oscuridad a 55°C durante 16 horas. En este tiempo, la solución viscosa se enfrió hasta 25°C y se concentró bajo vacío. El residuo se diluyó con 20 ml de agua y se filtró a través de un filtro de membrana de 0.2 µ. La solución de polímero se dializó a través de una membrana de acetato de celulosa ( WCO 3500) contra 2 x 4 I de agua. A partir de la diálisis se obtuvo 38.5 ml de solución de polímero. La concentración de una porción de esta solución a sequedad indicó 0.0075 g de polímero por 1.0 ml de solución. El rendimiento general del polímero fue de 0.289 g (77%).
E. Modulación de fluorescencia con glucosa, lactato y acetoacetato Se determinó la modulación de la fluorescencia del copolímero (que contiene dos elementos de reconocimiento) preparado en el paso D de este ejemplo por glucosa, lactato y acetoacetato. La figura 4 muestra la emisión de fluorescencia normalizada (l/lo @ 428 nm.) de 1.5 mg/ml de una solución de copolímero de antraceno bis boronato-TMAMA (relación molar de 1 :50) en PBS que contenía a) 0-20 mM de glucosa; b) 0-20 mM de lactato; c) 0-20 mM de acetoacetato de litio. Los espectros se registraron usando un espectrofluorómetro Shimadzu RF-5301 con excitación @365 nm; ranuras de excitación a 1.5 nm; ranuras de emisión a 1.5 nm; temperatura ambiente. La fluorescencia del copolímero fue afectada por la presencia de glucosa, pero no por la presencia de lactato o acetoacetato.
F. 9.10-b¡srN-r2-(5.5-dimetilborinan-2-il)bencin-N-r2-(2-metacroil-oxietoxi)etilamlnolmetinantraceno (monómero de metacrilato doble). Una solución de 9,10-bis(N-[2-(5,5-dlm?tilborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxi?tox¡)?tilamino]m?till-antraceno (0.100 g, 0.120 mmoles), ácido metacrílico (0.112 g, 0.110 ml, 1.30 inmoles, 10.8 equiv.), DCC (0.316 g, 1.53 mmoles, 12.8 equiv.) y N,N-dimetilaminopiridlna (0.014 g, 0.11 mmoles, 0.92 equiv.) en 5 ml de CH2CI2 se agitó a 0°C durante 1 hora, después a 23°C durante 22 horas. En este tiempo, la mezcla de reacción se filtró y se concentró por evaporación giratoria. El residuo se purificó por cromatografía en columna de alúmina (30 g de alúmina neutra activada, 0-2% CH3OH/CH2CI2) para dar 0.030 g (26%) de un sólido amarillo. Este producto se puede copolimerizar con uno o más monómßros adicionales para formar una macromoiécula indicadora. Los grupos boronato deben ser protegidos antes de usarse.
FAB EM: Calculado para CSßH7oB2N2O?o [M]+ 953; Encontrado [M]+ 951 (pico de ion molecular débil). CCD: placas básicas d? alúmina de Merck, Rf 0.67 con 95/5 CH2CI2/CH3OH, ver con UV (254/366). CLAR: Cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna de C18 Waters 5 x 100 mm NovaPak HR, 0.100 ml de inyección, 0.75 ml/min, 2 ml de asa de inyección, 370 nm de detección, A = agua (0.1% de HFBA) y B = MeCN (D. 1% d? HFBA), gradiente 10% d? B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención de 19.6 min.
G. Preparación de hidrogel de HEMA/SPE/MAA con indicador de glucosa Una solución d? mßtacrilato de hidroxietilo (HEMA, 0.078 ml, 0.084 g, 0.64 mmoles), ácido metacrílico (MAA, 0.031 ml, 0.030 g, 0.35 mmoles), dimetacrilato de poli?tilenglicol 1000 (PEGDMA, 0.5 mg/ml de solución acuosa, 0.048 ml) y N,N-dimet¡l-N-metacriloxi?til-N-(3-sulfopropil)-amonio-betaína (SPE, 0.462 g, 1.65 mmoles) en 0.900 ml de etilenglicol se preparó. 9,10-bis[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-m?tacroíloxi-etoxi)etilamino]m?til]antraceno (0.0096 g, 0.010 mmoles) y 0.020 ml d? solución acuosa al 5% en peso de persulfato de amonio se combinaron con 0.500 ml de la solución de monómero de etilßnglicol. Esta solución se colocó en una caja con guantes purgada con nitrógeno. Una solución acuosa de N.N.N'.N'-t?trametil?tilendiamina (0.040 ml, 5% en peso) se añadió a la formulación de monómero para acelerar la polimerización. La formulación resultante se vació en un molde construido d? portaobjetos de microscopio y un separador de acero inoxidable de 100 mieras. Después de mantenerse durante 8 horas en atmósfera de nitrógeno, el molde se colocó en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS, pH=7.4), los portaobjetos de microscopio se separaron y el hidrogel se removió. El hidrogßl ST lavó con 100 ml de PBS que contenía 1 mM de sal de sodio de laurilsulfato durante 3 días, la solución siendo cambiada cada día, seguida por lavado con MeOH/PBS (20/80 por vol., 3 x 100 ml) y finalmente con PBS (3 x 100 ml). El polímero de hidrogel resultante se almacenó en PBS (pH=7.4) que contenía 0.2% en peso de azida de sodio y 1 mM de sal de sodio de EDTA.
H. Modulación de fluorescencia con glucosa: Se determinó la modulación de la fluorescencia del compuesto indicador de metacrilato doble preparado en este ejemplo por glucosa. La figura 5 muestra la emisión de fluorescencia relativa (1(33427 nm) de hidrogel de HEMA/SPE (espesor de 100 mieras, preparado como se describió antes) que contenía la molécula de reconocimiento de glucosa de metacrilato doble de este ejemplo en PBS (pH de 7.4 que contenía 0.2% de NaN3 y 1 mM de EDTA) que contenía 0 a 20 mM de a-D-glucosa. Los hidrogeles se montaron sobre portaobjetos de vidrio y se cubrieron con una malla de poliéster negra (Sefar America, Dep?w, NY) en recipientes de PMMA a 45°C a la luz incidente. Todas las mediciones se hicieron a 37°C en un ßspectrofluorómetro Shimazu RF-5301 con excitación a 365 nm (ranura = 1.5 nm) y emisión a 427" nm (ranura = 1.5 nm) a alta sensibilidad usando un contenedor de muestra controlado por temperatura. Los recipientes que contenían 3 ml de la solución de glucosa deseada (0, 1 , 2, 4, 5, 10, 20 mM d? glucosa) se equilibraron a 37°C durante 30 minutos antes de ia medición. Se usó una función exponencial individual para ajustar los datos de fluorescencia en bruto.
EJEMPLO 7 Efecto de la glucosa o lactato sobre gel de acrilamlda que contiene N 3- (metbacrilamldo)propín-3.4-dlhldroxl-9.10-dioxo-2antracenosulfonamida (monómero de rolo de alizarina) v a.a'-blsfN-r2-(5,5-dÍm?tilborlnan-2- ipbencin-N-f3-(metacrllamldo propllamlnol-1 ,4-xlleno (monómero de ácido bis borónico) A. Cloruro de 3.4-dih¡droxi-9.10-dioxo-2-antracenosulfonilo Sal de sodio de ácido 3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracenosulfonico (1.4 g, 3.9 mmoles) se combinó con 30 ml d? ácido clorosulfónico y se calentó hasta 90°C durante 5 horas, después de lo cual la solución ST enfrió hasta 0°C y se vació en 100 g de hielo. Después de que se derritió el hielo, la solución se extrajo con CH2CI2 (3 x 100 ml), los extractos de cloruro de metileno se combinaron, se secaron con Na2SO4 y se evaporaron para producir 0.87 g de sólido (rendimiento de 66%). B. N-r3-(mataorilamido)prop?l1-3.4-dihidrox¡-9.10-dioxo-2-antra-censulfonamida Cloruro d? 3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfon¡lo (96 mg, 0.28 mmol?s) y clorhidrato de N-(3-aminopropil)metacrilamida (108 mg, 0.6 mmoles) se combinaron con 20 ml de CH2CI2. A esta suspensión se añadió Et3N (303 mg, 3 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas, se filtró, y el solvente se evaporó. El sólido resultante se sometió a cromatografía en columna sobre SÍO2 (10 g) con CH2CI2/MeOH (90/10) como un eluyente. El producto se obtuvo como un sólido rojo (80 mg, rendimiento de 64%). FAB EM: Calculado para C2?H20N2O7S M' 445; Encontrado M+ 445. CLAR: Cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna d? C18 Waters 5 x 100 mm NovaPak HR, 0.100 ml d? inyección, 0.75 ml/min, 2 ml de asa de inyección, 370 nm de detección, A = agua (0.1% HFBA) y B = MeCN (0.1 % HFBA), gradiente de 10% d? B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% d? B 2 min, tiempo de retención d? 17.67 min.
C. a.a'-bisf3-(m?tacrilam¡do)prop¡laminol-1.4-xileno Una solución d? sal de clorhidrato d? N-(3-aminopropil)metacrilamida (3.00 g, 16.8 mmol?s, 2.21 ßquiv.), DIEA (6.5 g, 8.8 ml, 50 mmoles, 6.6 equiv.), tereftaldicarboxald?hído (1.02 g, 7.60 mmoles) y Na2S?4 (10.7 g, 75.3 mimóles, 9.91 ?quiv.) en 75 ml de M?OH anhidro se agitó en la oscuridad a 25°C durante 18 horas. En este tiempo, ST añadió más Na2S0 (10.7 g, 75.3 mmoles, 9.91 equiv.) y la agitación se continuó durante 6 horas más. En este tiempo, la solución se filtró y se añadió NaBH4 (1.73 g, 45.7 mmoles, 6.01 ?quiv.) al filtrado en porciones y subsecuentemente se agitó a 25° durante 21 horas. La suspensión se filtró a través de C?lite y ?l filtrado se concentró. El residuo se disolvió en 100 ml de CH2CI2 y se lavó 1 x 25 ml en NaHC03 acuoso saturado. El extracto orgánico se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró y se concentró para dar un aceite viscoso. El producto se obtuvo como tal. CLAR: Cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna Vydac 201 TP 10 x 250 mm, 0.100 ml de inyección, 2.00 ml/min, 260 nm de detección, A = agua (0.1 % de HFBA) y B = MeCN (0.1 % de HFBA), gradiente: 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención de 15.8 mln.
D. a.a'-bísrN-í2-(5.5-dim?tilborinan-2-il)b?ncill-N-[3-(metacril-amldo)propilamino1-1 ,4-?ileno Una solución d? a,a'-bis[3-(m?tacrilamido)propilamino]-1-,4-xileno (2.94 g, 7.61 mmoles), DIEA (2.97 g, 4.00 ml, 23.0 mmoles, 3.02 equiv.), óstßr neopentílico de ácido (2-bromometÍlf?nÍI)borónico (6.50 g, 23.0 mmoles, 3.02 ?quiv.) y BHT (5 mg como inhibidor) en 75 ml de CH2CI2 a 25°C se agitó en la oscuridad durante 28 horas. En este tiempo, la mezcla se lavó en 1 x 25 ml de NaHCO3 acuoso saturado. El extracto orgánico se STCÓ sobre Na2S0 anhidro, se filtró y ST concentró. Al residuo se añadió 200 ml de éter y la suspensión ST agitó durante 18 horas. La suspensión se filtró y el residuo se disolvió en CH2CI2, se filtró y el filtrado se concentró. Al residuo sólido se añadió 150 ml de éter y la suspensión ST agitó durante 18 horas. En este tiempo, la suspensión se filtró dando 1.98 g (33%) de un polvo rosa esponjoso, que tiene una solubilidad máxima de 1 mmolar en PBS (f 7.4). FAB EM: Calculado para C ßHß B2N40ß [M*] 790; Encontrado [M + 1]+ 791. CLAR: Cromatógrafo HP 1100 para CLAR, columna d? C18 Waters 5 x 100 mm NovaPak HR, 0.050 ml de inyección, 0.75 ml/min, 280 nm de detección, A = agua (0.1% HFBA) y B = MeCN (0.1% HFBA), gradiente: 10% de B 2 min, 10-80% de B durante 18 min, 25 80-100% de B durante 2 min, 100% de B 2 min, tiempo de retención de 13.4 min.
E. Preparación de gel de acrilamida que contiene N-[3-(metacrilam¡do)propil1-3.4-dihidroxi-9.10-dioxo-2-antracensulfonamida (monómero de rolo de alizarina S) v a.a'-bisfN-[2-(5.5-dim?tllborinan-2-il)benc¡ll-N-í3-(metacrilamido)propilamino1-1. 4-xileno Una solución de etilenglicol que 30% en peso de acrllamida y 0.8% en peso de N.N'-metlI?nbisacrilamida se preparó. N- [3- (metacrilamldo)-propil]-3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfonamida (1.5 mg, 3.38 x 10"6 moles) and a,a'-bls[N-[2-(5,5-dimetil-borinan-2-i])b?nc¡l]-N-(3- (m?tacrilamido)propilamino]-1 ,4-xileno (28 mg, 3.54 x 10"5 moles) ST combinaron con 800 µl de solución d? monómero de etilenglicol y 40 µl de persulfato de amonio acuoso al 5% en peso. Esta formulación se colocó en una caja de guantes purgada con nitrógeno junto con un molde construido de portaobjetos de vidrio para microscopio y un separador de acero inoxidable de 100 mieras. Una solución acuosa de N.N.N'.N'-tetrametiletilendiamina (40 µl, 5% en peso) se añadió a la solución de monómero para acelerar la polimerización y la formulación final se vació en un molde de vidrio. El molde se dejó bajo atmósfera de nitrógeno durante 16 horas, después de lo cual se sumergió en PBS (pH=7.4) y los portaobjetos de vidrio ST separaron para dar un polímero de hidrogel en forma de una película delgada. La película delgada de hidrogel resultante ST lavó con 100 ml de solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 1 mM de sal de sodio de laurilsulfato durante 3 días, la solución siendo cambiada cada día, seguida por lavado con MeOH/PBS (20/80 por vol., 3 x 100 ml), y finalmente con PBS (pH=7.4, 3 x 100 ml). El polímero de hidrogel ST almacenó en PBS (10 mM PBS, pH=7.4) que contenta 0.2% en peso de azida de sodio y 1 mM de sal de sodio de EDTA.
F. Modulación de absorbancia con glucosa y lactato La modulación de la absorbancia del hidrogel indicador (que contiene dos elementos de reconocimiento) preparados en este ejemplo por glucosa y lactato se determinó. El gel de acrilamida se montó en una celda de PMMA de la misma forma como se describe en el ejemplo 5. La solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS), pH=7.4 que contiene la cantidad deseada de glucosa o lactato de sodio se calentó a 37°C en un baño de agua y se colocó en la celda de PMMA que contenía el gel después de lo cual la celda de PMMA se dejó equilibrar durante 15 minutos a 37°C. La medición d? absorbancia para cada concentración de glucosa o lactato ST condujo por triplicado. Para cada medición, la absorbencia a 650 nm se usó como un blanco, A (650 nm). Se sustrajo de todos los valores de A (450nm) y A (530 nm). La figura 7 muestra los espectros de absorbancia para gel de acrilamida (30%) que contenía 4 mM de monómero de rojo de alizarina S (relación molar de 1 :1000 de rojo de alizarina:acrilamida) y 44 mM de monómero de ácido bis-borónico con y sin glucosa. La figura 7 muestra el efecto de la glucosa sobre la absorbancia de gßl d? acrilamida (30%) que contenía 4 mM de monómero de rojo de alizarina S y 44 mm de monómßro de ácido bis-borónico. La figura 8 muestra el efecto de lactato de sodio sobre la absorbancia de gel de acrilamida (30%) que contenía 4 mM de monómero de rojo de alizarina S y 44 mm d? monómero de ácido bis-borónico (relación molar de 1:95 de monómero de ácido borónico:acrilamida). La absorbancia del indicador fue afectada por la presencia de glucosa, pero no sustancialmente afectada por la presencia de lactato.

Claims (59)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una macromolécula indicadora para detectar la presencia o concentración de un analito en un ambiente acuoso, dicha macromolécula comprendiendo un copolímero de: a) uno o más monómeros de componente indicador que individualmente no son suficientemente solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho analito; y b) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolócula TS capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso.
2.- La macromolócula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la macromolócula es capaz de la detección por un cambio óptico.
3.- La macromolócula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el monómero de componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronobenc¡l)amino?tilantraceno.
4.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el monómero de componente indicador se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-metilacriloil-aminopropil-N-(o-boronobencil)amino]-m?til]antrac?no; 9-[N-[2-(5.5-dimetil-borinan-2-il)bencil]-N-[3-(m?tacrilamldo)?ropilamino]m?til]-10-[N-[2-(5,5- d¡m?tilborinan-2-il)bencilJ-N-[2-(2-hidroxi?toxi)-?tilamino]m?til]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]met¡l]-10-[N-[2-bromo-b?nc¡l)-N-[2-(2-hÍdroxi?toxi)-?tilamino]m?til]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncll]-N-[3-(m?tacrilam¡do)propilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[3-(m?tacrilamido)-propilamino]m?til] antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilbor¡nan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-metacriloxi?toxi)-?tilamino]m?til]-10-[N-[2-(5,5-dlm?tllbor¡nan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacriloxietoxi)etil-amino]metil]10-[N-[2-boronobencil)-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]-antraceno; 9,10-bls[N-[2-(5,5-dim?tilbor¡nan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-metacrllox¡-etoxl)?tilamino]metil] antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacriloxietoxi)etllamino]metil] antraceno; N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfonamida; a,a'-bis[N-[2-(5.5-dimet¡lborinan-2-il)bencil]-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]-1,4-xileno; y sales o derivados de los mismos.
5.- La macromolócula indicadora de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(metilacr¡loilamino)-propil]trim?tilamonio.
6.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el monómero del componente indicador se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo pollaromátlco.
7.- La macromolócula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la relación molar de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 1000:1.
8.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la relación de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 5:1 a aproximadamente 50:1.
9.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la relación de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de aproximadamente 5:1.
10.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anaiito detectado se selecciona del grupo que consiste de diol vicinal; a-hidroxiácido; ß-cetoácido; oxígeno; dióxido de carbono; iones de zinc, potasio, hidrógeno o carbonato; una toxina; un mineral; y una hormona.
11.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el analito detectado es un diol vecinal que comprende un sacárido.
12.- La macromolócula indicadora de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque el sacárido es glucosa.
13.- La macromolécula indicadora de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque i) la relación molar de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ¡i) el monómero del componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronob?ncll)amino]-m?til]antraceno, lii) el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(metilacriloilamino)-propil]trimetilamonio, y iv) la macromolécula presenta un efecto de excímero.
14.- Un método para la producción de una macromolócula indicadora para detectar la presencia o concentración de un analito en un ambiente acuoso, dicho método comprendiendo la copolimerización de: a) uno o más monómeros de componente indicador que individualmente no son suficientemente solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho analito; y b) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolécula es capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la macromolécula es capaz de la detección por un cambio óptico.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el monómero de componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronobencil)aminoetilantraceno.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el monómero de componente indicador se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-metilacriloilaminopropil-N-(o-boronobencil)amino]-metll]antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)bencil]-N- [3-(m?tacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-?tilamino]m?til]antraceno; 9-[N-(2-borono-bencil)-N-[3- (metacrilamido)-propilamino]m?til]-10-[N-[2-bromob?ncil)-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)bencil]-N-[3-(metacrilamido)propilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronob?ncil)-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]m?til] antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dim?tilbor¡nan-2-il)bencil]-N-[2-(2-m?tacrilox¡?toxi)?tilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-hidroxletoxl)-etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-m?tacriloxi?tox¡)?tilamino]metil]10-[N-[2-boronobencil)-N-[2-(2-hidroxi?toxi)-?tilamino]met¡l]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-d¡metilborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-metacrilox¡etoxi)?t¡lamino]metll] aptraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacriloxietoxi)?tilamino]-metiljantraceno; N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-dihidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfonamida; a,a'-bis[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)bencíl]-N-[3-(metacrilamido)-propilamino]-1 ,4-xileno; y sales o derivados de los mismos.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(m?tilacriloilamino)-propil]trimetilamonio.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el monómero del componente indicador se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo poliaromático.
20.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la relación molar de monómero hidróf?lo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 1000:1.
21 .- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la relación de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 5:1 a aproximadamente 50:1.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la relación de monómero h¡drófilo:monómero del componente indicador es de aproximadamente 5:1 .
23.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el analito detectado se selecciona del grupo que consiste de diol vicinal; a-hidroxiácido; ß-cetoácido; oxígeno; dióxido de carbono; iones de zinc, potasio, hidrógeno o carbonato; una toxina; un mineral; y una hormona.
24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el analito detectado es un diol vecinal que comprende un sacárido.
25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el sacárido es glucosa.
26.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque i) la relación molar de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ii) el monómero del componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronobencil)amino]-m?til]antraceno, iil) el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(metilacriloilamÍno)-prop¡l]trimetilamonlo, y iv) la macromolécula presenta un efecto de excímero.
27.- Un método para detectar la presencia o concentración de un analito en una muestra que tiene un ambiente acuoso, dicho método comprendiendo: a) exponer la muestra a una macromolócula Indicadora, dicha macromolócula comprendiendo un copolímero de: i) uno o más monómeros de componente indicador que individualmente no son suficientemente solubles en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración de dicho analito; y Ii) uno o más monómeros hidrófilos; de tal manera que la macromolécula resultante es capaz de detectar la presencia o concentración de dicho analito en un ambiente acuoso, y en donde la macromolécula indicadora tiene una calidad detectabl? que cambia de una manera dependiente de la concentración cuando dicha macromolócula es expuesta al analito; y b) medir cualquier cambio en la calidad detectable para determinar así la presencia de concentración de dicho analito en la muestra.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el cambio en dicha calidad detectable es un cambio óptico.
29.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el monómero de componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronobencil)aminoetilantraceno.
30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el monómero de componente indicador se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-m?tilacriloilaminopropil-N-(o-boronobencil)amino]-metil]antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)b?ncÍI]-N-[3-(metacrilamido)propilam¡no]metil]-10-[N-[2-(5l5-dim?tilborinan-2-il)benc¡l]-N-[2-(2-hidrox¡etoxi)-etilamino]metil]antraceno; 9-[N-(2-borono-bencil)-N-[3- (metacrilamido)-propilamino]met¡l]-10-[N-[2-bromob?ncil)-N-[2-(2-hidroxietoxí)-?tilamipo]m?til]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncil]-N-[3-(m?tacrilamido)propilamino]m?tll]antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencH)-N-[3-(metacr¡lam¡do)-propilamipo]metil] antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimet¡lborinan-2-ll)b?ncil]-N-[2-(2-m?tacriloxietoxi)etilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-hidroxi?toxi)-et¡lamino]m?til]antraceno; 9-[N-(2-boronobepcil)-N-[2-(2-metacriloxi?toxi)etilamino]metil]10-[N-[2-boronob?ncil)-N-[2-(2-hidroxi?tox¡)-?tilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimet¡lborinan-2-il)bencÍI]-N-[2-(2-m?tacriloxietoxi)?tilamino]metil] antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacriloxi?toxí)etilamino]-metil] antraceno; N-[3-(metacrilamido)-prop¡l]-3,4-d¡hidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfonamida; a,a'-bis[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)bencil]-N-[3- (metacrilamido)-propilamino]-1 ,4-xlleno; y sales o derivados de los mismos.
31.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(metilacrlloilamlno)-propll]trimetilamonio.
32.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el monómero del componente indicador se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo poliaromático.
33.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la relación molar de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 1000:1.
34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la relación de monómero hldrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 5:1 a aproximadamente 50:1.
35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la relación de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de aproximadamente 5:1.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque el analito detectado se selecciona del grupo que consiste de sacárido; oxígeno; dióxido de carbono; y iones de zinc, potasio, hidrógeno o carbonato.
37.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el analito detectado es un sacárido.
38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el sacárido es glucosa.
39.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque i) la relación molar de monómero hidrófilo:monómero del componente indicador es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ¡i) el monómero del componente indicador comprende un derivado de N-(o-boronobencil)amino]-m?til]antraceno, iii) el monómero hidrófilo comprende cloruro de [3-(met¡lacriloilamino)-propil]tr¡metilamonlo, y iv) la macromolócula presenta un efecto de excímero.
40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la macromolócula sirve como indicador y como una referencia.
41.- Una macromolócula que es capaz de presentar un efecto de excímero, que comprende un copolímero de: a) uno o más monómeros formadores de excímero, las moléculas son capaces de presentar un efecto de exclmero cuando se orientan adecuadamente unas con respecto a otras; y b) uno o más monómeros adicionales; de tal manera que la macromolécula resultante presenta dicho efecto de excímero.
42.- La macromolócula de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque la macromolócula es capaz de detectar la presencia o concentración del analito.
43.- La macromolócula de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque a) el monómero formador de excímero individualmente no es suficientemente soluble en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración del analito; y b) el otro monómero es un monómero hidrófilo; de tal manera que la macromolécula es capaz de detectar la presencia o concentración del analito en un ambiente acuoso.
44.- La macromolócula de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el efecto de excímero no cambia sustancialmente en respuesta a cambios en la presencia o concentración del analito.
45.- La macromolécula de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque I) la relación molar de otro monómero:monómero formador de excímero es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ii) el monómero formador de excímero comprende un derivado de N-(o-boronobencil)am¡no]-met¡l]antraceno, iii) el otro monómero comprende cloruro de [3-(met¡lacriloilamino)-propil]trimetilamonio.
46.- La macromolócula de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque el monómero formador de excímero se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo poliaromático.
47.- La macromolócula de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque el monómero formador de excímero se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-metilacriloilaminopropil-N-(o-boronobencil)amino]-m?til]antraceno; 9-[N-[2-(5,5-dlmetilborinan-2-il)b?ncil]-N-[3-(m?tacrilamido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-ll)benc¡l]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-?tilamino]m?til]antrac?no; 9-[N-(2-borono-bencil)-N-[3- (metacrilamido)-propilamino]m?til]-10-[N-[2-bromob?ncil)-N-[2-(2-hidroxÍ?tox¡)-etllamino]m?til]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dim?t¡lborinan-2-il)bencil]-N-[3- (m?tacr¡lamido)?ropilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[3-(metacrllamido)-propilamino]metil] antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-¡l)b?ncil]-N-[2-(2-metacr¡lox¡etoxi)et¡lamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)bencil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antrac?no; 9-[N-(2-boronob?ncil)-N-[2-(2-metacriloxietoxi)?tilaminoJmetil]10-[N-(2-boronob?ncil)-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dim?tilborinan-2-¡l)bencil]-N-[2-(2-metacriloxietoxi)?tilamino]metil] antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronob?ncil)-N-[2-(2-m?tacrilox¡etox¡)etilamino]-metil] antraceno; N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-dihidroxi-9, 10-dioxo-2-antracensulfonamida; a,a'-bís[N-[2-(5.5-d¡m?tilborinan-2-¡l)bencil]-N-[3- (m?tacrilamido)-propilamino]-1,4-xil?no; y sales o derivados de los mismos.
48.- Un método para producir una macromolócula que es capaz de presentar un efecto de excímero, dicho método comprendiendo la copolimerización de: a) uno o más monómeros formadores de excímero, las moléculas son capaces de presentar un efecto de excimero cuando se orientan adecuadamente unos con respecto a otros; y b) uno o más monómeros adicionales; de tal manera que la macromolócula resultante presenta dicho efecto de excímero.
49.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque la macromolócula es capaz de detectar la presencia o concentración del analito.
50.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque a) el monómero formador de excímero individualmente no es suficientemente soluble en agua para permitir su uso en un ambiente acuoso para detectar la presencia o concentración del analito; y b) el otro monómero es un monómero hidrófilo; de tal manera que la macromolécula es capaz de detectar la presencia o concentración del anallto en un ambiente acuoso.
51.- El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque el efecto de excímero no cambia sustancialmente en respuesta a cambios en la presencia o concentración del analito.
52.- El método de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque i) la relación molar de otro monómero:monómero formador de excímero es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ii) el monómero formador de excimero comprende un derivado de N-(o-boronobencil)amino]-metil]antraceno, iii) el otro monómero comprende cloruro de [3-(m?tilacriloilamino)-prop¡l]tr¡metilamonio.
53.- El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado además porque el monómero formador de excímero se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo poliaromático.
54.- El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado además porque el monómero formador de excímero se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-metilacrilo¡laminopropil-N-(o-boronob?ncil)am¡no]-m?til]antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)bencil]-N- [3-(m?tacr¡lamido)propilamino]metilJ-10-[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncÍI]-N-[2-(2-hidroxi?toxi)-?tilamino]m?tll]antraceno; 9-[N-(2-borono-bencil)-N-[3- (m?tacrilamido)-propilamino]metil]-10-[N-[2-bromobenc¡l)-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]m?til]antrac?no; 9,10-bis[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncil]-N-[3-(metacr¡lamido)propilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[3-(m?tacrilamÍdo)-propilamino]metil] antraceno; 9-[N-[2-(5.5-dimetilborinan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-m?tacriloxi?tox¡)etilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-¡l)bencil]-N-[2-(2-hidroxi?toxi)-?tllamino]met¡l]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-m?tacriloxi?toxi)?tilamino]m?til]10-[N-[2-boronobencil)-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metil]antraceno; 9,10-bis[N-[2-(5,5-d¡metilborinan-2-¡l)bencil]-N-[2-(2-metacriloxi?toxi)etilamino]m?til] antraceno; 9,10-bis[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacrlloxietoxi)etilamino]-metil] antraceno; N-[3-(metacrilamido)-propil]-3,4-d¡hidroxi-9,10-dioxo-2-antracensulfonamida; a.a'-bistN-p-ÍS.d-dimetilborinan-S-i benciri-N-ß-(metacrilamido)-propilamino]-1 ,4-xileno; y sales o derivados de los mismos.
55.- Un método para detectar la presencia o concentración de un analito en una muestra, dicho método comprendiendo: a) exponer la muestra a una macromolócula indicadora, dicha macromolócula comprendiendo un copolímero de: i) uno o más monómeros de componente indicador, cuyas moléculas son capaces de presentar un efecto de excímero cuando se orientan adecuadamente unas con respecto a otras, y las cuales son capaces de detectar la presencia o concentración del analito; y ii) uno o más monómeros adicionales; de tal manera que la macromolécula resultante presenta dicho efecto de exclmero, y en donde la macromolócula tiene una calidad detectable que cambia de una manera dependiente de la concentración cuando dicha macromolócula se expone al anallto; y b) medir cualquier cambio en la calidad detectable para determinar así la presencia o concentración del analito en la muestra.
56.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el efecto de excímero no cambia sustancialmente en respuesta a cambios en la presencia o concentración del analito.
57.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque i) la relación molar de otro monómero:monómero formador de excímero es de alrededor de 2:1 a aproximadamente 15:1 , ii) el monómero formador de excímero comprende un derivado de N-(o-boronobenc¡l)amino]-m?til]antraceno, iii) el otro monómero comprende cloruro de [3-(metilacriloilamino)-propil]trim?tilamon¡o.
58.- El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el monómero formador de excímero se selecciona del grupo que consiste de un quelato de lantánido y un hidrocarburo poliaromático.
59.- El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque el monómero formador de excfmero se selecciona del grupo que consiste de 9-[[N-metilacriloilamino?ropil-N-(o-boronob?ncÍI)amino]-metil]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[3-(m?tacril- amido)propilamino]metil]-10-[N-[2-(5,5-dimetilborinan-2-il)b?ncil]-N-[2-(2-hidroxietoxi)-etilamino]metíl]antraceno; 9-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-metacril-oxietoxi)etilamino]metil]10-[N-(2-boronobencil)-N-[2-(2-h¡droxietox¡)-?t¡lamino]m?til]antraceno; y 9,10-bis[N-(2-boronobenc¡l)-N-[2-(2-m?tacriloxi-etoxi)?tilamino]metil] antraceno; y sales o derivados de los mismos.
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