MXPA02009660A - Antagonistas del receptor de quimiocina. - Google Patents

Abstract

Se describen los compuestos del tipo acido tetramico novedosos, aislados a partir del complejo activo CCR-5 producido mediante la fermentacion bajo condiciones controladas de un cultivo biologicamente puro del microorganismo, de Chaefomium globoso Kunze SCH 1705, ATCC 74489, composiciones farmaceuticas que contienen los compuestos y el uso de los compuestos antagonistas del CCR-5 y composiciones para tratar infecciones de VIH en humanos.

Description

ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE QU1MIOCINA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención describe compuestos del tipo ácido tetrámico novedosos, composiciones farmacéuticas que los contienen y su uso como antagonistas del CCR-5 para el tratamiento de infecciones del virus-1 de inmunodeficiencia humana ("VIH -1") en humanos. Los compuestos de esta invención se aislan a partir de un complejo activo CCR-5 que se produce a través de la fermentación, bajo condiciones controladas, de un cultivo biológicamente puro del microorganismo, Chaetomium globoso Kunze SCH 1705, ATCC 74489. M.P. Singh et al., The Journal of Antibiotics. Dec. 1998, Vol. 51 , No. 12, p 1109-1112 describe antibióticos novedosos producidos a través de hongos desconocidos y que incluye LL-49F233d que contiene un radical del ácido N-metil tetrámico unido a una estructura de hidrocarburo bicíclico. Estos antibióticos se describen como activos contra la bacteria resistente a vancomicina y meticilina pero no se describe actividad anti-H1V-1. S.B. Singh et al., Tetrahedron Letters. 39 (1998) 2243-2246 describe que los derivados del ácido N-metil tetrámico, equisetina y fomasetina, que se aislan a partir de extractos microbianos, son inhibidores de la VIH-1 integrasa. Tampoco la referencia describe los compuestos de la presente invención.

A-M. Vandamme et al., Antiviral Chemistrv & Chemotherapy, 9:187-203 (1998) describe tratamientos clínicos comunes de infecciones de VIH -1 en nombres que incluyen al menos combinaciones de tres fármacos o la llamada terapia antiretroviral altamente activa ("HAART"); HAART involucra varias combinaciones de inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósido ("NNRTI"), e inhibidores ("Pl") y de la VIH proteasa. En pacientes sin tratamiento previo que cumplen con el tratamiento con el fármaco, HAART es efectivo para reducir la mortalidad y el avance del VIH-1 a SIDA. Sin embargo, estas terapias de fármacos múltiples no eliminan el VIH-1 y usualmente el tratamiento a largo plazo resulta en una resistencia a los fármacos múltiples. El desarrollo de nuevas terapias con fármacos para proporcionar un mejor tratamiento del VIH -1 permanece como una prioridad. El receptor de quimiocina CCR5 se ha identificado como el co-receptor de la entrada del VIH-1 en las células. Por lo tanto, los antagonistas del CCR5 que interfieren con la interacción entre el receptor CCR5 y VIH-1 pueden bloquear ia entrada del VIH-1 en la célula. La crisis en la salud global provocada por el VIH-1 , que es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), no es cuestionada, y mientras recientes avances de terapias con fármacos han sido exitosos para retardar el progreso del SIDA, existe una necesidad de encontrar nuevas terapias con fármacos para controlar las infecciones de VIH- BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención abarca Chaetomium globoso Kunze SCF 1705, ATCC 74489 y mutantes y variantes del mismo, que tienen características de identificación del Chaetomium globoso Kunze. Otro aspecto de la invención proporciona el complejo activo CCR5 producido a través de la cultivación de una cepa biológicamente pura de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705 que tiene las características de identificación de Chaetomium globoso Kunze ATCC 74489 en un medio con un pH y temperatura controlados, que tiene fuentes presumibles de carbono y nitrógeno bajo condiciones aeróbicas sumergidas hasta producir una composición de materia que tenga una actividad anti VIH-1 substancial. La presente invención también se refiere a tres componentes del complejo activo CCR5, es decir, compuestos representados mediante las fórmulas I, II y lll.

II, o en forma sustancial y químicamente pura, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. La presente invención describe métodos para usar compuestos de fórmulas I, II ó lll -los cuales son antagonistas del CCR5- como una monoterapia o en asociación con interferón-alfa pegilado para tratar pacientes que tienen infecciones del tipo-1 del virus de inmunodeficiencia ("VIH-1"). La presente invención también describe métodos para el tratamiento de pacientes que tienen infecciones de VIH-1 al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de HAART en asociación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de -fórmulas I, II ó lll suficiente para disminuir VIH-1-ARN. La presente invención presente también describe métodos para el tratamiento de pacientes que tienen infecciones de VIH-1 al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa pegilado en asociación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmulas I, II ó lll suficiente para disminuir -1-ARN. La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de pacientes pediátricos que tienen infecciones de VIH-1 que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa pegilado en asociación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista del CCR5 representado por la fórmula estructural I ó II ó III. La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de pacientes infectados con VIH-1 y HCV que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa pegilado en asociación con una cantidad terapéuticamente efectiva de ríbavirina y una cantidad terapéuticamente efectiva de HAART y una cantidad terapéuticamente de un antagonista del CCR5 representado por la fórmula estructural I ó II ó lll. en forma sustancial y químicamente pura, a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1 a 9 muestran detalles del cultivo biológicamente puro: Chaetomium globoso Kunze SCF 1705 desarrollado en agar synthetischer náhrstoffármer (SNA). La figura 1 muestra la hifa enroscada en el peritecio, observada a través del microscopio compuesto. La figura 2 muestra un órgano que produce esporas simples bajo el microscopio compuesto, que muestra el peritecio cubierto por hifas enroscadas y rectas. La figura 3 muestra órganos que producen esporas creciendo en papel filtro. Las figuras 4 y 5 muestran un peritecio simple bajo un microscopio de disección, que muestra las hifas enroscadas, grises que cubren el peritecio negro. La figura 6 muestra un cirro negro de esporas que emergen de un peritecio. La figura 7 muestra hifas enroscadas en el peritecio, observadas en alto poder con el microscopio de disección. La figura 8 muestra detalles de la hifa enroscada y la incrustación similar a un cristal. La figura 9 ascosporas que tienen una forma similar a un limón y un poro sencillo en un extremo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El microorganismo El microorganismo usado para la producción del complejo activo CCR5 y los compuestos representados a través de las fórmulas I; II y lll es un cultivo biológicamente puro de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705, ATCC 74489. Un cultivo viable de este microorganismo se ha depositado (21 de abril de 1999) en la colección del American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University BIvd., Manassas, VA 20110-2209 donde se ha asignado el número de acceso ATCC 74489. El cultivo depositado puede perderse, destruirse o no estar disponible durante más de 30 años a partir de la fecha del cultivo en que se depositó o un periodo de 5 años después del último requerimiento del cultivo depositado, o la vida efectiva de la patente que se emite de esta solicitud, el cultivo será reemplazado, sobre aviso, para los solicitantes o cesionarios de esta solicitud. Los subcultivos de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705, ATCC 74489 están disponibles durante la suspensión de esta solicitud hasta que sea determinado a través del Comisionado Asistente de Patentes y Marcas Registradas titulada bajo 37CFR 1.14 and 35USC 122 y que estará disponible al público, sin restricción una vez que la patente de E.U.A, basada en esta solicitud, sea otorgada. El uso del microorganismo es dependiente de las leyes de patente de E.U.A.

El microorganismo producido se aisla a partir de una muestra de hoja de plantas siempre verdes colectadas en Tuscan Arizona como un hongo no identificado. Se ha caracterizado y encontrado que tiene las propiedades microscópicas, macroscópicas y de hidrólisia celular total del género Chaetomium.

Descripción de la cepa de producción chaetomium globoso kunze scf 1705. atcc 74489 Morfología Las observaciones morfológicas de la cepa de producción de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705 se realizan en la siguiente descripción estandarizada del agar de SNA (synthetischer náhrstofármer agar), formulado como sigue: Glucosa 0.2 g Sacarosa 0.2 g Agar 20.0 g dH2O 1000 mL Las piezas de papel de filtro estéril (cerca de 5 cm netos) se colocan en la su jpp erficie del agar después de que ha solidificado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS Las colonias crecen de 50 a 70 mm de diámetro en SNA después de 10 días a temperatura ambiente (en un ciclo de 12 horas de obscuridad: 12 horas de luz, con una luz de una mezcla de casi UV y fluorescente), que comprende de peritecia (órganos que producen esporas sexuales) esparcida sobre la mayor parte de la superficie (ver figura 3), concentrada cerca del inoculo y alrededor del borde del papel filtro, después en anillos concéntricos indefinidos hacia fuera, con un poco de micelio aéreo y el micelio sumergido no pigmentado e no conspicuo. La peritecia (ver figuras 2,4 y 5) superficial, fácilmente eliminada del substrato, simple, dispersada o en masas continuas, olivácea en una vista superficial, pero negra actualmente y cubierta con una capa densa de hifas grisáceas enroscadas y rectas que se proyecta 300-400 µM más allá de la pared peritecial, resultando en color oliváceo y apariencia velluda, altura de 700-1250 µM y anchura de 700-1100 µM que incluye los cabellos superficiales, cerca de 300-600 x 125-350 µM excluyendo las hifas superficiales. La parte negra del peridio (pared peritecial) en la vista superficial, comprende de una hepidermoidea textura (arreglo en forma de rompecabezas) de células cafés de anchura de 2.5-4 µM, con paredes ligeramente gruesas, ligeramente accidentadas. Las hifas que cubren el peridío de los dos tipos, ambas con septums esparcidos; la primera que se forma es recta y emerge de la base del peritecio; la segunda que se forma es enroscada elicoidalmente, anchura de 2.5-3.5 µM (ver figuras 1 y 7), con paredes ligeramente gruesas y con un grosor sin uniformidad cubiertas con cristales pequeños, que resultan en una apariencia superficial de espinosa a verrugosa (ver figura 8). Asci (estructuras que contienen esporas) no vista, se asume que es delicuescente. Las ascoporas (esporas sexuales) 9.5-10.5 x 8-9 µM, con paredes ligeramente gruesas, lisas, oliváceas, en forma ligeramente de limón, con un poro con una anchura de 1 µM en un extremo ( ver figura 9). Las ascoporas se mantienen en conjunto en forma de un cuerno, las masas negras llamadas chirrhi (fig.6), de hasta 300 µM de longitud y 50-125 µM de anchura. El término "sales farmacéuticamente aceptables del mismo" como se usa aquí se refiere a las sales formadas a través de los compuestos de contacto de las fórmulas I a lll con bases farmacéuticamente aceptables. Las bases farmacéuticamente aceptables que son adecuadas para su uso en la presente invención son aquellas que forman sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de las fórmulas I, II ó lll e incluyen bases orgánicas e inorgánicas adecuadas. Las bases orgánicas adecuadas incluyen aminas de alquilo primarias, secundarias y terciarias, alcanol aminas, aminas aromáticas, aminas alquil-aromáticas y aminas cíclicas. Las aminas orgánicas ejemplares incluyen bases farmacéuticamente aceptables seleccionadas de la cloroprocaína, procaína, piperazina, glucamina, N-metilglucamina, N,N-dimetilglucamina etilenodiamina, dietanolamina, diisopropilamina, dietilamina, N-benzil-2-feniletilamina, N-N'- dibenziletilenodiamina, colina, clemizol, tris(hidroximetil)-aminometano, o D-glucosa-amina. Las bases orgánicas preferidas incluyen N-metil glucamina ("NMG"), dietanolamina, y tris(hidroximetil)aminometano ("TRIS"). Se ha reportado que el gen CCR5 tiene un papel importante en la resistencia a la infección del VIH. La infección del VIH inicia al unir el virus a una membrana celular objetivo a través de la interacción con el CD4 del receptor celular y una molécula co-receptora de quimiocina secundaria, y que procede a través de la replicación y diseminación de células infectadas a través de la sangre y otros tejidos. Existen varios receptores de quimiocina, pero para el VIH macrófago-trópico, que se cree es la cepa patogénica clave que replica in vivo en las etapas iniciales de infección, el receptor principal de quimiocina requerido para la entrada del VIH-1 en la célula es CCR5. Por lo tanto, interfiriendo con la interacción entre el CCR5 del receptor viral y el VIH pueden bloquear la entrada del VIH- en la célula. Los términos "compuesto antagonista del CCR5" y "antagonistas del CCR5" como se usa aquí significan cualquier compuesto que interfiere con la interacción entre el CCR5 del receptor viral y el VIH-1 para bloquear la entrada del VIH-1 en la célula. Se presentan pruebas, por ejemplo la Prueba de Unión de la Membrana CCR5, la Entrada del VIH-1 y las Pruebas de Replicación de Entrada del VIH-1 , entre otros, aquí para identificar un compuesto como un antagonista del CCR5 y para determinar su actividad antagonista del CCR5.

El presente método para tratar pacientes que tienen infecciones del VIH-1 comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antagonista del CCR5 representado mediante la fórmula estructural I ó II, ó lll en asociación con una cantidad terapéuticamente de interferón-alfa pegilado, o en asociación con una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de ribavirina, interleucin-2("IL-2"), interleucin-12("IL-12"), y pentafusida sola o en combinación con una terapia de anti-VIH-1 , especialmente, HAART de acuerdo con una buena practica clínica para minimizar los niveles de plasma de VIH-1-ARN. Ver por ejemplo A-M. Vandamme et al., in Antiviral Chemistry & Chemotherapy, 9:187-203 (1998) y Drugs fro HIV Infection" in The Medical Letter. Vol. 39 (emisión 1015) Diciembre 5, 1997, páginas 111-116. En un aspecto preferido de la invención, la combinación de un ¡nterferón-alfa pegilado y un antagonista del CCR5 de fórmulas I a lll se administra a un paciente infectado con VIH-1 , o co-infectado con VIH-1 y HCV, en asociación con ribavirina y HAART. Un aspecto especial de la presente invención es que cada uno del interferón-alfa pegilado, los antagonistas del CCR5 de fórmulas I a lll y los componentes de HAART tienen mecanismos diferentes de acción en el tratamiento del VIH-1. Es otro aspecto especial de la presente invención es que ¡nterferón-alfa pegilado y los antagonistas del CCR5 de fórmulas I a lll no causan una resistencia cruzada uno con otro o con los componentes de HAART. La iniciación de la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación de un ¡nterferón-alfa pegilado, ribavirina, y un compuesto antagonista del CCR5 representado a través de la fórmula estructural I ó II ó lll y HAART puede ocurrir antes, después o concurrentemente con la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de combinación de un ínterferón-alfa pegilado y un compuesto antagonista del CCR5 representado a través de la fórmula estructural I ó II ó lll de acuerdo con la presente invención. En una modalidad de la presente invención, el método para tratar paciente que tienen infecciones del VIH-1 comprenden dos períodos de tratamiento. En el primer período de tratamiento, una combinación de una cantidad terapéuticamente efectiva de ¡nterferón-alfa pegilado y un antagonista del CCR5 representado a través de la fórmula estructural I ó II ó lll se administra para un primer periodo de tratamiento suficiente para disminuir los niveles de plasma de VIH-1-ARN, preferiblemente a través de una poder de diez, más preferiblemente al menos dos poderes de diez. Es decir, al menos 102, inferior que ei nivel de plasma de VIH-1 -ARN inicial. En el segundo período de tratamiento, el método ocasiona la continua administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una combinación de interferón-alfa pegilado en asociación con un compuesto antagonista del CCR5 representado mediante la estructura I ó II ó lll y una cantidad terapéuticamente efectiva de HAART de acuerdo con buenas practicas clínicas para minimizar los niveles de plasma de VIH-1-ARN. A-M. Vandamme et al., Antiviral Cehmistrv & Chemoterapy, 9:187-203 (1998) describe tratamiento clínicos comunes de infecciones de VIH-1 , incluyendo cuando la terapia de múltiples fármacos inicia y cuando los fármacos se combinan. La terapia de tres fármacos puede incluir dos NRTIs y un Pl, pero existen muchos puntos a considerarse en la elección de la HAART precisa para cualquier paciente. Ver por ejemplo, los cuadros 1 y 2 y la figura en A-M. Vandamme et al., listada anteriormente. El término "pacientes que tienen infecciones de "VIH- como se usa aquí significa cualquier paciente, incluyendo un paciente pediátrico que tiene una infección de VIH-1 e incluye tratamiento, pacientes sin tratamientos previos y pacientes que ya han experimentado este tratamiento que tienen la infección del VIH-1 así como también pacientes sin tratamiento previo y pacientes que ya han experimentado el tratamiento co-infectados con el VIH-1 y el virus de hepatitis C ("HCV). El término "paciente pediátrico" como se usa aquí significa un paciente menor de 17 años, y normalmente incluye aquellos de 16 años de edad. El término "pacientes sin tratamiento previo" como se usa aquí significa pacientes que tienen VIH-1 o co-infectados con VIH-1 y HCV que nunca han sido tratados con algún fármaco anti-retroviral, por ejemplo NRTI, NNRTI, Pl o cualquier interferón, incluyendo pero sin limitarse a interferón-alfa, o interferón-alfa pegilado. El término "pacientes que han experimentado el tratamiento" como se usa aquí significa aquellos pacientes que tienen VIH-1 o coinfectados con el VIH-1 y HCV que han iniciado alguna forma de terapia anti VIH incluyendo, pero sin limitarse a HAART o alguna forma de terapia anti- HCV incluyendo, pero sin limitarse a ¡nterferón-alfa, ¡nterferón-alfa pegilado o ribavirina. El término "pacientes que tienen infecciones de hepatitis C" como se usa aquí significa cualquier paciente, incluyendo un paciente pediátrico, que tiene hepatitis C y que incluye pacientes sin tratamiento previo que tienen infecciones de hepatitis C y pacientes que han experimentado el tratamiento que tienen hepatitis C así como aquellos pacientes pediátricos, sin tratamiento previo y pacientes que ya han experimentado el tratamiento, que tienen infecciones de hepatitis C crónicas. Estos pacientes que tienen hepatitis C incluyen aquellos que están infectados con genotipos múltiples HCV ¡ncluyendo el tipo 1 así como aquellos infectados con, por ejemplo, genotipos HCV 2, 3, 4, 5 y 6 y otros genotipos HCV. El término "pacientes sin tratamiento previo que tienen infecciones de hepatitis C" como se usa aquí significa pacientes con hepatitis C que nunca se han tratado con ribavirina o algún interferón, que incluyen pero sin limitarse a interferón-alfa, o interferón-alfa pegilado. El término "pacientes que han experimentado el tratamiento que tienen infecciones de hepatitis C" como se usa aquí significa pacientes con hepatitis C que ya se han tratado con ribavirina o con cualquier interferón, incluyendo pero sin limitarse a interferón-alfa, o interferón-alfa pegilado, incluyendo los que sufrieron una recaída y los no respondedores.

El término "sufrieron una recaída" como se usa aquí significa pacientes que han experimentado el tratamiento con hepatitis C que tienen una recaída después de la respuesta antes del tratamiento previo con interferón solo, o en combinación con ribavirina. El término "no respondedores" como se usa aquí significa pacientes que han experimentado el tratamiento con hepatitis C que no responden al tratamiento previo con cualquier interferón sencillo, o en combinación con ribavirina. Cuando el interferón-alfa pegilado administrado es un interferón-alfa-2b pegilado, la cantidad terapéuticamente efectiva del interferón-alfa-2b pegilado, administrada durante el tratamiento de acuerdo con la presente invención, en los períodos de tratamiento primero y segundo, varía de OJ a 9.0 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada por semana, en dosis individuales o divididas, preferiblemente una vez a la semana (QW) o dos veces a la semana (BIW), preferiblemente varía de OJ acerca de 9.0 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez a la semana (QW) o en la escala de 0.05 a cerca 4.5 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada dos veces a la semana (BIW), o en la escala de 0.5 a cerca de 3.0 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada por semana, preferiblemente varía de cerca de 0.5 a cerca de 3.0 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez a la semana (QW) o en la escala de 0.25 a cerca de 1.5 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada dos veces a la semana, o en la escala de 0.75 a cerca 1.5 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada por semana, más preferiblemente en la escala de 0.75 a cerca de 1.5 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez a la semana o cerca de 0.375 a cerca de 0.75 microgramos por cada kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada dos veces a la semana. Cuando el interferón-alfa pegilado administrado a pacientes pediátricos es un interferón-alfa-2b, la cantidad terapéuticamente efectiva de interferon-alfa-2b pegilado administrada durante el tratamiento de acuerdo con la presente invención, que está incluida en el primer y segundo períodos de tratamiento varía de OJ a cerca de 9 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada por semana, en dosis individuales o divididas, preferiblemente una vez por semana (QW) o dos veces por semana (BIW), más preferiblemente cerca de OJ a cerca de 9.0 microgramos por kilogramo de interferón-a!fa-2b pegilado, administrada una vez a la semana (QW), o cerca de 0.05 a cerca de 4.5 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada por semana, en dosis individuales o divididas, preferiblemente una vez por semana (QW) o dos veces por semana (BIW), más preferiblemente cerca de 0.05 a cerca de 4.5 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez por semana, o preferiblemente cerca de 0.75 a cerca de 3.0 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada en dosis individuales o divididas, preferiblemente una vez por semana (QW) o dos veces por semana (BIW), más preferiblemente cerca de 0.75 a cerca de 3.0 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez por semana o cerca de 0.375 a cerca de 1.5 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada dos veces por semana y más preferiblemente cerca de 2.25 a cerca de 2.6 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegilado, administrada una vez por semana o cerca de 1.1 a cerca de 1.3 microgramos por kilogramo de interferón-alfa-2b pegiiado, administrada dos veces por semana (BIW). Cuando el interferón-alfa pegilado, administrado es un interferón-alfa-2a pegilado, la cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa-2a pegilado, administrada durante el tratamiento de acuerdo con la presente invención, que está incluida en el primer y segundo períodos de tratamiento, varía de 50 microgramos a cerca de 500 microgramos una vez por semana ("QW), preferiblemente cerca de 200 microgramos a cerca de 250 microgramos QW o la cantidad efectiva varía de 50 microgramos a cerca de 250 microgramos, dos veces por semana, preferiblemente de 100 microgramos a cerca de 125 microgramos dos veces por semana. Cuando el interferón-alfa pegilado administrado a un paciente pediátrico es un ¡nterferón-alfa-2a pegilado, la cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa-2a pegilado, administrada durante el tratamiento de acuerdo con la presente invención, que está incluida en el primer período de tratamiento varía de 50 microgramos a cerca de 500 microgramos una vez por semana ("QW"), preferiblemente de cerca de 300 microgramos a cerca de 375 microgramos QW o la cantidad terapéuticamente efectiva de interferón-alfa-2a pegilado, administrada a un paciente pediátrico varía de 50 micrograrnos a cerca de 250 microgramos dos veces por semana, preferiblemente cerca de 150 microgramos a cerca de 190 microgramos una vez por semana. La ribavirina se administra al paciente en asociación con ¡nterferón-alfa pegilado, que es, antes, después o concurrentemente con la administración del interferón-alfa pegilado. La dosis de interferón-alfa pegilado preferiblemente es administrada durante el mismo período de tiempo en que el paciente recibe dosis de ribavirina. La cantidad de ribavirina administrada concurrentemente con el interferón-aifa pegiiado es de 400 a cerca de 1600 mg por día, preferiblemente cerca de 600 a cerca de 1200 mg por día o cerca de 800 a cerca de 1200 mg por día y más preferiblemente cerca de 1000 a cerca de 1200 mg por día. El interferón-alfa pegilado también se administra preferiblemente a pacientes pediátricos durante el mismo período de tiempo en el que el paciente recibe dosis de ribavirina. La cantidad de ribavirina administrada al paciente pediátrico concurrentemente con interferón-alfa pegilado es de cerca de 8 a cerca de 15 mg por kilogramo por día, preferiblemente cerca de 8, 12 ó 15 mg por kilogramo por día, en dosis divididas. Las formulaciones de interferón-alfa pegilado no son efectivas cuando se administran en forma oral, de manera que el método preferido de administrar el ¡nterferón-alfa pegilado es de forma parenteral, preferiblemente en forma subcutánea, IV, o IM, inyección. La ribavirina puede ser administrada en forma oral en cápsulas, tabletas o en forma líquida en asociación con la administración parenteral de interferón-alfa pegilado. Por supuesto, otros tipos de administración de ambos medicamentos, que llegan a ser disponibles son contemplados, tal como, por medio del rociador nasal, en forma transdérmica, a través de un supositorio, a través de una forma de dosis de liberación sostenida, y a través de inhalación pulmonar. Cualquier forma de administración trabajará mientras que las dosis apropiadas se suministran sin destruir el ingrediente activo.

Fermentación del microorganismo El complejo activo CCR-5 de esta invención se produce cuando el microrganismo producido, MER-229, se desarrolla en un medio nutriente acuoso bajo condiciones aeróbicas sumergidas a una temperatura de cerca de 24°C a cerca de 37°C, preferiblemente de 24°C a 35°C y a un pH de 6.5 a 8 con agitación hasta que una actividad de CCR-5 substancial se imparta al medio. Los estudios de la temperatura indican que el organismo crece rápidamente a una temperatura de 24°C. Por lo tanto, la fermentación preferiblemente se conduce empleando un patrón de temperatura individual de cerca de 24°C, para un período de cerca de 48 a cerca de 144 horas preferiblemente cerca de 120 horas en matraces. El crecimiento del organismo (el volumen de célula empacada, el pH y la concentración de glucosa residual) se determina de manera intermitente. Durante el curso de la fermentación, producción del complejo activo CCR-5 se vigilan a través de la prueba de CCR-5. Al igual que el medio nutriente, se emplea cualquier medio adecuado que contenga una fuente de carbono, por ejemplo un carbohidrato asimilable, y una fuente de nitrógeno, por ejemplo un nitrogenado asimilable o material proteinaseo y varias sales minerales. El medio empleado para la fermentación contiene proteosa peptona, extracto de levadura, cerelosa y sémola como las fuentes principales de nitrógeno y carbono, respectivamente. Bajo estas condiciones, el microorganismo, MER-229, produce componentes activos cuando se determina al vigilar la fermentación usando el la prueba CCR-5. Los medios anteriores son ejemplares de los nutrientes utilizados por MER-229 para producir componentes activos. Sin embargo es obvio para aquellos con experiencia en la ciencia de la fermentación que un amplio rango de nutrientes obtenidos a partir de un número de suministradores, se pueden substituir para lo anterior, y que un buen crecimiento en general y producción se pueden obtener, siendo los nutrientes el equivalente funcional de aquellos expuestos anteriormente. La fermentación en general se conduce al esterilizar inicialmente el medio de fermentación antes de la adición del inoculo. Antes de la esterilización, el pH del medio usualmente se ajusta a 7. La fermentación se inicia por la adición del inoculo al caldo. En general, el volumen del inoculo está entre 3.5 al 7% del volumen del caldo total. El inoculo se prepara al añadir una muestra de inoculo al 5% del caldo total congelado del cultivo de producción a un medio de germinación apropiado. Un medio de germinación particularmente preferido en gramos por litro comprenden proteus peptona #3, 5.0; cloruro de sodio 5.0; cerelosa, 20.0; extracto de levadura 3.0; sémola; 5.0 y potasio fosfato de sodio (monobásico) 5.0. La etapa del inoculo de la fermentación usualmente requiere de 24 a 120 horas, prefiriendo de 72 a 96 horas y en general conducida de 24°C. Con agitación (250 rpm). Un inoculo al 5% de este cultivo se transfiere al mismo medio de germinación y crece como se describió anteriormente. El inoculo desarrollado de esta manera se transfiere al medio de fermentación. Un medio de fermentación particularmente preferido comprende 10 gr/l de neopeptona, 40 gr/l de cerelosa y 5 gr/l de carbonato de calcio. La etapa de fermentación usualmente requiere de 96 a144 horas con 120 horas siendo la etapa preferida y en general se conduce de 24°C. con agitación (250 rpm). El pH de la solución se ajusta a 7. Un agente anti-espuma tal como la anti-espuma B (Dow Corning) se añade al medio para controlar la espuma, si es necesario. Un complejo activo detectado por la prueba CCR-5 es producido.

Aislamiento de los compuestos activos CCR-5 Como una primer etapa en el procedimiento de aislamiento, una extracción de acetato de etilo convencional a un pH de recolección de (6.5- 7.2) no se puede utilizar para extraer Sch 210791 (I), Sch 210792 (II) y Sch 213766 (lll) a partir del caldo de fermentación. La metodología de la extracción en fase sólida (SPE) originalmente se aplica a una escala pequeña usando material de empaque DZC-18 (Diazem). La evaluación adicional indica que I, II y lll se pueden extraer con acetato de etilo bajo condiciones acidas (pH=2). El caldo de fermentación (4 litros) se ajusta con ácido clorhídrico concentrado (12 N, 37%) a un pH igual a 2, después se extrae con 12 litros de acetato de etilo. Después de la remoción del solvente bajo presión reducida, el extracto crudo (8 g) se divide con un sistema de solvente bifásico (hexano: acetato de etilo: metanol: agua con ácido acético al 5%, 8:2:5:5). El complejo activo CCR-5 de la porción de la fase superior (800 mg) se analiza por cromatografía por HPLC en fase normal (columna PVA-Sil semi-preparativa YMC, de 30x250 mm con protección de 30x75 mm, S-5, MeOH al 2% en cloruro ¡socrático de n-butilo, 24 ml/min, UV=295 nm) para obtener el I puro (6 mg) y III (20 mg) y el complejo enriquecido. El complejo enriquecido además se purifica por HPLC en fase inversa (columna ODS semi-preparativa YMC, de 20x250 mm con una columna de protección de 20x50 mm, S-5, acetonitrilo 70-100% en agua con un gradiente lineal en 15 min, 12 ml/min, UV=220 nm) para producir II puro (5 mg).

Propiedades físico-químicas de los compuestos I. II y lll Ambos compuestos I y II se cristalizan con acetona/cloruro de metileno (1 :1 ) para formar sólidos cristalinos. Sin embargo, el compuesto lll se obtiene como un material viscoso después de la remoción del solvente a partir de la purificación por HPLC y se puede cristalizar con varios sistemas de solvente. Los tres compuestos son solubles en acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, cloruro de metileno y metanol, insoluble en hexano y agua. Estos compuestos son negativos en la prueba de ninhidrina y positivos en la prueba de Rydon. Las propiedades físico-químicas de los compuestos se resumen en ei cuadro 1.

Determinación de la estructura de los compuestos de las fórmulas I, II y lll La elucidación de la estructura de los compuestos de las fórmulas I, II y lll se realiza en base análisis de datos espectroscópicos, incluyendo experimentos UV, IR, MS, 1H y 13C NMR. Los datos espectrales 1H y 13C NMR se muestran en el cuadro 2 y 3. Las asignaciones de los protones y carbones se establecen por espectroscopia correlacionada (COSY) y los experimentos de prueba de protón unido (APT), respectivamente. Los protones para ios carbones relevantes se asignan por medio de experimentos correlacionados heteronucleares (HETCOR). Las conexiones del protón y el carbono se realizan en base a la correlación de enlace múltiple, heteronuclear (HMBC), coherencia del quantum múltiple heteronuclear (HMQC) y el aumento nuclear insensible, selectivo a través de los experimentos de transferencia de polarización (SINEPT). La estequiometría relativa se determina por espectroscopia de efecto Overhauser nuclear de dos dimensiones (NOSEY). La estructura propuesta y la estequiometría relativa de estos compuestos además se confirma por análisis de datos cristalográficos de rayos X, del compuesto II, que se muestra en el cuadro 4. Los tres compuestos pertenecen a la familia del ácido tetrámico de compuestos con un enlace de un radical bicíclico hidrófobo. Los compuestos I y II son estereoisómeros en la posición C-23, central, quiral. El compuesto lll es un éster de metilo del grupo carboxi en la posición C-25.

CUADRO 1 Propiedades físico químicas de compuestos de fórmulas I, II Y III II lil P.F.°C 126-128 149-150 1 ESI-MS (m/z)2 446 (MH+H)+ 446 (M+H)+ 460 (M+H)+ Análisis C^HssNOe C25H35N06 C2 H3TN06 elemental Calculado C67.42,H7.87,N3J5 C67.42,H7.87,N.315 C67.97,H8.06,N3.05 Encontrado C68.23, H7.98.N3J 1 C66.95,H7.51 ,N3.58 C67J 1 ,H7.88,N3.67 [ ]24D(Acetona) +127.5° +40.0° +33.3° UV(MeOH)ma? 220,220 220, 295 220, 295 IIíTI I (Kbr) max cm"1 3390, 1725 3436, 1710 3407, 1736 1650, 1595, 1645, 1578, 1655, 1602, 1440 1447 1456 1. Ei compuesto iii parece ser un material sólido suave similar a una goma probablemente debido a la presencia de dos formas isoméricas (equilibración enol- cetona). 2. Datos espectrales de masa de ionización por electro-rociado CUADRO II Datos de 1H NMR de los compuestos de fórmulas I. II Y IIIa Protó lil n # 1 3,95 dd (8.0,7.0)° 3,94 dd (8.0,7.0) 3,95 dd (8.0,7.0) 2 3,01 dt (8.0,1.0,1.0) 3.00 dt (8.0,1.0,1.0) 3.00 dt (8.0,1.0,1.0) 3 5.67 br.s 5.66 br.s 5.66 br.s 4 5.67 br.s 5.66 br.s 5.66 br.s 5 1.85 m 1.85 m 1.82 m 6 0.93,L90m 0.95J .91 m 0.95J .90 m 7 1.62 m 1.63 m 1.63 m 8 0.82,1.64 m 0.83J .66 m 0.83J .66 m 9 1.38 m 1.39 m 1.39 m 10 1.40 m 1.40 m 1.40 m 11 - -- - 12 1.58 br.s 1.57 br.s 1.59 br.s 13 5.20 dq (6.5,1.0) 5J9 dq (6.5J .O) 5.19 dq (6.5,1.0) 14 1.51 br.d (6.5) 1.50 br.d (6.5) 1.50 br.d (6.5) 15 0.92 d (6.5) 0.91 d (6.5) 0.91 d (6.5) 16 0.84 d (6.5) 0.85 d (6.5) 0.84 d (6.5) 17 - - ~ 18 - -- - 19 - .. ~ 20 4.10 dd (10.0,2.5) 3.80 dd (10.0,2.5) 4.04(10.0,2.5) 21 - - - 22 1.90(14.0,10.0) 1.75 dd (14.0J0.0) 1.72 dd (14.0,10.0) 2.22 dd (14.0,2.5) 2.50 dd (14.0,2.5) 2.45 dd (14.0,2.5) 23 -- - - 24 1.49 s 1.49 s 1.46 s 25 - - - 25- ~ - - OCH3 a. Medido a 400 MHz en acetona-d6, desplazamientos químicos en ppm de TMS. b. Constantes de acoplamiento en Hz Prueba de unión de la membrana ccr5 Una pantalla de alto rendimiento que utiliza una prueba de unión de la membrana CCR5 identifica los inhibidores de unión RANTES. Esta prueba utiliza membranas preparadas a partir de células NIH 3T3 que expresan el receptor de quimiocina CCR5 humano que tiene la capacidad de unirse a RANTES, un ligando natural para el receptor. Usando un formato de placa de 96 pozos, las preparaciones de la membrana se incuban con 1 AIRANTES en presencia o ausencia de un compuesto por una hora. Los compuestos se diluyen en serie sobre una amplia escala de 0.001 ug/ml a 1 ug/ml y se prueban por triplicados. El cóctel de reacción se colecta a través de filtro de fibra de vidrio, y se lava completamente. El conteo total de las réplicas es promediado y los datos se reportan conforme la concentración es requerida para inhibir el 50 por ciento de la unión 25I-RANTES total. Los compuestos con actividad potente en las pruebas de unión de la membrana además son caracterizados en la entrada VIH-1 en base a la célula secundaria y las pruebas de replicación.

Actividad del compuesto de formula ii en la prueba de unión de la membrana ccr5 La actividad del compuesto de fórmula II se evalúa en la prueba de unión de la membrana CCR5. La prueba utiliza membranas preparadas a partir de células NIH 3T3 que expresan el receptor de quimiocina CCR5 humano. RANTES (célula normal T, expresada y secretada, regulada en la activación) es un ligando natural para CCR5. En el formato de placa de 96 pozos, 14 ug (proteína total) de la preparación de la membrana y 0.05 nM de 125l Rantes se incuban en presencian (y ausencia) del compuesto por una hora. El compuesto II se diluye en serie sobre una escala de 0.001 ug/ml a 1.0 ug/ml y cada concentración se prueba en replicas de cuatro. Los cócteles de reacción se colectan a través de filtros de fibra de vidrio, y se lavan completamente. Los conteos totales de las replicas son promediados y la inhibición del 50 por ciento de la unión de la membrana total de 125l Rantes se determinan. El compuesto de la fórmula II demuestra un valor IC50 de 78.6 nM para II. Una escala similar de actividad se espera para los compuestos de las fórmulas I y lll.

CUADRO 3 Datos de 1 CNMR del compuesto de fórmula I. II v IIIa Carbono # lll 1 45.8 db 46.9 d 45.2 d 2 47.8 d 48.5 d 48.7 d 3 128.4 d 129.4 d 126.2 d 4 133.5 d 134.5 d 134.3 d 5 40.4 d 41.2 d 38.4 d 6 41.8 t 42.6 t 42.4 t 7 32.4 d 33.2 d 33.2 d 8 45.8 t 46.6 t 46.8 d 9 39.1 d 39.9 d 35.1 d 10 46.0 d 46.9 d 39.9 d 11 135.3 s 136.2 s 138.2 s 12 15.1 q 16.8 q 16.5 q 13 121.5 d 122.3 d 122.0 d 14 12.9 q 13.8 q 13.8 q 15 21.8 q 22.6 q 22.8 q 16 20.5 q 21.4 q 20.2 q 17 192.8 s 193.5 s 192.9 s 18 100.6 s 101.4 s 100.9 s 19 194.8 s 194.9 s 194.7 s 20 58.9 d 60.9 d 60.7 d 21 175.6 s 176.6 s 176.6 s 22 41.3 t 42.7 t 43.01 23 72.9 s 75.1 s 75.3 s 24 25.0 q 27.7 q 28.0 q 25 176.9 s 177.2 s 176.9 s 25OCH3 - 52.9 q a. Registrado a 100 MHz en acetona-d6, desplazamientos químicos en ppm de TMS. b. Se determina la multiplicidad por medio de datos APT.

CUADRO 4 Datos cristalográficos1 Un difractómetro Enraf-Nonius CAD-4 (radiación Cu-Ka, monocromador de grafito) se usa para todas las mediciones. Los datos de intensidad se corrigen para los efectos de Lorentz y de polarización usuales. La simetría Laue indica que los cristales pertenecen al sistema monoclínico. El grupo espacial se determina a partir de las ausencias sistemáticas y del lecho de que la molécula es quiral. Los parámetros de la célula unitaria final se calculan a partir de ángulos de ajuste del difractómetro para 25 reflexiones (25°<?<29°) ampliamente separados en espacios recíprocos. La estructura cristalina se resuelve a través de métodos directos (MULTAN11/82). El aproximado coordina los átomos de no hidrógeno obtenidos en parte a partir de un mapa-E y a partir de una serie de síntesis F° Fourier ponderadas fasadas sucesivamente a través de un número de incremento de átomos. Los parámetros de posición y térmicos (primero isotrópicos y después anisotrópicos) de estos átomos se ajusta por medio de varios redondeos de cálculos de mínimos cuadrados de matriz completa. La mayoría de los átomos de hidrógeno se localizan en las síntesis Fourier diferenciales y se incorporan en sus posiciones calculadas en las subsecuentes iteraciones de mínimos cuadrados. Una corrección de extinción se incluye como una variable en los ciclos posteriores. Una síntesis Fourier diferencial final no contiene aspectos inusuales. Los cálculos cristalográficos se realizan en computadoras PDP11/44 y MicroVAX mediante el uso del paquete de determinación estructural Enraf-Nonius (SDP). Para todos los cálculos del factor estructural, los factores de dispersión atómica neutral y sus correcciones de dispersión anómalas se toman de Internatiomal Tables for X-Ray Crystallography, vol. IV, The Kynoch Press, Birmingham, U.K., 1974. 2R=S| | Fo |-FC | |/?| F-| ; Rw=[ ?w( | H- Fc ir/?w I F- 1 T , Sw? w = 1 «y ( | F- | ), ? = ( | F- | Fc | ) ]se minimizan. 1/2 3ajUSte apropiado = [?w?2/(N0bservaciones " Nparámetros) ]

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un compuesto representado mediante las fórmulas I, II o lll: 20 en una forma sustancial y químicamente pura, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 2.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del antagonista del CCR5 de un compuesto de la reivindicación 1 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. 3.- Un cultivo biológicamente puro de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705 y mutantes y variantes del mismo tienen las características de identificación de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705, ATCC 74489, dicho cultivo es capaz de producir los compuestos de fórmula I a lll en cantidades admisibles en la terminación en un medio acuoso que contiene fuentes presumibles de carbono y nitrógeno y sustancias inorgánicas.. 4.- Un complejo activo CCR5 comprende los compuestos representados mediante las fórmula I, II y lll. 5.- Un procedimiento para producir un compuesto de fórmula I, II o lll de la reivindicación 1 que comprende el cultivo de Chaetomium globoso Kunze SCF 1705, ATCC 74489, en un medio acuoso nutriente que contiene fuentes presumibles de carbono y nitrógeno y sustancias inorgánicas, bajo condiciones aeróbicas sumergidas a una temperatura de cerca de 24 a 40°C y a un pH en la escala de 6 a 8.5 con agitación durante un tiempo suficiente para producir una actividad anti-CCR-5 sustancial que es impartida al medio.