MXPA02003384A - Composiciones y metodos para atacar tumores y entrega de moleculas determinantes. - Google Patents

Composiciones y metodos para atacar tumores y entrega de moleculas determinantes.

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Abstract

La presente solicitud revela la preparacion y el uso de vectores de bacterias atenuados para atacar tumores, para el suministro de una o mas moleculas determinantes primarias al sitio de un tumor solido. Las moleculas determinantes primarias de la invencion se utilizan en los metodos de la invencion, para tratar un cancer de tumor solido, tal como un carcinoma, melanoma, linfoma, o sarcoma. La invencion se relaciona con el sorprendente descubrimiento de que moleculas determinantes, que pueden ser toxicas cuando se suministran sistematicamente a un huesped, pueden suministrarse localmente a tumores por medio de bacterias atenuadas para atacar tumores, con toxicidad reducida para el huesped. La solicitud tambien revela el suministro de una o mas moleculas determinantes opcionales (moleculas determinantes secundarias expresadas) que pueden suministrarse por la bacteria atenuada para atacar tumores, en conjuncion con las moleculas determinantes primarias.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA ATACAR TUMORES Y ENTREGA DE MOLÉCULAS DETERMINANTES Esta solicitud reclama prioridad de las solicitudes de patentes provisionales Norteamericanas Nos. 60/157,500, 60/157,581, y 60/157,637, presentadas el día 4 de Octubre de 1999, cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia en su totalidad. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al suministro de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) a un tumor sólido para el tratamiento o inhibición del tumor. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de uso de bacterias dirigidas al tumor atenuadas, como por ejemplo, Salmcnella, como vector para suministrar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) a un sitio de acción apropiado, por ejemplo, el sitio de un tumor sólido. Específicamente, la bacteria dirigida al tumor atenuada de la invención es un aerobio facultativo c anaerobio facultativo modificado para codificar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s). La molécula (s) efectora (s) primaria (s) de la invención incluye (n) miembros de la familia TNF citocina, factores anti-angiogénicos, y polipéptidos o péptidos citotóxicos. Las moléculas efectoras primarias de la invención son útiles, por ejemplo para tratar un cáncer de tumor sólido, per ejemplo, carcinoma, melanoma, linfoma, ? at™"" J "° ""* ' ,*" - * . j&*dk L a¿.A4., sarcoma o metástasis derivadas de estos tumores. La invención se refiere además al descubrimiento sorprendente que la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) tales como miembro de la familia TNF, factores anti-angiogénicos, y polipéptidos o péptidos citotóxicos pueden ser administrados localmente a tumores por bacteria dirigida al tumor atenuada con una toxicidad reducida y complicaciones inmunológicas reducidas para el huésped. La invención se refiere también al suministro de una o varias molécula (s) efectora (s) opcional (es) (se conocen como "moléculas efectoras secundarias") que pueden ser suministradas a través de la bacteria dirigida hacia el tumor atenuada en combinación con la molécula (s) efectora(s) primaria(s). La(s) molécula(s) efectora(s) secundaria (s) proporciona (n) una actividad terapéutica anti- tumor adicional, incrementa (n) la liberación de la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) a partir de la bacteria dirigida hacia el tumor atenuada y/o incrementa (n) la absorción de la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) en el sitio apropiado de acción, por ejemplo, en el sitio de un tumor sólido. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un neoplasma o tumor, es una masa neoplásica que resulta del crecimiento anormal de células que puede ser benigno o maligno. Los tumores benignos permanecen generalmente localizados. Los tumores malignos tienen generalmente el potencial de invadir y destruir tejidos corporales aledaños y difundirse hasta sitios distantes y provocar la muerte (para una reseña véase Robins and Angelí, 1976, Basic Pa thology, 2da. edición, W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-122). 5 Se dice que un tumor presenta metástasis cuando se ha difundido desde un órgano o tejido hacia otro. Un problema mayor en la quimioterapia de cánceres de tumores sólidos es la administración de los agentes terapéuticos tales como fármacos, en concentraciones suficientes para 10 erradicar las células tumorales mientras se minimiza al mismo tiempo los daños a las células normales. Así, estudios en muchos laboratorios se enfocan hacia el diseño de sistemas de fl administración biológicos, tales como anticuerpos, citocinas y virus para la administración dirigida de fármacos, enzimas 15 de conversión de pro-fármacos, y/o genes er. células tumorales (véase, por ejemplo, Crystal, R. G., 199?, Science 270:404- 410 ) . 2.1 INMUNIDAD CELULAR Y CITCCINAS Una estrategia para el tratamiento de cáncer incluye el 20 incremento o la activación de una respuesta inmunológica celular. Una inducción exitosa de una respuesta inmunológica celular dirigida a tumores autólogos ofrece varias ventajas en comparación con una quimioterapia convencional: 1) el reconocimiento in unológico es altamente específico, y es 25 dirigido exclusivamente a tumores; 2) el crecimiento en los i, "i^,*-*".?ltÍ?lll?l mili, sitios de metástasis puede ser suprimido a través de vigilancia inmunológica; 3) la diversidad de respuesta inmunológica y reconocimiento puede compensar los mecanismos de resistencia empleados por las células tumorales; 4) la expansión clonal de células T citotóxicas puede ocurrir más rápidamente cuando el tumor se está expandiendo, lo que resulta en mecanismos antitumorales que superar finalmente el tumor; 5) una respuesta de memoria puede suprimir la recurrencia de la enfermedad en sus etapas iniciales, antes de una detección física, estudios clínicos de pacientes que respondieron han proporcionado resultados a partir de modelos de animales que demuestran que una inmunoterapia exitosa incluye la activación de células CD8+T (respuesta de clase I), aún cuando existe evidencia de la participación de células de CD4+T, macrófagos y células NK. Véase Chapoval et al . , 1998, J. Immunol. 161:6977-6984, Gollub et al . , 1998, J. Clin. Invest. 102-561-575; Kikuchi et al., 1999, Int. J. Cáncer 80:425-430; Pan et al . , 1995, Int. J. Cáncer 80:425-430; Saffran et al . , 1998, Cáncer Gene Ther. 5:321-330; y Zimmermann et al . , 1999. Eur. J. Im unol. 29:284-290. 2.2 FAMILIA DE CITOCINAS DE FACTOR DE NECROSIS TUMORAL (TNF) El miembro mejor caracterizado de la familia TNF es TNF-a. TNF-a se conoce por ejercer efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmunológico. TNF-a es una citocina que puede ejercer efectos citotóxicos potentes directamente sobre las células !^™¡fe^^^^^ ^ £fc?^ »j tumorales. Se considera, que TNF-a ejerce sus efectos antitumorales a través de otros mecanismos tales como la estimulación de la proliferación y diferenciación, y prevención de apóptosis en monocitos (véase, por ejemplo, Mangan, et al . , 1991, J. Immunol. 146.1541-1546; y Ostensen et al . , 1987, J. Immunol. 138:4185-4191), promoción de actividad procoagulante de tipo factor tisular y su presión de la actividad anticoagulante de la superficie de células endoteliales, provocando finalmente la formación de coágulos dentro del tumor (reseñado en Beutler y Cerami, 1989, Ann.
Rev. Immunol. 7:625-655, y Vasalli, P., 1992, Ann. Rev.
Immunol. 10:411-452) . Sin embargo, como resultado de estas propiedades la administración sistémica de TNF-a resulta en consecuencias letales en el huésped debido a una coagulación intra vascular diseminada. Otras citocinas han sido también implicadas en respuestas anti-tumor. IL-2 es una clase de citocina I y se considera también que desempeña una función en una respuesta antitumor. Por ejemplo, melanomas que regresan espontáneamente han sido asociados con niveles intra-tumorales elevados de TNF-a en IL-2. Véase, por ejemplo, Beutler y Cerami, 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:625-655; Lowes et al . , 1997, J. Invest. Dermatol. 108:914-919; Mangan et al . , 199A J. Immunol. 146:1541-1546; Scheruich et al . , 1987, J. Ir- nol. 138:1786- 1790.
Ll*UI.j l,>j4tJ-,J „,»... J Tanto TNF-a como IL-2 ayudan a direccionar los linfocitos, y se ha mostrado que IL-2 induce la infiltración de tumores de células asesinas naturales (NK) , células T así como células asesinas activadas por linfocinas (LAK) (véase, por ejemplo, Etter et al . , 1998, Cytokine 10:395-403; Reinhardt et al . , 1997, Blood 89:3837-46; Chen et al . , 1997, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56:541-50; Vora et al . , 1996, Clin. Exp. Immunol. 105:155-162; Luschinskas et al., 1996, J. Immunol. 157:326-35; Kjaergaard et al . , 1998, Scand. J. Immunol. 47, 532-540; Johansson et al . , 1996, Nat. Immun. 15:87-97 y Watanabe et al . , 1997, Am. J. Pathol. 150:1869-80). En presencia tanto de TNF-a como IL-2, la actividad citolítica de células NK y LAK es incrementada aún cuando está dirigida contra líneas de células insensibles a TNF (véase, por ejemplo, Ostensen et al . , 1987, J. Immuncl. 138:4185-4191). Sin embargo, niveles terapéuticos de IL-2 son también tóxicos para el huésped. Claramente, la toxicidad que limita la dosis para la administración sistémica de citocinas plantea una barrera significativa para el lograr el potencial de las citocinas en la terapia del cáncer. Además, la administración sistémica de citocinas puede resultar en un direccionariento disminuido de células T singeneicas, oponiéndose por consiguiente a una inmunoterapia dirigida, además de resultar en efectos colaterales clínicos no deseados. Ver Addison et al . , 1998, Gene Ther. 5:1400-1409; Albertini et al . , 1997, Clin. Cáncer Res. 3:1277-1288; Becker et al . , 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7826-7831; Book et al., 1998, J. Neuroimmunol . 92:50-59; Cao et al., 1998, J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 124:88-92; D'Angelica et al . , 1999, Cáncer Immunol. Immunother. 47:265-271; Deszo et al . , 1996, Clin. Cáncer Res. 2:1543-1552; Kjaergaard et al., 1998, Scand. J. Immunol. 47:532-540; Ostensen et al . , 1987, J. Immunol. 138:4185-4191; y Schirrmacher et al . , 1998, Clin. Cáncer Res. 4:2635-2645. 2.3. ADMINISTRACIÓN DE CITOCINAS Estudios recientes experimentales con animales así como estudios clínicos han intentado evitar la toxicidad sistémica de las citocinas y administrar dosis más elevadas, a través de métodos de administración de citocinas sub-sistémicos o alternativos. En modelos de murino, sarcoma, 180 tumores han sido tratados con administración de un gen fusogénico de TNF-a encapsulado en liposoma, y la administración sistémica de TNF-a encapsulado en polietilenglicol, que podría colocarse en la vasculatura tumoral (ver Tsutsumi et al . , 1996, Jpn. J. Cáncer Res. 87 : 1078-1C 35) . La sensibilización de tumores TNF-a por polipéptidos de II de activación de monocitos endoteliales se ha reportado también (ver, Marvin, et al . , 1999, J. Surg. Res. 63:248-225; Wu et al . , 1996, Cáncer Res. 59:205-212) . En estudios clínicos se ha observado una erradicación I ?OutA. * «mM .1... i,AAtjA-,jjiAI,A..A. completa de tumor, después de la administración de altas dosis de TNF-a a pacientes a través de perfusión aislada en miembro en combinación con interferón-a o melfalano. Sin embargo, esta técnica presenta riesgos severos para el paciente si las citocinas no están totalmente removidas después del tratamiento. Además, estos tratamientos requieren del aislamiento de miembro, lo que en si presente riesgos para el paciente. Ver Eggermont et al . , 1997, Semin. Oncol. 24:547-555; Fraker et al . , 1995, Cáncer J. Sci. Am. 1:122-130; Lejeune et al . , 1998, Curr. Opin. Im unol. 10:573-580; Marvin et al . , 1996, J. Surg. Res. 63:248-255; Mizuguchi et ai., 1998, Cáncer Res. 58:5725-5730; Tsutsumi et al . , 1996, Jpn., J. Cáncer Res. 87:1078-1085; y Wu et al . , 1996, Cáncer Res. 59, 205-212. Estudios previos efectuados por Carrier et al . , 1992, J. Immunol. 148:1176-81, Saltzman et al . , 1997, Cáncer Biother. Radiopharm. 12:37-45, Saltzman et al . , 1997, J. Pediat. Surgery 32:301-306 han reportado el uso de cepas atenuadas de Salmonella para suministrar IL-lß (Carrier) e IL-2 (Saltzman) directamente a hígados y bazos, los sitios naturales de infección por Salmonella, para servir como cepas de vacuna o para efectuar metástasis hepáticas. Los estudios de Saltzman utilizaron la administración oral de Salmonella en donde bacterias son absorbidas por GALT (tejido linfoide asociado con intestinos) y transportadas al hígado y al bazo. Sin Si .j .lt -.t ¡ í ..tí!??-l i embargo, estas infecciones son limitadas a los sitios naturales de infección. 2.4. ANGIOGÉNESIS Y TUMORIGÉNESIS Otra estrategia para el tratamiento de cáncer incluye la 5 inhibición de la angiogénesis. La angiogénesis el proceso de crecimiento de nuevos vasos capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes nuevos vasos capilares se forman a • través de un proceso en el cual las células endoteliales del vaso sanguíneo preexistente, utilizando enzimas proteolíticas 10 tales como metaloproteasas de matriz degradan las membranas de base en su cercanía, proliferan, migran en tejido estromal aledaño y forman microtubos. El proceso de angiogénesis es (—\ muy estrechamente regulado por una interacción entre factores negativos y positivos y en adultos es normalmente restringido 15 al ciclo reproductivo de la mujer y reparación de heridas (Malonne et al . , 1999, Clin. Exp. Metástasis 17:1-14). Una regulación aberrante o anormal de la angiogénesis ha estado implicada en numerosos trastornos humanos incluyendo retinopatía diabética, soriasis, artritis reumatoide, 20 enfermedad cardiovascular, así como tumorigénesis (Folkman, 1995, Nat. Med. 1:27-31). La angiogénesis es un proceso crítico para el crecimiento tumoral y metástasis. La formación del tumor se divide en dos etapas, la etapa prevascular y la etapa vascular. Estudios 25 han mostrado que las células de tumores prevascAares proliferan tan rápidamente como las células de tumores vascularizados. Sin embargo, los tumores prevasculares raras veces crecen más de 2-3 mm' debido a la existencia de un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte 5 celular, esta última resultando de la naturaleza hipóxica del tumor prevascular (Folkman, 1995, Nat. Med. 1:27-31). El cambio de la etapa prevascular a la etapa vascular requiere • de un cambio en cuanto al equilibrio de los factores de regulación de la angiogénesis desde un balance neto que 10 favorece los factores negativos hacia un balance neto en el cual los factores positivos tales como factor de crecimiento de microblasto (FGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) predomina (Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20:161-176) . 15 El cambio de equilibrio entre factores reguladores es el resultado de la regulación ascendente de los factores angiogénicos y de la regulación descendente simultánea de los factores antiangiogénicos (Folkman, 1995, N. Eng. J. Med. 333:1757-1763) . 20 2.5. FACTORES ANTIANGIOGÉNICOS • Se postuló la existencia de factores antiangiogénicos en base en varios fenómenos relacionados que llevaron a la conclusión que los tumores primarios inhibían frecuentemente el crecimiento de sus metástasis (Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. 25 Biol. 20:161-176). El primero de estos factores que fue A> &&i¿A ., aislado fue la angiostatina de ratón, un fragmento proteolítico de 38 kDa de plasminógeno que es liberado en la circulación por tumores de carcinoma de pulmón de Lewis primarios y evita el crecimiento de metástasis secundarias (O'Reilly et al . , 1994, Cell 79:315-328). En seres humanos, péptidos de 40, 42 y 45 kDa producidos por la proteólisis limitada de plasminógeno con metaloelastasa tienen una actividad anti-angiogénica comparable en la angiostatina de ratón (O'Reilly et al . , 1994, Cell 79:315-328). El plasminógeno en sí no tiene dicha actividad. Se considera también que macrófagos asociados con tumores son responsables de la producción de angiostatina, puesto que las células tumorales mismas no tienen ARNm de angiostatina detectable. La expresión de metaloelastasa de macrófago es inducida por el factor de estimulación de colonias de granulocitos (GM-CSF) secretado por las células tumorales (Dong et ai., 1997, Cell 88:801-810). En ciertos tumores, la producción de angiostatina es catalizada por serinas proteasas y no por metaloeslastasa, en donde la serinas proteasas son producidas directamente por las células tumorales (Gately et al . , 1997, Cáncer Res. 56:4887-4890). La administración de Angiostatina en una concentración de 100 mg/kg/día a ratones de experimento con tumores primarios resultó en una fuerte inhibición del crecimiento tumoral sin efectos colaterales tóxicos. Los tumores reiniciaron su crecimiento después de 2 semanas de suspensión del tratamiento de angiostatina lo que indica los tumores regresan a un estado latente y no mueren totalmente como resultado del tratamiento (O'Reilly et ai., 1996, Nat. Med. 2:689-692). Después del descubrimiento de la angiostatina, otros inhibidores de la angiogénesis, incluyendo varios péptidos de inhibición de angiogénesis, fueron descubiertos y aislados. Un inhibidor más potente de la angiogénesis que la angiostatina es kringle 5, un péptido que comprende un quinto dominio kringle de plasminógeno (la angiostatina comprende los dominios kringle 1-4) . Kringle 5 puede ser producido por la proteólisis de plasminógeno, y formas recombinantes son también activas (Cao et al . , 1997, J. Biol. Chem. 272-22924-22928) . La endostatina fue aislada de manera similar al aislamiento de la angiostatina (O'Reilly et al., 1997, Cell 88:1-20), la fuente siendo un hemangioendotelioma de murino en lugar de un carcinoma pulmonar de Lewis. El péptido tiene una masa molecular de 20 kDa cuya secuencia corresponde a la C-terminal de colágena XVIII (O'Reilly et al . , 1997, Cell 88:1-20) , una región conocida como NCl que es divergente entre varias moléculas de colágena (Oh et ai., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:4229-4233; y Rehn et al . , 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:4234-4238). En ratones, el crecimiento de metástasis de carcinoma pulmonar de Lewis es suprimido por la d atAAatobiA. administración de 0.3 mg/kg/día de endostatina recombinante y el tumor primario regresa a un estado latente cuando el péptido es administrado a un régimen de 20 mg/kg/día. Una endostatina recombinante funcional puede ser producida a 5 partir de cuerpos de inclusión ya sea in vi tro por desnaturalización y nuevo plegado, o bien in vivo a través de la liberación sostenida de preparaciones de cuerpos de inclusión de endostatina administrada subcutáneamente (O'Reilly et ai., 1997, Cell 88:1-20). Un método alternativo 10 de administración de endostatina que consiste en la administración intramuscular de un plásmido de expresión de endostatina resulta en una inhibición solamente parcial del fl crecimiento tumoral en un sistema de modelo de ratón (Blezinger et al . , 1999, Nat. Biotech. 17:343-348). De manera 15 similar, plásmidos que codifican angiotensina o endostatina forman complejos con liposomas que fueron suministrados de manera intravenosa lo que resultó en una inhibición parcial del crecimiento en un modelo de ratón desnudo de cáncer de mama (Chen et al . , 1999, Cáncer Res. 53:3308-3312). 20 Recientemente, se ha atribuido una actividad anti-angiogénica • novedosa a un péptido de truncado de C-terminal de la anti- trombina de Serpin (Inhibidor de Serina Proteasa) (O'Reilly et al . , 1999, Science 285-1926-1928). Una anti-trombina de longitud completa no tiene ninguna actividad anti-angiogénica 25 inherente pero al disociarse del bucle reactivo de C-terminal de la proteína por la trombina, la anti-tro bina adquiere una actividad angiogénica potente. El fragmento proteolítico se conoce a continuación como anti-trombina anti-angiogénica. Otros péptidos que inhiben la angiogénesis conocidos en la 5 técnica incluyen los fragmentos proteolíticos de 29 kla N- terminal y 40 kDa C-terminal de fibronectina (Homandberg et al . , 1985, J. Am. Pathol. 120:327-332); el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina (Clapp et al . , 1993, Endocrinology 133:1292-1299); y el fragmento proteolítico de 10 7.8 kDa del factor plaquetario 4 (Gupta et ai., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7799-7803). Además de estos fragmentos proteolíticos producidos <^ naturalmente que han demostrado efectos anti-angiogér.icos, varios péptidos sintéticos que corresponden a regiones de 15 proteínas de matriz extracelulares conocidas han sido evaluados para actividad en la inhibición de la angiogér.esis. Péptidos sintéticos que han demostrado ser inhibidores endoteliales funcionales, es decir, inhibidores ce la angiogénesis, incluyen un péptido de 13 aminoácidos que 20 corresponde a un fragmento de factor plaquetapo 4 (Maicne et • ai., 1990, Cáncer Res. 51:2077-2083); un péptido ce 14 aminoácidos que corresponde a un fragmento de colágena I (Tolma et al . , 1993, J. Cell Biol. 122:497-511); un péptido de 19 aminoácidos que corresponde a un fragment de 25 Trombospondina I (Tolsma et al . , 1993, J. Cell Biol. 122:497- 511); y un péptido de 20 aminoácidos que corresponde a un fragmento de SPARC (Sage et ai., 1995, J. Cell Biochem. 57:1329-1334), una glicoproteína de matriz extracelular rica en cisteína secretada cuya expresión en células de melanoma 5 humanas provoca una invasión celular reducida in vi tro y una tumorigenicidad reducida en un modelo de ratón desnudo in vi vo (Ledda et al, 1996, Nature Med. 3:171-176). • Otros péptidos de menos de 10 aminoácidos que inhiben la angiogénesis y corresponde a fragmentos de lamir.ina, 10 fibronectina, procolágena EGF han sido también descritos (ver la reseña por Cao, 1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20:161- 176) . ^A Los pequeños péptidos de fibronectina que inhiben la angiogénesis comprenden generalmente ei motivo RGD. RGD es un 15 motivo de péptidos (aminoácidos Arg-Gly-Asp) utilizado por proteínas y unión con moléculas de integrina. La expresión de integrina a,ß3 se relaciona con vasos sanguíneos angiogér.icos y la inhibición de su actividad por su anticuerpo monoclonales bloquea la vascularización (Brooks et al . , 1994, 20 Science 264:569-571). Esto ha sido confirmado por un estudio • que muestra la administración de péptidos cíclicos que contienen el motivo RGD e inhiben la actividad de integrinas de tipo receptor de vitronectrina y bloquear. la neovascularización retinal (Hammes et ai., 1996, Nature 25 Medicine 2:529-533). El efecto anti-angiogénicc de bloqueadores de integrina tales como pentapéptidos cíclicos y anticuerpos monoclonales ha sido mostrado como promoviendo la regresión de tumores mediante la inducción de la apóptosis de los vasos sanguíneos angiogénicos (Brooks et ai., 1994, Cell 79:1157-1164). Péptidos que comprende el motivo RGD, y otro motivo de unión de integrina, NGR (aminoácidos Asn-Gln-Arg) , mostrando una actividad antitumoral notablemente mejorada. La inhibición de la actividad de otro tipo de receptor de superficie celular específicamente el receptor de activador de plasminógeno uroquinasa (uPA) , resulta también en la inhibición de la angiogénesis. El receptor de uPA, al unirse con ligando inicia una cascada proteolítica que es necesaria para el paso de invasión de membrana de base de la angiogénesis. La inhibición de un receptor uPA por antagonistas de receptores inhiben la angiogénesis, inhibe el crecimiento tumoral (Min et al . , 1996 Cáncer Res. 56:2428- 2433) e inhibe la metástasis (Crcwley et al . , 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90.5021-5025) . Tales antagonistas han sido identificados por el despliegue de péptidos bacteriófagos de péptidos aleatorios (Goodson et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:7129-7133). Formas negativas dominantes del ligado de receptor, uPA, han sido también identificadas (Min et al . , 1996, Cáncer Res. 56:2428-2433). Mientras el descubrimiento de la angiostatina, endostatina y otros péptidos anti-angiogénicos proporcionó un nuevo enfoque alentador para la terapia del cáncer, la realidad de un tratamiento que involucra uno o varios de estos péptidos es el carácter impractico de la producción de inmensas cantidades de péptidos (empezando a partir del costo y/o trabajo que se requiere para su producción para una persona promedio de 65 kg o 143 libras, aproximadamente 1.3 o 6.5 gramos de proteína por día, según el péptido) y la duración del tratamiento (que tiene ser sostenido si se desea que el tumor permanezca en regresión) . Se considera que las dos razones principales por las cuales estos péptidos tienen que ser administrados en cantidades tan grandes que, primero, la mayor parte es degradada en el torrente sanguíneo, segundo, de las moléculas, que sí sobreviven a la degradación, solamente una proporción muy limitada llega al tumor. Así, sería una gran ventaja en el ámbito de la terapia de los tumores si proteínas o péptidos anti-angiogénicos pudieran ser administrados más eficientemente al tumor y de manera más efectiva y en forma más amigable para el paciente. 2.6. FAMILIA DE BACTERIOCINAS La colicina E3 (que se conoce a continuación como ColE3 es una bacteriocina, es decir, una toxina proteinaza bacteriana que presenta una actividad selectiva en la medida en que su huésped es inmune a la toxina. Las bacteriocinas pueden ser codificadas por el genoma del huésped o bien por un plásr.ido, pueden tener un rasgo de huéspedes amplio o estreche, y Mam »J.Í faA»t > . „..,,.,. ,. „__ „ , . pueden tener una estructura simple que comprende una o dos subunidades o pueden ser una estructura de subunidades múltiples (Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36:125-144). Además, un huésped de bacteriocina tiene inmunidad contra la 5 bacteriocina. La inmunidad se encuentra en todas las células de una población huésped dada, aún las células que no expresaron la bacteriocina. • La citotoxicidad de ColE3 resulta de su inhibición de síntesis de proteína (Nomura, 1963, Cold Spring Harbor Symp. 10 Quant. Biol. 28:315-324). El objetivo de la actividad de ColE3 es el componente 16S de ribosomas bacterianos que es común para los ribosomas 30S y 70S (Bowman et ai., 1971, f Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 68:964-968), y la actividad resulta en la degradación del ribosoma (Meyhack, 1970, Proc. 15 Nati. Acad. Sci. USA). La actividad de ColE3 es única entre las ARNsas, en la medida en que no provoca la degradación global del -ARN, si no que disocia las moléculas de AR? 49 nucleótidos del final, lo que resulta en la separación del AR?r del ARNm, y por consiguiente inhibe la traducción. La 20 actividad ribonucleasa de ColE3 se encuentra en la molécula • misma, y no es mediada por otra proteína (Saunders, 1978, ?ature 274:113-114). ColE3 puede también penetrar en las membranas internas y externa de la célula objetivo. En su forma que ocurra naturalmente, ColE3 es un complejo de 25 proteína de 60 kDa que consiste de una proteína de 50 kDa y una proteína de 10 kDa en una proporción 1:1, la subunidad más grande tiene la actividad nucleasa y la subunidad más pequeña tiene una función inhibidora de la subunidad 50 kDa. Por consiguiente, la proteína 50 kDa actúa como una proteína citotóxica (o toxinas) , y la proteína de 10 kDa actúa como una antitoxina. La subunidad de 50 kDa comprende por lo menos dos dominios funcionales, una región N-terminal requerida para la translocación a través de membranas de células blanco, y una región C-terminal con actividad catalítica (ARNse) dentro del organismo huésped la actividad de una gran subunidad es inhibida por la pequeña subunidad. Las subunidades se disocian, según se cree, al entrar la toxina en la célula objetivo como resultado de la interacción con la membrana externa de la célula objetiva (reseñado por Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36:125-144). La toxicidad de la subunidad grande de ColE3 ha sido utilizada para prevenir la difusión colateral de genes clonados a partir de los microorganismos. Diaz et ai. (1994, Mol. Microbiol. 13:855-861) separaron los dos componentes de ColE3 de tal manera que la pequeña subunidad (antitóxica) fuera expresada como una secuencia codificadora integrada cromosómicamente y la subunidad grande fuera expresada a partir de un plásmido. Bacterias con la pequeña subunidad cromosómicamente integrada son inmunes a los plásmidos que expresan la subunidad grande de Col?3 pero sí el plásmido fuese transferido lateralmente a otro recipiente que no tuviera la pequeña subunidad, entonces las células sería matadas . La colicina E3 (ColE3) tiene también un profundo efecto 5 citotóxico sobre las células de mamíferos (ver Smarda et al . , 1978, Folia Microbiol. 23:272-277), incluyendo un sistema de modelo de células de leucemia (ver Fiska et al . , 1979, • Experimentia 35:406-407). ColE3 enfoca activamente la subunidad 40S del ribosoma de mamífero 80S (Turnowsky et al , 10 1973, Biochem, Biophys. Res. Comm. 52:327-334). 2.7. INFECCIONES BACTERIANAS Y C NCER Observaciones clínicas tempranas reportaron casos en los cuales cánceres fueron reportados como regresando en pacientes con infecciones bacterianas. Ver Nauts et al . , 15 1953, Acta Medica. Scandinavica 145:1-102, (Suppl. 276); y Shear, 1950, J.A.M.A. 142:383-390. Desde estas observaciones, Lee et ai., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 89:1847-1851 (Lee et al . ) y Jones et ai. 1992, Infect. Immun. 60:2475-2480 (Jones et ai.) aislaron mutantes de Salmonella typhimurium 20 que pudieron invadir células HEp-2 (carcinoma epidermoide • humano) in vi tro en números significativamente más grandes que la cepa de tipo silvestre. Los mutantes "hiperinvasivos" fueron aislados en condiciones de crecimiento aeróbico de las bacterias que reprimen normalmente de la capacidad de las 25 cepas de tipo silvestre para invadir células de animal H?p-2.
Sin embargo, esta Salmoneiia typhimuri um hiperinvasiva de conformidad con lo descrito por Lee et al . y Jones et ai. llevan el riesgo de una infección pan-invansiva y podrían provocar infecciones bacterianas generalizadas en el paciente con cáncer. Carswell et ai, 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72:3666-3669, demostraron que ratones que recibieron una inyección de bacilo Calmette-Guerin (BCG) presentaban niveles séricos incrementados de TNF y que el suero positivo para TNF provocaba la necrosis del sarcoma Meth A y otros tumores transplantados en ratones. Como resultado de estas observaciones, la inmunización de pacientes con cáncer con inyecciones de BCG se está utilizando hoy en día en ciertos protocolos de terapia de cáncer. Véase Sosnowski, 1994, compr. Ther. 20:695-701, Barth y Morton, 1995, Cáncer 75 (Suppl. 2):726-734; Friberg, 1993, Med. Oncol. Tumor.
Pharmacother. 10:31-36 para reseña de terapia con BCG. Sin embargo, el choque séptico mediado por TNF-a se encuentra entre las preocupaciones primarias asociadas con bacterias, y puede tener consecuencias tóxicas o letales para el huésped (Bone, 1992 JAMA 268:3452-3455; Dinarello et al . , 1993, JAMA 269:1829-1835). Además, la toxicidad sistémica de TNF-a que es una limitante de la dosis ha sido la barrera principal al uso químico efectivo. Modificaciones que reducen esta forma de una respuesta inmunológica podrían ser útiles puesto que A -at Jk , t .l , los niveles de TNF-a no serían tóxicos y se podría utilizar una concentración más efectiva y/o una mayor duración del vector terapéutico. 2.8. BACTERIAS DIRIGIDAS A TUMORES Se ha demostrado que Salmonella genéticamente manipulada para poder enfocarse a tumores poseen una actividad anti-tumor y son útiles para suministrar genes efectores tales como la timidinquinasa de herpes simplex (HSV TK) a tumores sólidos (Pawelek et al . , WO 96/40238). 2.9. INDUCCIÓN DISMINUIDA DE TNF-a POR LIPIDO A BACTERIANO MODIFICADO Modificaciones en la composición de lípido de bacterias dirigidas a tumores que alteran la respuesta inmunológica como resultado de una inducción disminuida de la producción de TNF-a fueron sugeridas por Pawelek et ai. (Pawelek et al . , WO 96/40238). Pawelek et ai. proporcionaron métodos para el aislamiento de genes a partir de Rhodobacter responsable de la producción del lípido A de monofosforilo (MLA) . MLA actúa como un antagonista de choque séptico. Pawelek et al . sugirieron también el uso de modificaciones genéticas en vía biosintética, incluyendo mutación de firA, que codifica la tercera enzima UDP-3-0 (R-30 hidroxilmiristoil) -glucosamina-aciltransferasa en la biosíntesis de lípido A (Kelley et al . , 1993, J. Biol. Chem. 268:19866-19874). Pawelek et al . mostraron que mutaciones que en el gen firA inducen niveles menores de TNFa. En Escherichia coli , el gen msbB (ml t) que es responsable de la miristalización terminal de lípido A ha sido identificado (Engel, et ai., 1992, J. Bacteriol. 174:6394-6403; Karow y Georgopoulos 1992, J. Bacteriol. 174:702-710; Somerville et ai., 1996, J. Clin. Invest. 97:359-365). Una desorganización genética de este gen resulta en una mutación estable no condicional que disminuye la inducción de TNFa (Somerville et ai., 1996, J. Clin. Invest. 97:359-365; Somerville, WO 97/25061) . Estas referencias, sin embargo, no sugieren que la desorganización del gen msbB en vectores de Salmonella enfocados a tumor resultaría en bacterias con menos virulencia y más sensibles a los agentes de quelación. Los problemas asociados con el uso de bacterias como vectores de administración de genes se centra en la capacidad general de las bacterias de matar directamente células normales de mamíferos así como en su capacidad de sobre-estimular el sistema inmunológico a través de TNFa, lo que puede tener consecuencias tóxicas para el huésped (Bone, 1992, JAMA 268:3452-3455, y Dinarello et ai., 1993, JAMA 269:1829-1835). Además de esos factores, la resistencia a los antibióticos puede complicar severamente el manejo de la presencia de bacterias dentro del cuerpo humano (Tschape, 1996, D T W Dtsch Tierarztl Wochenschr 1996 103:273-7; Ramos et ai., 1996, Enferm Infec. Microbiol. Clin. 14:345-51).
U JA J -i ? ....
Hone y Powell, W097/18827 ("Hone y Powell") , divulgan métodos para producir bacterias gram-negativas que tienen lípido A no pirogénico o bien LPS. Maskell, W098/33923, describe una cepa mutante de Salmonella > que tiene una mutación en el gen msbB que induce TNFa a un nivel menor en comparación con una cepa de tipo silvestre. Bermudes et ai., WO99/13053, presenta composiciones y métodos • para la desorganización genética del gen msbB en Salmonella, que resulta en Salmonella que posee una capacidad menor de 10 inducir TNFa y una virulencia reducida en comparación con el tipo silvestre. En ciertas modalidades, algunos de estos mutantes de Salmonella tienen una sensibilidad incrementada a áfc los agentes de quelación en comparación con Salmonella de tipo silvestre. Ver también, Low et al . , 1999, Nature 15 Biotech. 17:37-47. Citación o identificación de cualquier referencia en la sección 2, o bien cualquier sección de está solicitud no debe considerarse como una admisión que dicha referencia se encuentra disponible como técnica anterior a la presente 20 invención. • 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece métodos para suministrar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) a un tumor sólido. En una modalidad, los métodos proporcionan la administración 25 de un alto nivel de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) . En particular, la invención ofrece métodos mediante los cuales una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s), que puede (n) ser tóxica (s) o inducir efectos no deseados (por ejemplo, efectos inmunológicos no deseados) cuando se administra (n) sistémicamente a un huésped, puede (n) ser suministrada (s) localmente a un tumor a través de una bacteria dirigida a tumor atenuada, como por ejemplo Salmonella con una toxicidad reducida para el huésped. La presente invención abarca la preparación y el uso de bacterias dirigidas a tumor atenuadas, como por ejemplo, Salmonella, como vector la administración de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) , a un sitio apropiado de acción, como por ejemplo, el sitio de un tumor sólido. Específicamente, las bacterias a tumor atenuadas de la presente invención son aerobios facultativos o anaerobios facultativos manipulados para codificar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria s) . La presente invención ofrece bacterias dirigidas a tumores atenuadas manipuladas par expresar moléculas de ácido nucleico que codifican molécula (s) efectora (s) primaria (s) en el sitio de un tumor sólido. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora primaria. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleido que codifican una o varias moléculas efectoras primarias. De conformidad con esta 5 modalidad, una cepa bacteriana individual es manipulada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias en el sitio de un tumor sólido. En otra modalidad, más que una cepa bacteriana dirigida a tumor atenuada es manipulada para 10 expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias. Er. una modalidad de esta dimensión, las cepas bacterianas dirigidas {fl^ a tumor atenuadas son de la misma especie. En otro moco de esta modalidad, las cepas bacterianas dirigidas a tumores 15 atenuadas son de especies diferentes (por ejemplo, Listaría y Salmonella) . Las moléculas efectoras primarias de la presente invención son útiles para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido, por ejemplo, carcinoma, melanoma, linfoma o sarcoma. Como 20 siempre aquí, la expresión "tratamiento de un tumor sólido" o • bien "tratar un tumor sólido" abarca la inhibiciór. del crecimiento de un tumor o células tumorales, la reducción del volumen de un tumor, la muerte de células tumorales o bien la prevención de la difusión de células tumorales (metástasis) . 25 En una modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención inducen una respuesta inmunológica local en el sitio del tumor que resulta en la inhibición del crecimiento de un tumor o células tumorales, la muerte de células tumorales, o la prevención de la difusión de células 5 tumorales a otras partes del cuerpo. Por consiguiente, las moléculas efectoras primarias proporcionan un efecto terapéutico para el tratamiento de un tumor. Las moléculas efectoras primarias pueden ser derivadas de cualquier organismo conocido, incluyendo, sin limitarse a 10 ellos animales, plantas, bacterias, hongos y protistos, o virus. En un modo preferido de una modo preferido de una modalidad de esta invención la(s) molécula (s) efectora (s) <fl primaria (s) es/son derivada(s) de un mamífero. En modo más preferido de esta modalidad, la(s) molécula (s) efectora (s) 15 primaria (s) es/son derivada (s) de un ser humano. Las moléculas efectoras primarias de la presente invención incluyen miembros de la familia de TNF, factores anti- angiogénicos, polipéptidos o péptidos citotóxicos, enzimas inhibidoras de tumores así como fragmentos funcionales de los 20 mismos. En una modalidad específica, las moléculas efectoras • primarias de la invención son miembros de la familia TNF o fragmentos funcionales de los mismos. Ejemplos de miembros de la familia TNF incluyen, sin limitarse a ellos, factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral-ß 25 (TNF-ß) , ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor débil de apóptosis relacionado con TNF-a (TWEAK), ligando de CD40 (CD40L) , LT-a (linfotoxina alfa), LT-ß (linfotoxina beta), OX40L (ligando de 0X40), FasL, CD27L (ligando de CD27), CD30L (ligando de CD30) , 4-1BBL, APRIL (un ligando inductor de proliferación) , LIGHT (una proteína de transmembrana de tipo II de 29 kDa producida por células T activadas) , TL1 (una citocina de tipo factor de necrosis tumoral), TNFSF16, TNFSF17, y AITR-L (ligando de un miembro de familia de TNFR inducible por activación) . En una modalidad preferida, una molécula efectora primaria de la invención es factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral-ß (TNF-ß), ligando inductor de apóptcsis relacionada con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor débil de apóptosis relacionado con TNF-a (TWEAK) y ligando CD40 (CD4L), o bien un fragmento funcional del mismo. En otra modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención son factores anti-angiogénicos o fragmentos funcionales de los mismos. Ejemplos de factores anti-angiogénicos incluyen sin limitarse a ellos, endostatina, angiostatina, apomigren, anti-trombina III, anti-angiogénica, los fragmentos prcteolíticos N-terminal de 29 kDa y C-terminal de 40 kDa de fibronectina, una antagonista de receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario -4, el fragmento de 24 aminoácidos antiangiogénico de factor plaquetario-4, el factor antiangiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénicos de péptidos que contienen SPARC, RGD y MGR, los pequeños péptidos anti-angiogénicos de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, y antagonistas de péptido de integrina avß3 y el receptor para VEGF. En una modalidad preferida de la invención una molécula efectora primaria de la invención es un fragmento funcional de endostatina, apomigren o trombospondina I. En otra modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención son polipéptidos o péptidos citotóxicos, o fragmentos funcionales de ios mismos. Ejemplos de polipéptidos o péptidos citotóxicos incluyen, sin limitarse a ellos, miembros de la familia de bacteriocina, verotoxina, factor necrótico citotóxico 1 (CNF1) , factor necrótico citotóxico 2 (CNF2), toxina de Pasteureiia mul tiocida (PMT) , endotoxina de Pseudcmonas, hemolisina, tetrapéptidos de CAAX que son inhibidores competitivos potentes de la farnesiltransferasa, inhibidores de ciclina, inhibidores de Raf quinasa, inhibidores de CDC quinasa, caspasas, p53, pl6 y p21. En una modalidad preferida, la .JI-AÍA É molécula efectora primaria es miembro de la familia de bacteriocina, condición que dicho miembro de familia de bacteriocina no sea una proteína de liberación de bacteriocina (BRP) . Ejemplos de miembros de la familia de 5 bacteriocina incluyen sin limitarse a ellos, ColEl, ColEla, ColElb, ColE2, C?lE3, ColE4, C?lE5, C0IE6, C?lE7, C0IE8, ColE9, Colicinas A, Colicina K, Colicina L, Colicina M, • cloacina DF13, pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, megacina A-216, y 10 vibriocina. En una modalidad específica, la molécula efectora primaria es colicina E3. En otra modalidad específica, las moléculas efectoras mk primarias de la invención son enzimas inhibidoras de tumores o fragmentos funcionales de las mismas. Ejemplos de enzimas 15 inhibidoras de tumores incluyen, sin limitarse a ellas, metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, proteasa, ribonucleasa, (excluyendo colE3' , .ADNasa y glicosidasa. En una modalidad preferida, la molécula efectora primaria es metionasa. 20 La presente invención ofrece también métodos para la administración local de combinación de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) a tumores sólidos por bacterias dirigidas a tumores atenuadas, como por ejemplo, 25 Salmoneiia. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora primaria y una molécula efectora secundaria. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias. De conformidad con esta modalidad, una sola cepa bacteriana es manipulada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias en el sitio de un tumor sólido. En otra modalidad, más que una cepa bacteriana dirigida a tumor atenuada es manipulada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias en el sitio de un tumor sólido. En un modo de esta modalidad, las cepas bacterianas dirigidas a tumor atenuadas son de la misma especie. En otro modo de esta modalidad, las cepas bacterianas dirigidas a tumor atenuadas son de especies diferentes (por ejemplo, Listeria y Saimone ia) . La(s) segunda (s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) proporciona (n) una actividad terapéutica anti-tumor adicional, incrementa (n) la liberación de la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) a partir de las bacterias dirigidas a tumor atenuadas y/o incrementa (n) la internalización del sitio de acción, por ejemplo, en el sitio de un tumor sólido. La(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) de la invención comprende una molécula (como por ejemplo una proteína anti- 5 tumor), que incluye, sin limitarse a estos ejemplos, citotoxinas, una enzima y una bacteriocina; una enzima convertidora de profármacos; una molécula de antisentido; una ribozima; un antígeno; etc . ) que se suministra además de la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) a través de los 10 métodos de la invención para tratar un cáncer de tumor sólido, como por ejemplo, carcinoma, melanoma, linfoma, o sarcoma . fe Las moléculas efectoras secundarias pueden ser derivadas de cualquier organismo conocido, incluyendo, sin limitarse a 15 ellos, animales, plantas, bacterias, hongos y protistos o virus. En ciertas modalidades, la molécula efectora secundaria es derivada de una bacteria o virus. En ciertas modalidades preferidas de la invención la(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) es derivada de una bacteria (por 20 ejemplo, BRP) . En otras modalidades preferidas de la invención la(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) es/son derivada(s) de un virus (por ejemplo, TAT). En otras modalidades preferidas de la invención, la(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) es/son derivada (s) de un mamífero. 25 En ciertas modalidades preferidas, la(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) es/son derivada (s) de un ser humano . La invención proporciona bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden molécula (s) efectora (s) codificada (s) por un plásmido o ácido nucleico transfectable. En una modalidad preferida de la invención, la bacteria dirigida a tumor atenuada es Salmone ia. Cuando se expresa más de una molécula efectora (por ejemplo, primaria o secundaria) en una bacteria dirigida a tumor atenuada, como por ejemplo Salmonella , las moléculas efectoras pueden ser codificadas por el mismo plásmido o ácido nucleico, o bien por más que un plásmido o ácido nucleico. La invención proporciona también bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden molécula (s) efectora (s) que es/son codificada (s) por un ácido nucleico integrado en el genoma bacteriano. Molécula (s) efectora (s) integrada (s) puede (n) ser endógena (s) para una bacteria dirigida a tumor atenuada, cor.o por ejemplo, la introducción de ácido nucleico que codifica la molécula efectora, por ejemplo, un plásmido, ácido nucleico transfectable, transposón, etc.) de tal manera que el ácido nucleico que modifica la molécula efectora se vuelve integrado en el genoma de la bacteria dirigida a tumor atenuada. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora en donde el ácido nucleico está unido de manera operativa a un promotor apropiado. Un promotor unido operativamente a un ácido nucleico que codifica una molécula efectora puede ser homologo o bien heterólogo (es decir, no nativo para el ácido nucleico que codifica la molécula efectora) . Ejemplos de 5 promotores adecuados se incluyen sin limitarse a ellos, el promotor Tet, tre, pepT, lac, sulA, pol II (dinA) , ruv, recA, uvrA, uvrB, uvrD, umuDC, lexA, cea, caá, recN y pagC. La presente invención ofrece también métodos para la administración local de una o varias proteínas de fusión que 10 comprende una secuencia de señales y una molécula efectora con bacterias dirigidas a tumor atenuadas. En una modalidad preferida, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son ? manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas que comprenden 15 proteína de tipo Omp o una porción de la misma (por ejemplo, secuencia de señal, secuencia líder, región periplásmica, dominio de transmembrana, dominio de transmembrana múltiples, o una combinación de los mismos; véase infra, sección 3.1 para definición la "proteína de tipo Omp") y una molécula 20 efectora. Sin pretender limitarse a un mecanismo, los presentes inventores creen que la proteír.a de tipo Omp actúa como un ancla o un sujetador para la molécula efectora sobre la membrana externa o bien sirve para localizar la molécula efectora en la membrana externa bacteriana. En ciertas 25 modalidades, la molécula efectora tiene una administración incrementada hacia la membrana externa de la bacteria. En una modalidad, la fusión de una molécula efectora sobre una proteína Omp se utiliza para incrementar la localización de una molécula efectora en el periplasma. En ciertas otras 5 modalidades la fusión de una molécula efectora con una proteína de tipo Omp se utiliza para incrementar la liberación de la molécula efectora. Ejemplos de proteínas de tipo Omp incluyen, sin limitarse a ellas, por lo menos una porción de cada una de las siguientes: OmpA, OmpB, OmpC, 10 OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, una proteína de tipo porina, PhoA, PhoE, la B, ß-lactamasa, una enterotoxina, proteína A, endoglucanasa, lipoproteína asociada con péptidoglicano (PAL) m FepA, FhuA, NmpA, NmpB, N pC, y una lipoproteína de membrana externa mayor (como por ejemplo, LPP) . En otras modalidades 15 de la invención, una proteína de fusión de la invención comprende un sitio de disociación proteolítico. El sitio de disociación proteolítico puede ser endógeno con relación a la molécula efectora o bien endógeno con relación a la proteína de tipo Omp, o bien el sitio de disociación proteolítico 20 puede ser construido en la proteína de fusión. • La presente invención ofrece métodos para la administración local de una o varias proteínas de fusión, que comprende un péptido de transporte y una molécula efectora a un tumor sólido por bacterias dirigidas a tumor atenuadas. Péptidos de 25 transporte utilizados en proteínas de fusión facilitan la administración de un polipéptido o péptido de interés a virtualmente todas las células dentro de los límites de difusión de su producción o introducción (véase, por ejemplo, Bayley, 1999, Nature Biotechnology 17:1066-1067; Fernández et ai., 1998, Nature Biotechnology 16:418:420, y Derossi et al . , 1998, Trends Cell Biol. 8:84-87). Por consiguiente, bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar proteínas de fusión que comprende un péptido de transporte y una molécula efectora incrementan la capacidad de una molécula efectuada para ser internalizada por células tumorales. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son manipuladas para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una prcteína de fusión que comprende un péptido de transporte y - a molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión que comprenden un péptido de transporte y ¿na molécula efectora. De conformidad con estas modalidades, la molécula efectora puede ser una molécula efectora primaria o secundaria. Ejemplos de péptidos de transporte incluyen, sin limitarse a ellos, péptidos derivados de la proteína TAT de VIH, el homeodominio de antenapedia (penetratma) , factor de crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF) , secuencia de translocacicn de membrana (MTS) y virus herpes simplex VP22.
La presente invención ofrece invención métodos para la administración local de una o varias proteínas de fusión que comprenden un péptido de señal, un péptido de transporte y una molécula efectora a un tumor sólido mediante una bacteria dirigida a tumor atenuada. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión que corresponde a una secuencia de señal, un péptido de transporte y una molécula efectora. De conformidad con esta modalidad, la molécula efectora puede ser una molécula efectora primaria o secundaria. La presente invención proporciona también métodos para administración local de una o varias proteínas de fusión, que comprende un péptido de señal, un sitio de disociación proteolítica, un péptido de transporte y una molécula efectora a un tumor sólido mediante bacteria dirigida a tumor atenuada. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión que comprende una secuencia de señales, sitios de disociación proteolítica, un péptido de transporte y una molécula efectora. De conformidad con esta modalidad, la molécula efectora puede ser una molécula efectora primaria o secundaria. \ *st i ti En ciertas modalidades, una cepa bacteriana única es manipulada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de la invención en el sitio de un tumor sólido. En ciertas otras modalidades, más que una cepa bacteriana dirigida a tumor atenuada es manipulado para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención en el sitio de un tumor sólido. En modos de estas modalidades, las cepas bacterianas dirigidas a tumor atenuadas son de la misma especie. En otros modos de estas modalidades, las cepas bacterianas dirigidas a tumor atenuadas son de especies diferentes (por ejemplo, Listeria y Salmonella) . La presente invención ofrece también métodos para la administración local de una o varias proteínas de fusión de la invención y una varias moléculas efectoras de la invención en el sitio de un tumor sólido por bacterias dirigidas a tumor atenuadas. De preferencia la expresión proteína (s) de fusión y molécula (s efectora (s) en ei sitio de tumor sólido por una bacteria que se enfoca a tumor atenuada mejora el nivel de crecimiento tumoral o crecimiento de células tumorales inhibido er. comparación con la situación cuando o bien proteína (s) de fusión sola(s) o molécula (s) efectora (s) sola(s) se expresa (n . La presente invención ofrece también la expresión de una --- - --- -- - ?.t molécula efectora primaria y opcionalmente una molécula efectora secundaria en una bacteria dirigida a tumores atenuada, como por ejemplo Salmonella , dicha bacteria tiene un mejor sistema de liberación. En una modalidad preferida de la invención, la liberación incrementada se relaciona con la expresión de un factor de liberación por la bacteria dirigida a tumor atenuada. En una modalidad, la liberación permite una liberación incrementada de moléculas efectoras del espacio citoplásmico o periplásmico. Un factor de liberación puede ser endógeno con relación a la bacteria dirigida a tumor atenuada o puede ser exógeno (es decir, codificado por una molécula de ácido nucleico que no es nativa de la bacteria dirigida a tumor atenuada) . Un factor de liberación puede estar codificado por un ácido nucleico que comprende ur. plásmido, o bien por un ácido nucleico integrado en el genoma de la bacteria dirigida a tumor atenuada. Un factor de liberación puede estar codificado por el ácido nucleico c plásmido que codifica una molécula efectora primaria, o bie por un ácido nucleico o plásmido separado. Un factor de liberación puede estar codificado por el mismo ácido nucleico o plásmido que codifica una molécula efectora secundaria, z bien por un ácido nucleico o plásmido separado. En una modalidad preferida, el factor de liberación es una Proteína de Liberación de Bacteriocina (BRP) . En una modalidad específica, la BRP es la BRP del plásmido DF13 de cloacina, una BRP de los plásmidos E1-E9 de colicina, o bien de los plásmidos A, N o D de colicina. En una modalidad preferida, la BRP es de DF13 de cloacina (pCloDF13 BRP) . En otra modalidad de la invención, el sistema de liberación 5 incrementado comprende la sobreexpresión de una proteína de porina. La presente invención ofrece también a la expresión de una proteína de fusión de la invención en una bacteria dirigida a tumor, como por ejemplo, Salmonella, dicha bacteria tiene un 10 sistema de liberación realzado. En una modalidad específica, el factor de liberación es expresado en una célula que expresa también una proteína de fusión que comprende una ^fe molécula efectora primaria fusionada sobre una proteína de tipo Omp. En esta modalidad, la co-expresión del factor de 15 liberación permite la liberación incrementada de la proteína de fusión a partir del espacio periplásmico. En una modalidad, la presente invención ofrece métodos para suministrar altos niveles de moléculas efectoras o proteínas de fusión utilizando cepas de bacteria dirigidas a tumor 20 atenuadas, modificadas, que se acumulan selectivamente dentro • de tumores mientras expresan las moléculas efectoras o proteínas de fusión. En un modo específico, una cepa de bacteria dirigida a tumor atenuada, modificada amplifica selectivamente moléculas efectoras dentro de tumores. 25 Mientras las enseñanzas de las secciones siguientes se comentan, para mayor simplicidad, con referencia específicamente a Salmonella, las composiciones y métodos de la invención no se limitan a la Salmonella, si no que abarcan cualquier otra bacteria a la cual aplican las enseñanzas. Específicamente, la invención ofrece una bacteria dirigida a tumor atenuada que es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo. Ejemplos de bacterias dirigidas a tumor, atenuadas incluyen, sin limitarse a ellas, Escherichia coli , incluyendo Escherichia coli enteroinvasiva, Salmonella spp. , Shigella spp. , Yersinia enterocohtica , Listeria monocytogenies, Micoplasma hominis, y Streptomoccus spp. La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada para que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias. La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias. La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención. Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención y una o varias moléculas efectoras (es decir, moléculas primarias y/o secundarias) . En una modalidad preferida, la bacteria dirigida a tumor atenuada es Salmonella . Las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles para el tratamiento de tumores sólidos. Tumores sólidos incluyen, sin limitarse a ellos, sarcomas, carcinomas, linfomas, y otros cánceres de tumor sólido incluyendo, sin limitarse a ellos, tumores de línea germinal, tumores del sistema nervioso central, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer pulmonar, cáncer de ovarios, cáncer testicular, cáncer de la tiroide, astrocitoma, glioma, cáncer pancreático, cáncer del estómago, cáncer del hígado, cáncer de colon, melanoma, cáncer renal, cáncer de vejiga y mesotelioma. La presente invención ofrece métodos para suministrar una molécula efectora primaria para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración a un animal, de preferencia un mamífero, y con mayor preferencia un ser %Jb humano, que requiere de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias 5 moléculas efectoras primarias. La presente invención ofrece también métodos para suministrar una molécula efectora primaria para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración, a un animal, de preferencia un mamífero, y con mayor preferencia un ser humano, que requiere 10 de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido ? nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias. La 15 presente invención ofrece también métodos para suministrar una molécula efectora primaria para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración a un animal, de preferencia a un mamífero y muy especialmente a un ser humano, que requiere de dicho tratamiento, de una 20 composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención. Además, la presente invención ofrece métodos para suministrar una molécula 25 efectora primaria para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración a un animal, de preferencia a un mamífero, y muy especialmente a un ser humano, que requiere de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada de tal manera que contenga una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención y una o varias moléculas efectoras (es decir, moléculas primarias y/o secundarias) . En una modalidad preferida, la bacteria dirigida a tumor atenuada es Saimoneiia. En un modo específico, la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende un sistema de liberación realzado. En ciertas modalidades, bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión pueden ser utilizadas en combinación con otras terapias conocidas para tratar el cáncer. Por ejemplo, bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión pueden ser utilizadas en combinación con un agente quimioterapéutico. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitarse a ellos, cisplatina, ifosfamida, paclitaxol, taxanos, inhibidores de topoisomerasa I (por ejemplo, CPT-11, topotecano, 9-AC, y GG-211), gemcitabina, vinorelbina, oxaliplatina, 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, vinorelbina, temodal, taxol, citocalasina B, gramicidina D, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristanina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, 5 daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrcna, itramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, elfalano, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propanolol, y homólogos de puromicina, y citoxano. Alternativamente, bacterias dirigidas a tumor atenuadas 10 manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión pueden utilizarse en combinación con una flt terapia de radiaciones. La presente invención incluye la administración secuencial o 15 concomitante de agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión. La invención abarca combinaciones de agentes anticéncer y bacterias 20 dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión que son aditivas o sinérgicas. La invención abarca también combinaciones de agentes 25 anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas .*.?&* , , t ¿?? . fe A < _ ^. A ^J .. , . manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión que tienen sitios de acción diferentes. Dicha combinación ofrece una terapia mejorada basada en la acción doble de estos agentes terapéuticos ya sea que la combinación sea sinérgica o aditiva. Así, la terapia de combinación novedosa de la presente invención proporciona una eficacia mejorada en comparación con cualesquiera de los agentes empleados como monoterapia. 3.1. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS Como se emplea aquí, Salmonella abarca todas las especies de Salmonella, incluyendo: Salmonella typhi , Salmonella choleraesuis , y Salmonella enteri tidi s . Serotipos de Salmonella están también incluidos dentro de este concepto, por ejemplo, typhimurium, un subgrupo de Salmonella enteri tidis, comúnmente conocido como Salmonella typhimuri um. Análogo: Como se emplea aquí, el término "análogo" se refiere a un polipéptido que posee una función similar o idéntica como molécula efectora primaria o secundaria pero que no comprende necesariamente una secuencia similar o idéntica de aminoácidos de una molécula efectora primaria o secundaria ni posee una estructura similar o idéntica de molécula efectora primaria o secundaria. Un polipéptido que tiene una secuencia similar de aminoácidos se refiere a un polipéptido que cumple por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta un nivel de identidad de por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 4 %, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo .renos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 93%, por lo menos 95% o bien por lo menos 99% con la secuencia de aminoácidos de una molécula efectora primaria o secundaria descrita aquí; (b) un polipéptido codificado per una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones estrictas con una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula efectora primaria o secundaria descrita aquí de por lo menos 5 aminoácidos contiguos, por lo menos ÍC residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 20 residuos de amir.cácidos contiguos, por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos "A residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, cor lo menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, oor lo menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, o oien por lo menos 150 residuos de aminoácidos contiguos; y c) un polipéptido codificado por fe&fr á • i .A. una secuencia de nucleótidos que presenta un nivel de identidad de por lo menos 30%, por lo menos 35%, por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo 5 menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 99% con la secuencia de nucleótidos que codifica una molécula efectora primaria o • secundaria descrita aquí. Un polipéptido con estructura similar a una molécula efectora primaria o secundaria 10 descrita aquí se refiere a un polipéptido que tiene una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de molécula efectora primaria o secundaria descrita aquí similar. La estructura de un polipéptido puede ser determinada por métodos conocidos por parte de los expertos en la materia, 15 incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, secuenciamiento de péptidos, cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear, dicroísmo circular así como microscopía electrónica cristalográfica. Factor anti-angiogénico: Un factor anti-angiogénico es 20 cualquier molécula proteinácea que tiene una actividad anti- • angiogénica, o un ácido nucleico que codifica dicha molécula proteinácea. En una modalidad preferida, el factor antiangiogénico es un fragmento de péptido o bien un fragmento de disociación de una proteína más grande. 25 Atenuación: La atenuación es una modificación de tal manera que un microorganismo o vector sea menos patogénico. El resultado final de la atenuación es que el riesgo de toxicidad así como otros efectos colaterales disminuyen cuando el microorganismo o vector es administrado al 5 paciente. Bacteriocina: Una bacteriocina es una toxina proteinácea bacteriana con actividad selectiva, en donde el huésped bacteriano es inmune a la toxina. Las bacteriocinas pueden ser codificadas por el genoma de huésped bacteriano o bien 10 por un plásmido, pueden ser tóxicas para un rango amplio o angosto de otras bacterias, y pueden tener una estructura simple que comprende una o dos subunidades o bien pueden ser ^fc una estructura de subunidades múltiples. Además, un huésped que expresa una bacteriocina tiene inmunidad contra la 15 bacteriocina. Sensibilidad a agente de quelación: La sensibilidad a agente de quelación se define como la concentración efectiva a la cual la proliferación bacteriana es afectada, o bien la concentración a la cual la viabilidad de bacterias, de 20 conformidad con lo determinado por las unidades formadores de • colonias (c.f.u.) recuperables se reduce. Derivados: Como se emplea aquí, el término "derivado" en el contexto de un "derivado de un polipéptido" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de un 25 polipéptido, como por ejemplo una molécula efectora primaria o secundaria, que ha sido alterada por introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos, o bien por la fijación covalente de cualquier tipo de molécula sobre el polipéptido. El término "derivado" 5 como se emplea aquí en el contexto de un "derivado de una molécula efectora primaria o secundaria" se refiere a una molécula efectora primaria o secundaria que ha sido modificada de esta manera, por ejemplo, por la fijación covalente de cualquier tipo de molécula sobre la molécula 10 primaria o secundaria. Por ejemplo, pero sin que sea limitativo, una molécula efectora primaria o secundaria puede ser modificada, por ejemplo, por disociación proteolítica, — unión con un ligando celular o bien otra proteína, etc. Un derivado de una molécula efectuar primaria o secundaria puede 15 ser modificado por modificaciones químicas empleando técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia (por ejemplo, por acilación, fosforilación, carboxilación, glicosilación, modificación con selenio y sulfatación) . Además, un derivado de una molécula efectora primaria o 20 secundaria puede contener uno o varios aminoácidos no clásicos. Un derivado de polipéptido posee una función similar o idéntica a la molécula efectora primaria o secundaria descrita aquí. El término "derivado" en el contexto de un "derivado de un mutante de Salmonella dirigido 25 a tumor atenuado msbB"" se refiere a un mutante de Salmc ella msbB' modificado de conformidad con le definido en la Publicación Internacional No. WO 99/13053 en la página 17, que se incorpora aquí en su totalidad. Fragmento: Como se emplea aquí, el término "fragmento" se 5 refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 20 residuos de 10 aminoácidos contiguos, por lo menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 50 residuos de • aminoácidos contiguos, por lo menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 70 residuos de 15 aminoácidos contiguos, por lo menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 150 residuos de 20 aminoácidos contiguos, por lo menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, por lo menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o por lo menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de una molécula efectora primaria o secundaria. 25 Fragmento funcional: Como se emplea aquí, el término "fragmento funcional" se refiere a un fragmento de una molécula efectora primaria o secundaria que conserva por lo menos una función de la molécula efectora primaria o secundaria (por ejemplo, actividad enzimática, actividad anti-angiogénica, o actividad anti-tumor de la molécula efectora) . Proteína de fusión: Como se emplea aquí, el término "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la molécula efectora primaria o secundaria, o bien un fragmento funcional o derivado de la misma, y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido heterólogo (por ejemplo, una molécula efectora no primaria o no secundaria) . Proteína de tipo Omp: Como se emplea aquí, una proteína de tipo Omp incluye cualquier proteína de membrana externa bacteriana, o porción de la misma (por ejemplo, una secuencia de señal, secuencia líder, región periplásmica, dominio de transmembrana, dominios de transmembrana múltiples o combinaciones de los mismos) . En modalidades específicas, la proteína de tipo Omp es por io menos una porción de OmpA, OmpB, OmpC, OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, una proteína de tipo porisina, PhoA, PhoE, lamB, ß-lactamasa, una enterotoxina, proteína A, endoglucanasa, lipoproteína asociada con péptidoglicano (PAL) , FepA, FhuA, NmpA, NmpB, N pC, z bien una lipoproteína de membrana externa mayor (como por ejemplo LA LPP) , etc. Purificada: Como se emplea aquí, una cepa bacteriana dirigida a tumor atenuada "purificada" se encuentra sustancialmente libre de proteínas contaminantes o aminoácidos contaminantes (por ejemplo, residuos de bacterias muertas) o medio. Una cepa bacteriana dirigida a tumor atenuada sustancialmente libre de proteínas o aminoácidos contaminantes incluye preparaciones de bacterias dirigidas a tumor atenuadas que tienen menos que aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína o aminoácido contaminante. Factor de liberación: Como se emplea aquí, un factor de liberación incluye cualquier proteína, o porción funcional de la misma, que incrementa la liberación de componentes bacterianos. En una modalidad, un factor de liberación es una proteína de liberación de bacteriocina. Factores de liberación incluyen, sin limitarse a ellos, ia prcteína de liberación de bactenocina (BRP) codificada por ei plásmido D13 de cloacina, las 3RPs codificadas por los plásmidos E1-E9 de colicina, o las BRPs codificadas por los plásmidos A, N o D de colicina. Choque séptico: Un choque séptico es un estado de falla de órganos internos debido a una cascada de citocinas compleja iniciada por TNF-a. La capacidad relativa de un microorganismo o vector para inducir TNF-a se utiliza como una medición para indicar su capacidad relativa para inducir un choque séptico. Dirigida a tumor: Dirigida a tumor se define como la capacidad de localizarse de preferencia sobre un tejido celular objetivo canceroso en comparación con un tejido celular correspondiente no canceroso y replicarse. Así, una bacteria dirigida a tumor como por ejemplo Salmonella de preferencia se fija, infecta y/o permanece viable en la célula objetivo cancerosa o en el entorno de tumor. Virulencia: La virulencia es un término relativo que describe la capacidad general para provocar enfermedad, incluyendo la capacidad de matar células normales o la capacidad de provocar choques sépticos (ver definición específica abajo) .
Como se emplea aquí, las designaciones de cepa VNF20009 (Publicación Internacional No. WC 99/13053), YS1646 y 41.2.9 se utilizan de manera intercambiable y cada una de dichas designaciones se refiere a la cepa depositada ante la American Type Culture Collectio y que recibió el NA. de Acceso 202165. De conformidad con lo utilizado aquí, las designaciones de cepa YS1456 y 8.7 se utilizan de manera intercambiable y cada uno se refiere a la cepa depositada ante la American Type Culture Collection y recibió el No. de Acceso 202164. La presente invención puede ser entendida más cabalmente per referencia la siguiente descripción detallada, a los ejemplos ilustrativos de modalidades específicas y a las figuras . M'fc * íí anexas. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DS LAS FIGURAS Figura 1. Secuencia codificadora para el TNF-a humano maduro. Se indican tanto secuencias de ADN (SEQ ID NO: 3) y proteína (SEQ ID NO: 4) . Figura 2. Derivación de cepa VNP20009 serC de Salmonella . Figura 3. TNF-a, expresión a partir de un gen TNF-a impulsado por promotor tre integrado cromosómicamente en Salmonella typhimurium. Figura 4. Secuencia codificadora para la fusión de secuencia de señal OmpA sintética (nucleótidos 1-63) con el TNF-a humano madura (nucleótidos 67-543) . Tanto secuencias de ADN (SEQ ID NO: 7) como de proteína (SEQ ID NO: 8) son indicadas para el constructo de fusión. Figura 5. Localización periplásmica y procesamiento de una proteína de fusión OmpA/TNF-a en E-coli (cepa JM109) . Figura 6. Secuencia codificadora para la fusión de secuencia de señal de OmpA (nucleótidos 1-63) sobre TRAIL humano maduro (nucleótidos 67-801). Tanto secuencias de ADN (SEQ ID NO: 9) como de proteína (SEQ ID NO: 10) son indicadas para el constructo de fusión. Figura 7. Expresión y procesamiento de una proteína de fusión OmpA TRAIL en E-coli (cepa JM109) . Figura 8. Secuencia codificadora para la fusión de secuencia de señal de OmpA modificada (nucleótidos 1-63) con IL-2 de ser humano madura (C125A) (nucleótidos 64-462) . Tanto secuencias de ADN (SEQ ID NO: 11) como de proteína (SEQ ID NO: 12) son indicadas para el constructo de fusión. Figura 9. Expresión y procesamiento de IL-2 humana madura fusionada sobre los péptidos de señal sintéticos phoA (8L) o bien ompA (8L) . Figura 10. Secuencia codificadora para la fusión de secuencia de señal phoA modificada (nucleótidos 1-63) por IL-2 humana madura (C125A) (nucleótidos 64-462) . Tanto secuencias de ADN (SEQ ID NO: 13) como de proteína (SEQ ID NO: 14) son indicadas para el constructo de fusión. Figura 11. Eficacia anti-tumor in vivo de una cepa atenuada de Salmonella typhimuri um que expresa la forma madura de TNF- a humano . Figura 12. Efecto de expresión BRP sobre la eficacia antitumor ín vi vo . La figura muestra una representación gráfica de un tamaño promedio de tumor con el paso del tiempo de una población de ratones C57BL/6 con tumores de melanoma B16 tratados con (1) un control de PBS; Í2) VNP20009; y (3) VNP20009 que contiene el plásmido pSWl, que comprende el gen de BRP. Figura 13. Inducción anaeróbica de expresión de gen ß-gal bajo el control del promotor pepT en Saímonelia. La figura 13A demuestra ia inducción in vi tro de la expresión de ß-gal en respuesta a condiciones anaeróbicas de dos cepas de Saimonelia, YS1456 y VNP20009. La figura 13B demuestra la inducción in vivo de ß-gal en tumor v. células hepáticas de VNP20009 Salmonella que expresan BRP, ß-gal, o BRP y ß-gal. Figura 14. Inducción por tetraciclina de la expresión de gen ß-gal bajo el control del promotor Tet en Salmonella . La respuesta a la dosis indica una respuesta lineal a la tetraciclina hasta una concentración de aproximadamente 0.15 µg/ml, después de lo cual esta respuesta disminuye, probablemente como resultado de la función antibiótica de la tetraciclina. Figura 15. Expresión de hexahistidina-endostatina (HexaHIS-endostatina) a partir del vector pTrc99a. La figura 15A muestra la expresión de HexaHIS-endostatina a partir de tres clones independientes transformados en Salmonella (VNP2 009) . La figura 15B muestra la expresión de HexaHIS-endostatma a partir de cinco clones independientes transformados en E. coli (DH5a) . Los carriles pares indican extractos de cultivos no inducidos mientras que los carriles impares indican los cultivos inducidos con IPTG correspondientes. Figura 16. Expresión de HexaHIS-endostatina a partir del plásmido YA3334: HexaHIS-endostatina en el sistema asd (utilizando el promotor tre) puede expresar una banda del tamaño correcto para HexaHIS-endostatina (aproximadamente 25 kD) por análisis Western con un anticuerpo anti-histidina (los carriles 1-8 corresponden a ocho clones independientes) .
Figura 17. Eficacia de células VNP20009 que expresan endostatina en carcinoma de colon de murino C38. La figura muestra una representación gráfica de un tamaño promedio de tumor con el paso del tiempo de una población de ratones con tumores C38 establecidos tratados con (1) un control de PBS; (2) ascTVNP20009 que lleva un vector YA3334 vacío; (3) asd~ VNP20009 que expresa hexahistidina-endostatina; (4) y VNP20009 que expresa hexahistidina-endostatina y BRP. Figura 18. Eficacia de células de VNP20009 que expresan endostatina en carcinoma de colon humano DLDl. La figura 1 muestra una representación gráfica de un tamaño promedio de tumor con el paso del tiempo de una población de ratones desnudos con tumores DLDl establecidos tratados con (1) un control de PBS; (2) asd"VNP20009 que lleva un vector YA3334 vacío; y (3) VNP20009 que expresa hexahistidina-endostatina y BRP. Figura 19. Actividad antiproliferativa de usados a partir de Salmonella dirigida a tumor atenuada que expresa endostatina humana en células endoteliales. Esta figura muestra la inhibición de la proliferación de células endoteliales venosas humanas (HUVEC) en respuesta a bFGF y usados que corresponden a 8 x 10" bacterias. Como control, se utilizó Saimoneiia que contiene el vector pTrc vacío. Cada punto de datos es una media de valores por cuadruplicado a partir de un experimento representativo. Las muestras fueron normalizadas por el número de bacterias. Figura 20. Actividad antiproliferativa de lisados a partir de Salmonella dirigida a tumor atenuada que expresa péptidc de factor propietario-4 (aminoácidos 47-70 de factor plaquetario 4) y péptido de trombospondina (13.40) en células endoteliales. Esta figura muestra la inhibición de la proliferación de células endoteliales venosas humanas (HUVEC) en respuesta a bFGF y lisados que corresponden a 3.2 x 10° bacterias. Como control, se utilizó Salmonella que contenía el vector pTrc vacío. Cada punto de dato es una media de valores por cuadruplicado a partir de un experimento representativo. Las muestras fueron normalizadas por el número de bacterias. Figura 21. Construcción del vector pE3. shuttle-1. Figura 22. Construcción del vector Col E3-CA38 (GenBank, No. de Acceso AF129270) . La secuencia de nucieótidos del vector Col E3-CA38 es de conformidad con lo mostrado en SEQ ID N : 1. El vector Col E3-CA38 contiene 5 marcos abiertos de lectura de conformidad con lo presentado en SEQ ID NO: 2-5, respectivamente. Figura 23. Construcción del vector Col E3-CA38/BRP-1. Figura 24. Gráfica de barras que muestra la cantidad de unidades letales de E3 de colicina producidas por cada cepa. Figura 25. Ensayo de Halo para varias cepas expuestas a luz ultravioleta o rayos x. a ái . i? i Figura 26. Eficacia de 41.2.9/Col E3 sobre carcinoma de colon de murino C38. Figura 27. Actividad antitumoral de 41.2.9/Col E3 sobre carcinoma de colon humano DLDl en ratones UN/Un . Figura 28. Eficacia de 41.2.9/Col E3 sobre melanoma de murino B16. Figura 29. Citotoxicidad de Salmonella que expresa E. coli C?F1 clonado. Figura 30. Células Hela expuestas a C?F1 (A) muestran ampliación y multinucleación en comparación con células Hela normales (B) . Figura 31. La porción msbB del vector pCVD442-msjS en la orientación 3' a 5' (según lo visto en el mapa de la figura 32), con una deleción en la parte media de msbB y que contiene polienlazadores internos Nctl , Pací, Sphl, Sfil, Sival y Dral en su lugar (SEQ ID ?O:61). Ver figura 32. Figura 32. Mapa de restricción y esquemático del vector pCVD442-i7iS B para clonación de AD? en la región OmsbB e inserción subsecuente en el cromosoma. ms¿Sdel, las regiones 5' y 3' de DmsbB; mob RP4, el elemento de movilización para que el plásmido sea transferido de una cepa a otra. Jbia: el gen de beta-lactamasa que proporciona sensibilidad a antibióticos b-lactámicos tales como carbenicilina y ampicilina. sacB, el gen que proporciona sensibilidad a la sucrosa.
Figura 33. 1) vector pCVD442-Tet-BRP-AB, 2) recombinación homologa con la copia cromcsómica de Dj.sbB en Salmonella YS50102, 3) integración cromosómica en Salmonella YS50102, y transducción de fagos seguida en cepa VNP2C009, 4) reducción de sucrosa que resulta en cepa 41.2.9-Tet-3RP-AB. oriR6K, el origen de replicación de plásmido; mobRP4, el elemento de movilización para que el plásmido sea transferido de una cepa a otra. amp; el gen de beta-lactamasa que proporciona sensibilidad a antibióticos b-lactámicos tales como carbenicilina y ampicilina. sacB, el gen que proporciona sensibilidad a la sucrosa. Nota: no dibujado a escala. Figura 34. Citotoxicidad porcentual de cien #26 y clon #31 de tetBRPAB en comparación con controles positivos y negativos (HSC10 y 41.2.9) después de 2 horas de exposición a células SKOV3 (Ave N=8) . La expresión de verotoxir.a fue inducida por tetraciclina (ver clones 26 y 31) . Tratamiento con tetraciclina (+) ; y tratamiento sin tetraciclina (-) . La cepa de E. coli HSC10 fue utilizada como un control positivo para la citotoxicidad porcentual. Figura 35. Formación de Halo en agar de sangre para Salmonella dirigida a tumor atenuada en ausencia de tetraciclina (ÍA) y en presencia de tetraciclina (IB) . La formación de Halo para Salmoneila dirigida a tumor atenuada manipulada para expresar constitutivamente SheA, en ausencia de tetraciclina (2A) y en presencia de tetraciclina (2B) .
Formación de Halo para Salmonella dirigida a tumor atenuada manipulada para expresar SheA inducible por tetraciclina en ausencia de tetraciclina (3A) y en presencia de tetraciclina (3B) . Figura 36. (A) Una ilustración de la proteína de fusión TAT-apoptina sin el marcador de hexahistadina . (B) Una ilustración de la proteína de fusión TAT-apoptina con el marcador de hexahistadina. (C) A) Una ilustración de la proteína de fusión TAT-apoptina con una secuencia de señal de OmpA-8L. Figura 37. Secuencia codificadora para la proteína de fusión TAT-apoptina. Ambas secuencias de ADN (SEQ ID NO: 57) y de proteína (SEQ ID NO: 58) están indicadas. Figura 38. Secuencia codificadora para proteína de fusión hexahistidina-TAT-apoptina. Ambas secuencias de ADN (SEQ ID NO: 59) y de proteína (SEQ ID NO: 60) están indicadas. Figura 39. Eficacia de la terapia de combinación VNP20009/citoxano sobre el crecimiento de carcinoma pulmonar M27 en ratones CS^BL/d. Figura 40. Eficacia de la terapia de combinación VNP20009/mitomicina sobre el crecimiento de carcinoma pulmonar M27 en ratones C57BL/6. Figura 41. Eficacia de la terapia de combinación VNP20009/cisplatina sobre el crecimiento de carcinoma pulmonar M27 en ratones C57BL/6. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención utiliza cepas dirigidas a tumor atenuadas de bacterias para suministrar altos niveles de molécula (s) efectora (s) primaria (s) terapéutica (s) a tumores. La presente invención ofrece la ventaja de evitar la toxicidad sistémica potencial de ciertas moléculas efectoras primarias (por ejemplo, choque séptico provocado por TNF-a) . La presente invención ofrece la administración de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) a un tumor sólido. Más particularmente, la presente invención abarca la preparación y el uso de bacterias dirigidas a tumores atenuadas, por ejemplo Salmonella , como un vector para la administración de una o varias molécula (s) efectcra(s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectcra(s) secundaria (s) , a un sitio de acción apropiado, por ejemplo, el sitio de un tumor sólido. Específicamente, las bacterias dirigidas a tumores atenuadas de la presente invención son aerobios o anaerobios facultativos manipulados para codificar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) . El sistema de administración basado en bacterias dirigidas a tumores atenuadas actualmente descrito ofrece la administración local de una c varias molécula (s) efectora (s) ..A. AÍ al sitio de tumores sólidos. La invención proporciona métodos seguros y efectivos a través de los cuales una(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s), que puede (n) ser tóxica (s) o inducir un efecto colateral no deseado (por ejemplo, un efecto inmunológico no deseado) cuando se administra sistémicamente a un huésped, puede ser administrada localmente a tumores a través de una bacteria dirigida a tumor atenuada, por ejemplo Saimoneiia con toxicidad reducida para el huésped. La invención ofrece también la administración en combinación de una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) que se administra (n) a través de una bacteria dirigida a tumores atenuada, por ejemplo Salmonella . L invención ofrece también ia administración en combinación de bacterias diferentes dirigidas a tumores atenuadas que llevan una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) diferente (s) y/o opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) diferente (s) . La presente invención ofrece también métodos para la administración local de una varias proteínas de fusión, que comprende una molécula efectora, a través de bacterias dirigidas a tumores atenuadas manipuladas para expresar dichas proteínas de fusión en el sitie del (os) tumor (es) sólido (s). En una modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una proteína de fusión que comprende un péptido de señal y una molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una proteína de fusión que comprende un péptido de señal, un sitio de disociación proteolítico, y una molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una proteína de fusión que comprende un péptido de transporte y una molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una proteína de fusión que comprende un péptido de señal, un péptido de transporte y una molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una proteína de fusión que comprende un péptido de señal, un sitio de disociación proteolítico, un péptido de transporte y una molécula efectora. Bacterias dirigidas a tumores atenuadas son manipuladas para expresar una o varias proteínas de fusión de la invención y una o varias moléculas efectoras de la invención. La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumores atenuada manipulada para contener una o varias moléculas de ácido nucleico que codifica (n) una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) . La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumores atenuada manipulada para que contenga una o varias molécula (s) de ácido nucleico que codifica (n) una o varias 5 molécula (s) efectora (s) primaria (s) y una o varias molécula(s) efectora(s) secundaria (s) . Además, la presente invención ofrece composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada para contener una o 10 varias molécula (s) de ácido nucleico que codifica (n) una o varias proteínas de fusión y una o varias proteínas efectoras . La presente invención ofrece métodos para el tratamiento de canceres de tumores sólidos en un animal, dichos métodos 15 comprenden la administración a un animal que requiere de dicha administración de una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada para que exprese una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias. La presente invención ofrece también 20 métodos para el tratamiento de canceres de tumores sólidos en un animal, dicho método comprende la administración a un animal que requiere de dicha administración de una bacteria dirigida a tumores atenuada manipulada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifica (n) una o 25 varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias. Además, la presente invención ofrece métodos para el tratamiento de canceres de tumores sólidos en un animal, dichos métodos comprenden la administración a un animal que requiere de dicha administración de una bacteria dirigida a tumor atenuada manipulada para contener una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión y una o varias moléculas efectoras. De preferencia, el animal es un mamífero (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un mono, o un cerdo) y con mayor preferencia, el animal es un ser humano. Ejemplos de canceres de tumores sólidos incluyen, sin limitarse a ellos, sarcomas, carcinomas, linfomas, y otros canceres de tumores sólidos, incluyendo sin limitarse a ellos, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de testículos, cáncer de la tiroide, astrocitoma, glioma, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer del hígado, cáncer de colon, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de línea de células madres, melanoma, cáncer renal, cáncer de vejiga, y mesotelioma. Aún cuando no pretenden ser limitados a un mecanismo específico, los inventores creen que la presente invención resulta en la expresión dirigida de la(s) molécula (s) efectora (s) en el sitio de un tumor mediante la administración del vector bacteriano enfocado a ese tumor atenuado que contiene la(s) molécula(s) efectora(s).
Por razones de claridad, la descripción detallada se divide en las siguientes subsecciones: Vectores Bacterianos; Moléculas Efectoras Primarias para terapia de tumor; Moléculas Efectoras Secundarias para Co-expresión con Moléculas Efectoras Primarias; Derivados y Análogos; Proteínas de Fusión; Vehículos de Expresión; y Métodos de composición para Administración. 5.1 VECTORES BACTERIANOS Cualquier bacteria dirigida a este tumor atenuada puede ser utilizada en los métodos de la invención. Más específicamente, las bacterias dirigidas a ese tumor atenuadas empleadas en los métodos de la invención son aerobios facultativos o anaerobios facultativos. Ejemplos de bacterias dirigidas a ese tumor atenuadas que son aerobios facultativos o bien anaerobios facultativos que pueden ser utilizados en los métodos de la invención incluyen, sin limitarse a ellas, Escherichia coli incluyendo Escherichia coli , Salmonella spp. , Shigella spp. , Yersinia er.zerocoh ica, Listeria monocytogenies , Micoplasma hominis, y Streptococcus spp. , enteroinvasivos . Factores que contribuyen a la atenuación y enfcque a tumor se describen aquí y pueden utilizarse para construir o seleccionar una cepa bacteriana apropiada para su uso en los métodos de la invención. Por ei emplo, r.étodos para seleccionar y aislar bacterias dirigidas hacia el tumor se describen en la sección 6.1, y métodos para atenuar bacterias se describen en la sección 6.2 de la Publicación Internacional WO96/40238, que se incorporan aquí por referencia. Ejemplos de bacterias dirigidas a tumor atenuadas se describen también en la Solicitud Internacional WO99/13053, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En ciertas modalidades de la invención, una bacteria puede ser modificada por métodos conocidos en la técnica para ser atenuada o altamente atenuada. La presente invención ofrece bacterias dirigidas a tumor atenuadas como vector para la administración de una o varias moléculas efectoras primarias (por ejemplo, un miembro de familia TNF, un péptido o polipéptido citotóxico, una enzima inhibidora de tumor, o un factor anti-angiogénico) , sola o en combinación con una o varias moléculas efectoras secundarias. La presente invención ofrece también bacterias dirigidas a tumor atenuadas como vector para la administración de una c varias proteínas de fusión de la invención sola o en combinación con una o varias moléculas efectoras. En una modalidad preferida de la invención, la bacteria dirigida a ese tumor atenuada que es manipulada para expresar una c varias moléculas efectoras que codifican moléculas de ácido nucleico y/o proteínas de fusión es Salmonella . Mientras las enseñanzas de la sección siguiente se refieren específicamente a Salmonella , las composiciones y métodos de la invención no se limitan de ninguna manera a Salmonella si no que abarcan cualquier otra bacteria a la cual se aplican las enseñanzas. Especies adecuadas de bacterias incluyen, sin limitarse a ellas, Escherichia coli incluyendo Escherichia coli, Salmonella spp. , Shigella spp. , Yersinia enterocohtica , Listeria monocytogenies , Micoplasma hominis, Streptococcus spp. , enteroinvasivo, en donde la bacteria es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo. 5.1.1 VECTORES DE SALMONELLA Cualquier bacteria dirigida a este tumor atenuada puede ser modificada empleando las enseñanzas de la presente invención para codificar una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente una o varias moléculas efectoras secundarias para producir una bacteria dirigida a este tumor atenuada novedosa útil para la administración de una o varias moléculas efectoras de la invención a un tumor sólido. Además, cualquier bacteria dirigida a este tumor atenuada puede ser modificada empleando las enseñanzas de la presente invención para codificar una o varias proteínas de fusión de la invención y opcionalmente una o varias moléculas efectoras para producir una bacteria dirigida a este tumor atenuada novedosa útil para la administración de proteínas de fusión y moléculas efectoras de la invención a un tumor sólido. Bacterias tales como Salmcnella es un agente causante de enfermedad en seres humanos y animales. Una enfermedad que «,* JL, puede ser causada por la Salmonella es la sepsis, que es un grave problema debido a las altas tasas de mortalidad asociadas con el inicio de un choque séptico (Bone, 1993, Clinical Microbiol. Revs . 6:57-68). Por consiguiente, para permitir el uso seguro de vectores de Salmonella en la presente invención, los vectores bacterianos tales como Salmonella son atenuados en cuanto a su virulencia para provocar la enfermedad. En la presente solicitud, la atenuación, además de su definición tradicional en donde un vector de microorganismo es modificado de tal manera que el vector de microorganismo es menos patogénico, se contempla para que incluya también la modificación de un vector de microorganismo para que se pueda administrar un título más bajo de este vector de microorganismo derivado a un paciente y para que se pueda seguir logrando resultados comparables como si se hubiera administrado un título más elevado del vector de microorganismo de origen. El resultado final sirve para reducir el riesgo de choque tóxico u otros efectos colaterales debido a la administración del vector al paciente. Tales bacterias atenuadas son aisladas a través de numerosas técnicas. Por ejemplo, la atenuación puede lograrse a través de la deleción o desorganización de secuencias de ADN que codifican factores de virulencia que aseguran la supervivencia de la bacteria en la célula huésped, especialmente en macrófagos y neutrófilos. Tales técnicas de deleción y desorganización son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, recombinación homologa, mutagénesis química, mutagénesis por radiación, o mutagénesis mediada por transposones. Estos factores de virulencia que están asociados con la supervivencia en macrófagos son habitualmente expresados específicamente dentro de los macrófagos en respuesta a señales de estrés, por ejemplo, acidificación, o en respuesta a mecanismos de defensa de célula huésped, por ejemplo macropinocitosis (Fields et al . , 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:5189-5193). La tabla 4 de la Publicación Internacional WO96/40238 es una lista ilustrativa de factores de virulencia de Salmonella cuya deleción resulta en atenuación. Otro método para la atenuación de vectores bacteriales, por ejemplo Salmonella es utilizar sus fluyentes de la bacteria que son responsables de la toxicidad de esta bacteria. Por ejemplo, lipopolisacárido (LPS) o endotoxina es responsable primariamente de los efectos patológicos de la sepsis bacteriana. El componente de LPS que resulta en esta respuesta es el lípido A ("LA") . La eliminación o mitigación de los efectos tóxicos de LA resulta en una bacteria atenuada puesto que 1) el riesgo de choque séptico en el paciente es reducido y 2) se pueden tolerar niveles más altos de nivel bacterial . La alteración del contenido de LA de bacteria, por ejemplo Saimoneiia, puede lograrse a través de la introducción de mutaciones en la vía biosintética de LPS. Varios pasos enzimáticos en biosíntesis de LPS y los loci genéticos que los controlan en Salmonella han sido identificados (Raetz, 5 1993, J. Bacteriol. 175:5745-5753 y referencia ahí) así como mutantes correspondientes. Un mutante ilustrativo de este tipo es firA, una mutación del gen que codifica la enzima UDP-3-O(R-30 hidroximiristoil) -glicociamina N-aciltransferasa que regula la tercera etapa en la bicsíntesis de endotoxmas 10 (Kelley et al . , 1993, J. Biol. Chem. 268:19866-19874). Cepas bacterianas que llevan este tipo de mutación producen un lípido A que difiere del lípido A de tipo silvestre en la j—\ media en que contiene un séptimo ácido graso, un ácido hexadecanoico (Roy y Coleman, 1994, J. Bacteriol. 176:l 39- 15 1646) . Roy y Coleman demostraron que además de bloquear el tercer paso en la biosíntesis de endotoxina, la mutación firA' disminuye también la actividad enzimática en 4' quir.asa de lípido A que regula la sexta etapa de biosíntesis de lípido A. 20 Además de ser atenuados, los vectores bacterianos de la invención están enfocados a tumores es decir, la bacteria se fija de preferencia, infecta y/o permanece viable en el tumor o célula tumoral versus en tejido normal, no-tumor o una célula no-tumoral. Métodos adecuados para obtener bacterias 25 dirigidas a ese tumor atenuadas se describen en la sección 6.1 (páginas 25-32; enfoque a tumores) y Sección 6.2.2 (páginas 43-51; atenuación) de la Publicación Internacional WO96/40238; que se incorporan aquí por referencia. Puesto que los vectores resultantes son altamente específicos y súper- 5 infecciosos, la diferencia entre el número de bacterias infecciosas encontradas en el tumor objetivo o célula tumoral en comparación con las contrapartes no cancerosas se vuelve cada vez más importante conforme se eleva la dilución del cultivo de microorganismos de tal manera que títulos más 10 bajos de vectores de microorganismos pueden ser utilizados con resultados positivos. Estas técnicas descritas en la Publicación Internacional WO96/40238 pueden también ser utilizadas para producir vectores bacterianos de Salmonella o no Salmonella atenuados, enfocados a tumores. 15 Un ejemplo ilustrativo de una bacteria dirigida a ese tumor atenuada que tiene un mutante de vía de LPS es el mutante de Salmonella msbB' descrito en la Publicación Internacional WO99/13053, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad; véase, por ejemplo, sección 6.1.2 que describe la 20 característica del mutante msbB' Salmonella . Una característica de msbB' Salmonella es su capacidad disminuida para inducir una respuesta TNF-a en comparación con el vector bacteriano de tipo silvestre. msbB' Salmonella induce la expresión de TNF-a en niveles de aproximadamente 5% a 25 aproximadamente 40% en comparación con los niveles inducidos m& ^ . íÉ tál iA Á?&vM&é?J. , por Salmonella de tipo silvestre. La respuesta de TNF-a inducida por la bacteria entera o LPS aislado o purificado puede ser evaluada in vi tro o in vivo empleando sistemas de ensayo comercialmente disponibles tales como inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) . La comparación de la producción de TNF-a en base a unidad formadora de colonias ("c.f.u") o bien en base a µg/kg se emplea para determinar la actividad relativa. Niveles más bajos de TNF-a en una base por unidad indican una inducción disminuida de la producción de TNF-a. En una modalidad preferida, el vector msbB' Salmonella es modificado de tal manera que contenga una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) de la invención. La presente invención abarca también el uso de derivados de mutantes de Salmonella enfocados a tumor atenuados msbB' . Derivados de mutantes de Salmonella enfocados a tumor atenuados msJB" pueden ser modificados mediante el uso de las enseñanzas de esta invención para codificar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) para producir una bacteria novedosa dirigida a tumor atenuada útil para la administración de una o varias molécula (s) efectora (s) de la invención a un tumor sólido. La estabilidad del fenotipo atenuado es importante de tal manera que la cepa no se revierta a un fenotipo más virulento durante el transcurso del tratamiento del paciente. Dicha estabilidad puede lograrse, por ejemplo, haciendo que el gen de la virulencia sea desorganizado por remoción o bien otras mutaciones no reversibles a nivel cromosómico y no epistáticamente . Otro método para asegurar el fenotipo atenuado es manipular la bacteria de tal manera que presente atenuación en más de una forma, por ejemplo, una mutación de la vía para la producción de lípido A, por ejemplo mutación msbB' (Publicación Internacional WO99/13053) y una o varias mutaciones para auxotrofia para uno o varios nutrientes o metabolitos, por ejemplo, biosíntesis de uracilo, biosíntesis de purina, y biosíntesis de arginina de conformidad con lo descrito por Bochner, 1980, J. Bacteriol. 143:926-933. En una modalidad preferida, la msbB' Salmonella dirigida a tumor que codifica o expresa por lo menos una molécula efectora primaria es también auxotrófica para purina. En ciertas modalidades, la bacteria dirigida a tumor atenuada que codifica o expresa por lo menos una molécula efectora primaria es atenuada por la presencia de una mutación en AroA, msbB, PurI o SerC. En otras modalidades, las bacterias dirigidas a tumor atenuadas que codifican por lo menos una molécula efectora primaria son atenuadas por la presencia de una remoción en AroA, msbB, PurI o SerC.
Por consiguiente, cualquier bacteria dirigida a tumor atenuada puede ser utilizada en lo métodos de la presente invención para expresar y suministrar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) a un cáncer de tumor sólido. En modalidades preferidas, las bacterias dirigidas a tumor atenuadas son construidas para expresar una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) , Además, cualquier bacteria dirigida a tumor atenuada puede ser utilizada en los métodos de la invención para expresar y suministrar una o varias proteínas de fusión y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras a un cáncer de tumor sólido. En modalidades preferidas, las bacterias dirigidas a tumor atenuadas son construidas para expresar una o varias proteínas de fusión y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras. 5.2 MOLÉCULAS EFECTORAS PRIMARIAS PARA TERAPIA TUMORAL La invención ofrece ei suministro de molécula (s) efectora (s) primaria (s) (y opcionalmente secundaria (s) ) a través de bacterias dirigidas a tumor atenuadas, por ejemplo Salmoneiia. Las moléculas efectoras de la invención son moléculas proteináceas, (por ejemplo, proteínas (incluyendo sin limitación péptido, polipéptido, proteína, proteína modificada post después de la traducción, etc) . La invención 7 b VA» Í Q luolécultb efectoictb prirtidi ict de la invención. Las moléculas efectoras primarias pueden ser derivadas de cualquier organismo conocido, incluyendo, sin limitarse a ellos, animales, plantas, bacterias, hongos, y protistes, o virus. En una modalidad preferida de la invención, la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) es/son derivada (s) de un mamífero. En una modalidad más preferida, la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) es/son derivada (s) de un ser humano. Las moléculas efectoras primarias de la invención comprenden miembros de la familia de TNF, factores anti-angiogénicos, polipéptidos o péptidos citotóxicos, enzimas inhibidoras de tumores, así como fragmentos funcionales de los mismos. En una modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la presente invención son miembros de la familia de TNF o bien fragmentos funcionales de la misma. Ejemplos de miembros de familia de TNF incluyen, sin limitarse a ellos, el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , el factor de necrosis tumoral-ß (TNF-ß) , el ligando de inducción de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , la citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , el inauctor débil de apóptosis relacionado con TNF-a (TWEAK) , el ligando de CD40 (CD40L), LT-a, LT-ß, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, y AITR-L. En una modalidad preferida, una molécula efectora primaria de ... **„ ,, £ ? ,tj.É la invención es el factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral-ß (TNF-ß) , ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor débil de apóptosis relacionado con TNF-a (TWEAK , ligando de CD40 (CD40L) o un fragmento funcional del mismo. Para una reseña, véase, por ejemplo, Kwon, B. et al . , 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:340-345, que describe miembros de la familia de TNF. Así mismo, la tabla 1 a continuación presenta una lista de nomenclatura clásica y estandarizada de miembros ejemplares de la familia de TNF. En una modalidad preferida de la invención, la molécula efectora primaria de la invención es factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral-ß (TNF-ß) , ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionado con TNF-a (TRANCE) , inductor débil de apóptosis relacionado con TNF-a (TWEAK) , o bien ligando de CD40 (CD40L) . Tabla 1 MIEMBROS DE FAMILIA DE TNF Nomenclatura clásica Nomenclatura estandarizada LT-a TNFSF1 TNF-a TNFSF2 LT-ß TNFSF3 OX40L TNFSF4 CD40L TNFSF5 FasL TNFSF6 CD27L TNFSF7 CD30L TNFSF8 4-1BBL TNFSF9 TRAIL TNFSF10 TRANCE TNFSF11 TWEAK TNFSF12 APRIL TNFSF13 LIGHT TNFSF14 TL1 TNFSF15 TNFSF16 TNFSF17 AITR-L TNFSF18 En otra modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención son factores anti-angiogénicos o fragmentos funcionales de los mismos. Ejemplos de factores anti-angiogénicos incluyen, sin limitarse a ellos, endostatina, angiostatina, apomigren, antitrombina anti-angiogénica III, los fragmentos proteolíticos de fibronectina N-terminal de 29 kDa y C-terminal de 40kDa, un antagonista de receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario-4, el fragmento de 24 aminoácidos anti-angiogénico de factor plaquetario 4, el factor anti- angiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospcndina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénico de péptidos que contienen SPARC, RGD y NGR, los pequeños 5 péptidos anti-angiogénicos de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, y antagonistas de péptido de integrina avß3 y el receptor para VEGF. Una modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es la endostatina. Una 10 endostatina que ocurre naturalmente consiste de aproximadamente 180 aminoácidos C-terminales de colágena XVIII (ADNc que codifica dos formas de empalme de colágena XVIII que tienen los números de acceso Ger.bank AF18081 y AF18082) . 15 En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es fragmentos de plasminógeno (la secuencia codificadora para plasminógeno puede encontrarse en número de acceso Genbank NM_000301 y A33096) . Péptidos de angiostatina incluyen naturalmente los 20 cuatro dominios de kringle de plasminógenc, kringle 1 a kringle 4. Se ha demostrado que kringle 1, 2 y 3 recombinantes poseen las propiedades anti-ar.giogénicas del péptido nativo, mientras que kringle 4 no tiene dicha actividad (Cao et al., 1996, J, Biol. Chem. 2~i : 29461-29467) . 25 Por consiguiente, la molécula efectora de angiostatina de la presente invención comprende por lo menos uno y de preferencia más que un dominio kringle seleccionado dentro del grupo que consiste de kringle 1, kringle 2 y kringle 3. En una modalidad específica, la molécula efectora primaria de la invención es una molécula de angiostatina humana seleccionada dentro del grupo que consiste de la isoforma de 40kDa, la isoforma de 42kDa, la isoforma de 45 kDa, o bien una combinación de las mismas. En otra modalidad, la molécula efectora primaria es el dominio kringle 5 de plasminógeno, que es un inhibidor más potente de la angiogénesis que la angiostatina (la angiostatina comprende los dominios kringles 1-4) . En otra modalidad preferida de la invención, una mclécula efectora primaria de la invención es antitrombina III. La antitrombina III, que se conoce a continuación como antitrombina, comprende un dominio de unión de heparma que une la proteína a las paredes de la vasculatura, y un bucle de sitio activo que interactúa con la trombina. Cuando la trombina es unida a la heparina, la proteína provoca un cambio de conformación que permite que el bucle activo interactúe con la trombina, lo que resulta en la disociación proteolítica de dicho bucle por trombina. El evento de disociación proteolítica resulta en otro cambio de conformación de antitrombina que (i) altera la interfaz de interacción entre trombina y antitrombina y (ii) libera el t.Í.j.^?»AJ.. complejo de la heparina (Carell, 1999, Science 285:1861-1862, y referencias ahí). O'Reilly et ai. (1999, Science 285:1926-1928) han descubierto que la antitrombina disociada tiene una actividad anti-angiogénica potente. Por consiguiente, en una modalidad, el factor anti-angiogénico de la invención es la forma anti-angiogénica de la antitrombina. Para la administración de dicha proteína a un tumor sólido de conformidad con los métodos de la invención, el vector bacteriano es modificado para expresar una antitrombina de longitud completa Número de Acceso Genbank NM_000488 y una enzima proteolítica que cataliza la disociación de antitrombina para producir la forma anti-angiogénica de la proteína. La enzima proteolítica es seleccionada dentro del grupo que consiste de trombina, elastasas pancreáticas, y elastasa de neutrófilo humana. En una modalidad preferida, la enzima proteolítica es elastasa pancreática. Métodos para la expresión recombinante de elastasa pancreática funcional son enseñados por Shirasu (Shirasu et al . , 1987, J. Biochem. 102:1555-1563) . En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es el fragmento proteolítico de 40kDa y/o 29kDa de fibronectina. Los vehículos de expresión para estos fragmentos pueden ser generados por métodos estándares empleando la secuencia de ácido nucleico de longitud completa que codifica la proteína ?,A,,i ?.Á, precursora de fibronectina (Numero de Acceso Genbank X02761), y una descripción de la maduración de la proteína codificada. En una modalidad preferida, el fragmento de 40 kDa y/o el fragmento de 29 kDa de fibronectina es expresado como una proteína citoplásmica bajo el control del promotor tre, por ejemplo, mediante inserción en el plásmido pTrc99A. En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es un antagonista de receptor de activador de plasminógeno uroquinasa (uPA) . En un modo de la modalidad, el antagonista es un mutante negativo dominante de uPA (ver, por ejemplo, Crowley et ai., 1993, Proc. Nati. Acad Sci. USA 90:5021-5025). En otro modo de la modalidad, el antagonista es una antagonista de péptido o una proteína de fusión del mismo (Goodson et ai., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:7129-7133). En otro modo de la modalidad, el antagonista es un receptor de uPA soluble negativo dominante (Min et al., 1996, Cáncer Res, 56:2428-2433) . En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es el fragmento N-terminal de 16 kDa de prolactina, que comprende aproximadamente 120 aminoácidos, o un fragmento biológicamente activo del mismo (la secuencia codificadora para prolactina puede encontrarse en Número de Acceso Genbank NM_000948) . En una modalidad específica, dicho fragmento de prolactina tiene una mutación Cys58-Ser58 para evitar una reticulación indeseada de la proteína por enlaces disulfuro. En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es el fragmento de 7.8 kDa de factor plaquetario- . En una modalidad específica, el fragmento de 7.8 kDa de factor plaquetario-4 es expresado como una proteína de fusionen donde la terminal amino comprende los primeros 35 aminoácidos de ß-glucoronidasa de E. coli . En otra modalidad, las usinas de unión con heparina de factor plaquetario-4 son mutadas en residuos de ácido glutámico lo que resulta en una proteína variante que tiene una actividad anti-angiogénica potente (Maione et al . , Cáncer Res. 51:2077-2083). Le secuencia codificadora para el factor plaquetario-4 tiene el Número de Acceso Genbank NM_002619) . En otra modalidad preferida de la invención, una molécula efectora primaria de la invención es un pequeño péptido que corresponde la fragmento de 13 aminoácidos anti-angiogénico del factor plaquetario-4, el factor anti-angiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénico de SPARC, los pequeños péptidos anti-angiogénicos de laminina, fibronectina, procolágena, o EFG, o bien pequeños antagonistas de péptidos de integrina avßa o el receptor para VEGF. En una modalidad específica, los pequeños péptidos son expresados en tándem í*á?l?.? ?-L V?Í???..A. ««A ^^^^^ MJ. para incrementar la estabilidad de la proteína. Las secuencias de los pequeños péptidos se proporcionan por Cao (1998, Prog. Mol. Subcell. Biol. 20:161-176), a excepción de los antagonistas de receptor para VEGF (Soker et al . , 1993, Biol. Chem. 272:31582-31588). En una modalidad altamente preferida, el pequeño péptido comprende un motivo RGD o NGR. En ciertos modos de la modalidad, el péptido que contiene RGD o NGR es presentado en la superficie celular de la bacteria huésped, por ejemplo, mediante la fusión del ácido nucleico que codifica el péptido en marco con un ácido nucleico que codifica uno o varios bucles extracelulares de OmpA. En otra modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención son polipéptidos o péptidos citotóxicos o bien fragmentos funcionales de los mismos. Un polipéptido o péptido citotóxico es citotóxico o citostético para una célula, por ejemplo, mediante la inhibición del crecimiento celular a través de interferencia con síntesis de proteína o bien a través de desorganización del ciclo celular. Un producto de este tipo puede actuar por disociación de ARNr o bien ribonucleoproteína, inhibiendo un factor de elongación, disociando ARNm o bien otros mecanismos que reducen ia síntesis de proteína a un nivel tal que la célula no puede sobrevivir. Ejemplos de polipéptidos o péptidos citotóxicos incluyen, sin limitarse a ellos, miembros de la familia de bacteriocina, verotoxina, factor necrótico citotóxico 1 (CNF1; por ejemplo, CNF1 de E coli y CNF1 de Vibrio fischeri ) , factor necrótico citotóxico 2(CNF2), toxina de Pasteurella mul tiocida (PMT), hemolisina, tetrapéptidos de CAAX que son inhibidores competitivos potentes de la farnesiltransferasa, saporina, las ricinas, abrina, otras proteínas que desactivan los ribosomas (RIPs) , exotoxina de Pseudomonas, inhibidores de síntesis de ADN, ARN o proteína, ácidos nucleicos de antisentido, otros inhibidores metabólicos (por ejemplo, molécula de disociación de ADN o ARN, por ejemplo ADNasa y ribonucleasa, lipasa, fosfolipasa) , enzimas de conversión de profármacos (por ejemplo, timidinquinasa a partir de HSV y citocina desaminasa bacterial) , porfirina activada por luz, ricina, cadena A de ricina, RIP maíz, gelonina, toxina de difusión citoletal, toxina de difteria, cadena A de toxina de difteria, tricosantina, tritina, proteína antiviral de hierba carmín (PAP) , proteína antiviral de mirabilis í AP) , Diantinas 32 y 30, abrina, monodrina, briodina, shiga, un inhibidor catalítico de la biosíntesis de proteína a partir de semillas de pepino (véase, por ejemplo, Publicación Internacional WO 93/24620) , exotoxina de Pseudomonas, toxina termo-lábil de E. coli , toxina termo-estable de E. coli , toxina una estable de EaggEC (EAST) , fragmentos biológicamente activos de citotoxinas y oros agentes conocidos por partes de los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, O'Brian y Holmes, Protein Tcxins of Escherichia coli and Salmonella en Escherichia and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al. ( e?s ) , pp. 2788-2802, ASM Press, Washington, D.C. para una reseña de toxina de E. coii y Salmonella . En una modalidad preferida, la molécula efeetora primaria, la molécula efectora primaria es miembro de la familia de bacteriocina (véase, por ejemplo, Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36:125-144), a condición que dicho miembro de familia de bacteriocina no sea una proteína de liberación de bacteriocina (BRP) . Ejemplos de miembro de familia de bacteriocina incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, ColEl, ColEla, ColElb, ColE2, ColE3, C?lE4, CclE5, C0IE6, ColE7, C0IE8, ColE9, Colicina A, Colicina K, oliema L, Colicina M, cloacina DF13, pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, egacir.a A-216, microcina M15, y vibrocina (Jayawardene y Farkas-Himsley, 1970, J. Bacteriology vol. 102 pp 382-388). Con mayor preferencia, la(s) molécula(s) efectora(s) primaria(s) es colicina E3 o V, aún cuando colicina A, El, E2, la, Ib, K, 1 y M (ver, Konisky 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36:125-144) se también adecuadas como molécula (s) efectora (s) primaríais . En otro modo preferido de esta modalidad, la bacterioema es una cloacina, con mayor preferencia cloacina DF13. En una modalidad preferida, la(s) molécula (s) efectcra(s) primaria (s) es ColEl, ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, C0IE6, ColE7, C0IE8, o bien ColE9. Se ha mostrado que Colicina E3 (ColE3) tiene un efecto profundamente citotóxico sobre células de mamíferos (Smarda et al . , 1978, Folia Microbiol. 23:272-277) , incluyendo un sistema de modelo de células de leucemia (Fiska et al . , 1978, Experientia 35:406-40). La citotoxicidad del ColE3 depende de la suspensión de síntesis de proteína mediada por la inhibición de ribosomas 80S (Turnowsky et al . , 1973, Biochem. Biophys. Res. Comm. 52:327-334) . Más específicamente, ColE3 tiene una actividad ribonucleasa (Saunders, 1978) (Nature 274:113-114). En su forma que ocurre naturalmente, ColE3 es un complejo de proteína de 60 kDa que consiste de una proteína de 50 kDa y una proteína de 10 kDa en una proporción 1:1, la subunidad mayor teniendo la actividad nucleasa y la subunidad menor teniendo una función inhibidora de la sub-unidad 50 kDa. Así, la proteína de 50 kDa actúa como una proteína citotóxica (o toxina), y la proteína de 10 kDa actúa como una anti-toxina. Por consiguiente, en una modalidad, cuando se utiliza ColE3 como molécula efectora secundaria, la subunidad de ColE3 más grande o un fragmento activo de la misma es expresado solo o en niveles más elevados que la subunidad más pequeña. En otra modalidad de la invención, la toxina de 50 kDa de ColE3 y la anti-toxina de 10 kDa son codificadas en un plásmido único dentro de una bacteria dirigida a tumor atenuada, por ejemplo, Salmonella . En esta modalidad, la toxina/antitoxina puede actuar como un sistema de selección para Salmonelia que lleva el plásmido de tal manera que Salmonella que pierden el plásmido son matadas por la toxina. En otra modalidad, la anti-toxina de 10 kDa se encuentra en el cromosoma, separada de la toxina colE3 en el plásmido lo que resulta en una barrera a la transmisión a otras bacterias, (ver sección 5.6, infra) . En otra modalidad preferida, la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) es cloacina DF13. La cloacina DF13 funciona de manera análoga a ColE3. El complejo de proteína tiene un peso molecular de 67 kDa. Los componentes individuales tienen un tamaño de 57 kDa y 9 kDa. Además de su actividad ribonucleasa, DF13 puede provocar ia fuga de potasio celular. En otra modalidad preferida, la.s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) es colicina V (Pugsley, A.P. y Oudega B. "Methods for Studying Colicins and Their Plasmids" [Métodos para estudiar Colicinas y sus Plásmidos] en Plasmids, a Practical Approach 1987, editado por K.G. Hardy; Gilson, L. et al . EMBO J. 9: 3875-3884) . En otra modalidad, la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) Es colicina E2 (una colicina de subunidad doble similar a ColE3 en estructura pero con actividad endonucleasa en lugar de actividad ribonucleasa) ; colicinas A, El, lb, o K, que forman canales permeables a los iones, provocando un colapso tatsá J,,* á..á toMMa CT^JJ , „ ??» m i .». . . , , . A, ^ . , , . , , , ¡. , de la fuerza motora protónica de la célula y provocando la muerte de la célula. Colicina L que inhibe la síntesis de proteína, ADN y ARN; colicina M que provoca sepsis celular por alteración del entorno osmótico de la célula; pesticina A1122 que funciona de una manera similar a colicina B; estaficocina 1580, una bacteriocina formadora de peros; butiricina 7423 que inhibe indirectamente la síntesis de ARN, ADN y proteína a través de un blanco desconocido; piocina Pl, o bien proteína que se parece a una proteína de cola de bacteriófago que mata células por desacoplamiento de la respiración del transporte de soluto; Piocina AP41 que tiene un modo de acción similar a colicina E2; o bien megacina A-216 que es una fosfolipasa que provoca la fuga de material intracelular (para una reseña general de bacteriocinas, véase Konisky, 1982, Ann. Rev. Microbiol. 36:125-144); colicina A (Pugsley, A.P. y Oudega, B. "Methods for Studying Colicins and Their Plasmids" [Métodos para Estudiar Colicinas y sus Plásmidos] en Plasmids, a Practical Approach 1987, ed. 5y K.
G. Hardy) . Por consiguiente, una molécula efectora primaria puede comprender cualquier bacteriocina descrita aquí o conocida en la técnica, a condición que dicha bacteriocina no sea una proteína de liberación de bacteriocina. En otra modalidad específica, las moléculas efectoras primarias de la invención son enzimas inhibidoras de tumor o fragmentos funcionales de las mismas. Ejemplos de enzimas inhibidoras de tumor incluyen, sin limitarse a ellas, metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, proteasa, ribonucleasa, ADNasa, y glicosidasa. En una modalidad preferida, la molécula efectora primaria es metionasa. Las moléculas efectoras primarias de la invención son útiles, por ejemplo, para tratar o prevenir un cáncer de tumor sólido, por ejemplo, carcinoma, melanoma, linfoma, o sarcoma. La invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una molécula efectora primaria. La invención ofrece también moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias molécula (s) efectoras (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectoras(s) secundaria (s) . La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican molécula (s) efectoras (s) de la invención unidos operativamente a un promotor apropiado. Opcionalmente, los ácidos nucleicos que codifican una o varias molécula (s) efectoras (s) pueden estar unidos operativamente a otros elementos que participan en la transcripción, traducción, localización, estabilidad y similares. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora primaria tiene una longitud de aproximadamente 6 a aproximadamente 100,000 pares de bases. De preferencia, el ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a aproximadamente 50,000 pares de bases de longitud. Con mayor IAÍI.?A. . ... Biifrsi preferencia, la longitud de la molécula de ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a aproximadamente 10,000 pares de bases. Con preferencia aún mayor, la molécula de ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a 5 aproximadamente 4000 pares de bases de longitud. 5.3 MOLÉCULAS EFECTORAS SECUNDARIAS PARA CO-EXPRESIÓN CON MOLÉCULAS EFECTORAS PRIMARIAS En ciertas modalidades de la invención, la molécula efectora primaria (por ejemplo, un miembro de la familia de TNF, un 10 péptido o polipéptido citotóxico, un factor anti-angiogénico, o una enzima inhibidora de tumor) es opcionalmente coexpresada en un vector bacteriano con otra molécula, es ?k decir, una molécula efectora secundaria. La molécula efectora secundaria proporciona valor terapéutico adicional y/o 15 facilita la liberación de los contenidos del vector bacteriano modificado (que expresa por lo menos una molécula efectora primaria u opcionalmente una o varias moléculas efectoras secundarias) en el entorno aledaño. Como se emplea aquí, el término "valor terapéutico adicional" indica que la ^^ 20 molécula efectora secundaria proporciona un efecto sinérgico, citostático, o citotóxico, sobre un tumor, por ejemplo, además de lo proporcionado por la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s). Así, una molécula efectora secundaria funciona como un factor terapéutico adicional y/o un factor de 25 liberación. De preferencia, la molécula efectora secundaria, Í??? a ?A?-AU?SÍ.Í ya sea un factor terapéutico o un factor de liberación (o bien ambas cosas), es de preferencia o específicamente activada o expresada en el sitio deseado, es decir, en el sitio del tumor. En ciertas modalidades, la molécula efectora 5 secundaria puede servir dos funciones, es decir, promover la liberación de los contenidos de las células bacterianas (por ejemplo, mediante la promoción de lisis de células bacterianas o casi lisis) y promover el valor terapéutico (por ejemplo por citotoxicidad para las células tumorales) . 10 En ciertas modalidades no limitativas, la citotoxicidad de la molécula efectora secundaria puede ser mediada por el sistema inmunológico del paciente; por consiguiente, dicha molécula á—^ efectora secundaria puede funcionar como i munomodulador. En ciertas modalidades de la invención, el vector bacteriano 15 dirigido a tumor atenuado de la invención es manipulado para expresar por lo menos una molécula efectora secundaria que tiene una actividad ar.ti-tumor, es decir, la expresión de la molécula efectora secundaria resulta e la muerte o la inhibición del crecimiento de un tumor o células tumorales. 20 La molécula efectora secundaria es una molécula proteinácea o de ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN de cadena doble o de cadena única o bien ARN de cadena doble o de cadena única, así como moléculas de ácido nucleico triplex. La molécula de ácido nucleico puede funcionar como 25 una ribozima, o un ácido nucleico de antisentido, etc. Í l-A ií,^ ? M. id Nucleótidos de antisentidos son oligonucleótidos que se unen en forma específica para secuencia a ácidos nucleicos, por ejemplo ARNm o ADN. Cuando se unen ARNm que tiene secuencias complementarias, los oligonucleótidos de antisentido evitan la traducción de ARNm (véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 5,168,053; 5,190,931; 5,135,917; y 5,087,617). Moléculas triplex se refieren a cadenas de ADN únicas que se unen a ADN dúplex formando una molécula triplex colineal, evitando así la transcripción (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,176,996). Una ribozima es una molécula de ARN que disocia específicamente los sustratos de ARN, tales como AR?m, lo que resulta en la inhibición o interferencia de la expresión o crecimiento celular. Existen por lo menos cinco clases conocidas de ribozimas involucradas en ia disociación y/o ligado de cadenas de AR?. Las ribozimas puede ser dirigidas hacia cualquier transcripto de ARN y pueden disociar catalíticamente dicho transcripto (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,272,262; Patente Norteamericana No. 5,144,019; y Patentes Norteamericanas Nos. 5,168,053; 5,180,818, 5,116,742 y 5,093,246). De conformidad con lo descrito arriba para la molécula efectora primaria, un ácido nucleico que codifica o que comprende una molécula efectora secundaria se proporciona en enlace operativo con un promotor seleccionado, y opcionalmente en enlace operativo con otros elementos que participan en la transcripción, traducción, localización, estabilidad y/o similares. Además, la molécula efectora secundaria puede ser expresada utilizando el mismo promotor que la molécula efectora primaria y un sitio de unión de ribosoma interno, o bien utilizando un promotor diferente déla molécula efectora primaria. La molécula de ácido nucleico que codifica la molécula efectora secundaria es de aproximadamente 6 pares de bases a aproximadamente 100,000 pares de bases de longitud. De preferencia, la longitud de la molécula de ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a aproximadamente 50,000 pares de bases. Con mayor preferencia, la longitud de la molécula de ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a aproximadamente 10,000 pares de bases. Con preferencia aún mayor, la longitud de la molécula de ácido nucleico es de aproximadamente 20 pares de bases a aproximadamente 4,000 pares de bases. Las secuencias de nucleótidos de las moléculas efectoras que codifican las moléculas efectoras secundarias descritas abajo son bien conocidas . éase GenBank) . Una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora secundaria, dicha molécula efectora secundaria es un factor citotóxico o citostático o un fragmento, variante o derivado biológicamente active, puede ser aislada por métodos Í ? 'L Á tn , , j, ^BaHnitit..A. ^ ¿ 5 estándares, por ejemplo amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa) , hibridación de sondas de bibliotecas genómicas o de ADNc, tamizado de anticuerpos de bibliotecas de expresión, sintetizadas químicamente o bien obtenidas a partir de fuentes comerciales o fuentes de otros tipos. Moléculas de ácido nucleico y oligonucleótidos para su uso de conformidad con lo descrito aquí pueden sintetizarse a través de cualquier método conocido por parte de los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Publicación Internacional WO93/01286, Patentes Norteamericanas Nos. 5,218,088; 5,175,269; y 5,109,124). La identificación de los oligonucleótidos y ribozimas para su uso como agentes de antisentido incluye métodos bien conocidos en la técnica. 5.3.1. FACTORES QUE PROPORCIONAN VALOR TERAPÉUTICO ADICIONAL En ciertas modalidades de la invención, el vector bacteriano dirigido a tumor atenuado de la invención, que expresa por lo menos una molécula efectora primaria y es de preferencia un vector de Saimoneiia, expresa por lo menos una molécula efectora secundaria que tiene una actividad anti-tumor, es decir, expresión de la molécula efectora secundaria resulta en la muerte o inhibición del crecimiento de un tumor o células tumorales o la inhibición de la difusión de células tumorales, incrementando así la acción citotóxica o citostática de la molécula efectora primaria. En una modalidad, los efectos sobre el tumor de la molécula efectora secundaria son aditivos a los efectos de la molécula efectora primaria. En una modalidad preferida, los efectos son supra-aditivos o sinérgicos, es decir, mayores que la suma de los efectos de las moléculas efectoras primaria y secundaria si se administran separadamente. En ciertas modalidades, la molécula efectora secundaria es citotóxica o citostática para una célula mediante la inhibición del crecimiento celular a través de interferencia con síntesis de proteína o a través de desorganización del ciclo celular. Dicho producto puede actuar, por ejemplo, disociando el ARNr o la ribonucleoproteína, inhibiendo un factor de elongación, disociando ARNm, o bien otro mecanismo que reduce la síntesis de proteína a un nivel tal que la célula no puede sobrevivir. Ejemplos de tales moléculas efectoras secundarias incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, saporina, ricinas, abrina, y otras proteínas desactivadoras de ribosoma (RIPs) . En otra modalidad, la molécula efectora secundaria es una enzima de conversión de profármaco o ácido nucleico que la codifica, es decir, una enzima que modula la naturaleza química de un fármaco para producir un agente citotóxico. Ejemplos ilustrativos de enzimas de conversión de profármacos se presentan en la página 33 y en la tabla 2 de WO 96/40238 por Pawelek et ai., que se incorpora aquí por referencia. WO ^^^*j*^^^¿^^¿ 96/40238 enseña también métodos para la producción de proteínas de fusión secretadas que comprenden tales enzimas convertidoras de profármacos. De conformidad con la presente invención, una enzima de conversión de profármacos no tiene 5 que ser una proteína secretada si es co-expresada con un factor de liberación, por ejemplo BRP (Ver, infra , Sección 5.3.2). En una modalidad específica, la enzima de conversión de profármaco es citocromo p-450 NADPH óxidoreductasa que actúa sobre la mitomicina C y porfiromicina (Murray et al., 10 1994, J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 270:645-649). En otra modalidad, la(s) molécula (s) efectora (s) secundaria (s) es coexpresada con un factor de liberación, por ejemplo BRP, y —\? provoca la liberación de co-factores (por ejemplo, NADH, NADPH, ATP, etc) que incrementan la actividad de la enzima de 15 conversión de profármacos. En otro modo de la modalidad, una molécula efectora secundaria es co-expresada con un factor de liberación, por ejemplo BRP, provocando la liberación de un fármaco activado (por ejemplo, un fármaco activado dentro del citoplasma o periplasma bacteriano, y después liberado a 20 partir del vector bacteriano) . En otra modalidad, una molécula efectora secundaria es un inhibidor de la sintasa de óxido nítrico (NOS) inducible o de sintasa de óxido nítrico endotelial. El óxido nítrico (NO) participa en la regulación del crecimiento vascular y en la 25 arterosclerosis . El NO se forma a partir de L-arginina l .¡ .. .i...i -i.?t .. A Í X, mediante sintasa de óxido nítrico (NOS) y modula respuestas inmunológicas, inflamatorias y cardiovasculares. En otra modalidad, la molécula efectora secundaria es citotóxica o citostática para una célula mediante la 3 inhibición de la producción o actividad de una proteína involucrada en la proliferación celular, por ejemplo un oncógeno o factor de crecimiento (por ejemplo bFGF, int-2, # hst-1/K-FGF, FGF-5, hst-2/FGF-6, FGF-8) o bien receptor celular o ligando. La inhibición puede ser a nivel de la 10 transcripción o traducción (mediada por una molécula efectora secundaria que es la ADN triplex o una ribozima) , o bien a nivel de la actividad de proteína (mediada por una molécula W ' efectora secundaria que es un inhibidor de una vía de factor de crecimiento, por ejemplo mutante negativo dominante) . 15 En otra modalidad, una molécula efectora secundaria es una citocina, quimiocina, o bien una proteína inmunomoduladora o un ácido nucleico que la codifica, por ejemplo interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-10 (IL-10), interleucina- 20 15 (IL-15), interleucina-18 (IL-18) , proteína de activación de monocitos endoteliales-2 (EMAP2), GM-CSF, IFN-?, IFN-a, MIP-3a, SLC, MIP-3ß, o bien un gen de MHC, por ejemplo HLA- B7. La administración de tales moléculas efectoras inmunomouladoras modula el sistema inmunológico, 25 incrementando el potencial para inmunidad antitumor del -^•-•rta^af¿-»M*«' -»jjjijr _ huésped. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas coestimuladoras, por ejemplo B7.1, y B7.2, ligando tanto para CD28 como para CTLA-4, pueden también suministrarse para incrementar la inmunidad mediada 5 por células T. Otro agente inmunomc uiador es a-1, 3- galactosiltransferasa cuya expresión en células tumorales permite la muerte de células mediada por complemento. Además, otro agente inmunomodulador es un antígeno asociado con tumor, es decir, una molécula específicamente expresada por 10 una célula tumoral y no en la célula correspondiente no- transferosa, o bien expresado en la célula tumoral a un nivel mayor que en la célula correspondiente no cancerosa. Ejemplos ^0 ilustrativos de antígenos asociados con tumores se describen en Kuby, Immunology, W.H. Freeman and Company, New York, NY. 15 Primera edición (1992), páginas 515-520 que se incorpora aquí por referencia. Otros ejemplos de antígenos asociados con tumores son bien conocidos por parte de los expertos en la materia. En otra modalidad, una molécula efectora secundaria es 20 ligando Flt-3 o ácido nucleico que lc codifica. En otra modalidad, una molécula secundaria es BRP. En una modalidad específica, una molécula efectora secundaria no es un miembro de la familia TNF cuando la molécula efectora primaria es un miembro de la familia de TNF. En otra 25 modalidad específica, una molécula efectora secundaria no es ......i .i i.? un factor anti-angiogénico cuando la molécula efectora primaria es un factor anti-angiogénico. En otra modalidad específica, una molécula secundaria no es un péptido o polipéptido citotóxico cuando la molécula secundaria es un péptido o polipéptido citotóxico. En otra modalidad específica, una molécula secundaria no es una enzima inhibidora de tumor cuando la molécula efectora primaria es una enzima inhibidora de tumor. 5.3.2. FACTORES QUE PROMUEVEN LA LIBERACIÓN DE MOLÉCULAS EFECTORAS ANTI-TUMOR EN EL ENTORNO DEL TUMOR En ciertas otras modalidades de la invención, el vector bacteriano dirigido al tumor atenuado de la invención que expresa por lo menos una molécula efectora primaria y es de preferencia un vector de Salmcnell a , expresa por lo menos una molécula efectora secundaria que funciona para permeabiiizar la(s) membrana (s) celular (es) de bacteria o bien para realzar la liberación de componentes intracelulares en ei entorno extracelular, por ejemplo, en el sitio del tumor, realzando así la administración de la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) y/o secundaríais). Dicha molécula efectora secundaria que permeabiliza la célula bacteriana o realza la liberación se conoce como "un factor de liberación". En ciertas modalidades, el factor de liberación tiene también de manera provechosa una actividad anti-tumor. El factor de liberación expresado por el vector bacteriano de *-*** *-'* Á¡ á k ? la invención puede ser endógeno para la bacteria dirigida a tumor atenuada modificada o bien puede ser exógeno (por ejemplo, codificado por un ácido nucleico que no es nativo de la bacteria dirigida a tumor atenuada) . Un factor de 5 liberación puede ser codificado por un ácido nucleico que comprende un plásmido, o bien por un ácido nucleico integrado en el genoma de la bacteria dirigida a tumor atenuada. Un • factor de liberación puede ser codificado por el mismo ácido nucleico o plásmido que codifica una molécula efectora 10 primaria, o bien por un ácido nucleico o plásmido separado. Un factor de liberación puede ser codificado por el mismo ácido nucleico o plásmido que codifica una molécula efectora • secundaria, o bien por un ácido nucleico o plásmido separado. En una modalidad, el factor de liberación es expresado en una 15 célula que expresa también una proteína de fusión que comprende una molécula efectora primaria fusionada sobre una proteína de tipo Omp. En esta modalidad, ia co-expresión del factor de liberación permite la liberación realzada de la proteína de fusión partir del espacio periplásmico. 20 En una modalidad preferida, dicho factor es una de las Proteínas de Liberación de Bacteriocina, o bien BRPs (se conoce aquí genéricamente como BRP) . Las BRP empleadas en la invención pueden provenir de cualquier fuente conocida en la técnica incluyendo, sin limitarse a estas fuentes, las 25 plásmido DF13 de cieacina, uno de los plásmidos E1-E9 de colicina, o bien de plásmidos A, N o D de colicina. En una modalidad preferida, la BRP es de DF13 de cloacina (pCloDF13 BRP) . En general, las BRPs son péptidos de 45-52 aminoácidos inicialmente sintetizados como moléculas precursoras (PreBRP) con secuencias de señales que no son disociadas por endopeptidasas de señal. La actividad de BRP es mediada, según se cree, por lo menos en parte, por la fosfolipasa A de membrana externa resistente a detergente (PldA) y se relaciona habitualmente a un incremento de la degradación de fosfolípido de membrana externa (para una reseña general de BRPs, véase van der Wal et al . , 1995, FEMS Microbiology Review 17:381-399). Sin limitación en cuanto a mecanismos, la BRP promueve la liberación preferencial de componentes periplásmicos, aún cuando la liberación de componentes citoplásmicos se detecta también en menor medida. Cuando es sobreexpresada moderadamente, la BRP puede provocar que la membrana bacteriana se vuelva frágil, induciendo una casílisis y una alta liberación de componentes citoplásmicos. Además, se cree que cuando BRP es expresada en niveles súper elevados, la proteína puede provocar lisis de células bacterianas, suministrando así contenidos celulares por liberación lítica. En esta modalidad, la expresión de BRP puede ser correlacionada con 1 actividad de BRP (por ejemplo, liberación de contenidos bacterianos) . Por ejemplo, una á »,] t actividad de BRP súper elevada resulta en la lisis de células bacterianas sustancialmente de la totalidad de las bacterias. Así, como se emplea aquí, una "expresión súper elevada" se define como el nivel de expresión de BRP que resulta en la lisis de células bacterianas de sustancialmente todas las bacterias. Una actividad BRP moderada se relaciona con una liberación parcial o realzada de contenidos bacterianos en comparación con una bacteria de control que no está expresando BRP, sin lisis obligatoria de la bacteria. Así, en esta modalidad, una sobreexpresión moderada de BRP se define como el nivel de expresión en el cual se realza la liberación de componentes citoplásmicos, sin lisis bacteriana de sustancialmente la totalidad de las bacterias. Sustancialmente la totalidad de las bacterias, como se emplea aquí, se refiere a más del 60% de las bacterias, de preferencia más de 70% de las bacterias, con mayor preferencia 80% de las bacterias, con preferencia todavía mayor más del 90% de las bacterias y muy especialmente de 90 a 100% de las bacterias. En una modalidad específica de la invención, la proteína de BRP es un mutante de pCloDF13 BRP cuya función lítica ha sido desacoplada de su función de liberación de proteína, realzando así la liberación de proteína sin lisis bacteriana (van der Wal et al . , 1998, App. Env. Microbiol. 64:392-398). Esta modalidad permite una liberación prolongada de proteína a partir del vector bacteriano, mientras reduce la necesidad de una administración frecuente del vector. En otra modalidad específica, la BRP de la invención es pCloDF13 BRP con una terminal C acortada, que además de la liberación de proteína provoca la lisis de células (Luirink et ai., 1989, J. Bacteriol. 171:2673-2679). En otra modalidad de la invención, el sistema de liberación realzado comprende la sobreexpresión de una proteína porina; véase por ejemplo, Sugawara, E. and Nikaido, H., 1992, J. Biol. Chem. 267:2507-11. En ciertas modalidades cuando se expresa BRP a través del vector bacteriano de la invención, la BRP puede ser endógena para la bacteria dirigida a tumor atenuada modificada o bien puede ser exógena (por ejemplo, codificada por un ácido nucleico que no es nativo de la bacteria dirigida a tumor atenuada) . Una BRP puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende un plásmido, o bien por un ácido nucleico que es integrado en el genoma de las bacterias dirigidas a tumor atenuadas. Una BRP puede estar codificada por el mismo ácido nucleico o plásmido que codifica una molécula efectora primaria, o bien por un ácido nucleico o plásmido separado. Una BRP puede ser codificada por el mismo ácido nucleico o plásmido que codifica una molécula efectora secundaria, o bien por un ácido nucleico o plásmido separado. En una modalidad, la proteína de tipo BRP es expresada en una célula ..... que expresa también una proteína de fusión que comprende una molécula efectora fusionada sobre una proteína de tipo Omp. En esta modalidad, la coexpresión de BRP permite la liberación realzada de la proteína de fusión. En una modalidad específica preferida de la invención, un ácido nucleico que codifica una BRP es codificado por un plásmido de colicina. En otra modalidad específica de la invención, el ácido nucleico que codifica BRP es expresado bajo el control del promotor de BRP nativo que es un promotor SOS que responde al estrés (por ejemplo, condiciones que llevan a daño al ADN, por ejemplo luz UV) en su huésped normal (para BRP, Enterococcus cloacae) , sin embargo es parcialmente constitutivo en Salmonella . En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica BRP es expresado bajo el control del promotor pepT, que es activado en respuesta a la naturaleza anaeróbica del entorno del tumor (ver, por ejemplo, Lombardo et al., 1997, J. Bacteriol. 179:1909-17) . Alternativamente, el promotor puede ser un promotor inducido por anticuerpos, por ejemplo el promotor tet del transposón TnlO. En una modalidad preferida, el promotor tet es un singlemero, dicho singlemero corresponde en forma de todo o nada a la presencia de tetraciclina o análogos de la misma, por ejemplo doxiciclina y anhidrotetraciclina y proporciona un conmutador activado/desactivado genéticamente estable. En otra modalidad, el promotor tet es multimerizado, por ejemplo, tres veces. Dicho multímero responde de manera progresiva a la presencia de tetraciclina y proporciona un sistema más manejable para controlar los niveles de molécula efectora. La actividad del promotor seria después inducida por la administración a un sujeto que ha sido tratado con la bacteria dirigida a tumor atenuada de la invención de una dosis apropiada de tetraciclina. Aún cuando el sistema de expresión inducible tet fue inicialmente descrito para sistemas eucarióticos tales como Schizosaccharomyces pombe (Faryar y Gatz, 1992, Current Genetics 21:345-349) y células de mamíferos (Lang y Feingold, 1996, Gene 168:169-171), estudios recientes extienden su aplicación a células bacterianas. Por ejemplo, Stieger et al. (1999, Gene 226:243-252) han mostrado una inducción de 80 veces del gen de luciferaza de luciérnaga con inducción de tet cuando está unido operativamente al promotor tet. Una ventaja de este promotor es que es inducido con niveles muy bajos de tetraciclina, aproximadamente una décima parte de la dosificación requerida para actividad antibiótica. 5.4. DERIVADOS Y ANÁLOGOS Esta invención abarca además vectores bacterianos que son modificados para codificar o suministrar un derivado, incluyendo, sin limitarse a esos ejemplo, fragmento, análogo o variante de una molécula efectora primaria y/o secundaria, - t ?J 1 o un ácido nucleico que la codifica. El derivado, análogo o variante es funcionalmente activo, por ejemplo, capaz de presentar una o varias actividades funcionales asociadas con una molécula de efector de tipo silvestre de longitud completa. A título de ejemplo, dichos derivados, análogos o variantes que tienen las propiedades terapéuticas deseadas pueden ser utilizados para inhibir el crecimiento de un tumor o la difusión de células tumorales (metástasis) . Derivados o análogos de la molécula efectora pueden ser probados para la actividad deseada por procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo los descritos aquí. En particular, variantes pueden ser efectuadas por alteración de molécula efectora que codifica secuencias por sustituciones, adiciones (por ejemplo, inserciones) o deleciones que proporcionan moléculas que tienen la misma función anti-tumor o una función anti-tumor incrementada en comparación con la molécula efectora de tipo silvestre. Por ejemplo, las variantes de la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, las variantes que contienen, como secuencia de aminoácidos primarios, la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos de una molécula efectora, incluyendo secuencias alteradas en donde residuos de aminoácidos funcionalmente equivalente son sustituidos por residuos dentro de la secuencia lo que resulta en un cambio silencioso, es decir, la secuencia alterada tiene per lo menos una sustitución conservadora. Cualesquiera de los ácidos nucleicos que codifican efectores primarios o secundarios que son de origen mamífero pueden ser alterados para emplear codones bacterianos por métodos 5 conocidos en la técnica. El uso de codones preferido es ejemplificado en Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular] , Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc. New York, y Zhang et al., 1991, Gene 105:61-72. 10 En una modalidad específica, un derivado, análogo o variante de una molécula primaria o secundaria comprende una secuencia de nucleótidos que se híbrida con la secuencia de nucleótidos que codifica la molécula primaria o secundaria, o fragmentos de la misma en condiciones estrictas, es decir, hibridación 15 sobre ADN unido a filtro en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a una temperatura de aproximadamente 45° C seguido por uno o varios lavados en 0.2xSSC/SDS al C.1% a una temperatura de aproximadamente 50-65° C, bajo condiciones altamente estrictas, por ejemplo, hibridación con un ácido • 20 nucleico unido a filtro en 6x SSC a una temperatura de aproximadamente 45° C seguido per uno o varios lavados en O.lxSSC/0.2% de SDS a una temperatura de aproximadamente 68° C, o bien bajo otras condiciones de hibridación estrictas que son conocidas por parte de los expertos en la materia (ver, 25 por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989 C rrent >*^~*j¡* * ~-«M-T _^ .. ,. . ¿Í Ü -t v".v-J.S r-.vJ. J ] S r-/v ü; J J-fV_f J. DUSUJl pV. U s-Tu Biología Molecular], Vol. L, Green Publishing -Associates,-Inc. y John Wiley & Sons, Inc. New York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3) . Derivados o análogos de una molécula efectora primaria o secundaria incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas que comprenden regiones sustancialmente homologas con la molécula efectora primaria o secundaria o fragmentos de la misma (por ejemplo, en varias modalidades, una identidad de por lo menos 60% o 70% u 80% o 90% o 95% con relación a una secuencia de aminoácidos de tamaño idéntico sin ninguna inserción ni deleción o bien cuando se compara a una secuencia alineada en la cual el alineamiento es efectuado por un programa de homología computarizado conocido en la técnica) o cuyo ácido nucleico codificador puede hibridarse con una secuencia codificadora de molécula efectora de proteína de molécula efectora, bajo condiciones altamente estrictas, moderadamente estrictas, o bien poco estrictas . Para determinar la identidad porcentual de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, por ejemplo, entre las secuencias de una molécula efectora primaria y otras secuencias conocidas, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima por ejemplo, espacios pueden ser introducidos en la secuencia de un primer A «t.j».t tl ¿ ? aminoácido o secuencia de ácido nucleico para alineamiento óptimo con una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico) . Los residuos de aminoácido o nucleótidos en posiciones de aminoácido correspondientes o posiciones de nucleótidos correspondientes son después comparados. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición. La identidad porcentual entre las dos secuencias dependen del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, identidad porcentual = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones de empalme) x 100) . En una modalidad, las dos secuencias tienen la misma longitud. La determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse empleando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado de conformidad con Karlin y Altschul, 1993. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NB1AST y XBLAST de Altschul, et al . , 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Búsquedas de nucleótidos BLAST pueden ser efectuados con el -h-. . - zí programa de NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteína BLAST pueden ser efectuadas con el programa XBLAST, resultado = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencia de aminoácidos homologas a moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos de comparación, se puede utilizar Gepped BLAST de conformidad con lo descrito en Altschul et ai., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, se puede utilizar PSI-Blast para efectuar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas ( Id) . Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, los parámetros por omisión de los programas respectivos ipor ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse. Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo preferido no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989) . Dicho algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programática de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, se puede emplear la tabla de residuos ce pesos de PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12, y una penalidad de espacio de 4. Algoritmos adicionales para análisis de secuencia se conocen en la técnica e incluyen ADVANCE y ADAM de conformidad con lo descrito en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci., 10 : 3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. 85 : 2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda. Si ktup = 2, regiones similares en las dos secuencias que se están comparando se encuentran mediante la búsqueda de pares de residuos alineados; si ktup = 1, aminoácidos alineados individuales son examinados. Ktup puede ser establecido en 2 o bien 1 para secuencias de proteínas, o bien de 1 a 6 para secuencias de ADN. La omisión if ktup no es especificada es 2 para proteínas y 6 para ADN. Para una descripción adicional de los parámetros de FASTA, véase http: //bioweb.pasteur. fr/docs/man/fasta.1.html#sect2, cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia. Alternativamente, el alineamiento de secuencias de proteína puede efectuarse utilizando el algoritmo CLUSTAL W, de conformidad con lo descrito por Higgings et al . , 1996, Methods Enzymol. 266:383-402. La identidad porcentual entre dos secuencias puede ser determinado empleando técnicas similares a las descritas arriba, con o sin espacios. Al calcular la identidad porcentual, se cuentan solamente las correspondencias exactas . * <u % ? z Una molécula efectora primaria o una molécula efectora secundaria, derivados o análogos de la misma puede ser producida por varios métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que resultan en su producción pueden ocurrir a 5 nivel de ácido nucleico o de proteína. Por ejemplo, una molécula efectora clonada que codifica secuencias que codifica, por ejemplo, una molécula efectora puede ser modificada por numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et ai., 1989, Molecular Clcr.ing, A Laboratory 10 Manual [Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio] , Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, New York) . La secuencia puede ser disociada en sitios apropiados con endonucleasa (s) de restricción, seguido por modificación enzimática adicional si se desea, aislada y 15 ligada in vi tro . En la producción de una molécula efectora modificada que codifica un derivado o análogo de una molécula efectora primaria o secundaria, se debe cuidar de asegurar que la molécula efectora modificada que codifica la secuencia permanece dentro del mismo marco de lectura de traducción que • 20 la proteína nativa, sin interrupción por señales de suspensión de traducción, en la región de secuencia codificadora de molécula efectora en dcnde se codifica la actividad de molécula efectora primaria o secundaria deseada. Además, una secuencia de ácidos nucleiccs que codifica una 25 molécula efectora puede ser mutada in vi zro o in vi vo, para - — "ü Mififflifipin iT ^,01^ ., . ^ ^, . i , .. . , crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación, y/o terminación, o para crear variaciones en regiones codificadoras y/o para formar nuevos sitios de endonucleasa de restricción o destruir sitios preexistentes, para facilitar modificación adicional in vi tro . En una modalidad específica preferida, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula efectora es mutada, por ejemplo, para producir una variante más potente. Cualquier técnica de mutagénesis conocida puede emplearse, incluyendo, sin limitarse a estos ejemplos, mutagénesis química, mutagénesis dirigida a sitio in vi tro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol.
Chem. 253:6551), uso de enlazadores TAB® (marca registrada) (Pharmacia), reacción en cadena de polimerasa con cebadores que contienen una mutación, etc. En una modalidad preferida, se efectúan sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o varios residuos de aminoácidos no esenciales predichos de una molécula efectora. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una sustitución en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral con una carga similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutár.ico) , i. i. t ,« > cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tircsina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, 5 triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Alternativamente, mutaciones pueden ser introducidas aleatoriamente sobre toda la secuencia codificadora o parte 10 de ella, como por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser tamizados para determinar actividad biológica para identificar mutantes que conservan dicha actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada y se puede determinar la 15 actividad de dicha proteína. En otras modalidades, las moléculas efectoras o proteínas de fusión de la invención son construidas de tal manera que contengan un sitio de disociación de proteasa. 5.5 PROTEÍNAS DE FUSIÓN 20 En ciertas modalidades, la invención cfrece una molécula efectora primaria o secundaria que es construida como una proteína de fusión (por ejemplo, covalentemente unida a una proteína diferente) . La invención proporciona ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de fusión. En otras 25 modalidades de la invención, el ácido nucleico que codifica gg | |gj| una proteína de fusión de la presente invención está enlazado operativamente a un promotor apropiado. En una modalidad específica, una molécula efectora es construida como una proteína quimérica o de fusión que comprende una molécula efectora o fragmento de la misma (de preferencia que consiste de por lo menos un dominio o motivo de la molécula efectora, o bien por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 25, por lo menos 50, por lo menos 75 o por lo menos 100 aminoácidos de la molécula efectora) unido en su terminal amino o carboxi a través de un enlace de péptido a una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente. En modalidades específicas, la proteína de fusión comprende por lo menos 2, por lo menos 6, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 75, o por lo menos 100 aminoácidos contiguos de un polipéptido heterólogo o fragmento del mismo funcionalmente activo. En una modalidad, dicha proteína de fusión o proteína quimérica es producida mediante la expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica la molécula efectora primaria (por ejemplo, una secuencia codificadora de TNF, una secuencia codificadora de factor anti-angiogénico, una secuencia codificadora de enzima inhibidora de tumor, o una secuencia codificadora de polipéptido citotóxico) unida en marco a una secuencia codificadora para una proteína diferente. Dicho producto quimérico puede ser elaborado mediante el ligado de ? ¿ ? J las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican las secuencias de aminoácidos deseadas entre ellas por métodos conocidos en la técnica, en el marco de codificación apropiado, y expresando el producto quimérico en el vehículo de expresión de elección por métodos comúnmente conocidos en la técnica. Ácidos nucleicos quiméricos que comprenden porciones de un ácido nucleico que codifica una molécula efectora fusionada sobre secuencias codificadoras de polipéptidos heterólogos pueden construirse. Una modalidad específica se refiere a una proteína quimérica que comprende un fragmento de una molécula efectora primaria o secundaria de por lo menos 5, por lo menos 10, por lo menos 25, por lo menos 50, o por lo menos 100 aminoácidos, o un fragmento que presenta una o varias actividades funcionales de la molécula efectora primaria o secundaria de longitud completa. En una modalidad específica, una proteína de fusión comprende un marcador de afinidad como por ejemplo un marcador de hexahistidina, o bien otro marcador de afinidad que puede ser utilizado en la purificación, aislamiento, identificación, o bien ensayo de expresión. En otra modalidad específica, una proteína de fusión comprende un sitio de disociación de proteasa como por ejemplo un sitio de disociación de proteasa metálica o serina. En esta modalidad, se prefiere en algunos casos que un sitio de proteasa que corresponde a una proteasa que es activa en el sitio de un tumor se construya en una ti ii proteína de fusión de la invención. En varias modalidades, una molécula efectora es construida como una proteína de fusión en una proteína de tipo Omp, o fragmento de la misma (por ejemplo, secuencia de señal, secuencia líder, región periplásmica, dominio de transmembrana, dominios de transmembrana múltiples, o bien combinaciones de los mismos; ver infra , sección 3.1 para la definición de "proteína de tipo Omp") . En una modalidad preferida, una molécula efectora (primara o secundaria) de la presente invención es expresada como una proteína de fusión con una proteína de membrana externa (proteína de tipo Omp) . Proteínas de membrana externa de bacterias son proteínas de membrana integrales de la membrana externa de bacteria, poseen múltiples dominios que abarcan la membrana y están frecuentemente unidas a una o varias porciones de lípido. Proteínas de membranas externas son expresadas inicialmente en forma de precursor (pro-Omp) con un péptido de señal de terminal amino que dirige la proteína hacia ia membrana, con lo que el péptido de señal es disociado por una peptidasa de señal para producir la proteína madura. En una modalidad, una molécula efectora es construida como proteína de fusión con una proteína de tipo Omp. En esta modalidad, la molécula efectora primaria tiene una administración incrementada a la membrana externa de la bacteria. Sin pretender ser limitados en cuanto al mecanismo, *. i .i. t la proteína de tipo Omp actúa, según los inventores, como un ancla o amarre para la molécula efectora sobre la membrana externa, o bien sirve para localizar la proteína en la membrana externa bacteriana. En una modalidad, la fusión de una molécula efectora con una proteína de tipo Omp se utiliza para incrementar la localización de una molécula efectora sobre el periplasma. En otra modalidad, la fusión de una molécula efectora sobre una proteína de tipo Omp se utiliza para incrementar la liberación de una molécula efectora. En modalidades específicas, la proteína de tipo Omp es por lo menos una porción de OmpA, OmpB, OmpC, OmpD, OmpE, OmpF, OmpT, una proteína de tipo porina, PhoA, PhoE, lamB, ß-lactamasa, una enterotoxina, proteína A, endoglucanasa, lipoproteína asociada con péptidoglicano (PAL), FepA, FhuA, NmpA, NmpB, NmpC, o bien una lipoproteína de membrana externa principal (como por ejemplo LPP) , etc. En ciertas modalidades de la presente invención, la secuencia de señal es construida para que sea más hidrofóbica (por ejemplo, mediante la inserción o el reemplazo de aminoácidos dentro de la secuencia de señal por aminoácidos hidrofóbicos, por ejemplo, leucina). Como ejemplos ilustrativos, véanse secciones 7.1-7.4, infra . En otras modalidades de la invención, una proteína de fusión de la presente invención comprende un sitio de disociación proteolítica. El sitio de disociación proteolítica puede ser J ¿ y .„ t .¿...fr. ,t endógeno para la molécula efectora o bien endógeno para la proteína de tipo Omp, o bien el sitio de disociación proteolítica puede estar construido en la proteína de fusión. En ciertas modalidades específicas, la proteína de tipo Omp de la invención es Omp híbrida que comprende elementos estructurales que se originan de proteínas separadas. En un modo ejemplar de la modalidad, la proteína de tipo Omp es OmpA; los mismos principios utilizados en la construcción de proteínas de fusión de tipo OmpA se aplican a otras proteínas de fusión Omp, guardando en mente la configuración estructural de la proteína de tipo Omp específica. Por ejemplo, la proteína OmpA nativa contiene ocho cadenas ß de transmembrana antiparalelas dentro del dominio N-terminal de 170 aminoácidos de la proteína. Entre cada par de dominios de transmembrana se encuentra un bucle extracelular o intracelular, según la dirección de la inserción del dominio de transmembrana. El dominio C-terminal consiste de 155 aminoácidos que se localizan intracelularmente y probablemente están en contacto con el péptidoglicano que ocupa el espacio periplásmico. Vectores de expresión han sido generados que facilitan la generación de proteínas de fusión OmpA. Por ejemplo, Hobom et al. (1995, Dev. Biol. Strand. 84:255-262) han desarrollado vectores que contienen el marco abierto de lectura de OmpA con enlazadores insertados dentro de las secuencias que codifican el tercer o cuarto bucle t» JA extracelular que permiten la inserción en marco de la proteína heteróloga de elección. En una modalidad de la invención, la porción de la proteína de fusión OmpA que contiene la molécula efectora primaria tiene una expresión incrementada en el periplasma. En un aspecto de la modalidad, la proteína de fusión comprende antes de la maduración, ya sea la secuencia de señal o bien la secuencia de señal seguida por, al menos, un dominio de OmpA que abarca la membrana, localizado N-terminal con relación a la molécula efectora primaria. La secuencia de señal es disociada y ausente de la proteína madura. En otro aspecto de la modalidad, la molécula efectora primaria se encuentra en la terminal N de la fusión OmpA, haciendo inconsecuencial para la colocación de la molécula efectora primaria el número de dominios de OmpA que abarcan membrana utilizados en la medida en que la proteína de fusión presenta estabilidad. En otro aspecto de la modalidad, la molécula efectora primaria se localiza entre los dominios N-terminal y C-terminal de OmpA como una proteína periplásmica soluble que contiene la molécula efectora primaria al disociarse a través de proteasa periplásmica dentro del periplasma. En ciertos aspectos de esta modalidad, se prefiere que un vector bacteriano que expresa una molécula efectora primaria periplásmica coexprese también BRP para incrementar la liberación de la molécula efectora de la célula bacteriana.
-J*. i -4. » En otra modalidad de la invención, la porción de fusión OmpA que contiene la molécula efectora primaria se encuentra en la superficie bacteriana extracelular. En un aspecto de la modalidad, la proteína de fusión comprende un número par o un número impar de dominios de OmpA que abarca membrana localizados N-terminal con relación a la molécula efectora primaria. En otro aspecto de la modalidad, la molécula efectora primaria se localiza entre dos bucles extracelulares de OmpA para presentación a la célula tumoral por la célula bacteriana. En modalidades específicas, la invención ofrece plásmidos de expresión de proteínas de fusión de molécula efectora en la superficie extracelular bacteriana. Por ejemplo, el plásmido nombrado Tre (lpp) ompA, comprende una secuencia de ancla de lipoproteína impulsada por promotor tre (lpp) fusionada sobre una secuencia de transmembrana ompA truncada. A título de ejemplo, el plásmido es indicado Trcsmp? comprende una secuencia de señal codificadora de ompA impulsada por promotor trc. Tales plésmidos pueden ser construidos de tal manera que comprendan un ácido nucleico que codifica una o varias molécula (s) efectora (s) de la invención. Opcionalmente, una molécula efectora está precedida o flanqueada por sitios de disociación de complejo para una metaloproteasa o serinaproteasa que es abundante en tumores, para la liberación de la molécula efectora en el entorno del ™ J- Jt i l i tumor. Si la molécula efectora primaria está precedida o flanqueada por sitios de disociación de proteasa depende si se encuentra terminal o internamente en la prcteína de fusión, respectivamente. Proteínas de fusión similares pueden ser construidas con cualesquiera de las proteínas de tipo Omp utilizando las estrategias descritas arriba en términos de OmpA. En la construcción de tales proteínas de fusión, como resultará aparente a una persona con conocimientos normales en la materia, la selección de la porción de la proteína de tipo Omp a fusionar sobre una molécula efectora dependerá de la ubicación que se desea para la expresión de la molécula efectora (por ejemplo, periplásmica, extracelular, unida a membrana, etc) . Dichas construcciones de proteína de fusión según lo descrito aquí para moléculas efectoras primarias son también apropiadas para moléculas efectoras secundarias. En una modalidad preferida, una molécula efectora es fusionada sobre un péptido de transporte. Los péptidos de transporte utilizados en proteínas de fusión facilitan la administración de un polipéptido o péptido de interés virtualmente a cualquier célula dentro de límites de difusión de su producción o introducción (ver, por ejemplo, Bayley, 1999, Nature Biotechnology 17:1066-1067; Fernández et al., 1998, Nature Biotechnology 16:418-420; y Derossi et al., 1998, Trends Cell Biol. 8:84-87). Por consiguiente, la , Á á ? i. manipulación de bacterias dirigidas a tumor atenuadas para expresar proteínas de fusión que comprenden un péptido de transporte y una molécula efectora incrementa la capacidad de internalización de una molécula efectora por parte de células 5 tumorales. En una modalidad específica, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son manipuladas para expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende un péptido de transporte y una molécula efectora. En otra modalidad, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son 10 manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión que comprenden un péptido de transporte y una molécula efectora.
• De conformidad con estas modalidades, la molécula efectora puede ser una molécula efectora primaria o secundaria. 15 Ejemplos de péptidos de transporte incluyen, sin limitarse a ellos, péptidos derivados de proteína TAT de VIH, el homeodominio de antennapedia (penetratina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF) , virus VP22 de herpes simplex, 20 polihistadina (por ejemplo, hexahistadina; 6H) , polilisina (por ejemplo, hexalisina; 6K) , y poliarginina (por ejemplo, hexaarginina; 6R) (véase, por ejemplo, Blanke et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:8437-8442). En otra modalidad preferida, una proteína de fusión comprende 25 un péptido de señal, un péptido de transporte y una molécula efectora. En un modo específico de esta modalidad, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión que comprenden una secuencia de 5 señal, un péptido de transporte y una molécula efectora. De conformidad con este modo, la molécula efectora es una molécula efectora primaria o secundaria. En otra modalidad preferida, una proteína de fusión comprende un péptido de señal, un sitio de disociación proteolítica, un 10 péptido de transporte y una molécula efectora a un tumor sólido por bacteria dirigida a tumor atenuada. En una modalidad específica, bacterias elegidas a tumores atenuadas son manipuladas de tal manera que expresen una c varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias 15 proteínas de fusión que comprenden una secuencia de señal, un sitio de disociación proteolítico, un péptido de transporte, y una molécula efectora. De conformidad con esta modalidad, la modalidad efectora puede ser una molécula efeetora primaria o secundaria. 20 A título de ejemplo no limitativo, la actividad de la colicma puede ser incrementada mediante la adición de péptidos de internalización derivados de TAT de VIH, virus VP22 de herpes simplex, antennapedia, 6H, 6K y 6R. La fusión puede ser ya sea C-terminal, N-terminal, o interna. Fusiones 25 internas se prefieren especialmente en los casos en los -j^^^gg^ cuales la fusión sigue el péptido de disociación de secuencia de señal N-terminal. La proteína de fusión puede comprender además una secuencia de señal N-terminal como por ejemplo OmpA o una secuencia de señal C-terminal como por ejemplo hlyA. En una modalidad preferida, una molécula efectora es fusionada sobre la porción de suministro de una toxina. Se conocen varias toxinas que tienen una capacidad de autosuministro, en donde una porción de la toxina actúa como agente de suministro para la segunda porción de la toxina. Por ejemplo, Ballard et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:12531-12534 demostraron que el agente protector de ántrax (PA) que media ia entrada de factor letal (LF) y factor de edema en el compartimiento citosólico de las células mamarias puede también mediar la entrada de fusiones de proteína en una forma truncada de LF (LFn; 255 residuos de aminoácidos) . Así, moléculas efectoras de la invención, excepto las que funcionan fuera de la célula, pueden ser fusionadas sobre LFn, o bien otros sistemas de toxina, incluyendo, sin limitarse a estes ejemplos, residuos 1-193 de cadena A de toxina de difteria (Blanke et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 843 -8442) , toxina de cólera, verotoxina, toxinas lábiles al calor de E. coli (LTs) , toxinas estables al calor de E. coli (STs), enterohemolisinas, enterotoxinas, citotoxinas, toxina 1 estable de EaggEC (EAST) , CNFs, toxina '•*•»-* ' de distención citoletal, a-hemolisinas, ß-hemolisinas, y SheA hemolisinas (para una reseña, véase, por ejemplo, O'Brien y Holmes, 1996. Protein toxins of Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al. 5 (eds), ASM Press, Washington, D.C. pp 2788-2802). En una modalidad específica, una molécula efectora primaria está fusionada sobre la porción de suministro de una toxina. En otra modalidad específica, una molécula efectora secundaria está fusionada sobre la porción de suministro de una toxina. 10 La construcción de proteínas de fusión para expresión en bacterias es bien conocido en la técnica y estos métodos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. (Véase, por ejemplo, Makrides, S., 1996, Microbiol. Revs 60:512-538 que se incorpora aquí por referencia en su 15 totalidad) . 5.6. VEHÍCULOS DE EXPRESIÓN La presente invención proporciona bacterias dirigidas a tumor atenuadas que han sido manipuladas para codificar una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente, una o 20 varias moléculas efectoras secundarias. La invención proporciona bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden molécula (s) efectora (s) codificada (s) per un plásmido o ácido nucleico transfectable. En una modalidad preferida de la invención, la bacteria dirigida a tumor 25 atenuada es Salmonella . Cuando más que una molécula efeetera (por ejemplo, primaria o secundaria) se expresa en una bacteria dirigida a tumor atenuada como por ejemplo Salmonella, las moléculas efectoras pueden ser codificadas por el mismo plásmido o ácido nucleico, o bien más de un 5 plásmido o molécula de ácido nucleico. La invención ofrece también bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden molécula (s) efectora (s) codificada (s) por una molécula de ácido nucleico integrada en el genoma bacteriano. Molécula (s) efectora (s) integrada (s) puede (n) ser endógena para una 10 bacteria dirigida a tumor atenuada, como por ejemplo Salmonella, o bien puede (n) ser introducida (s) en la bacteria dirigida a tumor atenuada (por ejemplo, por introducción de • un ácido nucleico que codifica la molécula efectora, como por ejemplo un plásmido, ácido nucleico transfectable, 15 transposón, etc) de tal manera que la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula efectora se vuelva integrada en el genoma de la bacteria dirigida a tumor atenuada. En una modalidad preferida de la invención, la bacteria dirigida a tumor atenuada es Salmonella . La • 20 invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora cuyo ácido nucleico está enlazado operativamente con un promotor apropiado. Un promotor enlazado operativamente con una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora puede ser 25 homólogo (es decir, nativo) o bien heterólogo 'es decir, no . >,.«.« A. t.J nativo para la molécula de ácido nucleico que codifica la molécula efectora) . La secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula efectora de la invención o un análogo o fragmento 5 funcionalmente activo u otro derivado de la misma puede ser insertada en un vehículo de expresión apropiado, por ejemplo, un plásmido que contiene los elementos necesarios para la • transcripción y traducción de la secuencia codificadora de proteína insertada. Las señales de transcripción y traducción 10 necesarias pueden ser suministradas por la molécula efectora y/o sus regiones de flanco. Alternativamente, un vehículo de expresión es construido mediante la inserción de una secuencia de ADN estructural que codifica una prcteína deseada junto con señales adecuadas de inicio y terminación 15 de traducción en fase de lectura operable con un prcr.otor funcional empleando uno de varios métodos conocidos en la técnica para la manipulación de ADN. Véase, en términos generales, Sambrook et al., 1939, Mol ecular Biol ogy: ?. Labora tory Manual [Biología Molecular: Un manual de • 20 laboratorio], Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1995, Currer.t Protocol s in Molec7lar Biology [Protocolos actuales en biología molecular] , Greene Publishing, New York, NY) . Estes métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante ín vi tre y sintéticas así come 25 recombinantes in vivo (recombinación genética) . La invención ofrece una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula efectora cuyo ácido nucleico está unido operativamente a un promotor apropiado. La presente invención ofrece también bacterias dirigidas a tumor atenuadas que han sido modificadas para codificar una o varias proteínas de fusión y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras. La invención ofrece bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden proteínas de fusión codificadas por un plásmido o ácido nucleico transfectable. Cuando más de una proteína de fusión y/o molécula efectora (por ejemplo, primaria o secundaria) es expresada en una bacteria dirigida a tumor atenuada, por ejemplo, Salmonella, las proteínas de fusión y/o las moléculas efectoras pueden ser codificadas por el mismo plásmido o ácido nucleico, o bien por más que un plásmido o ácido nucleico. La invención ofrece también bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden proteínas de fusión codificadas por un ácido nucleico integrado en el genoma de la bacteria. La invención ofrece también una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión cuya molécula de ácido nucleico está enlazado operativamente con un promotor apropiado. La secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión de la invención puede estar insertada en un vehículo de expresión apropiado, por ejemplo, un plásmido que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora de proteína insertada. En ciertas modalidades específicas de la invención, el vehículo de expresión de la invención es un plásmido. grandes números de plásmidos adecuados son conocidos por parte de los expertos en la materia y están disponibles en el comercio para la generación de los constructos recombinantes de la presente invención. Tales plásmidos comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl, Estados Unidos de América) . Estas secciones de "estructura" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a expresar. Se considera que pBR322 es un plásmido de número bajo de copias. Si se desean altos niveles de expresión, el plásmido puede ser un plásmido de alto número de copias, por ejemplo, un plásmido con una estructura de pUC. Los plásmidos pUC incluyen sin limitarse a ellos, pUC19 (ver, por ejemplo, Yanisch-Perron et al. 1985, Gene 33:1:3-119) y pBluescript (Stratagene) . Los siguientes plásmidos se proporcionan a título de ejemplo y pueden ser utilizados en combinación con los métodos de la invención. Bacterianos: pBs, phagescript, phiX174, pbluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Un plásmido comercial con una "estructura" de pBR322 puede también ser utilizado, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM 1 (Promega Biotec, Madison, Wl, Estados Unidos de América) . Estos plásmidos son combinados con un promotor apropiado y la 5 secuencia estructura a expresar, pCET, pTS (de conformidad con lo descrito en la Sección 6 en este documento) . En modalidades específicas de la invención, un plásmido que • codifica una molécula efectora es el plásmido pTS-TNF-a, el plásmido pTS-BRP, o el plásmido pTS-BRPTNF-a, de conformidad 10 con lo descrito en la Sección 6 aquí. En una modalidad específica de la invención, la proteína de fusión de la invención para secreción en el espacio • periplásmico que comprende la secuencia de señal de OmpA y la proteína efectora primaria son codificadas por el plásmido 15 pIN-III-ompA-Hind, que contiene la secuencia de ADN que codifica la secuencia de señal de ADN que codifica la secuencia de señal de ompA corriente arriba de una secuencia de enlazador en la cual se puede clonar la secuencia codificadora para la molécula efectora primaria. En una • 20 modalidad específica preferida, el promotor inducible iac del vector pIN-III-ompA-Hind es reemplazado por un promotor pepT o tet. (Véase, Rentier-Delrue et al. (1988), Nuc. Acíds. Res. 16:8726) . La presente invención ofrece también la integración 25 cromosómica mediada por transposón de moléculas efectoras. fl¡liif * M*"^, cii-iig. » .
Cualquier plásmido de transposón conocido en la técnica puede ser utilizado en los métodos de la invención en la medida en que un ácido nucleico que codifica una molécula efectora puede ser construido en el cassette de transposón. Por ejemplo, la invención proporciona un plásmido de transposón, que comprende un transposón o minitransposón, y un MCS. En ciertas modalidades de la invención, el plásmido de la presente invención es un plásmido de transposón, es decir, comprende un transposón en el cual la secuencia codificadora de una molécula efectora de interés está insertada. Los plásmidos de transposón contienen cassettes de transposón dichos cassettes se vuelven integrados en el genoma bacteriano. Por consiguiente un ácido nucleico que codifica una molécula efectora o proteína de fusión de la misma esté insertado en el cassette de transposón. Así, una inserción de transposón integra el cassette en el ger.oma bacteriano. La secuencia codificadora de la molécula efectora puede estar unida operativamente a un promotor, o bien puede estar sin promotor. En este último caso, la expresión del marcador seleccionable es impulsada por un promotor en el sitio de inserción de transposón en el genoma bacteriano. Colonias de bacterias que tienen una inserción de transposón son tamizadas para niveles de expresión que cumplen con los requerimientos de la invención, por ejemplo, que expresan niveles suficientes de citocina para promover citotoxicidad, estasis o regresión del tumor. En ciertas modalidades, además del transposón, el plásmido de transposón comprende, fuera de las repeticiones invertidas del transposón, un gen de transposasa para catalizar la inserción del transposón en el genoma bacteriano, sin ser arrastrado junto con el transposón, de tal manera que se generen cepas bacterianas con inserciones estables de transposón. Los transposones a utilizar por la presente invención incluyen, sin limitarse a ellos, Tn7, Tn9, TnlO y Tn5. En una modalidad preferida, el plásmido de transposón es pNK2883 (ATCC) que tiene un gen de resistencia a la ampicilina ubicado fuera de los elementos de inserción de TnlO y los ácidos nucleicos que codifican una o varias molécula (s) efectora (s) es/son insertado (s) entre los dos elementos de inserción de TnlO (por ejemplo, dentro del cassette de transposón) . De preferencia, el constructo es elaborado de tal manera que secuencias adicionales que codifican otros elementos estén insertadas entre los dos elementos de inserción TnlO. En modalidades específicas, tales elementos pueden incluir opcionalmente (1) una copia sin promotor de un marcador seleccionable (por ejemplo, SerC, AroA, etc) para selección positiva de las bacterias que contienen el plásmido; (2) un gen de BRP, (3) un promotor para la molécula efectora (como por ejemplo tre) enlazado operativamente al -Ai, -A. A . J. .i ?.? ácido nucleico que codifica la(s) molécula (s) efectora (s) primaria (s) (como por ejemplo TNF-a o una proteína de fusión del mismo, por ejemplo, una proteína de fusión OmpA-TNF-a) , (4) un terminador para el ácido nucleico que codifica la(s) 5 molécula (s) efectora (s). En una modalidad, después de la manipulación del plásmido según lo apropiado y la selección de estos clones que tienen • el constructo deseado utilizando las propiedades de resistencia a la ampicilina codificadas por el plásmido, la 10 selección de antibióticos es removida a través de pérdida de plásmido y cepas que tienen un inserto de transposón cromosómico se seleccionan para su administración a sujetos humanos (por ejemplo, por colocación en placas en medio selectivo) . 15 En otra modalidad específica, el plásmido pTS es utilizado el cual comprende un gen de transposasa de especificidad de blanco alterada y un minitransposón, que contiene las secuencias codificadoras para un gen serC sin promotor y un MCS. En otra modalidad específica, el plásmido pTS-BRP es • 20 utilizado el cual comprende un gen de transposasa de especificidad de blanco alterada y un minitransposón, que contiene las secuencias codificadoras para un gen serC sin promotor, y factor de liberación de bacteriocina inducible por agente de alquilación, y un MSC. 25 En una modalidad preferida, un plásmido de transposón para —--—pi^rr mr A^.„ «^„.„ _„.^,.A, _ _ _, , , >- j. ^L selección de integrantes cromosómicos mediados por transposón, comprende: a) un gen de transposasa, para excisión e integración de transposón, localizado fuera de la secuencia de inserción de transposón (por ejemplo, fuera del cassette de transposón) ; b) una secuencia codificadora de tipo silvestre que corresponde al gen de selección borrado en la cepa bacteriana (por ejemplo, serC) así como un sitio de unión ribosomal y terminador para gen de tipo silvestre, pero sin promotor. Esta secuencia se localiza de preferencia inmediatamente después de la secuencia de inserción de transposón TN10 izquierda; c) opcionalmente, entre las secuencias de inserción derecha e izquierda se encuentra una secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico realzador de liberación (por ejemplo BRP) ; y d) un sitio de clonación múltiple (MCS) localizado entre las secuencias de inserción derecha e izquierda, que contiene sitios de restricción únicos dentro del plásmido, para la incorporación de molécula efectora. El MSC se localiza de preferencia inmediatamente después del ácido nucleico realzador de liberación 8si se utiliza) y justo antes de la secuencia de inserción de TN10 derecho.
En otra modalidad, la desorganización de gen que resulta de la integración aleatoria de moléculas efectoras en el cromosoma huésped identifica el carácter adecuado de la ubicación de gen para inserción de efector. En otra modalidad, el vehículo de expresión es un plásmido extracromosómico estable sin requerir de selección de antibiótico, es decir, es automantenido. En un ejemplo no limitativo, el vehículo de expresión automantenido es un plásmido de virulencia de Salmonella . Por ejemplo, en una modalidad de la invención, el sistema de selección de plásmido es mantenido proporcionando una función que no tiene la bacteria, como por ejemplo Salmonella, y con base en la cual se puede seleccionar las Salmonellas que tienen la función a costas de las que no tienen dicha función. En una modalidad, la Salmonella de ia invención es una cepa mutante auxotrófica y el plásmido de expresión proporciona la función de enzima biosintética mutante o ausente. Salmonella que contienen el plásmido de expresión pueden ser seleccionadas mediante el cultivo de células en medio de cultivo que no tienen el nutriente que solamente las células deseadas, es decir, la cepa que tienen el plásmido de expresión, pueden metabolizar. En un aspecto altamente preferido de esta modalidad, la Salmonella de la invención tiene un requerimiento obligatorio para DAP (ácido meso-diaminopimélico) , con mayor preferencia por deleción dei gen asd. DAP es un componente del péptidoglicano presente en el periplasma de bacterias Gram-negativas, que se requiera para la integridad de la membrana externa de la bacteria. La ausencia de DAP resulta en lisis de células bacterianas que 5 resulta de la pérdida de la integridad de la membrana externa. El gen asd (ß-aspartato semialdehído deshidrogenasa) codifica una enzima en la vía biosintética de DAP. Bacterias • Gram-negativas que no tienen la función asd pueden ser cultivadas mediante el suministro de DAP al medio de cultivo. 10 Plásmidos, por ejemplo, los plásmidos de expresión de la invención, que llevan la secuencia de gen asd unida operativamente a un promotor homólogo o heterólogo pueden ser seleccionados para cultivar bacterias Gram-negativas que no tienen la actividad asd en ausencia de DAP (véase, por 15 ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,840,483 de Curtiss, III) . Otros sistemas de selección no antibióticos se conocen en ia técnica y se encuentran dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un sistema de selección que utiliza un plásr.i o 20 que comprende una toxina estable y una antitoxina menos estable puede emplearse para seleccionar bacterias que mantienen dicho plásmido. En otra modalidad, el vehículo de expresión es un piésr.ido extra-cromosómico que puede ser seleccionado por medios no 25 antibióticos, por ejemplo, un plásmido de colicina. Cerne se . & k ZkA emplean aquí, un plásmido de coiicina codifica de manera mínima una toxina de colicina y una anti-colicma, la toxina de colicina es más estable que la anti-colicina de tal manera que cualquier bacteria que pierda el plásmido de colicina es matada como resultado de la persistencia de la toxina de colicina. En una modalidad preferida la toxina de colicina es la subunidad grande de ColE3 y la anti-colicina es la subunidad pequeña de ColE3. En otras modalidades de la invención, el vehículo de expresión es un vector ? más específicamente un vector ? lisogénico. En una modalidad preferida, el huésped bacteriano comprende el vector ? que comprende además un represor ? sensible a la temperatura que es funcional a 30° C pero no a 37° C. Por consiguiente, el huésped bacteriano puede ser cultivado y manipulado in vivo a una temperatura de 30° C sin expresión de la molécula efectora primaria o secundaria que puede ser tóxica para la célula bacteriana. Al introducir la cepa bacteriana en el sujeto, el represor ? es desactivado por temperatura corporal normal y se activa la expresión de la molécula efectora primaria, y cpcionalmente de una molécula efectora secundaria. La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula efectora o proteína de fusión puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de tal manera que la molécula efectora sea expresada en una bacteria i. . . Li transformada con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de una molécula efectora puede ser controlada por cualquier elemento promotor/realzador conocido en la técnica. Un promotor/realzador puede ser homólogo (es decir, nativo) o bien heterólogo (es decir, no nativo) . Promotores que pueden ser utilizados para controlar la expresión de una molécula efectora, por ejemplo, una citocina, o proteína de fusión en bacteria incluyen, sin limitarse a ellos, promotores procarióticos tales como promotor de ß-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.
Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), o bien el promotor lac (DeBoer et al. , 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21- 25; Seientific American, 1980, 242:74-94A Otros promotores abarcados por la presente invención incluyen, sin limitarse a ellos, lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda, P=, lambda, P-_, tre, pagC, sulA, pol II (dinA) , ruv, recA, uvrA, uvrB, uvrD, umuDC, lexA, cea, caá, y recN (véase, por ejemplo, Schnarr et ai., 1991, Biochimie 73:423-431). En una modalidad preferida, el promotor es tre, (véase, por ejemplo Amann et al., 1998, Gene 69:301-15) . En ur.a modalidad particular, en la cual ia molécula efectora primaria es una colicina expresada bajo el control de un promotor que responde a SOS, la cepa bacteriana atenuada puede ser tratada con rayos X, radiación ultravioleta, un agente de alquilación, o bien otro agente que daña el ADN de tal manera que se incremente la expresión de la colicina. Promotores ejemplares que responden a SOS incluyen, sin limitarse a ellos, recA, sulA, u uC, dinA, ruv, uvrA, uvrB, uvrD, lexA, cea, caá, recN, etc. 5 En otra modalidad preferida, el promotor tiene una actividad incrementada en el entorno del tumor; por ejemplo, un promotor que es activado por el entorno anaeróbico del tumor • como por ejemplo el promotor Pl del gen pepT. La activación del promotor Pl depende del activador de transcripción FNR 10 (Strauch et al., 1985, J. Bacteriol. 156:743-751). En una modalidad específica, el promotor Pl es un promotor mutante inducido en niveles más elevados bajo condiciones anaeróbicas que el promotor Pl nativo, como por ejemplo el promotor pepT200 cuya actividad en respuesta a condiciones anaeróbicas 15 es inducida por CRP-cAMP en vez de FNR (Lombardo et al., 1997, J. Bacteriol. 179:1909-1917). En otra modalidad, el promotor inducido anaeróbicamente es utilizado, por ejemplo, el promotor potABCD. potABCD es un operón expresado de manera divergente a partir de pepT en condiciones anaeróbicas. El • 20 promotor en el gen pepT responsable de esta expresión ha sido aislado (Lombardo, et al., 1997, J. Bacteriol. 179:1909-1917) y puede ser utilizado de conformidad con los métodos de la presente invención. Alternativamente, el promotor puede ser un promotor inducido 25 por antibióticos, por ejemplo, el promotor tet del transposón J^A,^J¿jj=8M^¿J^.¿áÍ TnlO. En una modalidad preferida, el promotor tet es multimerizado, por ejemplo, tres veces. La actividad del promotor sería después inducida por medio de la administración a un sujeto que ha sido tratado con la bacteria dirigida a tumor atenuada de la invención de una dosis apropiada de tetraciclina. Aun cuando el sistema de expresión inducible de tet fue inicialmente descrito para sistemas eucarióticos tales como Schi zosaccharomyces pombe (Faryar y Gatz, 1992, Current Genetics 21:345-349) y células de mamíferos (Lang y Feingold, 1996, Gene 168:169-171), estudios recientes amplían su aplicabilidad a células bacterianas. Por ejemplo, Stieger et al. (1999, gene 226:243-252) han mostrado una inducción de 80 veces del gen de luciferasa de la luciérnaga al inducirse tet cuando está unido operativamente al promotor tet. Una ventaja de este promotor es que es inducido a niveles muy bajos de tetraciclina, aproximadamente una décima parte de la dosificación requerida para actividad antibiótica. Una vez construido un plásmido que comprende una molécula efectora o introducida una proteína de fusión en la bacteria dirigida a tumor atenuada, se puede ensayar la expresión de molécula efectora o la expresión de proteína de fusión a través de cualquier método conocido en la técnica incluyendo, sin limitarse a estos métodos, actividad biológica, actividad enzimática, análisis Northern blot, y análisis Western blot.
(Véase Sambrook et al., 1989, Molecular Biology: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1995, Current Protocol s in Molecular Biology, Green Publishing, New York, NY) . 5 5.7. TERAPIA DE COMBINACIÓN En ciertas modalidades, bacterias dirigidas a tumor atenuadas son utilizadas en combinación con otras terapias contra • cáncer conocidas para tratar un tumor de cáncer sólido. En ciertas otras modalidades, bacterias dirigidas a tumor 10 atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifica (n) una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión se utilizan en combinación • con otras terapias contra cáncer conocidas para tratar un cáncer de tumor sólido. Por ejemplo, bacterias dirigidas a 15 tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión pueden utilizarse en combinación con un agente quimioterapéutico. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitarse a ellos, 20 cisplatina, ifosfamida, taxanos como por ejemplo taxol y paclitaxol, inhibidores de topoisomerasa I (por ejemplo, CPT- 11, topotecano, 9-AC, y GC—211), gemcitabina, vinorelbina, oxaliplatina, 5-fluorouracilo (5-FU) , ieucovorina, vinorelbina, temodal, citocaiasina B, gramicidir.a D, emetina, 25 mitomicina, etoposido, tencposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestostercna, glucocorticoides, procaína, tetracaina, lidocaina, propanclol, y homólogos de puromicina, y citoxano. Alternativamente, bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión pueden ser utilizadas en combinación con terapia ae radiaciones (por ejemplo, radiación gamma o bien radiación de rayos X) . Cualquier protocolo de terapia con radiaciones puede utilizarse según el tipo de cáncer a tratar. Por ejemplo, pero no a título limitativo, se pueden administrar radiaciones de rayos X; en particular, se puede utilizar megavoltaje de alta energía (radiación co una energía mayor que 1 MeV) para tumores profundos y haces electrónicos y radiaciones de rayos X de otro voltaje pueden utilizarse para cánceres de la piel. Radioisótopos que emiten rayos gamma, tales como isótopos radioactivos del radio, cobalto y otros elementos pueden también ser administrados para exponer tejidos a radiaciones. La presente invención incluye la administración secuencial o concomitante de un agente anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas, la invención abarca combinaciones de agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tur.cr atenuadas que son -A.» i ?,- aditivas o sinérgicas. La invención abarca también combinaciones de uno o varios agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas que tienen sitios de acción diferentes. Dicha combinación 5 proporciona una terapia mejorada con base en la acción doble de estos agentes terapéuticos si la combinación es sinérgica o aditiva. Así, la terapia de combinación novedosa de la • presente invención proporciona una eficacia me: orada en comparación con cualesquiera de estos agentes utilizado como 10 terapia de agente único. La presente invención incluye también la administración secuencial o concomitante de un agente anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican ur.a o varias 15 moléculas efectoras y/o proteínas de fusión. La invención abarca combinaciones de agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar ana o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión que ser. aditivas 20 o sinérgicas. La invención abarca también combinaciones de une o varios agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o 25 proteínas de fusión que tienen sitios de acción ciferentes. i .. t í .í -¡ Dicha combinación proporciona una terapia mejorada con base en la acción doble de estos agentes terapéuticos que la combinación sea sinérgica o aditiva. Así, la terapia de combinación novedosa de la presente invención ofrece una eficacia mejorada en comparación con cualesquiera de los agentes empleada como terapia de agente único. 5.8. MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA ADMINISTRACIÓN La invención ofrece métodos a través de los cuales una o varias moléculas efectoras primarias que pueden ser tóxicas cuando se administran sistémicamente a un huésped, pueden ser administradas localmente a tumores por una bacteria dirigida a tumor atenuada con toxicidad reducida para el huésped. En una modalidad, la molécula efectora primaria es útil para tratar sarcomas, linfomas, carcinomas y otros cánceres de tumor sólido. En ciertas modalidades no limitativas, ia molécula efectora es útil para inducir una respuesta inmunológica local en el sitio del tumor. De conformidad con la presente invención, los vectores bacterianos dirigidos a tumor atenuados que contienen moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente una o varias moléculas efectoras secundarias se utilizan de manera provechosa en métodos para inhibir el crecimiento de un tumor, reducir el volumen de un tumor, o prevenir la difusión de células tumorales en un animal, incluyendo un paciente = ? i humano, que tiene un cáncer de tumor sólido. La presente invención ofrece métodos para suministrar una o varias moléculas efectoras primarias para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración a un animal que requiere de dicho tratamiento de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias unidas de manera operativa a uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece también métodos para suministrar una o varias moléculas efectoras primarias para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración, a un animal que requiere de dicho tratamiento, de una ccr.posicicn farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codificar, una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias unidas de manera operativa a uno o varios promotores apropiados. En una modalidad, la molécula efectora primaria es miembro de la familia de TNF, un péptido o polipéptido citotóxico, un factor anti-angiogénico, una enzima inhibidora de tumor, o un fragmento funcional del mismo. La presente invención ofrece métodos para suministrar ur.a o varias proteínas de fusión ae la invención para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración, a un animal que requiere de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención unidas de manera operativa a uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece también métodos para suministrar una o varias proteínas de fusión de la invención y una o varias moléculas efectoras para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido que comprende la administración, a un animal que requiere de dicho tratamiento, de una composición farmacéutica que comprende una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención y una o varias moléculas efectoras unidas de manera operativa con uno o varios promotores apropiados. En una modalidad preferida, la bacteria dirigida a tumor atenuada es Sair.oneiia . En otra modalidad, la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende un sistema de liberación realzado. En una modalidad preferida, ei animal es un mamífero. En una modalidad altamente preferida, el animal es un ser humano. La invención ofrece también la administración en combinación de una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras secundarias que son suministradas por una bacteria dirigida a tumor atenuada como por ejemplo Salmonella . La invención ofrece también la administración en combinación de diferentes bacterias dirigidas a tumor atenuadas que llevan una o varias moléculas efectoras primarias diferentes y/u opcionalmente una o varias moléculas efectoras secundarias diferentes. La invención ofrece también la administración de una o varias proteínas de fusión de la invención que son suministradas por una bacteria dirigida a tumor atenuada como por ejemplo Salmonella . La invención ofrece también la administración en combinación de una o varias proteínas de fusión de la invención y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras déla invención, que son suministradas por una bacteria dirigida a tumor atenuada como por ejemplo Salmonella . La invención ofrece también la administración en combinación de diferentes bacterias dirigidas a tumor atenuadas que llevan una o varias proteínas de fusión diferentes y/u opcionalmente, una o varias moléculas efectoras diferentes. Los tumores sólidos incluyen, sin limitarse a ellos, sarcoma, carcinoma, y otros cánceres de tumores sólidos incluyendo, sin limitarse a ellos, tumores de línea germinal, tumores del sistema nervioso central, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer pulmonar, cáncer de ovarios, cáncer de testículo, cáncer de la tiroide, a ? i. astrocitoma, glioma, cáncer pancreático, cáncer del estómago, cáncer hepático, cáncer de colon, melanoma, cáncer renal, cáncer de vejiga y mesotelioma. El sujeto es de preferencia un animal, incluyendo, sin limitarse a estos animales, vacas, cerdos, pollos, perros, gatos, caballos etc, y es de preferencia un mamífero, y con mayor preferencia un ser humano. Como se emplea aquí, el tratamiento de un tumor sólido incluye, sin limitarse a esto, la inhibición del crecimiento del tumor, la inhibición de la proliferación de células tumorales, la reducción del volumen del tumor, o bien la inhibición de la difusión de las células tumorales a otras partes del cuerpo (metástasis) . La presente invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias unidas operativamente a uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias unidas operativamente a uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la invención unidas operativamente a 5 uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor • atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión de la 10 invención y una o varias moléculas efectoras unidas operativamente a uno o varios promotores apropiados. La presente invención ofrece también una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada. La 15 presente invención ofrece también una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas efectoras primarias y, opcionalmente, una o varias moléculas efectoras secundarias. 20 Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de Salmonella dirigido a tumor atenuado que comprende una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente una o varias moléculas efectoras secundarias, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente 25 invención ofrece también una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una Salmonella dirigida a tumor atenuada que comprende ur.a o varias proteínas de fusión de la invención y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector de Salmonella dirigido a tumor atenuado que comprende una o varias proteínas de fusión de la invención y opcionalmente una o varias moléculas efectoras, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o de un gobierno estatal o bien que se encuentra en la lista en la Farmacopea Estadounidense, o bien otra farmacopea generalmente reconocida para su use en animales, y más particularmente en seres humanos. El terrino "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles como por ejemplo agua y aceites, incluyendo de petróleo, animal, vegetal o de origen sintético, como por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí, aceite de olivo y similares. Una solución salina es un portador preferido cuando la composición farmacéutica es administrada de manera intravenosa. Soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden tar-bién ^ i ,k*? . emplearse como portadores líquidos, especialmente en el caso de soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, 5 monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o bien agentes que regulan el pH. Estas 10 composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares.
• Una formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitoi, lactosa, almidón, 15 estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remir.gtorJ s Pharmaceutical Sciences", por E. W. Martín. Tales composiciones contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de la bacteria 20 dirigida a tumor atenuada terapéutica, en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador con el objeto de proporcionar la forma adecuada para una administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración. 25 En una modalidad preferida, la composición es formulada de j^M^aiiaa^^g^^^^^ conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede también incluir un agente de suspensión y un anestésico local como por ejemplo lignocaína para mitigar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes son suministrados ya sea separadamente o bien mezclados juntos en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado como por ejemplo una ampolleta o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición debe ser administrada por infusión, puede ser suministrada con una cotella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición es administrada por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina puede proporcionarse de tal manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de ia administración. La cantidad de- composición farmacéutica de la invención que será efectiva en el tratamiento o la prevención de un cáncer sólido dependerá de la naturaleza del cáncer, y puede también ser determinada por técnicas clínicas estándares. Además, ensayos in vi trc pueden ser empleados opcionalmente para j,-¿fc'-' ayudar a identificar rangos óptimos de dosificación. La dosis precisa a emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad del cáncer, y se decidirá tomando en cuenta el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Sin embargo, rangos adecuados de dosificación son generalmente de aproximadamente 1.0 c.f.u./kg a aproximadamente 1 x 101 c.f.u./kg; opcionalmente de aproximadamente 1.0 c.f.u./kg a aproximadamente 1 x 10' c.f.u./kg; opcionalmente de aproximadamente 1 x 102 c.f.u./kg a aproximadamente 1 x 10fc c.f.u./kg; opcionalmente de aproximadamente 1 x 104 c.f.u./kg a aproximadamente 1 x 10" c.f.u./kg; y opcionalmente de aproximadamente 1 x 104 c.f.u./kg a aproximadamente 1 x 10" c.f.u./kg. Dosis efectivas pueden ser extrapoladas a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in vi tro . Varios sistemas de administración se conocen y pueden emplearse para administrar una composición farmacéutica de la presente invención. Métodos de introducción incluyen, sin limitarse a ellos, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intratecal, intranasal, epidural, y oral. Métodos de introducción pueden también ser intratumoral (por ejemplo, mediante administración directa en el área del tumor; . Las composiciones pueden ser administradas por cualquier ruta conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolos, por absorción a través de forros epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administradas juntas con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier ruta adecuada incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, fijado sobre un depósito, como por ejemplo un depósito Ommaya. La administración pulmonar puede también emplearse, por ejemplo, a través del uso de un inhalador o nebuiiza or, y formulación con un agente para formar aerosol. En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente al área que requiere de tratamiento; esto puede lograrse por ejemplo y no a título limitativo, mediante infusión local durante una intervención quirúrgica, mediante inyección, a través de un catéter, o bien por medio de un implante, dicho implante siendo de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, como por ejemplo membranas sialásticas, o fibras. En una modalidad, la administración puede ser por inyección directa en el sitio (o bien sitio to & &?* anterior) de un tumor maligno o tejido neoplásico o pre- neoplásico . Las bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden una o varias moléculas efectoras primarias y opcionalmente, una o 5 varias moléculas efectoras secundarias pueden ser suministradas en sistema de liberación controlada. Las bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden una o varias proteínas de fusión de la invención y opcionalmente, una o varias moléculas efectoras pueden también ser 10 administradas en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaid • et al., 1980, Surgery 88:507; y Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). En otra modalidad, se puede emplear 15 materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Pelease, Langer and Wise (eds. , CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Contrclled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Panger and Peppas, J. Macromol. Sci. 20 Rev. Macromoi. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy et al., 1985, Science 229:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; y Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra modalidad, un sistema de liberación controlado puede ser colocado en la cercanía de un objetivo terapéutico, es decir, 25 el cerebro, requiriendo así solamente de una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, [Aplicaciones Médicas de Liberación Controlada] supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada se comentan en la reseña de Langer (1990, Science 249:1527-1533) y pueden emplearse con relación a la administración de las bacterias dirigidas a tumor atenuadas que comprenden una o varias molécula (s) efectora (s) primaria (s) y opcionalmente, una o varias molécula (s) efectora (s) secundaria (s) . La invención ofrece también un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o varios recipientes llenados de uno o varios de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado con tal (es) recipiente (s) puede encontrarse un folleto en la forma indicada por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, dicho folleto refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración a seres humanes. La presente invención ofrece también métodos para tratar un tumor sólido, que comprende la administración a un animal que requiere de la misma de una composición farmacéutica ie ia invención y por lo menos otra terapia contra cáncer conocida. En una modalidad específica, un animal con un cáncer de tumor sólido recibe una administración de una composición farmacéutica de la invención y por lc menos un agente i.» -i_L i. ol quimioterapéutico. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, sin limitarse a ellos, cisplatma, ifosfamida, taxanos como por ejemplo taxol y paclitaxoi, inhibidores de la topoisomerasa I (por ejemplo, CPT-1I, topotecano, 9-AC, y GG-211), gemcitabina, vinorelbina, cxaliplatina, 5- fluorouracilo (5-FU) , leucovorina, vinorelbina, temodal, citocalasina B, gramicidina D, emetma, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vir.blastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaina, lidocaina, propranolol, y homólogos de puromicina, y citoxano . La presente invención incluye la administración secuencial o concomitante de una composición farmacéutica de la invención y un agente anticáncer como por ejemplo un agente quimioterapéutico. En una modalidad específica, la composición farmacéutica de la invención ee administra antes (por ejemplo, 2 horas, 6 horas, 12 hcras, I día, 4 días, 6 días, 12 días, 14 días, 1 mes o varios meses antes) de la administración del agente anticáncer. Er. otra modalidad específica, la composición farmacéutica de la invención se administra después (por ejemplo, 2 horas, horas, 12 horas, 1 día, 4 días, 6 días, 12 días, 14 días, 1 r.es o varios meses después) de la administración de un agente anticáncer. En una modalidad específica, la composición farmacéutica de la invención se administra de manera concomitante con un agente anticáncer. La invención abarca combinaciones de agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión que son aditivos o sinérgicas. La invención abarca también combinaciones de agentes anticáncer y bacterias dirigidas a tumor atenuada para expresar una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras y/o proteínas de fusión que tienen sitios de acción diferentes. Dicha composición proporciona una terapia mejorada basada en la acción doble de estos agentes terapéuticos que la combinación sea sinérgica o aditiva. Así, la terapia de combinación novedosa de la presente invención proporciona una eficacia mejorada en comparación con cualesquiera de les agentes empleados como terapia de agente individual. En una modalidad, un animal con un cáncer de tumor sólido recibe una administración de una composición farmacéutica de la presente invención y es tratado con terapia co radiación (por ejemplo, radiación gamma o bien radiación de rayos X) .
En una modalidad específica, la invención ofrece un método para tratar o prevenir cáncer que es refractario a una terapia con radiación. La composición farmacéutica puede ser .*,-,*$*-» ik-í * administrada concurrentemente con una terapia de radiación. Alternativamente, la terapia de radiación puede ser administrado después de ia administración de una composición farmacéutica de conformidad con la presente invención, de preferencia por lo menos 1 hora, 5 horas, 12 horas, 1 día, una semana, un mes, con mayor preferencia varios meses (por ejemplo, hasta tres meses , después de la administración de una composición farmacéutica. La terapia de radiación administrada antes, de manera concurrente, o bien posteriormente a la administración de la composición farmacéutica de la invención puede ser administrada por cualquier método conocido en la técnica. Cualquier protocolo de terapia con radiación puede ser utilizado según el tipo de cáncer a tratar. Por ejemplo, pero no para limitar, una radiación de rayos X puede ser administrada; en particular, se puede utilizar un megavoltaje de alta energía (radiación de una energía mayor que un MeV) para tumores profundes, y haces de electrones y radiación de rayos X de ortovoltaje pueden emplearse para cánceres cutáneos. Radioisótopos q^e emiten rayos gamma, como por ejemplo isótopos radioactivos de radio, cobalto y otros elementos pueden también administrarse para exponer tejidos a la radiación. Además, la invención zfrece también métodos para el tratamiento de cáncer cor. una composición farmacéutica como *»»->.» i . una alternativa a la terapia con radiación en donde la terapia con radiación ha comprobado ser demasiado tóxica o bien puede ser demasiado tóxica, es decir, puede resultar en efectos colaterales inaceptables o insoportables para el 5 sujeto tratado. 5.9 DEMOSTRACIÓN DE LA UTILIDAD TERAPÉUTICA 0 PROFILÁCTICA DE COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE LA INVENCIÓN Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son de preferencia probadas in vi tro, y después in vi vo para la 10 actividad terapéutica o profiláctica deseada, antes de su uso en seres humanos. Por ejemplo, ensayos in vi tro que pueden ser utilizados para determinar si ia administración de una • composición farmacéutica específica es indicada, incluyen ensayos de cultivos de células in vi zro en donde una muestra 15 de tejido de un paciente es cultivada, y expuesta a una composición farmacéutica o bien recibe de otra forma una composición farmacéutica, y se observa el efecto de dicha composición sobre la muestra de tejido. Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden • 20 ser probadas para determinar su capacidad para incrementar células inmunológicas activadas por medio del contacto ae las células inmunológicas con una composición farmacéutica de prueba o un control y mediante ia determinación de la capacidad de la composición farmacéutica de prueba para 25 modular (por ejemplo, incrementar) la actividad biológica de las células inmunológicas. La capacidad de una composición de prueba para modular la actividad biclógica de células inmunológicas puede ser evaluada mediante la detección de la expresión de citocinas o antígenos, la detección de la 5 proliferación de las células inmunológicas, la detección de la activación de moléculas de señalización, la detección de la función efectora de células inmunológicas, o la detección de la diferenciación de células inmunelógicas . Técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia pueden ser 10 utilizadas para medir estas actividades. Por ejemplo, la proliferación celular puede ser ensayada radiante ensayos de incorporación de ^H-timidina y conteos de células con azul • tripan. Citocinas y expresión de antígene pueden ensayarse, por ejemplo, a través de inmunoensayes incluyendo, sin 15 limitarse a ellos, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos utilizando técnicas tales como Western blot, radioinmunoensayos de inmunohistoquímica, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas , inmunoensayos "emparedados", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de • 20 precipitina, reacciones de precipitina czz. difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos mmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensaye= de proteína A y análisis FACS. La activación de moléculas de señalización 25 puede ser ensayada, por ejemplo, por ensayos de quinasa y ifc,«p«an-.. . .j,.,?. *. ... ensayos de desplazamiento de electromovilidad (EMSAs) . La función efectora de células T puede ser medida, por ejemplo, por un ensayo de liberación de 51Cr (véase, por ejemplo, Palladino et al., 1987, Cáncer Res. 47:5074-5079 y Blachere 5 et al., 1993, J. Immunotherapy 14:352-356). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser probadas para determinar su capacidad para reducir la formación de tumores en animales que padecen de cáncer. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención 10 pueden también ser probadas para determinar su capacidad de mitigar uno o varios síntomas asociados con un cáncer de tumor sólido. Además, composiciones farmacéuticas de la • presente invención pueden ser probadas para determinar su capacidad de incrementar el período de sobrevivencia de 15 pacientes que padecen de un cáncer de tumor sólido. Técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia pueden ser utilizadas para analizar la función de las composiciones farmacéuticas de la invención en animales. En varias modalidades específicas, ensayos in vi tro pueden • 20 ser efectuados con células representativas de tipos de células involucradas en un cáncer de tumor sólido, para determinar si una composición farmacéutica de la presente invención tiene un efecto deseado sobre estos tipos de células . 25 Composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en terapia pueden ser probadas en sistemas de modelo de animal adecuados antes de probarse en seres humanos, incluyendo, sin limitarse a ellos, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, perros, conejos, etc. Para prueba in 5 vi vo, antes de su administración a seres humanos, se puede utilizar cualquier sistema de modelo de animal conocido en la técnica. La siguiente serie de ejemplos se presentan a título de ilustración y no para limitar el alcance de la invención. 10 6. EJEMPLOS: EXPRESIÓN DE TNF-a POR S.ALMONELLA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA El siguiente ejemplo demuestra que bacterias dirigida a tumor • atenuadas como por ejemplo Salmonella, que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de la 15 familia de TNF pueden expresar el miembro de familia de TNF. 6.1. CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS DE TNF-a Los plésmidos descritos aquí sirven para ilustrar ejemplos de modalidades específicas de la invención. Como será aparente a una persona con conocimientos normales en la materia, un • 20 promotor y/o ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras tales como el promotor tre y/o ácidos nucleicos que codifican TNF-a pueden ser remplazados con otros promotores o moléculas efectoras apropiadas por métodos conocidos en la técnica. 25 Para la expresión bacteriana basada en plásmido de ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras empleando el promotor tre, el plásmido Trc99A (comercialmente disponible en Pharmacia) o TrcHisB (comercialmente disponible en Invitrogen) fueron utilizados. Ambos plásmidos emplean un sitio Neo I, como el codón de inicio, seguido por un sitio de clonación múltiple. 6.1.1. EL PLÁSMIDQ pCET Para la expresión bacteriana basada en plásmido de ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras utilizando un promotor ?PL, o ?PR doble, el plásmido pCET fue construido de la siguiente manera. El plásmido pCE33 (Elvin et al., 1990, Gene 87:123-126) fue secuencialmente disociado con la enzima de restricción Cía I y terminado con punta plana con nucleasa de frijol mung, seguido por disociación con ia enzima de restricción BamHl. Después, el fragmento resultante de 1.4 kb fue ligado en un fragmento Ssp I /Bam Hl de 2.1 kb de pUC19 (comercialmente disponible en GIBCO) para crear el plásmido pCI. El plásmido pCI fue disociado con enzima de restricción BamHl y terminado en punta plana con nucleasa de frijol mung, seguido por disociación con la enzima de restricción Afl III. La banda resultante de 3.1 kb fue aislada. El plásmido TrcHisB fue parcialmente digerido con la enzima de restricción Cial, terminado en punta plana con T4 ADN poiimera=a, seguido por disociación con Afl III. La banda resultante de 0.6 kb, que contiene el minicistrón y terminador, fue después ligada en el fragmento de 3.1 kb de pCI para proporcionar el plásmido pCET. Como en el caso de Trc99A o TrcHisB, pCET emplea un sitio Ncol como el codón de inicio, seguido por el sitio de clonación múltiple de 5 TrcHisB. El crecimiento de bacterias que tienen un plásmido que contiene el promotor ?PL o ?P? fue efectuado a una temperatura de 30° C. 6.1.2 El PLÁSMIDO pTS Un plásmido, conocido como pTS, que emplea la integración 10 cromosómica mediada por transposón y selección prototrófica de serina de ácidos nucleicos que codifican una molécula efectora, fue construido de la siguiente manera. El plásmido pNK2882 (comercialmente disponible en el American Type Culture Collection (ATCC) ) fue disociado con enzima de 15 restricción Bam Hl y se aisló la banda de 4.8 kb. El ácido nucleico que codifica Salmonell a typhimuri um serC fue aislado de la cepa 14028 de S. typhimuri um (comercialmente disponible en ATCC) por reacción en cadena de polimerasa utilizando un cebador directo de secuencia GSSGSTCTTCCGGAGGAGGGGAAATG (SEQ • 20 ID NO:l), y un cebador reverso de secuencia CGGGATCCGAGCTCGAGGGCCCGGGAAAGGATCTAAGAAGATCC (SEQ ID NO: 2) . La mezcla en reacción en cadena de polimerasa fue disociada con las enzimas de restricción Bgl II y Bam Hl, y el producto de reacción en cadena de polimerasa de 1.1 kb fue aislado y 25 ligado en el fragmento 4.8 pNK2883 para proporcionar un plásmido, conocido como pTS. Un sitio de clonación inmediatamente 3' con relación al ácido nucleico codificador de serC estuvo presente para la inserción de ácidos nucleicos codificadores de molécula efectora. 6.1.3. EL PLÁSMIDO pTS-TNF-a Un plásmido (pTS-TNF-a) para la integración cromosómica mediada por pTS de un ácido nucleico que codifica TNF-a de ser humano impulsado por promotor tre fue construido de la siguiente manera. El plásmido PYA3332 es el plásmido ASD con PYA272 (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana NO. 5,840,483 de Curtiss, III) con el origen de replicación reemplazado por el origen de replicación del plásmido colEl (véase, por ejemplo, Bazaral y Helsinki, 1970, Biochem 9:399-406) . Ei plásmido PYA3332 fue disociado con la enzima de restricción Neo I y se terminó de manera plana con nucleasa de frijol mung. El fragmento de punta plana fue después disociado con la enzima de restricción Hind III y el fragmento de ADN de 3.3 kb fue aislado. Un ácido nucleico que codifica TNF-a de ser humano optimizado con ?. coli (véase Pennica et al . , 1984 Nature 312:724-729; y Saltzman, et al . , 1996, Cáncer Biotherapy 11:145-153) de conformidad con lo ilustrado en la figura 1, fue después disociado con enzima de restricción Nde I, su punta fue aplanada con T4 ADN polimerasa, y después fue disociado con enzima de restricción Hind III. El fragmento resultante de 0.5 kb fue ligado en el fragmento de 3.3 kb PYA3332 para proporcionar el plásmido Asd34 TNF-a. Asd34TNF-a fue después disociado con enzima de restricción Bgl II, y el fragmento de 1.1 kb, que codifica el ácido nucleico que codifica TNF-a impulsado por promotor tre, 5 y ligado en el sitio Bam Hl de pTS para proporcionar el plásmido pTS- TNF-a. 6.1.4. EL PLÁSMIDO pTS-BRP • Un plásmido, conocido como pTS-BRP, que emplea integración cromosómica mediada por transposón del ácido nucleico que 10 codifica BRP y selección prototrófica de serina de ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras, fue construido de la siguiente manera. Un ácido nucleico que codifica BRP • fue aislado del plásmido pSWI (comercialmente disponible en BiollOl, Vista, CA) por reacción en cadena de polimerasa 15 utilizando un cebador directo, de secuencias CCGACGCGTTGACACCTGAAAACTGGAG (SEQ ID NO: 5) y un cebador reverso, de secuencia CCGACGCGTGAAAGGATCTCAAGAAGATC (SEQ ID NO: 6), y clonado en un plásmido de clonación TOPO-TA (comercialmente disponible en In Vitrcgen, Carlsbad, CA) para • 20 proporcionar un plásmido, conocido como pBRP#5. El plásmido pBRP#5 fue disociado con enzimas de restricción Apa I y Bam Hl, y la banda resultante de 0.6 kb, que contiene el ácido nucleico que codifica BRP, fue ligada en el fragmento proto- pTS de 5.9 kb Apa /Bam Hl para proporcionar el plásmido pTS- 25 BRP. Sitios de clonación tanto 5' como 3' con relación a los ácidos nucleicos que codifican BRP estuvieron presentes para la inserción de los ácidos nucleicos que codifican la molécula efectora. 6.1.5. EL PLÁSMIDO pTS-BRPTNF-a 5 Un plásmido (pTS-BRPTNF-a) , para la integración cromosómica mediada por pTS de los ácidos nucleicos que codifican TNF-a impulsado por promotor BRP y tre, fue construido de la • siguiente manera. El plásmido Asd34TNF-a, descrito arriba para la construcción de pTS-TNF-a fue disociado con la enzima 10 de restricción de Bgi II, y el fragmento de 1.1 kb, que codifica el ácido nucleico que codifica TNF-a impulsado por promotor tre, fue ligado en el sitio Bam Hl de pTS-BRP para • proporcionar el plásmido pTS-BRPTNF-a. 6.2. INTEGRACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA MOLÉCULA 15 EFECTORA EN EL CROMOSOMA HUÉSPED DE SALMONELLA El sistema descrito aquí emplea cepas AserC-Salmonella auxotrófica para cerina o glicina, y plásmidos que restauran la prototrofía de cerina/glicina al efectuarse la integración cromosómica en la región activamente transcrita. Sin embargo, 20 se sabe en la técnica que otros marcadores de selección pueden ser utilizados para seleccionar los integrantes cromosómicos y tales marcadores están dentro del alcance de la presente invención. Véase, por ejemplo, Kleckner et al . , Meth. Enzymol. 204:139-180. 25 Los plásmidos pTS o pTS-BRP que contienen ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras pueden ser introducidos en cepas serC-Salmonella de varias maneras bien conocidas en la técnica, incluyendo transformación química y electroporación. Después de la introducción de los ácidos nucleicos que 5 codifican moléculas efectoras, se cultivan Salmonella en medio de crecimiento que contiene ampicilina durante un mínimo de 2 horas, y con mayor preferencia 6 horas o más. Las • bacterias son después coloeadas en un medio capaz de seleccionar bacterias prototrcficas para cerina, por ejemplo, 10 medio M56. Atlas, R.M. "Handbook of Microbiological Media." [Manual de Medios Microbiológicos] L.C. Parks, ed. CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1993. Bacterias que contienen • integraciones cromosómicas de ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras pueden crecer en el medio selectivo. La 15 expresión de ácido nucleico que codifica molécula efectora es después medida, como se muestra a continuación. La expresión de ácido nucleico que codifica molécula efectora puede ser medida por cualesquiera de varios métodos conocidos por parte de los expertos en la materia, por ejemplo • 20 actividad enzimática, actividad biológica, análisis Northern blot, o bien análisis Western blot. 6.2.1. SUMINSITRO Y EXPRESIÓN DE TNF-a EXPRESADO POR SALMONELLA Un ácido nucleico que codifica TNF-a impulsado por promotor 25 tre fue insertado en sitio Bam Hl de pTS-BRP para proporcionar un plásmido, conocido como pTS-BRPTNF-a, de conformidad con lo descrito arriba, el plásmido pTS-BRPTNF-a fue sometido a electroporación en una cepa atenuada de S. typjhimurium, cepa VNP20009, (véase Publicación Internacional 5 WO 99/13053) construida para que fuera serC- de tal manera que el genotipo fuese .dmsbB, ?purI, ?serC por métodos estándares conocidos en la técnica. Sin limitación en cuanto • a mecanismo, la integración del plásmido en el genoma bacteriano permite la activación del ácido nucleico que 10 codifica serC y lleva a un fenotipo serCA Por consiguiente, bacterias que alojan una integración cromosómica del ácido nucleico que codifica TNF-a fueron seleccionadas por • colocación en platos de la bacteria sometida a electroporación en placas de agar M? complementadas con 15 adenina. Las bacterias fueron caracterizadas adicionalmente para perdida de resistencia a la ampicilina, lo que indica pedida de plásmido, y perdida concomitante de expresión de TNF-a basado en plásmido. Con el objeto de examinar y cuantificar la expresión de TNF-a 20 por la bacteria dirigida a tumor de la invención, Salmonella que aloja una integración cromosómica de los ácidos nucleicos que codifican TNF-a fue cultivada durante la noche y, una muestra medida del cultivo fue utilizada en análisis Western blot. Específicamente, la expresión de TNF-a a partir de un 25 clon sensible a la ampicilina serC' , ccnocido como clon 2 de pTS-BRPTNF-a se muestra en la figura 3. El análisis Western blot mostró que una proteína bacteriana, que corresponde a 3.9x10" cfu de bacteria de clon 2 de pTS-BRPTNF-a (carril 1), expresaba más de 50 ng de TNF-a (carril 5) , lo que indica la 5 expresión de TNF-a a niveles mayores que 10 ng/10 bacteria. Por consiguiente, el TNF-a de ser humano fue exitosamente expresado a partir de un ácido nucleico que codifica TNF-a, • impulsado por promotor tre, integrado cromosómicamente en Salmonella . 10 7. EJEMPLO: BACTERIA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA QUE EXPRESA PROTEÍNA DE FUSIÓN OMPA La localización periplásmica de proteínas por fusión sobre varios péptidos de señal depende tanto de péptido de señal como de la proteína. Por ejemplo, proteínas pueden ser 15 localizadas en el compartimiento periplásmico de bacterias por fusión de un péptido de señal sobre la terminal amino de la proteína. Sin limitación, la localización periplésmica se considera que facilita la liberación de componentes bacterianos (por ejemplo proteínas) requiriendo que el • 20 componente atraviese solamente una sola membrana para ser liberado en el entorno aledaño. En contraste, la localización citoplásmica requiere que el componente atraviese tanto la membrana interna como la membrana externa de bacterias para ser liberado en el entorno aledaño. Además, la locaiización 25 periplásmica de ciertas proteínas puede ayudar la actividad 1 / D biológica. Varios métodos conocidos en ia técnica pueden ser utilizados para dirigir una molécula efectora de la invención hacia el periplasma. Este ejemplo demuestra que la fusión dei péptido de señal ompA en la terminal amino de una molécula efectora, por ejemplo TNF-a, TRAIL (ligando que induce apóptosis relacionada con TNF-a) y la interleucina-2 (IL-2) resulta en la localización periplásmica y procesamientos subsecuente de proteínas . 7.1. PROCESAMIENTO DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN OMPA-WF- La expresión de TNF-a en cuatro clones diferentes, que expresan una proteína de fusión ompA- TNF-a impulsada por tre basada en plásmido en bacterias JM109, fue examinada por análisis Western blot del lisado celular entero. La localización periplásmica fue demostrada por disociación de las proteínas de fusión precursoras en TNF-a maduro por peptidasa de señal, una enzima ubicada er. el periplasma. En los cuatro clones, después de la inducción con IPTG, la sobreexpresión de TNF-a resultó en la aparición de TNF-a como un doblete que migra a aproximadamente 20 kd (figura 5, carriles 4-7), que corresponde a formas no procesadas y procesadas. Para comparación, una cepa de Salmonella que contiene un ácido nucleico que codifica TNF-a integrado cromosómicamente, que expresa la forma madura (procesada) de TNF-a, fue utilizada como un control positivo (figura 5, carril 3) . La expresión de TNF-a no fue detectada en bacterias que no tenían los ácidos nucleicos que codifican TNF-a (figura 5, carril 2) . Estos resultados demostraron que la fusión de la proteína de TNF-a de ser humano madura en el péptido de señal ompA de E. coli (de conformidad con lo ilustrado en la figura 4) resultó en la localización periplásmica y procesamiento cuando se expresa en E. coli . Además, se desconocía si la sobreexpresión de una proteína secretada sería tóxica APRA el huésped bacteriano como resultado del hecho de rebasar el aparato secretorio normal. La presente demostración de expresión de una proteína de fusión ompA-TNF-a procesada indicó que el aparato secretorio normal podía adecuarse a la expresión de alto nivel de proteínas secretadas. 7.2. PROCESAMIENTO DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN QftfPA-TRAIL La capacidad del péptido de señal ompA para localizar periplásmicamente miembros de la familia de TNF fue ampliada a TRAIL Aigando de inducción de apóptosis relacionado con TNF-a) , otro miembro de la familia de TNF. Para estos experimentos, un ácido nucleico que codifica TRAIL impulsado por promotor tre, que codifica la forma madura de TRAIL de ser humano (hTRAIL) , fue fusionada sobre la secuencia codificadora del péptido de señal de ompA (de conformidad con lo ilustrado en la figura 6) . Dos uniones ompA/TRAIL diferentes fueron examinadas, una que codifica un sitio Ncol y una que codifica un sitio Ndel (véase figura 6 para la secuencia que contiene Ndel) . Un análisis Western de ambos tipos de clones se muestra en la figura 7. Empleando un anticuerpo anti-hTRAIL, un análisis Western blot reveló que 5 bacterias que sobreexpresan ompA-TRAIL con la unión Neo I expresaban tanto la forma procesada (28.2 kd) como la forma no procesada (30.2 kd) de hTRAIL (figura 7, carriles 2-4), • mientras que bacterias que sobreexpresan ompA-TRAIL con la unión Nde I expresaban la forma procesada exclusivamente 10 (figura 7, carriles 4-7) , lo que indica que la unión Nde I proporcionó un procesamiento más eficiente. Estos resultados demostraron que la fusión de la proteína TRAIL humana madura con el péptido de señal ompA de E. coli resultó en locaiización periplásmica y procesamiento, además, 15 no se sabía si ia sobreexpresión de la proteína secretada sería toxica para el huésped bacteriano como resultado de la superación del aparato secretorio normal. La presente demostración de expresión de una proteína de fusión ompA- TRAIL procesada indicó que el aparato secretorio normal era 20 capaz de adecuarse a la expresión de alto nivel de proteínas secretadas . 7.3 PROCESAMIENTO DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN OMPA (8L) -IL-2 Una molécula efeetora secundaria (IL-2) fue expresada como una proteína de fusión. La fusión de hIL-2 madura (C125A) de 25 la secuencia de señal de OmpA de tipo silvestre, empleada (Uta arriba para TNF-a y TRAIL, no permitió el procesamiento de IL-2. Con el objeto de examinar la localización periplásr.ica y procesamiento de la citocina IL-2 humana, 11-2 humana madura (C125A) fue fusionada sobre un péptido de señal ompA modificado, conocido ompA(8L) , de conformidad con lo presentado en la figura 8. El péptido de señal ompA modificado fue modificado mediante el reemplazo de los aminoácidos 6-17 de la señal ompA con los presentados en la figura 8. La expresión y el procesamiento se presentan en la figura 9 (carriles 6 y 7) . Cada carril representa un clon único. Los resultados del análisis Western blot indicaron que virtualmente se observó un procesamiento completo con el péptido de señal de o.npA(8L) (figura 9, carriles 6 y 7), 7.4. PROCESAMIENTO DE UNA PROTEÍNA DE FUSIÓN PHOA ( 8L) -11-2 Una segunda proteína de fusión fue examinada para localización periplásmica y procesamiento de IL-2 de ser humano, y se comparo con la proteína de fusión de la sección 7.3. La expresión y procesamiento de IL-2 de ser hur.ano madura (C125A) fusionada sobre un péptido de señal phoA modificado, conocido como p?aA '8L), de conformidad cor. lo ilustrado en la figura 10, fue examinada. La expresión y el procesamiento se muestran en la figura 9. se observó un procesamiento parcial con el péptido de señal sintético phoA ( 8L) (figura 9, carriles 4 y 5), mientras que se observó un procesamiento más completo con el péptido de eeñal _^|g^ ompA(8L) (figura 9, carriles 6 y 7) . Estos resultados indican que la localización y procesamiento de IL-2 fueron proporcionados por péptidos de señal diferentes. Los resultados demuestran también que la 5 localización periplásmica de proteínas por la fusión con varios péptidos de señal depende tanto del péptido de señal como de la proteína. Los resultados de los estudios de proteína de fusión indican que una proteína efectora secundaria de la invención, por 10 ejemplo IL-2, puede ser expresada y localizada en el periplasma bacteriano por fusión con el péptido de señal de proteína, por ejemplo OmpA o PhoA. Como resultará aparente a • una persona con conocimientos normales er. la materia, otras secuencias de señal pueden ser utilizadas para causar que se 15 pueda utilizar la localización periplásmiea de una molécula efectora. Como será aparente a una persona con conocimientos normales en la materia, otras moléculas efectoras de la invención pueden ser sustituidas por las roléculas efectoras descritas en los ejemplos aquí. • 20 8. EJEMPLOS: EFICACIA ANTI-TUMQR DE SALMCr.ELLA (M4SBB, ?PURI) QUE EXPRESA LA FORMA MADURA C? TNF-a El siguiente experimento demuestra que una bacteria dirigida a tumor atenuada, por ejemplo Salmonella que contiene un ácido nucleico que codifica una molécula efectora primaria 25 (por ejemplo, un miembro de familia de TNF^ puede suministrar el efector primario a tumores de mamíferos y provocar una disminución en cuanto al volumen del tumor. La capacidad de la expresión de TNF-a para incrementar la eficacia anti-tumor de Salmonella typhimuri um fue evaluada en un modelo de carcinoma de colon 38 de r.urino escalonado. Para estos experimentos, fragmentos de tumor de 1 m 3, derivados de un tumor de colon 38, fueron implantados en ratones C57BL/6 y se permitió el crecimientc de tumores hasta un tamaño promedio de aproximadamente 0.3 g, en ese momento los animales fueron colocados de manera aleatoria en los siguientes grupos de tratamiento (n=lD):l) sin tratamiento; 2) Salmonella typhimuri um (?msbB ?p rl, serC) (cepa de origen) ; y 3) pTS-BRPTNF-a (el color. 2 descrito arriba) . Ratones en cada grupo que ya sea permanecieron sin tratamiento o bien recibieron una inyección intravenosa única de 1 x 10° cfu de la cepa bacteriana apropiada. Se midió el tamaño del tumor semanalmente, empezando al momento de la inoculación de la bacteria. En el grupo que recibió Salmonella dirigida a tumor atenuada que expresa TNF-a, la regresión del tumor fue aparente a las dos semanas después del tratamienfe, y se observó una regresión completa en 6 de los animales dentro de un período de 4 semanas después del tratamiento figura 11) . Tumores en el grupo sin tratamiento presentaron un incremento progresivo de tamaño, mientras que los tumores er. el grupo tratado con la cepa Salmonella typhimuri um (?msbB ?purI, serC) parental presentaron una regresión parcial entre las semanas 3-4 después del tratamiento, después de lo cual los tumores presentaron un incremento progresivo en cuanto a tamaño 5 (figura 11) . Estos resultados demuestran que Salmonella dirigida a tumor atenuada puede expresar y suministrar una molécula efectora, • por ejemplo, un miembro de familia de TNF a un tumor. Dicha Salmonella es útil para el tratamiento de tumores y 10 proporciona resultados mejorados de regresión de tumor en comparación con cepas de origen de Salmonella que no expresan el miembro de familia de TNF. • La demostración de una regresión completa del tumor por TNF-a que expresa Salmonella a partir de ácido nucleico integrado 15 cromosómicamente, indica que la expresión biológicamente efectiva puede resultar de ácidos nucleicos que codifican moléculas efectoras integradas cromosómicamente. 9. EJEMPLOS: ADMINISTRACIÓN INCREMENTADA DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICC POR BACTERIAS QUE EXPRESAN BRP • 20 Para demostrar que la actividad BRP podía realzar la liberación de un plásmido a partir de una bacteria atenuada dirigida a tumor, cero por ejemplo Salmonella , una cepa de Salmonella atenuada dirigida a tumor fue construida la cual contenía BRP en un plásmido así como un segundo plásmido 25 utilizado como marcadcr para liberación (pTrc99a con marcador ^ AMP) . Para ensayar la actividad de BRP, la Salmonella con o sin BRP fue cultivada en cultivo per métodos estándares. El sobrenadante resultante fue después limpiado de cualquier bacteria restante por centrifugación y filtración y el sobrenadante depurado fue después agregado a células competentes y sometido a una reacción de transformación. Estas células "receptoras" fueron después colocadas en placas en LB amp para determinar la absorción del plásmido marcador AMP. Un incremento del número de colonias resistentes a AMP con BRP indicaría que más plásmido fue liberado en el medio a partir de las cepas que expresaron BRP. Los resultados de resumen a continuación en la Tabla 2: Tabla 2 Plásmido Número promedio de colonias resistentes a Air.p/transformación pTrc99a solo 125 pTrc99a+BRP(pSWl) 353 Estos resultados demuestran que la presencia de BRP elevó la cantidad de plásmido de amp secretado al medio. Así, la transformación "células receptoras" con sobrenadantes a partir de células que expresan BR? proporcionó un mayor número de colonias. Estos resultados demuestran que BRP incrementó la liberación de una molécula efectora secundaria, que consistía de un plásmido de ácido nucleico. Por consiguiente, los resultados muestran que BRP es útil para la liberación de plásmido c administración de ADN. Además estas cepas de Salmonella expresaron BRP y pudieron administrar ADN y permanecieron competentes para la replicación como población. 5 10. EJEMPLO: LA EXPRESIÁN DE BRP NO AFECTA LA CAPACIDAD DE INHIBIR TUMORES O DIRIGIRSE CONTPA TUMORES DE SALMONELLA DIRIGIDA CONTRA TUMOR ATENUADA • El siguiente ejemplo indica que bacterias dirigidas a tumor atenuadas pueden ser manipuladas para expresar BRP en 10 combinación con una o varias moléculas efectoras para realzar la administración de moléculas efectoras a tumores sin inhibir la capacidad de bacterias para dirigirse contra el tumor. Modelos de tumores s lides fueren obtenidos mediante la 15 inyección subcutánea de células de melanoma B16 en el flanco posterior derecho de ratones C57BL/6. Para implantación de tumores, fueron desprendidas células del frasco por tripsinización, lavadas y suspendidas en una solución salina amortiguada con fosfate a 2.5 x ÍC" células/ml. Una alícuota 20 de 0.2 ml de la suspensión de células, para un total de 5 x 10" células/ratón, fue inyectada el día 0. Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron 150-200 mitr, aproximadamente 10 días después del implante, los ratones fueron aleatorizados er. tres grupos de 10 ratones por grupo y 25 cada grupo recibió un tratamiento diferente. El grupo de ^?*m?i * É^****itt^l?m?^¿átoi^^^ control (curva número 1 en la figura 12) recibió 0.2 mis de PBS. Otro grupo recibió 0.2 ml que contenía 2 x 10" c.f.u. /ratón de la cepa atenuada dirigida al tumor de Salmonella de VNP20009 (curva número 2 en la figura 12) . El tercer grupo recibió 0.2 ml que contenía 2 x 10° c.f.u. /ratón de la cepa dirigida a tumor atenuada de Salmonella que comprende pSWl, un plásmido que comprende un gen de BRP bajo el control de su promotor nativo (curva número 3 en la figura 12) . El gen de BRP es inducible por SOS en E. coli aún cuando los inventores creen, sin limitación en cuanto al mecanismo, que es parcialmente constitutivo en Salmonella, produciendo niveles bajos a moderados de la proteína BRP, que son realzados adicionalmente por la naturaleza de SOS del entorno del tumor. Ratones inyectados con Salmonella VNP20009 que expresan BRP mostraron respuestas antitumor casi idénticas a los que recibieron VNP20009 que no expresan BRP, lo que indica que la supervivencia o la capacidad de dirigirse ai tumor de estas Salmonellas no es alterada por la expresión de BRP, ni su capacidad de inhibir el crecimiento tumoral. El resultado de la expresión de BRP sobre Salmonella dirigido a tumor atenuada contrasta directamente con el efecto de la expresión de HSV-timidinquinasa secretada (HSV-TK) , dicha expresión de HSV-TK resulta en la perdida de las capacidades de inhibición de tumor VNP20009 (Pawelek et al . , 1997, Cáncer Res. 57:4537-4544). Así, el sistema de BRP puede ser t m ^ai i «o utilizado para incrementar la administración de moléculas efectoras primarias y/o secundarias a tumores sin modificación adicional. 11. EJEMPLO: VEHÍCULOS DE EXPRESIÓN DE PROMOTOR DE pepl Este ejemplo demuestra la expresión in vi tro e in vi vo de un reportero que codifica molécula de ácido nucleico, por ejemplo ß-gal bajo el control del promotor de pepT en una bacteria dirigida a tumor atenuada, como por ejemplo Salmonella . 11.1 CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDQS DE EXPRESIÓN pepT-BRP-ßGAL El promotor pepT fue clonado por amplificación por reacción en cadena de polimerasa de la región a partir de una colonia aislada de Salmonella typhimuri um de tipo silvestre (.-.TCC 14028) utilizando los siguientes cebadores: Directo: 5' -AGT CTA GAC AAT CAG GCG AAG AAC GG-3' (SEC. ID NO:15) Reverso: 5' AGC CAT GGA GTC ACC CTC ACT TTT C-3' (SEQ ID NO: 16) . Las condiciones de reacción en cadena de polimerasa consistieron de un ciclo de 95° C durante 5 minutos, 35 ciclos de 95° C durante 1 minuto, 65° C durante 1 minuto, 72° C durante 2 minutos y 1 ciclo de 72° C durante 10 minutos. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue clonado en el vector de clonación PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, California), y se conoce como PepT/PCR 2.1.
El vector PepT/PCR 2.1 fue digerido con Ncol y Xbal. El fragmento pepT fue aislado en gel y ligado en el vector ß-gal Zter digerido con las mismas enzimas. Zterm (Temporary Genbank Bankit No. 296495) es un plásmido de ß-gal sin promotor generado por clonación del marco abierto de lectura de ßGal en pUC19. El plásmido resultante fue llamado pepT-ßGAL. 11.2. EXPRESIÓN JN VITRO DE pepT-ßGAL Y MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE pepT-ßGAL Cepas de Salmonella YS1456 (CC14 en figura 13A; para la constitución genética de la cepa, véase WO 96/40238) o bien VNP20009 (CC16 en figura 13A) que contiene pepT-ßGAL fueron cultivadas en condiciones aeróbicas o bien en condiciones anaeróbicas hasta una OD, . de aproximadamente 0.5-0.8. La actividad ß-gal fue medida por el método Birge y Low (1974, J. Mol. Biol. 83:447-457). Los resultados se muestran en la figura 13A, y demuestran una inducción de aproximadamente 14 a 24 veces de la actividad ß-gal al crecer las bacterias en condiciones anaeróbicas. 11.3. EXPRESIÓN AV VIVO DE pepT-ßGAL Y MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE pepT-ßGAL Células de la cepa Salmonella YS1456 que contienen los plásmidos de expresión pepT-ßgal, un plásmido de expresión de BRP (pSWl de BIO101 (Vista California) , que comprende la secuencia codificadora de pCloDF13 BRP bajo el control de su -*«* *-* * promotor nativo) o bien ambos plásmidos de expresión fueron inyectados de manera intravenosa en ratones con tumor. 5 aías después de la inyección los tumores e hígados fueron homogeneizados y las bacterias fueron aisladas para mostrar que la presencia de plásmidos para pepT-ßgal y/o BRP no interfirió con la capacidad de estas bacterias para dirigirse a tumores. Además, los homogenados de tumores e hígados fueron utilizados para medir la actividad ß-gal para determinar si se podía medir ßgal activo in vivo y sí el promotor pepT fue inducido en un entorno de tumor anaeróbico. Los resultados mostrados en la figura 13B, indican niveles muy altos de actividad de promotor pepT en el entorne del tumor. No se observó ningún incremente significativo en cuanto a expresión hepática de ßgal en comparación ccr. el nivel de fondo, lo que se piensa se debe a una actividad taja de promotor pepT en el entorno hepático aeróbico y/e al enfoque bajo del vector bacteriano hacia el hígado. 12. EJEMPLO: SISTEMA DE EXPRESIÓN INDUCIBLE POR TETRACIC1INA Este ejemplo demuestra la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un gen reportero, por ejemplo ß-gal bajo el control del promotor tet en una bacteria dirigí ca a tumor atenuada, por ejemplo Salmonella . El promotor tet fue clonado a partir de un transposón r.mi-TN10 por amplificación por reacción en cadena de polimerasa utilizando los siguientes cebadores.
Directo: 5' -GGA TCC TTA AGA CCC ACT TTC ACÁ TTT AAG T-3' (SEQ ID N0:17) Reverso: 5' -GGT TCC ATG GTT CAC TTT TCT CTA TCA C-3' (SEQ ID NO:18) . Las condiciones de reacción en cadena de polimerasa fueron las siguientes: un ciclo de 95° C durante 5 minutos, 35 ciclos de 95° C durante 1 minuto, 60° C durante 1 minuto, 72° C durante 2 minutos; y un ciclo de 72° C durante 10 minutos. El fragmento de reacción en cadena de polimerasa de aproximadamente 400 pares de bases fue aislado en gel y clonado en el vector PCR 2.1 (Invitrogen). El vector de promotor PCR 2.1/ tet fue digerido con Ncol y BamHl. El fragmento de promotor tet de aproximadamente 400 pares de bases fue aislado en gel y ligado el vector ß-gal sin promotor Zterm que había sido digerido con las mismas dos enzimas. La mezcla de ligación fue transformada y las bacterias transformadas fueron colocadas en placas de tetraciclina/X-gal . Colonias positivas fueron aisladas en base en su color azul. Extractos de varios clones positivos fueron realizados y ensañados por el método Birge y Low (1974, J. Mol. Biol. 83:447-457) para actividad ß-gal en presencia de tetraciclina. Un clon fue aislado y ensañado para expresión de ß-gal sobre un rango de concentraciones de tetraciclina. Los resultados del ensayo, que demuestran la inducción de la actividad de ß-gal por tetraciclina en forma dependiente de la dosis, aparecen en la figura 14. 13. EJEMPLO: INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO TUMORAL POR Salmonella DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA QUE EXPRESA ENDOSTATINA El siguiente ejemplo demuestra la generación de Salmonella dirigida a tumor atenuada que expresa endostatina, y la eficacia in vivo del tratamiento del tumor por dicha Salmonella . 13.1 CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN DE ENDOSTATINA La endostatina fue amplificada por reacción en cadena de polimerasa proveniente de una biblioteca ADNc placental humana utilizando los siguientes cebadores: Directo: 5' -GTG TCC ATG GGG CAC AGC CAC GCG GAC TTC CAG-3' (SEQ ID NO: 19) . Reverso: 5' -ACÁ CGA GCT CCT .ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC T-3? (SEQ ID NO:20) . Del producto resultante de la reacción en cadena de polimerasa fue clonado en el vector PCR 2.1 (Invitrogen). La hexahistidina-endostatina fue amplificada por reacción en cadena de polimerasa utilizando el plásmido construido arriba como templado con los siguientes cebadores: Directo: 5' -GTG TCC ATG GCT CGG CGG GCA AGT GTC GGG ACT GAC CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC CAC CGC GAC TTC-3' (SEQ ID NO:21) Reverso: 5' -GTG CGG ATC CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC TG-3' (SEQ ID NO:22) . ..*.,,. m Las condiciones para la amplificación por reacción en cadena de polimerasa consistieron de un ciclo de 95° C durante 1 minuto, 55° C durante 1 minuto, y 72° C durante 2 minutos; y un ciclo de 72° C durante 10 minutos. 5 El producto resultante fue un fragmento de JDN con sitios de restricción Ncol (5' ) y BamHl (3' ) que codifican endostatina humana que tiene la secuencia de péptidos MARRASVGTDHHHHHH • (SEQ ID NO: 23) su terminal amino. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue digerido 10 con Ncol y BamHl y el producto de 550 pares de bases fue aislado en gel y ligado en el vector pTrc99A que había sido previamente cortado con las mismas enzimas. Los productos de reacción de ligación fueron transformados en E. coli DH5a y la cepa VNP20009 de Salmonella dirigida a tumor atenuada. 15 La secuencia codificadora de hexahistidina-endostatina fue también clonada en el vector de expresión YA3334 como un fragmento NcoI/BamHI. YA3334 es el plásmido asd PYA272 (Curtís III, Patente Norteamericana No. 5,840,483) con el origen de replicación remplazado por el origen de replicación 20 de ColEl (Basarla y Helsinki), 1970, Biochem 9:399-406}. El ADN de plásmido preparado a partir de los clones positivos fue aislado y transformado en cepas 8324 de Salmonella, que es VNP20009 con mutación asd. Esta cepa fue generada de conformidad con los métodos descritos en Curtiss III (Patente 25 Norteamericana nc . 5,840,483). -t wnttetfifiri "i 13.2. EXPRESIÓN JN VITRO DE E?DOSTATI?A POR SALMONELLA DIRIGIDA A TEMOR ATENUADA Diferentes cepas de Salmonella VNP20Q09 y E. coli DH5a que contienen el plásmido pTrc99A-hexahistidina-endostatina 5 fueron cultivadas en fase mid-log (O.D.- ~0.6-0.8), en dicho punto cada cultivo fue divido, una mitad recibiendo IPTG 0.1 mM para inducción de actividad de promotor tre y la otra mitad no recibiendo IPTG. Después de tres horas adicionales de crecimiento, extractos bacterianos fueron preparados y se 10 confirmó la expresión de hexahistidina-endostatina por análisis Western blot con un anticuerpo anti-histidina (Clontech, Palo Alto, California) . Las figuras 15A y 15B muestran los resultadcs de Western blots que demuestran la expresión de pTrc99A. hexahistidina-endostatina (HexHIS- 15 endostatina. en E . coli DH5a y Salmonella VNP20009, respectivamente. Mientras el promotor tre no muestra actividad en E. coli en ausencia de IPTG, el mismo promotor es censtitutivamente activo en Salmonella . Hexahistidma- endostatina es expresada cerno una banda única de 20 aproximadamente 25kD, que es el peso molecular predicho para la proteína de fusión; La prcteína de fusión hexahistidma-endostatina fue expresada de manera similar a partir del plásmido YA3334 que utiliza el promotor tre para expresión directa. Una proteína de la más 25 predicha de 25 kDa fue detectada empleando el anticuerpo gHHHi anti-histidina, como se muestra en la figura 16. En la figura 16, todos los cultivos bacterianos a parte de los cuales se derivaron las muestras habían sido inducidos con IPTG 0.1 mM durante tres horas. 5 13.3 EFICACIA DE SALMONELLA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA QUE EXPRESA ENDOSTATINA EN CARCINOMA DE COLON DE MURINO C38 Fragmentos de tumor de colon 38 de un volumen de 2x2x2 mm3 • fueron implantados subcutáneamente en ratones C57BL/6 hembras de 9 semanas de edad. Cuando los volúmenes de los tumores 10 alcanzaron 1000mmJ, fueron removidos, cortados en fragmentos de 2x2x2 m A Los fragmentos fueron pasados en serie para ciclos adicionales y los fragmentos resultantes de 2x2x2 mm" • fueron implantados subcutáneamente en los flancos derechos de ratones C57BL/6 hembras. Cuando los volúmenes de tumores 15 alcanzaron 150-25 mm , aproximadamente 24 días después del implante, los ratones fueron aleatorizados en 6 grupos de 10 ratones y cada grupo recibió un tratamiento diferente. Un grupo de control recibió 0.2 mis de PBS. Otro grupo de control recibió 0.2 ml que contenía 1x10" c.f.u. de la cepa • 20 dirigida a tumor atenuada de Salmonella WP20009 que lleva un plásmido de control a asd, es decir, un plásmido asd, que no tiene inserto, de conformidad con lo descrito en la sección 5.6, supra . El primer grupo experimental recibió 0.2 ml que contenía 1x10° c.f.u. de VNP20009 que expresa una proteína de 25 fusión hexahistidina-endostatina en el plásmido asd. El segundo grupo experimental recibió VNP20009 con el mismo constructo de expresión que el primer grupo y expresó además BRP. La figura 17 muestra los resultados de estos experimentos, que demuestran la eficacia de la inhibición de tumor por las cepas VNP20009 que expresan hexahistidina-endostatina. Después de 60 días de tratamiento, el tamaño medio del tumor en las Salmonella VNP20009 que expresan endostatina fue aproximadamente 13% del tamaño medio de tumor en animales de control, y más de 30% menos que el tamaño promedio de tumor en animales tratados con VNP20009 Salmonella que contenía un vector vacío. De los animales sobrevivientes muchos presentaron un crecimiento estático de tumor, según lo indicado por cambios pequeños en cuanto a tamaño neto de tumor, y un animal presentó una regresión fuerte del tumor. Una penetración incompleta o una efectividad incompleta del tratamiento refleja con mayor probabilidad un sistema de administración imperfecto para la endostatina, de conformidad con los hallazgos de O'Reilly et al . (1997, Cell 88-277-285) en el sentido que la endostatir.a se acumula en cuerpos de inclusión. El sistema de administración para la endostatma es realzado por la expresión de BRP. La expresión de BRP es controlada por su promotor natural, que muestra normalmente una respuesta de SOS en bacteria. La expresión de BRP disminuyó el volumen de tumor promedio a aproximadamente 6% del volumen de tumor medio de la población de control. Además, dentro de las poblaciones de ratones tratadas con hexahistidina-endostatma y BRP, varios ratones presentaron reducciones sorprendentes en cuanto al volumen de tumor con el paso del tiempo en donde el volumen de tumor regresó a aproximadamente 10% o menos del volumen de tumor inicial. El efecto de BRP es probablemente doble: primero BRP en sí puede poseer una actividad antitumor, y segundo, BRP promueve la liberación de contenidos periplásmicos y hasta cierto punto la liberación de contenidos citoplásmicos, incluyendo endostatina lo que previene la acumulación de proteína en cuerpos de inclusión. 13.4. EFICACIA DE SALMONELLA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA QUE EXPRESA ENDOSTATINA EN CARCINOMA DE COLON HUMANO DLD Cultivos de células DLDl cultivadas en fase log fueron tripsinizados, lavados, con PBS y las células fueron reconstituidas en una suspensión de 5x10 células/ml en PBS. Alícuotas de 0.1 ml de suspensiones individuales de células, cada uno conteniendo 5x10° células, fueron inyectadas subcutáneamente en los flancos derechos de ratones hembras desnudas de 9 semanas de edad (Nu/Un-CDl de Charles River) . Los ratones fueron divididos aleatoriamente en tres grupos de 10 animales cada uno y después escalonados a 10-15 días después de la inyección o bien cuando el volumen de tumor alcanzó 200-400 mm . El primer grupo de ratones fue el grupo i a; de control, y cada uno recibió una inyección de 0.3 mi de PBS. Ei segundo grupo de ratones recibió ..3 ml que contenía 1x10' c.f.u. de la cepa dirigida a tumor atenuada de Salmonella VNP20009 que lleva un plasmado asd de control. El 5 tercer grupo de ratones recibió 0.3 ml que contenía lxl A c.f.u. de la cepa dirigida a tumor atenuada de Salnonell a VNP20009 que lleva un plásmido asd que expresa una proteína • de fusión hexahistidina-endostatina y BRP. Los tumores fueron monitoreados y medidos dos veces por semana. La figura 18 es 10 una representación gráfica del volumen de tumor después de la administración de los tres tratamientos, lo que demuestra el efecto inhibidor de Salmonella dirigida a tumor atenuada que • expresa hexahistidina-endostatma sobre el crecimiento de carcinoma de colon humano DLDl. 15 VNP20009 que lleva el vector vacío PYA2?32 no pudo inhibir significativamente el crecimiento del :mcr. Sin embargo, VNP20009 que expresa endostatina y B?? pudo inhibir el crecimiento de tumor. Estos resultados demuestran que la combinación de endostatina más BP? incrementa el efecto 20 antitumor de cualesquiera de V?P2 C9 ie lleva el vector PYA3332 (cepa 8324) 14. EJEMPLOS: EXPRESIÓN DE FACTORES AN"-ANGIOGÉNICOS POR SALMONELLA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA El siguiente ejemplo muestra la metodología utilizada para 25 manipular bacterias dirigidas a tumor atenuadas, por ejemplo „ j.A .t I Salmonella para expresar los factores anti-angiogénicos región de homología anti-angicgénica de trcmbospondma, factor plaquetario 4 y apomigren. 14.1 CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE 5 ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA REGIÓN DE HOMOLOGÍA A TI- ANGIQGÉNICA DE TROMBOSPONDINA La secuencia de péptidos TiP 13.40: AYRWRLSHRPKTGFIRV7MYEG (SEQ ID NO:24), que corresponde a la región de homología anti-angiogénica (AHR) de trombospondina (ver, por ejemplo, 10 solicitud de patente no. C07K-14/78), fue sometida a ingeniería reversa y en codón fue optimizado para expresión en Salmonella lo que resultó, en la secuencia de ADN: • GCG TAC CGC TGG CGC CTG TCC CAT CGC CCG AAA ACC GGC TTC JATC CGC GTG GIG ATG TAC GAA GGC SEQ ID NO:25). Oligenuciectidos 15 complementarios (Oligo 13:40-1 y Oligo 13:43-2^ fieron producidos para sintetizar eete péptido. En el extremo 5', se agregaron una secuencia que codifica la región de procesamiento de OMPA y un sitie de restricción Spel. ?r. eí extremo 3', se agregó un codón de terminación con ur. sitio de • 20 restricción BamHl. Los dos cligos fueron unidos para generar el fragmento de ADN de cadena debie. El fragmento de A.CN fue cortado con Spel/BamHI y ligado en el vector certado Spel/BamHI pTrc801IL2 para producir el plásmido pTrc801-13.40 que contiene la secuencia líder de OmpA odificaaa de 25 longitud completa. Cuando es procesada, la secuencia pr educe ...-4. ÍJ. A .; el péptido de trombospondina 13.40 de longitud completa. Oligo 13.40-1: 5'gtgtactagtgtggcgcaggcgGCGTACCGCTGGC CCTGTCCCATCGCCCGAAAACCG GCTTTATCCGCGTGGTGATGTACGAAGGCTAAggatccgcgc 3' (SEQ ID NO: 26 5 Oligo 13.40-2: 5' gcgcggatccTTAGCCTTCGTACATCACCACGCGGATAAAGCCGGTTTTCGGGCGATGGGA CAGGCGCCAGCGGTACGCcgcctgcgccacactagtacac 3' (SEQ ID NO: 27) (Los sitios de restricción son indicados en cursivas y el 10 sitio de reconocimiento de procesamiento de OmpA es subrayado. ) 14.2 CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE • UN ÁCIDO NUCLEICO AJE CODIFICA ?L PÉPTIDO DE FACTOR PLAQUETARIO-4 (47-70) 15 El péptido que consiste de los resiauos ae aminoácidos 47-70 de la terminal C del factor propietar?o-4 (PF-4, ver, por ejemplo, Maione et ai . , 1990, Science 2 ¿ ; ~ p-19 y Jouan et al . , 1999, Blood 94:954-993) fue cptimizado por codón para expresión en Salmor.éila . El péptido, que se describe a • 20 continuación, incluye el motivo DLQ responsable de la actividad inhibidora ae PF-4 sobre células prcgenitoras de CFU-GM y grupos de aminoácidos básicos que es el dominio principal de unión de r.epapna. Factor plaquetar?o-4 25 MSSJAAGFCASRPGLLFLGLLLLPLWAFASAEJAEEDGDLQCICA^CTSQVPPJRHITSLEVI í i KAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO: 28) Péptido de señal = subrayado y en negritas Lys 61, 62, 65, 66 = dominio principal de unión de heparina (en negritas) DLQ (7-9, 54-56) = actividad inhibidora sobre células progenitoras de CFU-GM (en negritas) Oligonucleótidos complementarios (oligo PF4-1 y oligo PF4-2) fueron producidos para sintetizar este péptido en el extremo 5' se agrego una secuencia codificadora de la región de procesamiento de OmpA y un sitio de restricción Spel. En el extremo 3', se agregó un codón de terminación con un sitio de restricción BamHl. Los dos oligos fueron fusionados para generar el fragmento de ADN de doble cadena. Después de la digestión por restricción, el fragmento fue ligado en el vector restringido Spel/BamHl pTrcSOl para producir el plásmido pTrc801-PF4. Cuando es procesada, la secuencia produce el péptido PF-4 (41-60) de longitud completa. Oligo PF4-1 5' cttcactagtgtggcgcaggcgAACGGCCGCAAAATCTGCCTGGACCTGCAGGCGCCGCTG TACAAAAAAATCATCAAAAAACTGCTGGAAAGCTAA gga tcc gcg3' (SEQ ID NO:29) Oligo FF4-2 5'cgcggatccTTAGCTTTCCAGCAGTTTTTTGATGATTTTTTTGTACAGCGGCGCCCGC.A GGTCCAGGCAGATTTTGCGGCCGTTcgcctgcgccacactagtgaag3' (SEQ ID NO:30) (Los sitios de restricción se presentar, en cursivas y el sitio de reconocimiento de procesamiento de ompA es subrayado) . 5 14.3. CONSTRUCCIÓN DE UN PAÁSMIDO QUE CONTIENE LA SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA APOMIGREN El péptido anti-angiogénico apomigren (IYSFDGRDIMTDPSWPQKVIWHGSSPKGVRLVDNYCEAWRTADTAVTGLASPLSTGKILD QKAYSCANRLIVLCIENSFMTDARK ! SEQ ID NO: 31; véase, per ejemplo, 10 Publicación Internacional No. W09/29856) que corresponde a la terminal C de restina, que es un fragmento proteciítico de colágena XV. Oligonucleótidos (oligo Apom5F y oligo Apom6F) • fueron diseñados para amplificar el fragmento de Ai: a partir de ADNc de ser humano. En el extremo 5', se agregó una 15 secuencia cedificadora para ia región de procesariento de OmpA y un sitio de restricción Spel. En el extrer.o 3', se agregó un codón de terminación con sitio de restricción BamHl : Oligo Acom5F: 5'-ggcttc aczagt stggcgcaggcg • 20 ATATACTCCTTCGATGGTCG -3' (SEQ ID NO: 32 ^ Oligo Apom R: 5' -cgc gga zee TTACTTCCTAGCGTCTGTCATGAAA TG - 3' (SEQ ID NO: 33) (Los sities de restricción se presentan en cursivas y el sitio de reconocimiento de procesamiento de Omp.A es 25 subrayado) .
Un fragmento del tamaño correcto fue obtenido por reacción en cadena de polimerasa empleando ADNc placental como templado. El producto de reacción en cadena de polimerasa fue cortado con Spel/BamHI y ligado sobre el vector restringido por 5 Spel/BamHI pTrc801 que contiene la secuencia de señal ompj modificada para producir el plásmido pTrcdOl-Apom. Cuando es procesada, la secuencia produce el péptido Apomigren. 14.4. PÉPTIDOS ANTI-ANGIQGÉNICOS PRODUCIDOS POR SALMCNELLA QUE INHIBE LA PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS ENDOTELIALES 10 Los plásmidos pTrcOmpA-Endostatina, pTrc801-PF4 y pTredOl- 13.40 fueron sometidos a electroporación en cepas VNP20C09 de Salmonella dirigidas a tumor atenuadas. Las cepas de • Salmonella que expresan pTrcOmpA-Endostatina, pTrc801-?F4 y pTrc801-13.40 fueron tamizadas para su determinar anti- 15 proliferativa de conformidad con lo descrito por Feldr.an et al . , 2000, Cáncer Res. 60:1503-1506 y Blezinger et al . , 1999, Natura Biotech. 17:343-348. cultivos de 5 ml de colonias individuales fueron cultivados durante 4 horas. Se produjeron lisados de células mediante la resuspensión de la pella de • 20 células en un volumen 1/20 de HUVEC que contenía 10 mg/ml de gentamicina y efectuando 3 ciclos consecutivos de congelación/descongelación. Los lisados fueron depurados por centrifugación y esterilizados por filtración empleando un filtro de jeringa de 0.2 mm. 10, 25 o 50 de los iisados 25 fueron agregados a células endoteliales de venas humanas ^^ Sn (HUVECs) en placas de 96 pozos que contenían 100 ml de medio basal FCS al 2% más 10 ng/ml de FGF. Como control se utilizaron Salmonella que contenían el vector de pTrc vacío. Fueron encubadas placas durante "2 horas y la proliferación 5 fue medida por ensayo MST y (Mosr.an et ai., 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63) . Los resultados preliminares en las figuras 19y 20 muestran que el péptido de factor plaquetaria-4 (PF4-2) el péptido de trombospondina 13.40 (13.40-3) y ia endostatina producidos 10 por Salmoneiia parecen tener una actividad anti-proliferativa entre 40 y 60%. 15. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE UNIÓN DE FAMILIA DE BACTERIOCINA • POR SALMONELLA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA. Este ejemplo demuestra que bacterias dirigidas tumor 15 atenuadas, por ejemplo, Salmonella, que contienen un ácido nucleico que codifica un miercro de ia familia de las bacteriocinas pueden expresar el miembro de familia de bacteriocinas . 15.1 CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDOS CCLE3 • 20 Los plásmidos descritos aqui sirven para ilustrar ejemplos de modalidades especificas de la invención. Como será aparente a una persona con conocimientos normales en la técnica, ácidos nucleicos que modifican moléculas efectoras y/o promotores tales como el promotor tre ?: z ios ácidos nucleicos que 25 codifican bacteriocina pueden ser remplazados per otro .- ,'í.? promotor apropiado o moléculas efectoras apropiadas por métodos conocidos en la técnica. 15.1.1. EL PLÁSMIDQ DE VECTOR INTERMEDIO pE3. SHUTTLE-1 pE3.shuttle-l representa el vector intermedio utilizado para 5 crear un cásete que contiene un sitio de clonación múltiple y fragmento lacZ para clonación/selección en el vector de plásmido Cole3-CA38 (SEQ ID NO:34). Para facilitar la • clonación de BRP en E3, BRP fue clonada primero en un vector shuttle intermedio (figura 21) . Este vector contiene un 10 fragmento lacZ que puede ser utilizado para seleccionar clones en lactosa en una cepa bacteriana con una mutación o varias mutaciones en lacZ cromosómico el fragmento de BRP fue después clonado en el sito Smal de plásmido E3 (figura 22) como un cásete que contiene el fragmento de completación lacZ 15 alfa. El fragmento de lacZ hace posible la selección de insertos (es decir, Lac+) en esta etapa. Aún cuando el plásmido, que ocurre naturalmente no tiene marcadores de selección de antibióticos (figura 23), la selección para la presencia de piásmido es posible mediante la utilización de 20 un ensayo halo (Pugsley. A. P. y Oudega, B. "Methods for Studying Colicins and Their Plasmids" [Métodos para estudiar colicinas y sus plásmidos] en Plasmids, Practical Approach 1987, ed. By K.G. Hardy; Gilson, L. et al . EMBO J. 9:3875- 3884) . Este vector shuttle debería no solo facilitar la 25 clonación de BRP en el plásmido E3 sino también cualquier ADN "•-- ~~*- t -* ?-que podría ser combinado con E3 o E3/BRP. El nuevo plásmido E3/BRP fue después transformado en 41.2.9 y probado para actividad. Ensayos de formación halo preliminares demostraron que la presencia de BRP en el plásmido nc interfiere con la capacidad de esta cepa para producir E3 para determinar si 41.2.9 E3/BRP tenía una actividad incrementada en comparación con 41.2.9 E3, se determinó la cantidad de unidades letales de E3 producidas por cada cepa (figura 24). 41.2.9 E3 BRP produce 100% más unidades letales que 41.2.9 E3 sola, lo que demuestra que esta cepa tiene una actividad realzada en comparación 41.2.9 E3 sola. 15.1.2. ENSAYO DE "CLAVADO" DE HALO PARA ACITIVIDAD E3 La cepa de prueba sensible (SK522) es cultivada a un OD: de 0.8. 100 µl de cepa de prueba se agrega a 3 ml de agar blando LB caliente (aproximadamente 55° C) (para un plato de ICO x 15 mm) y se vacían rápidamente en una placa de agar LB. La placa es agitada suavemente para esparcir el recubrimiento de manera regular sobre la placa y se permite la solidificación del agar durante 10-15 minutos. Colonias de E. coli o Salmonella para las cuales se desea ensayar la actividad E3 son aisladas con un palillo estéril y "clavado" en el agar. Las placas de agar son después invertidas e incubadas a una temperatura de 37° C durante la noche. Al día siguiente, aparece una zona clara o halo alrededor del clavado de E3 puesto la colicina E3 secretada mata la cepa sensible. Las colonias pueden ser inducidas adicionalmente a incrementar la producción de E3 o secreción de E3 por tratamiento por cualesquiera de varios agentes inductores de SOS, por ejemplo, un agente de alquilacicn (por ejemplo, mitomicina) , luz ultravioleta o rayos X. Los resultados de uno de los ensayos halo aparecen en la figura 25. cuando una cepa bacteriana secreta una colicina en presencia de una cepa sensible cultivada en un césped bacteriano o una caja de petp, la colicina secretada se difunde y mata las células contenidas en el césped bacteriano, usándolas, creando así una zona clara o halo. El tamaño del halo corresponde a la cantidad de colicina secretada. Los resultados mostrados en la figura 25 muestran numerosas cepas. No se han nunca observado ningún halo alrededor de cepas que nc contienen el plásmido colE3-CA38. En ausencia de inducción, la celicina es producida por las cepas de Salmonella . Resulta tarrAér. evidente que, con varios tipos de inducción, (por ejemplo, agentes de alquilación, luz UV, rayos X) , todos los halos incrementan su tamaño de manera dependiente de la dosis. 15.1.3 ENSAYO DE RECUBRIMIENTO PARA CLONES E3 SELECTIVOS Transformantes se colocan en placas con varias diluciones (hasta 1:10,000) en LB y se cultivan durante 2 horas a una temperatura de 37° C. La cepa de prueba sensible es después preparada como arriba en el ensayo de halo y se coloca un ti ^j^^ recubrimiento con agar suave. Después de permitir la solidificación durante 10 minutos, ia placa es después invertida e incubada durante ia noche a una temperatura de 37° c. pequeñas zonas claras aparecen después, el día siguiente (que se parecen a placas de bacteriófagos) con una pequeña colonia (o colonias) en la zona clara. 15.1.4. ENSAYO DE PURIFICACIÓN DE "PLACAS" 0 HALO La pequeña colonia en el centro de la zona clara en el recubrimiento de agar que se describió arriba es después aislada empleando una pipeta pasteur estéril en el caso de ausencia de colonias visibles en el caso de múltiples colonias en un halo, el halo entero es recogido con una pipeta pasteur estéril. La colonia o halo es transferida en 550 µi de LB. Diluciones (hasta 1:10,000) se efectúan y se colocan de nuevo en placas en agar LB y se deja crecer durante 2 horas a una temperatura de 37° C. se vacía después un recubrimiento con la cepa de prueba sensible de conformidad con lc presentado arriba. Al día siguiente, la totalidad o la mayor parte de las colonias deben tener halos alrededor de ellas. 16. EJEMPLO: INYECCIÓN DE E3 JN VIVO, Y DETERMINACIÓN DE LA RETENCIÓN PORCENTUAL DE PLÁSMIDO EN SALMONELLA Ei siguiente ejemplo demuestra la retención del plásmido con E3-CA38 en Salmonella in vivo . Homogenados de tumor e hígado de 2 ratones 30 días después de la inyección ya sea de 41.29 (o bien 41.2.9E3-CA38) fueron utilizados para los estudios. En la descripción, L=hígado, T=tumor. Todos los homogenados fueron colocados en placas para CFU y colonias fueron recogidas para análisis por 5 reacción en cadena de polimerasa msbB y para producción de colicina. Cultivos casi puros de colonias similares a 41.2.9 fueron obtenidos de todos los homogenados. 5 colonias fueron • recogidas de cada uno para análisis PCR y colicina. 30 colonias adicionales fueron recogidas de las placas de 41.2.9 10 E3 T y L para análisis adicional puesto que parecían ser una población mixta de productores de colicina y no productores de colicina en el homogenado de hígado de 41.2.9 E3. En base en estos resultados, 100 colonias adicionales de tumor 41.2.9 en E3 e hígado fueron recogidas y probadas para la producción 15 de colicina y msbB PCR. La distribución y retención de plásmidos se calcularon a partir de ios datos combinados. Los resultados de la inyección de E3 in vi vo, determinación de la retención porcentual de plásmido en Salmonelia , se muestran a continuación. 20 Tabla 3 Tejido CFU/ml peso de CFU/g número % po- i de tejido positivo sitivo reten- para en msbB ción colicina PCR 25 41.29L 1.07E+03 1.33 4.02E+03 0/5 100% n/a 41.29T 1.26e+07 0.26 2.42E+08 0/5 100% n/a 41.29E3L 1.15E+04 2.34 2.46E+04 87/135 100% 64.44 41.29E3T 1.09e+06 0.35 1.56E+07 134/135 100% 99.2 Para que el plásmido colE3 tenga un efecto in vivo, y para 5 llevar otros genes al sitio de tumor in vi vo, el plásmido colE3 debe ser efectivamente retenido in vivo . Los resultados obtenidos en este experimento fueron sorprendentes y también provechosos puesto que el objetivo del efector es tumor, y por consiguiente habría menos efectos sobre el hígado mismo. 10 17. EJEMPLO: ENFOQUE A TUMOR DE VARIAS CEPAS 41.2.9 EN EL MODELO DE TUMOR PULMONAR M27 El siguiente experimento demuestra la capacidad de las cepas • de Salmonella 41.2.9 colE3 y 41.2.9 colE3 BRP y 41.2.9 colE3 BRP-M (BRP modificada) para enfocarse a tumores. 15 Las cepas de Salmonella presentadas en la lista de la Tabla 4 a continuación fueron inyectadas en animales que presentaban tumores pulmonares M-27 y los animales fueron sacrificados el día 7. Se ensayaron los pesos de los órganos al día siguiente para calcular CFU/g. Tumores e hígados fueron homogeneizados • 20 y colocados en placas en msbB para determinar las unidades formadoras de colonias (c.f.u.). En los grupos i, 2, 4, y 6, las cepas se acumularon todas en los tumores a aproximadamente 4 x 10" cfu/g con una acumulación variable en los hígados dentro de un rango de 6 x 104 a 4 x 10" cfu/g. La 25 Tabla 4 presenta un resumen de los datos para todos los grupos y es representada por cfu/g promedie. Se encontró que todas las cepas presentaban una buena acumulación en tumor (más que 10" c.f.u. /gramo de tejido y todas las cepas presentaron proporciones positivas entre tumor e hígado. La cepa BRP colE3 presento presentó la mejor proporción pero no fue necesariamente mejor que todas las demás cepas disponibles. Las cepas E3 y E3BRP se acumulan a niveles relativamente elevados en tumores con proporciones entre tumor e hígado comprendidas entre 100-200:1. Tabla 4 Grupo Cepa Tumor (T) efu/s te" ido Proporción Hígado (L) [tumor: hígado) 1 41.2.9/E3 T 5 . 1 _ i , AxI O" 131.1 1 41.2.9/E3 L 3 . 9 = -, . cxl O ' 2 41.2.9/E3BR? T 4 . 6 ± AxlO" 209:1 2 41.2.9/E3BRP L 2 . 2 - 1 . 3x10 " 6: 41.2.9/E3BRP. T 3 . 5 = c . , 15x10 90: 61 41.2.9/E3BPP- L 3 . 9 _ - 6xl 0 : BRPm se refiere a una BRP modificada que contiene mutaciones de puntos en la posición 96 (G en A que resulta en un cambio de aminoácido de una glicina a una argimr.a* y en ia posición 14 (T en A lo que resulta en un cambio de aminoácido de una serina a una treonina) . La BRPm mutante ya no provoca una casílisis pero sigue pudiendo secretar proteínas a partir de la bacteria (van der Wal, F., Koningstein, G., Ten Hagen, C.
M., Oudega, B y Luirink, J. (1998) Optimization of Bacteriocin Reléase Protein (BRP) -Mediated Protein Reléase by Escherichia coli : Random Mutagenesis of the pCloDF13-Derived BRP Gene to Microbiology vol. 64 pp 392-398) . 18. EJEMPLO: EFICIACIA DE 41.2.9/COLE3 SOBRE CARCINOMA CE COLON DE .MURINO C38 El siguiente ejemplo demuestra la capacidad de 41.2.9/ccl?3 para inhibir el crecimiento de carcinoma de colon de muri.no C38. Un fragmento de tumor 38 de colon (2x2x2 mmJ) fue implantado en ratones C57BL/6 (hembras, edad: 9 semanas;, subcutáneamente. Después de que el volumen del tumor haya alcanzado 1,000 miA, los tumores fueron removidos de los ratones en condiciones estériles y cortados en fragmentos pequeños (aproximadamente 2x2x2 mmAfragmento, y se repitió el procedimiento anterior durante 5 ciclos. Los fragmentos fueron implantados en ratones subcutáneamente en el flanco derecho mediante la utilización de una aguja de implantación de tumor el día 0 de implantes de tumor. Los animales fueron aieatorizados el día 0 de administración de Salmonella cuando el volumen de tumor alcanzó 150-200 A . Soluciones madres congeladas de 41.2.9 y 41.2.9/CoiE3 fueron descongeladas a temperatura ambiente y diluidas en PBC hasta una concentración final de 7.5 x 10" cfu/ml, respectivamente. Alícuotas de 0.2 mí de suspensión bacterial (1.5 x 10" CFU/ratón 9 fueron administradas intravenosamente en ratones según lo indicado en ei grupo el día 0. Las suspensiones de bacterias fueron diluidas a 1 x 10 CFU colocadas en placas de msbB e incubadas durante la noche para determinar el número de CFU bacterianas que fueron administradas. Los tumores fueron medidos dos veces por semana hasta el final del experimento. 3 tumores de cada grupo (ColE3) fueron disecados y procesados para determinar cfu y retención de plásmido. Grupos: Ratones 1. Control no tratado 8 2. 41.2.9 (1.5 x 10 /ratón) 8 3. 41.2.9/ColE3 (1.5 x 10'Vratón 8 Los resultados para la eficacia de 41.2.9/ColE3 sobre carcinoma de colon de murino C38 aparecen en la figura 26. Los datos demuestran que ratones tratados por inyección intravenosa con VNP20009 (41.2.9) podían inhibir significativamente ei crecimiento de carcinoma de colon de murino C38. Además, cuando ratones fueron tratados con VNP20009 que contenía el plásmido ColE3, se logró una regresión del tumor (es decir, los tumores eran más pequeños al final del experimento que al principio1. 19. EJEMPLO: ACTIVIDAD ANTI-TUMOR DE VNP20009/COLE3 SOBRE CARCINOMA DE COLON HUMANO DLDl EN RATONES DESNUDOS «^ * » * El siguiente ejemplo demuestra la capacidad incrementada de mutante de Salmonell a VNP20009/ColE3 ?41.2.9/ColE3) para inhibir el crecimiento de carcinoma de colon humano DLDl en comparación con el mutante de Salmonella 41.2.9. Células DLDl cultivadas en fase log fueron removidas por tripsinización, lavadas con PBS, y reconstituidas a 5 x 10 células/ml de PBS. Suspensiones individuales de células (0.1 ml) fueron inyectadas en ratones desnudos (?u/?u-CDl, hembras, edad: 9 semanas; de Charles River) subcutáneamente, el día 0 (5 x lOVratón) en el flanco derecho. 10 animales fueron utilizados en cada grupo, aleatorizados y escalonados a aproximadamente 10-15 días después del implante de tumor, cuando el tamaño de tumor alcanzó 300-400 mm" . Se contaron las CFU de mutante de Salmonella 41.2.9 y 1.2.9/ColE3 un día adelante. Bacterias (41.2.9 t 41.2.9/ColE3! fueron diluidas a 1 x 10 CFU/ l . Alícuotas de suspensión bacterial 0.2 ml (2 x 10' /ratón) fueron inyectadas de manera intravenosa en ratones los días indicados. La suspensión de bacterias fue eluída en 1 x 10" CFU, coloca cada solución de lOCul fue colocada en placas de msbB y las placas fueren incubadas durante la noche. Las colonias de bacterias fueron contadas al día siguiente. Los tumores fueron medidos dos veces por semana. Grupos : Ratones 1. Control no tratado (PBS) 10 A . -ilij S.J 2. 41.2.9(2xlOc7ratón) 10 3. 41.2.9/ColE3 (2x10 /ratón- 10 Los resultados de la actividad anti-tumor de 41.2.9/ColE3 sobre carcinoma de colon humano DLDl en ratones desnudos se 5 muestran en la figura 27. Cepa 41.2.9 que contiene colicina E3 incrementó la actividad en comparación con la cepa 41.2.9 sola. • 20. EJEMPLO: EFICACIA DE 1.2.9/COLE3 SOBRE MELANOMA DE MURINO B16 EN RATONES C57BL/6 10 El siguiente ejemplo demuestra la capacidad de mutante de Salmonella 41.2.9/ColE3 para inhibir el crecimiento de melanoma B16-F10. • Células B16-F10 cultivadas en fase log fueron removidas por tripsinización lavadas con PBS, y reconstituidas a 5 x 10° 15 células/ml de PBS. Suspensiones individuales de células (0.1 ml) fueron inyectadas en ratones C57BL/6 (hembras, edad: 9 semanas) subcutáneamente, el día 0 (5 x 10"células/ratón) en el flanco derecho. 10 animales fueron utilizados en cada grupo, y aleatorizados el día 9, cuando el volumen del tumor • 20 alcanzó 150-200 mm . Soluciones madres de clones de Salmonella 41.2.9 y 41.2.9/ColE3 fueron descongeladas a temperatura ambiente y diluidas en PBS hasta concentración final de 7.5 x 10 CFU/ml, respectivamente. Alícuotas de suspensión bacterial 0.2 ml (2 x 10u /ratón) fueron inyectadas 25 de manera intravenosa en ratones como grupo indicado el día 9. Las suspensiones de bacterias fueron diluidas en 1 x 10J CFU, colocadas en placas de msbB e incubadas durante la noche para determinar el número de CFU bacterianas que fueron administradas. Los tumores fueron medidos dos veces por semana hasta el final del experimento. Grupos : Ratones 1. Control no tratado 10 2. 41.2.9(lx57ratón) 10 3. 41.2.9/ColE3(1.5xl06/ratón) 10 Los resultados de la eficacia de 41.2.9/ColE3 sobre melanoma de murino B16 en ratones C57BL/6 se muestran en la figura 28. Los datos demuestran que ratones tratados por inyección intravenosa con 41.2.9 (41.2.9) son capaces de inhibir significativamente el crecimiento de r.elanoma de murino B16. Además, ratones tratados con 41.2.9/ColE3 mostraron una disminución significativa en cuanto al tamaño del tumor en puntos de tiempo tempranos (hasta el día 37) en comparación con 41.2.9 sola. Este hallazgo es muy importante puesto tamaños más pequeños de tumor son más fácilmente susceptibles a otros agentes terapéuticos por ejemplo, agentes quimioterapéuticos y radiación, por ejemplo rayos X.) 21. EJEMPLO: EFICACIA ANTI-TUMOR DE 41.2.9/E3 COMBINADA CO BRP El siguiente ejemplo demuestra que la co-expresión de BRP y E3 en mutante de Salmonella 41.2.9 incrementa la eficacia anti-tumor del mutante. La co-expresión de BRP y E3 en mutante de Salmonella 41.2.9 incrementa la cantidad de E3 secretado a partir de la 5 bacteria in vi tro . Sí BRP pudo incrementar la cantidad E3 secretada a partir de Salmonella in vi vo, entonces podría plantearse de manera hipotética que E3 extracelular • adicional, podría estar fácilmente disponible para las células tumorales y por consiguiente podrían incrementar la 10 citotoxicidad para estas células. En este experimento se probaron 4 grupos de animales (10 animales por grupo): Número de grupo Tratamiento • 1 Control sin tratamiento) 2 41.2.9 15 3 41.29/E3 4 41.29/E3/3RP El modelo utilizado en este experimento fue la línea de carcinoma pulmonar humano HTB17". Las células fueron implantadas en el flanco de ratones de manera subcutánea el • 20 día 1. Cuando los tumores alcanzaren aproximadamente 500 miA ei día 14, los animales recibieron inyección intravenosa de 1 x 10 CFU de la cepa descrita en la Tabla anterior o bien con solución salina en el caso del grupo 1. El volumen del tumor fue medido semanalmente hasta el día 24. Los resultados de la 25 Tabla 5 muestran que mientras 41.2.9 en sí puede inhibir el crecimiento de tumor (inhibición del 40%) la combinación con E3 puede aumentar la eficacia anti- umor '63%A Sin embargo, cuando la cepa que lleva tanto E3 como BRP se utiliza este modelo, la eficacia anti-tumor es incrementada adicionalmente 5 (inhibición del 67% en comparación con el grupo control no tratado) y la inhibición realzada es bastante significativa en los puntos de tiempo iniciales (Tabla 5) . Tabla 5: Inhibición porcentual del crecimiento tumoral en comparación con control no tratado. 10 Cepa Día 17 Día 20 Día 24 41.2.9 50 38 40 41.2.9/E3 63 58 63 41.2.9/E3/BRP 97 82 67 En conclusión, el tratamiento con Salmonelia que lleva tanto 15 colicina E3 citotóxica como el sistema de secreción realzado BRP resulta en un incremento de la eficacia anti-tumor en comparación con el control no tratado y con el tratamiento con 41.2.9/E3 solo. 22. EJEMPLO: COMBINACIÓN DE SALMONELLA QUE CONTIENE COLICINA • 20 E3 CON TRATAMIENTO DE RAYCS X El siguiente ejemplo demuestra que la combinación de 41.2.9 con dos dosis de rayos X incrementa significativamente el tiempo de supervivencia de ratones arriba de lo que se observa en el caso de rayos X solos . 25 El esquema fue el siguiente: el día 0, tumores fueron implantados mediante la administración de melanoma B16F10 (5 x 10" células/ratón) s.c. en el costado derecho, a la mitad de cuerpo de 100 ratones hembras C57B6 (5-7 semanas de edad) . El día 8, se inyectó Salmonella 41.2.9 que contiene colicina E3 y los días 12 y 26 se administraron rayos x. Los resultados de la combinación de Salmonella que contiene colicina E3 con tratamiento con rayos X se muestran en la Tabla 6. Categoría n= ( ) Días media T/C Hasta lg Un 15Gy ficticio (6) 12,12,18, 17 1.0 18,18,21 J rayos X 15Gy (9) 14,14,18, 33 l.S 12dpt, 26dpt 21,25,35, 35,67,67 K 41.2.9 +15Gy (9) 21,28,35, 47 2.5 rayos X 12dpt, 26dpt 35,56,60, regresión #1,2 60,60,67 L 41.2.9/E3+15Gy (9) 28,39,53, 57 3.3 rayos X 12dpt, 26dpt 56,56,60, regresión d32 67,74,78 Estos datos demuestran que ia combinación de 41.2.9 cor. dos dosis de rayos X incrementa significativamente el tier.po de supervivencia de ratones por encima de lo observado en el caso de rayos X solos. E3 incrementó adicionalmente el tiempo i-r Í A i .á de supervivencia arriba de lo observado en el caso de 41.2.9 más rayos X. 23. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE FACTORES NECRÓTIC S CITOTÓXICQS POR BACTERIAS DIRIGIDAS A TUMOP 5 El siguiente demuestra la expresión de factor necrótico citotóxico 1 de E. coli (CNF1) por bacteria dirigida a tumor. Los factores necróticos citotóxicos incluyen, sin limitarse a • ellos, el factor necrótico citotóxico 1 de E. coli (CNF1; Falbo et ai., 1993, Infect. Im un. 61:4904-4914), CNF1 de 10 Vibrio Eischeri (Lin et al . , 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm. 250:462-465) y el factor necrótico citotóxico 2 de E. coli (CNF2; Sugai et al . 1999, Infect. Irjtiun. 67:6550-6557). La familia de CNF incluye también toxina de Pasteurella mul tiocida (PMT) que comparte 27% de residuos idénticos y 80% 15 de residuos conservados de la porción N-terminal de CNF2 (Oswaid et ai., 1994, Proc. Acad. Sci. USA 91:3814-3818). CNF1 fue clonado a partir de E. coli J9 (ATCC 700336) por reacción en cadena de polimerasa usando les cebadores (directos) 5' GTGTCATGAAAATGGGTAACCAATGG AAC -3' (SEQ ID 20 NO: 35) y (reverso) 5' CACAGAGCTCGCGCTAACAAAAC.AGCACAAGGGAG -3' (SEQ ID NO: 36) utilizando reacción en cadena de polimerasa estándar. Un producto de aproximadamente 31CC pares de base fue obtenido y clonado en los sitios NccC y Sacl de pTrc99a para la expresión de la proteína así como secuenciamiento de 25 ADN utilizando E. coli como el huésped de clonación de ADN.
El secuenciamiento de ADN fue efectuado por métodos estándares en el laboratorio Keck Biotechnology de la Universidad de Yale. El secuenciamiento de ADN confirme que el producto de reacción en cadena de polimerasa elonade fue CNFl con solamente una variación de secuencia menor de ó de los 3065 pares de bases. El plásmido de CNFl fue sometido a electroporación en un huésped de clonación de ADN de E. coli de DH5a y cepa YS1646 de Salmonella (Publicación Internacional No. WO99/13053 . La expresión de CNFl fue determinada en el huésped de clonación de ADN de E. coli y de cepa YS1646 de Salmonella empleando un ensayo de LDH estándar (Promega, Madison, Wl, Cytotox 96®) . La Figura 29 muestra que la presencia del plásmidc que contiene CNF resulta en una citotoxicidad incrementada. Un ensayo subsecuente fue utilizado para mostrar que Salmcr.ella que lleva el plásmido que contiene CNF presenta también otras propiedades conocidas de CNFl, por ejemplo, multinucleación (Rycke et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28:694-699). Células Hela expuestas a CNFl fueron examinadas para núcleos por microscopía de luz. Los resultados en la Figura 30 muestran claramente que la presencia de CNFl en Salmonella resulta en la multinucleación esperada y la ampliación esperada de células. 24. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE VERCTQXINA POR BACTERIAS DIRIGIDAS A TUMOR El siguiente ejemplo demuestra la citotoxicidad de verotoxina AB producida por bacterias dirigidas a tumor manipuladas para expresar verotoxina AB. Verotoxina (sinónimo toxina HSC10, toxina Shiga, toxina de tipo Shiga, toxina Shigella) . Esa toxina fue aislada de una cepa HSC10 de E. coli que produce colicina y se pensó originalmente que era colicina (Farkas-Himsley et al . , 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. 92 (15) : 6996-7000) . Tiene una larga historia de actividad antitumoral, especialmente en el caso de cáncer de ovarios y tumores cerebrales, sin embargo, la actividad antitumoral se relaciona con preparaciones purificadas no con la bacteria viva entera. La verotoxina fue clonada en E. coli HSC10 (ATCC 55227) utilizando cebadores basados en ia secuencia publicada para verotoxina I y confirmada por secuenciamiento de ADN en el Yale Keck Biotechnology Center utilizando técnicas de secuenciamiento de ADN estándares. La expresión de verotoxina fue lograda utilizando el gen de BRP bajo el control del promotor inducible de tetraciclina policistrónico con las subunidades A y B de verctoxina. Esta verotoxma de BRP inducible por tetraciclina A3 fue clonada en un vector para integración cromosómica utilizando el gen msbB. 24.1. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES 24.1.1. .AMPLIFICACIÓN Y CLONACIÓN DE AB La verotoxina AB (AB) fue generada por reacción en cadena de polimerasa utilizando los siguientes iniciadores: K19B-A directo: 5' GTGTCCAAT3GCTAAAACATTATTÍATA.GCTGCATCGC -3' (SE!>¿ 11 O ! J i i ,' y QSTX-R1: reverso 5' GTGTCTGCAGAACTGACTGAATTGAGATG -3' (SEQ ID NO:38) . Estos iniciadores contienen también sitios externos de endonucleasa de restricción Ncol (5') y Pstl(3') para clonación en los sitios Ncol y PstI de ptrc99A. 24 . 1 . 2 . AMPLI FICACIÓN Y CLONACIÓN DE TETBRP TetBRP-AB fue construido en el vector intermedio pSP72-F6/R6. TetBRP fue generado por reacción en cadena de polimerasa empleando los siguientes cebadores: Tet-5' :directo 5'-GTGTAGATCTTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTG-3' (SEQ ID NO: 39) y BRP-TET-3' : reverso 5' -CACAGGATCCTTACTGAACCGCGATCCCCG-3' (SEQ ID NO: 40). Estos cebadores contienen sitios de endonucleasa de restricción BglII(5') y BamHl (3') para clonación en sitios Bgkll y BamHl del vector pS?72-F6/R6. 24.1.3. SUBCLONACIÓN DE AB EN pSP72-F6/R6-TETBRP ptrc99A-AB fue digerido con endonucleasas de restr?cc_ón BamHl y Aval para remcver AJ3 para inserción en pSP72-F /?o-TetBRP, digerido también con endonucleasas de restricción BamHl y Aval. El vector pSP 2-F6/Rß contiene múltiples sitios de endonucleasa de restricción para clonación además de una porción del gen ß-gal para complementación lacZ-alfa en trans. Tanto el vector (pSP72-F6/R6-TetBRP) como el inserto ? ? i ' . -J. de AB fueron reducidos en gel de agarosa 1XTAE 0.8% y purificados empleando el kit de extracción de gel Qiagen. El vector y el inserto fueron ligados empleando T4 ligasa y transformados en células DH5a E. coli usando el método de choque pérmico. Las células fueron colocadas en placas de LB que contenían 100 µg/ml de Amp y 40 µg/ i de X-gal. Colonias positivas fueron seleccionadas en base en la resistencia a la ampicilina y la presencia de un gen de ß-gal funcional (las colonias positivas presentaron un color azul) . 24.1.4. SUBCLQNACIÓN DE TETBRP-AB EN pCDV442 pSP72-F6/R6-TetBRP-AB fue digerido con endonucleasas de restricción Notl y Sfil para subclonación en vector pCVD442, digerida también con endonucleasas de restricción Notl y Sfil. 24.1.5 VECTOR CROMOSOMICO msbB Un vector capaz de ser sometido a recombinación homologa con el gen DmsjB en el cromosoma de la cepa VNP20009 (a.k.a. YS1646 en la Publicación Internacional No. WO 99/13053) fue construido en el vector suicida pCVD442 (Donnenberg y Kaper, 1991, Infection and Immunity 59:4310-4317). Cebadores para reacción en cadena de polimerasa fueron diseñados ios cuales podían generar porciones de las secciones 5' y 3' de la deleción de msbB que ocurre en VNP20009 como dos productos separados { ir.sbB-5 ' : directo 5' -GTG TGA GCTCGA TCA ACC AGC AAG CCG TTA ACC CTC TGA C-3' (SEQ ID NO: 41) y reverso 5' GTG TGC ItfaAlitfMfiÉklMIhMilMMM^ftÉiÉ^ ATG CGG GGG GCC ATA TAG GCC GGG GAT TTA AAT GCA AAC GTC CGC CGA AAC GCC GAC GCA C-3' (SEQ ID NO:42); y msbB-3' : directo 5' -GTG TGC ATG CGG GGT TAJA TTA AGG GGG CGG CCG CGT GGT ATT GGT TGA ACC GAC GGT GCT CAT GAC ATC GC-3' (SEQ ID NO: 43) y 5 reverso 5' -GTG TCT CGA GGA TAT CAT TCT GGC CTC TGA CGT TGT G- 3' (SEQ ID NO:44). Estos cebadores contienen también sitios de endonucleasa de restricción externo SacJ(5') y AvaJ(3') • para facilitar la clonación en los sitios Sacl y Salí de pCVD442 cuando estos dos fragmentos están unidos a través de 10 un sitio Sphl común y generan Notl , Pací, Sphl , Sfil y Dral , internos, con el objeto de facilitar la clonación de fragmentos de AD? en OmsbB para integración cromosómica • estable sin resistencia a los antibióticos (Figura 31). Este vector se conoce como pCVD4442-ms B (ver Figuras 32 y 33) . 15 Para clonar Tet -BRP-AB en pCVD4 2 -msbB, el AD? de plásmido de Tet -BRP-AB fue digerido por restricción y el AD? apropiado fue purificado y se efectúo una reacción de ligación que contenía dos estos componentes empleando T4 ligasa. La reacción de ligación fue después transformada en DH5-1 pir y • 20 colonias fueron tamizadas para determinar la presencia y orientación de Tet -BRP-AB. El clon Tet -BRR- ^B fue transformado en la cepa SM10 1 pir (Donnenberg y Kaper, 1991 supra ) y el plásmido recibió la designación de PCVD442-Tet- BRP-AB. Colonias de SM10 1 pir fueron tamizadas para en Tet - 25 BRP-1 B por reacción en cadena de polimerasa y un clon SM10 1 - . i .ni ! - 11 „Mt—tÉM,aa^„(.^M^|i^^^ pir pCVD 42-Tet-BRP-AB fue seleccionado para su utilización como un donador correspondiente para cepas de Salmonella . SM10 1 pir que contiene pCVD442-Jet -BRP -AB fue acoplado con una cepa YS50101 de Salmonella (un derivado espontáneo de la cepa resistente a la tetraciclina YS82 (Low et al . , 1999, supra) con resistencia realzada a agar de Difco MacConkey) por métodos estándares (Davis, R. W., Botstem, D., y Roth, J. R. 1980. Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) y seleccionado en placas que contienen 50 µg/mL de carbenicilina (carb) y 300 µg/mL de estreptomicina (strep) . Los clones YS50102-pCVD442-Tet-BRP-AB resultantes fueron revisados para el gen de pCVD442- Tet -BRP-AB por reacción en cadena de polimerasa. 24.2. TRANSFERENCIA DEL pCVD442-Tet-BRP-AB CROMOSQMICA.MENTE INTEGRADO EN 41.2.9 (Y51646) PARA GENERAR LA CEPA 41.2.9-Tet-BRP-AB Empleando el bacteriófago P22 (mutante Htl05/1 int-201; Davis et al., 1980), 41.2.9 fue transducido a la resistencia a carbenicilina utilizanao la cepa YS50132-Tet-BRP-AB como donadora. La presencia de los genes bla y sacB de pC7D442 permitió la selección de una cepa carb" (o bien amp suc" indicada 41.2.9-Tet-BRP-AB-l que contenía tanto los genes de OmsbB como DmsbB-Tet-BRP-AB (Figura 33, #3 . Las cepa 41.2.9-Tet-BRP-AB-1 fue colocada en placa en sucrosa de LB para seleccionar un derivadc de suc" carb para remover el gen OmsbB y dejar el gen Dmsr?B-Tet-BRP-AB de conformidad con los métodos de Donnenberg y Kaper, 1991, supra (Figura 33, #4) excepto que las placas de agar de LB-sucrosa fueron elaboradas sin NaCl y las placas fueron incubadas a una temperatura de 30° C. después del crecimiento de las colonias en estas placas, fueron reticuladas en una placa msbB y réplicas fueron colocadas en placas que contenían ya sea carbenicilina o sucrosa con el objeto de detectar la presencia de un clon que presentara los marcadcres de antibióticos y sucrosa. Los clones resultantes fueron revisados para la presencia del gen de Tet-BRP-AB por reacción en cadena de polimerasa. Un derivado de ese tipo que contiene el Tet-BRP-AB cromcsómicamente integrado y que no tiene sensibilidad a la sucrosa y resistencia a la carbenicilina fue indicado como 41.2.9-Tet-BRP-verotoxma AB. 41.2.9-Tet-BRP-verotoxina AB fue probado para citotoxicidad in vi tro empleando un ensayo de citotoxicidad de LDH estándar (Cytotox^®; Promega, Madiscr, Wisconsin) . Los resultados se muestran en la Figura 34, que demuestran las propiedades tóxicas de los clones 26 y 31 que expresan la verotoxina. Los clones 26 y 31 presentaron un porcentaje significativamente más elevado de citotoxicidad cuando fueron tratados con tetraciclina que cuando no fueron tratados con tetraciclma. 25. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE HEMOLISINA POR BACTERIA DIRIGIDA A TUMOR »--'" »• *" ^j^> El siguiente ejemplo demuestra que bacterias dirigidas a tumor pueden ser manipuladas para expresar proteínas hemolíticas como hemolisina constitutivamente o bajo un control inducible. 5 Las hemolisinas son proteínas citotóxicas bien conocidas que tienen la capacidad de lisar las células sanguíneas rojas (véase, por ejemplo, Beutin, 1991, Med. Microbiol, Immunol • 180:167-182) . SheA (Genbank Número EC0238954) es una hemolisina silenciosa encontrada en la mayoría de E. coli de 10 tipo silvestre que normalmente no es expresada (Fernández, et ai., 1998, FEMS Microbiol Lett 168:85-90). SheA (a.k.a. hlyE; Genbank Número U57430) fue clonada por reacción en cadena de polimerasa empleando los siguientes cebadores (directo) 5' - TTTTTTCCAT GGCTATTATG ACTGAAATCG TTGCAGATAA AACGG-3' (SEQ ID 15 NO: 45) y (reverso) 5' -TTTTTTAAGC TTCCCGGGTCAGACTTCAGGTACCTCAAAG AGTGTC-3' (SEQ ID NO: 46) a partir de E. coli de tipo silvestre (cepa 25007, Yale University E. coli Genetic Stock Center) bajo condiciones estándares de reacción en cadena de polimerasa. El producto 20 de reacción en cadena de polimerasa del tamaño correcto fue clonado en los sitios Ncol y HindlII de ptrc99a (Pharmacia) para colocarlo bajo el promotor tre parcialmente constitutivo. El Producto de reacción en cadena de polimerasa fue también clonado en el vector tet-bgal-Z-term (descrito 25 supra) cortado con Ncol y EcoRV. E. coli DH5a (Gibco) fue MMMaMa|MÍMkiaÉaH transformado con los plásmidos y colocado en placas de agar de sangre (agar de soya tríptica con ?% de sangre de borrego; BioMerieux, Lombard, IL) con y sin la adición de 0.2 ug/ml de tetraciclina. Colonias positivas fueren determinadas como las colonias que contenían halos de zona clara alrededor de la colonia lo que indica hemolisis. Colonias positivas fueron sometidas a purificación estándar de plásmido y transformadas en Salmonella YS501 y tamizadas de nuevo para halos. La formación constitutiva de halo se muestra en la Figura 35 (2A y 2B) para el constructo trc99a en donde el halo es observado con o sin tetraciclina agregada. La formación de halo dependiente de tetraciclina se muestra en la Figura 35 (3A y 3B) para SheA impulsado por tetraciclina-promotor, en donde no observa halo sin la adición de tetraciclina. Estos resultados demuestran que una bacteria dirigida a tumor puede expresar una prcteína hemolítica, ya sea constitutivamente o bien bajo un control inducible. 26. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE METIONASA ?OR BACTERIA DIRIGIDA A TUMOR El siguiente ejemplo demuestra que bacteria dirigida a traor atenuada, per ejemplo Salmonella puede ser manipulada para expresar metionasa. La metionaea es una enzima que degrada la metionina, un aminoácido esencial necesario para el crecimiento de tumor. Métodos han sido descritos para la administración de metionasa purificada para inhibir el crecimiento de tumor o para administrar un ADN o vector viral que codifica para la metionasa (Publicación Internacional No. WO00/29589 por Xu y Tan) . XU y Tan no divulgaron métodos para utilizar vectores bacterianos específicos para tumor para la administración de la metionasa y, para lograr eficacia con proteína purificada, se requieren de grandes cantidades de metionasa. Un método novedoso para suministrar metionasa directamente a los tumores es expresar la enzima utilizando bacterias dirigidas a tumor. Los siguientes cebadores fueron generados para metionasa a partir de Pneudomas putzda basado en Genbank No. L43133; Directo: METH-XHOI 5'-CCGCTCGAGATGCACGGCTCCAACAAGCTCCCCA-3' (SEQ ID NO: 47); Y Reverso: METH-BAM 5'-CGCGGATCCTTAGGCACTCGCCTTGAGTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 48) Utilizando los cebadores presentados arriba (4 mM) y una colonia aislada de Pneudomas pu tida como templado, la secuencia de metionasa fue amplificada por reacción en cadena de pciimerasa bajo las siguientes condiciones: Un ciclo de 94° C durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de: 94° C durante 1 minuto, 60° C durante 1 minuto, y 72° C durante 2 minutos. Un paso final de amplificación de 72° C durante 10 minutos fue incluido como el último paso de la reacción en cadena de polimerasa. Los productos de reacción en cadena de polimerasa fueron reducidos en 0.8% 1XTAE gel de agarosa y un producto de reacción en cadena de polimerasa del tamaño esperado para la metionasa (aproximadamente 1196 pares de bases) fue identificado. La banda fue removida del gel y purificada empleando el kit de extracción de gel Qiagen. Tanto el vector pSP72 como el gel de metionasa purificado el gel aislado obtenido arriba fueron digeridos con las enzimas de restricción Xhol y Bam Hl . El vector digerido y ia metionasa fueron reducidos en un gel de agarosa 0.8% 1XTAE. Los productos de la digestión que corresponden al vector linearizado y al gen de metionasa digerido fueron removidos del gel y purificado empleando el kit de extracción de gel Qiagen. El vector linearizado y el inserto (metionasa) fueren ligados juntos empleando T4 ligasa. La mezcla de ligación fue transformada en células Dh5a E. coli por método de choque térmico. Después de la recuperación, las células fueron colocadas en placas de medio LB que contenía 100 mg/r.L de ampicilina (Amp) para seleccionar las células que contenían el vector pSP72 intacto. Colonias resistentes a ia ampicilir.a fueron identificadas y la presencia del vector pSP72 que contiene el gen de metionasa fue confirmada por preparacicn de plásmido utilizando un kit de mini-preparación Qiagen y digerido con las enzimas Eco Rl y 3sp Hl . El clon #9 fue enviado para secuenciamiento para las instalaciones de secuenciamiento de Yale, Yale University School of Medicine. 3L * ? -t¡, El secuenciamiento fue efectuado empleando cebadores de secuenciamiento SP6 (directo) y T7 (reverso) los resultados demuestran que el 100% de la secuencia corresponde a la secuencia publicada de metionasa a excepción del codón de terminación TGA que fue cambiado a TAA por reacción en cadena de polimerasa. La actividad metionasa puede ser determinada empleando el ensayo de metionasa descrito en Hori et al . , 1996, Cáncer Research 56:2116-2122. 27. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE PRQTEÍNA APOPTINA COMO UNA FUSIÓN DE TAT EN BACTERIA DIRIGIDA A TUMOR ATENUADA El siguiente ejemplo de demuestra que una bacteria dirigida a tumor atenuada puede ser manipulada para expresar y secretar proteínas de fusión que comprenden una molécula efectora y un péptido de transporte, por ejemplo TAT, antenapedia, VP22, y MTS de FGF de Kaposi. 27.1 CONSTRUCCIÓN DE VECTORES TAT-APOPTINA La apoptina proteína de virus de canario (CAV) induce la apóptosis en células necplásticas, cuando se administra por vectores adenovirales (véase, por ejemplo, Noteborn et al., 1992, Gene Therapy 6:882-892). Para generar una proteína que puede ser transcrita er. el citoplasma de Salmonella y que tenga la capacidad de ser transportada al núcleo de una célula tumoral y provoca la apóptosis, la proteína apoptina fue fusionada con un péptido derivado de la proteína TAT del virus de ia inmunodeficiencia humana (VHI) véase, por ejemplo, Schwartze et al., 1999, Science 285:1569-1572). Puesto que fusiones de proteína TAT son también funcionales cuando se fusionan sobre aminoácidos de poli-histadina (hexahistadina: que incrementan la carga positiva y facilitan la purificación de proteína (Schwartze et al . , 1999, supra), ia fusión TAT-apoptina fue generada con y sin la hexahistadina (figura 36A y B) . Además, la fusión TAT-apoptina puede ser generada con y sin una secuencia de señal OmpA-8L (figura 36A y C) . La apoptina y apoptina de hexahistadina son ensambladas utilizando oligonucleótidos de empalme. La secuencia de ácido nucleico que codifica la apoptina fue generada por reacción en cadena de pclimerasa empleando los siguientes oligonucleótidos: TAPI: 5 ' -GATCCCATGGGG CTTAATGGCAG AAAAAAACGC CGTCAGCGCC GTCGCATTGAA CGCGCTGCAG GAAGATACCC CGCCGGGCCC GTCCACCGTG TTTCGCCCGC CG-3' (SEQ CD NO: 49^ TAP 2: 5 ' -GGGACAGGGT GATGGTGATG TG CCCGCGATGC CGATGCGGAT TTCGCGGCAA TGCGGGGTTT CCAGCGGGCG GGAGGAGGT GGCGGGCGAA ACACGGTGGA CGG-3' (SEQ ID NO: 50) TAP 3: 5 ' -GGCATCGCGG G ATCACCAT CACCCTGTCC CTGTGCGGCT GCGCGAACGC GCGCGCGCCG ACCCTGCGCT CCGCGACCGC GGAATAACTCC GAAAACACCG GC-3ASEQ CD NO: 51) TAP 4: 5 ' -GCCATATTCG GACGGATCGC AGGAGCGTTT TTTGGAACGGC GGTTTCGGCT GATCGGTGCG CAGATCCGGG ACGTTTTTA AGCCGGTGTT TTCGGAGTTA TCCGCGGTGG C-3' (SEQ ID NO: 52) TAP 5: 5 ' -CCTGCGATCC GGTCCGAATAT CGCGTCTCCG ACTGAAAGA ATCCTGATC ACCACCACCC CGTCCCGCCC GCGCACCGCC CGCCGCTGCA TCCGCCTCTG AAAGCTTCAT G-3' (SEQ ID NO: 53) TAP 6: 5 " -CATGAAGCTT TCAGAGGCGG ATGCAGCGGC GGGGGGTGCG C-3' (SEQ ID NO: 54) La secuencia de ácido nucleico que codifica la versión que contiene hexahistadina de la proteína de fusión TAT-apoptma fue generada empleando oligonucleótidos TAP 2-TAP€ y oligonucleótidos TAP6HI (5'-GATCCCATGG CTCATCACCA TCACCACCAT TATGGCCGCA AAAAACGCCG TCAGCGCCGT CGCATGAACG CGCTGC.-.GGA AGATACCCCG CCGGGCCC-3'; SEQ ID NO: 55). La secuencia de ácido nucleico que codifica la versión que contiene OmpA.5l de la proteína de fusión TAT-apoptina es generada a partir del producto de reacción en cadena de polimerasa de los oligonucleótidos TAP1-TAP6 por reacción en cadena de polimerasa empleando el oiigonucleótido TAP6 y el oligonucleótido ompdLFl (5' -GATCCCATGG CTAAAAAC GGCTCCC-GCG CTTCTGCTCT TGCTGTTAGC GCTGACTAGT GTAGCGCAGG CCTATGCCCG CAAAAAACGC CGTCAGCGCC-3 ' ; SEQ ID NO: 56). Cada oligonucleótido es formulado en una solución r.adre que se encuentra en concentración 4 µM. Empleando perlas de reacción en cadena de polimerasa premezcladas (Pharmacia, perlas listas para emplearse) , se utilizaron 2 µi de cada 1 A i t i oligonucleótido. La reacción en cadena de polimerasa consistió de un ciclo a 95° C durante 5 minutos; 35 ciclos a 95° C durante 1 minuto, 60° C durante 1 minute, 72° C durante 1 minuto; y un ciclo a 72° C durante 10 minutos. La reacción en cadena de polimerasa fue después extraída con fenol/cloroformo, precipitada con efanol, redisuelta en agua y sometida a digestión de restricción con Neo Ien Hind III. El producto de reacción en cadena de polimerasa digerido por restricción fue reducido por electrofcresis en gel y el producto del tamaño correcto (aproximadamente 420 y 450 pares de bases para TAT-apoptina y hexahistadina-TAT-apoptina, respectivamente) fue removido del gel y aislado empleando técnicas estándares de biología molecular. Estos productos son ligados en ptrc99a (Pharmacia) digeriao por Neo I y Hind III y resultan en el constructo ptrc99a-CAT-apoptina. La secuencia correcta de ADN fue obteniaa tanto para TAT-apoptina (figura 36) como para nexahistaama-TAT-apoptina (figura 38) . 27.2 DEMOSTRACIÓN DE LA SECRECIÓN Y ABSORCIÓN DE AAT-APOPTINA Bacterias dirigidas a tumor atenuadas sor. transformadas empleando el constructo ptrc99a-TAT-apcpt?r.a por técnicas conocidas (por ejemplo, por choque térmico z electroporación) y cultivadas en medio. El sobrenadante del c-ltivo bacteriano es probado para la presencia de TAT-apeptma empleando técnicas conocidas por parte de los expertos en la materia (por ejemplo, análisis Western blot o ELISA) . Una vez confirmada la presencia de TAT-apoptina en el sobrenadante del cultivo bacteriano, el sobrenadante del cultivo bacteriano es incubado con células de mamífero (por ejemplo, células NIH3T3, CHO, 293, Y 293 T) y la presencia de TAT-apoptina dentro de las células es confirmada por ensayos ae apoptina conocidos por parte de los expertos en la materia. 27.3 DEMOSTRACIÓN DE LA ABSORCIÓN DE TAT-APQPTCNA INTRATUMORALMENTE Bacterias dirigidas a tumor atenuadas manipuladas para expresar TAT-apoptina o apoptina son administradas de manera intravenosa a un modelo de tumor B16. Los ratones eon sacrificados varios días después de la administración de las bacterias y se determinaron los pesos de los órganos. Tumores son ensayados para determinar la presencia y localización de TAT-apoptina o bien apoptina utilizando ensayos de apóptoeis (por ejemplo, DNA laddering and Fluorescein In Situ Ceil Death Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, jAlemania ) conocidos por parte de los expertos en la materia. Además, el tamaño de los tumores es ensayado para determinar la actividad anti-tumor de TAT-apoptina. Los tumores son también homogeneizados y colocados en placas para determinar las unidades formadoras de colonias (c.f.u.). 28. EJEMPLO: EFICACIA DE LA COMBINACIÓN DE VNP20009 Y AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO DE CARCINOMA PULMCAAR M27 EN RATONES El siguiente ejemplo demuestra que la administración de bacterias dirigidas a tumor atenuadas en combinación con un agente quimioterapéutico puede actuar sinérgicamente o bien aditivamente para inhibir el crecimientc de tumores sólidos, por ejemplo carcinoma pulmonar. 28.1. EFICACIA DE LA COMBINACIÓN DE VNP20009 Y CITOXA O 0 VNP20009 Y MITOMICINA C SOBRE EL CRECIMIENTO DE CARCINOMA PULMONAR M27 EN RATONES Células de carcinoma pulmonar de murino M27 almacenadas en nitrógeno líquido (IxlO'Vml x ml) fueron recuperadas mediante el descongelamiento rápido de las células a 37° C y su cultivo con 10 ml de medio de cultivo DMEM que contenía suero de becerro fetal al 10% (FCS) a una temperatura de 37° C, 5% de CO . Después de pasar las células durante 2 generaciones, células M27 en fase log fueron removidas por tripsinización, lavadas con 1 x PBS, y reconstituidas a 2.5x10" células/ml con 1 x PBS para implante de tumor. Una suspensión de células M27 fue implantada en 100 ratones C57BL76 (hembras, edad 8 semanas, 20 g; 5 x 10" células/ratón) subcutáneamente en el flanco derecho el día 0. Los ratones fueron divididos de manera aleatoria en 10 grupos, cada uno consistiendo de 10 ratones . La cepa VNP20009 de Salmonella fue diluida a 5x10' CFU/ml con 1 x PBS con nuestros procedimientos estándares de dilución.
Cada ratón recibió de manera intravenosa 0.2 ml de Salmonella diluida AxlO CFU/ratón) el día 12 de conformidad con la tabla 6, infra . Para determinar el número real de bacterias inyectadas, las suspensiones bacterianas 5x10° CFU/ml fueron diluidas adicionalmente a 1x10' CFJ/ l y colocadas en placas en agar nutriente (placas MsbB; Publicación Internacional No. WO 99/13053) . Las colonias formadas fueron contadas al día siguiente. La mifo icina C (Sigma) y citocina (Sigma) fueron administradas a ratones de conformidad con la tabla 7, infra . La segunda dosis de mitomicina C fue administrada a los grupos de combinación el día 22 pero no a los grupos tratados con mitcr.icina C solamente debido al gran tamaño del tumor. 200 mpk de Cipro (Bayer Inc., West Haven, CT) fueron administrados a cada ratón tratado cen VNP20009 sola o VNP200C9 + fármacos quimioterapéuticos puesto que reacciones tóxicas severas fueron observadas en grupos tratados con VNP200C9 + citoxano. El volumen del tumor fue medido dos veces por semana hasta el final del experimento. El comportamiento, apariencia y mortalidad de los animales se observaron diariamente. Los ratones fueron mantenidos en un laboratorio limpio a temperatura constante. La cama fue cambiaaa dos veces a la semana y los ratones recibieron suficiente alimento y agua potable. Tabla 23C Grupo Número de ratones Sin tratamiento, control 3 mpk mitomicina C, i.v., día 15 10 5 mpk mitomicina C, i.v., día 15 10 5 150 mpk citoxano, i.p., día 15 10 200 mpk citoxano, i.p., día 15 10 P20009, lxlOVratón i.v., día 12 10 • VNP20009, lxlOVratón i.v., día 12+3 10 mpk mitomicina C, i.v., días 15 y 22 10 VNP20009, lxl06/ratón i.v., día 12+5 10 mpk mitomicina C, i.v., días 15 y 22 VNP20009, lxlOVratón i.v., día 12+150 10 mpk citoxano, i.p., día 15 VNP20009, lxlOVratón i.v., día 12+200 10 15 mpk citocina, i.p., día 15 Como se muestra en la figura 39, el tratamiento de combinación con VNP2 C 009 + citoxano inhibió el crecimiento del carcinoma pulmonar M27 más que el tratamiento con VNP20009 sola o que el tratamiento con citoxano solo. Como se 20 muestra en la figura 40, la combinación de VNP20009 + mitomicina C inhibió el crecimiento del carcinoma pulmonar M27 más que la mitomicina C sola. Sin embargo, la combinación de VNP20009 + mitoiricina C no inhibió el crecimiento del carcinoma pulmonar M27 más que el tratamiento con VNP20009 25 sola (figura 40) . Estos resultados sugieren que la administración de bacterias dirigidas a tumor atenuadas en combinación con un agente quimioterapéutico puede actuar de manera sinérgica o aditiva para inhibir el crecimiento de tumores sólidos tales como carcinoma pulmonar. 5 28.2. EFICACIA DE LA COMBINACIÓN DE VNP200C 9 Y CISPLATI?A SOBRE EL CRECIMIENTO DE CARCINOMA PULMONAR M2"7 EN RATONES Células de carcinoma pulmonar de murino M27 almacenadas en • nitrógeno líquido (lxlO'Vml x 1 ml) fueron recuperadas mediante descongelación rápida de las células a una 10 temperatura de 37° C y cultivadas con 25 ml de medio de cultivo DMEM que contenía 10% suero de becerro fetal (FCSí a 37° C, 5% co;. Después de pasar las células durante dos generaciones, las células M27 en fase log (saturación de aproximadamente 90-95%) fueron removidas por tripsinizacicn, 15 lavadas con 1 x PBS, reconstituidas a 2.5x10 células/ml con 1 x PBS para implante de tumor. Una suspensión de células M27 (0.2 ml) fue implantada en 36 ratones C57BL/6 (hembras, ecad: 8 semanas, 20 g; 5xl0J células/ratón) subcutáneamente en el flanco derecho el día 0. Los ratones fueron divididos de 20 manear aleatoria en grupo, cada grupo consistiendo de 9 ratones . La cepa VNP20009 de Salmonella fue diluida a 5x10^ CFU/ l con 1 x PBS con nuestros procedimientos de dilución estándares. Cada ratón recibió a través de la vena de la cola 0.2 ml de 25 Salmonella (lxl0J CFU/ratón) el día 12 de conformidad cor. la tabla 8, infra) . Con el objeto de determinar el número real de bacterias inyectadas, las suspensiones bacterianas de 5xlOc CFU/ml fueron diluidas adicionalmente a lxl0J CFU/ml y colocadas en placas de MsBb. Las colonias formadas fueron contadas el día siguiente. La cisplatina fue administrada a ratones el día 14, dos días después de la inyección de bacterias (tabla 8, infra) . La cisplatina fue diluida 0.5 mg/ml con solución salina normal antes de la administración. El volumen del tumor fue medido dos veces por semana hasta el final del experimento. Se observó diariamente el comportamiento, la apariencia y la mortalidad de los animales. Los ratones fueron mantenidos en un laboratorio limpio a temperatura constante. La cama fue cambiada dos veces por semana y los ratones recibieron suficiente alimento y agua potable. Tabla 8 Grupo Número de ratones Control (sin tratamiento) 9 VNP20009, lxlOVratón i.v., 9 el día 12 5 mpk cisplatina, o.p. qw 9 x 2, el día 14, 19 VNP20009, lxlOVratón i.v., 9 el día 12 + 5 mpk cisplatina, i.p., qw x 2, el día 14, 19, 33 Como se muestra en la figura 41, el tratamiento de combinación con VNP20009 + cisplatina inhibió el crecimiento del carcinoma pulmonar M27 más que el tratamiento con VNP20009 sola o bien que el tratamiento con cisplatina sola. Estos resultados sugieren que la administración de bacterias dirigidas a tumor atenuadas en combinación con un agente quimioterapéutico, por ejemplo cisplatina puede actuar sinérgicamente o de manera aditiva para inhibir el crecimiento de tumores sólidos tales cerno carcinoma pulmonar. La presente invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades específicas descritas aquí. Varias modificaciones de la invención además de las descritas aquí serán aparentes a los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Tales modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Varias publicaciones se citan en este documento, sus divulgaciones se incorporan por referencia en su totalidad. mil • • . GI --i- f-- ,-? , - "¿?üáim ^-^^mam^^?m- 120> COMPOSICIONES i META A PARA ATACA :UMCRIC Y ENAGAEG DE MOLÉCULAS DETERMINANTES <130> 8002-059-228 <15i 1999-10-04 • <.150 60/157, 637 <151> 1999-10-04 <160> 61 <170> FastSEQ for Windows Version J.u <211> 26 <212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador directo <400> 1 gaagatcttc cggaggaggg gaaatg 26 20 <210> 2 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Arti f icial <220> 25 <223> Cebador reverso Jtü "^*t^ <400> 2 cgggatccga gctcgagggc ccgggaaagg atctaagaag atcc 44 <210> 3 <211> 477 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) (474; <400> 3 a;g gta cgt age tcc tct ccc acr ceg tcc gat aag ceg gtt gct cat 43 Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala Kis 1 5 10 15 gta gtt gct aac cct cag gca gaa ggt cag ctg cag tgg ctg aac cgt 96 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg 20 25 30 cgc gct aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtt gag etc cgt gat aac cag Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 etc gtg gta cct tct gaa ggt ctg tac ctg atc tat tct caá gta ctg 192 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu He Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 ttc aag ggt cag ggc tgc ceg teg act cat gtt ctg ctg act cae acc 240 Phe Lys Gly Glr. Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr 65 ' 70 75 80 atc age cgc att gct gta tct tac cag acc aaa gtt aac ctg ctg age 238 He Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 85 90 95 gct atc aag :c: ceg tgc cag cgn gaa act ccc sag ggt gca gaa gcg Ala He Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala 100 105 110 aaa cea tgg tat gaa ceg atc tac ctg ggt ggc gta ttt caá ctg gag 3 34 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 V**^ J^„ . A „ j lifcjjbi .43 aaa ggt gac cgt ctg tcc gca gaa atc aac cgt cct gac tat cta gac 432 Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 135 140 ttc gcc caá tct ggc cag gcg tac ttc ggt att ate gca c g 4 " Phe Ala Glu Ser Gly Gln Va l T r Phe Gly He He Ala Leu 145 150 155 taa 477 • 10 <210> 4 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 15 Xet Vai Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp L>s Pro Val Ala ,.?s 1 5 10 15 Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg 20 25 30 Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln 35 40 45 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu T/r Leu He Tyr Ser Gln Val Leu 50 55 60 Phe Lys Gly Gln Gly Cys Fro Ser Thr His Val Lej Leu Tr His Thr 65 70 75 80 He Ser Atg He Ala Val Ser Tyr Cln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser 20 85 90 95 Aia He L,s Ser Pro Cys Gli ?rg Giu Thr Pro Glu Gly Ala Giu Ma 100 105 110 Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu 115 120 125 Lys Gly As? Arg Leu Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp 130 " 135 140 Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly He He Ala Leu 1 5 150 15 25 <210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 5 <220> <223> Cebador directo <400> 5 • ccgacgcgtt gacacctgaa aactggag 28 <210> 6 10 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial • <220> <223> Cebador reverso 15 <400> 6 ccgacgcgtg aaaggatctc aagaagatc 29 <210> 7 <211> 543 <212> ADN 20 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Constructo de fusión <221> CDS <222> (1) (540) 25 <400> 7 atg aaa aag acá gct atc gcg acc gca gtg gca ctg gcc ggc ttc gct 48 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 acc gta gcg cag gcc cat atg gca cgt age tcc tct cgc act ceg tcc 96 Thr Val Ala Gln Ala His Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser 20 25 30 gat aag ceg gtt gct cat gta gtc gcc aac cct cag gca gaa ggt cag 144 Asp Lys Pro Val Ala His Val Val ^la Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln 35 40 45 ctg cag tgg ctg aac cgt cgc gcc aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtc 192 Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Giy Vai 50 55 60 gag etc cgt gat aac cag etc gcg gta cct tct gaa ggt ctg tac ctg 240 Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu 65 70 75 80 atc tat tct caá gta ctg ttc aag ggt cag ggc tgc ceg teg act cat 288 ? ?le Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His 85 90 95 gtt ctg ctg act cae acc atc age cgt att gct gta tct tac cag acc 336 Val Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gln Thr 100 105 110 • aaa gtt aac ctg ctg age gct acr aag tct ceg tgc cag cgt gaa act 384 Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Tnr 115 12: 125 5 ccc gag ggt gca gaa gcg aaa cea tgg tat gaa ceg atc tac ctg ggt 432 Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Prc Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly 130 135 140 ggc gta ttt caá ctg gag aaa ggc gac cgc ctg tcc gca gaa atc aac 460 Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Giu He Asr. 145 150 155 16. cgt cct gac tat cta gat ttc gcc gaa cct ggc cag gtg tac ttc ggt 528 Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Pne Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr P.ie Gly 165 170 175 • 20 att atc gca ctg taa He He Aia Leu 180 <210> 8 <211> 180 <212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial •j11i%¡fi¡A-fct.t. .^¡^ . . . .. .. .. . . .a,.. . . ... . . . „ . . ....... .......~A, - .,.,*..-*...->. - A -i, 400> 8 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala His Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser 20 25 30 Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln 35 40 45 Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val 50 55 60 Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu 65 70 75 80 He Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His 85 90 95 Val Leu Leu Thr His Thr He Ser Arg He Ala Val Ser Tyr Gln Thr 100 105 110 Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr 115 120 125 Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly 130 135 140 Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn 145 150 155 160 Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly 165 170 175 He He Ala Leu 180 <210> 9 <211> 801 <212> ADN <213> Secuencia Arti ficial <220> <223> Constructo de fusión <221> CDS <222> ( 1 ) . . . ( 798 ) <400> 9 atg aaa aag acá gct atc gcg act gca gtg gca ctg gct ggt t tc gct 48 Met Lys Lys Thr Al a He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 5 10 15 acc gta gcg cag gcc cat atg gct aac gag ctg aag cag atg cag gac 96 Thr Val Ala Gln Ala His Met Ala Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp 20 25 30 aag tac tcc aaa agt ggc att gct ,tgt ttc tta aaa gaa gat gac agt 144 Lys Tyr Ser Lys Ser Gly He .Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser 35 40 45 tat tgg gac ccc aat gac gaa gag agt atg aac age ccc tcc tgg caá 192 Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln 50 55 60 gtc aag tgg caá etc cgt cag etc gtt aga aag atg att ttg aga acc 240 Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met He Leu Arg Thr 65 70 75 80 tct gag gaa acc att tct acá gtt caá gaa aag caá caá aat att tct 288 Ser Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Glp Asn He Ser 85 90 95 ccc c a gtg aga gaa aga ggt cct cag aga gta gca gct cae ata act 336 Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His He Thr 100 105 110 ggg acc aga gga aga age aac acá ttg tct tct cea aac tcc aag aat 384 Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn 115 120 125 gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac tcc tgg gaa tea tea agg agt 432 Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys He Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser 130 135 140 ggg cat tea ttc ctg age aac ttg cae teg agg aat ggt gaa ctg gtc 480 Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val 145 150 155 160 ate cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc tat tcc caá acá tac ttt cga 528 He His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr He Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg 165 170 175 ttt cag gag gaa ata aaa gaa aac acá aag aac gac aaa caá atg gtc 576 Phe Gln Glu Glu He Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val 180 35 190 caá tat att tac aaa tac acá agt tat cct gac cct ata ceg ttg atg Gln Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro He Leu Leu Met 195 200 205 . »-A.» »tAÍÍ..> ,.t..l..? aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct aaa gat gca gaa tat gga etc 572 Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys .?sp Ala Giu Tyr Gly Leu 210 215 220 tat tcc atc tat caá ggg gga ata ttt gag etc aag gaa aac gac aga 720 Tyr Ser He Tyr Gln Gly Giy He' Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 225 230 235 240 att ttt gtt tct gta acá aat gag cae ttg ata gac atg gac cat gaa 768 He Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu He Asp Mee Asp His Glu 245 250 255 gcc age ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt ggc taa 801 Ala Ser Phe Phe Gly Aia Phe Leu Val Gly 260 265 10 <210> 10 <211> 266 • <212> PRT <213> Secuencia Artificial 15 <400> 10 Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Aia Giy Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala His Met Ala Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp 2C 25 30 Lys Tyr Ser Lys Ser Gly He Ala Cys Phe Leu Lys Giu Asp Asp Ser 35 40 45 Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln • 20 50 55 60 Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Mee lie Leu Arg Thr 65 70 75 80 Ser Glu Glu Thr He Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn He Ser 85 90 95 Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His He Thr 100 105 110 Gly Thr Arg Giy Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn 115 120 125 Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys He Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser 25 130 135 140 Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val 145 150 55 160 He His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr He Tyr Ser Gln thr Tyr Phe Arg 165 170 175 Phe Gln Glu Glu He Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val 180 185 190 Gln Tyr He Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro He Leu Leu Met 195 200 205 Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu 210 21S 220 Tyr Ser He Tyr Gln Gly Gly He Phe Giu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 225 230 235 240 He Phe Val Ser Val Thr Asn Glu Kis Leu He Asp Met Asp His Glu 245 250 255 Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 260 265 <210> 11 <211> 265 <212> ADN <213> Secuencia Arti f icial <220> <223> Constructo de fusión <221> CDS <222> ( 1 ) . . . ( 462 ) <400> 11 atg aaa aag acg gct ctg gcg ctt ctg etc ttg ctg tta gcg ctg act 48 Met LYS LYS Thr Ala Leu A^a Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu thr 1 5 10 15 agt gta gcg cag gcc gct cct act age teg age act aag aaa act caá 96 Ser Val Ala Gln Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln 20 25 30 ctg caá ttg gag cat ctg ctg ctg gat ctg cag atg att ceg aat ggc 144 Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly 35 40 45 atc aat aac tac aag aac cct aag ctg act cgc atg ctg act ttc aaa 192 He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys 50 55 60 ttc tac atg ceg aaa aag gct acc gag etc aaa cat etc cag tgc ctg 240 Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu 65 70 75 80 gaa gag gaa ctg aag ceg ctg gag gaa gta ctt aac ctg gca cag tct 288 Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser 85 90 95 aag aac ttc cae ctg cgc ceg cgt gac ctg atc tcc aac atc aat gta 336 Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val 100 105 110 atc get ctt gag ctg aag gga tcc gaa acc acc ttc atg t c gaa tac 384 He Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr 115 120 125 gct gac gaa acc gcc acc att gtg gag ttc ctg aac cgc egg atc acc 432 -LQ Ala Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr 130 135 140 ttt gcc caá teg atc att age acg tta act taa 465 Phe Ala Glr. Ser He He Ser Thr Leu Thr 145 150 5 <210> 12 <211> 154 <212> PRT <213> Secuencia jArtificial <400> 12 0 Met Lys Lys Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ser Val Ala Glr. Ala Aia Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin 20 25 30 Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly 35 40 45 He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys 50 55 60 Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser 5 35 90 95 ...A. . . ,_ - Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val 100 105 110 He Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Giu Thr Thr Phe Mee Cys Glu Tyr 115 120 1 5 Ala Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe Leu Asn Are Trp He Thr 130 135 1 ° Phe Ala Gln Ser He He Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 13 <211> 465 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Constructo de fusión <221> CDS <222> ( 1 ) . . . ( 462 ) <400> 13 atg aaa cag teg act ctg gcg ctt ctg etc ttg ctg tta gcg ctg act 48 Met Lys Gln Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr 1 5 10 15 agt gtg gcc aaa gcg cct cct act age ecg age act aag aaa act caá 96 Ser Val Ala Lys Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Glr. 20 25 30 ctg caá ttg gag cat ctg ctg ctg gat ctg cag atg att ctg aat ggc 144 Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly 35 40 45 atc aat aac tac aag aac cct aag ctg act cgc atg ceg act e tc aaa 192 He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys 50 55 60 ttc tac acg ceg aaa aag gct acc gag ccc aaa cat etc cag tgc ctg 240 Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu leu Lys His Leu Gln Cys Leu 65 70 75 80 25: gaa gag gaa ctg aag ceg ctg gag gaa gta ctt aac ctg gea cag tct Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Al 288 a Gln Ser 85 90 95 aag aac ttc cae ctg cgt ceg cgt r atc gtt ctt gag ctg aag gga tcc gá a acc acc eec atg cgc caá He Val Leu Glu Leu Lvs Glv Ser r?.: ca Lys Gly Ser Glu Thr Thr Ph 3 34 115 'ne Met Cys Glu Tyr .20 125 gct gac gaa acc gcc acc att gtg gag ttc ctg aac cgt tgg atc aaccc . 32 Ala Asp Glu Thr Ala Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Th 130 135 140 ttt scc caá teg atc att age acg tea act taa Phe Ala Gln Ser He He Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 14 <211> 154 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 14 Met Lys Gln Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Thr 1 5 10 15 Ser Val Ala Lys Ala Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gir. 20 25 30 Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met He Leu Asn Gly 35 40 45 He Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys 50 55 60 Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu siu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser 85 90 95 Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu He Ser Asn He Asn Val 100 105 110 He Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Mee Cys Glu Tyr 115 120 125 Ala Asp Glu Thr Ala Thr He val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He Thr 130 135 140 <210> 15 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 5 <220> <223> Cebador directo <400> 15 agtctagaca atcaggcgaa gaacgg 26 <210> 16 10 <211 > 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial • <220> <223> Cebaaor directo 15 <400> 16 agccatggag tcaccctcac ttttc 25 <210> 17 <211> 31 <212> ADN • 20 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebaaor directo <400> 17 ggatccttaa gacccacttt cacatttaag t 31 25 <210> 18 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 5 <223> Cebador reverso <400> 18 ggttccatgg ttcacttttc tctatcac 28 <210> 19 <211> 33 10 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> • <223> Cebador directo <400> 19 15 gtgtccatgg ggcacagcca ccgcgacttc cag 33 <210> 20 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial • 20 <220> <223> Cebador reverso <400> 20 acacgagctc ctacttggag gcagt atga agct 34 <210> 21 25 <211> 72 - H¡ r- ~. íMáia«M aai^M^^^Mtt <212> ADN <213> Secuencia Arti ficial <220> <223> Cebador directo 5 <400> 21 gtgcccatgg cccggcgggc aagtg eeggg ac cgaccacc atcatcatca tcatcacagc 60 caccgcgact te 10 <210> 22 <211> 35 <212 > ADN • <213> Secuencia Arti f icial <220> 15 <223> Cebador reverso <400> 22 gtgcggatcc ctacttggag gcag-catga agctg 35 <210> 23 <211> 16 • 20 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 23 Met Ala Arg Arg Ala Ser Val Gly Thr Asp His His His His His His 1 5 10 15 25 <210> 24 Ui ijUíih ^fciY <211> 22 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> 5 <223> Secuencia de péptido Ti'P 13.40 <400> 24 • Ala Tyr Arg Tro Arg Leu Ser His Arg Pro Lys Thr Gly Phe He Arg 1 ' 5 10 15 Val Val Met Tyr Glu Giy 20 10 <210> 25 <211> 66 <212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia de nucleótido que codifica TÍP13.40 <400> 25 gcgtaccgct ggcgcctgtc ccatcgcccg aaaaccggct ttatccgcgc gg.ga a • 20 aaaaac <210> 26 <211 > 101 25 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 26 gtgtactagt gtggcgcagg cggcgtaccg ctggcgcccg tcccatcgcc cgaaaaccgg 60 ccctatccgc gcggcgacgt acgaaggcta aggatccgcg c 101 <210> 27 <211> 101 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 27 claa a rt tta9CCttC9 Cacatcac" cgcggataaa gccggttttc gggcaacccg 60 acaggcgcca gcggcacgcc gcccgcgcca caccascaca c " " 10i <210> 28 <211> 101 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 28 ??^A^^^?¡^ ^mll?tmt??álßa?¡? Met Ser Ser Ala Ala Gly Phe Cys Ala Ser Arg Pro Gly Leu Leu Pne 1 5 10 15 Leu Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Val Val Ala Phe Ala Ser Ala Glu 20 25 30 Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr Ser 35 40 45 Gln Val Arg Pro Arg His He Thr Ser Leu Glu Val He Lys Ala Gly 50 55 60 Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu He Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 65 70 75 80 Lys He Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys He He Lys R 3^5 90 95 Lys Leu Leu Glu Ser 100 <210> 29 10 <211> 106 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> • <223> Ol igonucleot do 15 <400> 29 ct tcactagt gtggcgcagg cgaacggccg caaaatctgc ctggacccgc aggcgccgcc 60 gtacaaaaaa atcatcaaaa aactgctgga aagccaagga tccgcg 106 20 <210> 30 • <211 > 106 <212> ADN <213> Secuencia Artif icial <220> 25 <223> Ol igonucleótido <400> 30 cgcggatcct tagctttcca gcagtttttt gatgattttt ttgtacagcg gcgcctgcag 60 gtccaggcag attttgcggc cgttcgcccg cgccacacta gtgaag 106 <210> 31 <211 > 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 He Tyr Ser Phe Asp Gly Arg Asp He Met Thr Asp Pro Ser Trp Pro 1 5 10 15 Gln Lys Val He Trp His Gly Ser Ser Pro His Gly Val Arg Leu Val 20 25 30 Asp Asn Tyr Cys Glu Ala Trp Arg Thr Ala Asp Thr Ala Val Thr Gly 35 40 45 Leu Ala Ser Pro Leu Ser Thr Gly Lys He Leu Asp Gln Lys .Ala Tyr 50 55 60 Ser Cys Ala Asn Arg Leu He Val Leu Cys He Glu Asn Ser Phe Met 65 70 75 80 Thr Asp Ala Arg Lys 85 <210> 32 <211 > 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 32 ggcttcacta gtgtggcgca ggcgatatac tcctttgatg gtcg 44 <210> 33 í¿¿A¿J, i 1*¿A* ^&£ <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 33 cgcggatcct tacttcctag cgtctgtcat gaaactg 37 <210> 34 <211> 7117 <212> ADN <213> E. coli <400> 34 cccgggcact tccggggcat gagtatgtga tatccggggc tgcaccccgg accccgccaa 60 cacatcacgg gccacaaaat ccettgtggc ccgctctgcg ttttctaagt gttatccctc 120 ctgatctcta aaaaattctc cacctgaact tgacagaaaa aacgatgacg agtacttttt 180 gatctgtaca taaacccagt ggttttacgc acagtattaa tcgtgtaacc aattgtttta 240 acgcttaaaa gagggaattt ttatgagcgg tggcgatgga cgcggccaca acacgggcgc 300 gcatagcaca agtggcaaca ttaatggcgg cccgaccggg cttg tgtag cggtggtgc 360 ttctgatggc tccggatgga getcggaaaa taacccgtgg ggtggtggtt ccggtagcgg 420 cattcactgg ggtggtggtt ccggtcatgg taatggcggg gggaatggta attccggtgg 480 tggttcggga acaggcggta atctgtcagc agtagctgcg ccagtggcat ttggttttcc 540 ggcaccttcc actccaggag ceggcggccc ggcggtcagt atttcagcgg gageattace 600 ggeagetatt gctgatatta Cggctgccct gaaaggaccg tttaaatttg tctttgggg 660 ^^¡¡^ ggtggcttta tatggtgtat tgccatcaca aatagcgaaa gatgacccca atatgatgtc 720 aaagattgtg acgtcattac ccgcagatga tattactgaa tcacctgtca gttcattacc 780 tctcgataag gcaacagtaa acgtaaatgt tcgtgttgtt gatgatgtaa aagacgagcg 840 acagaatatt tcggttgttt caggtgttcc gatgagtgtt ccggtggttg atgcaaaacc 900 taccgaacgt ccgggtgttt ttacggcatc aattccaggt gcacctgttc tgaatatttc 960 agttaataac agtacgccag cagtacagac attaagccca ggtgctacaa ataatactga 1020 caaggatgtt cgcccggcag gatctactca gggtggtaat accagggatg cagttatccg 1030 attcccgaag gacagcggtc acaatgccgc acatgtttca gtgagtgacg ctcttagccc 1140 • tgaccaggta aaacaacgtc aagatgaaga aaatcgccgt cagcagsaat gggat ccac 1200 gcatccggtt gaagcggctg agcgaaatta tgaacgcgcg cgtgcagagc tgaaccaggc 1260 aaatgaagat gttgccagaa atcaggagcg acaggctaaa gctgtecagg tttataattc 1320 gcgtaaaagc gaacttgatg cagcgaataa aaccctcgct gatgcaatag ctgaaataaa 1380 1440 10 acaatttaat cgatttgccc atgacccaat ggctggcggt cacagaatgt ggcaaatggc cgggcttaaa gcccagcggg cgcagacgga tgtaaataat aagcaggctg catttgatgc 1500 tgctgcaaaa gagaagtcag atgctgatgc tgcattgagt tctgctatgg aaagcaggaa 1560 gaagaaagaa gataagaaaa ggagtgctga aaataattta aacgatgaaa agaataagcc 1620 cagaaaaggt tttaaagatt acgggcatga ttatcatcca gctccgaaaa ctgagaatat 1680 taaagggctt ggtgatctta agcctgggat accaaaaaca ccaaagcaga atggtggtgg 1740 aaaacgcaag cgctggactg gagataaagg gcgtaagatt tatgagtggg attctcagca 1800 • eggtgagctt gaggggtatc gtgccagtga tggtcagcat cttggctcat ctgaccctaa 1860 aacaggcaat cagttgaaag gtccagatcc gaaacgaaat atcaagaaat aeccttgaga 1920 ggaagttatg ggacttaaat tggatttaac ttggtttgat aaaagtacag aagatcttaa 1980 gggtgaggag tattcaaaag attttggaga tgacggttca gttatggaaa gtctaggtgt 2040 15 gccttttaag gataatgtta ataacggttg ctttgatgtt atagctgaat gggtaccttt 2100 gctacaacca tacttt'aatc atcaaattga tatttccgat aatgagtatt ttgtttcgtt 2160 tgattatcgt gatggtgatt ggtgatcaaa tattatcagg gatgagttga tatacgggct 2220 tctagtgttc atggatgaac gctggagcct ccaaatgtag aaatgttata ttttttattg 2230 agttcttggt tataattgct ccgcaatgat ttaaataagc attatttaaa acattctcag 2340 gagaggtgaa ggtggagcta aaaaaaagta ttggtgatta cactgaaacc gaattcaaaa 2400 aatttattga agacatcatc aattgtgaag gtgatgaaaa aaaacaggat gataacctcg 2460 agtattttat aaatgttact gagcatccta gtggttctga tctgacttac tacccagaag 2520 gtaataatga tggtagccct gaaggcgtta ttaaagagat taaagaatgg cgagccgcta 2580 acggtaagtc aggatttaaa cagggctgaa atacgaacgc cggttgttca tggatgaacg 2640 gccggcattc tttcacaaca aggagtcgtt atgaaaaaaa taacagggat tattttattg 2700 ctccttgcag tcaetattcc gtctgcatgt caggcaaact atatccggga tgttcagggc 27€0 • 20 gggaccgtat ctccgtcatc aacagctgaa gtgaccggat tageaaegea gtaacccgaa 2820 25 atcctctttg acaaaaacaa agcgtgtcag gctgattccg at cgcctce tttttgaaat 2350 gtcacaaaaa ttccatgtgg gagatgggac ctaaaatcct cgtgcagaac ettccatcca 2940 gggggagaaa acttgtcgtt ttgagccgtt cggtgttcag aacgcacgaa accgatcgcg 3000 cgcatcgctt tcgtgaatag ttatgcaggc ccctgaaaac gattctgacg cgttttttcg 3060 gttttgcctg gegttttcct gtctttttgc gttttttgcg tcagaacgcg tctgagggcg 3120 ttttaagggg tgcgtacaac gggagttatg gtaaatggat csgtttttcg ggaaggatcg 3130 acaggatttg ccgttgggtg tagtgtaagc gactgaaaaa caaacgcccc gtaaatcgtg 3240 ctctcaccgc caagattgat cacgaaatta cagggcgccg ggttccgcgt ttcccgatgg 3300 10 gaaagcgcgg ttagttaaac tgtgtaccga gagaaatcgt atcacatgag cgccgtactt 3360 caacgcttca gggaaaaatt accgcacaaa ccgtactgta cgaacgattt cgcgtacggc 3420 gttcgcattc tgccgaaaaa cattgccatt cttgcccgtt tcatccagca gaaccagcca 3430 catgcactgt actggcttcc ccctgacgtg gaccggacgg sggcatcaat cgactggagc 3540 gaccggaatt gtccggcccc gaacatcacc gtaaaaaatc cccgtaacgg gcacgcgcat 3600 ctgctctacg cgctcgccct ccctgtgaga actgcgccgg atgcatcggc ctcggcgctc 3650 agatacgctg ccgctattga gcgtgcgttg tgtgaaaaac tgggcgcgga tgtgaattac 3720 • agcggcctga tctgcaaaaa tccgtgccac cctgaatggc aggaagtgga atggcgcgag 3730 gaaccctaca ctctcgacga actggctgac tatctcgatt tgagcgcctc agcgcgccgt 3840 agcgtcgata aaaattacgg gctggggcga aactgctatc tgttcgaaaa gggccgtaaa 3900 tgggcttacc gggctattcg tcagggcegg ccggcattct cacaatggct tgatgcggtg 3960 15 attcagcgtg tcgaaatgta caacgcatcg ctccccgttc cgctttcacc tcctgaatgt 4020 cgggctattg gcaagagcat tgcgaaatac acgcacagga acttcacgcc ggaaactttc 4 C 30 gcacagtatg tggctgatac gcacacgcca gaaattcagg ctacacgcgg tcgcaagggc 4 0 ggttctaagt ctaagcgcgg cacagtagct acatcagcac gcacgctgaa accttgggag 4200 aaattaggga tcagtcgcgc ctggtattac caactgaaaa aacgaggtct cgtagagtag 4260 accaaataag cctatatcag ataacagcgc ctttttggcg cctttttgag cagcttggtt 4320 tgttgctatt tccctcgttg aatcccgcaa tggcgcggct ttccgcatga ttgaggtggt 4330 agcgctcgcc gcagtcccat gaccgagcgt agcgagcgaa tgagcgagga agcgcaaagg 4440 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ttgcgccgga atggcagagc tgaaagaaaa actgtcagca cgggaagcgg agcggcgcag 613 15 ggaggagccc gaagcggaag cgcgccggaa ggaacaggag catgaggcgc ggctgaaacg 624 tcatgataac caccgtctga gccgtgaaac ggcattagtc ggggttatta cggagctggg 633 gcgtgccaga gagccgggaa ccggcaggat aacccgctac atgatgttga gcaacagagc 6360 cggagaattc acggtatggg gtgatgagct ggcgcattac ccccagagtg cccatgaccc 6420 ggtgaatgtt tacctgtcgc caggcggggc tgtgatggtc tcggatacac cegagggaat 64S0 gccagaatct catgagacga tggcgcggcc tgagcgtgtg agaatgtatt ccggtgcgac 6540 20 ggtccggcat gtactggaac agatgcgcca ggggtggccc tcttacggtt tcccggcgct 6600 gccgcatcac tggccggata acctttattt cagcgacgac cgcaggcccg cagcctctcc 6660 gctgccgtct gcgcaccggg cggacgccac cgcttatgcg gcaccggagc aactcacgcc 6720 cgttgtattt ccgacagagc gaaacagcag gacgctgaat ctgccgtcce gcaasgggcc 6780 «miiu irtnMl?i ifi niín. ggaggaagtg cctgtcggat tcgcgcgcca ggaggacggg ccgcgtcccg tccttgcgcc 6840 tccgtcgccg gattacagtc aeccgaeggt cagcaccatc acggagaacg gggeatgccc 6900 ggcaggttac ggagaagcca taaaccacga cgcggatact 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reverso <400> 40 cacaggatcc ttactgaacc gcgat cccg 30 <210> 41 5 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador directo 10 <400> 41 gtgtgagctc gatcaaccag caagccgtta acccctgac 40 <210> 42 <211> 67 <212> ADN 15 <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador reverso <400> 42 20 gtgtgcatgc ggggggccat ataggccggg gatttaaatg caaacgtccg cegaaacgcc 60 aacacac <210> 43 <211> 71 25 <212> ADN <213> Secuencia Arti ficial <220> <223> Cebador directo <400> 43 5 gtgtgcatgc ggggt taatt aagggggcgg' ccgcgtggca ttggttgaac cgacggtgct 71 catgacatcg 10 <210> 44 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 15 <223> Cebador reverso <400> 44 gtgtctcgag gatatcattc tggcctctga cgttgtg 37 <210> 45 <211> 45 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador directo <400> 45 25 ttttttccat ggctattatg actgaaatcg crgcagataa aacgg 45 <210> 46 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador reverso <400> 46 ttttttaagc ttcccgggtc aga -ccagg tacctcaaag agtgtc 46 <210> 47 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador directo <400> 47 ccgctcgaga tgcacggctc caac=agctc cea 33 <210> 48 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Cebador reverso <400> 48 cgcggatcct taggcactcg cctc agtgc ctg 33 <210> 49 HaaÉÉaa?a|ai |kMáa|tortBriBj | ¿i|^| |J <211> 102 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 49 gatcccatgg cttatggcag aaaaaaacgc cgtcagcgcc gtcgcatgaa cgcgctgcag 60 gaagataccc cgccgggccc gtccaccgeg tttcgcccgc cg ' c, ~> 10 <210> 50 <211> 103 <212> ADN <213> Secuencia Arti ficial <220> 15 <223> Ol igonucleótido <400> 50 gggacaggge gatggtgatg cccgcgaegc cgacgccgac cccgcggcaa -s-gggg - D v, ccagcgggcg ggaggaggcc ggcgggcgaa acacggcgga cgg 103 20 <210> 51 <211> 102 <212> ADN <213> Secuencia Arti f icial 25 <220> •^^•^•^at ,^ <223> Oligonucleótido <400> 51 ggcatcgcgg gcatcaccat caccctgtcc ctgtgcggcc gcgcgaacgc gcgcgcgccg 60 accccgcgct ccgcgaccgc ggataactcc gaaaacaccg ge 102 <210> 52 <211 > 111 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleótido <400> 52 gcgatat tcg gacggatcgc aggagcgtt t t ccggacggc ggtttcggcc gaccggtgcg cagatccggg acgtttttaa agccggtgtt ttcggag t ca cccccsgtcg c <210> 53 <211 > 111 <212 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 53 CC A9c9aA== ,.«,.«« cct cc ..« -««.« .cc. .ccc 113 cgccccgccc gcgcaccgcc cgccgccgca tccgcccc g 5 <210> 54 <2 i l > 41 • <212 > ADN <213> Secuencia Arti ficial 10 <220> <223> Oligonucleótido <400> 54 catgaagctt tcagaggcgg atgcagcggc gggcggtgcg c 41 <210> 55 15 <211> 98 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido 20 <400> 55 gaccccatgg ctcatcacca ccaccaccat caeggccgca aaaaacgccg ccagcgccgc 60 cgcacgaacg cgccgcagga agacaccccg ccgggccc 98 <210> 56 25 <21 1 > 100 27: <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleótido <400> 56 eccgcccc cgctgttagc gctgactagt 60 gaccccatgg ctaaaaagac ggctctggcg -.^H ^^ 100 gtagcgcagg cctacggccg caaaaaacgc cgecagcgcc <210> 57 <211> 551 <213> Bacteriófago <220> <221> CDS <222> (7) ... (408) <221> mod?f?ed_base (base modificada) <222> (1) ... (1) <223> n=a, c, g, o t <400> 57 nagacc atg gcc tat ggc aga aaa aaa aga aga cag aga aga aga atg 48 Mee Ala Tyr Gly Arg L/s Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met 1 5 10 aac gcg ctg cag gaa gac acc ceg ceg ggc ceg tcc acc gtg ctt cgc 96 Asn Ala Le- Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Phe Arg 15 20 25 30 -i.i.11.,- ceg ceg acc tcc tcc cgc ceg ctg gaa acc ceg cat tgc cgc gaa atc 144 Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Glu He 35 40 4S cgc atc ggc atc gcg ggc acc acc atc acc ctg tcc ceg egc ggc tgc 192 Arg He Gly He Ala Gly He Thr He Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys 50 55 63 gcg aac gcg cgc gcg ceg acc ceg cgc tcc gcg acc gcg gae aaaacc cccccc 240 Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr ^la 2.3= -.sn Ser 65 70 75 gaa aac acc ggc ccc aaa aac gcc ceg gac ceg cgc acc cae ccaagg cceegg 233 Glu Asn Thr Gly Pne Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Trr -. Gin Pro 80 85 90 aaa ceg ceg ccc aaa aaa cgc tcc tgc gat ceg tcc gaa tac cgc gcc 336 Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Ciu T. r ^r Val 95 100 105 110 tcc gaa ctg aaa gaa ccc ctg atc acc acc acc ceg ccc cgc ceg cgc 384 Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu He Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro Arg 115 120 125 acc gcc cgc cgc cgc atc cgc etc tgaaagctcg gctgccctgg cggatgagag 43S Thr Ala Arg Arg Cys He Arg Leu 130 aagatettea gcctgataca gaccaaacca gaacgcagaa gcggcccgac aaaacagaaC 493 CCgcccggcg gcagtagcgc ggtggcccca cccgacccca cgccgaaccc aga 551 <210> 58 <211> 134 <212> PRT <213> Bacteriófago <400> 58 Met Ala Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Ara Arg '-' z Asn Ala 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Thr Pro Pro Gly Pro Ser Thr Val Pne .-.rg Pro Pro 20 25 3: Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His Cys Arg Ciu lie Arg He 35 40 " 45 Gly He Ala Gly He Thr He Thr Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn 50 55 60 Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr Ala Asp <%sn Ser Glu Asn 65 70 75 80 Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro 85 90 95 Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu 100 ' 105 110 Leu Lys Glu Ser Leu He Thr Thr Thr Pro Ser Arg Pro ¿rg Thr Ala 115 120 125 Arg Arg Cys He Arg Leu 130 <210> 59 <211> 444 <212> ADN <213> Bacteriófago <220> <221> mod?f?ed_base (base -edificada) <222> (1) ... (1) <223> n=a, c, g, o t <221> CDS <222> (7) ... (427) <400> 59 ,.-„ p-r rsr ra- cat cae cae cae cae ggc cgc aaa aaa cgc Oa9aCC M l Tía s K,l is HIS Hi3 Hxs Tyr Gly Arg Lys Lys Arg 1 S 1° 96 cgt cag cgc cgc cgc acg aac gcg ceg cag gaa gat acc ceg ceg ggc A A.rg mGlnn A arrag AArrag AArrag MMeeee AAssnn --llaa LLeeuu Gulmn GDlIuU A«sBpJJ ?In,... . A~ .__ A 15 20 25 30 144 ceg tcc acc gtg tcc cgc ceg ceg acc ccc ccc cgc ceg ceg gaa acc *»-- -^— --. c„, ?P A a pro -SU Q u t r Pro Ser Thr Val Phe Arg Pro Pro Tr.r Ser Ser Arg Pro 35 40 45 192 ceg cat tgc cgc gaa atc cgc ate ggc atc gcg ggc atc acc atc acc Pro His Cys Arg Glu He Arg He Gly He Ala Gly He Thr He Thr 60 50 ctg tcc ctg tgc ggc tgc gcg aac gcg cgc gcg ceg acc ceg cgc ccc 240 Leu Ser Leu Cys Gly Cys Ala Asn Aia Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser 65 70 75 gcg acc gcg gat aac tcc gaa aac acc ggc ttt aaa aac gtc ceg gat 288 Ala Thr Ala Asp Asn Ser Glu Asn T.-.r Gly Phe Lys Asn Vai Pro Asp 80 35 90 ctg cgc acc gat cag ceg aaa ceg ceg tcc aaa aaa cgc tcc tgc gat 336 Leu Arg Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp 95 100 105 110 ceg tcc gaa tat cgc gtc tcc gaa ceg aaa gaa tcc ctg acc acc acc 384 • Pro Ser Glu Tyr Arg Val Ser Glu Leu Lys Glu Ser Leu He Thr Thr 115 120 125 acc ceg tcc cgc ceg cgc acc gcc cgc cgc tgc atc cgc etc t 427 10 Thr Pro Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Cys He Arg Leu 130 135 140 gaaagcttgg ctgtttt 444 <210> 60 <211> 140 15 <212> PRT <213> Bacteriófago <400> 60 Met Ala His His His Hi s Hi s r. i s T\ r Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln 1 5 10 ' 15 20 Arg Arg Arg Met Asn Ala Leu C-ln Glu Asp Thr Pro Pro Giy Pro Ser 20 25 30 Thr Val Phe Arg Pro Pro Thr Ser Ser Arg Pro Leu Glu Thr Pro His 35 45 Cys Arg Glu He Arg He Gly He Ala Gly He Thr He Thr Leu Ser 50 55 60 Leu Cys Gly Cys Ala Asn Ala Arg Ala Pro Thr Leu Arg Ser Ala Thr 65 70 75 80 Ala Asp Asn Ser Glu Asn Thr Gly Phe Lys Asn Val Pro Asp Leu Arg 85 90 95 Thr Asp Gln Pro Lys Pro Pro Ser Lys Lys Arg Ser Cys Asp Pro Ser 25 100 105 HC Giu Tyr Arg Val Ser Glu Lea lys Glu Ser Leu He Thr T.-.r Thr Pro 115 120 125 !76 Ser Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Cys He Arg Leu 130 135 140 <210> 61 <211> 1565 <212> ADN <213> Salmonella <400> 61 gatatcattc tggcctctga cgttgtgatg gtcgcacgtg gcgatctggg cgttgaaatc 60 ggcgatccgg agctggttgg tatccagaaa gcgctgattc gccgtgcgcg ecagctaaac 120 cgcgcagtca tcaccgcaac gcaaacgacg gagtcgatga tcaccaaccc gatgccgacc 180 cgtgcggaag tgatggacgt ggcgaacgcc gtcctggatg gcacggatgc ggttacgceg 240 tctgccgaaa ccgcagccgg tcagtatcct tctgaaaccg ttgccgcaat ggcgcgcgec 300 tgcctgggcg cagaaaaaat ccccagcaec aacgcgtcca aacaccgtct cgacgtgcag 360 ttcgacaacg ttgaagaagc categccacg ectgcgatgt atgcggcaaa ccatctgaaa 420 ggcgttaccg cgatcatcac catgacggaa tccggtcgta ccgcgctaat gacttcccgc 480 atcagctccg gcctgccgat tttcgccaeg ccgcgccatg aacgcacgct gaacccgacc 540 gcgcccCacc gcggagtaac gccggtgcac ctcgacagcg cggccgatgg cgctgtcgcg 600 gcacatgaag ctgttaatct gctgcgcgac aaagggtatc tggtttccgg cgacctggee 660 atcgtgaccc agggcgatgt catgagcacc gtcggttcaa ccaataccac ccggccgccc 720 ccctaattaa ccccgcatgc ggggggccac ataggccggg gacttaaatg caaacgtccg 730 ccgaaacgcc gacgcactgt gtcccagaea cagccaaaaa ccggattacc ccgattacsa 340 aacaccgccg ccattttttg cccctgagag gccatcagca cggccggaac gccgacgccc 900 cagccacgcg gtacgagaaa aatgactttc tcgtcgttac gacgcatctc ctcgataacc 960 tccagaccte cccagtcaac acgctgttga atttttttcg gaccgcgcat cgccaactca 1020 gccatcatcg ccattgcctg tggcgcggeg gcgaacatct caccgacaae cgccccgcgc 1080 tcagcttcgc tacgctgcgg aaagcacaac gacagattaa ttagcgcccg gcgacgagaa 1140 ctcttcccca gccgcccggc aaaacgcccc agcgtcgcca gcaaagggtc gcggaatgac 1200 gccggtgcta atgcgatccc cgccattgcc gccgcgccca accaggcgcc ccaatactgc 1260 ggatagcgaa aggatttttc gaattcaggg atatactcac tattattttt tttggtttcc 1320 atgctttccc agggtctgct gacgcgaaaa ggaattgtga atagtgtagc cacgtctgcg 1380 tctcacacaa aacaaaaaag ccggcacaca tcgcgtaccg gctctgtcag cgcatttgtt 1440 aatcgaagcg cagttgcggc agaacctctt tcacctgtgc caggtattca cgacgatctg 1500 accccgtcag accttccgtg cgcggcaatt tcgctgtcag agggttaacg gctegceggt 1560 tgatc 1565

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo. Una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias enlazadas operativamente a uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de la familia de TNF. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 3, en donde el miembro de la familia de TNF es un factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a ( TRANCE ) , inductor de apóptosis débil relacionado con T?F-a (TWEAK), ligando de CD40 (CD40L) , LT-a, LT-ß, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, o bien AITR-L. 5. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o 2, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un factor antiangiogénico. 6. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 5, en donde el factor anti-angiogénico es endostatina, angiostatina, antitrombina anti- angiogénica III, los fragmentos proteolíticos N- terminal de 29 kDa y C-terminal de 40 kDa de fibronectina, un antagonista de receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario-4, el fragmento de 24 aminoácidos anti- antiogénico de factor plaquetario-4, el factor antiangiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénico de SPARC, RGD y NGR que contiene péptidos, los péptidos anti-angiogénicos pequeños de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, y antagonistas de péptido de integrina avß3 o receptor para VEGF. 7. La bacteria dirigida a tumor atenuada de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de la familia de bacteriocina a condición que dicha bacteriocina no sea BRP. 5 8. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 7, en donde el miembro de la familia de bacteriocina es ColEl, CclEla, ColElb ColE2, ColE3, • ColE4, ColE5, C0IE6, ColE7, C0IE8, ColE9, colicina A, colicina K, colicina L, colicina M, cloacina DF13, 10 pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, megacina A-216, vibriocina, o bien microcina M15. • 9. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula efectora 15 primaria es una enzima inhibidora de tumor. 10. La bacteria dirigida a tumor atenuada de conformidad con la reivindicación 9, en donde la enzima inhibidora de tumor es metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, prcteasa, ADNasa o glicosidasa. f 20 11. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula efectora primaria es hemolisina, verotoxina, CNFl, CNF2, o PMT. 12. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula efectora 25 primaria es derivada de un animal, de una planta, de una bacteria o de un virus. 13. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 2, en donde la molécula efectora secundaria es un agente inmunomodulador, una proteína antitumor, un enzima de conversión de profármaco, una molécula de antisentido, una ribozima o un antígeno. 14. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1 o 2, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada es Salmonella . 15. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 1, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además un sistema de liberación realzado. 16. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 2, en donde la molécula efectora secundaria es un factor de liberación de bacteriocina (BRP) . 17. Una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codificar. una o varias proteínas de fusión unidas de manera operativa con uno o varios promotores en donde dicta bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende una secuencia de señal y una molécula efectora. ^^^_* 18. Una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente a uno o varios promotores, en donde 5 dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende un péptido de transporte y una • molécula efectora. 19. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la 10 reivindicación 18, en donde la proteína de fusión comprende además una secuencia de señal. 20. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la • reivindicación 17 o 19, en donde la secuencia de señal es una proteína de tipo OmpA. 15 21. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 18 o 19, en donde el péptido de transporte se deriva de una proteína TAT de VIH, el homeodominio de antenapedia (penetraxina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de ^P 20 crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF) , virus de herpes simplex VP22, hexahistidina, hexalisina, o hexaarginina . 22. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 17, 18 o 19, en donde la molécula 25 efectora es una molécula efectora primaria o '•"•^ i *»^*' - •..»>—- * secundaria. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 17, 18 o 19, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras enlazadas operativamente con uno o varios promotores. La bacteria dirigida a tumor atenuada de la reivindicación 23, en donde la molécula efectora es una molécula efectora primaria o secundaria. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor A, atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo . 27. La composición farmacéutica de la reivindicación 25 o 26, en donde por lo menos una de las moléculas 5 efectoras primarias es un miembro de la familia de TNF. 28. La composición farmacéutica de la reivindicación 27, en donde el miembro de la familia de TNF es factor de • necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tu oral- a (TNF-a) , ligando inductor de apóptosis relacionado 10 con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor de apóptosis débil relacionado con TNF-a (TWEAK) , ligando de CD40 • (CD40L), LT-a, LT-ß, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, o bien 15 AITR-L. 29. La composición farmacéutica de conformidad con ía reivindicación 25 o 26, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un factor antiangiogénico. ^ 20 30. La composición farmacéutica de la reivindicación 29, en donde el factor anti-angiogénico es endostatina, angiostatina, antitrombina anti-angiogénica III, los fragmentos proteolíticos N-terminal de 29 kDa y C- terminal de 40 kDa de fibronectina, un antagonista de 25 receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario-4, el fragmento de 24 aminoácidos anti-antiogénico de factor plaquetario-4, el factor anti-angiogénico designado 13.40, el fragmento de 5 péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénico de SPARC, RGD y NGR que • contiene péptidos, los péptidos anti-angiogénicos pequeños de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, 10 y antagonistas de péptido de integrina avß3, o receptor para VEGF. 31. La composición farmacéutica de la reivindicación 25 o • 26, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de la familia de 15 bacteriocina a condición que dicha bacteriocina no sea BR?. 32. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31, en donde el miembro de la familia de bacteriocina es ColEl, ColEla, ColElb ColE2, ColE3, 20 C?lE4, ColE5, C0IE6, ColE7, C0I?8, ColE9, colicina A, colicina K, colicina L, colicma M, cioacina DF13, pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, megacina A-216, vibriocina, o bien microcina M15. 25 33. La composición farmacéutica de la reivindicación 25 o 26, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es una enzima inhibidora de tumor. 34. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, en donde la enzima inhibidora de tumor es metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, proteasa, ADNasa o glicosidasa. 35. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25 o 26, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es hemolisina, verotoxina, CNFl, CNF2, o PMT. 36. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25 o 26, en donde la molécula efectora primaria se deriva de un animal, de una planta, de una bacteria o de un virus. 37. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, en donde la molécula efectora secundaria es un agente inmunomoduiador, una proteína antitumor, un enzima de conversión de profármaco, una molécula de antisentido, una ribozima o un antígenc. 38. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25 c 26, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada es Salmonella . 39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 25, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además un sistema de .*• JtstÁnA l^?iAÍ liberación realzada. 40. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, en donde la molécula efectora secundaria es un factor de liberación de bacteriocina. 41. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente a uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende una secuencia de señal y una molécula efectora. 42. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente a uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende un péptido de transporte y una molécula efectora. 43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, en donde la proteína de fusión comprende además una secuencia de señal. tti......... ?.? ^ JL.- 44. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41 o 43, en donde la secuencia de señal es una proteína de tipo OmpA. 45. La composición farmacéutica de conformidad con la 5 reivindicación 42 o 43, en donde el péptido de transporte es derivado de la proteína TAT de VIH, el ho eodominio de antenapedia (penetraxina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF), virus de 10 herpes simplex VP22, hexahistidina, hexalisina, o hexaarginina. 46. La composición farmacéutica de conformidad con la • reivindicación 41, 42 o 43, en donde la molécula efectora es una molécula efectora primaria o 15 secundaria. 47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 41, 42 o 43, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias ^ 20 moléculas efectoras enlazadas operativamente con uno o varios promotores. 48. Un método para administrar una o varias moléculas efectoras primarias para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido a un sujeto que requiere de dicho 25 tratamiento, que comprende la administración de una h*,?lt?ti?ft.liiÉ?i1<-,i,jrál,H.„ i , ?m, - . ,. . .A..-,. .,.*._. ....A _ _ ^ L.i 1..1.A composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo. 49. Un método para administrar una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido a un sujeto que requiere de dicho tratamiento, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo. 50. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de la familia de TNF. >* HA**** . -*. ***-!*., 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, en donde el miembro de la familia de TNF es un factor de necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral- a (TNF-a) , ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor de apóptosis débil relacionado con TNF-a (TWEAK) , ligando de CD40 (CD40L), LT-a, LT-ß, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, o bien AITR-L. 52. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un factor anti-angiogénico. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52, en donde el factor anti-angiogénico es endostatina, angiostatina, antitrombina anti-angiogénica III, los fragmentos proteolíticos N-terminal de 29 kDa y C- terminal de 40 kDa de fibronectina, un antagonista de receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario-4, el fragmento de 24 aminoácidos anti-antiogénico de factor plaquetario-4, el factor anti-angiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 * 4** 4 *.*HÍ?? i*.. »**»„»«. ..A.. .. . A. . .-„,.,„ ...A, .„,,_,„, ..^.A, A.^t^fc^M ^t.1,i..t..^=fcÍé¡?ÍÉI aminoácidos anti-angiogénico de SPARC, RGD y NGR que contiene péptidos, los péptidos anti-angiogénicos pequeños de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, y antagonistas de péptido de integpna a ß3, o receptor para VEGF. 54. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de la familia de bacteriocinas a condición que dicha bacteriocina no sea BRP. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, en donde el miembro de la familia de bacteriocina es ColEl, ColEla, ColElb ColE2, ColE3, ColE4, ColE5, ColE6, ColE7, ColEd, ColE9, colicina A, colicina K, colicina L, colicina M, cloacina DF13, pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, megacina A-216, vibriocina, o bien microcina M15. 56. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es una enzima inhibidora de tumor. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, en donde la enzima inhibidora de tumor es metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, proteasa, ADNasa o glicosidasa. 58. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es hemolisina, verotoxina, CNFl, CNF2, o PMT. 59. El método de conformidad con la reivindicación 48 o 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias se deriva de un animal, de una planta, de una 5 bacteria o de un virus. 60. El método de conformidad con reivindicación 49, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras • secundarias es una proteína antitumor, un enzima de conversión de profármaco, una molécula de antisentido, 10 una ribozima, o un antígeno. 61. El método de conformidad con la reivindicación 48 c 49, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada es • Salmonella . 62. El método de conformidad con la reivindicación 45, en 15 donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además un sistema de liberación realzada. 63. El método de conformidad con la reivindicación 49, en donde la molécula efectora secundaria es un factcr de liberación de bacteriocina. • 20 64. Un método para administrar una o varias proteínas de fusión para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido a un sujeto que requiere de dicho tratamiento, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un vehículo 25 farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente con uno o varios promotores en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o un anaerobio facultativo y dichas proteínas de fusión comprenden una secuencia de señal y una molécula efectora. 65. Un método para suministrar una o varias proteínas de fusión para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido a un sujeto que requiere de dicho tratamiento, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente a uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo y dichas proteínas de fusión comprenden un péptido de transporte y una molécula efectora. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, en donde la proteína de fusión comprende además una secuencia de señal. 67. El método de conformidad con la reivindicación 64 o 66, en donde la secuencia de señal es una proteína de tipo tw.«.»M a . OmpA. 68. El método de conformidad con la reivindicación 65 o 66, en donde el péptido de transporte es derivado de la proteína TAT de VIH, el horneedominio de antenapedia 5 (penetraxina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF), virus de herpes simplex VP22, hexahistidma, • hexalisina, o hexaarginina. 69. El método de conformidad con la reivindicación 64, 65 o 10 66, en donde la molécula efectora es una molécula efectora primaria o secundaria. 70. El método de conformidad con la reivindicación 64, 65 o • 66, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además una o varias moléculas de ácido 15 nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras enlazadas operativamente con uno o varios promotores. 71. Un método para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido en un animal, que comprende la administración de uno o varios agentes quit.ioterapéuticos y una ^ 20 composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas efectoras primarias enlazadas operativamente con uno o 25 varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo. 72. Un método para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido en un animal, que comprende la administración de 5 uno o varios agentes quimioterapéuticos y una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a • tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias moléculas 10 efectoras primarias y una o varias moléculas efectoras secundarias enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor • atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo. 15 73. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es un miembro de familia TNF. 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, en donde el miembro de la familia de TNF es factor de • 20 necrosis tumoral-a (TNF-a) , factor de necrosis tumoral- a (TNF-a) , ligando inductor de apóptosis relacionado con TNF-a (TRAIL) , citocina inducida por activación relacionada con TNF-a (TRANCE) , inductor de apóptosis débil relacionado con TNF-a (TWEAK) , ligando de CD40 25 (CD40L), LT-a, LT-ß, OX40L, CD40L, FasL, CD27L, CD30L, Utt? Aju ^ÍAtu-M?tAaAtiA^^^AA^AA?^A. | , „ _,^ ._ „, ^J , £ *í£,I 4-1BBL, APRIL, LIGHT, TL1, TNFSF16, TNFSF17, o bien AITR-L. 75. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras 5 primarias es un factor anti-angiogénico. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, en donde el factor anti-angiogénico es endostatina, # angiostatina, antitrombina anti-angiogénica III, los fragmentos proteolíticos N-terminal de 29 kDa y C- 10 terminal de 40 kDa de fibronectina, un antagonista de receptor de uPA, el fragmento proteolítico de 16 kDa de prolactina, el fragmento proteolítico de 7.8 kDa de factor plaquetario-4, el fragmento de 24 aminoácidos anti-antiogénico de factor plaquetario-4, el factor 15 anti-angiogénico designado 13.40, el fragmento de péptido de 22 aminoácidos anti-angiogénico de trombospondina I, el fragmento de péptido de 20 aminoácidos anti-angiogénico de SPARC, RGD y NGR que contiene péptidos, los péptidos anti-angiogénicos (P 20 pequeños de laminina, fibronectina, procolágena y EGF, y antagonistas de péptido de integrina a.ß , o receptor para VEGF. 77. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras 25 primarias es un miembro de la familia de bacteriocmas a condición que dicha bacteriocina no sea BRP. 78. El método de conformidad con la reivindicación 77, en donde el miembro de la familia de bacteriocinas es ColEl, ColEla, ColElb C?lE2, C?lE3, C?lE4, C?lE5, C0IE6, ColE7, C0IE8, ColE9, colicina A, colicina K, colicina L, colicina M, cloacina DF13, pesticina A1122, estafilococina 1580, butiricina 7423, piocina Rl o AP41, megacina A-216, vibriocina, o bien microcina M15. 79. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es una enzima inhibidora de tumor. 80. El método de conformidad con la reivindicación 79, en donde la enzima inhibidora de tumor es metionasa, asparaginasa, lipasa, fosfolipasa, proteasa, ADNasa o glicosidasa. 81. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde por lo menos una de las moléculas efectoras primarias es hemolisina, verotoxina, CNFl, CNF2, o PMT. 82. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde la molécula efectora primaria es derivada de un animal, de una planta, de una bacteria o de un virus. 83. El método de conformidad con la reivindicación 82, en donde la molécula efectora secundaria es un agente inmunomodulador, una proteína antitumor, un enzima de conversión de profármaco, una molécula de antisentido, una ribozima o un antígeno. 84. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada es 5 Salmonella . 85. El método de conformidad con la reivindicación 71, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además un sistema de liberación realzada. 86. El método de conformidad con la reivindicación 72, en 10 donde la molécula efectora secundaria es un factor de liberación de bacteriocina. 87. Un método para el tratamiento de un cáncer de tumor ^^ sólido en un animal, que comprende la administración de uno o varios agentes quimioterapéuticos y un vehículo 15 farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor ^?- 20 atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende una secuencia de señal y una molécula efectora. 88. Un método para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido en un animal, que comprende la administración de 25 uno o varios agentes quimioterapéuticos y una t ?.?.« a .a.J^faia..» .. ? ^^«... , ...... composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada que comprende una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican una o varias proteínas de fusión enlazadas operativamente con uno o varios promotores, en donde dicha bacteria dirigida a tumor atenuada es un aerobio facultativo o anaerobio facultativo y dicha proteína de fusión comprende un péptido de transporte y una molécula efectora. 89. El método de conformidad con la reivindicación 88, en donde dicha proteína de fusión comprende además una secuencia de señal. 90. El método de ccr.formidad con la reivindicación 87 u 89, en donde la secuencia de señal es una secuencia de tipo OmpA. 91. El método de conformidad con la reivindicación 88 89, en donde el péptido de transporte se deriva de proteína TAT de VIH, el homeodommio de antenapedia (penetraxina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de crecimiento de fibroblasto de Kaposi (FGF) , virus de herpes simplex VP22, hexahistidina, hexalisina, o hexaargmina. 92. El método de conformidad con la reivindicación 87, 88 u 89, en donde la molécula efectora es una molécula efectora primaria o secundaria. 93. El método de conformidad con la reivindicación 87, 88 u 89, en donde la bacteria dirigida a tumor atenuada comprende además una o vanas moléculas de ácido nucleico que codifican una o vanas moléculas efectoras 5 enlazadas operativamente con uno o varios promotores. 94. Un método para el tratamiento de un cáncer de tumor sólido en un animal, que comprende la administración de • uno o varios agentes quimioterapéuticos y una composición farmacéutica que comprende un vehículo 10 farmacéuticamente aceptable y una bacteria dirigida a tumor atenuada. 95. Una proteína de fusión que comprende una proteína de tipo OmpA y una molécula efectora. 96. Una proteína de fusión que comprende una secuencia de 15 señal, un péptido de transporte, y una molécula efectora. 97. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 96, en donde la secuencia de señal es una proteína de tipo OmpA. • 20 98. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 96, en donde el péptido de transporte se deriva de la proteína TAT de VIH, el homeodominio de antenapedia (penetraxina) , secuencia de translocación de membrana (MTS) de factor de crecimiento de 25 fibroblasto de Kaposi (FGF , virus de herpes simplex ??at ? it Í¡m?áiá¡ ?,i..At.A.A,*. «*-.. VP22, hexahistidina, hexalisina, o hexaarginina. 99. La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 95 o 96, en donde la molécula efectora es una molécula efectora primaria o secundaria. .I. ?. ' ¡.AAA?„ >
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