MXPA01004737A - Proteina zapop3 de la porcion terminante ring - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de polinucleótidos y polipéptidos para el zapop3, un nuevo miembro de la familia de la proteína de la porción terminante RING. Los polipéptidos y polinucleótidos que los codifican, se pueden utilizar para detectar estados de padecimientos humanos y anormalidades cromosómicas, y como una terapia. La presente invención también incluye anticuerpos para los polipéptidos zapop3.

Description

PROTEINA ZAPOP3 DE LA PORCIÓN TERMINANTE RING ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El control apropiado de los procesos que se oponen de la proliferación celular contra la diferenciación terminal y la muerte celular programada apoptótica es un aspecto importante del desarrollo normal y la homeostasis (Raff, M.C., Cell 8_6: 173-175, 1996), y se ha encontrado que está alterado en muchos padecimientos humanos. Ver, por ejemplo, Sa yers, C.L. et al., Cell 64:337-350, 1991; Meyaard, L. et al., Science 257:217-219, 1992; Guo, Q. et al., Nature Med. •4:957-962, 1998; Barinaga, M. , Science, 273:735-737, 1996; Solary, E. et al., Eur. Respir. J., 9 : 1293-1305, 1996; Hamet, P. et al., J. Hypertension, 1 :S65-S70, 1996; Roy, N et al., Cell, 80:167-178, 1995; y Ambrosini, G., Nature Med. , Q_: 917-921, 1997. Se ha hecho mucho progreso hacia el entendimiento de la regulación de este equilibrio. Por ejemplo, se han elucidado las cascadas de señalización a través de las cuales los estimulo celulares, tales como los factores del crecimiento, las hormonas peptidicas y las interacciones célula-célula controlan la relación de las células precursoras hacia las lineas celulares especificas y su subsecuente expansión proliferativa (Morrison, S.J. et Ref: 129517 al., Cell 88:287-298, 1997). Además, se ha encontrado que la terminación o salida del ciclo celular y la diferenciación están acoplados en la mayor parte de los tipos de células. Ver, por ejemplo, Coppola, J.A. et al., Nature 320 : 760-763, 1986; Freytag, S.O., Mol. Cell. Biol. 8_: 1614-1624, 1988; Lee, E.Y. et al., Genes Dev. 8:2008-2021, 1994; Morgenbesser, S.D. et al., Nature 371: 72-74, 1994; Casaccia-Bonnefil, ' P. et al., Genes Dev. 1JL: 2335-2346, 1996; Zacksenhaus, E. et al., Genes Dev. 1_0: 3051-3064, 1996; y Zhang, P. et al., Nature 387:151-158, 1997. La apoptosis también juega un papel importante en muchos procesos del desarrollo y homeostáticos (Raff, M.C., Nature 356: 397-400, 1992; Raff, M.C., supra. ) , y a menudo se regula coordinadamente con la diferenciación terminal (Jacobsen, K.A. et al., Blood 84: 2784-2794, 1994; Morgenbesser et al., supra. ; Yan, Y. et al., Genes Dev. 11:973-983, 1997; Zacksenhaus et al., supra. ) . De aqui, parece que el desarrollo de las lineas individuales, tejidos, órganos, o aún organismos multicelulares completos es el resultado de un equilibrio sintonizado finamente entre la producción celular incrementada debida a la proliferación, y al número disminuido de células que resultan de la diferenciación terminal y apoptosis. Este equilibrio está en su mayor parte regulado coordinadamente por la convergencia de las trayectorias o rutas reguladoras múltiples. La identificación de nuevos miembros de tales redes puede proporcionar enseñanzas importantes hacia los procesos celulares hormonales, asi como sobre la etiología y tratamiento de los estados de padecimientos humanos. Asi, existe una necesidad continua de descubrir nuevas proteínas que regulan la proliferación, diferenciación, y trayectorias apoptóticas. Las actividades in vivo de los inductores y los inhibidores de estas vias ilustran el enorme potencial clínico de, y la necesidad de nuevas proteínas de proliferación, de diferenciación, y apoptóticas, sus agonistas y antagonistas. La presente invención está dirigida a esta necesidad de proporcionar tales polipéptidos para estos y otros usos que deberán ser aparentes para aquéllos con habilidades en la técnica a partir de las enseñanzas la presente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a la necesidad de proporcionar un nuevo polipéptido y composiciones relacionadas y métodos. Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) , en donde la identidad de porcentaje del aminoácido se determina utilizando un programa FASTA con ktup = 1, penalidad por abertura del intervalo = 10, penalidad por extensión del intervalo = 1, y matriz de substitución = BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por defecto. Dentro de una modalidad el polinucleótido aislado descrito anteriormente, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de: (a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID NO: 1 desde el nucleótido 367 hasta el nucleótido 2535; y (b) las moléculas del polinucleótido complementarias a (a) . Dentro de otra modalidad, el polinucleótido aislado descrito arriba comprende el nucleótido 1 al nucleótido 2169 de la SEC. ID NO: 3. Dentro de otra modalidad, el polinucleótido aislado descrito arriba comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , al aminoácido número 723 (Ser) . Dentro de modalidad, el polinucleótido aislado descrito arriba consiste de una secuencia de residuos de aminoácidos que es como se muestra en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , al aminoácido número 723 (Ser) . Dentro de otra modalidad el polinucleótido aislado descrito arriba codifica además un polipéptido que contiene un dominio de la porción terminante RING o al menos una porción LRR. Dentro de otra modalidad el polinucleótido aislado descrito arriba codifica además un polipéptido que contiene un dominio de la porción terminante RING y al menos una porción LRR. Dentro de un segundo aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende los siguientes elementos enlazados operablemente: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que codifica un polipéptido zapop3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , al aminoácido número 723 (Ser) ; y un terminador de la transcripción; en donde el promotor está enlazado operablemente al segmento de ADN, y el segmento de ADN se enlaza operablemente al terminador de transcripción. Dentro de una modalidad, el vector de expresión descrito arriba comprende además una secuencia de señal secretoria enlazada operablemente al segmento de ADN.

Dentro de un tercer aspecto, la presente invención proporciona una célula cultivada dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión como se describió arriba, en donde la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN. Dentro de un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) moléculas de polinucleótido que comprenden una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) , en donde la identidad de porcentaje del aminoácido se determina utilizando un programa FASTA con ktup = 1, penalidad por abertura del intervalo = 10, penalidad por extensión del intervalo = 1, y matriz de substitución = BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por defecto. Dentro de una modalidad el polipéptido aislado descrito anteriormente comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) . Dentro de modalidad, el polipéptido aislado descrito arriba consiste del aminoácido número 1 (Met) , al aminoácido número 723 (Ser) de la SEC ID NO: 2. Dentro de otra modalidad, el polipéptido aislado descrito arriba contiene además un dominio de la porción terminante RING o al menos una porción LRR. Dentro de otra modalidad el polipéptido aislado descrito arriba contiene además un dominio de la porción terminante RING y al menos una porción LRR. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona, un método para producir un polipéptido zapop3 que comprende: cultivar una célula como se describió arriba; y aislar el polipéptido zapop3 producido por la célula. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo para el polipéptido zapop3 que comprende: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que consiste de 9 a 723 aminoácidos, en donde el polipéptido consiste de una secuencia contigua de aminoácidos en la SEC ID NO: 2 del aminoácido número 1 (Met) , al aminoácido número 723 (Ser) ; y (b) un polipéptido como se describió anteriormente; (c) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 1 (Met) hasta el residuo de aminoácido 223 (Leu) ; (d) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el residuo de aminoácido 224 (Glu) hasta el residuo de aminoácido 348 (Arg) ; (e) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde los residuos de aminoácido 520 (Lys) hasta el residuo de aminoácido 543 (Arg) ; (f) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 675 (Cys) hasta el residuo de aminoácido 709 (Cys) ; (g) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 278 (Gln) hasta el aminoácido número 283 (Gln) ; (h) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 311 (Ser) hasta el aminoácido número 316 (His) ; (i) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 344 (Gln) hasta el aminoácido número 349 (Gln) ; (j) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 521 (Glu) hasta el aminoácido número 526 (Glu) ; y (k) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos en la SEC. ID NO: 2 desde el aminoácido número 523 (Gln) hasta el aminoácido número 528 (Glu) ; en donde el polipéptido genera una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona, un anticuerpo producido por el método descrito arriba, que se enlaza al polipéptido zapop3. Dentro de una modalidad, el anticuerpo descrito arriba es un anticuerpo monoclonal. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido descrito arriba. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar, en una muestra de prueba, la presencia de un antagonista de la actividad de la proteina zapop3, que comprende: transfectar una célula que expresa al zapop3, con un constructo del gen reportero que es responsivo o que responde a un sendero celular estimulado por zapop3; y agregar una muestra de prueba; y comparar los niveles de la respuesta en la presencia y ausencia de la muestra de prueba, mediante un ensayo biológico o bioquímico; y determinar a partir de la comparación, la presencia del agonista de la actividad del zapop3 en la muestra de prueba. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica de predicción de hidrofobicidad y de estructura secundaria del zapop3. La gráfica de predicción de la estructura secundaria se basa en Mehta, P.K. et al., Protein Science _4: 2517-2525, 1995. La gráfica de hidrofobicidad se basa en una ventana de seis residuos deslizantes, con los residuos G, S, y T escondidos y con los residuos H, Y, y expuestos, ignorados; El rango hidrofóbico utilizado fue MIFLVWCGRSTAPYNKDEHQ (Trinquier, G., y Sanejuand, Y-H., Protein Enginner, JL1:153-169, 1998). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de establecer la invención en detalle, será de ayuda el definir los siguientes términos para el entendimiento de la misma: El término "marca de afinidad" se utiliza aqui para denotar un segmento del polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido para proporcionar purificación o detección del segundo polipéptido o proporcionar sitios de unión del segundo polipéptido a un substrato. De manera principal, cualquier péptido o proteina para la cual un anticuerpo u otro agente de enlace especifico esté disponible • se pueden utilizar como marca de afinidad. Las marcas de afinidad incluyen un tracto de poli-histidina, la proteina A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), la glutationa S transferasa (Smith y Johnson, Gene _67:31, 1988), marca de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), substancia P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6^:1204-10, 1988), el péptido de enlace de la estreptavidina, u otro epitope antigénico o dominio de enlace. Ver, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95-107, 1991. Las marcas de afinidad que codifican los ADNs están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscata ay, NJ) . El término "variante alélica" se utiliza aqui para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo lugar cromosómico. La variación alélica se vuelve natural a través de una mutación, y puede resultar en poliformismo genotipico o fenotipico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de los genes pueden ser silentes (sin cambio) en el polipéptido codificado) o pueden ser polipéptidos codificados que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se utiliza aqui para denotar una proteina codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" son utilizados aqui para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. En donde el contexto permite, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia del carboxilo-terminal posicionada a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido es localizado de manera próxima al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no necesariamente al carboxilo terminal del polipéptido completo. El término "par complemento/anti-complemento" denota porciones no idénticas que forman un par estable, asociado, no covalentemente, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototipicos de un par complemento/anti-complemento. Otros pares complemento/anti-complemento incluyen pares receptor/ligando, pares de anticuerpo/ antigeno (o antigeno incompleto o epitope) , pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. En donde la disociación subsecuente del par complemento/anti-complemento sea deseable, el par complemento/anti-complemento preferiblemente tiene un afinidad de enlace de <10^ M--1. El término "complementos de una molécula de polinucleótido" es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de base complementaria y orientación inversa cuando se compara a la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementario para 5' CCCGTGCAT 3' . El término "contig" denota un polinucleótido que tiene una porción contigua de secuencia idéntica o complementaria a otros polinucleótidos. Las secuencias contiguas se dice que se "traslapan" a una porción de secuencia dada de la secuencia del polinucleótido ya sea en su totalidad o a lo largo de una porción parcial del polinucleótido. Por ejemplo, los contiguos representativos a la secuencia del polinucleótido 5' -ATGGAGCTT-3' son 5'-AGCTTgagt-3' y 3' -tcgacTACC-5 El término "secuencia de nucleótido degenerado" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (cuando se compara a una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican los mismos residuos de aminoácidos (es decir, los tripletes GAU y GAC cada uno codifica Asp) . El término "vector de expresión" se utiliza para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés enlazado operablemente a segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un mejorador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión se derivan generalmente del plásmido o del ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido eliminado de su medio genético natural y por lo tanto está libre de otras secuencias de codificación no deseadas o extrañas, y está en una forma adecuada para usarse dentro de los sistemas de producción de proteínas mediante ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquéllas que se separan de su medio ambiente natural e incluyen clones genómicos y de ADNc. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los cuales se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se presentan de manera natural tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para alguien con habilidades en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). ün polipéptido o proteina "aislada" es un polipéptido o proteina que se encuentra en una condición diferente a su medio ambiente natural, tal como separado de la sangre y del tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido separado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, mayor de 95% puros, más preferiblemente mayor del 99% puros. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dimeros o formas derivadas o glicosiladas alternativamente . El término "enlazado operablemente" cuando se refiere a segmentos de ADN, indica que los segmentos están arreglados de manera que funcionen en concierto para sus propósitos pretendidos, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación hasta el terminador. El término "ortólogo" denota un polipéptido o proteina obtenida de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o proteina de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la especiación. Los "parálogos" son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas fabricadas por un organismo. Se cree que los parálogos se generan a través de la duplicación genética. Por ejemplo, la a-globina, ß-globina y micglobina son parálogos entre si. Un "polinucleótido" es un polímero de doble o de una sola hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leidas desde el extremo 5' hasta el extremo 3' . Los polinucleótidos incluyen el ARN y ADN, y se pueden aislar de las fuentes naturales, se pueden sintetizar in vi tro, o se preparan a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan en pares de base (abreviados "pp") nucleótidos ("nt") , o kilobases ("kb") . En donde el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos, que son de doble hebra o de una sola hebra. Cuando el término se aplica a moléculas de doble hebra se utiliza para denotar una longitud completa y se entenderá que es equivalente al término "pares de base". Se reconocerá por aquellos hábiles en la técnica que las dos hebras de un polinucleótido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de las mismas se pueden colocar en etapas como resultado de la escisión enzimática; asi todos los nucleótidos dentro de un molécula de polinucleótido de doble hebra pueden no estar apareados. Tales extremos no apareados en general excederán 20 nt de longitud. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptidicos, ya sea producidos de manera natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se refieren comúnmente como "péptidos". El término "promotor" se utiliza aqui con su significado reconocido en la técnica para denotar una porción de un gen que contiene las secuencias de ADN que prcporcionan el enlace de la polimerasa de ARN y la iniciación de la 'transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones de no codificación 5' de los genes. Una "proteina" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteina también puede comprender componentes no peptidicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros substituyentes no peptidicos se pueden agregar a una proteina mediante la célula en la cual la proteina se produce, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas están definidas aqui en términos de sus estructuras básicas de aminoácidos; substituyentes tales como los grupos de carbohidratos son generalmente no especificados, pero sin embargo pueden estar presentes . El término "receptor" denota una proteina asociada a la célula que se enlaza a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y que media el efecto del ligando en la célula. Los receptores enlazados a la membrana se caracterizan por una estructura multi-peptidica que comprende un dominio de enlace de ligando extracelular y un dominio efector intracelular que está implicado típicamente en la transducción de la señal. El enlace del ligando al receptor da como resultado una cambio de conformación en el receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y otras moléculas en la célula. Esta interacción a su vez genera una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están enlazados a las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción de los genes, fosforilación, desfosforilación, incrementos e? la producción de AMP cíclico, movilización del calcio de las células, movilización de los lipidos de la membrana, adhesión celular hidrólisis de los lipidos de inositol e hidrólisis de fosfolipidos. En general, los receptores pueden ser enlazados a la membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, el receptor de la hormona que estimula la tiroides, el receptor beta-adrenérgico) o ultiméricos (el receptor PDGF, el receptor de la hormona de crecimiento, el receptor IL-3, el receptor GM-CSF, el receptor G-CSF, el receptor de eritropoyetina y el receptor IL-6) . El término "secuencia de señal secretoria" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido secretorio") que, como un componente de un polipéptido más grande dirige el polipéptido más grande a través de una via secretoria de una célula en la cual se sintetiza. El péptido más grande se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretorio durante el tránsito a través del sendero secretorio. El término "variante de empalme" se utiliza aqui para denotar las formas alternativas del ARN transcrito de un gen. La variación de empalme se genera naturalmente a través del uso de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula e ARN transcrita, o menos comúnmente entre moléculas de ARN transcritas de manera separada, y puede dar como resultado varios ARNms transcritos del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar los polipéptidos que tienen secuencia de aminoácidos alteradas. El término variante de empalme también se utiliza aqui para denotar una proteina codificada por una variante de empalme de un ARNm transcrito de un gen. Los pesos moleculares y longitudes de los polímeros determinados por los métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electrofóresis en gel) se entenderá que son valores aproximados. Cuando tales valores se expresan como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el valor establecido de X será entendido que tiene una exactitud de ±10%. Todas las referencias citadas aqui son en su totalidad incorporadas como referencia. La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de una nueva secuencia de ADN que codifica un polipéptido que tiene una homología parcial parcial al dominio de la porción terminante BRCA1 RING (Jensen, D.E. et al., Oncogene 16:1097-1112, 1998) y que contiene LRRs . El análisis de la distribución de los tejidos del ARNm que corresponde a este novedoso ADN mostró fuertes niveles de expresión en el corazón y en los músculos esqueléticos, y baja expresión en otros tejidos. El polipéptido se ha designado zapop3. Los nuevos polipéptidos zapop3 de la presente invención se identificaron inicialmente mediante el cuestionamiento de una base de datos EST para las proteínas homologas a las proteínas que tienen una secuencia de porción terminante RING. La porción terminante RING de consenso está caracterizada por una porción de cisteina de la fórmula: CXXCX{10-27}CXHX{2-3}CXXCX{5-16}CPXC, en donde X es cualquier aminoácido, C es Cisteina, H es Histidina, y {#-#} es el rango de repetición del residuo X precedente. Esta porción de cisteina se presenta en todas las proteínas de porción terminan RING, tales como, las proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs), y similares, y es única para esta familia de proteínas. Estos criterios de búsqueda se compararon con la base de datos EST para identificar nuevas proteínas que tienen homología a las proteínas de porción terminante RING conocidas. La secuencia completa del polipéptido zapop3 se obtuvo a partir de un solo clon que se creia que lo contenia, en donde el clon se obtuvo a partir de una biblioteca de granulocitos de la sangre periférica. Otras bibliotecas que también podrían ser investigadas para tales secuencias incluyen el corazón, músculos esqueléticos, páncreas, cerebro, estomago, colon, tiroides y similares. La secuencia de nucleótidos del zapop3 de longitud completa se describe en la SEC. ID NO: 1, y su secuencia de aminoácidos deducida se describe en la SEC. ID NO: 2. El análisis de la secuencia reveló el zapop3 es un miembro de una familia diversa de proteínas que contiene repeticiones ricas en leucina (LRRs), y es un miembro de una familia diversa de proteínas que se caracteriza por un dominio de porción terminante RING. El zapop3, a diferencia de las proteínas de porción terminante RING o LRR, contiene tanto el dominio de la porción terminante RING y las LRRs en la misma proteina. El análisis del ADN que codifica un polipéptido zapop3 (SEC. ID NO: 1) reveló una estructura de lectura abierta descrita que codifica 723 aminoácidos (SEC. ID NO: 2) . La alineación múltiple de zapop3 con BRCA1 y otros miembros de las proteínas de la porción terminante RING, tales como la IAP humana y murina además de las determinaciones estructurales a base de secuencias de aminoácidos reveló las siguientes regiones, dominios, y porciones conservadas: (1) Región LRR N-terminal, que corresponde al residuo de aminoácido 1 (Met) al residuo de aminoácido 223 (Leu) de la SEC ID NO: 2. Dentro de la región LRR existen 8 porciones LRR consecutivas, ordenadas desde el, N-terminal hasta el C-terminal: "LRR-1" (que corresponde a los aminoácidos 30 (Ala) a 55 (Leu) de la SEC ID NO: 2); "LRR-2" (que corresponde a los aminoácidos 56 (Gln) a 81 (Ala) de la SEC ID NO: 2) ; "LRR-3" (que corresponde a los aminoácidos 82 (Thr) a 104 (Thr) de la SEC ID NO: 2); "LRR-4" (que corresponde a los aminoácidos 105 (Ala) a 127 (Thr) de la SEC ID NO: 2) ; "LRR-5" (que corresponde a los aminoácidos 128 (Gln) a 150 (Arg) de la SEC ID NO: 2); "LRR-6" (que corresponde a los aminoácidos 151 (Ser) a 173 (Arg) de la SEC ID NO: 2); "LRR-7" (que corresponde a los aminoácidos 174 (Thr) a 199 (Ala) de la SEC ID NO: 2); y "LRR-8" (que corresponde a los aminoácidos 200 (He) a 223 (Leu) de la SEC ID NO: 2) . (2) Región 'hidrofilica central, que corresponde a los residuos de aminoácidos 224 (Glu) hasta los residuos de aminoácidos 348 (Arg) de la SEC ID NO: 2. (3) Región rica en hélice alfa, que corresponde a los residuos de aminoácidos 349 (Gln) a los residuos de aminoácidos 543 (Arg) de la SEC ID NO: 2. Dentro de esta región está un dominio hidrofilico corto que corresponde a los residuos de aminoácidos 520 (Lys) a los residuos de aminoácidos 543 (Arg) de la SEC ID NO: 2. (4) Región C-terminal que corresponde a los residuos de aminoácidos 544 (Gln) a los residuos de aminoácidos 723 (Ser) de la SEC ID NO: 2. Dentro de esta región está un dominio de porción terminante RING que corresponde a los residuos de aminoácidos 675 (Cys) a los residuos de aminoácidos 709 (Cys) de la SEC ID NO: 2, el cual contiene la secuencia de consenso de la porción terminante RING descrita anteriormente. La presencia de las porciones conservadas y de baja varianza en general se correlaciona con o define regiones estructurales importantes en las proteínas. Las regiones de baja varianza (por ejemplo, amontonamientos hidrofóbicos) por lo general están presentes en regiones de importancia estructural (Sheppard, P. et al., Gene 150: 163-167, 1994).

Tales regiones de baja varianza a menudo contienen aminoácidos raros o infrecuentes, tales como Triptofano. Las regiones flanqueantes y entre tales porciones conservadas y de baja varianza o variación pueden ser más variables, pero a menudo son funcionalmente significativas porque se relacionan a o definen estructuras importantes y actividades tales como los dominios de enlace, la actividad biológica y enzimática, la transducción de señal, los dominios de localización del tejido y similares. Por ejemplo, las regiones hidrofilicas y C-terminal descritas arriba pueden ser significativas funcionalmente. Además, algunos dominios, tales como el dominio de la porción terminante RING y las porciones LRR, tienen actividades biológicas conocidas, por ejemplo como proteina enlazante o dominios de enlace del ADN (Wang, H et al., Oncogene 15: 143-157, 1997; Buchanan, S. y Gay, N., Prog. Biophys. Molec. Biol. _65:l-44, 1996; Brzovic, P.S. et al., J. Biol. Chem. 273:7795-7799, 1998). Los polinucleótidos correspondientes que codifican las regiones, dominios, motivos y residuos y secuencias del polipéptido zapop3 son como se muestran en la SEC. ID. NO: 1. Los aminoácidos conservados en la región LRR y el dominio de la porción terminante RING del zapop3, se pueden usar como una herramienta para identificar nuevos miembros de la familia. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa-transcripción (RT-PCR) se puede usar para amplificar las secuencias que codifican la porción terminante RING del ARN obtenido de una variedad de fuentes de tejido o lineas celulares. En particular, los cebadores de oligonucleótidos altamente degenerados designados desde las secuencias de polinucleótidos de zapop3 son útiles para este propósito. El diseño tales cebadores degenerados se puede realizar rápidamente por alguien con habilidades en la técnica. La presente invención también proporciona moléculas de polinucleótidos, que incluyen moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos zapop3 descritos en la presente. Aquéllos con habilidades en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, la variación de la secuencia considerable es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEC. ID. NO: 3 es una secuencia de ADN degenerado que engloba todos los ADNs que codifican el polipéptido zapop3 de la SEC. ID. NO: 2. Aquellos hábiles en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC. ID. NO: 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican la SEC. ID. NO: 2 substituyendo U por T. Asi, los polinucleótidos que codifican al polipéptido zapop3 que comprenden del nucleótido 1 al nucleótido 2169 de la SEC. ID. NO: 3 y sus equivalentes de ARN están contemplados por la presente invención. La Tabla 1 establece los códigos de una letra utilizados dentro de la SEC. ID. NO: 3 para denotar las posiciones del nucleótido degenerado. Las "resoluciones" son los nucleótidos denotados por el código de una letra. El "complemento" indica el código para el (los) nucleótido (s) complementario (s) . Por ejemplo, el código Y denota ya sea C o T, y su R complemento denota A o G, A siendo complementaria a T, y G siendo complementaria a C. TABLA 1 Nucleótido Resolución Complemento Resolución A A C C G G G G C C T A A R A|G Y C|T Y C|T R A|G M A|C K G|T K G|T M A|C S C|G S C|G W A|T W A|T H A|C|T D A|G|T B CIGIT V A|C|G V A|C|G B CIGIT D A1G|T H A|C|T N A|C|G|T N AICIGIT Los codones degenerados utilizados en la SEC. ID NO: , que engloban a todos los posibles codones para un aminoácido dado, se establecen en la Tabla 2.

TABLA 2 Código Aminoácido Codon de una Codones Degenerado Letra Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC TCG CT WSN Thr T ACÁ ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly 0 GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC CAT GAY Glu E CAÁ GAG GAR Gln Q CAÁ CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R ACÁ AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG He I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y TAC TAT TAY Trp • W TGG TGG Ter • TAA TAG TGA TRR Asn | Asp B RAY GluIGln Z SAR Cualquiera X NNN Alguien con habilidades ordinarias en la técnica apreciará que alguna ambigüedad se introduzca en la determinación de un codon degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada uno de los aminoácido. Por ejemplo, el codon degenerado para la serina (WSN) puede, en algunos casos, codificar arginina (AGR) , y el codon degenerado para arginina (MGN) puede, en algunos casos, codificar para serina (AGY) . Una relación similar existe entre los codones que codifican la fenilalanina y leucina. Asi, algunos polinucleótidos englobados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias variantes de aminoácidos, pero solamente alguien con habilidades ordinarias en la técnica puede fácilmente identificar tales secuencias de variantes por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID NO: 2. Las secuencias variantes se pueden probar para' la funcionalidad como se describió aqui. Alguien con habilidades en la técnica también apreciará que las diferentes especies pueden mostrar "uso del codon preferencial". En general, ver, Grantham, et al., Nuc. Acids Res., 8_: 1893-1912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. , 6:315-324, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene, 13:355-364, 1981; Grosjean, H., y Fiers, W. , Gene, l_t:199_209' 1982, Holm, L., Nuc. Acids Res., 14:3075-3087, 1986; e Ikemura, T., J. Mol. Biol., 158: 573-597, 1982. Como se usa aqui, los términos "uso del codon preferencial" y "codones preferenciales" son términos en la técnica que se refieren a los codones de traducción de las proteínas que son más frecuentemente utilizados en células de una cierta especie, favoreciendo asi uno o unos cuantos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (ver Tabla 2) . Por ejemplo, el aminoácido Treonina (Thr) se puede codificar por ACÁ, ACC, ACG, ó ACT, pero en las células de mamíferos el ACC es el codon más comúnmente utilizado; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o bacterias, diferentes codones Thr pueden ser preferenciales. Los codones preferenciales para una especie particular se pueden introducir en los polinucleótidos de la presente invención por una variedad de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo, mejorar la producción de la proteina haciendo la traducción de la proteina más eficiente dentro de un tipo de célula particular o especie. Por lo tanto, la secuencia de codon degenerada descrita en la SEC. ID NO: 15 sirve como una plantilla o modelo para optimizar la expresión de los polinucleótidos en varios tipos y especies de células comúnmente utilizadas en la técnica y descritas aqui. Las secuencias que contienen codones preferenciales se pueden probar y optimizar para la expresión en varias especies, y se pueden probar para una funcionalidad como se describe aqui. Dentro de las modalidades preferidas de la invención los polinucleótidos aislados hibridizarán a regiones de tamaño similar de la SEC. ID NO: 1, o a una secuencia complementaria de la misma, bajo condiciones severas. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especifica a una resistencia iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se hibridiza a una sonda apareada perfectamente. Las numerosas ecuaciones para calcular Tm son conocidas en la técnica, y son especificas para los híbridos de ADN, ARN y ADN-ARN y las secuencias de la sonda de polinucleótidos de longitud variante (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); Ausubel et al . , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987). Berger y Kimmel (eds.) Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26_: 221 r 1990). El programa del análisis de secuencias tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) , asi como los sitios en Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y para calcular el Tm en base a los criterios definidos por el usuario. Tales programas también pueden analizar una secuencia dada bajo condiciones definidas e identificar las secuencias de sonda adecuadas. Típicamente, la hibridización de las secuencias de polipéptido más largas (por ejemplo, >50 pares de base) se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25 °C por debajo del Tm calculado. Para sondas más pequeñas (por ejemplo, <50 pares de base) la hibridización típicamente se lleva a cabo al Tm ó por debajo de 5-10 °C. Esto permite la proporción máxima de la hibridización para los híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. Los grados más elevados de severidad a temperaturas más bajas se pueden lograr con la adición de formamida lo cual reduce el Tm del híbrido a aproximadamente 1°C para cada formamida al 1% en la solución amortiguadora. Las condiciones de hibridización severas, adecuadas, son equivalentes de aproximadamente unas 5 horas hasta toda la noche de incubación a aproximadamente 42 °C en una solución que comprende: aproximadamente 40-50% de formamida, hasta aproximadamente SSC 6X, aproximadamente solución de Denhardt 5X, cero hasta aproximadamente 10% de sulfato de dextrano, y aproximadamente 10-20 µg/ml de ADN portador disponible comercialmente, desnaturalizado. En general, tales condiciones de severidad incluyen temperaturas de 20-70 °C y un amortiguador de hibridización que contiene hasta SSC 6x y formamida al 0-50%; la hibridización se realiza entonces lavando los filtros en hasta aproximadamente SSC 2X. Por ejemplo, un lavado adecuado de severidad es equivalente a SSC 0.1X a SSC 2x, SDS al 0.1%, de 55°C hasta 65°C. Los diferentes grados de severidad se pueden utilizar durante la hibridización y lavado para lograr un enlace especifico máximo a la secuencia objetivo. Típicamente, los lavados después de la hibridización se realizaron a grados incrementados de severidad para eliminar las sondas de polinucleótido no hibridizada de los complejos hibridizados. Las condiciones de hibridización y de lavado, severas, dependen de la longitud de la sonda, reflejadas en la Tm, las soluciones de hibridización y lavado utilizadas, y son rutinariamente determinadas de manera empírica por alguien con habilidades ordinarias en la técnica. Como se notó previamente, los polinucleótido aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para la preparación de ADN y ARN son bien conocidos en la técnica. En general, el ARN se aisla de un tejido o célula que produce grandes cantidades de ARN de zapop3. Tales tejidos y células se identifican mediante manchado o transferencia Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_7:5201, 1980), e incluyen la tiroides, aunque el ADN también se puede preparar utilizando ARN de otros tejidos o lineas celulares o aislado como ADN genómico. El ARN total se puede preparar utilizando la extracción de isotiocianato de guanidinio seguido por aislamiento mediante centrifugación en un gradiente CsCl (Chirg in et al., Biochemistry 1__:52~94/ 1979). El ARN poli (A) + se prepara a partir del ARN utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972). El ADN complementario (ADNc) se preparar a partir del poli (A) + utilizando métodos conocidos. En un alternativa, el ADN genómico se puede aislar. Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zapop3 se identifican entonces y aislar mediante, por ejemplo, hibridización o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis, Patente Norteamericana No. 4,683,202) . Un clon de longitud completa que codifica al zapop3 se puede obtener mediante procedimientos de clonación convencionales. Los clones de ADN complementarios (ADNc) son preferidos, aunque para algunas aplicaciones (por ejemplo, expresión en animales transgénicos) puede ser preferible utilizar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para incluir al menos un intrón genómico. Los métodos para la preparación de ADNc y clones genómicos son bien conocidos y están dentro del nivel de alguien con habilidades ordinarias en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia descrita aquí, o partes de la misma, para la generación de sondas o el cebado de una biblioteca. Las bibliotecas de expresión se pueden convertir en sondas con anticuerpos para el zapop3, los fragmentos receptores u otras porciones de enlace específicas . Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden sintetizar utilizando máquinas de síntesis de ADN, por ejemplo utilizando el método de fosforamidita. Un gen zapop3 sintético se puede construir a partir de un grupo de oligonucleótidos complementarios, sobrepuestos, cada uno de los cuales está entre 20 a 60 nucleótidos de longitud. Cada sección interna del gen tiene extensiones terminales 3' y 5' complementarias diseñadas para los pares de base precisamente con una sección adyacente. Así, después de que se ensambla el gen el proceso se completa sellando los cortes o hendiduras a lo largo de las estructuras básicas de las dos hebras con ligasa de ADN T4. Además de la secuencia de codificación de la proteína, los genes sintéticos se pueden diseñar con secuencias terminales que faciliten la inserción en un sitio de endonucleasa de restricción de un vector de clonación. Además, se pueden agregar otras secuencias que contienen señales para la iniciación y terminación adecuadas de la transcripción y traducción. Alternativamente, se puede utilizar un conjunto especificado de oligonucleótidos que se sobrepongan parcialmente (40 a 100 nucleótidos) . Después de lo cual las regiones cortas complementarias 3' y 5' , que se sobreponen, se aparean, los espacios grandes aún permanecen, pero las regiones apareadas de bases cortas son lo suficiente largas y estables para mantener la estructura de manera conjunta. Las separaciones o espacios se llenan y el ADN dúplex se completa vía la síntesis enzimática del ADN por la polimerasa I de ADN de E. coli . Después se completa la síntesis enzimática, y las porciones extremas se sellan con ligasa de ADN T4. Los constructores de doble hebra se enlazan secuencialmente entre sí para formar la secuencia del gen completa que se verifica mediante el análisis de secuencia de ADN. Ver Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies & Applications of Recombinant DNA, (ASM Press, Washington, D.C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56, 1989 y Cumie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:633-7, 1990) . Las secuencias del polinucleótido zapop3 descritas aquí también se pueden utilizar como sondas o cebadores para las regiones no codificantes 5' de un gen zapop3. En vista de la expresión específica del tejido observada para zapop3 mediante manchado Northern, es espera que esta región del gen proporcione la expresión específica de los músculos esqueléticos y del corazón. Los elementos promotores de un gen zapop3 podrían así ser utilizados para dirigir la expresión específica del tejido de los genes heterólogos en, por ejemplo, animales transgénicos o pacientes tratados con terapia génica. La clonación de las secuencias flanqueantes 5' también facilita la producción de las proteínas zapop3 mediante la "activación de genes" como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,641,670. De manera breve, la expresión de un gen zapop3 endógeno en una célula se altera introduciendo en el sitio de zapop3 un constructo de ADN que comprende al menos una secuencia objetivo, una secuencia reguladora, un exon, y un sitio donador de empalme no apareado. La secuencia objetivo es una secuencia no codificante 5' del zapop3 que permite la recombinación homologa del constructo con el sitio del zapop3 endógeno, por medio de lo cual las secuencias dentro del constructo se llegan a enlazar operablemente con la secuencia de codificación del zapop3 endógeno. De esta manea, un promotor del zapop3 endógeno se puede reemplazar o suplementar con otras secuencias reguladoras para proporcionar la expresión del tejido especifica, mejorada, o de otra manera regulada. La presente invención además proporciona polipéptidos y polinucleótidos de contrapartes de humanos (parálogos) y de otras especies (ortólogos) . Estas especies incluyen, pero no están limitadas a, mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies vertebradas e invertebradas. De particular interés son los parálogos y polipéptidos de humanos de zapop3 de otras especies de mamíferos, que incluyen murinos, ratones, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y otras proteínas de primates. Los ortólogos del zapop3 humano, se pueden clonar utilizando la información y composiciones proporcionadas por la presente invenciónen combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc se puede clonar utilizando el ARNm obtenido de un tejido o tipo celular que expresa el zapop3 como se describió aquí. Las fuentes adecuadas de ARNm se pueden identificar mediante manchado Northern de las sondas con las sondas diseñadas de las secuencias descritas aquí. Una biblioteca se prepara entonces a partir del ARN de un tejido positivo o línea celular. El ADNc que codifica al zapop3 se puede aislar entonces por una variedad de métodos, tales como la generación de sondas con un ADNc humano completo o parcial con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. Un ADNc también se puede clonar utilizando la reacción en cadena de polimerasa, o PCR (Mullís, Patente Norteamericana No. 4,683,202), utilizando cebadores diseñados de las secuencias de zapop3 humanas representativas descritas aquí. Dentro de un método adicional, se puede utilizar una biblioteca de ADN para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del ADNc de interés se puede detectar con un anticuerpo para el polipéptido zapop3. También se pueden aplicar técnicas similares al aislamiento de los clones genómicos. Aquellos hábiles en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEC. ID NO: 1 representan un solo alelo del gen y polipéptido humano zapop3, y se espera que ocurran que la variación alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta secuencia se pueden clonar mediante la generación de sondas de ADNc o bibliotecas genómicas de diferentes individuos de acuerdo a los procedimientos estándar. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEC. ID NO: 1, que incluye aquellas que contienen las mutaciones silentes y aquéllas en las cuales las mutaciones resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como son las proteínas que son las variantes alélicas de la SEC. ID NO: 2. Los ADNcs generados de los ARNms empalmados alternativamente, que retienen las propiedades del polipéptido zapop3 se incluyen dentro del alcance de la presente invención, como son los polipéptidos codificados por tales ADNcs y ARNms. Las variantes alélicas y variantes de empalme de estas secuencias se pueden clonar mediante la generación de sondas de ADNc o bibliotecas genómicas por ejemplo una biblioteca de ADNc de tiroides humana, de diferentes individuos o tejidos de acuerdo a los procedimientos estándares conocidos en la técnica. Los correspondientes polinucleótidos que codifican el polipéptido, regiones, dominios, motivos, residuos y secuencias de zapop3, descritos anteriormente son como se muestra en la SEC. ID. NO: 1. La presente invención también proporciona los polipéptidos zapop3 que son substancialmente similares a los polipéptidos de la SEC. ID NO: 2 y sus ortólogos. El término "substancialmente similar" se utiliza aquí para denotar los polipéptidos que tienen 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente al menos 80%, de identidad de secuencia a las secuencias mostradas en la SEC. ID NO: 2 o sus ortólogos. Tales polipéptidos serán más preferiblemente al menos 90% idénticos, y más preferiblemente 95% ó más idénticos a la SEC. ID NO: 2 o sus ortólogos. El porcentaje de la identidad de secuencia se determina mediante métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul et al., Bull . Math. Bio. 48: 603-616, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA _89: 19015-10919, 1992. De manera breve, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los regiones de alineación utilizando un valor de castigo de abertura de espacio de 10, un valor de castigo por la extensión del espacio de 1, y la matriz de registro "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid. ) como se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos se indican por los códigos estándar de una sola letra) . El porcentaje de identidad se calcula como: Número total de apareamientos idénticos x 100 [longitud de la secuencia larga más el número de espacios introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias] > r~ ?-t 01 co £-< ?n J J O 1 1 CQ G rH ro J OJ 1 1 1 C r» H <d« CO J 1 1 1 1 Cu l£> OJ OJ H CO ?-l _, -n rH ro H O rH ro J J 1 1 1 1 1 J CM cs O CO J OJ rH rH 1 1 1 1 1 1 f-t "# CM ro H O CO OJ rH ro rH ro 1 1 1 1 1 1 K co ro ro rH J H OJ H ? OJ J ro 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 o < > o. •*< OJ o co J o J OJ ro o 1 1 1 1 1 1 1 1 t ? ID J o ro ro H ! ro H o H ro Ol J 1 1 1 1 < 1 1 1 1 1 s ID J OJ o m J O ro H o rH OJ rH OJ 1 1 1 1 1 1 1 1 u C? ro rn ro rH H rH ] ro H H OJ J rH I 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 P o co o J H ro H ro ro H O H ro ro I 1 t. 1 1 1 1 1 ¡a y> r-l ro o O o H e rO O Ol co OJ i-l O J ro 1 1 1 t 1 1 1 r. 05 u. o J ro rH O J O C. J H ro J H H co J ro 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 rd rH < •<a< rH J OJ o H OJ r. rH iH J H H O ro OJ o -Q 1 1 1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 1 rd E-? *C 05 2 Q U o¡ ? O S H I-. M 2 C. CU D_ E- S í* > La identidad de secuencia de las moléculas de polinucleótidos se determina mediante métodos similares utilizando una proporción como se describió arriba. Aquellos hábiles en la técnica apreciarán que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similaridad o similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineación de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita aquí y la secuencia de aminoácidos de una variante de zapop3 putativa. El algoritmo FASTA se describe por Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). De manera breve, el FASTA primero caracteriza la similaridad de secuencia identificando las regiones compartidas por la secuencia de cuestionamiento (por ejemplo, SEC. ID NO: 2) y una secuencia de prueba que tiene ya sea la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o los pares de identidades (si ktup = 2) , sin considerar las substituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos conservativas. Las diez regiones con la densidad más alta de identidades entonces se re-registran comparando la similaridad de todos los aminoácidos apareados utilizando una matriz de substitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se "recortan" para incluir solamente aquellos residuos que contribuyen con el registro más alto. Si hay varias regiones con registros mayores que el valor "de corte" (calculado por una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y al valor ktup) , entonces las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar sí las regiones se pueden unir para formar una alineación aproximada con las separaciones o espacios. Finalmente, las regiones de registro más alto de las dos secuencias de aminoácidos se alinean utilizando una modificación del algoritmo Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. £8:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), el cual permite las inserciones y eliminaciones de aminoácidos. Los parámetros ilustrativos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalidad por abertura del intervalo = 10, penalidad por extensión del intervalo = 1, y matriz de substitución = BLOSUM62. Estos parámetros se pueden introducir en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de registro ("SMATRIX") , como se explicó en el Apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). El FASTA también se puede utilizar para determinar la identidad de secuencia de las moléculas de ácido nucleico utilizando una proporción como se describió arriba. Para comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor ktup puede estar en el rango de entre uno a seis, preferiblemente de tres a seis, más preferiblemente tres, con otros parámetros ajustados por defecto. La tabla BLOSUM62 (Tabla 3) es una matriz de substitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2,000 alineaciones múltiples locales de los segmentos de la secuencia de proteina, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992) ) . De acuerdo con esto, se pueden utilizar las frecuencias de substitución BLOSUM62 para definir las substituciones conservativas de aminoácidos que se pueden introducir en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar substituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (como se discute más adelante) , el lenguaje "substitución conservativa de aminoácidos" se refiere preferiblemente a una substitución representada por un valor BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una substitución de aminoácidos es conservativa si la substitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de O, 1, 2 ó 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones conservativas de aminoácidos preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 ó 3), mientras que las sustituciones conservativas e aminoácidos más preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3) . Los polipéptidos variantes de zapop3 ó los polipéptidos substancialmente homólogos de zapop3 están caracterizados por tener una o más substituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, que es conservativa de las substituciones de aminoácidos (ver Tabla 4) y otras substituciones que no afectan significativamente la actividad del polipéptido; las pequeñas eliminaciones, típicamente de uno hasta aproximadamente 30 aminoácidos; y las extensiones pequeñas de amino o carboxilo terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador de pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una marca de afinidad. La presente invención incluye así los polipéptidos desde aproximadamente 698 hasta aproximadamente 750 residuos de aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, y más preferiblemente 95% ó más idéntica a la región correspondiente de la SEC. ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden marcas de afinidad pueden además comprender un sitio de escisión proteolítico entre el polipéptido zapop3 y la marca de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de escisión de la trombina y los sitios de escisión del factor Xa. Tabla 4 Substituciones de Aminoácidos Conservativas Básicas: arginina lisina histidina Acídicas : ácido glutámico ácido aspártico Polares : glutamina asparagina Hidrofóbicas : leucina isoleucina valina Aromáticas : fenilalanina triptofano tirosina Pequeñas: glicina alanina serina treonina metionina La presente invención proporciona además una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. por ejemplo, un polipéptido zapop3 se puede preparar como una fusión para una proteina dimerizante como se describió en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas dimerizantes preferidas en relación a esto incluyen los dominios de la región constante de la inmunoglobulina. Las fusiones del polipéptido zapop3 de inmunoglobulina se pueden expresar en células modificadas mediante ingeniería genética para producir una variedad de análogos zapop3 multiméricos . Los dominios auxiliares se fusionar a los polipéptidos zapop3 para volverlos un objetivo a las células, tejidos, o macromoléculas específicas (por ejemplo, colágeno) . Por ejemplo, un polipéptido o proteina zapop3 se puede volver un objetivo para un tipo de célula predeterminado mediante la fusión de un polipéptido zapop3 a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor en la superficie de la célula objetivo. De esta manera, los polipéptidos y proteínas se pueden volver objetivos para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido zapop3 se puede fusionar a dos o más porciones, tales como una etiqueta de afinidad para la purificación y un dominio de objetivo. Las fusiones del polipéptido también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre los dominios. Ver Tuan et al., Connective Tissue Research 3_4:l-9, 1996. Las proteínas de la presente invención también pueden comprender residuos de aminoácidos que no se presentan de manera natural. Los aminoácidos que no se presentan de manera natural incluyen, sin limitación trans-3-metilprolina, 2, 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteina, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidin carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3, 3-dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina, y 4-fluorofenilalanina. Se conocen muchos métodos en la técnica para la incorporación de residuos de aminoácidos que no se presentan de manera natural en las proteínas. Por ejemplo, un sistema in vi tro se puede emplear en donde las mutaciones sin sentido se supriman utilizando los ARNts supresores aminoacilados químicamente. Los métodos para la síntesis de aminoácidos y el ARNt aminoacilado se conocen en la técnica. La transcripción y traducción de los plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se realiza en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas disponibles comercialmente y otros reactivos. ' Las proteínas se purifican mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-809, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-10149, 1993) . En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en oocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y los ARNts supresores aminoacilados químicamente (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-19998, 1996). Dentro de un tercer método, las células de __. coli se cultivan en la ausencia de un aminoácido natural que se va a remplazar (por ejemplo, fenilalanina) y en la presencia de los aminoácidos que no se presentan de manera natural, deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4-azafenilalanina, ó 4-fluorofenil-alanina) . Los aminoácidos que no se presentan de manera natural se incorporan dentro de la proteina en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al., Biochem. 33:7470-7476, 1994. Los residuos aminoácidos que se presentan de manera natural se pueden convertir en especies que no se presentan de manera natural mediante una modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente el rango de substituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993). Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, los aminoácidos que no se presentan de manera natural, y los aminoácidos no naturales se pueden substituir para los residuos de aminoácidos zapop3. Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos zapop3 de la presente invención se pueden identificar de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica, tales la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis por exploración de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:4498-502, 1991). En la última técnica, las mutaciones de una sola alanina se introducen en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultante se prueban para su actividad biológica o bioquímica como se describió abajo para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Los sitios del ligando-receptor u otras interacciones . biológicas también se pueden determinar mediante análisis fisico de la estructura, como se determinó mediante tales técnicas como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, en conjunción con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto putativo. Ver, por ejemplo, de Vos et al., Science 255 : 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también se pueden inferir del análisis de las homologías con los miembros relacionados de la familia. Las substituciones múltiples de aminoácidos también se pueden realizar y probar utilizando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquéllos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241 : 53-57, 1988) ó Bowie y Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA _86: 2152-2156, 1989). De manera breve, estos autores describen métodos para la aleatorización simultáneamente de dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando polipéptidos funcionales, y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de substituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la muestra del fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem., 30:10832-10837, 1991; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Huse, Publicación WIPO WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 4_6:145, 1986; Ner et al., DNA 7:127, 1988). Las variantes del ADN de zapop3 descrito y las secuencias del polipéptido se pueden generar a través del entremezclado del ADN como se describió por Stemmer, Nature 370:389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994 y la Publicación WIPO WO 97/20078. De manera breve, los ADNs variantes se generan mediante una recombinación homologa in vi tro mediante fragmentación aleatoria de un ADN generador seguido por un reensamblaje utilizando PCR, resultando en mutaciones en puntos introducidos aleatoriamente. Esta técnica se puede modificar utilizando una familia de ADNs generadores, tales como variantes alélicas o ADNs de diferentes especies, para introducir la variabilidad adicional en el proceso. La selección o separación para la actividad deseada, seguida por las iteraciones adicionales de la mutagénesis y del ensayo proporciona una rápida "evolución" de las secuencias seleccionando las mutaciones deseables mientras que se lleva a cabo una selección simultánea contra los cambios negativos . Los métodos de mutagénesis se describen aquí y se pueden combinar con métodos de selección automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados, en las células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos (por ejemplo, secretados y detectados por anticuerpos; o medidos mediante una ensayo de tipo de transducción de señal) se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente utilizando equipo moderno. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. Utilizando los métodos descritos aqui, alguien con habilidades ordinarias en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que son homólogos substancialmente a la SEC. ID NO: 2, ó a las variantes alélicas de los mismos y retener las propiedades funcionales y estructurales de la proteina nativa. Por ejemplo, alguien podría fabricar un "fragmento de enlace de la proteína" de zapop3 preparando una variedad de polipéptidos que son substancialmente homólogos a la región LRR o al dominio de la porción terminante RING y retener la actividad de enlace a la proteína de la proteína zapop3 tipo salvaje. Tales polipéptidos pueden incluir aminoácidos adicionales de, por ejemplo, parte o todos los dominios C-terminales y N-terminales. Tales polipéptidos también pueden incluir segmentos de polipéptidos adicionales, como se describe arriba de manera general en la presente tales como marcas de afinidad, y similares. Para cualquier polipéptido zapop3, incluyendo variantes y proteínas de fusión, alguien con habilidades ordinarias en la técnica puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótido degenerada completa que codifica esta variante utilizando la información establecida en las Tablas 1 y 2 anteriores. Los polipéptidos zapop3 de la presente invención, que incluyen polipéptidos de longitud completa, fragmentos activos biológicamente, y polipéptidos de fusión, se pueden producir en células huésped modificadas mediante ingeniería genética de acuerdo a las técnicas convencionales. Las células hospederas adecuadas son aquéllos tipos de células que se pueden transformar o transfectar con ADN exógeno y crecer en un cultivo, e incluyen células de bacterias, hongos, y células eucarióticas superiores cultivadas. Las células eucarióticas particularmente las células cultivas de organismos multicelulares, son las preferidas. Las técnicas para la manipulación de moléculas de ADN clonadas y la introducción del exógeno en una variedad células hospederas se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido zapop3 de la presente invención está enlaza operablemente a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen generalmente el promotor de transcripción y el terminador, dentro de un vector de expresión. El vector comúnmente contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos hábiles en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas los marcadores seleccionables se pueden proporcionar en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno se puede proporcionar mediante integración en el genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vector y otros elementos es una materia de diseño de rutina dentro del nivel de habilidades ordinarias en la técnica. Muchos de tales elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido zapop3 hacia el sendero secretorio de una célula huésped, una secuencia de señal secretoria (también conocida como un péptido secretorio, secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) se proporciona en el vector de expresión. La secuencia de señal secretoria puede ser aquélla del polipéptido zapop3, o se puede deriva de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo . La secuencia de señal secretoria está enlazada a la secuencia de ADN del zapop3, es decir, las dos secuencias están unidas en la estructura de lectura correcta y colocadas para dirigir el péptido nuevamente sintetizado hacia la via o sendero de la célula huésped. Las secuencias de señal secretorias están colocadas comúnmente en 5' a la secuencia de ADN que codifica al polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretorias se pueden colocar en cualquier lugar en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch et al., Patente Norteamericana No. 5,037,743, Holland et al., Patente Norteamericana No. 5,143,830) . Para dirigir la exportación de un polipéptido zapop3 de la célula hospedera, el ADN del zapop3 se enlaza a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretorio, tal como un péptido secretorio t-PA. Para facilitar la purificación del polipéptido del receptor secretado, una extensión C-terminal, tal como una marca de poli-histidina, substancia P, péptido Flag (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204-1210, 1988; disponible de Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteina para el cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico está disponible, se puede fusionar al polipéptido zapop3. Las células de mamíferos, cultivadas, son adecuadas como células huésped dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno en las células huésped de mamíferos incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 1^: 603 , 1981: Graham y Van der Eb, Virology 5_2:456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1 : 841-845, 1982), transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), y la transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993), y los vectores virales (A. Miller y G. Rosman, BioTechniques 2:980~90' 1989'" Q-Wang y M. Finer, Nature Med. 2:714-16, 1996) . La producción de polipéptidos recombinantes en células de mamífero cultivadas se describe, por ejemplo, por Levinson et al., Patente Norteamericana No. 4,713,339; Hagen et al., Patente Norteamericana No. 4,784,950; Palmiter et al., Patente Norteamericana No. 4,579,821; y Ringold, Patente Norteamericana No. 4,656,134. Las células de mamíferos cultivadas, adecuadas, incluyen la COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. 10314), 293 (ATCC No. CRL 1373; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y las lineas celulares de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-Kl; ATCC No.

CCL 61) . Las líneas celulares adecuadas, adicionales, son conocidas en la técnica y están disponibles al público de los depositantes tales como en la Colección de Cultivos Tipo Americanos, Manassas, VA. En general, los promotores de transcripción fuertes son los preferidos, tales como promotores de SV-400 ó citomegalovirus. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,956,288. Otros promotores adecuados incluyen aquéllos de los genes metalotioneina (Patente Norteamericana No. 4,579,821 y 4,601,978) y el promotor tardío principal del adenovirus. La selección del fármaco generalmente se utiliza para seleccionar las células de mamíferos cultivadas dentro del ADN extraño que ha sido insertado. Tales células comúnmente son referidas como "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en la presencia del agente selectivo y son capaces de pasar el gen de interés a su progenie son referidas como "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se lleva a cabo en la presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, tal como G-418 o similares. Los sistemas de selección también se pueden usar para incrementar el nivel de expresión de interés, un proceso referido como "amplificación". La amplificación se lleva a cabo mediante el cultivo de los transfectantes en la presencia de un bajo nivel del agente de selección y luego incrementando la cantidad del agente de selección para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la reductasa de dihidrofolato, que confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a los fármacos (por ejemplo, de resistencia a la higromicina, resistencia a los fármacos múltiples, acetiltransferasa de puromicina) también se pueden utilizar. Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tales como la proteina fluorescente verde, o proteínas de superficie celular tales como CD4, CD8, MHC Clase I, la fosfatasa alcalina de la placenta, se pueden utilizar para clasificar las células transfectadas de las células no transfectadas por tales medios tales como la clasificación por FACS o la tecnología de separación de cuentas magnéticas. Otras células eucarióticas superiores también se pueden utilizar como huéspedes, que incluyen células de plantas, células de insectos y células de aves. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para la expresión de genes en células de plantas ha sido revisado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) _ll 47-58, 1987 y en la Publicación WIPO WO 94/06463. La transformación de las células de insectos y la producción de polipéptidos extraños en las mismas se describe por Guarino et al., Patente Norteamericana No. 5,162,222; y en la publicación WIPO 94/06463. Las células de insectos se puedan infectar con baculovirus recombinante, comúnmente derivados del virus polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) . Ver, King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; y, Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Un segundo método para fabricar baculovirus de zapop3 recombinante utiliza un sistema basado en los transposones descritos por Luckow (Luckow, V.A., et al., J. Virol 67:4566-79, 1993). Este sistema, que utiliza los vectores de transferencia, es vendido en el equipo Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBací™ (Life Technologies) que contiene un transposon Tn7 para mover el ADN que codifica al polipéptido zapop3 hacia un genoma del baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado un "bacmid". El vector de transferencia pFastBací™ utiliza el promotor de polihedrina AcNPV para accionar la expresión del gen de interés, en este caso el zapop3. Sin embargo, el pFastBací™ se puede modificar hasta un grado considerable. El promotor de polihedrina se puede eliminar y substituir con el promotor de la proteina básica del baculovirus (también llamado como promotor Peor, p6.9 ó MP) el cual se expresa más temprano en la infección con baculovirus, y ha demostrado ser ventajoso para expresar las proteínas secretadas. Ver, Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J Gen Virol 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J Gen Virol 75:1551-6, 1994; y, Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J Biol Chem 270: 1543-9, 1995. En tales constructos del vector de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteina básica. Además, los vectores de transferencia se pueden construir de manera que reemplacen las secuencias de señal secretorias de zapop3 nativa con las secuencias de señal secretorias derivadas de las proteínas de insectos. Por ejemplo, una secuencia de señal secretoria de la Glucosiltransferasa de Ecdisteroide (EGT) , Melitina de miel de abeja (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) , o gp67 del baculovirus (PharMingen: San Diego, CA) se pueden utilizar en constructos para reemplazar la secuencia de señal secretoria de zapop3 nativa. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en la estructura con el ADN que codifica una marca de epítope en el C- o N-terminal del polipéptido zapop3 expresado, por ejemplo, una marca del epítope Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985). Utilizando una técnica conocida en el arte, un vector de transferencia que contiene el zapop3 se transforma en E. coli, y se separa o selecciona con respecto a los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo del baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aisla, utilizando técnicas comunes y se usa para transfectar las células de Spodoptera frugiperda, por ejemplo, las células Sf9. El virus recombinante que expresa el zapop3 es producido subsecuentemente. El material viral recombinante se fabrica mediante los métodos comúnmente utilizados en la técnica. El virus recombinante se utiliza para infectar las células huésped, típicamente una línea celular derivada del gusano soldado, Spodoptera frugiperda . Very en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO™ (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente Norteamericana No. 5,300,435). El medio libre de suero, disponible comercialmente se utiliza para hacer crecer y mantener las células. El medio adecuado es el Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y Ex-cel3O405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células T. ni . Las células se hacen crecer desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 10 células hasta una densidad de 1-2 x 106 células en cuyo tiempo un material viral recombinante se agrega a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 a 10, más típicamente cerca de 3. Los procedimientos utilizados son generalmente descritos en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Possee, R.D. ibid. ; O'Reilly, D.R. et al., ibid. ; Richardson, C. D., ibid. ) . La purificación subsecuente del polipéptido zapop3 del sobrenadante se puede lograr utilizando los métodos descritos aqui. Las células de hongos, que incluyen células de levaduras, también se pueden utilizar dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de particular interés en relación a esto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Pichia methanolica . Los métodos para la transformación de las células de S. cerevisiae con el ADN exógeno y la producción de los polipéptidos recombinantes de las mismas se describe por, por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No. 4,599,311; Kawasaki et al., Patente Norteamericana No. 4,931,373; Brake, Patente Norteamericana No. 4,870,008; Welch et al., Patente Norteamericana No. ,037,743; y Murray et al., Patente Norteamericana No. 4,845,075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a los fármacos o la capacidad para crecer en la ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina) . Un sistema de vector preferido para usarse en Saccharomyces cerevisiae es el sistema del vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (Patente Norteamericana No. 4,931,373), que permite que las células transformadas sean seleccionadas mediante ei crecimiento en un medio que contiene glucosa. Los promotores adecuados y terminadores para usarse en levaduras incluyen aquéllos de los genes de enzima glicolitica (ver, por ejemplo, Kawasaki, Patente Norteamericana No. 4,599,311; Kingsman et al., Patente Norteamericana No. 4,615,974; y Bitter, Patente Norteamericana No. 4,977,092) y los genes alcohol deshidrogenasa. Ver también Patentes Norteamericanas Nos. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 y 4,661,454. Los sistemas de transformación para otras levaduras, que incluyen Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica , Phicia guillermondii y Candida maltosa, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459^3465, 1986 y Cregg, Patente Norteamericana No. 4,882,279. Las células de Aspergillus se pueden utilizar de acuerdo a los métodos de McKnight et al., Patente Norteamericana No. 4,935,349. Los métodos para transformar al Acremonium chrysogenum se describen por Sumino et al., Patente Norteamericana No. 5,162,228. Los métodos para transformar la Neurospora se describen por Lambowitzs, Patente Norteamericana No. 4,486,533. El uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes se describe en las Publicaciones WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, . y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para usarse en la transformación de P. methanolica se prepararán comúnmente como plásmidos circulares de doble hebra, los cuales se linealizan preferiblemente antes de la transformación. Para la producción del polipéptido en P. methanolica , se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean aquéllos de un gen de P. methanolica tales como un gen de utilización del alcohol de P. methanolica (AUG1 ó AUG2) . Otros promotores útiles incluyen aquéllos de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS) , formiato deshidrogenasa (FMD), y genes de catalasa (CAT) . Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma huésped, se prefiere tener el segmento de expresión completa del plásmido flanqueado en ambos extremos por las secuencias del ADN huésped. Un marcador seleccionable preferido para utilizarse en la Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, el cual codifica la carboxilasa de fosforibosil-5-aminoimidazol (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células huésped de ade2 crezcan en la ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala en donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere el uso de células huésped en las cuales tanto los genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2) sean eliminados. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren las células huésped deficientes en genes de proteasa vacuolar ( PEP4 y PRB1 ) . Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en las células de P. methanolica . Se prefiere transformar las células de P. methanolica mediante electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado, que disminuye exponencialmente, que tiene una resistencia de campo de 2.5 a 4.5 kV/cm, preferiblemente alrededor de 3.75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) desde 1 hasta 40 milisegundos, más preferiblemente alrededor de 20 milisegundos .

Las células huésped procarióticas, que incluyen cepas de la bacteria Escherichia coli, Bacillus y otros géneros son también células huésped útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos huéspedes y expresar las secuencias de ADN extrañas clonadas en las mismas son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido zapop3 en bacterias tales como __. coli, el polipéptido se puede retener en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles, o se puede dirigir hacia el espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células se usan, y los granulos se recuperan y se desnaturalizan utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidino o urea. El polipéptido desnaturalizado se puede re-doblar y dimerizar mediante la dilución del desnaturalizante, tal como por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutationa oxidada y reducida, seguido por diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido se puede recuperar del espacio periplásmico en una forma funcional y soluble mediante la disrupción de las células (polipéptido, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalización y re-doblado. Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivaron de acuerdo a los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de las células huésped escogidas. Una variedad de medios adecuados, incluyen los medios definidos y los medios complejos, son conocidos en la técnica y generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener tales componentes como factores de crecimiento o suero, según se requiera. El medio de crecimiento generalmente se seleccionará para las células que contienen el ADN agregado exógenamente, por ejemplo, para la selección de fármacos o deficiencia en un nutriente esencial el cual se complementa por el marcador seleccionable realizado en el vector de expresión o co-transfectado en la célula huésped. Las células de P. methanolica se cultivan en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y nutrientes de trazas a una temperatura de aproximadamente 25°C a 35°C. Los cultivos líquidos se proporcionan con una aireación suficiente mediante medios convencionales, tales como agitación de matraces pequeños o rocío de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para P. methanolica es el YEPD (D-glucosa al 2%, Bacto™ Peptona al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto™ al 1% (Difco Laboratories), adenina al 0.004% y L-leucina al 0.006%) . Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención hasta una pureza >80%, más preferiblemente hasta una pureza >90%, aún- más preferiblemente la pureza >95%, y particularmente se prefiere un estado puro farmacéuticamente, que es mayor que el 99.9% de pureza con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido purificado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal . Los polipéptidos zapop3 recombinantes expresados (o polípéptidos zapop3 quiméricos) se pueden purificar utilizando los métodos y medios de purificación por fraccionación y/o convencionales. Por ejemplo, los métodos de purificación particulares para el TIGR, descritos por Nguyen, supra. , son ejemplares, y se pueden adaptar al polipéptido zapop3 por alguien con habilidades ordinarias en la técnica utilizando los métodos descritos más adelante. Un método de purificación ejemplar para los constructos que tiene una etiqueta de afinidad tales como una etiqueta FLAG N-terminal o C-terminal producidas de las células de mamífero, tal como las células BHK, involucra utlizar un anticuerpo para el epítope de la etiqueta FLAG para purificar la proteína zapop3. El medio condicionado de las células BHK filtra de una estéril secuencialmente a través de un filtro de cápsulas OptiCap Millipore (Bedford, MA) de 0.2 mM, de 4 pulgadas, y un Supercap 50 de Gelman (Ann Arbor, MI) 0.2 mM. El material se concentra entonces utilizando un concentrador Amicon (Beverly, MA) DC 10L equipado con cartucho de fibras huecas A/G Tech (Needham, MA) con una membrana de corte de 3000 kDa de 15 pies cúbicos. El material concentrado se filtra de manera estéril nuevamente con el filtro Gelman como se describió arriba. Se agrega una alícuota de anti-Flag Sepharose (Eastman Kodak, Rochester, NY) a la muestra para la absorción discontinua o por lotes y la mezcla se agita suavemente en un aparato de cultivo en forma de rodillo Wheaton (Millville, NJ) durante 18.0 horas a 4°C. La mezcla se vierte entonces en una columna de 5.0 x 20.0 cm Econo-Columna (Bio-Rad, Laboratories, Hercules CA) y el gel se lava con 30 volúmenes de columna de solución salina amortiguada de fosfato (PBS) . Se desecha la fración no retenida a través de todo el flujo. Una vez que la absorbancia del efluente a 280 nM es menos de 0.05, el flujo a través de la columna se reduce a cero y el gel anti-Flag Sepharose se lava con 2.0 volúmenes de la columna de PBS que contiene 0.2 mg/ml del péptido Flag, (SEC. ID. NO: 4) (Eastman Kodak). Después de 1.0 horas a 4°C, se reinicia el flujo y se recolecta la proteína eluida. A esta fracción se le refiere como la elución del péptido. El gel de anti-Flag Sepharose se lava con 2.0 volúmenes de la columna de glicina 0.1 M, pH 2.5, y el lavado con glicina se recolecta por separado. El pH de la fracción eluida con glicina se ajusta a 7.0 mediante la adición de un pequeño volumen de PBS 10X y se almacena a 4°C. La elución del péptido se concentra a 5.0 ml utilizando un concentrador de membrana de corte de peso molecular 5,000 (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La elución del péptido concentrado se separa entonces del péptido libre mediante cromatografía en una columna Sephadex G-50 1.5 x 50 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en PBS con una velocidad de flujo de ml/min utilizando sistema HPLC de BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) . Se recolectan fracciones de dos ml y se monitorea la absorbencia a 280 nM. El primer pico de material absorbente a 280 nM y la elución cercana al volumen de vacio de la columna se recolecta. El SDS-PAGE, el análisis Western, el análisis de aminoácidos y la secuenciación N-terminal se pueden hacer a la proteína purificada. La concentración de proteína se puede determinar mediante análisis BCA (Pierce, Rockford, IL) . Los métodos de purificación también incluyen la fraccionación de muestras mediante la precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácido o caótropo. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatita, exclusión de tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, silicios especializadas, y similares. Se prefieren los derivados PEÍ, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos medios derivados con grupos fenilo, butilo, u octilo, tales como Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia) , Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Montomeryville, PA) , Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen cuentas de vidrio, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, cuentas de agarosa, cuentas de agarosa reticuladas, cuentas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles bajo las condiciones en las cuales se van a utilizar. Estos soportes se pueden modificar con grupos reactivos que permiten la unión de las proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo, y/o porciones de carbohidrato. Los ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y derivados de carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente utilizados en la técnica, y están disponibles de los proveedores comerciales. Los métodos para el enlace del ligando o de los polipéptidos receptores a los medios de soporte son bien conocidos en la técnica. La selección de un método particular es una materia de diseño de rutina y se determinará en parte por las propiedades del soporte escogido. Ver, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988. Los polipéptidos de la presente invención se pueden aislar mediante la explotación de sus propiedades estructurales y biológicas_._ Por ejemplo, la cromatografía por adsorción iónica de metales inmovilizados (IMAC) se puede utilizar para purificar las proteínas ricas en histidina, que incluyen aquéllas que comprenden las marcas de polihistidina. De manera breve, un gel primer se carga con iones de metales divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. _3:l-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán a esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico utilizado, y se eluirán mediante elución competitiva, disminución del pH, o el uso de agentes quelatantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de las proteínas glicosiladas mediante cromatografía por afinidad de lectina y la cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39) . Dentro de las modalidades adicionales de la invención, una fusión del polipéptido de interés y una marca de afinidad (por ejemplo, polihistidina, proteína de enlace a la maltosa, y un dominio de inmunoglobulina) se pueden construir para facilitar la purificación. Además, utilizando los métodos descritos en la técnica, las fusiones de polipéptidos, o las proteínas za?op3 híbridas, se construyen utilizando regiones o dominios del polipéptido zapop3 de la invención en combinación con aquéllos de otras proteínas de la familia RING o LRR (por ejemplo, BRCA1, IAP murino o humano), o proteínas heterólogas (Sambrook et al., ibid. , Altschul et al., ibid., Picard. D. Cur, Opin. Biology, 5:511-515, 1994, y referencias de los mismos) . Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones grandes en un polipéptido de interés. Tales híbridos pueden alterar las cinéticas de la reacción, el enlace, la constricción o la expansión de la especificidad del substrato, o alterar el tejido y la localización celular de un polipéptido, y se pueden aplicar a polipéptidos de estructura desconocida. Los polipéptidos de fusión se pueden preparar mediante métodos conocidos por aquellos hábiles en la técnica preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos químicamente. Alternativamente, un polinucleótido que codifica uno o más componentes de la próteína de fusión en la estructura de lectura adecuada se puede generar utilizando técnicas conocidas y expresadas por los métodos descritos aquí. Por ejemplo, parte o todo de los dominios que confieren una función biológica se pueden atrapar entre el zapop3 de la presente invención con los dominios equivalentes de funcionalidad desde otro miembro de la familia, tales como BRCA1. Tales dominios comprenden pero no están limitados a, la región LRR, las LRRs individuales (LRR 1-8), región hidrofílica, región alfa-de hélice, dominio hidrofilico corto, región C-terminal, y el dominio de la porción terminante RING descritas en la presente. Tales proteínas de fusión se esperaría que tengan un perfil funcional biológico que sea el mismo o similar a los polipéptidos de la presente invención o a los miembros de la familia de la proteína RING conocidos, dependiendo de la fusión construida. Además, tales proteínas de fusión pueden mostrar otras propiedades como se describe aquí. Las técnicas de clonación y biológicas moleculares, estándar, se pueden utilizar para generar los dominios equivalentes entre el polipéptido zapop3 y aquellos polipéptidos a los cuales se van a fusionar. Generalmente, un segmento de ADN, que codifica un dominio de interés, por ejemplo, un dominio zapop3 descrito aquí, está enlazado operablemente en la estructura a al menos otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional (por ejemplo un dominio análogo o región de la proteína de la porción terminante RING, tal como BRCA1) , e insertado en un vector de expresión apropiado, como se describió aquí. Los constructos de ADN generalmente se hacen de tal manera que varios segmentos de ADN que codifican las regiones correspondientes de un polipéptido se enlacen operablemente en la estructura para fabricar un solo constructo que codifique la proteína de fusión completa, o una porción funcional de la misma. Por ejemplo, un constructo de ADN codificaría desde el N-terminal hasta el C-terminal a una proteína de fusión que comprenda una región N-terminal que contenga las LRRs, conectadas operablemente a la región hidrofílica central, conectada operablemente a la región alfa-hélice, conectada operablemente a, una región C-terminal que contiene el dominio de la porción terminante RING. Tales proteínas de fusión se pueden expresar, aislar, y ensayar para actividad como se describe aquí. Los polipéptidos zapop3 o fragmentos de los mismos se pueden preparar a través de síntesis química; los polipéptidos zapop3 pueden ser monómeros o multímeros; glicosilados o no glicosilados; pegilados o no pegilados; y pueden o no incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial. Los polipéptidos de la presente invención también se pueden sintetizar mediante síntesis de fase sólida exclusiva, los métodos de fase sólida parcial, la condensación de fragmentos o la síntesis de solución clásica. Los métodos para sintetizar los polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963; Kaiser et al., Anal. Biochem. 3_4:595, 1970. Después de la síntesis completo del péptido deseado sobre un soporte sólido, el péptido-resina se hace reaccionar con un reactivo que escinde el polipéptido de la resina y elimina la mayor parte de los grupos protectores de cadena lateral. Tales métodos están bien establecidos en la técnica. La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir utilizando una variedad de ensayos que miden la proliferación, morfogénesis, apoptosis, o transformación. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica . Los polipéptidos, ácidos nucleicos y/o anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de padecimientos asociados con el infarto al miocardio, falla congestiva del corazón, cardiomiopatia hipertrófica y cardiomiopatia dilatada. Las moléculas de la presente invención también pueden ser útiles para limitar el tamaño del infarto después de un ataque al corazón, ayudar en la recuperación después del transplante de corazón, promover la angiogénesis y el sanado de las heridas después de la angioplastia o endarterectomia, para desarrollar la circulación colateral coronaria, para la revascularización en los ojos, para las complicaciones relacionadas con la circulación pobre tal como en las ulceras de los pies diabéticos, para la apoplejía que se genera después de la reperfusión coronaria utilizando los métodos farmacológicos, y otras indicaciones en donde la angiogénesis es de beneficio. Las moléculas de la presente invención pueden ser útiles para mejorar la función cardiaca, ya sea induciendo la neogénesis y/o hiperplasia de los miocitos cardiacos, induciendo el desarrollo colateral coronaria o induciendo la remodelación de las del miocardio necróticas. Otros usos terapéuticos para la presente invención incluyen la inducción de la neogénesis y/o hiperplasia del músculo esquelética, la regeneración del riñon y/o para el tratamiento de la hipertensión pulmonar y sistémica.

La zapop3 se puede ensayar para la actividad inhibidora de la apoptosis utilizando los métodos de Ambrosini, G. et al., Nature Med. _3: 917-921, 1997. De manera breve, los ADNcs que codifican al Bcl-2 y zapop3 se clonan en un vector de expresión de mamíferos pcDNA3 (Invitrogen) y se transfectan hacia la línea de las células pre-B de murino dependientes de IL-3, BaF3, utilizando las técnicas de biología molecular estándar (Ausubel et al., supra; Palacios y Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986; Ascaso, R. et al., Eur. J. Immunol. 24_: 537-541, 1994). Las líneas de células estables se seleccionan y se clonan mediante los métodos descritos en la presente, por ejemplo, mediante la selección G418. Para valorar el efecto del zapop3 en la apoptosis, se mide la supervivencia de las células que co-expresan el Bcl-2 y la zapop3 bajo condiciones en donde la apoptosis es normalmente inducida, es decir, cuando la IL-3 se extrae del medio de cultivo de células. La viabilidad se puede medir, por ejemplo, mediante teñido con azul de tripano. Las células Baf3 tipo salvaje, y las células que expresan solamente Bcl-2 se utilizan como controles positivos para la apoptosis. En la presencia de zapop3, se muestra como la inhibición de la apoptosis incrementa la supervivencia de las células que expresan la zapop3 con relación a las células de control. Una aproximación in vivo para ensayar las proteínas de la presente invención implica los sistemas de suministro viral. Los virus ejemplares para este propósito incluyen adenovirus, herpesvirus, retrovirus, virus de vaccinia y virus adeno-asociados (AAV) . Los adenovirus, un virus de ADN de doble hebra, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiado para el suministro de ácido nucleico heterólogo (para revisión, ver Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine _4:44-53, 1997). El sistema del adenovirus ofrece varias ventajas: (1) el adenovirus puede acomodar los insertos de ADN relativamente grandes; (ii) se pueden hacer crecer hasta títulos altos; (iii) infectar un amplio rango de tipos de células de mamíferos; y (iv) se puede utilizar con un gran número de promotores diferentes que incluyen promotores regulables, específicos del tejido, y ubicuos. También, debido a que los adenovirus son estableces en la corriente sanguínea, se pueden administrar mediante inyección intravenosa. Utilizando los vectores del adenovirus en donde las porciones del genoma del adenovirus se eliminan, los ¡5 - insertos se pueden incorporar en el ADN viral mediante ligación directa o mediante recombinación homologa con un plásmido co-transfectado. En un sistema ejemplar, el gen El esencial ha sido eliminado del vector viral, y el virus no se replicará a menos que se proporcione el gen El por la célula hospedera (la línea celular 293 humana es ejemplar) . Cuando se administra intravenosamente a animales humanos, el adenovirus tiene como principal objetivo el hígado. Si el sistema de suministro adenoviral tiene una elimina del gen El, el virus no se puede replicar en las células hospederas. Sin embargo, el tejido del hospedero (por ejemplo, el hígado) se expresará y procesará (y lo secretará, si una secuencia de señal secretoria está presente) la proteína heteróloga. Las proteínas secretadas entrarán a la circulación en el hígado altamente vascularizado, y los efectos sobre el animal infectado se puede determinar. Además, los vectores adenovirales que contienen varias eliminaciones de los genes virales se pueden utilizar como un intento para reducir o eliminar las respuestas inmunes al vector. Tales adenovirus tienen eliminado el El y además contienen eliminaciones de E2A ó E4 (Lusky, M. et al., J. Virol. 72:2022-2032, 1998; Raper, S.E. et al., Human Gene Therapy 9>: 671-679, 1998). Además, se reportó que la eliminación del E2b reduce las respuestas inmunes (Amaifitano, A. et al., J. Virol. 72:926-933, 1998). Además, eliminando el genoma del adenovirus completo se pueden acomodar insertos grandes del ADN heterólogo. La generación de los adenovirus llamados "sin estómago" en donde todos los genes virales se han eliminado son particularmente ventajoso para la inserción de insertos grandes de ADN heterólogo. Para revisión, ver Yeh, P. y Perricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997. El sistema de adenovirus también se puede utilizar para la producción de proteína in vi tro. Cultivando las células no 293 infectadas con adenovirus bajo condiciones en donde las células no se dividen rápidamente, las células pueden producir proteínas durante periodos pretendidos de tiempo. Por ejemplo, las células BHK se hacen crecer hasta confluencia en fábricas de células, luego se exponen al vector adenoviral que codifica la proteína secretada de interés. Las células se hacen crecer entonces bajo condiciones libres de suero, lo cual permite que las células infectadas sobrevivan durante varias semanas sin división celular significativa. Alternativamente, las células 293 de humano infectadas con el vector de adenovirus se pueden hacer crecer como células adherentes o en el cultivo de suspensión a densidades relativamente altas para producir cantidades significativas de proteína (ver Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)). Con cualquier protocolo, una proteína heteróloga secretada, expresada, se puede aislar rápidamente del sobrenadante del cultivo celular, lisado, o las fracciones de la membrana dependiendo de la disposición de la proteína expresada en las células. Dentro del protocolo de la producción de las células 293 infectadas, también se pueden obtener efectivamente las proteínas no secretadas. La activación del polipéptido zapop3 se puede medir mediante un microfisiómetro de biosensor a base de silicio que mide la proporción de acidificación extracelular o la excreción de protones asociada con un receptor que se enlaza y subsecuentes respuestas celulares fisiológicas. Un dispositivo ejemplar es el Microfisiómetro Cytosensor™ fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Una variedad de respuestas celulares, tales como la proliferación celular, el transporte iónica, la producción de energía, la respuesta inflamatoria, la activación reguladora y del receptor, y similares, se pueden medir mediante este método. Ver, por ejemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257 : 1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Sur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. El microfisiómetro también se puede usar para un ensayo adherente o no adherente de las células eucarióticas o procarióticas. Mediante la medición de los cambios de la acidificación extracelular en el medio celular durante el tiempo, el microfisiómetro mide directamente las respuestas celulares a varios estímulos, que incluyen al polipéptido zapop3, sus agonistas, o antagonistas. Preferiblemente, el microfisiómetro se usa para medir respuestas de una célula eucariótica que responde al zapop3, comparada con una célula eucariótica de control que no expresa el polipéptido zapop3. Las células eucarióticas que expresan al ZAP0P3 comprenden células dentro de las cuales el zapop3 se ha transfectado creando una célula que responden al estímulo de modulación del zapop3; o células que expresan de manera natural al zapop3, tales como células que expresan al zapop3 derivadas del bazo, testículos, músculos, o tejido del corazón. Las diferencias, medidas por un cambio, por ejemplo, un incremento o disminución en la acidificación extracelular, en la respuesta de las células expuestas al polipéptido zapop3, en relación a un control no expuesto al zapop3, son' una medición directa de las respuestas celulares moduladas ¡9 - por zapop3. Además, tales respuestas moduladas por zapop3 se pueden ensayar bajo una variedad de estímulos. También, utilizando el microfisiómetro, se proporciona un método para identificar los agonistas del polipéptido zapop3, que comprende proporcionar células que responden a un polipéptido zapop3, cultivar una primer porción de las células en la ausencia de un compuesto de prueba, cultivar una segunda porción de las células en la presencia de un compuesto de prueba, y detectar un cambio, por ejemplo, un incremento o disminución, en una respuesta celular de la segunda porción de las células comparado con la primera porción de las célula. El cambio en la respuesta celular se muestra como un cambio medible de la proporción de acidificación extracelular. Los antagonistas y agonistas, para el polipéptido zapop3, se pueden identificar rápidamente utilizando este método. En vista de la distribución observada para el zapop3, los agonistas (que incluyen el substrato natural/cofactor/etc. ) y los antagonistas tienen un potencial enorme tanto en aplicaciones in vivo como in vi tro. Los compuestos identificados como agonistas zapop3 se utilizan para estimular el crecimiento de los músculos esqueléticos, las células inmunes y hematopoieticas in vi tro e in vivo. Por ejemplo, el zapop3 y los compuestos agonistas son útiles como componentes del medio de cultivo celular definido, y se pueden utilizar solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que se utiliza comúnmente en el cultivo celular. Los agonistas son así útiles en promover específicamente el crecimiento y/o desarrollo de las células cardiacas, las células de los músculos esqueléticos y otras células en el cultivo. Además, el agonista zapop3, o antagonista, se puede utilizar in vitro en un ensayo para medir la estimulación de la formación de colonias de los cultivos de médula ósea primaria aislados. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica . Los antagonistas también son útiles como reactivos de investigación para caracterizar sitios de interacción proteína-proteína. Los inhibidores de la actividad del zapop3 (antagonistas zapop3) incluyen los anticuerpos anti-zapop3 así como los agentes peptídicos y no peptídicos (que incluyen las ribozimas) . El zapop3 también se puede utilizar para identificar los moduladores (por ejemplo, agonistas o antagonistas) de su actividad. Los compuestos de prueba se agregan a los ensayos descritos aquí para identificar los compuestos que inhiben o estimulan la actividad del zapop3. Además de aquellos ensayos descritos aquí, las muestras se pueden probar para la inhibición/estimulación de la actividad del zapop3 dentro de una variedad de ensayos diseñados para medir el enlace del zapop3, la dimerización, la heterodimerización, el enlace del ADN o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes del zapop3. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan el zapop3 se pueden transfectar con un constructo del gen reportero que es responsivo a la vía celular estimulada por zapop3. Los constructos del gen reportero de este tipo son conocidos en la técnica, y comprenderán un elemento de respuesta del zapop3-ADN enlazado operablemente a un gen que codifica una proteína detectable del ensayo, tal como la luciferasa. Los elementos de respuesta del ADN pueden incluir, pero no están limitados a, los elementos de respuesta AMP cíclicos (CRE) , los elementos de respuesta a las hormonas (HRE) , elementos de respuesta a la insulina (IRÉ) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990) y los elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw et al. Cell 5_6: 563-72, 1989). Los elementos de respuesta AMP cíclicos son revisados en Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-6; 1988 y Habener, Molec. Endocrinol . 4_ (8):1087-94; 1990. Los elementos de respuesta a las hormonas se revisan en Beato, Cell 5_6:335-44; 1989. Los compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidatos o los medios condicionados a partir de varios tipos de células se prueban por su capacidad de mejorar la actividad de la transducción de señal del zapop3 como se evidencia por un incremento en la estimulación del zapop3 de la expresión del gen reportero. Los ensayos de este tipo detectarán los compuestos que estimulan directamente la actividad de transducción de la señal del zapop3 a través del enlace del receptor corriente arriba (5' ) o mediante la parte estimulante de otra manera de la cascada de señal en la cual el zapop3 está involucrado. Como tal, se proporciona un método para identificar los agonistas del polipéptido zapop3, que comprende proporcionar células que expresan el zapop3 responsivas a una via del zapop3, cultivando una primera porción de las células en la ausencia de un compuesto de prueba, cultivar una segunda porción de las células en la presencia de un compuesto de prueba, y detectando un incrementado en una respuesta celular de la segunda porción de las células cuando se compara con la primera porción de las células. Además una tercer célula, que contiene el constructo del gen reportero descrito arriba, pero que no expresa al polipéptido zapop3, se puede utilizar como un control celular para valorar la estimulación del reportero no mediada por el zapop3, o no específica. Los agonistas son útiles para estimular o incrementar la función del polipéptido zapop3. Además, los compuestos u otras muestras se pueden probar para el bloqueo directo del enlace del zapop3 a otra proteína, por ejemplo, un heterodímero descrito más adelante, utilizando el zapop3 etiquetado con una etiqueta detectable (por ejemplo, 125I, biotina, peroxidasa de rábano, FITC, y similares) . Dentro de los ensayos de este tipo, la capacidad de una muestra para inhibir el enlace de la zapop3 etiquetada a la otra proteína es indicativo de la actividad inhibidora, la cual se puede confirmar a través de los ensayos secundarios. Las proteínas utilizadas dentro de los ensayos de enlace pueden ser proteínas celulares o proteínas inmovilizadas, aisladas. Un polipéptido zapop3 se puede expresar como una fusión con una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc, que contiene dos dominios de región constante y que carece de la región variable. Los métodos para preparar tales fusiones se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,155,027 y 5,6¿567,584. Tales fusiones se secretan típicamente como moléculas multiméricas en donde las porciones Fc son disulfuros enlazados entre sí y dos polipéptidos no Ig están arreglados en una proximidad cercana entre sí. Las fusiones de este tipo se pueden utilizar para (cualquier uso específico, ligando de purificación por afinidad, herramientas de ensayo in vitro, antagonista) . Para el uso en ensayos, las quimeras se enlazan vía la región Fc y se utilizan en un formato ELISA. Un polipéptido de enlace al ligando zapop3 también se puede utilizar para la purificación del ligando. El polipéptido se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como cuentas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar los polipéptidos a los soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen la química con aminas, activación por bromuro de cianógeno, activación por N-hidroxisuccinimida, activación por epóxido, activación por sulfhidrilo, y activación por hidrazida el medio resultante está configurado de manera general en la forma de uña columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasan a través de la columna una o más veces para permitir al ligando enlazarse al polipéptido receptor. El ligando entonces se eluye utilizando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (HCl de guanidina) o pH para romper el enlace ligando-receptor. Un sistema de ensayo que utiliza el receptor ligando-enlazador (o un anticuerpo, un miembro de un par complemento/anticomplemento) o un fragmento de enlace del mismo, y un instrumento biosensor disponible comercialmente (BIACORE, Pharmacia, Biosenso, Piscataway, NJ) se puede emplear ventajosamente. Tal receptor, anticuerpo, miembro de un par complemento/anti-complemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de una porción pequeña receptora. El uso de este instrumento se describe por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se une covalentemente, utilizando la química de la amina o el sulfhidrilo, a las fibras de dextrano que se unen a una película de oro dentro de la célula de flujo. Una muestra de prueba se hace pasar a través de las células. Si un ligando, epitope, o miembro opuesto del par complemento/anti-complemento está presente en la muestra, se enlazara al receptor inmovilizado, anticuerpo o miembro, respectivamente, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, el cual es detectado como un cambio en la resonancia del plasmon superficial de la película de oro. Este sistema permite la determinación de velocidades de inicio y de paro, de los cuales se puede calcular la afinidad de enlace, y valorar la estequiometría de enlace. Los polipéptidos del receptor de enlace al ligando también se pueden utilizar dentro de otros sistemas conocidos en la técnica. Tales sistemas incluyen el análisis Scatchard para la determinación de afinidad del enlace (ver Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham et al., Science 253 : 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991). Los polipéptidos zapop3 también se pueden utilizar para preparar anticuerpos que se enlacen específicamente a los epítopes, péptidos o polipéptidos zapop3. El polipéptido zapop3 ó un fragmento del mismo sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular a un animal y generar una respuesta inmune. Alguien con habilidades en la técnica reconocerá que los polipéptidos que llevan epítopes antigénicos contienen una secuencia de al menos 6, preferiblemente al menos 9, y más preferiblemente al menos 15 hasta aproximadamente 30 residuos de aminoácidos contiguos de un polipéptido zapop3 (por ejemplo, SEC. ID. NO: 2) . Los que comprenden una porción más grande del polipéptido zapop3, es decir, de 30 a 10 residuos hasta la longitud completa de la secuencia de aminoácidos están incluidos. Los antigenos o epitopes inmunogénicos también pueden incluir etiquetas unidas, adyuvantes y portadores, como se describe en la presente. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido zapop3 codificado por la SEC. ID. NO: 2 a partir del aminoácido número 1 (Met) a un aminoácido número 723 (Ser) , o un fragmento del aminoácido de los aminoácidos 9 a 723, contiguo, del mismo. Los péptidos preferidos para usarse como antígenos son la región LRR N-terminal, la región hidrofílica central, la región rica en hélices alfa, el dominio hidrofílico corto, la región C-terminal y el dominio de la porción terminante RING, descritos aquí, y los péptidos hidrofílicos zapop3 tales como aquéllos predichos por alguien con habilidades en la técnica desde una gráfica de hidrofobicidad, determinada por ejemplo, desde un perfil de hidrofilicidad tales como aquel que se muestra en la Figura. Los péptidos hidrofílicos zapop3 incluyen los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de: (1) el aminoácido número 278 (Gln) hasta el aminoácido número 283 (Gln) de la SEC. ID NO: 2; desde el aminoácido número 311 (Ser) hasta el aminoácido número 316 (His) de la SEC. ID NO: 2; desde el aminoácido número 344 (Gln) hasta el aminoácido número 349 (Gln) de la SEC. ID NO: 2; desde el aminoácido número 521 (Glu) hasta el aminoácido número 526 (Glu) de la SEC. ID NO: 2; y desde el aminoácido número 523 (Gln) hasta el aminoácido número 528 (Glu) de la SEC. ID NO: 2. Además, las porciones conservadas, y las regiones variables entre las porciones conservadas de zapop3 son antígenos adecuados. Los anticuerpos generados de esta respuesta inmune. Los anticuerpos de una respuesta inmune generados mediante la inoculación de un animal con estos antígenos se pueden aislar y purificar como se describió aquí. Los métodos para preparar y aislar los anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R. , Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982.

Como será evidente para alguien con habilidades en la técnica, los anticuerpos se pueden generar de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, borregos, perros, pollos, conejos, ratones, y ratas con un polipéptido zapop3 o fragmento del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido zapop3 se puede incrementar a través del uso de un adyuvante, tal como alum (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen los polipéptidos de fusión, tales como las fusiones de zapop3 o una porción de la misma con un polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína de enlace a la maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "similar al hapteno", tal porción puede ser unida o enlazada ventajosamente a un portador macromolecular (tal como hemocianina de cierre limpet (KLH) , albúmina de suero de bovino (BSA) o toxoide tetánico) para la inmunización. Como se usa aquí, el término "anticuerpos" incluye los anticuerpos policlonales, los anticuerpos policlonales purificados por afinidad, los anticuerpos monoclonales, y los fragmentos de enlace al antígeno, tales como los fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. Los anticuerpos o fragmentos intactos por ingeniería genética, tales como los anticuerpos quiméricos, los fragmentos Fv, y los anticuerpos de una sola cadena y similares, así como los péptidos de enlace del antígeno sintéticos y los polipéptidos, también están incluidos. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar mediante el injerto de CDRs no humanos en la estructura humana y las regiones constantes, o mediante la incorporación de los dominios variables no humanos completos (opcionalmente "envolviéndolos" con una superficie similar a la humana mediante el reemplazo de los residuos expuestos, en donde el resultado sea un anticuerpo "revestido") . En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener' residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de la región variable humana para mejorar las caracteristicas de enlace adecuadas. A través de los anticuerpos humanizados, se puede incrementar la vida media biológica, y se reduce el potencial para las reacciones inmunológicas adversas luego de la administración a humanos. Además, los anticuerpos humanos se puede producir en animales no humanos, transgénicos, que se han diseñado por ingeriría genética como se describe en la Publicación WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógena en estos animales estén inactivados o eliminados, tales como por recombinación homologa. Se considera que los anticuerpos se enlazan específicamente si: 1) muestran un nivel de umbral de actividad de enlace, y 2) no tienen una reacción cruzada significativamente con las moléculas del polipéptido relacionado. Un nivel de umbral de enlace se determina si los anticuerpos anti-zapop3 aqui específicamente se enlazan si se enlazan a un polipéptido, péptido o epítope zapop3 con una afinidad al menos 10 veces mayor que aquélla de la afinidad de enlace al polipéptido de control (que no es zapop3) . Se prefiere que los anticuerpos exhiban una afinidad de enlace (Ka) de 10^ M~l O mayor, preferiblemente ^ M~l o mayor, más preferiblemente 108 M~l o mayor, y más preferiblemente 109 M~l o mayor. La afinidad de enlace de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por alguien con habilidades ordinarias en la técnica, por ejemplo, mediante análisis Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) . Sí los anticuerpos anti-zapop3 que no tienen una reacción cruzada significativamente con las moléculas de los polipéptidos, por ejemplo, si detectan el zapop3 pero no los polipéptido relacionados conocidos utilizando un análisis de manchado o transferencia Western estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos son aquellos descritos en la técnica anterior, tales como ortólogos, y parálogos, y miembros conocidos similares de una familia de las proteina, la selección se puede hacer utilizando los polipéptidos zapop3 mutantes, y zapop3 no humanos. Además, los anticuerpos se pueden "separar contra" polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población que se enlace especificamente a los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos generados respecto al zapop3 son absorbidos a los polipéptidos relacionados adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos al zapop3 fluirán a través de la matriz bajo las condiciones de amortiguación adecuadas. Tal separación permite el aislamiento de los anticuerpos policlonales y monoclonales que no tienen una reacción cruzada con los polipéptidos cercanamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). La selección y el aislamiento de los anticuerpos es bien conocido en la técnica. Ver, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. _43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press, Ltd., 1996; Benjamín et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Específicamente los anticuerpos anti-zapop3 de enlace se pueden detectar mediante un número de métodos en la técnica, y se describen abajo. Una variedad de ensayos conocidos para aquéllos hábiles en la técnica se" pueden utilizar para detectar los anticuerpos que se enlazan específicamente a las proteínas o péptidos zapop3. Los ensayos ejemplares se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis a contracorriente, radioinmunoensayo, radioinmuno-precipitación, ensayo inmunosorbente enlazado a la enzima (ELISA) , ensayos de manchado o transferencia Western o transferencia de punto, ensayos de inhibición o competición, y ensayos de emparedado. Además, los anticuerpos se pueden seleccionar para enlazarse al tipo nativo contra la proteína o polipéptido zapop3 mutante. Las técnicas alternativas para la generación o selección de anticuerpos útiles aqui incluyen la exposición in vitro de los linfocitos a la proteína o péptido zapop3, y la selección de las bibliotecas que muestran el anticuerpo en el fago o vectores similares (por ejemplo, a través del uso del péptido o proteína zapop3 etiquetada o inmovilizada) , Los genes que codifican los polipéptidos los dominios de enlace al polipéptido zapop3, potenciales, se pueden obtener mediante la selección aleatoria de las bibliotecas de péptidos mostradas en el fago (muestra del fago) o en las bacterias, tales como E. coli . Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos se pueden obtener en un número de formas, tales como a través de mutagénesis aleatoria y síntesis de polinucleótidos aleatoria. Estas bibliotecas que muestran a los péptidos aleatorios se pueden utilizar para seleccionar los péptidos que interactúan con un objetivo conocido que puede ser una proteína o un polipéptido, tal como un ligando o un receptor, una macromolécula sintética o biológica, substancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y seleccionar tales bibliotecas de muestras de péptidos aleatorias, son conocidas en la técnica (Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,223,409; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 4,946,778; Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,403,484 y Ladner et al., Patente Norteamericana No. 5,571,698) y las bibliotecas y equipos de muestra de péptido aleatorio para la selección de tales bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo de Clontech (Palo Altó, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA) , New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . Las bibliotecas que muestran el péptido aleatorio se pueden seleccionar utilizando las secuencias de zapop3 descritas aquí para identificar las proteínas que se enlazan al zapop3. Estos "polipéptidos de enlace" que interactúan con los polipéptidos zapop3 se pueden utilizar para marcar las células; para aislar los polipéptidos homólogos mediante purificación por afinidad; se pueden conjugar directa o indirectamente a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares. Estas polipéptidos de enlace también se pueden utilizar en los métodos analíticos tales como para la selección de bibliotecas de expresión y actividad neutralizante, por ejemplo, para la interacción de bloqueo entre el ligando y el receptor, o como un enlace viral a un receptor. Los polipéptidos de enlace también se pueden utilizar para los ensayos de diagnóstico para la determinación de los niveles circulantes de polipéptidos; para la detección o cuantificación de polipéptidos solubles como marcadores de patologías o padecimientos que se están estudiando. Estos polipéptidos de enlace también pueden actuar como "antagonistas" de zapop3 para bloquear el enlace del zapop3 y la transducción de la señal in vitro e in vivo. Estos polipéptidos de enlace anti-zapop3 serían útiles para inhibir la actividad o proteína-enlace del zapop3. Los anticuerpos para el zapop3 se pueden utilizar para las células marcadoras que expresan zapop3; para aislar el zapop3 mediante purificación por afinidad; para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles de circulación de los polipéptidos zapop3; para detectar o cuantificar el zapop3 soluble como marcador de patologías o padecimientos que se encuentren en estudio; en métodos analíticos que emplean FACS; para la selección de las bibliotecas de expresión; para la generación de anticuerpos anti-idiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear la actividad de zapop3 in vitro e in vivo . Las marcas o etiquetas directas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; las marcas o etiquetas indirectas pueden caracterizar el uso de la biotina-avidina u otros pares de complemento/anti-complemento como intermediarios. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar directa o indirectamente a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados se pueden utilizara para el diagnóstico in vivo o las aplicaciones terapéuticas. Además, los anticuerpos para el zapop3 o fragmentos del mismo se pueden utilizar in vi tro para detectar el zapop3 desnaturalizado o fragmentos del mismo en los ensayos, por ejemplo, los Manchados o Transferencia Western u otros ensayos conocidos en la técnica. Los anticuerpos o polipéptidos descritos aquí también pueden estar conjugados directa o indirectamente a los fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados se pueden utilizar para diagnóstico in vivo o aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, los polipéptidos o anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar para identificar o tratar los tejidos u órganos que expresan una molécula anti-complementaria correspondiente (receptor o antigeno, respectivamente, por ejemplo) . Más específicamente, los polipéptidos zapop3 ó los anticuerpos anti-zapop3, o los fragmentos o porciones bioactivas de los mismos, se pueden acoplar a moléculas citotóxicas o detectables y se pueden suministrar a mamíferos que tienen células, tejidos u órganos que expresan la molécula anticomplementaria . Las moléculas detectables adecuadas se pueden unir directa o indirectamente a los polipéptidos o anticuerpos, e incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas se pueden unir directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de plantas (por ejemplo, la toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como a los radionúclidos terapéuticos, tales cerno el yodo-131, renio-188 ó itrio-90 (ya sea unidos directamente al polipéptido o anticuerpo, o unidos indirectamente por medio de una porción quelatante, por ejemplo) . Los polipéptidos o anticuerpos también se pueden conjugar a fármacos citotóxicos, tales como la adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula citotóxica o detectable, la molécula citotóxica o detectable se puede conjugar con un miembro de un par complementario/anticomplementario, en donde el otro miembro se enlaza al polipéptido o porción del anticuerpo. Para estos propósitos, la biotina/estreptavidina es un par complementario/anticomplementario. En otra modalidad, las proteínas de fusión del polipéptido-toxina o las proteínas de fusión del anticuerpo-toxina se pueden utilizar para las células objetivo o tejido de inhibición o ablación (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerígenos). Alternativamente, si el polipéptido tiene múltiples dominios funcionales (es decir, un dominio de activación o un dominio de enlace al ligando, más un dominio de objetivo), una proteína de fusión que incluye solamente el dominio de objetivo puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a una célula o tipo de tejido de interés. En casos en donde el dominio solamente es una proteína de fusión e incluye una molécula complementaria, la molécula anti-complementaria se puede conjugar a una molécula citotóxica o detectable. Tales proteínas de fusión de moléculas complementarias de dominio representan así un vehículo de objetivo genérico para el suministro específico a células/tejido de conjugados de moléculas genéricas anti-complementarias-detectables/citotóxicas . En otra modalidad, las proteínas de fusión de zapop3-citocina o las proteínas de fusión anticuerpo-citocina se pueden utilizar para mejorar la muerte in vivo de los tejidos objetivo (por ejemplo, cánceres en la sangre y en la médula ósea) , si el polipéptido zapop3 o el anticuerpo anti-zapop3 toma como objetivo las células de la sangre o de la médula ósea hiperproliferativas (Ver, en general, Hornick et al., Blood £9:4437-47, 1997). Describe las proteínas de fusión que son capaces de tomar como objetivo una citocina de un sitio deseado de acción, por lo que proporcionan una concentración local elevada de citocina. Los polipéptido zapop3 adecuados o los anticuerpos anti-zapop3 tienen como objetivo una célula o tejido indeseable (es decir, un tumor o una leucemia), y la citocina fusionada mediada mejora la lisis celular objetivo mediante las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este propósito incluyen la interleucina 2 y el factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), por ejemplo. Además, tales conjugados se pueden utilizar como diagnósticos para padecimientos humanos. Por ejemplo, los conjugados etiquetados y los anticuerpos anti-zapop3 se pueden utilizar para identificar tejidos con padecimientos, células, cánceres, necrosis, y similares, que sobreexpresan o subexpresan la zapop3 con relación al control normal que no tiene padecimientos. Los métodos histológicos conocidos en la técnica y otros ensayos descritos en la presente se pueden utilizar con estos conjugados para identificar los tejidos con padecimientos. .En aún otra modalidad, el polipéptido zapop3 o el anticuerpo anti-zapop3 pueden tener como objetivo las células o tejidos vasculares. Tal polipéptido o anticuerpo se pueden conjugar con un radionúclido y particularmente con un radionúclido que emite rayos beta, para reducir la restenosis. Tal método terapéutico posee un mejor peligro para los médicos que administran la terapia radioactiva. Por ejemplo, los listones impregnados con iridio-192 colocados dentro de los recipientes de los pacientes hasta que la dosis de radiación requerida se suministre muestra un decremento del crecimiento del tejido en el recipiente y un diámetro luminal mayor que el grupo de control, que los listones con placebo que recibieron radiación. Además, la revascularización y la trombosis fueron significativamente menores en el grupo en tratamiento. Los resultados similares se predicen con el objetivo de un conjugado bioactivo que contiene un radionúclido como se describe aquí. Los conjugados del polipéptido bioactivo o del anticuerpo descritos aquí se puede suministrar intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o también se puede introducir localmente en el sitio de acción pretendido. Las moléculas de la presente invención se pueden utilizar para identificar y aislar las proteínas que se heterodimerizan con la zapop3. Por ejemplo, las proteínas y polipéptidos de la presente invención se pueden inmovilizar en una columna y las preparaciones de lisados celulares se pueden hacer correr sobre la columna (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, 195-202) . Las proteínas y péptidos también se pueden radioetiquetar (Methods in Enzymol., vol. 192, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) ó etiquetarse por fotoafinidad (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62 : 483-514, 1993 y Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) y las proteínas de superficie celular específica se pueden identificar. Por ejemplo, un polipéptido de enlace a la proteina zapop3, tal como la región LRR o el dominio de la porción terminante RING descrito aquí, también se pueden utilizar para la purificación heterodimérica a la cual se enlaza al zapop3. El polipéptido de enlace a la proteína zapop3 se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como cuentas de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas o materiales similares que son estables bajo las condiciones de uso. Los métodos para enlazar los polipéptidos a los soportes sólidos son conocidos en la técnica, e incluyen la química con aminas, activación por bromuro de cianógeno, activación por N-hidroxisuccinimida, activación por epóxido, activación por sulfhidrilo, y activación por hidrazida. El medio resultante está configurado de manera general en la forma de una columna, y los fluidos que contienen el ligando se pasan a través de la columna una o más veces para permitir a la proteina heterodimérica enlazarse al polipéptido de enlace a la proteina zapop3. La proteína heterodimérica entonces se eluye utilizando cambios en la concentración de sal, agentes caotrópicos (HCl de guanidina) o pH para romper el enlace proteína-proteína . Las moléculas de la presente invención pueden ser útiles para identificar los cánceres que sobreexpresan la zapop3 o expresan las formas mutantes del polipéptido. Los polipéptidos, los ácidos nucleicos y/o anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en el tratamiento de padecimientos asociados con el cáncer. Las moléculas de la presente invención se pueden utilizar para modular y/o prevenir el desarrollo de las condiciones patológicas en tejidos diversos tejidos tales como el músculo esquelético o del corazón. En particular, en ciertos síndromes y padecimientos se pueden tratar bajo tal diagnóstico, tratamiento o prevención. Por ejemplo, las mutaciones en el dominio de la porción terminante RING en el gen de susceptibilidad del cáncer de pecho, BRCA1, corresponde con la incapacidad de la proteina a dimerizarse, y están enlazados a ciertos cánceres del seno (Brzovic, P.S. et al., supra, 273) . De manera similar, como otro miembro de la familia de la porción terminante RING, las mutaciones o expresión elevada de zapop3 se puede asociar con cánceres específicos. Así, los polinucleótidos y anticuerpos zapop3, descritos aquí, se pueden utilizar para identificar tales cánceres, sirviendo como diagnóstico . para la susceptibilidad del cáncer, así como un tratamiento a través de la terapia genética. Utilizando los métodos conocidos en la técnica, los anticuerpos para el zapop3 y los polinucleótidos de zapop3 se pueden radioetiquetar, etiquetar fluorescente o químicamente y se utilizan en los ensayos histológicos para detectar la zapop3 elevada presente en las biopsias. Los anticuerpos zapop3 y los polinucleótidos de zapop3 de la presente invención son útiles para medir los cambios en los niveles de expresión de los polipéptidos zapop3. Debido a que la expresión de' zapop3 está restringida a los tejidos específicos (es decir, corazón y músculo esquelético, con baja expresión en otros tejidos), los cambios en los niveles de expresión podrían ser utilizados para monitorear el metabolismo dentro de estos tejidos. Por ejemplo, un incremento en la expresión y/o transcripción de los polipéptidos y polinucleótidos zapop3, puede ser predictivo para una proliferación celular incrementada de las células del tumor. Además, la expresión de zapop3 en el tejido que no expresa normalmente zapop3, por ejemplo, los ovarios y los pulmones, pueden ser indicativos de metástasis de células tumorales. Se puede demostrar que la zapop3 se expresa de manera diferente en ciertos tejidos epiteliales y carcinomas, particularmente en los pulmones, estómago, colon, esófago, o intestino. La expresión diferencial es la expresión transiente, ola falta de la misma, de genes específicos, proteínas u otras propiedades fenotípicas (conocidas como marcadores de diferenciación) que ocurren durante el progreso de la maduración en una célula o tejido. Un conjunto de marcadores de diferenciación está definido como una o más de las propiedades fenotípicas que se pueden identificar y son específicas para un tipo de célula particular. Así, se pueden hacer las células madre pluripotentes sin tener que expresar en una línea un conjunto de marcadores de diferenciación que se pierden cuando se expresan a una línea celular. Las células precursoras expresan un conjunto de marcadores de diferenciación que pueden o no pueden continuar expresándose conforme la célula progresa hacia la via de la línea celular hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que se expresan exclusivamente por las células maduras son propiedades usualmente funcionales tales como los productos celulares, las enzimas que producen productos y receptores. Así, la expresión de zapop3 se puede utilizar como un marcador de diferenciación en los tejidos normales y del tumor para determinar la etapa del tumor o madurez de la célula. Un conjunto de marcadores de diferenciación se define como una o más propiedades fenotípicas que se pueden identificar y son específicas para un tipo de célula particular. Los marcadores de diferenciación se exhiben transientemente en varias etapas de líneas celulares. Las células madre pluripotentes que se pueden regenerar sin obligarse a expresarse a una línea celular en un conjunto de marcadores de diferenciación que se pierden cuando se obligan a expresarse a una línea celular. Las células precursoras expresan un conjunto de marcadores de diferenciación que pueden o no pueden continuar expresándose conforme las células progresen hacia la vía de la línea celular hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que se expresan exclusivamente por células maduras son usualmente propiedades funcionales tales como los productos celulares, enzimas para producir productos y receptores celulares. La actividad de las moléculas de la presente invención se puede medir utilizando una variedad de ensayos que miden la proliferación y/o diferenciación de los tipos de células específicas, la regulación de los niveles secundarios del mensajero y la liberación de quimiocina y neurotransmisores. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica y están descritos aquí. Los métodos adicionales utilizan sondas o cebadores derivados, por ejemplo, de secuencia de nucleótidos descritas aquí también se pueden utilizar para detectar la expresión de zapop3 en una muestra del paciente, tal como una biopsia del tumor, estómago, pulmón, sangre, saliva, muestra de tejido, o similares. Por ejemplo, las sondas se pueden hibridizar a los tejidos del tumor y el complejo hibridizado se puede detectar mediante hibridización in si tu . También se pueden detectar las secuencias de za?op3 mediante amplificación por PCR utilizando el ADNc degenerado mediante la traducción inversa del ARNm de muestra como una plantilla (PCR Primer A Laboratory Manual, Diffenbach y Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Press, 1995). Cuando se compara con un control normal, tanto el incremento o el decremento de la expresión del zapop3 en una muestra del paciente, con relación a aquélla de un control, se puede monitorear y utilizar como un indicador o diagnóstico del padecimiento . Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos zapop3 son útiles dentro de las aplicaciones de la terapia genética en donde se desea incrementar o inhibir la actividad del zapop3. Si un mamífero tiene un gen zapop3 mutado o ausente, el gen zapop3 se puede introducir en las células del mamífero. En una modalidad, un gen que codifica un polipéptido zapop3 se introduce in vivo en un vector viral. Tales vectores incluyen un virus de ADN defectuoso o atenuado, tal como, pero no limitado a, virus de herpes simplex (HSV); papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV),' adenovirus, retrovirus, virus adeno-asociados (AAV) , y similares. Se prefieren los virus defectuosos, que carecen casi enteramente o enteramente de los genes virales. Un virus defectuoso no es inefectivo después de la introducción a la célula. El uso de los vectores virales defectuosos permite la administración a las células en un área localizada, específica, sin la preocupación de que el vector puede infectar otras células. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector de virus 1 de herpes simplex, defectuoso, (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992; y un vector de virus adeno-asociado defectuoso (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-101, 1987; Salmulski et al., J. Virol. 63:3822-8, 1989). En otra modalidad, un gen zapop3 se puede introducir en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., Patente Norteamericana No. 5,399,346; Mann et al. Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente Norteamericana No. 4,650,764; Temin et al., Patente Norteamericana No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. £2:1120, 1988; Temin et al., Patente Norteamericana No. 5,124,263; Publicación de Patente Internacional No. WO 95/07358, publicada el 16 de Marzo de 1995 por Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood £2:845, 1993. Alternativamente, el vector se puede introducir mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Los lípidos catiónicos sintéticos se pueden utilizar para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA £4:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA £5:8027-31, 1988). El uso de lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El objetivo molecular de los liposomas para células específicas representa un área de beneficio. Más particularmente, la dirección de la transfección a células particulares representa un área de beneficio. Por ejemplo, la dirección de la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, ríñones y cerebro. Los lípidos pueden estar químicamente acoplados a otras moléculas con el propósito de volverse objetivos. Los péptidos que se han vuelto objetivos (por ejemplo, hormonas o neurotransmisores) , las proteínas tales como los anticuerpos, o las moléculas no peptídicas se pueden acoplar a los liposomas químicamente.

Es posible eliminar las células objetivo del cuerpo; introducir el vector como un plásmido e ADN desnudo; y luego re-implantar las células transformadas en el cuerpo. Los vectores de ADN desnudos para la terapia genética se pueden introducir en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, el uso de una pistola genética o el uso de un transportador del vector de ADN. Ver, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263-14621-4, 1988. La metodología antisentido se puede usar para inhibir la transcripción del gen zapop3, tal como para inhibir la proliferación celular in vivo. Los polinucleótidos que son complementarios a un segmento del polinucleótido que codifica al zapop3 (por ejemplo, un polinucleótido como se establece en la SEC. ID NO: 1) se diseña para enlazarse al ARNm que codifica al zapop3 y para inhibir la traducción de tal ARNm. Tales polinucleótidos antisentido se utilizan para inhibir la expresión de los genes que codifican al polipéptido zapop3 en el cultivo celular o en un sujeto.

La presente invención también proporciona reactivos que encontrarán uso en las aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen zapop3, una sonda que comprende el ADN o ARN del zapop3, o una subsecuencia del mismo, se puede utilizar para determinar si el gen zapop3 está presente en el cromosoma 9 ó si ha ocurrido una mutación. El zapop3 está localizado en la región 9q34.11 del cromosoma 9 (Ver, el Ejemplo 3) . Las aberraciones cromosómicas detectables en el lugar del gen zapop3 incluyen, pero no están limitados a aneuploides, cambios en el número de copias del gen, inserciones, eliminaciones, cambios en el sitio de restricción, y rearreglos. Tales aberraciones se pueden detectar utilizando los polinucleótido de la presente invención empleando técnicas genéticas moleculares, tales como el análisis del poliformismo de la longitud del fragmento por restricción (RFLP) , métodos de hibridización in con fluoresencia in si tu, análisis repetitivo en series cortas (STR) que emplea técnicas PCR, y otras técnicas de enlace genético, conocidas en la técnica (Sambrook et al., ibid. ; Ausubel, et al., ibid. ; Marian, A.J., Chest, 108 : 255-265, 1995) . El conocimiento preciso de la posición del gen puede ser útil para un número de propósitos que incluyen: 1= determinar si una secuencia es parte de un contig existente y obtener secuencias genéticas adicionales que están rodeadas de varias formas, tales como clones YACs, BACs o ADNc; 2) proporcionar un gen candidato posible para un padecimiento heredable el cual muestre enlazarse a la misma región cromosómica; 3) referenciar de manera cruzada los organismos modelo, tales como el ratón, los cuales pueden ayudar en determinar que función podría tener un gen particular. El gen zapop3 está localizado en la región 9q34.11 del cromosoma 9. Diversos genes de función conocida forman un mapa para esta región. Por ejemplo el oncogen CAÍN (CAN), cuya transcripción aberrante está enlazada a la leucemia mieloide aguda, y también es esencial para el desarrollo embriónico adecuado para formar un mapa para 9q34.1 (Pilz, A. et al., Genomics 21: 139-149, 1995; Van Deursen, J. et al., EMBO J. 15:5774-5583, 1996; Von Lindern, M. et al., Molec. Cell Biol. 10:4016-4026, 1990). Las sondas del polinucleótidos zapop3 de la presente invención se pueden utilizar para detectar anormalidades o genotipos asociados con CAN tales como aquéllos que están involucrados en la leucemia mieloide aguda, o para identificar portadores heterocigotos de un gen CAN defectuoso para la prueba genética. Además, las sondas del polinucleótidos zapop3 se pueden utilizar para detectar las anormalidades o genotipos asociados con el síndrome 1 de retinitis pigmentosa-sordera, una mutación dominante autosómica en el cromosoma 9 a 9q34 (Kenna, P. et al., Brit. J. Ophthal. £1:207-213, 1997). Además, las sondas del polinucleótidos zapop3 se pueden utilizar para detectar anormalidades o genotipos asociados con las leucemias mielocíticas y mielogenosa, en donde el oncogen ABL está localizado (9q34.1). Por ejemplo, una translocación del cromosoma 9 a este lugar (con BRCAl en el cromosoma 22) está presente sobre el 90% de leucemias mielógenas crónicas, y 25-30% de leucemias linfoblásticas adultas y (con el cromosoma Filadelfia) en las leucemias mielocíticas crónicas (Bernards, A. et al., Molec. Cell. Biol. 7:3231-3236, 1987; Haas, O.A. et al., Nature 359:414-416, 1992; de Klein, A. et al., Nature 300:765-767, 1982). Además, entre otros lugares genéticos, aquéllos para la Esclerosis Tuberosa (9q34), deficiencia del complemento C5 (9q34.1), todos se manifiestan asi mismos en estados de padecimientos humanos así como para la formación del mapa de esta región del genoma humano. Ver el mapa genético de Online Medellian Inheritance of Man (OMIM) , y referencias en la misma, para esta región del cromosoma 9 en un servidor de la red (WWW) disponible públicamente (http://www3.ncbi.-nlm. nih. gov/htbin-post/Omim/getmap?-chromosome=2q37.3) . Todos estos sirven como genes de posibles candidatos para un padecimiento heredable que muestra un enlace corto en la misma región cromosómica que el gen zapop3. De manera similar, los defectos en el sitio o lugar zapop3 pueden dar como resultado un estado de padecimiento humano heredable. Por ejemplo, en el síndrome 1 de la retinitis pigmentosa-sordera, descrito anteriormente, (Kenna P. et al., supra. ) , los pcientes tienen una histología del músculo esquelético anormal, electromiografía, y electrocardiografía. Como zapop3 está altamente expresado tanto en el corazón como en el músculo esquelético, los defectos en el polipéptido zapop3 pueden provocar directa o indirectamente los síntomas de este padecimiento, por ejemplo, mediante el enlace inadecuado con una proteína heterodimérica importante para la función de las células normales. Las moléculas de la presente invención, tales como los polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención ayudarían en la detección, diagnóstico, prevención, y tratamiento asociado con un defecto genético del zapop3. La ingeniería con ratones para expresar el gen zapop3, referida como "ratones transgénicos", y los ratones que muestran una ausencia completa de la función del gen zapop3, referidos como "ratones bloqueados", también se pueden generar (Snouwaert et al., Science 257 : 1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu. Rev. Genet. 20: 465-499, 1986) . Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobreexpresan al zapop3, ya sea en cualquiera parte o bajo un promotor restringido del tejido o especifico del tejido se puede utilizar para preguntar sí la sobreexpresión provoca un fenotipo. Por ejemplo, la sobreexpresión de un polipéptido zapop3 de tipo nativo, el fragmento del polipéptido o un mutante del mismo pueden alterar los procesos celulares normales, dando como resultado un fenotipo que identifica un tejido en el cual la expresión de zapop3 es funcionalmente relevante y puede indicar un objetivo terapéutico para el zapop3, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico preferido para generar ingeniería genética es uno que sobreexpresa el polipéptido zapop3 completo, o los polipéptidos que comprenden la región N-terminal que contiene los LRRs, o el dominio de la porción terminante RING. Además, tal sobreexpresión puede dar como resultado un fenotipo que muestra similaridad con los padecimientos humanos. De manera similar, el ratón bloqueado con zapop3 se puede utilizar para' determinar si el zapop3 se requiere absolutamente in vivo. El fenotipo del ratón bloqueado es predictivo de los efectos in vivo de aquéllos que pueden tener un antagonista zapop3, tales como aquéllos descritos aquí. El ADNc del zapop3 humano se puede utilizar para aislar el ADN genómico, ADNc, y el ARNm del zapop3 murino, el cual subsecuentemente se utiliza para generar un ratón bloqueado. Estos ratones se pueden emplear para estudiar el gen zapop3 y la proteína codificada para los mismos en un sistema in vivo, y se pueden utilizar como modelos in vivo para los padecimientos humanos correspondientes. Además, la expresión del ratón transgénico de los polinucleótidos antisentido zapop3 o ribozimas dirigidas contra el zapop3, descritos aquí, se pueden usar análogamente al ratón bloqueado descrito arriba. La invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos. EJEMPLOS Ejemplo 1 Identificación del zapop3 A. Utilizando una Secuencia EST para Obtener el zapop3 de Longitud Completa La exploración de una base de datos de ADN PBL utilizando el dominio de la porción terminante RING como una pregunta dando como resultado una identificación de una secuencia de la marca de la secuencia expresada (EST) . La secuencia EST inicial contenida en un plásmido, y contenía una secuencia 3' parcial. Se llevó a cabo el 5' RACE con los cebadores ZC9,739 (API) (SEC. ID NO: 5) y ZC16,257 (SEC. ID NO: 6) utilizando el ADNc del músculo esquelético preparado a partir del ARN del músculo esquelético (Clontech) utilizando un equipo de ADNc Marathón (Clontech) . Las condiciones de PCR fueron como sigue: un ciclo a 9 °C durante 2'; 5 ciclos a 94°C durante 20", y 72°C durante 2', 30 ciclos a 94°C durante 20", 66°C durante 20", 72°C durante 2' ; un ciclo a 72°C durante 5' ; seguido por una retención a 4°C. Utilizando 5 µl de la dilución 1:100 de la reacción RACE inicial, el RACE acoplado sobre sí mismo se realizó con los cebadores ZC9,719 (AP2) (SEC. ID NO: 7) y ZC16,568 (SEC. ID NO: 8) . Las condiciones de PCR fueron como sigue: un ciclo a 94°C durante 2'; 18 ciclos a 94°C durante 30", 56°C durante 20", 72°C durante 2'; un ciclo a 72°C durante 5' ; seguido por una retenció'n a 4°C. La reacción de PCR acoplado sobre sí mismo se sometió a electrofóresis sobre un gel de agarosa al 1.5% y se escindió una banda de 1 kb y se purificó en gel utilizando los reactivos QiaxII (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis de secuencia se realizó y se designó ZC16,795 (SEC. ID. NO: 9) para ser utilizado en una reacción PCR con ZC15,255 (SEC. ID. NO: 10) utilizando el ADNc del músculo esquelético descrito arriba. Las condiciones PCR fueron como sigue: un ciclo a 94°C durante 2'; 4 ciclos a 94°C durante ", y 72°C durante 3'; 4 ciclos a 94°C durante 20"; y 68°C para 3'; 25 ciclos a 94°C por 20", 66°C durante 20", 72°C durante 3'; un ciclo a 72°C durante 5'; seguido por una retención a 4°C. La reacción de PCR acoplado sobre sí mismo se sometió a electrofóresis sobre un gel de agarosa al 1.5% y se escindió una banda de 1 kb y se purificó en gel utilizando los reactivos y el protocolo de QiaxII (Qiagen) . El análisis de secuencia se realizó y se confirmó la extensión 5' de la secuencia EST inicial. Esta información se utiliza para extraer una base de datos EST por una segunda vez. La secuencias EST se identificó y está contenida en un plásmido. La confirmación de la secuencia EST se hizo mediante los análisis de secuencia del ADNc de los cuales se originó la EST. El clon parece tener el extremo 5' completo del zapop3. Las reacciones de secuenciación descritas anteriormente utilizan los siguientes cebadores en un protocolo de secuenciación estándar: ZC447 (SEC. ID, NO: 11), ZC976 (SEC. ID. NO: 12), ZC18,222 (SEC. ID. NO: 13), ZC18,228 (SEC. ID. NO: 14), ZC18,283 (SEC. ID. NO: 15), y ZC18,284 (SEC. ID. NO: 16), ZC694 (SEC. ID. NO: 17), ZC6,768 (SEC. ID. NO: 18), ZC16,257 (SEC. ID. NO: 6), ZC15254 (SEC. ID. NO: 20), ZC15255 (SEC. ID. NO: 10), ZC15392 (SEC. ID. NO: 21) . Ejemplo 2 Distribución del Tejido Se realizó el análisis por manchado o transferencia Northern utilizando Manchados de Tejido Múltiples Humanos (MTN I, MTN II, y MTN III) (Clontech) . El fragmento de 400 bp se escindió del plásmido que contiene la EST inicial en el Ejemplo 1, utilizando Apal (NEB) . El fragmento se purificó utilizando un equipo comercialmente disponible (QiaexII™; Qiagen) y luego se etiquetó radioactivamente con 2P-dCTP utilizando Rediprime™, un sistema de etiquetado de cebadores aleatorio (Amersham) , de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó entonces utilizando una columna Nuc-Trap™ (Stratagene) , de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se utilizó la solución ExpressHyb™ (Clontech) para la prehibridización y como una solución de hibridización los manchados Northern. La hibridización tuvo lugar durante toda la noche a 55 °C utilizando 2 x 106 cpm/ml de la sonda etiquetada. Las manchas se lavaron entonces en SSC 2X/SDS al 1% a 65°C, seguido por un lavado en SSC 0.1X/SDS al 0,1% a 65°C. Un transcripto se detecto en aproximadamente a 2 bp con fuertes señales en el corazón y músculo esquelético. Las señales moderadas a débiles fueron vistas en la mayor parte de los tejidos analizados. No fueron aparentes las señales en los tejidos de ovario o de pulmón. Los Manchados por Puntos también se realizaron utilizando ARN en Master Blots™ (Clontech) . Los métodos y condiciones para los Manchados por Puntos son los mismos que para los Manchados de Tejidos Múltiples descritos arriba. La intensidad de la señal fuerte se presentó en el corazón. Una señal moderada se presentó en la mayor parte de otros tejidos analizados. No hubo señales aparentes en los tejidos de ovario y de pulmón representados en los manchados. Ejemplo 3 Formación del Mapa Cromosómico a Base de PCR del Gen zapop3 Se formó el mapa del zapop3 para el cromosoma 9 utilizando "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" comercialmente disponible (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). El GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel contiene el ADN de cada uno de los 93 clones híbridos por radiación, más dos ADNs de control (HFL del donador y el A23 del receptor) . Un servidor de la red disponible públicamente (http: //www-genome.wi.mit. edu/cgi-bin/contig/rhmapper .pl) permite la formación del mapa relativo al mapa del híbrido por radiación del Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research del genoma humano (el mapa del híbrido por radiación "WICGR") que se construyó con el GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel. Para la formación del mapa del zapop3 con el "GeneBridge 4 RH Panel", se efectuaron reacciones en 20 µl en una placa de microtitulación de 96 pozos (Stratagene, La Jolla, CA) y se utilizó en un formador de ciclos térmicos "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene) . Cada una de las 95 reacciones de PCR consiste de 2 µl del amortiguador de reacción PCR 10X KlenTaq (Clontech), 1.6 µl de mezcla de dNTPs (2.5 mM cada uno, Perkin-Elmer, Foster City, CA) , 1 µl del cebador de sentido, ZC 15,414 (SEC. ID NO: 18), 1 µl del cebador antisentido, ZC 15,413 (SEC. ID NO: 19), 2 µl de "RediLoad" (Research Genetics, Inc.), 0.4 µl de la Mezcla de Polimerasa Advantage KlenTaq 50X (Clontech) , 25 ng de ADN de un clon híbrido individual o control y ddH2? para un volumen total de 20 µl. Las reacciones se llevaron a cabo con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del formador de ciclos de PCR fueron las siguientes: 1 ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 95 °C, 35 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95°C, 1 minuto de calentamiento y enfriamiento a 65°C y 1.5 minutos de extensión a 72°C; seguido por 1 ciclo final de extensión de 7 minutos a 72 °C. Las reacciones se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% (Life Technologies) . Los resultados mostraron que el zapop3 genera el mapa 0.80 cR_3000 desde la parte superior del grupo de enlace del cromosoma 9 humano en el mapa híbrido por radiación WICGR. Los marcadores de la estructura próximos y lejanos fueron WI-6352 (D9S1144) y WI-9685 (D9S1721), respectivamente. El uso de los marcadores de los alrededores colocó al zapop3 en la región 9q34.11 en el mapa del cromosoma 9 del LDB integrado (The Genetic Location Datábase, Universidad de Southampton, servidor de la red: http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public html/) .

De lo anterior, se podrá apreciar que, aunque se han descrito modalidades específicas de la invención aquí para propósitos de ilustración, se pueden hacer varias modificaciones sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. De conformidad con esto, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: 1.- Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) , en donde la identidad de porcentaje del aminoácido se determina utilizando un programa FASTA con ktup = 1, penalidad por abertura del intervalo = 10, penalidad por extensión del intervalo = 1, y matriz _ de substitución = BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por defecto.
2. 2.- Una molécula del polinucleótido aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste de: (a) moléculas del polinucleótido que comprenden una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC. ID NO: 1 desde el nucleótido 367 hasta el nucleótido 2535; y (b) moléculas del polinucleótido complementarias a (a) . 3.- Una secuencia de polinucleótidos aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido comprende el nucleótido 1 hasta el nucleótido 2169 de la SEC. ID NO:
3. 3.
4. 4.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) .
5. 5.- Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polipéptido zapop3 consiste de una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) .
6. 6.- La molécula del polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica además un polipéptido que contiene un dominio de la porción terminante RING o al menos un motivo LRR.
7. 7. - La molécula del polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica además un polipéptido que contiene un dominio de la porción terminante RING y al menos un motivo LRR.
8. 8.- Un vector de expresión caracterizado porque comprende los siguientes elementos enlazados operablemente: un promotor de transcripción; un segmento de ADN que codifica un polipéptido zapop3 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) . un terminador de la transcripción en donde el promotor está enlazado operablemente al segmento de ADN, y el segmento de ADN está enlazado operablemente al terminador de transcripción.
9. 9.- Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende una secuencia de señal secretoria enlazada operablemente al segmento de ADN.
10. 10.- Una célula cultivada dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula expresa un polipéptido codificado por el segmento de ADN.
11. 11.- Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos -90% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) moléculas del polipéptido que ocmprenden la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser), en donde la identidad de porcentaje del aminoácido se determina utilizando un programa FASTA con ktup = 1, penalidad por abertura del intervalo = 10, penalidad por extensión del intervalo = 1, y matriz de substitución = BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por defecto.
12. 12.- Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en. la SEC ID NO: 2 desde el aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) .
13. 13.- Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de residuos de aminoácidos consiste del aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) .
14. 14.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido contiene además un dominio de la porción terminante RING o al menos un motivo LRR.
15. 15.- El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido contiene además un dominio de la porción terminante RING y al menos un motivo LRR.
16. 16.- Un método para producir un polipéptido zapop3 caracterizado porque comprende: cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 10; y aislar el polipéptido zapop3 producido por la célula.
17. 17.- Un método para producir un anticuerpo para el polipéptido zapop3 caracterizado porque comprende: inocular un animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polipéptido que consiste de 9 a 723 aminoácidos, en donde el polipéptido consiste de la secuencia contigua de los aminoácidos en la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 1 (Met) , hasta el aminoácido número 723 (Ser) . (b) un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11; (c) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del residuo de aminoácido 1 (Met) al residuo de aminoácido 223 (Leu) ; (d) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del residuo de aminoácido 224 (Glu) al residuo de aminoácido 348 (Arg) ; (e) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del residuo de aminoácido 520 (Lys) al residuo de aminoácido 543 (Arg) ; (f) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 675 (Cys) al residuo de aminoácido 709 (Cys) ; (g) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 278 (Cys) al aminoácido número 283 (Gln) ; (h) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 311 (Ser) al aminoácido número 316 (His) ; (i) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 344 (Cys) al aminoácido número 349 (Gln) ; (j) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 521 (Glu) al aminoácido número 526 (Glu) ; y (k) un polipéptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. NO: 2 del aminoácido número 523 (Gln) al aminoácido número 528 (Glu) ; en donde el polipéptido genera una respuesta inmune en el animal para producir el anticuerpo; y aislar el anticuerpo del animal.
18. 18.- Un anticuerpo producido por el método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se enlaza al polipéptido zapop3.
19. 19.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal .
20. 20.- Un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido de la reivindicación 11.
21. 21.- Un método para detectar, en una muestra de prueba, la presencia de un antagonista de la actividad de la proteína zapop3, caracterizado porque comprende: transfectar una célula que responde al zapop3, con un constructo de gen reportero que responde a una vía celular estimulada por zapop3; y agregar una muestra de prueba; y comparar los niveles de la respuesta al polipéptido zapop3, en la presencia y ausencia de la muestra de prueba, mediante un ensayo biológico o bioquímico; y determinar desde la comparación, la presencia del antagonista de la actividad de zapop3 en la muestra de prueba.