MX377669B - Derivados de aminoester. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos compuestos que son tanto inhibidores de la enzima fosfodiesterasa 4 (PDE4) como antagonistas de receptor M3 muscarínico, métodos para preparar tales compuestos, composiciones que los contienen y el uso terapéutico. Ensayo de unión a M3: Células de clon CHO-KI que expresan el receptor M3 humano (Swissprot P20309) se recolectaron en salina amortiguada de fosfato libre de Ca++/Mg++ y se recolectaron por centrifugación a 1500 rpm por 3 min. Las pelotillas se resuspendieron en amortiguador A enfriado en hielo (15 mM de Tris-HC1 pH 7.4, 2 mM de MgCl2, 0.3 mM de EDTA, 1 mM de EGTA) y se homogenizó por un politrón PBI (ajustado 5 por 15 s). La fracción de membrana cruda se recolectó por dos etapas de centrifugación consecutivas a 40000 g por 20 min a 4°C, se separó por una etapa de lavado en amortiguador A. Las pelotillas obtenidas se resuspendieron finalmente en amortiguador B (75 mM de Tris HCl pH 7.4, 12.5mM de MgCl2, 0.3 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 250 mM de sacarosa), y las alícuotas se almacenaron a -80°C. El día del experimento, las membranas congeladas se resuspendieron en amortiguador C (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 2.5 mM de MgCb, 1 mM de EDTA). El radio ligando muscarínico no selectivo [3H] - N-metil escopolamina (Mol.Pharmacol. 45:899-907) se usó para etiquetar los sitios de unión a M3. Se realizaron experimentos de unión por duplicado (curvas de concentración de diez puntos) en placas de 96 pocillos a concentración de radioligando de 0.1-0.3 nM. La unión no específica se determinó en la presencia de 10 µM de N-metil escopolamina fría. Las muestras (volumen final 0.75 mL) se incubaron a temperatura ambiente por 90 min. La reacción se terminó por filtración rápida a través de placas de Unifiltro GF/B y dos lavados (0.75 mL) con amortiguador C frío usando un Recolector Filtermate de Packard. Se midió la radioactividad en los filtros por un contador de escintilación de microplaca TriCarb 2500 (PerkinElmer). Los compuestos representativos de la invención, cuando se probaron en uno de los protocolos reportados anteriormente, presentaron una IC50 inferior de 100 nM. Los compuestos representativos de la invención presentaron una IC50 inferior de 100 nM en tanto ensayos de unión a M3 como libres de células de PDE4.