MX2015004786A - Cepas de levadura para la produccion de biomasa en un substrato de comprende un azucar c5. - Google Patents
Cepas de levadura para la produccion de biomasa en un substrato de comprende un azucar c5.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a cepas de levadura novedosas de Saccharomyces cerevisiae capaces de multiplicarse en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 con una velocidad e índice de multiplicación compatible con la producción industrial de levadura; también se refiere a cepas novedosas que, cuando se cultivan, hacen posible obtener levaduras que tienen una eficiencia de aplicación, es decir una eficiencia que es satisfactoria en aplicaciones y usos de interés en industrias tales como la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabolitos secundarios, producción de proteínas, producción de etanol, producción de cerveza, vitivinicultura o la producción de extracto de levadura.
Description
CEPAS DE LEVADURA PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN UN SUBSTRATO
QUE COMPRENDE UN AZÚCAR C5
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se relaciona con el campo de la producción de biomasa, en particular la producción de levadura. Se refiere particularmente a la producción de levaduras en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 y más particularmente a la producción de levaduras en un substrato que se origina de la hidrólisis de materiales llgnocelulósicos. También se refiere al uso de levaduras producidas en aplicaciones para la Industria de levadura, tal como la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabóllcos secundarios, producción de proteínas, producción de ARN, producción de etanol, producción de cerveza o producción de extracto de levadura.
ANTECEDENTES Y PROBLEMAS TECNOLÓGICOS QUE SE VAN A RESOLVER
Para su multiplicación por medio de un procedimiento de respiración aeróbica, las levaduras necesitan:
- compuestos de carbono como fuente de carbono y energía,
- compuesto reducido de nitrógeno en forma de amonio; sin embargo, algunas levaduras son capaces de utilizar compuestos oxidados (tal como nitratos) o los compuestos orgánicos para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos,
- varios elementos minerales, y vitaminas y factores de crecimiento que varían dependiendo de las levaduras.
SI la levadura se produce en un medio con una composición definida, basada, por ejemplo, en jarabes de glucosa o fructosa como substrato de carbono, y sales de amonio y fósforo como fuentes de nitrógeno y fosfato, el medio de cultivo tendrá que ser complementado por una adición de sales minerales, de vitaminas y de elementos traza, que hace compleja y costosa a la producción.
Las melazas del proceso de refinación de caña de azúcar y remolacha consisten en azúcares (glucosa y fructosa), de compuestos orgánicos y de compuestos minerales. Ésta es la razón por la cual estas melazas son los substratos de elección desde el punto de vista económico y téenico y por lo cual, hasta la fecha, son la materia prima principal utilizada para la producción industrial de levaduras.
Sin embargo, la disponibilidad disminuida de las melazas de caña o remolacha,
relacionada en particular con su uso masivo para la producción de bioetanol, pone en peligro este tipo de producción. Por consiguiente, es necesario encontrar nuevos substratos de carbono como un sustituto para la sacarosa proporcionada de las melazas.
Actualmente, la producción industrial de bioetanol, en particular bioetanol de segunda generación, ha revelado la disponibilidad de otras fuentes de substratos de fermentación. De hecho, la industria de bioetanol de segunda generación utiliza materiales lignocelulósicos derivados de plantas. Estos materiales, que representan la inmensa mayoría de las plantas, consisten en celulosa, hemicelulosa y lignina. Después de la hidrólisis, los materiales lignocelulósicos conducen a una mezcla de azúcares C6 (6 átomos de carbono) y azúcares C5 (5 átomos de carbono).
Todas las levaduras son capaces de metabolizar azúcares C6; los azúcares C5, por otro lado, por lo general se adaptan pobremente o no se pueden fermentar por medio de levaduras del género Saccharomyces, en particular Saccharomyces cerevisiae (Se).
La literatura reciente que se relaciona con la producción de bioetanol de segunda generación describe levaduras de Se que se han modificado para hacerlas capaces de fermentar azúcares C5. Entre estos documentos, se puede citar, por ejemplo, WO 2011/128552 y WO 2012/72793 a nombre del solicitante.
WO 2011/128552 describe una cepa de levadura obtenida por medio de un método para la modificación genética, que comprende introducir en el genoma de la cepa un gen que codifica para la Xilosa reductasa (XR, por sus siglas en inglés) y un gen que codifica para una Xilosa deshidrogenasa (XDH, por sus siglas en inglés).
WO 2012/72793 describe una cepa de levadura obtenida por un método que incluye introducir en el genoma de la cepa una copia de un gen exógeno que codifica para una xilosa isomerasa, dicho gen se origina preferiblemente de Qostridium phytofermentans, y por lo menos una copia de un gen que codifica para la xilitol deshidrogenasa, dicho gen se origina de Pichiastipitis.
Aunque las cepas que se describen en estos documentos son capaces de multiplicarse en un substrato que comprende azúcar C5, los inventores de la presente invención han observado que la velocidad de multiplicación en un substrato que consiste en o que comprende un azúcar C5 permanece baja y en cualquier caso es incompatible con una producción industrial de levaduras.
Además, los inventores observaron que, durante su uso industrial final, por ejemplo, como levaduras en la fermentación para la elaboración de pan o levaduras destinadas para la producción de extractos de levadura, etc., las levaduras así obtenidas presentaron una eficiencia reducida en comparación con la eficiencia de las levaduras obtenidas de las cepas originales sin modificar.
De este modo, existe una demanda real de cepas novedosas para la producción de levaduras que hagan posible reemplazar parcial o completamente los azúcares C6 como substrato de carbono, con rendimientos de producción de levadura compatibles con explotación económica e industrial. Además, el cultivo de dichas levaduras debe conducir a levaduras con una eficiencia en su uso industrial final que sea de gran interés y enteramente satisfactorio.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La materia en cuestión de la presente invención se relaciona con cepas de levadura de Se novedosas capaces de multiplicarse en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 a una velocidad e índice de multiplicación compatible con la producción industrial de levadura.
También se relaciona con cepas novedosas que, cuando se cultivan, hacen posible obtener levaduras con una eficiencia de aplicación, es decir una eficiencia que es satisfactoria en su uso industrial final, es decir por lo menos igual a 80%, preferiblemente 95% e incluso más preferiblemente 105% de la eficiencia de la aplicación de referencia.
Otra materia en cuestión de la invención es un método para obtener una cepa de levadura de acuerdo con la invención por medio de modificación genética o por hibridación.
Otra materia en cuestión de la invención es el uso de levaduras obtenidas por el método de la invención y/o de levaduras novedosas en una aplicación industrial seleccionada de la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabólicos secundarios, producción de proteínas, producción de ARN, producción de etanol, producción de cerveza, vitivinicultura o la producción de extracto de levadura.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 es el resultado de un análisis de PCR del Ejemplo 1. Los valores indicados en la porción del lado izquierdo del gel corresponden al tamaño de los fragmentos de ADN del marcador de tamaño, y son expresados en pares de base (carril 1). Los carriles 2 a 5 corresponden a X10S1, X10S2, Mat a Control y Control Mat alfa, respectivamente.
La figura 2 es una gráfica que representa la variación en la turbidez del medio expresado en Log 10(OD iambda _ 600 nm) como una función del tiempo de cultivo (que se expresa en horas) a 30 °C y 150 rpm en medio de CP.
La figura 3 es una gráfica que representa la turbidez del medio expresado en OD a una longitud de onda de 600 nm, como una función del tiempo de cultivo, que se expresa en horas, a 30 °C y a 150 rpm en medio de YFX.
La figura 4 es una gráfica que representa la liberación gaseosa expresada en mL por minuto en masa normal contra el tiempo expresado en minutos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con una cepa de levadura capaz de multiplicarse bajo condiciones aeróbicas en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5, que se caracteriza porque satisface una prueba del crecimiento en la xilosa o porque tiene una velocidad máxima de multiplicación de manera que satisface una prueba de crecimiento en el medio de CP.
Prueba de crecimiento en xilosa
Esta prueba consiste en el monitoreo con el tiempo por espectrofotometría a una longitud de onda de 600 nm de la variación en la turbidez de una solución que contiene 50 mL del medio de cultivo de YFX inoculado con células de cepa 108 que se van a probar a 30°C bajo agitación constante a 150 rpm. La prueba se satisface cuando la Densidad Óptica (OD, por sus siglas en inglés) a 24 h es mayor que 2, y es por lo menos 3, preferiblemente por lo menos 10 a 48 h.
El medio de YFX es como se define a continuación.
Prueba de crecimiento en el medio de CP
Esta prueba consiste en el monitoreo con el tiempo por espectrofotometría a una longitud de onda de 600 nm de la variación en la turbidez de una solución que contiene 50 mL del medio de cultivo de CP que contiene 10 g/kg de J100 tipo EXL (Biospringer) y 10 g/kg de
bactopeptona así como también 100 g/kg de sacarosa, dicho medio se inocula con células 108 que se van a probar a 30°C bajo agitación constante a 150 rpm. La prueba se satisface si la variación en la OD es exponencial entre 3.5 y 7.5 horas. La ecuación que entonces representa la variación en la OD tiene la forma ODtf = ODtien(tf t en donde n está entre 0.35 y 0.9, preferiblemente entre 0.45 y 0.80, y preferiblemente entre 0.65 y 0.75.
De acuerdo con una modalidad ventajosa, las cepas de acuerdo con la invención satisfacen tanto la prueba de crecimiento en xilosa como la prueba de crecimiento en el medio de CP.
De acuerdo con la invención, la cepa de levadura se selecciona del genero Saccharomyces y preferiblemente es Saccharomyces cerevisiae.
De acuerdo con la invención, el azúcar C5 se refiere a un monosacárido que comprende 5 átomos de carbono o pentosa. El azúcar C5 se selecciona del grupo que comprende arabinosa, xilosa y sus mezclas. Preferiblemente, el azúcar C5 es xilosa.
De acuerdo con la invención, el substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 también comprende por lo menos un azúcar C6, es decir un monosacárido que comprende 6 átomos de carbono o hexosa. El azúcar C6 se selecciona del grupo que comprende glucosa, fructosa, galactosa, mañosa o se origina de la degradación de disacárido tal como sacarosa, maltosa, trehalosa, isomaltosa o sus mezclas.
Preferiblemente, el substrato de la invención incluye por lo menos un azúcar C5 y por lo menos un azúcar C6 en una relación C5/C6 entre 0.1 y 2.
Las levaduras obtenidas por la multiplicación de las cepas de acuerdo con la invención tienen desempeños útiles para aplicaciones industriales tales como elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabólicos secundarios, producción de proteínas, producción de etanol, producción de cerveza, vitivinicultura o la producción de extracto de levadura. En otras palabras, las levaduras obtenidas al cultivar las cepas de acuerdo con la invención son eficientes en el uso industrial final para las cuales se destinan. Esta eficiencia se menciona como "eficiencia de aplicación" en la presente solicitud de patente.
Para todos los usos industriales considerados, es necesario que las levaduras obtenidas al cultivar las cepas de la invención no sean dañadas durante el secado, es decir que menos del 20% de las levaduras se inactive después un secado.
De acuerdo con una modalidad particular, las cepas de acuerdo con la invención son tales que satisfacen la siguiente prueba de secado:
La biomasa obtenida después de cultivar se separa del medio por medio de separación centrífuga utilizando opcionalmente pasos de lavado con el fin de obtener una suspensión concentrada de levadura a 18-22% del extracto seco ("crema de levadura").
Esta suspensión se somete a un paso de deshidratación por filtración con el fin de obtener una masa pastosa ("levadura prensada") a 28-34% del extracto seco.
Esta composición entonces se somete a un procedimiento para formar piezas tipo salchicha (extrusión) para obtener piezas delgadas tipo salchicha (piezas tipo fideos) con un diámetro de 0.2 a 2 mm, que se secan por medio de una corriente de aire caliente en un secador con lecho de aire fluidizado.
Las condiciones de secado (programa de temperatura) se controlan rigurosamente para que la temperatura del producto sea siempre menor que 50°C. La levadura seca final, que está en forma de piezas finas tipo fideo, tiene un contenido de extracto seco de por lo menos 95%.
Con el fin de mejorar la viabilidad de las células de la levadura seca, se puede agregar a la levadura (levadura prensada o en suspensión) aditivos con un efecto protector, tal como emulsionantes, a 0.2 a 2 %/ en peso seco de levadura, entre los que el monoestearato de sorbitán (MSS, por sus siglas en inglés) es un aditivo estándar comúnmente utilizado.
Las cepas satisfacen la prueba si el número de levaduras vivas después del secado es por lo menos igual a 80% del número de levaduras vivas antes del secando.
De acuerdo con otra modalidad, la cepa de acuerdo con la invención tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos igual a 95% e incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia. En el sentido de la presente invención, el término eficiencia de aplicación de las cepas se refiere a una eficiencia de las levaduras obtenidas cuando se cultivan que es satisfactoria en el uso industrial final de dichas levaduras, es decir, una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 90% de la eficiencia de aplicación de una levadura obtenida al cultivar una cepa de referencia para este uso. Una cepa de referencia para un uso dado es una cepa convencionalmente utilizada para este uso. De este modo, la eficiencia de aplicación de un cepa cultivada para la industria de la elaboración de pan será la energía de fermentación y la eficiencia de aplicación de referencia será esa de la cepa depositada el 12 de febrero del 2003 en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes [Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos] (CNCM, Pasteur Institute, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15) bajo el No. 1-2970, y serán 120 mL de CO2 liberados en 2 horas de 20 g de harina. El método de determinación es el método de risografía así denominado que se lleva a cabo por medio del fermentómetro de Burrows y Harris (Journal of Institute of Brewing, Vol. LXV, No. 1, Enero-Febrero 25, 1959).
La producción de blomasa se lleva a cabo utilizando el "método aeróbico de lotes alimentados " así denominado, también mencionado como "cultivo en modo semi-continuo" o "cultivo semi-continuo" o "modo semi-continuo" que en la presente se refiere al cultivo en un termentador (o reactor) que se alimenta progresivamente con el medio de cultivo, pero a partir del
cual no se retira ningún volumen del medio. En dicho método, el volumen de cultivo es variable (y por lo general creciente) en el termentador, y la velocidad de alimentación puede ser constante o variable.
El método de "Lotes alimentados" por lo general se lleva a cabo bajo las condiciones descritas en el libro de referencia "Yeast Technology," Capítulo 6, 2da edición, 1991, G. Reed y T. W. Nagodawithana, que se publicó por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Para una cepa cultivada para producción de biomasa, la eficiencia de aplicación será el rendimiento de producción, y la eficiencia de aplicación de referencia será esa de la cepa depositada el 26 de febrero de 1981 en la NCYC (Colección Nacional de Cultivos de Levadura, Instituto de Investigación de Alimentos, Norwlch Research Park, Colncy, Norwlch, Reino Unido, NR4 7UA) bajo el No. 995, y tendrá el 80% del rendimiento con respecto al azúcar C6 utilizada, u 80 g de levadura por g de las melazas vertidas. La prueba se llevará a cabo midiendo la cantidad de materia seca producida.
Para una cepa cultivada para la producción de alcohol, la eficiencia de aplicación será el rendimiento de la producción de etanol y la eficiencia de aplicación de referencia será esa de la cepa depositada el 4 de septiembre del 2008 en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM, Pasteur Institute, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15) bajo el No. 1-4071 y serán 0.40 g de etanol producidos por g de azúcar C6 utilizada. Las cantidades de etanol y azúcar C6 se miden por medio de HPLC o pruebas enzlmátlcas.
Para una cepa cultivada para la producción de un extracto de levadura, la eficiencia de aplicación será la determinación del contenido de nitrógeno del extracto de levadura obtenido, y la eficiencia de la aplicación de referencia será esa del extracto de levadura comercializado por la compañía Bio Sprlnger bajo la referencia Springer 0203/0-MG-L y será del 10% de nitrógeno con respecto a la materia seca. La prueba de nitrógeno se hace utilizando el método de combustión.
De acuerdo con una modalidad particular, la cepa tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos Igual a 95% e Incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia, la eficiencia de aplicación se selecciona del grupo que incluye la fuerza de fermentación, el rendimiento de la biomasa, producción de sabor, de metabollto secundario, de proteína, de etanol.
De manera ventajosa, la cepa de acuerdo con la invención satisface la prueba de secado y tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80% de la eficiencia de aplicación de referencia.
La invención también se relaciona con las siguientes cepas novedosas:
- la cepa de levadura depositada el 23 de agosto del 2012 en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM, Pasteur Institute, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París
cedex 15) bajo el No. 1-4670
- la cepa de lavadura depositada el 23 de agosto del 2012 en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM, Pasteur Institute, 28 rue du Docteur Roux, 75724 París cedex 15) bajo el No. 1-4671.
Estas cepas son cepas de levadura para la elaboración de pan cada una de las cuales satisface la prueba de crecimiento en xilosa y la prueba de crecimiento en el medio de CP, y cada una de las cuales tiene una fuerza de fermentación de por lo menos 100 mL de CO2 que se libera en 2 horas a partir de 20 g de harina, respectivamente. Estas cepas también satisfacen la prueba de secado.
Otra materia en cuestión de la invención es un método para obtener una cepa de levadura como se definió arriba.
De acuerdo con una primera modalidad, el método comprende un paso de modificación genética de una cepa B que tiene una eficiencia de aplicación de referencia para hacerla capaz de metabolizar un azúcar C5.
De acuerdo con una segunda modalidad, el método comprende el cruce de una cepa A capaz de metabolizar un azúcar C5 con una cepa B que tiene una eficiencia de aplicación de referencia.
A pesar de la modalidad del método de acuerdo con la invención, dicho método puede comprender por lo menos un paso de selección que hace posible seleccionar una cepa que satisface por lo menos una de las pruebas seleccionadas de la prueba de crecimiento en xilosa, la prueba de crecimiento en el medio de CP y la prueba de secado, o que tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos igual a 95% y aún más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia de la cepa B.
El paso de selección se puede llevar a cabo como el último paso del método de la invención.
De acuerdo con la invención, la capacidad de metabolizar un azúcar C5 se refleja en la capacidad de producir etanol de un medio que comprende un azúcar C5 bajo condiciones anaeróbicas. Las cepas capaces de metabolizar un azúcar C5, en general, son cepas modificadas genéticamente en donde cada gen de la trayectoria de pentosa se ha desregulado, se eliminan las copias del gen GRE3 que codifican para una aldosa reductasa, el gen XKS1 nativo que codifica para la xiluloquinasa se ha sobreexpresado, y ha sufrido una evolución dirigida.
De acuerdo con una forma de la invención, una cepa capaz de metabolizar un azúcar C5 es una cepa que comprende por lo menos una copia del gen Pichiastipitis XR que codifica para la enzima xilosa reductasa, y por lo menos una copia del gen Pichiastipitis XDH que codifica para la enzima xilosa deshidrogenasa.
De acuerdo con otra forma de la invención, una levadura capaz de metabolizar un azúcar C5 es una cepa de levadura que comprende por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilosa isomerasa y por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilitol deshidrogenasa preferiblemente que se origina de Pichiastipitis.
La xilosa isomerasa es un gen que se origina de Cbstridium, Piromyces, Bacteroides, Streptomyces, Haemophilus, Burkholderia, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacterium, GeobaciHus, Arthrobacter, dona, Physcomitrella, Cellvibrio, Chitinophaga, Saccharopolyspora o Sa/inibacter, y preferiblemente es un gen que se origina de Oostridium phyto fermenta ns o de Piromyces sp.
Además, las cepas capaces de metabolizar un azúcar C5 comprenden las siguientes modificaciones:
- por lo menos una copla, preferiblemente por lo menos dos copias, de un gen que codifica para una aldosa reductasa, preferiblemente el gen GRE3, se elimina, y
- el gen endógeno que codifica para una xiluloquinasa, preferiblemente el gen XKS1, se coloca bajo el control de un promotor de un gen no reprimido por la anaerobiosis o por la represión catabólica inducida por cualquier fuente de carbono, y se expresa fuertemente durante la fermentación de alcohol,
- por lo menos un gen endógeno de la porción no oxidativa de la trayectoria de fosfato de pentosa, preferiblemente seleccionado de los genes RPE1, RKI1, TKL1 y TAL1, y particularmente preferiblemente todos estos genes son colocados bajo el control de un promotor de un gen no reprimido por anaerobiosis o por la represión catabólica inducida por cualquier fuente de carbono, y que se expresa totalmente durante la fermentación de alcohol.
Los métodos para las modificaciones genéticas puede ser uno de los que se describen en WO 2011/128552 o en WO2012/72793.
De acuerdo con la primera modalidad, el método para la modificación genética comprende introducir en el genoma de la cepa A por lo menos una copia de un gen Pichiastipitis que codifica para una xilosa reductasa y por lo menos una copia de un gen Pichiastipitis que codifica para una xilosa deshidrogenasa.
El método para la modificación genética puede, además, comprender introducir en el genoma de la cepa obtenida previamente por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilosa isomerasa, que se origina preferiblemente de bacterias del género Cbstridium, y preferiblemente Cbstridium phytofermentans, y por lo menos una copia de un gen que codifica para una xilitol deshidrogenasa que se origina de Pichiastipitis.
De acuerdo con una modalidad del método de hibridación de acuerdo con la invención, dicho método comprende los siguientes pasos:
- selección de una cepa (A) capaz de metabolizar un azúcar C5;
- selección de una cepa (B) que tiene rendimientos compatibles con una aplicación industrial;
- hibridación de los segregantes de la cepa (A) con los segregantes de la cepa (B).
De acuerdo con una variante, dicho método de hibridación de acuerdo con la invención comprende los siguientes pasos adicionales:
- selección de una cepa (A) capaz de metabolizar un azúcar C5;
- esporulación de dicha cepa (A) con el fin de obtener un segregante X;
- selección de una cepa (B) que tiene rendimientos compatibles con una aplicación industrial;
- esporulación de dicha cepa (B) con el fin de obtener un segregante Y;
- hibridación de X e Y.
La cepa A se selecciona de cepas genéticamente modificadas en donde cada gen de la trayectoria de pentosa se ha desregulado, las copias del gen que codifican para la aldosa reductasa se eliminan y han sufrido una evolución dirigida.
De acuerdo con una forma de la invención, una cepa capaz de metabolizar un azúcar C5 es una cepa que comprende por lo menos una copia del gen Pichiastipitis X.R que codifica para la enzima xilosa reductasa, y por lo menos una copia del gen Pichiastipitis XDH que codifica para la enzima xilitol deshidrogenasa.
De acuerdo con otra forma de la invención, una cepa A capaz de metabolizar un azúcar C5 es una cepa de levadura que comprende por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilosa isomerasa y por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilitol deshidrogenasa preferiblemente que se origina de Pichiastipitis.
La xilosa isomerasa es un gen que se origina de Ciostridium, Piromyces, Bacteroides, Streptomyces, Haemophiius, Burkhoideria, Enterococcus, Thermotoga, Fusobacterium, GeobaciHus, Arthrobacter, dona, Physcomitreiia, Ceiivibrio, Chitinophaga, Saccharopolyspora o Saiinibacter, y preferiblemente es un gen que se origina de Ciostridium phytofermentans o de Piromyces sp.
Además, las cepas A capaces de metabolizar un azúcar C5 comprenden las siguientes modificaciones:
- por lo menos una copia, preferiblemente por lo menos dos copias, de un gen que codifica para una aldosa reductasa, preferiblemente el gen GRE3, se elimina, y
- el gen endógeno que codifica para una xiluloquinasa, preferiblemente el gen Xi <51, se coloca bajo el control de un promotor de un gen no reprimido por la anaerobiosis o por la represión catabólica inducida por cualquier fuente de carbono, y se expresa fuertemente durante la fermentación de alcohol,
- por lo menos un gen endógeno de la porción no oxidativa de la trayectoria de
fosfato de pentosa, preferiblemente seleccionado de los genes RPE1, RKI1, TKL1 y TAL1, y particularmente preferiblemente todos estos genes son colocados bajo el control de un promotor de un gen no reprimido por anaerobiosis o por la represión catabólica inducida por cualquier fuente de carbono, y que se expresa totalmente durante la fermentación de alcohol.
Los métodos para las modificaciones genéticas puede ser uno de los que se describen en WO 2011/128552 o en W02012/72793.
La cepa A también se puede seleccionar por medio de un método de localización de cepas. Sólo se seleccionan las cepas que satisfacen la prueba de crecimiento en xilosa y/o la prueba de crecimiento en el medio de CP, como se definió anteriormente.
La cepa B también se puede seleccionar por medio de un método de selección de cepas. Solo se seleccionarán las cepas con una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos igual a 95% e incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia.
Cuando la cepa es una cepa para la elaboración de pan, la cepa (B) que se seleccionará tendrá una fuerza de fermentación mayor que 5 mL^h ^g de harina 1 preferiblemente mayor que 6 mL^h ^g de harina 1 e incluso más preferiblemente mayor que 8 mL-2h_1-g de harina 1.
El método que utiliza los pasos para obtener los segregantes también puede comprender un paso de selección de segregante X y/o un paso de selección de segregante Y. Sólo se seleccionan los segregantes X que satisfacen la prueba de crecimiento en xilosa y/o la prueba de crecimiento en el medio de CP, como se definió anteriormente. Solo se seleccionarán los segregantes Y con una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos igual a 95% e incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia.
Preferiblemente, el segregante X se selecciona de las cepas depositadas en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15) el 23 de agosto del 2012 bajo el No. 1-4672 y 1-4673, y el segregante Y es la cepa depositada en la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 28 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15) el 23 de agosto del 2012 bajo el No. I-4669.
Otra materia en cuestión de la invención es un método aeróbico de "lotes alimentados" para producir levaduras en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 de una cepa como la que se describió anteriormente. Método aeróbico de "lotes alimentados" se refiere a un "cultivo en modo semi-continuo" o "cultivo semi-continuo" o "modo semi-continuo" que en la presente se refiere al cultivo en un termentador (o reactor) que se alimenta progresivamente con el medio de cultivo, pero a partir del cual no se retira ningún volumen del medio. En dicho método, el
volumen de cultivo es variable (y por lo general creciente) en el termentador, y la velocidad de alimentación puede ser constante o variable.
El método de "Lotes alimentados" por lo general se lleva a cabo bajo las condiciones descritas en el libro de referencia "Yeast Technology," Capítulo 6, 2da edición, 1991, G. Reed y T. W. Nagodawithana, que se publicó por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
De acuerdo con la invención, el índice de multiplicación por lo general es de 1.16. En general, el índice del uso de azúcares C5 por medio de las cepas de la invención depende de la naturaleza de estas cepas y puede alcanzar hasta 100% bajo ciertas condiciones. De este modo, una cepa destinada para una aplicación final en la elaboración de pan puede, en su multiplicación, utilizar hasta 50% de los azúcares C5 incluidos en el substrato de fermentación, mientras que una cepa destinada para una aplicación de la producción de etanol puede utilizar hasta 100% de los azúcares C5.
Otra materia en cuestión de la invención es el uso de las levaduras obtenidas en por lo menos una aplicación industrial seleccionada de la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabólicos secundarios, producción de proteínas, producción de ARN, producción de etanol, producción de cerveza, o la producción de extracto de levadura.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar el alcance de la misma.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Preparación de segregantes X
Con el fin de obtener los segregantes de la cepa CNCM 1-4538, la última se cultivó durante 24 horas en un medio de YPG que contiene 10 g/kg de Extracto de Levadura (EXL, por sus siglas en inglés) tipo J100, 10 g/kg de peptona y 20 g/kg de glucosa. La suspensión de las células que se obtuvo entonces se transfirió a la placa de Petri que contiene medio de SAA que consiste en 20 g/kg de agarosa y 7.5 g/kg de acetato de sodio. Después de 5 días de incubación a 30°C, las tétradas se disecaron utilizando un micromanipulador. Las placas de este modo preparadas se incubaron durante 48 horas a 30° C.
Uno de los límites para el uso de los segregantes obtenidos se relaciona con su señal sexual. De hecho, en el momento de la construcción por medio de la biología molecular de las cepas capaces de fermentar xilosa, algunos genes esenciales para esta trayectoria se introdujeron en un locus que por lo general se relaciona con Mat alfa. Por lo tanto este punto implica que todos los segregantes que se originan de la cepa depositada en la Collection Nationale des Cultures de
Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15) el 5 de octubre del 2011 bajo la referencia CNCM 1-4538, y que son capaces de metabolizar xilosa, tienen la señal Mat alfa. Con el fin de eliminar esta limitación, la señal sexual de estos segregantes fue cambiada. Para este fin, se utilizó un procedimiento que existe en la naturaleza. De hecho, algunas levaduras silvestres, cuando están en el estado haploide, son capaces de cambiar la señal sexual. Este procedimiento ocurre bajo la acción de la recombinasa de HO. La última no es funcional en la cepa depositada en la CNCM bajo la referencia CNCM 1-4538, y por consiguiente tampoco funciona en esta cepa. Se introdujo un plásmido replicativo que contiene un gen que codifica para una recombinasa de HO funcional en los segregantes de interés. Este método se basa en los estudios de Herskowitz y Jensen publicados en 1991. El gen de HO portado por el plásmido en cuestión se colocó bajo la dependencia de un promotor inducido por galactosa. Los segregantes de este modo transformados se incubaron durante 16 horas en un medio que contiene 10 g/kg de EXL tipo J100, 10 g/kg de Peptona y 20 g/kg de galactosa. Las células entonces fueron esparcidas en un medio sólido que contiene 10 g/kg de EXL tipo J100, 20 g/kg de agarosa y 20 g/kg de glucosa. Después de haber obtenido clones, el cambio en la señal sexual fue verificado al llevar a cabo un PCR en el locus de expresión de la señal sexual. Esta reacción se lleva a cabo utilizando como matriz el ADN genómico de cada segregante potencial. Los oligonucleótidos, por un lado, son un iniciador específico para el locus MAT que se expresa en el cromosoma III de la levadura (iniciador Matl: AGTCACATCAAGATCGTTTATGG) y otros dos iniciadores, uno específico para Mat alfa (iniciador Mat2: GCACGGAATATGGGACTAU ICG) y el otro específico para Mat a (iniciador Mat3: ACrCCACTTCAAGTAAGAGTTTG).
El genotipo Mat a de las levaduras se caracteriza por la presencia de un amplicón de 544 pares de base que es detectable en el gel de agarosa a 0.8%.
Los resultados obtenidos se presentan en la figura 1.
EJEMPLO 2
Preparación de segregantes Y v verificación de la capacidad de los segregantes para transmitir una alta fuerza de fermentación después de la hibridación
Preparación del segregante: el segregante depositado en la CNCM bajo el No. I-4669 se preparó de la cepa de elaboración de pan depositada en la CNCM bajo el No. 1-2970. El método de preparación utilizado es idéntico al que se describe en el Ejemplo 1.
Verificación de la transmisión: híbridos 4539 y 4550 fueron preparados por hibridación de los segregantes que se originan de las cepas de elaboración de pan que se depositan en la NCYC bajo el No. 955 y en la CNCM bajo el No. 1-2970.
Las fuerzas de fermentación en la Masa Normal (NDf por sus siglas en Inglés) y Masa Endulzada a 2 g (SD 2 g) que se indican en el siguiente cuadro muestran que el segregante I-4669 puede transmitir una alta fuerza de fermentación después de la hibridación.
CUADRO 1
EJEMPLO 3
Hibridación
Los diferentes segregantes preparados se cruzaron como se indica en el siguiente cuadro:
CUADRO 2
Los cruces realizados
EJEMPLO 4
Selección
Las cepas híbridas obtenidas en el Ejemplo 3 anterior se sometieron a las siguientes investigaciones diferentes:
1/ Prueba de crecimiento en xilosa
Esta primera prueba se refiere a la capacidad de multiplicación utilizando xilosa
como fuente de carbono.
Con el fin de determinar la capacidad de las cepas para multiplicarse utilizando xilosa como fuente de carbono, se inocularon las células mat 2 x 106/mL ¡n 50 mL de medio de YFX cuya composición se da más abajo, y se mantuvieron a 30 °C bajo agitación a 150 rpm.
La variación en la biomasa se determina al monitorear la turbidez medida con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. El resultado de este monitoreo se representa en la figura 2.
La variación en la biomasa en el medio de YFX permitió seleccionar 4 cepas. Son las cepas HC5-A, HC5-B, HC5-C y HC5-D que tienen buena disponibilidad para usar xilosa como fuente de carbono. Además, estas cepas son capaces de procesar xilosa rápidamente, mientras las HC5-K y HC5-L híbridas no se mantuvieron debido a su demora para iniciar su crecimiento en xilosa.
2/ Prueba de crecimiento en el medio de CP
Otro criterio importante es la velocidad máxima de multiplicación de las células. Con el fin de determinar esto, las levaduras se inocularon en 50 mL del medio de CP con células 2 x 106 por mL. Este medio es muy rico, ya que contiene 10 g/kg de EXL y 10 g/kg de bactopeptona así como también 100 g/kg de sacarosa. La variación en la turbidez se mide por espectrofotometría a 600 nm. A continuación, la velocidad máxima de multiplicación se analiza al identificar el período durante el cual la biomasa crece de manera exponencial. La figura 3 representa la variación en la turbidez en una escala logarítmica y como una función del tiempo de cultivo.
En el intervalo entre 3.5 y 7.5 horas, la variación en la turbidez es exponencial, que se confirma por la apariencia lineal en la gráfica que utiliza una escala logarítmica. La velocidad de multiplicación se define como la derivada de la variación en la turbidez a 600 nm como una función de tiempo. Ahora, ya que las varias líneas parecen ser paralelas, esto sugiere que las velocidades de multiplicación parecen ser comparables con aquéllas de la cepa depositada en la NCYC bajo la referencia NCYC 995 y de la cepa depositada en la CNCM bajo la referencia CNCM 1-4538 en este medio.
3/ Prueba de la fuerza de fermentación después de un pseudo lote alimentado
Las HC5-B y HC5-C híbridas (cepas 1-4670 y 1-4671) se propagaron utilizando rafinosa como fuente de carbono. El uso de este trisacárido hace posible suministrar el azúcar progresivamente a la levadura. De hecho, la rafinosa se hidroliza lentamente por la invertasa de las levaduras. Después de estandarizar las cantidades de biomasa de las diferentes producciones al medir la cantidad de material de levadura seca por unidad de volumen utilizando un aparato SMART Systems™ (CEM Corporation, E.U.A.), se analizó la liberación gaseosa utilizando un fermentómetro
risográfico. La variación en las liberaciones gaseosas para una prueba en masa normal, que se representa en la figura 4, se lleva a cabo de la siguiente manera:
• Una suspensión de levadura se prepara de la siguiente manera: la cantidad equivalente a 1 g de materia seca de la levadura que se va a probar se suspende y se lleva a 100 mL con una solución que contiene 27 g/L de NaCI y 4 g/L de (NH4)2S04.
• 15 mL de la suspensión anterior (que es 150 mg de la materia de levadura seca) se equilibran a una temperatura de 30 °C durante 15 minutos.
• A esta suspensión, se agregaron 20 g de harina, equilibrada de antemano durante la noche a 30 °C. El total se homogeneizó durante un tiempo de 35 segundos.
• La masa formada se incubó en un contenedor herméticamente cerrado que se colocó a 30 °C. La liberación gaseosa (que se expresa en mL bajo 760 mm Hg) se registró durante un tiempo total de 120 minutos.
El protocolo de la medición de la liberación gaseosa para una prueba en Masa Endulzada (SD) es idéntico al que se siguió para ND excepto que el azúcar (aquí 2 g) se agrega con los otros ingredientes secos.
Los perfiles obtenidos muestran que la represión catabólica es alta en la cepa depositada en la CNCM bajo la referencia CNCM 1-4538, que induce un fenómeno importante de diauxia que se menciona como "maltoselag" que descalifica para las aplicaciones de elaboración de pan. Por otro lado, cabe señalar que las HC5-A, B, C y D híbridas, aunque más lentas que la cepa depositada en la NCYC bajo el No. NCYC 995, parecen tener perfiles de interés. Las HC5-B y HC5-C híbridas (cepas 1-4670 y 4671) producen mejores resultados.
EJEMPLO 5
Cada una de las cepas depositadas bajo el No. 1-4670 y No. 1-4671 fueron sometidas a una prueba de crecimiento en xilosa, a una prueba de crecimiento en el medio de CP, y se midió su fuerza de fermentación.
Los resultados obtenidos se muestran en el siguiente cuadro:
EJEMPLO 6
Cada una de las cepas depositadas bajo el No. 1-4670 y No. 1-4671 se multiplicaron de acuerdo con un método aeróbico de lote alimentado durante 18 horas. Las fuerzas de fermentación de las levaduras obtenidas después del secado se midieron de acuerdo con una prueba de Masa Normal (ND) y de acuerdo con una prueba de Masa Endulzada 2 gramos (SD 2 g). Los resultados obtenidos se reproducen a continuación:
Claims (31)
1.- Una cepa de levadura del género Saccharomyces, capaz de multiplicarse bajo condiciones aeróbicas en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5, caracterizada porque satisface una prueba de crecimiento en xilosa o porque tiene una velocidad máxima de multiplicación que satisface una prueba de crecimiento en el medio de CP y porque, en su genoma, cada gen de la trayectoria de pentosa se ha desregulado, las copias del gen GRE 3 que codifican para la aldosa reductasa se eliminan, el gen XKS1 nativo se ha sobreexpresado, por lo menos una copia de un gen PichiaStipitis que codifica para una xilosa deshidrogenasa se ha introducido, y por lo menos una copia del gen PichiaStipitis que codifica para una xilosa reductasa se ha introducido.
2.- Una cepa de levadura del género Saccharomyces, capaz de multiplicarse bajo condiciones aeróbicas en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5, caracterizada porque satisface una prueba de crecimiento en xilosa o porque tiene una velocidad máxima de multiplicación que satisface una prueba de crecimiento en el medio de CP y porque, en su genoma, cada gen de la trayectoria de pentosa se ha desregulado, las copias del gen GRE 3 que codifican para la aldosa reductasa se eliminan, el gen XKS1 nativo se ha sobreexpresado, por lo menos una copia de un gen PichiaStipitis que codifica para una xilosa deshidrogenasa se ha introducido, y por lo menos una copia del gen PichiaStipitis que codifica para una xilosa isomerasa se ha introducido.
3.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el gen que codifica para la xilosa isomerasa se origina de las bacterias del género Ciostridium y preferiblemente de Ciostridium phytofermentans.
4.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque satisface una prueba de crecimiento en la xilosa y porque tiene una velocidad máxima de multiplicación que satisface una prueba de crecimiento en el medio de CP.
5.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque se selecciona del género Saccharomyces, y preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.
6.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque satisface una prueba de secado.
7.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 80%, preferiblemente por lo menos igual a 95% e incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia.
8.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la eficiencia de aplicación se selecciona del grupo que comprende la fuerza de fermentación, la viabilidad, el rendimiento de biomasa, sabor, metabolito secundario, proteína, ARN o producción de etanol.
9.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque es una cepa de levadura para elaboración de pan.
10.- La cepa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la eficiencia de aplicación es la fuerza de fermentación y es por lo menos igual a 95% de la fuerza de fermentación de referencia que es 100 mL de CO2 en 2 horas de 20 g de harina.
11.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque se depositó en la CNCM el 23 de agosto de 2012 bajo el No. 1-4670.
12.- La cepa de levadura de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque se depositó en la CNCM el 23 de agosto de 2012 bajo el No. 1-4671.
13.- Un método para obtener una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un paso de modificación genética de una cepa B que tiene una eficiencia de aplicación de referencia con el fin de hacerla capaz de metabolizar un azúcar C5.
14.- Un método para obtener una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende el cruce de una cepa A capaz de metabolizar un azúcar C5 con una cepa B que tiene una eficiencia de aplicación de referencia.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, caracterizado además porque la eficiencia de aplicación de referencia de la cepa B se selecciona del grupo que comprende la fuerza de fermentación de referencia, la viabilidad, el rendimiento de referencia de biomasa, sabor, metabolito secundario, proteína, ARN o producción de etanol.
16.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente un paso de cribado que hace posible seleccionar una cepa que satisface por lo menos una de las pruebas seleccionadas de la prueba de crecimiento en xilosa, la prueba de crecimiento en el medio de CP y la prueba de secado, o que tiene una eficiencia de aplicación EA por lo menos igual a 90%, preferiblemente por lo menos igual a 98% y aún más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia de la cepa B.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 13 o la reivindicación 16, caracterizado además porque comprende introducir en el genoma de la cepa A por lo menos una copia de un gen PichiaStipitis que codifica para una xilosa reductasa y por lo menos una copia de un gen PichiaSti itis que codifica para una xilosa deshidrogenasa.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 13 o la reivindicación 16, caracterizado además porque comprende introducir en el genoma de la cepa A por lo menos una copia de un gen exógeno que codifica para una xilosa isomerasa y por lo menos una copia de un gen que codifica para una xilitol deshidrogenasa que se origina de una levadura del género Pichia, y preferiblemente PichiaStipitis.
19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el gen que codifica para la xilosa isomerasa se origina de las bacterias del género Oostrídium y preferiblemente de Oostrídium phytofermentans.
20.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado además porque comprende los siguientes pasos: - selección de una cepa (A) capaz de metabolizar un azúcar C5; - selección de una cepa (B) que tiene rendimientos compatibles con una aplicación industrial; - hibridación de la cepa (A) con la cepa (B).
21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado además porque comprende los siguientes pasos: - selección de una cepa (A) capaz de metabolizar un azúcar C5; - esporulación de dicha cepa (A) con el fin de obtener un segregante X; -selección de una cepa (B) que tiene rendimientos compatibles con una aplicación industrial; -esporulación de dicha cepa (B) con el fin de obtener un segregante Y; - hibridación de X e Y.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 20 o la reivindicación 21, caracterizado además porque la selección de la cepa (A) se hace por medio de cribado, sólo se seleccionan las cepas que satisfacen la prueba de crecimiento en xilosa y/o la prueba de crecimiento en el medio de CP, y/o la selección de la cepa (B) se hace por medio de cribado, sólo se seleccionan las cepas que tienen una eficiencia de aplicación EA por lo menos Igual a 90%, preferiblemente por lo menos igual a 98% e incluso más preferiblemente por lo menos igual a 105% de la eficiencia de aplicación de referencia.
23.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque comprende un paso de cribado del segregante X y/o un paso de cribado del segregante Y.
24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado además porque el segregante X se selecciona de las cepas depositadas el 23 de agosto de 2012 bajo el No. 1-4672 y No. 1-4673, y el segregante Y es la cepa depositada el 23 de agosto de 2012 bajo el No. 1-4669.
25.- El uso de las levaduras obtenidas al cultivar cepas como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o como se obtiene del método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24 en una aplicación industrial seleccionada de la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabolitos secundarios, producción de proteínas, producción de ARN, producción de etanol, producción de cerveza o producción de extracto de levadura.
26.- Un método aeróbico de "lotes alimentados" para producir levaduras en un substrato que comprende por lo menos un azúcar C5 de una cepa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o como se obtiene de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24.
27.- El uso de levaduras producidas de conformidad con el método de la reivindicación 26, en una aplicación industrial seleccionada de la elaboración de pan, producción de biomasa, producción de sabor, la producción de metabolitos secundarios, producción de proteínas, producción de ARN, producción de etanol, producción de cerveza, vitivinicultura o la producción de extracto de levadura.
28.- La cepa de levadura de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24 y 26, caracterizado además porque dicho substrato C5 comprende por lo menos un azúcar C6.
29.- La cepa de levadura o método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la relación de de azúcar C5/C6 está entre 0.1 y 2.
30.- La cepa de levadura o método de conformidad con la reivindicación 28 o la reivindicación 29, caracterizado además porque el azúcar C5 es xilosa.
31.- La cepa de levadura o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizada además porque los azúcares C6 se seleccionan de glucosa, fructosa, galactosa, mañosa o se originan de la degradación de un disacárido como sacarosa, maltosa, trehalosa o isomaltosa.
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