MX2015003932A - Metodos para diagnosticar y tratar la enfermedad inflamatoria intestinal. - Google Patents

Metodos para diagnosticar y tratar la enfermedad inflamatoria intestinal.

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Abstract

Se proporcionan biomarcadores predictivos de la sensibilidad a los antagonistas de integrina beta7, incluyendo anticuerpos de subunidad anti-integrina beta7, y métodos para utilizar tales biomarcadores. Además, se proporcionan métodos para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como enfermedades inflamatorias intestinales incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. También se proporcionan métodos para utilizar tales biomarcadores predictivos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.

Description

MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR Y TRATAR LA ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de E.U. provisional No.61/860,422 presentada el 31 de julio de 2013 y de la Solicitud de E.U. provisional No. 61/710,656 presentada el 5 de octubre de 2012, ambas de las cuales se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de EFS-Web y se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 23 de septiembre de 2013, se denomina P4989RlWO_SL.txt y es de 19,125 bytes de tamaño.
CAMPO Se proporcionan biomarcadores predictivos de sensibilidad a antagonistas de integrina beta7, incluyendo anticuerpos de subunidad anti-integrina beta7, y métodos para utilizar tales biomarcadores. Además, se proporcionan métodos para tratar trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como las enfermedades inflamatorias intestinales incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. También se proporcionan métodos para utilizar tales biomarcadores predictivos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias intestinales incluyendo colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.
ANTECEDENTES La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es una condición autoinmune inflamatoria crónica del tracto gastrointestinal (GI), que se presenta clínicamente ya sea como colitis ulcerativa (UC) o enfermedad de Crohn (CD). CD es una enfermedad inflamatoria transmural crónica con el potencial de afectar cualquier parte del tracto GI completo, y UC es una inflamación mucosal del colon. Ambas condiciones se caracterizan clínicamente por movimientos frecuentes del intestino, mala nutrición, y deshidratación, con interrupción en las actividades de la vida diaria. CD frecuentemente se complica por el desarrollo de mala absorción, contracciones, y fístulas y puede requerir cirugía repetida. UC, menos frecuentemente, puede complicarse por diarrea sanguínea severa y megacolon tóxico, que también requiere cirugía. Ambas condiciones de la IBD se asocian con un riesgo incrementado para malignidad del tracto GI. La etiología de IBD es compleja, y muchos aspectos de la patogénesis permanecen poco claros.
El tratamiento de IBD de moderada a severa plantea retos significativos para los médicos tratantes, debido a que la terapia convencional con corticoesteroides y terapia inmunomoduladora (e.g., azatioprina, 6 mercaptopurina, y metotrexato) se asocia con efectos secundarios e intolerancia y no ha demostrado beneficio probado en terapia de mantenimiento (esteroides). Los anticuerpos monoclonales que se dirigen al factor de necrosis de tumoral alfa (TNF-a), tales como infliximab (un anticuerpo quimérico) y adalimumab (un anticuerpo completamente humano), se utilizan actualmente en el manejo de CD. Infliximab también ha demostrado eficacia y se ha aprobado para usarse en UC. Sin embargo, aproximadamente 10%-20% de pacientes con CD básicamente no responden a la terapia anti TNF, y otro ~20%-30% de los pacientes con CD pierden respuesta a través del tiempo (Schnitzler et al., Gut 58:492-500 (2009)). Otros eventos adversos (AEs) asociados con anti TNFs incluyen tasas elevadas de infección bacteriana, incluyendo tuberculosis, y, más raramente, linfoma y demielinación (Chang et al., Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220 (2006); Hoentjen et al., World J. Gastroenterol.15(17):2067 (2009)). Ninguna terapia actualmente disponible logra la remisión sostenida en más del 20%-30% de pacientes con IBD con enfermedad crónica (Hanauer et al., Lancet 359:1541-49 (2002); Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)). Además, la mayoría de los pacientes no logran remisión sostenida libre de esteroides y curación mucosal, resultados clínicos que se correlacionan con la modificación real de la enfermedad. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar una terapia más dirigida en IBD que se optimice para uso crónico: un perfil de seguridad mejorado con remisión sostenida, particularmente remisión libre de esteroides y prevención de complicaciones a largo plazo en una mayor proporción de pacientes, incluyendo aquellos pacientes quienes ya sea que nunca responden a un agente terapéutico anti TNF o que pierden respuesta a través del tiempo (pacientes que responden de manera inadecuada a TNF o pacientes TNF-IR).
Las integrinas son receptores de glicoproteína de superficie celular heterodimérica alfa/beta que juegan un papel en numerosos procesos celulares incluyendo adhesión de leucocitos, señalización, proliferación, y migración, así como en regulación genética (Hynes, R. O., Cell, 1992, 69:11-25; y Hemler, M. E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8:365-368). Estas se componen de dos subunidades de transmembrana a y b heterodiméricas que interactúan no covalentemente, que se unen específicamente a distintas moléculas de adhesión celular (CAMs) en proteínas de matriz extracelular, de epitelio y endotelio. De esta manera, las integrinas pueden funcionar como receptores de adhesión celular específica del tejido que ayudan en el reclutamiento de leucocitos de la sangre en casi todos los sitios de tejido en una manera altamente regulada, jugando un papel en la guía de leucocitos a tejido normal y a sitios de inflamación (von Andrian et al., N Engl J Med 343:1020-34 (2000)). En el sistema inmune, las integrinas se encuentran involucradas en el tráfico de leucocito, la adhesión e infiltración durante procesos inflamatorios (Nakajima, H. et al . , J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154). La expresión diferencial de integrinas regula las propiedades adhesivas de las células y se incluyen diferentes integrinas en diferentes respuestas inflamatorias. (Butcher, E. C. et al . , Science, 1996, 272:60-66). Las integrinas que contienen beta7 (es decir, alfa4beta7 y alfaEbeta7) se expresan principalmente en monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, y macrófagos pero no en neutrófilos (Elices, M. J. et al . , Cell, 1990, 60:577-584).
La integrina a4b7 es un receptor que guía el leucocito que es importante en la migración de las células a la mucosa intestinal y tejidos linfoides asociados, tales como parches de Pcyer en el intestino delgado, folículos linfoide en el intestino grueso, y nodos linfáticos mesentéricos. En los intestinos, el enrollado de leucocito y adhesión firme al endotelio mucosal se inicia por señales de quimiocinas y se media a través de sialil Lewis X asociada a molécula de adhesión celular de adresina mucosal (MAdCAM)-1. La señalización de quimiocina induce la integrina a4b7 para experimentar un cambio de afinidad de unión baja a alta a MAdCAM-1. El leucocito se para entonces y comienza el proceso de extravasación a través del endotelio vascular al tejido subyacente. Se cree que este proceso de extravasación ocurra en tanto el estado de reticulación de célula inmune normal como en condiciones inflamatorias (von Andrian et al., supra) . Los números de células a4b7+ en infiltrados y la expresión del ligando MAdCAM-1 son más altos en sitios de inflamación crónica tal como en el tracto intestinal de pacientes con UC o CD (Briskin et al., Am J Pathol 151:97-110 (1997); Souza et al., Gut 45:856-63 (1999)). a4b7 se une preferentemente a altas vénulas endoteliales que expresan MAdCAM-1 y molécula de adhesión celular vascular (VCAM)-l, así como al fragmento de fibronectina de molécula de matriz extracelular CS-1 (Chan et al., J Biol Chem 267:8366-70 (1992); Ruegg et al., J Cell Biol 17:179-89 (1992); Berlín et al., Cell 74:185-95 (1993)). Junto con MAdCAM-1 constitutivamente expresada en vasos mucosales del intestino, la integrina a4b7 juega un papel selectivo en tropismo intestinal por leucocito pero no parece contribuir a guiar los leucocitos al tejido periférico o el CNS. En su lugar, el tráfico de linfoide periférico se ha asociado con interacción a4b? con VCAM-1 (Yednock et al., Nature 356:63-6 (1992); Rice et al., Neurology 64:1336-42 (2005)).
Otro miembro de la familia de integrina b7, expresado exclusivamente en los linfocitos T y asociado con tejidos mucosales, es la integrina aEb7, de otro modo conocido co o CD103. La integrina aEb7 se une selectivamente a cadherina-E en células epiteliales y se ha propuesto que juega un papel en la retención de células T en el tejido mucosal en el compartimento de linfocito intraepitelial (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993); Karecla et al. Eur J Immunol 25:852-6 (1995)). Se ha reportado que las células aEb7+ en la lámina propia muestran citotoxicidad contra células epiteliales infectadas o estresadas (Hadlcy et al., J Immunol 159:3748-56 (1997); Buri et al., J Pathol 206:178-85 (2005)). La expresión de aEb7 se incrementa en CD (Elewaut et al., Acta Gastroenterol Belg 61:288-94 (1998); Oshitani et al., Int J Mol Med 12:715-9 (2003)), y se ha reportado que el tratamiento con anticuerpo 3^ ?-aEb7 atenúa la colitis experimental en ratones, implicando un papel para linfocitos aEb7+ en modelos experimentales de IBD (Ludviksson et al., J Immunol 162:4975-82 (1999)).
La administración de anticuerpos monoclonales contra alfaE beta7 supuestamente evita y mejora la colitis inducida por inmunización en ratones IL-2 sugiriendo que el inicio y mantenimiento de la enfermedad inflamatoria intestinal depende de la localización colónica de linfocitos CD4+ de lámina propia que expresan alfaEbeta7 (Ludviksson et al., J Immunol.1999, 162(8)-.4975-82). Un anticuerpo anti-a4 (natalizumab) supuestamente tiene eficacia en el tratamiento de pacientes con CD (Sandborn et al . , N Engl J Med 2005; 353:1912-25) y un anticuerpo anti-a4p7 (MLN-02, MLN0002, vedolizumab) supuestamente es efectivo en pacientes con UC (Feagan et al . , N Engl J Med 2005;352:2499-507). Un segundo anticuerpo anti-alfa4/beta7 (AMG 181) también está en desarrollo y recientemente se han comenzado pruebas clínicas (identificador clinicaltrials(dot)gov, NCT01164904, Septiembre 2012). Estos estudios y descubrimientos validan a4b7 como un objetivo terapéutico y soportan la idea que la interacción entre a4b7 y MAdCAM-1 media la patogénesis de IBD. De esta manera, los antagonistas de integrina beta7 son de mayor potencial como un agente terapéutico para tratar IBD.
Los anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos contra la subunidad de integrina b7 se han descrito previamente. Ver, e.g., Publicación de Patente Internacional No. W02006/026759. Un tal anticuerpo, rhuMAb Beta7 (etrolizumab) se deriva del anticuerpo monoclonal anti ratón/humano FIB504 de rata (Andrew et al.1994). Se diseñó incluir estructuras de cadena ligera Kl y cadena pesada de IgGl de humano. Publicación de Patente Internacional No. W02006/026759. La administración de etrolizumab a pacientes humanos de acuerdo a ciertos regímenes de dosificación se ha descrito previamente. Ver, e.g., Publicación de Patente Internacional No. WO/2012/135589.
RhuMAb Beta7 (etrolizumab) se une a a4b7 (Holzmann et al., Cell 56:37-46 (1989); Hu et al., Proc Nati Acad Sci USA 89:8254-8 (1992)) y aEb7 (Cepek et al., J Immunol 150:3459-70 (1993)), que regulan el tráfico y retención de subconjuntos de linfocito, respectivamente, en la mucosa intestinal. Los estudios clínicos han demostrado la eficacia de un anticuerpo anti a4 (natalizumab) para el tratamiento de CD (Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)), y se han reportado resultados alentadores para anticuerpo anti 0?4b7 (LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab) en el tratamiento de UC (Feagan et al., N Engl J Med 352:2499-507 (2005), Feagan et al., N Engl J Med 369(8):699-710 (2013)) y también CD (Sandborn et al., N Engl J Med 369(8):711-721 (2013)). Estos descubrimientos ayudan a validar 0?4b7 como un objetivo terapéutico potencial y soportar la hipótesis que la interacción entre a4b7 y molécula de adhesión celular de adresina mucosal 1 (MAdCAM 1) contribuye a la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD).
A diferencia de natalizumab, que une «4 y de esta manera une tanto a4b? y a4b7, rhuMAb Beta7 se une específicamente a la subunidad b7 de a4b7 y aEb7 y no se une a subunidades individuales de integrina a4 o b?. Esto se demostró por la incapacidad del anticuerpo para inhibir la adhesión de células o^ l+o^ 7-Ramos a molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM 1) a concentraciones tan altas como 100 nM. De manera importante, esta característica de rhuMAb Beta7 indica selectividad: subconjuntos de célula T que expresan a4b1 pero no b7, no deberían afectarse directamente por rhuMAb Beta7.
El soporte para los efectos específicos del intestino de rhuMAb Beta7 en la guía de leucocito viene de varios estudios no clínicos in vivo. En ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) reconstituidos con células T CD45RBaltaCD4+ (un modelo animal de colitis), rhuMAb Beta7 bloqueó el linfocito radiomarcado que se guía al colon inflamado pero no bloqueó la guía al bazo, un órgano linfoide periférico. Ver, e.g., Publicación de Patente Internacional No. W02006/026759. Además, anti-murino b7 quimérico de rata-ratón (anti b7, muFIB504) fue incapaz de reducir el grado histológico de la inflamación del sistema nervioso central (CNS) o mejorar la supervivencia de la enfermedad en ratones transgénicos con receptor de célula T de proteína básica de mielina (MBP-TCR) con encefalitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal de esclerosis múltiple. Id. Además, en dos estudios de seguridad en monos cinomolgos, rhuMAb Beta7 indujo un incremento moderado en los números de linfocitos sanguíneos periféricos que fue debido grandemente a un incremento marcado (aproximadamente tres- a seis veces) en células T se sangre periférica CD45RA p7alta, un subconjunto que es fenotípicamente similar a células T efectoras/de memoria que se guían al intestino en humanos.
Ver, e.g., Publicación de Patente Internacional No. W02009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol.162:1855-1870 (2011). En contraste, rhuMAb Beta7 tuvo efecto mínimo a ninguno en el número de células T de sangre periférica intermediaria CD45RA+P7, un subconjunto que es fenotípicamente similar a células T simples en humanos, y ningún efecto en el número de células de sangre periférica CD45RA p7ba:ia, un subconjunto que es fenotípicamente similar a células T efectoras/de memoria de guía periférica en humanos, confirmando la especificidad de rhuMAb Beta7 para la subpoblación de linfocito que se guía al intestino. Publicación de Patente Internacional No. W02009/140684; Stefanich et al., Br. J. Pharmacol.162:1855-1870 (2011).
Aunque los estudios clínicos han demostrado la eficacia de un anticuerpo anti-o¡4 (natalizumab) para el tratamiento de CD (Sandborn et al., N Engl J Med 353:1912-25 (2005)), y se han reportado resultados alentadores para anticuerpo anti-o(4p7 (LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab) en el tratamiento de UC, permanece una necesidad de mejoras adicionales en el tratamiento de estos trastornos. Por ejemplo, tratamiento con natalizumab se ha asociado con casos confirmados de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) en pacientes con enfermedad de Crohn (y por separado, esclerosis múltiple) quien recibió el tratamiento concomitante con natalizumab e inmunosupresores. PML es una condición neurológica potencialmente fatal relacionada con la reactivación de un poliomavirus (virus JC) y réplica viral activa en el cerebro. Intervenciones no conocidas pueden prevenir de manera confiable PML o tratar de manera adecuada PML, si ocurre. Una limitación del tratamiento con vedolizumab es que se administra intravenosamente, lo que puede ser inconveniente para el paciente y también puede asociarse con eventos indeseables o adversos, e.g., reacciones del sitio de infusión. De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad de planteamientos terapéuticos mejorados para el tratamiento de trastornos inflamatorios gastrointestinales tal como IBD, e.g., colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, así como regímenes de dosificación más deseables.
Con frecuencia se desconoce, antes de tratamiento, si un paciente responderá a un agente terapéutico particular o clase de agentes terapéuticos. De acuerdo con lo anterior, ya que los pacientes con IBD en general, y pacientes con UC y CD en particular, buscan tratamiento, hay prueba considerable y error incluido en la búsqueda de agente(s) terapéutico(s) efectivo(s) para un paciente particular. Tal prueba y error con frecuencia incluye riesgo considerable e incomodidad del paciente para encontrar la terapia más efectiva. De esta manera, existe una necesidad de medios más efectivos para determinar que pacientes responderán a que tratamiento y para incorporar tales determinaciones en regímenes de tratamiento más efectivos para pacientes con IBD.
Por lo tanto sería altamente ventajoso tener métodos de diagnóstico adicionales, incluyendo métodos de diagnóstico predictivos, que pueden utilizarse para identificar de manera objetiva pacientes más propensos a responder al tratamiento con varios agentes terapéuticos para IBD, incluyendo anticuerpos de subunidad anti-integrina beta7. De esta manera, existe una necesidad continua de identificar nuevos biomarcadores asociados con colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn así como otros trastornos inflamatorios intestinales y que son predictivos de respuesta a anticuerpos de subunidad anti-integrina beta7. Además, la información estadística y biológicamente significativa y reproducible considerando tales asociaciones podría utilizarse como un componente esencial en esfuerzos para identificar subconjuntos específicos de pacientes con UC o CD, tales como pacientes TNF-IR, de quienes se esperaría que se beneficien del tratamiento con anticuerpos de subunidad anti-integrina beta7, por ejemplo donde el agente terapéutico es, o que se ha mostrado en estudios clínicos que es de beneficio terapéutico en tal subpoblación de pacientes con CD o UC específica.
La invención descrita en la presente satisface ciertas de las necesidades arriba descritas y proporciona otros beneficios.
Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo publicaciones y solicitudes de patente, se incorporan para referencia en su totalidad para cualquier propósito.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos de la invención se basan, al menos en parte, en el descubrimiento que los niveles de expresión de ARNm de ciertos genes en biopsias intestinales y en sangre entera periférica, así como los niveles de expresión de proteína celular de ciertos genes en biopsias intestinales son predictivos de la sensibilidad de pacientes, que padecen de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, a tratamiento con antagonistas de integrina beta7.
De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, se proporcionan métodos para predecir la respuesta de un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7. En ciertas modalidades, se obtiene una muestra biológica del paciente y se miden niveles de expresión de ARNm. En una modalidad, se mide la expresión de ARNm de integrina beta7. En una modalidad, se mide la expresión de ARNm de integrina alfaE. En una modalidad, se mide la expresión de CD3épsilon. En una modalidad, se mide la expresión de una combinación de dos o tres ARNms seleccionados de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon. En una modalidad, la muestra biológica es una muestra de biopsia de tejido. En una modalidad, la biopsia se obtiene de tejido intestinal. En una modalidad, la muestra biológica es sangre entera periférica. En una modalidad, la sangre entera periférica se recolecta en un tubo PAXgene. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de ARNm se mide por un método PCR. En una modalidad, el método PCR es qPCR. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de ARNm se compara con un valor promedio. En una modalidad, se predice que el paciente responde a terapia que comprende el antagonista de integrina beta7 si el nivel de expresión de ARNm de una o más de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon es elevado en comparación con un valor de referencia, el cual en ciertas modalidades es un valor promedio. En una modalidad, se predice que el paciente no responde a terapia que comprende el antagonista de integrina beta7 si el nivel de expresión de ARNm de una o más de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon es bajo en comparación con un valor de referencia, el cual en ciertas modalidades, es un valor promedio. En una modalidad, la respuesta es remisión clínica. En una modalidad, la respuesta es curación mucosal. En una modalidad, la respuesta es respuesta clínica. En ciertas modalidades, se determina que la remisión en el paciente se induce cuando la Escala Mayo absoluta < 2 y sin subpuntuación individual >1, que también se refiere como remisión clínica. En ciertas modalidades, se determina que la curación mucosal ha ocurrido cuando se determina que el paciente tiene una subpuntuación de endoscopia de 0 o 1 según se valoró por sigmoidoscopia flexible. En ciertas tales modalidades, se determina que los pacientes que experimentan curación mucosal tienen una subpuntuación de endoscopia de 0.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para predecir la sensibilidad de un paciente, con trastorno inflamatorio gastrointestinal, a un tratamiento con antagonista de integrina beta7. En una modalidad, se determina el nivel de expresión de ARNm de integrina beta7 en una muestra biológica del paciente. En una modalidad, se determina el nivel de expresión de ARNm de integrina alfaE en una muestra biológica del paciente. En una modalidad, se determina el nivel de expresión de ARNm de CD3épsilon en una muestra biológica del paciente. En una modalidad, se determina el nivel de expresión de ARNm de dos o tres ARNms seleccionados de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en una muestra biológica del paciente. En ciertas modalidades, la expresión de ARNm de integrina beta7 elevada en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un valor promedio, o expresión de ARNm de integrina alfaE elevada en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un valor promedio, o expresión de ARNm de CD3épsilon elevada en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un valor promedio, detectada en la muestra biológica identifica al paciente como uno que es propenso a responder al tratamiento con antagonista de integrina beta7.
En todavía otro aspecto, se obtiene una muestra biológica del paciente y se miden el número de células que expresan una o una combinación de ciertas proteínas y en comparación con el número total de células o el número de células que expresan la proteína, se determina en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico. En una modalidad, se mide el número de células que expresan integrina beta7. En una modalidad, se mide el número de células que expresan integrina alfaE. En una modalidad, se mide el número de células que expresan CD3épsilon. En una modalidad, se mide el número de células que expresan una combinación de dos o tres proteínas seleccionadas de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon. En una modalidad, la muestra biológica es una muestra de biopsia de tejido. En una modalidad, la biopsia se obtiene de tejido intestinal. En una modalidad, la muestra biológica se coloca en formalina y se incrusta opcionalmente en bloques de parafina. En ciertas modalidades, el número de células que expresan una o una combinación de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon se mide por un método inmunohistoquímico. En ciertas modalidades, el número de células que expresan una o una combinación de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon se compara con el número total de células en un área dada. En una modalidad, se predice que el paciente responde a terapia que comprende el antagonista de integrina beta7 si el número de células que expresan uno o más de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon es elevado (o alto) en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un valor promedio. En una modalidad, se predice que el paciente no responde a terapia que comprende el antagonista de integrina beta7 si el número de células que expresan uno o más de integrina beta7, integrina alfaE, o CD3épsilon es bajo en comparación con un valor de referencia, por ejemplo, un valor promedio. En una modalidad, la respuesta es remisión clínica. En una modalidad, la respuesta es curación mucosal. En una modalidad, la respuesta es respuesta clínica. En ciertas modalidades, se determina que la remisión en el paciente se induce cuando la Escala Mayo absoluta < 2 y sin subpuntuación individual >1, que también se refiere como remisión clínica. En ciertas modalidades, se determina que la curación mucosal ha ocurrido cuando se determina que el paciente tiene una subpuntuación de endoscopia de 0 o 1 según se valoró por sigmoidoscopia flexible. En ciertas tales modalidades, se determina que los pacientes que experimentan curación mucosal tienen una subpuntuación de endoscopia de 0.
En aún otro aspecto, se proporcionan métodos para identificar un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, como propenso a responder a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7. En ciertas modalidades, los métodos comprenden: (a) medir el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen en una muestra biológica del paciente, en donde el al menos un gen se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el nivel de expresión de ARNm medido en (a) con un nivel de referencia; y (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión.
En un aspecto adicional, se proporcionan métodos para tratar un paciente que tiene un trastorno inflamatorio gastrointestinal. E Enn cciieerrttaass mmooddaalliiddaaddeess,, los métodos comprenden: (a) medir el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen en una muestra biológica del paciente, en donde el al menos un gen se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el nivel de expresión de ARNm medido en (a) con un nivel de referencia; (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia; y(d) administrar la terapia cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia, tratando así el trastorno inflamatorio gastrointestinal. En una modalidad, 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, una dosis de carga plana de 420 mg del antagonista de integrina beta7 se administra subcutáneamente, seguida por dos semanas después de la administración de la dosis de carga por una segunda administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida por dos semanas después de la segunda administración por una tercer administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida cuatro semanas después de la tercer administración por administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 y después administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión. En una modalidad, la administración del antagonista de integrina beta7 da como resultado uno o más de lo siguiente: (1) una disminución de 3 puntos y 30% de reducción desde la línea basal en MCS y disminución ; 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1, (2) una subpuntuación endoscópica de 0 o 1, (3) MCS 2 sin subpuntuación individual > 1.
En aún otro aspecto, se proporcionan métodos para predecir la respuesta de un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7. En ciertas modalidades, los métodos comprenden: obtener una muestra biológica del paciente, medir el número de células que expresan al menos una proteína seleccionada de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon, comparar el número de células de expresión medidas en la muestra con un nivel de referencia, y predecir la respuesta del paciente a la terapia, en donde los números elevados de células de expresión en comparación con el nivel de referencia indica respuesta a la terapia y un número bajo de células de expresión en comparación con el nivel de referencia indica no respuesta a la terapia. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión. En una modalidad, la muestra biológica es tejido intestinal. En una modalidad, los métodos comprenden medir el número de células de expresión por un método inmunohistoquímico. En una modalidad, la medición comprende poner en contacto la muestra con un agente que se une específicamente a la proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, o proteína CD3épsilon y detectar la cantidad de complejo formado, y medir así el número de células de expresión. En una modalidad, el número de células de expresión en la muestra se divide entre el número total de células en la muestra. En una modalidad, se determina el número de células de expresión en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para predecir la sensibilidad de un paciente, con trastorno inflamatorio gastrointestinal, a un tratamiento con antagonista de integrina beta7. En ciertas modalidades, los métodos comprenden determinar el número de células que expresan al menos una proteína seleccionada de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en una muestra biológica del paciente, en donde los números elevados de células de expresión en comparación con un nivel de referencia identifica al paciente como uno que es propenso a responder al tratamiento con antagonista de integrina beta7. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión. En una modalidad, la muestra biológica es tejido intestinal. En una modalidad, los métodos comprenden medir el número de células de expresión por un método inmunohistoquímico. En una modalidad, la medición comprende poner en contacto la muestra con un agente que se une específicamente a la proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, o proteína CD3épsilon y detectar la cantidad de complejo formado, y así medir el número de células de expresión. En una modalidad, el número de células de expresión en la muestra se divide entre el número total de células en la muestra. En una modalidad, se determina el número de células de expresión en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio.
En todavía otro aspecto, se proporcionan métodos para identificar un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, como propenso a responder a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7. En ciertas modalidades, los métodos comprenden: (a) medir el número de células que expresan al menos una proteína en una muestra biológica del paciente, en donde la al menos una proteína se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el número de células medidas en (a) con un nivel de referencia; y (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el número de células medidas en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión. En una modalidad, la muestra biológica es tejido intestinal. En una modalidad, los métodos comprenden medir el número de células de expresión por un método inmunohistoquimico. En una modalidad, la medición comprende poner en contacto la muestra con un agente que se une específicamente a la proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, o proteína CD3épsilon y detectar la cantidad de complejo formado, y medir así el número de células de expresión. En una modalidad, el número de células de expresión en la muestra se divide entre el número total de células en la muestra. En una modalidad, se determina el número de células de expresión en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio.
En aún otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar un paciente que tiene un trastorno inflamatorio gastrointestinal. En ciertas modalidades, comprendiendo el método: (a) medir el número de células que expresan al menos una proteína en una muestra biológica del paciente, en donde la al menos una proteína se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el número de células de expresión medidas en (a) con un nivel de referencia; (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el número de células de expresión medidas en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia; y (d) administrar la terapia cuando el número de células de expresión medidas en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia, tratando así el trastorno inflamatorio gastrointestinal. En una modalidad, 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, una dosis de carga plana de 420 mg del antagonista de integrina beta7 se administra subcutáneamente, seguida por dos semanas después de la administración de la dosis de carga por una segunda administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida por dos semanas después de la segunda administración por una tercer administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida cuatro semanas después de la tercer administración por administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 y después administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad, el paciente responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR). En una modalidad, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn. En una modalidad, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión. En una modalidad, la administración del antagonista de integrina beta7 da como resultado uno o más de lo siguiente: (1) una disminución de 3 puntos y 30% de reducción desde la línea basal en MCS y disminución _> 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1, (2) una subpuntuación endoscópica de 0 o 1, (3) MCS < 2 sin subpuntuación individual > 1. En una modalidad, la muestra biológica es tejido intestinal. En una modalidad, los métodos comprenden medir el número de células de expresión por un método inmunohistoquimico. En una modalidad, la medición comprende poner en contacto la muestra con un agente que se une específicamente a la proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, o proteína CD3épsilon y detectar la cantidad de complejo formado, y medir así el número de células de expresión. En una modalidad, el número de células de expresión en la muestra se divide entre el número total de células en la muestra. En una modalidad, se determina el número de células de expresión en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio.
En aún otro aspecto, se proporciona un antagonista de integrina beta7 para utilizarse en tratar un paciente que tiene un trastorno inflamatorio gastrointestinal. En ciertas modalidades, el paciente se trata o selecciona para tratamiento cuando el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen seleccionado de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon está arriba de un nivel de referencia. En ciertas modalidades, el paciente se trata o selecciona para tratamiento cuando el número de células que se expresan al menos en la proteína seleccionada de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon es elevado o alto en comparación con un nivel de referencia. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio. En una modalidad, el antagonista de integrina beta7 es para utilizarse en tratar el paciente, en donde se administran 100 mg subcutáneamente una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, el antagonista de integrina beta7 es para utilizarse en tratar el paciente, en donde se administra subcutáneamente una dosis de carga plana de 420 mg del antagonista de integrina beta7, seguida por dos semanas después de la administración de la dosis de carga por una segunda administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida por dos semanas después de la segunda administración por una tercer administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida cuatro semanas después de la tercer administración por administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 y después administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 una vez cada cuatro semanas.
En un aspecto adicional, se proporciona el uso in vitro de al menos un agente que se une específicamente a un biomarcador seleccionado de ARNm de integrina beta7, ARNm de integrina alfaE, ARNm de CD3épsilon, proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, y proteína de CD3épsilon. En ciertas modalidades, el al menos un agente se utiliza para identificar o seleccionar un paciente, que tiene un trastorno gastroinflamatorio, como propenso a responder a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, en donde un nivel de expresión de ARNm de integrina beta7, integrina alfaE, y/o CD3épsilon o un número de células que expresan integrina beta7, integrina alfaE, y/o CD3épsilon arriba de un nivel de referencia identifica o selecciona al paciente que es más probable que responda a la terapia. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor promedio.
En aún otro aspecto, se proporcionan métodos para tratar un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un paciente. En ciertas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7 se administra a un paciente cuando se ha determinado que una muestra biológica obtenida del paciente expresa niveles elevados de expresión de ARNm de uno o más de ciertos genes. En una modalidad, se ha determinado que la muestra expresa ARNm de integrina beta7 elevado en comparación con el valor promedio. En una modalidad, se ha determinado que la muestra expresa ARNm de integrina alfaE elevado en comparación con el valor promedio. En una modalidad, se ha determinado que la muestra expresa ARNm de CD3épsilon elevado en comparación con el valor promedio. En una modalidad, se ha determinado que la muestra expresa niveles de ARNm elevados de dos o tres de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en comparación con los niveles medios de los mismos ARNms. En ciertas modalidades, el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en niveles elevados de expresión de ARNm de ciertos genes en la muestra biológica en comparación con un valor promedio del mismo gen o genes. En una modalidad, el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en la expresión de ARNm de integrina beta7 elevada en comparación con el valor promedio. En una modalidad, el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en la expresión de ARNm de integrina alfaE elevada en comparación con el valor promedio. En una modalidad, el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en la expresión de ARNm de CD3épsilon elevada en comparación con el valor promedio. En una modalidad, el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en la expresión de ARNm elevada de dos o tres de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en comparación con los valores medios para los mismos ARNms. En una modalidad, la muestra biológica es una muestra de biopsia de tejido. En una modalidad, la muestra biológica es sangre entera periférica. En una modalidad, la sangre entera periférica se recolecta en un tubo PAXgene. En ciertas modalidades, el nivel de expresión de ARNm se mide por un método PCR. En una modalidad, el método PCR es qPCR. En ciertas modalidades la administración del antagonista de integrina beta7 da como resultado uno o más de lo siguiente: (1) una disminución de 3 puntos y 30% de reducción desde la línea basal en MCS y disminución > 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1, (2) una subpuntuación endoscópica de 0 o 1, (3) MCS <_ 2 sin subpuntuación individual > 1. En una modalidad, 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, una dosis de carga plana de 420 mg del antagonista de integrina beta7 se administra subcutáneamente, seguida por dos semanas después de la administración de la dosis de carga por una segunda administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida por dos semanas después de la segunda administración por una tercer administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7, seguida cuatro semanas después de la tercer administración por administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 y después administración subcutánea de 300 mg del antagonista de integrina beta7 una vez cada cuatro semanas.
En ciertas de las modalidades anteriores, el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal, y en ciertas tales modalidades, la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa (UC) o enfermedad de Crohn (CD), y en ciertas tales modalidades, el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal. En ciertas tales modalidades, el anticuerpo anti-beta7 se selecciona de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos Al-All, en donde Al-All es RASESVDTYLH (SEC ID NO:l); RASESVDSLLH (SEC ID N0:7), RASESVDTLLH (SEC ID N0:8), o RASESVDDLLH (SEC ID NO:9) o una variante de la SEC ID N0s:l, 7, 8 o 9 (SEC ID NO:26) en donde el aminoácido A2 se selecciona del grupo que consiste de A, G, S, T, y V y/o el aminoácido A3 se selecciona del grupo que consiste de S, G, I, K, N, P, Q, R, y T, y/o A4 se selecciona del grupo que consiste de E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N, y R, y/o el aminoácido A5 se selecciona del grupo que consiste de S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, y V, y/o el aminoácido A6 se selecciona del grupo que consiste de V, R, I, A, G, K, L, M, y Q, y/o el aminoácido A7 se selecciona del grupo que consiste de D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, y T, y/o el aminoácido A8 se selecciona del grupo que consiste de D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 se selecciona del grupo que consiste de L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 se selecciona del grupo que consiste de L, A, I, M, y V y/o el aminoácido All se selecciona del grupo que consiste de H, Y, F, y S; (ii) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEC ID NO:2), RYASQSIS (SEC ID NO:20), o XaaYASQSIS (SEC ID NO:21, donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de la SEC ID NOs:2, 20 o 21 (SEC ID NO:27) en donde el aminoácido B1 se selecciona del grupo que consiste de K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (en donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 se selecciona del grupo que consiste de S y D, y/o el aminoácido B5 se selecciona del grupo que consiste de Q y S, y/o el aminoácido B6 se selecciona del grupo que consiste de S, D, L, y R, y/o el aminoácido B7 se selecciona del grupo que consiste de I, V, E, y K; (iii) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos C1-C9, en donde C1-C9 es QQGNSLPNT (SEC ID NO:3) o una variante de la SEC ID NO:3 (SEC ID NO:28) en donde el aminoácido C8 se selecciona del grupo que consiste de N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L, y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos D1-D10 en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEC ID NO:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos E1-E17 en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEC ID NO:5), o una variante de la SEC ID NO:5 (SEC ID NO:29) en donde el aminoácido E2 se selecciona del grupo que consiste de Y, F, V, y D, y/o el aminoácido E6 se selecciona del grupo que consiste de S y G, y/o el aminoácido E10 se selecciona del grupo que consiste de S y Y, y/o el aminoácido E12 se selecciona del grupo que consiste de N, T, A, y D, y/o el aminoácido 13 se selecciona del grupo que consiste de P, H, D, y A, y/o el aminoácido E15 se selecciona del grupo que consiste de L and V, y/o el aminoácido E17 se selecciona del grupo que consiste de S y G; y (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos F2-F11 en donde F2-F11 es MTGSSGYFDF (SEC ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEC ID NO:19); o comprende la secuencia de aminoácidos Fl-Fll, en donde Fl-Fll es AMTGSSGYFDF (SEC ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEC ID NO:17), O AQTGSSGYFDF (SEC ID NO:18), o una variante de la SEC ID NOs:6, 16, 17, 18, o 19 (SEC ID NO:30) en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido Fll se selecciona del grupo que consiste de F y Y. En ciertas tales modalidades, el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de región hipervariable de cadena ligera (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEC ID NO:7, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:9; (ii) HVR-L2 comprende SEC ID NO:2; (iii) HVR-L3 comprende SEC ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEC ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEC ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEC ID NO:6 o SEC ID NO:16 o SEC ID NO:17 o SEC ID NO:19.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:24. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 comprende una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:31 (SEC ID NO:31 corresponde a SEC ID NO:25 excepto que la secuencia de aminoácidos de HVR-H3 de SEC ID NO:25 (MTGSSGYFDF (SEC ID NO:6) o AMTGSSGYFDF (SEC ID N0:16)) se sustituye con RTGSSGYFDF (SEC ID NO:19) o ARTGSSGYFDF (SEC ID NO:17), respectivamente). En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:24 y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:31. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-beta7 es rhuMAb Beta7, también referido en la presente como etrolizumab.
En otro aspecto, el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-alfa4/beta7 monoclonal. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-alfa4/beta7 es vedolizumab. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-alfa4/beta7 es AMG 181.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y IB muestran la alineación de secuencias de las cadenas ligeras y pesadas variables para las siguientes secuencias consenso y secuencias de anticuerpo de subunidad anti-beta7: secuencia consenso kappa I del subgrupo de humano de cadena ligera (figura 1A, SEC ID NO:12), secuencia consenso del subgrupo III de humano de cadena pesada (figura IB, SEC ID NO:13), cadena ligera variable del anticuerpo de rata anti-beta7 de ratón (Fib504) (figura 1A, SEC ID NO:10), cadena pesada variable de anticuerpo de rata anti-beta7 de ratón (Fib504) (figura IB, SEC ID NO:11), y variantes de anticuerpo humanizado: cadena ligera variable de injerto hu504K humanizado (figura 1A, SEC ID NO :14), cadena pesada variable de injerto hu504K humanizado (figura IB, SEC ID NO:15), variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (variaciones de aminoácidos de injerto hu504K humanizado se indican en la figura 1A) (cadena ligera) (SEC ID NOS:22-24, respectivamente, en orden de aparición) y figura IB (cadena pesada) para variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (SEC ID NO:25).
La figura 2 muestra el esquema de estudio para el estudio clínico Fase II como se describe en el Ejemplo 1.
La figura 3A-3C muestra el por ciento de pacientes tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) en remisión en la semana 10 (fig.3A), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.3B), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.3C), estratificados por los niveles de expresión genética beta7 de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 4A-4C muestra el por ciento de pacientes tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) en remisión en la semana 10 (fig.4A), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.4B), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.4C), estratificados por los niveles de expresión del gen CD3épsilon de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 5 muestra la correlación de niveles de expresión beta7 como se detecta por análisis FACS en células CD45+, células CD3+ y células CD19+ al nivel de expresión genética beta7 en sangre periférica como se detecta por qPCR en ambos pacientes con IBD (puntos en blanco) y en controles saludables (puntos llenos) como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 6A-6C muestra el por ciento de pacientes tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) en remisión en la semana 10 (fig.6A), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.6B), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.6C), estratificados por los niveles de expresión genética beta7 de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en sangre periférica como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 7A-7G muestra la expresión de integrina alfaE en biopsias intestinales determinada por inmunohistoquímica o por qPCR como se describe en el Ejemplo 2. (fig.7A) Inmunohistoquímica de alfaE en tejido de colon (paneles izquierdos) o íleo (paneles derechos) obtenido de pacientes sin IBD (paneles superiores), pacientes con enfermedad de Crohn (paneles intermedios), o un paciente con UC (panel inferior; en cada caso, las regiones positivamente teñidas son más oscuras; (fig.7B) autoconteos computarizados de células alfaE+ como un porcentaje de células totales en tejido de colon, íleo, o ycyuno como se indica, de pacientes sin IBD, pacientes con UC, y pacientes con CD; (fig.7C) expresión genética alfaE relativa a GAPDH en biopsias de grosor completo del colon sin IBD, UC y el colon, íleo o yeyuno de pacientes con enfermedad de Crohn como se indica experimentando extirpaciones intestinales; (fig.7D) autoconteos computarizados de células alfaE+ como un porcentaje de células totales en tejido de biopsia obtenido de pacientes reclutados en la prueba de etrolizumab Fase II en la selección e identificados como con TNF simple (lado izquierdo de la gráfica) o TNF-IR (lado derecho de la gráfica), puntos con puntos: remitentes de etrolizumab, puntos en blanco: no remitentes de etrolizumab, puntos negros: placebo, línea punteada indica el valor promedio; (fig.7E) coloración de alfaE ejemplificativa para seleccionar las biopsias de pacientes reclutados en la prueba de etrolizumab Fase II, panel izquierdo: paciente alto en alfaE, panel izquierdo: paciente bajo en alfaE; en cada caso, las regiones positivamente teñidas son más oscuras; (fig.7F) expresión genética alfaE relativa a la expresión de GAPDH en tejido de biopsia obtenido de pacientes reclutados en la prueba de etrolizumab Fase II en la selección e identificados como con TNF simple (lado izquierdo de la gráfica) o TNF-IR (lado derecho de la gráfica), puntos con puntos: remitentes de etrolizumab, puntos en blanco: no remitentes de etrolizumab, puntos negros: placebo, línea punteada indica el valor promedio; (fig.7G) gráfica mostrando la relación de expresión genética alfaE según se mide por qPCR (eje vertical) a expresión de proteína alfaE según se mide por IHC (eje horizontal); puntos con puntos: remitentes de etrolizumab, puntos en blanco: no remitentes de etrolizumab, línea punteada indica el valor promedio.
La figura 8A-8F muestra la proporción de pacientes (porcentaje) estratificados por los niveles de expresión genética alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.8A), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.8B), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.8C); o estratificados por expresión de proteína alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.8D), mostrando curación ucosal en la semana 10 (fig.8E), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.8F), como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 9A-9F muestra la proporción de pacientes con TNF simple (porcentaje) estratificados por los niveles de expresión genética alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.9A), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.9B), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.9C); o estratificados por expresión de proteína alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.9D), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.9E), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.9F), como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 10A-10F muestra la proporción de pacientes (porcentaje) estratificados por los niveles de expresión genética alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en sangre periférica en la selección y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.lOA), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.lOB), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.lOC); o estratificados por expresión genética alfaE (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en sangre periférica el día 1 y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.lOD), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.lOE), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.lOF), como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 11A-11F muestra la proporción de pacientes con TFN simple (porcentaje) estratificados por los niveles de expresión genética alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en sangre periférica en la selección y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.llA), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.llB), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.llC); o estratificados por expresión genética alfaE (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en sangre periférica el día 1 y tratados con placebo (barras punteadas), 100 mg/dosis de etrolizumab (barras con líneas), o 300 mg/dosis de etrolizumab (barras en blanco) que estuvieron en remisión en la semana 10 (fig.llD), mostrando curación mucosal en la semana 10 (fig.llE), o mostrando respuesta clínica en la semana 10 (fig.llF), como se describe en el Ejemplo 2.
La figura 12 muestra el esquema de estudio para el estudio clínico de extensión abierto Fase II como se describe en el Ejemplo 1.
La figura 13A-13F muestra el porcentaje de pacientes TNF-IR del estudio de extensión abierto estratificados por la expresión genética alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales que estuvieron en remisión clínica (fig.l3A) o mostrando respuesta clínica (fig.13B); o estratificados por expresión de proteína alfaE de referencia (baja, por debajo del valor promedio vs. alta, arriba del valor promedio) en biopsias intestinales que estuvieron en remisión clínica (fig.l3C) o mostrando respuesta clínica (fig.l3D); o estratificados por expresión genética alfaE en sangre periférica que estuvieron en remisión clínica (fig.l3E) o mostrando respuesta clínica (fig.13F).
DESCRIPCIÓN DETALLADA Al menos que se defina de otra manera, los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2da edición, J. Wilcy & Sons (Nueva York, N.Y.1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4ta edición, John Wiley & Sons (Nueva York, N.Y. 1992), proporcionan a un experto en la materia una guía general a muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.
CIERTAS DEFINICIONES Para propósitos de interpretar esta especificación, se aplicarán las siguientes definiciones y cuando sea apropiado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso que cualquier definición descrita abajo tenga conflicto con cualquier documento incorporado en la presente para referencia, se debe controlar la definición descrita abajo.
Como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un," "una" y "el(la)" incluyen referencias plurales al menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. De esta manera, por ejemplo, referencia a "una proteína" incluye una pluralidad de proteínas; referencia a "una célula" incluye mezclas de células, y lo similar.
Los rangos proporcionados en la especificación y reivindicaciones anexas incluyen ambos puntos finales y todos los puntos entre los puntos finales. De esta manera, por ejemplo, un rango de 2.0 a 3.0 incluye 2.0, 3.0, y todos los puntos entre 2.0 y 3.0.
"Tratamiento," "tratar," y variaciones gramáticas de los mismos se refieren a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminución de la tasa de evolución de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión o diagnóstico mejorado.
"Régimen de tratamiento" se refiere a una combinación de dosificación, frecuencia de administración, o duración de tratamiento, con o sin adición de un segundo medicamento.
"Régimen de tratamiento efectivo" se refiere a un régimen de tratamiento que ofrecerá respuesta benéfica a un paciente que recibe el tratamiento.
"Respuesta del paciente" o "sensibilidad del paciente" puede valorarse utilizando cualquier punto final que indica un beneficio al paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, de algún modo, de la evolución de la enfermedad, incluyendo disminución y detención completa; (2) reducción en el número de síntomas y/o episodios de la enfermedad; (3) reducción en tamaño de lesión; (4) inhibición (es decir, reducción, disminución o detención completa) de la infiltración de célula enferma en tejidos y/u órganos periféricos adyacentes; (5) inhibición (es decir, reducción, disminución o detención completa) de difusión de la enfermedad; (6) disminución de la respuesta auto-inmune, que puede, pero no puede, resultar en la regresión o ablación de la lesión por enfermedad; (7) alivio, de algún modo, de uno o más síntomas asociados con el trastorno; (8) incremento en la duración de presentación libre de enfermedad después del tratamiento; y/o (9) mortalidad disminuida en un punto de tiempo dado después del tratamiento. El término "sensibilidad" se refiere a una respuesta medible, incluyendo respuesta completa (CR) y respuesta parcial (PR).
Como se utiliza en la presente, "respuesta completa" o "CR" significa la desaparición de todas las señales de inflamación o remisión en respuesta al tratamiento. Esto no significa necesariamente que la enfermedad se ha curado.
"Respuesta parcial" o "PR" se refiere a una disminución de al menos 50% en la severidad de inflamación, en respuesta al tratamiento.
Una "respuesta benéfica" de un paciente a tratamiento con un antagonista de integrina beta7 y expresión similar se refiere al beneficio terapéutico o clínico impartido a un paciente en riesgo de o que sufre de un trastorno inflamatorio gastrointestinal de o como un resultado del tratamiento con el antagonista, tal como un anticuerpo anti-integrina beta7. Tal beneficio incluye respuestas celulares o biológicas, una respuesta completa, una respuesta parcial, una enfermedad estable (sin evolución o recaída), o una respuesta con una recaída posterior del paciente de o como un resultado del tratamiento con el antagonista.
Como se utiliza en la presente, "sin respuesta" o "falta de respuesta" o expresión similar significa una ausencia de una respuesta completa, una respuesta parcial, o una respuesta benéfica a tratamiento con un antagonista de integrina beta7.
"Un paciente mantiene sensibilidad a un tratamiento" cuando la sensibilidad del paciente no disminuye a través del tiempo durante el curso de un tratamiento.
El término "muestra," o "muestra de prueba" como se utiliza en la presente, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que debe caracterizarse y/o identificarse, por ejemplo con base en las características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. En una modalidad, la definición comprende sangre y otras muestras líquidas de origen biológico y muestras de tejido tales como un espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido como de un órgano fresco, congelado y/o conservado o muestra de tejido o biopsia o aspirado; sangre o cualquier constituyente sanguíneo; fluidos corporales; y células de cualquier momento en la gestación o desarrollo del sujeto o plasma. El término "muestra," o "muestra de prueba" incluye muestras biológicas que se han manipulado en cualquier manera después de su obtención, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización, o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o incrustación en una matriz semi-sólida o sólida para propósitos de división en secciones. Para los propósitos en la presente una "sección" de una muestra de tejido significa una pieza o parte única de una muestra de tejido, e.g. una porción delgada de tejido o células cortada de una muestra de tejido. Las muestras incluyen, pero no se limitan a, sangre entera, células derivadas de sangre, suero, plasma, fluido linfoide, fluido sinovial, extractos celulares, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra se utiliza en un ensayo de diagnóstico.
Una "muestra de referencia," como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier muestra, estándar, o nivel que se utiliza para propósitos de comparación. En una modalidad, se obtiene una muestra de referencia de una parte saludable y/o no enferma del cuerpo (e.g., tejido o células) del mismo sujeto o paciente. En otra modalidad, se obtiene una muestra de referencia de una célula y/o tejido sin tratar del cuerpo del mismo sujeto o paciente. En todavía otra modalidad, se obtiene una muestra de referencia de una parte saludable y/o no enferma del cuerpo (e.g., tejidos o células) de un individuo quien no es el sujeto o paciente. Incluso en otra modalidad, se obtiene una muestra de referencia de una parte de célula y/o tejido sin tratar del cuerpo de un individuo quien no es el sujeto o paciente.
"Un antagonista de integrina beta7" o "antagonista beta7" se refiere a cualquier molécula que inhibe una o más actividades biológicas o bloquea la unión de integrina beta7 con una o más de sus moléculas asociadas. Los antagonistas de la invención pueden utilizarse para modular uno o más aspectos de efectos asociados con beta7, incluyendo pero no limitándose a asociación con subunidad de integrina alfa4, asociación con subunidad de integrina alfaE, unión de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCAM-1 o fibronectina y unión de integrina alfaEbeta7 a cadherina-E. Estos efectos pueden modularse por cualquier mecanismo biológicamente relevante, incluyendo interrupción de la unión de ligando a subunidad beta7 o a la integrina dimérica alfa4beta7 o alfaEbeta7, y/o al interrumpir la asociación entre las subunidades de integrina alfa y beta de manera que se inhibe la formación de la integrina dimérica. En una modalidad de la invención, el antagonista beta7 es un anticuerpo anti-integrina beta7 (o anticuerpo anti-beta7). En una modalidad, el anticuerpo anti-integrina beta7 es un anticuerpo anti-integrina beta7 humanizado y más particularmente un anticuerpo anti-beta7 monoclonal humanizado recombinante (o rhuMAb beta7). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-beta7 de la presente invención son anticuerpos antagonísticos anti-integrina beta7 que inhiben o bloquean la unión de subunidad beta7 con subunidad de integrina alfa4, asociación con subunidad de integrina alfaE, unión de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCAM-1 o fibronectina y unión de integrina alfaEbeta7 a cadherina-E.
Por "subunidad beta7" o "subunidad b7" se entiende la subunidad de integrina b7 de humano (Erle et al . , (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). La subunidad beta7 se asocia con la subunidad de integrina alfa4, tal como la subunidad alfa4 de humano (Kilger y Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). La integrina alfa4beta7 supuestamente se expresa en una mayoría de linfocitos maduros, así como una población pequeña de timocitos, células de médula ósea y mastocitos. (Kilshaw y Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish et al . , (1992) 149: 1964-1972; y Shaw, S. K. y Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol.7:335). La subunidad beta7 también se asocia con la subunidad alfaE, tal como la subunidad de integrina alfaE de humano (Cepek, K. L, et al . (1993) J. Immunol.150:3459). La integrina alfaEbeta7 se expresa en linfocitos epiteliales intra-intestinales (ilELs) (Cepek, K. L. (1993) supra) .
Por "subunidad alfaE" o "subunidad de integrina alfaE" o "subunidad aE" o "subunidad de integrina aE" o "CD103" se entiende una subunidad de integrina que se encontró que se asocia con la integrina beta7 en linfocitos intra-epiteliales, tal integrina alfaEbeta7 media la unión de los iELs a epitelio intestinal que expresa cadherina-E (Cepek, K. L. et al. (1993) J. Immunol.150:3459; Shaw, S. K. y Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol.7:335).
"MAdCAM" o "MAdCAM-1" se utilizan de manera intercambiable en el contexto de la presente invención y se refieren a la molécula de adhesión celular de adresina mucosal de proteína-1, que es un polipéptido de cadena única que comprende una cola citoplásmica corta, una región de transmembrana y una secuencia extracelular compuesta de tres dominios como inmunoglobulina. Se han clonado los ADNcs para MAdCAM-1 de murino, humano y macaco (Briskin, et al., (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al . , (1996) J. Immunol. 156:2851-2857).
"VCAM-1" o "molécula de adhesión celular vascular-1" "CD106" se refiere a un ligando de alfa4beta7 y alfa4betal, expresado en endotelio activado e importante en interacciones de leucocito endotelial tal como unión y transmigración de leucocitos durante la inflamación.
"CD45" se refiere a una proteína de la familia de tirosina fosfatasa de proteína (PTP). PTPs se conocen por ser moléculas de señalización que regulan una variedad de procesos celulares incluyendo crecimiento celular, diferenciación, ciclo mitótico, y transformación oncogénica. Esta PTP contiene un dominio extracelular, un segmento de transmembrana único y dos dominios catalíticos intracitoplásmicos aleatorios, y de esta manera pertenece a PTP tipo receptor. Este gen se expresa específicamente en células hematopoyéticas. Se ha mostrado que esta PTP es un regulador esencial de la señalización del receptor de antígeno de célula T o B. Funciona a través de ya sea interacción directa con componentes de los complejos del receptor de antígeno, o al activar varias cinasas de familia Ser requeridas para la señalización del receptor de antígeno. Esta PTP también suprime las cinasas JAK, y de esta manera funciona como un regulador de la señalización del receptor de citocina. Se han reportado cuatro variantes de transcripciones alternativamente unidas de este gen, que codifican isoformas distintas. (Tchilian EZ, Beverlcy PC (2002). "CD45 in memory and disease." Arch. Inmuno 1. The r. Exp . (Warsz . ) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, et al. (2004). "Interleukin-6, CD45 and the src-kinases in myeloma cell proliferation. " Leuk. Linfoma 44 (9):1477-81.
Existen varias isoformas de CD45: CD45RA, CD45RB, CD 5RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (ABC). CD45 también se glicosila altamente. CD45R es la proteína más larga y migra a 200 kDa cuando se aísla de las células T. Las células B también expresan CD45R con glicosilación más pesada, llevando el peso molecular a 220 kDa, por tanto el nombre B220; una isoforma de célula B de 220 kDa. La expresión de B220 no se restringe a células B y también puede expresarse en células T activadas, en un subconjunto de células dendríticas y otras células que presentan antígeno. Stanton T, Boxall S, Bennett A, et al . (2004). "CD45 variant alíeles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV seropositive Ugandans. " Immunogenetics 56 (2): 107-10.
"Los linfocitos que se guían al intestino" se refieren a un subgrupo de linfocitos que tienen la característica de guiarse selectivamente a tejidos y nodos linfoides intestinales pero no guiarse a tejidos y nodos linfoides periféricos. Este subgrupo de linfocitos se caracteriza por un patrón de expresión único de una combinación de múltiples moléculas de superficie celular, incluyendo, pero no limitándose a, la combinación de CD4, CD45RA y Beta7. Típicamente, al menos dos subconjuntos de linfocitos CD4+ de sangre periférica pueden subdividirse con base en los marcadores de células CD45RA y Beta7, CD45RA 37alta, y CD45RA 7baja CD4 +. Las células CD45RA 7alta CD4 + se guían preferentemente a tejidos y nodos linfoides intestinales, mientras que las células CD45RA _ + se guían preferentemente a tejidos y nodos linfoide periféricos (Rott et al. 1996; Rott et al . 1997; Williams et al . 1998; Rosé et al . 1998; Williams and Butcher 1997; Butcher et al . 1999). Los linfocitos que se guían al intestino son, por lo tanto, un subgrupo distintivo de linfocitos identificado como - citometría de flujo. Los métodos para identificar este grupo de linfocitos se conocen bien en la materia.
Como se utiliza en la presente con respecto a un marcador de superficie celular, el símbolo "+" indica una expresión positiva de un marcador de superficie celular. Por ejemplo, los linfocitos CD4 + son un grupo de linfocitos que tienen CD4 expresado en sus superficies celulares.
Como se utiliza en la presente con respecto a un marcador de superficie celular, el símbolo indica una expresión negativa de un marcador de superficie celular. Por ejemplo, los linfocitos CD45RA son un grupo de linfocitos que no tienen CD45RA expresado en sus superficies celulares.
"Trastornos inflamatorios gastrointestinales" son un grupo de trastornos crónicos que causan inflamación y/o ulceración en la membrana mucosa. Estos trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal (e.gr., enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, colitis indeterminada y colitis infecciosa), mucositis (e.gr., mucositis oral, mucositis gastrointestinal, mucositis nasal y proctitis), enterocolitis necrosante y esofagitis.
"Enfermedad Inflamatoria Intestinal" o "IBD" se utiliza de manera intercambiable en la presente para referirse a enfermedades del intestino que causan inflamación y/o ulceración e incluyen sin limitación enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.
"Enfermedad de Crohn (CD) " y "colitis ulcerativa (UC) " son enfermedades inflamatorias intestinales crónicas de etiología desconocida. Enfermedad de Crohn, a diferencia de colitis ulcerativa, puede afectar cualquier parte del intestino. La característica más prominente de la enfermedad de Crohn es el espesamiento edematoso rojizo-morado, granular de la pared intestinal. Con el desarrollo de inflamación, estos granulomas con frecuencia pierden sus bordes circunscritos y se integran con el tejido circundante. Diarrea y obstrucción del intestino son las características clínicas predominantes. Como con colitis ulcerativa, el curso de la enfermedad de Crohn puede ser continuo o reincidente, leve o severa, pero a diferencia de colitis ulcerativa, la enfermedad de Crohn no es curable por la extirpación del segmento incluido del intestino. La mayoría de los pacientes con enfermedad de Crohn requieren cirugía en algún punto, pero es común la recaída subsiguiente y es usual el tratamiento medico continuo.
La enfermedad de Crohn puede incluir cualquier parte del tracto alimenticio de la boca al ano, aunque típicamente aparece en las regiones ileocólica, del intestino delgado o colónica-anorectal. Histopatológicamente, la enfermedad se manifiesta por granulomatomas discontinuos, abscesos de cripta, fisuras y úlceras afta. El infiltrado inflamatorio se mezcla, consistiendo de linfocitos (tanto células T como B) , células de plasma, macrófagos, y neutrófilos. Hay un incremento desproporcionado en neutrófilos, macrófagos y células de plasma que secretan IgM e IgG.
Los fármacos anti-inflamatorios, sulfasalazina y ácido 5-aminosalisílico (5-ASA) se utilizan para tratar enfermedad de Crohn colónica moderadamente activa y se prescriben comúnmente en un intento por mantener la remisión de la enfermedad. Metroidazol y ciprofloxacin son similares en eficacia a sulfasalazina y se prescriben particularmente para tratar enfermedad perianal. En casos más severos, se prescriben corticosteroides para tratar exacerbaciones activas y algunas veces pueden mantener la remisión. Azatioprina y 6-mercaptopurina también se han utilizado en los pacientes quienes requieren administración crónica de corticosteroides. Se ha sugerido que estos fármacos pueden jugar un papel en la profilaxis a largo plazo. Desafortunadamente, puede haber un retraso muy largo (hasta seis meses) antes del inicio de acción en algunos pacientes. Los fármacos antidiarréicos también pueden proporcionar alivio sintomático en algunos pacientes. La terapia nutricional o dieta elemental puede mejorar el estado nutricional de pacientes e inducir la mejora sintomática de la enfermedad aguda, pero no induce las remisiones clínicas prolongadas. Los antibióticos se utilizan para tratar sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado secundario y en tratamiento de complicaciones piogénicas.
"Colitis ulcerativa (UC) " aflige el intestino grueso. El curso de la enfermedad puede ser continuo o reincidente, leve o severa. La lesión más temprana es una infiltración inflamatoria con formación de absceso en la base de las criptas de Lieberkuhn. La coalescencia de estas criptas rotas o expandidas tiende a separar la mucosa superior de su suministro de sangre, conduciendo a ulceración. Los síntomas de la enfermedad incluyen calambres, dolor abdominal inferior, sangrado rectal, y descargas sueltas, frecuentes que consisten principalmente de sangre, pus y moco con partículas fecales escasas. Una colectomía total puede requerirse para colitis ulcerativa aguda, severa o crónica, no remitente.
Las características clínicas de UC son altamente variables, y el inicio puede ser insidioso o abrupto, y pueden incluir diarrea, tenesmo y sangrado rectal reincidente. Con inclusión fulminante del colon entero, megacolon tóxico, puede ocurrir una emergencia que amenaza la vida. Las manifestaciones extraintestinales incluyen artritis, pioderma gangrenoso, uveitis, y eritema nudoso.
El tratamiento para UC incluye sulfasalazina y fármacos que contienen salicilato relacionados para casos leves y fármacos con corticoesteroide en casos severos. La administración tópica de ya sea salicilatos o corticosteroides algunas veces es efectiva, particularmente cuando la enfermedad se limita al intestino distal, y se asocia con efectos secundarios disminuidos en comparación con uso sistémico. Algunas veces se indican las mediciones de apoyo tal como administración de hierro y agentes antidiarréricos. Azatioprina, 6-mercaptopurina y metotrexato algunas veces también se prescriben para utilizarse en casos dependientes de corticoesteroide refractario.
Una "dosificación efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado.
Como se utiliza en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier sujeto único para el cual se desea el tratamiento. En ciertas modalidades, el paciente en la presente es un humano.
Un "sujeto" en la presente es típicamente un humano. En ciertas modalidades, un sujeto es un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos ejemplificativos incluyen animales de laboratorio, domésticos, mascotas, para deportes, y ganado, e.g., ratones, gatos, perros, caballos, y vacas. Típicamente, el sujeto es elegible para tratamiento, e.g., tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan de manera intercambiable en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales intactos o de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecífíeos (e . g. , anticuerpos biespecíficos siempre que muestren la actividad biológica deseada) y también pueden incluir ciertos fragmentos de anticuerpo (como se describe en mayor detalle en la presente). Un anticuerpo puede ser humano, humanizado y/o maduro por afinidad.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden solamente una porción de un anticuerpo intacto, en donde la porción preferentemente retiene al menos una, y típicamente la mayoría o todas, de las funciones normalmente asociadas con esa porción cuando están presentes en un anticuerpo intacto. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo intacto y de esta manera retiene la habilidad de unir el antígeno. En otra modalidad, un fragmento de anticuerpo, por ejemplo uno que comprende la región Fe, retiene al menos una de las funciones biológicas normalmente asociada con la región Fe cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como unión FcRn, modulación de vida media del anticuerpo, función de ADCC y unión complemento. En una modalidad, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una vida media in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal un fragmento de anticuerpo puede comprender un extremo de unión a antígeno enlazado a una secuencia Fe capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.
El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un antígeno único. Además, en contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno.
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica a u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena(s) es idéntico a u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (Patente de E.U.A. No.4,816,567; y Morrison et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (e.g., murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la capacidad, afinidad y especificidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar además el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulinas de humano. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano. Para detalles adicionales, ver Jones et al . , Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también los siguientes artículos de análisis y las referencias citadas en la misma: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es uno que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho utilizando cualquiera de las téenicas para hacer anticuerpos humanos como se describe en la presente. Tales técnicas incluyen selección de bibliotecas en combinación derivadas de humano, tales como bibliotecas de despliegue de fago (ver, e . g. , arks et al., J. Mol . Biol . , 222: 581-597 (1991) y Hoogenboom et al . , Nucí . Acids Res . , 19: 4133-4137 (1991)); utilizando líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (ver, e . g. , Kozbor J. Immunol . , 133: 3001 (1984); Brodeur et al . , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al . , J. Immunol . , 147: 86 (1991)); y generando anticuerpos monoclonales en animales transgénicos { e. g. , ratones) que son capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena (ver, e . g. , Jakobovits et al., Proc . Nati . Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al . , Year in Immunol . , 7: 33 (1993)). Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno de un animal no humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En ciertas modalidades, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% por peso de anticuerpo según se determina por el método Lowry, y con frecuencia más del 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o secuencia de aminoácidos interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando tinte azul Coomassie o plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
El término "región hipervariable, " "HVR," o "HV, " cuando se utiliza en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2, L3). Un número de delineaciones de región hipervariable están en uso y se comprenden en la presente. Las Regiones Determinantes de la Complementariedad Kabat (CDRs) se basan en variabilidad de secuencia y son las más comúnmente utilizadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se refiere en su lugar a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDRs Kabat y bucles estructurales Chothia, y se utilizan por el software de moldeado de anticuerpo AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristal complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se observan abajo.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 Las regiones hipervariables pueden comprender "regiones hipervariables extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll), 46-56 o 49-56 o 50-56 o 52-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL y 26-35 (Hl), 50-65 o 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 o 95-102 (H3) en VH. Los residuos de dominio variable se enumeran de acuerdo a Kabat et al . , supra para cada una de estas definiciones.
Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se define en la presente.
Una "estructura consenso de humano" es una estructura que representa el residuo de aminoácido que ocurre más comúnmente en una selección de secuencias de estructura VH o VL de inmunoglobulina de humano. Generalmente, la selección de secuencias VH o VL de inmunoglobulina de humano es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al . En una modalidad, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al . En una modalidad, para VH, el subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al .
Un anticuerpo "maduro por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no tiene aquella(s) alteración(es). En ciertas modalidades, los anticuerpos maduros por afinidad tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos maduros por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe maduración por afinidad al mezclar el dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura se describe por: Barbas et al . Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1996); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al. J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
La frase "sustancialmente similar," o "sustancialmente el mismo," como se utiliza en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numericos (generalmente uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador) de modo que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores sea de poco o nada de significado biológico y/o estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores.
"Afinidad de unión" generalmente se refiere a la intensidad de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (e.g., un anticuerpo) y su socio de unión { e . g. , un antígeno). Al menos que se indique de otra manera, como se utiliza en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión {e. g. , anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su socio Y generalmente puede representarse por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. Anticuerpos de baja afinidad generalmente unen el antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras los anticuerpos de alta afinidad generalmente unen el antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conocen en la materia, cualquiera de los cuales pueden utilizarse para propósitos de la presente invención.
El término "variable" en relación con anticuerpos o inmunoglobulinas se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se llaman las regiones de estructura (FRs). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, adoptando grandemente una configuración de hoja b, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles conectando, y en algunos casos formando parte de, la estructura de hoja b. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad por las FRs y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no se incluyen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tal como participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno único, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y sitio de unión a antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en asociación no covalente, hermética. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir el antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab= difieren de fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en el cual el(los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda (l), con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), e . g. , IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, g, y m, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien y describen generalmente en, por ejemplo, Abbas et al. Cellular and Mol .
Imnunology, 4ta edición. (W. B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos.
Los términos "anticuerpo de longitud completa," "anticuerpo intacto," y "anticuerpo entero" se utilizan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se define abajo. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe.
Un "anticuerpo puro" para los propósitos en la presente es un anticuerpo que no se conjuga con una fracción citotóxica o radiomarca.
El término "región Fe" en la presente se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de cadena pesada de IgG de humano se define usualmente para estirarse de un residuo de aminoácido en posición Cys226, o de Pro230, al término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo al sistema de numeración de E.U.A.) de la región Fe puede removerse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o al diseñar recombinantemente el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 removidos, y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
Al menos que se indique de otra manera, en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice de E.U.A. como en Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5ta Edición. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), expresamente incorporada en la presente para referencia. El "índice de E.U.A. como en Kabat" se refiere a la numeración de residuo del anticuerpo EU de IgGl de humano.
Una "región Fe funcional" tiene una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplificativas incluyen unión de Clq; citotoxicidad dependiente del complemento; unión del receptor Fe; Citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; disminución de los receptores de superficie celular (e.g., receptor de célula B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión {e . g. , un dominio variable de anticuerpo) y pueden valorarse utilizando varios ensayos como se describe en la presente, por ejemplo.
Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Las regiones Fe de humano de secuencia nativa incluyen una región Fe de IgGl de humano de secuencia nativa (alotipos no A y A); región Fe de IgG2 de humano de secuencia nativa; región Fe de IgG3 de humano de secuencia nativa; y región Fe de IgG4 de humano de secuencia nativa así como variantes que ocurren naturalmente de las mismas.
Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido. En ciertas modalidades, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fe de secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido de origen, e.g., de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácido, y en ciertas modalidades de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido de origen. En ciertas modalidades, la región Fe variante en la presente tendrá al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido de origen, o al menos aproximadamente 90% de homología con la misma, o al menos aproximadamente 95% de homología con la misma.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases." Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden dividirse además en "subclases" (isotipos), e. g. , IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, d, e, g, y m, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.
"Citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por célula, en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcRs) (e.g. células Asesinas Naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula objetivo y subsiguientemente causan lisis de la célula objetivo. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Inanunol 9:457-92 (1991). Para valorar la actividad de ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vi tro, tal como aquel descrito en la Patente de E.U.A. No. 5,500,362 o 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Asesinas Naturales (NK). Alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, e. g. , en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
Las "células efectoras de humano" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. En ciertas modalidades, las células expresan al menos FcyRIII y realizan función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos de humano que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, e.g., de sangre o PBMCs como se describe en la presente.
Los términos "receptor Fe" o "FcR" se utilizan para describir un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En ciertas modalidades, FcR es un FcR de humano de secuencia nativa. Además, FcR es uno que une un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente unidas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. El receptor de activación, FcyRIIA, contiene un motivo de activación con base en tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición, FcyRIIB, contiene un motivo de inhibición con base en tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico (ver análisis M. en Daéron, Annu. Rev. Inmuno 1. 15:203-234 (1997)). FcRs se analizan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al . , Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se comprenden por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)), y regula la homeostasis de inmunoglobulinas. Los anticuerpos con unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn), y vidas medias incrementadas, se describen en WOOO/42072 (Presta, L.) y US2005/0014934A1 (Hinton et al . ) . Estos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Por ejemplo, la región Fe puede tener sustituciones en una o más de las posiciones 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 o 434 (numeración de E.U.A de residuos). En ciertas modalidades, la variante de anticuerpo que comprende región Fe con unión de FcRn mejorada comprende sustituciones de aminoácido en una, dos o tres de las posiciones 307, 380 y 434 de la región Fe de la misma (numeración de E.U.A de residuos).
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido única. En ciertas modalidades, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten que scFv forme la estructura deseada para unión de antígeno. Para un análisis de scFv ver Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp.269-315 (1994). Los fragmentos de scFv del anticuerpo HER2 se describen en W093/16185; Patente de E.U.A. No. 5,571,894; y Patente de E.U.A. No.5,587,458.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, tales fragmentos comprenden un dominio pesado variable (VH) conectado a un dominio ligero variable (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan a formarse en pares con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Nati . Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "maduro por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables del mismo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no tiene aquella(s) alteración(es). En ciertas modalidades, los anticuerpos maduros por afinidad tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos maduros por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Marks et al . Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe maduración por afinidad al mezclar el dominio VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de estructura se describe por: Barbas et al. Proc Nat . Acad. Sci , USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al . Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al . J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al . , J. Immunol . 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al , J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992).
Un anticuerpo "variante de secuencias de aminoácidos" en la presente es un anticuerpo con una secuencia de aminoácidos que difiere de un anticuerpo de especie principal. En ciertas modalidades, variantes de la secuencia de aminoácidos tendrán al menos aproximadamente 70% de homología con el anticuerpo de especie principal, o serán al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% homologas con el anticuerpo de especie principal. Las variantes de la secuencia de aminoácidos tienen sustituciones, eliminaciones, y/o adiciones en ciertas posiciones dentro de o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de especie principal. Ejemplos de variantes de la secuencia de aminoácidos en la presente incluyen una variante ácida ( e . g . , variante de anticuerpo deamidado), una variante básica, un anticuerpo con una extensión guía amino-terminal (e . g. VHS-) en una o dos cadenas ligeras del mismo, un anticuerpo con un residuo de lisina C-terminal en una o dos cadenas pesadas del mismo, etc, e incluye combinaciones de variaciones a las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y/o ligeras. La variante de anticuerpo de interés particular en la presente es el anticuerpo que comprende una extensión guía amino-terminal en una o dos cadenas ligeras del mismo, opcionalmente comprende además otras diferencias de glicosilación y/o secuencia de aminoácidos relativas al anticuerpo de especie principal.
Un anticuerpo "variante de glicosilación" en la presente es un anticuerpo con una o más fracciones de carbohidrato unidas al mismo que difieren de una o más fracciones de carbohidrato unidas a un anticuerpo de especie principal. Los ejemplos de variantes de glicosilación en la presente incluyen anticuerpo con una estructura de oligosacárido G1 o G2, en lugar de una estructura de oligosacárido GO, unida a una región Fe de la misma, anticuerpo con una o dos fracciones de carbohidrato unidas a una o dos cadenas ligeras del mismo, anticuerpo sin carbohidrato unido a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, etc, y combinaciones de alteraciones de glicosilación. Donde el anticuerpo tiene una región Fe, una estructura de oligosacárido puede unirse a una o dos cadenas pesadas del anticuerpo, e.gr. en el residuo 299 (298, numeración de E.U.A de residuos).
El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o causa la destrucción de células.
El término se destina a incluir isótopos radiactivos ( e . g.
A 7, 4t.211, -I-131 T, I125, Yr90, R-,e 186 n, Re„188, Sm 153, B o -i! 212 p, P32 e„ isotopo _s radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas, y hormonas de polipéptido tradicionales. Se incluyen entre las citocinas, la hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana de N-metionilo, y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante folicular (FSH), hormona estimulante tiroidal (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placental; factor de necrosis tumoral-a y -b; sustancia que inhibe muleriano; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento del nervio tal como NGF-b; factor de crecimiento de plaqueta; factores de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-b; factor-I y -II de crecimiento como insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferon-a, -b, y -g; factores estimulantes de colonia (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF),· granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-I , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-b; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El término "agente inmunosupresor" como se utiliza en la presente para terapia adjunta se refiere a sustancias que actúan para suprimir u ocultar el sistema inmune del sujeto que se trata en la presente. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citocina, disminución o supresión de la expresión de auto-antígeno, u ocultan los antígenos MHC. Los ejemplos de tales agentes incluyen pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (ver Patente de E.U.A. No.4,665,077); fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs); ganciclovir; tacrolimus; glucocorticoides tales como cortisol o aldosterona; agentes anti-inflamatorios tal como un inhibidor de ciclooxigenasa; un inhibidor de 5-lipoxigenasa; o un antagonista del receptor de leucotrieno; antagonistas de purina tales como azatioprina o mofetil de micofenolato (MMF); agentes alquilantes tales como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que oculta los antígenos MHC, como se describe en Patente de E.U.A. No. 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina; 6 mercaptopurina; esteroides tales como corticoesteroides o glucocorticoesteroides o análogos de glucocorticoide, e. g. , prednisona, metilprednisolona, incluyendo SOLU-MEDROL.RTM, succinato de sodio de metilprednisolona, y dexametasona; inhibidores de reductasa de dihidrofolato tal como metotrexato (oral o subcutáneo); agentes anti-malaria tales como cloroquina e hidroxicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; citocina o anticuerpos del receptor de citocina o antagonistas incluyendo anticuerpos anti-interferon-alfa, -beta, o -gamma, anticuerpos anti-factor de necrosis tumoral (TNF)-alfa (infliximab (REMICADE.RTM.) o adalimumab), immunoadhesina anti-TNF-alpha (etanercept), anticuerpos anti-TNF-beta, anticuerpos anti-interleucina-2 (IL-2) y anticuerpos anti receptor de IL-2, y anticuerpos anti-receptor de interleucina-6 (IL-6) y antagonistas; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocito heteróloga; anticuerpos pan-T, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptido soluble que contiene un dominio de unión LFA-3 (WO 90/08187 publicada el 26 de Julio de 1990); estreptocinasa; factor de crecimiento de transformación-beta (TGF-beta); estreptodomasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-61443; clorambucil; deoxiespergualina; rapamicina; receptor de célula T (Cohén et al . , Patente de E.U.A. No. 5,114,721); fragmentos de receptor de célula T (Offner et al . , Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); y WO 91/01133); antagonistas de BAFF tales como anticuerpos BAFF o BR3 o immunoadhesinas y antagonistas de zTNF4 (para análisis, ver Mackay y Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002) y ver también la definición abajo); agentes biológicos que interfieren con señales auxiliares de célula T, tal como receptor anti-CD40 o ligando anti-CD40 (CD154), incluyendo anticuerpos de bloqueo a ligando CD40-CD40.(e. g. , Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohán et al . , J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)) y CTLA4-Ig (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); y anticuerpos del receptor de célula T (EP 340,109) tal como T10B9.
El término "mejorar" o "mejora" como se utiliza en la presente se refiere a una disminución, reducción o eliminación de una condición, enfermedad, trastorno, o fenotipo, incluyendo una anormalidad o síntoma.
Un "síntoma" de una enfermedad o trastorno (e.g., enfermedad inflamatoria intestinal, e.g., colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn) es cualquier fenómeno mórbido o partida de lo normal en estructura, función, o sensación, experimentado por un sujeto e indicador de la enfermedad.
La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para prevenir, mejorar, o tratar una enfermedad o trastorno (e.g., enfermedad inflamatoria intestinal, e.g., colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn). Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo se refiere a una cantidad del anticuerpo que es efectiva para prevenir, mejorar, o tratar el trastorno o enfermedad especificada. De manera similar, una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una combinación de un anticuerpo y un segundo compuesto se refiere a una cantidad del anticuerpo y una cantidad del segundo compuesto que, en combinación, es efectiva para prevenir, mejorar, o tratar el trastorno o enfermedad especificada.
Debe entenderse que la terminología "una combinación de" dos compuestos no significa que los compuestos tienen que administrase en mezcla entre sí. De esta manera, el tratamiento con o uso de tal una combinación comprende una mezcla de los compuestos o administración separada de los compuestos, e incluye la administración el mismo día o diferentes días. De esta manera la terminología "combinación" significa dos o más compuestos se utilizan para el tratamiento, ya sea individualmente o en mezcla entre sí. Cuando un anticuerpo y un segundo compuesto, por ejemplo, se administran en combinación a un sujeto, el anticuerpo está presente en el sujeto en un momento cuando el segundo compuesto también está presente en el sujeto, si el anticuerpo y segundo compuesto se administran individualmente o en mezcla con el sujeto. En ciertas modalidades, un compuesto diferente al anticuerpo se administra antes del anticuerpo. En ciertas modalidades, un compuesto diferente al anticuerpo se administra después del anticuerpo.
Para los propósitos en la presente, "factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) " se refiere a una molécula TNF-alfa de humano que comprende la secuencia de aminoácidos como se describe en Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) o Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985).
Un "inhibidor TNF-alfa" en la presente es un agente que inhibe, de algún modo, una función biológica de TNF-alfa, generalmente a través de la unión a TNF-alfa y neutralizando su actividad. Los ejemplos de inhibidores de TNF específicamente contemplados en la presente son etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®), adalimumab (HUMIRA®), golimumab (SIMPONITM), y certolizumab pegol (CIMZIA®).
"Corticoesteroide" se refiere a cualquiera de varias sustancias sintéticas o que ocurren de manera natural con la estructura química general de esteroides que imitan o aumentan los efectos de los corticoesteroides que ocurren de manera natural. Ejemplos de corticoesteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona), dexametasona triamcinolona, y betametasona.
Un "antagonista" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abolir, reducir o interferir con las actividades de una proteína específica o particular, incluyendo su unión a uno o más receptores en el caso de un ligando o unión a uno o más ligandos en caso de un receptor. Los antagonistas incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas b100rgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de traducción y transcripción, y lo similar. Los antagonistas también incluyen inhibidores de molécula pequeña de la proteína, y proteínas de fusión, moléculas receptoras y derivados que se unen específicamente a la proteína secuestrando así su unión a su objetivo, variantes antagonistas de la proteína, moléculas antisentido dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN, y ribozimas contra la proteína.
Un "dispositivo de auto-inyección" se refiere a un dispositivo medico para auto-administración, e.g., por un paciente o cuidador en casa, de un agente terapéutico. Los dispositivos de auto-inyección incluyen dispositivos autoinyectores y otros dispositivos diseñados para auto administración.
"Oligonucleótido, " como se utiliza en la presente, se refiere a polinucleótidos de filamento único, cortos que son al menos aproximadamente de siete nucleótidos en longitud y menos de aproximadamente 250 nucleótidos en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos.
El término "cebador" se refiere a un polinucleótido de filamento único que es capaz de hibridarse a un ácido nucleico y permitir la polimerización de un ácido nucleico complementario, generalmente al proporcionar un grupo 3'-OH libre.
El término "amplificación" se refiere al proceso para producir una o más copias de una secuencia de ácidos nucleicos de referencia o su complemento. La amplificación puede ser lineal o exponencial (e.g., PCR). Una "copia" no significa necesariamente identidad o complementariedad de secuencia perfecta relativa a la secuencia templada. Por ejemplo, las copias pueden incluir análogos de nucleótido tales como deoxiinosina, alteraciones de secuencia intencional (tales como alteraciones de secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable, pero no completamente complementaria, al templado), y/o errores de secuencia que ocurren durante amplificación.
El término "detección" incluye cualquier medio de detección, incluyendo detección directa e indirecta.
"Expresión elevada" o "niveles elevados" se refiere a una expresión incrementada de un ARNm o una proteína en un paciente relativa a un control, tal como un individuo o individuos quienes no están padeciendo de una enfermedad autoinmune, e.g., IBD, o relativa a un umbral pre-establecido o valor de corte, o relativa al valor promedio para una población de pacientes y/o sujetos.
"Expresión baja" o "niveles de expresión baja" se refiere a una expresión disminuida de un ARNm o una proteína en un paciente relativa a un control, tal como un individuo o individuos quienes no están padeciendo de una enfermedad autoinmune, e.g., IBD, o relativa a un umbral pre-establecido o valor de corte, o relativa al valor promedio para una población de pacientes y/o sujetos.
El término "PCR multiplex" se refiere a una reacción PCR única llevada a cabo en ácido nucleico obtenido de una fuente única (e.g., un paciente) utilizando más de un cebador descrito para el propósito de amplificar dos o más secuencias de ADN en una reacción única.
El término "biomarcador" como se utiliza en la presente se refiere a un indicador de un fenotipo de un paciente, e.g., un estado patológico o probablemente sensibilidad a un agente terapéutico, que puede detectarse en una muestra biológica del paciente. Los biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN, proteína, carbohidrato, o marcadores moleculares con base en glicolípido.
El término "diagnóstico" se utiliza en la presente para referirse a la identificación o clasificación de una condición, enfermedad o estado patológico o molecular. Por ejemplo, "diagnóstico" puede referirse a la identificación de un tipo particular de IBD, e.g., UC o enfermedad de Crohn. "Diagnóstico" también puede referirse a la clasificación de un subtipo particular de IBD, e.g., por criterios histopatológicos o por características moleculares (e.g., un subtipo caracterizado por expresión de uno o una combinación de genes particulares o proteínas codificadas por dichos genes).
El término "diagnóstico auxiliar" se utiliza en la presente para referirse a métodos que ayudan en hacer una determinación clínica que considera la presencia, o naturaleza, de un tipo particular de síntoma o condición. Por ejemplo, un método para diagnóstico auxiliar de IBD puede comprender medir la expresión de ciertos genes en una muestra biológica de un individuo.
El término "pronóstico" se utiliza en la presente para referirse a la predicción de la probabilidad de síntomas de la enfermedad atribuibles al trastorno autoinmune de una enfermedad autoinmune tal como IBD.
El término "predicción" se utiliza en la presente para referirse a la probabilidad que un paciente responderá ya sea favorable o desfavorablemente a un fármaco (agente terapéutico) o conjunto de fármacos o un régimen terapéutico. En una modalidad, la predicción se refiere al grado de aquellas respuestas. En una modalidad, la predicción se refiere a si y/o la probabilidad que un paciente sobrevivirá o mejorará después del tratamiento, por ejemplo tratamiento con un agente terapéutico particular, o por un cierto periodo de tiempo sin recurrencia de enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden utilizarse clínicamente para hacer decisiones de tratamiento al elegir las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valuables para predecir si un paciente es propenso a responder favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico dado, incluyendo por ejemplo, administración de un agente terapéutico dado o combinación, intervención quirúrgica, tratamiento con esteroides, etc., o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente o remisión o remisión sostenida, siguiendo un régimen terapéutico Un "sujeto control" se refiere a un sujeto saludable que no se ha diagnosticado como teniendo una enfermedad particular, e.g., IBD, y quien no sufren de ninguna señal o síntoma asociado con esa enfermedad.
Por "correlacionar" o "correlación" se entiende comparar, en cualquier manera, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, uno puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o uno puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debería realizarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la modalidad de protocolo o análisis de expresión genética, uno puede utilizar los resultados del protocolo o análisis de expresión genética para determinar si debería realizarse un régimen terapéutico específico.
El término "comparando" como se utiliza en la presente se refiere a comparar el nivel del biomarcador en la muestra del individuo o paciente con el nivel de referencia del biomarcador especificado en otra parte en esta descripción. Debe entenderse que comparando como se utiliza en la presente usualmente se refiere a una comparación de valores o parámetros correspondientes, e.g., una cantidad absoluta se compara con una cantidad de referencia absoluta mientras una concentración se compara con una concentración de referencia o una señal de intensidad obtenida del biomarcador en una muestra se compara con el mismo tipo de señal de intensidad obtenida de una muestra de referencia. La comparación puede llevarse a cabo manualmente o auxiliada por computadora. De esta manera, la comparación puede llevarse a cabo por un dispositivo de cómputo (e.g., de un sistema descrito en la presente). El valor del nivel detectado o medido del biomarcador en la muestra del individuo o paciente y el nivel de referencia pueden, e.g., compararse entre sí y dicha comparación puede llevarse a cabo automáticamente por un programa de cómputo que ejecuta un algoritmo para la comparación. El programa de cómputo que lleva a cabo dicha evaluación proporcionará la valoración deseada en un formato de salida adecuado. Para una comparación auxiliada por computadora, el valor de la cantidad determinada puede compararse con valores que corresponden a referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos por un programa de cómputo. El programa de cómputo puede evaluar además el resultado de la comparación, es decir, proporcionar automáticamente la valoración deseada en un formato de salida adecuado. Para una comparación auxiliada por computadora, el valor de la cantidad determinada puede compararse con valores que corresponden a referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos por un programa de cómputo. El programa de cómputo puede evaluar además el resultado de la comparación, es decir, proporciona automáticamente la valoración deseada en un formato de salida adecuado.
La frase "recomendar un tratamiento" como se utiliza en la presente se refiere a utilizar la información o datos generados que se relacionan con el nivel o presencia de proteína o ARNm de integrina beta7, proteina o ARNm de integrina alfaE, o proteína o ARNm de CD3épsilon en una muestra de un paciente para identificar el paciente como tratado de manera adecuada o no tratado de manera adecuada con una terapia. En algunas modalidades la terapia puede comprender un antagonista de integrina beta7, incluyendo un anticuerpo anti-integrina beta7 tal como etrolizumab. En algunas modalidades la frase "recomendar un tratamiento/terapia" incluye la identificación de un paciente quien requiere adaptación de una cantidad efectiva del antagonista de integrina beta7 siendo administrado. En algunas modalidades recomendar un tratamiento incluye recomendar que se adapta la cantidad de antagonista de integrina beta7 siendo administrado. La frase "recomendar un tratamiento" como se utiliza en la presente también puede referirse a utilizar la información o datos generados para proponer o seleccionar una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 para un paciente identificado o seleccionado como más o menos propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7. La información o datos utilizados o generados puede estar en cualquier forma, escrita, oral o electrónica. En algunas modalidades, uso de información o datos generados incluye comunicar, presentar, reportar, almacenar, enviar, transferir, suministrar, transmitir, distribuir, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, comunicar, presentar, reportar, almacenar, enviar, transferir, suministrar, transmitir, distribuir, o combinaciones de los mismos se realizan por un dispositivo de cómputo, unidad de análisis o combinación de los mismos. En algunas modalidades adicionales, comunicar, presentar, reportar, almacenar, enviar, transferir, suministrar, transmitir, distribuir, o combinaciones de los mismos se realizan por un profesional médico o laboratorio. En algunas modalidades, la información o datos incluyen una comparación del nivel de proteína o ARNm de integrina beta7, proteína o ARNm de integrina alfaE, o proteína o ARNm de CD3épsilon con un nivel de referencia. En algunas modalidades, la información o datos incluye una indicación que proteína o ARNm de integrina beta7, proteína o ARNm de integrina alfaE, o proteína o ARNm de CD3épsilon están presentes o ausentes en la muestra. En algunas modalidades, la información o datos incluye una indicación que el paciente se trata de manera adecuada o no se trata de manera adecuada con una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, incluyendo un anticuerpo anti-integrina beta7 tal como etrolizumab.
Un "folleto" se utiliza para referirse a instrucciones comúnmente incluidas en paquetes comerciales de medicamentos o productos terapéuticos, que contiene información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a combinarse con el producto empaquetado, y/o advertencias que conciernen al uso de tales medicamentos o productos terapéuticos y lo similar.
Un "kit" es cualquier fabricación (e.g. un paquete o recipiente) que comprende al menos un reactivo, e. g. , un medicamento para tratamiento de una IBD, e.g., UC o enfermedad de Crohn, o una sonda para detectar específicamente un gen biomarcador o proteína de la invención. En ciertas modalidades, la fabricación se promueve, distribuye, o vende como una unidad para realizar los métodos de la presente invención.
Una "audiencia objetivo" es un grupo de personas o una institución a quien o a la cual se está promoviendo un medicamento particular o se tienen la intención de promover, como al vender o anunciar, especialmente para usos particulares, tratamientos, o indicaciones, tales como pacientes individuales, poblaciones de pacientes, lectores de periódicos, literatura médica, y revistas, televisión o quienes ven internet, quienes escuchan radio o internet, médicos, compañías de fármacos, etc.
El término "muestra de suero" se refiere a cualquier muestra de suero obtenida de un individuo. Los métodos para obtener sueros de mamíferos se conocen bien en la materia.
El término "sangre entera" se refiere a cualquier muestra de sangre entera obtenida de un individuo. Típicamente, sangre entera contiene todos los componentes de la sangre, e.g., componentes celulares y plasma. Los métodos para obtener sangre entera de mamíferos se conocen bien en la materia.
La expresión "no sensible a," "sin respuesta" y variantes gramaticales de la misma, como se refiere a la reacción de sujetos o pacientes a uno o más de los medicamentos (agentes terapéuticos) que se administraron previamente a ellos, describe aquellos sujetos o pacientes quienes, en la administración de tal(es) medicamento(s), no mostraron ninguna señal o señales adecuadas de tratamiento del trastorno para el cual están siendo tratados, o mostraron un grado de toxicidad clínicamente alto inaceptable al(los) medicamento(s), o no mantuvieron las señales de tratamiento después de administrarse primero tal(es) medicamento(s), con la palabra tratamiento utilizándose en este contexto como se define en la presente. La frase "no sensible" incluye una descripción de aquellos sujetos quienes son resistentes y/o insumisos al(los) medicamento(s) previamente administrado(s), e incluye las situaciones en la cuales un sujeto o paciente ha evolucionado mientras recibe el(los) medicamento(s) que se le están dando, y en las cuales un sujeto o paciente ha evolucionado dentro de 12 meses (por ejemplo, dentro de seis meses) después de completar un régimen que incluye el(los) medicamento(s) al(los) cual(es) ya no es sensible. La no sensibilidad a uno o más medicamentos de esta manera incluye sujetos quienes continúan teniendo la enfermedad activa después del tratamiento previo o actual con los mismos. Por ejemplo, un paciente puede tener actividad de la enfermedad active después de aproximadamente uno a tres meses, o tres a seis meses, o seis a 12 meses, de terapia con el(los) medicamento(s) al(los) cual(es) ya no son sensibles. Tal sensibilidad puede valorarse por un experto clínico en tratar el trastorno en cuestión.
Para propósitos de sin respuesta a medicamento(s), un sujeto quien experimenta "un nivel de toxicidad clínicamente alto inaceptable" de tratamiento previo o actual con uno o más medicamentos, experimenta uno o más efectos secundarios negativos o eventos adversos asociados con los mismos que se consideran por un médico experimentado significativos, tales como, por ejemplo, infecciones serias, falla cardiaca congestiva, demielinación (que conduce a esclerosis múltiple), hipersensibilidad significativa, eventos neuropatológicos, altos grados de autoinmunidad, un cáncer tal como cáncer endometrial, linfoma de no Hodgkin, cáncer de mama, cáncer prostático, cáncer pulmonar, cáncer ovárico, o melanoma, tuberculosis (TB), y lo similar.
La "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un beneficio clínico incrementado para un paciente que sufre de una cierta enfermedad o trastorno, o predictivo de respuesta a un régimen de tratamiento o agente terapéutico particular, es un nivel detectable en una muestra biológica. Este puede medirse por métodos conocidos por un experto en la materia y también descritos en la presente. La cantidad o nivel de expresión de biomarcador valorado, pueden utilizarse para determinar la respuesta o la respuesta pronosticada a un tratamiento o agente terapéutico.
Los términos "nivel de expresión" o "nivel de expresión" en general se utilizan de manera intercambiable y generalmente se refieren a la cantidad de un polinucleótido o un producto de aminoácido o proteína en una muestra biológica. "Expresión" generalmente se refiere al proceso por el cual la información codificada por el gen se convierte en las estructuras presentes y que operan en la célula. Por lo tanto, como se utiliza en la presente, "expresión" de un gen puede referirse a transcripción en un polinucleótido, traducción en una proteína, o incluso modificación post traducción de la proteína. Los fragmentos del polinucleótido transcrito, la proteína traducida, o la proteína modificada post-traducción, también deben considerarse como expresados si se originan de una transcripción generada por unión alternativa o una transcripción degradada, o de un procesamiento post-traducción de la proteína, e . g. , por proteólisis. Los "genes expresados" incluyen aquellos que se transcriben en un polinucleótido como ARNm y después se traducen en una proteína, y también aquellos que se transcriben en ARN pero no se traducen en una proteína (por ejemplo, ARNs ribosomales y de transferencia).
Se define una variedad de términos adicionales o de otra manera caracterizados en la presente.
COMPOSICIONES Y MÉTODOS A. Antagonistas de Integrina Beta7 Se proporcionan métodos para tratar un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un sujeto, e.g., un humano, al administrar antagonistas de integrina beta7. Ejemplos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con integrina beta7f y, en particular, anticuerpos incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones humanizadas y quiméricas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína cercanamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada de la integrina beta7 que reconoce el ligando pero no imparte efecto, inhibiendo así competitivamente la acción de la integrina beta7.
Otro antagonista de integrina beta7 potencial es una construcción de ADN o ARN antisentido preparada utilizando teenología antisentido, donde, e. g. , una molécula de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción de ARNm al hibridar al ARNm objetivo y prevenir la traducción de proteína. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión genética a través de la formación de triple hélice o ARN o ADN antisentido, ambos métodos se basan en unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica la integrina beta7 en la presente, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de desde aproximadamente 10 a 40 pares base en longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario a una región del gen incluida en la transcripción (triple helice--ver Lee et al . , Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooncy et al . , Science, 241: 456 (1988); Dervan et al . , Science, 251:1360 (1991)), previniendo así la transcripción y la producción de la integrina beta7. El oligonucleótido de ARN antisentido se híbrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en proteína de integrina beta7 (antisentido--Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Ratón, Fia., 1988). Los oligonucleótidos descritos arriba también pueden suministrarse a células de modo que el ADN o ARN antisentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se utiliza ADN antisentido, son típicos los oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de inicio de traducción, e . g. , entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo.
Otros antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el ligando o sitio de unión de la molécula de unión, bloqueando así la actividad biológica normal de la integrina beta7. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas como péptido o péptidos pequeños, típicamente péptidos solubles, y compuestos inorgánicos u orgánicos sin peptidilo sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la penetración específica de ARN. Las ribozimas actúan por hibridación específica de secuencia al ARN objetivo complementario, seguido por penetración endonucleolítica. Los sitios de penetración de ribozima específicos dentro de un ARN potencial objetivo pueden identificarse por téenicas conocidas. Para detalles adicionales ver, e.g. , Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y Publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de Septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de filamento único y estar compuestas de deoxinucleótidos. La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la formación de triple hélice a través de la regla de formación de pares base Hoogsteen, que generalmente requieren estiramientos dimensionables de purinas o pirimidinas en un filamento de un dúplex. Para detalles adicionales ver, e. g. . Publicación PCT No. WO 97/33551. Estas moléculas pequeñas pueden identificarse por cualquiera de uno o más de los ensayos de selección tratados arriba en la presente y/o por otras técnicas de selección bien conocidas por aquellos expertos en la materia.
Los ensayos de selección para antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se unen o componen con la integrina beta7 codificada por los genes identificados en la presente, o de otra manera interferir con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de selección incluirán ensayos dispuestos a selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos de fármaco de molécula pequeña.
Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión de proteína-proteína, ensayos de selección bioquímicos, inmunoensayos, y ensayos a base de célula, que se caracterizan bien en la materia.
B. Anticuerpos Anti-Integrina Beta7 En una modalidad, los antagonistas de integrina beta7 son anticuerpos anti-beta7. Los anticuerpos ejemplificativos incluyen anticuerpos policlonal, monoclonal, humanizado, humano, biespecífico, y heteroconjugado, etc., como se describe abajo. 1. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales pueden elevarse en animales por múltiples inyecciones intraperitoneales (IP) o subcutáneas (SC) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizarse, e . g. , hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de semilla de soya utilizando un agente de derivación o bifuncional, por ejemplo, éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoil (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, S0Cl2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados al combinar, e.g., 100 pg o 5 mg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después los animales se estimulan con 1/5 a 1/10 la cantidad de péptido original o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después los animales sangran y el suero se analiza para concentración de anticuerpo. Los animales se estimulan hasta la estabilización de la concentración. En ciertas modalidades, el animal se impulsa con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes de adición tal como alumbre, se utilizan de manera adecuada para mejorar la respuesta inmune. 2. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse utilizando el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos de ADN recombinante (ver, e.g., Patente de E.U.A. No. 4,816,567).
En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe arriba para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después de la inmunización, los linfocitos se aíslan y después se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma de esta manera preparadas se siembran y desarrollan en un medio de cultivo adecuado, tal medio puede contener una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parenterales, no fusionadas (también referidas como socio de fusión). Por ejemplo, si las células de mieloma parenterales carecen de la hipoxantina-guanina-fosforibosil-transíerasa de enzima (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo selectivo para los hibridomas típicamente incluirán hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), tales sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
En ciertas modalidades, las células de mieloma de socio de fusión son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción a alto nivel estable de anticuerpo por las células que producen anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio selectivo que se selecciona contra las células parenterales sin fusionar. En ciertas modalidades, líneas celulares de mieloma son líneas de mieloma de murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-ll disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California E.U.A., y SP-2 y derivados e . g. , células X63-Ag8-653 disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, Va., USA. Líneas celulares de heteromieloma de ratón-humano y mieloma de humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur efc al ., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el cual se desarrollan las células de hibridoma se analiza para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En ciertas modalidades, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis Scatchard descrito en Munson et al . , Anal. Biochem., 107:220 (1980). Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la actividad, afinidad y/o especificidad deseada, los clones pueden subclonarse al limitar los procedimientos de dilución y desarrollarse por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores de ascitis en un animal e.g., mediante inyección intraperitoneal de las células en ratones. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, fluido de ascitis, o suero por procedimientos de purificación de anticuerpo convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad { e . g. , utilizando proteína A o proteína G-Sefarosa) o cromatografía de intercambio de ion, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, etc.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (e . g. , al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino). Las células de hibridoma sirven como una fuente de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfieren entonces en células huésped tales como células de E. coli , células de COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen en otra manera proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de análisis en expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al . , Curr. Opinión in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs.130:151-188 (1992).
En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo también pueden aislarse de bibliotecas de fago de anticuerpo generadas utilizando e.g., las téenicas descritas en McCafferty et al . , Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al . , Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al . , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos humanos y murino, respectivamente, utilizando bibliotecas de fago. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por cambio de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fago muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas téenicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicional para aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpo de fusión o quimérico, por ejemplo, al sustituir secuencias de dominio constante de cadena ligera y cadena pesada (CH y CL) de humano para las secuencias de murino homologas (Patente de E.U.A. No.4,816,567; y Morrison, et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o al fusionar la secuencia de codificación de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina (polipéptido heterólogo). Las secuencias de polipéptido sin inmunoglobulina pueden sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente.
Los anticuerpos anti-beta7 ejemplificativos son Fib504, Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. J Immunol.1 de Agosto de 1997;159(3):1497-505) o derivados humanizados de los mismos. Los anticuerpos humanizados de Fib504 se describieron en detalle en la Publicación de Patente de E.U.A. No. 20060093601 (emitida como Patente de E.U.A. No. 7,528,236), el contenido de la cual se incorpora para referencia en su totalidad (también ver discusión abajo). 3. Anticuerpos Humanizados y de humano Los anticuerpos anti-integrina beta7 de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (e.gr., murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas de humano (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que contiene la capacidad, afinidad y especificidad deseada. En algunos casos, los residuos de estructura Fv de la inmunoglobulina de humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que se no encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas de las regiones CDR corresponden a aquella de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina de humano. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina de humano [Jones et al . , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la materia. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humano con frecuencia se refieren como residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al . , Nature, 332:323-327 (1988); Verhocyen et al . , Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir las secuencias de CDR o CDRs de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con lo anterior, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U.A. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable de humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de dominios variables de humano, tanto ligeros como pesados, a utilizarse para hacer los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y respuesta HAMA (anticuerpo anti-ratón de humano) cuando el anticuerpo se propone para uso terapéutico humano. De acuerdo al así llamado método "más adecuado", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca entera de secuencias de dominio variable de humano conocidas. Se identifica la secuencia de dominio V de humano que está más cercana a aquella del roedor y la región de estructura de humano (FR) dentro de ella aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al . , J. Immunol.151:2296 (1993); Chothia et al . , J. Mol.
Biol., 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas pesadas o ligeras. La misma estructura puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al . , J . Immunol.151:2623 (1993)). Es importante además que los anticuerpos se humanicen con la retención de alta afinidad de unión para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo a ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parenterales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y parenterales. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la materia. Están disponibles los programas de cómputo que ilustran y despliegan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estos despliegues permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que tienen influencia en la habilidad de la inmunoglobulina candidata para unir su antígeno. DDee eessttaa mmaanneerraa,, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse del receptor y secuencias de importación, de modo que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para el(los) antígeno(s) objetivo(s). En general, los residuos de región hipervariable se incluyen directamente y más sustancialmente en influenciar la unión a antígeno.
Se contemplan varias formas de un anticuerpo anti-integrina beta7 humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agente(s) citotóxico(s) para generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo de IgGl intacto.
Los anticuerpos anti-beta7 humanizados ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a rhuMAb Beta7, que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra la subunidad de integrina b7 y se derivó del anticuerpo monoclonal de anti-ratón/humano de rata FIB504 (Andrew et al., 1994 J Immunol 1994;153:3847-61). Se ha diseñado para incluir estructuras de cadena ligera k? y de cadena pesada de IgGl de inmunoglobulina de humano y se produce por células de ovario de hámster Chino. Este anticuerpo se une a dos integrinas, 0?4b7 (Holzmann et al.1989 Cell, 1989;56:37-46; Hu et al., 1992, Proc Nati Acad Sci USA 1992;89:8254-8) y aEb7 (Cepek et a1. , 1993 J Immunol 1993;150:3459-70), que regulan el tráfico y retención de subconjuntos de linfocitos en el tracto gastrointestinal y se encuentran involucradas en enfermedades inflamatorias intestinales (IBD) tales como colitis ulcerativa (UC) y enfermedad de Crohn (CD). rhuMAb Beta7 es un bloqueador in vitro potente de la interacción celular entre a4b7 y sus ligandos (molécula de adhesión celular de adresina mucosal-1 [MAdCAM]-1, molécula de adhesión celular vascular [VCAM]-1, y fibronectina) así como la interacción entre aEb7 y su ligando (cadherina-E). rhuMAb Beta7 se une de manera reversible, con alta afinidad similar, a b7 en linfocitos de conejos, monos cinomolgos y humanos. También se une a b7 de ratón con alta afinidad. La secuencia de aminoácidos así como la elaboración y uso de rhuMAb Beta7 y sus variantes se describen en detalle en e.g.. Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20060093601 (emitida como Patente de E.U.A. No. 7,528,236), el contenido de la cual se incorpora en su totalidad.
Las figuras 1A y IB representan la alineación de secuencias de las cadenas ligeras y pesadas variables para las siguientes: secuencia consenso kappa I del subgrupo de humano de cadena ligera (figura 1A, SEC ID NO:12), secuencia consenso del subgrupo III de humano de cadena pesada (figura IB, SEC ID NO:13), cadena ligera variable del anticuerpo de rata anti-beta7 de ratón (Fib504) (figura 1A, SEC ID NO:10), cadena pesada variable de anticuerpo de rata anti-beta7 de ratón (Fib504) (figura IB, SEC ID NO:ll), y variantes de anticuerpo humanizado: cadena ligera variable de injerto hu504K humanizado (figura 1A, SEC ID NO:14), cadena pesada variable de injerto hu504K humanizado (figura IB, SEC ID NO:15), variantes hu504-5, hu504-16, y hu504-32 (variaciones de aminoácidos de injerto hu504K humanizado se indican en la figura 1A (cadena ligera) (SEC ID NOS:22-24, respectivamente, en orden de aparición) y figura IB (cadena pesada) para variantes hu504-5, hu504-16, y 504-32 (SEC ID NO:25). 4. Anticuerpos Humanos Como una alternativa a humanización, pueden generarse los anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (e.g., ratones) que son capaces, en inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigosa del gen de región de unión de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quimérica da como resultado inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal de humano a tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos en el estímulo con antígeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc.
Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al . , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al . , Year in Immuno. 7:33 (1993); Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm); Patente de E.U.A.
No. 5,545,807; y WO 97/17852.
Alternativamente, la teenología de despliegue de fago (McCafferty et al . , Nature 348:552-553
[1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en estructura en ya sea un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se desplegaron como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de filamento único del genoma de fago, las selecciones con base en las propiedades funcionales del anticuerpo, también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede realizarse en una variedad de formatos, analizados en, e. g. , Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para despliegue de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donadores humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las téenicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J.12:725-734 (1993). Ver, también, Patentes de E.U.A. Nos.5,565,332 y 5,573,905.
Como se trata arriba, los anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in vitro (ver Patentes de E.U.A. Nos.5,567,610 y 5,229,275). 5. Fragmentos de Anticuerpo En ciertas circunstancias existen ventajas de utilizar fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos enteros. El tamaño más pequeño de los fragmentos permite la rápida remoción, y puede conducir a acceso mejorado a tumores sólidos.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivan a través de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e. g. , Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107- 117 (1992) y Brennan et al . , Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fago de anticuerpo tratadas arriba. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al . , Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo a otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo celular huésped recombinante. Otras téenicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv). Ver WO 93/16185; Patente de E.U.A. No. 5,571,894; y Patente de E.U.A. No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", e .g. , como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,641,870 por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecífíeos o biespecíficos. 6. Anticuerpos Biespecí f icos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplificativos pueden unirse a dos epítopos diferentes de integrina beta7 como se describe en la presente. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de unión TAT con un sitio de unión para otra proteína. Alternativamente, un extremo de anti-integrina beta7 puede combinarse con un extremo que se une a una molécula de activación en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T ( e . g . , CD3), o receptores Fe para IgG (Fc.y.R), tales como Fc.yRI (CD64), Fc.yRII (CD32) y Fe.g.RU I (CD16), para enfocar y localizar mecanismos de defensa celular para la célula que expresa TAT. Los anticuerpos biespecífíeos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos para células que expresan TAT. Estos anticuerpos tienen un extremo de unión a TAT y un extremo que une el agente citotóxico { e . g. , saporina, anti-interferon-.alfa., alcaloide vinca, cadena de ricino A, metotrexato o isótopo radiactivo hapteno). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo { e . g. , anticuerpos biespecíficos F(ab')2).
Los métodos para hacer anticuerpos biespecífíeos se conocen bien en la materia. La producción tradicional de anticuerpos biespecífíeos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Debido a la diversidad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que usualmente se hace por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante difícil, y los rendimientos del producto son muy bajos. Se describen los procedimientos similares en WO 93/08829, y en Traunecker et al . , EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo a un planteamiento diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En ciertas modalidades, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que comprende al menos parte de las regiones de articulación, CH2, y CH3. En ciertas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CHi) que contiene el sitio necesario para unión de cadena ligera, se presenta en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en una célula huésped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión único cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no afectan de manera significativa el rendimiento de la combinación de cadena deseada.
En ciertas modalidades, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de unión en un extremo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro extremo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseada, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula específica proporciona una manera fácil de separación. Este planteamiento se describe en WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).
De acuerdo a otro planteamiento descrito en la Patente de E.U.A. No.5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. En ciertas modalidades, la interfase comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácido pequeño de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más largas (e.g., tirosina o triptofan). Las "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(es) se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con pequeñas (e.g., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de E.U.A. No. 4,676,980), y para tratamiento de infección por V1H (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados se conocen bien en la materia, y se describen en la Patente de E.U.A. No. 4,676,980, junto con un número de téenicas de reticulación.
También se han descrito en la literatura las técnicas para generar anticuerpos biespecífíeos de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se penetran proteolíticamente para generar fragmentos F(ab').sub.2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de composición de ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles cercanos y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB): Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte entonces en el Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El reciente progreso ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. coli , que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med.175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico de esta manera formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T de humano normales, así como activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama de humano. También se han descrito varias téenicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión genética. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después re-oxidarse para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden V.sub.H conectado a un V.sub.L por un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con lo anterior, los dominios V.sub.H y V.sub.L de un fragmento se forzan a formar pares con los dominios complementarios V.sub.L y V.sub.H de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha reportado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífico por el uso de dímeros Fv de cadena única (sFv). Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991). 7. Anticuerpos Heterocon jugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de E.U.A. No.4,676,980], y para tratamiento de infección por V1H [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteína sintética, incluyendo aquellos que incluyen agentes reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace de tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en Patente de E.U.A. No.4,676,980. 8. Anticuerpos Multivalentes Un anticuerpo multivalente puede interiorizarse (y/o catalizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes a los de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (e . g. , anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. En ciertas modalidades, el dominio de dimerización comprende (o consiste de) una región Fe o una región de articulación. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión a antígeno amino-terminal para la región Fe. En ciertas modalidades, el anticuerpo multivalente en la presente comprende (o consiste de) tres a aproximadamente ocho, pero típicamente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y típicamente dos cadenas de polipéptido), en donde la(s) cadena(s) de polipéptido comprende(n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender VD1-(XI).sub.n-VD2-(X2).sub.n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender: cadena de VH-CHl-enlazador flexible-VH-CHl-región Fe; o cadena de VH-CH1-VH-CHl-región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente pueden comprender además al menos dos (y típicamente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente, por ejemplo, puede comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. 9. Diseño de la Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, e . g. , para mejorar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el(los) residuo(s) de cisterna puede(n) introducirse en la región Fe, permitiendo así la formación del enlace de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico de esta manera generado puede tener capacidad de interiorización mejorada y/o muerte celular mediada por complemento aumentada y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med.176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando reticulantes heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo, el cual tiene regiones Fe duales y así puede tener capacidades mejoras de ADCC y lisis complemento. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la vida media de suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epítopo de unión de receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en Patente de E.U.A. No. 5,739,277, por ejemplo. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo de unión de receptor de referencia" se refiere a un epítopo de la región Fe de una molécula de IgG (e.g., IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media del suero in vivo de la molécula de IgG. 10. Inmunoconj ugados El antagonista o anticuerpo utilizado en los métodos en la presente se conjuga opcionalmente con otro agente, tal como un agente citotóxico, o citocina.
La conjugación ordinariamente se logrará a través de un enlace covalente, la naturaleza precisa del cual se determinará por la molécula objetivo y el sitio de enlace en el polipéptido de anticuerpo o antagonista de integrina beta7. Típicamente, un agente no peptídico se modifica por la adición de un enlazador que permite la conjugación con un anticuerpo anti-integrina beta7 a través de sus cadenas laterales de aminoácido, cadenas de carbohidrato, o grupos reactivos introducidos en el anticuerpo por modificación química. Por ejemplo, un fármaco puede unirse a través del grupo .epsilon.-amino de un residuo de lisina, a través de un grupo .alfa.-amino libre, por intercambio de disulfuro a un residuo de cisteína, o por oxidación de los 1,2-dioles en una cadena de carbohidrato con ácido periódico para ayudar en la unión de fármacos que contienen varios nucleófilos a través de un enlace de base Schiff. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No.4,256,833. Los agentes que modifican la proteína incluyen reactivos amina-reactivos (e.g., ésteres reactivos, isotiocianatos, aldehidos, y haluros de sulfonilo), reactivos tiol-reactivos (e.g., derivados de haloacetilo y maleimidas), y reactivos ácido carboxílico- y aldehido-reactivos). Los polipéptidos de anticuerpo o antagonista de integrina beta7 pueden unirse covalentemente a agentes peptídicos a través del uso de reactivos de reticulación bifuncional. Los reactivos heterobifuncionales se utilizan más comúnmente y permiten el acoplamiento controlado de dos proteínas diferentes a través del uso de dos fracciones reactivas diferentes (e.g., amina-reactiva más tiol, yodoacetamida, o maleimida). El uso de tales agentes de enlace se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Brinklcy, supra, y Patente de E.U.A. No.4,671,958. Los enlazadores peptídicos también pueden emplearse. En la alternativa, un polipéptido de anticuerpo anti-integrina beta7 puede enlazarse a una fracción peptídica a través de la preparación de un polipéptido de fusión.
Ejemplos de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional adicionales incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidil), aldehidos (tales como glutareldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). 11. Inmuno Upo somas Los anticuerpos anti-integrina beta7 descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o agentes tensoactivos que es útil para suministro de un fármaco a un mamífero. Los componentes del liposoma se ordenan comúnmente en una formación bicapa, similar al orden de lípido de membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la materia, tal como se describe en Epstein et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al . , Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); Patentes de E.U.A. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicada el 23 de Octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de E.U.A. No.5,013,556.
Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.
Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas como se describe en Martin efc al . , J. Biol. Chem.257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico se contiene opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al . , J. National Cáncer Inst. 81(19):1484 (1989). 12. Vectores , Células Huésped y Métodos Re combinantes para Producción de Anticuerpo También se proporcionan ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-beta7 o agentes de polipéptido descritos en la presente, los vectores y células huésped que comprenden los ácidos nucleicos y téenicas recombinantes para la producción de los anticuerpos.
Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica puede aislarse e insertarse en un vector replicable para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión. En otra modalidad, el anticuerpo puede producirse por recombinación homologa, e.g. , como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,204,244, específicamente incorporada en la presente para referencia. ADN que codifica el anticuerpo monoclonal se aísla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales {e. g. , al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de réplica, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción, e. g. , como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,534,615 emitida el 9 de Julio de 1996 e incorporada específicamente en la presente para referencia.
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente son las células procarióticas, de levadura, o eucarióticas más altas descritas arriba. Las procariotas adecuadas para este propósito incluyen eubacteria, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, e . g. , E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salonella typhimurium, Serratia, e . g. , Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E . coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.
Además de las procariotas, los microbios eucarióticos tales como levadura u hongos filamentosos son huéspedes de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican el anticuerpo anti-integrina beta7. Saccharomyces cerevisiae, o levadura para hornear común, es la más comúnmente utilizada entre microorganismos huéspedes eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y cepas están comúnmente disponibles y útiles en la presente, tal como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, e . g. , K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, e . g. , huéspedes de Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.
Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-Beta7 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insecto y de planta. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (Caterpillar), Aedes aegyp i (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta), y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para transfección están públicamente disponibles, e . g. , la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus en la presente de acuerdo a la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperduna. Los cultivos celulares de planta de algodón, maíz, papa, semilla de soya, petunia, tomate, y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células vertebradas, y la propagación de células vertebradas en cultivo (cultivo de tejido) se ha vuelto un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de célula huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebe (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical de humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón de humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado de humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al . , Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma de humano (Hep G2).
Las células huésped se transforman con los vectores de clonación o expresión arriba descritos para producción de anticuerpo anti-integrina beta7 y se cultivan en medio nutriente convencional modificado como apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-integrina beta7 de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's FIO (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al . , Anal. Biochem.102:255 (1980), Patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Patente de E.U.A. Re.30,985 puede utilizarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones químicos (tal como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tal como fármaco GENTAMYCIN.TM.), elementos indicadores (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse a concentraciones apropiadas que se conocerían por aquellos expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y lo similar, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán aparentes para el experto ordinario en la materia.
Cuando se utilizan téenicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, los residuos particulados, ya sea células huésped o fragmentos con lisis, se remueven, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar los anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli . Brevemente, la pasta celular se descongela en la presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los residuos celulares pueden removerse por centrifugación. Donde el anticuerpo se secreta hacia el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero utilizando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede incluirse en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse los antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes inesperados.
La composición de anticuerpo preparada de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, con cromatografía de afinidad siendo la téenica de purificación típica. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas .gamma.1, .gamma.2, o .gamma. de humano (Lindmark et al . , J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)).
La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para.gamma.3 de humano (Guss et al . , EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es con más frecuencia agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estable tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que pueden lograrse con agarosa. Donde el anticuerpo comprende un dominio C.sub.H3, la resina ABX.TM Bakerbond (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para purificación. Otras téenicas para purificación de proteína tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de ion, precipitación de etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina cromatografía SEPHAROSE.TM. en una resina de intercambio de catión o anión (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a recuperarse. Siguiendo cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrofóbica con bajo pH utilizando un tampón químico de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, típicamente realizada a bajas concentraciones de sal (e.g., de aproximadamente 0-0.25 M de sal).
C. Formulaciones Farmaceuticas Las formulaciones terapéuticas que comprenden los agentes terapéuticos, antagonistas o anticuerpos de la invención se preparan para almacenamiento al mezclar el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables, opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16va edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de soluciones acuosas, formulaciones liofilizadas u otras secas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos a receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones químicos tales como fosfato, citrato, histidina y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol de bencilo o butilo; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol,· 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formando sal tal como sodio; complejos de metal (e . g. , complejos de proteína Zn); y/o agentes tensoactivos no iónicos tales como TWEEN.TM., PLURONICS.TM. o polietilenglicol (PEG).
La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, típicamente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pensado.
Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsula preparada, por ejemplo, por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16va edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Pueden prepararse las preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la inmunoglobulina de la invención, tales matrices están en la forma de artículos formados, e . g. , películas, o microcápsula. Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato.gamma., acetato de etileno-vinilo no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradable tal como LUPRON DEPOT.TM. (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como acetato de etileno-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando las inmunoglobulinas encapsuladas permanecen en el cuerpo por un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de exposición a humedad a 37°C., resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden contemplarse para estabilización dependiendo del mecanismo incluido. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de reunión es formación de enlace S--S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, puede lograrse la estabilización al modificar los residuos de sulfhidrilo, liofilizar de soluciones acidas, controlar el contenido de humedad, utilizar aditivos apropiados, y desarrollar composiciones de matriz de polímero específicas.
D. Administración El médico que administra el tratamiento será capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto individual para dosificación con base al peso o, para dosificación plana, seguirá las instrucciones en la etiqueta. Los programas de dosificación y preparación para segundos compuestos terapéuticos comercialmente disponibles y otros administrados en combinación con los antagonistas de integrina beta7 pueden utilizarse de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes o determinarse de manera empírica por el practicante experto.
Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada del antagonista de integrina beta7 y cualquier segundo compuesto terapéutico u otro administrado en combinación con el anticuerpo sin eliminación dependerá del tipo de trastorno inflamatorio gastrointestinal a tratarse, e.g., IBD, UC, CD, la severidad y curso de la enfermedad, si el antagonista de integrina beta7 o combinación se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al antagonista de integrina beta7 o combinación, y la discreción del médico que atiende. El antagonista de integrina beta7 o combinación se administra de manera adecuada al paciente en una sola vez o más típicamente durante una serie de tratamientos. En ciertas modalidades, el antagonista de integrina beta7 se administra una vez cada semana, o una vez cada dos semanas, o una vez cada cuatro semanas, o una vez cada seis semanas, o una vez cada ocho semanas por un periodo de un mes (4 semanas), o dos meses, tres meses, o seis meses, o 12 meses, o 18 meses, o 24 meses, o crónicamente por el tiempo de vida del paciente. En ciertas modalidades, el tratamiento se auto-administra por el paciente.
Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 0.5 mg/kg a 4.0 mg/kg de anticuerpo anti-beta7 es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Para administraciones repetidas durante varios días o más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, una dosis plana de anticuerpo anti-beta7 se administra al paciente. Una dosis plana es una cantidad particular de anticuerpo anti-beta7 que se administra a cada paciente sin considerar el peso. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, una dosis plana de entre aproximadamente 50 mg y 450 mg de anticuerpo anti-beta7 se administra al paciente, que puede ser una o más administraciones o infusiones o inyecciones separadas. Tal dosis plana puede administrarse intravenosa o subcutáneamente o por otras vías como se describe en la presente. En ciertas modalidades, la dosis plana es 50 mg, o 100 mg, o 150 mg, o 200 mg, o 300 mg, o 400 mg, o 420 mg, o 450 mg.
En ciertas modalidades, una dosis de carga plana inicial de anticuerpo anti-beta7 se sigue por una o más dosis de mantenimiento planas de anticuerpo anti-beta7. La dosis de carga es una cantidad más grande de anticuerpo anti-beta7 que la dosis de mantenimiento. En ciertas modalidades, la dosis de carga es entre aproximadamente 400 mg y 450 mg y la dosis de mantenimiento es entre aproximadamente 50 mg y 350 mg. En ciertas modalidades, la dosis de carga es 400 mg, o 420 mg, o 430 mg, o 450 mg. En ciertas modalidades, la dosis de mantenimiento es 50 mg, o 100 mg, o 150 mg, o 200 mg, o 300 mg, o 350 mg.
Típicamente, el médico administrará un anticuerpo (solo o en combinación con un segundo compuesto) de la invención hasta que se alcanza una dosificación que proporciona el efecto biológico requerido. El progreso de la terapia de la invención se monitorea fácilmente por ensayos y téenicas convencionales.
El antagonista de integrina beta7 puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo administración parenteral, tópica, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, y/o intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. También se contempla administración intratecal (ver, e.g., Publicación de Patente de E.U.A. No. 2002/0009444 por Grillo-Lopez). Además, el antagonista de integrina beta7 puede administrarse de manera adecuada por infusión de impulso, e.g., con dosis en declive del anticuerpo. En ciertas modalidades, la dosificación se da intravenosa o subcutáneamente. Cada exposición puede proporcionarse utilizando el mismo o un diferente medio de administración. En una modalidad, cada exposición a anticuerpo anti-beta7 es por administración subcutánea. En una modalidad, la primera exposición a anticuerpo anti-beta7, e.g., la dosis de carga, es por administración intravenosa y cada exposición subsiguiente es por administración subcutánea.
En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-beta7 se administra utilizando, por ejemplo, un dispositivo de auto-inyección, dispositivo autoinyector, u otros dispositivos diseñados para auto-administración. Varios dispositivos de auto-inyección, incluyendo dispositivos autoinyectores, se conocen en la materia y están comercialmente disponibles. Los dispositivos ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, jeringas prellenas (tales como BD HYPAK SCF®, READYFILLTM, y STERIFILL SCFTM de Becton Dickinson; jeringas prellenas de copolímero CLEARSHOTTM de Baxter; y jeringas prellenas CRYSTAL ZENITH® Daikyo Seiko disponibles de West Pharmaceutical Services); dispositivos de inyección de pluma desechables tal como Pluma BD de Becton Dickinson; dispositivos ultra-puntiagudos y microaguja (tal como INJECT-EASETM y dispositivos de microinfusión de Becton Dickinson; y H-PATCHTM disponibles de Valeritas) así como dispositivos de inyección libres de aguja (tales como BIOJECTOR® y IJECT® disponibles de Bioject; y SOF-SERTER® y dispositivos de parche disponibles de Medtronic). En ciertas modalidades, rhuMAb Beta7 es un artículo de elaboración que comprende una jeringa prellena que comprende 2 mi (150 mg) de rhuMAb Beta7. En ciertas modalidades, rhuMAb Beta7 es un artículo de elaboración que comprende una jeringa prellena que comprende 1 mi (180 mg) de rhuMAb Beta7.
Como se observa, el antagonista de integrina beta7 puede administrarse solo o en combinación con al menos un segundo compuesto terapéutico. Estos segundos compuestos terapéuticos generalmente se utilizan en las mismas dosificaciones y con vías de administración como se utiliza hasta ahora, o aproximadamente de 1 a 99% de las dosificaciones hasta ahora empleadas. Si se utilizan tales segundos compuestos, se utilizan en ciertas modalidades en cantidades inferiores que si el antagonista de integrina beta7 no estuviera presente, para eliminar o reducir efectos secundarios causados así.
También como se observa (e.g., ver abajo), se conoce en la materia una variedad de segundos compuestos terapéuticos adecuados para el tratamiento de IBD, e.g., colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn, y del mismo modo se han descrito dosificaciones y métodos de administración para tales segundos compuestos terapéuticos.
La administración del antagonista de integrina beta7 y cualquier segundo compuesto terapéutico puede hacerse simultáneamente, e.g., como una composición única o como dos o más composiciones distintas utilizando la misma o diferentes vías de administración. Alternativa, o adicionalmente, la administración puede hacerse secuencialmente, en cualquier orden. En ciertas modalidades, los intervalos que varían de minutos a días, a semanas a meses, pueden estar presentes entre las administraciones de las dos o más composiciones. Por ejemplo, el antagonista de integrina beta7 puede administrarse primero, seguido por el segundo compuesto terapéutico. Sin embargo, también se contempla la administración simultánea o administración del segundo compuesto terapéutico antes que el antagonista de integrina beta7.
El estándar de cuidado para sujetos con UC activa moderada-severa incluye terapia con dosis estándar de: un aminosalicilato, un corticoesteroide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) y/o azatioprina. La terapia con un antagonista de integrina beta7, tal como un anticuerpo anti-integrina beta7 como se describe en la presente dará como resultado una mejora en remisión de enfermedad (control rápido de enfermedad y/o remisión sostenida), y/o respuesta clínica, superior a aquella lograda con el estándar de cuidado para tales sujetos.
En una modalidad, el tratamiento de la presente invención para enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en un humano sujeto con IBD comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un agente terapéutico, tal como un anticuerpo anti-integrina beta7, y comprende además administrar al sujeto una cantidad efectiva de un segundo medicamento, que es un inmunosupresor, un agente de control de dolor, un agente antidiarrérico, un antibiótico, o una combinación de los mismos.
En una modalidad ejemplificativa, dicha medicina secundaria se selecciona del grupo que consiste de un aminosalicilato, un corticoesteroide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) y azatioprina. En otra modalidad ejemplificativa, dicha medicina secundaria es otro antagonista de integrina beta7, tal como otro anticuerpo anti-integrina beta7 o un anticuerpo contra una citocina.
Todos estos segundos medicamentos pueden utilizarse en combinación entre sí o por ellos mismos con el primer medicamento, de manera que la expresión "segundo medicamento" como se utiliza en la presente no significa que es el único medicamento además del primer medicamento, respectivamente. De esta manera, el segundo medicamento no necesita ser un medicamento, pero puede constituir o comprender más de un tal fármaco.
La Administración combinada en la presente incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmaceutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde generalmente hay un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos simultáneamente ejercen sus actividades biológicas.
La administración combinada de un segundo medicamento incluye co-administración (administración concurrente), utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde generalmente hay un periodo de tiempo mientras ambos (o todos) agentes activos (medicamentos) simultáneamente ejercen sus actividades biológicas.
E. Diseñar Regímenes de Tratamiento El desarrollo de fármaco es un proceso complejo y costoso. El costo de llevar un nuevo fármaco al mercado se estima que es entre $800 millones y $1 billón. Menos del 10% de fármacos en pruebas clínicas fase I pasa la fase de aprobación. Dos razones clave del porque los fármacos fallan en etapas posteriores son una falta de entendimiento de la relación entre respuestas de concentración a dosis y eventos de seguridad sin anticipar. Dado este escenario, es importante tener herramientas habilitadas que ayudan a predecir como un fármaco actuará in vivo y ayudará en el éxito de un candidato terapéutico clínico (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).
Farmacocinética (PK) caracteriza las propiedades de absorción, distribución, metabolismo, y eliminación de un fármaco. Farmacodinámica (PD) define la respuesta fisiológica y biológica al fármaco administrado. El modelado PK/PD establece un enlace matemático y teórico entre estos dos procesos y ayuda a predecir mejor la acción del fármaco.
El modelado PK/PD integrado y diseño de prueba auxiliado por computadora a través de la simulación se están incorporando en muchos programas de desarrollo de fármaco y están teniendo un impacto de crecimiento (Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)).
La prueba PK/PD típicamente se realiza en cada etapa del proceso de desarrollo de fármaco. Debido a que el desarrollo cada vez se vuelve más complejo, consume tiempo, y es de costo intensivo, las compañías están buscando hacer mejor uso de los datos PK/PD para eliminar los candidatos con defectos al comienzo e identificar aquellos con la mejor oportunidad de éxito clínico. (Lakshmi Kamath, supra) .
Los planteamientos de modelado PK/PD se prueban útiles para determinar las relaciones entre la respuesta del biomarcador, niveles de fármaco, y regímenes de dosificación. El perfil PK/PD de un fármaco candidato y la habilidad de predecir una respuesta del paciente a él son críticos al éxito de pruebas clínicas. Los avances recientes en téenicas de biología molecular y un mejor entendimiento de objetivos para varias enfermedades tienen biomarcadores validados como un buen indicador clínico de una eficacia terapéutica del fármaco. Los ensayos del biomarcador (incluyendo aquellos descritos en la presente) y uso de tales ensayos de biomarcados ayudan a identificar una respuesta biológica a un candidato fármaco. Una vez que un biomarcador se valida clínicamente, las simulaciones de prueba pueden modelarse efectivamente. Los biomarcadores tienen el potencial de lograr el estado sustituto que puede sustituir algún día los resultados clínicos en desarrollo de fármaco. (Lakshmi Kamath, supra) .
La cantidad de biomarcadores en la sangre periférica tales como aquellos descritos en la presente pueden utilizarse para identificar la respuesta biológica a un tratamiento con antagonistas de integrina beta7 y, por lo tanto, pueden funcionar como un buen indicador clínico para la eficacia terapéutica de un tratamiento candidato.
El modelado de PK/PD tradicional en el desarrollo de fármaco define parámetros tales como concentración de dosis de fármaco, efectos de exposición al fármaco, vida media del fármaco, concentraciones del fármaco contra el tiempo, y efectos del fármaco contra el tiempo. Cuando se utilizan más ampliamente, las téenicas cuantitativas tales como modelado del fármaco, modelado de la enfermedad, modelado de prueba, y modelado del mercado pueden soportar el proceso de desarrollo completo, que da como resultado mejores decisiones a través de la consideración explícita de riesgo y mejor uso de conocimiento. Una variedad de herramientas de modelado de PK/PD está disponible para los investigadores del desarrollo, por ejemplo, WinNonlin y el Servidor Knowledgebase (PKS) desarrollado por Pharsight, Inc. Mountain View, California.
Téenicas de Biomarcador General La práctica de la presente invención empleará, al menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, e inmunología, que están dentro de la experiencia de la materia. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshncy, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., eds., 1994).
Los cebadores, oligonucleótidos y polinucleótidos empleados en la presente invención pueden generarse utilizando técnicas estándar conocidas en la materia.
Los biomarcadores de expresión genética asociados con predecir la sensibilidad de pacientes con IBD incluyendo paciente que sufre de UC o enfermedad de Crohn a ciertos agentes terapéuticos se proporcionan en la presente. Estos niveles de expresión del ARNm o proteínas individuales codificadas por los genes constituyen biomarcadores para predecir la sensibilidad a agentes terapéuticos para IBD, agentes terapéuticos para UC, y/o agentes terapéuticos para enfermedad de Crohn. De acuerdo con lo anterior, la invención descrita en la presente es útil en una variedad de establecimientos, e.g., en métodos y composiciones relacionadas con diagnóstico y terapia de enfermedades inflamatorias intestinales.
Detección de Niveles de Expresión Genética El ácido nucleico, de acuerdo a cualquiera de los métodos descritos en la presente puede ser ARN transcrito de ADN genómico o ADNc generado de ARN o ARNm. El ácido nucleico puede derivarse de un vertebrado, e.g., un mamífero. Un ácido nucleico se dice que se "deriva de" una fuente particular si se obtiene directamente de aquella fuente o si es una copia de un ácido nucleico encontrado en esa fuente.
El ácido nucleico incluye copias del ácido nucleico, e.g., copias que resultan de amplificación. La amplificación puede ser deseable en ciertos casos, e.g., para obtener una cantidad deseada de material para detectar variaciones. Los amplicones pueden someterse entonces a un método de detección de variación, tales como aquellos descritos abajo, para determinar la expresión de ciertos genes.
Los niveles de ARNm pueden medirse y cuantificarse por varios métodos bien conocidos para aquellos expertos en la materia, incluyendo el uso de reactivos y kits comercialmente disponibles. Un tal método es reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Otro método, para uso cuantitavo, es PCR cuantitativa en tiempo real, o qPCR. Ver, e.g., "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications," (M.A. Innis et al., eds., Academic Press, Inc., 1990); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periódicas); y "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., eds., 1994).
Un microconjunto es una teenología multiplex que utiliza típicamente una serie en conjunto de miles de sondas de ácido nucleico para hibridar con, e.g., una muestra de ADNc o ARNc bajo condiciones de alta severidad. La hibridación de sonda-objetivo se detecta típicamente y cuantifica por la detección de objetivos marcados con fluoróforo, plata o quimioluminisencia para determinar la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en el objetivo. En microconjuntos típicos, las sondas se unen a una superficie sólida por un enlace covalente a una matriz química (a través de epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otros). La superficie sólida es por ejemplo, vidrio, un chip de silicio, o perlas microscópicas. Varios microconjuntos están comercialmente disponibles, incluyendo aquellos fabricados, por ejemplo, por Affymetrix, Inc. e IIlumina, Inc.
Puede obtenerse una muestra biológica utilizando ciertos métodos conocidos por aquellos expertos en la materia. Las muestras biológicas pueden obtenerse de animales vertebrados, y en particular, mamíferos. En ciertos casos, una muestra biológica es tejido sinovial, suero o células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Al seleccionar tales muestras corporales, puede lograrse un diagnóstico temprano simple para enfermedades tales como colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Además, el progreso de terapia puede monitorearse más fácilmente al probar tales muestras corporales para variaciones en niveles de expresión de ácidos nucleicos objetivo (o polipéptidos codificados).
Posterior a la determinación que un sujeto, o el tejido o muestra de célula comprende una firma de expresión genética o niveles relativos de ciertos biomarcadores descritos en la presente, se contempla que una cantidad efectiva de un agente terapéutico apropiado puede administrarse al sujeto para tratar la enfermedad particular en el sujeto, e.g., UC o enfermedad de Crohn. El diagnóstico clínico en mamíferos de las varias condiciones patológicas descritas en la presente puede hacerse por el practicante experto. Están disponibles en la materia las téenicas de diagnóstico clínicas que permiten, e.g., el diagnóstico o detección de enfermedades inflamatorias intestinales en un mamífero, e.g., colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn.
Kits Para utilizarse en las aplicaciones descritas o sugeridas en la presente, también se proporcionan kits o artículos de elaboración. Tales kits pueden comprender un medio portador que se pone compartimentos para recibir en confinamiento cercano uno o más medios contendores tales como frascos, tubos, y lo similar, cada uno de los medios contenedores comprendiendo uno de los elementos separados a utilizarse en el método. Por ejemplo, uno del medio contenedor puede comprender una sonda que se marca o puede marcarse de manera detectable. Tal sonda puede ser un polinucleótido específico para un polinucleótido que comprende uno o más genes de una firma de expresión genética. Donde el kit utiliza hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el kit también puede tener recipientes que contienen nucleótido(s) para amplificación de la secuencia de ácidos nucleicos objetivo y/o un recipiente que comprende un medio informador, tal como una proteína de unión a biotina, tales como avidina o estreptavidina, unida a una molécula informadora, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, o radioisótopo.
Los kits típicamente comprenderán el recipiente descrito arriba y uno o más otros recipientes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista del usuario y comercial, incluyendo tampones químicos, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y folletos con instrucciones para uso. Una etiqueta puede estar presente en el contenedor para indicar que la composición se utiliza para una terapia específica o aplicación no terapéutica, y también puede indicar direcciones para ya sea uso in vivo o in vitro, tales como aquellas descritas arriba. Otros componentes opcionales en el kit incluyen uno o más tampones químicos (e.gr., tampón químico de bloqueo, tampón químico de enjuague, tampón químico de sustrato, y lo similar), otros reactivos tales como sustrato (e.gr., cromógeno) que se altera químicamente por una etiqueta enzimática, solución de recuperación de epítopo, muestras de control (controles positivo y/o negativo), portaobjeto(s) de control etc.
Métodos para Comercializar La invención en la presente también comprende un método para comercializar un agente terapéutico o una composición farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende promover a, dar instrucciones, y/o especificar a una audiencia objetivo, el uso del agente o composición farmacéutica del mismo para tratar un paciente o población de pacientes con una enfermedad particular, e.g., UC o enfermedad de Crohn, de la cual se ha obtenido una muestra que muestra una firma de expresión genética o niveles de biomarcadores de suero como se describe en la presente.
La comercialización es generalmente comunicación pagada a través de un medio no personal en el cual se identifica un patrocinador y se controla el mensaje. La comercialización para propósitos en la presente incluye publicidad, relaciones públicas, colocación del producto, patrocinio, suscripción, y promoción de rebajas. Este término también incluye avisos públicos de información patrocinados que aparecen en cualquiera de los medios de comunicaciones impresos diseñados para solicitar a una audiencia de masa persuadir, informar, promover, motivar, o de otra manera modificar la conducta hacia un patrón favorable de compra, soporte, o aprobación de la invención en la presente.
La comercialización del método de diagnóstico en la presente puede realizarse por cualquier medio. Los ejemplos de medios de comercialización utilizados para suministrar estos mensajes incluyen televisión, radio, películas, revistas, periódicos, internet, y carteles, incluyendo comerciales, que son mensajes que aparecen en los medios de emisión.
El tipo de comercialización utilizado dependerá de muchos factores, por ejemplo, en la naturaleza de la audiencia objetivo a alcanzarse, e.g., hospitales, compañías de seguro, clínicas, doctores, enfermeras, y pacientes, así como consideraciones de costo y las lcyes jurisdiccionales relevantes y regulaciones que gobiernan la comercialización de medicamentos y diagnóstico. La comercialización puede individualizarse o adaptarse con base en las caracterizaciones del usuario definidas por interacción de servicio y/u otros datos tales como demográficas de usuario y ubicación geográfica.
La especificación escrita anterior y los siguientes ejemplos se consideraron ser suficientes para permitir a un experto en la materia practicar la invención. Varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción anterior y siguientes ejemplos y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Se entiende que la aplicación de las enseñanzas de la presente invención a un problema específico o situación estará dentro de las capacidades de un experto en la materia en vista de las enseñanzas contenidas en la presente.
Los detalles adicionales de la invención se ilustran por los siguientes Ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en la presente para referencia.
EJEMPLOS Ejemplo 1 ESTUDIO CONTROLADO POR PLACEBO DOBLE CIEGO ALEATORIO FASE II PARA EVALUAR LA EFICACIA Y SEGURIDAD DE rhuMAb BETA7 (ETROLIZUMAB) EN PACIENTES CON COLITIS ULCERATIVA MODERADA A SEVERA Y ESTUDIO DE EXTENSIÓN ABIERTO Descripción del Estudio Clínico Descripción de rhuMAb Beta7 (etrolizumab) RhuMAb Beta7 (etrolizumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado con base en las secuencias consenso VL de subgrupo-1 K, VH de subgrupo III de IgGl de humano y se dirige específicamente contra la subunidad b7 del heterodímero de integrina. Ver Figuras 1A y IB. Se ha mostrado que se une con alta afinidad a a4b7 (Kd de aproximadamente 116 pM) y aEb7 (Kd de aproximadamente 1800 pM).
Este anticuerpo recombinante tiene dos cadenas pesadas (446 residuos) y dos cadenas ligeras (214 residuos) que se enlazan covalentemente por enlaces de disulfuro de intracadena e intercadena típicos de anticuerpos de IgGl. Para el trabajo descrito en la presente, se produjo en células de ovario de hámster Chino (CHO). La masa molecular de la molécula rhuMAb Beta7 no glicosilada, intacta fue aproximadamente 144 kDa. Cada cadena pesada de rhuMAb Beta7 tuvo un sitio de glicosilación N enlazado conservado en Asn297. Los oligosacáridos presentes en este sitio fueron típicos de aquellos observados en anticuerpos recombinantes expresados en células CHO, con las glicoformas predominantes siendo el asíalo, biantennary G0, y glicanos G1. La masa de la forma rhuMAb Beta7 más prevalente conteniendo dos glicanos G0 y residuos de lisina no C terminal fue aproximadamente 147 kDa.
El producto de fármaco RhuMAb Beta7 y placebo se prepararon por Genentech. Fueron soluciones acuosas claras a ligeramente opalescentes, sin color a ligeramente amarillas. Ambas soluciones fueron estériles y líquidas libres de conservador pensadas para administración IV y SC.
Diseño del Estudio Descripción del Estudio Este estudio Fase II fue un estudio multicentro controlado por placebo, doble ciego, aleatorio para evaluar la eficacia y seguridad a través de dos niveles de dosis de rhuMAb Beta7 en comparación con placebo en pacientes con UC moderada a severa. El punto final de eficacia primaria se evaluó en la Semana 10 (2 semanas después de que se administró la dosis final de fármaco de estudio) con un punto final de eficacia secundario en la Semana 6.
Los pacientes se escogieron al azar en una proporción 1:1:1 a través de un rango de dosis de rhuMAb Beta7 100 mg de SC (dosis plana) en las Semanas 0, 4, y 8 y 420 mg de SC (dosis de carga plana) en la Semana 0 seguido por 300 mg de SC en las Semanas 2, 4, y 8 o igualar SC placebo. El esquema de estudio se muestra en la figura 2. El estudio se dividió en un periodo de selección de 0-35 días, un periodo de tratamiento doble ciego de 10 semanas, un periodo de seguimiento de seguridad de 18 semanas, y un periodo de seguimiento de leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML) de 17 meses (2 años después de la selección al azar).
Para ser elegibles, los pacientes deben tener un mínimo de una duración de 12 semanas de UC diagnosticada de acuerdo a las directrices de práctica del Colegio Americano de Gastroenterologia (ACG); es decir, evidencia endoscópica y clínica corroborada por un reporte de histopatología, con evidencia de enfermedad de moderada a severa como se pone en evidencia por, en ciertos casos MCS de > 5, o en ciertos casos, MCS de > 6, incluyendo una subpuntuación de endoscopia de > 2; una subpuntuación de sangrado rectal de > 1 (ver Tabla 1); y evidencia endoscópica de actividad de enfermedad un mínimo de 25 cm desde el borde anal. Los criterios de exclusión e inclusión adicionales para este estudio se proporcionan en la Publicación de Patente Internacional No. WO/2012/135589.
Tabla 1. Sistema de Puntuación Mayo para Valoración de la Actividad de Colitis Ulcerativa. a Cada paciente sirve como su propio control para establecer el grado de anormalidad de la frecuencia de deposición. b La puntuación de sangrado diario representa el sangrado más severo del día. c La valoración global del médico reconoce los tres otros criterios, la recolección diaria del paciente de incomodidad abdominal y sentido general de bienestar, y otras observaciones, tales como los descubrimientos físicos y el estado de desempeño del paciente.
Antes de la selección al azar, los pacientes deben estar en dosis estables de medicaciones concomitantes para UC. Las dosis de ácido 5-aminosalicílico oral (5-ASA) e inmunosupresor (azatioprina [AZA], 6-mercaptopurina [6-MP], o metotrexato) deben mantenerse estables por al menos 4 semanas antes de la selección al azar el Día 1. Los pacientes quienes recibieron 5-ASA tópico o corticoesteroides deben descontinuarse 2 semanas antes de la selección al azar el Día 1. Las dosis de corticoesteroides orales deben mantenerse estables por 2 semanas antes de la selección al azar el Día 1. Los pacientes que reciben alta dosis de esteroides debieron haber tenido la dosis reducida a < 20 mg/día por 2 semanas antes de la selección al azar el Día 1. Para pacientes que reciben corticoesteroides orales durante el periodo de tratamiento de estudio, el estrechamiento de esteroides debe haberse comenzado en la Semana 10 a una tasa de 5-mg de prednisona o equivalente de prednisona por semana por 2 semanas y después a una tasa de 2.5 mg de prednisona o equivalente de prednisona por semana a discontinuación. Para pacientes que reciben inmunosupresores orales (diferentes a corticoesteroides orales), el estrechamiento de inmunosupresores debe haberse comenzado en la Semana 8, y los pacientes deben tener inmunosupresores completamente discontinuos por la Semana 10. Los pacientes quienes han recibido previamente terapia anti-TNF debieron haber descontinuado la terapia por un mínimo de 8 semanas antes de la selección al azar para recibir el fármaco de estudio el Día 1. Si los pacientes experimentaron actividad de enfermedad creciente o persistente en cualquier momento durante el estudio, la terapia de rescate en la forma de un incremento en esteroides y/o dosis de inmunosupresor puede incrementarse o iniciarse de acuerdo al juicio clínico del investigador. Los pacientes quienes requirieron terapia de rescate se dejaron permanecer en el estudio pero se discontinuaron del tratamiento de estudio y, durante el análisis de datos, se clasificaron como habiendo experimentado falla del tratamiento.
Los pacientes fueron valorados para determinar si fallan en responder a terapia convencional, incluyendo al menos un agente anti-TNF. Como se utiliza en la presente, pérdida de respuesta y/o intolerancia a agentes anti-TNF e inmunosupresores significa lo siguiente. Con respecto a agentes anti-TNF, pérdida de respuesta y/o intolerancia significa que los síntomas de enfermedad activa persisten a pesar del tratamiento previo con uno o más de (a) infliximab: 5 mg/kg IV, 3 dosis durante 6 semanas con valoración a 8 semanas; (b) adalimumab: una dosis de SC de 160-mg en la semana 0, seguido por una dosis de 80-mg en la semana 2 y después 40 mg en las semanas 4 y 6, con valoración a 8 semanas; o síntomas activos recurrentes durante dosificación de mantenimiento regularmente programada siguiendo una respuesta previa (discontinuación opcional de tratamiento por el paciente que ha respondido y no perdió respuesta, no califica); o historia de intolerancia a al menos un anticuerpo anti-TNF (incluyendo pero no exclusivo de o limitado a reacción relacionada con infusión o reacción del sitio de inyección, infección, falla cardiaca congestiva, demielinación). Con respecto a agentes inmunosupresores, pérdida de respuesta y/o intolerancia significa que los síntomas de enfermedad activa persisten a pesar de tratamiento previo con una o más de azatioprina (> 1.5 mg/kg) o dosis equivalente de 6-mercaptopurina mg/kg (> 0.75 mg/kg) o metotrexato, 25 mg SC/intramuscular (o como se indica) por semana durante al menos 8 semanas; o historia de intolerancia de al menos un inmunopresivo (incluyendo, pero no exclusivo de pancreatitis, fiebre por fármaco, picazón, nausea/vómito, elevación de la prueba de función del hígado, infección, mutación genética S-metiltransferasa de tiopurina).
La selección al azar para tratamiento de estudio se estratificó por tratamiento concomitante con corticoesteroides (si/no), tratamiento concomitante con inmunosupresores (si/no), exposición previa a anti-TNF (si/no) (excepto para pacientes seleccionados al azar en los Estados Unidos), y sitio de estudio.
La actividad de la enfermedad UC se valoró utilizando MCS en la Puntuación (y esto se consideró MCS de referencia), Semana 6 (2 semanas después de la dosificación en la Semana 4), y Semana 10 (2 semanas después de la dosis final de fármaco de estudio). Las biopsias del colon se obtuvieron durante la sigmoidoscopia flexible conducida en estos mismos puntos de tiempo. MCS parcial también se recolectó por todo el estudio. Los Resultados Reportados del Paciente (PROs) también se valoraron al utilizar un Cuestionario Corto de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (SIBDQ) y MCS, que fueron para ser completados por los pacientes el Día 1 y en las Semanas 6 y 10. Además, la actividad de enfermedad, síntomas diarios, e impacto de UC se recolectaron en un paciente diario, para completarse diariamente por pacientes de la selección (aproximadamente 7 días antes y hasta el Día 1) y al menos 7 días antes y hasta el las visitas de estudio en las Semanas 6 y 10. Las muestras fecales y de suero también se obtuvieron para análisis del biomarcador. La deposición se obtuvo en la selección y las Semanas 6, 10, y 28 para medición de biomarcadores. Los biomarcadores ejemplificativos que se consideraron para medición incluyen, pero no se limitan a, lipocalina, calprotectina, y lactorferrina. Suero y plasma se obtuvieron en selección, el Día 1, y en las Semanas 4, 6, 10, 16, y 28 para medición de biomarcadores exploratorios.
El punto final de la eficacia primaria para este estudio fue la proporción de pacientes quienes alcanzaron remisión clínica, definida como una reducción absoluta en MCS a < 2 sin subpuntuación individual excediendo 1 punto, por la Semana 10. Los puntos finales secundarios adicionales se enlistan en las mediciones del resultado del estudio como se describe abajo.
Mediciones del Resultado Medición Primaria del Resultado de Eficacia La medición del resultado de eficacia primaria fue remisión clínica en la Semana 10. La remisión clínica se define por MCS < 2 sin subpuntuación individual excediendo 1 punto (ver Tabla 1).
Mediciones Secundarias del Resultado de Eficacia Las mediciones secundarias del resultado de eficacia para este estudio fueron (1) Respuesta clínica en la Semana 6 y Semana 10 donde la respuesta clínica se definió por al menos una disminución de 3 puntos y 30% de reducción de la referencia en MCS y una disminución de > 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1; (2) Remisión clínica (definida arriba) en la Semana 6; y (3) Un indicador para puntuación endoscópica y puntuación del sangrado rectal de 0 en la Semana 6 y Semana 10.
Mediciones del Resultado Exploratorio La medición del resultado exploratorio para este estudio fueron el tiempo para dilatación de UC en pacientes quienes alcanzaron respuesta o remisión. Para esta medición del resultado, se define una dilatación como un incremento de 2 puntos en MCS parcial acompañado por 3 días de sangrado rectal continuo y una puntuación de endoscopia de 2 en sigmoidoscopia flexible.
Mediciones del Resultado de Seguridad La seguridad y tolerancia de rhuMAb Beta7 se valoraron utilizando las siguientes mediciones: (1) Incidencia de eventos adversos y eventos adversos serios clasificados de acuerdo a los Criterios de Terminología Comunes para Eventos Adversos del Instituto Nacional de Cáncer (NCI CTCAE) Versión 4.0; (2) Cambios clínicamente significativos en signos vitales y mediciones del laboratorio de seguridad; (3) Descontinuación debida a evento(s) adverso(s); (4) Incidencia y naturaleza de las reacciones del sitio de inyección e hipersensibilidad; (5) Incidencia de complicaciones infecciosas; y (6) Inmunogenicidad como se mide por la incidencia de ATAs.
Mediciones del Resultado Farmacocinetico Las mediciones del resultado farmacocinético incluyeron lo siguiente: (1) Cmax después de la primer dosis y la final; (2) Tiempo para concentración máxima (Tmax) después de la primer dosis y la final; (3) Área bajo la curva de tiempo de concentración de suero (AUC) dentro de un intervalo de dosis después de la dosis final; (4) AUC de tiempo 0 al tiempo de la última observación detectable (AUCültima) o a infinidad (AUCinf); (5) Despeje aparente (CL/F); (6) Volumen aparente de distribución (V/F); y (7) Eliminación de la vida media (tl/2).
EJEMPLO 2 - Análisis y Estudios del Biomarcador Predictivo Racional para selección de los biomarcadores predictivos, integrina beta7 y CD3épsilon, para enriquecimiento de eficacia en pacientes tratados con etrolizumab Como se trata arriba, etrolizumab se une a la integrina b7 y bloquea la unión a MAdCAMl, que se expresa en células endoteliales mucosales. La unión de linfocitos que expresan integrina b7 a MAdCAMl juega un papel importante en la migración de células al intestino delgado, folículos linfoides del intestino grueso, y nodos linfáticos mesentéricos. Hicimos la hipótesis que debido a la migración incrementada de linfocitos que se guían al intestino a través de a4p7:MAdCAM se piensa que conduce una inflamación en progreso en UC, los pacientes con evidencia de tal guía de los linfocitos al intestino incrementada se beneficiarían del tratamiento con etrolizumab. De esta manera seleccionamos los marcadores de diagnóstico predictivos que midieron el linfocito y/o actividad de trayectoria b7:MA OAM1 para buscar la eficacia incrementada en pacientes quienes pueden tener enfermedad fuertemente conducida por migración del linfocito y presencia en tejido de la enfermedad.
Los marcadores de diagnóstico predictivos candidatos, integrina beta7 y CD3épsilon, se pre seleccionaron antes del análisis de los resultados de eficacia clínicos. La expresión de biopsia de CD3s, que es un componente del complejo de señalización del receptor de célula T-CD3, se eligió como un biomarcador predictivo potencial debido a su expresión relativamente exclusiva en células T, que pueden conducir la enfermedad en el intestino. Además, integrina b7 se expresa en linfocitos y células dendríticas y otros tipos celulares. Como se predice por los estudios preclínicos y clínicos Fase I, tales células de expresión b7 deben bloquearse del tráfico al intestino en pacientes tratados con etrolizumab. De acuerdo con lo anterior, buscamos determinar si los niveles de integrina b7 en biopsias y/o en sangre periférica fueron predictivos para respuesta a tratamiento con etrolizumab.
Recolección y procesamiento del tejido de biopsia intestinal Las biopsias intestinales se recolectaron de los participantes del estudio durante sigmoidoscopia flexible/colonoscopia completa en la visita de selección (hasta 4 semanas antes del tratamiento). Las biopsias se tomaron del área más inflamada del colon dentro de 10-40 cm del borde anal. Se evitaron las biopsias dentro de las áreas necróticas de mucosa ulcerada o en sitios de sutura en pacientes con resección colónica anterior. Las biopsias se colocaron en un ARN de tejido que estabilizan el tampón químico (RNAlater, Qiagen, Cat. No.76104) y se congelaron para envío. En la recepción, las muestras de biopsia se descongelaron y homogeneizaron con perlas de acero de 3mm utilizando un TissueLyzer (Qiagen, No. Cat.69989) y ARN se aisló utilizando el Mini kit RNeasy (Qiagen, Cat. No.74106) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La integridad de ARN se valoró con el Bioanalizador Agilent 2100 utilizando el Kit Agilent RNA 6000 Pico (Agilent Technologies, No. Cat. 5067-1513). Las muestras con baja calidad de ARN (RIN £ 5) se excluyeron del análisis. El ARN se trascribió inverso en ADNc utilizando el kit RT de alta capacidad ABI (Life Technologies, No. Cat. 4368814). Los niveles de expresión genética (es decir niveles de ARN) se valoraron por PCR en tiempo real, también referida como PCR cuantitativa o qPCR. Las reacciones PCR en tiempo real se ejecutaron en el Sistema BioMarkTM HD con mezcla maestra Fluidigm pre-amp (Life Technologies, No. Cat. 4391128) y reactivos (Fluidigm, No. Cat. BMK-M10-96.96) utilizando CD3s de humano (No. Cat. Hs00167894_ml), aE (No. Cat. Hs01025372_ml), b7 (No. Cat. Hs01565750_ml), y dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) (No. Cat. Hs99999905_ml) conjuntos cebadores (todos de Applied Biosystems [Life Technologies]) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La expresión de CD3e, aE, y b7 se normaliza a expresión de GAPDH utilizando el método 5CT previamente descrito.
Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 3A-3C (expresión genética b7) y 4A-C (expresión genética CD3s). En cada trazo de la gráfica de barras, la baja expresión genética (abajo del valor promedio para la población de pacientes del estudio Fase II) se muestra en la mitad izquierda del gráfico para placebo, 100 mg/dosis de etrolizumab, y 300 mg/dosis de etrolizumab y alta expresión genética (arriba del valor promedio para la población de pacientes del estudio Fase II) se muestra en la mitad derecha del gráfico para placebo, 100 mg/dosis de etrolizumab, y 300 mg/dosis de etrolizumab. Tanto para la expresión genética beta7 como la expresión CD3e en la referencia (también referida como selección, es decir antes de la primera administración de placebo o fármaco), valoramos el porcentaje de pacientes quienes han obtenido respuesta clínica (figuras 3C y 4C; definida como una disminución de 3 puntos y 30% de reducción de la referencia en MCS y disminución de > 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1), curación mucosal (figuras 3B y 4B; definida como una subpuntuación endoscópica de 0 o 1) o remisión (figuras 3A y 4A; definida como MCS < 2 sin subpuntuación individual > 1) en la semana 10 en el estudio clínico descrito arriba. Todos los valores reportados (números arriba de las barras) se corrigieron para respuesta de placebo en las poblaciones de beta7 alta y de beta7 baja (figura 3A-3C) y poblaciones de O?3e alta y de 0?3e baja (figura 4A-4C).
Como puede observarse en la figura 3A-3C, los pacientes con altos niveles de expresión genética beta7 en la referencia mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab como se midió por todos los tres puntos finales de (i) remisión (31% beta7 alta vs. 18% beta7 baja), (ii) curación mucosal (37% beta7 alta vs.1% beta7 baja), y (iii) respuesta clínica (29% beta7 alta vs. -3% beta7 baja). Este beneficio clínico enriquecido no se observó con 300 mg/dosis de etrolizumab para la curación mucosal (14% beta7 alta vs.16% beta7 baja) y puntos finales de remisión (7% beta7 alta vs.20% beta7 baja), pero se observó para el punto final de respuesta clínica (21% beta7 alta vs. -1% beta7 baja). De manera similar, los pacientes con altos niveles de expresión genética de CD3s en la referencia mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab (pero no 300 mg/dosis de etrolizumab) como se midió por todos los tres puntos finales de respuesta clínica (36% CD3c alta vs. -6% CD3s baja a 100 mg/dosis; 10% CD3s alta vs.9% CD3e baja a 300 mg/dosis), curación mucosal (36% CD3s alta vs.5% CD3£ baja a 100 mg/dosis; 12% CD3s alta vs.21% CD3E baja a 300 mg/dosis), y remisión (36% 0?3e alta vs.15% CD3e baja a 100 mg/dosis; 13% CD3e alta vs.15% 003e baja a 300 mg/dosis). De acuerdo con lo anterior, estos resultados demuestran que los niveles más altos que los medios de ya sea la expresión genética beta7 y/o expresión genética CD3s en biopsias intestinales de áreas inflamadas del colon, se asocian con beneficio clínico incrementado de tratamiento con etrolizumab, y este beneficio clínico es mayor cuando etrolizumab se administra a 100 mg/dosis. De esta manera, niveles más altos que los medios de ya sea la expresión genética beta7 y/o expresión genética CD3s en biopsias intestinales de áreas inflamadas del colon muestran potencial como biomarcadores predictivos para identificar pacientes con UC más propensos a beneficiarse de tratamiento con agente terapéuticos que dirigir la subunidad de integrina beta7, incluyendo etrolizumab.
En ciertos casos, son deseables métodos menos invasivos que obtener biopsias intestinales. De esta manera, buscamos determinar si el beneficio clínico enriquecido observado en pacientes tratados con etrolizumab quienes tuvieron niveles más altos que los medios de expresión genética beta7 de referencia en tejido de biopsia intestinal también podría observarse al valorar los niveles de expresión genética beta7 en muestras de sangre periférica entera.
En una prueba Fase I, hemos observado que los pacientes quienes expresaron altos niveles de beta7 en células CD3+ por análisis FACS parecieron responder mejor a tratamiento con etrolizumab (datos no mostrados) que pacientes quienes tuvieron bajos niveles de beta7 en células CD3+. En esa prueba, no hemos recolectado sangre periférica para análisis de ARN y De esta manera no podría analizar aquellas muestras para cualquier correlación entre niveles de ARN beta7 y niveles de proteína beta7 y respuesta a etrolizumab. De esta manera, antes de analizar las muestras del paciente de la prueba Fase II, buscamos determinar si niveles de expresión genética beta7 (niveles de ARN) correlacionados con niveles de expresión de proteína beta7 en células CD3+ y en otras poblaciones de células sanguíneas en muestras de pacientes con IBD no se reclutaron en la prueba Fase II y de sujetos control saludables.
Para los experimentos descritos abajo, se recolectó la sangre entera de acuerdo a procedimientos estándar; sangre para estudios de ARN se recolectó en tubos PAXgene de acuerdo al protocolo del fabricante. Para análisis FACS, se obtuvieron los anticuerpos de Becton Dickenson (ver Tabla 2). Las células de muestras de sangre periférica se incubaron con anticuerpos marcados de acuerdo a procedimientos estándar conocidos en la materia y se analizaron en una máquina FACSCalibur. La expresión Beta7 se cuantificó utilizando perlas Quantum PE-MESF (Bangs Laboratory, No. Cat. 827). También determinamos que la expresión beta7 por análisis FACS fue óptima cuando las muestras del paciente se enviaron y/o almacenaron durante la noche a temperatura ambiente antes de realizar los análisis FACS.
Tabla 2. Anticuerpos utilizados para análisis FACS.
Para qPCR, generamos ADNc utilizando el Kit de Síntesis de ADNc de Selección BioRad iScript (No. Cat.170-8897) de acuerdo al protocolo del fabricante y después se realizó qPCR utilizando ensayos ABI Taqman para integrina beta7, CD3épsilon, CD20 (No. Cat. Hs00544819_ml), CD45 (No. Cat. Hs04189704_ml) y GAPDH de acuerdo al protocolo del fabricante. La figura 5 muestra una gráfica que correlaciona estas mediciones de qPCR y análisis FACS. Como puede observarse en la figura 5, los niveles de ARN beta7 como se mide por qPCR no se correlacionaron con niveles de proteína beta7 en células T CD3+ o en células B CD19+. Sin embargo, los niveles de proteína beta7 en linfocitos se correlacionaron significativamente con niveles de ARN beta7 normalizado a los niveles del gen doméstico GAPDH o los niveles de ARN de CD45. Ver figura 5, cuadrados, correlaciones estadísticas (valores r y p Spearman indicados). De acuerdo con lo anterior, determinamos que la expresión genética beta7 (niveles de ARN) en sangre periférica (sangre entera recolectada en tubos PAXgene) podría detectarse fácilmente y cuantificarse por qPCR.
Después analizamos la expresión genética beta7 en la sangre periférica de pacientes tratados con etrolizumab de acuerdo al protocolo Fase II descrito arriba y buscamos asociaciones entre niveles de ARN beta7 en sangre periférica y mediciones de eficacia.
ARN total se aisló de tubos de sangre congelados PAXgene por aislamiento automático en un separador de partícula magnético KingFisher. Brevemente, los tubos se dejaron descongelar durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de la centrifugación y enjuague para recolectar bolitas de glóbulos blancos, las células se sometieron a lisis en tampón químico que contiene guanidinio. La extracción orgánica se realizó antes de agregar tampón químico de unión y perlas magnéticas en la preparación para la ejecución de KingFisher. El procedimiento se optimizó para retención de microARNs e incluyó una etapa de tratamiento con DNAse y limpieza antes de la elución de las perlas magnéticas. La pureza y cantidad de las muestras de ARN total se determinaron por lecturas de absorbencia a 260 y 280 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV. La integridad del ARN total se calificó por electroforesis microfluídica por Agilent Bioanalyzer 2100, utilizando el Ensayo Nano y el sistema de Caliper LabChip.
ARN total (hasta 2 pg) se transcribió inverso durante una hora en un volumen de reacción total de 20uL utilizando el Kit de Síntesis de ADNc de Alta Capacidad TaqMan*8 (Applied Biosystems [Life Technologies]) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las reacciones PCR en tiempo real rápidas se ejecutaron en un Sistema PCR en Tiempo Real Viia™ 7 (Applied Biosystems [Life Technologies]) utilizando conjuntos de cebador GAPDH y b7 de humano (Applied Biosystems [Life Technologies]) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La expresión Beta7 se normalizó a expresión de GAPDH.
Los resultados se muestran en las figuras 6A-6C. Los pacientes con altos niveles de expresión genética de sangre periférica beta7 en la referencia mostraron mayor respuesta corregida por placebo a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab para el punto final de curación mucosal (30% beta7 alta vs.3% beta7 baja) (figura 6B) y el punto final de remisión (42% beta7 alta vs.11% beta7 baja) (figura 6A). Los pacientes que expresan beta7 alta en el extremo de 100 mg/dosis de etrolizumab también mostraron una respuesta más alta a tratamiento con etrolizumab que los pacientes que expresan bajos niveles de beta7 para el punto final de respuesta clínica, pero estos resultados no se corrigieron por placebo (figura 6C). El beneficio clínico enriquecido observado en los pacientes con beta7 alta en el brazo de 100 mg/dosis no se observó con 300 mg/dosis de etrolizumab para la curación mucosal (figura 6B) y puntos finales de respuesta clínica (figura 6C), pero se observó para el punto final de remisión (figura 6A), aunque la magnitud de la diferencia entre pacientes con beta7 alta y pacientes con beta7 baja fue baja. De acuerdo con lo anterior, estos resultados demuestran que los niveles más altos que los medios de expresión genética beta7 en sangre periférica se asocian con beneficio clínico incrementado de tratamiento con etrolizumab, y este beneficio clínico es mayor cuando etrolizumab se administra a 100 mg/dosis. De esta manera, niveles más altos que los medios de expresión genética beta7 en sangre periférica muestra potencial como un biomarcador predictivo para identificar pacientes con IBD, tales como pacientes con UC y enfermedad de Crohn, más propensos a beneficiarse de tratamiento con agentes terapéuticos que dirigen la subunidad de integrinabeta7, incluyendo etrolizumab.
Racional para selección de integrina de biomarcador predictivo alfaE para enriquecimiento de eficacia en pacientes tratados con etrolizumab Etrolizumab se une a la integrina b7 y bloquea la unión a tanto MAdCAMl, que se expresa en células endoteliales mucosales, como cadherina-E, que se expresa en células epiteliales. La unión de linfocitos que expresan integrina aEb7 a cadherina-E puede ayudar a posicionar y retener células adyacentes al epitelio intestinal. Hacemos la hipótesis que la unión de aEb7:cadherina-E también puede ser importante en inflamación en proceso en UC y por lo tanto los pacientes con evidencia de linfocitos aEb7+ incrementados se beneficiarán de tratamiento con etrolizumab. De esta manera expandimos nuestros marcadores de diagnóstico predictivos para incluir aE en nuestros marcadores de trayectoria b7 para buscar eficacia incrementada en pacientes quienes pueden tener enfermedad fuertemente conducida por migración de linfocito y presencia en tejido de la enfermedad. De acuerdo con lo anterior, buscamos determinar si los niveles de integrina aE en biopsias y/o en sangre periférica fueron predictivos para respuesta a tratamiento con etrolizumab.
Las biopsias intestinales se recolectaron, colocaron en ARNposterior y procesaron como se describe arriba. Las biopsias adicionales se tomaron y colocaron en formalina y se almacenaron hasta envío. En la recepción, el segundo conjunto de muestras de biopsia se incrustó en bloques de parafina. Para los estudios descritos en esta sección, las biopsias intestinales ya sea se recolectaron durante la prueba Fase II descrita arriba o se obtuvieron de otras fuentes donde las muestras se recolectaron de pacientes que experimentan procedimientos de biopsia intestinal por razones no relacionadas con la prueba Fase II arriba descrita. Los bloques de parafina se procesaron en secciones de 4 mm y se colocaron en portaobjetos de vidrio. La coloración se realizó en un autocolorante Ventana Benchmark XT (Ventana Medical Systems; Tucson, AZ). El pretratamiento se hizo con el Acondicionador Celular 1 por el tiempo recomendado. El anticuerpo primario, anti-cxE (EPR4166 (2) monoclonal de conejo, No. Cat. abl29202, Abcam, Cambridge, MA), se utilizó a una concentración de 1.896 mg/ml y se incubó en portaobjetos por 60 minutos a 37°C. Esta etapa se siguió por incubación de los portaobjetos con Ventana Ultraview (Ventana Medical Systems; AZ). Ventana DAB y Hematoxilina II se utilizaron para detección cromogénica y contracoloración.
Como se muestra en la figura 7A-7G, inmunohistoquímica para o¡E demostró coloración de células redondas pequeñas que probablemente son linfocitos. Una mayoría de estas células estuvieron adyacentes a o asociadas con criptas celulares epiteliales en el colon (figura 7A, paneles izquierdos) y dentro del vello en el intestino delgado (figura 7A, paneles derechos). También observamos la asociación con epitelio de superficie (datos no mostrados). También se observó una subpoblación de células más grandes con coloración más difusa y podría representar células dendríticas. Enumeramos las células o¡E+ en secciones coloreadas de un panel de muestras de tejido de colon, íleo y ycyuno de pacientes sin IBD. Los autoconteos computarizados se utilizaron para enumerar las células OÍE+ en portaobjetos coloreados; el análisis se limitó a células que desplegaron simetría radial en el área mucosal de la sección de tejido. Los números incrementados de células OÍE+ por células totales se observaron en yeyuno e íleo en comparación con muestras de tejido colónico (figura 7B). Los números incrementados de células aE+ como un porcentaje de células totales también se observó en muestras de íleo y yeyuno de pacientes con CD (figura 7B). Finalmente, no observamos diferencia entre células aE+ como un porcentaje de células totales en muestras de tejido de pacientes con IBD en comparación con pacientes sin IBD. La expresión genética de OÍE normalizada con GAPDH también se realizó en muestras de colon sin IBD y UC, y colon con CD, íleo y yeyuno (figura 7C). De nuevo, la expresión genética incrementada de o¡E se observó en el intestino delgado y no se observaron diferencias entre muestras de tejido con IBD y sin IBD.
El intestino delgado es de interés particular en CD, ya que una mayoría (50-60%) de pacientes con CD tienen la enfermedad que incluye el íleo terminal. Los niveles más altos de tanto células OÍE+ como expresión genética OÍE en muestras de intestino delgado pueden indicar que estas células juegan un papel clave en patobiología CD y su abundancia relativa, de esta manera, puede servir como un marcador predictivo en pacientes con CD para tratamiento con etrolizumab. Las células alfaE+, junto con expresión genética alfaE, en la selección muestras de biopsia se consideraron como biomarcadores predictivos potenciales en el estudio Fase II de etrolizumab en UC (descrito arriba).
Las biopsias de tejido de selección fijas en formalina incrustadas en bloques de parafina de pacientes reclutados en el estudio Fase II se dividieron en secciones y colorearon por E por inmunohistoquímica y se contaron como se detalla arriba. La selección de biopsias en pacientes reclutados con muestras de tejido disponibles se utilizaron para establecer un valor promedio de células OÍE+ por corte celular total (figura 7D (en donde los puntos con puntos representan niveles de selección en pacientes tratados con etrolizumab quienes entraron en remisión, puntos en blanco representan pacientes quienes no alcanzaron remisión, y puntos negros que representan pacientes quienes recibieron placebo; línea punteada indica valor promedio; también se muestran TNF simple y respondedores inadecuados a TNF [TNF-IR]). La figura 7E muestra ejemplos de coloración aE en la selección de biopsias de pacientes reclutados en el estudio Fase II que tuvo niveles de células OÍE+ por células totales que estuvieron arriba (OÍE alta) y abajo (aE baja) del valor promedio. La distribución de expresión genética aE en la selección de biopsias de pacientes reclutados en el estudio Fase II se muestra en la figura 7F y la relación de las dos mediciones se muestra en la figura 7G.
El desempeño de aE según se determina por expresión genética e inmunohistoquímica utilizando biopsias intestinales de pacientes se muestran en las figuras 8A-8C y 8D-F, respectivamente. En estos experimentos, los pacientes no se estratificaron por estado de TNF (TNF-simple o TNF-IR). En cada trazo de la gráfica de barras, la baja expresión genética o números de células aE+ (abajo del valor promedio para la población de pacientes del estudio Fase II) se muestra en la mitad izquierda del gráfico para placebo, 100 mg/dosis de etrolizumab, y 300 mg/dosis de etrolizumab y alta expresión genética (arriba del valor promedio para la población de pacientes del estudio Fase II) se muestra en la mitad derecha del gráfico para placebo, 100 mg/dosis de etrolizumab, y 300 mg/dosis de etrolizumab. Se muestran los datos de todos los pacientes. Tanto para expresión genética aE como inmunohistoquímica en la referencia (también referida como selección, es decir antes de la primera administración de placebo o fármaco), valoramos el porcentaje de pacientes quienes han obtenido respuesta clínica (figura 8C y 8F; definida como una disminución de 3 puntos y 30% de reducción de la referencia en MCS y disminución de > 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1), curación mucosal (figura 8B y 8E; definida como una subpuntuación endoscópica de 0 o 1) o remisión (figura 8A y 8D; definida como MCS < 2 sin subpuntuación individual > 1) en la semana 10 en el estudio clínico descrito arriba. Todos los valores reportados (números arriba de las barras) representan número de pacientes alcanzaron este punto final (numerador) sobre el número de pacientes en cada grupo de dosificación que fueron parte del análisis (denominador).
Como puede observarse en la figura 8A-8C, los pacientes con altos niveles de expresión genética aE en la selección mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab según se mide por curación mucosal (19% aE alta vs. 13% aE baja), y remisión (38% aE alta vs. 13% aE baja). Este beneficio clínico enriquecido no se observó con 300 mg/dosis de etrolizumab. Los pacientes con altos niveles de células aE+ per células totales mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab según se mide por curación mucosal (figura 8E; 19% OÍE alta vs. -3% OÍE baja), y remisión (figura 8D; 50% aE alta vs.7% aE baja). En este experimento, solamente se enriqueció la remisión en pacientes a quienes se les dan 300 mg/dosis con altos niveles de células OÍE+ per células totales en la selección (figura 8D; 14% OÍE alta vs.9% OÍE baja).
Las figuras 9A-9F muestran resultados en pacientes con TFN simple. Los pacientes con TFN simple con altos niveles de expresión genética OÍE en la selección mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con 100 mg/dosis de etrolizumab como se midió por todos los tres puntos finales de respuesta clínica (28% aE alta vs.13% aE), curación mucosal (42% aE alta vs.17% aE), y remisión (67% aE alta vs.17% aE baja); solamente la remisión en enriqueció en pacientes a quienes se les dan 300 mg/dosis de etrolizumab (50% aE alta vs.20% aE baja a 300 mg/dosis) (figuras 9A-9C). Del mismo modo, los pacientes con TFN simple con altos niveles de células aE+ por células totales en la selección mostraron respuesta corregida con placebo más alta a tratamiento con etrolizumab según se mide por curación mucosal (figura 9E; 38% aE alta vs.25% aE en grupo de 100 mg/dosis y 46% aE alta vs.25% aE en grupo de 300 mg/dosis) y remisión (figura 9D; 67% aE alta vs.25% aE en grupo de 100 mg/dosis y 50% aE alta vs.25% aE en grupo de 300 mg/dosis).
Como se trata previamente, son deseables métodos menos invasivos que obtener biopsias intestinales. Los métodos para valorar niveles de expresión genética en sangre periférica son ejemplos de tales métodos menos invasivos. Ya que hemos examinado el beneficio clínico enriquecido en pacientes tratados con etrolizumab al valorar niveles de expresión genética beta7 en muestras de sangre periférica entera y beta7 pueden formarse en pares con tanto a4 como aE, después utilizaremos la selección y la expresión genética de sangre periférica del día 1 de aE para probar el enriquecimiento de respuesta y remisión. Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 10A-10F. En estos experimentos, los pacientes no se estratificaron por estado de TNF (TNF-simple o TNF-IR).
Como se muestra en la figura 10A, los pacientes con niveles más altos de expresión genética aE en sangre periférica en la selección mostraron mayor respuesta corregida por placebo a tratamiento con etrolizumab para el punto final de remisión (figura 10A; 29% aE alta vs.8% aE baja en el grupo de 100 mg/dosis, 19% aE alta vs.5% aE baja en el grupo de 300 mg/dosis). La expresión genética alfaE también se midió en sangre periférica del día 1 y se encontró que los pacientes ricos en aE en el grupo de 100 mg/dosis tienen remisión incrementada (figura 10D; 33% aE alta vs.13% OÍE baja) y curación ucosal (figura 10E; 27% OÍE alta vs.2% OÍE ba a).
Las figuras 11A-11F muestran los resultados de expresión genética de sangre periférica en la selección o el día 1 en pacientes con TFN simple. Los pacientes con TFN simple con altos niveles de expresión genética cxE de sangre periférica mostraron remisión corregida a placebo más alta a tratamiento con etrolizumab en la selección (figura 11A; 29% aE alta vs.8% E en grupo de 100 mg/dosis y 40% aE alta vs. 17% aE en grupo de 300 mg/dosis) y día 1 (figura 11D; 55% aE alta vs.20% aE).
A los pacientes reclutados en el estudio Fase II se les da la opción de reclutarse en un estudio de extensión abierto en el cual todos los pacientes recibieron 300 mg/dosis de etrolizumab cada cuatro semanas como se describe arriba. Los pacientes que no estuvieron en respuesta podrían entrar al estudio después de la terminación del punto en el tiempo de 10 semanas o en cualquier momento durante el seguimiento de seguridad. Como se muestra en la figura 12, 33 pacientes TNF-IR (14 en el extremo de 100 mg/dosis y 19 en el extremo de 300 mg/dosis) que recibieron fármaco activo en el estudio Fase II pero no tuvieron una respuesta a las 10 semanas se reclutaron en el estudio de extrusión abierto sin interrupción del régimen de dosificación. Estas pacientes se califican para remisión después de cuatro semanas (14-16 semanas después de la primer dosis) utilizando la puntuación Mayo parcial. La puntuación Mayo parcial es una puntuación de 9 puntos en la cual las subpuntuaciones Mayo se recolectan excepto la subpuntuación endoscópica. La remisión se define como una puntuación total de £2 puntos y la respuesta se define como una reducción en la puntuación Mayo parcial de referencia por 25% y ³2 puntos.
Los pacientes TNF-IR con altos niveles de expresión genética OÍE en biopsias intestinales en la selección que no tienen una respuesta en el punto final primario de 10 semanas, mostraron remisión más alta (figura 13A; 18% OÍE alta vs. 0% aE baja) y respuesta (figura 13B; 53% OÍE alta vs.8% aE baja) a tratamiento continuo. Los pacientes TNF-IR con altos niveles de células OÍE+ por células totales en la selección también mostraron remisión más alta (figura 13C; 22% aE alta vs.0% E baja) y respuesta (figura 13D; 56% aE alta vs.17% aE baja) a tratamiento adicional. Los pacientes TNF-IR con altos niveles de aE en sangre periférica mostraron respuesta más alta (figura 13F; 41% aE alta vs.15% aE baja).
De acuerdo con lo anterior, estos resultados demuestran que los niveles más altos que los medios de expresión genética E o células aE+ por células totales en biopsias intestinales de áreas inflamadas del colon así como niveles más altos que los medios de aE expresión genética en sangre periférica se asociaron con beneficio clínico incrementado de tratamiento con etrolizumab en pacientes, y este beneficio clínico fue mayor cuando etrolizumab se administró a 100 mg/dosis subcutáneamente cada cuatro semanas. De esta manera, los niveles más altos que los medios de expresión genética OÍE O células o¡E+ en biopsias intestinales de áreas inflamadas del colon o expresión genética aE en sangre periférica muestran potencial como biomarcadores predictivos para identificar pacientes con IBD, tales como pacientes con UC y enfermedad de Crohn, más propensos a beneficiarse de tratamiento con agentes terapéuticos que dirigen la subunidad de integrinabeta7, incluyendo etrolizumab.

Claims (50)

REIVINDICACIONES
1. Un método para predecir la respuesta de un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método: obtener una muestra biológica del paciente, medir el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen en la muestra, en donde el gen se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon, comparar el nivel de expresión de ARNm detectado en la muestra con un nivel de referencia, y predecir que el paciente responderá a la terapia cuando el nivel de expresión de ARNm se ha medido como elevado en comparación con el nivel de referencia y predecir que el paciente no responderá a la terapia cuando el nivel de expresión de ARNm se ha medido como bajo en comparación con el nivel de referencia.
2. Un método para predecir la sensibilidad de un paciente, con trastorno inflamatorio gastrointestinal, a un tratamiento con un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen seleccionado de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en una muestra biológica del paciente, en donde el nivel de expresión de ARNm elevado en comparación con un nivel de referencia identifica al paciente como uno que es propenso a responder al tratamiento con un antagonista de integrina beta7.
3. Un método para identificar a un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, como propenso a responder a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen en una muestra biológica del paciente, en donde el al menos un gen se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el nivel de expresión de ARNm medido en (a) con un nivel de referencia; y (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia.
4. Un método para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio gastrointestinal, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de expresión de ARNm de al menos un gen en una muestra biológica del paciente, en donde el al menos un gen se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el nivel de expresión de ARNm medido en (a) con un nivel de referencia,- (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia; y (d) administrar la terapia cuando el nivel de expresión de ARNm medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia, tratando así el trastorno inflamatorio gastrointestinal.
5. El método de la reivindicación 4, en donde 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el paciente es un humano.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el paciente es un paciente que responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR).
8. El método de la reivindicación 6, en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.
10. El método de la reivindicación 9, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión.
11. El método de la reivindicación 6, en donde la muestra biológica se selecciona de tejido intestinal y sangre entera periférica.
12. El método de la reivindicación 6, en donde el nivel de expresión de ARNm se mide por un método PCR.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el método PCR comprende qPCR.
14. El método de la reivindicación 6, en donde la medición comprende amplificar uno o más de ARNm de integrina beta7, ARNm de integrina alfaE, o ARNm de CD3épsilon y detectar el ARNm amplificado, midiendo así el nivel de ARNm amplificado.
15. El método de la reivindicación 6, en donde el nivel de referencia es un valor promedio.
16. Un método para tratar un trastorno inflamatorio gastrointestinal en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de integrina beta7, en donde se ha determinado que una muestra biológica obtenida del paciente expresa niveles elevados de expresión de ARNm de al menos un gen seleccionado de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon o en donde el paciente se ha seleccionado para tratamiento con base en niveles elevados de expresión de ARNm en la muestra biológica obtenida del paciente de al menos un gen seleccionado de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3epsilon.
17. El método de la reivindicación 16, en donde 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas.
18. El método de la reivindicación 17, en donde el paciente es un humano.
19. El método de la reivindicación 18, en donde el paciente es un paciente que responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR).
20. El método de la reivindicación 18, en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.
21. El método de la reivindicación 20, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.
22. El método de la reivindicación 18, en donde la muestra biológica se selecciona de biopsia y sangre entera periféric .
23. El método de la reivindicación 22, en donde el nivel de expresión de ARNm se mide por un método PCR.
24. El método de la reivindicación 23, en donde el método PCR comprende qPCR.
25. Un método para predecir la respuesta de un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método: obtener una muestra biológica del paciente, medir el número de células que expresan al menos una proteína seleccionada de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon, comparar el número de células de expresión medidas en la muestra con un nivel de referencia, y predecir que el paciente responderá a la terapia cuando el número de células que expresan la proteína se ha medido como elevado en comparación con el nivel de referencia y predecir que el paciente no responderá a la terapia cuando el número de células que expresan la proteína se ha medido como bajo en comparación con el nivel de referencia.
26. Un método para predecir la sensibilidad de un paciente, con trastorno inflamatorio gastrointestinal, a un tratamiento con un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método determinar el número de células que expresan al menos una proteína seleccionada de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon en una muestra biológica del paciente, en donde números elevados de células de expresión en comparación con un nivel de referencia identifican al paciente como uno que es propenso a responder al tratamiento con un antagonista de integrina beta7.
27. Un método para identificar a un paciente, que padece de un trastorno inflamatorio gastrointestinal, como propenso a responder a una terapia que comprende un antagonista de integrina beta7, comprendiendo el método: (a) medir el número de células que expresan al menos una proteína en una muestra biológica del paciente, en donde la al menos una proteína se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el número de células medidas en (a) con un nivel de referencia; y (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el número de células medidas en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia.
28. Un método para tratar a un paciente que tiene un trastorno inflamatorio gastrointestinal, comprendiendo el método: (a) medir el número de células que expresan al menos una proteína en una muestra biológica del paciente, en donde la al menos una proteína se selecciona de integrina beta7, integrina alfaE, y CD3épsilon; (b) comparar el número de células de expresión medidas en (a) con un nivel de referencia; (c) identificar al paciente como más propenso a responder a la terapia que comprende un antagonista de integrina beta7 cuando el número de células que expresan la proteína medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia; y (d) administrar la terapia cuando el número de células que expresan la proteína medido en (a) se encuentra por arriba del nivel de referencia, tratando así el trastorno inflamatorio gastrointestinal.
29. El método de la reivindicación 28, en donde 100 mg del antagonista de integrina beta7 se administran subcutáneamente una vez cada cuatro semanas.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en donde el paciente es un humano.
31. El método de la reivindicación 30, en donde el paciente es un paciente que responde inadecuadamente a TNF (TNF-IR).
32. El método de la reivindicación 30, en donde el trastorno inflamatorio gastrointestinal es una enfermedad inflamatoria intestinal.
33. El método de la reivindicación 32, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.
34. El método de la reivindicación 33, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerativa y la respuesta se selecciona de respuesta clínica, curación mucosal y remisión.
35. El método de la reivindicación 30, en donde la muestra biológica es tejido intestinal.
36. El método de la reivindicación 30, que comprende medir el número de células de expresión por un método inmunohistoquímico.
37. El método de la reivindicación 30, en donde la medición comprende poner en contacto la muestra con un agente que se une específicamente a la proteína de integrina beta7, proteína de integrina alfaE, o proteína CD3épsilon y detectar la cantidad de complejo formado, y medir así el número de células que expresan la proteína.
38. El método de la reivindicación 30, en donde el número de células de expresión en la muestra se divide entre el número total de células en la muestra.
39. El método de la reivindicación 30, en donde se determina el número de células de expresión en un campo de alta energía bajo un microscopio óptico.
40. El método de la reivindicación 30, en donde el nivel de referencia es un valor promedio.
41. El método de la reivindicación 10 o reivindicación 34, en donde la administración del antagonista de integrina beta7 da como resultado uno o más de lo siguiente: (1) una disminución de 3 puntos y 30% de reducción desde la línea basal en MCS y disminución > 1 punto en subpuntuación de sangrado rectal o puntuación de sangrado rectal absoluto de 0 o 1, (2) una subpuntuación endoscópica de 0 o 1, (3) MCS 2 sin subpuntuación individual > 1.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-41, en donde el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-beta7 monoclonal.
43. El método de la reivindicación 42, en donde el anticuerpo anti-beta7 se selecciona de un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado.
44. El método de la reivindicación 43, en donde el anticuerpo anti-beta7 es un fragmento de anticuerpo.
45. El método de la reivindicación 43, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende seis regiones hipervariables (HVRs), en donde: (i) HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos Al-All, en donde Al-All es RASESVDTYLH (SEC ID NO:l); RASESVDSLLH (SEC ID NO:7), RASESVDTLLH (SEC ID NO:8), O RASESVDDLLH (SEC ID NO:9) o una variante de la SEC ID N0s:l, 7, 8 o 9 (SEC ID NO:26) en donde el aminoácido A2 se selecciona del grupo que consiste de A, G, S, T, y V y/o el aminoácido A3 se selecciona del grupo que consiste de S, G, I, K, N, P, Q, R, y T, y/o A4 se selecciona del grupo que consiste de E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N, y R, y/o el aminoácido A5 se selecciona del grupo que consiste de S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, y V, y/o el aminoácido A6 se selecciona del grupo que consiste de V, R, I, A, G, K, L, M, y Q, y/o el aminoácido A7 se selecciona del grupo que consiste de D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, y T, y/o el aminoácido A8 se selecciona del grupo que consiste de D, G, N, E, T, P y S, y/o el aminoácido A9 se selecciona del grupo que consiste de L, Y, I y M, y/o el aminoácido A10 se selecciona del grupo que consiste de L, A, I, M, y V y/o el aminoácido All se selecciona del grupo que consiste de H, Y, F, y S; (ii) HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos B1-B8, en donde B1-B8 es KYASQSIS (SEC ID NO:2), RYASQSIS (SEC ID NO:20), o XaaYASQSIS (SEC ID NO:21, donde Xaa representa cualquier aminoácido) o una variante de las SEC ID NOs:2, 20 o 21 (SEC ID NO:27) en donde el aminoácido B1 se selecciona del grupo que consiste de K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y y Xaa (en donde Xaa representa cualquier aminoácido), y/o el aminoácido B4 se selección» del grupo que consiste de S y D, y/o el aminoácido B5 se selecciona del grupo que consiste de Q y S, y/o el aminoácido B6 se selecciona del grupo que consiste de S, D, L, y R, y/o el aminoácido B7 se selecciona del grupo que consiste de I, V, E, y K; (iii) HVR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos C1-C9, en donde C1-C9 es QQGNSLPNT (SEC ID NO:3) o una variante de la SEC ID NO:3 (SEC ID NO:28) en donde el aminoácido C8 se selecciona del grupo que consiste de N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I L, y M; (iv) HVR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos D1-D10 en donde D1-D10 es GFFITNNYWG (SEC ID N0:4); (v) HVR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos E1-E17 en donde E1-E17 es GYISYSGSTSYNPSLKS (SEC ID NO:5), o una variante de la SEC ID NO:5 (SEC ID NO:29) en donde el aminoácido E2 se selecciona del grupo que consiste de Y, F, V, y D, y/o el aminoácido E6 se selecciona del grupo que consiste de S y G, y/o el aminoácido E10 se selecciona del grupo que consiste de S y Y, y/o el aminoácido E12 se selecciona del grupo que consiste de N, T, A, y D, y/o el aminoácido 13 se selecciona del grupo que consiste de P, H, D, y A, y/o el aminoácido E15 se selecciona del grupo que consiste de L y V, y/o el aminoácido E17 se selecciona del grupo que consiste de S y G; y (vi) HVR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos F2-F11 en donde F2-F11 es MTGSSGYFDF (SEC ID NO:6) o RTGSSGYFDF (SEC ID NO:19); o comprende la secuencia de aminoácidos Fl-Fll, en donde Fl-Fll es AMTGSSGYFDF (SEC ID NO:16), ARTGSSGYFDF (SEC ID NO:17)f o AQTGSSGYFDF (SEC ID NO:18), o una variante de la SEC ID NOs:6, 16, 17, 18, o 19 (SEC ID NO:30) en donde el aminoácido F2 es R, M, A, E, G, Q, S, y/o el aminoácido Fll se selecciona del grupo que consiste de F y Y.
46. El método de la reivindicación 45, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende tres secuencias de región hipervariable de cadena pesada (HVR-H1-H3) y tres secuencias de región hipervariable de cadena ligera (HVR-L1-L3), en donde: (i) HVR-L1 comprende SEC ID NO:7, SEC ID NO:8 o SEC ID NO:9; (ii) HVR-L2 comprende SEC ID NO:2; (iii) HVR-L3 comprende SEC ID NO:3; (iv) HVR-H1 comprende SEC ID NO:4; (v) HVR-H2 comprende SEC ID NO:5; y (vi) HVR-H3 comprende SEC ID NO:6 o SEC ID NO:16 o SEC ID NO:17 o SEC ID NO:19.
47. El método de la reivindicación 46, en donde el anticuerpo anti-beta7 comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:24 y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:31.
48. El método de la reivindicación 47, en donde el anticuerpo anti-beta7 es etrolizumab.
49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-41, en donde el antagonista de integrina beta7 es un anticuerpo anti-alfa4/beta7 monoclonal.
50. El método de la reivindicación 49, en donde el anticuerpo anti-alfa4/beta7 se selecciona de vedolizumab y AMG 181.
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