MX2014012651A - Anticuerpos humanos y secuencias de unión específicas de los mismos para su uso en apoplejía e isquemia o condiciones isquémicas. - Google Patents

Abstract

Se proveen miembros de unión específicos, en particular anticuerpos humanos, en particular anticuerpos recombinantes, y fragmentos de los mismos, los cuales son capaces de unirse a y reconocer neuronas en el SNC y de inducir respuestas en las neuronas del SNC; los anticuerpos son útiles en el diagnóstico y tratamiento de condiciones asociadas con daño, lesión o degeneración nerviosa y enfermedad neurodegenerativa, y en particular en el tratamiento o alivio de apoplejía o isquemia cerebral; los anticuerpos, regiones variables o secuencias del dominio de CDR de los mismos, y fragmentos de los mismos de la invención, pueden usarse también en terapia en combinación con quimioterapéuticos, inmunomoduladores o agentes neuroactivos y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos; los anticuerpos o fragmentos activos de los mismos pueden usarse en terapia para apoplejía o isquemia cerebral solos o en combinación con trombolíticos tales como TPA; los anticuerpos son ejemplificados por los anticuerpos lgM12 e lgM42, cuyas secuencias se proveen en la presente.

Description

ANTICUERPOS HUMANOS Y SECUENCIAS DE UNIÓN ESPECÍFICAS DE LOS MISMOS PARA SU USO EN APOPLEJÍA E ISQUEMIA O CONDICIONES ISQUÉMICAS DECLARACIÓN DE APOYO GUBERNAMENTAL La invención descrita en la presente fue apoyada en su totalidad o en parte por los National Institutes of Health (concesión Nos. R01 NS 24180, R01 NS 32129, R01 CA104996, R01 CA096859), y la National Múltiple Sclerosis Society (concesión No. CA 1011 A8-3) El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, en particular anticuerpos naturales humanos, anticuerpos recombinantes derivados de los mismos y fragmentos de los mismos, los cuales son capaces de unirse a y reconocer neuronas en el SNC y de inducir respuestas en las neuronas del SNC. Estos anticuerpos son útiles en el diagnóstico y el tratamiento de condiciones asociadas con daño, lesión o degeneración nerviosa, enfermedad neurodegenerativa, lesión o daño nervioso crónico y lesión o daño nervioso repentino. Los anticuerpos, regiones variables o secuencias de los dominios de CDR de los mismos, y fragmentos de los mismos de la presente invención, pueden usarse tambien en terapia en combinación con quimioterapéuticos, inmunomoduladores o agentes neuroactivos y/o con otros anticuerpos o fragmentos de los mismos. Esta invención se refiere en particular a métodos para aliviar o tratar apoplejía o isquemia, en particular isquemia cerebral, y agentes, construcciones y composiciones asociados para su uso en apoplejía o isquemia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La neuro-regeneración se refiere al rebrote o la reparación de tejidos, células o productos de células nerviosos. Dichos mecanismos pueden incluir remielinización, generación de nuevas neuronas, glía, axones, mielina o sinapsis. La neuro-regeneración difiere entre el sistema nervioso periférico (SNP) y el sistema nervioso central (SNC) por los mecanismos funcionales implicados en y el grado y la velocidad de, la regeneración.

La regeneración del axón en el sistema nervioso central (SNC) del mamífero maduro es muy limitada después de la lesión. Por consiguiente, persisten déficits funcionales después de lesión de médula espinal (SCI), lesión traumática del cerebro, apoplejía y condiciones relacionadas que implican desconexión axonal. Esta situación difiere de aquella en el sistema nervioso periférico (SNP) de los mamíferos, en donde puede ocurrir recuperación funcional sustancial y regeneración del axón a larga distancia en el adulto. Las moleculas extracelulares y la capacidad de crecimiento intrínseca de la neurona, influyen sobre el éxito regenerativo.

Los axones del sistema nervioso central (SNC) no se regeneran espontáneamente después de la lesión en los mamíferos adultos. En contraste, los axones del sistema nervioso periférico (SNP) se regeneran fácilmente, permitiendo la recuperación de la función después del daño del nervio periférico. Aguayo y colaboradores demostraron que por lo menos algunas neuronas del SNC maduras retienen la capacidad para regenerarse cuando son provistas con un injerto de nervio periférico permisivo (Richardson PM, McGuinness UM, Aguayo AJ (1980) Nature 284: 264-265; Richardson PM, Issa VM, Aguayo AJ (1984) J Neurocytol 13: 165-182; David S, Aguayo AJ (1981) Science 214: 931-933; Benfcy M, Aguayo AJ (1982) Nature 296: 150-152). Este trabajo sugirió que el ambiente del SNP es estimulador y/o que el ambiente del SNC es inhibidor para el crecimiento del axón. Estudios subsiguientes identificaron factores que promueven el crecimiento en el SNP y factores que inhiben el crecimiento en el SNC. Los inhibidores de la regeneración incluyen proteínas específicas en la mielina del SNC y moléculas asociadas con la cicatriz astroglial. Además, la depuración más lenta de restos en el SNC respecto al SNP puede impedir el rebrote axonal. Un entendimiento de los factores que influyen sobre el crecimiento del axón es crítico para el desarrollo de terapéuticas para promover la regeneración del SNC.

Despues de la lesión del nervio periférico, los axones se regeneran rápidamente. La porción distal del axón, la cual está desconectada del cuerpo celular, sufre degeneración Walleriana. Este proceso activo da como resultado la fragmentación y desintegración del axón. Los restos son removidos por las células gliales, predominantemente los macrófagos. Los axones proximales pueden regenerarse entonces y volver a inervar sus objetivos, permitiendo la recuperación de la función.

Las dos clases principales de inhibidores de la regeneración del SNC son los inhibidores asociados con la mielina (MAIs) y los proteoglucanos de sulfato de condroitina (CSPGs). Estas moléculas limitan la regeneración del axón, e interfiriendo con su función, se logra cierto grado de crecimiento del SNC en el adulto. Los factores autónomos de células son también determinantes importantes de la falla de la regeneración del SNC. Las neuronas del SNC no sobrerregulan los genes asociados con el crecimiento al mismo grado que las neuronas del SNP. Por consiguiente, su capacidad para regenerarse es limitada incluso en ausencia de inhibidores. El aumento de la capacidad de crecimiento intrínseca de las neuronas permite la regeneración modesta del axón dentro del SNC (Bomze HM et al (2001) Nat Neurosci 4: 38-43; Neumann S, Woolf CJ (1999) Neuron 23: 83-91).

Los MAIs son proteínas expresadas por los oligodendrocitos como componentes de la mielina del SNC. Los MAIs deterioran el brote de las neuritas in vitro, y se piensa que limitan el crecimiento del axón in vivo después del daño del SNC. Los MAIs incluyen Nogo-A (Chen MS et al (2000) Nature 403: 434-439; GrandPre T et al (2000) Nature 403: 439-44), glucoproteína asociada con la mielina (MAG) (McKerracher L et al (1994) Neuron 13: 805-811), glucoproteína de la mielina de los oligodendrocitos (OMgp) (Kottis V et al (2002) J Neurochem 82: 1566-1569), efrin-B3 (Benson MD et al (2005) Proc Nat Acad Sci USA 102: 10694-10699) y Semaforina 4D (Sema4D) (Moreau-Fauvarque C et al (2003) J Neurosci 23: 9229-9239). Tres de estos (Nogo-A, MAG y OMgp) interactúan con un receptor 1 de Nogo-66 neuronal (NgR1) para limitar el crecimiento del axón. Estos tres ligandos estructuralmente no relacionados muestran tambien afinidad por un segundo receptor inhibidor del crecimiento del axón, el receptor B pareado tipo inmunoglobulina (PirB) (Atwal JK et al (2008) Science 322: 967-970).

Se han identificado varias moléculas de reconocimiento que actúan como señales moleculares que sufren promoción y/o inhibición del crecimiento de las neuritas. Entre las moléculas de reconocimiento que promueven el brote de las neuritas, la molécula de adhesión celular neural L1 desempeña una función prominente en la medición del brote de las neuritas (Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences 2: 497-507). El brote de las neuritas dependiente de L1 es mediado por interacción homofílica. L1 mejora el brote de las neuritas en las neuritas que expresan L1 y las células de Schwann y los fibroblastos transfectados con L1 (Bixby et al (1982) Proc Nati Acad. Sci. U.S.A. 84: 2555-2559; Chang et al (1987) J Cell Biol 104: 355-362; Lagenaur etal (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84: 7753-7757; Seilheimer et al (1988) J Cell Biol 107: 341-351; Kadmon ef a/ (1990) J Cell Biol 110: 193-208; Williams et al (1992) J Cell Biol 119: 883-892).

Las lesiones del sistema nervioso afectan a más de 90,000 personas cada año, y un número mucho mayor cuando eventos cerebrovasculares tales como la apoplejía están incluidos. Se estima que las lesiones de la medula espinal solas afectan a 10,000 personas cada año. Como resultado de esta alta incidencia de lesiones neurológicas, la regeneración y reparación nerviosa, un subcampo del diseño de tejido neural, está llegando a ser un campo de rápido crecimiento dedicado al descubrimiento de nuevas formas de recuperar la funcionalidad nerviosa después de la lesión. El sistema nervioso se divide en dos partes: el sistema nervioso central, el cual consiste del cerebro y la médula espinal, y el sistema nervioso periférico, el cual consiste de los nervios craneales y espinales junto con sus ganglios asociados. Mientras que el sistema nervioso periférico tiene una capacidad intrínseca de reparación y regeneración, el sistema nervioso central está, comparablemente y en su mayor parte, restringido en su capacidad para autorepararse y de mostrar regeneración. No existe actualmente tratamiento aprobado y aceptado para recuperar la función nerviosa del humano después de la lesión al sistema nervioso central.

La protección y reparación del axón después de la lesión de la médula espinal (SCI) mantiene gran potencial como una estrategia efectiva para prevenir la pérdida de neuronas motoras y la discapacitación permanente. Se ha logrado protección de las neuronas usando factores tróficos elegidos como objetivo para prevenir el daño y promover la reparación de los axones despues de la lesión. Estas moléculas se identificaron predominantemente usando estrategias de selección basadas en sistemas in vitro que se enfocaron en la focalización de factores neurotróficos específicos de pequeña molécula. Mientras que estas moléculas demostraron resultados neuroprotectores en modelos preclínicos, los resultados de las pruebas clínicas han sido menos favorables.

Los anticuerpos monoclonales autorreactivos naturales han demostrado funciones biológicas benéficas en las células del SNC usando modelos múltiples de lesión y enfermedad. Se ha demostrado in vivo la promoción mediada por anticuerpos, de la supervivencia de las neuronas, la regeneración del axón y la recuperación funcional usando la IgM monoclonal de ratón, IN-1 (Bregman BS et al ( 1995) Nature 378(6556): 498-501; Caroni P, Schwab ME (1988) Neuron 1(1): 85-96). Se obtuvieron resultados similares usando la inmunización del homogeneizado de la médula espinal (SCH) antes del daño del SNC (Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L (2003) Neurobiol Dis 12(1): 1-10; Huang DW et al ( 1999) Neuron 24(3): 639-647).

La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria crónica, con frecuencia progresiva, del sistema nervioso central (SNC) caracterizada patológicamente por desmielinización primaria, usualmente sin lesión axonal inicial. La etiología y patogénesis de la MS se desconocen. Varias características inmunológicas de la MS, y su asociación moderada con ciertos alelos del complejo de histocompatibilidad mayor, han acelerado la especulación de que la MS es una enfermedad mediada por el sistema inmune. Una hipótesis autoinmune es apoyada por el modelo de encefalomielitis autoinmune (alergica) experimental (EAE), en donde la inyección de ciertos componentes de la mielina en animales genéticamente susceptibles lleva a desmielinización del SNC mediada por células T. Sin embargo, autoantígenos específicos y células T patógenas reactivas a la mielina no se han identificado definitivamente en el SNC de los pacientes con MS, ni la MS está asociada con otras enfermedades autoinmunes. Una hipótesis alternativa, basada en datos epidemiológicos, es que un factor ambiental, quizá un virus no identificado, precipita una respuesta inflamatoria en el SNC, lo cual lleva a la destrucción directa o indirecta (“circunstante”) de la mielina, potencialmente con un componente autoinmune inducido. Esta hipótesis es apoyada por la evidencia de que varias infecciones virales de ocurrencia natural, tanto en humanos como animales, pueden causar desmielinización. Un modelo viral experimental usado comúnmente es inducido por el virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (TMEV) (Dal Canto, M. C. y Lipton, H. L, Am. J. Path., 88: 497-500 (1977)).

En el caso de la MS, la desmielinización da como resultado finalmente la muerte de la célula nerviosa. Sin embargo, la muerte del axón después de la desmielinización no es inmediata. Si se proveen células o moléculas de soporte apropiadas, el sistema nervioso tiene una capacidad significativa de repararse. La protección de los axones del SNC promete ser una estrategia efectiva para limitar la pérdida de axones sobrevivientes y de prevenir la discapacitación permanente. La neuroprotección puede lograrse modulando el ambiente inflamatorio potencialmente neurotóxico en las lesiones. Los reactivos diseñados para limitar la excitotoxicidad, inhibir el óxido nítrico o bloquear los canales de iones, están bajo estudio como metodos para proteger a los axones en peligro (Pitt, D., P. Werner y C. S. Raine (2000) Nat Med 6: 67-70; Okuda, Y et al (1997) Journal of Neuroimmunology 73: 107-116; Waxman, S. G. (2002) J Rehabil Res Dev 39: 233-242). Muchos de estos reactivos son pequeñas moléculas con toxicidad demostrada y actúan sistémicamente en todas las células.

La isquemia es una restricción en el riego sanguíneo hacia los tejidos, causando un déficit de oxígeno y glucosa necesarios para el metabolismo celular (para mantener el tejido vivo). La isquemia es causada generalmente por problemas con los vasos sanguíneos, con daño resultante a o disfunción del tejido. Se refiere también como anemia local en una parte dada de un cuerpo que resulta a veces de congestión (tal como vasoconstricción, trombosis o embolia).

La hipoxia es una condición en la cual el cuerpo como un todo o una región del cuerpo (hipoxia del tejido, o menos comúnmente hipoxia regional) es privado del suministro adecuado de oxígeno. Las variaciones en las concentraciones del oxígeno arterial pueden ser parte de la fisiología normal, por ejemplo, durante el ejercicio físico enérgico. Un desajuste entre el suministro de oxígeno y su demanda al nivel celular, puede dar como resultado una condición hipóxica. La hipoxia isquémica ocurre cuando existe un flujo sanguíneo disminuido y puede ocurrir, por ejemplo, en insuficiencia cardiaca y choque vasodilatador. La hipoxia cerebral ocurre cuando no existe suficiente oxígeno que llega al cerebro. El cerebro necesita un suministro constante de oxígeno y nutrientes para funcionar.

En la hipoxia cerebral, a veces sólo el suministro de oxígeno es interrumpido. Este puede ser causado por inhalación de humo, envenenamiento por monóxido de carbono, asfixia, enfermedades que previenen el movimiento de los músculos respiratorios, altas altitudes, presión sobre la tráquea y estrangulación. En otros casos, se detiene o se interrumpe el suministro de oxígeno y nutrientes, tal como el paro cardiaco, arritmia cardiaca, complicaciones de la anestesia general, ahogamiento, sobredosis de fármacos, lesiones a un recien nacido durante o después del nacimiento, tal como en parálisis cerebral, apoplejía y presión sanguínea muy baja.

La isquemia cerebral es flujo sanguíneo insuficiente hacia el cerebro, y puede ser aguda o crónica. La apoplejía isquémica aguda es una emergencia neurológica que puede ser reversible si se trata rápidamente. La isquemia crónica del cerebro puede dar como resultado una forma de demencia denominada demencia vascular. Un breve episodio de isquemia que afecta al cerebro se denomina un ataque isquémico transitorio (TIA), referido con frecuencia como un mini-apoplejía.

Una apoplejía, conocida también como un accidente cerebrovascular (CVA), es la pérdida rápida de las funciones del cerebro debida a alteración en el riego sanguíneo hacia el cerebro. Esto puede deberse a isquemia (falta de flujo sanguíneo) causada por bloqueo (trombosis, embolia arterial) o en una hemorragia (perdida de sangre). La isquemia del cerebro, conocida también como isquemia cerebral, es una condición en la cual existe flujo sanguíneo insuficiente hacia el cerebro para satisfacer la demanda metabólica, y es un tipo de apoplejía junto con hemorragia subaraenoidea y hemorragia intracerebral. La isquemia puede ser isquemia focal, la cual está confinada a una región específica del cerebro, o isquemia global, la cual abarca amplias áreas de tejido del cerebro. La apoplejía es la causa principal de discapacitación a largo plazo en los Estados Unidos. Cada año, cerca de 800,000 personas sufren de una apoplejía. Después de la lesión isquémica, la discapacitación asociada con déficits clínicos se debe principalmente a disfunción de las neuronas. La falta de recuperación funcional se atribuye en parte a la restricción de la regeneración y la neuroplasticidad (Walmslcy, A. R. y Mir, A. K. (2007) Current pharmaceutical design 13: 2470-2484). La apoplejía puede dar como resultado una función motora alterada tal como una discapacitación para mover una o más extremidades en un lado del cuerpo, efectos cognitivos tales como discapacitación para entender o formular el lenguaje, u otros déficits que incluyen efectos visuales tales como una discapacitación para ver un lado del campo visual. No existen actualmente tratamientos efectivos para prevenir o invertir los déficits neurológicos relacionados con la apoplejía.

Una apoplejía isquémica se trata ocasionalmente en un hospital con trombólisis (conocida también como un “destructor de coágulos”), y algunas apoplejías hemorrágicas se benefician de la neurocirugia. La prevención de la recidiva puede implicar la administración de fármacos antiplaquetarios tales como la aspirina y el dipiridamol, el control y la reducción de la hipertensión, y el uso de estatinas. Los pacientes seleccionados pueden beneficiarse de la endarterectomía de la carótida y el uso de anticoagulantes. La terapia intervencional de la isquemia cerebral continúa estando limitada a la trombólisis enzimática mediante el uso del activador de plasminógeno tisular recombinante rtPA (Brott, T. G., et al (1992) Stroke 23: 632-640; Halcy, E. C., et al ( 1992) Stroke 23: 641-645; Group, T. N. (1995) New England J Med 333: 1581-1587), y a la remoción intervencional del coágulo sanguíneo por medio de cateterización directa (Gobin YP et al (2004) Stroke 35: 2848-2854). Sin embargo, el rtPA tiene una ventana terapeutica corta de 3 horas, e incidencia incrementada de isquemia cerebral hemorrágica si se infunde más allá del marco de tiempo de 3 horas (Clark, WM et al (1999) JAMA 282: 2019-2026; Hacke W ef al (2008) New England J Med 359: 1317-1329).

Se han identificado autoanticuerpos monoclonales humanos que exhiben actividad en el sistema nervioso central, y que estuvieron particularmente asociados con la estimulación de la remielinización. Sería deseable desarrollar anticuerpos monoclonales humanos con actividad en el SNC, en particular anticuerpos recombinantes con estas actividades, y con capacidad para promover la regeneración neural y/o para proteger a las neuronas de la enfermedad, lesión, daño y/o muerte, en particular en casos de apoplejía o isquemia cerebral, o en donde el flujo de oxígeno o sangre hacia el cerebro o el SNC es privado a afectado, ya sea agudamente o crónicamente. En particular, sería deseable el uso y la aplicación de anticuerpos monoclonales humanos, con capacidad para acceder el SNC y tratar, prevenir o aliviar la isquemia cerebral o la apoplejía. Es hacia el logro de este objetivo, que la presente invención está dirigida.

La cita de referencias en la presente no debe considerarse como una admisión de que dicha teenica es previa a la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a agentes neuromoduladores con eficacia particular en el SNC, cuyos agentes comprenden un material seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo del subtipo IgM, fragmentos activos de los mismos, monómeros de los mismos, agonistas de los mismos y combinaciones de los mismos. Los agentes neuromoduladores o anticuerpos de la invención tienen una o más de las siguientes características: protegen y/o estabilizan a las neuronas; eligen como objetivo sitios en el SNC o daño, compromiso o lesión de las células nerviosas; reducen o bloquean la muerte celular, por ejemplo, muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno. En un aspecto particular de la presente invención, los agentes, en particular los anticuerpos monoclonales que se unen a neuronas, son efectivos y tienen aplicación y uso en el tratamiento y alivio de apoplejía e isquemia, en particular isquemia cerebral, y en condiciones en donde la isquemia o la hipoxia de las celulas nerviosas o el cerebro está implicada o ha ocurrido.

La invención provee anticuerpos monoclonales que se unen a neuronas con capacidad para promover la extensión de las neuritas, actuar en la neuro-regeneración, y/o proteger a las neuronas del daño y para propósitos de diagnóstico y terapéuticos en el sistema nervioso central. Los presentes estudios demuestran que cuando los anticuerpos monoclonales que se unen a neuronas, en particular el anticuerpo lgM12 rHlgM12, se administran a animales después de apoplejía (en este caso un modelo animal para inducción de apoplejía isquémica), dan como resultado una mejora clara de la función de los animales y protegen la integridad del tejido.

En particular, se proveen anticuerpos recombinantes específicos, en donde dichos anticuerpos reconocen y son capaces de unirse a neuronas, incluyendo neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, células granulares cerebelares y células ganglionares retínales, y los cuales eligen como objetivo y median neuronas y células neurales en el caso y tras de una apoplejía, condición isquémica o isquemia o hipoxia en células nerviosas o la microglia. Se proveen en la presente anticuerpos recombinantes completamente humanos. Los anticuerpos de la presente invención tienen uso terapéutico y de diagnóstico en condiciones o enfermedades asociadas con compromiso, daño o lesión nerviosa.

En un aspecto general, la presente invención provee anticuerpos dirigidos contra y capaces de unirse a uno o más epítopes en neuronas, que incluyen neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, células granulares cerebelares y células ganglionares retínales. En un amplio aspecto, la presente invención provee un miembro de unión específico aislado, en particular un anticuerpo o fragmento del mismo, que incluye un anticuerpo humano recombinante, el cual reconoce, se une y/o elige como objetivo neuronas. La invención provee un anticuerpo, en particular un anticuerpo humano, en particular un anticuerpo de IgM, el cual se une específicamente a neuronas y protege a las neuronas de la muerte celular, y el cual no promueve la remielinización. El anticuerpo de la invención tiene uso en el tratamiento o la mejora de enfermedades o condiciones en mamíferos, en donde los nervios están comprometidos, lesionados o dañados, o están en riesgo de los mismos, incluyendo en lesión de médula espinal (SCI), lesión traumática del cerebro (TBI), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, anoxia prenatal/isquemia perinatal, parálisis cerebral, encefalopatía, mielopatía, o enfermedades de neuronas motoras, y en particular en la protección, supervivencia o mantenimiento de neuronas y capacidad neurológica en estas enfermedades.

En un aspecto particular, el anticuerpo de la invención o las composiciones del mismo tienen uso y aplicación en apoplejía y en isquemia cerebral. En un aspecto particular, los anticuerpos o composiciones de la invención tienen uso en condiciones en las cuales existe flujo sanguíneo y/u oxígeno insuficientes hacia el cerebro para satisfacer la demanda metabólica, o en donde existe lesión traumática al cerebro que da como resultado muerte o lesión o riesgo de muerte o lesión de neuronas y células asociadas. En un aspecto particular, la presente invención provee un anticuerpo o fragmento del mismo, el cual es el anticuerpo 12 o 42, en particular lgM12 o lgM42 recombinante o derivado del suero.

En un aspecto de la invención, se provee un anticuerpo que se une a neuronas sintético o recombinante que comprende las secuencias de CDR de región variable expuestas en las figuras 5 y/o 6. El anticuerpo 12 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5. El anticuerpo 42 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), como se exponen en la figura 6. Por consiguiente, los anticuerpos recombinantes que se basan en las CDRs de los anticuerpos identificados en la presente, serán útiles para elegir como objetivo y proteger a las neuronas, en particular las neuronas susceptibles, comprometidas, dañadas o lesionadas en enfermedades o en cánceres.

La invención provee de esta manera anticuerpos de IgM humanos aislados o fragmentos de los mismos, los cuales se unen específicamente a las neuronas y protegen a las neuronas de la muerte celular, y los cuales no promueven la remielinización, en donde el anticuerpo o fragmento comprende: (a) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33) y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5; o (b) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), como se exponen en la figura 6, para su uso en el tratamiento o la mejora de enfermedades o condiciones en mamíferos, en donde nervios están comprometidos, lesionados o dañados o están en riesgo de esto mismo.

En otro aspecto particular, el anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 12 o 42 como se expone en la figura 5 y/o la figura 6. El anticuerpo recombinante lgM12 de la presente invención comprende la secuencia de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 11) como se expone en la figura 5. El anticuerpo recombinante lgM42 de la presente invención comprende la secuencia de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 17) y la secuencia de cadena ligera (SEQ ID NO: 27) como se expone en la figura 6. En un aspecto particular de la invención, los anticuerpos recombinantes son anticuerpos recombinantes completamente humanos, que comprenden la región variable de cadena pesada de humano, la región constante y la cadena J de humano. Se proveen en la presente anticuerpos de lgM12 recombinantes completamente humanos que comprenden la cadena pesada de inmunoglobulina humana que comprende la región variable (SEQ ID NO: 1), o las CDRs de la misma, una región constante de humano, en particular una secuencia kappa (SEQ ID NO: 3, 5, 7 y 9) y la cadena J de humano (SEQ ID NO: 15), como se exponen en la figura 5.

En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo aislado o fragmento del mismo capaz de unirse a un antígeno, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio que se une a polipeptidos que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en la presente y en la figura 6. La invención provee un anticuerpo humano aislado o fragmento del mismo capaz de unirse a neuronas, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 17), o las CDRs de la misma, y la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 27), o las CDRS de la misma, o que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en la presente y en la figura 6.

En otro aspecto, la presente invención provee un anticuerpo aislado completamente humano o fragmento del mismo capaz de unirse a un antígeno, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende un dominio que se une a polipeptidos que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en la presente y en la figura 5. La invención provee un anticuerpo aislado completamente humano o fragmento del mismo capaz de unirse a neuronas, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 1), o las CDRs de la misma, y la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 11), o las CDRs de la misma, o que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en la presente y en la figura 5. La invención provee en particular un anticuerpo de IgM aislado de humano o fragmento activo del mismo, que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31 ), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5. En un aspecto particular, la invención provee un anticuerpo de IgM recombinante aislado completamente humano o fragmento activo del mismo, que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), una región constante de humano y una secuencia de cadena J de humano como se expone en SEQ ID NO: 15.

En otros aspectos, la invención provee un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un polipeptido o anticuerpo que se une a neuronas como se definió anteriormente, y métodos para preparar los polipéptidos o anticuerpos de la invención, que comprenden expresar dichos ácidos nucleicos bajo condiciones para producir la expresión de dicho polipéptido o anticuerpo, y recuperar el polipéptido o anticuerpo. En dicho aspecto, se provee un ácido nucleico que codifica para una secuencia de región variable del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos como se exponen en las figuras 5 o 6, o se provee un anticuerpo que tiene secuencias del dominio de CDR como se expone en las figuras 5 o 6. En un aspecto, se provee un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de la figura 5 o 6. En otro aspecto, se provee un ácido nucleico que codifica para la región variable VL de cadena ligera o la región variable VH de cadena pesada como se expone en la figura 5 o 6. La presente invención se refiere también a una molécula de ADN recombinante o gen clonado, o una variante degenerada del mismo, que codifica para un anticuerpo de la presente invención; de preferencia, una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula de ADN recombinante o gen clonado, que codifica para las secuencias de la región VH y VL del anticuerpo, en particular la región CDR, que tiene una secuencia o es capaz de codificar para una secuencia mostrada en las figuras 5 o 6. En aspectos preferidos, la invención provee un ácido nucleico que codifica para la secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 2) y de cadena ligera (SEQ ID NO: 12) de lgM12, y un ácido nucleico que codifica para una secuencia de región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 18) y de cadena ligera (SEQ ID NO: 28) de lgM42. En un aspecto de la invención, se provee un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36). En otro aspecto, el ácido nucleico codifica además para una región constante de humano y una cadena J de humano, en particular la cadena J de SEQ ID NO: 15. En un aspecto de la invención, se provee un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable del dominio de CDR CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42). En otro aspecto, el ácido nucleico codifica además para una región constante de humano y una cadena J de humano, en particular la cadena J de SEQ ID NO: 15.

Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención pueden usarse en un metodo de tratamiento, prevención o diagnóstico del cuerpo de un humano o animal, tal como un método de neuroprotección en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invención. Los anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos que comprenden las secuencias de la región de dominio de CDR de conformidad con la invención pueden usarse en un método de neuroprotección en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invención.

Los agentes de la invención, en particular los anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, pueden usarse como agentes neuroprotectores en métodos para la prevención, el tratamiento o la mejora de lesión, daño o compromiso nervioso, y complicaciones que pueden resultar o dan como resultado, en daño del SNC. Los métodos de tratamiento o prevención de la invención son aplicables en donde la pérdida de estructura, función o supervivencia de las neuronas está implicada o está asociada, incluyendo lesión o trauma cerebral, lesión de médula espinal (SCI), lesión nerviosa, lesión de la cabeza, condiciones en donde el riego sanguíneo al cerebro está reducido o comprometido, enfermedades infecciosas del cerebro y enfermedades neurodegenerativas. Ejemplos de dichas enfermedades o condiciones para tratamiento, prevención o mejora de conformidad con los metodos de la invención, incluyen lesión de médula espinal (SCI), lesión traumática del cerebro (TBI), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, anoxia prenatal/isquemia perinatal y/o parálisis cerebral, encefalopatía, mielopatía y enfermedades de neuronas motoras. La presente invención se refiere de esta manera a métodos de tratamiento o mejora de enfermedades o condiciones en mamíferos, en donde nervios están comprometidos, lesionados o dañados, o escenarios en donde nervios o neuronas son susceptibles o están en riesgo de compromiso, lesión o daño, que comprenden administrar un anticuerpo recombinante o anticuerpo completamente humano o fragmento del mismo seleccionado de lgM12 e lgM42.

En un aspecto particular de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para el tratamiento o la mejora de apoplejía o isquemia cerebral. En un aspecto particular de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para el tratamiento o la mejora de apoplejía. En un aspecto particular de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para el tratamiento o la mejora de isquemia cerebral. En una modalidad de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para mejorar la función motora en condiciones tales como apoplejía. Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrase en composiciones para mejorar la función motora en un animal que sufre de o que se sospecha sufre de una apoplejía. Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para mejorar la función motora en un animal que ha tenido una apoplejía o que tiene isquemia cerebral. En un aspecto particular, el anticuerpo 12 lgM12, rlgM12 que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5, pueden usarse en el tratamiento, la prevención o el alivio de apoplejía o isquemia cerebral. En un aspecto, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden administrarse en casos en donde se determina, se sospecha o se está en riesgo de apoplejía y/o isquemia cerebral, incluyendo en casos en donde pueden administrarse o usarse trombolíticos enzimáticos, tales como activador de plasminógeno tisular (TPA) u otros agentes trombolíticos o antitrombóticos.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para la mejora o estabilización de la función neurológica o de la función motora en casos, enfermedades o condiciones en donde nervios están comprometidos, lesionados o dañados, o escenarios en donde nervios o neuronas son susceptibles o están en riesgo de compromiso, lesión o daño. En un aspecto particular, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se usan o se administran en las etapas tempranas o iniciales de una enfermedad, trauma o condición, o se repiten durante el curso o la duración de una enfermedad, trauma o condición, para facilitar o mantener la mejora o la estabilización de la función neurológica o la función motora, incluyendo o seleccionada de movimiento, tal como el caminar, o la función cognitiva, tal como el recordar o el reconocimiento.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en metodos o pueden administrarse en composiciones para mitigar o mejorar efectos, defectos o daño neurológico o muerte celular neuronal en caso de una apoplejía o isquemia cerebral. De conformidad con los métodos, los anticuerpos mejoran uno o más parámetros motores o neurológicos funcionales o evaluadles, incluyendo un parámetro evaluable o escalable tal como una escala de apoplejía o escala funcional. La administración de los anticuerpos es efectiva para mejorar o aliviar uno o más de un síntoma o parámetro asociado con apoplejía que incluye, por ejemplo, uno o más de función motora de extremidades inferiores y superiores, ataxia de extremidades, función sensitiva, lenguaje, articulación, atención, mirada fija y función visual y movimiento y potencia de brazos, manos y piernas.

Los métodos de la invención pueden comprender la administración de más de un anticuerpo o fragmento, incluyendo combinaciones del anticuerpo lgM12 y 42. En un aspecto de la invención, se proveen métodos que comprenden administrar uno o más anticuerpos o fragmentos de los mismos, en donde un anticuerpo comprende (a) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), o (b) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42). En otro de dichos metodos, uno o más del anticuerpo lgM12 y/o del anticuerpo lgM42 puede combinarse con otro anticuerpo activo del SNC, incluyendo en particular uno o más de los anticuerpos rHlgM22 y/o rHlgM46. El anticuerpo rHlgM22 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 43 y 44, o las CDRs de estas SEQ IDs. El anticuerpo rHlgM46 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 45 y 46, o las CDRs de estas SEQ IDs. De esta manera, uno o más del anticuerpo lgM12 y/o del anticuerpo lgM42 puede combinarse con uno o más anticuerpos remielinizantes que comprenden (a) las CDRs de región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de CDR1 SSGMH, la secuencia de CDR2 V(I)ISYDGSRKYYADSVKG y la secuencia de CDR3 GVTGSPTLDY, y las CDRs de región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de CDR1 SGSSSNIGNNFVS, la secuencia de CDR2 DITKRPS, y la secuencia de CDR3 G(E)TWDSSLSAV V; o (b) las CDRs de región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de CDR1 SGFTFSSYW, la secuencia de CDR2 IKKDGSEK y la secuencia de CDR3 ARPNCGGDCYLPWYFD, y las CDRs de región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de CDR1 QSVLYSSNNKNY, la secuencia de CDR2 YWAS y la secuencia de CDR3 QQYYNTPQA. Combinaciones de anticuerpos pueden administrarse en conjunto o en serie, y en varios tiempos y varias cantidades o concentraciones. Pueden usarse anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos. En dicho aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46 y/o un anticuerpo que tiene las secuencias de las regiones de CDR CDR1, CDR2 y CDR3 de lgM22 o lgM46, mediante administración combinada o en serie, separada por una corta duración de tiempo o duración de tiempo más larga, incluyendo por horas, días o semanas. En dicho aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, mediante administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de una enfermedad o condición que implica neurodegeneración, y en particular incluyendo desmielinización. En otro aspecto, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, mediante administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de una enfermedad o condición desmielinizante. En un aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, mediante administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de esclerosis múltiple. En dicho aspecto, la remielinización y neuroprotección se logra por efectos combinados, que incluyen efectos sinergicos, sobre un aspecto clínico mensurable de la enfermedad MS.

En vista de las capacidades neuroprotectoras y/o neuro-regenerativas de los agentes de la invención, esta invención se refiere además a métodos in vitro para producir o estimular la proliferación de neuronas, incluyendo la proliferación de neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, células granulares cerebelares y células ganglionares retínales. Dichas neuronas proliferadas pueden ser adecuadas para trasplante y protocolos y métodos terapéuticos de células nerviosas.

La utilidad de diagnóstico de la presente invención se extiende al uso de los anticuerpos de la presente invención en pruebas y métodos para caracterizar lesión o daño nervioso del SNC, o para seleccionar para o evaluar enfermedades o condiciones que implican lesión, daño o muerte nervioso (incluyendo muerte necrótica o apoptótica), incluyendo pruebas de formación de imágenes y de diagnóstico in vitro e in vivo. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse en pruebas y métodos para evaluar apoplejía o isquemia, y/o para evaluar lesión después de isquemia o apoplejía o isquemia o apoplejía predicha o presunta. En un inmunoensayo, una cantidad control de los anticuerpos, o similares, puede prepararse y puede marcarse con una enzima, un miembro de unión específico, ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radiactivo, y puede introducirse entonces en una muestra celular. Después de que el material marcado o sus miembros de unión han tenido una oportunidad de reaccionar con sitios dentro de la muestra, la masa resultante puede examinarse mediante téenicas conocidas, las cuales pueden variar con la naturaleza del marcador unido. En una aplicación de formación de imágenes o de diagnóstico in vivo, el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a neuronas puede prepararse y puede marcarse con una enzima, un miembro de unión específico, un ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radiactivo, y puede introducirse entonces en un animal. Despues de que el material marcado o sus miembros de unión han tenido una oportunidad de reaccionar con sitios dentro del animal, el animal puede examinarse mediante téenicas conocidas, las cuales pueden variar con la naturaleza del marcador unido. En un aspecto de la utilidad de diagnóstico de la invención, los anticuerpos o fragmentos activos de los mismos de la invención pueden usarse en pruebas y métodos para caracterizar apoplejía o isquemia cerebral. En particular, en casos en donde se sospecha o se está en riesgo de isquemia cerebral o apoplejía, los anticuerpos de la invención pueden usarse para determinar o evaluar la isquemia cerebral y/o apoplejía.

Los miembros de unión específicos radiomarcados, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de diagnóstico in vitro y en técnicas de radioformación de imágenes in vivo. En otro aspecto de la invención, los miembros de unión específicos radiomarcados, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos, en particular los radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia, en particular como anticuerpos radiomarcados para la reparación de lesión nerviosa, neuro-regeneración, recuperación neurodegenerativa, cáncer o terapia de tumores del SNC, o en forma alternativa, para la ablación de neuronas o tejido nervioso dañado en ciertos casos. En un aspecto in vivo , el anticuerpo o fragmento del mismo que se une a neuronas, es marcado y administrado al animal antes de, durante o después de cirugía o una téenica quirúrgica, que incluye una técnica estereotáctica o mínimamente invasiva, con el propósito de localizar lesión nerviosa o para evaluar tejido neural dañado o lesionado restante. En dicho aspecto, los miembros de unión específicos radiomarcados, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de cirugía radioinmunoguiadas, en donde pueden identificar e indica la presencia y/o localización de células nerviosas o neuronas o tejido nervioso comprometidos, dañados, lesionados o moribundos antes de, durante o después de cirugía, para elegir como objetivo, identificar o remover dichas células.

Inmunoconjugados o proteínas de fusión con anticuerpos se incluyen en la presente invención, en donde los miembros de unión específicos, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención, son conjugados o unidos a otras moléculas o agentes que incluyen además, pero no están limitados a, miembros de unión conjugados con un fármaco neuroactivo, agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico o fármaco.

La presente invención incluye un sistema de prueba el cual puede prepararse en la forma de un kit de prueba para el análisis cuantitativo del grado de la presencia de, por ejemplo, neuronas dañadas, comprometidas o lesionadas, o para cuantificar neuronas en una muestra. El sistema o kit de prueba puede comprender un componente marcado preparado mediante una de las teenicas enzimáticas y/o radiactivas discutidas en la presente, acoplando un marcador al anticuerpo, y uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales, opcionalmente por lo menos uno de los cuales es un componente libre o inmovilizado o sus miembros de unión.

Los anticuerpos de la presente invención, y en una modalidad particular los anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de cadena ligera y/o pesada presentadas en las figuras 5 y 6 en la presente, o fragmentos activos de los mismos, y anticuerpos sintéticos o recombinantes de cadena sencilla derivados de los mismos, en particular que comprenden las secuencias de las regiones CDR descritas en las figuras 5 y 6, pueden prepararse en composiciones farmacéuticas que incluyen un vehículo, portador o diluyente adecuado, para administración en casos en donde la terapia es apropiada, tal como para tratar o mejorar condiciones o enfermedades que implican compromiso, daño, lesión o muerte de neuronas. Dichas composiciones farmacéuticas pueden incluir también métodos para modular la vida media de los anticuerpos o fragmentos de los mismos mediante métodos conocidos en la técnica tales como pegilación. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender además anticuerpos o agentes terapéuticos adicionales.

La presente invención incluye también anticuerpos y fragmentos de los mismos, los cuales son unidos covalentemente a o de otra manera son asociados con, otras moléculas o agentes. Estas otras moléculas o agentes incluyen, pero no están limitados a, moléculas (incluyendo anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) con características de reconocimiento distintas, toxinas, ligandos, agentes neuroactivos y agentes quimioterapeuticos. En un aspecto adicional, los anticuerpos o fragmentos de la invención pueden usarse para elegir como objetivo o dirigir moléculas terapéuticas u otros agentes, por ejemplo, para dirigir moléculas o agentes hacia neuronas, por ejemplo, hacia neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, células ganglionares retínales o células granulares cerebelares, incluyendo en sitios de heridas, sitios isquémicos, sitios de tumores, áreas inflamatorias o lesiones neurodegenerativas. Los anticuerpos o fragmentos de la invención pueden usarse para elegir como objetivo o dirigir moléculas terapéuticas u otros agentes, por ejemplo, para dirigir moléculas o agentes hacia sitios de isquemia cerebral o apoplejía.

Otros objetivos y ventajas llegarán a ser evidentes para los expertos en la téenica a partir de una revisión de la descripción detallada resultante, la cual procede con relación a los dibujos ilustrativos incluidos, y las reivindicaciones concomitantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras 1A a 1H: Las moléculas de inmunoglobulina (IgMs) humanas se unen a la superficie de tipos de neuronas múltiples. sHlgM42 (figura 1 A) y rHlgM12 (figura 1C) se unen a la superficie de neuronas corticales vivas que co-expresan neurofilamento (NF) (figuras 1B y 1D). Las celulas se mantuvieron sobre hielo durante una incubación por 10 minutos con 10 mg/ml de moléculas de inmunoglobulina en el medio. Las células fueron fijadas y lavadas, y se detectó IgM humana con un anticuerpo secundario de Fab'2-FITC anti-humano de la cadena mu. El NF interno está presente como un patrón segmentado característico. Las células corticales se cultivaron por 6 días en medio Neurobasal B27 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina. No todas las neuronas corticales expresan no obstante NF, pero las moléculas de inmunoglobulina se unen a todas las neuronas en el cultivo. rFHgM12 (figura 1 E, verde) y shllgM42 (figura 1F, verde) se unen a la superficie de neuronas hipocámpicas vivas de ratón que co-expresan neurofilamento (NF, rojo). Las neuronas hipocámpicas se cultivaron por 1 semana en medio Neurobasal B27 sobre plástico recubierto con polilisina. Las células aisladas de una resección de lóbulo temporal de humano se cultivaron en DMEM/F12/N2/B27 por 21 días. rHlgM12 se unió a la superficie de las células (figura 1G) que eran también positivas para b III tubulina (figura 1F, anti-b III de Promega).

Figura 2. Las moléculas de Inmunoglobulina humanas marcan la superficie de las células granulares cerebelares en patrones distintos. Células granulares cerebelares de rata a 1 día en cultivo se incubaron vivas con 10 pg/ml de las moléculas de inmunoglobulina derivadas de suero humano, sHlgM12 o sHlgM42, en medio de cultivo por 15 minutos sobre hielo. Después de lavado y fijación con paraformaldehído a 4%, las células se incubaron a temperatura ambiente con un anticuerpo de cadena mu anti-humano conjugado con FITC, y se formó una imagen de las mismas usando un microscopio de inmunofluorescencia. El patrón del marcador de la membrana neuronal usando estos dos anticuerpos es diferente. Las áreas cortas de la membrana de las neuritas son unidas por sHlgM12, dando como resultado un patrón claramente punteado. Las áreas más grandes de la membrana de las neuritas son unidas por sHlgM42, dando como resultado un patrón segmentado. El aumento es de 400x.

Figura 3. Las moleculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas, rHlgM12 y sHlgM42, protegen a las neuronas corticales en cultivo de la muerte celular inducida por peróxido. Neuronas de ratón a 3 días en cultivo se trataron con H2O2500 nM o solución salina con o sin 10 mg/ml de moléculas de inmunoglobulina humanas por 30 minutos. Las células se lavaron con medio Neurobasal B27 fresco, y 24 horas después se detectó la expresión de la caspasa-3 detectada en placas de 96 cavidades tratadas por triplicado usando un kit de prueba FLICA para caspasa-3 (Immunochemistry Technologies 935). Las barras indican el % de protección de la activación de la caspasa 3.

Figura 4. Descripción del vector amplificable para producir el anticuerpo recombinante. Este es un mapa del vector usado para generar el anticuerpo recombinante con base en sHlgM22 (rHlgM22), el cual fue modificado para la producción de lgM12 e lgM42 recombinantes. Para la expresión en células CHO, el promotor VH se reemplazó con el promotor E1A.

La región constante de cadena ligera C se reemplazó con una región constante de cadena ligera kappa CK.

Figura 5. Descripción de la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico del anticuerpo lgM12, en el vector recombinante. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico codificante están en gris, y se proveen y se indican cada una de las secuencias de Vh y de la región constante CH1, CH2, CH3 y CH4. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y la secuencia de ácido nucleico codificante están en púrpura, y se indican las secuencias variable VL y constante CL (kappa). Se notan las secuencias de la región CDR para las regiones variables de cadena ligera y pesada. La cadena J de humano se indica en la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico.

Figura 6. Descripción de la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico del anticuerpo lgM42, en el vector recombinante. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada y la secuencia de ácido nucleico codificante están en gris, y se proveen y se indican cada una de las secuencias de Vh y de la región constante CH1, CH2, CH3 y CH4. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y la secuencia de ácido nucleico codificante están en púrpura, y se indican las secuencias variable VL y constante CL (kappa). Se notan las secuencias de la región CDR para las regiones variables de cadena ligera y pesada.

Figura 7. La rHlgM12 recombinante mejora los déficits en ratones con enfermedad inducida por el TMEV. La actividad nocturna espontánea media cada hora (cuando los ratones son normalmente activos) es alterada por 3 semanas despues de una sola dosis i.p. de 100 mg de sHlgM12. Grupos de 5 ratones SJL a 90 días post-infección con el TMEV fueron tratados con rHlgM12 (barras rojas), o una IgM humana control (barras negras), y monitoreados 3 días por semana como grupos en cajas de monitoreo de la actividad AccuScan. La media ± SEM de la actividad horizontal nocturna cada hora durante 3 períodos nocturnos, se comparó con la actividad nocturna por las 3 noches antes del tratamiento con la IgM. Un incremento en la actividad nocturna en comparación con los niveles de pretratamiento se presentó en la semana 3 a la semana 7 después del tratamiento con una sola dosis de rHlgM12 (P<0.01), pero no después del tratamiento con el control. Los niveles de actividad de los ratones de edad igualada no infectados se grafican para comparación (barra verde).

Figura 8. Espectros de resonancia magnética colectados en el tallo cerebral de ratón. Los paneles superiores indican el voxel del cual se colectó la señal. El posicionamiento de esta región de interés usó señales anatómicas. Una exploración por MRI muy breve se usa para obtener las imágenes en tres planos ortogonales para posicionar el cubo de 2.5 mm3 sobre el tallo cerebral (panel superior). Espectro de 1H, 300 MHz, del tallo cerebral de ratón (panel inferior). Se identifican fácilmente los picos de colina (Cho), creatina (Cr) y N-acetil-aspartato (NAA). El espectro es referido a agua a 4.7 ppm.

Figura 9. Los niveles decrecientes de NAA en el tallo cerebral se correlacionan con la pérdida creciente de axones. Se estudiaron prospectivamente 10 ratones SJL de 0 a 270 días después de la infección con el TMEV. Se obtuvo MRS en el tallo cerebral de cada ratón, y se determinó la concentración de NAA (arriba). Se registró una disminución gradual en el NAA en todos los ratones que alcanzaron una disminución estadística significativa a 90 días después de la infección con el virus, el punto cuando se muestra que los grandes axones se pierden por conteo directo en secciones transversales (2). Los niveles de NAA se mantuvieron deprimidos por la duración de la enfermedad. Axones absolutos contados (abajo) al nivel de T6 de los ratones no infectados (barra negra), 90 días (gris) y 270 días (blanco) post-infección.

Figura 10. NAA en el tallo cerebral después de una sola dosis de moléculas de ¡nmunoglobulina humanas. A grupos de 10 a 15 ratones SJL a 90 días post-infección con el TMEV, el tiempo cuando los niveles de NAA comienzan a disminuir, y la pérdida de grandes axones es detectadle, se les dio una sola dosis de 100 mg de sHlgM12, sHlgM42, una IgM humana control, o solución salina (PBS) i.p. Se colectó la MRS en el tallo cerebral antes y a 5 y 10 semanas después del tratamiento. Se calcularon los niveles de NAA a partir de estos espectros. En los grupos tratados con sHlgM12 y sHlgM42, el NAA se incrementó en comparación con los niveles de pretratamiento después de la semana 5 (P=0.005, P=0.029) y en la semana 10 (P0.001, P=0.037). En los grupos de ratones tratados con reactivos control, fueron estables o tendieron a disminuir. La gráfica representa la media +/- SEM de los niveles de NAA del voxel del tallo cerebral.

Figura 11. Las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a las neuronas no alteran la desmielinización, remielinización o inflamación. Se trataron grupos de 5 ratones crónicamente infectados con el TMEV con una sola dosis de 100 mg de moléculas de inmunoglobulina humanas. Todos los grupos contenían el mismo grado de inflamación de la médula espinal (barras negras) y desmielinización (barras rojas) a la semana 10 después del tratamiento. Como era de esperarse, los ratones tratados con la IgM que se une a oligodendrocitos, rHlgM22, mostraron mayor remielinización (barras verdes). sHlgM12 y sHlgM42 no promueven la remielización de la médula espinal. Esto sugiere que puede haber maneras múltiples de proteger a los axones in vivo.

Figura 12. Vida media de las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas en la circulación de ratones CD-1 después de inyección intravenosa. Se usó ELISA en sandwich para cuantificar la descomposición de la cadena mu humana del suero de ratones durante 48 horas. Media de la DO405 del substrato fosfatasa alcalina (Sigma 104) obtenida de las medias. Se grafican los sueros de 3 ratones por grupo y el error estándar.

Figura 13. rHlgM12 marcada con 35S entró al cerebro y la médula espinal de ratones SJL infectados con el TMEV y no infectados. Se administró i.p. rHlgM12 marcada con 35S a ratones SJL de 5 meses infectados con el TMEV y no infectados de edad igualada. 4 horas despues, un par de ratones fueron perfundidos con solución salina, y los tejidos se cosecharon agudamente, se pesaron y se desmenuzaron con una hoja de rasurar, y se mezclaron con 10 mi de fluido de escintilación (Ultima Gold LSC). Lo mismo se repitió a las 24 horas. Después de 48 horas, dejando que el tejido se solubilizara, se hizo el conteo de los viales por 1 minuto en un contador de escintilación Beckman. Se grafican los conteos totales para el cerebro entero y la médula espinal de cada ratón. Los conteos de fondo sin tejido en los viales fueron 12 conteos.

Figuras 14A a 14C. Las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas se dirigen in vivo hacia las lesiones de la médula espinal. A ratones con desmielinización crónica de la médula espinal inducida por el TMEV se les dio intraperitonealmente 1.0 mg de sHlgM42 (figura 14A), rHlgM12 (figura 14B) o IgM monoclonal humana control (figura 14C). 4 horas después, los ratones fueron perfundidos con paraformaldehído a 4%, y las médulas espinales fueron removidas, congeladas seccionadas e inmunomarcadas usando fragmentos de Fab'2 conjugados con FITC dirigidos contra la cadena mu humana (Jackson Immunoresearch). Las médulas espinales de los ratones que recibieron sHlgM42 o rHlgM12 contenían IgM humana en las lesiones. Poca IgM humana control se encontró en las lesiones. Los paneles inferiores son tinción con hematoxilina y eosina para visualizar las lesiones y células inflamatorias. Se concluye que ciertas moléculas de ¡nmunoglobulina humanas pueden cruzar la barrera hemoencefálica (BBB) en el modelo del TMEV.

Figuras 15A a 15D. Las moléculas de ¡nmunoglobulina humanas que se unen a neuronas se localizan hacia los axones positivos para neurofilamento (NF) en las lesiones de la médula espinal. A ratones con desmielinización crónica de la médula espinal inducida por el TMEV se les administró intraperitonealmente 1.0 mg de IgM, y se sacrificó a los mismos 4 horas después. Las médulas espinales fueron seccionadas congeladas longitudinalmente e inmunomarcadas con fragmentos Fab'2 de la cadena mu anti-humano conjugadas con FITC (verde) y anti-NF (SMI-32 y 34, rojo), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con TRICT. Las imágenes confocales fusionadas confirman la co-localización de shllgM42 (figura 15A) con largas fibras positivas para NF (figura 15B), fusionadas en (figura 15C). Se co-localizó también a rHIgMI 2 (figura 15D, verde) con estructuras positivas para NF, tal como haces de fibras de un axón cortado transversalmente.

Figura 16. rHIgMI 2 y sHlgM42 no exacerban las puntuaciones clínicas de la EAE. A grupos de 10 ratones C57BL6 con EAE inducida por el péptido MOG, se les dio una sola dosis i.v. de 100 mg de la IgM humana control rHIgMI 2, sHlgM42, o solución salina en el tiempo en que cada ratón alcanzó una puntuación clínica de 1 (cola flácida) y fue monitoreado cada tercer día hasta 28 días post-inmunización. Las gráficas son la media +/- SEM de la puntuación clínica media de cada grupo de tratamiento. El ANOVA en los rangos de las puntuaciones clínicas medias no indicó diferencia alguna entre los grupos (P=0.14).

Figura 17. rHlgM12 y sHlgM42 no exacerban la patología de la medula espinal con EAE. Al final del estudio en la figura 13, las médulas espinales fueron removidas, cortadas en bloques de 1 mm, cortadas en secciones transversales de cada tercer bloque consecutivo, y teñidas con ericromo para visualizar la patología. 10 secciones transversales por ratón (40 cuadrantes) fueron calificadas en forma simulada. No hubo diferencias en la inflamación (P=0.825) o desmielinización (P=0.766) a través de los grupos.

Figuras 18A1 a 18G. rHIgMI 2 promueve el brote de neuritas. Se cultivaron neuronas hipocámpicas E15 sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-D-lisina (PDL) (figuras 18A1 a 18A3) o nitrocelulosa (figuras 18B2 a 18B3). 12 horas después de la siembra de las células, estas neuronas fueron fijadas y teñidas con anticuerpo de 3-tubulina (figuras 18A1 y 18B1, verde) y faloidina de rojo Texas (figuras 18A2 y 18B2). Las figuras 18A3 a 18B3 son superposiciones de las figuras 18A1 a 18A2 y 18B1 a 18B2, en donde los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Las figuras 18C, 18D y 18E muestran la medición de las longitudes de las neuritas total (figura 18C, p=0.0056), más larga (figura 18D, p<0.0001) y segunda más larga (figura 18E, p=0.0782). Las neuronas que crecen en rHIgMI 2 poseen menos neuritas (figura 18F, p<0.0001), y la mayoría son neuronas de etapa 3 (figura 18G) en comparación con las neuronas sembradas en substratos de PDL control (72% contra 18%), las cuales tienen múltiples neuritas simétricas. Los análisis estadísticos muestran la media ± SEM (prueba t no pareada).

Figuras 19A1-19F. rHlgM12 dirige la formación de axones. Neuronas hipocámpicas 12 horas después de la siembra en substratos de PDL (figuras 19A1 a 19A3), PDL+laminina (figuras 19B1 a 19B3) o rHlgM12 (figuras 19C1 a 19C3), fueron teñidas con Tau1 (figuras 19A1 a 19C1 , verde) o MAP2 (figuras 19A2 a 19C2, azul). Las figuras 19A3 a 19C3 son superposiciones de las figuras 19A1 a 19C1 y 19A2 a 19C2, y la F-actina (rojo) fue teñida con faloidina de rojo Texas. Las figuras 19D a 19F muestran la intensidad de Tau1 relativa a lo largo de las neuritas más largas del cuerpo celular al cono de crecimiento en las figuras 19A1 a 19C1 marcadas por líneas a rayas. La tinción con Tau1 es asimétricamente enriquecida en la parte distal de la neurita más larga en las neuronas de etapa 3 cultivadas sobre substratos de rHlgM12 y laminina.

Figuras 20A1 a 20C3. Las membranas neuronales reorganizan la unión a rHlgM12. Neuronas hipocámpicas DIV3 fueron teñidas triplemente con rHlgM12, toxina B del cólera (CTB, Alexa Fluor 594) y filipina después de la fijación (figuras 20A1 a 20A4). rHlgM12 (Figura 20A1) marca uniformemente la superficie de la neurona, con un patrón similar al de GM1 (Figura 20A2) o colesterol (Figura 20A3) marcada por CTB o filipina, respectivamente. Sin embargo, después del tratamiento con rHlgM12 por 30 minutos a 37°C, rHlgM12 unida a la membrana se agrega sobre la superficie de la neurona (Figuras 20B1 a 20C1). El tratamiento con rHlgM12 da como resultado la agrupación de colesterol (Figura 20B2) y GM1 (Figura 20C2), los cuales se co-localizan con la rHlgM12 agregada (Figuras 20B3 a 20C3). Los paneles inferiores en el fondo de las figuras 20B1 a 20C3 y 20C1 a 20C3 son a mayor aumento de las regiones encerradas en un cuadro, mostrando la co-localización de la rHlgM12 agregada (verde) con colesterol (azul) o GM1 (rojo) agrupados en la región del cono de crecimiento.

Figuras 21A1 a 21C3. rHIgMI 2 se co-localiza con GM1 sobre los microdominios de la membrana de las neuronas. Figuras 21A1 a 21A3. Neuronas hipocámpicas DIV1 fueron fijadas primero con paraformaldehído a 4%, y entonces teñidas por rHlgM12. rHlgM12 marca las estructuras punteadas más pequeñas. Figuras 21 B1 a 21 B3. Neuronas hipocámpicas DIV1 vivas fueron enfriadas hasta 4°C por 30 minutos, y entonces marcadas con rHlgM12, seguido de tinción con el anticuerpo anti- -lll-tubulina después de la fijación. rHIgM 1 tiñe las formaciones punteadas mucho más grandes sobre la superficie de las neuronas. Figuras 21C1 a 21C3. Neuronas hipocámpicas DIV3 vivas fueron teñidas con metil-P-ciclodextrina por 30 minutos a 37°C para agotar el colesterol, y enfriadas entonces hasta 4°C. Las neuronas fijadas fueron teñidas entonces con rHIgM 12 (verde) y toxina B del cólera (rojo). rHIgMI 2 se une a las formas punteadas más grandes que co-localizan a GM1 marcado por la toxina B del cólera. El panel inferior muestra el mayor aumento de las regiones encerradas en un cuadro.

Figuras 22A a 22B. rHIgMI 2 se une a las masas flotantes de lípidos. Se dejó que neuronas corticales DIV7 vivas se unieran a rHIgMI 2 o anticuerpo de IgM control a 4°C por 30 minutos. Figura 22A. Las neuronas fueron lavadas tres veces después de la unión al anticuerpo, y lisadas en regulador de pH que contenía NP-40 a 0.5%. Los lisados fueron separados mediante micro-centrifugación a 4°C, y los sobrenadantes y las pellas fueron blotted con anticuerpo secundario de IgM anti-humano. rHlgM12 se distribuye en la pella y el sobrenadante en comparación con el anticuerpo de IgM control, el cual no se une a las neuronas y va hacia el abandono. El panel inferior muestra un gel separado teñido con azul de Coomassie cargado con la misma cantidad de proteína. Figura 22B. Neuronas lisadas en regulador de pH que contiene Tritón X-100 a 1%, fueron fraccionadas mediante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa a 4°C. Las fracciones resultantes fueron secuencialmente blotted para rHlgM12, caveolina-1, receptor de transferrina, 3-tubulina (B3-Tub) y beta-actina con anticuerpos específicos. rHlgM12 se localiza hacia la fracción de baja densidad la cual contiene caveolina-1 y 3-tubulina. Las fracciones de mayor densidad contienen al receptor de transferrina, bq-^u?hb y actina. Parte de rHlgM12 se localiza hacia la pella ¡nsoluble en detergente, la cual está compuesta principalmente de proteínas del citoesqueleto enriquecidas en tubulina. La mayor parte de la actina va hacia las fracciones de mayor densidad solubles en detergente.

Figuras 23A1 a 23B. rHlgM12 se asocia con los microtúbulos. Figuras 23A1 a 23A4. Neuronas hipocámpicas DIV1 fueron tratadas primero con rHlgM12 por 30 minutos a 37°C, entonces fijadas simultáneamente y extraídas con regulador de pH que contenía paraformaldehído a 4% y Tritón X-100 a 0.1%, y seguido de tinción para rHlgM12 (verde), P3-tubulina (azul) y F-actina (rojo). rHlgM12 se une a las moléculas insolubles en detergente que se co-localizan con los microtúbulos fasciculados a lo largo de los ejes de las neuritas (Figuras 23A2 y 23A4) y en el dominio central del cono de crecimiento, pero no con la F-actina localizada en la periferia del cono de crecimiento (Figuras 23A3 y 23A4). B. Se dejó que las neuronas corticales DIV7 se unieran a rHlgM12 primero, y entonces fueron lisadas en NP-40 a 0.5%. Los sobrenadantes fueron sometidos a co-inmunoprecipitación. rHlgM12 y p3-tubulina fueron co-inmunoprecipitadas entre sí.

Figuras 24A a 24C. Mecanismos propuestos por los cuales rHlgM12 promueve la formación del axón. Figura 24A. Las membranas de las neuronas contienen microdominios de masas flotantes y microdominios sin masas flotantes. Los microdominios de masas flotantes, los cuales están distribuidos uniformemente sobre las membranas de las neuronas, se segregan en dos grupos. Uno de ellos está asociado con los microtúbulos. Figura 24B. La unión de rHIgMI 2 induce la agrupación de los microdominios de masas flotantes, lo cual promueve la estabilización de los microtúbulos y el anclaje de la membrana de las neuronas. Figura 24C. Durante el brote de las neuritas, los conos de crecimiento exploran el ambiente y los microdominios de masas flotantes se agrupan interactuando con rHIgMI 2. Como resultado, los microtúbulos se estabilizan en los sitios de contacto con rHIgMI 2 y/o anclan las membranas de las neuronas, lo cual aumenta la transición de la periferia al dominio central del cono de crecimiento como se observa en las figuras 3 y 6, en donde la rHlgM12 aplicada al baño se agrega en el dominio central del cono de crecimiento.

Figuras 25A1 a 25B. rHlgM12 no se asocia directamente con la tubulina. Figuras 25A1 a 25A3. Celulas de neuroblastoma N2A fueron teñidas con rHlgM12 (Figura 25A1, verde) y 33-tubulina (Figura 25A2, rojo). Los núcleos fueron marcados con DAPI (Figura 25A3, azul). Las células N2A son negativas para la tinción con rHlgM12, pero expresan la 3-tubulina. B. Los sobrenadantes de los lisados de células N2A fueron incubados con rHlgM12, y las moléculas asociadas con rHlgM12 fueron debilitadas mediante proteína-L-agarosa, y sometidas a Western blotting. rHlgM12 no se asocia con la pella. La 33-tubulina no fue debilitada mediante rHlgM12, aunque detectada en los sobrenadantes.

Figuras 26A1 a 26B. rHlgM12 debilitada la actina, pero no se co-localiza con F-actina. Figuras 26A1 a 26A3. Neuronas hipocámpicas DIV1 vivas fueron teñidas primero a 4°C con rHlgM12 (Figura 26A1 , verde), y la F-actina (Figura 26A2, rojo) fue marcada con faloidina de rojo Texas después de la fijación. En la región del cono de crecimiento, la F-actina se contrajo y fue enriquecida en el dominio central, mientras que rHlgM12 tiñó uniformemente las estructuras punteadas sobre la superficie del cono de crecimiento, lo cual marcó el borde del cono de crecimiento. Figura 26B. Una pequeña cantidad de actina fue debilitada mediante rHlgM12, y ninguno de los tres anticuerpos anti-actina puestos a prueba funcionó en la inmunoprecipitación. La banda en la posición similar como bd?u?u?hq, es la cadena pesada de IgG indicada por la punta de flecha hueca.

Figura 27A. Las membranas de las células serán reconstituidas sobre una película de oro fina perforada con miles de nanoporos (200 nm en tamaño). Figura 27B. La película de oro suspendida está en contacto con una solución de regulador de pH en ambos lados.

Figuras 28A a 28B. Un anticuerpo humano que se une a las neuronas promueve la extensión de las neuritas. Se sembraron neuronas sobre substratos recubiertos con IgM humana, se dejó que crecieran por 24 horas, y fueron inmunomarcados con anti-neurofilamento. sHlgM42 indujo el brote (figura 28A) en comparación con una IgM humana no permisiva (figura 28B).

Figuras 29A a 29B. Un anticuerpo humano que se une a las neuronas agrupa los dominios de la membrana. Se llevó a cabo inmunomarcación uniforme en el soma y los axones a 0°C (Figura 29A). Cuando las células son calentadas hasta 15°C por 15 minutos, sHlgM42 se localiza hacia los parches más discretos sobre la superficie de los axones (Figura 29B).

Figuras 30A a 30B. El anticuerpo humano que promueve la extensión de las neuritas se dirige in vivo hacia las áreas de lesión. A ratones con SCI crónica se les dieron anticuerpo i.p., médulas espinales removidas 4 horas después, e IgM huma detectada en secciones transversales de la médula espinal. Las áreas lesionadas de la médula espinal de un ratón al que se le dio anticuerpo demuestran fibras paralelas que se unen a una IgM antihumano marcada con fluorescencia (Figura 30A). Las áreas lesionadas de la médula espinal de un ratón al que se le dio una IgM humana control, no contienen IgM humana (Figura 30B).

Figuras 31 A a 31 B. Lesión por aplastamiento de la médula espinal. Las microfotografías muestran la apariencia típica de la médula espinal teñida con hematoxilina y eosina de ratones control (Figura 31A) o ratones 30 días post-compresión con broche Fejota de 8 gramos (Figura 31 B). La lesión por compresión está asociada con la infiltración extensiva de células inflamatorias y pérdida de neuronas motoras.

Figuras 32A a 32C. Ejemplo de las actividades nocturnas espontáneas de los ratones infectados con el TMEV. Figura 32A) Registros completos originales de la actividad horizontal durante el período de 64 días. Son fáciles de apreciar las altas actividades nocturnas y las bajas actividades diurnas. Debido a que los ratones son normalmente activos durante las horas de la noche, se seleccionaron las actividades nocturnas para el análisis (6PM-6AM). Sin embargo, mediante la inspección visual de los registros no filtrados comprimidos en la actividad horizontal (Figura 32B) o vertical (Figura 32C), puede ser difícil identificar los cambios reales a largo plazo.

Figuras 33A a 33F. Una sola dosis i.p. del anticuerpo que se une a neuronas (rHlgM12), mejora la actividad horizontal en ratones SJL infectados crónicamente. Tres grupos de 5 ratones SJL a 90 dpi fueron puestos en cajas de monitoreo de la actividad AccuScan. Las mediciones en la línea base se colectaron durante 8 días. Después del tratamiento, los ratones fueron monitoreados continuamente durante 8 semanas. Las figuras 33A, 33C y 33E corresponden a la actividad horizontal, y las figuras 33B, 33D y 33F corresponden a la actividad vertical. Figuras 33A, 33B) Las actividades nocturnas promedio presentadas como casillas por cada día, sugirieron la mejora en la actividad horizontal sólo en el grupo tratado con rHlgM12. Figura 33C) La filtración Gaussiana (GB=2 días) y E) el ajuste polinomial de sexto orden de los valores Z estandarizados, proveyeron una mejora clara y distinta en los ratones tratados con rHlgM12. Figuras 33B, 33D y 33F) La actividad vertical no fue afectada por tratamiento alguno. La actividad (escala vertical) es el número de interrupciones del haz por hora. El parámetro GB puede interpretarse como un valor (en días) de la amplitud media a la altura media del filtro. Con el incremento del valor de GB, la desviación estándar disminuye. Se dan puntualmente las bandas de 95% de confianza para cada día.

Figura 34. Comparación de tres tratamientos a 90 dpi usando valores modelo predichos. Se llevó a cabo el análisis estadístico por cada día antes y después del tratamiento. La actividad nocturna horizontal de ratones tratados con rHlgM12 en comparación con ratones tratados con solución salina e IgM control divergieron/mejoraron significativamente en el día 7 (p=0.045) y el día 11 (p=0.042) post-tratamiento, respectivamente (denotado por las flechas negras). Se dan puntualmente las bandas de 95% de confianza para cada día.

Figuras 35A a 35H. rHlgM12 mejora la actividad horizontal y vertical en ratones SJL cuando se da tempranamente en la enfermedad. Tres grupos de 5 ratones SJL a 45 dpi fueron puestos en cajas de monitoreo de la actividad AccuScan. Se colectaron las mediciones en la línea base durante 8 días. Despues del tratamiento, los ratones fueron monitoreados continuamente durante 8 semanas. Las figuras 35A, 35C, 35E y 35G corresponden a la actividad horizontal, y las figuras 35B, 35D, 35F y 35H corresponden a la actividad vertical. Figuras 35A, 35B) Registros originales no filtrados para la actividad horizontal y vertical. Las figuras 35C, 35D) Actividades nocturnas promedio presentadas como casillas por cada día. Figuras 35E, 35F) La filtración Gaussiana (GB=2 días), y figuras 35G, 35H) el ajuste polinomial de sexto orden de los valores Z estandarizados, revelaron la mejora en la actividad horizontal y vertical en el grupo tratado con rHlgM12. Los grupos tratados con solución salina e IgM control mostraron niveles similares de actividad motora a lo largo del estudio. Se dan puntualmente las bandas de 95% de confianza para cada día.

Figuras 36A a 36F. Comparación de tres tratamientos a 45 dpi usando valores modelo predichos. Se llevó a cabo el análisis estadístico por cada día antes y después del tratamiento. Figuras 36A, 36C) La actividad nocturna horizontal de ratones tratados con rHlgM12 en comparación con ratones tratados con solución salina e IgM control, divergió significativamente en el día 13 (p=0.015) y el día 9 (p=0.036) post-tratamiento, respectivamente. Figuras 36B, 36D) La actividad vertical de ratones tratados con rHIgMI 2 divergió/mejoró en el día 14 (p=0.019) y el día 6 (p=0.037) post-tratamiento, respectivamente. Las flechas negras denotan los días con el inicio de mejora significativa. Se dan puntualmente las bandas de 95% de confianza para cada día.

Figuras 37A a 37H. Los ratones SJL normales no infectados tienen actividad espontánea altamente variable la cual no es influenciada por tratamiento alguno. Tres grupos de 5 ratones SJL no infectados fueron puestos en cajas de monitoreo de la actividad AccuScan. Se colectaron las mediciones en la línea base durante 8 días. Después del tratamiento, los ratones fueron monitoreados continuamente durante 8 semanas. Ninguno de los tratamientos indujo cambios en la actividad horizontal (Figuras 37A, 37C, 37E y 37G) o vertical (figuras 37B, 37D, 37F y 37H). Se dan puntualmente las bandas de 95% de confianza para cada día.

Figura 38. Una sola dosis de anticuerpo humano incrementó la supervivencia en los ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Se trató a ratones con una sola dosis de rHlgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. Los ratones fueron observados hasta que quedaran moribundos, y entonces sacrificados para patología. Algunos ratones murieron por la enfermedad. Todos los ratones tuvieron pérdida de peso profunda antes de la muerte. Se gráfico la supervivencia usando curvas de Kaplan-Meir, y se determinó la significancia estadística usando la prueba de Mantel-Cox no paramétrica. Hubo un incremento en la supervivencia en los ratones tratados con rHlgM12, en comparación con los ratones tratados con PBS o no tratados, P=0.008. Todos los análisis y el tratamiento se hicieron de una manera simulada, de modo que el investigador que toma la decisión de sacrificar a los ratones no tuviera conocimiento de los grupos de tratamiento. Se estudió un total de 45 ratones en este análisis. Los ratones SOD +/+ de tipo silvestre de la misma camada tuvieron supervivencia normal y ninguna perdida de peso (datos no mostrados).

Figura 39. Se describe la pérdida de peso en ratones SOD1 G86R como una función del tiempo en ratones a los que se les administró una sola dosis de 200 mg de rHlgM12 a los 50 días de edad, contra ratones control a los que se les administró PBS. Los ratones a los que se les administró rHlgM12 mostraron menos pérdida de peso durante un período de 60 días después de una sola inyección de anticuerpo.

Figura 40. Una sola dosis de anticuerpo humano disminuyó la degeneración del axón de la médula espinal en ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Se trató a ratones con una sola dosis de 250 pg de rHlgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. Se hizo el conteo del número de verticilos de mielina, característicos de los axones en degeneración, en la médula espinal al nivel torácico medio. El número de axones en degeneración fue disminuido en los ratones mutantes SOD1 tratados con rHlgM12, en comparación con los ratones tratados con PBS (P=0.003, prueba t) y los ratones no tratados. Nótese que el número de axones en degeneración en la médula espinal de los ratones SOD-/- de tipo silvestre es mínimo en comparación con los ratones mutantes SOD1 +/+. Al momento del sacrificio, los ratones fueron perfundidos con fijador de Trump (formaldehído a 4%, glutaraldehído a 0.1%), y la medula espinal fue cortada en bloques de 1 mm. Los bloques fueron embebidos en plástico Araldite, y secciones de 1 miera del nivel T6 fueron teñidas con parafenilendiamina para visualizar la envoltura de la mielina. Se muestran secciones de la médula espinal de ratones SOD-/- de tipo silvestre (arriba a la derecha) y ratones mutantes SOD1 +/+ (abajo a la derecha).

Figura 41. Una sola dosis de anticuerpo humano preservó las neuronas de las astas anterior y posterior en la médula espinal de ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Se trató a ratones con rHlgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. Se hizo el conteo del número de células de las astas anterior y posterior, teñidas con un anticuerpo para NeuN, el cual marca específicamente a las neuronas, en secciones de parafina de la médula espinal al nivel torácico medio. El número de células de las astas anterior y posterior en los ratones tratados con rHlgM12 fue significativamente mayor (P=0.0025 y P=0.018 mediante prueba t), que en los ratones tratados con PBS o los que se dejaron sin tratar. El número de células de las astas anterior y posterior en los ratones mutantes SOD tratados con rHgM12, fue similar al observado en los ratones SOD-/- de tipo silvestre.

Figuras 42A a 42H. El anticuerpo humano recombinante, rHlgM12, se une a las neuronas a través de las especies. Neuronas corticales de ratón (Figuras 42A, 42B, 42C, 42D), neuronas hipocámpicas de ratón (Figuras 42E, 42F) y neuronas corticales de humano (Figuras 42G, 42H), fueron teñidas vivas con rHlgM12 (Figuras 42A, 42C, 42E y 42G), y las mismas células fueron co-marcadas con anticuerpos para neurofilamentos (Figuras 42B, 42D) o beta-tubulina (Figuras 42F, 42G). Se detectó a rHlgM12 con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia.

Figuras 43A a 43C. Isquemia cerebral en ratones CD-1. Figura 43A. Exploración de la imagen por DWI-MRI que muestra el área de isquemia cerebral (región hiperintensa) a 24 horas. Figura 43B. Daño isquémico en el cerebro de un ratón después de isquemia cerebral (región circular pálida en el hemisferio derecho del cerebro). Figura 43C. Sección teñida con hematoxilina y eosina a 4x que muestra el tejido dañado (resaltado en negro).

Figuras 44A a 44C. Una sola dosis i.p. del anticuerpo que se une a neuronas (rHlgM12), mejora las actividades horizontal (figura 44A) y vertical (figura 44B) en ratones CD1 sometidos a isquemia cerebral fototrombótica. Se trató a ratones con una sola dosis de 200 mg de rHlgM12 (n=5) o PBS (n=5). La actividad mejoró desde el día tres en el grupo tratado con rHlgM12. Figura 44C. Se exploró a los ratones en un pequeño sistema de MRI para animales para medir el volumen total de isquemia cerebral que se expresa como mm3 en la gráfica.

Figuras 45A a 45C. La métrica de MT-MRI demuestra un resultado mejorado. Se sometió a ratones a isquemia cerebral, y se trató a los mismos con rHlgM12 o PBS. Tres días después del ataque isquémico, se computaron los mapas de MTR (figura 45A) de los hemisferios isquémico (esbozado en rojo) y contralateral (esbozado en verde) del cerebro. El grupo tratado con rHlgM12 demostró incremento relativo de MTR dentro del ROI de la apoplejía (figura 45B, las barras azules representan los valores computados en el lado control) y volumen disminuido de la apoplejía (figura 45C), en comparación con el grupo tratado con PBS.

Figura 46. Análisis Western blot de neuronas corticales (CN). Se cultivaron neuronas corticales en poli-D-Lisina por 5 días, y se incubaron por 4 a 44 horas bajo condiciones hipóxicas (02 a 2.7%, CO2 a 5%). Blot representativo que muestra los niveles de caspasa-3 separada después de un tratamiento hipóxico por 4 horas, 21 horas y 44 horas, en comparación con el control (44 horas, 0 horas de incubación en el blot).

Figura 47. Se describen gráficas de barras que muestran el análisis cuantitativo de Western blots de tres experimentos independientes con el marcador de mielina MBP y el marcador de apoptosis caspasa-3 separada. Se mantuvieron cultivos gliales mixtos por 4 días en medio que contenía FBS (10%), y se trataron por 7 días en medio químicamente definido con la IgM que promueve la remielinización rHlgM22, el anticuerpo monoclonal regenerativo rHlgM12, el control de isotipos sHlgM116 (10 mg/ml cada uno) o medio solo. El medio con anticuerpos frescos fue intercambiado cada segundo día. Al final de 4 días, los cultivos se evaluaron para MBP o caspasa-3 usando Western blot, se cuantificaron mediante DO/área, y se graficaron.

Figura 48. Se proveen Western blots representativos que muestran los niveles de varias proteínas y marcadores: marcadores de celulas progenitoras de oligodendrocitos (OPC) PDGFaR, marcadores de mielina CNPasa y MOG, marcadores de la microglia CD68 y Lyn, marcadores de proliferación Ki-67 e histona H3, marcador de apoptosis caspasa-3 separada, y marcador del ciclo celular pRbS795. Se mantuvieron co-cultivos de OPC-microglia en medio condicionado para astrocitos con los anticuerpos monoclonales que promueven la remielinización A2B5, 04, 01, 78.09, 94.03, rHlgM22, anticuerpo monoclonal regenerativo rHlgM12, control de isotipos (LEAF, 5A5, ChromPure IgM, rHlgM42, sHlgM14, sHlgM24, sHlgM26) (10 pg/ml cada uno) o medio, según se indica.

Figura 49. Se describen gráficas de barras que muestran el análisis cuantitativo de Western blots de tres experimentos independientes con el marcador CD68 para microglia activada y Lyn cinasa, una cinasa altamente abundante en la microglia y a un mejor grado en OPCs, pero no en astrocitos. Se trataron cultivos mixtos (co-cultivos de OPC-microglia) con anticuerpos como se indicó anteriormente para la figura 48 y como se indica.

Figura 50. Se proveen imágenes de inmunofluorescencia representativas que muestran los niveles de CD68 (verde) y el marcador nuclear DAPI (azul) en cultivos mixtos de células gliales antes del tratamiento con el anticuerpo monoclonal en el día 4 en cultivo y en el día 11 en cultivo después de 7 días de tratamiento con rHIgMI 2, rHlgM22 y el control de isotipos sHlgM24 (10 mg/ml de cada uno).

Figura 51. Se proveen Western blots representativos que muestran los niveles del factor 1 inducible por hipoxia (HIF1a), los marcadores de oligodendrocitos NG2, PDGFa, Olig-2, los marcadores de mielina MBP y CNPasa, el marcador de astrocitos GFAP, el marcador de la microglia CD68, el marcador del ciclo celular pRbS795, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada, y beta-actina usada como un control de carga. Se mantuvieron cultivos mixtos de células gliales por 4 días en medio que contenía FBS (10%) y se trataron por hasta otros 7 días en medio químicamente definido bajo hipoxia (O2 a 3%), en comparación con condiciones normóxicas (O2 a 21%). Se evaluaron las proteínas mediante Western blot en los días 1, 3, 5 y 7, según se indicó.

Figura 52. Se describe el análisis cuantitativo de los Western blots de la figura 51, que provee valores cuantitativos para la expresión y comparación de las condiciones hipóxicas y normóxicas para los marcadores de proteínas.

Figura 53. Se proveen Western blots representativos del marcador de proliferación Ki-67, los marcadores de la microglia IBA-1, CD68 e ¡NOS, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores del ciclo celular pRbS795 y pRbS807, los marcadores de oligodendrocitos PDGFaR, NG2, Olig-1 y Olig-2, y el marcador de mielina MBP. Se mantuvieron cultivos mixtos de células gliales por 4 días bajo condiciones normóxicas en medio que contenía FBS (10%), y se trataron posteriormente por 1 a 7 días en medio químicamente definido con el anticuerpo regenerativo humano rHlgM12 o medio solo bajo hipoxia (02 a 3%).

Figura 54. Se proveen Western blots representativos que muestran los niveles de los marcadores de la microglia IBA-1 y CD68, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores de oligodendrocitos PDGFaR, NG2, Olig-2 y los marcadores de mielina MBP y CNPasa, en cultivos mixtos de 7 días mantenidos bajo condiciones normóxicas e hipóxicas y tratados con los anticuerpos rHlgM12 o rHlgM22 contra medio solo. Se cultivó glía mixta como se describió anteriormente, y se trató en medio químicamente definido por 7 días con rHlgM12, rHlgM22, o medio solo bajo condiciones hipóxicas o normóxicas.

Figura 55. Se provee el análisis por RT-PCR de varios marcadores de las cortezas de ratones neonatos C57/BL6 hipóxicos y normóxicos en P13. Ratones neonatales C57/BL6 fueron criados en forma cruzada por madres CD1 y expuestos a hipoxia (02 a 10%) por 4 días de P3 a P7. Los ratones fueron expuestos posteriormente a aire ambiente por otras 6 horas y sacrificados en P13. Se aisló ARN de las cortezas en ambos grupos de tratamiento, y se sondearon para los marcadores de mielina PLP1, MOG, MBP1, los marcadores del progenitor de oligodendrocitos PDGFaR y Olig-1, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores neuronales Nestin y 3-tubulina, el factor 1a inducible por hipoxia y la proteína sarcospan SSPN. Los niveles de expresión se analizaron mediante RT-PCR, y los resultados fueron normalizados a los niveles de b-actina.

Figura 56. Se proveen gráficas que indican la cantidad del anticuerpo rlgM12 radiomarcado - según se indica mediante la radiactividad medida como cpm/100 ml - en varios tejidos de ratones control (pseudo-manipulados) y con apoplejía (protocolo Rosa de Bengala), como se denota en cada panel. A 30 a 40 minutos post-apoplejía, 10 millones de cpm de rHlgM12 marcado con 35S, aproximadamente 60 mg de IgM, se administraron intraperitonealmente a cada ratón en un volumen de 500 pl de solución salina. A 6, 12 y 24 horas post-tratamiento con IgM, se colectó la sangre de los ratones, la vasculatura se lavó con 30 mi de solución salina, y los tejidos se colectaron agudamente. Para el análisis de la marca radiactiva en el tejido con apoplejía, la corteza frontal derecha del cerebro que contenía el área de la lesión se removió como un bloque de tejido de 75 mg (denotado como cerebro en los paneles). Una porción de los otros tejidos se removió, se pesó y se procesó CB = cerebelo, cord = médula espinal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, pueden usarse téenicas convencionales de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante, dentro de la aptitud de la técnica. Dichas técnicas se explican enteramente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” volúmenes l-lll [Ausubel, R. M., ed. (1994)]; “Cell Biology: A Laboratory Handbook” volúmenes l-lll [J. E. Celis, ed. (1994))]; “Current Protocole in Immunology” volúmenes l-lll [Coligan, J. E., ed. (1994)]; “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” [B. D. Hames y S. J. Higgins eds. (1985)]; “Transcription And Translation” [B. D. Hames y S. J. Higgins, eds. (1984)]; “Animal Cell Culture” [R. I. Freshncy, ed. (1986)]; “Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press, (1986)]; y B. Perbal, “A Practical Guide To Molecular Cloning” (1984).

Por lo tanto, si aparecen en la presente, los siguientes terminos deben tener las definiciones expuestas a continuación.

A. Terminología El término “miembro de unión específico” describe un miembro de un par de moléculas que tiene especificidad de unión por alguna otra. Los miembros de un par de unión específico pueden derivarse naturalmente o pueden producirse sintéticamente enteramente o parcialmente. Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, o un componente sobre su superficie, que se une específicamente a, y es por lo tanto complementario a, una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. De esta manera, los miembros del par tienen la propiedad de que se unen específicamente entre sí. Ejemplos de tipos de pares de unión específicos son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando y enzima-substrato. Esta solicitud está relacionada con reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.

El término “anticuerpo” describe una inmunoglobulina ya sea natural o parcialmente o enteramente producida en forma sintética. El término abarca también cualquier polipéptido o proteína que tiene un dominio de unión que es, o es homólogo de, un dominio de unión al anticuerpo. Los anticuerpos injertados con CDR son contemplados también por este término. Un “anticuerpo” es cualquier inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen a un epítope específico. El término abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, los últimos mencionados descritos en más detalle en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,816,397 y 4,816,567. El término “anticuerpo”, incluye una molécula de inmunoglobulina (Ig) de tipo silvestre, que comprende generalmente cuatro cadenas de polipéptidos de longitud completa, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o un homólogo de Ig equivalente del mismo (por ejemplo, un nanocuerpo de camélido, el cual comprende sólo una cadena pesada); incluyendo mutantes funcionales de longitud completa, variantes, o derivados de los mismos, los cuales retienen las características de unión al epítope esenciales de una molécula de Ig, e incluyen anticuerpos específicos dobles, biespecíficos, multiespecíficos y de dominio variable doble; las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o subclase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2). Incluido también dentro del significado del término “anticuerpo”, es cualquier “fragmento de anticuerpo”.

Un “fragmento de anticuerpo” significa una molecula que comprende por lo menos una cadena de polipéptidos que no es de longitud completa, incluyendo (i) un fragmento Fab, el cual es un fragmento monovalente que consiste de los dominios ligero variable (VL), pesado variable (VH), ligero constante (CL) y pesado constante 1 (CH1); (ii) un fragmento F(ab')2, el cual es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de gozne; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab (Fd), el cual consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv) que consiste de los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo, (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), el cual comprende un dominio variable sencillo (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) un anticuerpo de camélido; (vii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (viii) un fragmento Fv de cadena sencilla, en donde un dominio VH y un dominio VL son enlazados por un enlazador de péptidos el cual permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (ix) un cuerpo bivalente, el cual es un anticuerpo biespecífico bivalente en el cual los dominios VH y VL son expresados en una cadena de polipéptidos sencilla, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena, y creando dos sitios de unión al antígeno (vease el documento WO94/13804; P. Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, (1993)); y (x) un anticuerpo lineal, el cual comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) los cuales, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno; (xi) fragmentos de anticuerpo multivalentes (dímeros, trímeros y/o tetrámeros de scFv) (Power y Fludson, J Immunol. Methods 242: 193-204 9 (2000)); y (xii) otras porciones no de longitud completa de cadenas pesadas y/o ligeras, o mutantes, variantes o derivados de los mismos, solos o en cualquier combinación.

Puesto que los anticuerpos pueden ser modificados de muchas maneras, debe considerarse que el término “anticuerpo” abarca cualquier miembro de unión específico o sustancia que tiene un dominio de unión con la especificidad requerida. De esta manera, este término abarca fragmentos de anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, que incluyen cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o totalmente o parcialmente sintético. Se incluyen por lo tanto moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado con otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en las patentes de los Estados Unidos Nos.4,816,397 y 4,816,567.

Un “sitio de combinación con el anticuerpo”, es aquella porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones variables e hipervariables de cadena ligera o de cadena pesada y ligera que se unen específicamente al antígeno.

La frase “molecula de anticuerpo” en sus varias formas gramaticales, como se usa en la presente, contempla una molécula de inmunoglobulina intacta y una porción inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina.

Ejemplos de moléculas de anticuerpo son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de inmunoglobulina que contienen al parátopo, incluyendo aquellas porciones conocidas en la téenica como Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), cuyas porciones se prefieren para su uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente.

Los anticuerpos pueden ser también biespecíficos, en donde un dominio de unión del anticuerpo es un miembro de unión específico de la invención, y el otro dominio de unión tiene una especificidad diferente, por ejemplo, para reclutar una función efectora, o similares. Los anticuerpos biespecíficos de la presente invención incluyen aquellos en donde el dominio de unión del anticuerpo es un miembro de unión específico de la presente invención, incluyendo un fragmento del mismo, y el otro dominio de unión es un anticuerpo distinto o fragmento del mismo, incluyendo aquel de un anticuerpo específico antitumoral o anti-cáncer distinto. El otro dominio de unión puede ser un anticuerpo que reconoce o elige como objetivo un tipo de célula particular, como en un anticuerpo específico de células gliales o células neurales. En los anticuerpos biespecíficos de la presente invención, el dominio de unión del anticuerpo de la invención puede combinarse con otros dominios de unión o moleculas que reconocen receptores de células particulares y/o que modulan células en una forma particular tal como, por ejemplo, un inmunomodulador (por ejemplo, interleucinas), un modulador del crecimiento o citocina (por ejemplo, factor de necrosis tumoral (FNT), y en particular la modalidad biespecífica de FNT demostrada en el documento U.S.S.N. 60/355,838, presentada en Febrero 13 de 2002, incorporada en su totalidad en la presente), o una toxina (por ejemplo, ricina) o agente o factor apoptótico o antimitótico. De esta manera, los anticuerpos anti-FAP de la invención pueden usarse para dirigir o elegir como objetivo agentes, marcadores, otras moléculas o compuestos o anticuerpos hacia sitios del estroma, áreas particulares de curación de heridas, inflamación, cáncer o tumores.

La frase “anticuerpo monoclonal” en sus varias formas gramaticales, se refiere a un anticuerpo que tiene sólo una especie de anticuerpo que combina sitios capaces de inmunorreaccionar con un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal exhibe de esta manera típicamente una afinidad de unión individual por algún antígeno con el cual inmunorreacciona. Un anticuerpo monoclonal puede contener también una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de sitios de combinación con el anticuerpo, cada una inmunoespecífica para un antígeno diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).

El termino “dominio de unión al antígeno”, describe la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a, y es complementaria a, parte o la totalidad de un antígeno. En donde el antígeno sea grande, un anticuerpo puede unirse a sólo una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina un epítope. Un dominio de unión al antígeno puede ser provisto por uno o más dominios variables del anticuerpo. De preferencia, un dominio de unión al antígeno comprende una región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo.

Los inmunoconjugados o proteínas de fusión con el anticuerpo de la presente invención, en donde los anticuerpos, moléculas de anticuerpo, o fragmentos de los mismos, de uso en la presente invención son conjugados o unidos a otras moléculas o agentes incluyen además, pero no están limitados a, dichos anticuerpos, moléculas o fragmentos conjugados con un agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico, agente microbiano o péptido, disruptor de la membrana celular y/o pared celular, o fármaco.

El término “específico” puede usarse para referirse a la situación en la cual un miembro de un par de unión específico no mostrará unión significativa alguna a moléculas diferentes de sus miembros de unión específicos. El término es aplicable también en donde, por ejemplo, un dominio de unión al antígeno es específico para un epítope particular el cual es llevado por muchos antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específico que posee al dominio de unión al antígeno será capaz de unirse a los varios antígenos que poseen el epítope.

El término “comprende” se usa generalmente en el sentido de que incluye, es decir, que permite la presencia de una o más características o componentes.

El término “que consiste esencialmente de” se refiere a un producto, en particular una secuencia de péptidos, de un número definido de residuos el cual no está unido covalentemente a un producto más grande. En el caso del péptido de la invención referido anteriormente, los expertos en la téenica apreciarán que modificaciones menores al extremo N- o C-terminal del péptido pueden sin embargo contemplarse, tal como la modificación química de la terminal que añade un grupo protector, o similares, por ejemplo, la amidación del extremo C-terminal.

El término “aislado” se refiere al estado en el cual los miembros de unión específicos de la invención, o el ácido nucleico que codifica para dichos miembros de unión, estarán de conformidad con la presente invención libres o sustancialmente libres de material con el cual están asociados naturalmente, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo, cultivo de células) cuando dicha preparación es mediante tecnología de ADN recombinante puesta en práctica in vitro o in vivo. Los miembros y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes, y aún para propósitos prácticos pueden aislarse - por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microtítulo para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnóstico o terapia.

Como se usa en la presente, “pg” significa picogramo, “ng” significa nanogramo, “ug” o “pg” significa microgramo, “mg” significa miligramo, “ul” o “pl” significa microlitro, “mi” significa mililitro, y “I” significa litro.

Los términos “anticuerpo”, “anticuerpo que se une a neuronas”, “anticuerpo lgM12”, “anticuerpo lgM42”, “anticuerpo 12”, “anticuerpo 42”, “sHlgM12”, “sHlgM42”, “rHlgM12”, “rHlgM42”, y cualquier variante no enlistada específicamente que puede usarse en la presente, y como se usa a lo largo de la presente solicitud y en las reivindicaciones, se refieren a material proteináceo que incluye proteínas individuales o múltiples, y se extienden a aquellas proteínas que tienen los datos de secuencias de aminoácidos descritas en la presente y presentadas en las figuras 5 y 6 y el perfil de actividades expuestas en la presente y en las reivindicaciones. En particular, el anticuerpo lgM12, el anticuerpo 12, rHlgM12, se refiere en particular a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, que comprenden la secuencia presentada en la figura 5. El anticuerpo lgM12, anticuerpo 12, rHlgM12, se refiere en particular a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, que comprenden las secuencias de CDR de la región variable de cadena pesada expuestas en SEQ ID NOS: 31-33 y las secuencias de CDR de la región variable de cadena ligera expuestas en SEQ ID NOS: 34-36. El anticuerpo lgM12, anticuerpo 12, rHlgM12, incluye un anticuerpo que tiene la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 , y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11. En particular, el anticuerpo lgM42, anticuerpo 42, rHlgM42, se refiere en particular a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, que comprenden la secuencia presentada en la figura 6. El anticuerpo lgM42, anticuerpo 42, rHlgM42, se refiere en particular a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, que comprenden las secuencias de CDR de región variable de cadena pesada expuestas en SEQ ID NOS: 37-39 y las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera expuestas en SEQ ID NOS: 40-42. El anticuerpo lgM42, anticuerpo 42, rHlgM42, incluye un anticuerpo que tiene la secuencia de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 27. Por consiguiente, se contemplan asimismo proteínas que exhiben actividad sustancialmente equivalente o alterada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tales como modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida a sitio, o pueden ser accidentales, tales como aquellas obtenidas a través de mutaciones en hospederos que son productores del complejo o sus subunidades nombradas. Asimismo, se pretende que los términos “anticuerpo”, “anticuerpo que se une a neuronas”, “anticuerpo lgM12”, “anticuerpo lgM42”, “anticuerpo 12”, “anticuerpo 42”, “sHlgM12”, “sHlgM42”, “rHlgM12” y “rHlgM42”, incluyan dentro de su alcance proteínas citadas específicamente en la presente, así como análogos y variaciones alélicas sustancialmente homólogos.

Se prefiere que los residuos de aminoácido descritos en la presente estén en la forma isomérica “L”. Sin embargo, los residuos en la forma isomérica “D” pueden sustituir a cualquier residuo de L-aminoácido, en tanto la propiedad funcional deseada de unión a una inmunoglobulina sea retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi de un polipéptido. De conformidad con la nomenclatura de polipéptidos estándar, J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969), las abreviaturas para los residuos de aminoácido se muestran en el siguiente cuadro de correspondencia: Cuadro de correspondencia Símbolo Símbolo de 1 letra de 3 letras Aminoácido Y Tyr tirosina G Gly glicina F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I lie isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Val valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gln glutamina E Glu ácido glutámico W Trp triptófano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina C Cys cisteína Debe notarse que todas las secuencias de residuos de aminoácido se representan en la presente mediante fórmulas cuya orientación derecha e izquierda está en la dirección convencional del extremo amino al extremo carboxi. Además, debe notarse que un guión al inicio o al final de una secuencia de residuos de aminoácido, indica un enlace peptídico con otra secuencia de uno o más residuos de aminoácido. El cuadro anterior se presenta para correlacionar las notaciones de una letra y de tres letras que pueden aparecer en forma alternativa en la presente.

Un “replicón” es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación del ADN in vivo ; es decir, capaz de mostrar replicación bajo su propio control.

Un “vector” es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al cual otro segmento de ADN puede ser unido para producir la replicación del segmento unido.

Una “molécula de ADN” se refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) en su forma de cadena sencilla o una hélice de doble cadena. Este término se refiere sólo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a alguna forma terciaria particular. De esta manera, este término incluye ADN de doble cadena encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. En la discusión de la estructura de moléculas de ADN de doble cadena particulares, las secuencias pueden describirse en la presente de acuerdo con la convención normal de que se den sólo las secuencias en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa al ARNm).

Un “origen de replicación” se refiere a aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.

Una “secuencia codificante” de ADN, es una secuencia de ADN de doble cadena que es transcrita y traducida en un polipeptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante son determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de detención de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero), e incluso secuencias de ADN sintético. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizarán usualmente 3’ a la secuencia codificante.

Las secuencias de control de la transcripción y traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotores, intensificadores, señales de poliadenilación, terminadores, y similares, que proveen la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedera.

Una “secuencia de promotor” es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula y de iniciar la transcripción de una secuencia codificante hacia el extremo 3’ (dirección 3’). Para los propósitos de definir la presente invención, la secuencia de promotor es unida en su extremo 3’ por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende hacia el extremo 5’ (dirección 5’), e incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables arriba del fondo. Dentro de la secuencia de promotor, se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente mediante el mapeo con la nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucarióticos contendrán con frecuencia, pero no siempre, cajas “TATA” y cajas “CAT”. Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10 y -35.

Una “secuencia de control de la expresión”, es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificante está “bajo el control” de secuencias de control de la transcripción y traducción en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, el cual es traducido entonces en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Una “secuencia de señal” puede estar incluida antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica para un péptido de señal, N-terminal al polipéptido, que le comunica a la célula hospedera dirigir el polipéptido hacia la superficie de la célula y secretar el polipéptido en el medio, y este péptido de señal es eliminado por la célula hospedera antes de que la proteína salga de la célula. Las secuencias de señal pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas nativas para procariontes y eucariontes.

El término “oligonucleótido”, como se usa en la presente con relación a la sonda de la presente invención, se define como una molécula que comprende dos o más ribonucleótidos, de preferencia más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores los cuales, a su vez, dependen de la función última y el uso del oligonucleótido.

El término “iniciador”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido, ya sea de ocurrencia natural como en una digesta de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se pone bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión del iniciador, el cual es complementario a una cadena de ácido nucleico, es inducida, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El iniciador puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, y debe ser suficientemente largo para iniciar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia del agente inductor. La longitud exacta del iniciador dependerá de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente del iniciador y el uso del método. Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el oligonucleótido iniciador contiene típicamente 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.

Los iniciadores se seleccionan en la presente para ser “sustancialmente” complementarios a las diferentes cadenas de una secuencia de ADN objetivo particular. Esto significa que los iniciadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus cadenas respectivas. Por lo tanto, la secuencia del iniciador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de nucleótido no complementario puede ser unido al extremo 5’ del iniciador, siendo complementario el resto de la secuencia del iniciador a la cadena. En forma alternativa, bases no complementarias o secuencias más largas pueden estar intercaladas en el iniciador, siempre que la secuencia del iniciador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridar con la misma y formar de esta manera el molde para la síntesis del producto de extensión.

Como se usa en la presente, los terminos “endonucleasas de restricción” y “enzimas de restricción” se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta el ADN de doble cadena en o cerca de una secuencia de nucleótidos específica.

Una célula ha sido “transformada” por ADN exógeno o heterólogo, cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN transformante puede ser o no integrado (enlazado covalentemente) en ADN cromosómico, constituyendo el genoma de la célula. En procariontes, levaduras y células de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede ser mantenido en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula establemente transformada es una en la cual el ADN transformante ha llegado a ser integrado en un cromosoma, de modo que es heredado por las células hijas a través de la replicación de los cromosomas. Esta estabilidad es demostrada por la capacidad de la célula eucariótica para establecer líneas de células o clones que comprenden una población de células hijas que contienen al ADN transformante. Un “clon” es una población de celulas derivadas de una célula individual o ancestro común por mitosis. Una “línea de células” es un clon de una célula primaria que es capaz de mostrar crecimiento estable in vitro por muchas generaciones.

Dos secuencias de ADN son “sustancialmente homologas”, cuando por lo menos aproximadamente 75% (de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90 o 95%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas pueden identificarse comparando las secuencias usando software estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la aptitud de la téenica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., citado anteriormente; DNA Cloning, Vols. I y II, citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, citado anteriormente.

Debe apreciarse que también dentro del alcance de la presente invención, están secuencias de ADN que codifican para miembros de unión específicos (anticuerpos) de la invención que codifican para, por ejemplo, un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos como se provee en las figuras 2 o 10, o que comprenden las secuencias de la región de dominio de CDR expuestas en la presente o en la figura 10, pero las cuales son degeneradas con la misma. Por el término “degenera hacia”, se entiende que un diferente codón de tres letras se usa para especificar un aminoácido particular. Es bien sabido en la téenica que los siguientes codones pueden usarse recíprocamente para codificar para cada aminoácido específico: Fenilalanina (Phe o F) UUU o UUC Leucina (Leu o L) UUA o UUG o CUU o CUC o CUA o CUG Isoleucina (lie o 1) AUU o AUC o AUA Metionina (Met o M) AUG Valina (Val o V) GUU o GUC o GUA o GUG Serina (Ser o S) UCU o UCC o UCA o UCG o AGU o AGC Prolina (Pro o P) CCU o CCC o CCA o CCG Treonina (Thr o T) ACU o ACC o ACA o ACG Alanina (Ala o A) GCU o GCG o GCA o GCG Tirosina (Tyr o Y) UAU o UAC Histidina (His o Fl) CAU o CAC Glutamina (Gln o Q) CAA o CAG Asparagina (Asn o N) AAU o AAC Lisina (Lys o K) AAA o AAG Ácido aspártico (Asp o D) GAU o GAC Ácido glutámico (Glu o E) GAA o GAG Cisteína (Cys o C) UGU o UGC Arginina (Arg o R) CGU o CGC o CGA o CGG o AGA o AGG Glicina (Gly o G) GGU o GGC o GGA o GGG Triptófano (Trp o W) UGG Codón de terminación UAA (ocre) o UAG (ámbar) o UGA (ópalo).

Debe entenderse que los codones especificados anteriormente son para secuencias de ARN. Los codones correspondientes para ADN tienen una T que sustituye a U.

Pueden hacerse mutaciones en las secuencias que codifican para los aminoácidos, fragmentos de anticuerpo, secuencias de la región CDR expuestas en las figuras 5 o 6, o en las secuencias de ácido nucleico expuestas en las figuras 5 o 6, de modo que un codón particular es cambiado por un codón que codifica para un aminoácido diferente. Dicha mutación se hace generalmente haciendo el menor número posible de cambios de nucleótidos. Una mutación por sustitución de este tipo puede hacerse para cambiar un aminoácido en la proteína resultante en una manera no conservativa (por ejemplo, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o característica particular, por un aminoácido que pertenece a otro grupo) o en una manera conservativa (por ejemplo, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular, por un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio conservativo lleva generalmente a menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Es más probable que un cambio no conservativo altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. Debe considerarse que la presente invención incluye secuencias que contienen cambios conservativos que no alteran significativamente las características de actividad o unión de la proteína resultante.

El siguiente es un ejemplo de varios grupos de aminoácidos: Aminoácidos con grupos R no polares Alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano, metionina Aminoácidos con grupos R polares no cargados Glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina Aminoácidos con grupos R polares cargados (cargados negativamente a pH 6.0) Ácido aspártico, ácido glutámico Aminoácidos básicos (cargados positivamente a pH 6.0) Usina, arginina, histidina (a pH 6.0).

Otro grupo puede ser aquellos aminoácidos con grupos fenilo: Fenilalanina, triptófano, tirosina Otro grupo puede ser de acuerdo con el peso molecular (es decir, tamaño de los grupos R): Glicina 75 Alanina 89 Serina 105 Prolina 115 Valina 117 Treonina 119 Cisteína 121 Leucina 131 Isoleucina 131 Asparagina 132 Ácido aspártico 133 Glutamina 146 Lisina 146 Ácido glutámico 147 Metionina 149 Histidina (a pH 6.0) 155 Fenilalanina 165 Arginina 174 Tirosina 181 Triptófano 204 Sustituciones particularmente preferidas son: - Lys por Arg y viceversa, de modo que una carga positiva puede ser mantenida; - Glu por Asp y viceversa, de modo que una carga negativa puede ser mantenida; - Ser por Thr, de modo que un -OH libre puede ser mantenido; y - Gln por Asn, de modo que un NH2 libre puede ser mantenido. Ejemplos de sustituciones conservativas de aminoácidos preferidas, incluyen cualquiera de: glutamina (Q) por ácido glutámico (E) y viceversa; leucina (L) por valina (V) y viceversa; serina (S) por treonina (T) y viceversa; isoleucina (I) por valina (V) y viceversa; lisina (K) por glutamina (Q) y viceversa; isoleucina (I) por metionina (M) y viceversa; serina (S) por asparagina (N) y viceversa; leucina (L) por metionina (M) y viceversa; lisina (L) por ácido glutámico (E) y viceversa; alanina (A) por serina (S) y viceversa; tirosina (Y) por fenilalanina (F) y viceversa; ácido glutámico (E) por ácido aspártico (D) y viceversa; leucina (L) por ¡soleucina (I) y viceversa; y lisina (K) por arginina (R) y viceversa.

Pueden introducirse tambien sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, una Cys puede ser introducida en un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede ser introducida como un sitio particularmente “catalítico” (es decir, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en catálisis bioquímica). Pro puede ser introducida debido a su estructura particularmente plana, la cual induce giros beta en la estructura de la proteína.

Dos secuencias de aminoácidos son “sustancialmente homologas”, cuando por lo menos aproximadamente 70% de los residuos de aminoácido (de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90 o 95%) son idénticos, o representan sustituciones conservativas. Las regiones CDR de dos anticuerpos son sustancialmente homologas, cuando uno o más aminoácidos son sustituidos con una sustitución de aminoácido conservativa o similar, y en donde el anticuerpo o los anticuerpos tienen el perfil de unión y las actividades de una o más de lgM12 o lgM42 descritas en la presente.

Una región “heteróloga” de la construcción de ADN es un segmento de ADN identificable dentro de una molécula de ADN más larga que no se encuentra en asociación con la molécula más larga en la naturaleza. De esta manera, cuando la región heteróloga codifica para un gen de mamífero, el gen será flanqueado usualmente por ADN que no flanquea al ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción en donde la secuencia codificante misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en donde la secuencia codificante genómica contiene intrones, o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Las variaciones alélicas de eventos mutacionales de ocurrencia natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en la presente.

Una secuencia de ADN está “enlazada operativamente” a una secuencia de control de la expresión, cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de ADN. El término “enlazado operativamente” incluye que tiene una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) enfrente de la secuencia de ADN que va a ser expresada y que mantiene el marco de lectura correcto que permite la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de control de la expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de inicio apropiada, dicha señal de inicio puede ser insertada enfrente del gen.

El término “condiciones de hibridación estándar” se refiere a condiciones de sal y temperatura sustancialmente equivalentes a 5x SSC y 65°C para hibridación y lavado. Sin embargo, el experto en la téenica apreciará que dichas “condiciones de hibridación estándar” dependen de condiciones particulares que incluyen la concentración de sodio y magnesio en el regulador de pH, la longitud y concentración de la secuencia de nucleótidos, el por ciento de no apareamientos, el por ciento de formamida, y similares. También importante en la determinación de las “condiciones de hibridación estándar”, es si las dos secuencias que hibridan son ARN-ARN, ADN-ARN o ARN-ADN. Dichas condiciones de hibridación estándar son determinadas fácilmente por el experto en la téenica de acuerdo con fórmulas bien conocidas, en donde la hibridación ocurre típicamente 10 a 20°C abajo de la Tm (temperatura de fusión) predicha o determinada, con lavados de mayor severidad, si se desea.

El término “agente” significa cualquier molécula, incluyendo polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos, compuestos químicos y pequeñas moléculas. En particular, el término agente incluye compuestos tales como compuestos de prueba o compuestos de fármaco candidatos.

El término “agonista” se refiere a un ligando que estimula al receptor con el que el ligando se une en el sentido más amplio.

El término “prueba o ensayo” significa cualquier procedimiento usado para medir una propiedad específica de un compuesto. Una “prueba de selección” significa un procedimiento usado para caracterizar o seleccionar compuestos con base en su actividad de una colección de compuestos.

El término “prevenir” o “prevención” se refiere a una reducción en riesgo de que se adquiera o se desarrolle una enfermedad o trastorno (es decir, haciendo que por lo menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrolle) en un sujeto que puede estar expuesto a un agente que causa la enfermedad, o predispuesto a la enfermedad antes del inicio de la enfermedad.

El término “profilaxis" está relacionado con y es abarcado en el término “prevención”, y se refiere a una medida o procedimiento cuyo propósito es prevenir, más que tratar o curar, una enfermedad. Ejemplos no limitativos de medidas profilácticas pueden incluir la administración de vacunas; la administración de heparina de bajo peso molecular a pacientes de un hospital en riesgo de trombosis debido, por ejemplo, a inmovilización; y la administración de un agente antipalúdico tal como cloroquina, antes de una visita a una región geográfica en donde la malaria es endémica o el riesgo de que se contraiga la malaria es alto.

Una “cantidad terapéuticamente efectiva” significa esa cantidad de un fármaco, compuesto, agente, anticuerpo o agente farmacéutico que inducirá la respuesta biológica o médica de un sujeto, que está siendo buscada por un médico u otro médico clínico. En particular, con respecto a enfermedades o condiciones neurológicas, se pretende que el término “cantidad efectiva” incluya una cantidad efectiva de un compuesto o agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, que producirá un cambio biológicamente significativo en un parámetro clínicamente relevante de la enfermedad. Esto puede incluir un cambio en la cantidad de lesión neurológica o muerte observable o evaluable tras la formación de imágenes, un cambio en un parámetro funcional tal como movimiento, lenguaje o cognición, o la ausencia o reducción de dicho cambio bajo condiciones de riesgo o susceptibilidad. La frase “cantidad terapeuticamente efectiva”, como se usa en la presente, significa una cantidad suficiente para mejorar o prevenir, y de preferencia reducir por cuando menos aproximadamente 20 por ciento, por lo menos aproximadamente 30 por ciento, más preferiblemente por cuando menos 50 por ciento, más preferiblemente por cuando menos 70 por ciento, más preferiblemente por cuando menos 80 por ciento, muy preferiblemente por cuando menos 90 por ciento, un cambio clínicamente significativo en un fenómeno mensurable o evaluable, o característica de patología, o evaluación de función.

El término “tratar” o “tratamiento” de cualquier enfermedad, condición, lesión o infección se refiere, en una modalidad, a la mejora de la enfermedad, condición, lesión o infección (es decir, la detención de la muerte de o la lesión a una célula o tejido, o la reducción de la manifestación, grado o severidad de por lo menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra modalidad, el término “tratar” o “tratamiento” se refiere a la mejora de por lo menos un parámetro físico, el cual puede no ser discernible por el sujeto. En otra modalidad, el término “tratar" o “tratamiento” se refiere a modular la enfermedad, condición, lesión o infección, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambos. En otra modalidad, el término “tratar” o “tratamiento” se refiere a retardar la progresión de una enfermedad o reducir la cantidad de lesión, daño o muerte a células o tejidos.

La frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que no producen típicamente una reacción adversa alérgica o similar, tal como malestar gástrico, mareo y similares, cuando se administran a un humano.

Como se usa en la presente, “pg” significa picogramo, “ng” significa nanogramo, “ug” o “pg” significa microgramo, “mg” significa miligramo, “ul” o “pl” significa microlitro, “mi” significa mililitro, y ?” significa litro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los agentes neuroprotectores están dirigidos a prevenir y tratar complicaciones que dan como resultado daño del SNC. Los compuestos o agentes con capacidad para neuroprotección tienen aplicación en trastornos agudos tales como apoplejía y lesiones del sistema nervioso, así como en enfermedades crónicas tales como trastornos neurodegenerativos. Muchos de los mecanismos subyacentes de daño a los tejidos neurales son similares en estas condiciones, y un compuesto o agente neuroprotector podría usarse en más de un trastorno. Las enfermedades incluyen trastornos cerebrovasculares, lesión traumática del cerebro, lesión de médula espinal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple, epilepsia, enfermedades de neuronas motoras y neuropatía isquémica. Otras aplicaciones incluyen neuroprotección durante la anestesia y la cirugía. Numerosos productos se han investigado por efectos neuroprotectores que incluyen aquellos de las categorías de barredores de radicales libres, agentes anti-excitotóxicos, inhibidores de apoptosis (muerte celular programada), agentes antiinflamatorios, factores neurotróficos, quelantes de iones de metal, moduladores de los canales de iones y terapia genica. Varios productos neuroprotectores candidatos han alcanzado pruebas clínicas y han fallado para mostrar significancia, incluyendo antagonistas de NMDA y agentes para reducir la liberación de neurotransmisores. Véase Clark WM et al. (2000) Stroke 31 (6): 1234-9; Sarco Rl et al. (2001) JAMA 285 (13): 1719-28; Albers, GW et al. (2001) JAMA 286(21): 2673-82). Un reto para los agentes neuroprotectores, es la especificidad y la focalización, de modo que los efectos del agente son dirigidos contra la lesión o neuronas dañadas/comprometidas sin actividad significativa contra las células normales, y de esta manera efectos secundarios adversos, incluso potencialmente peligrosos. La presente invención provee ahora agentes específicos y tolerables capaces de cruzar la barrera hemoencefálica y de elegir como objetivo áreas de lesión, compromiso o daño para efectuar la protección, con efectos adversos mínimos sobre las neuronas normales.

La invención provee generalmente miembros de unión específicos, en particular anticuerpos que demuestran unión a neuronas, con aplicación como agentes neuroprotectores para su uso en diagnóstico, monitoreo, mejora y tratamiento de enfermedades o condiciones en donde las neuronas o las celulas nerviosas están comprometidas, incluyendo condiciones neurodegenerativas, y lesión y muerte de células nerviosas. Los anticuerpos de la presente invención tienen ciertas cualidades únicas y notables que los hacen particularmente útiles y aplicables en neuroprotección y/o neuro-regeneración, y en el diagnóstico y terapéutica para enfermedades y condiciones neurológicas. Se demuestra en la presente que los anticuerpos novedosos de la invención, en particular los anticuerpos recombinantes, cruzan la barrera hemoencefálica efectivamente y sin modificación alguna, para proteger a las neuronas de la muerte celular, y para elegir como objetivo lesiones neurales y sitios de lesión en el SNC. Los anticuerpos mejoran la función nerviosa y mantienen los axones en modelos animales de lesión axonal crónica y desmielinización. Los anticuerpos tienen toxicidad mínima en los animales, y no exacerban las condiciones autoinmunes, según se evalúa en modelos animales.

La invención provee generalmente miembros de unión específicos, en particular anticuerpos que demuestran unión a neuronas, con aplicación como agentes terapéuticos, solos o en combinación con otros agentes neuroactivos o agentes neuroactivos alternativos, para la mejora y el tratamiento de enfermedades y condiciones en donde las neuronas o las células nerviosas están comprometidas, incluyendo condiciones neurodegenerativas, y lesión y muerte de células nerviosas. La solicitud provee evidencia de la capacidad y la actividad terapéuticamente relevante de los anticuerpos de la presente invención, incluyendo lgM12, en modelos animales de enfermedades o deficits neurológicos. En particular, los estudios provistos en la presente demuestran capacidad y actividad en un modelo del TMEV, en un modelo animal reconocido de enfermedad de neuronas motoras y en particular ALS, y provee estudios en modelos de lesión de médula espinal. En particular, la presente solicitud provee evidencia de la capacidad y actividad terapéuticamente relevante de los anticuerpos de la presente invención, incluyendo lgM12, en modelos animales de apoplejía y trombosis cerebral o isquemia cerebral. Los estudios provistos en la presente demuestran capacidad y actividad en un modelo animal reconocido de apoplejía e isquemia cerebral. Se proveen composiciones para su uso en la mejora o el tratamiento de cualquiera de dichas enfermedades, o en la prevención de lesión nerviosa o protección de nervios en casos de compromiso o riesgo de compromiso.

Estudios previos con lgM12 e lgM42 han mostrado que el anticuerpo derivado del suero se une a las neuronas del SNC, sustentan la extensión de las neuritas sobre un substrato recubierto de anticuerpos, y hacen caso omiso de la inhibición de la extensión de las neuritas de la mielina del SNC en estudios in vitro (véase Warrington A et al. (2004) J Neuropath Exp Neurol 63(5): 461-473). Los estudios de animales con TMEV e inyectados con sHlgM12 mostraron actividad nocturna espontánea incrementada; sin embargo, no se evaluaron los títulos del virus en los animales, y no pudieron determinarse efectos antivirales posibles (véase Rodrigues M et al. (2009) Neurology 72: 1269-1276). Los estudios descritos en la presente proveen el anticuerpo recombinante 12 completamente humano y la secuencia del anticuerpo 42, así como rHlgM42 recombinante. Se proveen ahora estudios que demuestran los efectos neuroprotectores y terapéuticamente relevantes notables de estos anticuerpos recombinantes y derivados del suero en animales y modelos animales de enfermedad, asi como su unión específica/focalización hacia sitios de lesión neural. En particular, los estudios que usan modelos animales de isquemia cerebral y apoplejía proveen demostración de los efectos terapéuticamente relevantes de estos anticuerpos recombinantes y derivados del suero, en particular lgM12 recombinante, rHlgM12, en apoplejía, isquemia cerebral y condiciones de o que resultan de la pérdida de flujo sanguíneo hacia el cerebro o las células en el SNC.

Anticuerpos v composiciones Los anticuerpos monoclonales humanos autorreactivos están bajo la clasificación de autoanticuerpos naturales humanos (NatAbs) (Cohén I. R. (2007) J Autoimmun 29: 246-249). Los NatAbs son parte del repertorio de inmunoglobulinas humanas (Cohén, I. R. y M. Schwartz (1999) Journal of neuroimmunology 100: 111-114), obtenidos naturalmente de genes humanos, usualmente sin mutaciones somáticas, y pueden funcionar para estimular procesos celulares o remover restos de células (Lutz, HU (2007) J Autoimmun 29: 287-294). Los NatAbs reaccionan con los autoantígenos, mientras que los anticuerpos convencionales reaccionan con los antígenos exógenos. Los NatAbs son de afinidad relativamente baja, usualmente poli-reactivos, y son con frecuencia moleculas de inmunoglobulina. El mecanismo de acción de estas moléculas de inmunoglobulina humanas parece ser similar, actuando a través de los microdominios de la membrana. Los NatAbs son por definición poli-reactivos, y por lo tanto la identificación del antígeno relevante para una función in vivo específica, puede ser un reto. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende actualmente que estas moléculas de inmunoglobulina se unen a moléculas de entrelazamiento de los microdominios de la membrana sobre la superficie de la célula. Las moléculas no normalmente en contexto son reunidas, ensamblando un complejo de señalización (Rodríguez, M., A. E. Warrington y L. R. Pease (2009) Neurology 72: 1269-1276).

Por consiguiente, se identificaron moléculas terapéuticas seleccionando para anticuerpos monoclonales (mAbs) humanos auto-reactivos de los sueros de individuos que poseen los mAbs a alta concentración sin enfermedad mediada por anticuerpos. Dichos mAbs se ponen a prueba para unión a la superficie de las células del sistema nervioso sin considerar el antígeno. Los mAbs se ponen a prueba entonces por su capacidad para modular un modelo de enfermedad. Este método de identificación de los mAbs con eficacia biológica es diferente de la metodología usada comúnmente por la industria farmacéutica (Rodríguez, M., A. E. Warrington y L. R. Pease (2009) Neurology 72: 1269-1276). Se ha demostrado que ciertas moléculas de inmunoglobulina humanas pueden promover la remielinización (Warrington AE et al. (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 6820-6825). Por ejemplo, una de dichas moléculas de inmunoglobulina es el anticuerpo monoclonal humano recombinante rHlgM22 que promueve la remielinización (Mitsunaga YB et al. (2002) Faseb J 16: 1325-1327). El anticuerpo rHlgM22 se une a los oligodendrocitos y la mielina, y promueve la remielinización del SNC en virus y modelos de MS inducida por toxinas (Warrington AE et al (2000) Proc Nati Acad Sci U S A 97: 6820-6825; Bieber AJ et al. (2002) Glia 37: 241-249). Spinal cord remyelination is induced after a single low dose of rHlgM22 (Warrington AE et al. (2007) J Neurosci Res 85: 967-976).

Es notable que un tratamiento intraperitoneal (i.p.) con una molécula de vida corta (vida media de 15 horas estimada en ratones) promueve la reparación máxima del tejido dentro de 5 semanas en un modelo de MS con poca reparación espontánea inherente. Después de la inyección periférica, rHlgM22 cruza la barrera hemoencefálica (BBB) y se acumula dentro del cerebro y lesiones de la médula espinal de ratones con desmielinización. Se ha detectado a rHlgM22 marcado con perlas de ferritina en lesiones in vivo mediante MRI (Pirko I et al. (2004) Faseb J 18: 1577-1579). Se ha descrito también un anticuerpo de IgM humana en suero adicional con capacidad de remielinización, sHlgM46, y su contraparte recombinante rHlgM46. Los anticuerpos sHlgM22 y sHlgM46 derivados del suero, y versiones recombinantes de los mismos, y métodos para la remielinización se describen, por ejemplo, en el documento WO 0185797. El anticuerpo rHlgM22 y métodos de producción del mismo se contemplan, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 7,473,423 y 7,807166.

La invención provee anticuerpos humanos, incluyendo anticuerpos monoclonales y en particular anticuerpos recombinantes, que demuestran actividad en la promoción, estimulación, protección y/o regeneración de neuronas en el sistema nervioso central. Los presentes anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos, demuestran actividad en neuroprotección, preservación y regeneración neuronal y del axón, en la prevención o reducción de la muerte de células nerviosas mediada por la lesión en el sistema nervioso central. Los anticuerpos son aplicables en el tratamiento o mejora de enfermedades o condiciones, o en la prevención o reducción de déficits de células nerviosas y muerte de células nerviosas o apoptosis asociada con enfermedades o condiciones, en particular en donde los nervios son dañados, lesionados o de otra manera son comprometidos. Las condiciones o enfermedades para el uso o la aplicación de los anticuerpos de la invención, incluyen escenarios en donde la pérdida de estructura, función o supervivencia de las neuronas está implicada o está asociada, incluyendo trauma o lesión del cerebro, lesión de médula espinal (SCI), lesión nerviosa, lesión de la cabeza, condiciones en donde el riego sanguíneo hacia el cerebro es reducido o comprometido, enfermedades infecciosas del cerebro y enfermedades neurodegenerativas. Ejemplos de dichas enfermedades o condiciones incluyen lesión de médula espinal (SCI), esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, apoplejía, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, anoxia prenatal/isquemia perinatal y/o parálisis cerebral, encefalopatía, mielopatía y enfermedades de neuronas motoras.

Los anticuerpos o agentes neuromoduladores de la invención tienen una o más de las siguientes características: protegen y/o estabilizan a las neuronas; eligen como objetivo sitios en el SNC o daño, compromiso o lesión de celulas nerviosas; y/o bloquean la muerte celular, por ejemplo, la muerte celular inducida por peróxido de hidrógeno. La invención provee anticuerpos monoclonales de la invención que se unen a neuronas que son capaces de promover la extensión de las neuritas y de proteger a las neuronas del daño para propósitos de diagnóstico y terapéuticos en el sistema nervioso central. En particular, se proveen anticuerpos recombinantes, en donde dichos anticuerpos reconocen y son capaces de unirse a neuronas, incluyendo neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, células granulares cerebelares y células ganglionares retínales.

La presente invención provee ejemplos de anticuerpos o fragmentos de los mismos, anticuerpo 12 y anticuerpo 42, en particular lgM12 o lgM42 recombinantes o derivados del suero. En otro aspecto particular, el anticuerpo de la invención comprende la secuencia de aminoácidos del anticuerpo 12 o 42, incluyendo como se expone en la figura 5 y/o la figura 6. El anticuerpo recombinante lgM12 de la presente invención comprende la secuencia de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 1) y de cadena ligera (SEQ ID NO: 11) como se expone en la figura 5. El anticuerpo recombinante lgM42 de la presente invención comprende la secuencia de cadena pesada variable (SEQ ID NO: 17) y de cadena ligera (SEQ ID NO: 27) como se expone en la figura 6. En un aspecto de la invención, se provee un anticuerpo que se une a neuronas sintetico o recombinante que comprende las secuencias de CDR de la región variable expuestas en las figuras 5 y 6. El anticuerpo 12 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5. El anticuerpo 42 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), como se exponen en la figura 6.

Paneles de anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, incluyendo fragmentos Fab o colecciones de exhibiciones de fagos, los cuales son capaces de reconocer neuronas, en particular neuronas humanas, pueden seleccionarse para varias propiedades, es decir, afinidad, isotipo, epítope, estabilidad, etc. De interés particular son los anticuerpos que imitan la actividad de los ejemplos de anticuerpos lgM12 e lgM42, y tienen la capacidad de unirse a las neuronas y de proteger a las neuronas de la muerte o lesión celular tal como, por ejemplo, muerte celular mediada por peróxido. Dichos anticuerpos pueden ser fácilmente identificados y/o seleccionados en pruebas de actividad y unión específicas. Los anticuerpos recombinantes que comprenden la región de unión al antígeno o las regiones CDR de cadena pesada y/o ligera de los presentes anticuerpos lgM12 y/o lgM42, pueden generarse y seleccionarse para actividad.

En general, las regiones CDR, que comprenden secuencias de aminoácidos sustancialmente como se exponen en las regiones CDR de las figuras 5 y 6, serán llevadas en una estructura que permite la unión de las regiones CDR a la superficie o en la superficie de las neuronas, y en particular a las neuronas de mamífero, en particular neuronas de humano, mono, babuino, rata y/o ratón. Por el termino “sustancialmente como se expone”, se entiende que las secuencias de la región variable, y/o en particular las secuencias de CDR de la invención, serán idénticas o altamente homologas a las regiones especificadas de las figuras 5 y 6. Por el término “altamente homologas”, se contempla que sólo unas cuantas sustituciones, de preferencia de 1 a 8, de preferencia de 1 a 5, de preferencia de 1 a 4, o de 1 a 3, o 1 o 2 sustituciones, pueden hacerse en las secuencias de la región variable y/o en las secuencias de CDR. El término “sustancialmente como se expone”, incluye en particular sustituciones conservativas de aminoácidos que no afectan materialmente o significativamente la especificidad y/o actividad de los anticuerpos en cuestión.

Pueden hacerse sustituciones en la secuencia de la región variable fuera de las CDRs para retener las secuencias de CDR. De esta manera, pueden introducirse o usarse cambios en la secuencia de la región variable o secuencias de la región variable no homologas u ocultas alternativas, de modo que las secuencias de CDR sean mantenidas, y el resto de las secuencias de la región variable puedan ser sustituidas. En forma alternativa, pueden hacerse sustituciones en particular en las CDRs. Secuencias de CDR para los anticuerpos de la presente invención se exponen y se describen en la presente, incluyendo en las figuras 5 y 6. El anticuerpo 12 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5. El anticuerpo 42 comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), como se exponen en la figura 6. Los anticuerpos de la invención que tienen sustituciones como se describieron anteriormente y se contemplan se seleccionan para mantener las actividades y especificidad en proporción con los ejemplos de modalidades, incluyendo los anticuerpos lgM12 e lgM42, y que tienen las características como se exponen en la presente y en las reivindicaciones.

La estructura para llevar las CDRs de la invención será generalmente de una secuencia de cadena ligera o pesada de anticuerpo o porción sustancial de la misma en la cual las regiones CDR se localizan en sitios que corresponden a la región CDR de los dominios variables de anticuerpo VH y VL de ocurrencia natural codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y los sitios de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse haciendo referencia a Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a. edición, US Department of Health and Human Services, 1987, y actualizaciones de esta cita, ahora disponible en la Internet (immuno.bme.nwu.edu). Los dominios variables pueden derivarse de cualquier dominio variable de humano reordenado o de la línea germinal, o pueden ser un dominio variable sintético basado en las secuencias consenso de dominios variables conocidos de humano. Las secuencias derivadas de CDR de la invención, como se definió en el párrafo anterior, pueden introducirse en un repertorio de dominios variables que carecen de regiones CDR, usando teenología de ADN recombinante.

Por ejemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10: 779-783) describen métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales iniciadores consenso dirigidos en o adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable, se usan en conjunto con los iniciadores consenso hacia la tercera región de estructura de genes de VH de humano para proveer un repertorio de dominios variables de VH que carecen de una CDR o varias CDRs. Marks et al. describen además cómo este repertorio puede combinarse con una CDR de un anticuerpo particular. El repertorio puede ser exhibido entonces en un sistema de hospedero adecuado, tal como el sistema de exhibición de fagos del documento W092/01047, de modo que puedan seleccionarse miembros de unión específicos adecuados. Un repertorio puede consistir desde cualquiera de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo, de 106 a 108 o 101° miembros. Téenicas combinatorias o de entremezclado análogas son descritas también por Stemmer (Nature, 1994, 370: 389-391), quien describe la técnica con relación al gen de b-lactamasa, pero observa que el procedimiento puede usarse para la generación de anticuerpos.

Otra alternativa es generar regiones de VH o VL novedosas que posean las secuencias derivadas de CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de, por ejemplo, los genes de VH o VL del anticuerpo para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Dicha técnica es descrita por Gram et al. (1992, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 89: 3576-3580), quienes usaron PCR propensa a errores. Otro método que puede usarse es dirigir la mutagénesis hacia las regiones CDR de genes de VH o VL. Dichas técnicas son descritas por Barbas etal. (1994, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91: 3809-3813) y Schier et al. (1996, J. Mol. Biol. 263: 551-567). Todas las técnicas descritas anteriormente se conocen como tales en la técnica. El experto en la técnica será capaz de usar dichas técnicas para proveer los miembros de unión específicos de la invención usando la metodología de rutina en la técnica.

Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá por lo menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura intermedias. De preferencia, la porción incluirá tambien por lo menos aproximadamente 50% de cualquiera de la primera y cuarta regiones de estructura, o ambas, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región de estructura y el 50% N-terminal de la cuarta región de estructura. Residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos no normalmente asociados con las regiones de dominio variable de ocurrencia natural. Por ejemplo, la construcción de los miembros de unión específicos de la presente invención hecha mediante téenicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por enlazadores introducidos que facilitan la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores que unen los dominios variables de la invención con otras secuencias de proteína que incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de cuerpos bivalentes) o marcadores de proteínas como se provee en la presente y/o como es sabido por los expertos en la técnica.

Aunque en un aspecto preferido de la invención, se prefieren anticuerpos recombinantes que comprenden un par de dominios de unión basados en las secuencias sustancialmente expuestas en las figuras 5 y/o 6, dominios de unión individuales basados en cualquiera de estas secuencias forman otros aspectos de la invención. En el caso de los dominios de unión basados en la secuencia expuesta sustancialmente en las figuras 5 y/o 6, dichos dominios de unión pueden usarse como agentes de focalización para neuronas del SNC, en particular sitios de daño o lesión nerviosa, puesto que se sabe que los dominios de VH de ¡nmunoglobulina son capaces de unirse a antígenos objetivo en una manera específica.

Los miembros de unión específicos de la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes basados en las secuencias de VH y VL de las figuras 5 y 6 pueden ser unidos en su extremo C-terminal a los dominios constantes de la cadena ligera del anticuerpo que incluyen las cadenas CK O CX humanas, de preferencia las cadenas CX, incluyendo dominios constantes que son distintos o variantes de los dominios constantes respectivos expuestos en las figuras 5 o 6. Asimismo, los anticuerpos recombinantes basados en las secuencias de las figuras 5 o 6 pueden ser unidos en su extremo C-terminal a la totalidad o parte de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE, IgD e IgM, y cualquiera de las subclases de ¡sotipos, en particular lgG1, lgG2b e lgG4, y entonces puestos a prueba para afirmar o determinar capacidad y actividad adecuada y/o comparable. Se prefiere la IgM.

Los anticuerpos, o cualquier fragmento de los mismos, pueden ser conjugados o fusionados en forma recombinante con cualquier toxina celular, exotoxina bacteriana u otra exotoxina, por ejemplo, de Pseudomonas, ricina o toxina de la difteria. La parte de la toxina usada puede ser la toxina entera, o cualquier dominio particular de la toxina. Dichas moléculas de toxina-anticuerpo se han usado exitosamente para la focalización y terapia de diferentes tipos de cánceres; véase, por ejemplo, Pastan, Biochem Biophys Acta. Octubre 24 de 1997; 1333(2): C1-6; Kreitman et al., N Engl J Med. Julio 26 de 2001; 345(4): 241-7; Sohnell et al., Leukemia. Enero de 2000; 14(1): 129-35; y Ghetie et al., Mol Biotechnol. Julio de 2001; 18(3): 251-68. Pueden formarse multímeros biespecíficos y triespecíficos por la asociación de diferentes moléculas de scFv, y se han diseñado como reactivos de entrelazamiento para el reclutamiento de células T en tumores (inmunoterapia), re-focalización viral (terapia génica) y como reactivos de aglutinación de eritrocitos (inmunodiagnóstico); véase, por ejemplo, Todorovska et al., J Immunol Methods. Febrero 1 de 2001; 248(1-2): 47-66; Tomlinson et al., Methods Enzymol. 2000; 326: 461-79; McCall et al., J Immunol. Mayo 15 de 2001; 166(10): 6112-7.

Los anticuerpos de la invención pueden ser marcados con un marcador detectable o funcional. Marcadores detectables incluyen, pero no están limitados a, marcas radiactivas tales como los isótopos de 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121l, 124l, 125l, 131l, 111ln, 117Lu, 211At, 198Au, 67Cu, 225AC; 213BÍ, 99TC y 186Re; los cuales pueden ser unidos a los anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la téenica de formación de imágenes de anticuerpos. Los marcadores incluyen también marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo Texas) y marcadores usados convencionalmente en la teenica para la formación de imágenes de MRI-CT. Incluyen también marcadores de enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, b-glucuronidasa, b-galactosidasa o ureasa. Los marcadores incluyen además porciones químicas tales como biotina, la cual puede detectarse por medio de la unión a una porción detectable de cognado específica, por ejemplo, avidina marcada. Los marcadores funcionales incluyen sustancias que son diseñadas para ser dirigidas hacia el sitio de compromiso, daño o lesión para brindar la protección de o causar la destrucción del tejido neural. Dichos marcadores funcionales incluyen fármacos citotóxicos tales como 5-fluorouracilo o ricina, y enzimas tales como nitro-reductasa o carboxipeptidasa bacteriana, las cuales son capaces de convertir los profármacos en fármacos activos en el sitio. Se contemplan inmunoconjugados o proteínas de fusión con anticuerpos de la presente invención, en donde los anticuerpos y fragmentos de los mismos son conjugados o unidos a otras moléculas o agentes que incluyen además, pero no están limitados a, miembros de unión conjugados con un agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citocina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico o fármaco. Cuando se usan marcadores radiactivos, pueden usarse procedimientos de conteo conocidos disponibles actualmente para identificar y cuantificar los miembros de unión específicos. En el caso en donde el marcador es una enzima, la detección puede lograrse mediante cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, fluoroespectrofotometricas, amperométricas o gasométricas actualmente utilizadas conocidas en la materia.

Modelos animales in vivo de complicaciones que dan como resultado daño del SNC, incluyendo lesión o daño de células nerviosas, o de condiciones neurodegenerativas, pueden ser usados por los expertos en la téenica para adicionalmente seleccionar, evaluar y/o verificar los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la presente invención, variantes de los mismos o de combinaciones de los mismos, o de combinaciones con otros anticuerpos reactivos del SNC. Dichos modelos animales incluyen, pero no están limitados a, modelos de condiciones o enfermedades asociadas con daño, compromiso, alteración, muerte, lesión o degeneración de células nerviosas. Los modelos incluyen aquellos de o que imitan aspectos de apoplejía, lesión cerebral, isquemia, MS, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, demencia, encefalitis, meningitis, ALS o enfermedad de neuronas motoras. Los modelos de apoplejía que usan oclusión de la arteria cerebral media en primates tales como babuinos, monos o macacos, se conocen en la técnica y pueden ser adecuados (Young A et al. (1997) Stroke 28: 1471-1476; delZoppo GJ et al. (1986) Stroke 17: 1254-1265; Marshall y Ridlcy (1996) Neurodegeneration 5: 275-286). Modelos de MS tales como el del TMEV, se conocen y se describen y se usan en la presente. Modelos de ratón SOD para ALS y enfermedad de neuronas motoras, se conocen y se describen y se usan en la presente (Gurney ME et al. (1994) Science 264: 1772-1775).

Apoplejía v metodos terapéuticos Los ejemplos y estudios provistos en la presente demuestran la eficacia y aplicación de los anticuerpos provistos, descritos y contemplados en la presente, en modelos de apoplejía, isquemia y casos de hípoxia del cerebro o las células neuronales. De esta manera, en un aspecto particular, la presente invención se refiere al uso de los anticuerpos en intervención que se relaciona con apoplejía, isquemia cerebral, apoplejía supuesta o presunta, ataques isquémicos transitorios (TIAs) o apoplejías menores, o en individuos en alto riesgo de apoplejía o un evento isquémico cerebral o evento hipóxico del cerebro.

En el caso de una apoplejía, o apoplejía presunta, el tratamiento rápido es importante puesto que el peor daño de una apoplejía ocurre usualmente dentro de las primeras horas. El tratamiento más rápido da como resultado menos daño inicial y permanente o a largo plazo. El tratamiento depende de la naturaleza o causa de la apoplejía, ya sea que se restaure el flujo sanguíneo en la apoplejía isquémica debida a un coágulo sanguíneo (isquémico) o se controle la hemorragia en caso de una apoplejía hemorrágica. Las exploraciones por CT y las MRIs se usan para evaluar o diagnosticar el tipo o grado de la apoplejía. Los tratamientos actuales para la apoplejía isquémica aguda incluyen la terapia trombolítica IV, en particular con el activador de plasminógeno tipo tisular (tPA), y las terapias endovasculares, que incluyen la terapia trombolítica intraarterial y el uso de dispositivos de recuperación de coágulos. Sin embargo, el tPA tiene una ventana terapéutica limitada y se administra típicamente dentro de 3 horas del inicio de la apoplejía. La protección de las neuronas dañadas despues de la isquemia cerebral, es una estrategia prometedora que limita la discapacitación permanente. Mientras que las terapias que modulan la respuesta inflamatoria pueden tener propiedades neuroprotectoras, existen actualmente muy pocos fármacos que actúan directamente sobre las neuronas para protegerlas.

Están disponibles muchas medicaciones que pueden ayudar a prevenir la apoplejía en los pacientes de alto riesgo, en particular aquellos que han tenido ataques isquémicos transitorios (TIAs) previos o apoplejías menores. Estos fármacos pertenecen a dos categorías principales -anticoagulantes y agentes antiplaquetarios. Ejemplos de anticoagulantes incluyen heparina, cumarina, warfarina, ximelagatrán y Exanta. Estos fármacos funcionan adelgazando la sangre para ayudar a prevenir la coagulación, incluyendo en casos de trombosis de venas profundas y émbolos pulmonares, y son muy efectivos para ayudar a prevenir la apoplejía en los pacientes con fibrilación auricular. Los agentes antiplaquetarios incluyen aspirina, persantina, dipiridamol, Plavix y clopidogrel. Estos agentes previenen o reducen la agregación plaquetaria y reducen de esta manera los coágulos o la formación de coágulos, y pueden reducir el riesgo de apoplejía en los pacientes que han tenido TIAs o apoplejías isquémicas previas. A pesar de la disponibilidad de la terapia trombolítica, la apoplejía continúa siendo la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos, y la causa más común de discapacitación del adulto. Los científicos y médicos continúan buscando formas de lograr una mejor recuperación funcional en los pacientes con apoplejía. Los agentes neuroprotectores han generado interes intenso, y tienen el potencial de hacer que el cerebro sea menos susceptible a los efectos nocivos de la apoplejía.

En la valoración y evaluación del grado y los efectos de una apoplejía, los médicos clínicos y el personal médico revisan y consideran varios aspectos de las capacidades y funciones del paciente. Además de las téenicas de formación de imágenes para identificar y localizar el área de una apoplejía o coágulo e isquemia, los pacientes son evaluados usando escalas de valoración de la apoplejía y escalas de valoración funcional. Numerosas escalas son aceptadas o usadas, y serán reconocidas y conocidas por los médicos clínicos y expertos en la técnica. Las escalas de valoración funcional incluyen, por ejemplo, la escala de balance de Berg, la escala de actividades instrumentales de la vida diaria de Lawton (IADL), la escala de Rankin o escala de Rankin modificada, y la escala de apoplejía de los NIH (NIHHS). Estas escalas evalúan y determinan varios o cierto número de varios parámetros, que incluyen: función motora de las extremidades superiores e inferiores, ataxia de las extremidades, función sensitiva, lenguaje, articulación, atención, mirada fija y función visual, y el movimiento y la potencia de brazos, manos y piernas. Los pacientes pueden ser evaluados con base en una o más escalas poco después de la apoplejía o el evento isquémico, después del evento, antes y después del tratamiento, para la evaluación de tratamientos con agentes posibles o candidatos, para la comparación de tratamientos o agentes y con el tiempo, incluyendo días, semanas, meses o años.

Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de la región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos de tratamiento, prevención o diagnóstico del cuerpo humano o el cuerpo de un animal, tal como un método de neuroprotección en un mamífero, en particular en casos de apoplejía o isquemia cerebral establecida, presunta o posible, el cual comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes de la invención. Anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos que comprenden las secuencias de la región de dominio de CDR de conformidad con la invención, pueden usarse en dichos métodos. Los agentes de la invención, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, pueden usarse en casos de isquemia cerebral o apoplejía establecida, presunta o posible, incluyendo como agentes neuroprotectores en métodos para la prevención, el tratamiento o la mejora de lesión, daño o compromiso nervioso, y complicaciones que pueden resultar o resultan en daño del SNC. Los métodos de la invención son aplicables en donde la pérdida de estructura, función o supervivencia de las neuronas está implicada o asociada, incluyendo lesión o trauma cerebral, lesión de médula espinal (SCI), lesión nerviosa, lesión de la cabeza, o condiciones en donde el suministro de sangre u oxígeno hacia el cerebro es reducido o está comprometido. Ejemplos de dichas enfermedades o condiciones para el tratamiento, prevención o mejora de conformidad con los metodos de la invención, incluyen apoplejía, TIAs, isquemia cerebral, anoxia prenatal/isquemia perinatal y/o parálisis cerebral.

Los agentes de la invención, en particular anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos, pueden usarse como agentes en métodos para la prevención, el tratamiento o la mejora de apoplejía o isquemia cerebral. La presente invención provee métodos de tratamiento o mejora de apoplejía o isquemia cerebral, que comprenden administrar un anticuerpo de la presente invención, en particular un anticuerpo recombinante, en particular el anticuerpo lgM12 o lgM12 recombinante, incluyendo un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), como se exponen en la figura 5.

La presente invención provee métodos de tratamiento o mejora de enfermedades o condiciones en mamíferos, en donde nervios están comprometidos, lesionados o dañados, o escenarios en donde nervios o neuronas son susceptibles o están en riesgo de compromiso, lesión o daño, que comprenden administrar un anticuerpo recombinante o anticuerpo completamente humano o fragmento del mismo seleccionado de lgM12 e lgM42. Los métodos de la invención pueden comprender la administración de más de un anticuerpo o fragmento, incluyendo combinaciones del anticuerpo lgM12 y 42. En otro método, uno o más del anticuerpo lgM12 y/o del anticuerpo lgM42 pueden combinarse con otro anticuerpo activo sobre el SNC, en particular incluyendo uno o más de los anticuerpos rHlgM22 y/o rHlgM46. Las combinaciones de anticuerpos pueden administrarse en conjunto o en serie, y en varios tiempos y varias cantidades o concentraciones. De esta manera, el anticuerpo 12 y/o 42 puede administrarse en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, mediante administración combinada o en serie, por separado por una corta duración de tiempo o duración de tiempo más larga, incluyendo por horas, días o semanas. El anticuerpo 12 y/o 42 puede administrarse en particular en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46 (sHlgM22, rHlgM22, sHlgM46 o rHlgM46), mediante administración combinada o en serie, para el tratamiento de mejora de una enfermedad o condición que implica neurodegeneración, y en particular incluyendo desmielinización. En dicho método, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, mediante administración combinada o en serie, para el tratamiento de mejora de una enfermedad o condición desmielinizante, en particular incluyendo esclerosis múltiple (MS). Las secuencias de cadena ligera y pesada variables del anticuerpo lgM22 se exponen en SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, respectivamente. Las secuencias de cadena ligera y pesada variables del anticuerpo lgM46 se exponen en SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46, respectivamente. Uno o más del anticuerpo lgM12 y/o del anticuerpo lgM42 pueden combinarse con uno o más anticuerpos remielinizantes que comprenden (a) CDRs de la región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de CDR1 SSGMH, la secuencia de CDR2 V(I)ISYDGSRKYYADSVKG, y la secuencia de CDR3 GVTGSPTLDY, y CDRs de la región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de CDR1 SGSSSNIGNNFVS, la secuencia de CDR2 DITKRPS y la secuencia de CDR3 G(E)TWDSSLSAV V; o (b) CDRs de la región variable de cadena pesada que comprenden la secuencia de CDR1 SGFTFSSYW, la secuencia de CDR2 IKKDGSEK y la secuencia de CDR3 ARPNCGGDCYLPWYFD, y CDRs de la región variable de cadena ligera que comprenden la secuencia de CDR1 QSVLYSSNNKNY, la secuencia de CDR2 YWAS y la secuencia de CDR3 QQYYNTPQA.

Los metodos de la invención pueden incluir la administración de los anticuerpos de la invención solos o en combinación con, en serie con, o subsiguientes a, la administración de agentes isquémicos o para apoplejía que incluyen uno o más de agentes trombolíticos, agentes antiplaquetarios, moduladores de la presión sanguínea, antihipertensivos, antiinflamatorios, agentes que alteran aminoácidos excitatorios o sus receptores, moduladores del calcio intracelular, moduladores de los canales de iones y barredores de radicales libres. En un aspecto particular, los anticuerpos o fragmentos activos de los mismos, en particular el anticuerpo lgM12 y/o lgM42, se administran con agentes trombolíticos y/o agentes antiplaquetarios. En un aspecto, los anticuerpos pueden administrarse con o despues de un agente trombolítico, tal como TPA.

La administración puede incluir a casi la misma hora, poco después, minutos después, hasta una hora después, horas después, o un día después. La administración de los anticuerpos, ya sea solos en particular como anticuerpos lgM12 o lgM42, o en combinación, o con otros agentes, puede ser dentro o después de la ventana terapéutica de 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, hasta 9 horas para TPA o la administración de agentes trombolíticos después de un evento isquémico cerebral o de apoplejía documentada o presunta. Los anticuerpos pueden administrarse en una sola dosis o en dosis múltiples. A manera de ejemplo y no de limitación, los anticuerpos pueden administrarse dentro de 3 horas, después de 3 horas, hasta 4 horas, hasta 5 horas, hasta 6 horas, hasta 8 horas, hasta 12 horas, hasta 24 horas, hasta un día, hasta 2 días, hasta 3 días, hasta varios días, hasta una semana o más tiempo, después de un evento isquémico cerebral o de apoplejía documentado o presunto. Los anticuerpos pueden administrarse inicialmente a manera de ejemplo y no de limitación, dentro de 3 a 6 horas después de un evento isquémico cerebral o de apoplejía documentado o presunto, seguido de una o más administraciones adicionales del anticuerpo o los anticuerpos hasta por un día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, una semana, más de una semana, 2 semanas, más de 2 semanas, o por más tiempo después de la administración inicial o cualquier administración subsiguiente. La dosificación puede ser modulada con base en la respuesta o función del paciente. Por ejemplo, el paciente puede ser evaluado, por ejemplo, usando una escala de apoplejía tal como NIHSS antes o despues, antes y después, o después de la administración inicial del anticuerpo, y la administración del anticuerpo puede ser modificada o continuada o alterada con base en dicha escala u otra evaluación neurológica o motora del paciente.

En un aspecto particular de la invención y el método, los anticuerpos son efectivos para mejorar las medidas de la escala de apoplejía u otras escalas neurológicas o funcionales, en particular cuando se comparan con sin administración del anticuerpo, administración de TPA u otro agente solo, o contra un agente alternativo que incluye un anticuerpo o agente neuroprotector alternativo.

De esta manera, como se demuestra en la presente en modelos animales de apoplejía, los animales a los que se les administran los anticuerpos de la invención, demuestran actividad funcional mejorada. Los anticuerpos de la presente invención son efectivos en la mejora de la actividad locomotora, que incluye mejora en la función motora horizontal, mediante la administración de los mismos después de una apoplejía o isquemia cerebral. Después de la lesión isquémica o apoplejía, la discapacitación asociada con los déficits clínicos se debe principalmente a la disfunción de las neuronas. La falta de recuperación funcional es en parte atribuida a la restricción de la regeneración y neuroplasticidad (véase Walmslcy, A. R. y Mir, A. K. (2007) Current Pharmaceutical Design 13: 2470-2484). La apoplejía puede dar como resultado una función motora alterada tal como una discapacitación para mover una o más extremidades en un lado del cuerpo, efectos cognitivos tales como una discapacitación para entender o formular el lenguaje, u otros deficits que incluyen efectos visuales tales como una discapacitación para ver un lado del campo visual. En un aspecto de la invención y sus métodos, los anticuerpos de la invención son efectivos para prevenir o invertir déficits neurológicos relacionados con la apoplejía. De esta manera, los anticuerpos de la invención pueden mejorar uno o más déficits o síntomas neurológicos en casos de apoplejía o isquemia cerebral. Los anticuerpos de la invención son efectivos para mitigar los efectos o daño neurológicos, en particular en el SNC en caso de, por ejemplo, una apoplejía. Los anticuerpos son de uso en métodos para reducir el daño neurológico o la muerte celular neuronal, y efectivos para preservar o proteger a las neuronas en caso de una apoplejía o isquemia cerebral.

En un aspecto de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de la región variable de conformidad con la invención, pueden usarse en métodos o pueden administrarse en composiciones para la mejora o estabilización de la función neurológica o de la función motora en casos, en particular durante, después o tras un evento isquémico cerebral o de apoplejía, en donde nervios están comprometidos, lesionados o dañados, o escenarios en donde nervios o neuronas son susceptibles o están en riesgo de compromiso, lesión o daño. En un aspecto particular, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se usan o se administran en las etapas tempranas o iniciales de una enfermedad, trauma o condición, tal como una apoplejía o apoplejía presunta, o se repiten durante el curso o la duración de una enfermedad, trauma o condición, tal como repetidos después de una apoplejía, para facilitar o mantener la mejora o estabilización de la función neurológica o función motora, incluyendo o seleccionada de movimiento, tal como el andar, o función cognitiva, tal como el recordar o el reconocimiento.

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesita de tratamiento por medio de cualquier vía adecuada, que incluye mediante inyección intraperitonealmente, en el torrente sanguíneo o el CSF, o directamente en el sitio de lesión o compromiso. Una ventaja particular de los ejemplos de anticuerpos de la presente invención, es que cruzan la barrera hemoencefálica y pueden elegir como objetivo por lo tanto el SNC incluso durante la administración i.p. La dosis precisa dependerá de muchos factores, que incluyen si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño o grado y localización de la lesión, la naturaleza precisa del anticuerpo (si es un anticuerpo entero, fragmento, cuerpo bivalente, etc.), y la naturaleza de cualquier marcador detectable o funcional unido al anticuerpo. En donde un radionúclido se usa para terapia, una sola dosis máxima adecuada puede ser aproximadamente 45 mCi/m2, hasta un máximo de aproximadamente 250 mCi/m2. La dosificación preferible está en la escala de 15 a 40 mCi, con otra escala de dosificación preferida de 20 a 30 mCi, o 10 a 30 mCi. Dicha terapia puede requerir el reemplazo de médula ósea o de células madre. Anticuerpos desnudos aprobados clínicamente se administran generalmente en cantidades de mg, con dosis para adultos de 20 a 2000 mg de proteína por dosis, 20 a 1500 mg de proteína por dosis, o 20 a 1000 mg de proteína por dosis, o 20 a 500 mg de proteína por dosis, o 20 a 100 mg de proteína por dosis. Los anticuerpos monoclonales inyectables clínicamente aprobados se administran en cantidades de mg, 3-5 mg/kg, 5-10 mg/kg por dosis, 300-400 mg/dosis o 300-500 mg/dosis (Newsome BW y Ernstoff MS (2008) Br J Clin Pharmacol 66(1): 6-19; herceptin.net, tysabri.net, avastin.net, remicade.com). Es notable que se ha mostrado que el anticuerpo remielinizante lgM22 es efectivo en comparativamente dosis significativamente menores, en la escala de mg, y es capaz de cruzar la barrera hemoencefálica para ser activo en el SNC con incluso una sola dosis de anticuerpos (vease el documento WO 2004/110355; Warrington AE et al. (2007) J Neurosci Res 85(5): 967-976). Se muestra en la presente que el anticuerpo lgM12 recombinante tiene actividad terapéuticamente relevante en modelos animales tras una sola dosis i.p. en la escala de pg. De esta manera, la dosificación de los anticuerpos de la presente invención, en una sola dosis, o en dosis múltiples y/o periódicas, en la escala de mg por dosis o dosis de pg/kg, o en pocos mg por dosis (100 pg-1 mg, menos de 1 mg, 1 mg-5 mg, 1 mg-10 mg, 5 mg-15 mg, 10 mg-20 mg por dosis), puede ser aplicable y efectiva. Una dosis para un sólo tratamiento de un paciente adulto, puede ajustarse proporcionalmente para niños e infantes, y puede ajustarse también para otros formatos de anticuerpos, en proporción, por ejemplo, al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces por semana, semanalmente o mensualmente, a la discreción del medico. Una ventaja de los ejemplos de anticuerpos, es que cruzan la barrera hemoencefálica y eligen como objetivo sitios de daño o lesión, facilitando de esta manera el uso de dosis menores y potencialmente menores para lograr efectos adecuados.

Composiciones farmacéuticas v terapéuticas Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención se administrarán usualmente en la forma de una composición farmacéutica, la cual puede comprender por lo menos un componente además de los anticuerpos o fragmentos de la invención. De esta manera, las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención, y para su uso de conformidad con la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, regulador de pH, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la téenica. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, la cual puede ser oral, o mediante inyección, por ejemplo intravenosa, o mediante deposición en el sitio de un tumor.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas líquidas comprenden generalmente un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites vegetales o animales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo puede estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Los expertos con aptitud relevante en la téenica son capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer o inyección lactada de Ringer. Pueden incluirse conservadores, estabilizadores, reguladores de pH, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera.

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, terapéuticas o agentes, ya sea simultáneamente o secuencialmente, dependiendo de la condición que se va a tratar. Se contemplan composiciones que comprenden combinaciones de uno o más anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos como se describen en la presente. Además, la presente invención contempla e incluye composiciones que comprenden el anticuerpo o fragmento del mismo descrito en la presente, y otros agentes o terapéuticas tales como terapéuticas o agentes neuroactivos, agentes antiinflamatorios, agentes moduladores de la liberación de neurotransmisores, ligandos o agonistas o antagonistas de neuro-receptores, agentes de los canales de calcio, inmunomoduladores, u otros anticuerpos reactivos con el SNC. Se contemplan composiciones que comprenden combinaciones de uno o más anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos como se describen en la presente. Otros tratamientos o terapeuticas pueden incluir la administración de dosis adecuadas de fármacos para el alivio del dolor, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroidales (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o ketoprofeno) u opiáceos tales como morfina o antieméticos. Además, la composición puede administrarse con inmunomoduladores, tales como interleucinas, factor de necrosis tumoral (FNT) u otros factores de crecimiento, factores estimuladores de colonias, citocinas u hormonas tales como dexametasona que estimula la respuesta inmune y la reducción o eliminación de células o tumores cancerosos. La composición puede administrarse también con, o puede incluir combinaciones junto con, otros anticuerpos reactivos con el SNC, en particular incluyendo anticuerpos remielinizantes, que incluyen a rHlgM22 y/o rHlgM46.

La presente invención contempla además composiciones terapéuticas útiles en la práctica de los métodos terapéuticos de esta invención. Una composición terapéutica en cuestión incluye, en mezcla, un excipiente (vehículo) farmacéuticamente aceptable y uno o más de un anticuerpo, análogo de polipéptido del mismo o fragmento del mismo, como se describe en la presente como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición comprende un antígeno capaz de modular la unión especifica del presente miembro de unión/anticuerpo con una celula objetivo. La preparación de composiciones terapéuticas o farmacéuticas que contienen anticuerpos, polipéptidos o fragmentos activos como ingredientes activos, es bien entendida en la téenica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Sin embargo, pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación puede ser también emulsionada. El ingrediente terapéutico activo se mezcla con frecuencia con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes mojantes o emulsionantes, y agentes reguladores de pH que mejoran la eficacia del ingrediente activo. Un anticuerpo o fragmento activo del mismo puede formularse en la composición terapéutica como formas de sal neutralizadas farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales ácidas de adición (formadas con los grupos amino libres de la molécula de polipéptido o anticuerpo), y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Sales formadas de los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, y similares.

Las composiciones terapéuticas que contienen fragmento activo o anticuerpo se administran convencionalmente intraperitonealmente o intravenosamente, así como mediante inyección como una sola dosis, por ejemplo. El término “dosis unitaria”, cuando se usa con relación a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para humanos, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente, es decir, portador o vehículo requerido.

Las composiciones se administran en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se va a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado deseado de capacidad de unión a neuronas o el grado de lesión neural. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administrado dependen del juicio del profesional médico, y son peculiares para cada individuo. Los regímenes adecuados para la administración inicial y después de una administración son también variables, y pueden incluir una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas, días, semanas o meses, por una inyección subsiguiente u otra administración. En forma alternativa, se contemplan la infusión continua o una administración suficiente para mantener concentraciones apropiadas y suficientes en la sangre, el SNC o en el sitio de la terapia deseada.

La oportunidad de la administración puede variar, y puede ser determinada por los expertos en la teenica o el profesional médico, con base en la enseñanza de la especificación, los parámetros clínicos del paciente o sujeto, el estado o la severidad de la condición o enfermedad, o el grado o la naturaleza de la lesión, envolvimiento o compromiso neural. De esta manera, la mejora en la función neural o la protección mejorada de las neuronas, por ejemplo, de la muerte o compromiso, puede mejorarse mediante la administración tempranamente al inicio de la demostración clínica de una enfermedad, para reducir al mínimo el grado de daño o compromiso neurológico. En un aspecto, la oportunidad de la administración se coordina con evaluaciones de la función neurológica, la determinación del estado y/u otras evaluaciones clínicas para reducir al mínimo o aliviar la progresión de la enfermedad del deterioro o daño neurológico.

Pruebas de diagnóstico La presente invención se refiere también a una variedad de aplicaciones de diagnóstico, que incluyen métodos para detectar o determinar el daño, la lesión o el compromiso de las células nerviosas. Los anticuerpos y fragmentos de la invención pueden usarse para evaluar, cuantificar, elegir como objetivo y/o representar neuronas, in vitro o in vivo. Los presentes anticuerpos que incluyen fragmentos de los mismos, y fármacos que modulan la producción o la actividad de los miembros de unión específicos, anticuerpos y/o sus subunidades, pueden poseer ciertas aplicaciones de diagnóstico y pueden utilizarse, por ejemplo, con el propósito de detectar y/o medir condiciones o enfermedades que implican compromiso, degeneración, lesión, daño o muerte de las neuronas. Los presentes anticuerpos que incluyen fragmentos de los mismos poseen ciertas aplicaciones de diagnóstico, y pueden utilizarse, por ejemplo, con el propósito de detectar y/o medir condiciones o enfermedades que implican isquemia cerebral, incluyendo apoplejía o lesión cerebral que incluye lesión traumática del cerebro. Los anticuerpos marcados, incluyendo anticuerpos radiomarcados, y fragmentos de los mismos, son útiles en téenicas de diagnóstico in vitro y en técnicas de radioformación de imágenes in vivo y en radioinmunoterapia. En el caso de la formación de imágenes in vivo , los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden ser conjugados con un agente de formación de imágenes más que con radioisótopos incluyendo, pero no limitados a, un agente que mejora la imagen de resonancia magnética en donde, por ejemplo, una molécula de anticuerpo es cargada con un gran número de iones paramagnéticos a través de grupos quelantes. Ejemplos de grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, éteres de corona de poliaminas y polioximas. Ejemplos de iones paramagnéticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantano, holmio y erbio. En otro aspecto de la invención, los anticuerpos radiomarcados y fragmentos de los mismos, en particular los radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia, en particular como anticuerpos radiomarcados para terapia celular. En otro aspecto, los miembros de unión específicos radiomarcados, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en teenicas de cirugía radioinmunoguiada, en donde pueden identificar e indicar la presencia y/o la ubicación de neuronas comprometidas o dañadas o los sitios de lesión nerviosa, durante o después de cirugía para elegir como objetivo o remover dichas células o para trasplantar o administrar células hacia esos sitios específicos.

La radioinmunoterapia (RAIT) ha entrado a la clínica, y ha demostrado eficacia usando varios inmunoconjugados de anticuerpos. Se ha evaluado el anticuerpo hMN-14 del antígeno anticarcinoembrionario (anti-CEA) humanizado marcado con 1311 en cáncer colorrectal (Behr TM et al. (2002) Cáncer 94 (supl. 4): 1373-81), y el mismo anticuerpo con marcador de 90Y se ha evaluado en carcinoma medular de tiroides (Stein R et al. (2002) Cáncer 94(1): 51-61). La radioinmunoterapia que usa anticuerpos monoclonales se ha evaluado también y se ha reportado para linfoma no de Hodgkin y cáncer pancreático (Goldenberg DM (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39(1-2): 195-201; Gold DV et al. (2001) Crit Rev Oncol Hematol 39 (1-2): 147-54). Métodos de radioinmunoterapia con anticuerpos particulares se describen también en las patentes de los Estados Unidos 6,306,393 y 6,331,175. La cirugía radioinmunoguiada (RIGS) ha entrado también a la clínica, y ha demostrado eficacia y utilidad, incluyendo el uso de anticuerpo anti-CEA y anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados con tumores (Kim JC et al. (2002) Int J Cáncer 97(4): 542-7; Schneebaum S et al. (2001) World J Surg 25(12): 1495-8; Avital S et al. (2000) Cáncer 89(8): 1692-8; Mclntosh DG etal. (1997) Cáncer Biother Radiopharm 12 (4): 287-94).

Los anticuerpos radiomarcados y fragmentos de los mismos, son útiles en teenicas de diagnóstico ¡n vitro y en técnicas de radioformación de imágenes in vivo. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos, en particular los radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia, en particular como anticuerpos radiomarcados para reparación de lesión nerviosa, recuperación neurodegenerativa, terapia de tumores del SNC o cáncer, o en forma alternativa, para la ablación de tejido nervioso dañado o neuronas en ciertos casos. En un aspecto in vivo, el anticuerpo o fragmento que se une a neuronas del mismo, es marcado y administrado al animal antes de, durante o después de cirugía o una técnica quirúrgica, que incluye una técnica estereotáctica o mínimamente invasiva, con el propósito de localizar una lesión nerviosa o para evaluar tejido neural lesionado o dañado restante. En dicho aspecto, los miembros de unión específicos radiomarcados, en particular los anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de cirugía radioinmunoguiada, en donde pueden identificar e indicar la presencia y/o ubicación de células nerviosas comprometidas, dañadas, lesionadas o moribundas, o neuronas o tejido nervioso antes de, durante o después de cirugía para elegir como objetivo, identificar o remover dichas células.

Las aplicaciones de diagnóstico de los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención, incluyen aplicaciones in vitro e in vivo bien conocidas y estándar para los expertos en la teenica y basadas en la presente descripción. Pruebas y kits de diagnóstico para la valoración y evaluación in vitro de neuronas o tejido nervioso, pueden usarse para diagnosticar, evaluar y monitorear muestras de pacientes que incluyen aquellas que se sabe o que se sospecha tienen condiciones o enfermedades neurológicas, en donde las células nerviosas están comprometidas, dañadas o lesionadas, o para determinar el grado de muerte o lesión celular o de un tumor o cáncer del SNC, incluyendo en una muestra de un paciente o sujeto. La valoración y evaluación del estado de enfermedad neurológica es también útil para determinar la viabilidad de un paciente para una prueba clínica de un fármaco o para la administración de un agente neuroterapéutico o quimioterapéutico particular o un anticuerpo de la presente invención, incluyendo combinaciones de los mismos, contra un agente o anticuerpo diferente.

La presente invención incluye un sistema de prueba que puede prepararse en la forma de un kit de prueba para el análisis cuantitativo del grado de la presencia de, por ejemplo, neuronas dañadas, comprometidas o lesionadas, o para cuantificar neuronas en una muestra. El sistema o kit de prueba puede comprender un componente marcado preparado mediante una de las técnicas radiactivas y/o enzimáticas discutidas en la presente, acoplando un marcador al anticuerpo, y uno o más reactivos ¡nmunoquímicos adicionales, por lo menos uno de los cuales es un componente libre o inmovilizado que se va a determinar, o sus miembros de unión.

En otra modalidad de esta invención, pueden prepararse kits de prueba comerciales adecuados para su uso por un especialista medico con base en lo anterior, para determinar el estado de las neuronas en una muestra. De conformidad con las téenicas de prueba discutidas anteriormente, una clase de dichos kits contendrá por lo menos el anticuerpo marcado o su miembro de unión, por ejemplo, un anticuerpo específico para el mismo e instrucciones que dependen, de hecho, del método seleccionado, por ejemplo, “competitivo”, “en sandwich”, “DAP”, y similares. Los kits pueden contener también reactivos periféricos tales como reguladores de pH, estabilizadores, etc.

Por consiguiente, puede prepararse un kit de prueba para la demostración de la presencia o la determinación del estado de las neuronas, que comprende: (a) una cantidad predeterminada de por lo menos un componente ¡nmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante la unión directa o indirecta del presente anticuerpo o fragmento del mismo o un miembro de unión específico para el mismo, a un marcador detectable; (b) otros reactivos; y (c) instrucciones para el uso de dicho kit.

Puede prepararse un kit de prueba para la demostración de la presencia de lesión, daño o compromiso de células nerviosas, que comprende: (a) una cantidad predeterminada de por lo menos un componente inmunoquímicamente reactivo marcado obtenido mediante la unión directa o indirecta del presente anticuerpo o un miembro de unión específico para el mismo, a un marcador detectable; (b) otros reactivos; y (c) instrucciones para el uso de dicho kit. Ácidos nucleicos La presente invención provee además un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo, en particular un anticuerpo recombinante, en particular un anticuerpo completamente humano, de la presente invención. El ácido nucleico incluye ADN y ARN. En un aspecto preferido, la presente invención provee un ácido nucleico el cual codifica para un polipéptido de la invención como se definió anteriormente, incluyendo un polipéptido como se expone en las figuras 5 o 6 o capaz de codificar para las regiones CDR del mismo.

La presente invención provee también construcciones en la forma de plásmidos, vectores, cassettes de transcripción o de expresión, los cuales comprenden por lo menos un polinucleótido como anteriormente. La presente invención provee también una célula hospedera recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Un ácido nucleico que codifica para cualquier anticuerpo o fragmento del mismo como se provee, forma un aspecto de la presente invención, como un método de producción del miembro de unión específico cuyo método comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante para el mismo. La expresión puede lograrse convenientemente cultivando bajo condiciones apropiadas células hospederas recombinantes que contienen al ácido nucleico. Después de la producción mediante expresión, un miembro de unión específico puede aislarse y/o purificarse usando cualquier téenica adecuada, y entonces puede usarse según sea apropiado.

Los anticuerpos y vectores y moléculas de ácido nucleico codificantes de conformidad con la presente invención pueden ser provistos aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de un ácido nucleico, libres o sustancialmente libres del ácido nucleico o los genes de diferente origen de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico de conformidad con la presente invención puede comprender ADN o ARN, y puede ser totalmente o parcialmente sintético.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas, son bien conocidos. Células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, celulas HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de cáncer, células de cáncer ovárlco, y muchas otras. Una bacteria hospedera común preferida es E. coli. La expresión de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procariótlcas tales como E. coli, está bien establecida en la téenica. Pueden seleccionarse o pueden construirse vectores adecuados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias de promotor, secuencias de terminador, secuencias de poliadenilación, secuencias de intensificador, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos virales, por ejemplo, de fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2a. edición, Sambrook et al., 1989, Coid Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short, Protocols in Molecular Biology, segunda edición; Ausubel et al. eds., John Wilcy & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al., se incorporan en la presente como referencia.

De esta manera, otro aspecto de la presente invención provee una célula hospedera que contiene ácido nucleico como se describe en la presente. Otro aspecto provee un método que comprende introducir dicho ácido nucleico en una célula hospedera. La introducción puede usar cualquier téenica disponible. Para células eucarióticas, técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrán, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, virus de la vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. La introducción puede ir seguida causando o permitiendo la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospederas bajo condiciones para la expresión del gen. La presente invención provee también un método que comprende usar una construcción como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar un miembro de unión específico o polipéptido, como se hizo anteriormente.

Otra característica de esta invención, es la expresión de las secuencias de ADN descritas en la presente. Como es bien sabido en la técnica, las secuencias de ADN pueden ser expresadas enlazándolas operativamente a una secuencia de control de la expresión en un vector de expresión apropiado, y usando ese vector de expresión para transformar un hospedero unicelular apropiado. Una amplia variedad de combinaciones de hospedero/vector de expresión pueden usarse en la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E. coli col El, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; moléculas de ADN de fagos, por ejemplo, los numerosos derivados del fago l, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fagos, por ejemplo, M13 y ADN de fago de cadena sencilla filamentoso; plásmidos de levaduras tales como el plásmido 2u o derivados del mismo, vectores útiles en células eucarióticas, tales como vectores útiles en células de insecto o mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y moléculas de ADN de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para usar ADN de un fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares. Cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión - secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN enlazada operativamente a la misma - puede usarse en estos vectores para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano o tardío de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, el operador mayor y las regiones de promotor del fago l, las regiones de control de la proteína de cubierta fd, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatasa ácida (por ejemplo, Pho5), los promotores de los factores de apareamiento de levadura, y otras secuencias que se sabe controlan la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos.

Una amplia variedad de células hospederas unicelulares son también útiles en la expresión de las secuencias de ADN de esta invención. Estos hospederos pueden incluir hospederos procarióticos y eucarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras, y células animales tales como células CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl.l, B-W y L-M, células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10), células de insecto (por ejemplo, Sf9), y células humanas y células vegetales en cultivo de tejidos.

Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de la expresión y células hospederas funcionarán igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de esta invención. Ni todos los hospederos funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo, el experto en la téenica será capaz de seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresión y hospederos apropiados sin experimentación indebida, para lograr la expresión deseada sin que se aparte del alcance de esta invención. En la selección de una secuencia de control de la expresión, una variedad de factores se considerará normalmente. Estos incluyen, por ejemplo, la concentración relativa del sistema, su capacidad de control, y su compatibilidad con la secuencia de ADN o gen particular que va a ser expresado, en particular con respecto a estructuras secundarias potenciales. Se seleccionarán hospederos unicelulares adecuados considerando, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus características de secreción, su capacidad para plegar proteínas correctamente, y sus requerimientos de fermentación, así como la toxicidad para el hospedero del producto codificado por las secuencias de ADN que van a ser expresadas, y la facilidad de purificación de los productos de expresión. Considerando estos y otros factores, el experto en la teenica será capaz de construir una variedad de combinaciones de vector/secuencia de control de la expresión/hospedero que expresará las secuencias de ADN de esta invención en fermentación o en cultivo animal a gran escala.

Una secuencia de ADN que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo puede prepararse sintéticamente, más que ser clonada. La secuencia de ADN puede diseñarse con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos del miembro de unión específico. En general, se seleccionarán codones preferidos para el hospedero deseado si la secuencia se usará para expresión. La secuencia completa es ensamblada a partir de oligonucleótidos traslapantes preparados mediante métodos estándar, y ensamblada en una secuencia codificante completa. Véase, por ejemplo, Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al. Science , 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984). Las secuencias de ADN sintéticas permiten la construcción conveniente de genes que expresarán análogos o “muteínas” del miembro de unión específico. En forma alternativa, puede obtenerse ADN que codifica para muteínas mediante mutagénesis dirigida a sitio de genes o moléculas de ADNc nativos del miembro de unión específico, y pueden obtenerse muteínas directamente usando síntesis de polipéptidos convencional.

La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos, los cuales se proveen como ejemplos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más enteramente las modalidades preferidas de la invención, y de ninguna manera debe considerarse, sin embargo, que limitan el amplio alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Identificación de autoanticuerpos naturales (NatAbs) que se unen a células propias del sistema nervioso moléculas de inmunoglobulina humanas naturales del suero que se unen a neuronas se identificaron por selección del banco de suero de la Mayo Clinic (“Clínica Mayo”), que contiene más de 140,000 muestras colectadas durante 45 años, para candidatos con una alta espiga monoclonal de IgG o IgM (mayor de 10 mg/ml en la sangre), y entonces poniendo a prueba el suero para la unión del anticuerpo a cortes de corteza cerebral y cerebelo vivos (31). Dichas moléculas de inmunoglobulina se purificaron entonces a partir de muestras positivas, y se pusieron a prueba adicionalmente para 1) unión a la superficie de neuronas primarias aisladas, 2) como substratos para el soporte de la extensión de las neuritas, 3) la capacidad para proteger a las neuronas de la apoptosis ante las moleculas agresivas. Este protocolo de selección se basa en que se usó para identificar moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a oligodendrocitos y promueven la remielinización en modelos de MS (22, y como se describe en el documento WO 0185797). El reconocimiento de la superficie de tejidos o células apropiados, parece ser una característica definitoria importante de las moléculas de inmunoglobulina terapéuticas.

Se han identificado dos moléculas de inmunoglobulina humanas novedosas distintas que se unen a neuronas derivadas del suero (sHlgM 2 y sHlgM42). Ciertas características de estos anticuerpos derivados del suero se enlistan en el cuadro 1. Se ha mostrado inicialmente in vitro que sHlgM12 y sHlgM42 derivadas del suero soportan la extensión de las neuritas así como el substrato potente laminina, y pasan por alto la inhibición del brote de las neuritas de la mielina del SNC (23).

Otros estudios han mostrado que la sHlgM12 derivada del suero mejora la función espontánea en ratones infectados con el TMEV, según se evalúa mediante la actividad nocturna espontánea media por hora en ratones (21). En contraste con los NatAbs de IgM previamente identificados (sHlgM22 y sHlgM46), ni sHlgM12 ni sHlgM42 promueve la remielinización de la médula espinal.

CUADRO 1 moleculas de inmunoglobulina humanas terapéuticas Con frecuencia, se piensa que los autoanticuerpos son patogénicos. En contraste, como se demuestra en la presente, los autoanticuerpos para neuronas (sHlgM12 y sHlgM42 y anticuerpos recombinantes basados en los mismos) no destruyen a las neuronas. Más bien, estas moléculas de inmunoglobulina protegen a las neuronas de morir, promueven la extensión de las neuritas, incrementan el NAA in vivo , protegen a los axones in vivo en el modelo de TMEV, y mejoran la función nocturna espontánea de los ratones enfermos por el TMEV.

Los anticuerpos que se unen a neuronas lgM12 e lgM42 eligen como objetivo a las neuronas en las lesiones del SNC, y son aplicables para invertir la pérdida neuronal y/o mejoran los efectos de la lesión o enfermedad neuronal. Las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a las neuronas representan una nueva clase de terapéutica con aplicación única para varias enfermedades y condiciones que implican neurodegeneración, lesión de neuronas o muerte de neuronas. Dichas enfermedades incluyen, sin limitación, MS, lesión de medula espinal, ALS, enfermedad de Alzheimer, lesión traumática del cerebro, eventos cerebrovasculares o apoplejía. Estas moléculas de ¡nmunoglobulina humanas han sido mínimamente antigénicas cuando se administran sistémicamente en animales.

Identificación v caracterización de moléculas de ¡nmunoglobulina humanas que se unen a la superficie de tipos múltiples de neuronas vivas Muestras de suero con una alta concentración de IgG o IgM (>10 mg/ml) se seleccionaron para la unión del anticuerpo a las capas neuronales en cortes de tejidos vivos del SNC (corteza y cerebelo). De 152 sueros puestos a prueba, 17 sueros humanos fueron positivos en cortes de tejido (23).

Los anticuerpos sHlgM12 y sHlgM42 se unen a la superficie de una amplia variedad de neuronas que son co-marcadas con los marcadores neuronales neurofilamento o b III tubulina. Dichas neuronas incluyen células granulares cerebelares (23), neuronas corticales, neuronas hipocámpicas, neuronas de biopsia de lóbulo temporal humano (figuras 1A a 1H), y células ganglionares retínales (datos no mostrados). rHlgM12 tiñe el soma, las neuritas y los conos de crecimiento de las neuronas hipocámpicas (datos no mostrados). Esta reactividad cruzada sugiere que las moléculas de ¡nmunoglobulina humanas pueden actuar sobre las células del SNC afectadas en muchas condiciones/enfermedades neurológicas, tales como MS, esclerosis lateral amiotrófica o apoplejía.

Los presentes datos indican que la unión de sHlgM12 o sHlgM42 a la superficie de las neuronas, depende de los carbohidratos. El tratamiento de las neuronas con sialidasa en cultivo eliminó la unión de las moléculas de inmunoglobulina humanas a la superficie de las células, mientras que el bloqueo de la síntesis de esfingolípidos con Fumonisina B1 o la remoción de las proteínas enlazadas a GPI con PIPLC, no eliminó la unión de la IgM (23). Los gangliósidos son candidatos para los antígenos de estas moléculas de inmunoglobulina humanas. En experimentos de co-marcación, rHlgM12 se co localiza con GM1 en la membrana neuronal (véase el ejemplo 11 y la figuras 21C1 a 21C3).

Aunque comparten ciertas características funcionales tales como la inducción del brote de las neuritas, sHlgM12 y sHlgM42 demuestran diferencias, y son cada uno anticuerpos únicos. Esto es evidente en estudios de unión e inmunofluorescencia, y marcan la superficie de las células granulares cerebelares en patrones distintos. En estudios de inmunofluorescencia de células granulares cerebelares de rata en cultivo, los patrones de marcación de la membrana neuronal mediante el uso de estos dos anticuerpos son distintos (figura 2). Las áreas cortas de la membrana de las neuritas son unidas por sHlgM12, dando como resultado un patrón punteado. Las áreas más grandes de la membrana de las neuritas son unidas por sHlgM42, dando como resultado un patrón más segmentado.

EJEMPLO 2 Las moléculas de inmunoqlobulina humanas protegen a las neuronas corticales de la muerte inducida por peróxido Se ha mostrado que las moléculas de inmunoglobulina humanas que promueven la remielinización protegen a los oligodendrocitos en cultivo de la activación de la caspasa-3 inducida por peróxido (33), un marcador de la apoptosis activa. Como se expone en la presente, se evaluó a sHlgM12 o sHlgM42 en protocolos análogos. La sHlgM12 o sHlgM42, respectivamente, y peróxido se añadieron juntos a cultivos de neuronas corticales primarias de ratón, y el grado de activación de la caspasa-3 se puso a prueba 24 horas después (figura 3).

El tratamiento de las neuronas cultivadas con rHlgM12 dio como resultado la protección de 80% de la activación de la caspasa-3. El tratamiento de las neuronas con sHlgM42 fue también protector, con aproximadamente 40% de activación de la caspasa-3. Estos resultados fueron significativamente diferentes (P<0.01) en comparación con una IgM humana control, la cual dio como resultado menos de 10% de protección de la activación de la caspasa-3.

De esta manera, sHlgM12 o sHlgM42 que se unen a las neuronas protegieron a las neuronas corticales de la muerte celular inducida por peróxido. De esta manera, cuando se proveyó un inductor o agente de daño (o muerte) de células nerviosas, lgM12 e lgM42 previnieron que ocurriera independientemente y significativamente el daño (o muerte).

EJEMPLO 3 Anticuerpos recombinantes derivados de sHlgM12 Se han construido dos formas recombinantes de sHlgM12. Cada uno usó el mismo vector de expresión que se utilizó previamente para el anticuerpo lgM22 recombinante (rHlgM22) para las cadenas pesada y ligera (22, 28, documento WO0185797). El vector incluye un gen de dHfR seleccionable expresado bajo el control del promotor de SV40. Una forma de anticuerpo lgM12 recombinante parcialmente humano con una cadena J de ratón se construyó inicialmente como sigue, y después el anticuerpo se produjo en células F3B6 de la línea de hibridoma de ratón/humano.

Se llevó a cabo la construcción del vector del anticuerpo lgM12 recombinante (PAD12), insertando el ADNc de la región variable de cadena pesada con una secuencia guía de la base de datos de nucleótidos, y ADNc de la cadena ligera completa con una secuencia guía unida de la base de datos de nucleótidos en una manera similar a la descrita anteriormente (6), usando los iniciadores descritos más adelante. El vector se describe en la figura 4. La secuencia de la cadena ligera y pesada usada para el anticuerpo lgM12 humano recombinante, con las regiones constante y variable indicadas, se muestra en la figura 5.

Los iniciadores usados para obtener rHlgM12VH y empalmarlo mediante extensión por traslape (Horton RM et al. (1989) Gene 77: 61-68) con una secuencia guía con un intrón (letras minúsculas) de la base de datos (M29812), son los siguientes: (1) iniciador 5' con el sitio BspEI: TCC GGA CGG TCC GGG A (2) TCC GGA CGG TCC G ggacctcct gtgcaagaac atgaaacatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgtga gtatctcagg gatccagaca (3) cagg gatccagaca tggggatatg ggaggtgcct ctgatcccag ggctcactgt gggtctctct gttcacaggg gtcctgtccc aggtgcagct gcaggagtcg ggcccaggac (4) iniciador 3' con el sitio PAC I: CCTTAATTAAGACCTGG AGAGGCCATTCTTACCTGAG GAGACGGTGACCAGGGTTC Los iniciadores usados para obtener rHlgM12Vk y empalmarlo mediante extensión por traslape (soe) con la secuencia guía de la base de datos (letras minúsculas, No. de acceso X59312), son los siguientes: (1) iniciador 5'-Ck para soe (empalme mediante extensión por traslape) de lym 12 Vk a Ck: CGA ACT GTGGCT GCA C (2) iniciador 3' Ck con Xho 1: CCGCT CGAGT AT CTAACACT CTCCCCT GTT (3) 5' Lym 12 Vk con Nhe I: AG C ATT ACTAG CT AG CTC AAGACTCAGCCTGGAC atggaca tgagggtccc cgctcagctc ctggggctcc tgctactctggctccgag gtgccaga tgt GAC ATC CAG ATG ACC CA El vector con los genes de anticuerpos sintéticos fue introducido en células de hibridoma F3B6 mediante electroporación, y se llevó a cabo amplificación con metotrexato (MTX) como se describió previamente (6).

En resumen, 8 millones de células de heterohibridoma de humano/ratón F3B6 (American Type Culture Collection: ATCC) se incubaron con 10 mg del vector PAD12 linealizado con Bgl II por 10 minutos en 800 ml de medio libre de suero, tiempo en el cual fueron sometidos a electroporación a 0 2 V en un Biorad Gene Pulser™ (Biorad, Hercules, CA, USA). Después de una incubación por 10 minutos sobre hielo, las células fueron diluidas hasta 24 mi en medio del RPMI-1640 que contenía suero de ternera fetal (FC) a 10% (Gibco, Carlsbad, CA, USA), se sembraron en una placa de 24 cavidades, y se incubaron a 37°C; 48 horas después, las células que contenían al vector se seleccionaron usando metotrexato 1 mM (Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Después de un período de incubación de 2 semanas, las colonias se llevaron a nueva placa y se dejó que crecieran hasta confluencia. En este punto, el sobrenadante se cosechó y se puso a prueba mediante prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para la presencia de IgM humana. Se seleccionaron colonias positivas adicionalmente durante el curso de 2 meses con dosis crecientes de metotrexato que variaron de 1 pM a 200 pM. De esta manera, se generaron células que dieron más de 10 mg/ml de IgM.

El primer anticuerpo recombinante construido como se hizo anteriormente no es completamente humano. Para generar una forma completamente humana, células CHO (GibcoBRL número de catálogo 11619) fueron co-transfectadas con un vector que codifica para la cadena pesada y ligera recombinante bajo el control de un promotor E1A y una construcción que expresa la cadena J humana en pCI (Promega). Las celulas se seleccionaron con dosis crecientes de metotrexato en una mezcla 50/50 de PowerChol e IMDM con clon cósmico a 10%, y los dos clones que produjeron la mayor parte del anticuerpo según se midió mediante ELISA, fueron subclonados. Los subclones fueron expandidos y los viales fueron congelados. Ambas formas de lgM12 recombinante mantienen la unión a las neuronas y el carácter de eficacia in vivo de la IgM aislada en suero, pero tienen una vida media más corta en ratones (lo cual puede deberse a diferencias en glucosilación).

Un procedimiento similar y comparable se usó para construir el anticuerpo HlgM42 recombinante en el vector comparable. La secuencia de la cadena pesada y ligera del anticuerpo lgM42 humano con las regiones variable y constante observadas, se muestra en la figura 6.

EJEMPLO 4 La dosis periférica individual de rHlqM12 mejoró la función neurológica en el modelo de MS por el TMEV En vista del hecho de que rHlgM12 protegió a las neuronas primarias en cultivo, y que la discapacitación en el modelo de esclerosis múltiple (MS) por el TMEV se correlaciona con la pérdida del axón (2), el tratamiento con rHlgM12 de los ratones infectados por el TMEV se usó para evaluar la capacidad para retardar la progresión de los deficits neurológicos.

Grupos de 5 ratones a 90 días post-infección por el TMEV, punto en el cual los axones comienzan a perderse, fueron tratados con una sola dosis de 100 mg de rHlgM12 o una IgM humana control. Cinco ratones infectados se seleccionaron aleatoriamente por cada grupo, y los registros funcionales del pretratamiento se usaron para tener la certeza de que la actividad en la línea base no fue diferente entre los grupos. Se observó a los ratones como grupos por 3 días consecutivos durante varias semanas usando cajas de actividad (34, 35). Los cambios en el comportamiento nocturno son medidas sensibles de déficit neurológico en la enfermedad mediada por el TMEV. Las cajas de actividad son cajas de acrílico claras con haces infrarrojos opuestos que crean una rejilla a través del alojamiento que registra todos los movimientos horizontales y verticales. La sensibilidad de la prueba refleja la capacidad para medir el erguirse y el andar. En los ratones infectados por el TMEV, las extremidades posteriores se vuelven rígidas y se reduce el erguirse. Sin embargo, el andar espontáneo alrededor de la jaula no es afectado tan severamente. Es más fácil para los ratones con extremidades posteriores rígidas caminar que arrastrarse, e incluso los ratones con enfermedad avanzada pueden ser extremadamente activos durante la noche.

Cada grupo de tratamiento fue reunido aleatoriamente y alojado en cajas de actividad por 72 horas antes del tratamiento, y entonces por 72 horas cada semana después del tratamiento. Se calcularon las interrupciones medias del haz por hora para la actividad horizontal y vertical durante las 12 horas, de 6 mm a 6 am durante el período de análisis de 72 horas. No hubo diferencias entre los grupos de tratamiento en la actividad horizontal o vertical en el día, la cual estuvo típicamente abajo de 600 interrupciones/hora conforme los ratones dormían. Sin embargo, un incremento en la actividad horizontal nocturna espontánea en comparación con su pretratamiento en la línea base se registró en el grupo tratado con rHlgM12 (P<0.01, semanas 3 a 7) (figura 7). Una IgM humana control que no se une a las celulas no mejoró la actividad.

En contraste con el efecto visto con sHlgM12 derivado del suero, y ahora también el anticuerpo recombinante rlgM12, en un estudio similar el anticuerpo humano sHlgM42 no alteró la actividad nocturna de ratones infectados con el TMEV bajo las mismas condiciones. Los parámetros de dosificación alternativos para sHlgM42 en el mismo formato de prueba producen resultados diferentes y más positivos en la actividad nocturna.

Una explicación posible para la mejora en función, es que las moléculas de inmunoglobulina efectivas interfieren con las cargas de virus que dan como resultado menos enfermedad. Sin embargo, esta no parece ser la explicación. Los ratones con enfermedad crónica por el TMEV fueron tratados con una sola dosis de rHlgM12, sHlgM42 o moléculas de inmunoglobulina control, el cerebro y la médula espinal se cosecharon 5 semanas después, y entonces el nivel de los transcritos genómicos del ARN del TMEV se midió mediante PCR con una sonda para la proteína 2 viral. Los transcritos virales no fueron diferentes a traves de los grupos (P<0.01) (datos no mostrados).

EJEMPLO 5 Niveles de NAA dentro del tallo cerebral de ratones con enfermedad de la médula espinal - un marcador sustituto no invasivo de preservación del axón por toda la médula espinal El NAA es un metabolito asociado con la función de las neuronas (36, 37). El NAA es el segundo aminoácido más abundante en el cerebro, y está casi exclusivamente restringido a las neuronas. La preservación de los niveles de NAA en el tallo cerebral, es una medida de la salud general de los axones de la médula espinal validada por el grupo de los presentes inventores usando el modelo de ratón con TMEV (8). Cuando los axones a menores niveles de la médula espinal son dañados, las células en el tallo cerebral mueren, reduciendo el NAA. Los niveles de NAA medidos mediante MRS reflejan principalmente la densidad de las neuronas. El NAA es expresado en otras células neurales, pero la expresión primaria del NAA es en las neuronas. Los estudios del perfil de MRS de las células del SNC purificadas, indican que la amplitud de señal del NAA es predominante en las neuronas, mientras que la amplitud de la señal del NAA en los oligodendrocitos o astrocitos fue 5% y 10% de la señal de las neuronas, respectivamente (38).

Para evaluar adiclonalmente la capacidad de sHlgM12 e lgM42 para mejorar la actividad en los ratones preservando la función de los axones, los presentes inventores usaron una prueba de formación de imágenes no invasiva y la morfología tradicional para evaluar los axones de la médula espinal. Se usó trazo retrógrado para demostrar la disfunción del axón de la médula espinal después de la desmielinización en enfermedad mediada por el TMEV (5). Se midió una reducción dramática del marcador retrógrado de los axones a nivel torácico a los núcleos del tallo cerebral. El tallo cerebral es en donde muchos de los cuerpos celulares residen que proyectan largos tractos del axón a lo largo de la longitud de la médula espinal. Después, los niveles de N-acetil-aspartato (NAA) en el tallo cerebral se evaluaron mediante espectroscopia de resonancia magnética (MRS) en ratones infectados por el TMEV (figura 8), usando un protocolo previamente reportado (8).

Se observó una reducción en el NAA del tallo cerebral con el tiempo en los ratones con enfermedad inducida por el TMEV (figura 9). Los niveles de NAA disminuyeron durante los primeros 45 días de la infección, y se mantuvieron deprimidos hasta los 270 días post-infección. En ratones SJL infectados con el TMEV, el grado de desmielinización de la médula espinal alcanza una meseta alrededor de los 90 días después de la infección (39). Es en este punto de tiempo que la pérdida de los axones es notable por histología en este modelo (2). Por lo tanto, el NAA es una medida sensible de la disfunción de los axones.

Después de la última colecta de la MRS, los axones fueron muestreados sistemáticamente de 6 áreas de materia blanca de apariencia normal dentro de una sección transversal de médula espinal al nivel T6. Este nivel se eligió debido a que esto provee una representación global de la pérdida del axón por lesiones desmielinizadas múltiples distribuidas aleatoriamente por toda la médula espinal (39). Se encontró que había 30.5% menos axones en los ratones SJL infectados por el TMEV a 270 días en comparación con los controles no infectados (p<0.001). Se encontró que existe una correlación positiva entre los niveles de NAA en el tallo cerebral y el conteo de axones al nivel T6 de la médula espinal (r=0.823) (8).

La sola dosis de la IqM humana que se une a las neuronas preserva los niveles de NAA en el tallo cerebral v los axones en la médula espinal Se evaluó la capacidad de las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a las neuronas para alterar los niveles de NAA o el conteo de axones en los ratones infectados con el TMEV. Se encontró que cuando los ratones infectados con el TMEV al inicio de la disminución de axones de la médula espinal (90 días post-infección) fueron tratados con una sola dosis de 100 mg de sHlgM12 o de la IgM que se une a las neuronas, sHlgM42, la densidad de axones mielinizados en la materia blanca normal de la médula espinal torácica fue mayor cuando se midió 10 semanas después.

Grupos de 10 a 15 ratones a 90 días post-infección fueron tratados con una sola dosis de 100 mg de la IgM humana control sHlgM12, sHlgM42, o solución salina (figura 10). Antes del tratamiento y a 5 y 10 semanas después, cada ratón fue puesto en un imán de diámetro pequeño, y se colectó la MRS en el tallo cerebral. A 10 semanas, se sacrificó a los ratones, y las médulas espinales se colectaron, se embebieron en plástico y se cortaron secciones transversales al nivel T6 teñidas con parafenilamindiamina para visualizar las vainas de mielina, se colectaron 6 imágenes por sección que abarcaban 400,000 mm de la materia blanca de apariencia normal, y se hizo el conteo de los axones. En los grupos tratados con cualquiera de las dos moléculas de inmunoglobulina que se unen a las neuronas (sHlgM12, sHlgM42), los niveles de NAA se incrementaron a 5 y 10 semanas después en comparación con los niveles de pretratamiento. Los ratones control tratados con IgM tendieron a ser menos, y los ratones tratados con solución salina se mantuvieron constantes.

Los niveles de NAA de los grupos tratados con sHlgM12 y sHlgM42 se incrementaron hasta 9.13 y 9.3 mM, respectivamente, cada uno de los cuales estuvo bien abajo de los niveles de 12.0 mM de los ratones no infectados. Cuando los axones al nivel T6 se compararon a través de los grupos de tratamiento (cuadro 2), los ratones tratados con sHlgM12 o sHlgM42 contenían más axones que el grupo tratado con solución salina (17,303 y 17,771 axones, en comparación con 15,198 axones, P=0.008 y P<0.001), pero menos que el número de axones contados en los ratones no infectados (21 ,284 axones).

Estos resultados indicaron que cada uno de los anticuerpos sHlgM12 y rHlgM12 mejoró la función mediante la preservación de los axones, según se evidencia en el modelo del TMEV. Aunque el anticuerpo sHlgM42 preservó los axones en el modelo del TMEV, cambios demostrables en la evaluación de la actividad nocturna no se observaron en la prueba inicial. Despues de los estudios de escala de la dosis, se encontró que sHlgM42 logra también actividad resaltada en la prueba de actividad nocturna.

El uso de la MRS del tallo cerebral para evaluar el estado de los axones en modelos de enfermedad de médula espinal en el ratón, valida adicionalmente la presente invención. Por consiguiente, el NAA en el tallo cerebral sirve como un excelente punto de extremo para el uso de estos anticuerpos humanos en pruebas clínicas.

Los ratones tratados con sHlgM42 y sHlgM12 con niveles de NAA mejorados contenían también más axones en la médula espinal media torácica. Grupos de 10 a 15 ratones SJL infectados con el TMEV se trataron con una sola dosis de 100 mg de rHlgM22, sHlgM42, sHlgM12, sHlgM39 control y solución salina a 90 días post-infección. Dos semanas después del tratamiento, las médulas espinales se removieron y una sección media torácica se tiñó con PPD para visualizar la mielina. Seis áreas que abarcan 400,000 pm2 de materia blanca se muestrearon de cada ratón, y se hizo el conteo del número de axones mielinizados (1). El promedio del número absoluto de axones mielinizados por sección transversal de T6 ± SEM, se enlista en el cuadro 2.

CUADRO 2 El tratamiento con moleculas de inmunoqlobulina que se unen a neuronas preserva el conteo de axones en la médula espinal EJEMPLO 6 Las moléculas de inmunoqlobulina que se unen a las neuronas preservan los axones sin que promuevan la remielinización Se han identificado varias moléculas de inmunoglobulina humanas (por ejemplo, sHlgM22 y sHlgM46) que se unen a oligodendrocitos y promueven la remielinización (22, 40, 41). Como se muestra a continuación, las moléculas de inmunoglobulina que se unen a las neuronas mejoran el número y la función de las neuronas sin embargo sin remielinización obvia. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que el mecanismo de acción de debe a la activación directa de los axones (protección, extensión de las neuritas) y/o mediante la activación del sistema inmune innato o adaptativo para secretar factores que protegen a las neuronas. Los resultados presentados anteriormente demuestran claramente que los anticuerpos tienen un efecto directo sobre los axones y las neuronas. Dentro de las mismas meduias espinales en las cuales sHlgM12 y sHlgM42 mediaron la preservación de los axones y/o se midió el rebrote, la desmielinización, remielinización e inflamación generales no fueron diferentes a través de los grupos de tratamiento (figura 11).

Estos atributos se cuantificaron clasificando los cuadrantes de 10 secciones transversales de médula espinal (6) que representan muestras a lo largo de la longitud de la médula espinal. El grupo tratado con rHlgM22 (control positivo) mostró el incremento esperado en la remielinización, mientras que los ratones tratados con sHlgM12 y sHlg 42 contenían poca remielinización de la médula espinal. Por consiguiente, se mejoraron los déficits neurológicos en el modelo del TMEV (por ejemplo, lgM12), sin el requerimiento de remielinización significativa; además, la remielinización no es necesaria para la preservación y/o el rebrote de los axones dentro del mismo marco de tiempo examinado.

EJEMPLO 7 Vida media en suero de rHlgM12 (sin cadena J humana) y sHlqM42 Para determinar la vida media de las moléculas de inmunoglobulina humanas, rHlgM12 (con cadena J humana) y sHlgM42, 100 mg de rHlgM12 que contenía a la cadena J humana o 100 pg de sHlgM42 en 200 mI de solución salina se inyectaron en la vena de la cola de ratones CD-1 normales (figura 12). A intervalos definidos (15 minutos, 1, 4, 8, 24, 48 horas), se colectó sangre de grupos de 3 ratones por punción cardiaca. El suero se colectó y se puso a prueba para la presencia de la cadena mu de la IgM humana usando una ELISA en sandwich.

Para rHlgM12, la vida media entre la primera colecta a 15 minutos y la colecta a 8 horas fue de 3.8 horas. Para sHlgM42, la vida media entre la primera colecta a 15 minutos y la colecta a 24 horas fue de 20.5 horas. Estos valores ponen entre paréntesis la vida media de rHlgM22 que promueve la remielinización, el cual tiene una vida media en ratones de 15 horas (29) y en conejos de 90 horas. Se calculó la vida media usando las fórmulas keliminación = (ln(Cp¡co)-ln(Cbaja))/t¡ntervalo Y tl/2— 0.693/ke|¡minac¡ón· EJEMPLO 8 Las moléculas de inmunoqlobulina humanas monoclonaies radiomarcadas cruzan la barrera hemoencefálica Se ha aceptado con frecuencia que las moléculas de ¡nmunoglobulina con un peso molecular cercano a 1 millón pueden ser demasiado grandes para cruzar la barrera hemoencefálica (BBB) desde la circulación, y de esta manera entran al SNC (42, 43). Sin embargo, existe cierta evidencia de que algunas moléculas de ¡nmunoglobulina cruzan la barrera hemoencefálica.

Se midió la distribución en los tejidos de rHlgM12 marcado con 35S en ratones SJL normales e infectados con el TMEV (figura 13). Se administraron i.p. 50 mg de rHlgM12 (1 x107 cpm). Se perfundió a los ratones con solución salina, y 4 o 24 horas después los tejidos se cosecharon agudamente, se desmenuzaron y se disolvieron en fluido de escintilación. El cerebro y la médula espinal de los ratones no infectados contenían la marca radiactiva en ambos puntos de tiempo. El SNC de los ratones infectados con el TMEV contenía dos veces tanta marca radiactiva en el punto de tiempo de 4 horas que los ratones no infectados - esto se incrementó hasta 4x alrededor de las 24 horas.

Se encontró también que rHlgM12 (con y sin la cadena J humana) y sHlgM42 son capaces de cruzar la barrera hemoencefálica en ratones normales y SAMP8, los cuales sufren de enfermedad de Alzheimer.

Por consiguiente, las moleculas de inmunoglobulina humanas marcadas con 125l se inyectan i.v., y se colectan los cerebros dos horas después. Cada uno de estos anticuerpos se acumula en los cerebros de los ratones normales y enfermos. Estos anticuerpos invierten también el deterioro cognitivo en el modelo de enfermedad de Alzheimer del ratón, si la IgM se suministra mediante inyección intracerebral o i.v.

EJEMPLO 9 Las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas, suministradas intraperitonealmente, entran a las lesiones de la médula espinal desmielinizada v se localizan hacia los axones positivos para neurofilamento El estudio de la IgM de ratón isotópicamente marcada que promueve la remielinización, SCH94.03, por Hunter (44), usó autorradiografía para demostrar el marcador radiactivo localizado in vivo en la médula espinal de ratones infectados con el TMEV, específicamente hacia células que se identificaron ultraestructuralmente como oligodendrocitos. Se han llevado a cabo estudios de autorradiografía similares con rHlgM12 marcado con 35S. Mediante el uso de inmunocitoquímica tradicional, los presentes inventores han detectado moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas dentro de las lesiones de la médula espinal (figuras 14A a 14C).

Por consiguiente, 1.0 mg de rHlgM12 (con cadena J humana), sHlgM42 o una IgM humana control comercial (Jackson Immuno Research), se administraron intraperitonealmente a ratones infectados con el TMEV con desmielinización crónica. Cuatro horas despues, los ratones fueron perfundidos con paraformaldehído, y las médulas espinales fueron congeladas seccionadas longitudinalmente e inmunoteñidas para la presencia de la cadena mu de la IgM humana. En los ratones que recibieron rHlgM12 o sHlgM42, la cadena mu humana se localizó en las lesiones desmielinizadas en tractos paralelos, sugiriendo fibras de axones. La IgM humana control no se encontró dentro de las lesiones o en la médula espinal no lesionada. De esta manera, era claro que las moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas, rHlgM12 o sHlgM42, cruzan la barrera hemoencefálica en los ratones infectados con el TMEV.

Secciones adyacentes de médula espinal fueron entonces inmunomarcadas con anticuerpos anti-neurofilamento (NF) (SMI-32 y 34, Sternberger) seguido de TRUC anti-ratón y FITC de la cadena mu anti humano de anticuerpos secundarios fluorescentes. La microscopía confocal demostró que rHlgM12 y sHlgM42 se co-localizaron hacia los axones positivos para NF dentro de las lesiones, en rastros paralelos de fibras y como haces de fibras de axones cortados en el extremo (figuras 15A a 15D).

EJEMPLO 10 rHlqM12 o sHlqM42 no exacerban la EAE inducida por el péptido MOG cuando se dan al inicio de la enfermedad Para consignar las inquietudes de que la administración de moléculas de inmunoglobulina autorreactivas que se unen al SNC a animales con autoinmunidad activa puede exacerbar la enfermedad, los efectos de rHlgM12 y sHlgM42 se pusieron a prueba en ratones con EAE. A grupos de 10 ratones C57BL6 con EAE inducida por el péptido MOG (200 pg) se les administró una sola dosis de 100 mg de IgM humana control, rHlgM12, sHlgM42 o solución salina vía intravenosa. Se trató a los ratones individuales al momento de que su puntuación clínica alcanzó 1 (cola flácida). Los ratones fueron observados entonces por un investigador sin conocimiento de los grupos de tratamiento, quien registró los pesos y las puntuaciones clínicas calificadas cada tercer día hasta que los ratones alcanzaron 28 días postinmunización o estaban moribundos.

No hubo diferencias entre los grupos de tratamiento en los pesos, o las puntuaciones clínicas medias (figura 16, P=0.14). Además, 10 secciones transversales de médula espinal que abarcan la médula espinal entera de cada ratón fueron calificadas de manera oculta para la presencia de inflamación de las meninges y desmielinización en cada cuadrante de la médula espinal (6). No hubo diferencias en el por ciento de cuadrantes con inflamación de las meninges (P=0.825) o desmielinización (P=0.766) a través de los grupos de tratamiento (figura 17). De esta manera, se encontró que una sola dosis de moléculas de inmunoglobulina humanas que se unen a neuronas que son eficaces para proteger a los axones en el modelo del TMEV, no empeora los déficits clínicos de la EAE, acelera la progresión de déficits o incrementa la patología de la médula espinal.

Referencias 1. Howe, C. L, J. D. Adelson y M. Rodríguez. 2007. Absence of perforin expression confers axonal protection despite demyelination. Neurobiol Dis 25: 354-359. 2. McGavern, D. B., P. D. Murray, C. Rivera-Quiñones, J. D. Schmelzer, P. A. Low y M. Rodríguez. 2000. Axonal loss results in spinal cord atrophy, electrophysiological abnormalities and neurological déficits following demyelination in a chronic inflammatory model of múltiple sclerosis. Brain 123 Parte 3: 519-531. 3. Jones, M. V., T. T. Nguyen, C. A. Deboy, J. W. Griffin, K. A. Whartenby, D. A. Kerr y P. A. Calabresi. 2008. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of neuroimmunology. 4. Rodríguez, M., E. Oleszak y J. Leibowitz. 1987. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus.

Crit Rev ImmunoU : 325-365. 5. Ure, D. R. y M. Rodríguez. 2002. Preservation of neurologic function during inflammatory demyelination correlates with axon sparing ¡n a mouse model of múltiple sclerosis. Neuroscience 111: 399-411. 6. Mitsunaga, Y., B. Ciric, V. Van Keulen, A. E. Warrington, M. Paz Soldán, A. J. Bieber, M. Rodríguez y L. R. Pease. 2002. Direct evidence that a human antibody derived from patient serum can promote myelin repair in a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. Faseb J 16: 1325-1327. 7. Van Keulen, V. P., B. Ciric, S. Radhakrishnan, K. L. Heckman, Y. Mitsunaga, K. lijima, H. Kita, M. Rodríguez y L. R. Pease. 2006.

Immunomodulation using the recombinant monoclonal human B7-DC cross-linking antibody rHlgM12. Clin Exp Immunol 143: 314-321. 8. Denic, A., A. Bieber, A. Warrington, P. K. Mishra, S. Macura y M. Rodríguez. 2009. Brainstem (1)H nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: Marker of demyelination and repair in spinal cord. Annals of neurology 66: 559-564. 9. Duncan, I. D. 1996. Glial cell transplantation and remyelination of the central nervous system. Neuropathol Appl Neurobiol 22: 87-100. 10. Fernández, M., A. Giuliani, S. Pirondi, G. D'lntino, L. Giardino, L. Aloe, R. Levi-Montalcini y L. Calza. 2004. Thyroid hormone administration enhances remyelination in chronic demyelinating inflammatory disease. Proc NatlAcad Sci U SA 101: 16363-16368. 11. Craig, C. G., V. Tropepe, C. M. Morshead, B. A. Rcynolds, S. Weiss y D. van der Kooy. 1996. In vivo growth factor expansión of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci 16: 2649-2658. 12. Rodríguez, M. 2007. Effectors of Demyelination and Remyelination in the SNC: Implications for Múltiple Sclerosis. Brain Pathol 17: 219-229. 13. Pitt, D., P. Werner y C. S. Raine. 2000. Glutamate excitotoxicity in a model of múltiple sclerosis. Nat Med 6: 67-70. 14. Okuda, Y., S. Sakoda, H. Fujimura y T. Yanagihara. 1997.

Nitric oxide via an inducible isoform of nitric oxide synthase is a possible factor to elimínate inflammatory cells from the central nervous system of mice with experimental allergic encephalomyelitis. 10urnal of neuroimmuno/ogy 73: 107-116. 15. Waxman, S. G. 2002. Sodium channels as molecular targets in múltiple sclerosis. J Rehabil Res Dev 39: 233-242. 16. Irvine, K. A. y W. F. Blakemore. 2008. Remyelination protects axons from demyelination-associated axon degeneration. Brain 131: 1464-1477. 17. Linker, R. A., M. Maurer, S. Gaupp, R. Martini, B. Holtmann, R. Giess, P. Rieckmann, H. Lassmann, K. V. Toyka, M. Sendtner y R. Gold. 2002. CNTF is a major protective factor in demyelinating SNC disease: a neurotrophic cytokine as modulator in neuroinflammation. Nat Med8: 620-624. 18. Chang, A., W. W. Tourtellotte, R. Rudick y B. D. Trapp. 2002. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of múltiple sclerosis. N EnglJ Med 346: 165-173. 19. McTlgue, D. M., R. Tripathl y P. Wei. 2006. NG2 colocalizes with axons and ¡s expressed by a mixed cell population in spinal cord lesions.

J Neuropathol Exp Neurol 65: 406-420. 20. Franklin, R. J., G. L. Hinks, R. H. Woodruff y M. T. O'Leary. 2001. What roles do growth factors play in SNC remyelination? Prog Brain Res 132: 185-193. 21. Rodríguez, M., A. E. Warrington y L. R. Pease. 2009. Artículo invitado: Human natural autoantibodies in the treatment of neurologic disease. Neurology 72: 1269-1276. 22. Warrington, A. E., K. Asakura, A. J. Bieber, B. Ciric, V. Van Keulen, S. V. Kaveri, R. A. Kyle, L. R. Pease y M. Rodríguez. 2000. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of múltiple sclerosis. Proc Nati Acad Sci U SA 97: 6820-6825. 23. Warrington, A. E., A. J. Bieber, V. Van Keulen, B. Ciric, L. R. Pease y M. Rodríguez. 2004. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. J Neuropathol Exp Neurol 63: 461-473. 24. Radhakrishnan, S., L. T. Nguyen, B. Ciric, D. Flies, V. P. Van Keulen, K. Tamada, L. Chen, M. Rodríguez y L. R. Pease. 2004.

Immunotherapeutic potential of B7-DC (PD-L2) cross-linking antibody in conferring antitumor immunity. Cáncer Res 64: 4965-4972. 25. Cohen, I. R. 2007. Biomarkers, self-antigens and the immunological homunculus. J Autoimmun 29: 246-249. 26. Cohén, I. R. y M. Schwartz. 1999. Autoimmune maintenance and neuroprotection of the central nervous system. 10urnal of neuroimmunology 100: 111-114. 27. Lutz, H. U. 2007. Homeostatic roles of naturally occurring antibodies: an overview. J Autoimmun 29: 287-294. 28. Bieber, A. J., A. Warrington, K. Asakura, B. Cirio, S. V.

Kaverl, L. R. Pease y M. Rodríguez. 2002. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia 37: 241-249. - 29. Warrington, A. E, A. J. Bieber, B. Ciric, L. R. Pease, V. Van Keulen y M. Rodríguez. 2007. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res 85: 967-976. 30. Pirko, I., B. Ciric, J. Gamez, A. J. Bieber, A. E. Warrington, A. J. Johnson, D. P. Hanson, L. R. Pease, S. I. Macura y M. Rodríguez. 2004. A human antibody that promotes remyelination enters the SNC and decreases lesión load as detected by T2-weighted spinal cord RI in a virus-induced murine model of MS. Faseb J 18: 1577-1579. 31. Warrington, A. E. y S. E. Pfeiffer. 1992. Proliferation and differentiation of 04+ oligodendrocytes in postnatal rat cerebellum: analysis in unfixed tissue slices using anti-glycolipid antibodies. J Neurosci Res 33: 338-353. 32. Ciric, B , V. Van Keulen, M. Paz Soldán, M. Rodríguez y L. R. Pease. 2004. Antibody-mediated remyelination operates through mechanism independen† of immunomodulation. 10urnal of neuroimmunology 146: 153-161. 33. Howe, C. L, A. J. Bieber, A. E. Warrington, L. R. Pease y M. Rodríguez. 2004. Antiapoptotíc signaling by a remyelination-promoting human antimyelin antibody. Neurobiol Dis 15: 120-131. 34. Rivera-Quiñones, C, D. McGavern, J. D. Schmelzer, S. F.

Hunter, P. A. Low y M. Rodríguez. 1998. Absence of neurological deficits following extensive demyelination in a class l-deficient murine model of múltiple sclerosis. Nature medicine 4: 187-193. 35. McGavern, D. B., L. Zoecklein, K. M. Drescher y M. Rodríguez. 1999. Quantitative assessment of neurologic déficits in a chronic Progressive murine model of SNC demyelination. Exp Neurol 158: 171-181. 36. De Stefano, N., P. M. Matthews, L. Fu, S. Narayanan, J. Stanlcy, G. S. Francis, J. P. Antel y D. L. Arnold. 1998. Axonal damage correlates with disability in patients with relapsing-remitting múltiple sclerosis. Results of a longitudinal magnetic resonance spectroscopy study. Brain 121 (Parte 8): 1469-1477. 37. Tourbah, A., C. Linnington, C. Bachelin, V. Avellana-Adalid, H. Wekerle y A. Baron-Van Evercooren. 1997. Inflammation promotes survival and migration of the CG4 oligodendrocyte progenitors transplanted in the spinal cord of both inflammatory and demyelinated EAE rats. J Neurosci Res 50: 853-861. 38. Manganas, L. N , X. Zhang, Y. Li, R. D. Hazel, S. D. Smith, M. E. Wagshul, F. Henn, H. Benveniste, P. M. Djuric, G. Enikolopov y M.

Maletic-Savatic. 2007. Magnetic resonance spectroscopy identifies neural progenitor cells in the live human brain. Science 318: 980-985. 39. McGavern, D. B., P. D. Murray y M. Rodríguez. 1999. Quantitation of spinal cord demyelination, remyelination, atrophy, and axonal loss in a model of Progressive neurologic injury. J Neurosci Res 58: 492-504. 40. Asakura, K., D. J. Miller, L. R. Pease y M. Rodríguez. 1998. Targetíng of IgMkappa antibodies to oligodendrocytes promotes SNC remyelination. J Neurosci 18: 7700-7708. 41. Asakura, K., D. J. Miller, K. Murray, R. Bansal, S. E. Pfeiffer y M. Rodríguez. 1996. Monoclonal autoantibody SCH94.03, which promotes central nervous system remyelination, recognizes an antigen on the surface of oligodendrocytes. J Neurosci Res 43: 273-281. 42. Kozlowski, G. R , I. Sterzl y G. Nilaver. 1992. Localizaron patterns for immunoglobulins and albumins in the brain suggest diverse mechanisms for their transport across the blood-brain barrier (BBB). Prog Brain Res 91: 149-154. 43. Banks, W. A. 2008. Developing drugs that can cross the blood-brain barrier: applications to Alzheimer's disease. BMC Neurosci 9 Supl. 3: S2. 44. Hunter, S. F., D. J. Miller y M. Rodríguez. 1997. Monoclonal remyelination-promoting natural autoantibody SCH 94.03: pharmacokinetics and in vivo targets within demyelinated spinal cord in a mouse model of múltiple sclerosis. J Neurol Sci 150: 103-113. 45. Banks, W. A., S. A. Farr, J. E. Morlcy, K. M. Wolf, V. Geylis y M. Steinitz. 2007. Anti-amyloid beta protein antibody passage across the blood-brain barrier in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease: an age-related selective uptake with reversal of learning impairment. Exp Neurol 206: 248-256. 46. Schenk, D., R. Barbour, W. Dunn, G. Gordon, H. Grajeda, T. Guido, K. Hu, J. Huang, K. Johnson-Wood, K. Khan, D. Kholodenko, M. Lee, Z. Liao, I. Lieberburg, R. Motter, L. Mutter, F. Soriano, G. Shopp, N. Vásquez, C. Vandevert, S. Walker, M. Wogulis, T. Yednock, D. Games y P. Seubert. 1999. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400: 173-177. 47. Bard, F., C. Cannon, R. Barbour, R. L. Burke, D. Games, H. Grajeda, T. Guido, K. Hu, J. Huang, K. Johnson-Wood, K. Khan, D.

Kholodenko, M. Lee, I. Lieberburg, R. Motter, M. Nguyen, F. Soriano, N. Vásquez, K. Weiss, B. Welch, P. Seubert, D. Schenk y T. Yednock. 2000. Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. NatMed 6: 916-919. 48. Mikami, Y., M. Toda, M. Watanabe, M. Nakamura, Y. Toyama y Y. Kawakami. 2002. A simple and reliable behavioral analysis of locomotor function after spinal cord injury in mice. Nota teenica. J Neurosurg 97: 142-147. 49. Mikami, Y., H. Okano, M. Sakaguchi, M. Nakamura, T. Shimazaki, H. J. Okano, Y. Kawakami, Y. Toyama y M. Toda. 2004. Implantaron of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. J Neurosci Res 76: 453-465. 50. Gilgun-Sherki, Y., H. Panet, V. Holdengreber, R. Mosberg-Galili y D. Often. 2003. Axonal damage is reduced following glatiramer acétate treatment in C57/bl mice with chronic-induced experimental autoimmune encephalomyelitis. Neurosci Res 47: 201-207. 51. Genain, C. P., B. Cannella, S. L. Hausery C. S. Raine. 1999. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in múltiple sclerosis. Nat Med 5: 170-175. 52. Genain, C. P., M. H. Nguyen, N. L. Letvin, R. Pearl, R. L. Davis, M. Adelman, M. B. Lees, C. Linington y S. L. Hauser. 1995. Antibody facilitation of múltiple sclerosis-like lesions in a nonhuman primate. J Clin Invest 96: 2966-2974. 53. Lennon, V. A., D. M. Wingerchuk, T. J. Kryzer, S. J. Pittock, C. F. Lucchinetti, K. Fujihara, I. Nakashima y B. G. Weinshenker. 2004. A serum autoantibody marker of neuromyelitis óptica: distinction from múltiple sclerosis. Lancet 364: 2106-2112. 54. Rodríguez, M., W. E. Karnes, J. D. Bartleson y A. A. Pinerfa. 1993. Plasmapheresis in acute episodes of fulminant SNC inflammatory demyelination. Neurology 43: 1100-1104. 55. Herrero-Herranz, E., L. A. Pardo, R. Gold y R. A. Linker. 2008. Pattern of axonal injury in murine myelin oligodendrocyte glycoprotein induced experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for múltiple sclerosis. Neurobiol Dis 30: 162-173. 56. Yednock, T. A., C. Cannon, L. C. Fritz, F. Sánchez-Madrid, L. Steinman y N. Karin. 1992. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature 356: 63-66. 57. Kanwar, J. R., J. E. Harrison, D. Wang, E. Leung, W. Mueller, N. Wagner y G. W. Krissansen. 2000. Beta7 integrins contribute to demyelinating disease of the central nervous system. 10urnal of neuroimmunology 103: 146-152. 58. Warrington, A. E. y M. Rodríguez. 2008. Remyelination-promoting human moléculas de inmunoglobulina: developing a therapeutic reagent for demyelinating disease. Curr Top Microbio! Immunol 318: 213-239. 59. Jaffe, J. D., H. Keshishian, B. Chang, T. A. Addona, M. A. Gillette y S. A. Carr. 2008. Accurate inclusión mass screening: a bridge from unbiased discovery to targeted assay development for biomarker verification. Mol Cell Proteomics 7: 1952-1962. 60. Keshishian, H., T. Addona, M. Burgess, E. Kuhn y S. A. Carr. 2007. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution. Mol Cell Proteomics 6: 2212-2229.

EJEMPLO 11 El anticuerpo de IqM humana rHlqM12 promueve la formación de axones e interactúa con las masas flotantes de lípidos para elegir como objetivo microtúbulos El anticuerpo sHlgM12 promovió el brote de neuritas en neuronas granulares cerebelares primarias cultivadas. En el presente ejemplo, se encontró que el uso de neuronas hipocámpicas primarias completamente humanas (rHlgM12 que tiene una cadena J humana) promueve la formación de axones). rHlgM12 se une a la membrana de las neuronas e induce la agrupación del colesterol y el gangliósido GM1.

Además, el rHlgM12 unido a la membrana se distribuye en dos grupos, uno asociado con los dominios de masas flotantes de lípidos, y el otro con la pella insoluble en detergente enriquecida en el citoesqueleto. Los agregados de rHlgM12 se co-localizan sobre los microtúbulos, pero no sobre la actina filamentosa despues de la extracción con detergente. Los estudios de co-inmunoprecipitación demostraron que rHlgM12 y 33-tubulina existen en un complejo. Estos resultados indican que rHlgM12, especifica la formación del axón agrupando los dominios de membrana que señalizan el citoesqueleto de los microtúbulos.

Las neuronas desarrollan axones a través de la regulación del brote de neuritas (Barnes y Polleux, 2009). El citoesqueleto de la neurona, el cual incluye actina filamentosa (F-actina) y microtúbulos, desempeña una función crucial en el brote de neuritas y la exploración por el cono de crecimiento.

El anticuerpo derivado del suero puede no ser adecuado para estudios a mayor escala, en particular si no puede producirse en cantidad y debe aislarse para cada uso del paciente que produce el anticuerpo, por lo que la generación de una forma recombinante que demuestra actividad y capacidad comparable, es ventajosa. El presente estudio demostró que el anticuerpo lgM12 completamente humano y recombinante (rHIgMI 2) promovió la formación del axón y de esta manera dirigió la polarización neuronal en neuronas hipocámpicas cultivadas. rHlgM12 agrupa los dominios de la membrana neuronal que contienen colesterol y gafígliósido GM1.

El fraccionamiento por gradiente de densidad de sacarosa indicó que el rHlgM12 unido a la membrana neuronal se segrega en dos grupos, uno asociado con la fracción más ligera resistente a detergentes que contiene caveolina-1, y el otro con la pella enriquecida en citoesqueleto. La extracción de neuronas vivas con detergente demostró que rHlgM12 se asocia con los microtúbulos. rHlgM12 también se co-inmunoprecipitó con 3-tubulina. Considerados en conjunto, se entiende que rHlgM12 se une a los dominios de la membrana asociados con los microtúbulos. Cuando está presente como un substrato sobre una superficie, rHlgM12 promueve el anclaje de los microtúbulos sobre la membrana de la neurona, facilitando el brote de neuritas y la formación del axón. lgM12 humana recombinante (rHlgM12): rHlgM12 fue expresado en células CHO (GibcoBRL, # de catálogo 11619). Plásmidos que expresan las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera para el anticuerpo predominante expresado en el suero del paciente 12 con macroglobulinemia de Waldenstrom, fueron transfectados junto con el transgen de la cadena J humana en células CHO-S. Las células CHO resultantes se seleccionaron con dosis crecientes de metotrexato, y un clon estable que produjo el anticuerpo según se midió mediante ELISA, fue subclonado y expandido. El anticuerpo rHlgM12 del sobrenadante de cultivo se purificó mediante cromatografía hasta 97%, según se midió mediante análisis de CLAR.

Cultivo de células y prueba del brote de neuritas: Se prepararon neuronas hipocámpicas primarias de ratones FVB. Neuronas hipocámpicas embrionarias del día 15 fueron disociadas en tripsina-EDTA, sembradas en poli-D-lisina (PDL), PDL con laminina o substratos de rHlgM12 recubiertos sobre una capa delgada de membrana de nitrocelulosa unida a cubreobjetos de vidrio y desarrollada en medio neurobasal que contenía 2% (v/v) de B27. El brote de neuritas se puso a prueba 12 horas despues de que las neuronas se sembraron. Las neuronas fueron fijadas con paraformaldehído a 4% y teñidas con el anticuerpo anti 33-tubulina. La actina filamentosa (F-actina) fue marcada con faloidina de rojo Texas, y los núcleos con DAPI. La longitud de las neuritas se midió usando el software Neuron J, se procesó con Excel (Microsoft) y se analizó estadísticamente con Prism (GraphPad). Una neurona de la etapa 3 se definió como una neurona con neuritas múltiples en las cuales la neurita más larga (Dotti et al., 1988), determinada como un axón mediante tinción con Tau1, era por lo menos dos veces la longitud de la segunda neurita más larga. Tau1 fue enriquecido asimétricamente en la parte distal del axón. En contraste, las neuronas de la etapa 2 tuvieron neuritas simétricas múltiples.

Inmunotinción, inmunoprecipitación y fraccionamiento por gradiente de densidad de sacarosa, de neuronas primarias cultivadas. Neuronas hipocámpicas cultivadas de uno a tres días in vitro (DIV) fueron permeabilizadas con Tritón X-100 a 0.2% después de fijación con paraformaldehído a 4%, seguido de inmunotinción. Se colectaron imágenes usando un microscopio vertical Olympus, y se procesaron usando Photoshop (Adobe). La distribución de rHlgM12 se determinó mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa no continuo. En resumen, se dejó que rHlgM12 se uniera a neuronas corticales vivas de DIV7 a 4°C por 30 minutos, y entonces fueron lisadas en regulador de pH de lisis enfriado en hielo (Tris-HCI 50 mM, pH 7.4, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100 a 1% y coctel de inhibidores de proteasa) por 30 minutos. Los lisados neuronales se mezclaron con un volumen igual de sacarosa a 100% (p/v). La mezcla se transfirió a un tubo de centrífuga, y se cubrieron secuencialmente 8 mi de sacarosa a 35% y 3.5 mi de sacarosa a 5%. Despues de centrifugación a 2x105 g por 20 horas a 4°C, se colectaron seis fracciones (2 mi de cada una) de la parte superior del gradiente. Cada fracción y la pella se disolvieron en regulador de pH de muestras de SDS, y se sometieron a Western blotting.

Para la co-inmunoprecipitación de rHlgM12 con proteínas del citoesqueleto, de trataron neuronas corticales vivas de DIV7 con rHlgM12 a 4°C por 30 minutos, y fueron lisadas en regulador de pH de tisis que contenía NP-40 a 0.5%. Se capturó rHlgM12 mediante perlas de proteína L-agarosa y p3-tubulina mediante proteína resina-G (Thermo). Para marcación doble, se tiñeron neuronas vivas con rHlgM12 sobre hielo y se permeabilizaron con Tritón X-100 a 0.2% después de fijación. La extracción y fijación de neuronas vivas se llevó a cabo en regulador de pH que contenía Pipes 60 mM, Hepes 25 mM, EGTA 5 mM, MgC 1 mM, paraformaldehído a 4% y Tritón X-100 a 0.1%.

Anticuerpos y otros reactivos en este ejemplo: Anti- 3-tubulina (Promega); anti-actina, EDTA, poli-D-lisina, metil-P-ciclodextrina y filipina (Sigma); anti-Tau1, anti-caveolina-1 y receptor anti-transferrina (Millipore); faloidina de rojo Texas, toxina B del cólera, medio Neurobasal y B27 (Invitrogen); tableta inhibidora de proteasa (Roche).

La IaM humana recombinante rHlqM12. promovió la formación del axón Para entender adicionalmente el efecto de la IgM sobre la diferenciación de las neuronas y los mecanismos moleculares subyacentes, se llevaron a cabo pruebas del brote de neuritas con neuronas hipocámpicas cultivadas usando un rHlgM12 recombinante. Las neuronas hipocámpicas sufren tres etapas de diferenciación para formar un axón (Dotti et al., 1988). Los procesos múltiples se inician del cuerpo celular. Una de las neuritas de crecimiento más rápido se diferencia en el axón, y las otras despues en dendritas, las cuales pueden identificarse mediante la distribución diferencial de Tau1 y MAP2, respectivamente (Lewis et al., 1989; (Kanai y Hirokawa, 1995). Los presentes inventores encontraron que rHlgM12, cuando se presentó como un substrato, promovió sustancialmente la diferenciación de las neuronas. Dentro de 12 horas después de la siembra, las neuronas hipocámpicas que crecían sobre rHlgM12 desarrollaron neuritas múltiples, y una de ellas era mucho más larga en comparación con las neuritas vecinas. En contraste, las neuronas sembradas sobre poli-D-lisina (PDL) tuvieron neuritas simétricas múltiples (figuras 18A1 a 18A3 y figuras 18B1 a 18B3).

Después de que se midió la longitud de las neuritas, los presentes inventores encontraron que las neuronas sembradas sobre rHlgM12 (n=86) en comparación con PDL (n=74) tuvieron una longitud total de las neuritas significativamente más larga (195.8 mm contra 150.7 mm, p=0.0056) (figura 18C). La longitud más larga de las neuritas era más del doble (117.1 mhh contra 51.8 mhi, r<0.0001) (figura 18D), pero no se encontró diferencia significativa alguna en la segunda longitud más larga de las neuritas (38.7 pm contra 33.3 mm, p=0.0782) (figura 18E). Las neuronas que crecían en rHlgM12 tenían menos neuritas primarias (2.9 contra 4.1, p<0.0001) (figura 18F), y la mayoría de ellas eran del fenotipo de neurona de la etapa 3 (72% en rHlgM12 contra 18% en PDL) (figura 18G). Estos resultados indican que rHlgM12 promovió la diferenciación de las neuronas cuando se presentó como un substrato.

El rasgo característico de la diferenciación de las neuronas es el brote polarizado del axón y la segregación de las dendritas. Los presentes inventores observaron que rHlgM12 promovió la extensión de las neuritas, con una neurita significativamente más larga. Para verificar adicionalmente que estas neuritas más largas de las neuronas de la etapa 3 se desarrollaron en axones, las neuronas hipocámpicas sembradas sobre diferentes substratos se tiñeron con anticuerpos anti-tau1 y de MAP2 (figuras 19A1 a 19F). La tinción con Tau1 fue debil en las neuronas cultivadas en PDL (figuras 19A1 a 19A3, figura 19D), pero mucho más fuerte en las neuronas sembradas sobre PDL-laminina (figuras 19B1 a 19B3, figura 19E) o rHlgM12 (figura 19C, figura 19F). La laminina es un substrato clásico para la diferenciación de las neuronas y la formación del axón (Chen et al., 2009), y se usó como control positivo.

Mediante la comparación de la intensidad de tau1 de las neuronas cultivadas en PDL (figura 19D), la distribución de tau1 fue enriquecida asimétricamente en la parte distal de la neurita más larga, y mucho mayor en las neuronas sembradas en PDL-laminina (figura 19E) o rHlgM12 (figura 19F). En contraste, MAP2 tiñó la parte proximal de todas las neuritas (figura 19A2 a 19C2). Este resultado indicó que las neuritas más largas de las neuronas de la etapa 3 cultivadas en rHlgM12 y laminina, eran axones. Estos estudios demuestran que rHlgM12 sustenta el brote de neuritas a partir de tipos de neuronas múltiples, y que rHlgM12 dirige la formación del axón. rHlqM12 indujo la agrupación de los microdominios de la membrana neuronal Las neuronas hipocámpicas que crecen en rHlgM12 como un substrato mostraron mayor diferenciación (figuras 18A1 a 18G y 19A1 a 19F). Sin embargo, los presentes inventores no observaron que rHlgM12 indujera el brote de neuritas cuando rHlgM12 se aplicó al medio del baño (datos no mostrados). Esta observación sugirió que rHlgM12, para ejercer su función, requiere que sea presentado como una molecula de matriz extracelular. Para entender adicionalmente las interacciones de la membrana de las neuronas con rHlgM12, neuronas vivas fueron tratadas primero con rHlgM12, entonces fijadas y doblemente teñidas con filipina o toxina B del cólera (CTB), la cual se une a colesterol o gangliósido GM1, respectivamente (Shogomori y Futerman, 2001). rHlgM12, CTB y filipina marcaron uniformemente la superficie de las células de las neuronas control no tratadas (figura 20A1). En contraste, el tratamiento con rHlgM12 a 37°C indujo la reorganización de las membranas neuronales 30 minutos (figuras 20B1 a 20B3, figuras 20C1 a 20C3). Primero, rHlgM12 se agrega en estructuras tipo “parche” (figura 20B1, figura 20C1) en la membrana, las cuales no se observaron en las neuronas no tratadas (figuras 20A1 a 20A4) o las neuronas tratadas con un anticuerpo de IgM control el cual no se une a la membrana de las neuronas (datos no mostrados). Segundo, se formaron grupos de colesterol (figura 20B2) y GM1 (figura 20C2) en las membranas neuronales en el cuerpo celular, el eje de las neuritas y el cono de crecimiento. Tercero, el rHlgM12 agregado se co-localizó con colesterol agrupado (figura 20B3) o GM1 (figura 20C3), especialmente en el dominio central del cono de crecimiento (figuras 20B1 a 20C3, alto aumento), pero no en la periferia del cono de crecimiento. Estos resultados indicaron que rHlgM12 aplicado en el baño indujo el reordenamiento de la membrana neuronal, aun cuando no sustenta la extensión del axón y las neuritas. Es posible que rHlgM12, cuando se presenta como un substrato, pueda reclutar las moleculas de la membrana hacia los sitios de contacto de la membrana neuronal con rHlgM12, y dar como resultado señalización direccional. rHlqM12 unido a masas flotantes de lípidos Se han usado estudios bioquímicos basados en la extracción con detergente no iónico en condiciones frías para demostrar la existencia de masas flotantes de lípidos que contienen colesterol y glucoesfingolípidos (Chichili y Rodgers, 2009). Sin embargo, existe información morfológica limitada acerca de las masas flotantes de lípidos debido a que el tamaño a nanoescala está más allá de la resolución del microscopio óptico (Lingwood y Simons, 2010). La observación de que rHlgM12 induce la agrupación de la membrana y se co-localiza con dominios de membrana que contienen colesterol y GM1 (figuras 20A1 a 20C3), elevó la posibilidad de que rHlgM12 se asocia con dominios de masas flotantes de lípidos.

Puesto que las membranas neuronales están enriquecidas en colesterol y glucoesfingolípidos, los cuales tienen temperaturas de fusión (Tm) mayores (Samsonov et al., 2001), la disminución de la temperatura de la membrana abajo de la Tm puede facilitar la visualización de las masas flotantes de lípidos y sus moleculas asociadas que son más dinámicas a 37°C. Para poner a prueba esta hipótesis, se enfriaron hasta 4°C neuronas vivas, seguido de la tinción con rHlgM12. En contraste con las neuronas fijadas a 37°C en donde rHlgM12 se unió uniformemente (figuras 21A1 a 21A3), a 4°C, rHlgM12 marcó estructuras punteadas mucho más grandes. Además, los conos de crecimiento neuronales se encogieron (figuras 21 B a 21 B3).

Los presentes inventores sacaron ventaja del hecho de que las masas flotantes de lípidos son dominios de membrana dependientes de colesterol, y que la depleción de colesterol altera su estructura (Chichili y Rodgers, 2009). Se trataron primero neuronas hipocámpicas cultivadas con metil- -ciclodextrina (Mbq?) para agotar el colesterol (Ko et al., 2005), y entonces se enfriaron hasta 4°C, seguido de tinción con rHlgM12 y CTB después de la fijación. rHlgM12 se unió a las estructuras punteadas en las membranas neuronales despues de la depleción de colesterol, y se co-localizó con GM1 marcado con CTB (figuras 21 C1 a 21 C3). Debido a que GM1 reside dentro de los microdominios de las masas flotantes de lípidos, y rHlgM12 induce la agrupación de GM1 (figuras 20A1 a 20C3), se concluyó que rHlgM12 se a une a los microdominios que contienen GM1, los cuales son independientes del colesterol de la membrana neuronal. Estos experimentos confirmaron que las masas flotantes de lípidos existen como estructuras morfológicas distintas, las cuales son insertadas uniformemente en las membranas (figuras 20A1 a 20A4 y figuras 21A1 a 21A3) o se agregan para formar dominios más grandes (figuras 20B1 a 20B3 y figuras 20C1 a 20C3, figuras 21 B1 a 21B3 y figuras 21 C1 A 21 C3). Estos resultados indican que rHlgM12 se une a las moléculas que transitan entre los dominios de las masas flotantes y sin masas flotantes, dependiendo de las interacciones biofísicas con otras moléculas.

Los presentes inventores pusieron a prueba además la hipótesis de que rHlgM12 se une a las masas flotantes de lípidos. Debido a que las masas flotantes de lípidos se localizan dentro de las membranas resistentes a detergentes (DRM) no iónicos a baja temperatura (Samsonov et al., 2001), la localización de rHlgM12 se analizó en los lisados de neuronas corticales preparados a 4°C. El Blotting de los lisados neuronales con anticuerpo de IgM secundario anti-humano, reveló que rHlgM12 unido a la membrana se encontró en la pella y el sobrenadante, mientras que el anticuerpo de IgM control que no se une a las neuronas se encontró sólo en los eluatos de lavado (figura 22A). Estas observaciones indicaron que rHlgM12 se segregó en dos grupos, uno localizado en la fracción “soluble en detergente” en el sobrenadante, y el otro asociado con la pella “insoluble en detergente”.

En un segundo experimento, neuronas corticales fueron marcadas primero con rHlgM12, y entonces fraccionadas mediante gradiente de densidad de sacarosa a 4°C. El blotting de diferentes fracciones indicó que rHlgM12 se localizó hacia la fracción más ligera que contenía también caveolina-1, un marcador de las masas flotantes de lípidos, pero no hacia la fracción no de masas flotantes enriquecida con el receptor de transferrina (figura 22B). Sin embargo, incluso en este procedimiento de fraccionamiento estricto (Tritón X-100 a 1% y ultracentrifugación a 2x105 g), cierta cantidad de rHlgM12 se detectó en la pella, la cual contiene principalmente citoesqueleto insoluble en detergente (figura 22B). Aunque tanto la tubulina (Sorice et al., 2009) como la actina (Levitan y Gooch, 2007) están presentes en las masas flotantes de lípidos, sólo se detectó p3-tubulina en la masa flotante, y la mayor parte de la actina se fue hacia la fracción sin masas flotantes (figura 22B). Estos datos indicaron la existencia de dos grupos de rHlgM12 unidos a la membrana, uno presente en la masa flotante de lípidos, y el otro en la pella. rHlqM12 asociado con microtúbulos Los datos de los presentes inventores mostraron que el rHlgM12 agregado se localizó hacia regiones tales como el cuerpo celular, el eje de las neuritas y el dominio central del cono de crecimiento (figuras 20A1 a 20C3), que son dominados por microtúbulos (Forscher y Smith, 1988). En conjunto con el hecho de que rHlgM12 unido a la membrana se segrega en la masa flotante de lípidos y las fracciones de pellas, las cuales contenían 33-tubulina (figura 22B), estos hallazgos sugirieron que rHlgM12 puede estar asociado con los componentes del citoesqueleto. Para poner a prueba esta hipótesis, se trataron neuronas hipocámpicas con rHlgM12 para inducir el reordenamiento de la membrana, y entonces fueron fijadas simultáneamente y extraídas a 37°C con paraformaldehído a 4% que contenía Tritón X-100 a 0.1%. Despues de la extracción, las estructuras punteadas de la membrana insolubles en detergente marcadas con rHlgM12 se alinearon con fascículos de microtúbulos hacinados en el eje de la neurita (figura 23A2). En el cono de crecimiento, rHlgM12 se localizó principalmente hacia el dominio central ocupado por microtúbulos desfasciculados, pero no en la periferia del cono de crecimiento enriquecido con F-actina (figura 23A3 y figura 23A4). Estos resultados indicaron que rHlgM12 puede asociarse con los microtúbulos.

Se encontró que rHlgM12 se co-localizó con GM1 (figuras 21C1 a 21C3). Se mostró que GM1 es anclado por la tubulina de la membrana en neuronas granulares cerebelares, y era debilitado por un anticuerpo anti-tubulina después del entrelazamiento (Palestini et al., 2000). De esta manera, es probable que rHlgM12 se asocie con los microdominios de la membrana que contienen tubulina. Para poner a prueba adicionalmente esta hipótesis, los procedimientos de acción debilitante modificados se llevaron a cabo con lisados de células de neuronas corticales vivas tratadas con rHIgM a 4°C. Los presentes inventores encontraron que rHlgM12 y p3-tubulina se co-inmunoprecipitan entre sí (figura 23B), sugiriendo que rHlgM12 y 3-tubulina existen como un complejo. La molecula de IgM tiene una estructura de pentámero con un peso molecular de aproximadamente 900 kDa. Para eliminar la posibilidad de que rHlgM12 se asocia con la tubulina o los microtúbulos directamente en los lisados neuronales, se llevaron a cabo pruebas de acción debilitante con células de neuroblastoma N2A que no se unen a rHlgM12, pero que expresan 3-tubulina (figuras 25A1 a 25A3). rHlgM12 ni se asocia con 3-tubulina ni está presente en la pella. Se detectó sólo en los sobrenadantes de los lisados de células de neuroblastoma N2A (figura 25B). En conjunto, estos resultados confirmaron que las masas flotantes de lípidos median la asociación entre rHlgM12, su antígeno y los microtúbulos.

Los datos en la presente demostraron que una IgM recombinante completamente humana, rHlgM12, dirigió la polarización de las neuronas promoviendo el brote del axón en neuronas hipocámpicas primarias cultivadas cuando se presentaron como un substrato (figuras 18A1 a 18G y 19A1 a 19F). rHlgM12 se agregó sobre la superficie de las neuronas e indujo la agrupación de colesterol y el gangliósido GM1 (figuras 20A1 a 20C3). rHlgM12 se co-localizó con GM1 (figuras 21 A1 a 21 C3). El fraccionamiento de lisados de neuronas con gradiente de sacarosa indicó que el rHlgM12 unido a la membrana se segregó en dos grupos: uno asociado con masas flotantes de lípidos, el otro con la pella (figuras 22A a 22B). Mediante la extracción de neuronas vivas con detergente no iónico, se mostró adicionalmente que rHlgM12 unido a la membrana se co-localizó con los microtúbulos, y fue co-inmunoprecipitado con 33-tubulina (figuras 23A1 a 23B).

Lo anterior indica que rHlgM12 se une a e interactúa con los microdominios de las masas flotantes de lípidos, e indica además que los dominios de las masas flotantes asociados con rHlgM12 transmiten la señalización hacia los microtúbulos. Como resultado, rHlgM12 media la estabilización de los microtúbulos, lo cual dirige el brote de los axones. Este ejemplo demostró que rHlgM12 promueve selectivamente el brote de los axones de las neuronas hipocámpicas primarias (figuras 18A1 a 18G y 19A1 a 19F).

Recientemente, los presentes inventores mostraron que la IgM humana derivada del suero, sHlgM12, mejoró la función neurológica de un modelo animal de esclerosis múltiple que desarrolla degeneración y pérdida axonal extensiva (Rodríguez et al., 2009). Estos estudios apoyan el concepto de que HlgM12 ejerce su función fomentando el crecimiento del axón.

Las neuronas especifican axones a través de un programa intrínseco controlado que regula la extensión de las neuritas. Una neurona en desarrollo inicia neuritas múltiples. Una de las neuritas se diferencia en el axón, las otras en dendritas. Las neuritas vecinas compiten entre sí. La neurita más larga, la cual tiene también la tasa de extensión más rápida, interrumpe primero la extensión simétrica de la neurita para desarrollarse en un axón, mientras que las otras neuritas se extienden mucho más lento y se desarrollan despues en dendritas (Dotti et al., 1988; Goslin y Banker, 1989). La F-actina y los microtúbulos son los dos principales citoesqueletos que están implicados en la extensión de las neuritas y la formación del axón. Ha estado evolucionando el entendimiento que se tiene de la especificación del axón. Se consideró que la F-actina, la cual se localiza principalmente hacia la periferia del cono de crecimiento, desempeña una función importante. Se pensó que los microtúbulos, los cuales dominan el eje de la neurita y están confinados al dominio central del cono de crecimiento, son secundarios a la F-actina. Recientemente, se encontró que los microtúbulos desempeñan también una función crítica en el crecimiento del axón. Los microtúbulos son capaces de explorar dinámicamente la red de actina del cono de crecimiento. La estabilización de los microtúbulos es suficiente para inducir la formación del axón (Witte y Bradke, 2008).

Los resultados de los presentes inventores, de que rHlgM12 y la p3-tubulina son co-inmunoprecipitados, que rHlgM12 se co-localiza con los microtúbulos y que rHlgM12 estaba presente en la pella después de la extracción con detergente, no sólo apoyan que los microtúbulos desempeñan una función central. Además, estos datos proveen la primera evidencia en la téenica de que los microtúbulos interactúan directamente con las membranas de las neuronas. Estos hallazgos apoyan el concepto de que rHlgM12 interactúa con o se une a una cascada de transmembrana que transporta la señal extracelular hacia los microtúbulos. La propiedad dinámica de los microtúbulos para crecer y retraerse, por ejemplo, en los conos de crecimiento, les permite dirigir el movimiento de la membrana de la neurona (Dent y Kalil, 2001). Los microtúbulos estabilizados anclan las membranas de las neuronas. La existencia de microtúbulos dinámicos y estabilizados y/o la transición entre estos dos estados dirige el proceso de brote de las neuritas que especifica un axón. Por consiguiente, lgM12 mejora la extensión del axón efectuando la estabilidad de los microtúbulos.

Lípidos y las proteínas son incorporados continuamente en las membranas celulares, los cuales son divididos entonces en microdominios, las denominadas masas flotantes de lípidos. Las masas flotantes de la membrana se definen generalmente como compartimientos de membrana a nanoescala (10-200 nm) heterogeneos y dinámicos, enriquecidos con esterol y esfingolípidos (Lingwood y Simons).

Los presentes inventores proponen que rHlgM12 se une a las masas flotantes de lípidos. Primero, observaron que rHlgM12 se agregó en las membranas de las neuronas e indujo la agrupación de colesterol o gangliósido, GM1 (figuras 20A1 a 20C3). Estos resultados indican que rHlgM12 se une a los dominios de las masas flotantes de lípidos que contienen colesterol y GM1. Las masas flotantes pequeñas pueden interactuar con lípidos y/o proteínas. Las masas flotantes diminutas individuales pueden estabilizarse y fusionarse en plataformas más grandes que integran señales y regulan la intensidad y la amplitud de las vías de señalización. Los anticuerpos de IgM, los cuales poseen una estructura pentámera, pueden amplificar las señales entrelazando antígenos (receptores) adyacentes, y/o llevando a los antígenos bastante cerca para mejorar el entrelazamiento o la interacción. De esta manera, los antígenos entrelazados y las moleculas de señalización asociadas pueden agruparse. En segundo lugar, los presentes inventores mostraron que rHlgM12 se unió a estructuras punteadas mucho más grandes sobre la membrana de las neuronas cuando las neuronas hipocámpicas fueron enfriadas hasta 4°C (figuras 21 A1 a 21 C3). El colesterol y los esfingolípidos tienen alta temperatura de fusión (Tm). El tratamiento de las neuronas a una temperatura abajo de la Tm puede disminuir la dinámica de la membrana, lo cual facilita la visualización de las masas flotantes de lípidos agregadas. En conjunto con el hallazgo de que rHlgM12 se co-localiza con GM1 incluso después de la depleción de colesterol (figuras 21 A1 a 21 C3), estos resultados sugieren que rHlgM12 se une a e interactúa con las moléculas de la membrana de la neurona que se co-localizan con GM1. La identidad precisa no es clara, aunque el hallazgo previo de los presentes inventores de que el tratamiento con sialidasa, de neuronas granulares cerebelares cultivadas de rata suprimió la unión a sHlgM12, sugirió que el epítope unido a sHlgM12 es un carbohidrato (Warrington et al., 2004). En tercer lugar, después del fraccionamiento de los lisados de neuronas con sacarosa, rHlgM12 unido a la membrana se localizó en la fracción más ligera, la cual contenía también el marcador de masas flotantes de lípidos, caveolina-1. Considerados en conjunto, los resultados de los presentes inventores apoyan la hipótesis de que rHlgM12 se une a las masas flotantes de lípidos.

Las cascadas de señales, del folíolo exterior de las membranas de las neuronas hacia el citoesqueleto intracelular, son centrales para la especificación del axón. Los agregados de rHlgM12 estuvieron distribuidos hacia el eje de las neuritas y el dominio central del cono de crecimiento (figuras 20A1 a 20C3), los cuales son dominados por microtúbulos, pero no actina filamentosa (figuras 23A1 a 23B). Parte de los agregados de rHlgM12 eran insolubles en detergente, y se localizaron en haces de microtúbulos fasciculados despues de la extracción con detergente (figuras 23A1 a 23A4). Estas observaciones indican la existencia de otro grupo de moléculas unidas a rHlgM12, las cuales pueden ser diferentes de la que está asociada con las masas flotantes de lípidos. El estudio del fraccionamiento con sacarosa confirmó adicionalmente que existe un grupo de moléculas asociadas con rHlgM12 que se localizan en la pella insoluble en detergente (figura 22B), la cual puede ser el grupo que se localizó con microtúbulos según se detectó en la figuras 23A1 a 23A4.

Estos resultados demostraron que parte de rHlgM12 se asocia con los componentes del citoesqueleto, posiblemente microtúbulos. El hallazgo de que rHlgM12, el cual se asocia con las moléculas “solubles en detergente” en el sobrenadante (figura 22A y figura 23B) y fue co-inmunoprecipitado con 3-tubulina (figura 23B), indica que las moléculas unidas a rHlgM12 y la p3-tubulina pueden existir como un complejo en las masas flotantes de lípidos. Sin embargo, no es probable que rHlgM12 interactúe directamente con la 3-tubulina, debido a que rHlgM12 no extrajo la P3-tubulina en las células de neuroblastoma N2A con la cual rHlgM12 no se une (figuras 25A1 a 25B). De esta manera, el rHlgM12 asociado con las masas flotantes de lípidos y el citoesqueleto se une a las moléculas que se localizan en la vecindad de la tubulina. Este concepto es reforzado adicionalmente por observaciones de que rHlgM12 se co-localizó con GM1 (figuras 21 C1 a 21 C3), y que GM1 fue extraído por un anticuerpo anti-tubulina después de una reacción de entrelazamiento (Palestini etai, 2000).

Las moléculas unidas a rHlgM12 en los dominios de las masas flotantes de lípidos pueden ser incorporadas constantemente en los citoesqueletos durante el proceso del brote de neuritas y la extensión del axón. Esta hipótesis es apoyada por los hallazgos de que, en la región del cono de crecimiento, rHlgM12 se agregó en el dominio central (figuras 3 y 6), y era ¡nsoluble en detergente a 37°C (figuras 23A1 a 23A4). Considerados en conjunto, se describe que HlgM12 se une a y afecta la dinámica de las masas flotantes de lípidos que media la señalización de HlgM12 hacia los microtúbulos.

No está claro si la F-actina está implicada en la señalización inducida por rHlgM12. Muchas líneas de evidencia indican que la actina y las proteínas que se unen a la actina están asociadas con las masas flotantes de lípidos (Levitan y Gooch, 2007). Los filamentos de actina y los microtúbulos interactúan activamente en el movimiento coordinado de las células (Rodríguez et al., 2003), lo cual incluye también neuronas. De esta manera, es probable que la actina desempeñe también una función en la señalización inducida por rHlgM12. Junto con la b3-?u?u?h3, una pequeña cantidad de actina fue extraída por rHlgM12 (figura 26B). De esta manera, rHlgM12 se une a las masas flotantes de lípidos que contienen actina y 33-tubulina.

Sin embargo, las estructuras punteadas marcadas con rHlgM12 permanecieron en el borde del cono de crecimiento, mientras que las redes de F-actina se encogieron desde la periferia del cono de crecimiento cuando las neuronas se trataron a 4°C (figuras 26A1 a 26A3). Después del fraccionamiento con gradiente de sacarosa, la actina se localizó principalmente en la fracción sin masas flotantes, y sólo una pequeña cantidad de actina se detectó en la pella insoluble en detergente (figura 22B). Estas observaciones indican que la F-actina es muy dinámica y la mayor parte es despolimerizada en condiciones frías y/o por extracción con detergente. De esta manera, la actina puede estar implicada en la señalización mediada por rHIgMI 2.

Los presentes inventores concluyen que: 1) la IgM humana rHIgMI 2 se une a y reorganiza las masas flotantes de lípidos, y que los microtúbulos son uno de los objetivos corriente abajo. rHIgMI 2 promueve la extensión del axón sólo cuando se presenta como substrato. Como un substrato, rHIgMI 2 fue inmovilizado y constreñido en su interacción con la membrana neuronal. El rHIgMI 2 inmovilizado puede haber creado un gradiente de señales a través de las membranas neuronales como se observa con frecuencia en la señalización inducida por morfógenos (Schmitt et al., 2006). En contraste, la aplicación de rHIgMI 2 puede sólo facilitar la agrupación aleatoria de las masas flotantes de lípidos (figuras 20A1 a 20C3), y puede no ser suficiente para romper el brote simetrico de las neuritas y mejorar la extensión del axón. En resumen, los resultados de los presentes inventores apoyan el modelo propuesto en las figuras 24A a 24C. Las membranas de las neuronas contienen microdominios de masas flotantes y sin masas flotantes. Existen dos grupos de dominios de masas flotantes, en donde sólo uno de ellos está asociado con los microtúbulos (figura 24A). 2) rHlgM12 se une a y agrupa los dominios de las masas flotantes, lo cual promueve la estabilización de los microtúbulos y el anclaje de la membrana (figura 24B). 3) En el cono de crecimiento, la agrupación de masas flotantes inducida por rHlgM12 puede aumentar la periferia del cono de crecimiento hacia la transición del dominio central, interrumpiendo el brote simétrico de las neuritas para especificar la formación del axón (figura 24C).

Referencias Alien JA, Halverson-Tamboli RA, Rasenick MM (2007) Lipid raft microdomains and neurotransmitter signalling. Nat Rev Neurosci 8: 128-140.

Barnes AP, Polleux F (2009) Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu Rev Neurosci 32: 347-381.

Chen ZL, Haegeli V, Yu H, Strickland S (2009) Cortical deficiency of laminin gammal impairs the AKT/GSK-3beta signaling pathway and leads to defects in neurite outgrowth and neuronal migration. Dev Biol 327: 158-168.

Chichili GR, Rodgers W (2009) Cytoskeleton-membrane interactions in membrane raft structure. Cell Mol Life Sci 66: 2319-2328.

Conde C, Cáceres A (2009) Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci 10: 319-332. de Anda FC, Pollarolo G, Da Silva JS, Camoletto PG, Feiguin F, Dotti CG (2005) Centrosome localization determines neuronal polarity. Nature 436: 704-708.

Dent EW, Kalil K (2001) Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci 21: 9757-9769.

Dent EW, Callaway JL, Szebenyi G, Baas PW, Kalil K (1999) Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci 19: 8894-8908.

Dotti CG, Sullivan CA, Banker GA (1988) The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J Neurosci 8: 1454-1468.

Forscher P, Smith SJ (1988) Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. J Cell Biol 107: 1505-1516.

Goslin K, Banker G (1989) Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol 108: 1507-1516.

Herdegen T, Skene P, Bahr M (1997) The c-Jun transcription factor— bipotential mediator of neuronal death, survival and regeneration.

Trends Neurosci 20: 227-231.

Higginbotham HR, Gleeson JG (2007) The centrosome in neuronal development. Trends Neurosa 30: 276-283.

Kanai Y, Hirokawa N (1995) Sorting mechanisms of tau and MAP2 in neurons: suppressed axonal transit of MAP2 and locally regulated microtubule binding. Neuron 14: 421-432.

Ko M, Zou K, Minagawa H, Yu W, Gong JS, Yanagisawa K, Michikawa M (2005) Cholesterol-mediated neurite outgrowth is differently regulated between cortical and hippocampal neurons. J Biol Chem 280: 42759-42765.

Levitan I, Gooch KJ (2007) Lipid rafts in membrane-cytoskeleton ¡nteractions and control of cellular biomechanics: actions of oxLDL. Antioxid Redox Signal 9: 1519-1534.

Lewis SA, Ivanov IE, Lee GH, Cowan NJ (1989) Organization of microtubules in dendrites and axons is determined by a short hydrophobic zipper in microtubule-associated proteins MAP2 and tau. Nature 342: 498-505.

Lingwood D, Simons K Lipid rafts as a membrane-organizing principie. Science 327: 46-50.

Niethammer P, Delling M, Sytnyk V, Dityatev A, Fukami K, Schachner M (2002) Cosignaling of NCAM via lipid rafts and the FGF receptor is required for neuritogenesis. J Cell Biol 157: 521-532.

Palestini P, Pitto M, Tedeschi G, Ferraretto A, Parenti M, Brunner J, Masserini M (2000) Tubulin anchoring to glycolipid-enriched, detergent- resistant domains of the neuronal plasma membrane. J Biol Chem 275: 9978-9985.

Rodríguez M, Warrington AE, Pease LR (2009) Artículo invitado: Human natural autoantibodies ¡n the treatment of neurologic disease. Neurology 72: 1269-1276.

Rodríguez OC, Schaefer AW, Mandato CA, Forscher P, Bement WM, Waterman-Storer CM (2003) Conserved mícrotubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol 5: 599-609.

Samsonov AV, Mihalyov I, Cohen FS (2001) Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer membranes. Biophys J 81: 1486-1500.

Schmid RS, Maness PF (2008) L1 and NCAM adhesión molecules as signaling coreceptors in neuronal migration and process outgrowth. Curr Opin Neurobiol 18: 245-250.

Schmitt AM, Shi J, Wolf AM, Lu CC, King LA, Zou Y (2006) Wnt- Ryk signalling mediates medial-lateral retinotectal topographic mapping. Nature 439: 31-37.

Segal RA (2003) Selectivity in neurotrophin signaling: therne and variations. Annu Rev Neurosci 26: 299-330.

Shogomori H, Futerman AH (2001) Cholera toxin is found in detergent-insoluble rafts/domains at the cell surface of hippocampal neurons but is internalized vía a raft-independent mechanism. J Biol Chem 276: 9182- 9188.

Sorice M, Matarrese P, Tinari A, Giammarioli AM, Garofalo T, Manganelli V, Ciarlo L, Gambardella L, Maccari G, Botta M, Misasi R, Malorni W (2009) Raft component GD3 associates with tubulin following CD95/Fas ligation. Faseb J 23: 3298-3308.

Warrington AE, Bieber AJ, Van Keulen V, Ciric B, Pease LR, Rodríguez M (2004) Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. J Neuropathol Exp Neurol 63: 461-473.

Witte H, Bradke F (2008) The role of the cytoskeleton during neuronal polarizaron. Curr Opin Neurobiol 18: 479-487.

Witte H, Neukirchen D, Bradke F (2008) Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization. J Cell Biol 180: 619-632.

EJEMPLO 12 Pruebas con biosensor óptico de nanoporos para MAbs humanos beneficos para lesión de médula espinal La protección y reparación del axón después de una lesión de médula espinal (SCI), mantiene gran potencial como una estrategia efectiva para prevenir la pérdida de neuronas motoras y la discapacitación permanente. Se ha logrado la protección de las neuronas usando factores tróficos elegidos como objetivo para prevenir el daño y promover la reparación de los axones después de la cirugía. Estas moléculas se identificaron predominantemente usando estrategias de selección basadas en sistemas in vitro que se centraron en la focalización de factores neurotróficos específicos de pequeña molecula.

Los anticuerpos monoclonales autorreactivos naturales han demostrado funciones biológicas benéficas en células del SNC, usando modelos múltiples de lesión y enfermedad. La promoción de la supervivencia de las neuronas mediada por anticuerpos, la regeneración del axón y la recuperación funcional se han demostrado in vivo usando la IgM monoclonal de ratón, IN-1 (Bregman 1995; Caroni y Schwab 1988). Se obtuvieron resultados similares usando la inmunización del homogeneizado de médula espinal (SCH) antes del daño del SNC (Ellezam 2003; Huang 1999).

Con base en los datos de los presentes inventores, de los anticuerpos humanos que se unen a neuronas que incluyen a lgM12 y el anticuerpo remielinizante lgM22, se describió que las interacciones de los anticuerpos monoclonales humanos que protegen a los axones del daño promoviendo la supervivencia y función de las neuronas, y benéficas para el tratamiento de la lesión y/o enfermedad del SNC tal como SCI, dependen de las interacciones entre la bicapa lipídica y la proteína de membrana plasmática de superficie bajo condiciones patológicas/fisiológicas.

Se evalúan anticuerpos humanos que promueven la supervivencia de las neuronas después de lesión o daño nervioso (por ejemplo, en SCI) o que protegen a las neuronas de lesión o muerte, en cada caso dando como resultado la preservación de la función neurológica, caracterizados y/o identificados usando teenologías que mantienen las bicapas lipídicas-proteína de membrana plasmática de superficie patológica/fisiológica.

En este estudio, se determina la cinética de la interacción de unión a la superficie de los anticuerpos monoclonales humanos usando sensores de resonancia de plasmones de superficie (SPR) de bicapa lipídica-proteína. Se caracterizan o se identifican los anticuerpos monoclonales humanos usando la unión en lesiones de médula espinal de secciones de tejido ex vivo de roedores después de la lesión de la médula espinal. Después, un modelo de lesión por aplastamiento de la médula espinal de roedor se usa para evaluar adicionalmente la capacidad de los anticuerpos humanos para promover la supervivencia de las neuronas, la extensión de las neuritas o la remielinización in vivo que da como resultado patología reducida y función neurológica mejorada.

Un sensor de bicapa lipídica de SPR novedoso provee una tecnología rápida libre de marcadores que permiten la caracterización de la cinética de unión de lípido-proteína de superficie y la afinidad de los anticuerpos de IgM humanos benéficos. Esta tecnología del sensor de resonancia de plasmones de superficie (SPR) se desarrolló con base en disposiciones de nanoporos periódicas en películas metálicas combinadas con la bicapa lipídica fisiológica plana. La tecnología de SPR ha permitido la caracterización rápida libre de marcadores, de la cinética de unión de los anticuerpos de IgM y la afinidad con antígenos relevantes.

La cinetica de la unión importante para cuantificar pequeñas diferencias, provee una razón fundamental para seleccionar moléculas guía durante el desarrollo e impacto de la dosificación y potencia de una molécula terapéutica in vivo. La SPR se ha vuelto un estándar aceptado en los campos industrial y académico, en los cuales típicamente se caracteriza la interacción molecular entre un par de miembros de unión solubles. Sin embargo, la teenología está sólo comenzando a ser adaptada a las necesidades de los antígenos unidos a la membrana. El substrato de oro usado en la detección de la SPR no está sujeto a la formación de una membrana lipídica soportada. Además, las proteínas de la membrana en contacto directo con la superficie de oro pierden con frecuencia su funcionalidad. Sin embargo, el desarrollo de una tecnología novedosa de la arquitectura para detectar nanoporos que usa una película de oro delgada perforada con disposiciones periódicas de nanoporos, ha superado estos retos (véase, por ejemplo, las figuras 27A a 27B). Cada nanoporo se sitúa en un substrato de vidrio y forma una cavidad diminuta que confina las membranas lipídicas soportadas, mientras que la película de oro circundante provee efectos de SPR que monitorean dinámicamente la unión de las moléculas en la membrana (figura 27B). Las disposiciones de nanoporos molidas en una película de oro provee una geometría única, puesto que una bicapa lipídica delgada puede ser suspendida sobre los nanoporos, mientras que mantiene estabilidad mecánica y es rodeada por un regulador de pH en ambos lados (figura 27B).

Las proteínas de la membrana pueden ser integradas de esta manera inconsútilmente con la capacidad de detección de SPR de las disposiciones de nanoporos de oro, manteniendo su funcionalidad en un ambiente que imita más estrechamente su estado natural. Además, las proteínas de la membrana integradas en la bicapa lipídica autoestable pueden ser fácilmente accedidas desde ambos lados, haciendo este procedimiento más atractivo para estudiar el mecanismo por el cual la unión del anticuerpo y el antígeno sobre la superficie de la celula, da como resultado señalización celular (figura 27B). Este sensor de la bicapa lipídica de la SPR provee una teenología rápida libre de marcadores que se usa para la evaluación, identificación y caracterización de la cinética de la unión lípido-proteína de la superficie, y la afinidad de los anticuerpos de IgM humanos terapéuticos.

Esta plataforma del sensor caracteriza la cinética de la unión lípido-proteína de superficie y la afinidad de los anticuerpos de IgM terapéuticos para prueba en un modelo animal de lesión de médula espinal. Los presentes inventores han caracterizado extensivamente ciertos anticuerpos de IgM identificados por la unión a la superficie no fijada “viva” del tejido y las células cerebelares en el SNC. Estos anticuerpos de IgM (ejemplificados por lgM22 e lgM46) estimularon el flujo de calcio in vitro , y promovieron la remielinización in vivo. Con base en los mismos criterios, se han identificado anticuerpos humanos seleccionando muestras de bancos de suero de disproteinemia en la Mayo Clinic. Anticuerpos de IgM humanos adicionales (ejemplificados en la presente por lgM12 e lgM42) se unen a la superficie de las neuronas y promueven el brote de las neuritas y previenen la muerte de las neuronas in vitro.

Los anticuerpos que se unen a neuronas exhibieron inmunorreactividad específica a células y estructuras específicas del SNC de lesión y patología de la enfermedad usando secciones corticales no fijadas “vivas” de los modelos múltiples de lesión y enfermedad del SNC de ratón.

Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales humanos naturales potencian funciones biológicas benéficas en las células del SNC a partir de modelos múltiples de lesión y enfermedad. Los anticuerpos monoclonales humanos se unen a la superficie de una amplia variedad de neuronas en cultivo que incluyen neuronas de la médula espinal y células ganglionares retínales y células corticales cerebelares (por ejemplo, los anticuerpos humanos IgM 12 e lgM42). Estos anticuerpos inducen la extensión de las neuritas a partir de neuronas del SNC (figuras 28A a 28B), y hacen caso omiso de la inhibición de la mielina del SNC sobre el brote de las neuritas (Warrington et al., 2004).

Los estudios ¡n vitro demuestran la unión de los anticuerpos monoclonales humanos a la membrana plasmática de superficie de las neuronas. La unión característica es uniforme a 0°C, mientras que los reordenamientos de superficie forman estructuras punteadas a 15°C (figuras 29A a 29B). La unión a la superficie de las células es característica de la agrupación de los microdominios de la membrana asociados con las moleculas de señalización que inician las cascadas de señales (Howe et al., 2004).

Los anticuerpos monoclonales humanos entran al tejido de la médula espinal y se acumulan en sitios de daño 4 horas después de la administración intravenosa (figuras 30A a 30B). La inmunocitoquímica llevada a cabo en secciones de vibrátomo de la médula espinal detecta la IgM humana dentro de las lesiones después de la administración de anticuerpos que se unen a las neuronas, pero no altera la administración de una IgM humana control. A ratones con enfermedad crónica de la médula espinal (ratones infectados con el TMEV) se les dieron 0.5 mg de sHlgM42 intraperitonealmente, las médulas espinales se removieron 4 horas después, y se detectó la presencia de la IgM humana en secciones transversales de médula espinal (figuras 30A a 30B). Las áreas lesionadas de médula espinal de un ratón al que se le dio sHlgM42 demuestran fibras paralelas que se unen a una IgM anti-humano marcada con fluorescencia (figura 30A). Las áreas lesionadas de médula espinal de un ratón al que se le dio IgM humana control, no contienen IgM humana (figura 30B).

Se han identificado anticuerpos monoclonales humanos usando pruebas de la función biológica que seleccionan muestras del banco de suero de disproteinemia de la Mayo Clinic. Las muestras de suero, 115,000 colectadas durante 40 años, contienen altas concentraciones de anticuerpo monoclonal de pacientes con gammapatía monoclonal. Los presentes inventores han sintetizado y puesto a prueba lgM22 humana recombinante, la cual tiene actividad que promueve la remielinización en modelos animales (Mitsunaga 2002; Warrington 2000).

En una modalidad, el presente ejemplo genera un anticuerpo monoclonal de calidad GMP útil para aplicaciones terapeuticas, de pronóstico, de diagnóstico y/o profilácticas en condiciones de degeneración nerviosa, lesión y/o daño nervioso tal como en SCI humana o en condiciones desmielinizantes que exponen a las neuronas del SNC.

Estos estudios caracterizan y evalúan adicionalmente anticuerpos de IgM humanos que promueven la supervivencia de las neuronas después de SCI traumática que dan como resultado la preservación de la función neurológica. Se evalúan pruebas conductuales y mediciones morfológicas del número de axones después de SCI, y se determinan las diferencias entre la preservación endógena y mediada por anticuerpos de la función neurológica. Los tratamientos con los anticuerpos que extienden los axones y que protegen a los axones en comparación con controles de anticuerpos después de SCI, se usan para caracterizar diferencias de la preservación de la función neurológica para actividades específicas mediadas por anticuerpos.

Vesículas de membrana que contienen la bicapa lipídica-proteína de membrana plasmática se aíslan de células bajo condiciones fisiológicas. Los nanoporos de los sensores de SPR se recubren usando preparaciones de microvesículas de neuronas aisladas, glía, sinaptosomas y membranas de mielina de tejidos lesionados de médula espinal y del SNC normales.

Muestras de suero de anticuerpos monoclonales humanos y de muestras de anticuerpos recombinantes se seleccionan para determinar la cinetica de la unión para tipos de membrana específicos.

Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a la membrana plasmática de superficie de células y tejidos “vivos” no fijados no congelados bajo condiciones fisiológicas, según se confirma usando sensores de SPR, se ponen a prueba para unión específica usando tejidos patológicos “vivos” no fijados no congelados después de SCI. Los anticuerpos monoclonales humanos que demuestran unión a lesiones de la médula espinal se caracterizan adicionalmente para campos de aplicación y actividad en el tratamiento después de SCI en el roedor.

Diseño del protocolo. Se genera lesión por compresión al nivel de T9 en ratones C57BL/6J hembras de diez semanas (18-22 g) (Jackson Laboratories), usando un broche para aneurisma modificado (broche para ratón FEJOTA, fuerza de cierre de 3 g u 8 g. Este modelo de SCI incluye no sólo un impacto inicial, sino también una fase de compresión persistente que promueve cavitación microcística, degeneración del axón y astrogliosis robusta, todas distintivas de la SCI traumática humana (Joshi y Fehlings 2002). Pruebas conductuales que usan la escala de evaluación locomotora de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) para ratas, y la escala para locomoción de ratones de Basso (BMS), se determinan después de SCI para evaluar los déficits neurológicos. La téenica se describe en las figuras 31 A a 31 B.

Secciones de tejido ex vivo no fijadas no congeladas vivas se preparan entonces a partir de lesiones patológicas después de lesión por compresión de la médula espinal en roedores. Se selecciona la inmunorreactividad de la unión de anticuerpos de IgM humanos usando tinción inmunofluorescente (IF) de secciones mantenidas bajo condiciones fisiológicas.

Se trata agudamente a ratones después de una lesión por compresión de la médula espinal con anticuerpos humanos, que incluyen rHlgM12 y sHlgM42 o rHlgM42, administrados intraperitonealmente. Se mide la capacidad de los anticuerpos humanos para promover la preservación del axón o la reparación del tejido. Se llevan a cabo pruebas conductuales usando las escalas de BBB y BMS a intervalos regulares durante un período de 5 semanas después de SCI. Una sola dosis de 0.5 mg de anticuerpo humano se administra i.p. a ratones 30 minutos después de SCI. Grupos de ratones (15 ratones) reciben anticuerpos humanos que promueven la protección de neuronas, el brote de las neuritas, y anticuerpos humanos control que no se unen a células o control. Los ratones individuales son alojados durante la noche durante una semana en cajas de actividad infrarroja automatizadas (Mikami et al. 2002), y se registran la incorporación espontánea, una medida de la discapacitación de las extremidades posteriores, y la actividad horizontal (Accuscan Inc., Ohio). Se colectan también semanalmente las puntuaciones tradicionales de BBB. Se llevan a cabo evaluaciones funcionales de manera oculta.

Se inyectan azul rápido y Fluoro-gold, 4 semanas después del tratamiento, en las médulas espinales de cuatro ratones al nivel torácico inferior. Una semana después se perfunde a los ratones, y se remueven los cerebros y las médulas espinales. Se hace el conteo de los cuerpos celulares marcados retrógrados en los núcleos reticulares, vestibulares y rojos del tallo cerebral a través de los grupos mediante microscopía fluorescente (Ure y Rodríguez 2002). El número de cuerpos celulares marcados en el tallo cerebral (sección del vibrátomo) refleja el nivel de axones funcionales por toda la médula espinal. Se lleva a cabo inmunocitoquímica para la acumulación de proteína b amiloide en secciones transversales de tejido tomadas cada mm a lo largo de la médula espinal. El número de agregados b amiloides en una sección refleja el transporte deteriorado de los axones y la disfunción de los axones a ese nivel.

Cinco semanas después de la lesión, los ratones restantes son perfundidos con formaldehído/glutaraldehído, y se remueven las médulas espinales. Cada tercer bloque de 1 mm que comprende el sitio de la lesión de la médula espinal es embebido en plástico Araldite y seccionado (1 miera), y teñido con parafenileno para visualizar los axones preservados circunscritos por mielina. El área de la sección transversal de la lesión, el número de axones preservados y la infiltración de células inmunes de la lesión, se miden usando el software Microsuite (Olympus). Se mide y se compara la frecuencia de axones a través de los grupos (McGavern et al. 2000; Rodríguez et al. 1987). Todos los análisis se hacen en muestras codificadas y de manera oculta sin conocimiento del grupo experimental. Los axones preservados se expresan como el número de axones preservados/mm2 de la lesión. La comparación de los datos por pares entre los grupos experimental y control, usa la prueba de suma de rangos de Mann-Whitncy.

Referencias Rodríguez M, Warrington AE, Pease LR. Human Natural Autoantibodies in the Treatment of Neurologic Disease. Neurology 2009; 72: 1269-1276.

Im H, Lesuffleur A, Lindquist NC, Oh SH. Plasmonic nanoholes in a multichannel microarray format for parallel kinetic assays and differential sensing. Analytical Chemistry. 2009; 81: 2854-2859.

Maynard JA, Lindquist NC, Sutherland JN, Lesuffleur A, Warrington AE, Rodríguez M y Oh SH. Next generation SPR technology of membrane-bound proteins for ligand screening and biomarker discovery. J Biotech 2009; 4(11): 1542-1558.

Nagpal P, Lindquist NC, Oh SH, Norris DJ. Ultrasmooth patterned metáis for plasmonics and metamaterials. Science. 2009; 325: 594-597.

Bieber AJ, Warrington A, Asakura K, Ciric B, Kaveri SV, Pease LR, Rodríguez M. 2002. Human antibodies accelerate the rate of remyelination following lysolecithin-induced demyelination in mice. Glia 37(3): 241-249.

Bregman BS, Kunkel-Bagden E, Schnell L, Dai HN, Gao D, Schwab ME. 1995. Recovery from spinal cord injury mediated by antibodies to neurite growth inhibitors. Nature 378(6556): 498-501.

Caroni P, Schwab ME. 1988. Antibody against myelin-associated inhibitor of neurite growth neutralizes nonpermissive substrate properties of SNC white matter. Neuron 1(1): 85-96.

Corse AM, Bilak MM, Bilak SR, Lehar M, Rothstein JD, Kuncl RW. 1999. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis 6(5): 335-346.

Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L. 2003. Vaccination stimulates retinal ganglion cell regeneration in the adult optic nerve. Neurobiol Dis 12(1): 1-10.

Estévez AG, Spear N, Manuel SM, Radi R, Henderson CE, Barbeito L, Beckman JS. 1998. Nitric oxide and superoxide contribute to motor neuron apoptosis induced by trophic factor deprivation. J Neurosci 18(3): 923-931.

Festoff BW, Ameenuddin S, Arnold PM, Wong A, Santacruz KS, Citrón BA. 2006. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem 97(5): 1314-1326.

Hemendinger RA, Armstrong EJ, Persinski R, Todd J, Mougeot JL, Volvovitz F, Rosenfeld J. 2008. Huperzine A provides neuroprotection against several cell death inducers using in vitro model systems of motor neuron cell death. Neurotox Res 13(1): 49-61.

Howe CL, Bieber AJ, Warrington AE, Pease LR, Rodríguez M. 2004. Antiapoptotic signaling by a remyelination-promoting human antimyelin antibody. Neurobiol Dis 15(1): 120-131.

Huang DW, McKerracher L, Braun PE, David S. 1999. A therapeutic vaccine approach to stimulate axon regeneration in the adult mammalian spinal cord. Neuron 24(3): 639-647.

Joshi M, Fehlings MG. 2002. Development and characterization of a novel, graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse: Parte 1. Clip design, behavioral outcomes, and histopathology. J Neurotrauma 19(2): 175-190.

McGavern DB, Murray PD, Rivera-Quiñones C, Schmelzer JD, Low PA, Rodríguez M. 2000. Axonal loss results in spinal cord atrophy, electrophysiological abnormalities and neurological deficits following demyelination in a chronic inflammatory model of múltiple sclerosis. Brain 123 Parte 3: 519-531.

McTigue DM, Tripathi R, Wei P. 2006. NG2 colocalizes with axons and is expressed by a mixed cell population in spinal cord lesions. J Neuropathol Exp Neurol 65(4): 406-420.

Mikami Y, Toda M, Watanabe M, Nakamura M, Toyama Y, Kawakami Y. 2002. A simple and reliable behavioral analysis of locomotor function after spinal cord injury in mice. Nota téenica. J Neurosurg 97(Supl. 1): 142-147.

Mitsunaga Y, Ciric B, Van Keulen V, Warrington AE, Paz Soldán M, Bieber AJ, Rodríguez M, Pease LR. 2002. Direct evidence that a human antibody derived from patient serum can promote myelin repair ¡n a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. Faseb J 16(10): 1325-1327.

Pannu R, Christie DK, Barbosa E, Singh I, Singh AK. 2007. Posttrauma Lipitor treatment prevenís endothelial dysfunction, facilitates neuroprotection, and promotes locomotor recovery following spinal cord injury. J Neurochem 101(1): 182-200.

Pirko I, Ciric B, Gamez J, Bieber AJ, Warrington AE, Johnson AJ, Hanson DP, Pease LR, Macura SI, Rodríguez M. 2004. A human antibody that promotes remyelination enters the SNC and decreases lesión load as detected by T2-weighted spinal cord MRI in a virus-induced murine model of MS. Faseb J 18(13): 1577-1579.

Rodríguez M, Lennon VA, Benveniste EN, Merrill JE. 1987.

Remyelination by oligodendrocytes stímulated by antiserum to spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol 46(1): 84-95.

Warrington AE, Asakura K, Bieber AJ, Ciric B, Van Keulen V, Kaveri SV, Kyle RA, Pease LR, Rodríguez M. 2000. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of múltiple sclerosis. Proc Nati Acad Sci U S A 97(12): 6820-6825.

Warrington AE, Bieber AJ, Ciric B, Pease LR, Van Keulen V, Rodríguez M. 2007. A recombinant human IgM promotes myelin repair after a single, very low dose. J Neurosci Res 85(5): 967-976.

Warrington AE, Bieber AJ, Van Keulen V, Ciric B, Pease LR, Rodríguez M. 2004. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. J Neuropathol Exp Neurol 63(5): 461-473.

EJEMPLO 13 Modelo de esclerosis múltiple - Dosis: Evaluación de la respuesta Se evalúan anticuerpos de IgM por su capacidad para promover la mejora funcional y el aumento de los procesos de remielinización, el brote de las neuritas o en un modelo de esclerosis múltiple en ratones. El modelo implica el uso del picornavirus virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (TMEV), que induce lesiones desmielinizantes progresivas crónicas persistentes del SNC con características similares a las encontradas en la MS humana usando un método similar al de Warrington et al., 2007.

Se inyecta a ratones machos y hembras (cepa SJL/J, de aproximadamente 8 semanas) con el virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (2 x 105 unidades formadoras de placas de la cepa de Daniel, 10 pl intracerebroventricularmente). Se deja que los ratones se recuperen durante un período de 6 meses antes de la aleatorización para el tratamiento. Se examina entonces a los ratones para condición del pelaje, modo de andar y reflejo de incorporación, y se asignan aleatoriamente a grupos de tratamiento (como se indica en los cuadros de tratamiento). Se trata entonces a los ratones con una sola inyección intravenosa de vehículo (solución salina normal) o anticuerpo de IgM humana recombinante (0.025 a 2.5 mg/kg). Se monitorea la función neurológica a 2 semanas, 1 mes y 2 meses despues del tratamiento.

Los puntos de extremo funcionales incluyeron la puntuación basada en la condición del pelaje, el modo de andar y el desempeño de Rotarod. Para la apariencia del pelaje, la puntuación es como sigue: sin enfermedad (0); cambios mínimos del pelaje (1); pelaje desdeñable (2); incontinencia y pelaje manchado (3). Los cambios de actividad se cuantifican en una caja de actividad automatizada. Además, se analiza el modo de andar usando una adquisición digital del modo de andar (DigiGait) que usa velocidades al caminar > 90 cm/s. Los puntos de extremo del análisis cuantitativo del modo de andar incluyen amplitud y duración de la postura, longitud y frecuencia de la zancada, ángulo de la pata, así como duración del impulso, frenado y propulsión. Se cuantifican los cambios del modo de andar a partir de la línea base. El desempeño de Rotarod (una medida de la coordinación sensitiva y del equilibrio se evalúa por la capacidad de un animal para caminar sobre un eje rotatorio que mide el motor en términos de velocidad y duración en el eje rotatorio) se cuantifica como la cantidad de tiempo que los animales permanecen en el aparato rotatorio durante una serie de pruebas.

Al concluir el experimento, se somete a los animales a eutanasia por sobre-exposición a CO2. Se remueven los cerebros y las médulas espinales para la evaluación de: 1) el grado de mielinización (análisis con microscopio electrónico de tejido osmicado fijado con paraformaldehído/glutaraldehído embebido en plástico, y 2) el crecimiento de las neuritas (evaluación de la densidad de neuritas mediante evaluación estereológica).

En la primera modalidad, se administran anticuerpos humanos recombinantes solos a tres niveles de dosis como se indica en el cuadro 3A y el cuadro 3B.

CUADRO 3A Resumen de los puntos de extremo v grupos de tratamiento - anticuerpos de IqM recombinantes individuales CUADRO 3B Resumen de resultados para los grupos de tratamiento I? Oí (*) X indica mejora, X+ indica más mejora, y X++ indica aún más mejora. Los valores de la puntuación de mejora son respecto a la dosificación de un anticuerpo dado. De esta manera, una X+ es una mayor mejora que X para ese mismo anticuerpo. La mejora X para un anticuerpo no es necesariamente la misma que el valor X para otro anticuerpo; el valor X+ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+ para otro anticuerpo, y el valor X+++ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+++ de otro anticuerpo.

En este ejemplo, se encuentra que cada uno de los anticuerpos recombinantes lgM12, lgM42, lgM22 e lgM46 producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod (p < 0.05) para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo). Los animales tratados con vehículo dan un déficit estable en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod dentro de 6 meses de la lesión por el TMEV. Para cada anticuerpo, se encuentra un cambio significativo dependiente de la dosis en los puntos de extremo sensitivos motores sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, con un incremento de mejora X en los puntos de extremo sensitivos motores a la baja dosis, un mayor incremento de mejora X+ en los puntos de extremo sensitivos motores con 0.25 mg/kg, y una mejora X+++ incluso mayor en los puntos de extremo sensitivos motores a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05. De esta manera, cada uno de los anticuerpos lgM12, lgM42, lgM22 e lgM46 produce mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod (p < 0.05 para cada punto de extremo), en comparación con el tratamiento con vehículo. Ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el genero.

En este ejemplo, se encuentra que lgM12 e lgM42 producen incrementos dependientes de la dosis estadísticamente significativos en el brote de neuritas en secciones de médula espinal y de cerebro de ratones infectados con el TMEV, según se evalúa mediante estereología en comparación con los controles tratados con vehículo. Para cada anticuerpo, se encuentran cambios significativos dependientes de la dosis en el brote de neuritas sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, con un incremento de mejora X en el brote de neuritas a la baja dosis, un mayor incremento de mejora X+ en el brote de neuritas con 0.25 mg/kg y un incremento incluso mayor en el brote de neuritas X+++ a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05.

Se encuentra que lgM22 e lgM46 producen incrementos dependientes de la dosis estadísticamente significativos en remielinización en secciones de médula espinal y de cerebro de ratones infectados con el TMEV, según se evalúa mediante estereología en comparación con los controles tratados con vehículo. Para cada anticuerpo, se encuentran cambios significativos dependientes de la dosis en remielinización sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, con un incremento de mejora X en remielinización a la baja dosis, un mayor incremento de mejora X+ en remielinización con 0.25 mg/kg, y un incremento incluso mayor en remielinización X+++ a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05.

EJEMPLO 14 Modelo de esclerosis múltiple - combinaciones de anticuerpos En este experimento, se examinan varias combinaciones de relaciones de dosis fija de anticuerpos de IgM recombinantes para mejora del resultado neurológico en el modelo de MS con el TMEV, como se describió en el ejemplo previo. Seis meses después de la exposición al TMEV, se inicia en ratones el tratamiento con combinaciones de IgM recombinante. En esta serie de estudios, se les da a los ratones vehículo solo, o varias combinaciones de moléculas de inmunoglobulina, en una sola administración intravenosa (mezcla). Los puntos de extremo sensitivos motores se monitorean como anteriormente. Se evalúan la mielinización y el brote de neuritas para examinar los cambios producidos por las combinaciones de anticuerpos. Las combinaciones bajo evaluación se muestran en el cuadro 4A y el cuadro 4B.

CUADRO 4A Resumen de los grupos de tratamiento - combinaciones de anticuerpos de IqM recombinantes G? O CUADRO 4B Resumen de resultados - combinaciones de anticuerpos de IgM recombinantes CUADRO 4B (CONTINUACIÓN) I? (*) X indica mejora, X+ indica más mejora, y X++ indica aún más mejora. Los valores de la puntuación de mejora son respecto a la dosificación de un anticuerpo dado. De esta manera, una X+ es una mayor mejora que X para ese mismo anticuerpo. La mejora X para un anticuerpo no es necesariamente la misma que el valor X para otro anticuerpo; el valor X+ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+ para otro anticuerpo, y el valor X+++ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+++ de otro anticuerpo.

En este ejemplo, las combinaciones de anticuerpos recombinantes de lgM12 + lgM42, lgM22 + lgM46, lgM12 + lgM22, IgM 12 + lgM46, lgM42 + lgM22 e lgM42 + lgM46, producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod, en comparación con el tratamiento con vehículo (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo). Ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el genero.

Además, el grado de mejora de los puntos de extremo sensitivos motores con cada de una de estas combinaciones es supra-aditivo (sinergia exhibida) en una manera dependiente de la dosis estadísticamente significativa, en comparación con las mejoras aditivas predichas de cada uno de los anticuerpos solos. De nuevo, ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el género.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12+lgM42 mejoró significativamente el brote de neuritas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). El grado de brote de neuritas es supra-aditivo en comparación con el efecto aditivo de cada anticuerpo administrado solo. De esta manera, se entiende que estos anticuerpos inducen el brote de neuritas mediante distintos mecanismos de acción; esto es consistente con los patrones de unión distintos respectivos de estos anticuerpos al tejido neural.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM22 + lgM46 produjo un incremento significativo en la mielinización en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de remielinización es supra-aditivo en comparación con el efecto aditivo predicho de lgM22 o lgM46 administrado solo. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando están presentes neuronas en crecimiento y/u oligodendrocitos en crecimiento, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12 + lgM22 produce un incremento significativo en mielinización así como crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo en la médula espinal lesionada (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM12 o lgM22, respectivamente, administrados solos a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada una de las neuronas en crecimiento y los oligodendrocitos en crecimiento están presentes, estas células inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12 + lgM46 produce un incremento significativo en mielinización, así como crecimiento de las neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM12 o lgM46, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se piensa que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando están presentes cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM22 + lgM42 produce un incremento significativo en mielinización, así como el crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM22 o lgM42, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando están presentes cada una de neuronas en crecimiento y/u oligodendrocitos en crecimiento, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM46 + lgM42 produce un incremento significativo en mielinización así como el crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM46 o lgM42, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento están presentes, las células inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

EJEMPLO 15 Modelo de lesión de medula espinal Los anticuerpos de IgM se evalúan por su capacidad para promover la mejora funcional y el aumento de los procesos de remielinización, brote de neuritas o ambos, en un modelo de lesión de médula espinal en ratas. El modelo implica comprimir lateralmente la médula espinal entre las hojas de fórceps modificados, en donde el ancho de la hoja de los fórceps es de 2.5 mm, hasta una separación preestablecida de las hojas hasta 0.9 mm por un período de 15 segundos. La lesión resultante tiene características similares a las encontradas en la SCI humana (Gruner et al., 1995).

En ratas machos y hembras (aproximadamente 200-225 g, Long Evans) que sufren cirugía, se produce una lesión de médula espinal como se describió anteriormente. Anticuerpos de IgM recombinantes o tratamiento con vehículo se dan vía intravenosa 10 minutos después de la cirugía. Se evalúan el modo de andar y la función locomotora de las extremidades posteriores por un período de 12 semanas usando la escala de evaluación locomotora de BBB (véase, por ejemplo, Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC, Anderson DK, Faden Al, Gruner JA, Holford TR, Hsu CY, Noble LJ, Nockels R, Perot PL, Salzman SK, Young W. (1996) MASCIS evaluation of open field locomotor scores: Effects of experience and teamwork on reliability. Journal of Neurotrauma, 13: 343-359; Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. (1995) A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.

Journal of Neurotrauma, 12: 1-21). Las ratas se ponen a prueba a 1, 3, 5, 7 y 10 días, y entonces se cuantifican semanalmente despues de SCI por 9 a 12 semanas en los desafíos de BBB a partir de la línea base.

Al final del experimento, se somete a los animales a eutanasia mediante sobre-exposición a CO2. Se remueven los cerebros y las médulas espinales para la evaluación de: 1) el grado de mielinización (análisis con microscopio electrónico de tejido osmicado fijado con paraformaldehído/glutaraldehído embebido en plástico, y 2) el crecimiento de las neuritas (evaluación de la densidad de neuritas mediante evaluación estereológica).

EJEMPLO 16 Uso de anticuerpos individuales en un modelo de lesión de médula espinal En este experimento, se administraron anticuerpos humanos recombinantes solos a tres niveles de dosis como se indica en el cuadro 5A y el cuadro 5B.

CUADRO 5A Resumen de los puntos de extremo y grupos de tratamiento - anticuerpos de IgM recombinantes individuales r to o CUADRO 5B Resumen de resultados para los grupos de tratamiento N> 03 (*) X indica mejora, X+ indica más mejora, y X++ indica aún más mejora. Los valores de la puntuación de mejora son respecto a la dosificación de un anticuerpo dado. De esta manera, una X+ es una mayor mejora que X para ese mismo anticuerpo. La mejora X para un anticuerpo no es necesariamente la misma que el valor X para otro anticuerpo; el valor X+ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+ de otro anticuerpo, y el valor X+++ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+++ de otro anticuerpo.

En este ejemplo, se encuentra que cada uno de los anticuerpos recombinantes lgM12, lgM42, lgM22 e lgM46 producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en la función locomotora de las extremidades posteriores con parámetros de BBB mejorados (p<0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo). Los animales tratados con vehículo dan una puntuación de BBB estable dentro de 6 semanas de un nivel moderado de lesión de medula espinal. Un cambio significativo dependiente de la dosis en la puntuación de BBB sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, se encuentra para cada anticuerpo, con un incremento de mejora X en el nivel de BBB a la baja dosis, un incremento de mayor mejora X+ de BBB con 0.25 mg/kg, y una mejora de BBB incluso mayor X+++ a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05. De esta manera, cada uno de los anticuerpos lgM12, lgM42, lgM22 e lgM46 produce mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en la función locomotora de las extremidades posteriores con BBB mejorada (p < 0.05 para cada punto de extremo) en comparación con el tratamiento con vehículo. Ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el género.

Se encuentra que lgM12 e lgM42 producen incrementos dependientes de la dosis estadísticamente significativos en el brote de neuritas en secciones de médula espinal y de cerebro de ratones infectados con el TMEV, según se evalúa mediante estereología en comparación con los controles tratados con vehículo. Para cada anticuerpo, se encuentran cambios significativos dependientes de la dosis en el brote de neuritas sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, con un incremento de mejora X en el brote de neuritas a la baja dosis, un incremento de mayor mejora X+ en el brote de neuritas con 0.25 mg/kg, y un incremento incluso mayor en el brote de neuritas X+++ a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05.

Se encuentra que lgM22 e lgM46 producen incrementos dependientes de la dosis estadísticamente significativos en remielinización en secciones de médula espinal y de cerebro de ratones infectados con el TMEV, según se evalúa mediante estereología en comparación con los controles tratados con vehículo. Para cada anticuerpo, se encuentran cambios significativos dependientes de la dosis en remielinización sobre la escala de dosis de 0.025-2.5 mg/kg, en donde X es una mejora, con un incremento de mejora X en remielinización a la baja dosis, un incremento de mayor mejora X+ en remielinización con 0.25 mg/kg, y un incremento incluso mayor en remielinización X+++ a la dosis de 2.5 mg/kg. Esta tendencia se observa para los tamaños de grupo de 12 animales potenciada a un nivel de 0.8 y un nivel alfa de 0.05.

EJEMPLO 17 Lesión de medula espinal - combinaciones de anticuerpos En este ejemplo, varias combinaciones de relaciones de dosis fijas de anticuerpos de IgM recombinantes se examinan para mejora del resultado neurológico en el modelo de lesión de médula espinal como se describió en el ejemplo 14 en la presente. Por consiguiente, se da tratamiento intravenoso con combinaciones de anticuerpos de IgM (como mezclas) o control de vehículo 10 minutos después de la cirugía. Se monitorean los puntos de extremo locomotores como anteriormente. Además, se evalúa la mielinización y el brote de neuritas para examinar los cambios producidos por las combinaciones de anticuerpos. Las combinaciones evaluadas se muestran en el cuadro 6A y el cuadro 6B.

CUADRO 6A Resumen de los grupos de tratamiento - combinaciones de anticuerpos de igM recombinantes CUADRO 6B Resumen de los grupos de tratamiento - Resultados N CO> en CUADRO 6B (CONTINUACIÓN) r co - j (*) X indica mejora, X+ indica más mejora, y X++ indica aún más mejora. Los valores de la puntuación de mejora son respecto a la dosificación de un anticuerpo dado. De esta manera, una X+ es una mayor mejora que X para ese mismo anticuerpo. La mejora X para un anticuerpo no es necesariamente la misma que el valor X para otro anticuerpo; el valor X+ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+ de otro anticuerpo, y el valor X+++ de un anticuerpo no es necesariamente el mismo que el valor X+++ de otro anticuerpo.

En este experimento, se encuentra que cada una de las combinaciones de anticuerpos recombinantes IgM 12 + lgM42, lgM22 + lgM46, lgM12 + lgM22, lgM12 + lgM46, lgM42 + lgM22 e lgM42 + lgM46, produce mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en la función de las extremidades posteriores (puntos de extremo locomotores), como se encuentran mediante los parámetros de BBB. Ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el género.

Además, se encuentra que cada una de las combinaciones mejora la función locomotora en una manera supra-aditiva (es decir, sinérgica) en comparación con las mejoras de cada uno de los anticuerpos solos a la misma dosis. De nuevo, ninguna distinción en mejora se encuentra con base en el género.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12 + lgM42 mejoró significativamente el brote de neuritas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). El grado de brote de neuritas es supra-aditivo en comparación con el efecto aditivo de cada anticuerpo administrado solo. De esta manera, se entiende que estos anticuerpos inducen el brote mediante mecanismos de acción distintos; esto es consistente con los patrones de unión distintos respectivos de estos anticuerpos al tejido neural.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM22 + lgM46 produjo un incremento significativo en mielinización en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de remielinización es supra-aditivo en comparación con el efecto aditivo predicho de lgM22 o lgM46 administrado solo. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando están presentes cada uno de las neuronas en crecimiento y los oligodendrocitos en crecimiento, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12 + lgM22 produce un incremento significativo en mielinización así como crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo en la medula espinal lesionada (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de IgM 12 o lgM22, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento están presentes, estas células inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM12 + lgM46 produce un incremento significativo en mielinización así como crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM12 o lgM46, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento están presentes, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM22 + lgM42 produce un incremento significativo en mielinización así como crecimiento de neuronas, en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM22 o lgM42, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento están presentes, las células inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

Además de que se producen mejoras dependientes de la dosis estadísticamente significativas en varios puntos de extremo sensitivos motores que incluyen condición del pelaje, parámetros del modo de andar y puntuación de Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p < 0.05 para cada punto de extremo en comparación con el tratamiento con vehículo), la combinación de lgM46 + lgM42 produce un incremento significativo en mielinización así como crecimiento de neuronas en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0.05). Además, el grado de crecimiento y remielinización de las neuronas es supra-aditivo en comparación con el efecto de lgM46 o lgM42, respectivamente, administrado solo a las dosis usadas aquí. Sin que sea limitado por la teoría, se entiende que esto es un resultado de actividad paracrina. Por consiguiente, cuando cada uno de neuronas en crecimiento y oligodendrocitos en crecimiento están presentes, las celulas inducen respectivamente producción paracrina que afecta positivamente al otro tipo de célula bajo evaluación.

EJEMPLO 18 El anticuerpo rHlqM12 recombinante, una IqM humana que se une a neuronas, protege a los axones de la médula espinal Los presentes inventores han demostrado que un anticuerpo natural del suero humano, sHlgM12, se une a las neuronas in vitro y promueve el brote de neuritas. Generaron una forma recombinante, rHlgM12, con propiedades identicas. La infección intracerebral con el virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (TMEV) de cepas susceptibles de ratón, causa enfermedad desmielinizante crónica con pérdida axonal progresiva y disfunción neurológica similar a las formas progresivas de esclerosis múltiple. El tratamiento de este modelo con anticuerpos de la clase de IgM que se unen a los oligodendrocitos, mejora la remielinización del SNC (Warrington et al., (2007) J Neurosci Res 85: 967-976). En contraste, el anticuerpo monoclonal humano derivado del suero (sHlgM12) que se une a las neuronas, promueve el brote robusto de neuritas al mismo grado que la laminina, y reduce los efectos inhibidores de la mielina del SNC sobre el brote de neuritas (Warrington et al., (2004) J Neuropathol Exp Neurol 63(5): 461-473). Más recientemente, se generó una forma recombinante de sHlgM12 humano (rHlgM12) con propiedades biológicas idénticas, como se describió anteriormente. Para estudiar los efectos de rHlgM12 sobre la integridad axonal de la médula espinal, los presentes inventores llevaron a cabo marcación retrógrada, una téenica que depende de los axones anatómicamente continuos y funcionalmente preservados.

Métodos Marcación retrógrada: Después de que se anestesia a los ratones, se llevó a cabo laminectomía dorsal en las vértebras torácicas inferiores (T10-11). Se hemiseccionó la médula espinal en el lado derecho, y el sitio de la hemisección se empacó con una solución estéril de Fluorogold a 4%. Una semana despues de la cirugía, se sacrificó a los ratones, y se removieron los cerebros. Se hicieron secciones en serie (40 mm de espesor) del tallo cerebral, y se analizó cada cuarta sección. Se hizo el conteo de las neuronas grandes brillantemente fluorescentes bajo aumento de 200x de 16 cortes del tallo cerebral.

Resultados El modelo del TMEV ofrece una plataforma para desarrollar estrategias que promueven la neuroprotección y previenen la pérdida del axón. Las primeras etapas de la enfermedad incluyen inflamación y desmielinización; las etapas posteriores presentan pérdida del axón y déficits funcionales. Como se detalló en los ejemplos previos, rHlgM12 entra a la médula espinal y se localiza hacia los axones positivos para neurofilamento (NF) después de una sola inyección i.p. de 1 mg, según se confirma mediante imágenes confocales (figuras 15A a 15D). rHlgM12 se co-localizó también como haces de fibras positivas para NF cortadas transversalmente (figura 15D). En estudios en animales, rHlgM12 mejora el número de neuronas del tallo cerebral retrógradas marcadas. Se administró rHlgM12 o solución salina a ratones SJL a 90 días post-infección (dpi). Se llevó a cabo cirugía de la médula espinal para marcación retrógrada 9 semanas después del tratamiento. Una semana después de la cirugía, se sacrificó a los ratones, y se cuantificaron las neuronas marcadas con fluorescencia en secciones en serie del tallo cerebral. rHlgM12 mejora el número de neuronas del tallo cerebral retrógradas marcadas en comparación con el control de solución salina (datos no mostrados). De esta manera, los ratones tratados con rHlgM12 tuvieron más neuronas del tallo cerebral retrógradas marcadas, en comparación con los controles tratados con solución salina.

EJEMPLO 19 Una sola dosis de anticuerpo monoclonai humano que se une a neuronas mejora la actividad espontánea en un modelo de desmielinización de murino El laboratorio de los presentes inventores ha demostrado que un anticuerpo natural del suero humano, sHlgM12, se une a las neuronas in vitro y promueve el brote de neuritas. Generaron una forma recombinante, rHlgM12, con propiedades identicas. La infección intracerebral con el virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (TMEV) de cepas susceptibles de ratón, da como resultado enfermedad desmielinizante crónica con pérdida axonal progresiva y disfunción neurológica similar a las formas progresivas de esclerosis múltiple. Para estudiar los efectos de rHlgM12 sobre la función motora de ratones infectados con el TMEV, los presentes inventores monitorearon la actividad nocturna espontánea durante muchas semanas. El comportamiento nocturno es una medida sensitiva de la función neurológica de los roedores, debido a que se espera que los cambios de actividad máximos ocurran durante el período de monitoreo de la vida nocturna normalmente activa. Se puso a los ratones en cajas de actividad 8 días antes del tratamiento para colectar la actividad espontánea en la línea base. Después del tratamiento, la actividad en cada grupo se registró continuamente durante 8 semanas. Se eligió un período de monitoreo de 8 semanas por dos razones: (1) se demostró previamente que la remielinización inducida por la IgM está presente alrededor de 5 semanas post-tratamiento, y (2) la enfermedad desmielinizante inducida por el TMEV en esta cepa progresa muy lentamente. Debido a los largos períodos de observación y la gran serie de datos, puede ser difícil apreciar las diferencias entre los grupos de tratamiento estudiando los registros no filtrados originales. Para delinear claramente los cambios en los datos originales altamente fluctuantes, se aplicaron tres diferentes métodos: (1) contención de datos, (2) aplicación de filtros de bajo paso Gaussianos (GF) y (3) ajuste polinomial. Mediante el uso de cada uno de los tres métodos, se mostró que en comparación con la IgM control y solución salina, el tratamiento temprano con rHlgM12 indujo mejora en la función motora horizontal y vertical, mientras que el tratamiento posterior mejoró sólo la actividad horizontal. rHlgM12 no alteró la actividad de los ratones normales no infectados. Este estudio apoya la hipótesis de que el tratamiento con una IgM que se une a las neuronas no sólo protege a las neuronas in vitro , sino influye también sobre la mejora motora funcional.

Introducción El monitoreo a largo plazo y el análisis de la función neurológica en los modelos de enfermedad en roedores, continúa siendo un reto. El comportamiento nocturno es una medida sensitiva de la función neurológica de los roedores, debido a que se espera que los cambios de actividad máximos ocurran durante el período de monitoreo de la vida nocturna normalmente activa [1] Sin embargo, en los modelos animales de enfermedades lentamente progresivas, el monitoreo se extiende con frecuencia durante varias semanas. Se reportó previamente que el anticuerpo que se une a oligodendrocitos (rHlgM22) mejoró la remielinización alrededor de las 5 semanas despues del tratamiento [2]. Considerando en conjunto que la evolución de la enfermedad y la reparación es un proceso lento, y para asegurar que cualquier fluctuación en actividad se tome en cuenta, se monitoreo la actividad prolongada con la misma densidad de muestreo usada en el monitoreo a corto plazo. Esto creó series de datos grandes y altamente fluctuantes (figuras 32A, 32C). Para delinear claramente los cambios post tratamiento y las tendencias generales de recuperación en la actividad a largo plazo, se comparó el uso de la contención de datos, la filtración Gaussiana y el ajuste polinomial usando Mathematica (Wolfram Research, Inc).

La infección intracerebral con el virus de la encefalomielitis de murino de Theiler (TMEV) de cepas de ratón susceptibles, da como resultado enfermedad desmielinizante crónica con disfunción neurológica progresiva similar a las formas progresivas de esclerosis múltiple [3] El tratamiento de este modelo con anticuerpos de la clase de IgM que se unen a los oligodendrocitos, mejora la remielinización del SNC [4] En contraste, un anticuerpo monoclonal humano derivado del suero (sHlgM12) que se une a las neuronas, promueve el brote de neuritas robusto al mismo grado que la laminina, y reduce los efectos inhibidores de la mielina del SNC sobre el brote de neuritas [5] Más recientemente, se generó una forma recombinante de sHlgM12 humano (rHIgMI 2) con propiedades biológicas idénticas. Se mostró previamente que rHlgM12 tiene una vida media de 3.6 horas, pero que cruza aún la barrera hemoencefálica y se une a los tejidos nerviosos (observación no publicada). Para estudiar los efectos de rHIgMI 2 sobre la actividad de los ratones infectados con el TMEV, se monitoreó la actividad espontánea durante varias semanas usando cajas de actividad AccuScan (Accuscan Instruments, Inc., Columbus, OH). Se eligió un período de monitoreo relativamente largo de 8 semanas por dos razones: (1) La remielinización inducida por la IgM está presente alrededor de las 5 semanas post-tratamiento, y (2) la enfermedad desmielinizante inducida por el TMEV en esta cepa progresa muy lentamente en comparación con los modelos de EAE puramente autoinmunes de MS [6]. Debido a los largos períodos de observación en comparación con los datos previamente publicados (cuadro 7), la identificación de los cambios mediante la inspección visual de los datos sin elaborar demostró ser difícil.

CUADRO 7 Duración del monitoreo de la actividad espontánea en estudios publicados en comparación con el presente estudio Materiales v metodos Ratones: Se alojó y se crió a ratones SJL/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) en la unidad de cuidados animales de la Mayo Clinic. Los protocolos para animales fueron aprobados por el Mayo Clinic _ Institutional Animal Care and Use Committee.

Modelo de desmielinización por el virus de Theiler: Se indujo enfermedad desmielinizante en ratones hembras de 6 a 8 semanas mediante inyección intracerebral del TMEV. Una aguja de calibre 27 suministró 10 mI que contenía 2.0 x 105 unidades formadoras de placas de la cepa de Daniel del TMEV. Esto dio como resultado más de 98% de incidencia de infección con fatalidades raras. Todos los animales desarrollaron encefalitis leve, la cual se resolvió dentro de 2 semanas. Los animales empeoraron durante los siguientes 6 a 8 meses con enfermedad desmielinizante crónica de la medula espinal. La lesión y pérdida del axón comienzo tres meses después de la infección que se correlacionó con disfunción neurológica [3] Tratamiento con anticuerpos: Se trató a ratones SJL (no infectados, 45 y 90 días post-infección) con una sola dosis intraperitoneal de 200 mg de anticuerpos (rHlgM12 o control de isotipos de IgM) disueltos en 0.5ml de PBS. El tercer grupo se trató sólo con 0.5 mi de PBS.

Monitoreo de la actividad espontánea: Se registró la actividad locomotora espontánea con el aparato de campo abierto (OF) Digiscan (Omnitech Electronics; Columbus, OH) y el software Versamax, v.4.12-1 AFE (Accuscan Instruments, Inc, Columbus, OH). El aparato consiste de seis jaulas de acrílico (40x40x30.5 cm) suportadas por un marco de metal que sostiene dos series de fotoceldas. El dispositivo mide el número de movimientos horizontales y verticales discretos tabulando el número de interrupciones del haz infrarrojo proyectado. En todas las jaulas, los ratones fueron expuestos a condiciones ambientales idénticas: (a) agua y alimento libremente accesible, (b) un ciclo normal de 12 horas de luz/oscuridad, y (c) temperatura ambiente de 21.11°C. En cada experimento, se excluyó a los animales hiperactivos y, en raras ocasiones con sobrepeso, y el resto de los ratones se distribuyó al azar. Varios grupos de 5 ratones SJL se pusieron en el centro de cada jaula, y se colectó la actividad espontánea en la línea base durante el período de 8 días consecutivos. Después de este período, tres grupos de ratones con la actividad en la línea base más similar se trataron con el anticuerpo de IgM control rHlgM12 o solución salina, y se monitoreó entonces a los mismos durante el mismo período de 8 semanas. Se colectaron los datos como el número de interrupciones del haz por bloques de 1 hora. Se registraron las actividades horizontales y verticales totales usando el programa Versadat, V.3.02-1AFE (Accuscan Instruments). No se pudo poner más de 5 animales por jaula de actividad, debido a que este es el número máximo de animales permitidos por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

Análisis de datos: Las diferencias entre los grupos de tratamiento pueden ser difíciles de apreciar estudiando los registros no filtrados originales (figuras 32A a 32C). Para recuperar las tendencias lentas en los datos originales altamente fluctuantes, se aplicaron tres diferentes métodos: 1) contención de datos, 2) aplicación del filtro de paso bajo Gaussiano (GF), y 3) ajuste polinomial.

La contención de datos es el método más simple y reemplaza a un grupo de puntos de datos con un contenedor (bin) preseleccionado por su valor promedio. En el presente caso se seleccionó un contenedor nocturno, dado que la actividad de los murinos alcanzó un pico en la noche. Por lo tanto, se reemplazaron todas las lecturas nocturnas (12 h/día) por su valor promedio como se muestra en las figuras 33A, 33B, 35C, 35D, 37C y 37D. La comparación de grupos puede llevarse a cabo mediante una prueba t simple para una diferencia de medias, con un tamaño de muestra efectivo de 12 horas por tratamiento. Mientras que estas comparaciones son simples, el pequeño tamaño de muestra en cada punto de tiempo resulta en grandes errores estándar y las comparaciones estadísticas son de uso limitado. En general, la contención de datos es un metodo efectivo para visualizar los datos ruidosos, pero es de uso limitado para pruebas estadísticas.

La filtración Gaussiana (GF) (conocida también como filtración de paso bajo, nivelación de datos o mejora de sensibilidad), es un procedimiento de reducción de ruido usado comúnmente en la espectroscopia de transformación de Fourier y el procesamiento de imágenes [7] La GF, llevada a cabo con una selección apropiada de ensanchamiento Gausiano (GB, en días), filtró las fluctuaciones de alta frecuencia a un nivel deseado. La elección del filtro es arbitraria, y puede ser guiada por la tasa de cambios de actividad esperados. La GF es un método de nivelación que usa la información de los puntos tomados de ambos lados de un valor y ponderando la influencia de estos puntos, de modo que la influencia decae de acuerdo con la función Gaussiana. Computacionalmente, la GF puede ser implementada de dos maneras equivalentes: 1) Transformación de Fourier (FT) de los datos, seguida de multiplicación con una función Gaussiana y FT inversa del producto; y 2) convolución directa de los datos con un grano Gaussiano. En los paquetes de software de alto nivel (Matlab (Mathworks) o Mathematica (Wolfram)), la función del filtro Gaussiano está disponible con programación mínima o ninguna programación por el usuario. Con la selección apropiada de GB, el método de GF detallado anteriormente permite la visualización simplificada de los datos heterogéneos y altamente complejos. Una limitación de la GF es que mientras que permite la fácil visualización de las tendencias, las comparaciones estadísticas se complican por la elección del GB.

Para comparación y para demostrar un metodo que permite la comparación estadística simplificada, se ajustaron polinomiales a los datos. Estos modelos permitieron términos polinomiales hasta arriba a través de cualquier grado (xn), y estimó parámetros de forma por separado para cada grupo de tratamiento (términos de interacción). La elección de un polinomial de sexto grado fue arbitraria después de que se exploraron varias opciones, pero permitió flexibilidad suficiente para representar los efectos no lineales con el tiempo. Debido a que los diferentes grupos de tratamiento fueron óptimamente ajustados usando polinomiales de orden variable, se eligió permitir el orden de flexibilidad mayor. Se usaron criterios de información Alkaike (AIC) para determinar el “mejor ajuste” de las líneas polinomiales a través de varios de los grupos de tratamiento [8]. AIC es un método de comparación de modelos que equilibra la ganancia en R2 añadiendo términos adicionales, pero penaliza la complejidad exagerada (es decir, el uso de grado de libertad). En general, el ajuste de tercer orden fue suficiente para capturar la tendencia de los datos, y para algunos casos el segundo orden o incluso el ajuste lineal fue “mejor” de acuerdo con AIC. Sin embargo, el propósito primario fue comparar los grupos de tratamiento en los puntos de tiempo observados. Debido al gran número de puntos de datos, y debido a que no se está usando el ajuste polinomial para predecir (o extrapolar) los valores de tratamiento fuera de los datos observados, el impacto del “sobreajuste” sobre los resultados es mínimo.

Una ventaja del ajuste polinomial es que la comparación estadística de los grupos de tratamiento es directa: pueden compararse los tratamientos en puntos de tiempo especificados usando los valores del modelo predichos y los errores estándar respectivos. Pueden llevarse a cabo comparaciones en pares directas de los tratamientos a intervalos regulares a través del marco de tiempo entero para determinar cuándo los grupos de tratamiento han divergido significativamente. Por último, el ajuste polinomial remueve el medio adicional y el ruido de baja frecuencia que enfoca la atención visual sobre la tendencia general durante el marco de tiempo entero.

Sin embargo, dentro de cada uno de los experimentos, algunos grupos de ratones tuvieron actividad horizontal y vertical en la línea base (8 días) un poco diferente. Por lo tanto, se usaron primero los valores Z para estandarizar la actividad en la línea base independientemente para cada grupo, y entonces se llevó a cabo filtración Gaussiana o polinomiales ajustados para estos valores.

Análisis estadístico: La contención de datos y la nivelación de los datos del filtro de bajo paso Gaussiano se llevaron a cabo usando un macro escrito en Mathematica (Wolfram). El macro y las instrucciones están disponibles en mavoresearch.mavo.edu/mavo/research/rodriauez lab/software.cfm. Se llevaron a cabo modelos de regresión polinomial y comparaciones estadísticas de los grupos de tratamiento usando los valores del modelo predichos y los errores estándar respectivos basados en la estadística z (SAS Institute, Inc). Se hicieron comparaciones en pares directas de los tratamientos para cada día a través del marco de tiempo entero, y se determinó la significancia estadística al umbral típico a = 0.05. Ningún ajuste se hizo para comparaciones múltiples.

Resultados rHlqM12 mejora la actividad horizontal en ratones SJL cuando se da a 90 dpi Tres grupos de 5 ratones SJL a 90 días post-infección (dpi) se pusieron en cajas de actividad, y se midió la actividad en la línea base por 8 días consecutivos. Dos grupos de ratones se trataron con una sola dosis de 200 mg de rHlgM12 o una IgM control de isotipos. El tercer grupo se trató con solución salina. Después del tratamiento, la actividad espontánea se registró continuamente durante 8 semanas. Debido a que los datos se colectaron en bloques de 1 hora, se obtuvieron aproximadamente 900 puntos de datos por cada grupo. Estos datos sin elaborar originales (figura 32A a 32C) son altamente fluctuantes, de modo que las diferencias entre los grupos de tratamiento pueden ser difíciles de apreciar. Los tres métodos (contención de datos, filtración gaussiana y ajuste polinomial) revelaron que los ratones tratados con rHlgM12 mostraron mejora en la actividad horizontal, mientras que los ratones tratados con solución salina e IgM control no tuvieron cambios en la actividad durante el período de 8 semanas (figuras 33A, 33C y 33E). Mediante el uso de comparaciones en pares directas de tres tratamientos despues del ajuste polinomial, se determinó que la mejora en la función motora horizontal en los ratones tratados con rHlgM12 llegó a ser estadísticamente significativa en el día 7 post-tratamiento (en comparación con la IgM control) y en el día 11 (en comparación con solución salina) (figura 34). La mejora observada en la actividad nocturna horizontal de los animales tratados con rHlgM12 persistió por aproximadamente 30 días, y regresó entonces a los niveles en la línea base. La comparación en pares de los grupos de tratamiento con IgM control contra solución salina mostró significancia estadística alrededor de los días 38 a 52. Sin embargo, cuando se comparó con las diferencias mayores observadas entre el grupo de tratamiento con rHlgM12 y los controles, se cree que estas diferencias entre los grupos de control no son biológicamente significativas. Por otra parte, la actividad vertical no mostró diferencias mayores y fue similar en los tres grupos (figuras 33B, 33D, y 33F). rHlqM12 mejora la actividad horizontal y vertical en ratones SJL cuando se da a 45 dpi El estudio previo usó la actividad vertical (comportamiento de erguirse) como una lectura de salida primaria [1] Debido a la separación axonal en los ratones infectados crónicamente con el TMEV, las extremidades posteriores llegaron a ser progresivamente débiles y rígidas de modo que el erguirse fue reducido. En el primer experimento de este estudio, cuando se administró rHlgM12 al momento de la desmielinización máxima (90 dpi) y al inicio de la perdida axonal progresiva, sólo se mejoró la actividad horizontal. El comportamiento de erguirse no fue afectado, y fue equivalente en los tres grupos de tratamiento. Por lo tanto, se formuló la pregunta de si el tratamiento en un punto de tiempo anterior puede ser más benéfico. En un segundo experimento, se trató a grupos de 5 ratones a 45 dpi con una sola dosis de 200 mg de rHlgM12, una IgM control de isotipos o solución salina. Se usó un diseño experimental idéntico, se colectó la actividad en la línea base por 8 días, y la actividad post-tratamiento por 8 semanas. En este experimento, comenzando alrededor de 2 semanas post-tratamiento, los ratones tratados con rHlgM12 mostraron mejoras claras en la actividad horizontal y vertical. Esto fue evidente después del uso de los tres métodos: promedio de datos, aplicación del filtro Gaussiano o ajuste polinomial (figuras 35C a 35H). Los ratones tratados con solución salina y con IgM control mostraron niveles de actividad similares a lo largo del final del estudio. En los ratones tratados con rHlgM12, la mejora en la actividad horizontal fue evidente hasta que el experimento concluyó. Por otra parte, la mejora en la actividad vertical duró por aproximadamente 4 semanas, y entonces disminuyó hasta los valores de la línea base. Las comparaciones en pares directas de tres tratamientos mostraron que la mejora en la función motora horizontal en los ratones tratados con rHlgM12 divergió significativamente en el día 13 post-tratamiento (en comparación con la IgM control) y en el día 9 (en comparación con solución salina) (figuras 36A y 36C). Asimismo, la función motora vertical en los ratones tratados con rHlgM12 divergió significativamente en el día 14 post- tratamiento (en comparación con la IgM control) y en el día 6 (en comparación con solución salina) (figuras 36B y 36D). La comparación de los grupos tratados con solución salina contra IgM control no reveló diferencias biológicas mayores para la actividad horizontal o vertical (figuras 36E y 36F). rHlaM12 no altera la actividad espontánea en los ratones no infectados normales El tratamiento con rHlgM12 en dos experimentos previos mostró claro efecto benéfico en ratones infectados neurológicamente discapacitados. Para excluir la posibilidad de que este anticuerpo puede tener propiedades irritables y por lo tanto induce función motora incrementada, se llevó a cabo un experimento similar con ratones no infectados. Tres grupos de ratones no infectados de edad igualada se trataron con rHlgM12, IgM control o solución salina. En comparación con la mejora de actividad en los ratones infectados, rHlgM12 así como los otros dos tratamientos no indujeron incremento alguno en la función motora de los ratones normales (figuras 37A a 37H). Los tres grupos mostraron una tendencia a disminuir en la actividad espontánea. Este resultado indica que ninguno de los anticuerpos tiene una influencia sobre el incremento de actividad en los ratones normales.

Discusión Existe una necesidad crítica por el desarrollo de terapias neuroprotectoras para esclerosis múltiple así como para otras enfermedades desmielinizantes y neurodegenerativas. Aún cuando existen algunos fármacos antiinflamatorios que pueden llevar indirectamente a una disminución en el daño axonal durante la enfermedad inflamatoria del SNC, no existen fármacos que actúen directamente al nivel de las neuronas o los axones. El propósito principal de la neuroprotección es limitar la disfunción neuronal e intentar mantener la integridad funcional de las neuronas y los axones. Por muchos años la desmielinización, el distintivo patológico de la MS, se consideró como una causa de déficits neurológicos permanentes. Es claro ahora que la desmielinización es necesaria, pero no suficiente para la pérdida axonal permanente [9]. La desmielinización sólo predispone a los axones denudados a la lesión secundaria causada por la citotoxicidad de las células T o la pérdida del soporte neurotrófico local de los oligodendrocitos muertos [10].

La observación previa de que el anticuerpo que se une a neuronas, sHlgM12, promovió la extensión robusta de las neuritas [5], representa una respuesta in vitro benéfica clara. Debido a que la versión recombinante de este anticuerpo mostró propiedades in vitro similares, se formuló la pregunta de si afectaría la actividad motora de los ratones con enfermedad desmielinizante inducida por el TMEV. El análisis de la función motora se llevó a cabo monitoreando la actividad nocturna espontánea. Primero, se trató a ratones al momento de la desmielinización máxima y el inicio de la pérdida axonal (90 dpi). Ocho semanas después del tratamiento, rHlgM12 mejoró sólo la actividad motora horizontal, mientras que la actividad vertical no fue afectada. Sin embargo, cuando se trató tempranamente a los ratones en la enfermedad (a 45 dpi), rHlgM12 mejoró la actividad horizontal y vertical. En la enfermedad crónica inducida por el TMEV, el comportamiento de erguirse (actividad vertical) es afectado más severamente, y parece que la degeneración y perdida de axones responsable de esta actividad es irreversible. A la inversa, la fase temprana de la enfermedad, cuando estos axones no son irreversiblemente lesionados, parece ser el tiempo ideal para el tratamiento. Jones et al. usaron el modelo de EAE, y estudiando la separación axonal y la función motora, propusieron un paradigma idéntico; el tratamiento con fármacos neuroprotectores debía comenzar tempranamente en la enfermedad, incluso antes del inicio de los déficits motores [11] Segundo, debido a que la mejora funcional ocurre aproximadamente dos semanas después del tratamiento y comienza a decaer aproximadamente 25 a 30 días después, puede ser que serán necesarios tratamientos repetidos para sustentar la función motora. Infortunadamente en los presentes estudios, no fue posible poner a prueba dosis múltiples de moléculas de inmunoglobulina humanas debido a que la respuesta inmune del anticuerpo anti-humano en los ratones resulta en anafilaxis. A2B5 es un anticuerpo monoclonal de ratón que también promueve el brote de neuritas [5], y representa un candidato probable para poner a prueba la dosificación individual contra la dosificación múltiple en el resultado funcional y su duración de acción. Por último, ninguno de los tratamientos tuvo un efecto sobre la función motora de los animales normales no infectados. Sin tener en cuenta el tratamiento, todos los grupos de ratones normales mostraron una disminución gradual en la actividad espontánea, la cual puede ser explicada por la habituación al ambiente. Esta disminución de actividad en los animales normales, hace que el incremento en actividad de los ratones enfermos inducido por rHlgM12 sea incluso más impresionante.

Los presentes inventores han demostrado mejora en la función motora en un modelo progresivo crónico de enfermedad desmielinizante inflamatoria en la cual ha sido generalmente muy difícil prevenir el desarrollo de déficits neurológicos. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal que se une a neuronas rHlgM12 representa un agente terapéutico muy prometedor para el tratamiento no sólo de MS humana, sino también otros trastornos desmielinizantes o neurodegenerativos. Además, debido a que existen ejemplos de ataques de MS clínicamente silenciosos [12, 13], los presentes inventores y otros han propuesto que los compuestos neuroprotectores deben ser complementados con agentes inmunomoduladores [11]. Se propone que el tratamiento combinado de fármacos inmunomoduladores y rHlgM12 pueda resultar en una mejora significativa de la preservación y reparación del SNC después de la lesión axonal.

Considerados en conjunto, los resultados de este estudio proveen tres conclusiones importantes: 1) la etapa de la enfermedad cuando el tratamiento se da, es crítica (el tratamiento temprano es más benéfico); 2) para mantener adicionalmente una función motora mejorada, puede haber una necesidad de tratamientos repetidos, y 3) rHlg 12 no es tóxico y no afecta la función motora en los animales normales no infectados. Los hallazgos son consistentes con la hipótesis de que un anticuerpo recombinante que elige como objetivo a las neuronas, mejora la función neurológica en un modelo axonal crónico de desmielinización.

Referencias 1. McGavern, D. B., et al., Quantitative assessment of neurologic deficits in a chronic Progressive murine model of SNC demyelination. Exp Neurol, 1999. 158(1): p. 171-81. 2. Warrington, A. E., et al., Human monoclonal antibodies reactive to oügodendrocytes promote remyelination in a model of múltiple sclerosis. Proc Nati Acad Sci USA, 2000. 97(12): p.6820-5. 3. McGavern, D. B., et al., Axonal loss results in spinal cord atrophy, electrophysiological abnormalities and neurological déficits following demyelination in a chronic inflammatory model of múltiple sclerosis. Brain, 2000. 123 Parte 3: p. 519-31. 4. Warrington, A. E., et al., A recombinant human IgM promotes myelin repair añera single, very low dose. J Neurosci Res, 2007. 85(5): p. 967- 76. 5. Warrington, A. E., et al., Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. J Neuropathol Exp Neurol, 2004. 63(5): p.461-73. 6. Denic, A., et al., The relevance of animal models in múltiple sclerosis research. Pathophysiology, 2010. 18(1): p. 21-9. 7. Hoch, J. C. y A. S. Stern, NMR Data Processing. 1a. ed. 1996, New York: Wilcy-Liss.230. 8. Akaike, H., A new look at the statistical model Identification. IEEE Transactions on Automatic Control, 1974. 19(6): p. 716-723. 9. Howe, C. L, J. D. Adelson y M. Rodríguez, Absence of perforin expression confers axonal protection despite demyelination. Neurobiol Dis, 2007. 25(2): p. 354-9. 10. Rodríguez, M., A function of myelin is to protect axons from subsequent injury: implications for deficits in múltiple sclerosis. Brain, 2003. 126 (Parte 4): p.751-2. 11. Jones, M. V., et al., Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurolmmunol, 2008. 199(1-2): p. 83-93. 12. Jacobs, L, P. R. Kínkel y W. R. Kinkel, Silent brain lesions in patients with isolated idiopathic optic neuritis. A clinical and nuclear magnetic resonance imaging study. Arch Neurol, 1986.43(5): p.452-5. 13. Pohl, D., et al., Pediatric múltiple sclerosis: detection of clinically silent lesions by multimodal evoked potentials. J Pediatr, 2006. 149(1): p. 125-7. 14. Mikami, Y., et al., A simple and reliable behavioral analysis of locomotor function after spinal cord injury in mice. Nota técnica. J Neurosurg, 2002. 97 (Supl. 1): p. 142-7. 15. Mikami, Y., et al., Implantaron of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to the novo neurogenesis and functional recovery. J Neurosci Res, 2004. 76(4): p.453-65. 16. Melnick, S. M. y D. L. Dow-Edwards, Differential behavioral responses to chronic amphetamine in adult male and female rats exposed to postnatal cocaine treatment. Pharmacol Biochem Behav, 2001.69(1-2): p.219-24. 17. Shen, H., et al., Inosine reduces ischemic brain injury in rats. Stroke, 2005.36(3): p.654-9. 18. Torres-Reveron, A. y D. L. Dow-Edwards, Prenatal cocaine dampened behavioral responses to methylphenidate in male and female adolescent rats. Neurotoxicol Teratol, 2006.28(2): p. 165-72. 19. Zhu, N., J. Weedon y D. L. Dow-Edwards, Oral methylphenidate improves spatial leaming and memory in pre- and peri-adolescent rats. Behav Neurosci, 2007. 121(6): p. 1272-9. 20. Li, X., et al., Attenuation of basal and cocaine-enhanced locomotion and nucleus accumbens dopamlne in cannabinoid CB1-receptor-knockout mice. Psychopharmacology (Berlín), 2009.204(1): p. 1-11. 21. Rivera-Quiñones, C., et al., Absence of neurological deficits following extensive demyelination in a class l-deficient muríne model of múltiple sclerosis. Nat Med, 1998.4(2): p. 187-93.

EJEMPLO 20 Anticuerpos monoclonales humanos neuroprotectores para el tratamiento de la enfermedad de neuronas motoras ALS La esclerosis lateral amiotrófica (ALS) es una enfermedad neurológica devastadora que afecta principalmente a las celulas del asta anterior y neuronas del tracto corticoespinal. La ALS es una enfermedad de las neuronas motoras caracterizada por la degeneración progresiva de las células motoras en el cerebro y la médula espinal. Las células motoras (neuronas) controlan los músculos que permiten que un individuo se mueva, hable, respire y degluta. Sin nervios que los activen, los músculos gradualmente se debilitan y se desechan. A pesar de la investigación extensiva, la etiología de este trastorno es ampliamente desconocida, y no existen tratamientos efectivos. Los genes implicados en una minoría de los pacientes con una forma genética rara de ALS proveen una pista potencial para este trastorno (1). Una mutación génica identificada ha sido la mutación SOD Cu/Zn (superóxido dismutasa de cobre/zinc), la cual está presente en un pequeño porcentaje de pacientes con la forma genética de ALS (2). Es evidente que los pacientes que poseen las mutaciones SOD tienen resultados neurológicos muy similares en comparación con los pacientes que desarrollan la enfermedad espontáneamente sin una mutación genética asociada (3). Esta enzima cataliza el superóxido hasta oxígeno y peróxido de hidrógeno. SOD1 es la forma de la enzima asociada con la ALS. Parece haber una ganancia de función de S0D1, que afecta el transporte axonal rápido (4). La frecuencia de la mutación SOD en ALS familiar varía de 12 a 23%, y el gen es usualmente heredado como un dominante autosómico.

La identificación del gen permitió el desarrollo de modelos animales con características de enfermedad de ALS para el diseño y la prueba de nuevos fármacos. Debido a que la forma heredada y no heredada de la ALS son enfermedades similares, la causa subyacente puede estar relacionada. Por lo tanto, los fármacos que son efectivos en los modelos de ratón de ALS heredada pueden funcionar tambien en las personas con las formas aleatorias más comunes de ALS. La disponibilidad de modelos de ratón transgénico con genes de SOD1 de humano y las características patológicas de la ALS, han promovido el desarrollo de fármacos para la enfermedad (5). Estos ratones transgénicos desarrollan pérdida progresiva de neuronas motoras y déficits neurológicos. Debido a que las formas heredada y no heredada de la ALS son clínicamente similares, los defectos subyacentes en la función de las neuronas motoras pueden estar relacionados. Los reactivos eficaces en ALS enlazada a SOD1 pueden ayudar también en las formas esporádicas más frecuentes de ALS. En la actualidad, existe sólo un fármaco en el mercado para ALS, el fármaco bloqueador de glutamato Rilutek® (tabletas de Riluzole). Sin embargo, los estudios han mostrado que este fármaco no mejora la calidad de vida del paciente, y puede sólo extender la vida un promedio de 2 meses. Claramente, fármacos más efectivos son críticamente necesarios.

El laboratorio ha desarrollado terapias novedosas para el tratamiento de trastornos desmielinizantes y degenerativos del sistema nervioso central (SNC) (69), y ha identificado una serie de anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) que se unen a oligodendrocitos (7) o neuronas (8), que se ha mostrado inducen la reparación en el SNC. Estos anticuerpos han sido clonados, secuenciados (9) y producidos en grandes cantidades en una instalación de GMP para pruebas clínicas futuras (10). El anticuerpo humano recombinante lgM12 (rHlgM12) se deriva de un anticuerpo aislado de un paciente con macroglobulinemia de Waldenstrom (11). Este anticuerpo marca específicamente las neuronas y los axones del SNC (8). A pesar de que es un anticuerpo de IgM, lgM12, como se mostró en los ejemplos anteriores, cruza la barrera hemoencefálica y se une específicamente a los axones y las neuronas dentro del SNC. rHlgM12 in vitro se une a una amplia gama de neuronas, que incluyen neuronas granulares cerebelares, neuronas corticales, neuronas hipocámpicas y celulas neuronales ganglionares retínales (12). Experimentos in vitro demuestran que rHlgM12 protege a las neuronas de la muerte celular. El anticuerpo monoclonal rHIgMI 2, administrado a los pacientes en las etapas tempranas de la ALS (las formas genética y espontánea de la enfermedad), puede actuar para proteger a las células del asta anterior y previene la lesión del axón y de esta manera retarda el inicio de la discapacitación y mejora la supervivencia.

Resultados Los presentes inventores han llevado a cabo experimentos tratando a ratones con la mutación hSOD1 G86R [13] (FVBTg SOD1 G86R M1Jwg, Jackson Labs), con el anticuerpo humano rHlgM12. Los ratones G86R parecen ser normales al nacer. Sin embargo, comenzando a aproximadamente 90 a 100 días de edad, sufren perdida de peso pronunciada, desarrollan atrofia muscular significativa, y mueren de insuficiencia respiratoria dentro de semanas de la pérdida de peso precipitada. En una prueba “de manera oculta’’ aleatorizada, estos ratones recibieron rHlgM12 purificado con GMP a la edad de 55 días como una sola dosis intraperitoneal (200 pg). En contraste, el grupo tratado con placebo recibió solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). Unos cuantos ratones se dejaron sin tratar para determinar el curso natural de la enfermedad sin manipulación humana. Debido a que los datos para los ratones tratados con PBS y no tratados fueron similares, los grupos se combinaron para análisis estadísticos. Los ratones fueron aleatorizados para tratamiento por un investigador en el laboratorio de los presentes inventores, y fueron observados para déficits neurológicos por otro investigador “de manera oculta”, hasta que llegaron a estar moribundos. Los investigadores del tratamiento y otros investigadores que llevaron a cabo los análisis patológicos no estuvieron al tanto del protocolo aleatorizado hasta que el código fue roto.

Se pesó a los animales sobre una base semanal para determinar si el tratamiento con los anticuerpos monoclonales humanos no sólo incrementarían la supervivencia, sino tambien retardarían el inicio de la pérdida de peso. Los resultados fueron notables, y mostraron un incremento estadísticamente significativo en supervivencia en los animales que recibieron rHlgM12 en comparación con los animales que recibieron PBS. En promedio, los investigadores registraron una supervivencia incrementada de 25 a 30 días la cual, mediante curvas de Kaplan-Meier (figura 38), mostraron significancia estadística (P = 0.008). Además, los ratones tratados con rHlgM12 tuvieron pérdida de peso menos pronunciada (figura 39), un parámetro comúnmente evaluado en la evaluación de la progresión de la enfermedad en los animales (18). Para el conocimiento de los presentes inventores, esta es la primera demostración de un anticuerpo monoclonal humano completamente recombinante dirigido contra las neuronas que es eficaz en el incremento de la supervivencia de los animales con un fenotipo de ALS.

Cuando los animales alcanzaron la fase moribunda, fueron sacrificados y perfundidos con fijador de Trump. Las médulas espinales fueron removidas y cortadas en bloques de 1 mm y embebidas en plástico Araldite por secciones de 1 mm de espesor. Estas secciones se examinaron histológicamente. Los animales que desarrollaron ALS debido a la mutación SOD mostraron degeneración axonal significativa en los tractos de la materia blanca, de modo que cuando el axón se colapsa, se desarrollan verticilos de mielina relativamente fácilmente identificados en la materia blanca de la médula espinal. Cuando el número de verticilos de la médula espinal (axones en degeneración) se cuantificó en secciones torácicas en animales que reciben rHlgM12 contra PBS, hubo una disminución estadísticamente significativa en el número de verticilos de mielina en los animales tratados con la terapia con el anticuerpo monoclonal (figura 40).

Se tiñeron tambien secciones de médula espinal con un anticuerpo para NeuN, un marcador que marca específicamente a las neuronas en el SNC y define muy claramente las células del asta anterior, así como las neuronas en el asta posterior. Muchas células del asta anterior se cuantificaron al nivel de la médula espinal torácica en los animales que recibieron rHlgM12 en comparación con PBS (figura 41, izquierda). Hubo una diferencia altamente estadística con un incremento en el número de células del asta anterior preservadas en los animales que recibieron rHlgM12 contra PBS. Un análisis similar en las neuronas en las astas posteriores reveló también un incremento significativo en las neuronas de los ratones tratados con rHlgM12 (figura 41, derecha).

El anticuerpo humano, rHIgMI 2, se une a la superficie de muchos tipos de neuronas del SNC obtenidas de muchas especies que incluyen ratones, humanos (figuras 42A a 42H), conejos y primates. Esto provee evidencia de que la señalización de neuronas por rHIgMI 2 se preserva en los mamíferos que van desde ratones hasta humanos. Los estudios de los presentes inventores en los ratones SOD sugieren que la protección de las células del asta anterior y posterior ante la muerte puede llevar a menos axones de la médula espinal en degeneración y supervivencia incrementada de los animales. Los experimentos descritos anteriormente en los ejemplos previos con neuronas corticales en cultivo, demuestran que el tratamiento de las neuronas con rHlgM12 puede protegerlas de la muerte celular (vease la figura 3). Neuronas corticales cultivadas de ratones neonatos fueron expuestas a concentraciones muy altas de peróxido de hidrógeno para determinar una concentración en donde 90% de las neuronas morirían. Las neuronas expuestas al peróxido de hidrógeno fueron tratadas al mismo tiempo con rHlgM12 u otra IgM humana que no se une a las neuronas. El tratamiento con rHlgM12 dio como resultado la preservación de 80% de las neuronas. En contraste, el tratamiento con una IgM control dio como resultado la muerte de 90% de las neuronas después de la exposición a peróxido de hidrógeno. Los presentes inventores formularon la hipótesis de que rHlgM12 extiende la duración de vida en los animales con ALS protegiendo a las neuronas de la muerte celular.

Se pusieron a prueba también anticuerpos humanos como substratos en placas de cultivo de tejidos, y se compararon por su capacidad para promover la extensión de procesos celulares normales de neuronas cerebelares o corticales. Los anticuerpos rHlgM12 y sHlgM42 que se unen a la superficie de las neuronas, y los anticuerpos rHlgM22 y sHlgM39 que no se unen a las neuronas, se compararon con la molécula de matriz extracelular que soporta procesos potentes, la laminina. El crecimiento de las neuronas sobre un substrato de los anticuerpos humanos rHlgM12 o sHlgM42, dio como resultado una extensión dramática del brote de las neuronas, similar a la observada con la laminina (8). Este estudio mostró también que las neuronas se comportaron normalmente en presencia de rHlgM12.

Se ha aceptado generalmente el dogma de que las moleculas de inmunoglobulina con un peso molecular cercano a 1 millón, son demasiado grandes para cruzar la barrera hemoencefálica (BBB) de la circulación para entrar al SNC [15] [16]. Sin embargo, existe evidencia acumulada de que algunos anticuerpos cruzan la BBB. Los presentes inventores han descrito anteriormente la detección de rHlgM12 dentro de la médula espinal después de la inyección periférica. Se administró intraperitonealmente 1 mg de rHlgM12 o una IgM humana control a ratones con lesiones de médula espinal desmielinizada. Cuatro horas después se sacrificó a los ratones, y secciones de la médula espinal fueron inmunoteñidas para detectar la presencia de la cadena mu de la IgM humana y anti-neurofilamento. En los ratones que recibieron rHlgM12, la microscopía confocal demostró que la cadena mu humana dentro de las lesiones desmielinizadas se co-localizó con antineurofilamento, un marcador de los axones, en tractos paralelos y como haces cortados en el extremo (véase las figuras 15A a 15D). No se encontró la IgM humana dentro de las lesiones de la médula espinal de ratones que recibieron una IgM control.

Mientras que los estudios provistos están en modelos animales, existen muchos aspectos tentadores de estos resultados de investigación que indican adicionalmente que este procedimiento novedoso será efectivo en pacientes humanos. De modo importante, el anticuerpo lgM12 descrito y usado en la presente es un anticuerpo monoclonal completamente humano.

Como resultado, sólo una dosis de este anticuerpo puede usarse en ratones. Dosis subsiguientes hacen que los animales desarrollen una respuesta inmune al anticuerpo, dando como resultado neutralización de rHlgM12 o la muerte del animal debido a anafilaxis. Sin embargo, puesto que estos son anticuerpos humanos “verdaderos”, es improbable que los pacientes humanos tratados con rHlgM12 desarrollen una respuesta inmune a ellos. Asimismo, rHlgM12 puede darse potencialmente sobre una base intermitente continua a los pacientes sin efecto deletereo o el desarrollo de una reacción de bloqueo de anticuerpos. Debido a que rHlgM12 es un autoanticuerpo humano natural, son improbables los efectos secundarios adversos y, por lo tanto, se espera que la toxicidad de este agente sea mínima. Existe mucha evidencia de que rHlgM12 será seguro en humanos. Antes de estos resultados positivos en el modelo de ALS, la forma del anticuerpo en suero, sHlgM12, se puso a prueba en varios modelos de enfermedad neurológica sin toxicidad, como se describió anteriormente en la presente. En estos estudios, se encontró: 1) ningún incremento en la patología del SNC en ratones con desmielinización mediada por virus después de una dosis de 1 mg, 2) ningún incremento en severidad de las puntuaciones clínicas en ratones con EAE activa después de una dosis de 200 mg, y 3) química sanguínea y patología del tejido limpia en los ratones CD-1 normales después de una dosis de 300 pg. Aún así, es notable que una sola dosis a un ratón en un modelo animal reconocido de ALS dé resultados notables. rHlgM12 ya se ha cultivado en una unidad de GMP de acuerdo con las normas generales de la FDA, y según las normas generales de la FDA, se han generado líneas de células transfectadas estables y se han almacenado sin infección adventicia alguna. Estas líneas de células se han puesto a prueba contra un panel de más de 50 organismos infecciosos, todos con resultados negativos. Además, las líneas de células producen grandes cantidades de anticuerpo en cultivo de tejidos (150 mg/ml). Se ha establecido una metodología para purificar a rHIgMI 2 hasta >97% de pureza sin virus adventicios, ADN, ARN u otro material extraño de acuerdo con las normas generales de la FDA, proveyendo una base preclínica fuerte para rHIgMI 2 en la prueba clínica de fase inicial futura en los pacientes con etapas tempranas de ALS.

Estudios en curso Habiendo mostrado anteriormente que el anticuerpo monoclonal humano recombinante (rHIgMI 2) puede prolongar la supervivencia en un modelo transgénico de ALS en humanos previniendo la pérdida de células del asta anterior y axones, están en curso estudios para generar datos preclínicos a través de farmacocinética y toxicología que se mueven hacia una prueba clínica de fase I en pacientes con ALS.

Estudios de manera oculta contra anticuerpo placebo: Se llevó a cabo un estudio definitivo controlado con placebo “de manera oculta” en dos cepas de ratones SOD con el fenotipo de ALS (SOD1 G86R y G93A), poniendo a prueba el anticuerpo humano recombinante rHIgMI 2 contra un anticuerpo humano control de isotipos, sHlgM39. La eficacia de una sola dosis de 200 mg de anticuerpo humano recombinante, rHlgM12, se pone a prueba para reducir la enfermedad en los modelos de ratón transgénico muíante SOD1 G86R y G93A [14] (B6 Cg-Tg SOD1 G93A 1Gur, Jackson Labs), en comparación con una dosis de 200 pg de un anticuerpo humano control de isotipos, sHlgM39. El tratamiento con el anticuerpo es a 55 días de edad después de la recomendación de ENMC de tratamiento preinicio [18], con resultados que reflejan los estudios piloto que comparan a rHlgM12 con PBS (figuras 38 a 41). Los puntos de extremo primarios son la supervivencia y la prevención de pérdida de peso. Cada grupo experimental consiste de 24 ratones, el cual es suficiente para detectar una diferencia con base en los datos anteriores. Además, se examina el SNC en todos los ratones después del sacrificio para determinar el número de células del asta anterior en la médula espinal torácica media usando un marcador para NeuN. Se hace el conteo del número de axones en degeneración indicado por los verticilos anormales de mielina. Se incluye el modelo muíante SOD1 G93A (B6.Cg-Tg)SOD1G93A)1Gur/J #004435, Jackson Laboratory), debido a que este es el primer modelo de ALS basado genéticamente, más ampliamente usado y mejor caracterizado, y permite que se comparen resultados con rHlgM12 con una base de datos amplia de paradigmas de tratamiento. Los ratones G86R tienen un inicio de enfermedad tardío (7 meses) y una progresión rápida, mientras que los ratones G93A tienen un inicio más rápido (3 a 4 meses) con una progresión más lenta. Este estudio controla la introducción de una proteína extraña en los ratones SOD1, y consigna también los conceptos del mecanismo de acción. El carácter de unión a neuronas que exhibe rHlgM12 es crítico, y una IgM que no se une a las neuronas no debe mejorar la enfermedad. El punto de extremo primario en este estudio es supervivencia incrementada (P<0.05 de 10% o mayor) y pérdida de peso disminuida (P<0.05 de 10% o mayor). La mejora en por lo menos una cepa de ratones SOD1 se considera como un éxito. Se sacrifica a todos los ratones al momento de que sean incapaces de enderezarse por sí mismos dentro de 15 a 30 segundos si se ponen sobre cualquier lado. Los puntos de extremo secundarios miden el número de axones en degeneración, según es indicado por los verticilos de mielina anormales, y la densidad de células del asta anterior positivas para NeuN al nivel torácico (T6) de la médula espinal. Se consideran como eventos adversos, si los ratones tratados con rHIgMI 2, 1) pierden 20% más de peso corporal en comparación con los controles, 2) desarrollan convulsiones, y 3) tienen una tasa de mortalidad de 20% más que los controles.

Estudio de titulación de la dosis: Siguiendo los resultados positivos en el estudio anterior, se lleva a cabo un estudio de titulación de la dosis (una sola dosis de 0, 5, 50, 100 y 250 mg por ratón dada a los 55 días de edad) para determinar la dosis mínima requerida para proteger a los ratones SOD1 de la muerte. Se usa espectroscopia de MR del tallo cerebral del ratón para medir el N-acetil-aspartato (NAA). Los presentes inventores han mostrado en otros modelos de enfermedad neurológica que el NAA en el tallo cerebral es un excelente indicador sustituto de la salud del axón por toda la médula espinal [17]. Los datos de espectroscopia de MR ayudan a validar al NAA como un marcador sustituto de eficacia del anticuerpo en pruebas humanas potenciales que usan a rHlgM12. Una sola dosis de 0, 5, 50, 100 y 250 mg se da intraperitonealmente a los 55 días de edad a grupos de 20 a 24 ratones SOD1. Los puntos de extremo primarios y secundarios y eventos adversos son los mismos como se describió anteriormente con la adición de espectroscopia de MR en el tallo cerebral para medir el N-acetil-aspartato (NAA). Se colecta la espectroscopia de MR para cada ratón en el día de tratamiento con el anticuerpo, a los 100 días de edad e inmediatamente antes del sacrificio. Un incremento de 10% (P<0.05) en la concentración de NAA en el tallo cerebral en cualquier grupo tratado con rHlgM12 en el día 100, o exploración final en comparación con ratones tratados con solución salina, se considera como una mejora.

Estudios farmacocinéticos y BBB: Se llevan a cabo estudios en ratones SOD1 G86R y G93A a los 50 a 70 días de edad (18) después de una sola dosis intravenosa de 200 mg, usando un sistema de detección de ELISA establecido que detecta específicamente la IgM humana dentro del fondo de inmunoglobulina sanguínea normal de ratón. Se mide la IgM humana en la sangre en varios puntos de tiempo después de la dosificación (0, 15 min, 30 min, 1 hr, 4 hr, 8 hr, 12 hr, 18 hr, 24 hr, 2 días, 3 días, 5 días y 7 días). Debido a que el volumen de sangre de los ratones es pequeño (total <1.5 mi), se usan tres ratones individuales para cada punto de colecta.

Se propone que rHlgM12 actúa directamente sobre el sistema nervioso, cruzando la barrera hemoencefálica después de la inyección periférica para interactuar con las neuronas y protegerlas de la muerte. Es posible, pero improbable, que el anticuerpo humano no cruce la barrera hemoencefálica, pero estimula aspectos de una respuesta inmune, lo cual provee entonces la protección del axón. El rastreo in vivo de rHlgM12 marcado con 35S se usa para consignar enteramente esta cuestión. Dos niveles de dosis de rHlgM12 marcado con 35S, 250 mg y la dosis mínima efectiva establecida anteriormente, se siguen en ratones SOD1 a los 50 a 70 días de edad. Después de una dosis intravenosa de rHlgM12 marcado con 35S, se determina el porcentaje de 35S que cruza la barrera hemoencefálica y se encuentra en el parénquima de la médula espinal/cerebro a 4, 8, 24, 48 y 72 hr post-inyección. Además, el sitio de localización de 35S en la médula espinal/cerebro se determina usando téenicas de autorradiografía ya publicadas [19].

Estudios de la vida media en suero: Se lleva a cabo cinética en sangre para rHlgM12 usando una dosis de 200 pg en las cepas SOD1, en las cuales rHlgM12 demostró eficacia. El estudio se lleva a cabo en grupos de 3 ratones SOD1 por punto de tiempo; 13 puntos de colecta durante 7 días después de la inyección intravenosa. Se trata a los ratones SOD1 a los 50 a 70 días de edad para entender la cinética de los anticuerpos al momento del tratamiento. Se determinarán la vida media en suero de rHIgMI 2, la saturación de la exposición y la presencia de IgM de los anticuerpos neutralizantes. Los estudios que rastrean a rHIgMI 2 marcado isotópicamente con 35S, requieren la determinación de la dosis efectiva mínima descrita anteriormente. Se da a ratones SOD1 una sola dosis intravenosa de 250 mg y la dosis efectiva mínima de rHlgM12 (que contiene por lo menos 1x107 cpm) [19] a los 50-70 días de edad, para consignar si rHlgM12 entra al SNC al momento del tratamiento terapeutico. A 4, 8, 24, 48 y 72 hr post-inyección, se remueven agudamente los tejidos principales, incluyendo cerebro, médula espinal, hígado, corazón, pulmón, estómago, intestino, músculo, bazo, hígado y páncreas. Una porción de 150 mg de tejido se remueve, se pesa, se solubiliza en Solvable (Perkin Elmer), y se determinan los cpm en el fluido de escintilación (Ultima Gold, Perkin Elmer). El rHlgM12 marcado isotópicamente se localiza en secciones de la médula espinal usando autorradiog rafia [19]. En este experimento, el punto de extremo primario es una acumulación del isótopo 35S en el cerebro o la médula espinal de los ratones a 4, 8, 24, 48 y 72 hr después de la inyección de rHlgM12, en comparación con los controles del punto de tiempo cero. Un incremento de 50% (P<0.05) en los conteos de 35S/mg en la médula espinal o el cerebro entero en cualquier punto de tiempo se considera como significativo, y evidencia de que rHlgM12 puede entrar al SNC. Para estudios de autorradiog rafia, se dosifica a los ratones con rHlgM12 marcado, y se remueven las médulas espinales en un tiempo en el cual rHlgM12 se incrementó en el SNC. Un incremento de 50% en los granos de plata/mm2 sobre las neuronas en las secciones de médula espinal, se considera como evidencia significativa de focalización del anticuerpo in vivo.

Estudios de toxicidad iniciales: Se llevan a cabo experimentos con rHlgM12 para determinar si el anticuerpo es tóxico en conejos y ratones CD-1 normales. A grupos de 10 ratones CD-1 normales de ambos géneros se les administra 1 vez (1X), 10 veces (10X) y 20 veces (20X) la dosis eficaz mínima de rHlgM12 determinada anteriormente o solución salina vía intravenosa una vez o diariamente por 7 días. Dos semanas después, se colectan sangre y tejidos mediante una necropsia “total”, y se analizan. Secciones de tejido de todos los órganos principales son examinadas “de manera oculta” por un patólogo veterinario que tiene experiencia en evaluaciones de toxicología. Se caracteriza la sangre en química y hematología para el panel usual de exámenes de toxicología que incluyen estudios de sangre para enzimas del hígado, enzimas del corazón, electrólitos y efectos sobre el grupo de hematología. Se llevan a cabo estudios de exposición idénticos en una especie no de roedor; dos conejos de cada sexo se ponen a prueba a cada dosis. Además, se usan estudios de reactividad cruzada en tejidos usando rHlgM12, para determinar si el anticuerpo se une a cualquier otro tejido u órgano. Un panel de secciones de tejido embebidas en parafina de ratón, conejo, primate y humano (Zymed), es inmunomarcado con rHlgM12 o una IgM humana control. La intensidad y las estructuras unidas dentro de cada tejido se representan y se comparan con rHlgM12, y se marca la IgM control de cortes de tejido vivo cortados con una picadora de tejidos [7], puesto que esto imita más estrechamente la situación in vivo. Además, la unión de rHlgM12 y un anticuerpo control se pone a prueba en tejido congelado de primate y humano, como es consistente con la sección de toxicología preliminar de una solicitud de investigación de nuevos fármacos para la FDA. Estudios de reactividad cruzada en tejidos proveen pistas en cuanto a que órganos deben monitorearse en particular durante los estudios de exposición en ratones y conejos.

Unión al tejido: Después de la determinación de la eficacia, estos estudios consignan la unión a tejidos objetivo y no objetivo. Disposiciones de tejidos disponibles comercialmente (Zymed) y secciones de humano y de monos Cynomolgus (Charles River) son inmunomarcados con 10 mg/ml de rHlgM12 y la IgM humana control, sHlgM39. La intensidad de la marcación se compara usando imágenes digitales. La unión de rHlgM12 a disposiciones de tejidos fijados incluidos en parafina y cerebro y médula espinal congelados de humano y de primate se comparan con la unión del anticuerpo observada en cortes cerebelares vivos de ratón. Se ha utilizado un anticuerpo que se une a cortes cerebelares vivos como una prueba de potencia estándar y la primera selección en la cual se identificó la forma de rHlgM12 en suero.

Referencias citadas 1.- Gurncy, M. E., et al., Mutant CuZn superoxide dismutase in motor neuron disease. J Inherit Metab Dis, 1998.21(5): p. 587-97. 2.- Morrison, B. M. y J. H. Morrison, Amyotrophic lateral sclerosis associated with mutations in superoxide dismutase: a putative mechanism of degeneration. Brain Res Rev, 1999.29(1): p. 121-35. 3.- Siddique, T., D. Nijhawan y A. Hentati, Familial amyotrophic lateral selenosis. J Neural Transm Supl., 1997.49: p. 219-33. 4.- Cluskey, S. y D. B. Ramsden, Mechanisms of neurodegeneration in amyotrophic lateral selerosis. Mol Pathol, 2001. 54(6): p. 386-92. 5 - Turner, B. J. y K. Talbot, Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol, 2008. 85(1): p. 94-134. 6.- Bieber, A. J., et al., Humoral autoimmunity as a mediator of SNC repair. Trends Neurosci, 2001.24 (Supl. 11): p. S39-44. 7.- Warrington, A. E., etal., Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of múltiple selerosis. Proc Nati Acad Sci USA, 2000. 97(12): p.6820-5. 8.- Warrington, A. E., et al., Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. J Neuropathol Exp Neurol, 2004. 63(5): p.461-73. 9.- Cirio, B., et al., Clonal evolution in Waldenstrom macroglobulinemia highlights functional role of B-cell receptor. Blood, 2001. 97(1): p. 321-3. 10.- Mitsunaga, Y., et al., Direct evidence that a human antibody derived from patient serum can promote myelin repair in a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. Faseb J, 2002. 16(10): p. 1325-7. 11.- Rodríguez, M., A. E. Warrington y L. R. Pease, Artículo invitado: human natural autoantibodies in the treatment ofneurologic disease. Neurology, 2009. 72(14): p. 1269-76. 12.- Wright, B. R., et al., Cellular mechanisms of central nervous system repairby natural autoreactive monoclonal antibodies. Arch Neurol, 2009. 66(12): p. 1456-9. 13.- Bruijn, L. I., et al., ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly Progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron, 1997. 18(2): p.327-38. 14.- Gurncy, M. E., et ai, Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science, 1994. 264(5166): p. 1772-5. 15.- Banks, W. A., Developing drugs that can cross the blood-brain barrier: applications to Alzheimer's disease. BMC Neurosci, 2008. 9 Supl. 3: p. S2. 16.- Kozlowski, G. P., I. Sterzl y G. Nilaver, Localization pattems for immunoglobulins and albumins in the brain suggest diverse mechanisms for their transport across the blood-brain barrier (BBB). Prog Brain Res, 1992. 91: p. 149-54. 17.- Denic, A., et ai, Brainstem 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: marker of demyelination and repair in spinal cord. Ann Neurol, 2009. 66(4): p. 559-64. 18.- Ludolph, A. C., et al., Guidelines for the preclinical in vivo evaluation of pharmacological active drugs for ALS/MND : report on the 142nd ENMC intemational workshop. Amyotroph Lateral Scler, 2007.8(4): p.217-23. 19.- Hunter, S. F., D. J. Miller y M. Rodríguez, Monoclonal myelination-promoting natural autoantibody SCH 94.03: pharmacokinetics and in vivo targets within demyelinated spinal cord in a mouse model of múltiple sclerosis. J Neurol Sci, 1997.150(2): p. 103-13.

EJEMPLO 21 Tratamiento de isquemia cerebral v apoplejía con anticuerpos monoclonales humanos neuroprotectores La incidencia de apoplejía isquémica se incrementa con la edad. El envejecimiento de la población humana da como resultado un número creciente de apoplejías por año, poniendo una carga acumulativa sobre las familias y la infraestructura de cuidados a la salud. La apoplejía es la causa principal de discapacitación a largo plazo en los Estados Unidos. Cada año, cerca de 800,000 personas sufren de una apoplejía. Después de la lesión isquémica, la discapacitación asociada con los déficits clínicos se debe principalmente a la disfunción de las neuronas. La falta de recuperación funcional se atribuye en parte a la restricción de la regeneración y neuroplasticidad (1). No existen actualmente tratamientos efectivos para prevenir o invertir los déficits neurológicos relacionados con la apoplejía.

Anticuerpos de la clase de IgM monoclonales humanos de ocurrencia natural se han identificado y utilizado para promover la protección y reparación del SNC, e incluyen la reparación de la mielina y la recuperación axonal/neuronal (2). Los presentes inventores identificaron una IgM monoclonal humana derivada del suero que se une a la superficie de las neuronas. La IgM se une a las neuronas a través de las especies, incluyendo la especie humana, y promueve la extensión de las neuritas. Esta IgM protege a las neuronas de la apoptosis in vitro y preserva los axones de la médula espinal in vivo, según se mide mediante espectroscopia de resonancia magnética e histología de la médula espinal. Se ha sintetizado una forma recombinante, rHlgM12, que presen/a las características de la forma derivada del suero. Las propiedades neuroprotectoras de rHlgM12 son similares a las observadas con el gangliósido GM1. Los gangliósidos pueden estar en el antígeno del anticuerpo lgM12 y rHlgM12. rHlgM12 se co-localiza en la membrana neuronal con GM1, el colesterol y la integrina b1. GM1 es enriquecido en los microdominios de la membrana, los cuales funcionan para agrupar receptores de células y moléculas de señalización. rHlgM12 parece imitar los efectos plcyotrópicos de GM1 agrupando los dominios de membrana de las neuronas.

Los presentes estudios se llevaron a cabo para evaluar la eficacia de rHlgM12 para invertir los déficits neurológicos después de lesión isquémica cerebral. Estos estudios están dirigidos a aplicaciones del anticuerpo en pacientes con las etapas tempranas de lesión isquémica cerebral o que sufren de apoplejía. La hipótesis central es que el anticuerpo IGM12 y los efectos neuroprotectores mediados por rHlgM12 son aplicables en terapia para mejorar la restauración de células y tejidos y promover la recuperación general ante la apoplejía isquémica.

El manejo terapeutico de la isquemia cerebral depende de la prevención y reducción de factores de riesgo tales como la presión sanguínea elevada, la trombosis y la aterosclerosis de la arteria carótida. La terapia intervencional de la isquemia cerebral continúa estando limitada a la trombólisis enzimática por el uso del activador de plasminógeno tisular recombinante rtPA (3-5), y a la remoción intervencional del coágulo sanguíneo por medio de cateterización directa (6). Sin embargo, rtPA tiene una ventana terapéutica corta de 3 horas e incidencia incrementada de isquemia cerebral hemorrágica si se infunde más allá del marco de tiempo de 3 horas (7, 8). La protección de las neuronas dañadas después de la isquemia cerebral es una estrategia prometedora que limita la discapacitación permanente. Mientras que las terapias que modulan la respuesta inflamatoria pueden tener propiedades neuroprotectoras, existen actualmente muy pocos fármacos que actúan directamente sobre las neuronas para protegerlas. La neuroprotección puede lograrse modulando el ambiente inflamatorio neurotóxico en la región isquémica. Estudios previos que usan anticuerpos para tratar la isquemia cerebral no han dado un beneficio potencial: se usaron antagonistas para las moléculas de adhesión intercelular en una gran prueba de centros múltiples, y los sujetos tratados tuvieron mayores tasas de mortalidad y resultados más deficientes en comparación con el grupo tratado con placebo (9). El uso de anticuerpos antíplaquetarios en una prueba clínica de fase III en isquemia cerebral, llevó a hemorragia fatal en un pequeño grupo de pacientes (10). El uso de IgG humana policlonal (IVIg) dio como resultado mejora de un modelo animal de isquemia cerebral (11); sin embargo, las pruebas clínicas reportaron complicaciones tromboembólicas despues de la administración de IVIg, llevando a una opinión mixta del uso de IVIg para tratar la isquemia cerebral (12, 13). Un propósito ha sido identificar reactivos terapéuticos que eligen como objetivo directamente el sistema nervioso. La forma recombinante de un anticuerpo completamente humano rHlgM12 promueve la supervivencia neuronal y puede tener uso aplicable como un fármaco terapéutico restaurador/neuroprotector. Los experimentos en este ejemplo se enfocan en los efectos terapéuticos del anticuerpo lgM12, rHlg 12, en un modelo de isquemia cerebral de ratón. El modelo utilizado es un modelo foto-trombótico no invasivo que usa colorante fotosensible y por ende es más fisiológico que los modelos invasivos.

El propósito de los presentes inventores de proteger a las neuronas y mejorar el comportamiento en animales después de isquemia cerebral usando un anticuerpo monoclonal completamente humano es original y no invasivo, y el anticuerpo tiene el potencial como el primer fármaco diseñado para elegir como objetivo y proteger a las neuronas en isquemia cerebral y apoplejía. Aspectos relevantes de la molécula se enlistan a continuación: 1) rHlgM12 se une a la superficie de las neuronas (véase las figuras 1A a 1H), y protege a las neuronas de la muerte celular apoptótica (véase la figura 3). 2) rHlgM12 es un autoanticuerpo humano natural, y los efectos adversos son improbables. 3) rHIgMI 2, a pesar de que es una IgM, cruza la barrera hemoencefálica (BBB) en ratones SJL normales y en animales con inflamación (vease la figura 13). 4) Los presentes estudios demuestran ahora que cuando rHIgMI 2 se administra a animales después de la inducción de apoplejía isquémica, da como resultado una clara mejora de la función de los animales (figuras 44A a 44C), y protege la integridad del tejido (figuras 45A a 45C).

Resultados v discusión Un procedimiento único se utilizó para desarrollar terapias novedosas para el tratamiento de la lesión del sistema nervioso central (SNC) (14, 15). Se ha identificado una serie de anticuerpos monoclonales humanos que se unen a oligodendrocitos (16) o neuronas (17), y los cuales tienen aplicación en el SNC. El anticuerpo humano recombinante lgM12 (rHlgM12) se deriva de un anticuerpo aislado de un paciente con macroglobulinemia de Waldenstrom. Este anticuerpo marca específicamente las neuronas y los axones del SNC (17). A pesar de que es un anticuerpo de IgM, cruza la barrera hemoencefálica (BBB) (véase la figura 13), y se une específicamente a los axones y neuronas dentro del SNC. rHIgMI 2 in vitro se une a una amplia gama de neuronas, que incluyen neuronas granulares cerebelares, neuronas corticales, neuronas hipocámpicas y células ganglionares retínales. La hipótesis actual de los presentes inventores acerca del mecanismo de acción de los autoanticuerpos de IgM reparativos, es que entrelazan las moléculas en los microdominios para estimular eventos de señalización que están implicados en protección y reparación.

Estandarización de un modelo de ratón para isquemia cerebral Se utilizó un colorante fotosensible (Rosa de Bengala, RB) en un modelo fototrombótico mediado por colorante de apoplejía isquémica (isquemia cerebral fototrombótica) en el laboratorio de los presentes inventores. En 1985, Watson et al. introdujeron PT del cerebro como un modelo simple de isquemia cerebral focal (Watson BD, et al. (1985) Ann Neurol 17: 497-504). Para lograr la trombosis, se inyecta sistémicamente un colorante fotosensible. La iluminación subsiguiente a través del cráneo intacto lleva a la activación local del colorante con la formación de radicales libres y la fotoperoxidación del endotelio. La formación de coágulos es mediada de esta manera en vasos iluminados, y la oclusión de los vasos imita la isquemia cerebral (Dietrich WD, et al. (1987) Acta Neuropathol 72: 315-325). Las lesiones PT inducen una fuerte reacción inflamatoria pero retardada (Schroeter M, et al. (1997) Stroke 28: 382-386). Este modelo tiene la ventaja de que la región de la isquemia puede ser predefinida y altamente circunscrita, abriendo la posibilidad de coagular áreas corticales distintas con precisión estereotáctica.

Se inyectó RB disuelta en PBS a 10 mg/ml_ a través de la vena de la cola (0.02 mg/g de peso corporal). La abertura (5 mm) de la fibra óptica articulable unida a una fuente de luz (lámpara de halógeno de 150 W) se puso en un sitio estándar sobre la cabeza del ratón. Un minuto después de la inyección de RB, los cerebros fueron expuestos a luz constante (para activar RB) a través del cráneo intacto por 30 segundos. Después de la activación, RB genera radicales libres que perturban las células endoteliales dentro de la microvasculatura, lo cual da como resultado agregación plaquetaria y desencadena la coagulación que lleva a la oclusión de los vasos sanguíneos pequeños y causa isquemia cerebral trombótica. Los presentes inventores llevaron a cabo todos los experimentos en ratones CD-1® hembras de 6 semanas.

En una prueba aleatorizada “de manera oculta”, ratones recibieron rHlgM12 purificado con GMP treinta minutos después de la inducción de la isquemia cerebral (un intento por imitar la condición clínica en humanos) como una sola dosis intraperitoneal (i.p. 200 mg en 500 mI). En contraste, el grupo tratado con placebo recibió solución salina regulada en su PH con fosfato (PBS). Se estandarizaron las téenicas para visualizar y cuantificar la región isquémica después de la isquemia cerebral (figuras 43A a 43C y 45A a 45C). rHlqM12 mejora la actividad funcional en animales despues de la isquemia cerebral, sin diferencias significativas en el volumen del infarto definido por la formación de imágenes ponderada por difusión (DWD Se calcularon los déficits funcionales usando un aparato de campo abierto Accuscan. El aparato consiste de jaulas de acrílico individuales con fotoceldas que miden los movimientos horizontales y verticales discretos. Se pusieron grupos de 5 ratones CD-1 en cada jaula, y se registraron los valores en la línea base por 1 semana antes de la inducción de la isquemia cerebral. Se colectaron los datos como el número de interrupciones del haz por bloques de 1 hora, y se expresaron como el % de cambio horizontal (figura 44A) o vertical (figura 44B) a partir de la línea base. En el día uno, después de la inducción de la isquemia cerebral, hubo déficits similares en la actividad locomotora de ambos grupos de ratones. Las comparaciones en pares directas de dos tratamientos, mostraron que la mejora en la función motora horizontal en los ratones tratados con rHlgM12 divergió significativamente (p<0.05) en el día 3 post-tratamiento en comparación con PBS (figura 44A). Asimismo, la función motora vertical en los ratones tratados con rHlgM12 divergió significativamente en el día 3 post-tratamiento en comparación con PBS (figura 44B). La mejora persistió por hasta 30 días, cuando el experimento concluyó.

Se utilizó DWI-MRI para definir el volumen isquémico y para correlacionar la mejora funcional con la reducción en el tamaño del infarto. Se exploró a los ratones en los días 1, 3, 7 y 21 en un sistema de MRI para animales pequeños Avance 300 MHz de Bruker (7 Tesla), y las imágenes obtenidas en tres dimensiones (figura 43A) se cuantificaron usando el software Image J de NIH. La DWI no mostró significancia estadística dentro de los dos grupos de ratones en cualquiera de los días explorados (figura 44C), una indicación de que los volúmenes isquemicos cerebrales en ambos grupos de ratones fueron similares. Como conocimiento, esto provee la primera demostración de que un anticuerpo de IgM monoclonal humano natural completamente recombinante dirigido contra las neuronas, es eficaz para mejorar el resultado conductual en animales después de isquemia cerebral experimental.

El tratamiento con rHlqM12 mejora la métrica de MT-MRI v demuestra diferencias significativas en las relaciones de MT La formación de imágenes ponderada por difusión (DWI) estima la presencia y el grado de edema citotóxico en la difusión en agua después de apoplejía isquémica. Para evaluar las medidas de la MRI más sensibles a la integridad y recuperación del tejido después de la lesión, se usó MRI de transferencia de magnetización (MT-MRI) en un experimento subsiguiente, en 10 ratones en el día 3 después de la inducción de apoplejía y después del tratamiento con rHlgM12 o pseudo-tratamiento con PBS. Las imágenes obtenidas se incorporaron en FSL (23, 24), y se calculó un mapa de MTR paramétrico tridimensional en FSL MATHS. Se usó la fórmula estándar de 100*((Mo-Mt)/Mo), en donde Mo es la imagen tridimensional sin el pulso de MT, y Mt es la imagen tridimensional con el pulso de MT. Las imágenes se aumentaron a escala apropiadamente para proveer un resultado de mapeo en percentiles de la escala de grises con valores que varían de 0 a 100 (figura 45A). Los valores de MT de las lesiones se analizaron usando las herramientas de ROI tridimensionales estándar en Analyze 11.0, que permitió el análisis del daño del tejido sensible a MT en las áreas de isquemia. Un ROI comparativo en el hemisferio contralateral se usó para proveer valores control para comparación. Los valores de MTR en el lado de control fueron (59.9±0.9) y (58.3±0.8) en los grupos tratados con rHlgM12 y PBS, respectivamente: como era de esperarse, el análisis estadístico no reveló una diferencia significativa entre los dos grupos en los hemisferios control. De modo interesante, el tratamiento con rHlgM12 dio como resultado un incremento relativo en los valores de MTR en el sub-volumen de apoplejía en comparación con el pseudo-tratamiento con PBS (46.0±0.9 contra 41.9+08, p=0.01). Esto mostró normalización relativa de la arquitectura del tejido detectable con MT-MRI en el grupo tratado con el anticuerpo. Además, mientras que la significancia estadística no se alcanzó (p=0.39), se observó un volumen de apoplejía disminuido en los ratones tratados con rHlgM12 contra los controles tratados con PBS (18.1 ±5.9 mm3 contra 26.1+6.6 mm3). La diferencia altamente significativa en MT-MRI sostiene que los cambios inducidos por el anticuerpo dan como resultado restauración mejorada del tejido opuestamente a una reducción directa en los volúmenes de la apoplejía. rHlqMI 2 se une a las neuronas de humano v de ratón v protege a las neuronas corticales de ratón de la muerte inducida por el daño oxidativo Se formula la hipótesis de que rHlgM12 protege a las neuronas en la región isquémica porque se une a las neuronas. El anticuerpo humano, rHlgM12, se une a la superficie de muchos tipos de neuronas del SNC obtenidas de ratones y humanos (véase las figuras 1A a 1 H). Esto sostiene que la mejora funcional y la neuroprotección mediada por rHlgM12, serán preservadas de los ratones hasta los humanos. Se ha evaluado previamente si rHlgM12 protegería a las neuronas in vitro de la activación de la caspasa-3 inducida por peróxido, un marcador de apoptosis activa. Cultivos de neuronas corticales primarias de ratón se trataron simultáneamente con rHlgM12 o IgM humana control y peróxido de hidrógeno. El grado de activación de la caspasa-3 se determinó 24 horas después, usando un kit de prueba de caspasa-3 FLICA (Immunochemistry Technologies) (véase la figura 3). El tratamiento de las neuronas lesionadas con rHlgM12 redujo la activación de la caspasa-3 por 80%. Las neuronas lesionadas tratadas con IgM control mostraron menos de una reducción de 10% en la activación de la caspasa-3.

En una prueba neurotóxica diferente, neuronas corticales cultivadas se sometieron directamente a condiciones hipóxicas (atmósfera de 02 a 2.7%, N2 a 92.3% y CO2 a 5% por 4, 21 y 44 horas (44 horas, las células de la cámara sin hipoxia se consideraron como control de 0 horas). Los niveles de caspasa-3 se determinaron mediante Western blot (figura 46), y se encontró que los niveles de caspasa-3 son sobrerregulados alrededor de las 4 horas y alcanzaron un pico a las 21 horas. Alrededor de 44 horas, la mayoría de las celulas habían muerto y los niveles de caspasa-3 habían disminuido. Estas pruebas se usarán para demostrar que rHlgM12 es neuroprotector en condiciones tipo isquemia in vitro.

Un modelo de apoplejía isquémica cerebral de ratón se usó en los presentes estudios para demostrar la capacidad de rlgM12 para invertir los déficits neurológicos siguientes y brindar protección ante la lesión isquémica cerebral. Este modelo se aplica adicionalmente para optimizar la formulación de la dosis, para determinar el porcentaje de anticuerpo que cruza la barrera hemoencefálica, y para entender mejor la protección de las neuronas cultivadas por rHlgM12 in vitro a partir de condiciones tipo isquemia.

Dosis v biomarcadores para mejora neurolóqica Una prueba aleatorizada controlada con placebo en ratones usando rHlgM12 se usa para determinar la dosis mínima requerida para mejorar la actividad espontánea e identificar biomarcadores metabólicos para mejora neurológica. Los datos anteriores indican que 200 mg de rHlgM12 mejoraron la función neurológica en un modelo de apoplejía isquémica de ratón. La determinación de la dosis efectiva mínima es relevante para el diseño de los estudios de seguridad. Un estudio de titulación de la dosis de rHlgM12 se lleva a cabo en ratones después de la isquemia cerebral.

La isquemia cerebral en ratones CD-1 hembras usando el modelo fototrombótico con colorante RB se usa en estudios de dosificación.

Se trata i.p. a grupos de 5 ratones con 5, 50, 100 o 500 mg de rHlgM12, o con una IgM humana control comercial (Jackson ImmunoResearch, número de catálogo 009-000-012) que no se une a neuronas, o con solución salina, dentro de 30 minutos despues de la inducción de la isquemia cerebral. Se mide la función neurológica antes de la inducción de la isquemia cerebral o el tratamiento y semanalmente en cajas de actividad. Se aloja a grupos de 5 ratones en cajas de actividad, y se registra la actividad vertical y horizontal espontánea. La actividad horizontal nocturna es una medida sensible de la capacidad funcional de un animal (25). Además, todos los ratones sufren DWI-MRI (figura 2) para monitorear el tamaño del infarto en todos los grupos.

El punto de extremo primario es la mejora motora evaluada monitoreando la actividad espontánea. Un incremento de 20% en la actividad nocturna media (2000 interrupciones del haz/hora) registrada durante 72 horas en comparación con grupos control durante 5 días de un grupo tratado con rHlgM12 (P<0.05), se considera como una mejora significativa biológica (25). Se usa la metodología de laboratorio establecida de los presentes inventores (25) para calcular las diferencias estadísticas entre los grupos. Se lleva a cabo análisis por DWI-MRI de manera oculta usando herramientas de análisis de ROI tridimensionales en Analyze 11.0, un paquete de software de análisis de imágenes biomédicas desarrollado en la Mayo Clinic (26, 27).

Se determina si la mejora de la función neurológica después del tratamiento con rHlgM12 se correlaciona con el metabolito de NAA preservado (un metabolito asociado con la función neuronal (28)), y con la normalización relativa de la relación de transferencia de magnetización en MT-MRI en el cerebro. El MT es un marcador general de integridad del tejido, y se ha usado como un marcador sensible para la integridad en la penumbra en apoplejía isquémica humana (29). Estas pruebas se usan como un punto de extremo futuro de pruebas clínicas de rHlgM12 en isquemia cerebral en humanos.

Con base en los cálculos de potencia obtenidos para los datos de MT-MRI, se usan 12 ratones por grupo en este experimento. Las téenicas fueron previamente estandarizadas para medir los niveles de N-acetil-aspartato (NAA) en el SNC (30). Para investigar si el NAA puede usarse como un biomarcador de formación de imágenes del metabolito para la mejora funcional mediada por rHlgM12 después de la isquemia cerebral, se ha estandarizado un voxel para llevar a cabo MRS en la región isquémica. Se mide el metabolito NAA en los animales tratados con la dosis mínima efectiva, o IgM control de isotipos o solución salina. Se lleva a cabo MRS usando el espectrómetro de RMN vertical de diámetro 7T, y se obtienen datos de MRS de un voxel de 3x2x1.5 mm puesto dentro del área isquémica según se identifica en DWI y MRI ponderada con T2. El hemisferio contralateral sirve como un control apropiado para cada ratón. Como controles adicionales, se tratan ratones en otros grupos con IgM control o PBS. Se obtienen datos de MT-MRI adquiriendo una secuencia de RARE estándar ponderada con PD con tamaño de matriz 256x96x96, FOV de 6.4 x 1.92 x 1.92 cm, TR: 1500, TE: 30, factor de RARE de 16, con y sin un pulso de MT y un tiempo de MT total de 270 ms con ancho de banda de pulso de excitación de 500 Hz y margen de 1500 Hz, antes y despues de la apoplejía isquémica seguida de tratamiento con PBS o rHlgM12. Cada experimento se repite tres veces para confirmar la reproducibilidad del uso de biomarcadores de formación de imágenes como puntos de extremo de mejora funcional, para un total de 108 ratones (12 ratones por grupo para un total de tres grupos, repetidos tres veces) en este experimento.

Se cuantifican espectros de resonancia magnética usando el software TopSpin Biospin de Bruker y por medio de LCModel (31-34). Se calculan las diferencias estadísticas entre los grupos mediante ANOVA (30). Los datos de MTR se calculan usando el software FSL MATHS y Analyze 11.0. La normalización relativa de la MTR y la preservación o el incremento relativo de los niveles de NAA se determina en los grupos tratados con rHIgMI 2, en comparación con los grupos control. Un incremento de 10% en el NAA preservado en cualquier grupo tratado con rHIgMI 2 en comparación con los grupos control se considera como una mejora. Se ha reportado que neurotransmisores excitatorios tales como glutamato y glicina (35) están presentes a altos niveles después de isquemia cerebral. Puesto que la espectroscopia de resonancia magnética (MRS) es una téenica versátil, se cuantifican también otros metabolitos tales como lactato, mio-inositol, colina, creatina, glicina y glutamato.

Evaluación de la barrera hemoencefálica La proporción de rHlgM12 que cruza la barrera hemoencefálica (BBB) se determina en el modelo de apoplejía con RB fototrombótico. Ha habido un debate en cuanto a si las grandes moleculas de IgM pueden entrar al SNC. Un dogma generalmente aceptado es que las moléculas de inmunoglobulina con un peso molecular cercano a 1 millón son demasiado grandes para cruzar la barrera hemoencefálica desde la circulación para entrar al SNC (36, 37). Sin embargo, existe evidencia acumulativa de que algunas moléculas de inmunoglobulina pueden cruzar la barrera hemoencefálica. Se ha mostrado que rHlgM12 puede entrar al SNC de ratones no infectados normales así como ratones infectados con el TMEV (véase la figura 13). Se usa anticuerpo marcado con 35S en la determinación del porcentaje de anticuerpo que cruza la barrera hemoencefálica, y que demuestra además que la IgM actúa directamente sobre las neuronas en la región isquémica. Se evalúa la unión a las neuronas en el SNC después de la inyección i.v. en el modelo de isquemia cerebral.

Se produce rHlgM12 marcado isotópicamente (con 35S), y se valida para su unión a la superficie de las neuronas. rHlgM12 a una dosis efectiva o una IgM control de isotipos o una IgG no específica control se administran i.v. a grupos de 3 ratones por punto de tiempo después de la inducción de isquemia cerebral. Ratones CD-1 normales sin isquemia sirven como control. El experimento se lleva a cabo tres veces usando un total de 144 ratones (3 ratones por grupo para un total de 5 puntos de tiempo y 3 grupos más un grupo de 3 ratones no tratados, tres veces repetidas).

Se determina el porcentaje de 35S que cruza la barrera hemoencefálica y se encuentra en el parénquima de la médula espinal/cerebro a 4, 8, 24, 48 y 72 horas post-inyección. Además, se determina el sitio de localización del 35S en el cerebro/médula espinal usando téenicas de autorradiografía publicadas por el laboratorio de los presentes inventores (38). Se ha propuesto que rHlgM12 actúa directamente sobre el sistema nervioso, cruzando la barrera hemoencefálica después de la inyección periférica para interactuar con las neuronas y protegerlas de la muerte.

Cultivos de neuronas Se evalúa también la neuroprotección por rHlgM12 en una prueba de cultivo de neuronas “tipo isquemia” in vitro. La demostración de la eficacia de rHlgM12 para proteger a las neuronas en un ambiente in vitro, consignará las inquietudes de que un autoanticuerpo que se une a neuronas puede ser tóxico para las neuronas. Se consigna esto analizando los niveles de caspasa después del tratamiento de neuronas corticales normales privadas de glucosa y/u oxígeno con rHlgM12 o con anticuerpos control. Además, el desarrollo de una prueba in vitro proveerá las herramientas necesarias para los estudios de señalización futuros.

Podría ocurrir daño después de la isquemia cerebral mediante varios mecanismos diferentes. Los reactivos que son neuroprotectores para un tipo de daño no son necesariamente protectores para todos los tipos (39). Se establecen pruebas de neurotoxicidad usando ataques de privación de glucosa (GD), privación de oxígeno (OD) y OD y GD combinados (OGD), similares a aquellas observadas despues de la isquemia cerebral. Se han llevado a cabo pruebas análogas usando peróxido de hidrógeno (figura 3) y cámara hipóxica (figura 46) para evaluar los efectos protectores de rHlgM12 sobre las neuronas corticales de ratón. Se usa GM1 como un control positivo, puesto que las propiedades neuroprotectoras de rHlgM12 son reminiscentes de aquellas observadas para GM1.

Se establecen cultivos de células disociadas de fragmentos neocorticales a partir de embriones de ratón CD-1 de 16 días. Aproximadamente 95% de las células en dichos cultivos en neuronas, y las células restantes son astrocitos. Se induce GD incubando las neuronas en medio de Locke libre de glucosa por 24 horas. Una cámara libre de oxígeno con atmósfera de N2 a 95% y CO2 a 5% se usa para inducir OD (las neuronas se incuban en medio regular por 12 horas) y OGD (las neuronas se incuban en medio de Locke libre de glucosa por 12 horas). Se incuban las neuronas en presencia de medio de cultivo solo, o medio de cultivo complementado con rHlgM12 (a dosis efectiva), o IgM control o GM1. El experimento se lleva a cabo tres veces independientemente por triplicado usando tratamientos codificados, o diferentes días para evitar el prejuicio.

El punto de extremo primario es la viabilidad de las células neuronales, el cual se determina mediante una prueba de actividad mitocondrial usando solución de azul Alamar. Se analizan los cultivos neuronales para caspasas activadas usando el kit de detección de apoptosis FLICA. Se usan dos metodos de detección de fluorescencia diferentes: Microscopía de fluorescencia para análisis cualitativo; y fluorometría de placa de microtítulo de 96 cavidades para cuantificación. Se evalúa la supervivencia de las células incubando las células por 30 minutos con tinción de Hoechst, y se lee usando un filtro de UV con excitación a 365 nm y emisión a 480 nm. Cuando las células se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las células apoptóticas fluorecen de color rojo, mientras que las células no apoptóticas aparecen principalmente no teñidas. Las células en etapas más avanzadas de apoptosis aparecen de color rojo más brillante que las células en las etapas tempranas. Mediante el uso de un lector de placa de fluorescencia (con una placa de microtítulo negra), se cuantifica la apoptosis como la cantidad de fluorescencia roja emitida de las sondas de FLICA unidas a la caspasas. Se usa ANOVA para comparar las diferencias significativas entre los grupos. Los resultados de este experimento ayudarán a determinar los eventos de señalización corriente abajo que están implicados en la neuroprotección.

Referencias citadas 1. Walmslcy, A. R. y Mir, A. K. 2007. Targeting the Nogo-A signalling pathway to promote recovery following acute CNS injury. Current pharmaceutical design 13: 2470-2484. 2. Rodríguez, M., Warrington, A. E. y Pease, L. R. 2009. Artículo invitado: human natural autoantibodies in the treatment of neurologic disease. Neurology 72: 1269-1276. 3. Brott, T. G., Halcy, E. C., Jr., Levy, D. E., Barsan, W., Broderick, J., Sheppard, G. L, Spilker, J., Kongable, G. L., Massey, S., Reed, R., etal. 1992.

Urgent therapy for stroke. Parte I. Pilot study of tissue plasminogen activator administered within 90 minutes. Stroke; a joumal of cerebral circulation 23: 632-640. 4. Haley, E. C., Jr., Levy, D. E., Brott, T. G., Sheppard, G. L, Wong, M. C., Kongable, G. L., Torner, J. C. y Marler, J. R. 1992. Urgent therapy for stroke. Parte II. Pilot study of tissue plasminogen activator administered 91-180 minutes from onset. Stroke; a journal of cerebral circulation 23: 641-645. 5. Group, T.N.I.o.N.D.aS.r.-P.S.S. 1995. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The New England 10urnal of Medicine 333: 1581-1587. 6. Gobin, Y. P., Starkman, S., Duckwiler, G. R., Grobelny, T., Kidwell, C. S., Jahan, R., Pile-Spellman, J., Segal, A., Vinuela, F. y Saver, J. L 2004. MERCI 1 : a phase 1 study of Mechanical Embolus Removal in Cerebral Ischemia. Stroke; a journal of cerebral circulation 35: 2848-2854. 7. Clark, W. M., Wissman, S, Albers, G. W., Jhamandas, J. H., Madden, K. P. y Hamilton, S. 1999. Recombinant tissue-type plasminogen activator (Alteplase) for ischemic stroke 3 to 5 hours after symptom onset. The ATLANTIS Study: a randomized controlled trial. Alteplase Thrombolysis for Acute Noninterventional Therapy in Ischemic Stroke. JAMA: the joumal of the American Medical Association 282: 2019-2026. 8. Hacke, W., Kaste, M., Bluhmki, E., Brozman, M., Dávalos, A., Guidetti, D., Larrue, V., Lees, K. R., Medeghri, Z., Machnig, T., et al. 2008. Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke. The New England journal of medicine 359: 1317-1329. 9. Investigadores, E.A.S.T. 2001. Use of anti-ICAM-1 therapy in ischemic stroke: results of the Enlimomab Acute Stroke Trial. Neurology 57: 1428-1434. 10. Adams, H. P., Jr., Effron, M. B., Torner, J., Dávalos, A., Frayne, J., Teal, P., Leclerc, J., Oemar, B., Padgett, L, Barnathan, E.S., et al. 2008. Emergency administration of abciximab for treatment of patients with acute ischemic stroke: results of an international phase III trial: Abciximab in Emergency Treatment of Stroke Trial (AbESTT-ll). Stroke; a journal of cerebral circulation 39: 87-99. 11. Arumugam, T. V., Tang, S. C., Lathia, J. D., Cheng, A., Mughal, M. R., Chigurupati, S., Magnus, T., Chan, S. L., Jo, D. G., Ouyang, X., et al. 2007. Intravenous immunoglobulin (IVIG) protects the brain against experimental stroke by preventing complement-mediated neuronal cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 14104-14109. 12. Vucic, S., Chong, P. S., Dawson, K. T., Cudkowicz, M. y Cros, D. 2004. Thromboembolic complications of intravenous immunoglobulin treatment. Eumpean neurology 52: 141-144. 13. Rajabally, Y. A. y Kearncy, D. A. 2011. Thromboembolic complications of intravenous immunoglobulin therapy in patients with neuropathy: a two-year study. J Neurol Sci 308: 124-127. 14. Bieber, A. J., Warrington, A., Pease, L. R. y Rodríguez, M.2001.

Humoral autoimmunity as a mediator of SNC repair. Trends in neurosciences 24: S39-44. 15. Warrington, A. E., Bieber, A. J., Cirio, B., Van Keulen, V., Pease, L. R., Mitsunaga, Y., Paz Soldán, M. M. y Rodríguez, M. 2001. Immunoglobulin-mediated SNC repair. J Allergy Clin Immunol 108: S121-125. 16. Warrington, A. E., Asakura, K., Bieber, A. J., Cirio, B., Van Keulen, V., Kaveri, S. V, Kyle, R. A., Pease, L. R. y Rodríguez, M.2000. Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of múltiple sclerosis. Proc Nati Acad Sci USA 97: 6820-6825. 17. Warrington, A. E., Bieber, A. J., Van Keulen, V, Ciric, B., Pease, L. R. y Rodríguez, M. 2004. Neuron-binding human monoclonal antibodies support central nervous system neurite extensión. 10urnal of neuropathology and experimental neurology 63: 461-473. 18. Ciric, B., VanKeulen, V, Rodríguez, M., Kyle, R. A., Gertz, M. A. y Pease, L. R. 2001. Clonal evolution in Waldenstrom macroglobulinemia highlíghts functional role of B-cell receptor. Blood 97: 321-323. 19. Mitsunaga, Y., Ciric, B., Van Keulen, V, Warrington, A. E., Paz Soldán, M., Bieber, A. J., Rodríguez, M. y Pease, L. R. 2002. Direct evidence that a human antibody derived from patient serum can promote myelin repair in a mouse model of chronic-progressive demyelinating disease. The FASEB joumal: offícial publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 16: 1325-1327. 20. Wright, B. R., Warrington, A. E., Edberg, D. D. y Rodríguez, M. 2009. Cellular mechanisms of central nervous system repair by natural autoreactive monoclonal antibodies. Archives of neurology 66: 1456-1459. 21. Howe, C. L, Bieber, A. J., Warrington, A. E., Pease, L. R. y Rodríguez, M. 2004. Antiapoptotíc signalíng by a remyelinatíon-promoting human antimyelín antibody. Neurobiol Dis 15: 120-131. 22. Watzlawík, J., Holícky, E., Edberg, D. D., Marks, D. L, Warrington, A. E., Wright, B. R., Pagano, R. E. y Rodríguez, M. 2010. Human remyelination promoting antibody inhibits apoptotic signaling and differentiation through Lyn kinase in primary rat oligodendrocytes. Glia 58: 1782-1793. 23. Woolrich, M. W., Jbabdi, S., Patenaude, B., Chappell, M., Makni, S., Behrens, T, Beckmann, C, Jenkinson, M. y Smith, S.M. 2009. Bayesían analysis of neuroimaging data in FSL. Neuroimage 45: S173-186. 24. Smith, S. M., Jenkinson, M., Woolrich, M. W., Beckmann, C. F., Behrens, T. E., Johansen-Berg, H., Bannister, P. R., De Lúea, M., Drobnjak, I., Flitncy, D. E., et al. 2004. Advances in functional and structural MR image analysis and implementation as FSL. Neuroimage 23 Supl. 1: S208-219. 25. Denic, A., Macura, S. I., Warrington, A. E., Pirko, I., Grossardt, B. R., Pease, L.R. y Rodríguez, M. 2011. A single dose of neuron-bindíng human monoclonal antibody improves spontaneous activity in a murine model of demyelination. PloS one 6: e26001. 26. Robb, R. A. 1999. 3-D visualization in biomedical applications. Annual review of biomedical engineering 1 : 377-399. 27. Robb, R. A. 2001. The biomedical imaging resource at Mayo Clinic. IEEE transactions on medical imaging 20: 854-867. 28. De Stefano, N., Matthews, P. M., Fu, L, Narayanan, S., Stanlcy, J., Francis, G. S., Antel, J. P. y Arnold, D. L. 1998. Axonal damage correlates with disability in patients with relapsing-remitting múltiple sclerosis. Results of a longitudinal magnetic resonance spectroscopy study. Brain 121 (Parte 8): 1469-1477. 29. Tourdias, T., Dousset, V., Sibon, I., Pele, E., Menegon, P., Asselineau, J., Pachai, C, Rouanet, F., Robinson, P., Chene, G., et al. 2007. Magnetization transfer imaging shows tissue abnormalities in the reversible penumbra. Stroke; a journal of cerebral circulation 38: 3165-3171. 30. Denic, A., Bieber, A., Warrington, A., Mishra, P. K., Macura, S. y Rodríguez, M. 2009. Brainstem 1H nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: marker of demyelination and repair in spinal cord. Ann Neurol 66: 559-564. 31. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S. y Gruetter, R. 2003.

Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo: automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR in biomedicine 16: 400-412. 32. Opstad, K. S., Provencher, S. W., Bell, B. A., Griffiths, J. R. y Howe, F.A. 2003. Detection of elevated glutathione in meningiomas by quantitative in vivo 1 H MRS. Magnetic resonance in medicine: offícial joumal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine/Society of Magnetic Resonance in Medicine 49: 632-637. 33. Provencher, S. W. 2001. Automatic quantitation of localized in vivo 1H spectra with LCModel. NMRin biomedicine 14: 260-264. 34. Pfeuffer, J., Tkac, I., Provencher, S. W. y Gruetter, R. 1999. Toward an in vivo neurochemical profile: quantification of 18 metabolites in short-echo-time (1)H NMR spectra of the rat brain. 10umal of magnetic resonance 141 : 104-120. 35. Castillo, J., Dávalos, A. y Noya, M. 1997. Progression of ischaemic stroke and excitotoxic aminoacids. Lancet 349: 79-83. 36. Banks, W. A. 2008. Developing drugs that can cross the blood-brain barrier: applications to Alzheimer's disease. BMC Neurosci 9 Supl. 3: S2. 37. Kozlowski, G. P., Sterzl, I. y Nilaver, G. 1992. Localization patterns for immunoglobulins and albumins in the brain suggest diverse mechanisms for their transport across the blood-brain barrier (BBB). Prog Brain Res 91: 149-154. 38. Hunter, S. F., Miller, D.J. y Rodríguez, M. 1997. Monoclonal remyelination-promoting natural autoantibody SCH 94.03: pharmacokinetics and in vivo targets within demyelinated spinal cord in a mouse model of múltiple sclerosis. J Neurol Sci 150: 103-113. 39. Ryu, B. R., Choi, D. W., Hartlcy, D. M., Costa, E., Jou, I. y Gwag, B. J. 1999. Attenuation of cortical neuronal apoptosis by gangliosides. The 10urnal of pharmacology and experimental therapeutics 290: 811-816.

EJEMPLO 22 Actividad del anticuerpo y efectos bajo condiciones normales (normóxicas) e hipóxicas Para evaluar adicionalmente los efectos y la capacidad del anticuerpo neuroactivo, en particular el anticuerpo lgM12, en celulas y bajo condiciones relevantes y que imitan apoplejía, infarto al miocardio o isquemia, se llevaron a cabo estudios para evaluar los anticuerpos bajo condiciones normóxicas e hipóxicas. Las condiciones hipóxicas en cultivo sirven para imitar aspectos de la privación de oxígeno que resultan de apoplejía e isquemia en escenarios clínicos. Los cultivos normóxicos se evaluaron primero para varios marcadores en cultivos de células gliales mixtas. Se evaluaron entonces los marcadores relevantes bajo condiciones hipóxicas, con y sin anticuerpos neuroactivos y control para evaluar los efectos y las capacidades.

Condiciones normóxicas Para evaluar las condiciones normales o normóxicas, se desarrollaron cultivos de células gliales mixtas por 4 días en medio que contenía FBS (10%), y se trataron por 7 días en medio químicamente definido con IgM que promueve la remielinización rHlgM22, el anticuerpo regenerativo rHlgM12, los controles de isotipos sHlgM116 (10 mg/ml cada uno) o medio solo. El medio con anticuerpos nuevos se intercambió cada segundo día. Los resultados se describen en la figura 47. La gráfica de barras muestra el análisis cuantitativo de Western blots de tres experimentos independientes con el marcador de mielina MB, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada y CD68 como un marcador para la microglia activada. Estos resultados muestran que el anticuerpo regenerativo rHlgM12 estimula la diferenciación y la supervivencia de celulas progenitoras de oligodendrocitos (OPC) en cultivos de células gliales mixtas. Estos datos muestran que el anticuerpo regenerativo rHlgM12, pero no el anticuerpo que promueve la remielinización rHlgM22 o el control de isotipos sHlgM116, estimula la diferenciación de las OPC, reduce los niveles de apoptosis de las células gliales y activa la microglia. No se han determinado los tipos de células específicos rescatados de las células que sufren apoptosis.

Se cultivaron entonces co-cultivos de OPC-células de la microglia en medio condicionado con astrocitos con los anticuerpos monoclonales que promueven la remielinización A2B5, 04, 01, 78.09, 94.03, rHlgM22, el anticuerpo monoclonal regenerativo rHlgM12, los controles de isotipos (LEAF, 5A5, IgM ChromPure, rHlgM42, sHlgM14, sHlgM24, sHlgM26) (10 pg/ml de cada uno), o medio. El medio con anticuerpos nuevos se intercambió cada segundo día. Los Western blots representativos en la figura 48 muestran los niveles de los marcadores de OPC PDGFaR, los marcadores de mielina CNPasa y MOG, los marcadores de células de la microglia CD68 y Lyn, el marcador de proliferación Ki-67 e histona H3, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada y el marcador del ciclo celular pRbS795. Los astrocitos y la microglia son requeridos por los anticuerpos monoclonales regenerativos que se unen a GSL para estimular la diferenciación y la supervivencia de OPC en medio condicionado con astrocitos.

Los datos normóxicos anteriores demuestran que (i) los anticuerpos monoclonales que promueven la remielinización (A2B5, 04, 01, 78.09, 94.03) o el anticuerpo monoclonal regenerativo rHlgM12, no inducen la diferenciación o supervivencia de OPC en comparación con los controles de isotipos en co-cultivos de OPC/OL-microglia; (ii) los factores solubles en el medio condicionado con astrocitos no fueron suficientes para estimular las diferencias entre los grupos de tratamiento; (iii) los anticuerpos monoclonales regenerativos y que promueven la remielinización no activaron la microglia (CD68, Lyn) en ausencia de astrocitos; (iv) los factores astrocíticos solubles parecen ser suficientes para mediar la proliferación de OPC mediante rHlgM22 (Ki-67, histona H3) despues de 6 días de tratamiento con IgM.

En la siguiente serie de estudios normóxicos, cultivos de células gliales mixtas se cultivaron y se trataron como se describió anteriormente (figura 47 anterior). La figura 49 provee gráficas de barras del análisis cuantitativo de Western blots de tres experimentos independientes con el marcador CD68 para la microglia activada y la Lyn cinasa, una cinasa altamente abundante en la microglia y a un menor grado en OPCs, pero no en astrocitos. Se proveen imágenes de inmunofluorescencia representativas en la figura 50, y muestran los niveles de CD68 (verde) y el marcador nuclear DAPI (azul) en celulas gliales mixtas antes del tratamiento con el anticuerpo monoclonal en el día 4 en cultivo y en el día 11 en cultivo después de 7 días de tratamiento con rHlgM12, rHlgM22 y el control de isotipos sHlgM24 (10 mg/ml de cada uno). Estos datos demuestran que el anticuerpo monoclonal regenerativo rHlgM12 incrementa la expresión de CD68 y la Lyn cinasa en cultivos de células gliales mixtas. Mayores niveles de expresión de CD68 en Western blots (figura 49) pueden correlacionarse con mayores números de la microglia activada mediante inmunocitoquímica (figura 50). De esta manera, como se muestran en estos estudios, los anticuerpos que promueven la remielinización (ejemplos de anticuerpos A2B5 y 01) y el anticuerpo monoclonal regenerativo lgM12 activan la microglia (CD68) en los cultivos de células gliales mixtas.

Condiciones hipóxicas Los efectos moleculares de la hipoxia sobre los cultivos de células gliales mixtas se compararon entonces con los cultivos normóxicos. Se desarrollaron cultivos de células gliales mixtas por 4 días en medio que contenía FBS (10%), y se trataron por otros 7 días en medio químicamente definido bajo hipoxia (02 a 3%) en comparación con condiciones normóxicas (02 a 21%). Western blots representativos (figura 51) muestran los niveles del factor 1 inducible por hipoxia (HIF1a), los marcadores de oligodendrocitos NG2, PDGFa, Olig-2, los marcadores de mielina MBP y CNPasa, el marcador de astrocitos GFAP, el marcador de la microglia CD68, el marcador del ciclo celular pRbS795 y el marcador de apoptosis caspasa-3 separada. Se usó beta-actina como un control de carga. El análisis cuantitativo de los Western blots de los cultivos de celulas gliales mixtas expuestos a hipoxia y normoxia como se muestra en la figura 51 se completó a partir de tres experimentos independientes, y se muestra en la figura 52. Estos datos demuestran niveles de expresión reducida de los marcadores de microglia y astrocíticos y niveles incrementados de marcadores de mielina en los cultivos de células gliales mixtas bajo hipoxia, en comparación con las condiciones normóxicas. La verificación del modelo hipóxico se muestra mediante la expresión incrementada de HIF1a bajo hipoxia.

Habiendo verificado el modelo hipóxico, el tratamiento de los cultivos hipóxicos con el anticuerpo regenerativo lgM12 se llevó a cabo entonces para evaluar los efectos de los anticuerpos en condiciones relevantes para y que imitan apoplejía, infarto y efectos de isquemia. Se desarrollaron cultivos de células gliales mixtas por 4 días bajo condiciones normóxicas en medio que contenía FBS (10%), y se trataron posteriormente por 1 a 7 días en medio químicamente definido con el anticuerpo regenerativo humano rHlgM12 o medio sólo bajo hipoxia (02 a 3%). Western blots representativos (figura 53) muestran los niveles del marcador de proliferación Ki-67, los marcadores de microglia IBA-1, CD68 e ¡NOS, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores del ciclo celular pRbS795 y pRbS807 y los marcadores de oligodendrocitos PDGFaR, NG2, Olig-1 , Olig-2 y el marcador de mielina MBP. Los resultados de estos datos indican la eficacia del tratamiento con rHlgM12 bajo hipoxia. rHlgM12 activa la microglia, estimula la salida de las células gliales (pRbs) del ciclo celular, reduce los niveles de apoptosis de las células gliales, y reduce los niveles incrementados de producción de mielina bajo hipoxia. De esta manera, el anticuerpo regenerativo rHlgM12 estimula la supervivencia de las células gliales y reduce la diferenciación de OPC en los cultivos de células gliales mixtas hipóxicas.

El resultado molecular de rHlgM12 bajo hipoxia contra normoxia se evaluó mediante la comparación directa de los efectos mediados por rHlgM12 sobre las células gliales mixtas bajo hipoxia en comparación con la normoxia. Se cultivaron células gliales mixtas como se describió anteriormente, y se trataron en medio químicamente definido por 7 días con rHlgM12, rHlgM22 o medio sólo bajo condiciones hipóxicas o normóxicas. Western blots representativos (figura 54) muestran los niveles de los marcadores de la microglia IBA-1 y CD68, el marcador de apoptosis caspasa-3 separada, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores de oligodendrocitos PDGFaR, NG2 y Olig-2 y los marcadores de mielina MBP y CNPasa. rHlgM12 muestra eficacia bajo condiciones normóxicas e hipóxicas para estimular los marcadores de expresión de la microglia CD68 e IBA-1. Más significativamente, rHIgMI 2 equilibra el impacto de la hipoxia sobre la expresión de los marcadores de mielina MBP y CNPasa, en comparación con las condiciones normóxicas.

Se evaluaron las condiciones hipóxicas en animales para verificar la validez y consistencia de los marcadores de cultivo. Se llevó a cabo un análisis molecular de cortes hipóxicos y normóxicos de ratones B16 neonatales P13. Ratones neonatales C57/BL6 fueron criados en forma cruzada por madres CD1 y expuestos a hipoxia (02 a 10%) por 4 días, de P3 a P7. Los ratones fueron expuestos posteriormente a aire ambiente por otros 6 días, y sacrificados en P13. Se aisló ARN de los cortes en ambos grupos de tratamiento (ratones con normoxia e hipoxia), y se sondeó para los marcadores de mielina PLP1, MOG, MBP1, los marcadores de los progenitores de oligodendrocitos PDGFaR y Olig-1, el marcador astrocítico GFAP, los marcadores neuronales Nestin y 3-tubulina, el factor 1a inducible por hipoxia y la proteína sarcospan SSPN. Se analizaron los niveles de expresión mediante RT-PCR, y los resultados se normalizaron hasta los niveles de p3-actina. Se llevó a cabo el análisis por RT-PCR de los marcadores en los cortes de los ratones neonatos C57/BL6 hipóxicos y normóxicos en P13, y los resultados se muestran en la figura 55. Los resultados de estos datos indican que el tratamiento hipóxico de los ratones neonatales reduce selectivamente los niveles de expresión de los marcadores de mielina, pero no los marcadores neuronales, de OPC o astrocíticos en el tejido cortical.

EJEMPLO 23 Localización del anticuerpo de IqM rHlqM12 en un modelo de aplopeiía de ratón Para evaluar el acceso y la localización del anticuerpo para intervención despues de un evento isquémico o de apoplejía, se usó un modelo animal de apoplejía con administración IP de anticuerpo monoclonal. Se indujo apoplejía en ratones, se administró anticuerpo radiomarcado, y entonces los tejidos de los animales se evaluaron para anticuerpo determinando la radiomarcación en períodos de hasta 24 horas post administración. Se evaluó el cerebro (corteza) que contenía la lesión de apoplejía, así como el cerebelo, la médula espinal, el hígado, el bazo, el riñón y el suero sanguíneo.

Se indujo apoplejía en la corteza cerebral derecha en tres ratones CD-1 adultos usando el protocolo de Rosa de Bengala fotoactivada descrito anteriormente, y otros tres ratones recibieron un procedimiento de pseudoapoplejía, Rosa de Bengala pero no activación por la luz. A 30 a 40 minutos post-apoplejía, 10 millones de cpm de rHlgM12 marcado con 35S que corresponde a aproximadamente 60 mg de IgM, se administraron intraperitonealmente a cada ratón en un volumen de 500 ml de solución salina. A 6, 12 y 24 hr post-administración de IgM o tratamiento, se colectó sangre de los ratones, se lavó la vasculatura con 30 mi de solución salina, y los tejidos se colectaron agudamente. Para el análisis del radiomarcador en tejido, se removió la corteza frontal derecha del cerebro que contenía al área de la lesión como un bloque de tejido de 75 mg. Se disolvió al tejido en Solvable (PerkinElmer), y se determinaron los cpm en un coctel de escintilación de líquidos UltraGoId siguiendo los protocolos del fabricante. Una porción de otros tejidos se removió, se pesó y se procesó de acuerdo con las relaciones provistas por Perkin Elmer. Los resultados se muestran en la figura 56.

Aunque este estudio usó un sólo ratón en cada punto de tiempo, es notable que rHlgM12 se acumuló en el tejido del SNC durante 24 horas, mientras en contraste los niveles de rHlgM12 disminuyeron en los tejidos sensibles al metabolismo sanguíneo, y en el suero mismo. El alto nivel de rHlgM12 en la corteza (primer panel denotado como cerebro en la figura 56) del ratón con apoplejía a 6 horas, sugiere que la IgM tiene acceso mejorado al área de la apoplejía durante este tiempo. Existe significativamente más marcador en el animal con apoplejía en el cerebro/corteza en este punto de tiempo, contra el animal normal/animal bajo pseudoprocedimiento. También de interés, rHlgM12 entra al tejido del SNC del ratón con apoplejía y controla a los ratones igualmente, sugiriendo que una barrera hemoencefálica intacta no bloqueará completamente la capacidad de esta IgM terapéutica para llegar a las áreas de daño del SNC. El anticuerpo rlgM12 alcanzó el área de apoplejía durante las primeras 12 horas críticas después de la apoplejía, cuando se espera que el fármaco tenga su efecto máximo.

Esta invención puede describirse en otras formas o puede llevarse a cabo de otras maneras sin que se aparte del espíritu o las características esenciales de la misma. La presente descripción se considerará por lo tanto en todos los aspectos como ilustrativa y no restrictiva, siendo indicado el alcance de la invención por las reivindicaciones anexas, y se pretende que todos los cambios que están dentro del significado y la escala de equivalencia sean abarcados en la misma.

Varias referencias se citan a lo largo de esta especificación, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo de IgM humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente a las neuronas y protege a las neuronas de la muerte celular y el cual no promueve la remielinización, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende la siguiente secuencia: (a) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), o (b) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), para usarse en el tratamiento o la mejora de apoplejía o isquemia cerebral, mejorando la función neural en un animal despues de la apoplejía o isquemia cerebral, o protegiendo a las neuronas o células neurales del daño o la muerte celular después de la apoplejía o isquemia cerebral.

2.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 11 , o que comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 27, o variantes altamente homólogos del mismo, en donde dichas variantes retienen la unión a las neuronas y actividad neuroprotectora o neuro-regenerativa.

3.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es el anticuerpo recombinante rHlgM42, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 27.

4.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente una secuencia de la cadena J humana.

5.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la cadena J comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15.

6.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado además porque es el anticuerpo recombinante rHlgM12, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 11.

7.- El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 11, o variantes altamente homologas del mismo, en donde dichas variantes retienen unión a neuronas y actividad neuroprotectora o neuro-regenerativa.

8.- El anticuerpo aislado o fragmento del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usarse en apoplejía, lesión traumática del cerebro (TBI), isquemia cerebral u otras condiciones en las cuales existe flujo sanguíneo u oxígeno insuficientes hacia el cerebro o el cerebro o las celulas neurales.

9.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque se formula para usarse en el tratamiento o la mejora de apoplejía o isquemia cerebral, en combinación con uno o más agentes que son un trombolítico, un fármaco antiplaquetario, un fármaco antihipertensivo o una estatina.

10.- El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque es marcado con un marcador detectable o funcional.

11.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el marcador es una enzima, un miembro de unión específico, un ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radiactivo.

12.- Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

13.- Un método para preparar un anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende expresar el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 bajo condiciones para producir la expresión de dicho anticuerpo o fragmento del mismo, y recuperar el anticuerpo o fragmento del mismo.

14.- Una composición farmacéutica para el tratamiento o alivio de apoplejía o isquemia cerebral, que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

15.- Un kit para el tratamiento o mejora de apoplejía o isquemia cerebral en un animal, que comprende una forma de dosificación farmacéutica de la composición farmacéutica de la reivindicación 14, y una forma de dosificación farmacéutica separada que comprende uno o más de agente neuroactivo adicional, agente terapéutico, trombolítico o antihipertensivo, agente antiplaquetario, agente antiinflamatorio, agente modulador de la liberación de neurotransmisores, ligando o agonista o antagonista de neuro-receptores, agente de los canales de calcio, inmunomodulador u otro anticuerpo reactivo con el SNC.

16.- El uso de la composición farmaceutica de la reivindicación 14, en la preparación de un medicamento para tratar o mejorar apoplejía o isquemia cerebral en un animal.

17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable como una sola dosis a dicho animal que se sospecha o que se determina está sufriendo de apoplejía o isquemia cerebral.

18.- Un método para detectar la presencia o el grado de lesión, muerte o daño nervioso en un mamífero que sufre de o que se sospecha tiene una apoplejía o isquemia cerebral, que comprende: A. poner en contacto una muestra biológica de un mamífero en la cual se sospecha de apoplejía o isquemia cerebral, con el anticuerpo o fragmento del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 bajo condiciones que permitan que ocurra la unión de dicho anticuerpo o fragmento del mismo a neuronas en dicha muestra; y B. detectar si la unión ha ocurrido entre dicha neurona de dicha muestra y el anticuerpo, o determinar la cantidad de unión que ha ocurrido con dichas neuronas de dicha muestra y el anticuerpo; en donde la detección de la unión indica la presencia de lesión, muerte o daño nervioso en dicha muestra, y la cantidad de la unión indica la cantidad relativa de lesión, daño o muerte de la célula nerviosa.

19.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, para usarse en el tratamiento o mejora de apoplejía o isquemia cerebral en un animal.

20.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque la composición está adaptada para ser administrable como una sola dosis a dicho animal que se sospecha o que se determina está sufriendo de apoplejía o isquemia cerebral.

21.- El uso de un anticuerpo de IgM humano aislado o fragmento del mismo que se une específicamente a las neuronas y protege a las neuronas de la muerte celular y el cual no promueve la remielinización, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento del mismo comprende la siguiente secuencia: (a) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), o (b) las secuencias de aminoácidos de cadena pesada variable de los dominios de CDR CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y las secuencias de CDR de cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), en la preparación de un medicamento para tratar o mejorar apoplejía o isquemia cerebral, mejorando la función neural en un animal después de la apoplejía o isquemia cerebral, o para proteger a las neuronas o células neurales del daño o la muerte celular después de la apoplejía o isquemia cerebral.

22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 11, o comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 27, o variantes altamente homólogos del mismo, en donde dichas variantes retienen la unión a las neuronas y actividad neuroprotectora o neuro-regenerativa.

23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante rHlgM42, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 27.

24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el anticuerpo comprende adicionalmente una secuencia de la cadena J humana.

25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde la cadena J comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 15.

26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24 o 25, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante rHlgM12, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 11.

27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 11 , o variantes altamente homologas del mismo, en donde dichas variantes retienen unión a neuronas y actividad neuroprotectora o neuro-regenerativa.

28.- El uso del anticuerpo o fragmento del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en la preparación de un medicamento para tratar apoplejía, lesión traumática del cerebro (TBI), isquemia cerebral u otras condiciones en las cuales existe flujo sanguíneo u oxígeno insuficientes hacia el cerebro o el cerebro o las células neurales.

29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde el anticuerpo está adaptado para ser administrable en combinación con uno o más agentes que son un trombolítico, un fármaco antiplaquetario, un fármaco antihipertensivo o una estatina.

30.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en donde el anticuerpo es marcado con un marcador detectadle o funcional.

31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde el marcador es una enzima, un miembro de unión específico, un ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radiactivo.