ES2655077T3

ES2655077T3 - Anticuerpos humanos y secuencias de unión específicos del mismo para uso en accidente cerebrovascular e isquemia y condiciones isquémicas

Info

Publication number: ES2655077T3
Application number: ES13778780.0T
Authority: ES
Inventors: Moses Rodriguez; Arthur E. Warrington; Larry R. Pease
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2033-04-17
Also published as: EP3305323B1; EP2838562B1; BR112014025898A2; CN104379167A; JP2015520608A; MX356347B; IL235118A0; HK1207565A1; JP2017127329A; IL266658A; EP3305323A1; CN108285483B; HK1206997A1; CA2870625A1; WO2013158748A1; CA2870625C; JP6162219B2; ES2870717T3; MX2014012651A; JP2021000120A

Abstract

Un anticuerpo aislado humano IgM o fragmento del mismo que se une específicamente neuronas y protege a las neuronas de la muerte celular y que no promueve la remielinización, en el que el anticuerpo o fragmento comprende la siguiente secuencia: (a) las secuencias de dominio de CDR variable de aminoácido de la cadena pesada de CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y secuencias de CDR de la cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), tal como se establece en la Figura 5; o (b) las secuencias de dominio variable de CDR aminoácido de la cadena pesada de CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y secuencias de CDR de la cadena ligera CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42), tal como se establece en la Figura 6, para uso en el tratamiento o la mejora de la isquemia cerebral o derrame cerebral, mejora de la función neural en un animal después del accidente cerebrovascular o isquemia cerebral, o en la protección de las neuronas o células neuronales del daño o la muerte celular después del accidente cerebrovascular o isquemia cerebral.

Description

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invención, se pueden utilizar en métodos o se administran en composiciones para la mejora de la función motora en un animal que ha tenido un accidente cerebrovascular o que tiene la isquemia cerebral. En un aspecto particular, IgM12, rIgM12, anticuerpo 12 que comprende la cadena pesada CDR secuencias CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y secuencias de cadena ligera CDR de CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36), tal como se establece en la Figura 5, se pueden utilizar en el tratamiento, prevención o alivio de accidente cerebrovascular o isquemia cerebral. En un aspecto de la misma, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de acuerdo con la invención se pueden administrar en los casos en que se determina el accidente cerebrovascular y/o isquemia cerebral, sospechosos o en riesgo, incluso en casos en donde agentes trombolíticos enzimáticos, tales como activador del plasminógeno tisular (TPA) u otros agentes trombolíticos o antitrombóticos, se pueden administrar o utilizar.

[0036] Los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de acuerdo con con la invención, se pueden utilizar en métodos o se administran en composiciones para la mejora o la estabilización de la función neurológica o de la función motora en los casos, enfermedades o condiciones en que los nervios se ven comprometidos, lesionados o dañados o escenarios en que los nervios o neuronas son susceptibles o en riesgo de compromiso, lesiones o daños. En un aspecto particular, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se utilizan o se administran en etapas tempranas o iniciales de una enfermedad, trauma,

o condición, o se repiten en el curso o duración de una enfermedad, trauma, o condición, a fin de facilitar o mantener la mejora o estabilización de la función neurológica o la función motora, incluyendo o seleccionado de movimiento, como caminar, o la función cognitiva, como recuerdo o reconocimiento.

[0037] En un aspecto de la invención, los anticuerpos, fragmentos de los mismos y anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de región variable de acuerdo con la invención, se pueden utilizar en métodos o administrarse en composiciones para mitigar o mejorar efectos neurológicos, defectos, daños o muerte celular neuronal en caso de un accidente cerebrovascular o isquemia cerebral. De conformidad con los métodos, el anticuerpo mejora uno o más parámetros neurológicos o motores funcionales o evaluables, incluyendo un parámetro evaluable o escalable, tal como una escala de accidente cerebrovascular o escala de función. La administración de los anticuerpos es eficaz para mejorar o aliviar uno o más de un síntoma o parámetro asociado con el accidente cerebrovascular, incluyendo por ejemplo uno o más de la función superior y la extremidad inferior del motor, ataxia de extremidad, la función sensorial, el lenguaje, la articulación, la atención, la mirada y la función visual, brazo, mano y potencia de las piernas y el movimiento.

[0038] Se da a conocer la administración de más de un anticuerpo o fragmento, incluyendo combinaciones de anticuerpo IgM12 y 42. En un aspecto de la invención, se proporcionan métodos que comprenden la administración de uno o más anticuerpos o fragmentos, en que un anticuerpo comprende (a) la secuencias de dominio variable de CDR de aminoácido de la cadena pesada CDR1 GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31), CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32) y CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33), y secuencias de CDR de la cadena ligera CDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35) y CDR3 QQSYHTPW (SEQ ID NO: 36) o (b) el aminoácido de secuencias de dominio CDR de cadena pesada variable CDR1 GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO: 38) y CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39), y secuencias CDR de cadena ligera de CDR1 QGIG (SEQ ID NO: 40), CDR2 TTS (SEQ ID NO: 41) y CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO: 42). En un tal método adicional, uno o más anticuerpos IgM12 y/o un anticuerpo IgM42 puede combinarse con otro anticuerpo activo sobre el SNC, en particular incluyendo uno o más de los anticuerpos rHIgM22 y/o rHIgM46. anticuerpo rHIgM22 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 43 y 44, o las CDR de estas SEQ IDs. El anticuerpo rHIgM46 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 45 y 46, o las CDR de estas SEQ IDs. Por lo tanto, uno o más de anticuerpo IgM12 y/o de anticuerpo IgM42 se puede combinar con uno o más anticuerpos remielinizantes que comprenden (a) CDRs de la región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de CDR1 SSGMH secuencia CDR2 V(I) ISYDGSRKYYADSVKG y secuencia CDR3 GVTGSPTLDY, y la región variable de cadena luz CDR de la que comprende la secuencia de CDR1 SGSSSNIGNNFVS secuencia de CDR2 DITKRPS y secuencia CDR3 G(E)TWDSSLSAV V; o (b) región variable de cadena pesada CDR comprendiendo la secuencia de CDR1 SGFTFSSYW secuencia CDR2 IKKDGSEK y secuencia CDR3 ARPNCGGDCYLPWYFD, y región variable de cadena ligera CDR que comprende la secuencia CDR1 QSVLYSSNNKNY secuencia CDR2 YWAS y secuencia CDR3 QQYYNTPQA. Las combinaciones de anticuerpos se pueden administrar colectivamente o en serie, y en varios momentos y diferentes cantidades o concentraciones. Anticuerpos bi-o multi-específicos pueden ser utilizados. En tal aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46 y/o un anticuerpo que tiene las secuencias de región CDR de CDR1, CDR2 y CDR3 de IgM22 o IgM46, por administración combinada o en serie, separados por un corto período de tiempo o una longitud de tiempo más larga, incluso por horas, días o semanas. En un tal aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, por administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de una enfermedad o condición que implica la neurodegeneración, y en particular incluyendo desmielinización. En un aspecto adicional, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, por administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de una enfermedad desmielinizante o condición. En un aspecto particular, el anticuerpo 12 y/o 42 se administra en combinación con el anticuerpo 22 y/o 46, por administración combinada o en serie para el tratamiento de mejora de la esclerosis múltiple. En uno de tales aspectos, la remielinización y neuroprotección se consigue, por efectos combinados, incluidos los efectos

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sinérgicos, en un aspecto clínico medible de la enfermedad de MS.

[0039] En vista de las capacidades neuroprotectoras y/o neurorregenerativas de los agentes de la presente divulgación se refiere además a métodos de producción in vitro y estimulación de la proliferación de las neuronas, incluyendo la proliferación de las neuronas corticales, las neuronas del hipocampo, las células granulares de cerebelo y células ganglionares de la retina. Tales neuronas proliferadas pueden ser adecuadas para protocolos y métodos terapéuticos de trasplante y de nervio de células.

[0040] La utilidad de diagnóstico se extiende al uso de los anticuerpos de la presente invención en ensayos y métodos para caracterizar la lesión del nervio del SNC o daños o para detectar o evaluar la enfermedad o condiciones que implican lesiones del nervio, daños o muerte (incluyendo la muerte necrótica o apoptótica), incluyendo ensayos de diagnóstico in vitro e in vivo y de formación de imágenes. Por lo tanto, los anticuerpos pueden utilizarse en ensayos y procedimientos para evaluar accidente cerebrovascular o isquemia y/o para evaluar la lesión en isquemia o accidente cerebrovascular o isquemia o accidente cerebrovascular predicho o sospechado. En un inmunoensayo, una cantidad de control de los anticuerpos, o similares se puede preparar y marcar con una enzima, un par de unión específica, ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radioactivo, y puede entonces ser introducido en una muestra celular. Después de que el material marcado o su pareja de unión ha tenido la oportunidad de reaccionar con sitios dentro de la muestra, la masa resultante puede ser examinada mediante técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza de la etiqueta adjunta. En una aplicación in vivo de diagnóstico o de formación de imágenes, el anticuerpo o un fragmento de unión de la neurona de los mismos se puede preparar y marcar con una enzima, un par de unión específica, ligando, un colorante, un marcador fluorescente y/o un elemento radioactivo, y luego pueden introducirse en un animal. Después de que el material marcado o su pareja de unión ha tenido la oportunidad de reaccionar con sitios dentro del animal, el animal puede ser examinado por técnicas conocidas, que pueden variar con la naturaleza de la etiqueta adjunta. En un aspecto de la utilidad de diagnóstico de la invención, los anticuerpos o fragmentos activos de los mismos de la invención pueden utilizarse en ensayos y métodos para caracterizar la isquemia cerebral o derrame cerebral. En particular, en los casos en que se sospecha de isquemia cerebral o derrame cerebral o existe tal riesgo, los anticuerpos pueden ser utilizados para determinar o evaluar la isquemia cerebral y/o accidente cerebrovascular.

[0041] Los miembros de unión específicos radiomarcados, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles in vitro en las técnicas de diagnóstico e in vivo en técnicas de obtención de radioimágenes. En un aspecto adicional miembros radiomarcados de unión específica, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, en particular los radioinmunoconjugados, son útiles en radioinmunoterapia, particularmente como anticuerpos radiomarcados para la reparación de la lesión del nervio, neuroregeneración, la recuperación neurodegenerativa, cáncer o terapia de tumor del SNC, o alternativamente para la ablación de tejido del nervio dañado o neuronas en ciertos casos. En un aspecto in vivo, el fragmento de anticuerpo o neurona de unión del mismo se marca y se administra al animal antes de, durante o después de la cirugía o una técnica quirúrgica, incluyendo una técnica estereotáctica o mínimamente invasiva, para el propósito de localizar la lesión del nervio o para evaluar el daño que queda o lesión el tejido neural. En uno de tales aspectos, los miembros de unión específica radiomarcados, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, son útiles en técnicas de cirugía radioinmunoensayadas guiada, en las que se pueden identificar e indicar la presencia y/o ubicación de células nerviosas comprometidas lesionadas o moribundas o neuronas o tejido nervioso, antes de, durante o después de la cirugía para apuntar, identificar o eliminar tales células.

[0042] Se incluyen inmunoconjugados o proteínas de fusión de anticuerpos en las que los miembros de unión específica, particularmente anticuerpos y fragmentos de los mismos, de la presente invención están conjugados o unidos a otras moléculas o agentes que se incluyen adicionalmente, pero no se limitan a miembros de unión conjugados con un fármaco neuroactivo, agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico o fármaco.

[0043] La presente descripción incluye un sistema de ensayo que puede prepararse en forma de un kit de prueba para el análisis cuantitativo de la extensión de la presencia de, por ejemplo, neuronas dañadas, comprometidas o lesionadas o para cuantificar neuronas en una muestra. El kit de sistema o de prueba puede comprender un componente marcado preparado por una de las técnicas radiactivas y/o enzimáticas tratadas en este documento, el acoplamiento de una etiqueta para el anticuerpo, y uno o más reactivos inmunoquímicos, opcionalmente al menos uno de los cuales es un componente libre o inmovilizado o su pareja de unión.

[0044] Los anticuerpos y en una realización particular anticuerpos recombinantes que comprenden las secuencias de cadena pesada y/o ligera presentadas en las Figuras 5 y 6 en el presente documento, o fragmentos activos de los mismos, y anticuerpos de cadena única, recombinantes o sintéticos derivados de los mismos, en particular que comprenden las secuencias de la región de CDR representadas en las Figuras 5 y 6, se pueden preparar en composiciones farmacéuticas, incluyendo un vehículo, excipiente o diluyente adecuado, para la administración en casos en los que la terapia es apropiada, tal como para tratar o mejorar las condiciones de o enfermedades que implican el compromiso de las neuronas, daños, lesiones o la muerte. Tales composiciones farmacéuticas también pueden incluir procedimientos de modulación de la vida media de los anticuerpos o fragmentos mediante métodos conocidos en la técnica tales como pegilación. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender además

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anticuerpos adicionales o agentes terapéuticos.

[0045] La presente descripción también incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos, que están unidos de forma covalente o asociados de otro modo con otras moléculas o agentes. Estas otras moléculas o agentes incluyen, pero no se limitan a, las moléculas (incluyendo anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) con distintas características de reconocimiento, toxinas, ligandos, agentes neuroactivos, y agentes quimioterapéuticos. En un aspecto adicional los anticuerpos o fragmentos se pueden usar para orientar o dirigir moléculas terapéuticas u otros agentes, por ejemplo a las moléculas diana o agentes a las neuronas, por ejemplo a las neuronas corticales, las neuronas del hipocampo, células ganglionares de la retina o de células granulares del cerebelo, incluyendo por los sitios de la herida, sitios isquímicos, sitios de tumor, áreas inflamatorias o lesiones neurodegenerativas. Los anticuerpos o fragmentos se pueden utilizar para orientarse a moléculas terapéuticas directos u otros agentes, por ejemplo a las moléculas diana

o agentes a los sitios de isquemia cerebral o derrame cerebral.

[0046] Otros objetos y ventajas serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos, y las reivindicaciones acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0047]

FIGURA 1: IgM humanos se une a la superficie de múltiples tipos de neuronas. sHIgM42 (A) y rHIgM12 (C) se unen a la superficie de neuronas corticales vivas que co-expresan los neurofilamentos (NF) (B & D). Las células se mantuvieron en hielo durante una incubación de 10 min con 10 µg/ml IgM en los medios. Se fijaron las células, se lavaron y se detectó IgM humana con una cadena mu anti-humana Fab'2-FITC Ab secundaria. NF interna está presente como un patrón segmentado característico. Las células corticales se cultivaron durante 6 días en medios Neurobasal B27 en cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliornitina. No todas las neuronas corticales expresan NF todavía, pero las IgM se unen a todas las neuronas en el cultivo. rHIgM12 (E verde) y sHIgM42 (F verde) se unen a la superficie de las neuronas del hipocampo del ratón vivo que co-expresa neurofilamentos (NF, rojo). Neuronas hippocampales se cultivaron durante 1 semana en los medios Neurobasal B27 en plástico revestido de polilisina. Las células aisladas de una resección del lóbulo temporal humano se cultivaron en DMEM/F12/N2/B27 durante 21 días. rHIgM12 unido a la superficie de las células (G) que también fueron positivos para  III tubulina (F, anti-β III de Promega). FIGURA 2. IgM humana etiquetar la superficie de células granulares del cerebelo en patrones distintos. Rata de células granulares del cerebelo en 1 día en cultivo se incubaron in vivo con 10 µg/ml del suero humano derivado Ig Ms, sHIgM12 o sHIgM42, en medios de cultivo durante 15 min en hielo. Después del lavado y la fijación con paraformaldehído al 4%, las células se incubaron a temperatura ambiente con un anticuerpo humano anti-conjugado FITC cadena mu y la imagen usando un microscopio de inmunofluorescencia. El patrón de la etiqueta de la membrana neuronal utilizando estos dos anticuerpos es diferente. Áreas cortas de membrana de neuritas están vinculadas por sHIgM12 que resulta en un patrón claramente punteado. Las áreas más grandes de la membrana de neuritas están vinculadas por sHIgM42 que resulta en un patrón segmentado. La ampliación es 400x.

FIGURA 3. IgMs, rHIgM12 y sHIgM42 humanos de unión neuronal protegen a las neuronas corticales en cultivo a partir de peróxido inducido por la muerte celular. Las neuronas de ratón a los 3 días en cultivo se trataron con 500 nM de H2O2 o solución salina con o sin 10 µg/ml de IgM humanos durante 30 min. Las células se lavaron con medio neurobasal B27 frescas y 24 horas más tarde la expresión de la caspasa-3 detectada por 96 pocillos triplicados tratados usando un kit de ensayo de FLICA caspasa-3 (Immunochemistry Technologies 935). Las barras indican el % de protección a partir de la activación de caspasa 3. FIGURA 4 ilustra el vector amplificable para la producción de anticuerpo recombinante. Este es un mapa del vector usado para generar anticuerpo recombinante basado en sHIgM22 (rHIgM22), que fue modificad para la producción de IgM12 recombinante y IgM42. Para la expresión en células CHO, el promotor de VH fue reemplazado con el promotor de E1A. La región constante de cadena ligera Cλ se sustituyó por una región constante de la cadena ligera kappa Cκ.

FIGURA 5 representa IgM12 de aminoácidos del anticuerpo y la secuencia de ácido nucleico, en el vector recombinante. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la codificación de secuencia de ácido nucleico está en gris y cada una de las Vh, y las secuencias de región constante CH1, CH2, CH3 y CH4 están señalizadas. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y la codificación de secuencia de ácido nucleico está en CL púrpura y se indican las secuencias de VL tanto variables como constantes (kappa). Se observan secuencias de la región CDR de las regiones pesadas y ligeras variables de la cadena. La cadena J humana se indica en la secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico.

FIGURA 6 representa aminoácido de anticuerpo IgM42 y la secuencia de ácido nucleico, en el vector recombinante. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la codificación de secuencia de ácido nucleico está en gris y cada una de las secuencias de región Vh y constante CH1, CH2, CH3 y CH4 se proporcionan e indican. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera y la codificación de secuencia de ácido nucleico está en CL púrpura y se indican las secuencias VL tanto variables como constantes (kappa). Se observan secuencias CDR de la región para las regiones pesadas y ligeras variables de la cadena.

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espinales se congelaron, se seccionaron longitudinalmente y se inmunoetiquetaron con fragmentos FITC conjugados de cadena mu anti-humana Fab'2 (verde) y ant-NF (SMI-32 y 34, rojo) seguido de una TRICT secundario conjugado. Las imágenes confocales fusionadas confirmaron la co-localización de sHIgM42 (A) con largas NF + fibras (B), se fusionaron en (C). rHIgM12 (D, verde) también se co-localizó con estructuras NF + (D, rojo), tales como haces de fibras axón de cruz de corte. FIGURA 16. rHIgM12 y sHIgM42 no exacerben las puntuaciones clínicas de EAE. Grupos de 10 ratones C57BL6 con péptido MOG indujeron EAE se les dio una sola dosis de 100 µg i.v. de rHIgM12, sHIgM42, el control de IgM humana o solución salina en el momento en que cada ratón alcanzó una puntuación clínica de 1 (cola cojera) y se controló cada dos días hasta 28 días después de la inmunización. Los gráficos son la +/-SEM media de la puntuación clínica media de cada grupo de tratamiento. ANOVA sobre los rangos de las puntuaciones clínicas medias no indicó ninguna diferencia entre los grupos (P = 0,14). FIGURA 17. rHIgM12 y sHIgM42 no exacerben la patología de la médula espinal EAE. Al final del estudio en la Figura 13 se eliminaron las médulas espinales, se cortaron en bloques de 1 mm, secciones transversales cortadas de cada tercer bloque consecutivo y se tiñeron con ericromo para visualizar patología. 10 secciones transversales por ratón (40 cuadrantes) se calificaron a ciegas. No hubo diferencias en la inflamación (p = 0,825)

: o la desmielinización (P = 0,766) entre los grupos. FIGURA 18. rHIgM12 promueve la emergencia de neuritas Neuronas del hipocampo E15 se cultivaron en poliD-lisina (PDL) (A) o rHIgM12 (B) -cubreobjetos de vidrio recubierto de nitrocelulosa. 12 horas después de la siembra de las células, estas neuronas se fijaron y se tiñeron con anticuerpo β3-tubulina (A1 y B1, verde) y faloidina Texas-rojo (A2 y B2). A3-B3 son superposiciones de A1-A2 y B1-B2, donde los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). C, D y E muestran la medición del total (C, p = 0,0056), el más largo (D, p <0,0001) y 2º más largo (E, p = 0,0782) longitudes de neuritas. Las neuronas que crecen en rHIgM12 tienen un menor número de neuritas (F, p <0,0001), y la mayoría son neuronas de etapa 3 (G) en comparación con las neuronas sembradas sobre sustratos PDL de control (72% vs. 18%), que tienen múltiples neuritas simétricas. Los análisis estadísticos muestran la media + SEM (t-prueba no apareada). FIGURA 19. rHlgM12 impulsa formación axón Neuronas de hipocampo 12 horas después de la siembra sobre sustratos de PDL (A), PDL + laminina (B) o rHIgM12 (C) se tiñeron con Tau1 (A1-C1, verde) o MAP2 (A2-C2, azul). A3-C3 son superposiciones de A1-C1 y A2-C2, y F-actina (rojo) se marcó con faloidina rojo Texas. DF muestran la intensidad TAU1 relativo a lo largo de las neuritas más largas de cuerpo celular a la del cono de crecimiento en A1-C1 marcada por líneas de trazos. La tinción Tau1 se enriquece de manera asimétrica en la parte distal de la neurita más larga en las neuronas de etapa 3 cultivadas en sustratos tanto rHIgM12 como laminina. FIGURA 20. Unión de rHIgM12 reorganiza las membranas neuronales Neuronas del hipocampo DIV3 se tiñeron de modo triple con rHIgM12, la toxina de cólera B (CTB, Alexa Fluor 594) y filipina después de la fijación (A). rHIgM12 (A1) etiqueta de manera uniforme la superficie de la neurona, con un patrón similar al de GM1 (A2)

: o colesterol (A3) etiquetado por CTB o filipina respectivamente. Sin embargo, después del tratamiento con rHIgM12 durante 30 min a 37°C, unido a la membrana de rHIgM12 agregada en la superficie de la neurona (B1-C1). El tratamiento con resultados rHIgM12 en la agrupación de colesterol (B2) y GM1 (C2), que co-localiza con la rHIgM12 agregada (B3-C3). Los paneles inferiores en la parte inferior de B y C son un aumento mayor de las regiones en caja, mostrando colocalización de rHIgM12 agregada (verde) con el colesterol en clúster (azul) o GM1 (rojo) en la región del cono de crecimiento. FIGURA 21. rHIgM12 co-localiza con GM1 en microdominios de membrana de la neurona A. Neuronas del hipocampo DIV1 se fijaron con paraformaldehído al 4% primero y después se tiñeron por rHIgM12. rHIgM12 etiqueta estructuras de punto más pequeñas. B. Neuronas del hipocampo vivas DIV1 se enfriaron a 4°C durante 30 min y después se marcaron con rHIgM12, seguido de tinción con anticuerpo anti β-III-tubulina después de la fijación. rHIgM12 mancha formaciones de tinción punteada mucho más grandes en la superficie de las neuronas.

C.: Neuronas del hipocampo vivo DIV3 fueron tratadas con metilo-βciclodextrina durante 30 min a 37°C para agotar colesterol y después se enfrió a 4°C. Las neuronas fijadas fueron teñidas con rHIgM12 (verde) y la toxina B del cólera (rojo). rHIgM12 se une a los puntos lagrimales más grande que co-localiza GM1 etiquetado por la toxina del cólera B. El panel inferior muestra un aumento mayor de las regiones en caja. FIGURA 22. rHIgM12 se une a las balsas de lípidos Se permitió que neuronas corticales vivas DIV7 se unieran rHIgM12 o controlaran anticuerpo IgM a 4°C durante 30 min. A. Las neuronas se lavaron tres veces después de la unión del anticuerpo y se lisaron en tampón que contenía 0,5% de NP-40. Los lisados se separaron por microcentrifugación a 4°C, y tanto los sobrenadantes como los sedimentos se transfirieron con anticuerpo secundario IgM anti-humano. rHIgM12 se distribuye tanto en el sedimento como el sobrenadante en comparación con el anticuerpo IgM de control, que no se une a las neuronas y va al lavado. El panel inferior muestra un gel teñido con Coomassie separado cargado con la misma cantidad de proteína. B. Las neuronas se lisaron en tampón que contiene 1% de Triton X-100 se fraccionaron mediante ultracentrifugación en gradientes de sacarosa a 4°C. Las fracciones resultantes se transfirieron secuencialmente para rHIgM12, caveolina-1, receptor de transferrina, β3tubulina (B3-Tub), y beta-actina con anticuerpos específicos. rHIgM12 localiza a la fracción de baja densidad que contiene caveolina-1 y β3-tubulina. Las fracciones de mayor densidad contienen receptor de transferrina, β3tubulina y actina. Cierta rHIgM12 localiza al sedimento insoluble detergente, que se compone principalmente de proteínas del citoesqueleto enriquecidas en la tubulina. La mayoría de actina va a fracciones de mayor densidad solubles detergentes. FIGURA 23. rHIgM12 asociados con los microtúbulos A. Neuronas del hipocampo DIV1 fueron tratadas primero con rHIgM12 durante 30 min a 37°C, luego se fijan simultáneamente y se extraen con tampón que

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anchura del filtro en la altura media. Con el aumento del valor GB disminuye la desviación estándar. 95% de intervalos de confianza de fijación por puntos se dan para cada día. FIGURA 34. Comparación de tres tratamientos en 90dpi utilizando valores de modelo predichos. El análisis estadístico se realizó para cada día antes y después del tratamiento. La actividad nocturna horizontal de ratones tratados con rHIgM12 en comparación con el control IgM y los ratones tratados con solución salina divergieron significativamente/se mejoraron en el día 7 (p = 0,045) y el día 11 (p = 0,042) post-tratamiento, respectivamente (indicado por flechas negras). 95% de intervalos de confianza se dan para cada día.

FIGURA 35. rHIgM12 mejora tanto la actividad horizontal como vertical en ratones SJL cuando se administra temprano en la enfermedad. Tres grupos de 5 ratones SJL en 45dpi se colocaron en cajas de monitoreo de actividad AccuScan. Las medidas de línea de base se recogieron a lo largo de 8 días. Después del tratamiento, los ratones de tratamiento se controlaron continuamente durante 8 semanas. Paneles A, C, E y G corresponden a la actividad horizontal y B, D, F y H se corresponden con la actividad vertical. A, B), grabaciones originales sin filtrar para la actividad horizontal y vertical; C, D) actividades nocturnas promedias presentadas como contenedores para cada día, E, F) filtrado gaussiano (GB = 2 días) y G, H) sexto ajuste polinómico de valores Z normalizados reveló mejora tanto en la actividad horizontal como vertical en grupo tratado con rHIgM12. Grupos de control de IgM y de salina mostraron niveles similares de actividad motora durante todo el estudio. Los intervalos de confianza del 95% de punto de fijación se dan para cada día. FIGURA 36. Comparación de tres tratamientos en 45dpi utilizando valores de modelo predichos. El análisis estadístico se realizó para cada día antes y después del tratamiento. A, C) la actividad nocturna horizontal de ratones tratados con rHIgM12 en comparación con el control IgM y de los ratones tratados con solución salina divergieron significativamente en el día 13 (p = 0,015) y el día 9 p = 0,036) después del tratamiento, respectivamente. B, D) la actividad vertical de ratones tratados con rHIgM12 se divergió/mejoró en el día 14 (p = 0,019) y el día 6 (p = 0,037) post-tratamiento, respectivamente. Las flechas negras indican días con el inicio de la mejoría significativa. Los 95% de intervalos de confianza se dan para cada día.

FIGURA 37. Ratones normales de SJL no infectados tiene actividad espontánea altamente variable que no está influenciada por ningún tratamiento. Tres grupos de 5 ratones SJL no infectadas se colocaron en cajas de monitorización de la actividad AccuScan. Mediciones de línea de base se recogieron más de 8 días. Después del tratamiento, los ratones se controlaron continuamente durante 8 semanas. Ninguno de los tratamientos indujo cambios en actividad horizontal (A, C, E y G) o vertical (B, D, F y H). 95% de intervalos de confianza se dan para cada día.

FIGURA 38. Una sola dosis de anticuerpo humano incrementó la supervivencia en ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Los ratones fueron tratados con una dosis única de rHIgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. Los ratones fueron seguidos hasta moribundo y luego se sacrificaron para la patología. Algunos ratones murieron a causa de la enfermedad. Todos los ratones tenían una profunda pérdida de peso antes de la muerte. La supervivencia se representa gráficamente mediante las curvas de Kaplan-Meir y la significación estadística se determinó mediante la prueba de Mantel-Cox no paramétrico. Hubo un aumento en la supervivencia en ratones tratados con rHIgM12 en comparación con los ratones tratados con PBS o no tratados, P = 0,008. Todos los análisis y el tratamiento se realizaron de forma ciega de tal manera que el investigador que tome la decisión de sacrificar los ratones no tenía conocimiento de los grupos de tratamiento. Un total de 45 ratones fueron estudiados en este análisis. Ratones de tipo salvaje SOD +/+ tenían una supervivencia normal y sin pérdida de peso (datos no mostrados). FIGURA 39 representa la pérdida de peso en ratones G86R SOD1 como una función del tiempo en ratones administrados con una sola dosis de 200 µg de rHIgM12 a los 50 días de edad en comparación con los ratones de control administrados con PBS. Ratones administrados con rHIgM12 mostraron una menor pérdida de peso durante un período de 60 días después de la inyección única de anticuerpo.

FIGURA 40. Una sola dosis de anticuerpo humano disminuyó degeneración axonal de la médula espinal en ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Los ratones se trataron con una sola dosis de 250 µg de rHIgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. El número de verticilos de mielina, característico de axones en degeneración, fueron contados en la médula espinal en el nivel medio torácico. El número de axones en degeneración se redujo en ratones mutantes de la SOD1 tratados con rHIgM12 en comparación con PBS tratado (P = 0,003, prueba T) y ratones no tratados. Tenga en cuenta que el número de axones en degeneración en la médula espinal de ratones de tipo salvaje SOD -/-es mínimo en comparación con ratones mutantes SOD1 +/+. En el momento del sacrificio, los ratones se perfundieron con fijador de Trump (4% de formaldehído, 0,1% de gluataraldehído) y la médula espinal en bloques de 1 mm. Los bloques fueron incrustados en plástico de araldito y secciones de 1 micra desde el nivel T6 se tiñeron con diamina para fenileno para visualizar envoltura de mielina. Se muestran secciones de la médula espinal de SOD-/-de tipo salvaje (superior derecha) y mutante SOD1 +/+ (inferior derecha).

FIGURA 41. Una sola dosis de anticuerpo humano conservó neuronas tanto anterior como posterior de la médula espinal de ratones transgénicos mutantes SOD1 G86R. Los ratones se trataron con rHIgM12 o PBS a los 55 días de edad. Algunos ratones se dejaron sin tratar. El número de células de cuerno anterior y posterior, se tiñó con un anticuerpo para NeuN que específicamente etiqueta neuronas, se contaron en las secciones de parafina de la médula espinal en el un nivel torácico medio. El número de células de cuerno anterior y posterior en ratones tratados con rHIgM12 fue significativamente mayor (P = 0,0025 y P = 0,018 por prueba T) que en los ratones tratados con PBS o aquellos no se tratan. El número de células de cuerno anterior y posterior en ratones mutantes de SOD tratados con rHgM12 fueron similares a los observados en ratones de tipo salvaje de SOD -/-.

FIGURA 42. El anticuerpo humano recombinante, rHIgM12, se une a las neuronas a través de las

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de unión a antígeno puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpos. Preferiblemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una cadena pesada de la región variable de anticuerpo (VH).

[0060] Los inmunoconjugados o proteínas de fusión de anticuerpos de la presente invención, en los que los anticuerpos, moléculas de anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de uso en la presente invención están conjugados o unidos a otras moléculas o agentes incluyen adicionalmente, pero no se limitan a tales anticuerpos, moléculas, o fragmentos conjugados con un agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico, agente antimicrobiano o un péptido, de la pared celular y/o alterador de la membrana celular o medicamento.

[0061] El término "específico" puede usarse para referirse a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su pareja de unión específica. El término es aplicable cuando también, por ejemplo. Un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es llevado por un número de antígeno s, en cuyo caso el miembro de unión específica que lleva el dominio de unión al antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que llevan el epítopo.

[0062] El término "comprende" se utiliza generalmente en el sentido de incluir, es decir que permite la presencia de una o más características o componentes.

[0063] El término "que consta esencialmente de" se refiere a un producto, en particular una secuencia de péptido, de un número definido de residuos que no se une covalentemente a un producto más grande. En el caso del péptido de la invención mencionado anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que las modificaciones menores en el N-o C-término del péptido sin embargo se pueden contemplar, tales como la modificación química de la terminal para añadir un grupo protector o similar, por ejemplo, la amidación del C-terminal.

[0064] El término "aislado" se refiere al estado en el que los miembros de unión específica de la invención, o ácido nucleico que codifica tales miembros de unión estarán de acuerdo con la presente invención. Los miembros y ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de material con el que están asociados naturalmente tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su ambiente natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, el cultivo celular) cuando tal preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aún así ser aislados para fines prácticos -por ejemplo los miembros normalmente se mezclarán con la gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o serán mezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables vehículos o diluyentes cuando se utilizan en el diagnóstico o terapia.

[0065] Como se usa en el presente documento, "pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo, "ug" o " µg" significa microgramos, "mg" significa miligramo, "ul" o "µl" significa microlitro, "ml" significa mililitros, "I" significa litro.

[0066] Los términos "anticuerpo", "neurona de anticuerpo de unión", "anticuerpo IgM12", "anticuerpo IgM42", "anticuerpo 12", "anticuerpo 42", "sHIgM12", "sHIgM42", "rHIgM12", "rHIgM42" y cualquier variante no enumerado específicamente, se pueden usar en el presente documento, y como se utiliza en la presente solicitud y en las reivindicaciones se refieren a material proteico incluyendo las proteínas simples o múltiples, y se extiende a aquellas proteínas que tienen los datos de la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento y se presentan en las Figuras 5 y 6 y el perfil de actividades expuestas en el presente documento y en las reivindicaciones. En particular el anticuerpo IgM12, el anticuerpo 12, rHIgM12 particularmente se refiere a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, particularmente los anticuerpos recombinantes o fragmentos, que comprenden la secuencia presentada en la Figura 5. El anticuerpo IgM12, anticuerpo 12, rHIgM12 particularmente se refieren a polipéptidos o anticuerpos

o fragmentos, particularmente los anticuerpos recombinantes o fragmentos, que comprenden secuencias de CDR de la región variable de cadena pesada expuesta en la SEQ ID NOS: 31-33 de cadena ligera y secuencias de CDR de la región variable establecidas en SEQ ID NOS: 34-36. Anticuerpo IgM12, el anticuerpo 12, rHIgM12 incluye anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada de la región variable de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de cadena ligera de la región variable de la SEQ ID NO: 11. En particular, el anticuerpo IgM42, el anticuerpo 42, rHIgM42 particularmente se refiere a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, particularmente los anticuerpos recombinantes o fragmentos, que comprenden la secuencia presentada en la Figura 6. El anticuerpo IgM42, el anticuerpo 42, rHIgM42 particularmente se refiere a polipéptidos o anticuerpos o fragmentos, particularmente los anticuerpos recombinantes o fragmentos, que comprenden secuencias de región variable de CDR de la cadena pesada expuesta en la SEQ ID NOS: 37-39 y las secuencias de CDR de la región variable de cadena ligera se exponen en SEQ ID NOS: 40-42. El anticuerpo IgM42, el anticuerpo 42, rHIgM42 incluye anticuerpo que tiene la secuencia de la cadena pesada de la región variable de la SEQ ID NO: 17 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 27. En consecuencia, las proteínas que muestran una actividad sustancialmente equivalente o alterada están contempladas. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, tales como las modificaciones obtenidas a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como las obtenidas a través de mutaciones en huéspedes que son productoras del complejo o sus subunidades con nombre. Además, con los términos "anticuerpo", "anticuerpo de unión neurona", "anticuerpo IgM12", "anticuerpo IgM42", "anticuerpo 12", "anticuerpo 42", "sHIgM12", "sHIgM42", "rHIgM12", "rHIgM42" se pretende incluir dentro de su

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[0282] En este experimento, varias combinaciones de relaciones de dosis fijas de anticuerpos IgM recombinantes se examinan para la mejora del resultado neurológico en el modelo de TMEV de MS como se describe en el ejemplo anterior. Seis meses después de la exposición a TMEV, el tratamiento con combinaciones de IgM recombinantes se inicia en ratones. En esta serie de estudios, a los ratones se les administró vehículo solo, o diversas combinaciones de las IgM, en una única administración intravenosa (mezcla). Puntos finales sensorimotores son supervisados como anteriormente. Mielinización y el crecimiento de las neuritas se evalúan para examinar los cambios producidos por combinaciones de anticuerpos. Las combinaciones bajo evaluación se muestran en la Tabla 4A y en la Tabla 4B.

Tabla 4A. Resumen de grupos de tratamiento -Combinaciones de anticuerpo IgM recombinante

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Tratamiento: Resultado Nivel de Evaluaciones Evaluaciones

histológico propuesto: dosis (mg/kg, iv) neurológicas histológicas

Vehículo (salina): NA 0 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM12 + IgM42: Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM22 + IgM46: Remielinació n + Remielinació n 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM22 + IgM12: Remielinació n + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM46 + IgM12: Remielinació n + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM22 + IgM42: Remielinació n + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM46 + IgM42: Remielinació n + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Condición de revestimiento Análisis de andadura Rotarod Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

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Tratam: Resultado Nivel Tipo(s) Resultado Resultado

iento: histológico propuesto de dosis (mg/kg; iv) de resultad o histológi co histológicorelativo y tipo(s)de resultado (') neurológico de sensorimotor relativo (') -condición de revestimiento, análisis de andadura & rotarod

Vehícul o (salina): NA 0 Ninguno Ninguno Ninguno

IgM12 + IgM42: Excrecencia de neurita + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Excrecen cia de neurita > crecimiento de neurita que: (X+IgM12 excrecencia de neurita) y (X+IgM42 excrecencia de neurita > mejora de sensimotor que: (X+IgM12 mejora de sensimotor) y (X+IgM42 mejora de sensimotor

IgM22 + IgM46: Remielinació n + Remielinació n 0,25 0,25 Mielinaci ón > remielinación que: (X+IgM22 remielinación) y (X+IgM46 remielinación) > mejora de sensimotor que: (X+IgM22 mejora de sensimotor) y (X+IgM46 mejora de sensimotor

IgM12 + IgM22: Excrecencia de neurita + Remielinació n 0,25 0,25 Excrecen cia de neurita + Remielin ación > remielinación y > excrecencia de neurita que: (X+IgM12 excrecencia de neurita) y (X+IgM22 remielinación) > mejora de sensimotor que: (X+IgM12 mejora de sensimotor) y (X+IgM22 mejora de sensimotor

IgM12 + IgM46: Excrecencia de neurita + Remielinació n 0,25 0,25 Excrecen cia de neurita + Remielin ación > remielinación y > excrecencia de neurita que: (X+IgM12 excrecencia de neurita) y (X+IgM46 remielinación) > mejora de sensimotor que: (X+IgM12 mejora de sensimotor) y (X+IgM46 mejora de sensimotor

IgM42 + IgM22: Excrecencia de neurita + Remielinació n 0,25 0,25 Excrecen cia de neurita + Remielin ación > remielinación y > excrecencia de neurita que: (X+IgM42 excrecencia de neurita) y (X+IgM22 remielinación) > mejora de sensimotor que: (X+IgM42 mejora de sensimotor) y (X+IgM22 mejora de sensimotor

IgM42 + IgM46: Excrecencia de neurita + Remielinació n 0,25 0,25 Excrecen cia de neurita + Remielin ación > remielinación y > excrecencia de neurita que: (X+IgM42 excrecencia de neurita) y (X+IgM46 remielinación) > mejora de sensimotor que: (X+IgM42 mejora de sensimotor) y (X+IgM46 mejora de sensimotor

[0283] (*) X indica una mejora, X + indica una mayor mejoría, y X ++ indica aún más mejora. Los valores de puntuación de mejora están en relación con la dosificación de un anticuerpo dado. Así, un X + es una mejora mayor que X para ese mismo Ab. La mejora X para un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X para otro Ab; el valor X + de un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X + de otro Ab, y el valor X +++ de un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X +++ de otro Ab.

[0284] En este ejemplo, las combinaciones de anticuerpos recombinantes de IgM12 + IgM42, IgM22 + IgM46, IgM12

+ IgM22, IgM12 + IgM46, IgM42 + IgM22, y IgM42 + IgM46 producen mejoras estadísticamente significativas,

65 dependientes de la dosis en varios puntos finales sensoriomotores incluyendo condición de revestimiento, parámetros de la marcha y la puntuación Rotarod en comparación con el tratamiento con vehículo (p <0,05 para

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en el Ejemplo 14 en el presente documento. Por consiguiente, el tratamiento intravenoso con combinaciones de IgM de anticuerpos (como aditivos) o control de vehículo se le da 10 min después de la lesión. Puntos finales locomotores son supervisados como anteriormente. Además, la mielinización y el crecimiento de neuritas se evalúan para examinar los cambios producidos por combinaciones de anticuerpos. Las combinaciones evaluadas se muestran en la Tabla 6A y en la Tabla 6B.

Tabla 6A. Resumen de grupos de tratamiento -combinaciones de anticuerpo IgM recombinantes

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Tratamiento: Resultado histológico propuesto Nivel de dosis (mg/kg, iv) Evaluaciones neurológicas Evaluaciones histológicas

Vehículo (salina): NA 0 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM12 + IgM42: Excrecencia de neurita + Excrecencia de neurita 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM22 + IgM46: Remielinación + Remielinación 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM12 + IgM22: Excrecencia de neurita + Remielinación 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM12 + IgM46: Excrecencia de neurita + Remielinación 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM42 + IgM22: Excrecencia de neurita + Remielinación 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

IgM42 + IgM46: Excrecencia de neurita + Remielinación 0,25 0,25 Puntación BBB Mielinación por EM Excrecencia de neurita por estereología

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Tabla 6B. Resumen de grupos de tratamiento -Resultados

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Tratamiento: Función propuesta Nivel de dosis Ab (mg/kg; iv) Tipo(s) de resultado histológico Resultado histológico relativo(') Resultado neurológicorelativo -Puntuación BBB (')

Vehículo (salina): NA 0 Ninguno Ninguno Ninguno

IgM12 +: Excrecenci 0,25 Excrecencia > crecimiento de > mejora

IgM42: a de 0,25 de neurita neurita que: BBB que:

neurita +: (X+IgM12 (X+IgM12

Excrecenci: excrecencia de BBB) y

a de: neurita) y (X+IgM42 (X+IgM42

neurita: excrecencia de BBB)

neurita

IgM22 +: Remielinac 0,25 Mielinación > remielinación que: > mejora

IgM46: ión + 0,25 (X+IgM22 BBB que:

Remielinac: remielinación) y (X+IgM22

ión: (X+IgM46 BBB) y

remielinación): (X+IgM46

BBB)

IgM12 +: Excrecenci 0,25 Excrecencia > remielinación y > > mejora

IgM22: a de 0,25 de neurita + excrecencia de BBB que:

neurita +: Remielinación neurita que: (X+IgM12

Remielinac: (X+IgM12 BBB) y

ión: excrecencia de (X+IgM22

neurita) y (X+IgM22: BBB)

remielinación)

IgM12 +: Excrecenci 0,25 Excrecencia > remielinación y > > mejora

IgM46: a de 0,25 de neurita + excrecencia de BBB que:

neurita +: Remielinación neurita que: (X+IgM12

Remielinac: (X+IgM12 BBB) y

ión: excrecencia de (X+IgM46

neurita) y (X+IgM46: BBB)

remielinación)

IgM42 +: Excrecenci 0,25 Excrecencia > remielinación y > > mejora

IgM22: a de 0,25 de neurita + excrecencia de BBB que:

neurita +: Remielinación neurita que: (X+IgM42

Remielinac: (X+IgM42 BBB) y

ión: excrecencia de (X+IgM22

neurita) y (X+IgM22: BBB)

remielinación)

IgM42 +: Excrecenci 0,25 Excrecencia > remielinación y > > mejora

IgM46: a de 0,25 de neurita + excrecencia de BBB que:

neurita +: Remielinación neurita que: (X+IgM42

Remielinac: (X+IgM42 BBB) y

ión: excrecencia de (X+IgM46

neurita) y (X+IgM46: BBB)

remielinación)

55 [0301] (*) X indica una mejora, X + indica una mayor mejora, y X ++ indica aún más mejora. Los valores de puntuación de mejora están en relación con la dosificación de un anticuerpo dado. Así, un X + es una mejora mayor que X para ese mismo Ab. La mejora X para un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X para otro Ab; valor X + de un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X + de otro Ab, y valor X +++ de un Ab no es necesariamente el mismo que el valor X +++ de otro Ab.

[0302] En este experimento, cada una de las combinaciones de anticuerpos recombinantes IgM12 + IgM42, IgM22 + IgM46, IgM12 + IgM22, IgM12 + IgM46, IgM42 + IgM22, y IgM42 + IgM46 se encuentran para producir mejoras estadísticamente significativas, dependientes de la dosis en función de las extremidades posteriores (puntos finales motriz) que se encuentran por parámetros BBB. No hay diferencias en la mejora basadas en el género.

65 [0303] Por otra parte, cada una de las combinaciones se encuentra para mejorar la función locomotora en un supra

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motor funcional.

Introducción

[0314] Seguimiento y análisis de la función neurológica en modelos de enfermedad de roedor largo plazo sigue siendo un reto. El comportamiento nocturno es una medida sensible de la función neurológica de roedor porque se espera que los cambios de actividad máxima a ocurran durante el período de seguimiento de la noche normalmente activo [1]. Sin embargo, en modelos animales de enfermedades de progresión lenta, supervisión del rendimiento a menudo se extiende durante varias semanas. Hemos informado anteriormente del anticuerpo de unión a oligodendrocitos (rHIgM22) mejoró la remielinización por 5 semanas después del tratamiento

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[2]. Tomados en conjunto que tanto la evolución de la enfermedad y la reparación es un proceso lento y para asegurar que cualquier fluctuación en la actividad se tiene en cuenta, que supervisó la actividad prolongada con la misma densidad de muestreo utilizado en monitorización a corto plazo. Esto creó grandes y altamente fluctuantes conjuntos de datos (FIGURA 32A, C). Para delinear claramente los cambios post-tratamiento y recuperación de las tendencias generales en la actividad a largo plazo, se comparó el uso de agrupamiento de datos, filtrado gaussiano, y el ajuste de polinomio mediante el uso de Mathematica (Wolfram Research, Inc.).

[0315] La infección intracerebral con Virus de Encefalomielitis Murinos de Theiler (TMEV) de cepas de ratón susceptibles resultan en la enfermedad desmielinizante crónica con disfunción neurológica progresiva similar a las formas progresivas de esclerosis múltiple [3]. El tratamiento de este modelo con anticuerpos de clase IgM que se unen a los oligodendrocitos mejora la remielinización del SNC [4]. En contraste, un anticuerpo monoclonal derivado de suero humano (sHIgM12) que se une a las neuronas, promueve el crecimiento de neuritas robusto en el mismo grado como laminina, y reduce los efectos inhibidores de la mielina del SNC sobre el crecimiento de neuritas [5]. Más recientemente una forma recombinante de sHIgM12 humano se generó (rHIgM12) con propiedades biológicas idénticas. Nos mostró anteriormente que rHIgM12 tiene una vida media de 3,6 horas, pero todavía atraviesa la barrera hematoencefálica y se une a los tejidos nerviosos (observación no publicada). Para estudiar los efectos de rHIgM12 sobre la actividad de los ratones infectados con TMEV monitorizamos la actividad espontánea durante varias semanas utilizando cajas de actividad AccuScan (Accuscan Instruments, Inc., Columbus, OH). Elegimos un período relativamente largo de seguimiento de 8 semanas por dos razones: (1) la remielinización inducida IgM está presente por 5 semanas después del tratamiento, y enfermedad desmielinizante inducida por TMEV (2) en esta cepa progresa muy lentamente en comparación con los modelos de EAE puramente autoinmunes de MS [6]. Debido a los periodos de observación largos en comparación con los estudios publicados previamente (TABLA 7), la identificación de cambios por inspección visual de los datos en bruto resultó difícil.

TABLA 7 -Longitud de supervisión de la actividad espontánea en los estudios publicados en comparación con el estudio actual

Mikami et al. 2002, 2004 [14, 15]: 10 minutos (10 minutos de habituación)

Melnick y Dow-Edwards 2001 [16]: 60 minutos (sin habituación)

Chen et al. 2005 [17]: 30 minutos (sin habituación)

Torres-Reverón y Dow-Edwards 2006 [18]: 60 minutos (20 minutos de habituación)

Zhu et al. 2007 [19]: 60 minutos (sin habituación)

Li et al. 2009 [20]: 3 horas (1 hora de la habituación)

(Rivera-Quinones et al 1998; McGavern et al 1999 [1, 21]: 3 días (sin habituación)

Estudio actual: 64 días (8 días de habituación)

Materiales y métodos:

[0316] Ratones: Ratones SJL/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) fueron alojados y criados en la instalación de cuidado de los animales en Mayo Clinic. Protocolos de animales fueron aprobados por el Mayo Clinic_Institutional Animal Care and Use Committee.

[0317] Modelo de virus de Theiler de desmielinización: Enfermedad desmielinizante fue inducida en ratones hembra de 6 a 8 semanas de edad por inyección intracerebral de TMEV. Una aguja de calibre 27 administró 10 l que contenía 2,0 x 105 unidades formadoras de placas de cepa de Daniel TMEV. Esto resultó en> incidencia del 98% de la infección con víctimas mortales raras. Todos los animales desarrollaron encefalitis leve, que se resolvió dentro de 2 semanas. Animales empeoran durante los próximos 6-8 meses con enfermedad desmielinizante crónica de la

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Claims

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