MX2014010463A - Derivados de ingenol sobre la reactivacion del virus latente de inmunodeficiencia humana. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona ampliamente con el uso de ciertos derivados de ingenol como reactivadores del virus de inmunodeficiencia humana de virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales; en otro aspecto, la presente invención se relaciona con una asociación que comprende tales derivados de ingenol y agentes anti-retrovirales sustancialmente activos contra virus que se replican activamente.

Description

DERIVADOS DE INGENOL SOBRE LA REACTIVACIÓN DEL VIRUS LATENTE DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA La presente invención se relaciona generalmente con ciertos derivados de ingenol y su uso como reactivadores del virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con asociaciones y composiciones que comprenden dichos derivados de ingenol y agentes anti-retrovirales sustancialmente activos contra virus que se replican activamente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente etiológico responsable del SIDA - síndrome de inmunodeficiencia adquirida, una enfermedad fatal que se caracteriza por la destrucción del sistema inmune, inhabilitando al organismo para reaccionar apropiadamente ante las infecciones oportunistas que amenazan la vida.

Se ha usado terapia anti-retroviral altamente activa (conocida como HAART) para suprimir la replicación del VIH. Consiste en el tratamiento comúnmente conocido como "coctel" anti-SIDA, con al menos tres compuestos anti-retrovirales activos que contienen inhibidores de transcriptasa reversa, integrasa, proteasa y entrada.

Sin embargo, en pacientes infectados, el virus de los depósitos de células del linfocito CD4+ T infectadas latentemente (es decir, que contienen ADN pro-viral latente residual integrado en el genoma de células hospederas) reanuda rápidamente la replicación viral después del cese del tratamiento HAART.

Así, el VIH sigue siendo una infección viral crónica cuando tal infección latente persistente no se combate.

De conformidad con la base lógica actual en la técnica, la activación de virus latentes contenidos en dichos depósitos, en presencia de fármacos anti-retrovirales, tiene la intención de hacerlos detectables por medio del sistema inmune del cuerpo y accesibles para medicamento activo contra el virus para causar la destrucción de células que expresan proteínas virales, por medio de reacción del sistema inmune del hospedero y/o de modo que las células se lleven a apoptosis, inhibiendo la replicación de virus que salen de los depósitos por la acción de los fármacos anti-retrovirales, agotando así el depósito de infección persistente por VIH y habilitando la erradicación total de la infección.

En otras palabras, la inducción selectiva de infección latente permite que los fármacos anti-retrovirales y la respuesta inmune antiviral accedan y erradiquen la infección residual por VIH - es decir, no sólo estabilizando temporalmente el sistema inmune sin uso posterior de anti-retrovirales, sino suprimiendo definitivamente la infección por VIH en el cuerpo humano.

Glosario En el contexto de la presente invención, el término "virus latente" o "virus latente de inmunodeficiencia humana" significa la secuencia de ADN del virus que causa el síndrome de inmunodeficiencia adquirida que se importa en el núcleo de células infectadas y se integra en el ADN genómico de la célula hospedera que, después de tal integración, se puede volver latente, es decir, con niveles indetectables de expresión de gen viral, no permitiendo así la detección del virus y células infectadas por el sistema inmune hospedero y causando la persistencia de la infección, incluyendo a aquellos pacientes bajo terapia anti-retroviral altamente activa (HAART) con carga viral ¡ndetectable por periodos largos.

La expresión "virus bajo replicación activa" se relaciona con el ADN viral activo en la célula infectada, con la expresión de genes virales en la célula hospedera y producción de progenie de partícula viral.

La expresión "depósitos virales" se relaciona con las células hospederas en donde el virus de inmunodeficiencia humana puede persistir ¡ndetectable por el sistema inmune en su forma latente, incluso durante la terapia anti-retroviral altamente activa (conocida como HAART). Tales depósitos están distribuidos a lo largo del organismo hospedero, incluyendo el cerebro, médula ósea, tejido linfoide y tracto genitourinario. El depósito latente viral principal del virus de inmunodeficiencia humana está en la memoria CD4+ de células T.

La expresión "reactivación del virus latente de inmunodeficiencia humana" significa la reactivación del virus con la expresión de genes latentes virales y la subsecuente formación de nuevas partículas virales, haciendo que la célula infectada nuevamente sea detectable por medio del sistema inmune hospedero.

La expresión "agentes anti-retrovirales activos" se relaciona con agentes, principios activos de medicinas que actúan sobre diferentes etapas del ciclo de vida del virus de inmunodeficiencia humana, pero no actúan sustancialmente, o actúan sólo de manera limitada, contra el virus de inmunodeficiencia humana en una infección latente presente en depósitos virales hospederos.

El término "carga viral", también conocido como "título viral", significa un estimado del número de partículas virales presentes en una muestra de fluido de un paciente de conformidad con el resultado de los métodos de detección usados.

El término "adyuvante" se relaciona con un agente o principio activo a suministrarse adicionalmente al tratamiento inicial, primario o principal de una enfermedad, trastorno o mal. El efecto aislado del "adyuvante" no enfrenta efectivamente la enfermedad o trastorno, sino que complementa el tratamiento y mejora las tasas de supervivencia, la calidad de vida o las tasas de curación que usualmente se obtendrían con la terapia primaria o principal.

El término "liposoma" significa vesículas pequeñas que consisten en una o más bicapas de fosfolípidos concéntricos que por sí mismos se disponen espontáneamente en un medio acuoso. Se pueden usar como sistemas de liberación controlada de medicina. Los liposomas pueden proteger el principio activo de degradación química, física y enzimática, habilitar el incremento de concentración de fármaco en el sitio objetivo, se pueden usar como excipientes no tóxicos para solubilizar fármacos hidrófobos y pueden extender el tiempo de vida de la vesícula y el fármaco en la circulación, generando efectos positivos sobre las características de farmacocinética y toxicidad del principio activo.

El término "nanopartículas" significa partículas ultra-delgadas con 1 a 100 nanómetros de diámetro que pueden encapsular o proteger principios activos o fármacos y presentan propiedades potencialmente ventajosas cuando se usan como un sistema de liberación controlada de fármaco. Las nanopartículas pueden proteger el principio activo de degradación química, física y enzimática, habilitar el incremento de concentración de fármaco en el sitio objetivo, se pueden usar como excipientes no tóxicos para solubilizar fármacos hidrófobos y pueden extender el tiempo de vida del fármaco en circulación, produciendo efectos positivos sobre la farmacocinética y toxicidad del principio activo.

La expresión "principio activo" significa una sustancia biológicamente activa en una composición farmacéutica que puede contener uno o más principios activos en su formulación.

El término "asociación" significa cualquier forma de dosificación apropiada, en combinación, mezcla, formulación, preparación o equivalente, a administrarse a una persona, que contiene al menos un derivado de ingenol de la fórmula I (componente a) y al menos un agente anti-retroviral sustancialmente activo contra virus que se replican activamente (componente b).

El término "excipientes farmacéuticamente aceptables" se relaciona con sustancias inertes usadas en composiciones farmacéuticas como diluyentes o vehículos. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables se describen en las publicaciones: "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20ma edición o posterior, Lippincott Publishing House, Williams and Wilkins; "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., 7ma edición, Lippincott Publishing House, Williams and Wilkins; "Handbook of Pharmaceutical Excipiente" (2000) A. H. Kibbe et al, 3ra edición, American Pharmaceutical Association Publishing House.

El término "apoptosis" significa el procedimiento de muerte celular no seguido por autolisis que, como un procedimiento de muerte celular programada, ocurre de manera organizada, de forma diferente a la necrosis.

La expresión "regulación a la baja de receptor CD4" o "regulación a la baja de receptor de CD4 VIH" significa la desaparición del receptor CD4 de la superficie de membrana plasmática de células CD4+, lo cual hace a la célula refractaria a infecciones subsecuentes por el virus del SIDA u otros virus que usan el receptor CD4, creando un estado de inmunidad celular a superinfección.

La expresión "tratamiento anti-retroviral" significa terapia anti- retroviral altamente activa (conocida como coctel anti-SIDA o HAART) que usualmente comprende al menos tres medicamentos anti-retrovirales activos entre inhibidores de transcriptasa reversa, los cuales pueden comprender nucleósidos, que inhiben la replicación viral por medio de interrupción de la cadena de nucleótidos sintetizada por la enzima, o no nucleósidos que inhiben la replicación viral por medio de unión en el sitio activo de la enzima transcriptasa reversa, inhibidores de integrasa, que inhiben la integración del ADN viral en el ADN genómico de la célula hospedera, inhibidores de entrada o fusión, que interfieren con la unión y entrada de virus en la célula hospedera e inhibidores de proteasa, que inhiben la formación y liberación de nuevas partículas virales de la membrana celular de la célula hospedera.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se entiende en el texto a continuación que la mención de "agentes anti-retrovirales activos contra virus bajo replicación activa" se relaciona con agentes que no actúan sustancialmente, o actúan sólo de una manera limitada, sobre depósitos virales de VIH en el cuerpo humano.

La presente invención se relaciona, en un primer aspecto, con el uso de uno o más derivados de ingenol de la fórmula I a continuación: Fórmula I usada en la preparación de adyuvante producto en el tratamiento de la infección por VIH o tratamiento del SIDA, en donde Z es Z1 de modo que, cuando Z = Z1 , los derivados de ingenol de la invención son como se representan en la fórmula II a continuación: Fórmula II x e y son enteros, x varía entre 2 y 10 e y varía entre 2 y 7.

Particularmente para la fórmula II, x varía entre 3 y 5 e y varía entre 3 y 4. Se pueden citar modalidades particulares de la fórmula II, en donde x = 3 e y = 4: (3-(2,4,6,8-tetradecatetranoil)-ingenol) En relación con la fórmula I, cuando Z = Z2, los derivados de ingenol de la invención son como se representan en la fórmula III continuación: Fórmula III en donde A es fenilo, CH3- o CH2=CH-, y B es -CH=CH-, [-CH2-]q o [-CH2-]W, en donde q es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 2 y 6, y w es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 8 y 10, a condición de que: cuando A es fenilo, B es -CH=CH-; cuando A es CH3-, B es [-CH2-]q; cuando A es CH2=CH-, B es [-CH2-]W Los ejemplos particulares de derivados de ingenol de la fórmula III adecuados para la invención, de manera no exclusiva, son las estructuras A, B, C y D a continuación: Los productos derivados de la invención, particularmente cuando Z = Z2, con radicales 3-cinamil (Ejemplo A), 3-hexanoil (Ejemplo B), 3-dodecanoil (Ejemplo C) y 3-dodeca-1 1-enoil (Ejemplo D), se seleccionaron de conformidad con su bajo potencial para generar productos de degradación tóxicos después del metabolismo.

Particularmente, la fórmula I de derivados de ingenol de la invención presenta la siguiente conformación: Los derivados de ingenol de la invención se pueden preparar de diferentes maneras conocidas para el experto en la técnica, por medio de procedimientos sintéticos o semi-sintéticos, por ejemplo, a partir de materias primas vegetales (como la fracción activa resultante de la separación cromatográfica de un extracto butanólico de látex de Euphorbia tirucalli L, descrito en la solicitud de patente internacional WO2007000618, o a partir de cualquier otra materia prima apropiada, por ejemplo, ingenol de base libre, terpenos, etc.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de derivados de ingenol de la fórmula I anterior, sobre la reactivación del virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales del cuerpo humano. Es un uso en terapia médica.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una asociación útil para el tratamiento o prevención de infección por el virus de inmunodeficiencia humana, que comprende uno o más derivados de ingenol de la fórmula I, y al menos un agente anti-retroviral activo en virus bajo replicación activa, particularmente seleccionado entre inhibidores de transcriptasa reversa nucleósidos o no nucleósidos, inhibidores de proteasa, antagonistas de co- receptor, inhibidores de integrasa retro-viral, inhibidores de adsorción viral, inhibidores de transcripción viral específica, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina y combinaciones de los mismos.

Aún de conformidad con el significado empleado en la presente, se entiende que las asociaciones de uno o más derivados de ingenol de la fórmula I (componente a) y uno o más agentes retrovirales (componente b) pueden estar disponibles en una sola unidad de dosificación (por ejemplo, tableta, cápsula, ampolleta, bolsa, etc.) o en diferentes unidades de dosificación, en las que los componentes (a) y (b) se proporcionan para administración a un paciente de forma conjunta o separada, ya sea simultánea o secuencialmente.

No hay limitación particular sobre la forma de dosificación para la asociación de la invención, incluyendo, además de las ya mencionadas, liposomas y nanopartículas o cualquier otra forma conocida por el experto en la técnica.

Particularmente, la invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que contienen la asociación citada anteriormente y excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto particular, la composición de la invención puede contener adicionalmente otro(s) principio(s) activo(s) diferente(s) del (los) ingenol(es) de la fórmula I y agentes anti-retrovirales. Particularmente, la composición de la invención comprende uno o más compuestos capaces de reactivar el virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales en el cuerpo humano, diferentes de los derivados de ingenol de la fórmula I.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un complemento útil para reactivar el virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales en el cuerpo humano, caracterizado en que comprende uno o más derivados de ingenol de la fórmula I y excipientes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de tratamiento o prevención de infecciones por VIH, caracterizado en que comprende administrar una asociación a un paciente en necesidad de tal tratamiento, como se mencionó anteriormente. Dicho tratamiento comprende administrar los componentes de asociación al mismo tiempo o secuencialmente.

En incluso otro aspecto particular, la invención se relaciona con un método para reactivar el virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales en el cuerpo humano, caracterizado por la administración de uno o más derivados de ingenol de la fórmula I a un paciente.

Entre los inhibidores nucleósidos de transcriptasa reversa adecuados para la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los compuestos AZT (zidovudina), 3TC (lamivudina), d4T (estavudina), abacavir, ddl (didanosina), ddC (zalcitabina), FTC (emtricitabina), PMPA (R)-9-(2-fosfonilmetoxipropil)adenina), tenofovir, adefovir, amdoxovir, elvucitabina, alovudina, racivir, apricitibina, fosfazida y fozivudinetidoxil.

Entre los inhibidores de transcriptasa reversa no nucleósidos de la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los compuestos nevirapina, efavirenz, delavirdina, lovirida, etravirina (+)calanolida, rilpivirina y lersivirina.

Entre los inhibidores de proteasa adecuados para adecuados para la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los compuestos ritonavir, lopinavir, nelfinavir, saquinavir, indinavir, atazanavir, amprenavir, darunavir, fosamprenavir y tipranavir.

Entre los inhibidores de integrasa adecuados para la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los compuestos raltegravir, elvitegravir y dolutegravir.

Entre los inhibidores de fusión adecuados para la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los compuestos enfuvirtida y tifuvirtida.

Entre los inhibidores de co-receptor adecuados para la invención, se pueden citar, de una manera no exclusiva, los inhibidores del co-receptor CCR5 vicriviroc y maraviroc.

Los derivados de ingenol de la invención, los anti-retrovirales activos activamente sobre virus que se replican o la asociación de la invención que los contiene se pueden administrar a un paciente por medio de cualquier vía apropiada, por ejemplo, vía oral, parenteral, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, transdérmica, sublingual, rectal, intramuscular, transbucal, intra-nasal, liposomal, inhalación, vaginal, subcutánea, intra-adiposa, infraocular, intra-articular o intratecal, así como administración usando un catéter o stent, etc.

No hay restricción específica en cuanto a las formas de dosificación usadas con los derivados de ingenol de la invención o con la asociación inventiva. Por ejemplo, se pueden usar tabletas, pildoras, cápsulas, gránulos, pellas y similares para administración oral. Para administración oral líquida se pueden usar soluciones, dispersiones, suspensiones, emulsiones, aceites, etc.

La forma de dosificación puede ser de liberación inmediata, lenta o controlada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A representa una gráfica de inducción de latencia en el clon JIat 8.4 con diferentes concentraciones de un derivado de ingenol de la invención, en lo sucesivo Kyoll, cuando Z = Z1 en la estructura de Markush mostrada anteriormente. Se usaron 20 ng de TNF-a como control positivo y los resultados se muestran como porcentaje de células inducidas.

La Figura 1B representa una gráfica de inducción de latencia en el clon JIat 6.3 con diferentes concentraciones del derivado Kyoll mencionado anteriormente. Se usaron 20 ng de TNF-a como control positivo y los resultados se muestran como porcentaje de células inducidas.

La Figura 1C es un histograma que muestra la inducción de latencia en el clon JIat 6.3 con 4 pm del derivado Kyoll mencionado anteriormente. En este caso se usaron 20 ng de TNF-a como control positivo y los resultados también se muestran como porcentaje de células inducidas.

La Figura 2 es un histograma que muestra la activación de apoptosis en células PBMC humanas (células mononucleares de sangre periférica) cultivadas por 72 horas con las diferentes concentraciones del derivado de ingenol Kyoll mencionado anteriormente. La concentración de fármaco se muestra junto a cada gráfica y el porcentaje de células bajo apoptosis está marcado sobre el cuadrante izquierdo de cada gráfica.

Las Figuras 3 a 6 son gráficas compuestas que muestran la inducción de latencia del virus de inmunodeficiencia humana en el clon Jlat 6.3 y la citotoxicidad correspondiente, tanto para el derivado Kyoll (en donde Z = Z1) como para los derivados A, B y C (en donde Z = Z2).

Las Figuras 7 y 8 son gráficas de PCR (reacción en cadena de polimerasa) para células sanguíneas de pacientes tratados exclusivamente con efavirenz (Figura 7) y con una mezcla de efavirenz y el derivado de ingenol B de la invención (Figura 8).

Las Figuras 9 a 12 son lecturas de citometría de flujo que indican la modulación a la baja del receptor CD4 VIH-1 sobre la superficie de linfocitos humanos y de mono, para el derivado Kryoll (en donde Z = Z1) y para los derivados de ingenol A, B y C (en donde Z = Z2).

EJEMPLOS Las modalidades ejemplares de la invención se dan a continuación, en un sentido no limitante a tales ejemplos, ya que las limitaciones de la invención se exponen sólo en las reivindicaciones adjuntas.

Derivados Z1 de ingenol de la invención Los Ejemplos 1 y 2 se relacionan con una mezcla 1 :1 de dos derivados de ingenol de la fórmula (I), cuando Z = Z1 , que son 3-(2,4,6-dodecatrienoil)-ingenol (x = 3 e y = 4) y 3-(2, 4,6,8-tetradecatetranoil)-ingenol (x = 4 e y = 4), una mezcla en la presente llamada Kyoll, en solución de dimetil sulfóxido a una concentración de 20 mM. Tal solución se usa para hacer diluciones en medios de cultivo para lograr la concentración activa.

Se puede obtener la mezcla de Kyoll, por ejemplo, como se menciona en la solicitud de patente WO2007000618, por medio de separación cromatográfica de un extracto butanólico de látex de la planta Euphorbia tirucalli .

EJEMPLO 1 La siguiente prueba se realizó con la línea celular llamada J-Iat, derivada de los linajes de Jurkat, la cual funciona como un modelo in vitro del VIH-1 latente. De forma similar a las células T CD4+ en reposo infectadas con VIH-1 , las células J-Iat portan un genoma completo de VIH-1 integrado en las regiones del genoma celular que se pueden activar; sin embargo, la transcripción de estas regiones se inhibe temporalmente. Adicionalmente, el provirus latente integrado en las líneas celulares J-Lat codifica un gen GFP (proteína fluorescente verde), proporcionando así un reportero fluorescente de la actividad transcripcional del VIH-1. Estas células se trataron con TNF-a (20 ng/ml) para re-activación viral como control positivo y el efecto se comparó con la mezcla de derivados de ingenol Z1. La expresión de genes virales de inmunodeficiencia humana se monitoreó por medio del gen reportero GFP durante 48 a 72 horas después del tratamiento con TNF-a a través de citometría de flujo.

Las células del clon J-Iat 6.3 y 8.4 (proporcionado por el Dr. B. Matija Peterlin, Universidad de California, San Francisco, CA, EE.UU.) se mantuvieron en medio de cultivo RPMI (Instituto Rosewell Park Memorial -vendido por Invitrogen, EE.UU.) que contiene 10 % de FBS (suero bovino fetal). Las células del clon J-Iat 6.3 y 8.4, en una concentración de 106 células/mL, se indujeron con diferentes concentraciones del Kyoll derivado por 24 horas y se usó TNF-a como control positivo a una concentración de 20 ng/mL.

Después del paso de inducción, las células se lavaron con medio RPMI y después se re-suspendieron en medio RPMI que contiene 10 % de suero bovino fetal y se cultivaron por más de 24 horas para obtener la inducción del virus latente.

Después de la inducción, 30,000 células se leyeron en un citómetro de flujo BD-Excalibur (Beckton Dickinson Company and Co., EE.UU.) para leer células que expresan la proteína del marcador GFP. Una muestra celular no se indujo y se mantuvo 48 horas en cultivo para servir como control simulado (referido como "simulacro"), marcando así la inducción espontánea del provirus (antecedentes).

El histograma de las Figuras 1A y 1B muestra que la muestra de Kyoll, después de inducción por 24 horas, pudo activar el virus latente presente en los clones J-Iat 6.3 y 8.4 de una manera dependiente de la dosis, e incluso en dosis muy bajas (0.4 pm) pudo inducir hasta 8 % de las células del clon J-Iat 6.3 y 8.4 en cultivo, y a una concentración de 40 pm indujo casi 30 % de las células, superando así la potencia de TNF-a.

La Figura 1C muestra histogramas que presentan datos en bruto obtenidos del software Cellquest (Becton Dickinson and Company, EE.UU.) que muestran la inducción de latencia en un clon J-Iat 6.3, siguiendo el mismo protocolo citado anteriormente con 4 pm de Kyoll. En este caso se usaron 20 ng de TNF-a como control positivo y los resultados también se muestran como porcentaje de células inducidas.

EJEMPLO 2 Toxicidad En esta prueba se verifica que los derivados en la mezcla de Kyoll del Ejemplo , a concentraciones que inducen la latencia en células J-Iat, no son citotóxicos para células PBMC humanas. Así, las células PBMC humanas a una concentración de 106 células/mL se cultivaron en medio RPMI con 10 % de suero bovino fetal, se expusieron a diferentes concentraciones de Kyoll y se dejaron en cultivo por 72 horas. Después de la exposición, las células se tiñeron con yoduro de propidio. Así, las células se centrifugaron a 1000 G por 3 minutos y se lavaron con el mismo volumen con 1 x de PBS (sin Ca2+ y Mg2+, No. de Cat. 9240, Irvine Scientific Company, EE.UU.) que contiene 2 % de suero bovino fetal. PBS, o "Solución Salina de Regulador de pH de Fosfato" es solución salina de pH regulado con fosfato. Este lavado se repitió 3 veces y las células se suspendieron en 1 X PBS que contiene 500 g de yoduro de propidio y se dejó incubar por 5 minutos a 4 °C hasta que se leyó por medio de citometría de flujo. Después de la incubación se leyeron 30,000 células en un citómetro de flujo BD-Excalibur. Con este protocolo fue posible ver la cantidad de células con ADN degradado o en etapas avanzadas de apoptosis (Figura 2). Fue posible observar que, para concentraciones de hasta 10 µ?, el derivado de ingenol no es citotóxico para células PBMC y hubo un 100 % de muerte a 100 µ?t?.

EJEMPLO 3 Verificación de citotoxicidad vs. reactivación Este ejemplo apuntó a correlacionar los efectos de citotoxicidad y la reactivación del virus de inmunodeficiencia humana tanto para la mezcla de Kyoll de derivados de ingenol, en donde Z = Z1 de los Ejemplos 1 y 2 anteriores, como para 3 derivados de ingenol de la Fórmula I, en donde Z = Z2, indicado anteriormente como A, B y C. En estos casos, se indujo una concentración de 106 células/mL de J-Iat 6.3 con diferentes concentraciones de Kyoll, A, B y C por 24 horas. Después del paso de inducción, las células se lavaron con medio RPMI y se re-suspendieron en medio RPMI que contiene 10 % de suero bovino fetal y se cultivaron por otras 24 horas para la inducción del virus latente.

Después de la inducción, 30,000 células se leyeron en un citómetro de flujo BD-Excalibur para leer células que expresan la proteína del marcador GFP. Una muestra celular no se indujo y se mantuvo 48 horas en cultivo para servir como control simulado (referido como "simulacro"), marcando así la inducción espontánea del-provirus (antecedentes). La técnica de tinción con yoduro de propidio se usó para medir la citotoxicidad de los compuestos. Así, las células se centrifugaron a 1000 G por 3 minutos y se lavaron con el mismo volumen con 1 x de PBS (sin Ca2+ y Mg2+, No. de Cat. 9240, Irvine Scientific Company, EE.UU.) que contiene 2 % de suero bovino fetal. Este lavado se repitió 3 veces y las células se suspendieron en 1 x PBS que contiene 500 ig de yoduro de propidio y se incubó por 5 minutos a 4 °C hasta que se leyó por medio de citometría de flujo. Después de la incubación se leyeron 30,000 células en un citómetro de flujo BD-Excalibur (Beckton Dickinson and Co., EE.UU.). Con este protocolo fue posible ver precisamente la cantidad de células con ADN degradado o en etapas avanzadas de apoptosis midiendo con precisión la viabilidad celular (Figura 2). Los resultados se graficaron en una gráfica compuesta, la cual comparó la habilidad de inducción de compuestos contra su actividad citotóxica.

EJEMPLO 4 Prueba con células humanas positivas para el virus de inmunodeficiencia humana originadas de pacientes bajo tratamiento anti-retroviral En este experimento se puso a prueba la habilidad del derivado de ingenol de la Fórmula I, en donde Z = Z2, mencionado como B, de células latentes de activación de pacientes que ya estaban bajo tratamiento anti-retroviral por más de 1 año con carga viral indetectable. Se seleccionó un paciente (identificado como MLV), que ya había estado bajo tratamiento con zidovudina + lamivudina (AZT + 3TC) y efavirenz por más de 14 meses, con carga viral detectable y CD4 > 500 células/mm3. Se recolectaron 20 mL de sangre del paciente en un tubo de EDTA (ácido etileno diamina tetra acético) y las células de PBMC se aislaron y se colocaron en medio de cultivo RPMI con 10 % de suero bovino fetal y 50 lU/mL de IL2 (interleucina 2), y se cultivaron en 2 botellas con 5 mL de células idénticas (106/mL) con diferentes composiciones selectivas. Se agregaron 10 µ? de efavirenz (antiviral) a la botella control para bloquear la replicación viral que eventualmente surgiría de las células cultivadas. En otra botella de prueba se incluyeron tanto efavirenz (10 µ?) como el derivado B de la invención (1 µ?). Ambas botellas se cultivaron a 37 °C por 72 horas y después se extrajo el ARN intracelular de las PBMC con un kit RNEasy (QiaGen Company, EE.UU.) y se dosificó la cantidad de ARN genómico de VIH-1 por medio de reacción de PCR en tiempo real semi-anidada usando iniciadores que se hibridizan con la región gag del genoma del VIH-1 tomando el ARN viral no empalmado GAG1 Sentido I, II ((5' TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT 3'; posición del genoma 1280-1303; TM = 58.3 °C) y SK431 antisentido I (5' TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT 3'; posición del genoma 1474-1500; TM = 61.5 °C) en 10 rondas de PCR y seguido por una reacción en tiempo real semi-anidada con iniciadores GAG1 Sentido I, II (5' TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT3'; posición del genoma 1280-1303; TM = 58.3 °C) y antisentido AG2 II (5' CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT 3'; posición del genoma 1341-1362 55.1 TM = 57 °C) e identificado con la sonda GAG3 (FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-TAMRA; posición del genoma 131 1-1337; TM = 61 °C). La reacción en tiempo real PCR semi-anidada para detectar ARNv de VIH-1 se llevó a cabo de la siguiente manera: el ARN celular extraído se diluyó 10 veces en agua y se trató con ADNasa I (Invitrogen Corporation, EE.UU.) por 15 minutos para eliminar cualquier rastro de ADN proviral. Después la ADNasa se desactivó bajo incubación a 70 °C por 10 minutos en presencia de 1 mM de EDTA y 50 mM de DTT (ditiotreitol). Las transcripción reversa de ARN se condujo con iniciadores de hexámero aleatorio y SuperScript III (enzima comercial para síntesis de ADNc, de Invitrogen, EE.UU.) a 42 °C por 60 minutos. El ADNc después se sometió a reacciones de PCR. El par de iniciadores usados en la 1ra ronda de PCR fue GAG1 y SK431 que amplifica la región interior gag del VIH-1. Esta primera ronda se corrió en una máquina convencional de PCR en un volumen de 25 pL con 5 µ?_ de ADNc, 20 mM de tris(hidroximetil)aminometano (pH 8.3), 50 mM de KCI, 2 mM de MgCI2, 0.4 mM de DNTPs (trifosfatos de deoxinucléotido) y 1 U de Ampli-Taq (ADN polimerasa, de Applied Biosystems, EE.UU.) y 50 ng de cada iniciador. Las condiciones de PCR fueron: 94 °C por 3 minutos, seguido por 15 ciclos a 94 °C por 30 segundos, 55 °C por 30 segundos y 72 °C por 1 minuto. El producto de esta primera PCR se sometió a una 2da PCR en tiempo real semi-anidada, en una PCR en tiempo real de una máquina ABI Prism 7000 (de Applied Biosystems, EE.UU.) usando una mezcla de reacción_TaqMan en un volumen total de 25 µ?, con 2 µ? de la 1 ra ronda diluidos 50 veces con 0.2 pm de los iniciadores GAG1 y GAG2, y 0.2 µ?? de la sonda FAM GAG3. Las condiciones de PCR en tiempo real fueron: 50 °C por 2 minutos y 95 °C por 10 minutos, seguido por 50 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. Los tamaños de los amplicones fueron 221 pb para la 1ra ronda y 83 pb para la PCR (en tiempo real).

Se puede observar en la Figura 7 que los cultivos de PBMC del paciente MLV que contienen 10 µ? de efavirenz no produjeron ARNv intracelular y, por lo tanto, no generaron producto detectable en PCR semi-anidada en tiempo real.

Por otro lado, en el cultivo de PBMC en el que se agregaron 10 pm de efavirenz y 1 µ? de derivado B de la invención - Figura 8 - se verificó la emergencia de ARNv de VIH-1 intracelular, una señal del virus latente de inmunodeficiencia humana en estas células.

EJEMPLO 5 Regulación a la baja del receptor CD4 sobre la superficie de linfocitos T CD4+ v macrófaqos y monos de cola de cerdo (Macaca nemestrina) En esta prueba se verifica que los derivados de ingenol de la Fórmula I cuando Z = Z2, a concentraciones que activan el virus de inmunodeficiencia humana de latencia en células de J-Iat en el Ejemplo 3, regulan a la baja la expresión del receptor celular CD4 sobre la superficie del virus de inmunodeficiencia humana y los linfocitos T y macrófagos CD4+ del SIV de mono de cola de cerdo. Para este experimento se aislaron células PBMC de humanos y de monos de sangre periférica con aislamiento a través del gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (mezcla de polisacáridos neutrales hidrofílicos de alta densidad que se disuelve fácilmente en solución acuosa. "Ficoll" es una marca registrada de GE Healthcare Bio-Sciences, EE.UU.). Así, las células PBMC de humanos y monos, a una concentración de 106 células/mL, se cultivaron en medio RPMI con 10 % de suero bovino fetal por 24 horas y las células adheridas (monocitos que se diferencian en macrófagos) se separaron del sobrenadante celular que contenía los linfocitos totales. Esas dos poblaciones distintas de células se expusieron a diferentes concentraciones de derivados A, B y C de la invención, y se dejaron en cultivo por 72 horas. Después de la exposición, las células se tiñeron con monoclonales de linfocito específicos (anti-CD3) y monocitos/macrófagos (anti-CD14) simultáneamente con un anti-CD4. Así, las células se centrifugaron a 1000 G por 3 minutos y se lavaron con el mismo volumen de PBS (sin Ca2+ y Mg2 +, No. de Cat. 9240, Irvine Scientific, EE.UU.) que contiene 2 % de suero bovino fetal. Este lavado se repitió 3 veces y las células se suspendieron en 1 x PBS que contiene una dilución de 1/1000 de anticuerpos relevantes y se dejó incubar por 30 minutos a 4 °C hasta que se leyó en citometría de flujo. Después de la incubación, 30,000 células se leyeron en un citómetro de flujo BD-Excalibur (de Beckton Dickinson y Co., EE.UU.) y las poblaciones se separaron y se estimó la densidad del receptor CD4 a diferentes concentraciones del derivado B, asumiendo que la densidad celular sin el derivado B es del 100 %. Las moléculas ya conocidas por regular a la baja el CD4 también se colocaron en estos experimentos, para propósitos de comparación con los derivados A, B y C, como prostatina, briostatina y PMA (forbol12-miristato-13-acetato, un forboldiéster).

Se hace notar que los derivados de ingenol Z2 de la invención pudieron regular a la baja la expresión del receptor CD4 VIH-1 sobre la superficie de linfocitos humanos (Figura 11) y de Macaca nemestrína (Figura 9). De forma similar, estos compuestos también regularon a la baja el CD4 sobre monocitos/macrófagos humanos (Figura 12) y de Macaca nemestrína (Figura 10). Fue sobresaliente el poder superior de los derivados de ingenol 72 en la regulación a la baja de CD4 de células de mono cuando se comparó con moléculas comparativas (prostatina, briostatina y P A, véanse las Figuras 9 y 10).

Los derivados de ingenol A, B y C pudieron regular a la baja el receptor principal del virus de inmunodeficiencia humana (CD4) sobre la superficie de las células marcadas por infección. Así, se ha probado que los derivados de ingenol de la invención, además de activar el virus de inmunodeficiencia humana de la latencia, entorpecen el curso de la infección viral bloqueando su entrada en células nuevas.

EJEMPLO 6 Procedimiento para obtener ingenol a partir de una fracción activa resultante de la separación cromatográfica de extracto butanólico de látex de Euphorbia tirucalli L. (en lo sucesivo fuente de ingenoñ, descrito en la solicitud de patente internacional WO2007000618 Se llevó a cabo una reacción de hidrólisis con 18 g de fuente de ingenol eluidos en 300 ml_ de metanol y 6 mL de metóxido de sodio. La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 30 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ?t?, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mL/min. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo.

La reacción se neutralizó con 1 mi de ácido acético glacial. La purificación subsecuente se condujo en 75 % de solución de acetato de etilo en heptano aplicada en una columna instantánea que contiene 300 g de sílice. La columna se balanceó con el mismo solvente. El ingenol se eluyó en 100 g de acetato de etilo. La elución se monitoreó con un detector UV a 290 nm. Las fracciones combinadas se evaporaron.

EJEMPLO 7 Preparación del intermediario ingenol-5.20-acetónido para proteger los grupos hidroxilo 5 v 20 Se condujo una reacción para formación de acetónido de ingenol en 7.34 g de ingenol hidrolizado a partir del Ejemplo 6 (1.00 equiv.; 21.1 mmoles) eluido en 250 mL de acetona (34.1 volEquiv) con 76.0 mg de ( S)-(+)-10-ácido sulfónico de alcanfor (C2107; 0.0104 en peso Equiv.; 99 %). La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 15 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ??, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mUmin. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo. Después de 1.5 horas de reacción, se detectaron 78 % de acetónido de 5,20-ingenol y 9.8 % de ingenol. La reacción se neutralizó con 140 µ?_ de trietilamina (47.9 mEq; 1 .01 mmoles). La purificación del acetónido de 5,20-ingenol se condujo por evaporación a 35 °C/30 minutos/10 Torr, seguido de cristalización de tolueno.

EJEMPLO 8 Esterificación de 5.20 acetónido. seguida por desprotección del intermediario obtenido, para preparar cinamato de ingenol (Ejemplo A de la estructura de la Fórmula III para Z = Z2) Esterificación 3.60 g de acetónido de 5,20-ingenol (1.00 equiv.; 9.27 mmoles), producidos de conformidad con el Ejemplo 7, se eluyeron en 80 mL de acetonitrilo (22.2 volEquiv) con 3.09 g de anhídrido cinámico (1.50 equiv.; 13.9 mmoles y 4.53 g de carbonato de cesio (1.50 equiv.; 13.9 mmoles).

La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 15 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ?t?, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mL/min. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo.

Este intermediario obtenido, cinamato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3, después se sometió a extracción y purificación.

Se realizó la extracción del producto de este paso del paso de síntesis en diclorometano y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr. Esto fue seguido por purificación a través de solubilización en 5 % de acetato de etilo en heptano, y después se aplicó en columna instantánea que contiene 80 g de sílice. La columna se equilibró con el mismo solvente. A partir de entonces, la columa se lavó con 5 % de acetato de etilo en solución de heptano. El intermediario de cinamato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 se eluyó en 10 % de acetato de etilo en solución de heptano. La elución se monitoreó por medio de HPLC con un detector UV a 290 nm. Las fracciones combinadas se evaporaron a 35 °C/30 minutos/10 mbares.

Desprotección Para la desprotección de la estructura intermedia, 4.46 g de cinamato de 5,20-¡sopropilideno-ingenol-3 (1.00 equiv., 8.29 mmoles; 96 %) se eluyeron en 80 mL de metanol (19.9 volEquiv) más 4.60 mL de ácido clorhídrico 1 N (1M; 0.555 equiv.; 4.60 mmoles). Esto fue seguido por extracción con tolueno y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr.

El cinamato de ingenol-3 se obtuvo con pureza o cerca del 97 %.

EJEMPLO 9 Esterificación de 5.20 acetónido. seguida por desprotección del intermediario obtenido, para preparar caproato de ingenol 3 (Ejemplo B de la estructura de la Fórmula III. para Z = Z2) Esterificación 3.60 g de acetónido de 5,20-ingenol (1.00 equiv.; 9.27 mmoles), producidos de conformidad con el Ejemplo 7, se eluyeron en 80 mL de acetonitrilo (22.2 volEquiv) con 2.98 g de anhídrido caproico (1.50 equiv.; 13.9 mmoles) y 4.53 g de carbonato de cesio (1.50 equiv.; 13.9 mmoles).

La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 15 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ?t?, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mUmin. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo.

Este intermediario obtenido, caproato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3, después se sometió a extracción y purificación.

Se realizó la extracción del producto de este paso del paso de síntesis en diclorometano y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr. Esto fue seguido por purificación a través de solubilización en 5 % de acetato de etilo en heptano, y después se aplicó en columna instantánea que contiene 80 g de sílice. La columna se equilibró con el mismo solvente. A partir de entonces, la columa se lavó con 5 % de acetato de etilo en solución de heptano. El intermediario de caproato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 se eluyó en 10 % de acetato de etilo en solución de heptano. La elución se monitoreó por medio de HPLC con un detector UV a 290 nm. Las fracciones combinadas se evaporaron a 35 °C/30 minutos/10 mbares.

Desprotección Para la desprotección de la estructura intermedia, 4.20 g de caproato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 (1.00 equiv., 8.29 mmoles; 96 %) se eluyeron en 80 mL de metanol (19.9 volEquiv) más 4.60 mL de ácido clorhídrico 1 N (1M; 0.555 equiv.; 4.60 mmoles). Esto fue seguido por extracción con tolueno y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr.

El caproato de ingenol-3 se obtuvo con pureza o cerca del 97 %.

EJEMPLO 10 Esterificación de 5,20 acetónido, seguida por desprotección del intermediario obtenido, para preparar dodecanoato de ingenol 3 (Ejemplo C de la estructura de la Fórmula III. para Z = Z2) Esterificación 3.60 g de acetónido de 5,20-ingenol (1.00 equiv.; 9.27 mmoles), producidos de conformidad con el Ejemplo 7, se eluyeron en 80 mL de acetonitrilo (22.2 volEquiv) con 4.17 g de ácido dodecanoico (1.50 equiv.; 13.9 mmoles) y 4.53 g de carbonato de cesio (1.50 equiv.; 13.9 mmoles).

La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 15 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ?t?, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mL/min. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo.

Este intermediario obtenido, dodecanoato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3, después se sometió a extracción y purificación.

Se realizó la extracción del producto de este paso del paso de síntesis en diclorometano y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr. Esto fue seguido por purificación a través de solubilización en 5 % de acetato de etilo en heptano, y después se aplicó en columna instantánea que contiene 80 g de sílice. La columna se equilibró con el mismo solvente. A partir de entonces, la columa se lavó con 5 % de acetato de etilo en solución de heptano. El intermediario de dodecanoato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 se eluyó en 10 % de acetato de etilo en solución de heptano. La elución se monitoreó por medio de HPLC con un detector UV a 290 nm. Las fracciones combinadas se evaporaron a 35 °C/30 minutos/10 mbares.

Desprotección Para la desprotección de la estructura intermedia, 4.90 g de dodecanoato de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 (1.00 equiv., 8.29 mmoles; 96 %) se eluyeron en 80 mL de metanol (19.9 volEquiv) más 4.60 mL de ácido clorhídrico 1 N (1 M; 0.555 equiv.; 4.60 mmoles). Esto fue seguido por extracción con tolueno y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr.

El dodecanoato de ingenol-3 se obtuvo con pureza o cerca del 97 %.

EJEMPLO 11 Esterificación de 5,20 acetónido. seguida por desprotección del intermediario obtenido, para preparar inqenol de dodec-11-enoílo de ingenol 3 (Ejemplo D de la estructura de la Fórmula III, para Z = Z2) Esterificación 3.60 g de acetónido de 5,20-ingenol (1.00 equiv.; 9.27 mmoles), producidos de conformidad con el Ejemplo 7, se eluyeron en 80 mL de acetonitrilo (22.2 volEquiv) con 4.13 g de ácido 11-dodecanoico (1.50 equiv.; 13.9 mmoles) y 4.53 g de carbonato de cesio (1.50 equiv.; 13.9 mmoles).

La reacción se monitoreó por medio de análisis de HPLC cada 15 minutos a 214 y 290 nm en YMC Pro C18, 4.6 x 50 mm, columna de 3 µ??, con gradiente A-B de 5 a 70 % en 7 minutos, en 1.5 mIJmin. Solventes: solvente A - 0.1 % de TFA en agua, solvente B - 0.08 % de TFA en acetonitrilo.

Este intermediario obtenido, dodec-11-enoilo de 5,20-isopropilideno-ingenol-3, después se sometió a extracción y purificación.

Se realizó la extracción del producto de este paso del paso de síntesis en diclorometano y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr. Esto fue seguido por purificación a través de solubilización en 5 % de acetato de etilo en heptano, y después se aplicó en columna instantánea que contiene 80 g de sílice. La columna se equilibró con el mismo solvente. A partir de entonces, la columa se lavó con 5 % de acetato de etilo en solución de heptano. El intermediario de dodec-11-enoilo de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 se eluyó en 10 % de acetato de etilo en solución de heptano. La elución se monitoreó por medio de HPLC con un detector UV a 290 nm. Las fracciones combinadas se evaporaron a 35 °C/30 minutos/10 mbares.

Desprotección Para la desprotección de la estructura intermedia, 4.88 g de dodec-11-enoilo de 5,20-isopropilideno-ingenol-3 (1.00 equiv., 8.29 mmoles; 96 %) se eluyeron en 80 mL de metanol (19.9 volEquiv) más 4.60 mL de ácido clorhídrico 1 N (1M; 0.555 equiv.; 4.60 mmoles). Esto fue seguido por extracción con tolueno y agua. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se evaporó a 35 °C/30 minutos/10 Torr.

El experto en la técnica puede evaluar fácilmente, por medio de las enseñanzas contenidas en el texto y los ejemplos presentados, las ventajas de la invención, así como proponer modificaciones y alternativas equivalentes a las modalidades no presentadas expresamente en la presente, sin apartarse del alcance de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (28)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES El uso de uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I Fórmula I para preparar un medicamento para el tratamiento de la infección por el virus de inmunodeficiencia humana o tratamiento del SIDA, en donde Z es Z1 o 22 de modo que cuando Z es Z1 , x e y son enteros, x varía entre 2 y 10 e y varía entre 2 y 7; y cuando Z es Z2, A es fenilo, CH3- o CH2=CH-, y (B) es -CH=CH-, [-CH2-]q o [-CH2-]w. en donde q es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 2 y 6, y w es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 8 y 10, a condición de que: cuando A es fenilo, B es - CH=CH-; cuando A es CH3-, B es [-CH2-]q; cuando A es CH2=CH-, B is [-CH2"]w.
2. 2.- El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dichos uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I tienen la estructura
3. 3. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde cuando Z es Z1 , x varía entre 3 y 5 e y varía entre 3 y 4.
4. 4. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde cuando Z es Z1 , dichos derivados de ingenol son uno o más entre 3-(2,4,6-dodecatrienoilo)-ingenol y/o 3-(2,4,6,8-tetradecatetranoilo)-ingenol.
5. 5. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , en donde cuando Z es Z2, dichos derivados son uno o más entre A, B, C y D:
6. 6.- El uso de uno o más derivados de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 para preparar un producto para la reactivación del virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales del cuerpo humano.
7. 7. - Una asociación farmacéutica útil para el tratamiento de la infección por el virus de inmunodeficiencia humana, caracterizada en que comprende uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 y al menos un agente anti-retroviral activo contra virus bajo replicación activa.
8. 8. - La asociación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho al menos un agente anti-retroviral activo contra virus que se replican activamente se selecciona entre inhibidores de transcriptasa reversa nucleósidos o no-nucleósidos, inhibidores de proteasa, antagonistas de co-receptor, inhibidores de integrase retroviral, inhibidores de adsorción viral, inhibidores de transcripción viral específica, inhibidores de cinasa dependientes de ciclina y combinaciones de los mismos.
9. 9. - La asociación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I y dicho uno o más agentes anti-retrovirales están comprendidos en la misma forma de dosificación.
10. 10. - Una composición farmacéutica útil para tratar la infección por el virus de inmunodeficiencia humana, caracterizada en que contiene una asociación de conformidad con la reivindicación 7 y excipientes farmacéuticamente aceptables.
11. 11. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque contiene adicionalmente otro(s) principio(s) activo(s) diferente(s) de derivados de ingenol de la Fórmula I, o de agentes anti-retrovirales activos contra virus que se replican activamente.
12. 12. - Una composición farmacéutica útil en la reactivación de virus latentes de inmunodeficiencia humana en depósitos virales en el cuerpo humano, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada en que comprende uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1.
13. 13. - Un adyuvante útil para tratar la infección causada por el virus de inmunodeficiencia humana, caracterizado en que comprende uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 y excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. 14.- La asociación de conformidad con la reivindicación 7, para usarse en el tratamiento de una infección por el virus de inmunodeficiencia humana en un paciente.
15. 15.- La asociación para usarse de conformidad con la reivindicación 14, en donde los componentes de dicha asociación están adaptados para ser administrables concomitante o secuencialmente.
16. 16. - Uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 , para usarse en la reactivación del virus latente de inmunodeficiencia humana en depósitos virales en el cuerpo humano.
17. 17. - La asociación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, para usarse en terapia médica.
18. 18. - La asociación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para usarse en terapia médica.
19. 19.- El adyuvante de conformidad con la reivindicación 13, para usarse en terapia médica.
20. 20.- Uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1, para usarse para ayudar en el tratamiento de infección por el virus de inmunodeficiencia humana o prevención del SIDA.
21. 21.- El uso de una asociación de conformidad con la reivindicación 7, para preparar un medicamento para el tratamiento de una infección por el virus de inmunodeficiencia humana en un paciente.
22. 22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde los componentes del medicamento están adaptados para ser administrables concomitante o secuencialmente.
23. 23. - El uso de uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para ayudar en el tratamiento de la infección por el virus de inmunodeficiencia humana o en la prevención del SIDA.
24. 24. - Uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I Fórmula I para usarse en el tratamiento de la infección por el virus de inmunodeficiencia humana o tratamiento del SIDA, en donde Z es Z1 o Z2 de modo que cuando Z es Z1 x e y son enteros, x varía entre 2 y 10 e y varía entre 2 y 7; y cuando Z es Z2, A es fenilo, CH3- o CH2=CH-, y (B) es -CH= CH-, [-CH2-]q o [-CH2-]W, en donde q es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 2 y 6, y w es un entero que varía entre 1 y 10, preferiblemente entre 8 y 10, a condición de que: cuando A es fenilo, B es -CH=CH-¡ cuando A es CH3-, B es [-CH2-]q; cuando A es CH2=CH-, B es [-CH2-]W.
25. 25.- Uno o más derivados de ingenol para usarse de conformidad con la reivindicación 24, en donde dichos uno o más derivados de ingenol de la Fórmula I tienen la estructura
26. 26. - Uno o más derivados de ingenol para usarse de conformidad con la reivindicación 24, en donde, cuando Z es Z1 , x varía entre 3 y 5 e y varía entre 3 y 4.
27. 27. - Uno o más derivados de ingenol para usarse de conformidad con la reivindicación 24, en donde, cuando Z es Z1 , dichos derivados de ingenol son uno o más entre 3-(2,4,6-dodecatr¡enoil)-ingenol y/o 3-(2,4,6,8-tetradecatetranoil)-ingenol.
28. 28. - Uno o más derivados de ingenol para usarse de conformidad con la reivindicación 24, en donde, cuando Z es Z2, dichos derivados son uno o más entre A, B, C y D: ??