JP6280510B2 - 潜伏ｈｉｖウイルスの再活性化におけるインゲノール誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、一般的にウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶウイルスの再活性化剤としてある種のインゲノール誘導体の使用に関する。別の態様において、本発明は、上記インゲノール誘導体と活発に複製するウイルスに対して実質的に作用する抗‐レトロウイルス薬とを含む組み合わせ及び組成物に関する。

発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、免疫系の破壊の結果、生命を脅かす日和見感染に生体が適切に反応できなくなることを特徴とする致死的な病気であるＡＩＤＳ（即ち、後天性免疫不全症候群）の原因となる病原体として知られている。

高活性抗‐レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴとして知られている）は、ＨＩＶ複製を抑制するために使用されている。それは、逆転写酵素阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤及び侵入阻害剤を含む活性抗‐レトロウイルス化合物を少なくとも３種用いる抗‐ＡＩＤＳ「カクテル」として一般的に知られている治療法のみから構成される。

しかしながら、感染者では、潜伏的に感染されたＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞（即ち、宿主細胞のゲノムに組み込まれた残留潜伏ＤＮＡを含有している細胞）のリザーバー由来のウイルスは、ＨＡＡＲＴ療法の中断後にウイルスの複製を素早く回復する。

従って、そのような持続的な潜伏感染が克服されない場合、ＨＩＶは慢性的にウイルス感染をおこし続ける。

従来技術における理論的根拠によれば、そのようなリザーバーに含有される潜伏ウイルスの活性化は、抗‐レトロウイルス薬の存在下で、体免疫系がそれらを検出することができ且つウイルスに対する活性薬剤にそれらがアクセスできるようにすることを意図するものであり、これによって、宿主の免疫系の反応によって及び／又は細胞でアポトーシスが引き起されるように、ウイルスタンパク発現細胞を破壊し、その結果、抗‐レトロウイルス薬の作用によりリザーバーから出てきたウイルスの複製が阻害されるため、ＨＩＶの持続的な潜伏感染リザーバーが排除され、感染が全て根絶される。

言い換えると、潜伏感染の選択的な誘発は、抗‐レトロウイルス薬及び抗ウイルス免疫反応が、残留するＨＩＶ感染にアクセスして根絶することを可能にする。即ち、抗‐レトロウイルス薬を後で使用することなく免疫系を一時的に安定化することのみならず、人間の体内でＨＩＶ感染を完全に抑えることを可能にする。

発明の詳細な説明
「活発な複製状態下にあるウイルスに対する活性抗レトロウイルス剤」との記載は、人間の体内でＨＩＶウイルスリザーバーに対して、実質的には作用しない又は限られた状態でのみ作用する薬剤に関すると、以下、本文中で認識される。

本発明の、第１の態様は、以下の１種又はそれ以上の式I：
式I
のインゲノール誘導体の使用に関するものであり、ＨＩＶ感染の治療又はＡＩＤＳ治療における製品のアジュバントの調製において使用され、式中ＺはＺ１
又はＺ２
であり、
Ｚ＝Ｚ１の場合、本発明のインゲノール誘導体は以下の式II：
式II
として描かれるインゲノール誘導体であって、
ｘ及びｙは整数であり、ｘは２から１０及びｙは２から７である。

式IIは特に、ｘは３から５及びｙは３から４である。式IIの具体的な実施形態を挙げると、式中ｘ＝３及びｙ＝４：
３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）―インゲノール)、並びに式中ｘ＝４及びｙ＝４：
(３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル)―インゲノール)である。

式Iに関して、Ｚ＝Ｚ２の場合、本発明のインゲノール誘導体は以下の式III：
式III
として描かれ、
Ａはフェニル、ＣＨ_３又はＣＨ_２＝ＣＨ−であり、Ｂは−ＣＨ＝ＣＨ−、［−ＣＨ_２−］_ｑ又は［−ＣＨ_２−］_ｗであり、式中ｑは１から１０、特に２から６の１つの整数であり、ｗは１から１０、特に８から１０の１つの整数であって：
Ａがフェニルの場合、Ｂは−ＣＨ＝ＣＨ−；
ＡがＣＨ_３−の場合、Ｂは［−ＣＨ_２−］_ｑ；
ＡがＣＨ_２＝ＣＨ−の場合、Ｂは［−ＣＨ_２−］_ｗが与えられる。

本発明に適する式IIIのインゲノール誘導体の具体的な例は、限定するものではないが、以下の構造式Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤである。

特に、本発明にかかる式Iのインゲノール誘導体は、以下のコンホメーションを示す。

この発明の趣旨によれば、「アジュバント」とは、特定の疾患又は症状の治療において、ある薬剤又は有効成分の作用と併用をする又は補助する薬剤又は有効成分である。単独で、病気又は疾患を効果的に治療し、治癒を実現するのは、「アジュバント」の一般的な独自の効果ではない（アジュバントは他の効果を含み得る）。

別の態様において、本発明は人間の体内のウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶウイルスの再活性化における上記式Iのインゲノール誘導体の使用に関する。それは医薬療法における使用である。

別の態様において、本発明は、ＨＩＶウイルス感染の治療又は予防に有効な組み合わせに関するものであって、１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体及び活発な複製状態下にあるウイルスに対する活性抗‐レトロウイルス薬を少なくとも１種、特にヌクレオシド又は非ヌクレオシド逆転写阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、共同受容体拮抗剤、レトロウイルスインテグラーゼ阻害剤、ウイルス吸着阻害剤、特定ウイルス転写阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤及びその組み合わせの中から選ばれる活性抗‐レトロウイルス薬を少なくとも１種含む。

この発明の目的によれば、「組み合わせ」とは、少なくとも式Iのインゲノール誘導体（化合物ａ）及び活発に複製するウイルスに対して実質的に作用する少なくとも１種の抗‐レトロウイルス薬（化合物ｂ）を含む、人へ投与するのに適切な用量、併用、混合、配合、製剤又は相当物の任意の形態をとるものとして認識される。

更に、本発明中で採用される意味によれば、「組み合わせ」は、少なくとも式Iのインゲノール誘導体（化合物a）及び少なくとも１種の抗レトロウイルス薬（化合物ｂ）を単一の投与量単位で（例えば、タブレット、カプセル、アンプル、バッグ等）又は様々な投与量単位で利用することができ、化合物（a）及び（ｂ）は、一緒に又は別々に、同時にでも又は経時にでも、患者への投与のために提供されると認識される。

本発明の組み合わせのための投与形態に特に制限はなく、すでに述べたもの以外に、リポソーム及びナノ粒子又は当業者により知られている任意の他の形態を包含する。

特に、本発明は、上記組み合わせと製剤上許容される医薬用添加物を含有する医薬組成物に関するものである。以下の刊行物は、そのような添加物の情報源として挙げられる：“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”、第20版又はその以降の版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｈｏｕｓｅ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ.Ｃ.Ａｎｓｅｌら、第7版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｈｏｕｓｅ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ&Ｗｉｌｋｉｎ；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”（２０００）Ａ.Ｈ.Ｋｉｂｂｅら、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕse.

別の態様において、本発明の組成物は、式Iのインゲノール及び抗レトロウイルス薬とは異なる他の有効成分を更に含有することもできる。特に、本発明の組成物は、式Iの上記インゲノール誘導体以外にも、人間の体内のウイルスリザーバー中の潜伏レトロウイルスを再活性化することができる１種又はそれ以上の化合物を含む。

別の態様において、本発明は、人間の体内のウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶを再活性化するために有効なアジュバントに関するものであり、１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体、及び製剤上許容される医薬用添加物を含むことを特徴とする。

別の態様において、本発明は、上に記載されたような、ＨＩＶの治療又は予防の方法に関するものであり、そのような治療を必要とする患者に組み合わせを投与するステップを含むことを特徴とする。上記治療は、同時に又は経時に、組み合わせの構成成分を投与するステップを含む。

更に、別の具体的な態様において、本発明は、人間の体内のＨＩＶウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶウイルスを再活性化するための方法に関するものであり、１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体を患者に投与するステップを含むことを特徴とする。

本発明に適するヌクレオシド系逆転写阻害剤の中で、限定するものではないが、化合物であるＡＺＴ（ジドブジン）、３ＴＣ（ラミブジン）、ｄ４Ｔ（スタブジン）、アバカビル、ｄｄｌ（ジダノシン)、ｄｄＣ（ザルシタビン）、ＦＴＣ（エムトリシタビン、ＰＭＰＡ（Ｒ）―９―（２−ホスホニルメトキシプロピル）アデニン）、テノホビル、アデホビル、アムドキソビル、エルブシタビン、アロブジン、ラシビル、アプリタビン（apricitibina）、ホスファジド（fosfazida）及びホジブジンチドキシルが挙げられる。

本発明に適する非‐ヌクレオシド系逆転写阻害剤の中で、限定するものではないが、化合物であるネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、ロビリド、エトラビリン、（＋）カラノリド、リルピビリン及びレルシビリンが挙げられる。

本発明に適するプロテアーゼ阻害剤の中で、限定するものではないが、化合物であるリトナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、サクイナビル、インジナビル、アタザナビル、アンプレナビル、ダルナビル、ホサンプレナビル及びチプラナビルが挙げられる。

本発明に適するインテグラ―ゼ阻害剤の中で、限定するものではないが、化合物であるラルテグラビル、エルビテグラビル及びドルテグラビルが挙げられる。

本発明に適する融合阻害剤の中で、限定するものではないが、化合物であるエンフビルチド及びチフビルチドが挙げられる。

本発明に適する共同受容体阻害剤の中で、限定するものではないが、ＣＣＲ５共同受容体阻害剤であるビクリビロック及びマラビロックが挙げられる。

本発明のインゲノール誘導体、複製しているウイルスに対して活性を有する活性抗レトロウイルス薬又はそれらを含有する本発明の組み合わせは、例えば、経口、非経口、静脈内、動脈内、腹腔内、経皮、舌下、直腸内、筋肉内、経頬(transbucal)、鼻腔内、リポソーム、吸入、膣内、皮下、内部脂肪内、眼球内、関節内又は鞘内といった任意の適切な経路で患者に投与することができ、カテーテル又はステント等を使用して投与することもできる。

本発明のインゲノール誘導体又は本発明の組み合わせで使用される投薬形態に関して特別な制限はない。例えば、タブレット、ピル、カプセル、細粒、ペレット等が経口投与用に使用される。液体経口投与溶液としては、分散液、懸濁液、エマルジョン、オイル等が使用される。

投薬形態は、即時の放出でも、時間をかけて又は制御されて放出するものであってもよい。

図１Ａは、本発明のインゲノール誘導体(以下、ＫｙｏＩＩ、上に示したマーカッシュ形式においてＺ＝Ｚ１)を種々の濃度で用いた、Ｊｌａｔ８．４クローンにおける潜伏からの誘発に関するグラフを示す。陽性コントロールとして２０ｎｇのＴＮＦ−αを使用した。結果は、誘発された細胞を％として示されている。 図１Ｂは、上に記載されたＫｙｏＩＩ誘導体を種々の濃度で用いた、Ｊｌａｔ６．３クローンにおける潜伏からの誘発に関するグラフを示す。陽性コントロールとして２０ｎｇのＴＮＦ−αを使用した。結果は、誘発された細胞を％として示されている。 図１Ｃは、上に記載されたＫｙｏＩＩ誘導体を４μｍ用いた、Ｊｌａｔ６．３クローンにおける潜伏からの誘発に関するグラフを示す。陽性コントロールとして２０ｎｇのＴＮＦ−αを使用した。結果は、誘発された細胞を％として示されている。 図２は、上に記載されたインゲノール誘導体ＫｙｏＩＩを種々の濃度で用いた、７２時間培養されたヒトＰＢＭＣ細胞（末梢血単核細胞）におけるアポトーシス活性を示すヒストグラムである。 図３は、インゲノール誘導体ＫｙｏＩＩに関する、Ｊｌａｔ６．３クローンにおけるＨＩＶ潜伏からの誘発及び対応する細胞毒性を示す複合グラフである。 図４は、Ａ誘導体（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、Ｊｌａｔ６．３クローンにおけるＨＩＶ潜伏からの誘発及び対応する細胞毒性を示す複合グラフである。 図５は、Ｂ誘導体（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、Ｊｌａｔ６．３クローンにおけるＨＩＶ潜伏からの誘発及び対応する細胞毒性を示す複合グラフである。 図６は、Ｃ誘導体（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、Ｊｌａｔ６．３クローンにおけるＨＩＶ潜伏からの誘発及び対応する細胞毒性を示す複合グラフである。 図７は、エファビレンツだけで治療された患者から得た血液細胞のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のグラフである。 図８は、エファビレンツ及び本発明のインゲノール誘導体Ｂで治療された患者から得た血液細胞のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のグラフである。 図９は、インゲノール誘導体ＫｙｏＩＩ（Ｚ＝Ｚ１の場合）及びインゲノール誘導体Ａ、Ｂ、及びＣ（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、ヒト及びサルのリンパ球表面上のＣＤ４ ＨＩＶ‐１受容体の下方制御を示している、フローサイトメトリー分析値である。 図１０は、インゲノール誘導体ＫｙｏＩＩ（Ｚ＝Ｚ１の場合）及びインゲノール誘導体Ａ、Ｂ、及びＣ（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、サルのリンパ球表面上のＣＤ４ ＨＩＶ‐１受容体の下方制御を示している、フローサイトメトリー分析値である。 図１１は、インゲノール誘導体ＫｙｏＩＩ（Ｚ＝Ｚ１の場合）及びインゲノール誘導体Ａ、Ｂ、及びＣ（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、ヒトのリンパ球表面上のＣＤ４ ＨＩＶ‐１受容体の下方制御を示している、フローサイトメトリー分析値である。 図１２は、インゲノール誘導体ＫｙｏＩＩ（Ｚ＝Ｚ１の場合）及びインゲノール誘導体Ａ、Ｂ、及びＣ（Ｚ＝Ｚ２の場合）に関する、ヒトのリンパ球表面上のＣＤ４ ＨＩＶ‐１受容体の下方制御を示している、フローサイトメトリー分析値である。

以下、本発明の実施例が与えられているが、本発明の限定は添付された請求項においてのみ述べられるため、このような実施例は本発明の趣旨を限定するものではない。

本発明のＺ１インゲノール誘導体
実施例１及び２は、式（I）の２種のインゲノール誘導体（Ｚ＝Ｚ１）である３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）−インゲノール（ｘ＝３及びｙ＝４）及び３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル）−インゲノール（ｘ＝４及びｙ＝４)の１：１の混合物（ジメチルスルホキシド溶液中において濃度２０ｍＭ）であり、本明細書中でＫｙｏＩＩと呼ばれる混合物に関する。このような溶液は、活性濃度を得るために培養液にて希釈して使用される。

実施例１
以下の試験は、潜伏ＨＩＶ‐１のｉｎ ｖｉｔｒｏのモデルとして働く、Ｊｕｒｋａｔ系統由来のＪ‐ｌａｔと呼ばれる細胞株で行われた。同様に、ＨＩＶ‐１ウイルスで感染された休止ＣＤ陽性Ｔ細胞と同様に、Ｊ−Ｌａｔ細胞は、活性化される可能性のある、細胞ゲノム領域に組み込まれたＨＩＶ‐１の完全なゲノムを保持するが、これらの領域の転写は一時的に阻害される。更に、Ｊ‐Ｌａｔ細胞株中に組み込まれた潜伏プロウイルスは、ＧＥＰ（緑色蛍光蛋白質）遺伝子をエンコードしているため、ＨＩＶ‐１の転写活性の蛍光リポーターを提供する。これらの細胞を、陽性のコントロールとしてウイルスの再活性化のためにＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理し、その効果をインゲノールＺ１誘導体の混合物と比較した。

ＨＩＶウイルス遺伝子の発現は、ＴＮＦ−αで処理後４８〜７２時間の間ＧＦＰリポーター遺伝子によりフローサイトメトリーでモニターされた。

Ｊｌａｔクローン細胞６．３及び８．４（Ｂ． Ｍａｔｉｊａ Ｐｅｔｅｒｌｉｎ博士、米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ、カリフォルニア大学、により提供された）は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含有するＲＰＭＩ培養液（米国 Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ- Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売された)中で保持された。Ｊｌａｔクローン細胞６．３及び８．４は、１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度において、２４時間の間、種々の濃度の誘導体ＫｙｏＩＩを用いて誘発させ、陽性コントロールとしては２０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを使用した。

この誘発ステップの後、細胞をＲＰＭＩ培養液で洗浄して、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ中に再び懸濁し、潜伏ウイルス誘発を得るために２４時間以上培養した。

誘発後、３０，０００の細胞を、ＧＦＰマーカー発現細胞を読み取るためにＢＤ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター （米国 Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ Ｃｏ．)で分析した。１つの細胞サンプルは誘発させず、偽コントロール（ＭＯＣＫと称される）として働くように培地で４８時間保持して、プロウイルスの自発的誘発を記録した（バックグラウンド）。

図１Ａ及び１Ｂのヒストグラムは、ＫｙｏＩＩサンプルが、２４時間の誘発後、Ｊｌａｔクローン６．３及び８．４において存在する潜伏ウイルスを濃度依存的に活性化することができ、たとえ非常に低い濃度（０．４μｍ）であっても培地におけるＪｌａｔクローン細胞の８％まで誘発することができ、４０μｍの濃度においては細胞のほぼ３０％近くを誘発させたことから、それがＴＮＦ−αの効果をしのいでいるということを示している。

図１Ｃは、４μｍのＫｙｏＩＩを用いて上に記載されたものと同じプロトコルに従って、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ（米国 Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ)で得られた生データを表わすヒストグラムである。この場合、陽性コントロールとして２０ｎｇのＴＮＦ−αを使用した。結果は、誘発された細胞を％として示されている。

実施例２ 毒性
実施例１のＫｙｏＩＩ混合物中の誘導体は、Ｊ−ｌａｔ細胞において潜伏ウイルスを誘発する濃度では、ヒトＰＢＭＣ細胞への細胞毒性はないということが、この試験で確かめられる。従って、１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度のヒトＰＢＭＣ細胞を、１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ培養液中で培養して、種々の濃度のＫｙｏＩＩに曝して、７２時間培地に置いた。曝露後、細胞をエチレンジアミン四酢酸で染色した。しかる後、細胞を１０００Ｇで３分間遠心分離して、それと同じボリュームの２％ウシ胎児血清を含有する１×ＰＢＳ（Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋無し，Ｃａｔ Ｎｏ.９２４０，米国 Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ)で洗浄した。ＰＢＳ又は「リン酸緩衝塩類溶液」はリン酸を用いて緩衝処理された生理食塩水である。この洗浄を３回繰り返し、細胞を５００μｇのヨウ化プロピジウムを含有する１×ＰＢＳ中に懸濁して、フローサイトメトリーで分析されるまで、５分間４℃でインキュベーションした。インキュベーション後、３０，０００の細胞をＢＤ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで分析した。このプロトコルを用いると分解されたＤＮＡを有する細胞又はアポトーシスが進んだ段階にある細胞の量を知ることができた（図２）。１０μＭ迄の濃度では、インゲノール誘導体はＰＢＭＣ細胞に対する細胞毒性はないが、１００μＭでは１００％死んだ状態であったということが観察できた。

実施例３ 細胞毒性の立証 vs. 反応性
この実施例は、上の実施例１及び２のＺ＝Ｚ１であるインゲノール誘導体のＫｙｏII混合物、及びＺ＝Ｚ２であり上にＡ、Ｂ、及びＣと示される式Iの３種のインゲノール誘導体の両方に対する、細胞毒性の影響とＨＩＶの再活性化との関連性を示すことを目的とした。これらの場合において、１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度のＪＬａｔクローン細胞６．３を、種々の濃度のＫｙｏＩＩ、Ａ、Ｂ、及びＣを用いて２４時間誘発させた。誘発ステップの後、細胞をＲＰＭＩ培養液で洗浄して、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ中に再び懸濁し、潜伏ウイルスの誘発のために更に２４時間の間培養した。

誘発後、３０，０００の細胞を、ＧＦＰマーカータンパク発現細胞を読み取るためにＢＤ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（米国 Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ Ｃｏ．)で分析した。１つの細胞サンプルは誘発させず、偽コントロールとして培地に４８時間保持し（ＭＯＣＫと称される）、こうすることでプロウイルスの自発的誘発を記録した（バックグラウンド）。ヨウ化プロピジウムを用いた染色法を用いて、混合物の細胞毒性を測定した。然る後、細胞を１０００Ｇで３分間遠心分離して、それと同じボリュームの２％ウシ胎児血清を含有する１×ＰＢＳ（Ｃａ^２＋ 及びＭｇ^２＋無し、ＣａｔＮｏ.９２４０，ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ)で洗浄した。この洗浄を３回繰り返して、細胞を５００μｇのヨウ化プロピジウムを含有する１×ＰＢＳ中に懸濁し、フローサイトメトリーで分析されるまで５分間４℃でインキュベーションした。インキュベーション後、３０，０００の細胞をＢＤ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで分析した。このプロトコルを用いると、正確な細胞生存率で測定することにより、分解されたＤＮＡを有する細胞又はアポトーシスが進んだ段階における細胞の量を正確に知ることができる（図２）。結果は、構成図中にプロットしており、それらの細胞毒性に対する混合物の誘発能力を比較したものである。

実施例４ 抗‐レトロウイルス薬で治療中の患者由来のＨＩＶ陽性ヒト細胞の試験
この実験において、Ｂとして記載されている式Ｉのインゲノール誘導体（Ｚ＝Ｚ２）が、すでに１年以上の間抗‐レトロウイルス薬で治療してウイルス量が検出されない患者由来の潜伏細胞を活性化させる能力について試験した。すでにジドブジン＋ラミブジン（ＡＺＴ＋３ＴＣ）及びエファビレンツで過去１４か月の間治療してウイルス量が検出されていない、ＣＤ４＞５００Ｃｅｌｌｓ/ｍｍ^３の患者（ＭＬＶとして定義される）を選択した。２０ｍＬの血液を患者からＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）チューブに集めて、ＰＢＭＡ細胞を単離し、１０％ウシ胎児血清及び５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（インターロイキン２）を含有するＲＰＭＩ培養液中に置き、種々の選択的組成物と共に５ｍＬの同一細胞（１０^６／ｍＬ）を２本のボトル中で増殖させた。１０μＭのエファビレンツ（抗ウイルス薬）をコントロールのボトルに添加して、培養細胞から最終的には起こるであろうウイルスの複製を遮断した。もう１本のボトル中には、エファビレンツ（１０μＭ）及び本発明のＢ誘導体（１μＭ）の両方を含めた。両方のボトルを３７℃で７２時間培養して、その後ＰＢＭＣ由来の細胞内ＲＮＡをＲＮＥａｓｙキット（米国 ＱｉａＧｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）で抽出し、そのＨＩＶ‐１ゲノムＲＮＡの量を、ＨＩＶ‐１ゲノムのｇａｇ領域とハイブリダイズするプライマーである非切断ウイルスＲＮＡ ＧＡＧ１ センスI、II（（５‘ＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴ３’；ゲノム位置１２８０−１３０３；ＴＭ＝５８．３℃）及びＳＫ４３１ アンチセンスI（５‘ＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴ ３’；ゲノム位置１４７４−１５００；ＴＭ＝６１．５℃）を使用して、１０ラウンドのＰＣＲとしてセミ‐ネストリアルタイム（ｓｅｍｉ‐ｎｅｓｔｅｄ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ）ＰＣＲ反応を実行して、その後、プライマー ＧＡＧ１ センスＩ、ＩＩ（５‘ＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡＣＣＣＡＴＧＴ３’；ゲノム位置１２８０−１３０３；ＴＭ＝５８．３℃)及びアンチセンスＡＧ２ ＩＩ（５‘ＣＡＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＴＴ３’；ゲノム位置１３４１−１３６２ ５５．１ＴＭ＝５７℃）を使用してセミ‐ネストリアルタイム反応を実行することによって測定し、ＧＡＧ３ プローブ（ＦＡＭ−ＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＡＧＡ−ＴＡＭＲＡ； ゲノム位置１３１１−１３３７；ＴＭ＝６１℃）を使用して同定した。ＨＩＶ‐１ ｖＲＮＡを検出するためのセミ‐ネストリアルタイムＰＣＲ反応は以下のようにして行われた：抽出された細胞ＲＮＡを水で１０倍に希釈して、プロウイルスＤＮＡのいかなる痕跡も除去するように１５分間ＤＮａｓｅI（米国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で処理した。その後、ＤＮａｓｅIを１ｍＭのＥＤＴＡ及び５０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）の存在下での７０℃１０分間のインキュベーション下で不活性化した。ＲＮＡの逆転写は、４２℃で６０分間、ランダムな６量体プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII（米国ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ合成用酵素の商標名）を用いて行った。次に、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応にかけた。第１ＰＣＲラウンドで使用されたプライマーの組み合わせは、ＨＩＶ‐Iのｇａｇ内部領域を増幅させるＳＫ４３１及びＧＡＧ１であった。この第１ラウンドは、５μＬのｃＤＮＡ、２０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．４ｍＭのＤＮＴＰ(デオキシヌクレオチド三リン酸)及び１ＵのＡｍｐｌｉ−Ｔａｑ（米国 Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡポリメラーゼ)、及び５０ｎｇのそれぞれのプライマーを有する、２５μＬのボリュームで従来のＰＣＲ装置において行われた。ＰＣＲの条件は：９４℃３分間に続いて、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１分間であった。この最初のＰＣＲの産生物は、０．２μｍのプライマー ＧＡＧ１及びＧＡＧ２及び０．２μｍのＦＡＭ ＧＡＧ３ プローブを含む、５０倍に希釈された第１ラウンド産生物を２μｌ有する２５μｌのトータルボリュームのＴａｇＭａｎ反応混合物を使用して、ＡＢＩプリズム７０００機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, ＵＳＡ）において、第２回目のセミ―ネストリアルタイムＰＣＲを行った。リアル‐タイムＰＣＲの条件は：５０℃で２分間及び９５℃で１０分間に続いて、５０サイクルの９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間とした。増幅産物のサイズは、第１ラウンドでは２２１ｂｐであり、（リアル‐タイム）ＰＣＲでは８３ｂｐだった。

図７では、１０μＭのエファビレンツを含有する、ＭＬＶ患者由来のＰＢＭＣ培養では、細胞内ｖＲＮＡが産生されなかったため、リアルタイム セミ‐ネストＰＣＲで検出できる産生物は生み出されなかったということが認められる。

一方、１０μｍのエファビレンツ及び１μＭの本発明の誘導体Ｂが添加されたＰＢＭＣ培養においては、これらの血液細胞におけるＨＩＶ潜伏ウイルスのサインである、細胞内ＨＩＶ‐１のｖＲＮＡの出現が確認された（図８）。

実施例５
ヒト及びブタオザル（Ｍａｃａｃａ ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）ＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びマクロファージの表面上におけるＣＤ４受容体の下方制御
式Iのインゲノール誘導体（Ｚ＝Ｚ２）が、実施例３のＪｌａｔ細胞における潜伏状態からＨＩＶを活性化する濃度で、ＨＩＶ‐ヒト及びＳＩＶ−ブタオザルのＣＤ４陽性Ｔリンパ球及びマクロファージの表面上におけるＣＤ４細胞受容体の発現を下方制御するということが、この試験で確かめられる。この実験のために、ヒト及びサル由来のＰＢＭＣはフィコール‐ハイパック密度勾配法（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ）（水溶液中で容易に溶ける高密度親水性中性多糖類の混合物。フィコールは、米国 ＧＥヘルスケア・バイオ‐サイエンスの登録商標）により単離した。従って、ヒト及びサル由来のＰＢＭＣ細胞を、１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地中で２４時間培養して、接着細胞（マクロファージへと分化する単球）を、全てのリンパ球を含有する細胞上清から単離した。それら２種類の細胞群を、種々の濃度の本発明のＡ、Ｂ、及びＣ誘導体に曝して、７２時間培地に置いた。曝露後、細胞を、抗‐ＣＤ４と一緒にリンパ球特異的モノクローナル（抗‐ＣＤ３）及び単球／マクロファージ特異的モノクローナル（抗‐ＣＤ１４）により染色した。然る後に、細胞を１０００Ｇで３分間遠心分離して、それと同じボリュームの２％ウシ胎児血清を含有する１×ＰＢＳ（Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋無し、Ｃａｔ Ｎｏ.９２４０、米国 Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ)で洗浄した。この洗浄を３回繰り返して、細胞を、１／１０００希釈の当該抗体を含有する１×ＰＢＳ中に懸濁し、フローサイトメトリーで分析されるまで、３０分間４℃でのインキュベーションに置いた。インキュベーション後、３０，０００の細胞をＢＤ−Ｅｘｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（米国 Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ ｃｏ.）で分析し、上記群を分離した。Ｂ誘導体なしの細胞密度を１００％と仮定して、ＣＤ４受容体密度を種々の濃度のＢ誘導体で推定した。ブリオスタチン、プロストラチン及びＰＭＡ（ホルボールエステル）のような、ＣＤ４を下方制御することがすでに知られている分子も、Ａ、Ｂ、及びＣ誘導体との比較のために、これらの試験に用いた。

本発明のインゲノールＺ２誘導体が、ヒト（図１１）及びブタオザル（図９）のリンパ球の表面上におけるＣＤ４ ＨＩＶ‐１受容体の発現を下方制御できたことは注目に値する。同様に、これらの混合物は、ヒト（図１２）及びブタオザル（図１０）の単球／マクロファージにおけるＣＤ４も下方制御できた。比較対象の分子（ブリオスタチン、プロストラチン及びＰＭＡ、図９及び図１０を参照されたい）と比べた場合、サル細胞のＣＤ４の下方制御に対するＺ２インゲノール誘導体の大きなパワーは注目に値するものだった。

Ａ、Ｂ、及びＣインゲノール誘導体は、感染標的細胞の表面上で主要なＨＩＶ受容体（ＣＤ４）を下方制御することができた。従って、本発明のインゲノール誘導体は、潜伏状態からＨＩＶを活性化することの他に、新しい細胞中へのその侵入を阻止することによりウイルス感染の進行を妨げるということが証明されている。

当業者は、本文中及び本実施例に含まれる教示により、本発明の利点を容易に評価でき、添付された特許請求の範囲に規定された本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に対する修正又は等価な変更を容易に提案することができる。

Claims (14)

1. 人間の体内のウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶを再活性化させるための調製物の調製における１種又はそれ以上の式I：
   のインゲノール誘導体（Ｚは、Ｚ１又はＺ２
   Ｚ＝Ｚ１の場合、ｘ及びｙは整数、
   ｘは２から１０及びｙは２から７（但し、３−（２，４，６−ドデカトリエノイル）―インゲノール)及び(３−（２，４，６，８−テトラデカテトラノイル)―インゲノール)を除く）；
   及びＺ＝Ｚ２の場合、
   Ａはフェニル、ＣＨ_３−又はＣＨ_２＝ＣＨ−、
   Ｂは−ＣＨ＝ＣＨ−、［−ＣＨ_２−］_ｑ又は［−ＣＨ_２−］_ｗ、
   式中ｑは１から１０の整数であり、ｗは１から１０の整数であって：
   Ａがフェニルの場合、Ｂは−ＣＨ＝ＣＨ−；
   ＡがＣＨ_３−の場合、Ｂは［−ＣＨ_２−］_ｑ；
   ＡがＣＨ_２＝ＣＨ−の場合、Ｂは［−ＣＨ_２−］_ｗ）の使用。
2. 前記１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体は、構造式
   を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. Ｚ＝Ｚ１の場合、ｘは３から５及びｙは３から４であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
4. Ｘ＝Ｚ２の場合、前記インゲノール誘導体は、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ：
   の中の１種又はそれ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
5. 請求項１に記載の１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体、及び活発な複製状態下にあるウイルスに対して作用する少なくとも１種の活性抗‐レトロウイルス薬を含むことを特徴とする、潜伏ＨＩＶの治療のための医薬的混合物。
6. 前記少なくとも１種の活発に複製するウイルスに対して作用する活性抗‐レトロウイルス薬は、ヌクレオシド又は非ヌクレオシド逆転写阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、共同‐受容体拮抗剤、レトロウイルスインテグラーゼ阻害剤、ウイルス吸着阻害剤、特定ウイルス転写阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤及びその組み合わせの中から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の医薬的混合物。
7. 前記１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体及び前記少なくとも１種の抗レトロウイルス薬は、同じ投与形態であることを特徴とする、請求項５に記載の混合物。
8. 請求項５に記載の混合物及び製剤上許容される医薬用添加物を包含することを特徴とする、潜伏ＨＩＶの治療のための医薬組成物。
9. 式Iのインゲノール誘導体又は活発に複製するウイルスに対して作用する抗レトロウイルス薬とは異なる１又は複数の他の有効成分を更に含有することを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 請求項１に記載の１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体を含むことを特徴とする、人間の体内でウイルスリザーバー中の潜伏ＨＩＶウイルスを再活性化するための、医薬組成物。
11. 請求項１に記載の１種又はそれ以上の式Iのインゲノール誘導体及び製剤上許容される医薬用添加物を含むことを特徴とする、ＨＩＶウイルスにより引き起こされる感染を治療するためのアジュバント。
12. 医薬療法における使用であることを特徴とする、患者への投与に適した、請求項５〜７の何れかに記載の医薬的混合物。
13. 医薬療法における使用であることを特徴とする、患者への投与に適した、請求項８〜１０の何れかに記載の医薬組成物。
14. 医薬療法における使用であることを特徴とする、患者への投与に適した、請求項１１に記載のアジュバント。