MX2014010016A - Receptores de mucina de inmunoglobulina de celula t (tim) como co-factores de entrada del virus. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM en la prevención o tratamiento de cofactores de entrada de virus, en particular infección por el virus que hospeda fosfatidilserina tal como infección por flavivirus.

Description

RECEPTORES DE MUCINA DE INMUNOGLOBULINA DE CELULA T (TIM) COMO CO-FACTORES DE ENTRADA DEL VIRUS Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM para prevenir o tratar una infección viral.

Antecedentes de la Invención Las infecciones virales son de las principales amenazas para la salud pública. La emergencia y expansión de las enfermedades que amenazan la vida causadas por virus (por ejemplo, fiebre hemorrágica y encefalitis), junto con métodos preventivos no adecuados (por ejemplo, vacunas) resaltan la necesidad de explorar nuevas estrategias que si dirigen a estos mortales patógenos.

El género Flavivirus por ejemplo abarca mas de 70 pequeños virus encapsulados que contienen un solo genoma de ARN monocatenario positivo. Varios miembros de este género tales como el virus del Dengue (DV, por sus siglas en inglés) , el Virus de la Fiebre Amarilla (YFV, por sus siglas en inglés), y el virus del Nilo Occidental (WNV, por sus siglas en inglés), son patógenos humanos transportados por el mosquito que causan una variedad de enfermedades humanas médicamente relevantes incluyendo fiebre hemorrágica y encefalitis (Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:200-509; Ref.:250608 Gubler y otros , 2007, Fields Virology, 5a Edición, 1153-1252). La enfermedad del dengue, que es causada por cuatro serotipos antigénicamente relacionados (DV1 a DV4), ha emergido como un problema de salud global durante las últimas décadas y es una de las enfermedades arbovirales médicamente más relevantes. Se estima que 50-100 millones de casos de dengue ocurren anualmente y más de 2.5 mil millones de personas están en riesgo de infección. La infección por cualquiera de los cuatro serotipos causa enfermedades, en el intervalo de fiebre ligera a fiebre hemorrágica de dengue amenazante de la vida (DHF) y síndrome de choque por dengue (DSS, por sus siglas en inglés). A pesar de la importancia y la incidencia en aumento del DV como un patógeno humano, actualmente no existe una vacuna autorizada disponible contra DV y la falta de fármacos antivirales restringe severamente las opciones terapéuticas.

Los futuros esfuerzos para combatir la enfermedad del dengue requieren un mejor entendimiento del ciclo de vida del DV. El DV que entra en las células objetivo es un objetivo prometedor para estrategias preventivas así como terapéuticas debido a que un determinante principal del intervalo del hospedero, el tropismo celular y la patogénesis viral. Durante la infección primaria, el DV entra en las células hospederas por endocitosis mediada por clatrina, un proceso conducido por la interacción entre la glicoproteína viral (proteína E) con los receptores celulares. Dentro del endosoma, el entorno ácido activa una trimerización irreversible de la proteína E que resulta en la fusión de las membranas viral y de célula, permitiendo la liberación de la cápside viral y el ARN genómico en el citosol. A la fecha, las bases moleculares de las interacciones del DV-hospedero que llevan a la entrada del virus son pobremente entendidas y se conoce poco acerca de la identidad de (de los) receptor(es) celular(es). Se sabe que el DV infecta un amplio intervalo de tipos de células. El DV de esta forma puede explotar diferentes receptores, dependiendo de la célula objetivo, o utilizare moléculas de entrada ampliamente expresadas. Los estudios anteriores indican que los viriones DV hacen un contacto inicial con el hospedero mediante la unión a proteoglicanos de heparan-sulfato en la membrana celular. Estas moléculas reconocen los residuos positivamente cargados en la superficie de la proteína E y se cree que concentran el virus en la superficie de la célula objetivo antes de sus interacciones con los factores de entrada. Numerosas proteínas celulares tales como la proteína 70 de choque por calor (HSP70), HSP90, GRP78/Bip, un receptor-CD14 de lipopolisacárido o la laminina de alta afinidad de 37/67 kDa han sido propuestas como receptores de entrada DV putativos. Sin embargo, su función en la entrada viral aún está pobremente caracterizada y es de relevancia fisiológica ambigua. A la fecha, los únicos factores bien caracterizados que participan activamente en el programa de entrada del DV son DC-SIGN expresado en células dendríticas, L-SIGN expresado en células endoteliales sinusoidales hepáticas y el receptor de mañosa (MR, por sus siglas en inglés) expresado en macrófagos. Estas moléculas pertenecen a la familia del receptor de lectina de tipo C y se unen a glicanos N-enlazados ricos en mañosa en la proteína E DV. Sin embargo, DV infecta tipos de células que no expresan DC-SIGN, MR o L-SIGN, indicando que existen otros receptores de entrada relevantes y aún no se identifican.

Actualmente, DV se ha convertido en un problema global y endémico en más de 110 países. De esta forma, el desarrollo de un tratamiento profiláctico o curativo para la infección por DV es necesario.

Además, el descifrar el mecanismo de la internalización del DV podría también preparar la forma de desarrollar el tratamiento de otras infecciones virales.

Breve Descripción de las Figuras Ahora se describirá la invención con mayor detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos. Toda la literatura y documentos de patente citados en la presente se incorporan por referencia en la presente.

Figura 1. Los receptores TIM median la infección DV. Las células 293T, se confrontaron con DV2-JAM a las multiplicidades de infección indicadas (MOI). Los niveles de infección se evaluaron dos días después por citometría de flujo utilizando el mAB anti-NSl. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes.

Figura 2. Los receptores TIM median la infección DV. Los receptores TIM se utilizaron por los cuatro serotipos DV. Las células se infectaron por DV1-TVP, DV3-PAH881 y DV4-1086. La infección se evaluó dos días después por citometría de flujo utilizando el mAb anti-PrM 2H2. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes.

Figura 3. Los receptores TIM median la infección DV. Los receptores TIM potencian la infección por medio de las cepas Nueva Guinea C (NGC) DV2 adaptada en laboratorio y 16681. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes.

Figura 4. Las moléculas TIM-1 y TIM-4 se unen a DV. Análisis Western blot de DV2-JAM pre-incubadas con Fe de control, NKG2D-Fc, TIMl-Fc, o TIM-4-Fc unidas a perlas de A-agarosa de proteína. El virus derribado se detectó utilizando el mAb de proteína E 4G2 anti-DV. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 5. Las moléculas TIM-1 y TIM-4 se unen a DV.

Interacción de DV con TIM-1-Fe soluble. Fe de control, NKG2D-Fc o TIM-1-Fe se cubrieron con plástico en placas de 96 pocilios y se incubaron con partículas DV2-JAM por 1 hora a 4°C. El virus unido se detectó utilizando mAb 4G2 biotinilado e IgG anti-ratón conjugado con HRP. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 6. Las moléculas TIM-1 y TIM-4 se unen a DV.

PtdSer se asocian con viriones DV. Las partículas DV2 se recubrieron sobre placas de pocilios e incubaron con el mAb 11.16 anti-PtdSer. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 7. Las moléculas TIM-1 y TIM-4 se unen a DV. La infección DV mediada por TIM depende de PtdSer. DV2-JAM (MOI = 5) pre-incubadas con Anexina V (ANX5; 25 mg/ml) se utilizaron para infectar las células indicadas. Los niveles de células infectadas se cuantificaron 48 horas después por citometría de flujo y normalizaron con relación a la infección sin Anexina V. Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 8. Moléculas TIM mutadas en el dominio de unión PtdSer no median la infección DV. Las células transfectadas se infectaron con DV2-JAM. Se muestran los porcentajes de células infectadas (en el día 2). Los datos son medias ± SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 9. Las moléculas endógenas TIM-1 y AXL median la infección DV. Las células Huh7.5.1 se infectaron con las cepas DV indicadas o HSV-1 en la presencia de anti-TIM-1, anti-AXL o IgG de control. Los niveles de infectados se cuantificaron 24h después por citometría de flujo y normalizaron a la infección en presencia de IgG de control. Los datos son medias ±SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 10. Moléculas endógenas TIM-1 y AXL median la infección DV. Las células A549 fueron infectadas con las cepas DV indicadas o HSV-1 en la presencia de anti-TIM-1, anti-AXL o IgG de control. Los niveles de infectados se cuantificaron 24h después por citometría de flujo y normalizaron a la infección en presencia de IgG de control. Los datos son medias +SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 11. Moléculas endógenas TIM-1 y AXL median la infección DV. Análisis in unofluorescente representativo de A549 infectadas con DV2-JAM en la presencia de Ab indicado. Anti-PrM 2H2 Verde, DAPI Azul. Barra de escala: 100 pm. Los datos son medias +SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 12. TIM-1 y AXL endógenos median la infección DV. Las células A549 se infectaron con DV3-PAH881 (M01=10). Antes de incubar las células infectadas con la combinación indicada de anticuerpos policlonales anti-TIM-1 y anti-AXL. Los niveles de infección se cuantificaron 24 horas después por citometría de flujo y normalizaron a la infección en la presencia del anticuerpo IgG de control. Se muestran medias + SD de tres experimentos independientes por duplicado.

Figura 13. Efecto de la silenciación de TIM-1 y AXL en la infección DV. Las células A549 se transíectaron por el ARNsi indicado, y la expresión de TIM-1 y AXL se evaluó por citometría de flujo después de días, en el tiempo de la infección. Las células se infectaron con DV2- JAM (MOI = 2) o HSV-1 (MOI = 0.8). Los niveles de células infectadas se cuantificaron 24h después por citometría de flujo y normalizaron a la infección en células transíectadas con ARNsi no activadas (siNT). Los datos son medias SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 14. Células A549 infectadas con DV-2 JAM o HSV-1 pre-incubadas con diferentes concentraciones de ANX5. Los porcentajes de células infectadas se cuantificaron 24 horas después por citometría de flujo. Los datos son medias +SD de al menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.

Figura 15. Modelo esquemático de unión directa de fosfatidilserina-receptor TIM de DV. La fosfatidilserina interactúa directamente con los receptores TIM, que consecuentemente ya sea activan una cascada de transducción de señal que resulta en la inhibición de la inmunidad innata o la movilización de los efectores de endocitosis que potencian la internalización del virus.

Figura 16. Los receptores TIM median la infección por flavivirus. Los receptores TIM se utilizaron por DV2-JAM, Virus de Nilo del Occidente y Virus de Fiebre Amarilla. Parental y las células 293T que expresan los receptores TIM se infectaron por DV2-JAM, WNV (cepa Israelí IS_98-STI), la cepa de la vacuna del Virus de Fiebre Amarilla (YFV-17D) y Virus 1 de Herpes Simplex (HSV-1). La infección viral se cuantificó dos días después por citometría de flujo utilizando Abs específico. Los datos son medias ± SEM de al menos tres experimentos independientes.

Figura 17. TYR03 y AXL potencian la infección por DV y por otros flavivirus. Se confrontaron 293T parental que expresan TYR03 y AXL con DV2-Jam, WNV, YFV-17D y HSV-1. La infección se evaluó 24 horas después por citometría de flujo. Los datos se representan como media ± SEM de tres experimentos independientes por duplicado.

Figura 18. La expresión ectópica de TIM-1 y TIM-4 potencia la infección por Chikungunya. Las células 293T que expresan TIM-1, TIM-4 y las células 293T parentales se infectaron con Chikungunya (Chick). La infección se cuantificó 48 horas después por citometría de flujo, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón frente a la glicoproteína encapsulada E2 (3E4).

Figura 19. La expresión ectópica de TYR03 y AXL potencia la infección por Chikungunya. Las células 293T que expresan TIM-1, TIM-4 y las células 293T parentales se infectaron con Chikungunya (Chick). La infección se cuantificó 48 horas después por citometría de flujo, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón frente al anticuerpo monoclonal de ratón frente a la glicoproteína encapsulada E2 (3E4).

Breve Deascripción del Listado de Secuencias SEC ID NO: 1 muestra la secuencia del ARNsi 5'- AAACUCAACUGUUCCUACA-3' frente a TIM-1.

SEC ID NO: 2 muestra la secuencia del ARNsi 5'- CGGAAGGACACACGCUAUA-3' frente a TIM-1.

SEC ID NO: 3 muestra la secuencia del ARNsi 5'- GCAGAAACCCACCCUACGA-3' frente a TIM-1.

SEC ID NO: 4 muestra la secuencia del ARNsi 5'- GGUCACGACUACUCCAAUU-3 ' frente a TIM-1.

SEC ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-1 referenciado bajo el Número GenBank AAH13325.1.

SEC ID NO: 6 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM-1 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM 012206.2.

SEC ID NO : 7 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM- 1 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001099414 . 1.

SEC ID NO : 8 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM- 1 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001173393 . 1.

SEC ID NO: 9 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-3 referenciado bajo el Numero GenBank AAH20843.1.

SEC ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-3 referenciado bajo el Número GenBank AAH63431.1.

SEC ID NO : 11 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM-3 referenciado baj o la Secuencia de Referencia NCBI NM_032782 .4 .

SEC ID NO : 12 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-4 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_612388.2 .

SEC ID NO : 13 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-4 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_001140198 .1.

SEC ID NO : 14 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM-4 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_138379. 2 .

SEC ID NO : 15 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TIM-4 referenciado baj o la Secuencia de Referencia NCBI NM 001146726 . 1.

SEC ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácido de Anexina 5 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_001145.1.

SEC ID NO: 17 muestra la secuencia de ácido nucleico de Anexina 5 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001154.3.

SEC ID NO: 18 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TYRO-3 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_006284.2.

SEC ID NO: 19 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TYRO-3 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_006293.3.

SEC ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoácido del receptor AXL referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_001690.2.

SEC ID NO: 21 muestra la secuencia de aminoácido del receptor AXL referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_068713.2.

SEC ID NO : 22 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor AXL referenciado baj o la Secuencia de Referencia NCBI NM_021913 .3 .

SEC ID NO : 23 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor AXL referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001699 .4 .

SEC ID NO : 24 muestra la secuencia de aminoácido del receptor MER referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP 006334.2.

SEC ID NO: 25 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor MER referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_006343.2.

SEC ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácido de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_000811.1.

SEC ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácido de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_001137417.1.

SEC ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácido de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NP_001137418.1.

SEC ID NO: 29 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_000820.2.

SEC ID NO: 30 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001143945.1.

SEC ID NO: 31 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 referenciado bajo la Secuencia de Referencia NCBI NM_001143946.1.

SEC ID NO: 32 muestra la secuencia del ARNsi 5'-ACAGCGAGAUUUAUGACUA-3' frente a AXL.

SEC ID NO: 33 muestra la secuencia del ARNsi 5'- GGUACCGGCUGGCGUAUCA-3' frente a AXL.

SEC ID NO: 34 muestra la secuencia del ARNsi 5‘ GACGAAAUCCUCUAUGUCA-37 frente a AXL.

SEC ID NO: 35 muestra la secuencia del ARNsi 5 GAAGGAGACCCGUUAUGGA-3' frente a AXL.

SEC ID NO: 36 muestra la secuencia de la variante de la proteína Gas6AGla.

SEC ID NO: 37 muestra la secuencia de un cebador externo para la clonación de TYRO-3.

SEC ID NO: 38 muestra la secuencia de un cebador interno para la clonación de TYRO-3.

SEC ID NO: 39 muestra la secuencia de un cebador interno para la clonación de TYRO-3.

SEC ID NO: 40 muestra la secuencia de un cebador externo para la clonación de TYRO-3.

SEC ID NO: 41 muestra la secuencia de un cebador para la clonación de AXL.

SEC ID NO: 42 muestra la secuencia de un cebador para la clonación de AXL.

SEC ID NO: 43 muestra la secuencia de un cebador para La amplificación del ectodominio TIM-1.

SEC ID NO: 44 muestra la secuencia de un cebador para La amplificación del ectodominio TIM-1.

SEC ID NO: 45 muestra la secuencia de un cebador para La amplificación del ectodominio TIM-4.

SEC ID NO: 46 muestra la secuencia de un cebador para La amplificación del ectodominio TIM-4.

SEC ID NO: 47 muestra la secuencia de aminoácido del receptor TIM-1 referenciado bajo el UniProt Número Q96D42.

Descripción Detallada de la Invención Los inventores han encontrado que la infección DV está mediada por la interacción entre la fosfatidilserina (PtdSer) presente en la superficie del encapsulamiento viral DV y el receptor TIM presente en la superficie de la célula hospedera, y que tal interacción puede bloquearse, por lo tanto inhibiendo la entrada del DV en las células hospederas y previniendo la infección DV.

Además, los inventores encontraron que esta interacción entre fosfatidilserina (PtdSer) y receptores TIM no solamente se utiliza por otros flavivirus tales como el (YFN) y Virus de Nilo del Occidente (WNV) sino también por ejemplo por el Virus Chikungunya que muestra que esta interacción puede representar un mecanismo general explotado por los virus que incorporan fosfatidilserina (PtdSer) en su membrana.

De esta forma, la invención se refiere a un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM para uso para prevenir o tratar una infección viral, en particular una infección por el virus que hospeda fosfatidilserina (PtdSer) tal como una infección por flavivirus, en donde el inhibidor es preferiblemente (i) un inhibidor del receptor TIM, y/o (ii) una proteína de unión de fosfatidilserina. Preferiblemente, tal interacción es una interacción directa.

Por "infección viral que hospeda fosfatidilserina" significa en particular una "infección por flavivirus". Por "infección por flavivirus" quiere decir una infección con un virus del Dengue (DV), un virus del Nilo Occidental, un virus de encefalitis transportado por garrapata, un virus de encefalitis Saint-Louis, un virus de encefalitis Japonés o un virus de fiebre amarilla. Preferiblemente, tal receptor TIM es TIM-1, TIM-3 o TIM-4. Preferiblemente, tal inhibidor del receptor TIM es un anticuerpo del receptor anti-TIM, un ácido nucleico antisentido, un receptor TIM mimético o una variante, y preferiblemente tal inhibidor del receptor TIM es un ARNsi. Preferiblemente, la proteína de unión a fosfatidilserina es un anticuerpo anti-fosfatidilserina o Anexina 5.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM y adicionalmente al menos otro compuesto antiviral. Preferiblemente, tal al menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM.

Además se proporciona el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM en un método para inhibir la entrada de un virus, en particular un virus que hospeda PtdSer tal como un flavivirus, en una célula.

También se proporciona un método para prevenir o tratar una infección viral, en particular una infección por el virus que hospeda PtdSer tal como una infección por flavivirus, que comprende administrar a un individuo en tal necesidad una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM.

También se proporciona el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección viral, en particular una infección por el virus que hospeda PtdSer, en particular a infección por flavivirus.

Definición Por "infección viral que hospeda fosfatidilserina" significa una infección con un virus encapsulado que expresa o incorpora PtdSer en su membrana. Antes de la infección, el PtdSer se expone en la membrana viral a receptores de la célula hospedera. Los ejemplos de PtdSer que hospedan virus encapsulados incluyen, pero no se limitan a: Flavivirus (tal como el Virus del Dengue, Virus de Nilo del Occidente, Virus de Fiebre Amarilla), Alfavirus (por ejemplo Virus Chikungunya), Filovirus (por ejemplo Virus del Ebola), Poxivirus (por ejemplo Virus de Viruela Bovina) y Arenavirus (por ejemplo Virus Lassa).

"Una infección viral que hospeda fosfatidilserina" puede incluir, por ejemplo, una "infección por flavivirus". Por "infección por flavivirus" significa una infección con un virus del Dengue (DV), un virus del Nilo Occidental, un virus de encefalitis transportado por garrapata, un virus de encefalitis Saint-Louis, un virus de encefalitis Japonés o un virus de fiebre amarilla (Sabin y otros, 1952, A.B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1:30-50; Hammon y otros, 1960, Trans. Assoc. Am. Physicians 73:140-155; Smithburn, 1940, Am. J. Trop. Med., 20:471-492; Monath and Heinz, 1996, Flaviviruses, Fields Virology, 3a edición, p.961-1034; Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:500-509). El virus del Dengue puede ser de cualquier serotipo, es decir serotipo 1, 2, 3 o 4.

Por "interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM" significa la interacción directa entre fosfatidilserina presente en la superficie del virus que hospeda PtdSer y un receptor TIM presente en la superficie de la célula hospedera. De hecho, los inventores han encontrado que la interacción directa entre fosfatidilserina y el receptor TIM permite la infección por el virus que hospeda PtdSer o la entrada en las células hospederas.

Por "inhibidor" significa un agente que es capaz de reducir o abolir la interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM. Tal inhibidor también puede ser capaz de reducir o abolir la expresión de un receptor TIM. De acuerdo con la invención, tal inhibidor es (i) un inhibidor del receptor TIM y/o (iii) una proteína de unión de fosfatidilserina.

Preferiblemente, tal inhibidor es capaz de reducir o de abolir la interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM, en al menos 10, 20, 30, 40%, más preferiblemente en al menos 50, 60, 70%, y de preferencia en al menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%.

Se referencia en la presente a polipéptidos y ácido nucleico que incluye tanto las secuencias de aminoácido y las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente y variantes de tales secuencias.

Varias proteínas pueden ser variantes de origen natural, tales como variantes de empalme, alelos e isoformas, o pueden producirse por medios recombinantes. Las variaciones en la secuencia de aminoácido pueden introducirse por sustitución, supresión o inserción de uno o más codones en la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácido se la proteína. Opcionalmente la variación es por sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos con cualquier otro aminoácido en la proteína. Adicional o alternativamente, la variación puede ser por adición o supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos dentro de la proteína.

Las secuencias de ácido nucleico variantes incluyen secuencias capaces de específicamente hibridar la secuencia de SEC ID Nos: 1-4, 6-8, 11, 14, 15, 17, 19, 22, 23, 25, 29-31, 32-35 bajo condiciones de moderado o alto rigor. Las condiciones de rigor o alto rigor pueden identificarse por las que: (1) utilizan una baja resistencia iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo 0.015 M de cloruro de sodio/0.0015 M de citrato de sodio/0.1% de dodecil sulfato de sodio a 50°C; (2) utilizan durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suero de bovino/0.1% de Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50 mM de regulador de pH de fosfato sódico a pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42°C; o (3) utilizan 50% de formamida, 5 x SSC (0.75 M de NaCl, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5 x de solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 mg/ml), 0.1% de SDS, 1 10% de sulfato de dextrina a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55°C, seguido por un lavado de alto rigor que consiste de 0.1 x SSC con EDTA a 55°C. Las condiciones de rigor moderado pueden identificarse como se describe por Sambrook y otros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Coid Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica y % de SDS) menor rigurosas a las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones modernamente rigurosas es incubación nocturna a 37°C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, de 0% de sulfato de dextrina, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallada desnaturalizada, seguido por lacado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C.

Los fragmentos de las proteínas y las proteínas variantes en la presente también están abarcadas por la invención. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo N-terminal o C-terminal, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína de longitud completa. Ciertos fragmentos careen de residuos de aminoácido que no son esenciales para la actividad enzimática. Preferiblemente, tales fragmentos son de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos en longitud.

Los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico y las variantes descritas en la presente también están abarcadas por la invención. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo 3' o 5', o puede carecer de bases internas, por ejemplo, cuando se comparan con la secuencia de ácido nucleico de longitud completa. Preferiblemente, tales fragmentos son al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más bases en longitud.

Las proteínas variantes pueden incluir proteínas que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia de polipéptido descrita en la presente. Preferiblemente, una proteína variante tendrá al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácido para una secuencia de polipéptido de longitud completa o un fragmento de la secuencia de polipéptido como se describe en la presente. La identidad de la secuencia de aminoácido se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia variante que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia, después de la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede determinarse sobre la longitud completa de la secuencia variante, la longitud completa de la secuencia de referencia, o ambas.

Las secuencias de ácido nucleico variantes pueden incluir secuencias de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico variantes tendrán al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácido para una secuencia de ácido nucleico de longitud completa o un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se describe en la presente. La identidad de la secuencia de ácido nucleico se define como el porcentaje de ácidos nucleicos en la secuencia variante que son idénticos a los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia, después de la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. La identidad de secuencia puede determinarse sobre la longitud completa de la secuencia variante, la longitud completa de la secuencia de referencia, o ambas.

Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácido de consulta de la presente invención, pretende que la secuencia de aminoácido del polipéptido en cuestión sea idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia del polipéptido en cuestión pueda incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácido de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido con una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácido de consulta, hasta el 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácido en la secuencia en cuestión pueden insertarse, eliminarse o sustituirse con otro aminoácido.

En el contexto de la presente solicitud, el porcentaje de identidad se calcula utilizando una alineación global (es decir, las dos secuencias se comparan sobre su longitud completa). Los métodos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en la téenica. El programa n needle n, que utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970 J.

Mol. Biol. 48:443-453) para encontrar la alineación óptima (incluyendo huecos) de dos secuencias cuando se considera su longitud total, puede por ejemplo usarse. El programa needle está por ejemplo disponible en el sitio web a nivel mundial ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad de acuerdo con la invención preferiblemente se calcula utilizando el programa EMBOSS::needle (global) con un parámetro "Gap Open" igual a 10.0, un parámetro "Gap Extend" igual a 0.5, y una matriz Blosum62.

Las proteínas que consisten de una secuencia de aminoácido "al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica" para una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como supresiones, inserciones y/o sustituciones comparadas con la secuencia de referencia. En el caso de sustituciones, la proteína que consiste de una secuencia de aminoácido al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de referencia puede corresponder a una secuencia homologa derivada de otra especie diferente de la secuencia de referencia.

Las sustituciones se aminoácido pueden ser conservadoras o no conservadoras. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservadoras, en donde un aminoácido está sustituido por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares. La sustitución preferiblemente corresponde a una sustitución conservadora como se indica en la siguiente tabla El término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno. Es decir, el término anticuerpo abarca no solamente moléculas de anticuerpo entero, sino también fragmentos de anticuerpo así como variantes de anticuerpos, incluyendo derivados tales como anticuerpos humanizados. En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas se enlazan entre sí por medio de enlaces de disulfuro y cada cadena pesada se enlaza a una cadena ligera por un enlace de disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de la molécula del anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada una contiene diferentes dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios, un domino variable (VL, por sus siglas en inglés) y un dominio constante (CL, por sus siglas en inglés). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un domino variable (VH, por sus siglas en inglés) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, colectivamente referidos cono CH). Las regiones variables de ambas cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento de la unión y la especificidad del antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas tales como la asociación de la cadena del anticuerpo, la secreción, la movilidad trans-placenta, unión del complemento, y la unión a los receptores Fe (FcR).

El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste de las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación de anticuerpo y la determinante antigénica. Los sitios de combinación del anticuerpo se forman de residuos que son principalmente de las regiones determinantes hipervariables o de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) . Ocasionalmente, los residuos no se regiones hipervariables o de estructura (FR, por sus siglas en inglés) tienen influencia en la estructura global del domino y por lo tanto el sitio de combinación. Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se refieren a secuencias de aminoácidos que, juntos, definen la afinidad y la especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina cada una tienen tres CDR, designadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Por lo tanto, un sitio de unión a antígeno incluye seis CDR, que comprende el grupo de CDR de cada una de la región V de cadena pesada y de cadena ligera.

Las regiones de estructura (FR, por sus siglas en inglés) se refieren a secuencias de aminoácido interpuestas entre las CDR, es decir a aquellas porciones de las regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina y a regiones variables que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una sola especie, como se define por Kabat, y otros (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Como se utiliza en la presente, una "región de estructura humana" es una-región de estructura que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85%, o más, en particular 90%, 95%, o 100%) a la región de estructura de un anticuerpo humano de origen natural.

El término "anticuerpo monoclonal " o "Ab" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula del anticuerpo de una composición de un solo aminoácido, que se dirige contra un antígeno específico y que puede producirse por un solo clon de la células B o hibridoma. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser recombinantes, es decir, producidos por modificación de la proteína.

El término " anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo modificado que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio CL de otro anticuerpo, en particular un anticuerpo humano. Como el animal no humano, cualquier animal tal como un ratón, rata, hámster, conejo o similar puede usarse. Un anticuerpo quimérico también puede denotar un anticuerpo multiespecífico que tiene una especificidad para al menos dos diferentes antígenos.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en donde la región de estructura o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) ha sido modificadas para comprender la CDR de un inmunoglobulina donadora de diferente especificidad según comparada con la de la inmunoglobulina progenitora. En una modalidad preferida, una CDR de ratón se injerta en la región de estructura de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo humanizado".

"Fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión del antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab1, dsFv, scFv, SC(FV)2, diacuerpos, y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

El término "Fab" denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y la actividad de unión del antígeno, en donde aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y su cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, se unen juntos a través de un enlace de disulfuro.

El término "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y una actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que la unión Fab vía un enlace de disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos mediante el tratamiento de IgG con proteasa, pepsina.

El término "Fab1" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y una actividad de unión a antígeno, que se obtiene cortando un enlace de disulfuro de la región bisagra del F (ab1)2· Un polipéptido Fv de cadena individual ("scFv") es un heterodímero VH::VL covalentemente enlazado que usualmente se expresa de una fusión génica que incluye los genes que codifican VH y VL enlazados por un enlazador de codificación de péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye CDR que se mantienen en una conformación apropiada, preferiblemente mediante el uso de téenicas de recombinación génica. El "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace de disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes pueden formarse ya sea espontáneamente por la asociación de scFv monovalentes, o pueden generarse mediante el acoplamiento covalente de scFvs mediante un enlazador de péptido, tal como un sc(Fv)2 divalente.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento por pares entre dos dominios de la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejarse con los dominios de complementariedad de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Por " ácido nucleico antisentido", quiere decir una molécula de ácido nucleico no enzimática que se une a ARN no objetivo por medio de las interacciones de ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-PNA (ácido nucleico proteico; Egholm y otros, 1993, Nature 365, 566) y altera la actividad del ARN objetivo (para un revisión, ver Stein and Cheng, 1993, Science 261, 1004, and Woolf y otros, Patente de E.U.A. No. 5,849,902). Típicamente, las moléculas antisentido son complementarias a la secuencia objetivo a lo largo de una sola secuencia contigua de la molécula antisentido. Sin embargo, en ciertas modalidades, una molécula antisentido se puede unir a un sustrato de tal forma que la molécula del sustrato forma un bucle u horquilla, y/o una molécula antisentido se puede unir de tal forma que la molécula antisentido forma un bucle u horquilla. De esta forma, la molécula antisentido puede ser complementaria a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias de sustrato no contiguas o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más porciones de secuencia no contiguas de una molécula antisentido que puede ser complementaria a una secuencia objetivo o ambas (por ejemplo, ver Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45). Además, el ADN antisentido puede usarse para dirigir el ARN por medio de interacciones de ADN-ARN, por lo tanto activando el seARN H, que digiere el ARN objetivo en el dúplex. Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender una o más regiones de activación de seARN H, que son capaces de activar la división de seARN H de un ARN objetivo.

Después de la introducción, el ácido nucleico antisentido entra en una trayectoria celular que es comúnmente referida como la trayectoria de interferencia de ARN (iARN). El término "interferencia de ARN" o "iARN" se refiere a la degradación intracelular selectiva del ARN también referida como silenciación del gen. El iARN también incluye la represión traslacional mediante pequeños ARN de interferencia (siRNA). iARN puede iniciarse por la introducción de grandes ARN bicatenarios (dsRNA) o ARNsi, o la producción de ARNsi intracelularmente, por ejemplo, en la forma de un plásmido o transgén, para silenciar la expresión de uno o más genes objetivo. Alternativamente el iARN ocurre en células naturalmente para remover ARN foráneo, por ejemplo ARN viral. Los iARN naturales proceden vía fragmentación dirigida por dicer de ARNds precursores que dirigen el mecanismo de degradación a otras secuencias de ARN cognadas.

En algunas modalidades, el ácido nucleico antisentido puede ser Grandes ARN bicatenarios (ARNds), microARN (miARN) y/o pequeño ARN interferente (ARNsi).

Como se utiliza en la presente "Grande ARN bicatenario" o "ARNds" se refiere a un oligonucleótido o polirribonucléotido, modificado o no modificado, y sus fragmentos y porciones, de origen genómico o sintético o derivado de la expresión de un vector que puede ser parcial o completamente bicatenario y que puede tener extremos romos o contener una saliente 5' o 3', y también puede ser de una forma de horquilla que comprende un solo oligorribonucleótido se pliega de nuevo sobre sí mismo para dar una región bicatenaria. En algunas modalidades, el ARNds tiene un tamaño en el intervalo de 150 bp a 3000 bp, preferiblemente en el intervalo de 250 bp a 2000 bp, aún más preferiblemente en el intervalo de 300 bp a 1000 bp. En algunas modalidades, tal ARNds tiene un tamaño de al menos 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500 bp. En algunas modalidades, tal ARNds tiene un tamaño de cuando mucho 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 950, 900, 850, 800, 750,700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 bp .

Un "ARN de interferencia pequeño" o "ARNsi" es un ARN dúplex de nucleótidos que se dirigen hacia el gen de interés. Un ARN dúplex se refiere a la estructura formada por el acoplamiento por pares complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. ARNsi se dirige hacia un gen en donde la secuencia de nucleótido de la porción dúplex del ARNsi es complementaria a una secuencia de nucleótido del gen activado. En algunas modalidades, la longitud del dúplex del ARNsi está en el intervalo de 15 nucleótidos a 50 nucleótidos, preferiblemente en el intervalo de 20 nucleótidos a 35 nucleótidos, aún más preferiblemente en el intervalo de 21 nucleótidos a 29 nucleótidos. En algunas modalidades, el dúplex puede ser de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el dúplex puede ser de cuanto mucho 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos en longitud. La porción dúplex del ARN del ARNsi puede ser parte de una estructura de horquilla. Además de la porción dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre las dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas modalidades el bucle es de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 nucleótidos en longitud. La estructura de horquilla también puede contener 3 o 5 porciones salientes. En algunas modalidades, la saliente es una saliente 3' o 5' de 0, 1, 2, 3, 4, o 5 nucleótidos en longitud.

La inyección y transfección del ácido nucleico antisentido en las células y organismos ha sido el método principal de distribución. Sin embargo, los vectores de expresión también pueden usarse para continuamente expresar ácidos nucleicos antisentido en células de mamífero temporal y establemente transíectadas. (Ver por ejemplo, por ejemplo, Brummelkamp y otros, 2002, Science, 296:550-553; Paddison y otros, 2002, Genes & Dev, 16:948-958).

El ácido nucleico antisentido puede sintetizarse o químicamente expresarse mediante el uso de un solo vector de expresión de ADN monocatenario o uno de sus equivalentes utilizando protocolos conocidos en la téenica como se describe por ejemplo en Caruthers y otros, 1992, Methods in Enzymology, 211:3-19; Publicación PCT Internacional No. WO 99/54459; Brennan y otros, 1998, Biotechnol Bioeng, 61:33-45; y Patente de E.U.A. No. 6,001,311. En un ejemplo no limitante, la sintasas a pequeña escala que conducen en un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido de la presente invención pueden sintetizarse de manera separada Ironiza compras post-sintéticamente, por ejemplo por ligación (Publicación PCT Internacional No. WO 93/23569; Bellon y otros, 1997, Bioconjugate Chem, 8:204).

El ácido nucleico antisentido de la invención puede ser capaz de disminuir la expresión del gen objetivo, por ejemplo un receptor TIM, en al menos 10, 20, 30, 40 %, más preferiblemente en al menos 50, 60, 70 %, y de preferencia en al menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.

Por "receptor variante TIM" o "receptor TAM" o "porción Gas6 variante" respectivamente significa un receptor que difiere del receptor TIM o del receptor TAM o la proteína Gas6 mediante uno o varios aminoácidos. Por ejemplo, tal y receptor variante TIM puede diferir de receptor TIM en que ya no es capaz de unirse a la fosfatidilserina o en que ya no es capaz de tener su actividad de cinasa. Por ejemplo, tal receptor variante TAM pueden diferir del receptor TAM en que ya no es capaz de unirse a la proteína Gas6, tal como por ejemplo un receptor AXL de la secuencia SEC ID NO: 20 o 21 que lleva la mutación E63R, E66R o T847R, o en que ya no es capaz de tener su actividad cinasa, tal como por ejemplo un receptor AXL de la secuencia SEC ID NO: 20 que lleva la mutación K558M, o un receptor AXL de la secuencia SEC ID NO: 21 que lleva la mutación K567M. Por ejemplo, tal proteína mediante Gas6 puede diferir de la proteína Gas6 en que ya no es capaz de unirse a fosfatidilserina y/o a un receptor TAM. Por ejemplo, tal proteína variante Gas6 puede ser la Gas6Agía (también denominada rmGas6Agla) de la secuencia SEC ID NO: 36.

Los términos "sujeto", "individuo" u "hospedero" se usan una manera intercambiable y pueden ser, por ejemplo, Un mamífero humano o no humano. Por ejemplo, el sujeto es un murciélago; un hurón; un conejo; un felino (gato); un canino (perro); un primate (mono), un equino (caballo); un humano, incluyendo hombre, mujer y niño.

Inhibidor de la interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM La fosfatidilserina a es un fosfolípido cuyo grupo fosfato está asociado con el aminoácido serina que se referencia bajo el número CAS 8002-43-5.

Por "receptor TIM" se da entender un receptor de tirosina cinasa de la familia de Mucina de Inmunoglobulina de célula T (TIM, por sus siglas en inglés). En modalidades preferidas, tal receptor TIM es un TIM-1, TIM-3 o TIM-4.

En algunas modalidades, el receptor TIM-1 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 5 (Número GenBank AAH13325.1, actualizado en Octubre, 4, 2003), b) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 6 (Secuencia de Referencia NCBI NM_012206.2, actualizado en Noviembre 26, 2011), c) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 7 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001099414.1, actualizado en Noviembre 26, 2011), d) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 8 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001173393.1, actualizado en Diciembre 4, 2011), e) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % idéntica to la secuencia de a) to d).

En algunas modalidades, el receptor TIM-3 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 9 (Número GenBank AAH20843.1, actualizado en Septiembre 16, 2003), b) la secuencia SEC ID NO: 10 (Número GenBank AAH63431.1, actualizado en Julio 15, 2006), c) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 11 (Secuencia de Referencia NCBI M 032782.4, actualizado en Diciembre 25, 2011), d) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a c).

En algunas modalidades, el receptor TIM-4 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 12 (Secuencia de Referencia NCBI NP_612388.2, actualizado en Diciembre 24, 2011), b) la secuencia SEC ID NO: 13 (Secuencia de Referencia NCBI NP_001140198.1, actualizado en Diciembre 25, 2011), c) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 14 (Secuencia de Referencia NCBI NM_138379.2, actualizado en Diciembre 24, 2011), d) la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 15 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001146726.1, actualizado en Diciembre 25, 2011), e) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a d).

En algunas modalidades, el inhibidor del receptor TIM es un anticuerpo del receptor anti-TIM, un ácido nucleico antisentido, un receptor TIM mimético o una variante.

Preferiblemente, tal inhibidor del receptor TIM es un ácido nucleico antisentido, y más preferiblemente tal inhibidor del receptor TIM es un ARNsi. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de un receptor TIM de la secuencia SEC ID NO: 5, 9, 10, 12, o 13, o a receptor TIM de la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 6, 7, 8, 11, 14 o 15. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica un receptor TIM, por ejemplo un ácido nucleico de la secuencia SEC NO: 6, 7, 8, 11, 14 o 15. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de al menos un ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3, o 4. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de al menos 2, 3, o 4 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NOs: 1, 2, 3, y 4. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de a lo sumo 4, 3, o 2 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NOs: 1, 2, 3, y 4. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de los cuatro ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3, y 4.

Preferiblemente, tal anticuerpo del receptor anti-TIM es el anticuerpo ARD5 del receptor anti-TIMl descrito en Kondratowicz y otros, 2011, PNAS, 108:8426-8431, o el anticuerpo A6G2 anti-TIMl descrito en Sonar y otros, 2010, The Journal of Clinical investigation, 120: 2767-2781.

Preferiblemente, tal mimético comprende o consiste del dominio extracelular del receptor TIM. Por ejemplo, tal mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácido de los residuos 21 a 295 para TIM-1 de SEC ID NO: 5, tal mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácido de los residuos 21 a 290 para TIM-1 de SEC ID NO: 47 o tal mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácido de los residuos 25 a 314 para TIM-4 de SEC ID NO: 12.

Preferiblemente, tal anticuerpo del receptor anti-TIM es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del receptor TIM para fosfatidilserina . Preferiblemente, tal anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del receptor TIM para fosfatidilserina se dirige hacia un Sitio de Unión de Ligando Dependiente de Ion Metálico (MILIB, por sus siglas en inglés) del receptor TIM. Aún más preferiblemente, tal anti-receptor TIM se dirige hacia los aminoácidos 111 a 115 de la secuencia SEC ID NO: 5, o a los aminoácidos 119 a 122 de la secuencia SEC ID NO: 12 o SEC ID NO: 13.

En algunas modalidades, la proteína de unión de fosfatidilserina puede ser un anticuerpo anti-fosfatidilserina o una proteína que es capaz de unirse a la fosfatidilserina, por lo tanto bloqueando la interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM. Por ejemplo, tal anticuerpo puede ser el clon 1H6 del anticuerpo de anti-fosfatidilserina anticuerpo (Upstate®).

Preferiblemente, tal anticuerpo de anti-fosfatidilserina es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión de fosfatidilserina al receptor TIM.

Preferiblemente, la proteína de unión a fosfatidilserina es la Anexina V. Preferiblemente, tal proteína de Anexina V comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 16 (Secuencia de Referencia NCBI NP_001145.1, actualizado en Febrero 1, 2012), b) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 17 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001154.3, actualizado en Diciembre 18, 2011), c) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, * 98, 99% idéntica a la secuencia de a) o b).

Compuestos Antivirales En una modalidad preferida, el inhibidor de acuerdo con la invención es para administración en combinación con al menos otro compuesto antiviral, ya sea secuencial o simultáneamente.

La administración secuencial indica que los componentes se administran en diferentes tiempos o puntos en el tiempo, que sin embargo pueden traslaparse. La administración simultánea indica que los componentes se administran al mismo tiempo.

El compuesto antiviral puede incluir, pero no se limita a, inhibidores de neuraminidasa, inhibidores de fusión viral, inhibidores de proteasa, inhibidores de polimerasa de ADN, inhibidores de transducción de señal, inhibidores de transcriptasa, iinntteerrffeerroonneess,, análogos de nucleósido, inhibidores de integrasa, inhibidores de timidina cinasa, inhibidores de la síntesis de azúcar y glicoproteína viral, inhibidores de la síntesis de proteína estructural viral, inhibidores del acoplamiento y adsorción viral, inhibidores de la entrada viral y sus análogos funcionales.

Los inhibidores de neuraminidasa pueden incluir oseltamivir, zanamivir y peramivir. Los inhibidores de la fusión viral pueden incluir ciclosporina, maraviroc, enfuviritidae y docosanol.

Los inhibidores de proteasa pueden incluir saquinavir, indinarvir, amprenavir, nelfinavir, ritonavir, tipranavir, atazanavir, darunavir, zanamivir y oseltamivir.

Los inhibidores de polimerasa de ADN pueden incluir idoxuridina, vidarabina, ácido fosfonoacético, trifluridina, aciclovir, forscarnet, ganciclovir, penciclovir, cidoclovir, famciclovir, valaciclovir y valganciclovir.

Los inhibidores de la transducción de señal incluyen resveratrol y ribavirina. Los inhibidores de transcriptasa inversa de nucleósido (NRTI) pueden incluir zidovudina (ZDV, AZT), lamivudina (3TC), estavudina (d4T), zalcitabina (ddC), didanosina (2',31-dideoxiinosina, ddl), abacavir (ABC), emirivina (FTC), tenofovir (TDF), delaviradina (DLV), fuzeon (T-20), indinavir (IDV), lopinavir (LPV), atazanavir, combivir (ZDV/3TC), kaletra (RTV/LPV), adefovir dipivoxil y trizivir (ZDV/3TC/ABC). Los inhibidores de transcriptasa inversa no de nucleósido (NNRTI) pueden incluir nevirapina, delavirdina, UC-781 (tiocarboxanilida), piridinonas, TIBO, calanolida A, capravirina y efavirenz.

Los inhibidores de entrada viral pueden incluir Fuzeon (T-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos RANTES, AK602, UK-427, 857, anticuerpos monoclonales contra receptores relevantes, cianovirina-N, ciclodextrinas , carragenanos, polímeros sulfatados o sulfonados, polímeros de condensación de ácido mandélico, AMD-3100, y sus análogos funcionales.

Preferiblemente, tal al menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TAM.

En algunas modalidades, tal inhibidor de la interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM es un inhibidor del receptor TAM y/o un inhibidor Gas6.

Por "receptor TAM", se quiere dar a entender un receptor TYRO-3, AXL o MER.

Preferiblemente, el receptor TYRO-3 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 18 (Secuencia de Referencia NCBI NP_006284.2, actualizado en Noviembre 14, 2011), b) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 19 (Secuencia de Referencia NCBI NM 006293.3, actualizado en Enero 14, 2012), c) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% identica a la secuencia de a) o b) .

Preferiblemente, el receptor AXL comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 20 (Secuencia de Referencia NCBI NP__001690.2 , actualizado en Noviembre 26, 2011), b) la secuencia SEC ID NO: 21 (Secuencia de Referencia NCBI NP_068713.2, actualizado en Noviembre 26, 2011), c) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 22 (Secuencia de Referencia NCBI NM_021913.3, actualizado en Enero 15, 2012), d) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 23 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001699.4, actualizado en Enero 15, 2012), e) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a d) .

Preferiblemente, el receptor MER comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 24 (Secuencia de Referencia NCBI NP_006334.2, actualizado en Diciembre 24, 2011), b) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 25 (Secuencia de Referencia NCBI NM_006343.2 , actualizado en Diciembre 24, 2011) , c) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) o b) .

La proteína Gas6 es una molecula puente que media la interacción entre f osf at idilserina y a TAM receptor.

Preferiblemente, la proteína Gas6 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 26 (Secuencia de Referencia NCBI NP_000811.1, actualizado en Diciembre 24, 2011) , b) la secuencia SEC ID NO: 27 (Secuencia de Referencia NCBI NP_001137417.1, actualizado en Diciembre 24, 2011), c) la secuencia SEC ID NO: 28 (Secuencia de Referencia NCBI NP_001137418.1, actualizado en Diciembre 24, 2011), d) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 29 (Secuencia de Referencia NCBI NM_000820.2, actualizado en Enero 15, 2012) , e) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 30 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001143945.1 , actualizado en Enero 15, 2012) , f) la secuencia que codifica el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 31 (Secuencia de Referencia NCBI NM_001143946.1 , actualizado en Enero 15, 2012) , g) una secuencia al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a f) .

En algunas modalidades, el inhibidor del receptor TAM es un anticuerpo del receptor anti-TAM, un ácido nucleico antisentido, un mimético o un receptor variante TAM.

Preferiblemente, tal TAM receptor inhibidor es un ácido nucleico antisentido, y más preferiblemente tal TAM receptor inhibidor es un ARNsi. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de un TAM receptor de la secuencia SEC ID NO: 18, 20, 21, o 24, o a TAM receptor de la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 19, 22, 23, o 25. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica un TAM receptor, por ejemplo un ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 19, 22, 23, o 25. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de al menos un ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 32, 33, 34 o 35. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de al menos 2, 3, o 4 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NOs: 32, 33, 34, y 35. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de a lo sumo 4, 3, 2, o 1 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de SEC ID NOs: 32, 33, 34, y 35. En una modalidad, tal ARNsi comprende o consiste de los cuatro ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 32, 33, 34, y 35.

Preferiblemente, tal mimético comprende o consiste del dominio extracelular del receptor TAM. Por ejemplo, tal mimético puede comprender o consistir de los aminoácidos 26 a 451 de SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21.

Aún más preferiblemente, tal mimético comprende o consiste de la forma soluble del dominio extracelular del receptor TAM. Por ejemplo, tal mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos 41 a 428 de SEC ID NO: 18, o de la secuencia de aminoácidos 33 a 440 de SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21.

Preferiblemente, tal anticuerpo del receptor anti-TAM es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del TAM receptor para la proteína Gas6. Preferiblemente, tal anticuerpo del receptor anti-TAM se dirige a los aminoácidos 63 a 84 de la secuencia SEC ID NO: 20 o SEC ID NO: 21.

En algunas modalidades, el inhibidor Gas6 es un anticuerpo anti-Gas6, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una proteína Gas6 variante.

Preferiblemente, tal inhibidor Gas6 es un ácido nucleico antisentido, y más preferiblemente tal inhibidor Gas6 es un ARNsi. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de un proteína Gas6 de la secuencia SEC ID NO: 26, 27, o 28, o a proteína Gas6 de la secuencia que codifica el ácido nucleico SEC ID NO: 29, 30, o 31. Tal ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica Gas6 o uno de sus fragmentos, por ejemplo un ácido nucleico de la secuencia SEC NO: 29, 30, o 31.

Preferiblemente, tal inhibidor Gas6 es la proteína Gas6 variante Gas6AGla de la secuencia SEC ID NO: 36.

Preferiblemente, tal Gas-6 mimético comprende o consiste del sitio de reconocimiento de fosfatidilserina que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácido de los residuos 53 a 94 de SEC ID NO: 26 o tal mimético comprende o consiste del sitio de unión del receptor que puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácido de los residuos 298 a 670 de SEC ID NO: 26.

Preferiblemente, tal anticuerpo anti-Gas6 es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del proteína Gas6 para el receptor TAM. Preferiblemente, tal anticuerpo anti-Gas6 se dirige a los aminoácidos 304 a 312 de la secuencia SEC ID NO: 26, a los aminoácidos 31 a 39 de la secuencia SEC ID NO: 27, o a los aminoácidos 5 a 13 de la secuencia SEC ID NO: 28.

Método para inhibir la entrada de un virus que hospeda f os f atidilserina en una célula El inhibidor de acuerdo con la invención puede usarse en un método para inhibir la entrada de un virus hospeda PtdSer en una célula.

Tal método puede ser un método in vitro o ex vivo, o un método de prevención o tratamiento de una infección por el virus que hospeda PtdSer como se describe en la presente.

La invención de esta forma provee el uso de un inhibidor como se define en la presente en un método in vitro o in vivo para inhibir la entrada de un virus que hospeda PtdSer en una célula. También se proporciona un inhibidor como se define en la presente para el uso en un método in vitro o in vivo método para inhibir la entrada de un virus que hospeda PtdSer en una célula.

En algunas modalidades, tal inhibidor se usa en combinación con al menos otro compuesto antiviral como se define en la presente anteriormente.

Tal método puede comprender, por ejemplo, exponer tal célula y/o tal virus que hospeda PtdSer a tal inhibidor. En donde el método es un método in vivo, el método puede comprender administrar tal inhibidor a un sujeto, preferiblemente un paciente en tal necesidad.

En algunas modalidades, tal célula puede ser células dendríticas, células endoteliales , astrocitos, hepatocitos, neuronas, células Kupffer, y/o macrófagos.

Composiciones Farmacéuticas El inhibidor de acuerdo con la invención puede formularse en una composición farmacéuticamente aceptable, ya sea solo o en combinación con al menos otro compuesto antiviral.

La invención se esta forma provee una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de acuerdo con la invención y adicionalmente al menos otro compuesto antiviral.

Tal al menos otro compuesto antiviral puede ser un compuesto como se define anteriormente.

En una modalidad, tal inhibidor comprende o consiste de al menos 1, 2, 3, o 4, o a lo sumo 4, 3, 2, o 1 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de ARNsi de la secuencia SEC ID NOs 1, 2, 3, y 4, y/o anexina V como se define en la presente anteriormente, y al menos otro compuesto antiviral comprende o consiste de al menos 1, 2, 3, o 4, o a lo sumo 4, 3, 2, o 1 ARNsi seleccionados del grupo que consiste de ARNsi de la secuencia SEC ID NOs: 32, 33, 34, y 35 y/o la proteína Gas6 variante, Gas6Agla de la secuencia SEC ID NO: 36 como se define en la presente anteriormente. En una modalidad, tal inhibidor comprende o consiste de 4 ARNsi de la secuencia SEC ID NOs: 1, 2, 3, y 4, y/o anexina V como se define en la presente anteriormente, y al menos otro compuesto antiviral comprende o consiste de 4 ARNsi de la secuencia SEC ID NOs: 32, 33, 34, y 35 y/o la proteína Gas6 variante, Gas6Agla de la secuencia SEC ID NO: 36 como se define en la presente anteriormente.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse oralmente en la forma de una forma de dosis unitaria farmacéutica aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en muchas formas que incluyen tabletas, cápsulas de gelatina suaves o duras, soluciones, suspensiones y liposomas acuosas, y otras formulaciones de lenta liberación, tales como geles poliméricos moldeados.

El modo de administración y las formas de dosis están cercanamente relacionadas con las propiedades de los agentes terapéuticos o composiciones que son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Las formas de dosis adecuadas incluyen, pero no se limitan a, administración oral, intravenosa, rectal, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, espinal, intratecal, intra-articular, intra-arterial, sub-araenoidea, bronquial, y linfática, y otras formas para distribución sistémica de los ingredientes activos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, transdérmica (pasiva vía parche, gel, crema, ungüento o iontoforético); intravenosa (bolo, infusión); subcutánea (infusión, depósito); transmucosal (bucal y sublingual, por ejemplo, tabletas orodispersables tabletas, obleas, película, y formulaciones efervescentes; conjuntiva (gotas para los ojos); rectal (supositorios, enema)); o intradérmica (bolo, infusión, depósito).

Las composiciones farmacéuticas líquidas orales de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones, jarabes o elíxires acuosos u oleosos, o pueden presentarse como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Tales composiciones farmacéuticas líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), o conservadores.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ámpulas, jeringas pre-rellenas, envases de infusión de volumen pequeño, o envases multidosis con un conservador adicionado. Las composiciones farmacéuticas pueden tomar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos u acuosos, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en la forma de polvo, obtenerse por aislamiento aséptico del sólido estéril o por liofilización de la solución, para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua sin pirógeno, estéril, antes de uso.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal en donde el portador es un sólido son las más preferibles presentadas como supositorios de dosis unitaria. Los portadores adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente utilizados en la téenica, y los supositorios pueden formarse convencionalmente por la mezcla de la composición farmacéutica con el (los) portador(s) ablandados o fundidos seguido por enfriado y moldeado en moldes.

Para la administración por inhalación, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se suministran convenientemente de un insuflador, nebulizador o un paquete presurizado u otros medios convenientes para suministrar un aerosol. Los paquetes presurizados pueden comprenden propulsores adecuados tales como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar la cantidad medida. Alternativamente, para administración por inhalación o insuflación, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tomar la forma de una composición de polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo de la composición farmacéutica y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición de polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria en, por ejemplo, cápsulas o cartuchos o, por ejemplo, gelatina o paquetes blíster de los cuales el polvo puede administrarse con la ayuda de un inhalador o insuflador.

Para administración intra-nasal, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse vía un aerosol líquido, tal como vía un atomizador en botella de plástico. Los típicos de éstos son Mistometerg (inhalador de isoproterenol-Wintrop) y el Medihaler® (inhalador de isoproterenol-Riker).

Para la administración del ácido nucleico antisentido, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse en formas que incluyen la encapsulación en liposomas, micropartículas , microcápsulas, sistemas portadores a base de lípidos. Los ejemplos no limitantes de sistemas portadores a base de lípidos alternativos adecuados para uso en la presente invención incluyen complejos de ácido nucleico polimérico policatiónico (ver, por ejemplo la Publicación de Patente de E.U.A. No..20050222064), complejos de ácido nucleico polimérico de ciclodextrina (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No..20040087024), complejos de ácido nucleico polimérico de poli 3 amino éster biodegradable (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No..20040071654), liposomas sensibles al pH (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No..20020192274), liposomas aniónicos (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20030026831), liposomas catiónicos (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030229040), lipo-complejos irreversiblemente enmascarados (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030180950), liposomas específicos del tipo de célula (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030198664), matrices poliméricas que contienen micropartículas (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20040142475), lipo-complejos sensibles al pH (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20020192275), liposomas con lípidos derivatizados con polímeros hidrófobos liberables (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030031704), ácido nucleico atrapado en lípidos (ver, por ejemplo Publicación de Patente PCT No. WO 03/057190), ácido nucleico encapsulado en lípido (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20030129221), complejos de ácido nucleico de derivado de esterol policatiónico (ver, por ejemplo Patente de E.U.A. No.. 6,756,054), otras composiciones liposómicas (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20030035829), otras composiciones de micropartículas (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20030157030), poli-complejos (ver, por ejemplo Publicación de Patente PCT No. WO 03/066069), composiciones en emulsión (ver, por ejemplo Patente de E.U.A. No. 6,747,014), complejos de ácido nucleico condensado (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20050123600), otros complejos de ácido nucleico policatiónicos (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030125281), complejos de ácido nucleico de poliviniléter (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20040156909), complejos de ácido nucleico de amidinio policíclico (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030220289), composiciones de nanocápsulas y microcápsulas (ver, por ejemplo Publicación de Patente PCT No. WO 02/096551), mezclas estabilizadas de liposomas y emulsiones (ver, por ejemplo EP1304160), complejos de ácido nucleico de porfirina (ver, por ejemplo Patente de E.U.A. No.6,620,805), complejos de ácido nucleico lípido (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No.20030203865), micro-emulsiones de ácido (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050037086), y composiciones a base de lípido catiónico (ver, por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050234232). Un experto en la téenica apreciará que el ARNsi modificado de la presente invención también puede suministrarse como una molécula de ARNsi desnuda.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden contener otros adyuvantes tales como agentes saborizantes, colorantes, anti-microbianos, o conservadores.

Además se apreciará que la cantidad de composiciones farmacéuticas requerida para uso en el tratamiento variará no solamente con el agente terapéutico seleccionado sino también con la ruta de administración, la naturaleza de la afección que se está tratando y la edad y condición del paciente y será finalmente a discreción del médico o clínico que atiende.

Administración y metodos de tratamiento La invención también se refiere a un método para prevenir o tratar una infección por el virus que hospeda PtdSer en un individuo en tal necesidad que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de acuerdo con la invención.

Por "tratamiento" significa un uso terapéutico (es decir, en un paciente que tiene una enfermedad dada) y por "prevenir" significa un uso profiláctico (es decir, en un individuo susceptible a desarrollar una enfermedad dada). El término "tratamiento" no solamente incluye el tratamiento que lleva a un cura completa de la enfermedad, sino también tratamientos que desaceleran el avanza de la enfermedad y/o prolongan la supervivencia del paciente.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la habilidad de la proteína para provocar un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva abarca una cantidad en donde cualquier efecto tóxico o perjudicial del inhibidor se supera por los efectos terapéuticamente benéficos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también abarca una cantidad suficiente para conferir beneficio, por ejemplo, beneficio clínico.

En el contexto de la presente invención, "prevenir infección viral que hospeda fosfatidilserina" puede significar la prevención de una infección por el virus que hospeda PtdSer o la entrada en la célula hospedera.

En el contexto de la presente invención, "tratar infección viral que hospeda fosfatidilserina" , puede significar revertir, aliviar, o inhibir la infección por virus que hospeda fosfatidilserina en la célula hospedera.

En el contexto de la invención, la infección por virus que hospeda fosfatidilserina puede reducirse en al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.

En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden la administración de un inhibidor como se define anteriormente, en combinación con al menos otro compuesto antiviral como se define anteriormente, ya sea secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, tal al menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y a TAM receptor como se define en la presente anteriormente.

En otra modalidad, tal método comprende la administración de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

El régimen de administración puede ser un régimen sistémico. El modo de administración y las formas de dosis están cercanamente relacionadas con las propiedades de los agentes terapéuticos o composiciones que son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Las formas de dosis adecuadas y las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, administración oral, intravenosa, rectal, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, espinal, intratecal, intra-articular, intra-arterial, sub-araenoidea, bronquial, y linfática, y/u otras formas de dosis y rutas de administración para la distribución sistémica de los ingredientes activos. En una modalidad preferida, las formas de dosis son para administración parenteral.

El régimen de administración puede ser por ejemplo durante un período de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 días.

El intervalo de dosis puede estar entre 0.1 mg/kg/día y 100 mg/kg/día. Más preferiblemente, el intervalo de la dosis está entre 0.5 mg/kg/día y 100 mg/kg/día. Más preferiblemente, el intervalo de la dosis está entre 1 mg/kg/día y 80 mg/kg/día. Más preferiblemente, el intervalo de la dosis está entre 5 mg/kg/día y 50 mg/kg/día, o entre 10 mg/kg/día y 40 mg/kg/día.

En algunas modalidades, la dosis puede ser de al menos 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 mg/kg/día. En algunas modalidades, la dosis puede ser de a lo sumo 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 25, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1 mg/kg/día.

El intervalo de dosis también puede estar entre 10 a 10000 Ul/kg/día. Más preferiblemente, el intervalo de la dosis está entre 50 a 5000 Ul/kg/día, o entre 100 a 1000 Ul/kg/día.

En algunas modalidades, la dosis puede ser de al menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 Ul/kg/día. En algunas modalidades, la dosis puede ser de a lo sumo 10000, 9500, 9000, 8500, 8000, 7500, 7000, 6500, 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 Ul/kg/día.

EJEMPLO Material y métodos Clasificación de la biblioteca de ADNc Para la clasificación del ADNx, se seleccionaron 1728 genes que codifican receptores celulares putativos con base en bioinformáticos de una biblioteca 33 de ADNc de longitud completa en arreglo. En la primera ronda de clasificación, se transfectaron 216 agrupaciones de 8 ADNc en células 293T utilizando Lipofectamina LTX. Las células 293T transfectadas después se incubaron con la cepa primaria DV2-JAM (MOI = 2) por 48 horas y la infección se calificó por FACS utilizando el mAb 2H2 que reconoce la proteína PrM DV. Las agrupaciones de ADNc que convierte en positivas a las células 293T para la tinción intracelular de la proteína prM entraron en la segunda ronda de clasificación, en donde un solo ADNc que compone cada agrupación se ensayó individualmente.

Virus y células La cepa DV-1-TVP, la cepa DV2-JAM (Jamaica), la cepa DV2-Nueva Guinea C, la cepa DV2-16881, la cepa DV3-PAH881 (Tailandia) y la cepa DV4-1086 se propagaron en monocapas de célula AP61 de mosquito (Aedes pseudoscutellaris) después de haber experimentado pasajes de célula limitados. Es de notar, que el DV producido en células de mamífero dio resultados similares que los virus que se originan de células de insecto. Se evaluaron varias concentraciones de virus por análisis de citometría de flujo (FACS) en células C6/36 y se expresaron como unidades infecciosas FACS (FIU). Las células HEK 293T, A549, VERO, y Huh7 5.1 (un obsequio de C.Rice, New York, USA) se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina. Los astrocitos y células epiteliales primarias humanas se compraron de LONZA y cultivaron de acuerdo con las condiciones fabricadas.

DV2-JAM (Jamaica) y WNV (cepa Israelí IS-98-STI se propagaron en monocapas de células AP61 de mosquito (Aedes pseudoscutellaris) como se describe anteriormente. YFV (cepa YFV D17) se cultivó y tituló en células Vero. HSV-1 (F) se propagó y tituló en células Vero como se describe en cualquier lugar (Taddeo y otros 2004). Chikungunya (cepa CHIKV-21) se cultivó en células de insecto C6/36.

Proteínas y anticuerpos Gas6 de murino recombinante carente del dominio Gla N-terminal Gla (rmGas6AGla), IgGl-Fc, TYR03-FC, AXL-Fc, DC-SIGN-Fc, TIM-3-Fc y NKG2D-FC humanos recombinantes fueron de R&D systems. Los anticuerpos fueron como sigue: TIM-1 mouse anti-humano monoclonal (mAb) (clon 219211), TYR03 anti-humano (clon 96201), AXL anti-humano (clon 108724), isotipo IgG2b (MAB004), isotipo IgGl (clon 11711), PE-conjugado DC-SIGN anti-humano (clon Clone 120507), isotipo PE-conjugado IgG2B (clon 133303), TIM-1 anti-humano (AF1750) policlonal de cabra (pAb), TIM-4 anti-humano (AF2929), Tyro3anti-humano (AF859), AXL anti-humano (AF154) se compraron de R&D systems. La fosfatidilserina anti-humana monoclonal de ratón (1H6) se compró de Millipore. El IgG-HRP anti-humano de conejo policlonal fue de DakoCytomation y el IgG-HRP anti-cabra de Burro fue de Santa Cruz biotechnologies.

Cons truc tos de Plásmido Los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genes Tim-1 y Tim-4 amplif icaron de ADNc respectivamente comprados de Life Technologies y Origene . El ORF de Tim-3 se amplificó del clon de ADNc identif icado en la clasificación. Todos los ORF de TIM se clonaron en los vectores pADNC3 . 1 y pTRIP utilizando los sitios de restricción BamHI y Xhol .

Los ORF de los genes Tyro3 y Axl se amplificaron de clones ADNc identificados en la clasif icación y clonaron en el vector pTRIP. Para crear pTRIP-T ro3, el ORF se amplificó y el sitio Ba HI interno se removió simultáneamente utilizado mutagenesis silenciosa específica del sitio (T1155C) mediante el método de extensión de traslape. Un primer fragmento se amplificó con el cebador externo 5' CGGGATCCCGC ATG GGG CTG AGG CGG AGC ATGG (SEC ID NO: 37, codón de inicio en negrillas; el sitio de endonucleasas de restricción subrayado) y el cebador interno 5' GTCCITriGGGGGTCCCAGCCTGTCAAATTCGC (SEC ID NO: 38, nucleótido mutado subrayado) . El segundo fragmento se amplificó con el cebador interno 5 ' GCCAATTTGACAGGCTGGGACCCCCAAAAGGAC (SEC ID NO : 39 , nucleótido mutado subrayado) y el cebador externo 5 ' CCGCTCGAGCGG CTA ACA GCT ACT GTG TGG CAG TAG CCC (SEC ID NO : 40 , codón de detención en negrillas , sitios de endonucleasas de restricción subrayados) . Después de la purificación, ambos fragmentos se mezclaron y el ORF de longitud completa f inalmente se amplif icó con los dos cebadores externos . Este producto se clonó como un fragmento digerido BamHI y Xhol en un plásmido pTRIP igualmente digerido . El ORF Axl se amplificó con los oligos 5 ' CGGGATCCCGC ATG GCG TGG CGG TGC CCC (SEC ID NO : 41) y 5 ' CCGCTCGAGCGG TCA GGC ACC ATC CTC CTG CCC (SEC ID NO : 42 ) . Este fragmento se clonó como un fragmento BamHI/ Xhol en el plásmido TRIP igualmente digerido . Los mutantes de sustitución de alanina de Tim-1 , Tim-4 y Axl , se generaron utilizando el Kit de Mutagenesis Dirigida al Sitio de Cambio Rápido (Agilent) .

Establecimiento de líneas de células estables que sobre -expresan TIM-1, TIM-4, TYR03 y AXL Los pseudovirus se generaron de acuerdo con el protocolo de transfección de calcio-fosfato convencional mediante la co- transfección de constructos pTRIP con plásmidos que codifican HIV gag-pol y la proteína G (VSVg) del encapsulamiento del virus stomatis vesicular en células 293T. Dos días más tarde, los sobrenadantes se cosecharon, aclararon por centrifugación a baja velocidad, y las pseudopartículas se concentraron por ultracentrifugación. Los granulados se volvieron a suspender en regulador de pH TME (Tris 50 mM, NaCl 100 mM y EDTA 0.5 mM) , alicuotaron y almacenaron a -80°C. Las células 293T ( 1.5 x 105) se transdujeron con pseudovirus que llevan el ORF deseado. Las poblaciones de células con alta expresión en superficie celular de TIM-1, TIM-4, TYR03 y AXL se clasificaron con un BD FACSAria II (Becton Dickinson) con el software FACSDiva 6 . 1 .2 (Becton Dickinson) .

Producción de TIM-Fcs y rGas6 Las proteínas de fusión TIM-1 y TIM-4 con IgGl humano se generaron como sigue. El ectodominio TIM-1 (residuos 21-290) se amplificó con el cebador 5' ATCGGAGATATCT GTA AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CC (SEC ID NO: 43) y el cebador 3' TCTGGAAGATCTTCC TTT AGT GGT ATT GGC CGT CAG (SEC ID NO: 44). El ectodominio TIM-4 (residuos 25-314) es amplificó con el cebador 5' ATCGGAGATATCA GAG ACT GTT GTG ACG GAG GTT TTG GG (SEC ID NO: 45) y el cebador 3' TCTGGAAGATCTTTG GGA GAT GGG CAT TTC ATT CTTC (SEC ID NO: 46). Ambos productos PCR se clonaron en pFUSE-hIgGl-Fc2 (Invivogen) utilizando los sitios de restricción EcoRV y BglII (primero y último codones TIM en negrillas; sitios de endonucleasa de restricción subrayados). Los vectores que expresan la fusión de TIM-1- y TIM-4-Fc se transíectaron en células 293T en Medio de Dulbecco Modificado de Iscove suplementado con 10% de FBS y se cultivaron después de la transfección en OPTIPRO-SFM (Life Technologies). Ambos medios se suplementaron con P/S y L-glutamina. Cuatro días post-transfección, los sobrenadantes se cosecharon, aclararon por centrifugación y concentraron a través de Amicon 50K MWCO (Millipore). Los TIM-Fc se purificaron en una columna A de Proteína y concentraron/desalaron a través de unidades de filtro 30K MWCO PES (Pierce). Las proteínas se almacenaron en salina regulada en pH con fosfato (PBS), 0.02% de NaN3 y posteriormente alicuotaron a -80°C. Las proteínas se cuantificaron utilizando 280 nm de absorbencia y su pureza se evaluó en condiciones de reducción con tinción Azul Coomassie (R250) de muestras corridas en condiciones de SDS-PAGE.

Un vector de expresión de mamífero se modificó para codificar Gas6 de ratón de longitud completa mediante una etiqueta Hiss escindióle TEV, C-terminal. El constructo se transfectó en células 293T, y las células que expresaron establemente el constructo se seleccionaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco suplementado con 10% de FBS, 0.25 mg/ml de G418, y 100 mg/ml de higromicina. Para los estudios de expresión, las células se cultivaron en medio sin suero suplementado con 10 mM de Vitamina K2, y el medio acondicionado se recolectó después de 72 horas. El Gas6 secretado se aisló utilizando cromatografía por afinidad con perlas Ni-NTA seguido por purificación adicional en una columna de intercambio de ión Hi Trap Q Fast Flow. La proteína de eluyó en 20 mM de Tris, pH 8 con un gradiente de 0-1 M de NaCl, y posteriormente se alicuotó y congeló rápidamente en N2 líquido.

Unión ELISA Para la detección de interacciones directas entre TIM-Fc y DV, las proteínas fusionadas a Fe primero se recubrieron (duplicados, 400 ng/cavidad) en Salina Regulada en pH Tris (TBS) suplementada con 10 mM de CaCl2 en placas de 96 pocilios Maxisorp NUNC-IMMUNO (NUNC), durante la noche a 4°C. Las pocilios se lavaron con TBS 10 mM de CaCl2 y saturaron por 2 horas a 37°C con TBS 10 mM de CaCl2, 2% de BSA. Después de un lavado extensivo con TBS 10 mM de CaCl2, 0.05% de Tween, partículas DV (5.106 unidades infecciosas FACS (FIU)/pocilios) se agregaron e incubaron por 2 horas a 4°C. Las partículas unidas se detectaron con el anticuerpo 4G2 biotinilado (1 mg/ml) y Estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP)(R&D systems).

Para los experimentos de combinación Gas6, las partículas DV (107 FIU) se recubrieron a 4°C durante la noche por duplicado. Después del bloqueo con 2% de BSA en PBS CaCl2/MgCl2 a 37°C por 1 hora, las pocilios se incubaron con proteínas rGas6 (2 pg/ml) y proteínas Fc-quimera (2 pg/ml) por 1 hora a 37°C in TBS 10 mM de CaCl2í 0.05% de Tween. Las pocilios se lavaron extensivamente y las Fc-quimeras unidas se detectaron con el anticuerpo IgG anti-humano de conejo conjugado con HRP. Para los experimentos de unión de Gas6, las partículas DV (107 FIU) o PtdSer (3-sn-Fosfatidil-L-serina se cerebro de bovino) se recubrieron durante la noche por duplicado. Las pocilios se incubaron con proteínas rGas6 (2 pg/ml) y lavaron extensivamente. Las proteínas Gas6 unidas se marcaron con un anticuerpo policlonal anti-Gas6 de cabra y detectaron con un anticuerpo IgG anti-cabra de burro conjugado con HRP (Santa Cruz Biotechnology).

PtdSer se detectó sobre partículas DV recubiertas (107 FIU) usando el mAb 1H6 anti-PtdSer (10 mg/ml) y un anticuerpo IgG anti ratón de conejo conjugado con HRPen PBS BSA 2% .

Derribamiento del virus Las partículas DV (107 FIU) se incubaron durante la noche a 4°C con 2 mg de proteínas Fc-quimera proteínas en TBS, 10 mM de CaCl2. Las perlas de Sefarosa de Proteína G saturadas con BSA (GE Healthcare) se agregaron e incubaron por 4 horas a 4°C. Las perlas se lavaron 4 veces con TBS, 10 mM de CaCl2, 0.05% de Tween, y el material unido se resolvió en IX regulador de pH Laemmli en condiciones no de reducción. La glicoproteína encapsulada unida E a nitrocelulosa se detectó con el mAb 4G2 y el anticuerpo IgG anti-ratón de conejo conjugado con HRP (Sigma-Aldrich).

Ensayo de Unión de Celula Las células 293T que expresan TIM- 1 , TIM-4 , TYR03 , AXL o DC-SIGN (4 x 105) se incubaron con el MOI indicado de DV por minutos a 4 °C en regulador de pH de unión (DMEM, NaN3 0 . 05%) con ya sea 2% de BSA o 5% de FBS. Las células se incubaron con 100 U de heparina por 30 min a temperatura ambiente, antes de la incubación con el virus. Las células se lavaron dos veces con regulador de pH de unión frío, una vez con DMEM frío sin suero, y fijaron en PBS-PFA 2% a 4°C por 20 minutos. Las partículas DV absorbidas por la superficie de la célula se tiñeron con el anticuerpo 4G2 encapsulado de anti-panf lavivirus ( 5 pg/ml ) y analizó por citometría de flujo. Para los ensayos de combinación, las células se incubaron simultáneamente con el virus y rGas6 (10 mg/ml).

Análisis de Citometría de flujo Los análisis de citometría de flujo se realizaron por el siguiente protocolo convencional en la presencia de 0.02% de NaN3 y 5% de FBS en PBS frió. Para los ensayos de infección, las células infectadas se fijaron con PBS más 2% de (v/v) de paraformaldehído (PFA), permeabilizaron con 0.5% (p/v) de saponina, seguido por tinción con mAb 2H2 de ratón detectando PrM DV (2 pg/ml), o un mAb NS1 de ratón que detecta la proteína-1 no estructural (1 pg/ml). La infección por HSV-1 se detectó con mAb de ratón anti-ICP4 (clon 10F1, 0.3 pg/ml; Santa Cruz Biotechnology). La infección por WNV, YFV y Chikungunya se detectó con el anticuerpo anti-proteína E (4G2) y un anticuerpo monoclonal de ratón frente a la glicoproteína encapsulada E2 (3E4). Después de 45 minutos, los anticuerpos primarios se marcaron con inmunoglobulina anti-ratón de cabra policlonal/RPE (DakoCytomation). Finalmente, los porcentajes de células infectadas se evaluaron por citometría de flujo en un LSR con el software CellQuest (Becton Dickinson). Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star).

Ensayo de Inmuno fluorescencia Las células se cultivaron en un Portaobjetos de Cámara Lab-Tek II-CC2 (Nunc, Roskilde, Dinamarca) e incubaron con las cantidades indicadas de DV2-JAM por 24 o 48 horas. Después de la incubación, las células se fijaron con PBS-PFA 4% (v/v), permeabilizaron con 0.05% (p/v) de saponina en PBS, e incubaron 10 min en PBS glicina 0.1 M, seguido por incubación con regulador de pH de bloqueo antes de la inmuno-tinción de la proteína DV PrM (2H2, 5 mg/ml). Los porta-objeticos se montaron con Moviol conteniendo ,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción del núcleo (Life Technologies).

Inhibición del ensayo de infección Para los experimentos de inhibición, las células se cultivaron en placas de 24 pocilios, se incubaron por 30 minutos antes de la infección con medio conteniendo las cantidades indicadas de los anticuerpos anti-TIM y/o anti-TAM. Se utilizaron concentraciones idénticas de IgG de cabra normales como control simulado respectivo. Después de 3 horas de incubación con DV o HSV en la presencia de los inhibidores, el medio se cambió y las células se incubaron con medio de cultivo. La infección se cuantificó por FACS como se indica anteriormente.

Interferencia de ARN Las células A549 y los astrocitos primarios se transíectaron temporalmente utilizando el protocolo iARNMax de Lipofectamina (Life Technologies) con 10 nM de ARNsis Final. Después de 48 horas, las células se infectaron al MOI indicado, y los porcentajes de las células infectadas se cuantificaron 24 horas post-infección por citometría de flujo. Las agrupaciones de ARNsi (ON-TARGET lus SMARTpool) utilizadas en este estudio fueron de Dharmacon: TIM-1 (L019856-00), AXL (L-003104-00). Se utilizó el control negativo no activado (NT) como control.

Análisis Estad sticos Los análisis de representación gráfica y estadísticos se llevaron a cabo utilizando el software Prism5 (GraphPad Software). A menos que se afirme lo contrario, los resultados se muestran como medias +/- desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) d 3 experimentos independientes. Las diferencias se ensayaron para significancia estadística utilizando la prueba t de dos colas emparejada.

Resultados y discusión Para identificar nuevos factores de entrada DV, se clasificaron 1728 proteínas de membrana para su habilidad para convertir la línea celular 293T pobremente susceptible sensible a la cepa DV2-JAM derivada de mosquito primario. Esta clasificación identificó L-SIGN, confirmando la validez del método, pero también el dominio de inmunoglobulina de célula T y el dominio de mucina (TIM)-3, TYR03 y AXL como nuevos receptores DV potenciales. Estos pertenecen a dos diferentes familias de receptores de transmembrana que se unen directamente (TIM) o indirectamente (TAM) a fosfatidilserina (PtdSer), una señal de 'cómeme' que promueve el envolvimiento de células apoptóticas. El papel de estos receptores y de PtdSer durante infección DV después se caracterizó.

TIM-3, junto con TIM-1 y TIM-4, modulan la tolerancia inmunitaria, igualmente a través de la eliminación de las células muertas. Además, el virus de Hepatitis A y filovirus utilizan TIM-1 como un receptor. Para examinar si los receptores TIM potencian la infección DV, las células 293T que establemente expresan TIM-1 y TIM-4 o TIM-3 se generaron y confrontaron con DV2-JAM. Las células parentales, que no expresan moléculas TIM, se infectaron mínimamente por el virus (Figura 1). La expresión de TIM-3 resultó en un modesto aumento del porcentaje de células infectadas (Figura 1). Sorprendentemente, la expresión potenció la expresión de TIM-1 o TIM-4 hasta 500 veces (Figura 1). Es de notar, que la infección se evaluó midiendo las recién sintetizadas proteínas NS1, indicando que TIM media productivamente la infección DV. La potenciación de la infección DV no ocurre en células que expresan BAll, otro receptor PtdSer. TIM-1 o TIM-4 también median la eficiente infección por medio de otros tres serotipos DV (Figura 2). Las células 293T parentales infectadas por las cepas C de Nueva Guinea DV2 adaptada en laboratorio (NGC) y 16681, sugieren que algunos aislados pueden utilizar otro ís) receptor (es) (Figura 3 ) . Sin embargo, la infección por DV2 NGC o 16681 tambien se potenció fuertemente por TIM-1 o TIM-4 (Figura 3) . Juntos, estos datos indican que los receptores PtdSer TIM-1 y TIM-4, y a un grado menor TIM-3, son nuevos factores celulares que promueven la infección DV.

Si los viriones DV que se unen a proteínas TIM se examinan conduciendo un ensayo de eliminación con TIM-Fc soluble (la región extracelular de TIM fusionado a FC de inmunoglobulina) . Las partículas DV-2 se incubaron con TIM-l-Fc o TIM-4 -Fe, o con DC-SIGN-Fc como un control positivo. El virus precipitado se analizó con Western blotting . El DV unido a los constructos TIM-1 , TIM-4 y DC-SIGN, y no a constructos de control negativos NKG2D-FC o IgGl-Fc (Figura 4 ) . Esto se conf irmó por ELISA usando pocilios recubiertas con TIM-l-Fc (Figura 5 ) . Además , el DV ef icientemente se acopló a 293T-TIM- 1 y 293T-TIM-4 pero no a células de control . Juntos , estos resultados muestran que TIM-1 y TIM-4 se une a DV y media el acoplamiento del virus a células obj etivo .

TIM-1 y TIM-4 reconocen PtdSer en células apoptóticas . Además se examinó si la infección DV mediada por TIM depende de PtdSer . Un Ab monoclonal (mAb) ant i -PtdSer , pero no su control de isotipo, se unió en una forma dependiente de la dosis a placas ELISA recubiertas con DV (Figura 6 ) , indicando que PtdSer está asociado con partículas DV. DV-2 después se preincubó con anexina V (ANX5) , una proteína de unión PtdSer bien documentada. ANX5 inhibió la infección de 293T-TIM-1 y 293T-TIM-4 pero no de células 293T-DCSIGN (Figura 7). Los estudios estructurales de TIM han mostrado que PtdSer se une a una cavidad denominada el sitio de unión de ligando dependiente del ión metálico (MILIBS, por sus siglas en inglés). Los mutantes de esta cavidad (TIM-1 N114A o D115A, TIM-4 N121A) se designaron, que ya no mediaron la infección DV-2 a pesar de que se expresaron correctamente en la superficie celular (Figura 8). Por lo tanto, las moléculas PtdSer están asociadas con viriones DV y son requeridas para la infección DV mediada por TIM. TYR03 y AXL pertenecen a la familia TAM, un grupo de tres proteína tirosina cinasas del receptor esenciales para la depuración de las células apoptóticas. Los ligandos TAM, Gas6 y ProS, juegan un papel clave en este proceso. A través de su dominio Gla N-terminal, reconocen el PtdSer expresado en células apoptóticas, y combinan estas células con un receptor TAM en la superficie de los fagocitos. Los receptores TAM han demostrado que promueven la infección por los virus del Ebola y Lassa y Gas6 se encontró que mejora la infección por vectores lentivirales o virus de vacuna vía la combinación del PtdSer de membrana de virus para AXL.

Después se investigaron los roles respectivos de TIM y TAM en células que naturalmente expresan estos receptores. Al menos una de las cuatro moléculas (TIM-1, TIM- 3, TYR03, AXL) se detectó en un panel de líneas de células sensibles a DV. La línea de células Huh7 5.1 expresa solamente TIM-1. Un Ab anti-TIM-1 inhibió la infección DV2 pero no la infección por el virus de Herpes Simplex (HSV-1) (Figura 9). La línea de células A549 expresa ambos TIM-1 y AXL. La infección DV2 se redujo parcialmente con un Ab anti-TIM-1 o anti-AXL administrado solo, a pesar de que dos Ab en combinación inhibieron completamente DV2 (Figuras 10 y 11), DV3 (Figura 12) pero no la infección por HSV-1. Se obtuvieron resultados similares en células Vero que expresan TIM-1 y AXL. TIM-1 o AXL después se silenciaron por ARN de interferencia en células A549 (Figura 13). La infección DV se redujo en células silenciadas con AXL y se inhibió casi totalmente en células silenciadas con TIM-1. Notablemente, para células 293T transíectadas con TIM- y TAM-, ANX5 bloqueó la infección DV de células A549 (Figura 14). En conjunto estos resultados muestran que los receptores TIM y TAM pueden cooperar naturalmente para promover la infección DV y que PtdSer está mediando la infección en células que endógenamente expresan los receptores.

Las células epiteliales y los astrocitos con objetivos DV in vivo. Las células epiteliales de riñón primarias y los astrocitos expresan AXL y no TYR03, TIM-1 o TIM-4. La infección DV se redujo significativamente por un Ab anti-AXL en ambos tipos de célula. El AXL silenciado en astrocitos también reduce significativamente la infección DV2-JAM. Por lo tanto, como se demuestra por AXL, los receptores PtdSer identificados en la clasificación están involucrados en la infección de células primarias humanas, una observación que deberá ser relevante para la patogénesis DV.

Este reporte identifica los receptores TIM y TAM como nuevos factores celulares que median la unión DV, y la infección de células objetivo (Figura 15). PtdSer es una señal "cómeme" para el reconocimiento y depuración de células apoptóticas por fagocitos. De esta forma, DV utiliza una estrategia de "imitación apoptótica" para infectar células. Al utilizar al menos cuatro diferentes receptores PtdSer, solos o en combinación, DV puede ganar acceso a múltiples tipos de células, consistente con el amplio tropismo viral observado en pacientes infectados con DV.

La membrana DV se deriva germinando en el ER, que contiene PtdSer en el lado luminal, sugiriendo un mecanismo obvio a través del cual PtdSer se convierte en incorporado dentro de los viriones. Sin embargo, los estudios estructurales indican que la membrana no se expone fácilmente en partículas maduras, en donde se ocultaría por debajo de una coraza de icosaedro protectora formada por la proteína E. Es plausible que las moléculas TIM y TAM u otros receptores puedan desplegar débiles interacciones con la proteína E que activa la apertura de la coraza de icosaedro, llevando a la exposición de la membrana viral, como se sugiere recientemente por los estudios con complejos Ab. También, los reportes recientes indican un grado importante de heterogeneidad en esta coraza de glicoproteína, que despliega una mezcla de una mezcla de superficies inmadura y madura. Las regiones de tipo maduras podrían exponer parches de membrana, de tal forma que PtdSer estaría accesible para interactuar con los receptores TIM y TAM.

Para determinar si los receptores TIM y TAM median la infección viral mediante otras especies virales, las células que expresan TIM-1- y TIM-4 se confrontaron con el Virus del Nilo del Occidente DV2-Jam (WNV), la cepa de la vacuna del Virus de Fiebre Amarilla (YFV-17D), y el Virus 1 de Herpes Simplex (HSV-1). La infección viral se cuantificó por citometría de flujo utilizando Anticuerpos específicos (Figura 16). Los datos muestran que TIM-1 y TIM-4 masivamente potencian la infección WNV, la sensibilidad ligeramente sobre-regulada a YFV-17D, pero no tuvieron efecto sobre HSV-1. Se obtuvieron similares resultados para células que expresan TYR03- y AXL- (Figura 17). Juntos, estos datos indican que los receptores PtdSer, TIM y TAM ambos son factores celulares que promueven la infección por flavivirus.

Además, fue de interés si este mecanismo representa un mecanismo general explotado por los virus que expresan o incorporan PtdSer en su membrana. Las células Parentales 293T, las células 293T que expresan TIM-1 y TIM-4 se infectaron con Chikungunya (Chick). La infección se cuantificó 48 horas después por citometría de flujo usando un anticuerpo monoclonal de ratón frente a la glicoproteína encapsulada E2 (3E4). Los resultados (Figura 18) muestran que TIM-1 y TIM-4 masivamente potencian la infección Chikungunya. Se obtuvieron resultados similares para células que expresan TYR03 y AXL, su expresión ectópica se mejora así como la infección Chikungunya (Figura 19).

Estos datos muestran que TIM y TAM facilitan una infección viral que representa un mecanismo general explotado por virus que expresan o incorporan PtdSer en su membrana para una infección óptima.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor TIM para usarse en la prevención o tratamiento de una infección viral, en donde el inhibidor es: (i) un inhibidor del receptor TIM, y/o (iii) una proteína de unión de fosfatidilserina.

2. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el receptor TIM es TIM-1, TIM-3 o TIM-4.

3. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor del receptor TIM es un anticuerpo del receptor anti-TIM, un ácido nucleico antisentido, un receptor TIM mimético o una variante.

4. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la proteína de unión a fosfatidilserina es un anticuerpo anti-fosfatidilserina o Anexina 5.

5. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 3, en donde el inhibidor del receptor TIM es un ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3, o 4.

6. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tal virus es un virus que hospeda fosfatidilserina.

7. Un inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el virus que hospeda fosfatidilserina es un Alfavirus o un Flavivirus.

8. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 7, en donde el Alfavirus es el virus Chikungunya.

9. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 7, en donde el Flavivirus es el Virus del Nilo del Occidente, el Virus de Fiebre Amarilla o el Virus de la Fiebre del Dengue.

10. Un inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el inhibidor es para la administración en combinación con al menos otro compuesto antiviral, ya sea secuencial o simultáneamente.

11. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 10, en donde el otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM.

12. Un inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 11, en donde el inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM es: (i) un inhibidor del receptor TAM, y/o (ii) un inhibidor Gas6.

13. Un inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el inhibidor se formula en una composición farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y adicionalmente al menos otro compuesto antiviral.

15. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque tal al menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM.

16. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque tal inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor TAM es: (i) un inhibidor del receptor TAM, y/o (ii) un inhibidor Gas6.

17. El uso de un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un método in vitro para inhibir la entrada de un virus que hospeda fosfatidilserina en particular un flavivirus en una célula.