MX2014010015A - Receptores de tyro3/axl/mer (tam) como cofactores de entrada de virus. - Google Patents

Receptores de tyro3/axl/mer (tam) como cofactores de entrada de virus.

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MX2014010015A
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Abstract

La presente invención se relaciona con el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM para evitar o tratar cofactores de entrada de virus, en particular infección de virus que alberga fosfatidilserina tal como infección por flavivirus.

Description

RECEPTORES DE TYR03/AXL/MER (TAM) COMO COFACTORES DE ENTRADA DE VIRUS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM para evitar o tratar una infección viral.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las infecciones virales son un riesgo principal de la salud pública. El surgimiento y expansión de enfermedades que ponen en peligro la vida causadas por virus (por ejemplo, fiebre hemorrágica y encefalitis) junto con los enfoques de prevención convencionales aún no satisfechos (por ejemplo, vacunas) resaltan la necesidad de explorar estrategias nuevas para dirigirse contra estos patógenos mortales.
El género Flavivirus, por ejemplo, abarca más de 70 virus de envoltura pequeños que contienen un genoma de ARN de cadena positiva único. Varios miembros de este género tal como el virus del dengue (DV, por sus siglas en inglés), el virus de la fiebre amarilla (YFV, por sus siglas en inglés) y el virus del Nilo occidental (WNV, por sus siglas en inglés) son patógenos humanos transportados por mosquitos que provocan una diversidad de enfermedades en humanos médicamente relevantes que incluyen fiebre hemorrágica y encefalitis (Gould y Solomon, 2008, Lancet, 372:200-509; No. de Ref.250609 Gubler et al., 2007, Fields Virology, 5a Edición, 1153-1252). La enfermedad del dengue, la cual es causada por cuatro serotipos relacionados antigenicamente (DV1 a DV4), ha surgido como un problema de salud global durante las últimas décadas y es una de las enfermedades arbovirales médicamente más relevantes. Se calcula que 50-100 millones de casos de dengue se producen anualmente y más de 2.5 miles de millones de personas se encuentran en riesgo de infección. La infección puede ser por cualquiera de los cuatro serotipos que provocan enfermedades, que varían desde fiebre ligera a fiebre hemorrágica de dengue que pone en peligro la salud (DHF, por sus siglas en inglés) o síndrome de choque por dengue (DSS, por sus siglas en inglés). Pese a la importancia y la incidencia cada vez mayor de DV como un patógeno humano, actualmente no existe una vacuna autorizada disponible contra DV y la carencia de medicamentos antivirales limita gravemente las opciones terapéuticas.
Los esfuerzos en el futuro para combatir la enfermedad del dengue requieren una mejor comprensión del ciclo de vida del DV. La entrada de DV en las células objetivo es un objetivo promisorio para estrategias de prevención así como terapéuticas antivirales dado que es un determinante mayor del tropismo celular al alcance del hospedador y la patogénesis viral. Durante la infección primaria, DV entra a las células del hospedador por endocitosis mediada por clatrina, un proceso impulsado por la interacción entre glucoproteína viral (proteína E) con receptores celulares. Dentro del endosoma, el ambiente ácido activa una trimerización irreversible de la proteína E que resulta en fusión de las membranas virales y celulares lo que permite la liberación de la cápside viral y del ARN genómico en el citosol. Hasta ahora, las bases moleculares de las interacciones entre DV-hospedador han llevado a que la entrada del virus se entienda poco y existe poco conocimiento acerca de la identidad de uno o varios de los receptores celulares de DV. Se sabe que DV infecta a una amplia gama de tipos de celulas. DV por lo tanto puede aprovechar diferentes receptores, dependiendo de la célula objetivo, o utilizar moléculas de entrada que se expresen ampliamente. Los estudios iniciales indican que los millones de DV realizan contacto inicial con el hospedador al unirse a proteoglucanos de heparano-sulfato sobre la membrana celular. Estas moléculas reconocen los residuos cargados positivamente sobre la superficie de la proteína E y se considera que concentran el virus en la superficie de la célula objetivo antes de sus interacciones con factores de entrada. Numerosas proteínas celulares tales como la proteína de choque térmico 70 (HSP70, por sus siglas en inglés), HSP90, GRP78/Bip, un receptor de lipopolisacárido-CD14 o la laminina de alta afinidad de 37/67 kDa se han propuesto como receptores putativos de entrada de DV. No obstante, su función en la entrada viral permanece poco caracterizada y de relevancia fisiológica poco clara. Hasta ahora, los únicos factores bien caracterizados que participan activamente en el programa de entrada de DV son DC-SIGN que se expresa en células dendríticas, L-SIGN que se expresa sobre células endoteliales sinusoidales en hígado y el receptor de mañosa (MR, por sus siglas en inglés) que se expresa sobre macrófagos. Estas moléculas pertenecen a la familia de receptor de lectina tipo C y unen glucanos unidos a N ricos en mañosa que se expresan sobre la proteína E de DV. No obstante, DV infecta tipos de células que no expresan DC-SIGN, MR o L-SIGN, lo que indica que existen y están por identificarse otros uno o varios receptores de entrada relevantes.
Además de la vía clásica de entrada a célula, la cual es mediada por la interacción de proteína E con receptores de superficie celular, es plausible que los componentes solubles presentes en los fluidos corporales y tejidos puedan interactuar con las partículas de DV e incrementar la internalización del virus. En fundamento con esta hipótesis, un estudio reciente indicó que la captación de WNV en células de mosquito es mediada por lectina tipo C secretada mosGTLC-1. Este factor soluble une partículas de WNV con alta afinidad para putativamente formar un puente con ellas a su receptor celular, mosPTP-1, con lo que se facilita la entrada del virus. Otro ejemplo está representado por el adenovirus humano (HAdV)V5, el cual interactúa con el factor X de coagulación (FX, por sus siglas en inglés) de sangre humana, lo que resulta en la formación de complejos FX-HAdV5 que son el parámetro principal responsable de la captación hepática masiva de partículas de vector HAdV5. En base en la información anterior, es probable que el proceso de entrada de DV probablemente sea más complejo que lo que se consideraba previamente. Es razonable postular que la unión e internalización de DV es un proceso de etapas múltiples que involucra varios receptores y posiblemente componentes solubles que circulan en fluidos corporales que pueden favorecer la unión celular y el tropismo viral de DV.
Actualmente, DV se ha vuelto un problema global y es endémico en más de 110 países. De esta manera, se requiere el desarrollo de un tratamiento profiláctico y curativo para la infección por DV.
Además, descifrar el mecanismo de internalización de DV también puede ser la base para determinar la manera de desarrollar tratamientos contra otras infecciones virales.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra que la expresión ectópica de TYR03 y AXL aumenta la infección por DV. Se incubaron células 293T originales, que expresan TYR03 y AXL con DV2 JAM (MOI de 10) durante 3 horas. Los sobrenadantes se recolectaron 48 horas después y los títulos de virus se determinaron en un análisis de placa C6/36 y se expresaron en unidades formadoras de placa por mi. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. Los datos se muestran como media ± SD.
La figura 2 muestra que la expresión ectópica de TYR03 y AXL aumenta la infección por DV. Se infectaron células 293T originales y que expresan TYR03 y AXL, con DV2 JAM (MOI de 10), DV2 NGC (MOI de 0.05), DV2 16681 (MOI de 0.05), DV1 TVP (MOI de 50), DV3 PAH881 (MOI de 5), DV4 1086 (MOI de 50). El porcentaje de células infectadas se cuantificó 48 horas después. Los datos se muestran como media ± SD.
La figura 3 muestra el aumento de infección por DV por expresión ectópica de TYR03 y AXL. Células 293T originales, que expresan TYR03 y que expresan a AXL se infectaron con DV2 JAM (MOI de 10), WNV (MOI de 0.0008), TFV-17D (MOI de 0.005), cepa de virus de influenza A/WSN/33 (1:5,000) o partícula viral de V1H pseudotipificada VSV (100 ng, p24). La infección se determinó a 48 horas después por FACS y se normalizó a infección en células 293T originales. Los datos se muestran como la media ± SD.
La figura 4 muestra la expresión ectópica de TYR03 y AXL en el incremento de la infección por DV. Células HeLa originales, que expresan TYR03 y que expresan a AXL se infectaron con DV3 (MOI de 30) y WNV (MOI de 0.001) y la infección se clasificó 48 horas despues por FACS utilizando el mAb 2H2 o el mAb anti-proteína E WNV E16. Los datos se muestran como la media ± SD.
La figura 5 muestra la infección por DV y WNV de A549 la cual se inhibe por regulación por disminución de AXL.
Las células A549 transíectadas con ARNsi se infectan con DV3 (MOI de 20) o WNV (MOI de 0.05). El por ciento de células infectadas se cuantifica 24 horas después por FACS. Los datos se muestran ccmo la media ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
La figura 6 muestra la infección por DV y WNV de astrocitos primarios la cual se inhibe por regulación por disminución de AXL. Los astrocitos primarios transíectados con ARNsi se infectan con DV3 (MOI de 5) o WNV (MOI de 0.0001). El por ciento de células infectadas se cuantifica 48 horas después. Los datos se muestran como la media ± SD.
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
La figura 7 muestra que el Ab policlonal anti-AXL humano inhibe la infección por DV. Se incubaron células 293T-AXL, A549 y astrocitos primarios ya sea con anticuerpos de chivo IgG control o anticuerpos de chivo anti-AXL humano (10 mg/ml) 30 minutos antes y durante las 3 horas de incubación con DV3 (MOI de 10). El nivel de infección se cuantificó por FACS. Los datos se muestran como la media ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
La figura 8 muestra que los Ab an i-TYR03 humano y anti-AXL humano inhiben la etapa temprana de infección por DV. Células 293T originales, que expresan TYR03 y que expresan AXL se infectaron con DV2-JAM (MOI de 5). Los anticuerpos indicados (10 mg/ml) se agregaron 30 minutos antes y durante la infección (-30 minutos) o se agregaron 2 horas posteriores a la infección. El por ciento de células infectadas se cuantificó 48 horas después por FACS. Los datos se muestran como la media ± SD. **P < 0.01, ***P < 0.001.
La figura 9 muestra que TYR03 y AXL incrementan la captación de ARN para Dv. Células 293T originales, que expresan TYR03 y que expresan AXL se incubaron con DV2 JAM (MOI de 20) durante 4 horas a 37°C. El nivel de ARN viral para DV2 se determinó por PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un método CT comparativo (método AACT) con GAPDH humano como control endógeno. Los resultados se expresan como múltiplos de diferencia utilizando la expresión en células infectadas 293T como valor calibrador. El experimento se repite dos veces con resultados similares. Los datos se muestran como la media ± SD. **P < 0.01, ***p < 0.001.
La figura 10 muestra que TYR03 y AXL median la entrada a través de la vía dependiente de clatrina. Células HeLa-TYR03 y HeLa-AXL se transfectaron de manera inversa con el acumulado de ARNsi indicado (20 nM) y se infectaron con DV3 (MOI de 30) tres días después de la transíección. El porcentaje de células infectadas se cuantificó 48 horas después por FACS. Los datos se muestran como la media + SD. **P < 0.01, ***P < 0.001.
La figura 11 muestra que los dominios extracelulares solubles TYR03 y AXL inhiben la infección por DV de células 293T-TYR03 y 293T-AXL. Se incubó DV2 JAM (MOI de 10) con IgGl-Fc (control), TYR03-FC o AXL-Fc (10 m9/ih1) 30 minutos y se utilizaron para infección. El por ciento de células infectadas se cuantificó 48 horas después por FACS. Los datos se muestran como la media ± SD. ***p < 0.001.
La figura 12 muestra que uno o varios componentes de FBS incrementan la infección viral. Se infectaron células 293T-TYR03, 293T-AXKL y 293T-DC-SIGN con DV2- JAM (MOI de 10) en presencia de concentraciones diferentes de FBS. Después de 3 horas de incubación se sustituyó al medio con medio suplementado con FBS 10%. El por ciento de células infectadas se cuantificó 48 horas después por FACS y se normalizó a una condición de infección de 10%. Los datos se muestran como la media ± SD. ***P < 0.001.
Figura 13: rmGas6 incrementa la unión de DV a células que expresan TYR03 y AXL. Células 293T originales, que expresan TYR03 y que expresan AXL se incubaron con DV3 (MOI de 30) en medio libre de suero que contiene rmGas6 (1 m9/ih1) o volumen equivalente de PBS (en falso) durante 90 minutos a 4°C. La media de intensidad fluorescente se midió por FACS y se normalizó a MFI en células no infectadas. Los datos se muestran como la media ± SD. ***P < 0.001.
La figura 14 muestra mejoramiento de rmGas6 en infección por DV mediada por TYR03 y AXL. 293T-TYR03 y 293T-AXL se incuban con DV2 JAM (MOI de 5) en medio libre de suero que contiene rmGas6 (1 m9/th1) o un volumen equivalente de PBS (en falso). Después de 3 horas de incubación se sustituye el medio por medio suplementado con FBS 10%. El por ciento de células infectadas se cuantifica 48 horas después por FACS y se normaliza a infección en ausencia de rmGas6. Los datos se muestran como media +SD, ***P<0.001.
La figura 15 muestra que rmGas6 interactúa con DV a través de su dominio Gla. Se incuba JAM (107 FIU) recubierto con DV2 con rmGas6 o rmGas6úGla (2 mg/ml) durante 1 hora. Se detecta Gas6 unido por la prueba de ELISA utilizando un anti-Gas policlonal de chivo (10 g/ml) y anticuerpo de burro anti-IgG de chivo conjugado con HRP. Los datos se muestran como la media + SD. ***P<0.001.
La figura 16 muestra que la anexina V inhibe el mejoramiento mediado por TAM de infección de DV. Se incuba JAM con DV2 (MOI de 5) con anexina V (25 pg/ml) en medio libre de suero y se utiliza para infectar células que expresan TYR03, AXL y DC-SIGN- El porcentaje de células infectadas se cuantifica 48 horas después por FACS y se normaliza a infección en ausencia de anexina V. Los datos se muestran como la media ¿SD. ***P<0.001.
La figura 17 muestra que Gas6AGla no forma un puente entre DV a TYR03 y AXL. Se incuban partículas de JAM recubiertas con DV2 (107 FIU) con las quimeras Fe humanas indicadas (2 mg/ml) en presencia o ausencia de rGasS (2 pg/ml). Las quimeras de Fe unidas se detectan utilizando un anticuerpo de conejo anti-IgG humano conjugado con HRP. Los datos se muestran como la media +SD. ***P<0.01, ***P<0.001.
La figura 18 muestra que Gas6AGla inhibe el mejoramiento de infección por DV mediado por TYR03 y AXL. Se incuban células con r Gas6 (10 pg/ml) o rmGas6 (1 pg/ml) 30 minutos antes y durante la 3 horas de incubación con JAM con DV2 (MOI de 5). El por ciento de células infectadas se cuantifica 48 horas después. Los datos se muestran como la media +SD. ***P<0.01, ***P<0.001.
La figura 19 muestra que Gas6 AGla inhibe la unión por DV-3 a células CHO-745 que expresan TAM. Los datos se muestran como la media +SD. ***P<0.01, ***P<0.001.
La figura 20 muestra un modelo esquemático de unión mediada por Gas6 de DV y posibles mecanismos de incremento de infección. La función de Gas6 como molécula que forma un puente al unir simultáneamente a PtdSer expuesto a la envoltura viral de DV, a través del dominio Gla y al receptor TAM a través del dominio similar a SHGB C-terminal. El complejo DV-Gas6 puede actuar como "super" agonistas de receptores de TAM y activa una cascada de transducción de señal que resulta ya sea en inhibición de inmunidad innata o movilización de efectores de endocitosis que incrementa la internalización del virus. En segundo lugar, los receptores de TAM pueden actuar como un factor de unión, lo que incrementa localmente la concentración de DV y facilita la interacción de la proteina E con uno o varios de los receptores del virus bona fide. Finalmente, DV-Gas6 también puede inducir reclutamiento del receptor de virus bona fide por dimerización heterotípica con TYR03 y AXL, por lo que se forma un complejo de entrada trimérico requerido para endocitosis mediada por clatrina de partículas de DV.
La figura 21 muestra receptores de TIM que median infección de flavivirus. Los receptores de TIM se utilizan por DV2-JAM, virus del Nilo Occidental y virus de fiebre amarilla. Las células originales y 293T que expresan receptores TIM se infectan por DV2-JAM, WNV (cepa Israelí IS_98-STI). La cepa de vacuna de virus de fiebre amarilla (YFV-17D) y virus de herpes simple 1 (HSV-1). La infección viral se cuantifica dos días después por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos. Los datos son medias + SEM de por lo menos tres experimentos independientes.
La figura 22 muestra el incremento de infección por TYR03 y AXL por DV y por otros flavivirus. Células 293T originales y que expresan TYR03 y AXL se exponen con DV2-Jam, WNV, YFV-17D y HSV-1. La infección se determinó 24 horas después por citometría de flujo. Los datos se representan como media +SEM a partir de tres experimentos independientes por duplicado.
La figura 23 muestra el incremento de expresión ectópica de TIM-1 y TIM-4 que mejora la infección por Chikungunya. Células 293 que expresan TIM1, TIM4 y células 293T originales se infectan con Chikungunya (Chick). La infección se cuantifica 48 horas después por citometría de flujo, utilizando anticuerpo monoclonal de ratón contra la glucoproteína de envoltura E2 (3E4).
La figura 24 muestra el incremento de expresión ectópica de TYR03 y AXL en la infección por Chikungunya. Células 293T que expresan TYRO, AXL y las células 293T originales se infectan con Chikungunya (Chik). La infección se cuantifica 48 horas después por citometría de flujo, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón contra la glucoproteína de envoltura E2 (3E4).
La figura 25 muestra que las moléculas endógenas TIM-1 y AXL median la infección por DV. Las células A549 se infectan con las cepas DV indicadas de HSV-1 en presencia de anti-TIM-1, anti-AXL o IgG control. Los niveles infectados se cuantifican 24 h después por citometría de flujo y se normalizan a infección en presencia de IgG control. Los datos son medias _+ SD de por lo menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.
La figura 26 muestra que las moléculas endógenas TIM-1 y AXL median la infección por DV. El análisis de inmunofluorescencia representativo de A549 infectado con DV2-JAM en presencia del Ab indicado. Verde, anti-PrM 2H2, azul DAPI. Barra de escala: 100 mm. Los datos son medias ¿SD de por lo menos tres experimentos independientes. **p < 0.001, ***p < 0.0001.
La figura 27 muestra la infección de DV mediada por TIM-1 y AXL endógeno. Se infectan células A549 con DV3-PAH881 (MOI = 10). Antes de la infección las células se incuban con la combinación indicada de anticuerpos policlonales anti-TIM-1 y anti-AXL. Los niveles de infección se cuantifican 24 horas después por citometría de flujo y se normalizan a nivel de infección en presencia de anticuerpo control IgG. Se muestran medias + SD de tres experimentos independientes por duplicado.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEC ID NO: 1 muestra la secuencia de ARNsi 5'- ACAGCGAUUUAUGACUA-3' contra AXL.
La SEC ID NO: 2 muestra la secuencia de ARNsi 5'- GGUACCGGCUGGCGUAUCA-3' contra AXL.
La SEC ID NO: 3 muestra la secuencia de ARNsi 5'-GACGAAAUCCUCUAUGUCA-3' contra AXL.
La SEC ID NO: 4 muestra la secuencia de ARNsi 5'-GAAGGAGACCCGUUAUGGA-3' contra AXL.
La SEC ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor TYRO-3 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_006284.2.
La SEC ID NO: 6 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor TYRO-3 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_006293.3.
La SEC ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor AXL al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_001690.2.
La SEC ID NO: 8 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor AXL al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_068713.2.
La SEC ID NO: 9 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor AXL al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_021913.3.
La SEC ID NO:10 muestra la secuencia de acido nucleico del receptor AXL al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001699.4.
La SEC ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor MER al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP 006334.2.
La SEC ID NO: 12 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor MER al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_006343.2.
La SEC ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_000811.1.
La SEC ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_001137417.1.
La SEC ID NO: 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_001137418.1.
La SEC ID NO: 16 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_000820.2.
La SEC ID NO: 17 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001143945.1.
La SEC ID NO: 18 muestra la secuencia de ácido nucleico de la proteína Gas6 a la que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM 001143946.1.
La SEC ID NO: 19 muestra la secuencia de la proteína Gas6AGla variante.
La SEC ID NO: 20 muestra la secuencia de aminoácidos de anexina 5 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_001145.1.
La SEC ID NO: 21 muestra la secuencia de ácido nucleico de anexina 5 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001154.3.
La SEC ID NO: 22 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de TIM-1 al que se hace referencia bajo GenBank número AAH13325.1.
La SEC ID NO: 23 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-1 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_012206.2.
La SEC ID NO: 24 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-1 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001099414.1.
La SEC ID NO: 25 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-1 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001173393.1.
La SEC ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de TIM-3 al que se hace referencia bajo Gen Bank número AAH20843.1.
La SEC ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de TIM-3 al que se hace referencia bajo Gen Bank número AAH63431.1.
La SEC ID NO: 28 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-3 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_032782.4.
La SEC ID NO: 29 muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de TIM-4 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_612388.2.
La SEC ID NO: 30 muestra la secuencia de aminoácido del receptor de TIM-4 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NP_001140198.1.
La SEC ID NO: 31 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-4 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_138379.2.
La SEC ID NO: 32 muestra la secuencia de ácido nucleico del receptor de TIM-4 al que se hace referencia bajo NCBI, secuencia de referencia NM_001146726.1.
La SEC ID NO: 33 muestra la secuencia de ARNsi 5'- AAACUCAACUGUUCCUACA-3' contra TIM-1.
La SEC ID NO: 34 muestra la secuencia de ARNsi 5'-CGGAAGGACACACGCUAUA-3' contra TIM-1.
La SEC ID NO: 35 muestra la secuencia de ARNsi 5'- GCAGAAACCCACCCUACGA-3' contra TIM-1.
La SEC ID NO: 36 muestra la secuencia de ARNsi 5'- GGUCACGACUACUCCAAUU-3' contra TIM-1.
La SEC ID NO: 37 muestra la secuencia del receptor de TIM-1 al que se hace referencia bajo UniProt Número Q96D42 .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los inventores han encontrado que la infección por DV es mediada por interacción entre fosfatidilserina (PtdSer) presente en la superficie de la envoltura viral de DV y el receptor de TAM presente en la superficie de la célula hospedadora y que esta interacción se puede bloquear, con lo que se inhibe la entrada de DV en las células hospedadoras y se evita la infección de DV.
Además, los inventores encontraron que esta interacción entre fosfatidilserina (PtdSer) y receptores de TAM no sólo es usada por otros flavivirus tales como el virus de fiebre amarilla (YFN, por sus siglas en inglés) y el virus del Nilo occidental (WNV, por sus siglas en inglés) sino también, por ejemplo, por el virus Chikungunyia que muestra que esta interacción puede representar un mecanismo general aprovechado por los virus que incorporan fosfatidilserina (PtdSer) en su membrana.
De esta manera, la invención se relaciona con un inhibidor de la interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM para usarse en la prevención o tratamiento de una infección viral, en particular una infección viral que alberga fosfatidilserina (PtdSer) tal como una infección por un flavivirus, en donde el inhibidor preferiblemente es: (i) un inhibidor de receptor de TAM, (ii) un inhibidor de Gas6, y/o (iii) una proteína de unión de fosfatidilserina.
Preferiblemente, la interacción es una interacción indirecta. Mediante el término "una infección de virus que alberga fosfatidilserina" se quiere indicar en particular una "infección por flavivirus". Mediante el término "infección por flavivirus" se quiere indicar una infección con el virus del dengue (DV, por sus siglas en inglés), el virus de Nilo occidental, un virus de encefalitis transportado por ácaros, el virus de encefalitis por Saint-Louis, el virus de encefalitis japonés o el virus de la fiebre amarilla. Preferiblemente, el receptor de TAM es TYR03, AXL o MER. Preferiblemente, el inhibidor de receptor de TAM es un anticuerpo anti-receptor de TAM, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una variante de receptor de TAM, y de manera más preferible el inhibidor de receptor de TAM es un ARNsi. Preferiblemente, el inhibidor de Gas6 es un anticuerpo anti-Gas6, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una proteína variante de Gas6. Preferiblemente, la proteína de unión fosfatidilserina es un anticuerpo anti-fosfatidilserina o anexina 5.
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM y adicionalmente por lo menos otro compuesto antiviral. Preferiblemente, en por lo menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor de TIM.
Se proporciona adicionalmente el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM en un método para inhibir la entrada de un virus, en particular un virus que alberga PtdSer tal como un flavivirus, dentro de una célula.
También se proporciona un método para evitar o tratar una infección viral, en particular una infección por un virus que alberga PtdSer tal como una infección por flavivirus que comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM.
También se proporciona el uso de un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM para la elaboración de un medicamento, para evitar o tratar una infección viral, en particular una infección de virus que alberga PtdSer, en particular una infección por flavivirus. DEFINICIONES Mediante el término "infección de virus que alberga fosf tidilserina" se quiere indicar una infección con un virus envuelto que expresa o que incorpora PtdSer en su membrana. Antes de la infección, la PtdSer es expuesta sobre la membrana viral a receptores de la célula hospedadora. Los ejemplos de virus envueltos que albergan PtdSer incluyen, pero no se limitan a: Flavivirus (tal como el virus del dengue, el virus del Nilo occidental, el virus de la fiebre amarilla), alfavirus (por ejemplo, el virus Chikungunya), filovirus (por ejemplo, virus de ébola) , poxivirus (por ejemplo, virus de viruela vacuna) y arenavirus (por ejemplo virus de Lassa).
El término "una infección de virus que alberga fosfatidilserina" puede incluir, por ejemplo, una "infección por flavivirus". Mediante el término "infección por flavivirus" se quiere indicar una infección con un virus de dengue (DV, por sus siglas en inglés), el virus del Nilo occidental, un virus de encefalitis transportado por ácaros, el virus de encefalitis de Saint-Louis, el virus de encefalitis japonés o el virus de la fiebre amarilla (Sabin et al., 1952, A.B. Am. J. Trop. Med. Hyg.1:30-50; Hammon et al., 1960, Trans . Assoc. Am. Physicians 73:140-155; Smithburn, 1940, Am. J. Trop. Med., 20:471-492; Monath and Heinz, 1996, Flaviviruses, Fields Virology, 3a edición, p. 961-1034; Gould and Solomon, 2008, Lancet, 371:500-509). El virus de dengue puede ser de cualquier serotipo, es decir, los serotipos 1, 2, 3 ó 4.
Mediante el término "interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM" preferiblemente quiere indicarse la interacción indirecta entre fosfatidilserina presente en la superficie del que alberga PtdSer y un receptor de TAM presente en la superficie de la célula hospedadora. De hecho, los inventores han encontrado que la interacción entre fosfatidilserina y el receptor de TAM es mediada por una molécula puente, la cual puede ser, por ejemplo, la proteína Gas6 y esta interacción indirecta permite que la infección de virus que alberga PtdSer o la entrada en células en células hospedadoras.
Mediante el término "inhibidor" se quiere indicar un agente que es capaz de reducir o abolir la interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM. El inhibidor también puede ser capaz de reducir o abolir la expresión de un receptor de TAM y/o de una molécula puente tal como Gas6. De acuerdo con la invención, el inhibidor puede ser, por ejemplo: (i) un inhibidor de receptor de TAM, (ii) un Gas6 u otro inhibidor de molécula puente, y/o (iii) una proteína que une fosfatidilserina.
Preferiblemente, el inhibidor es capaz de reducir o de abolir la interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM, y/o reducir o abolir la expresión de un receptor de TAM y/o una molécula puente, en por lo menos 10, 20, 30, 40%, de manera más preferible por lo menos 50, 60, 70% y de manera mucho más preferible 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100%.
La referencia en la presente a polipéptidos y ácido nucleico incluye tanto secuencias de aminoácidos como secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente y variantes de estas secuencias.
Las proteínas variantes pueden ser variantes como se encuentran de modo natural, tales como variantes de empalme, alelos e isoformas o pueden ser producidas por medios recombinantes. Las variaciones en la secuencia de aminoácidos se pueden introducir por sustitución, supresión o inserción de uno más codones dentro de la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína lo que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Opcionalmente, la variación es por sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos con cualquier otro aminoácido en la proteína. De manera adicional o alternativa, la variación puede ser por adición o supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos dentro de la proteína.
La secuencia de ácido nucleico variante incluye secuencias capaces de hibridizar específicamente con la secuencia de las SEC ID NOs: 1-4, 6, 9, 10, 12, 16-18, 21, 23-25, 28, 31, 32, 33-36 bajo condiciones de rigurosidad moderada o alta. Las condiciones de rigurosidad o condiciones de alta rigurosidad se pueden definir como aquellas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una alta temperatura para lavado, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecilsulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como for amida, por ejemplo, formamida 50% (v/v) con albúmina sérica bovina 0.1%/Ficoll 0.1%/polivinilpirrolidona 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 M, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) utilizan formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x ADN de esperma de salmón sonicado (50 yg/ml), SDS 0.1% y sulfato de dextrano 10% a 42°C con lavados a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida 50% a 55°C, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55°C. Las condiciones de rigurosidad moderada se pueden identificar como se describe por Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Coid Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las que se acaban de describir en lo anterior. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 M, (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, sulfato de dextrano 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado, seguido por lavado con filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50°C.
Los fragmentos de las proteínas y proteínas variantes descritos en la presente también están abarcados por la invención. Estos fragmentos pueden estar truncados en la parte N-terminal o C-terminal o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con la proteína de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no son esenciales para la actividad enzimática. Preferiblemente, los fragmentos son de una longitud de por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más aminoácidos.
Los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico variantes descritas en la presente también están abarcados por la invención. Estos fragmentos pueden estar truncados en el extremo 3' o 5' o pueden carecer de bases internas, por ejemplo, cuando se comparan con una secuencia de ácido nucleico de longitud completa. Preferiblemente, los fragmentos tienen una longitud de por lo menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 150, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más bases.
Las proteínas variantes pueden incluir proteínas que tienen por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia polipeptídica descrita en la presente. Preferiblemente, una proteína variante tendrá por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptidos de longitud completa o un fragmento de una secuencia de polipéptidos como se describe en la presente. La identidad de secuencia de aminoácidos se define como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia variante que son idénticos con los residuos aminoácidos en la secuencia de referencia. Después de alinear las secuencias e introducir separaciones, es necesario obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia sin considerar sustitución conservadora alguna como parte de la identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede determinar sobre la longitud completa de la secuencia variante, la longitud completa de la secuencia de referencia o ambas.
Las secuencias de ácido nucleico variantes pueden incluir secuencias de ácido nucleico que tienen por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente. Preferiblemente, una secuencia de ácido nucleico variante tendrá por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de ácido nucleico de longitud completa o un fragmento de una secuencia de ácido nucleico como se describe en la presente. La identidad de secuencia de ácido nucleico se define como el porcentaje de ácidos nucleicos en la secuencia variante que son idénticos con los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir separaciones, si es necesario, para obtener el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar sustitución conservadora alguna como parte de la identidad de secuencia. La identidad de secuencia se puede determinar sobre la longitud completa de la secuencia variante, la longitud completa de la secuencia de referencia o ambas.
Mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos interrogante de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objeto sea idéntica a la secuencia interrogante excepto que la secuencia de polipéptidos objeto pueda incluir hasta 5 alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos interrogante. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos interrogante, hasta 5% (5 de 100) de los residuos aminoácidos en la secuencia sujeto pueden insertarse, suprimirse o sustituirse con otro aminoácido.
En el contexto de la presente solicitud, el porcentaje de identidad se calcula utilizando una alineación global (es decir, las dos secuencias se comparan sobre su longitud completa). Los métodos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en el ámbito. El programa "needle", el cual utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol.48:443-453) para encontrar la alineación óptima (incluyendo separaciones) de dos secuencias cuando se considera su longitud completa es por ejemplo el que se pueda utilizar. El programa needle está disponible, por ejemplo, en el sitio de la red mundial ebi.ac.uk. El porcentaje de identidad de acuerdo con la invención preferiblemente se calcula utilizando el programa EMBOSS::needle (global) con un parámetro de "separación abierta" igual a 10.0, un parámetro de extensión de "separación" igual a 0.5 y una matriz Blosum62.
Las proteínas que consisten de una secuencia de aminoácidos "por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idénticas" a una secuencia de referencia pueden comprender mutaciones tales como supresiones, inserciones y/o sustituciones, en comparación con la secuencia de referencia. En el caso de sustituciones, la proteína que consiste de una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idénticas a una secuencia de referencia puede corresponder a una secuencia homologa derivada de otra especie diferente a la secuencia de referencia.
Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras o no conservadoras. Preferiblemente, las sustituciones son sustituciones conservadoras, en las cuales un aminoácido es sustituido por otro aminoácido con propiedades estructurales y/o químicas similares. La sustitución preferiblemente corresponde a una sustitución conservadora, como se indica en la tabla siguiente.
El término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno el cual une inmunoespecíficamente un antígeno. De esta manera, el término anticuerpo abarca no solo la totalidad de las moléculas de anticuerpo sino también fragmentos de anticuerpo así como variantes de anticuerpos, que incluyen derivados tales como anticuerpos humanizados. En anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro y cada cadena pesada se une a una cadena ligera por un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases de cadena pesada principales (o isotipos) los cuales determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL, por sus siglas en inglés) y un dominio constante (CL, por sus siglas en inglés). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH, por sus siglas en inglés) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), denominados colectivamente como (CH, por sus siglas en inglés). Las regiones variables tanto de las cadenas ligera (VL) como pesada (VH) determinan el reconocimiento de unión y especificidad del antígeno. Los dominios de región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren propiedades biológicas importantes tales como asociación de cadena de anticuerpo, secreción, movilidad a través de la placenta, unión a complemento y unión a receptores Fe (FcR, por sus siglas en inglés). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste de las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación de anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios que combinan anticuerpo están constituidos de residuos que son principalmente de las regiones hipervariables o regiones determinadoras de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés). Ocasionalmente, los residuos de las regiones no hipervariables o de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) influyen sobre la estructura de dominio general y por lo tanto del sitio de combinación. Las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) se refieren a secuencias de aminoácidos los cuales, juntos, definen la afinidad de unión y especificidad de la región Fv natural de un sitio que une inmunoglobulina nativo. Las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tienen, cada una, tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2 y H-CDR3, respectivamente. Por lo tanto, un sitio que une antígeno incluye seis CDR que comprenden el conjunto de CDR de cada una de las regiones V de cadena pesada y una cadena ligera.
Las regiones de infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR, es decir, a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que están conservadas relativamente entre diferentes inmunoglobulinas en una especie única, como se define por Kabat et al (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Como se utiliza en la presente, una "región de infraestructura humana" es una región de infraestructura que es sustancialmente idéntica (aproximadamente 85% o más, en particular 90%, 95% ó 100%) a la región de infraestructura de un anticuerpo humano como se encuentra de manera natural.
El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de anticuerpo de una composición de aminoácido sencilla que está dirigida contra un antígeno específico y la cual se puede producir por un clon único de linfocitos B o hibridoma. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser recombinantes, es decir, pueden ser producidos por manipulación de proteínas.
El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo manipulado el cual comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo derivado de un animal no humano, en asociación con un dominio CH y un dominio CL de otro anticuerpo, en particular un anticuerpo humano. Como el animal no humano, se puede utilizar cualquier animal tal como un ratón, rata, hámster, conejo o similar. Un anticuerpo quimérico también indica un anticuerpo multiespecífico que tiene especificidad por al menos dos antígenos diferentes.
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los cuales la infraestructura o las "regiones determinadoras de complementariedad" (CDR) han sido modificadas para comprender la CDR de una inmunoglobulina donadora de especificidad diferente en comparación con la de una inmunoglobulina original. En una modalidad preferida, una CDR de ratón se injerta dentro de la región de infraestructura de un anticuerpo humano para preparar un "anticuerpo humanizado".
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente, la región que une antígeno o región variable de un anticuerpo intacto. Los ejemplos fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El término "Fab" indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y actividad de unión a antígeno, en el cual aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la totalidad de la cadena L, entre los fragmentos obtenidos por tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, se unen juntos mediante un enlace disulfuro.
El término "F(ab)2M se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 y una actividad de unión a antígeno, la cual es ligeramente mayor que la de Fab unido por medio de un enlace disulfuro de la región de bisagra entre fragmentos obtenidos al tratar IgG con una proteasa, pepsina.
El término "Fab" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 y actividad de unión a antígeno, lo cual se obtiene al cortar un enlace disulfuro de la región de bisagra de F(ab1)2.
Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("scFv") es un heterodímero VH::VL unido covalentemente el cual habitualmente se expresa a partir de la función de un gen que incluye genes que codifican para VH y para VL unidos por un enlace que codifican para péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye las CDR que se mantienen en conformación apropiada, preferiblemente mediante el uso de téenicas de recombinación de genes, "dsFv" es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes se pueden formar ya sea de modo espontáneo por asociación de los scFv monovalentes o se pueden generar por acoplamiento de los scFv monovalentes por un enlazante peptídico tal como sc(Fv)2 divalente.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios que unen antígeno, fragmentos los cuales comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al utilizar un enlazante que es demasiado corto para permitir pareamiento entre dos dominios de la misma cadena, los dominios son obligados a parearse con dominios complementarios de otra cadena lo que genera sitios que se unen a dos antígenos.
Mediante el término "ácido nucleico antisentido" se quiere indicar una molécula de ácido nucleico no enzimática que se une a ARN objetivo por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-PNA (proteína ácido nucleico; Egholm et al., 1993, Nature, 365: 566) y altera la actividad del ARN objetivo (para una revisión véase Stein y Cheng, 1993, Science, 261, 1004 y Woolf et al., patente U.S. número 5,849,902). Típicamente, las moléculas antisentido son complementarias a una secuencia objetivo a lo largo de una secuencia contigua única de la molécula antisentido. No obstante, en ciertas modalidades, una molécula antisentido puede unirse al sustrato de manera que la molécula de sustrato forma un bucle u horquilla y/o una molécula antisentido puede unirse de manera que la molécula antisentido forma un bucle u horquilla. De esta manera, la molécula antisentido puede ser complementaria a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secuencias de sustrato no contiguas o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más porciones de secuencia no contiguas de una molécula antisentido que pueden ser complementarias a una secuencia objetivo o ambas (por ejemplo, véase Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313: 3-45). Además, el ADN antisentido se puede utilizar para dirigir ARN por medio de interacciones ADN-ARN, por lo que se activa la ribonucleasa H, la cual digiere el ARN objetivo en la cadena dúplex. Los oligonucleótidos antisentido pueden comprender uno o más regiones activantes de ribonucleasa H, las cuales son capaces de activar la escisión de ribonucleasa H de un ARN objetivo.
Después de la introducción, el ácido nucleico antisentido entra a una vía celular que comúnmente se denomina la vía de interferencia de ARN (iARN). El término "interferencia de ARN" o "iARN" se refiere a la degradación intracelular selectiva de ARN también denominado como bloqueo de expresión de gen. iARN también incluye represión traduccional de los ARN de interferencia pequeños (los ARNsi). La vía iARN se puede iniciar por introducción de los ARN de cadena doble (ARNds) muy largos o los ARNsi o la producción de los ARNsi intracelularmente, por ejemplo a partir de un plásmido o transgen, para bloquear la expresión de uno o más genes objetivo. La iARN de manera alternativa se produce en células de modo natural para iluminar los ARN extraños, por ejemplo, los ARN virales. La vía iARN natural se lleva a cabo por medio de fragmentación dirigida por dados del ARNds precursor el cual dirige el mecanismo de degradación para otras secuencias de ARN afines.
En algunas modalidades, el ácido nucleico antisentido puede ser ARN de cadena doble (ARNds) largo, microARN (ARNmi) y/o interferente pequeño (ARNsi).
Como se utiliza en la presente, "ARN de cadena doble largo" o "ARNds" se refiere a un oligorribonucleótido o polirribonucleótido, modificado o no modificado y fragmentos o porciones del mismo, de origen genómico sintético derivado de la expresión de un vector, el cual puede ser de cadena doble parcial o completamente y el cual puede tener extremos romos o contener partes sobresalientes 5' y/o 3', y también puede estar en forma de una horquilla que comprende un oligorribonucleótido único el cual se plega sobre sí mismo para proporcionar una región de cadena doble. En algunas modalidades, el ARNds tiene un tamaño que varía de 150 pares de bases a 300 pares de bases, de manera preferible que varía de 250 pares de bases a 2000 pares de bases, de modo aún más preferible que varía de 300 pares de bases a 1000 pares de bases. En algunas modalidades, el ARNds tiene un tamaño de por lo menos 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500 pares de bases. En algunas modalidades, el ARNds tiene un tamaño como máximo de 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300 pares de bases.
Un "ARN de interferencia pequeño" o "ARNsi" es un ARN dúplex de nucleótidos que están dirigidos a un gen de interés. Un ARN dúplex se refiere a la estructura formada por pareamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. El ARNsi está dirigido a un gen en el que la secuencia nucleotídica de la porción dúplex del ARNsi es complementaria a una secuencia nucleotídica del gen dirigido. En algunas modalidades, la longitud del dúplex de los ARNsi varía de 15 nucleótidos a 50 nucleótidos, de manera preferible varía de 20 nucleótidos a 35 nucleótidos, de manera aún más preferible varía de 21 nucleótidos a 29 nucleótidos. En algunas modalidades, el dúplex puede ser de por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el dúplex puede tener como máximo 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos de longitud. La porción de ARN dúplex del ARNsi puede ser parte de una estructura de horquilla. Además de la porción dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre dos secuencias que forman el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas modalidades, el bucle tiene una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12 ó 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones que sobresalgan 3 ó 5. En algunas modalidades, las partes sobresalientes son partes sobresalientes 3' ó 5' con una longitud de 0, 1, 2, 3, 4 ó 5 nucleótidos.
La inyección y transfección de ácido nucleico antisentido en las células y organismos ha sido el método principal de suministro. No obstante, los factores de expresión también se pueden utilizar para expresar de manera continua ácido nucleico antisentido en células de mamífero transíectadas de manera transitoria y estable (véase, por ejemplo, Brummelkamp et al . , 2002, Science, 296:550-553; Paddison et al . , 2002, Genes & Dev, 16:948-958).
El ácido nucleico antisentido se puede sintetizar químicamente o se puede expresar por medio del uso de un vector de expresión de ADN de cadena sencilla o equivalente del mismo utilizando protocolos conocidos en el ámbito como se describe, por ejemplo, en Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology, 211:3-19; publicación internacional PCT No. WO 99/54459; Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng, 61:33-45, y patente de U.S. No. 6,001,311. En un ejemplo no limitante, la síntesis a pequeña escala se lleva a cabo en un sintetizador 394 Applied Biosystems, Inc. De manera alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido de la presente invención se pueden sintetizar por separado y se pueden unir post-sintéticamente, por ejemplo, por ligación (publicación internacional PCT No. WO 93/23569, Bellon et al . , 1997, Bioconjugate Chem, 8:204).
El ácido nucleico antisentido de la invención puede ser capaz de disminuir la expresión del gen objetivo, por ejemplo, el receptor TAM o la proteína Gas6 en por lo menos 10, 20, 30, 40%, de manera más preferiblemente en por lo menos 50, 60, 70% y de manera mucho más preferible en por lo menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
Mediante los términos "receptor TAM variante" o "proteína Gas6 variante" o "receptor TIM variante" se quiere indicar respectivamente un receptor de una proteína que difiere del receptor de TAM o de la proteína Gas6 o el receptor TIM en uno o varios aminoácidos. Por ejemplo, el receptor de TAM variante puede diferir del receptor de TAM en que ya no es capaz de unirse a la proteína Gas6, tal como por ejemplo un receptor de AXL de la secuencia SEC ID NO: 7 u 8 que presenta la mutación E63R, E66R o T847R, o en que ya no es capaz de tener su actividad de cinasa, tal como por ejemplo, un receptor AXL de la secuencia SEC ID NO: 7 que presenta la mutación K558M o un receptor de AXL de la secuencia SEC ID NO: 8 que presenta la mutación K567M.
Por ejemplo, la proteína Gas6 variante puede diferir de la proteína Gas6 en que ya no es capaz de unirse a fosfatidilserina y/o a un receptor de TAM. Por ejemplo, la proteína Gas6 variante puede ser Gas6úgla (también denominada rmGASAgla) de la secuencia SEC ID NO: 19. Por ejemplo, el receptor TIM variante puede diferir del receptor TIM en que ya no es capaz de unirse a fosfatidilserina o en que ya no es capaz de tener su actividad de cinasa.
Los términos "sujeto", "individuo" u "hospedador" se utilizan de manera intercambiable y pueden ser, por ejemplo, un humano o un animal no humano. Por ejemplo, el sujeto es un murciélago; un urón; un conejo; un felino (gato); un canino (perro); un primate (mono), un equino (caballo); un humano, que incluye a hombres, mujeres y niños.
Inhibidor de la interacción entre f osf atidilserina y un receptor de TAM La fosfatidilserina es un fosfolípido cuyo grupo fosfato se asocia al aminoácido serina y el cual tiene como referencia el número CAS 8002-43-5.
Por "receptor de TAM" se quiere indicar un receptor de tirosina cinasa de la familia Tyro3/Axl/Mer. En modalidades preferidas, el receptor de TAM es un receptor TYRO-3, AXL o MER.
Preferiblemente, el receptor TYR03 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 5 (secuencia de referencia NCBI NP 006284.2, actualizada el 14 de noviembre del 2011) b) la secuencia codificada por el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 6 (NCBI, secuencia de referencia NM_006293.3, actualizada el 14 de enero del 2012), c) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) o b).
Preferiblemente, el receptor de AXL comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 7 (NCBI, secuencias de referencia NP_001690.2, actualizada el 26 de noviembre del 2011), b) la secuencia SEC ID NO: 8 (NCBI, secuencias de referencia NP_068713.2, actualizada el 26 de noviembre del 2011), c) la secuencia codificada por el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 9 (NCBI, secuencia de referencia NM_021913.3, actualizada el 15 de enero del 2012), d) la secuencia codificada por el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 10 (NCBI, secuencia de referencia NM_001699.4, actualizada el 15 de enero del 2012), e) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a d).
Preferiblemente, el receptor de MER comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 11 (NCBI, secuencia de referencia NP 006334.2, actualizada el 24 de diciembre del 2011), b) la secuencia codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 12 (NCBI, secuencia de referencia NM_006343.2, actualizada el 24 de diciembre del 2011), c) una secuencia de por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a b).
La proteína Gas6 es una molécula de puente que media la interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM.
Preferiblemente, la proteína Gas6 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 13 (NCBI, secuencia de referencia NP_000811.1, actualizada el 24 de diciembre del 2011, b) la secuencia SEC ID NO: 14 (NCBI, secuencia de referencia NP_001137417.1, actualizada el 24 de diciembre del 2011, c) la secuencia SEC ID NO: 15 (NCBI, secuencia de referencia NP_001137418.1, actualizada el 24 de diciembre del 2011, d) la secuencia codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 16 (NCBI, secuencia de referencia NM_000820.2, actualizada el 15 de enero del 2012, e) la secuencia codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 17 (NCBI, secuencia de referencia NM_001143945.1, actualizada el 15 de enero del 2012, f) la secuencia codificada por la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 18 (NCBI, secuencia de referencia NM_001143946.1, actualizada el 15 de enero del 2012, g) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a f).
En algunas modalidades, el inhibidor de receptor de TAM es un anticuerpo anti-receptor de TAM, un ácido nucleico antisentido, un mimético o un receptor TAM variante.
Preferiblemente, el inhibidor de receptor de TAM es un ácido nucleico antisentido y de manera más preferible el inhibidor de receptor de TAM es un ARNsi. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de un receptor de TAM o la secuencia SEC ID NOs: 5, 7, 8 u 11 o un receptor de TAM de secuencia codificado por el ácido nucleico SEC ID NOs: 6, 9, 10 u 12. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica para un receptor de TAM o un fragmento del mismo, por ejemplo un ácido nucleico de la SEC ID NO: SEC ID NOs: 6, 9, 10 u 12. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de por lo menos un ARNsi de las secuencias SEC ID NOs: 1, 2, 3 ó 4. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de por lo menos 2, 3 ó 4 ARNsi que se seleccionan del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 4. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de como máximo 4, 3 ó 2 ARNsi que se seleccionan del grupo que consiste de las SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 4. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de los cuatro ARNsi de la secuencia SEC ID NOs: 1, 2, 3 y 4.
Preferiblemente, el mimético comprende o consiste del dominio extracelular del receptor de TAM. Por ejemplo, el mimético puede comprender o consistir de los aminoácidos 26 a 451 de la SEC ID NO: 7o SEC ID NO: 8.
De manera aún más preferible, el mimético comprende o consiste de la forma soluble del dominio extracelular del receptor de TAM. Por ejemplo, el mimético puede comprender o consistir de la secuencia de los aminoácidos 41 a 428 de la SEC ID NO: 5 o de la secuencia de los aminoácidos 33 a 440 de la SEC ID NO: 7o SEC ID NO: 8.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-receptor de TAM es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del receptor de TAM a la proteína Gas6. Preferiblemente, el anticuerpo anti-receptor de TAM está dirigido a los aminoácidos 63 a 84 de la secuencia SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: En algunas modalidades, el inhibidor de Gas6 es un anticuerpo anti-Gas6, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una proteína Gas6 variante.
Preferiblemente, el inhibidor de Gas6 es un ácido nucleico antisentido y de manera más preferible el inhibidor de Gas6 es un ARNsi. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de una proteína Gas6 de la secuencia SEC ID NO: 13, 14 ó 15 o una proteína Gas6 de la secuencia codificada por el ácido nucleico de la SEC ID NO: 16, 17 ó 18. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica para Gas6 o un fragmento del mismo, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 16, 17 ó 18.
Preferiblemente, el inhibidor de Gas6 es la proteína Gas6 variante, Gas6AGla de la secuencia SEC ID NO: 19.
Preferiblemente, el mimético de Gas6 comprende o consiste del sitio de reconocimiento de fosf tidilserina el cual puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos del residuo 53 a 94 de la SEC ID NO: 13 o el mimético comprende o consiste del sitio de unión a receptor el cual comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de los residuos 298 a 670 de la SEC ID NO: 13.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-Gas6 es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión de la proteína Gas6 al receptor de TAM. Preferiblemente, el anticuerpo anti-Gas6 se dirige a los aminoácidos 304 a 312 de la secuencia de la SEC ID NO: 13, a los aminoácidos 31 a 39 de la secuencia SEC ID NO: 14 o a los aminoácidos 5 a 13 de la secuencia SEC ID NO: 15.
La proteína que une fosfatidilserina puede ser una proteína que es capaz de unirse a fosfatidilserina pero que no es capaz de unirse a la proteína Gas6. Preferiblemente, la proteína que se une a fosfatidilserina es un anticuerpo anti-fosfatidilserina o la anexina V.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-fosfatidilserina es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión de la fosfatidilserina a la proteína Gas6. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un clon de anticuerpo anti-fosfatidilserina 1H6 (UpstateMR).
Preferiblemente, la proteína anexina V comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 20 (NCBI, secuencia de referencia NP_001145.1, actualizada el 1° de febrero del 2012), b) la secuencia codificada por el ácido nucleico de la secuencia SEC ID NO: 21 (NCBI, secuencia de referencia NM_001154 .3, actualizada el 18 de diciembre del 2011), c) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) o b).
Compuestos antivirales En una modalidad preferida, el inhibidor de acuerdo con la invención es para la administración en combinación con por lo menos otro compuesto antiviral , ya sea de manera secuencial o simultánea .
La administración secuencial indica que los componentes se administran en diferentes momentos o puntos de tiempo, los cuales no obstante pueden superponerse . La administración simultánea indica que los componentes se administran al mismo tiempo .
El compuesto antiviral incluye, pero no se limita a inhibidores de neuroaminidasa, inhibidores de fusión viral, inhibidores de proteasa, inhibidores de ADN polimerasa, inhibidores de transducción de señal, inhibidores de transcriptasa inversa, interf erones , análogos de nucleósidos, inhibidores de integrasa, inhibidores de timidina cinasa, inhibidores de síntesis de azúcar viral o glucoproteína, inhibidores de síntesis de proteína estructural viral , inhibidores de unión y absorción virales , inhibidores de la entrada viral y sus análogos funcionales .
Los inhibidores de neuroaminidasa pueden incluir oseltamivir, zanamivir y peramivir. Los inhibidores de fusión viral pueden incluir ciclosporina, maraviroc , enfuviritida y docosanol .
Los inhibidores de proteasa pueden incluir saquinavir, indinarvir, amprenavir, nelfinavir, ritonavir, tipranavir, atazanavir, darunavir, zanamivir y oseltamivir .
Los inhibidores de ADN polimerasa pueden incluir idoxuridina, vidarabina, ácido fosfonoacético, trifluridina, aciclovir, forscarnet, ganciclovir, penciclovir, cidoclovir, famciclovir, velaciclovir y valganciclovir.
Los inhibidores de transducción de señal incluyen resveratrol y ribavirina. Los inhibidores de nucleósidos de transcriptasa inversa (NRTI, por sus siglas en inglés) pueden incluir zidovudina (ZDV, AZT), lamivudina (3TC), estavudina (d4T), zalcitabina (ddC), didanosina (2',3'-didesoxiinosina, ddl), abacavir (ABC), emirivina (FTC), tenofovir (TDF), delaviradina (DLV), fuzeon (T-20), indinavir (IDV), lopinavir (LPV), atazanavir, combivir (ZDV/3TC), kaletra (RTV(LPV), adefovir dipivoxilo y trizivir (ZDV/3TC/ABC). Los inhibidores de transcriptasa inversa no nucleosídicos (N RTI, por sus siglas en inglés) pueden incluir nevirapina, delavirdina, UC-781 (tiocarboxanilida), piridinonas, TIBO, calanolida A, capravirina y efavirenz.
Los inhibidores de entrada viral pueden incluir Fuzeon (T-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857, anticuerpos monoclonales contra receptores relevantes, cianovirin-N, ciclodextrinas, carrageenanos, polímeros sulfatados o sulfonados, polímeros de condensación de ácido mandélico, AMD-3100 y análogos funcionales de los mismos.
Preferiblemente, por lo menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TIM.
Mediante el término 11receptor de TIM" se quiere indicar un receptor de TIM-1, TIM-3 o TIM-4.
En algunas modalidades, el receptor de TIM-1 comprende o consiste de: a) la secuencia de la SEC ID NO: 22 (GenBank, número AAH13325.1, actualizado el 4 de octubre del 2003), b) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 23 (NCBI, secuencia de referencia NM_012206.2, actualizada el 26 de noviembre del 2011), c) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 24 (NCBI, secuencia de referencia NM_001099414.1, actualizada el 26 de noviembre del 2011), d) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 25 (NCBI, secuencia de referencia NM_001173393.1, actualizada el 4 de diciembre del 2011), e) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a d).
En algunas modalidades, el receptor TIM-3 comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 26 (GenBank, número AAH20843.1, actualizada el 16 de septiembre del 2003), b) la secuencia SEC ID NO: 27 (GenBank número AAH63431.1, actualizada el 15 de julio del 2006), c) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 28 (NCBI, secuencia de referencia NM_032782.4, actualizada el 25 de diciembre del 2011), d) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a c).
En algunas modalidades, el receptor de TIM-4, comprende o consiste de: a) la secuencia SEC ID NO: 29 (NCBI, secuencia de referencia NP_612388.2, actualizada el 24 de diciembre del 2011), b) la secuencia SEC ID NO: 30 (NCBI, secuencia de referencia NP_001140198.1, actualizada el 25 de diciembre del 2011), c) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 31 (NCBI, secuencia de referencia NM_138379.2, actualizado al 24 de diciembre del 2011), d) la secuencia codificada por el ácido nucleico SEC ID NO: 32 (NCBI, secuencia de referencia NM_001146726.1, actualizada el 25 de diciembre del 2011), e) una secuencia por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% idéntica a la secuencia de a) a d).
En algunas modalidades, el inhibidor de interacción de fosfatidilserina y un receptor de TIM es un inhibidor de receptor de TIM, preferiblemente, el inhibidor de receptor de TIM es un anticuerpo anti-receptor de TIM, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una variante del receptor de TIM. Preferiblemente, el inhibidor de receptor de TIM es un ácido nucleico antisentido y de manera más preferible un inhibidor de receptor TIM es un ARNsi. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia que es capaz de inhibir o reducir la expresión de un receptor de TIM de la secuencia SEC ID NOS: 22, 26, 27, 29 ó 30 o un receptor de TIM de secuencia codificado por el ácido nucleico SEC ID NOS: 23, 24, 25, 28, 31 ó 32. El ácido nucleico antisentido puede comprender o consistir de una secuencia complementaria a un ácido nucleico que codifica para un receptor de TIM, por ejemplo un ácido nucleico de la secuencia SEC ID NOS: 23, 24, 25, 28, 31,ó 32. En una modalidad, el inhibidor de receptor de TIM comprende o consiste de por lo menos un ARNsi de la secuencia de SEC ID NOS: 33, 34, 35 ó 36. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de por lo menos 2, 3, ó 4 ARNsi que se seleccionan del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 33, 34, 35 y 36. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste por lo menos 4, 3, 2 ó 1 ARNsi que se selecciona del grupo que consiste de las SEC ID NOS: 33, 34, 35 y 36. En una modalidad, el ARNsi comprende o consiste de cuatro ARNsi de la secuencia SEC ID NOS: 33, 34, 35 y 36.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-receptor de TIM es el anticuerpo anti-receptor de TIM1, ARD5, descrito por Kondratowicz et al ., 2011, PNAS, 108: 8426-8431 o el anticuerpo anti-TIMl, A6G2 descrito por Sonar et al., 2010, The Journal of Clinical investigation, 120: 2767-2781.
Preferiblemente, el mimético comprende o consiste del dominio extracelular del receptor de TIM. Por ejemplo, el mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 295 de TIM-1 de la SEC ID NO: 22, el mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de los residuos 21 a 290 para TIM-1 de la SEC ID NO: 37 o el mimético puede comprender o consistir de la secuencia de aminoácidos de los residuos 25 a 314 para TIM-4 de la SEC ID NO: 29.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-receptor de TIM es un anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del receptor TIM a la fosfatidilserina. Preferiblemente, el anticuerpo dirigido contra el sitio de unión del receptor TIM a fosf tidilserina se dirige al sitio de unión de ligando dependiente de ión metálico (MILIB, por sus siglas en inglés) del receptor de TIM. De manera aún más preferible, el anti-receptor de TIM se dirige a los aminoácidos 111 a 115 de la secuencia SEC ID NO: 22, o los aminoácidos 119 a 122 de la secuencia SEC ID NO: 29 o la SEC ID NO: 30.
Método para inhibir la entrada de un virus que alberga f os f atidilserina en una célula El inhibidor de acuerdo con la invención se puede utilizar en un método para inhibir la entrada de un virus que alberga PtdSer en una célula.
El método puede ser un método in vitro o ex vivo, o un método de prevención o tratamiento de una infección por virus que alberga PtdSer como se describe en la presente.
La invención de esta manera proporciona el uso de un inhibidor como se define en la presente en un método in vitro o in vivo para inhibir la entrada de una virus que alberga PtdSer en una célula. También se proporciona un inhibidor, como se define en la presente, para usarse de un método in vitro o in vivo para inhibir la entrada de un virus que alberga PdtSer en una célula.
En algunas modalidades, el inhibidor se utiliza en combinación con por lo menos otro compuesto antiviral como se define en lo anterior.
El método puede comprender, por ejemplo, exponer la célula y/o el virus que alberga PtdSer al inhibidor. Cuando el método es un método in vivo, el método puede comprender administrar el inhibidor a un sujeto, preferiblemente un paciente en necesidad del mismo.
En algunas modalidades, la célula puede ser células dendríticas, células endoteliales, astrocitos, hepatocitos, neuronas, células de Kupffer y/o macrófagos.
Composiciones farmacéuticas El inhibidor de acuerdo con la invención se puede formular en una composición farmacéuticamente aceptable, solo o en combinación con por lo menos otro compuesto antiviral.
De esta manera la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de acuerdo con la invención y adicionalmente por lo menos otro compuesto antiviral.
Por lo menos otro compuesto antiviral puede ser un compuesto como se define en lo anterior.
En una modalidad, el inhibidor comprende o consiste de por lo menos 1, 2, 3, ó 4 o como máximo 4, 3, 2, ó 1 ARNsi que se selecciona del grupo que consiste de ARNsi de la secuencia SEC ID NOS: 1, 2, 3, y 4 y/o anexina V como se define en lo anterior, y por lo menos otro compuesto antiviral comprende o consiste de por lo menos 1, 2, 3 ó 4 o como máximo 4, 3, 2, ó 1 ARNsi que se selecciona del grupo que consiste de ARNsi de la secuencia SEC ID NOS: 33, 34, 35 y 36 y/o una proteína Gas6 variante, Gas6Agla, de la secuencia SEC ID NO: 19, como se define en lo anterior. En una modalidad, el inhibidor comprende o consiste de 4 de ARNsi de las secuencias SEC ID NOS: 1, 2, 3, y 4 y/o anexina V como se define en lo anterior, y por lo menos otro compuesto antiviral comprende o consiste de 4 ARNsi de la secuencia SEC ID NOS: 33, 34, 35 y 36 y/o la proteína Gas6 variante Gas6Agla de la secuencia SEC ID NO: 19, como se define en lo anterior.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden administrar oralmente en forma de una dosificación unitaria farmacéutica adecuada. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en muchas formas que incluyen tabletas, cápsulas de gelatina dura o suave, soluciones acuosas, suspensiones y liposomas y/u otras formulaciones de liberación lenta tales como geles poliméricos conformados.
El modo de administración y las formas de dosificación se relacionan estrechamente con las propiedades de los agentes terapéuticos o composiciones los cuales son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Las formas de dosificación adecuadas incluyen, pero no se limitan a oral, intravenosa, rectal, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaraenoidea, bronquial y administración linfática, y otras formas de dosificación para suministro sistémico de ingredientes activos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier método conocido en el ámbito que incluye, sin limitación, transdérmico (pasivo por medio de un parche, gel, crema, ungüento o iontoforético); intravenoso (bolo, infusión); subcutáneo (infusión, deposición); transmucosal (bucal y sublingual, por ejemplo tabletas dispersables en la boca, obleas, películas y formulaciones efervescentes; conjuntivales (gotas para los ojos); rectales (supositorios, enemas)); o intradérmica (bolo, infusión, deposición).
Las composiciones farmacéuticas líquidas pueden estar en forma, por ejemplo, de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires o pueden estar presentes como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Estas composiciones farmacéuticas líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes que mejoren la suspensión, agentes emulsificantes, vehículos no acuosos (los cuales pueden incluir aceites comestibles) o conservadores.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden formular para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua) y se pueden presentar en forma de dosificación unitaria de ampolletas, jeringas llenadas previamente, recipientes de infusión de volumen pequeño o recipientes de dosis múltiple con un conservador agregado. Las composiciones farmacéuticas pueden adquirir estas formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes que mejoren la suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. De manera alternativa, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de polvo, obtenidos por aislamiento aséptico de sólidos estériles o por liofilización a partir de solución, para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos antes de su uso.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración rectal en donde el portador es un sólido de manera más preferible se presentan como supositorios de dosis unitaria. Los portadores adecuados incluyen manteca de cacao u otros materiales comúnmente utilizados en el ámbito, y los supositorios se pueden formar convenientemente por una mezcla de la composición farmacéutica con uno o varios de los portadores suavizados o fundidos seguido por enfriamiento y conformación en moldes.
Para administración por inhalación, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención convenientemente se suministran desde un insuflador, nebulizador o un paquete presurizado u otro medio conveniente para suministrar la aspersión por aerosol. Los paquetes presurizados pueden comprender un propelente adecuado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. De manera alternativa, para administración por inhalación o insuflación, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden adquirir la forma de una composición en polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo de la composición farmacéutica y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. La composición en polvo puede estar presente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, de cápsulas o cartuchos o, por ejemplo, gelatina o empaques tipo ampolla desde los cuales el polvo se puede administrar con la ayuda de un inhalador o un insuflador.
Para administración intranasal, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por medio de una aspersión líquida tal como un atomizador en botella de plástico. La forma típica de estos son Mistometerg (inhalador de isopreterenol de Wintrop) y MedihalerMR (inhalador de isoproterenol de Riker).
Para administración de ácido nucleico antisentido, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en formas que incluyen encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, sistemas portadores basados en lípidos, los ejemplos no limitantes de sistemas portadores basados en lípidos alternativos adecuados para usarse en la presente invención incluyen los complejos de un polímero policatiónico y ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20050222064), complejos de polímero de ciclodextrina y ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20040087024), complejos biodegradables de poli 3 polímero aminoéster y ácido nucleico (véase, por ejemplo la publicación de patente U.S. No. 20040071654), liposomas sensibles a pH (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20020192274), liposomas aniónicos (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20030026831), liposomas catiónicos (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20030229040), lipoplexos enmascarados de manera reversible (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20030180950), liposomas específicos de tipo de célula (véase, por ejemplo, publicación de patente U.S. No.20030198664), micropartículas que contienen matrices poliméricas (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20040142475), lipoplexos sensibles a pH (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20020192275), lípidos que contienen liposomas derivatizados con polímeros hidrofílicos liberables (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20030031704), ácido nucleico atrapado en lípidos (véase, por ejemplo, la publicación de patente PCT No. WO 03/057190), ácido nucleico encapsulado en lípidos (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20030129221), complejos de ácido nucleico derivados en esterol policatiónico (véase, por ejemplo, la patente U.S. No.6,756,054), otras composiciones liposómicas (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20030035829), otras composiciones de micropartículas (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20030157030), poli-plexos ((véase, por ejemplo, la publicación de patente PCT No. WO 03/066069), composiciones en emulsión (véase, por ejemplo, la patente U.S. No.6,747,014), complejos de ácido nucleico condensados ((véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20050123600), otros complejos de ácido nucleico policatiónicos (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20030125281), complejos de poliviniléter y ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20040156909), complejos de amidinio policíclico y ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20030220289), composiciones de nanocápsula y microcápsula (véase, por ejemplo, la publicación de patente PCT No. WO 02/096551), mezclas estabilizadas de liposomas y emulsiones (véase, por ejemplo, EP1304160), complejos de porfirina y ácido nucleico (véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 6,620,805), complejos de lípidos y ácido nucleicos (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No. 20030203865), microemulsiones de ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20050037086), y composiciones basadas en lípido catiónico (véase, por ejemplo, la publicación de patente U.S. No.20050234232). Una persona experta en el ámbito apreciará que el ARNsi modificado de la presente invención también se puede suministrar como un molécula de ARNsi desnuda.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden contener otros adyuvantes tales como saborizantes, colorantes, agentes antimicrobianos o conservadores.
Se apreciará adicionalmente que la cantidad de composiciones farmacéuticas requeridas para usarse en el tratamiento variará no solo con el agente terapéutico seleccionado sino también con la vía de administración, la naturaleza de la condición que es tratada y la edad y condición del paciente y finalmente estará a criterio del médico o del personal clínico que atienda.
Administración y métodos de tratamiento La invención también se relaciona con un método para evitar o tratar infección por virus que alberga PtdSer en un individuo en necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de acuerdo con la invención.
Mediante el término "tratamiento" se quiere indicar un uso terapéutico (es decir, sobre un paciente que tiene una enfermedad dada) y mediante el término "evitar" se quiere indicar un uso profiláctico (es decir, en un individuo susceptible de desarrollar una enfermedad dada). El término "tratamiento" no solo incluye tratamiento que tiene como resultado la cura completa de la enfermedad sino también tratamientos que frenan el progreso de la enfermedad y/o que prolongan la supervivencia del paciente.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo así como la capacidad de la proteína para inducir un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz abarca una cantidad en la cual cualquier efecto tóxico o dañino del inhibidor sobrepasa los efectos terapéuticamente benéficos. Una cantidad terapéuticamente eficaz también abarca una cantidad suficiente para conferir beneficio, por ejemplo, beneficio clínico.
En el contexto de la presente invención "evitar una infección por virus que alberga fosfatidilserina" puede significar la prevención de una infección por un virus que alberga PtdSer evitando que entre a la célula hospedadora.
En el contexto de la presente invención, "tratar una infección por virus que alberga fosfatidilserina" puede significar revertir, aliviar o inhibir la infección por virus que alberga fosfatidilserina o evitar la entrada en la célula hospedadora .
En el contexto de la invención, una infección por virus que alberga fosfatidilserina puede reducirse en por lo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%.
En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden la administración de un inhibidor como se define en lo anterior, en combinación con por lo menos un compuesto antiviral adicional, como se define en lo anterior, ya sea de manera secuencial o simultánea. Por ejemplo, por lo menos otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TIM como se define en lo anterior.
En otra modalidad, el método comprende la administración de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.
El régimen de administración puede ser un régimen sistémico. El modo de administración y las formas de dosificación se relacionan estrechamente con las propiedades de los agentes o composiciones terapéuticos los cuales son deseables y eficaces para la aplicación de tratamiento dada. Las formas de dosificación y las vías de administración adecuadas incluyen, pero no se limitan a las vías oral, intravenosa, rectal, sublingual, mucosal, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, transdérmica, espinal, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaraenoidea, bronquial y administración linfática y/u otras formas de dosificación y vías de administración para el suministro sistémico de ingredientes activos. En una modalidad preferida, las formas de dosificación son para administración parenteral.
El régimen de administración puede ser, por ejemplo, por un período de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 días.
El intervalo de dosis puede estar entre 0.1 mg/kg/día y 100 mg/kg/día. De manera más preferible, el intervalo de dosis está entre 0.5 mg/kg/día y 100 mg/kg/día. De manera más preferible, el intervalo de dosis está entre 1 mg/kg/día y 80 mg/kg/día. De manera más preferible, el intervalo de dosis está entre 5 mg/kg/día y 50 mg/kg/día, o entre 10 mg/kg/día y 40 mg/kg/día.
En algunas modalidades, la dosis puede ser de por lo menos 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, mg/kg/día. En algunas modalidades, la dosis puede ser como máximo de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 25, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1 mg/kg/día.
El intervalo de dosis también puede estar entre 10 a 10000 Ul/kg/día. De manera más preferible, el intervalo de dosis está entre 50 a 5000 Ul/kg/día o entre 100 a 1000 Ul/kg/día.
En algunas modalidades, la dosis puede ser de por lo menos 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 Ul/kg/día. En algunas modalidades, la dosis puede ser como máximo de 10000, 9500, 9000, 8500, 8000, 7500, 7000, 6500, 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 Ul/kg/día.
La invención se describirá ahora con mayor detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos. Todos los documentos de literatura y de patente mencionados en la presente se incorporan en la presente como referencia.
EJEMPLOS Materiales y Metodos Cribado de biblioteca de ADNc Para el cribado de ADNc se seleccionan 1728 genes que codifican para receptores celulares putativos en base en el enfoque bioinformático de una biblioteca de ADNc de longitud completa distribuida (Porcel et al . , 2004, Genome Res. 14:463-471). Para la ronda primaria 216 acumulados de 8 ADNc individuales (1 mg) se transfectan transitoriamente en células 293T (formato de placa de 24 pozos) utilizando Lipofectamine LTX (Life Tecgnologies, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control positivo se transfecta una cantidad igual de un ADNc para DC-SIGN (l/8th en plásmido vacío). El plásmido vacío se utiliza como control negativo. La eficiencia de transfección se determina 24 horas después de la transfección por inmunotinción de DC-SIGN expresado ectópica ente.
Posteriormente se incuban células 293T transfectadas con cepa primaria JAM con DV2 (MOI de 2) durante 48 horas y el porcentaje de células infectadas se mide por citometría de flujo. En una segunda ronda, cada acumulado de ADNc positivo y los 8 ADNc individuales correspondientes (600 ng) se transfectan en células 293T y se infectan con JAM con DV2 para identificar ADNc positivo individual.
Análisis de Unión por ELISA Una placa NUNC-INMUNO Maxisorp de 96 pozos (NUNC, Roskidle, Dinamarca) se recubre durante la noche con partículas virales DV (107 FIU) a 4°C por duplicado. Después del bloqueo con BSA 2% en PBS CaCl2/MgCl2 a 37°C durante 1 hora, los pozos se incuban con proteínas rGas6 (2 mg/ml) durante 1 hora a 37°C en TBS suplementado con Tween 0.05% y CaCl2 10 mM. Los pozos se lavan exhaustivamente, las proteínas Gas6 unidas se marcan con anticuerpo policlonal de chivo anti-Gas6 y se detectan con anticuerpo de burro anti-IgG de chivo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Alemania) (dilución 1:2000) y diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD, por sus siglas en inglés) (Thermo Scientific) como sustrato. Para experimentos de unión, las proteínas rGas6 (2 yg/ml) se agregan simultáneamente durante la incubación de las proteínas Fc-quimeras (2 mg/ml). Los pozos de lavan extensamente y se detectan las Fc-quimeras unidas con el anticuerpo de conejo anti-IgG humano conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) (Dako) (dilución 1:1,000) y OPD.
Análisis de Unión de Células Células 293T y CH0745 que expresan TYR03, AXL y DC-SIGN (4 x 105) se incuban con las MOI indicadas de DV durante 90 minutos a 4°C en amortiguador de unión (DMEM, NaN3 0.05%) que contiene BSA 1% o FBS 5%. Para 293T, las células se incuban con 100 U de heparina durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de incubación con el virus. Las células se lavan dos veces con amortiguador de unión frío, una vez con medio DMEM frío libre de suero y se fija con PBS-PFA 2% a 4°C durante 20 minutos. Las partículas de DV absorbidas en la superficie celular se tiñen con anticuerpo anti-envoltura de panflavivirus (4G2, 5 pg/ml) y se analizan por citometría de flujo como se ha descrito previamente (Fernandez-Garcia et al . , 2011, J Virol.85:2980-2989). En el análisis de incremento de unión e inhibición, las células se incuban simultáneamente con virus y rGas6 (10 pg/ml).
Virus y células La cepa DV-1-TVP, la cepa DV2-JAM (Jamaica), la cepa DV2-New Guinea C, la cepa DV2-16881, la cepa DV3-PAH881 (Tailandia) y la cepa DV4-1086 se propagan en monocapas de célula AP61 de mosquito ( Aedes pseudoscutellaris) después de haber experimentado pasajes de células limitados. Es de notar que DV producido en célula de mamífero proporciona resultados iguales que los virus que se originan de células de insecto. Los títulos de virus se determinaron por análisis de citometría de fluo (FACS, por sus siglas en inglés) en células C6/36 y se expresan como unidades infecciosas FACS (FIU, por sus siglas en inglés). Se mantienen células HEK 293T, A549, VERO y Huh7 5.1 (un obsequio de C. Rice, New York, Estados Unidos) en DMEM suplementado con FBS 10%, 1% de penicilina/estreptomicina.
Las cepas DV2-JAM (Jamaica) y WNV (Israelí IS-98- STI) se propagan en monocapas de células AP61 de mosquito (Aedes pseudoscutellaris ) como se describe en lo anterior. YFV (cepa YVF D17) se hace crecer y se titula sobre células Vero. HSV-1 (F) se propaga y se titula sobre células Vero como se describe en otra parte (Taddeo et al., 2004). Se hace crecer Chikungunya (cepa CHIKV-21) en células de insecto C6/36.
Análisis de citometría de flujo El análisis de citometría de flujo se realiza al seguir un protocolo convencional en presencia de 0.02% de NaN3 y 5% de FBS en PBS frío. Para análisis de infección, las células infectadas se fijan con PBS más 2% (v/v) paraformaldehído (PFA), se permeabilizan con saponina 0.5% (p/v), seguido por tinción con mAb 2H2 de ratón que detecta prM de DV (2 mg/ml) o mAb NS1 de ratón que detecta la proteína-1 no estructural (1 pg/ml). La infección por HSV-1 se detecta con mAb anti-ICP4 de ratón (clon 10F1, 0.3 pg/ml; Santa Cruz Biotechnology). La infección por WNV, YFV y Chikungunya se detectó con el anticuerpo anti-proteína E (4G2) y el anticuerpo monoclonal de ratón contra la glucoproteína de envoltura E2 (3E4). Después de 45 minutos, los anticuerpos primarios se marcaron con anticuerpo de chivo anti-inmunoglobulina de ratón/RPE policlonal (DakoCytomation). Finalmente, los porcentajes de células infectadas se determinaron por citometría de flujo en un programa LSR con CellQuest (Becton Dickinson). Los datos se analizaron mediante la utilización del programa FlowJo (Tree Star).
Análisis Estadístico La representación gráfica, el análisis estadístico y el ajuste de curva se realizó el programa Prims5 (GraphPad Sotware, San Diego, CA). Dicho de otra manera, todos los resultados se muestran como media +/- de desviación estándar (SD) de 3 experimentos independientes. Los resultados se prueban para significancia utilizando la prueba t de dos colas pareadas.
RESULTADOS Un cribado de ADNc identifica a TYR03 y AXL como receptores de superficie celular que aumentan la infección por DV2 En un esfuerzo por identificar uno o varios receptores de entrada de DV nuevos, se ha llevado a cabo una ganancia de función de cribado de ADNc para genes humanos que vuelven a la línea de células poco susceptible 293T infectable con la cepa DV2 de JAM. Para este objetivo, las bases de datos de secuencia (Swiss Prot, Uniprot, Human Protein Reference Database) y los 1728 ADNc de longitud completa seleccionados que codifican para receptores de membrana de plasma para la biblioteca de ADNc distribuida que consiste de aproximadamente 10000 ADNc clonados en el vector de expresión impulsado por CMV pCMVSP0RT6 son los que se utilizaron. En la primera ronda de cribado 216 acumulados de 8 ADNc se transíectaron en células 293T. Se ha demostrado previamente que 293T es poco susceptible a infección por cepas primarias de DV derivadas de mosquito, dado que se observa que solo muy poca células se infectan, incluso con una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) alta. No obstante, las partículas infecciosas a partir de estas células transíectadas con el receptor de lectina tipo C, DC-SIGN fueron recuperadas eficientemente, lo que indica que la restricción se produce en la entrada del virus pero no en la replicación viral, en el ensamblado de partículas o en las etapas de liberación. Las células transfectadas después se exponen con partículas DV2 JAM que crecieron en mosquito a una MOI de 2. Dos días después, la infección se clasificó por FACS utilizando mAb 2H2 que reconoce la proteína prM de DV. Los acumulados de ADNc que se vuelven positivos a células 293T para tinción intracelular de proteína prM entran en la segunda ronda de cribado, en el cual el ADNc único que compone cada acumulado se prueba individualmente. Como un resultado de este cribado, se identificaron 3 proteínas principales: L-SIGN, un receptor de lectina tipo C previamente conocido que media la entrada de DV, TYR03 y AXL. TYR03 y AXL son dos miembros de la familia de receptor TAM (TYR03/AXL/MER), un grupo de moléculas de tirosina cinasa que son activadas por unión de ligandos naturales, específicas de supresión de crecimiento 6 (Gas6, por sus siglas en inglés) y proteína S (ProS). Los receptores TAM comparten un dominio de unión de ligando de dominio extracelular (el cual incluye dos secuencias similares a inmunoglobulina y dos secuencias repetidas fibronectina tipo III), un dominio transmembranal de paso único y un dominio citoplásmico responsable de la actividad de cinasa. Estas se expresan ampliamente y regulan una diversidad de cascadas de señalización involucradas en la transformación celular, fagocitosis, depuración de cuerpos de células apoptósicos e inmunidad innata. De manera interesante, un miembro de la familia del receptor de TAM, AXL, se ha encontrado que facilita la infección por virus de ébola y virus de vaccinia.
Expresión ectópica de TYR03 y AXL incrementa la infección por DV1-4 en células objetivo No hubo incremento en la infectividad de DV2 JAM con MER, el tercer miembro de la familia del receptor de TAM. Los estudios de esta manera se enfocaron en TYR03 y AXL. Células 293T las cuales expresan TYR03 a un nivel muy bajo y que carecen de expresión de AXL después se sometieron a transducción con vectores lentivirales que incluyen TYR03 o AXL humano. Las células se tiñeron con mAb específico y se clasificaron para un alto nivel de expresión de superficie. Los estudios de inmunofluorescencia muestran que la infección de células 293T.TYR03 o AXL con DV2 JAM resulta en un incremento notable en la producción intracelular de proteínas prM cuando se compara con células 293T originales. De manera consistente, el análisis por FACS o la expresión de NS1, una proteína no estructural DV se produce únicamente durante la replicación activa, lo que demuestra que las células 293T-TYR03 y 293T-AXL expuestas con DV2 JAM se infectan de manera productiva. La expresión ectópica de AXL o TYR03 incrementa la infección por DV2 de células 293T en 20 y 50 veces, respectivamente. La titulación de los sobrenadantes libres de células recolectados de células expuestas con DV2 JAM muestra que las células que expresan TYR03 y AXL liberan grandes cantidades de partículas virales infecciosas en comparación con sus contrapartes originales (figura 1).
Después se probó si TYR03 y AXL facilitan la infección de células humanas por cualquiera de los cuatro serotipos de DV. Se infectaron células 293T-TYR03, 293T-AXL y 293T con un grupo de cepas DV1-4. Después de 48 h las células de tiñeron con mAb 2H2 y se analizaron por FACS. La infección con las cepas adaptadas a laboratorio de DV2 NGC o 16881 así como con las cepas primarias DV1, DV3 y DV4 aumentaron de manera significativa por ya sea TYR03 o AXL (figura 2). Por lo tanto, la expresión ectópica de TYR03 y AXL aumenta la infección de los cuatro serotipos de DV.
La especificidad del incremento de infectividad mediado por TYR03 y AXL después se explora al probar otros miembros del género de flavivirus, WNV y YFV-17D y otros virus con envoltura tal como influenza (gripe) y pseudopartículas de V1H que presentan la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV pp). TYR03 y AXL mejoran fuertemente la infección por WNV y en menor grado YFV-17D.En contraste, no se produjo incremento de infectividad viral con gripe y VSVpp (figura 3). Por lo tanto, TYR03 y AXL se aprovechan por flavivirus para infección patogénicas diferente.
Para determinar si la expresión de los receptores de TAM vuelven susceptibles a infección por DV a otras líneas de células de humano se generaron células HeLa que expresan de manera estable TYR03 o AXL. Aunque las células HeLa originales son poco sensibles a partículas de DV3, se produce una infección eficiente después de expresión ectópica de TYR03 o AXL (figura 4). Se obtuvieron resultados similares con WNV (figura 4). Además, la adición de TYR03 en células CHME, una línea similar a macrófagos que expresa AXL endógeno incrementa fuertemente la infección por DV. Por lo tanto, la adición de TYR03 o AXL en por lo menos tres líneas de células humanas incrementa la infección por DV.
Bloqueo de la expresión o inhibición de receptores de TAM reduce la infección por DV en células permisivas Los experimentos de citometría de flujos mostraron que la expresión AXL se detecta en una amplia gama de células humanas que son susceptibles a infección por DV. AXL es particularmente abundante en célula A549, así como en astrocitos humanos primarios, los cuales se han propuesto que son objetivos DV importantes in vivo. En contraste, TYR03 no se expresa de manera detectable en todas las células probadas. Después se investigó si DV utiliza AXL endógeno en células A549 y astrocitos humanos primarios. Para este fin, la expresión de AXL endógeno se redujo por regulación por ARNsi en ambos tipos de células determinado por citometría de flujo. La susceptibilidad de infección por DV3 y WNV disminuyó de modo significativo en células en las que se bloqueó la expresión de AXL, en comparación con células que recibieron ARNsi no relacionado. El bloqueo en la expresión de ATP6V1B2, una subunidad de una ATPasa a vacunar requerida para fusión dependiente de pH en flavivirus, deteriora la infección por DV3 y WNV de manera tan eficiente como el ARNsi para AXL (figura 5 y figura 6). Se obtienen resultados similares con DV2 JAM. La capacidad de anticuerpos dirigidos contra el ectodominio de AXL para inhibir la infección por DV se investigó después. El pretratamiento de 293T-AXL, A549 o astrocitos primarios con Ab anti-AXL inhibe de manera significativa la infección por DV3 y DV2 mientras que el Ab control no tuvo efecto (figura 7). De manera similar, los Ab anti-TYR03 inhiben la infección por DV de células 293T-TYR03 (figura 8). Juntos, estos resultados indican que la expresión en superficie celular de AXL es necesaria para infección óptima por DV.
Los receptores de TYR03 y AXL mejoran la internal i zación de DV Para determinar en que etapa del ciclo de vida de DV actúan TYR03 y AXL, se examinó primero (figura 8) la capacidad del anticuerpo anti-TAM para inhibir la infección por DV, cuando se agrega en diversos puntos en el tiempo. Los anticuerpos anti-TYR03 y anti-AXL inhiben fuertemente la infección por DV cuando se incuban respectivamente con 293T-TYR03 o 293T-AXL 30 minutos antes de la exposición al virus (figura 8). Los anticuerpos pierden su capacidad neutralizante cuando se agregan 2 h después de la infección (figura 8) lo que sugiere que los receptores de TAM actúan en una etapa temprana del ciclo de vida de DV. Después se investigó si TYR03 y AXL promueven la internalización de DV. Se expusieron células que expresan TYR03 y AXL a DV2 JAM durante 4 h a 37°C. Se extrajo el ARN total y se cuantificaron los niveles de ARN viral por qPCR (figura 9). Los receptores de TAM incrementaron fuertemente la captación de ARN para DV en células 293T (incremento de 30 veces y 10 veces con TYR03 y AXL, respectivamente) (figura 9). En un segundo enfoque, TYR03 y AXL se expresaron en células CHO-745, las cuales carecen de sulfato de heparano en la superficie. Las células que expresan TAM o, como controles, células DC-SIGN CHO-745 se incubaron con partículas de DV2 JAM durante l h a 4°C y se desplazaron a 37°C durante 45 min para permitir endocitosis. La captación de virus se monitoreo por microscopía de fluorescencia utilizando el mAb anti-DV E, 4G2. Al igual que con DC-SIGN, encontramos una fuerte acumulación intracelular de proteína DV E en células que expresan TYR03 o AXL. Por lo tanto, las partículas de DV se internalizan eficientemente en células objetivo ante la expresión de TYR03 o AXL. Estos resultados indican que los receptores de TAM TYR03 y AXL son cofactores de entrada celulares novedosos para DV.
Después se investigó si la entrada de DV en células que expresan TAM requiere una vía endocítica dependiente de clatrina funcional. Se transfectaron células HeLa que expresan TYR03 o AXL con ARNsi dirigido a la cadena pesada de clatrina (CHC, por sus siglas en inglés), un factor celular que promueve la formación de orificios recubiertos. El bloqueo de expresión se verificó por WV y por análisis funcional que demuestra inhibición de transferrina mediada por clatrina, como se ha descrito previamente. El bloqueo de la expresión de CHC inhibe con potencia la infección de DV de células que expresan TYR03 y AXL (figura 10). Como un control positivo, el bloqueo de la expresión de ATP6V1B2 también bloquea la infección por DV. Juntos, estos datos muestran que el mejoramiento mediado por TAM de la entrada de DV depende del pH e involucra la vía de clatrina.
Gas6 soluble interactúa con PdtSer expresado en la envoltura de DV y forma un puente de partículas virales con TYR03 y AXL Para dilucidar los mecanismos por los cuales TYR03 y AXL mejoran la entrada de DV, se realizó un análisis de infección de inhibición con moléculas quiméricas solubles TYR03-Fe y AXL-Fc. Células originales 293T-TYR03 o 293T-AXL se infectaron con partículas DV2 JAM preincubadas con moléculas TYR03-FC, AXL-Fc o moléculas Fe control (figura 11). La infección por DV se bloqueó de manera significativa por TYR03-Fe o AXL-Fc solubles, lo que sugiere fuertemente que los viriones de DV se unen a receptores de TAM. No obstante, experimentos de separación utilizando TYR03-Fc o AXL-Fc solubles no inmunoprecipitan la proteína DV-E a partir de partículas DV intactas, lo que indica que el ectodominio de TYR03 o AXL no interactúa directamente con DV. Para investigar adicionalmente como los receptores de TAM se asocian con DV, se llevaron a cabo análisis de unión de virus en presencia o ausencia de suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) el cual contiene niveles altos (-300 nM) del ligando de TAM ProS. Se incubaron células 293T originales, TYR03 y AXL a 4°C con partículas de DV con o sin FBS 5%. Las partículas de DV unidas a la superficie celular se detectaron por FACS utilizando el mAb anti-proteína A, 4G2. Se detectó un incremento significativo en la unión de virus a TYR03 y AXL únicamente en presencia de FBS. Se obtuvieron resultados similares cuando TYR03 o AXL se expresan en células CHO 745 y cón diversas cepas de DV. Con FBS, la unión de DV a células positivas a TAM es específico puesto que se inhibe por AV anti-TYR03 o anti-AXL. De manera importante, el efecto de TAM sobre DV es abrogado con las infecciones se realizan en ausencia de FBS (figura 12). Incrementar la concentración de FBS a 10% aumenta la infección por DV de TYR03 o AXL pero no en células que expresan DC-SIGN (figura 12). De manera colectiva, estos datos indican que los factores de FBS pueden facilitar la unión de DV a receptores de TAM, lo que permite la entrada aumentada del virus.
Se investigó si la unión de DV a receptores de TAM es modulada por Gas6 murino de longitud completa (rmGas6). La unión de DV a células que expresan TYR03 y AXL se incremento de manera significativa cuando las partículas virales se preincubaron con mGas6 pero no con el control en falso (figura 13). De manera consistente, mGas6 de longitud completa refuerza drásticamente la infección por DV de células que expresan TYR03 y AXL y no en células control (figura 14). Se obtuvieron resultados similares utilizando Gas-6 de longitud completa humano. Esto sugiere fuertemente que Gas6 forma el complejo con DV que interactúa con los receptores de TAM para aumentar la entrada de DV. Con el fin de saber si Gas6 reconoce PdtSer expresado en viriones de DV, se realizó un análisis de ELISA en donde DV aplicado como recubrimiento sobre pozos se incubó con diversas moléculas de Gas6 (figura 15). Gas6 de longitud completa se une eficientemente a partículas de DV. En contraste, una molécula de Gas6 que carece del dominio Gal N-terminal (mGas6AGla) y por lo tanto es incapaz de unir PdtSer está deteriorada en su capacidad para interactuar con partículas de DV.
Después se investigó si PdtSer expresado en partículas de DV se requiere para infección de células TAM positivas. Células con TYR03 y AXL se infectaron con DV preincubado con anexina V (A X5), una proteína que une PdtSer bien documentada. ANX5 no tiene efectos sobre la entrada de DV a través de DC-SIGN. En contraste, ANX5, probablemente por bloqueo del acceso a PdtSer, inhibe de manera significativa la infección de DV de células 293T expresan TYR03 o AXL y que se cultivan en FBS (figura 16). Juntos, los resultados muestran que Gas6 aumenta la entrada de DV. La molécula actúa por unión a PdtSer expuesta en viriones DV a los receptores TAM, TYR03 y AXL.
Actividad antiviral de la molécula de Gas6 es incapaz de asociar partículas de DV a TYR03 y AXL Después de comparó la capacidad de mGas6 de longitud completa y un derivado de Gas6 disponible comercialmente que carece del dominio Gla (rmGas6áGla) para modular la unión de DV y la infección a células que expresan TYR03 y AXL. Las dos proteínas de Gas6 se probaron para determinar su capacidad de asociación de DV a TYR03 y AXL. Las partículas de DV recubiertas sobre placas de ELISA se incubaron con las formas solubles de TYR03-FC y AXL-Fc o como moléculas Fe control no relacionadas en presencia de moléculas Gas6. En este análisis, rmGas6 de longitud completa mostró actividad de asociación con DV mientras que este no fue el caso para rmGas6AGla y, sorprendentemente, rhGas6 (figura 17). Como control, ninguna de las moléculas Gas6 probadas moduló la unión de DV a DC-SIGN-Fc. Se observó que rmGas6 de longitud completa incrementa la infección de DV incluso en presencia de FBS (figura 18). Esto concuerda con el hallazgo de concentraciones de suero muy bajas de Gas6 (0.2-0.5 nM), casi la totalidad de las cuales está en forma de complejo con el ectodominio Axl soluble. De manera interesante, el pretratamiento de células 293T que expresan TYR03 o AXL con rmGas6AGla abroga el incremento de infección por DV2 (figura 18). Estos experimentos de unión indican que la inhibición de la infección mediada por receptor de TAM por rmGas6AGla se correlaciona con la capacidad de esta molécula para bloquear la unión de DV3 a células CH0745 que expresan TAM (figura 19). Juntos, estos resultados muestran que la molécula de Gas6 es incapaz de unir DV a receptores de TAM y funciona como un compuesto antiviral.
Los receptores TIM y TAM median la infección por otros flavivirus Para determinar si los receptores TIM y TAM median la infección por otras especies virales, células que expresan TIM-1 y TIM-4 se expusieron con virus DV2-JAM, virus del Nilo Occidental (WNV), cepa de vacuna de virus de fiebre amarilla (YFV-17D) y virus de herpes simple 1 (HSV-1). La infección viral se cuantificó por citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos (figura 21). Los datos muestran que TIM-1 y TIM-4 incrementan de manera masiva la infección por WNV, regulando por aumento ligeramente la sensibilidad a YFV-17D, pero no tuvieron efecto en HSV-1. Se obtuvieron resultados similares para células que expresan TYR03 y AXL (figura 22). Juntos, estos datos indican que los receptores de PtdSer, TIM y TAM son ambos factores celulares que promueven la infección por flavivirus.
La expresión ectópica de TIM y TAM incrementa la infección por Chikungunya Además, es de interés si el mecanismo representa un mecanismo general aprovechado por los virus que expresan o que incorporan PtdSer en su membrana. Células 293T originales, o células 293T que expresan TIM-1 y TIM-4 se infectaron con Chikungunya (Chick). La infección se cuantificó 48 horas después por citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón contra la glucoproteína de envoltura E2 (3E4). Los resultados (figura 23) muestran que TIM-1 y TIM-4 incrementan masivamente la infección por Chikungunya. Se obtuvieron resultados similares para células que expresan TYR03 y AXL, su expresión ectópica aumenta así como la infección por Chikungunya (figura 24).
Estos datos muestran que la facilitación de TIM y TAM de infección viral representa un mecanismo general aprovechado por los virus que expresan o que incorporan PtdSer en su membrana para infección óptima.
Las moléculas endógenas TIM-1 y AXL medían la infección por DV La línea de células A549 expresa tanto TIM-1 como AXL. La infección por DV2 se reduce parcialmente con un anticuerpo anti-TIM-1 o anti-AXL administrado solo, mientras que los dos anticuerpos en combinación inhiben completamente DV2 (figuras 25 y 26), DV3 (figura 27) pero no la infección por HSV-1. Se obtuvieron resultados similares en células Vero que expresan TIM-1 y AXL. Estos resultados muestran que los receptores de TIM y TAM pueden cooperar de modo natural para promover la infección por DV y que PtdSer media la infección en células que expresan de manera endógena los receptores. DISCUSIÓN El presente estudio agrega visión significativa en los mecanismos moleculares y requerimientos celulares para la entrada de DV. Utilizando un cribado de ADNc de ganancia de función, los inventores identificaron TYR03 y AXL como cofactores de entrada DV novedosos. TYR03 y AXL constituyen con MER la familia TAM de receptor de tirosinas cinasas (RTK, por sus siglas en inglés) los cuales regulan una mezcla interesante de procesos y son esenciales para la fagocitosis de células apoptósicas. TYR03 y AXL reconocen PdtSer expuesto sobre la envoltura viral a través de su ligando natural Gas6 y ProS el cual se asocia con viriones de DV a la célula hospedadora e incrementa la internalización del virus. Este hallazgo por lo tanto indica que los receptores del hospedador manipulan DV involucrado en la depuración de cuerpos de células apoptósicas para su entrada infecciosa y sugieren que DV aprovecha sistemas receptores de células múltiples para asegurar que puede establecer una infección productiva en el hospedador humano.
Este estudio demuestra que la partícula de DV no interactúa directamente con receptores de TAM. Por el contrario, el incremento de la infección por DV y la absorción en células que expresan TYR03 y AXL depende casi por completo de la presencia de suero. El suero contiene dos ligandos de receptor de TAM, la proteína Gas dependiente de vitamina K y la proteína S anticoagulante relacionada estrechamente que están presentes en el plasma en concentración fisiológica de 0.25 nM y 350 nM, respectivamente. Ambas moléculas son responsables por la unión de células apoptósicas al receptor de TAM y recientemente se ha reportado que Gas6 incrementa la transducción de virus pseudotipificado lentiviral mediada por AXL. De manera interesante, similar a estos resultados en presencia de FBS, Gas incrementa la infección por DV y la absorción en células que expresan TAM en ausencia de suero. Por el contrario, Gas que carece del dominio Gla disminuye la infección y la unión de receptor TAM en presencia de suero. Estos experimentos sugieren que el componente presente en el suero utiliza un mecanismo similar y se une a un dominio de receptor TAM como uno que se superpone en comparación con Gas6. De este modo, es probable que Gas6 y/o ProS estén presentes en el suero cuando se unen al virus a través de su dominio Gla, se unen simultáneamente al receptor TAM a través de su dominio SHBG. La observación de los inventores ha generado evidencias nuevas de que la interacción de flavivirus con el receptor celular puede involucrar una molécula de asociación y reforzar la investigación reciente sobre unión indirecta de WNV al receptor celular de mosquito mosPTP-1. En el caso de WNV, la lactina tipo C soluble, mosGCTL-1, se asocia con la proteína de envoltura de WNV a mosPTP-1 y subsecuentemente facilita la infección.
Varias evidencias sugieren que los efectos de FBS observados ciertamente se deben a ProS en vez de Gas6. En primer lugar, la concentración de Gas6 en plasma es muy baja y casi todo el Gas está formando complejos con el ectodominio AXL soluble (sAXL). Por el contrario, la concentración de ProS es muy alta y solo 60% de ProS está formando complejos con C4BP (proteína de unión C4b) . En segundo lugar, Gas6 se une a la totalidad de los tres receptores TAM in vitro (AXL >TYR03>>MER) y en realidad Gas6 de modo similar incrementa la unión de DV a células que expresan TYR03 y AXL como se observa desde la figura 11 hasta la figura 16. En contraste, ProS es un ligando in vitro más potente para TYR03 que para AXL, lo cual concuerda con el fuerte incremento de FBS al unir DV a células que expresan TYR03 y a células que expresan AXL en menor medida.
Puesto que la actividad de asociación de Gas6 y la proteína C sugiere una interacción del dominio Gla con la partícula viral, los inventores establecen la hipótesis de que los residuos de PtdSer están expuestos en la envoltura viral de DV. Los experimentos de ELISA que aquí se describen demuestran en realidad que el dominio Gla de Gas unido al virus y que el efecto potenciador del suero es eliminado por competencia por incubación previa de la partícula viral con la proteína que une PtdSer, anexina V. De manera interesante, PtdSer parece estar expuesto a varios viriones envueltos y publicaciones previas han demostrado que la anexina V se une a V1H-1, virus de vaccinia, CMV, HSV-1 y HSV-2. En concordancia con el ciclo de vida de DV, se supone que DV adquiere PtdSer mientras está brotando en el lumen del retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés) . La membrana plasmática y la membrana de bicapa de ER están constituidas de dos hojas y en la célula en reposo PtdSer se localiza y enriquece en la hoja interior. Mientras brota del citosol, la nucleocápside induce una invaginación hacia adentro de la membrana de ER. Durante este proceso la hoja interior de la membrana de ER y los heterodímeros prM-E, los cuales están anclados en el lado luminal del ER, son expuestos en la superficie de la partícula inmadura viral envuelta.
La relación de TYR03 y AXL en la entrada de DV genera preguntas interesantes acerca de la manera en que, ante la unión del complejo virus-ligando, estas moléculas facilitan la infección. Como se esquematiza en la figura 20, las proteínas TYR03 y AXL pueden facilitar la interacción de la proteína de envoltura viral con su receptor primario, por ejemplo al incrementar la concentración de virus en la superficie celular, en un modelo similar a la entrada de DV mediada por DC-SIGN. Además, debido a que los receptores TAM pueden asociarse físicamente con un receptor diferente de TAM por dimerización heterotípica, es concebible que TYR03 y AXL puedan reclutar un receptor bona fide. Esta interacción puede llevar a la activación de la vía de la señal corriente abajo que incrementa la internalización de DV mediada por clatrina. Otra hipótesis interesante es que la unión del complejo DV-ligando de TAM puede disparar la activación de receptor de efectores posteriores facilitando la infección viral. Esta hipótesis está fundamentada por: (i) la unión de Gas6 al receptor de TAM dispara una cascada de transducción de señales con una diversidad de resultados biológicos dependientes a la célula; (ii) demostración de que la supresión de la cola citoplásmica, así como mutación de un sitio de unión ATP (K567M) que suprime la fosforilación de tirosina reduce el incremento mediado por AXL de transducción ZEBOV-GP; (iii) se requiere la activación de la vía fosfolipasa C para transducción de células dependiente de AXL por virus pseudotipificado con ZEBOV-GP. Por lo tanto, es concebible que la activación de las vías posteriores se requiera para aumento de la infección por DV mediada por TYR03/AXL.
En realidad, una de estas vías corriente abajo puede ser la regulación negativa de la inmunidad innata. Recientemente se ha reportado que el receptor de TAM activado por Gas6 funciona como un inhibidor de la inflamación e induce el receptor similar a peaje (TLR, por sus siglas en inglés) y el receptor de citocina en macrófagos y células dendríticas. Durante la inflamación, la señalización de TLR y citocina impulsa la regulación por aumento de la expresión de AXL, lo cual subvierte la vía de la señalización INFAR/STAT1 proinflamatoria para inducir transcripción del gen S0CS1 y S0CS3 (supresión de la señalización de citocina) y regula de manera negativa la inmunidad innata y la inflamación. La unión de Gas6 a AXL induce un incremento de 10 veces en la expresión de ARNm para SOCS1 e inhibe la producción de citocina inducida por TLR. Se puede suponer que el complejo de DV-ligando de TAM pueda actuar como un superagonista del receptor de TAM e inducir una potente activación de receptor que estimula la expresión del gen SOCS y la inhibición subsecuente de TLR, y de esta manera se facilita la etapa temprana de infección.
Se predice un modelo por el cual DV a través de los residuos PtdSer presentes en la envoltura viral es reconocido por un componente de suero como un cuerpo apoptósico con lo que se forma un complejo que tiene la capacidad de unirse a TYR03 y AXL en la superficie celular. Al imitar los cuerpos apoptósicos, DV subvierte la función de depuración apoptósica del receptor TAM para facilitar la infección.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un inhibidor de una interacción entre fosfatidilserina y un receptor de TAM para usarse en la prevención o tratamiento de una infección por virus, en donde el inhibidor es: (i) un inhibidor de receptor de TAM, (ii) un inhibidor Gas6, y/o (iii) una proteína de unión de fosfatidilserina.
2. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el receptor de TAM es TYR03, AXL o MER.
3. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el inhibidor de receptor de TAM es un anticuerpo anti-receptor de TAM, un ácido nucleico antisentido, un mimético o un receptor TAM variante.
4. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el inhibidor Gas6 es un anticuerpo anti-Gas6, un ácido nucleico antisentido, un mimético o una proteína Gas6 variante.
5 . El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde la proteína que une fosfatidilserina es un anticuerpo anti-fosfatidilserina o anexina 5.
6. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 3, en donde el inhibidor de receptor de TAM es un ARNsi de la secuencia SEC ID NO: 1, 2, 3 ó 4.
7. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 4, en donde el inhibidor de Gas6 es la proteína Gas6 variante Gas6AGla de la secuencia SEC ID NO: 19.
8. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus es un virus que alberga fosfatidilserina.
9. El inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el virus que alberga fosfatidilserina es un alfavirus o un flavivirus.
10. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 9, en donde el virus alfavirus es el virus Chikungunya.
11. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 9, en donde el flavivirus es virus del Nilo occidental, virus de la fiebre amarilla o virus de la fiebre del dengue.
12. El inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el inhibidor es para administración y combinación con por lo menos otro compuesto antiviral, ya sea secuencial o simultáneamente.
13. El inhibidor para usarse de conformidad con la reivindicación 9, en donde el otro compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor de TIM.
14. El inhibidor para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el inhibidor se formula en una composición farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y adicionalmente por lo menos un compuesto antiviral.
16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque por lo menos un compuesto antiviral es un inhibidor de una interacción de fosfatidilserina y un receptor de TIM.
17. El uso de un inhibidor de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un método in vitro para inhibir la entrada de un virus que alberga fosfatidilserina, en particular un flavivirus, al interior de una célula.
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