MX2014008041A - Derivados de heterobiciclicos como inhibidores del virus de la hepatitis c. - Google Patents

Derivados de heterobiciclicos como inhibidores del virus de la hepatitis c.

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Abstract

Inhibidores de la replicación del VHC de fórmula I (ver Fórmula) que incluyen las formas estereoquímicamente isoméricas, así como sales, hidratos y solvatos de estos, donde R y R' tienen los significados que se definen en la presente; la presente invención también se refiere a procesos para preparar dichos compuestos, a composiciones farmacéuticas que los contienen y a su uso, solo o combinado con otros inhibidores del VHC, en la terapia contra el VHC.

Description

DERIVADOS HETEROBICÍCLICOS COMO INHIBIDORES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a derivados heterobicíclicos, en particular, sin carácter limitante, a derivados de quinolinona y quinazolinona, los cuales son inhibidores del virus de la hepatitis C (VHC), a su síntesis y a su uso, solo o combinado con otros inhibidores del VHC, en el tratamiento o la profilaxis del VHC.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA El VHC es un virus que contiene ARN de cadena sencilla y sentido positivo, el cual pertenece al género Hepacivirus de la familia Flavivirídae. El genoma vírico se traduce en un único marco de lectura abierto que codifica múltiples proteínas estructurales y no estructurales.
Tras la infección aguda inicial, la mayoría de los individuos infectados desarrollan hepatitis crónica, debido a que el VHC se replica preferentemente en los hepatocitos, aunque no es directamente citopático. En particular, la ausencia de una respuesta enérgica por parte de los linfocitos T y la elevada tendencia del virus a mutar parecen ser las causas que propician la elevada tasa de infecciones crónicas. La hepatitis crónica puede evolucionar hasta provocar fibrosis hepática, la cual puede acabar en cirrosis, enfermedad hepática terminal y CHC (carcinoma hepatocelular), por lo cual se ha convertido en la causa principal de trasplante de hígado.
Existen seis genotipos principales del VHC y más de 50 subtipos, los cuales se distribuyen geográficamente de forma distinta. El genotipo 1 del VHC es el que predomina en Europa y en los EE. UU. La considerable heterogeneidad genética del VHC tiene implicaciones importantes para el diagnóstico y en el ámbito clínico, y podría explicar las dificultades que se encuentran en el desarrollo de vacunas y la falta de respuesta a las terapias actuales.
La transmisión del VHC puede producirse a través del contacto con sangre o productos sanguíneos contaminados, por ejemplo, después de una transfusión de sangre o del uso de un fármaco por vía intravenosa. La introducción de pruebas de diagnóstico utilizadas en los análisis de sangre ha dado como resultado una tendencia a disminuir la incidencia del VHC después de las transfusiones. Sin embargo, debido a la lenta evolución de las enfermedades hepáticas terminales, las infecciones existentes seguirán suponiendo una seria carga médica y económica durante décadas.
Las terapias actuales para combatir el VHC se basan en interferón-alfa (IFN-a) (pegilado) combinado con ribavirina. Esta terapia combinada proporciona una respuesta virológica sostenida en un 40% de los pacientes infectados con el VHC de genotipo 1 y en aproximadamente un 80% de aquellos infectados con los genotipos 2 y 3. Además de la eficacia limitada para el genotipo 1 del VHC, esta terapia combinada presenta efectos secundarios significativos, que incluyen síntomas de la gripe, anomalías hematológicas y síntomas neuropsiquiátricos. Por lo tanto, se necesitan tratamientos más eficaces, más convenientes y que se toleren mejor.
La experiencia con los fármacos para combatir el VHC, en particular, con los inhibidores de proteasas del VHC, ha puesto de manifiesto que unos parámetros farmacocinéticos subóptimos y unas pautas posológicas complejas provocan rápidamente deficiencias involuntarias en el cumplimiento del tratamiento. A su vez, esto significa que la concentración mínima en un periodo de 24 horas (concentración mínima en plasma) de los fármacos respectivos empleados en un régimen para combatir el VIH se reduce frecuentemente hasta un nivel inferior al umbral de CI90 o DE90 durante gran parte del día. Se considera que un nivel mínimo en un periodo de 24 horas de al menos la Cl50 y, de forma más realista, la Cl90 o la DE90, es esencial para ralentizar el desarrollo de mutantes resistentes a fármacos. El hecho de conseguir unos parámetros farmacocinéticos y una velocidad del metabolismo del fármaco necesarios para obtener tales niveles mínimos supone un reto importante para el diseño de fármacos.
La proteína NS5A del VHC se localiza en un punto posterior a la proteína NS4B y anterior a la proteína NS5B. Tras la escisión posterior a la traducción por parte de la serina-proteasa vírica NS3/4A, la NS5A madura y se obtiene una fosfoproteína de tres dominios que contiene zinc, la cual existe como una especie hipofosforilada (56-kDa, p56) o una especie hiperfosforilada (58-kDa, p58). La NS5A del VHC participa en múltiples aspectos del ciclo vital vírico, que incluyen la replicación vírica y el acoplamiento de las partículas infecciosas, así como también en la modulación del entorno de su célula huésped. Aunque no se ha atribuido ninguna función enzimática a la proteína, se ha descrito que interacciona con numerosos factores víricos y celulares.
Una serie de patentes y solicitudes de patente describen compuestos con actividad inhibitoria del VHC, en particular que tienen NS5A como diana. El documento WO2006/133326 describe derivados de estilbeno, mientras que los documentos WO 2008/021927 y WO 2008/021928 describen derivados bifenílicos que poseen actividad inhibitoria de NS5A del VHC. El documento WO 2008/048589 describe derivados de 4-(feniletinil)-1 H-pirazol y su uso antivírico. El documento WO 2008/070447 describe una amplia gama de compuestos inhibidores del VHC que incluyen un resto de bencimídazol. Los documentos WO-2010/017401 y WO-2010/065681 describen inhibidores de tipo bisimidazol de NS5A del VHC.
Se necesitan inhibidores del VHC que puedan resolver las desventajas de las terapias actuales para combatir el HCV, tales como los efectos secundarios, la eficacia limitada, la aparición de resistencia y las deficiencias en el cumplimiento del tratamiento, así como también mejorar la respuesta a la carga vírica sostenida.
La presente invención se refiere a un grupo de derivados heterobicíclicos que inhiben el VHC, en particular, sin carácter limitante, a derivados de quinolinona y quinazolinona, con propiedades útiles respecto a uno o más de los siguientes parámetros: eficacia antivírica, perfil favorable de desarrollo de resistencia, toxicidad y genotoxicidad reducidas o nulas, parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos favorables, formulación y administración sencillas, e interacciones fármaco-fármaco limitadas o nulas con otras sustancias farmacológicas, en particular otros agentes contra el VHC.
Los compuestos de la invención también pueden resultar atractivos debido al hecho de que carecen de actividad frente a otros virus, en particular contra el VIH. Los pacientes infectados con el VIH sufren a menudo infecciones conjuntas tales como las debidas al VHC. El tratamiento de tales pacientes con un inhibidor del VHC que también inhibiera el VIH podría provocar la aparición de cepas de VIH resistentes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona compuestos de fórmula I ) o un estereoisómero de estos, donde: Y es CH, N o CR4; W es carbonilo, sulfonilo o CR5R6¡ c R y R' se seleccionan independientemente entre -CR-|R2R3, arilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados entre halo y metilo, o heterocicloalquilo, donde Ri se selecciona entre alquilo C- , alquilo C2-4 sustituido con metoxi o hidroxilo, y fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo y metilo; R2 es hidroxilo, amino, mono- o di(alquil C1-4)amino, (alquil C-i. 4)carbonilamino, (alquiloxi Ci^carbonilamino; R3 es hidrógeno o alquilo C^; R4 es hidrógeno, alquilo C1-4 o fluoro; R5 y R6 son, cada uno independientemente, alquilo C- ; O CR5R6 forman conjuntamente un cicloalquilo 03.7, oxetano, tetrahidrofurano; o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato de estos.
Además, la invención se refiere a un producto que contiene (a) un compuesto de acuerdo con la presente invención y (b) otro inhibidor del VHC, como un preparado combinado para el uso simultáneo, secuencial o por separado en el tratamiento de infecciones provocadas por el VHC.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de compuestos de fórmula la-c, o subgrupos de estos, según se especifica en la presente, para inhibir el VHC. Como alternativa, se proporciona el uso de dichos compuestos para la elaboración de un medicamento para inhibir el VHC.
En una primera modalidad, la presente invención proporciona un subgrupo de compuestos de fórmula I, los cuales se pueden representar con la fórmula (la): Son de particular interés los compuestos de fórmula I subgrupos de estos, según se define en la presente, que se corresponden c la fórmula Ib y le. independientemente de un grupo que comprende Más preferentemente, los compuestos de la invención proporcionan compuestos que se pueden representar con la fórmula Id En una modalidad adicional de la invención, R2 se selecciona del grupo que comprende (alquil Ci_4)carbonilamino o (alquiloxi Ci. 4)carbonilamino.
En otra modalidad más de la invención, R1 se selecciona entre alquilo C3-4 ramificado, alquilo C2-3 sustituido con metoxi, y fenilo opcionalmente sustituido con 1 sustituyente seleccionado entre halo y metilo.
En otra modalidad más de la invención, R3 es hidrógeno.
En una modalidad adicional, R y R' son idénticos.
En una modalidad adicional más, R2 es (alquil Ci-4)carbonilamino o (alquiloxi Ci^)carbonilamino, y R3 es hidrógeno.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un compuesto de fórmula I o una sal, un hidrato o un solvato farmacéuticamente aceptable de este, para su uso en el tratamiento o la profilaxis (o la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis) de una infección provocada por el VHC. Los genotipos representativos del VHC en el contexto del tratamiento o la profilaxis de acuerdo con la invención incluyen, sin carácter limitante, el genotipo 1b (predominante en Europa) o 1a (predominante en América del Norte). La invención también proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis de una infección provocada por el VHC, en particular del genotipo 1a o 1b, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según se ha definido anteriormente en la presente.
Las formas estereoisoméricas puras de los compuestos y los intermedios que se mencionan en la presente se definen como isómeros sustancialmente exentos de otras formas enantioméricas o diastereoméricas de la misma estructura molecular básica de dichos compuestos o intermedios. En particular, la expresión "estereoisoméricamente puro" se refiere a compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico de al menos un 80% (es decir, un mínimo de un 90% de un isómero y un máximo de un 10% de los otros isómeros posibles) y hasta un exceso estereoisomérico de un 100% (es decir, un 100% de un isómero y nada de los demás), más concretamente, compuestos o intermedios que tienen un exceso estereoisomérico desde un 90% hasta un máximo de un 100%, aún más concretamente que tienen un exceso estereoisomérico desde un 94% hasta un máximo de un 100% y, aún más concretamente, que tienen un exceso estereoisomérico desde un 97% hasta un máximo de un 100%. Las expresiones "enantioméricamente puro" y "diastereoméricamente puro" se deben interpretar de un modo similar, pero haciendo referencia al exceso enantiomérico y el exceso diastereomérico, respectivamente, de la mezcla en cuestión.
Las formas estereoisoméricas puras o los estereoisómeros puros de los compuestos y los intermedios de esta invención se pueden obtener mediante la aplicación de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los enantiómeros se pueden separar unos de otros mediante la cristalización selectiva de sus sales diastereoméricas con ácidos o bases ópticamente activos. Algunos ejemplos de estos son el ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico y ácido canforsulfónico. Como alternativa, los enantiómeros se pueden separar mediante técnicas cromatográficas utilizando fases estacionarias quirales. Dichas formas estereoquimicamente isoméricas puras también pueden obtenerse a partir de las formas estereoisoméricas puras correspondientes de los materiales de partida adecuados, siempre que la reacción tenga lugar de manera estereoespecífica. Preferentemente, si se desea obtener un estereoisómero específico, dicho compuesto se sintetizará mediante métodos de preparación estereoespecíficos. En estos métodos, se emplearán convenientemente materiales de partida enantioméricamente puros.
Los racematos diastereoméricos de los compuestos de fórmula I se pueden obtener por separado mediante métodos convencionales. Los métodos físicos de separación adecuados que se pueden utilizar de forma beneficiosa son, por ejemplo, la cristalización selectiva y la cromatografía, p. ej., la cromatografía en columna o la cromatografía de fluidos supercríticos.
Los compuestos de fórmula I y los subgrupos de los compuestos de fórmula I según se han definido anteriormente en la presente contienen varios centros de quiralidad. Son de interés los centros estereogénicos del anillo de pirrolidina en el átomo de carbono 2. La configuración en esta posición puede ser la correspondiente a L-prolina, es decir, y También es de interés la configuración del grupo -CR1R2R3 donde R3 es H: cuando R1 se selecciona entre alquilo C3-4 ramificado y alquilo C2-3 sustituido con metoxi, entonces se prefiere la configuración S; cuando R1 se selecciona entre fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo y metilo, entonces se prefiere la configuración R.
Las sales de adición farmacéuticamente aceptables comprenden las formas salinas de adición de ácido y base atóxicas terapéuticamente activas de los compuestos de fórmula I o subgrupos de estos. Son de interés las formas libres, es decir, no salinas, de los compuestos de fórmula I o de cualquier subgrupo de compuestos de fórmula I especificado en la presente.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden obtener convenientemente tratando la forma básica con un ácido adecuado de este tipo. Los ácidos adecuados comprenden, por ejemplo, ácidos inorgánicos tales como haluros de hidrógeno, p. ej., ácido clorhídrico o bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y los ácidos similares; o ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, propiónico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (es decir, etanodioico), malónico, succínico (es decir, ácido butanodioico), maleico, fumárico, málico (es decir, ácido hidroxibutanodioico), tartárico, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclámico, salicílico, p-aminosalicílico, pamoico y los ácidos similares. A la inversa, dichas formas salinas se pueden convertir en la forma de base libre tratándolas con una base adecuada.
Los compuestos de fórmula (I) que contienen un protón ácido también se pueden convertir en sus sales de adición de base, en particular en formas salinas de adición de amina o metal, tratándolas con bases orgánicas e inorgánicas adecuadas. Las formas salinas de adición de base adecuadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos, p. ej., las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, las sales con bases orgánicas, p. ej., las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina, y las sales con aminoácidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares.
El término "solvatos" engloba cualesquiera solvatos farmacéuticamente aceptables que los compuestos de fórmula I, asi como también las sales de estos, puedan formar. Tales solvatos son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos, p. ej., etanolatos, propanolatos y similares.
Algunos de los compuestos de fórmula I también pueden existir en formas tautoméricas. Por ejemplo, las formas tautoméricas de grupos amida (-C(=0)-NH-) son iminoalcoholes (-C(OH)=N-). Se pretende que las formas tautoméricas, aunque no se indiquen de forma explícita en las fórmulas estructurales representadas en la presente, queden incluidas dentro del alcance de la presente invención.
La expresión "alquilo C1-C4", tal como se utiliza en la presente, como un grupo o parte de un grupo, define grupos hidrocarbonados saturados de cadena lineal o ramificada que contienen de 1 a 4 átomos de carbono tales como, por ejemplo, metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo y 2-metil-2-propilo. A los efectos de la presente invención, entre los grupos alquilo Ci-4 son de interés los grupos alquilo C3-4, es decir, grupos hidrocarbonados de cadena lineal o ramificada que contienen 3 o 4 átomos de carbono tales como 1-propilo, 2-propilo, 1-butilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo, 2-metil-2-propilo. Pueden ser de particular interés los grupos alquilo C3-4 ramificados tales como 2-propilo, 2-butilo, 2-metil-1 -propilo, 2-metil-2-propilo.
La expresión "cicloalquilo C3.6", como un grupo o parte de este, define grupos hidrocarbonados cíclicos saturados que contienen de 3 a 6 átomos de carbono, los cuales forman conjuntamente una estructura cíclica. Los ejemplos de grupos cicloalquilo C3-6 incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
La expresión "alcoxi C- ", como un grupo o parte de un grupo, se refiere a un grupo de fórmula -0-(alquilo C- ) donde el alquilo Ci-4 es como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos de grupos alcoxi C- son metoxi, etoxi, p-propoxi e isopropoxi.
El término "halo" es genérico para fluoro, cloro, bromo y yodo.
Los términos "(=0)" u "oxo", tal como se utilizan en la presente, hacen referencia a grupos que forman un resto carbonilo cuando se unen a un átomo de carbono. Cabe destacar que un átomo solo podrá estar sustituido con un grupo oxo cuando la valencia de ese átomo lo permita.
El término "arilo", como un grupo o parte de este, tal como se utiliza en la presente a los efectos de su definición, se refiere a una estructura anular aromática que comprende opcionalmente uno o dos heteroátomos seleccionados entre N, O y S, en particular entre N y O. Dicha estructura anular aromática puede tener 5 o 6 átomos anulares.
El prefijo "hetero-", tal como se utiliza en la presente en la definición de un grupo, se refiere a que el grupo comprende al menos 1 heteroátomo seleccionado entre N, O y S, en particular N y O. Por ejemplo, el término "heteroarilo" se refiere a una estructura anular aromática según sea definido para el término "arilo" que comprende al menos 1 heteroátomo seleccionado entre N, O y S, en particular entre N y O, por ejemplo, furanilo, oxazolilo, piridinilo. Como alternativa, la expresión "hetero(cicloalquilo C3-6)" se refiere a un grupo hidrocarbonado cíclico saturado según se ha definido para "cicloalquilo C3-6" que comprende además al menos 1 heteroátomo seleccionado entre N, O y S, en particular entre N y O, por ejemplo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, piperidinilo.
Cuando la posición de un grupo en un resto molecular no se especifique (por ejemplo, un sustituyente en un fenilo) o se represente con un enlace flotante, dicho grupo podrá estar localizado en cualquier átomo del resto en cuestión, con la condición de que la estructura resultante sea químicamente estable. Cuando una variable cualquiera esté presente más de una vez en la molécula, cada definición será independiente.
Se pretende que las expresiones "compuestos de fórmula I", "compuestos de la presente" o similares, siempre que se utilicen en la presente, incluyan los compuestos de fórmula I, incluidas las formas estereoisoméricas posibles, así como las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de estos.
Métodos sintéticos generales ESQUEMA 1A Los bloques moleculares {building blocks) utilizados en la síntesis de los compuestos de fórmula I se describen en el esquema 1. La a- aminocetona lia (esquema 1 , A - NH2), donde X es un halógeno, en particular bromo o yodo, se acopla con un derivado protegido adecuadamente III, donde PC es un grupo protector del nitrógeno, preferentemente terí-butoxicarbonilo, en presencia de un reactivo de acoplamiento para la acilación de grupos amino, preferentemente HATU, en presencia de una base tal como DIPEA. El intermedio formado de este modo se cicla para obtener un compuesto imidazólico de fórmula general IV mediante el tratamiento con acetato de amonio, preferentemente a una temperatura comprendida en el intervalo entre 0 °C y 150 °C.
Como alternativa, el intermedio imidazólico IV se puede obtener mediante el acoplamiento de una a-halocetona llb, donde X y A' representan cada uno independientemente un átomo halogenado, X se selecciona preferentemente entre yodo o bromo y A' se selecciona preferentemente entre cloro, bromo o yodo, con un compuesto protegido adecuadamente III, donde PG' es un grupo protector del nitrógeno, preferentemente fe/f-butoxicarbonilo, en presencia de una base adecuada, por ejemplo, DIPEA, y a continuación la ciclación para obtener el intermedio imidazólico IV según se ha descrito anteriormente. Este intermedio IV se puede transformar para obtener un éster borónico de fórmula V en condiciones de catálisis con Pd, por ejemplo, en presencia de Pd(dppf)CI2, b/s(pinacolato)diboro y una base, por ejemplo, acetato de potasio.
De forma similar, los compuestos de fórmula IVa se pueden transformar en compuestos de fórmula Va según se representa en el esquema 1 b. IVa se puede obtener eliminando el grupo protector PG' (p. ej., utilizando HCI en dioxano o TMSOTf/lutidina en CH2CI2 en el caso de que PG' sea tert-butiloxicarbonilo) y a continuación acoplando la amina resultante con un ácido de fórmula R'(CO)OH en unas condiciones habituales para la formación de enlaces de tipo amida (p. ej., mediante el tratamiento con HATU o HBTU y una base tal como DIPEA o el uso de EDCI/HOBt/DIPEA).
En los esquemas 2A, 2B, 2C y 3A, 3B, 3C, 3D, 3E se describen otros bloques moleculares.
ESQUEMA 2A En el esquema 2A, el derivado ácido VI se convierte en un ß- cetoéster VII utilizando métodos que se describen en la bibliografía, por ejemplo, mediante la activación del ácido carboxílico con DCC o CDI y a continuación, por ejemplo, la reacción con el ácido de Meldrum y posterior descarboxilación en presencia de un alcohol o, como alternativa, mediante la condensación con una sal de tipo malonato de magnesio monoalquilado seguida de descarboxilación. Posteriormente, el ß-cetoéster VII (donde Raic hace referencia a un alquilo C- ) se condensa con VIII o X y a continuación se cicla para obtener IXa y IXb, respectivamente (X' es un halógeno seleccionado entre yodo o bromo, preferentemente bromo). Esta condensación se puede llevar a cabo en tolueno en presencia de ácido acético. La delación para obtener los compuestos de fórmula IXa y IXb se puede llevar a cabo térmicamente sometiéndolos a reflujo en Dowtherm™ A (mezcla de óxido de difenilo y bifenilo). Un ejemplo preferido del grupo protector PG es benciloxicarbonilo (CBz).
ESQUEMA 2B Como alternativa, los compuestos de fórmula general IXc se pueden obtener mediante una secuencia de reacción carbonilativa de Sonogashira catalizada con Pd/ciclación, según se describe en el esquema 2B. Se parte del compuesto de tipo yodo-anilina A.l y se utilizan procedimientos similares a los descritos en Applied Catalysis, A: General 2009, 369, 1-2, 125-132 y las referencias citadas en este.
ESQUEMA 2C Los compuestos de fórmula general IXd, donde R4 equivale a H o alquilo C -4, se pueden obtener según se muestra en el esquema 2c. El compuesto VIII (X' es un halógeno seleccionado entre yodo o bromo, preferentemente bromo) se puede convertir en el compuesto A.IV, por ejemplo, mediante el tratamiento de VIII con BCI3 en un disolvente tal como benceno a una temperatura inferior a la temperatura ambiente, por ejemplo, por enfriamiento con hielo, y a continuación el tratamiento con AICI3 y el nitrilo A.lll (R4 equivale a H o alquilo C1.4), por ejemplo, a reflujo en benceno. Tras una hidrólisis, se puede obtener el compuesto A.IV. La formación de un enlace de tipo amida partiendo de A.IV y VI da como resultado la formación del compuesto A.V. Esta reacción se puede llevar a cabo convirtiendo el compuesto VI en un haluro de ácido, por ejemplo, un fluoruro de ácido o cloruro de ácido, y a continuación haciéndolo reaccionar con A.IV en presencia de una base. Otro ejemplo consiste en la formación de A.V a partir de VI y A.IV mediante el uso del reactivo de acoplamiento cloruro de 4-(4,6-dimetoxi[1.3.5]triaz¡n-2-il)-4-metilmorfolinio o la sal de BF4 (DMTMM). La ciclación de A.V, en condiciones básicas, por ejemplo, KOH en EtOH o NaOH en dioxano, da como resultado el compuesto IXd.
ESQUEMA 3A La síntesis de los compuestos de fórmula XIII se describe en el esquema 3A. La formación de un enlace de tipo amida partiendo de XI (X' es un halógeno seleccionado entre yodo o bromo, preferentemente bromo) y VI da como resultado la formación del compuesto XII. Esta reacción se puede llevar a cabo convirtiendo el compuesto VI en un haluro de ácido, por ejemplo, un fluoruro de ácido o cloruro de ácido, y a continuación haciéndolo reaccionar con XI en presencia de una base. Otro ejemplo consiste en la formación de XII a partir de VI y XI mediante el uso del reactivo de acoplamiento cloruro de 4- (4,6-dimetoxi[1.3.5]triazin-2-il)-4-metilmorfolinio (DMTMM). A continuación, los compuestos XII se convierten en los compuestos de fórmula general XIII en condiciones básicas, por ejemplo, KOH o Na2C03 en etanol.
El compuesto de fórmula general A.XI (X' es un halógeno seleccionado entre yodo o bromo, preferentemente bromo) se puede obtener según se muestra en el esquema 3B. Utilizando métodos que se describen en la bibliografía (WO2007039578; Tet. Lett. 2001 , 42, 33, 5601-5603), el fluoruro A.VI se puede convertir en A.IX. Este último se acopla con un haluro de ácido A.X (donde X" equivale a cloro o fluoro) en presencia de una base, por ejemplo, trietilamina, y a continuación se cicla para obtener el compuesto A.XI en condiciones básicas tales como, por ejemplo, K2C03 acuoso 2 N a reflujo.
ESQUEMA 3C El compuesto de fórmula general A.XVI se puede obtener según se muestra en el esquema 3C. La dialquilación del éster A.XII con el haluro de alquilo adecuado, por ejemplo, Mel en el caso de que R5 = R6 = metilo, en presencia de una base, por ejemplo, NaH, da como resultado el compuesto A.XIII. Este éster se puede convertir en el compuesto A.XIV mediante su hidrólisis posterior, formación de la acilazia (por ejemplo, mediante el tratamiento del ácido correspondiente de A.XIII con difenilfosforilazida) y reacción de Curtius. Tras la reducción del compuesto A.XIV para obtener A.XV, este último compuesto se convierte en el compuesto A.XVI mediante el acoplamiento con el ácido VI, por ejemplo, mediante el tratamiento con HATU y una base, tal como trietilamina, y la ciclación posterior para obtener el compuesto A.XVI en condiciones ácidas, por ejemplo, en ácido acético a 50 °C.
ESQUEMA 3D En el esquema 3D se representa un procedimiento alternativo para la síntesis del compuesto A.XIV (por ejemplo, en el caso de que R5 y Re, junto con el carbono que los conecta, formen un oxetano). El anión, generado mediante una reacción de transmetalación, por ejemplo, del butillitio y el compuesto A.XVII a baja temperatura, por ejemplo, -78 °C, puede reaccionar con una sulfinamida A.XVIII. Tras la desprotección de la sulfinamida formada, en condiciones ácidas, se obtiene el compuesto A.XIV, el cual se puede transformar adicionalmente para obtener A.XVI según se ha descrito en el esquema 3C.
ESQUEMA 4 Los bloques moleculares A.XIX, obtenidos mediante métodos similares a los descritos en los esquemas 2 (a, b, c) y los esquemas 3 (a, b, c y d), y V (esquema 1) se pueden convertir en la estructura XIV, utilizando las condiciones de Suzuki-Miyaura (esquema 4). Se puede llevar a cabo una reacción de Suzuki-Miyaura similar cuando se sustituye V por Va y/o A.XIX por A.XIXa, lo cual da como resultado los compuestos de fórmula general XXI, XXIII o I. A.XIXa se puede obtener a partir de A.XIX eliminando de forma selectiva el grupo protector PG (p. ej., utilizando HCI en dioxano, TMSOTf/lutidina en CH2CI2 o TFA en CH2CI2 en el caso de que PG sea tert-butiloxicarbonilo o HBr en HOAc/H2O en el caso de que PG sea benciloxicarbonilo) y a continuación acoplando la amina resultante con un ácido de fórmula R(CO)OH en unas condiciones habituales para la formación de enlaces de tipo amida (p. ej., mediante el tratamiento con HATU o HBTU y una base tal como DIPEA o el uso de EDCI/HOBt/DIPEA) (esquema 3E).
ESQUEMA 3E Cuando PG' y PG en los esquemas 1-4 representan R'(C=0)- y R(C=0)-, respectivamente, los compuestos de estructura general XIV quedan englobados dentro la definición de los compuestos de fórmula I. En este caso, el esquema 4 describe la síntesis de los compuestos de fórmula I. Como alternativa, XIV se puede desproteger según se describe en el esquema 5. Por ejemplo, mediante el tratamiento con ácido (por ejemplo, HCI en iPrOH) cuando PG o PG' representan fert-butiloxicarbonilo (Boc). El compuesto XX se puede transformar en un compuesto de fórmula le, donde R y R' son idénticos, mediante la formación clásica de una amida entre un ácido R- (C=0)OH y la bisamina XX según se describe en el esquema 6. Los métodos preferidos consisten en el uso de HATU en presencia de una base tal como DIPEA o HOBt en presencia de EDCI y NEt3.
ESQUEMA 6 Cuando PG' es distinto de PG, es posible realizar una desprotección selectiva, según se describe en el esquema 5, la cual daría como resultado los compuestos XVIII o XIX cuando se parte de XIV. Por ejemplo, en el caso de que PG' sea terf-butiloxicarbonilo (Boc) y PG sea benciloxicarbonilo (Cbz), se puede llevar a cabo una desprotección selectiva eliminando el grupo protector Boc en condiciones ácidas, tales como HCI en iPrOH a temperatura ambiente, o eliminando el grupo protector CBz en condiciones reductoras, tales como hidrógeno en presencia de un catalizador, p. ej., Pd(OH)2.
Cuando PG' representa R'(C=0)- o PG representa R(C=0)-, la síntesis de los compuestos XIV según se describe en los esquemas 1-4 da como resultado el compuesto de fórmula XXI (esquema 7) o XXIII (esquema 8), respectivamente. Los compuestos XXI y XXIII se pueden obtener a partir del compuesto XIX y R'(C=0)OH o XVIII y R(C=0)OH, respectivamente, en las condiciones habituales para la formación de amidas. A continuación, estos compuestos se pueden transformar en los compuestos de fórmula I. La desprotección selectiva de XXI para obtener XXII seguida de la formación de un enlace de tipo amida entre XXII y R(C=0)-OH da como resultado los compuestos de fórmula I. A continuación, se puede aplicar una secuencia de reacciones análoga para transformar XXIII en XXIV y seguir los pasos posteriores para obtener los compuestos de fórmula I.
ESQUEMA 7 XXII ESQUEMA 8 En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I según se especifica en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En este contexto, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para estabilizar o para reducir una infección provocada por el VHC en sujetos infectados, o una cantidad suficiente para prevenir una infección provocada por el VHC en sujetos que corren el riesgo de ser infectados. En un aspecto adicional más, esta invención se refiere a un proceso para preparar una composición farmacéutica según se especifica en la presente, que comprende mezclar de forma íntima un portador farmacéuticamente aceptable con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula I, según se especifica en la presente.
Por consiguiente, los compuestos de la presente invención o cualquier subgrupo de estos se pueden formular en varias formas farmacéuticas con el fin de poderlos administrar. Como composiciones adecuadas, se pueden citar todas las composiciones empleadas normalmente para administrar fármacos por vía sistémica. Para preparar las composiciones farmacéuticas de esta invención, se combina una cantidad eficaz del compuesto particular, opcionalmente en forma de sal de adición o complejo metálico, como principio activo, en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, pudiendo adoptar dicho portador una gran variedad de formas dependiendo de la forma del preparado que se desee para la administración. Es deseable que estas composiciones farmacéuticas adopten una forma farmacéutica unitaria adecuada, en particular, para la administración por vía oral, rectal, percutánea o por inyección parenteral. Por ejemplo, en la preparación de composiciones en una forma farmacéutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparados líquidos orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones; o portadores sólidos tales como almidones, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a que su administración resulta sencilla, los comprimidos y las cápsulas representan las formas farmacéuticas unitarias orales más convenientes, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmacéuticos sólidos. Para las composiciones parenterales, el portador normalmente comprenderá agua esterilizada, al menos en gran parte, aunque puede incluir otros ingredientes, por ejemplo, para incrementar la solubilidad. Se pueden preparar soluciones inyectables, por ejemplo, en las que el portador comprenda solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y de glucosa. También se pueden preparar suspensiones inyectables, en cuyo caso se pueden emplear portadores líquidos, agentes de suspensión y similares que sean adecuados. También se incluyen preparados en forma sólida que están diseñados para convertirlos, poco antes de su uso, en preparados en forma líquida. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinados con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones minoritarias, donde los aditivos no provocan ningún efecto perjudicial significativo en la piel. Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar mediante inhalación o insuflación oral, en forma de una solución, una suspensión o un polvo seco, utilizando cualquier sistema de suministro conocido en la técnica.
Es especialmente conveniente formular las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en formas farmacéuticas unitarias debido a la uniformidad de la dosis y a que se pueden administrar fácilmente. La expresión "forma farmacéutica unitaria", tal como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, asociada con el portador farmacéutico requerido. Algunos ejemplos de tales formas farmacéuticas unitarias son comprimidos (incluidos los comprimidos recubiertos o ranurados), cápsulas, pastillas, supositorios, sobres de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables y similares, y múltiplos segregados de estos.
Los compuestos de fórmula I presentan actividad contra el VHC y se pueden utilizar en el tratamiento y la profilaxis de una infección provocada por el VHC o de enfermedades asociadas con el VHC. Estas últimas incluyen fibrosis hepática progresiva, inflamación y necrosis que provocan cirrosis, enfermedad hepática terminal y carcinoma hepatocelular. Además, existe constancia de que una serie de compuestos de esta invención son activos contra cepas mutadas del VHC. Además, los compuestos de esta invención pueden presentar unas propiedades atractivas en cuanto a la biodisponibilidad, pueden presentar un perfil farmacocinético favorable, que incluye una semivida, AUC (área bajo la curva) y valores máximos y mínimos aceptables, y pueden carecer de fenómenos desfavorables tales como un inicio que no sea suficientemente rápido o retención en los tejidos.
La actividad antivírica in vitro contra el VHC que presentan los compuestos de fórmula I se puede evaluar en un sistema celular de replicones del VHC basado en Lohmann et al. (1999), Science 285: 110-113, con las modificaciones adicionales descritas en Krieger ef al. (2001) Journal of Virology 75: 4614-4624 y en Lohmann et al. (2003) Journal of Virology 77: 3007-3019 para el genotipo 1b y en Yi et al. (2004) Journal of Virology 78: 7904-7915 para el genotipo 1a (que se incorporan a la presente por referencia), según se ilustra adicionalmente en la sección de ejemplos. Aunque este modelo no representa un modelo completo de infección para el VHC, está aceptado de forma generalizada como el modelo más sólido y eficaz para la replicación autónoma del ARN del VHC que se encuentra disponible en la actualidad. Se debe considerar que es importante distinguir entre los compuestos que interfieren de manera específica con las funciones del VHC y los que ejercen efectos citotóxicos o citostáticos en el modelo de replicones del VHC y, como consecuencia, provocan una reducción de la concentración del ARN del VHC o de las enzimas marcadoras asociadas. En la técnica se dispone de ensayos para evaluar la citotoxicidad celular, que se basan, por ejemplo, en la determinación de la actividad de enzimas mitocondriales utilizando colorantes fluorogénicos rédox tales como la resazurina. Además, existen análisis celulares secundarios para evaluar la inhibición no selectiva de la actividad de genes marcadores asociados tales como la luciferasa de la luciérnaga. Se puede introducir un gen marcador de una luciferasa, cuya expresión depende de un promotor del gen que presenta una actividad constitutiva, en tipos celulares adecuados mediante una transfección estable y estas células se pueden utilizar en un análisis secundario para descartar inhibidores no selectivos.
Debido a sus propiedades contra el VHC, los compuestos de fórmula I o subgrupos de estos, según se especifica en la presente, son útiles en la inhibición de la replicación del VHC, en particular en el tratamiento de animales de sangre caliente, en particular seres humanos, infectados con el VHC, y para la profilaxis de infecciones provocadas por el VHC en animales de sangre caliente, en particular seres humanos. La presente invención se refiere además a un método de tratamiento para un animal de sangre caliente, en particular un ser humano, infectado por el VHC o que corre el riesgo de ser infectado por el VHC, donde dicho método comprende la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de fórmula I, según se ha definido anteriormente en la presente.
Por consiguiente, los compuestos de fórmula I, según se especifican en la presente, se pueden utilizar como una medicina, en particular como una medicina contra el VHC. Dicho uso como una medicina o método de tratamiento comprende la administración sistémica a sujetos infectados con el VHC o a sujetos susceptibles de ser infectados con el VHC de una cantidad eficaz para aliviar o prevenir los síntomas y las afecciones asociadas con una infección provocada por el VHC.
La presente invención también se refiere al uso de los compuestos de la presente en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección provocada por el VHC.
En general, se considera que una cantidad antivírica diaria eficaz sería de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 50 mg/kg o de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. Podría resultar adecuado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o más subdosis en intervalos adecuados a lo largo del día. Dichas subdosis se pueden formular como formas farmacéuticas unitarias, por ejemplo, que contengan de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 mg, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg del principio activo por forma farmacéutica unitaria.
Terapia combinada La invención también se refiere a una combinación de un compuesto de fórmula I, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptable de este, y otro compuesto antivírico, en particular otro compuesto contra el VHC. El término "combinación" se refiere a un producto que contiene (a) un compuesto de fórmula I, según se ha definido anteriormente en la presente, y (b) otro inhibidor contra el VHC, como un preparado combinado para el uso simultáneo, secuencial o por separado en el tratamiento de infecciones provocadas por el VHC.
Las combinaciones de la presente invención se pueden utilizar como medicamentos. Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) o cualquier subgrupo de este según se ha definido anteriormente para la elaboración de un medicamento útil a la hora de inhibir la actividad del VHC en un mamífero infectado con un virus de tipo VHC, donde dicho medicamento se utiliza en una terapia combinada, comprendiendo dicha terapia combinada en particular un compuesto de fórmula (I) y al menos otro agente contra el VHC diferente, por ejemplo, IFN-a, IFN-a pegilado, ribavirina, albuferón, taribavirina, nitazoxanida, Debio025 o una combinación de estos.
Otros agentes que se pueden combinar con los compuestos de la presente invención incluyen, por ejemplo, inhibidores nucleosídicos o no nucleosídicos de la polimerasa del VHC, inhibidores de proteasas, inhibidores de helicasas, inhibidores de NS4B y agentes que inhiben funcionalmente el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), así como otros agentes que inhiben la unión a la célula del VHC o la entrada del virus, la traducción del ARN del VHC, la transcripción del ARN del VHC, la replicación o maduración del VHC, el acoplamiento o la liberación del virus. Los compuestos específicos de estas clases incluyen inhibidores de proteasas del HVC tales como telaprevir (VX-950), boceprevir (SCH-503034), narlaprevir (SCH-900518), ITMN-191 (R-7227), TMC-435350 (TMC-435), MK- 7009, BI-201335, BI-2061 (ciluprevir), BMS-650032, ACH-1625, ACH-1095, GS 9256, VX-985, IDX-375, VX-500, VX-813, PHX-1766, PHX2054, IDX-136, IDX-3 6, ABT-450, EP-013420 (y otros del mismo género) y VBY-376; los inhibidores nucleosídicos de la polimerasa del VHC útiles en la invención incluyen TMC649128, R7128, PSI-7851 , PSI 7977, INX-189.IDX-184, IDX-102, R1479, UNX-08189, PSI-6130, PSI-938 y PSI-879, así como otros análogos nucleosídicos y nucleotídicos diferentes e inhibidores del VHC, incluidos los derivados que son nucleósidos con una modificación de tipo 2 -C-metilo, nucleósidos con una modificación de tipo 4'-aza y nucleósidos con una modificación de tipo 7'-desaza. Los inhibidores de la polimerasa del VHC no nucleosídicos útiles en la invención incluyen HCV-796, HCV-371 , VCH-759, VCH-916, VCH- 222, ANA-598, MK-3281 , ABT-333, ABT-072, PF-00868554, BI-207127, GS-9190, A-837093, JKT-109, GL-59728, GL-60667, ABT-072, AZD-2795 y TMC647055.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la invención y deben interpretar como una limitación de su alcance.
Parte experimental Métodos de LCMS Método A: información general: fase móvil A: H20 (0.1% de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 2 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0.01 [90/10] hasta 0.9 [20/80] hasta 1.5 [20/80] hasta 1.51 [90/10]; flujo: 1.2 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método A1 : Shimadzu LCMS 2010, Shim-pack XR-ODS, 3*30 mm Método A2: Xtimate C18 2.1*30 mm, 3 pm Método A3: SHIMADZU Shim pack 2*30 Método B: Agilent 1100, YMC-PACK ODS-AQ, 50x2.0 mm, 5 pm, fase móvil A: H20 (0.1% de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 10 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0 [100/0] hasta 1 [100/0] hasta 5 [40/60] hasta 7.5 [40/60] hasta 8 [100/0]; flujo: 0.8 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método C: Agilent 1100, YMC-PACK ODS-AQ, 50x2.0 mm, 5 pm, fase móvil A: H20 (0.1% de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 10 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%BJ: desde 0 [90/10] hasta 0.8 [90/10] hasta 4.5 [20/80] hasta 7.5 [20/80] hasta 8 [90/10]; flujo: 0.8 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método D: Shimadzu LCMS 2010, Shim-pack XR-ODS,3*30 mm, fase móvil A: H20 (0.1% de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 2 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0.01 [100/0] hasta 0.9 [70/30] hasta 1.5 [70/30] hasta 1.51 [100/0]; flujo: 1.2 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método E: cromatografía líquida: Waters Alliance 2695, detector de UV: Waters 996 PDA, intervalo: 210-400 nm; detector de masas: Waters ZQ, fuente de iones: ES+, ES-, columna utilizada: SunFire C18 3.5 pm 4.6x100 mm; fase móvil A: NH4OOCH 10m + 0.1% de HCOOH en H2O; fase móvil B: CH3OH; temp. de la columna: 50 °C; flujo: 1.5 mIJmin; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0 [65/35] hasta 7 [5/95] hasta 9.6 [5/95] hasta 9.8 [65/35] hasta 12 [65/35].
Método F: Xtímate C18 2.1*30 mm, 3 pm, fase móvil A: H2O (1.5 ml_ de TFA /4 L); B: CH3CN (0.75 ml_ de TFA 4 L); tiempo de parada: 3 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0.0 [90/10] hasta 1.35 [20/80] hasta 2.25 [20/80] hasta 2.26 [90/10] hasta 3.0 [90/10]; flujo: 0.8 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método G: condiciones generales: fase móvil A: H20 (1.5 mL de TFA 14 L); B: CH3CN (0.75 mL de TFA/4 L); tiempo de parada: 2min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0.0 [100/0] hasta 0.9 [40/60] hasta 1.5 [40/60] hasta 1.51 [100/0] hasta 2.0 [100/0]; flujo: 1.2 mL/min; temp. de la columna: 50 °C. Método G1 : Xtimate C18, 2.1 *30 mm, 3 pm Método H: condiciones generales: fase móvil A: H20 (0.1 % de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 10 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0.0 [90/10] hasta 0.8 [90/10] hasta 4.5 [20/80] hasta 7.5 [20/80] hasta 9.5 [90/10]; flujo: 0.8 mIJmin; temp. de la columna: 50 °C Método H1 : Agilent TC-C18, 2.1 *50 mm, 5pm Método I: Shimadzu LCMS 2010, Shim-pack XR-ODS,3*30 mm, fase móvil A: H2O (0.1 % de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 7 min; tiempo del gradiente (min) [%AJ%B]: desde 0.01 [90/10] hasta 6.0 [20/80] hasta 6.5 [20/80] hasta 6.51 [90/10]; flujo: 0.8 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Método J: Agilent TC-C18, 50x2.1 mm, 5 µ??, fase móvil A: H20 (0.1 % de TFA); B: CH3CN (0.05% de TFA); tiempo de parada: 10 min; tiempo posterior: 0.5 min; tiempo del gradiente (min) [%A/%B]: desde 0 [100/0] hasta 1 [100/0] hasta 5 [40/60] hasta 7.5 [15/85] hasta 9.5 [100/0]; flujo: 0.8 mL/min; temp. de la columna: 50 °C Al compuesto PR-2 (30 g, 123 mmol) en THF (120 ml_), se añadieron etano-1 ,2-diol (53.6 g, 864 mmol), trietoximetano (54.6 g, 369 mmol) y TsOH (3 g, 3.69 mmol) a 25 °C. La mezcla se agitó a reflujo durante 5 horas. La mezcla se vertió sobre NH4CI acuoso (400 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2S04. La fase orgánica se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano: acetato de etilo = 10:1) para obtener el compuesto PR-3 (8.4 A una solución agitada del compuesto PR-3 (8.4 g, 29.3 mmol) en THF /H2O (100 mL, 1 :1), se añadió NaOH (5.85 g, 146 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 1 hora y se trató con acetato de etilo (20 mL). La fase inorgánica se separó, se ajustó su pH a 4 con HCI 2 N y se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto PR-4 (5.9 g).
El compuesto PR-5 (15.7 g, 63.1 mmol) se disolvió en CH2CI2 anhidro (250 mL) y se añadió DMF (1.5 mL) a la solución. Se añadió cloruro de oxalilo (13.5 mL, 157.5 mmol) gota a gota a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 0.5 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo (PR-6, 22 g) se utilizó directamente sin purificación adicional.
PR-6 QA-1 A la solución del compuesto PR-6 (22 g de crudo) en THF anhidro (250 mL), se añadieron 2-amino-4-bromobenzamida (7.6 g, 35.3 mmol) y NaOH 1 N (ac. 85 mL, 85 mmol). La mezcla se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaOH 1 N en agua (15 mL) y con salmuera, se secaron con Na2SO4 se concentraron al vacío para proporcionar un residuo crudo (17 g). El residuo crudo, obtenido de un modo similar al descrito anteriormente (25 g), junto con Na2CO3 (17.8 g, 168 mmol) en etanol (250 mL) y H2O (250 mL), se calentó a reflujo durante 2 horas. El disolvente orgánico se evaporó al vacío. La mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 200 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2SÜ4 y se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo). Las fracciones deseadas se evaporaron a sequedad. El residuo obtenido se agitó en acetato de etilo (50 mL), el precipitado se separó por filtración y se lavó con acetato de etilo para proporcionar el compuesto QA-1 (17 g).
El compuesto QA-1 (8 g, 18.6 mmol) se disolvió en HOAc (80 mL) y se añadió HBr al 40% (40 mL). La mezcla se agitó a 80 °C durante toda la noche. Se eliminó la mayor parte del disolvente al vacío. El precipitado se separó por filtración y se lavó con éter f-butil metílico. El sólido se evaporó conjuntamente con tolueno (2 x 20 mL) para proporcionar un residuo crudo (6.5 g). A continuación, parte de este residuo (6.4 g), junto con el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (4.5 g, 25.6 mmol), EDCI (4.9 g, 25.6 mmol) y HOBt (1.15 g, 8.5 mmol) en CH2CI2 (120 mL) se enfriaron hasta 0°C. Se añadió DIPEA (14.8 mL, 85.0 mmol). La mezcla se agitó durante 1.5 horas a 20 °C. La fase orgánica se lavó con NaHC03 acuoso saturado (100 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: éter de petróleo: acetato de etilo desde 100:0 hasta 0:100) para proporcionar el compuesto QA-2 (3.3 g).
PR-7 PR-8 Se agitó el compuesto PR-7 (7.0 g, 23.21 mmol) en THF (70 mL) a 0 °C. Se añadieron dicloruro de oxalilo (7 mL, 46.2 mmol) y DMF (2 gotas) gota a gota y la mezcla se agitó durante 10 min a 0 °C. La mezcla se agitó y se calentó a reflujo durante 1 hora. La mezcla se enfrió y se evaporó al vacío para proporcionar el compuesto PR-8 (7 g).
A la solución del compuesto PR-8 (7 g, 21 mmol) en THF (70 mL), se añadieron 2-amino-4-bromobenzamida (4.5 g, 21 mmol) y NaOH 1 N (42 mL, 42 mmol). La mezcla se agitó durante 1 hora a 25 °C. La mezcla se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas se recolectaron, se lavaron con NaOH 0.5 N y salmuera, se secaron y se concentraron al vacío, para proporcionar un residuo crudo (9 g). Este residuo (9 g), junto con Na2CO3 (5.7 g, 54 mmol) en H20 (200 mL) y THF (200 mL), se agitó y se calentó a reflujo durante 2 horas. La mezcla se concentró al vacio y se extrajo con CH2CI2 (2x), se lavó con salmuera, se secó y se evaporó al vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2, se lavó con HCI 1 N (3 x) y salmuera, se secó y se evaporó al vacío, para proporcionar QA-3 (4.4 g). Método A2; tR: 1.27 min. m/z=: 484.0 (M+H)+ Masa exacta: 483.1 PR-2 PR-9 Al compuesto PR-2 (10 g, 41.2 mmol) en THF (100 mL), se añadieron 1 , 3-propanodiol (22 g, 288 mmol), ortoformiato de trietilo (18.3 g, 123.6 mmol) y ácido tolueno-4-sulfónico (1 g, 0.2 mmol) a 25 °C. La mezcla se agitó a reflujo durante 2 horas. La mezcla se vertió sobre NH4CI acuoso (400 mL), se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL) y se separó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2S04. La fase orgánica se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano: acetato de etilo = 5:1) y el compuesto obtenido (3.8 g) se disolvió en THF /H20 (40 mL, 1:1). Se añadió NaOH (2.52 g, 63 mmol), la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se trató con acetato de etilo (20 mL). La fase inorgánica combinada se separó, se ajustó su pH a 4 con HCI 2 N y se extrajo con CH2CI2 (3 x 20 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SO4 y se concentró al vacío para proporcionar el compuesto PR- 9 (5.9 g).
PR-9 QA-4 Se añadió dicloruro de oxalilo (2.5 mL, 13.11 mmol) gota a gota a una mezcla del compuesto PR-9 (2.5 g, 8.74 mmol) y 2-amino-4- bromobenzamida (2.5 g, 10.49 mmol) en diclorometano (20 mL) y piridina (20 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo: acetato de etilo = 1 :1). El compuesto intermedio de tipo amida obtenido (0.98 g), Na2CO3 (1.08 g. 10.15 mmol), H20 (5 mL) y CH3CH2OH (5 mL) se agitaron durante 2 horas a reflujo. La mayor parte del CH3CH2OH se eliminó al vacío y el residuo obtenido se extrajo con acetato de etilo. La fase orgánica se secó con Na2S04 y se concentró al vacío. El residuo se lavó con éter f-butil metílico para proporcionar el compuesto QA-4 (0.89 g).
A una solución agitada del compuesto QA-4 (0.89 g, 1.92 mmol) y lutidina (0.41 g, 3.84 mmol) en CH2CI2 anhidro (10 mL) a 0 °C, se añadió TMSOTf (1 .7 g, 7.68 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 minutos, se desactivó con NH4CI acuoso saturado y se extrajo con acetato de etilo; las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2SO4 y se concentraron al vacío. El residuo obtenido se utilizó como tal en la siguiente reacción (0.3 g). Método A2; \R. 0.68 min. m/z=: 368.0 (M+H)+ Masa exacta: 367.0. Se añadió NEt3 (0.5 mL, 2.46 mmol) a una solución del residuo obtenido anteriormente (0.3 g), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.22 g, 1.23 mmol), HOBt (0.17 g, 1 .23 mmol) y EDCI (0.24 g, 1 .23 mmol) en diclorometano (15 mL) en un baño de hielo. La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla se diluyó con diclorometano (20 mL), se lavó con NaHC03 saturado y salmuera, y se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano: acetato de etilo = 1 :1), para obtener el compuesto QA-5 (0.2 g).
Método A2; tR: 1.14 min. m/z=: 547.1 (M+Na)+ Masa exacta: 524.1 Se añadió cloruro de oxalilo (2.9 ml_, 33 mmol) gota a gota a una mezcla del compuesto PR-1 (5 g, 22 mmol), 2-amino-4-bromobenzamida (4.7 g, 22 mmol) y piridina (50 ml_). La mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía (éter de petróleo: acetato de etilo = 5:1) para proporcionar un intermedio (3.6 g). Método A2; tR: 1.15 min. m/z=: 447.7 (M+Na)+ Masa exacta: 425.1. El intermedio obtenido anteriormente (3.6 g), Na2C03 (2.7 g. 25.4 mmol), H2O (20 ml_) y CH3CH2OH (20 ml_) se agitaron durante 2 horas a reflujo. La mayor parte del CH3CH2OH se eliminó al vacío. El residuo se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). La fase orgánica se secó con Na2S04 y se concentró al vacío. El residuo se lavó con éter f-butil metílico para proporcionar el compuesto QA-6 (3.4 g).
El compuesto QA-6 (3.4 g, 8.4 mmol) se disolvió diclorometano (30 mL) y se añadió HCI/dioxano (3 mL) gota a gota a la mezcla a 0 °C. la mezcla de reacción se agitó durante 5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se lavó con éter f-butil metílico y el residuo crudo obtenido se utilizó como tal (2.7 g). A una solución de este crudo (2.7 g), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-met¡lbutanoico (2.75 g, 15.76 mmol), HOBt (2.42 g, 17.33 mmol) y EDCI (3.32 g, 17.33 mmol) en diclorometano (20 mL) enfriada en un baño de agua-hielo, se añadió DIPEA (14 mL, 78.8 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con diclorometano (20 mL), se lavó con NaHC03 saturado y salmuera, y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano: acetato de etilo = 1 :1) para proporcionar el compuesto QA-7 (2.5 g). SFC: columna: AD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 µ?t?; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: EtOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 9.99 min Se agitó el compuesto PR-10 (2.0 g, 7.3 mmol) en CH2CI2 (20 mL) a 0 °C. Se añadieron dicloruro de oxalilo (2.3 g, 18.2 mmol) y DMF (2 gotas) gota a gota y la mezcla se agitó durante 10 minutos a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1 hora a 20 °C. La mezcla se enfrió y se evaporó al vacío. El residuo se diluyó dos veces con tolueno (2 x 10 mL) y se evaporó, para proporcionar un residuo (PR-11 , 2.5 g).
A la solución del compuesto PR-11 (2.5 g) en THF (30 mL), se añadieron 2-amino-4-bromobenzamida (1.57 g, 7.3 mmol) y NaOH 1 N (14.6 mL, 14.6 mmol). La mezcla se agitó durante 1 hora a 25 °C. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2x). Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con NaOH 0.5 N y salmuera, se secaron y se concentraron al vacío, para proporcionar un residuo (3.5 g), el cual se agitó con Na2CO3 (2.32 g, 21.9 mmol) en H20 (50 mL) y THF (50 mL), y se calentó a reflujo durante 2 horas. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. La mezcla se extrajo con CH2CI2 (2x), se lavó con salmuera, se secó y los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2l se lavó con HC1 1 N (3x) y salmuera, se secó y los componentes volátiles se eliminaron al vacío, para proporcionar el compuesto QA-8 (1.5 g). Método A2; tR: 1.15 min. m/z=: 453.9 (M+Hf Masa exacta: 453.1 Se añadió CICOCOCI (44.4 mL, 510.2 mmol) gota a gota a una mezcla de PR-13 (100.6 g, 374 mmol), 2-amino-4-bromobenzamida (73.2 g, 340 mmol) y piridina (760 mL) en atmósfera de nitrógeno a 0 °C. La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío. Se añadió NaHCÜ3 saturado al residuo y la mezcla resultante se extrajo con acetato de etilo tres veces. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 saturado y salmuera, y se secaron con Na2SO4. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía (ChbC iMeOH = 50:1) para proporcionar un compuesto intermedio de tipo amida (50.6 g). Método A2; tR: 1.15 min. m/z=: 490.1 (M+Na)+ Masa exacta: 467.1. Una solución del intermedio obtenido anteriormente (50.61 g), Na2C03 (34.51 g, 325.6 mmol), H20 (300 mL) y CH3CH2OH (300 mL) se agitó durante 3 horas a reflujo. Se eliminó el EtOH al vacío y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 300 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 y se concentraron al vacío. El residuo obtenido se lavó con éter /-butil metílico para proporcionar el compuesto QA-9 (39.2 g). Método A2; tR: 1.37 min. m/z=: 448.1 (M+H)+ Masa exacta: 447.1 Se disolvió QA-9 (39.2 g, 87.5 mmol) en diclorometano (400 mL). Se añadió HCI/dioxano (470 mL) gota a gota a la mezcla a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó durante 3.5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó cuidadosamente al vacío. El residuo obtenido se lavó con éter f-butil metílico para proporcionar un residuo (30.8 g). Método A2; Í : 0.92 min. m/z=: 348.1 (M+H)+ Masa exacta: 347.1 Se añadió DIPEA (54.2 mL, 308 mmol), a 0 °C, a una solución del residuo anterior (30.84 g, 61.6 mmol), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (11.9 g, 67.8 mmol) y HBTU (35.0 g, 92.4 mmol) en diclorometano (265 mL) en atmósfera de nitrógeno. A continuación, la mezcla de reacción se agitó durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano, se lavó con NaHC03 saturado y salmuera, y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo: acetato de etilo = 1 :1), para obtener el compuesto QA-10 (31.1 g). Método A2; tR: 1.28 min. m/z=: 507.2 (M+H)+ Masa exacta: 506.1 El compuesto SC-1 (100 g, 296 mmol) se disolvió en CHCI3 (3720 mL). Se añadieron 1 ,2-etanoditiol (53 mL, 592 mmol) y un complejo de trifluoruro de boro-ácido acético (44 mL, 296 mmol) en una atmósfera protectora de N2. La mezcla se calentó a reflujo durante 16 horas. El sólido se filtró y se secó con un vacío elevado para proporcionar el intermedio de tipo tiocetal (98 g). En un recipiente hecho de un polímero fluorado, se disolvió NIS (183 g, 811 mmol, 4.8 eq) en CH2CI2 anhidro (1600 mL). Se añadió fluoruro de hidrógeno-piridina a -75 °C. La mezcla se agitó a -75 °C durante 10 minutos. Se añadió gota a gota parte del tiocetal obtenido anteriormente (70 g, 169 mmol) en CH2CI2 anhidro (1000 mL). La mezcla se agitó a -75 °C durante 15 minutos. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (800 mL) y se hizo pasar a través de un lecho de gel de alúmina básica. El disolvente se concentró hasta que quedaron 600 mL y se lavó con una solución saturada de Na2S03 (500 mL) y una solución saturada de K2C03 (500 mL). La fase orgánica se secó con Na2S04 y se evaporó al vacío para proporcionar el compuesto SC-2 (48 g).
Se añadieron Pd(PPh3)4 (6.5 g, 5.6 mmol, 0.2 eq) y Pd(dppf)2CI2 (4 g, 5.6 mmol, 0.2 eq) a una mezcla del compuesto SC-2 (10 g, 28 mmol, 1 eq), tributil(1-etoxivinil)estaño (10 g, 28 mmol, 1 eq) y dioxano anhidro (200 mL). La mezcla se agitó a 70 °C en atmósfera de N2 durante 4 horas. La mezcla se enfrió hasta 20 °C. Se añadieron H20 (50 mL) y NBS (20 g, 112 mmol) y la mezcla se agitó a 20 °C en atmósfera de N2 durante 12 horas. Se añadieron CH2CI2 (200 mL) y H20 (100 mL). La fase orgánica se secó con Na2SO4 y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo: acetato de etilo = 3:1) para proporcionar el compuesto SC-3 (2 g).
SC-3 SC-4 El compuesto SC-3 (2 g, 5 mmol) se disolvió en CH3CN (20 mL). Se añadieron Boc-L-prolina (4.3 g, 20 mmol) y trietilamina (2.4 mL, 17.5 mmol). La mezcla se agitó a 25 °C durante 3 horas. El disolvente se eliminó al vacío para proporcionar un residuo crudo (4 g). Este residuo (4 g) se disolvió en tolueno (40 mL). Se añadió CH3COONH4 (7.7 g, 100 mmol). La mezcla se agitó a 100 °C durante 2 horas. La solución se diluyó con acetato de etilo (20 mL) y se lavó con H20 (2 x 10 mL). La fase orgánica se secó con Na2S04 y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo: acetato de etilo = 6:4) para proporcionar el compuesto SC-4 (2.6 g).
Se añadió Pd(dppf)CI2 (0.54 g, 0.74 mmol) a una mezcla del compuesto SC-4 (4.8 g, 7.4 mmol), KOAc (1.45 g, 14.8 mmol), 4,4,4,,4'I5,5,5,,5,-octametil-2,2,-bi(1 ,3,2-dioxaborolano) (3.76 g, 14.8 mmol) y tolueno (48 mL). La mezcla se agitó a 85 °C durante 12 horas. Después de enfriarla, el disolvente se evaporó al vacío, se añadió CH2CI2 y la mezcla se lavó con H20 (200 mL) y una solución saturada de Na2C03 (200 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2S04, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: CH2CI2/acetato de etilo =1 :3) para proporcionar el compuesto SC-5 (2.8 g).
El compuesto SC-4 (2.6 g, 5 mmol) se disolvió en CH2CI2 (26 mL) y se añadió HCI 4 N/dioxano (2 mL, 8 mmol) a 0°C. La mezcla se agitó a 25 °C durante 20 minutos. El disolvente se eliminó al vacío para proporcionar un residuo (2.5 g). Método A2; tR: 0.95 min. m/z : 415.9 (M+H)+ Masa exacta: 415.1. Este residuo (2.5 g), junto con el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.9 g, 11 mmol), EDCI (2.1 g, 11 mmol) y HOBt (1.5 g, 11 mmol) en CH2CI2 (25 mL), se enfrió hasta 0°C y se añadió DIPEA (8.7 mL, 50 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 12 horas. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y H2O (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHC03 acuoso saturado (5 mL) y salmuera, y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (éter de petróleo/acetato de etilo = 1 :8) para proporcionar el compuesto SC-6 (2.2 g). Método A2¡ ÍR: 0.97 min. m/z : 575.0 (M+H)+ Masa exacta: 574.1 Se añadió Pd(dppf)CI2 (0.14 g, 0.19 mmol) a una mezcla del compuesto SC-6 (2.2 g, 3.8 mmol), 4,4,4\4\5,5,5\5,-octametil-2,2,-bi(1 ,3,2-dioxaborolano) (1.95 g, 7.6 mmol), CH3COOK (0.75 g, 7.6 mmol) y tolueno anhidro (45 mL). La mezcla se agitó a 85 °C durante 12 horas. Después de enfriarla, el disolvente se evaporó al vacío, se añadió CH2CI2 y la mezcla se lavó con H20 (200 mL) y una solución saturada de Na2C03 (200 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2S04, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 1 :3) para proporcionar el compuesto SC-7 (2.05 g). Método A2; tR: 0.98 min. m/z : 621.1 (M+H)+ Masa exacta: 620.3 Se añadió Pd(PPh3)4 (0.4 g, 0.35 mmol) a una mezcla del compuesto SC-8 (3.3 g, 7 mmol), 4,4,4\4\5,5,5\5,-octametil-2,2,-b¡(1 ,3,2- dioxaborolano) (3.6 g, 14 mmol), KOAc (1.4 g, 14 mmol) y tolueno (75 mL). La mezcla se agitó a 85 °C durante 12 horas. Después de enfriarla, se añadió CH2CI2 y la mezcla se lavó con una solución saturada de Na2CO3 (200 mL) y salmuera (200 mL). El agua se extrajo con CH2CI2 (3 x 200 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron con a2SO4, se filtraron y se concentraron al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: CH2CI2/metanol = 10:1 ). El disolvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto SC-9 (1.6 g). Método A2; tR: 1.11 min. m/z : 516.1 (M+H)+ Masa exacta: 515.3 El compuesto SC-8 (10 g, 21 mmol) se disolvió en CH2CI2 (100 mL) y se añadió HCI 4 N/dioxano (50 mL) gota a gota. La mezcla se agitó durante 30 minutos a 25 °C. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se evaporó conjuntamente con tolueno (2 x 20 mL) y se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Método A2; tR: 0.96 min. m/z : 368.1 (M+H)+ Masa exacta: 367.1 El residuo obtenido anteriormente, junto con el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (5.6 g, 32 mmol), EDCI (6.1 g, 32 mmol) y HOBt (1.4 g, 10 mmol) en CH2CI2 (180 mL), se enfrió hasta 0°C. Se añadió DIPEA (18.6 g, 106 mmol) gota a gota. La mezcla se agitó durante 1 hora a 25 °C. La fase orgánica se lavó con NaHCÜ3 en una fase acuosa saturada (20 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: acetato de etilo: metanol desde 100:0 hasta 20:1), para proporcionar el compuesto SC-10 (9.9 g) como un polvo blanco. Método A2; tR: 1.02 min. m/z : 527.1 (M+H)+ Masa exacta: 526.1 Una mezcla del compuesto SC-10 (2 g, 3.80 mmol), 4,4,4,)4')5,5,5',5'-octamet¡l-2,2,-b¡(1 ,3,2-d¡oxaborolano) (1.9 g, 7.6 mmol), Pd(dppf)CI2 (0.28 g, 0.38 mmol) y KOAc (0.75 g, 7.6 mmol) en dioxano anhidro (20 mL) se agitó durante 2 horas a 100 °C en una atmósfera de N2. El sólido se filtró y el filtrado se evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: éter de petróleo: acetato de etilo desde 100:0 hasta 0:100), para proporcionar el compuesto SC-11 (1.88 g) como un polvo blanco. Método A2; tR: 1.08 min. m/z : 573.1 (M+H)+ Masa exacta: 572.3 SC-2 SC-12 SC-2 (20 g, 55.5 mmol), tributil(1-etoxivinil)estaño (20 g, 55.5 mmol), Pd(PPh3)4 (13 g, 12 mmol) y Pd(ddpf)CI2 (8 g, 12 mmol) se suspendieron en 1 ,4-dioxano (100 mL) a 20 °C. La mezcla se agitó a reflujo durante 4 horas. La mezcla se vertió sobre H20 (30 mL) a 20 °C. Se añadió NBS (40 g, 110.0 mmol) y la mezcla resultante se agitó a 20 °C durante 12 horas. La mezcla se vertió sobre H2O (50 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2S04. La fase orgánica se concentró al vacío para proporcionar SC-3 crudo (21 g). El residuo obtenido se utilizó en la siguiente reacción sin purificación. Se añadió Cs2C03 (20. Og, 61.38 mmol) a una solución agitada de PR-4 (7.6 g, 27.81 mmol) en DMF (40 mL). La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 0.5 horas. Se añadió SC-3 crudo (21.0 g, 52.23 mmol) a la mezcla. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 horas. La mezcla se lavó con agua (20 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2S04 y se concentraron al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: hexano: acetato de etilo = 5:1) para proporcionar el 1 ,4-dioxa-7-azaespiro[4.4)nonano-7,8-dicarboxilato de 7-fe/t-butilo y (S)-8-(2-(7-bromo-9,9-difluoro-9H-fluoren-2-il)-2-oxoetilo) (8 g).
A una solución agitada del 1 ,4-dioxa-7-azaespiro[4.4]nonano-7,8-dicarboxilato de 7-terf-butilo y (S)-8-(2-(7-bromo-9,9-difluoro-9tt-fluoren-2-il)-2-oxoetilo) (8 g) en xileno (80 mL) en un autoclave, se añadió NH4OAc (20 g, 260 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 140 °C durante 1 hora. La mezcla se lavó con agua (90 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL); la fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 y se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa en RP-18 (eluyente: CH3CN en H20 (0.5% de NH4HCO3) desde un 40% hasta un 80%, v/v). Se recolectaron las fracciones puras y se eliminaron los componentes volátiles al vacío. La fase acuosa se liofilizó a sequedad para proporcionar SC-12 (4.12 g). Método A2; tR: 1.12 min. m/z : 576.1 (M+H)+ Masa exacta: 575.1 A una solución agitada del compuesto SC-12 (4.5 g, 7.85 mmol) y 2,6-lutidina (1.68 g, 15.7 mmol) en CH2CI2 anhidro (50 mL) a 0 °C, se añadió TMSOTf (7 g, 31.4 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se agitó a 0 °C durante 30 minutos, se desactivó con NH4CI acuoso saturado y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2S04 y se concentraron al vacío, para proporcionar (S)-8-(5-(7-bromo-9,9-difluoro-9/-/-fluoren-2-il)-1 H-imidazol-2-il)-1 ,4-dioxa-7-azaespiro[4.4]nonano (2 g). Se añadió NEt3 (0.5 g, 45 mmol) a una solución agitada de (S)-8-(5-(7-bromo-9,9-difluoro-9/-/-fluoren-2-il)-1 H-imidazol-2-il)-1 ,4-dioxa-7-azaespiro[4.4)nonano (2 g, 4.2 mmol), ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.89 g, 5 mmol), EDCI (0.96 g, 5 mmol) y HOBt (0.67 g, 5 mmol) en CH2CI2 anhidro (50 mL). La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 2 horas, se desactivó con Na2C03 acuoso saturado y se extrajo con CH2CI2 (3 x 10 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 y se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa en RP-18 (eluyente: CH3CN en H20 (0.5% de NH4HCO3) desde un 30% hasta un 70%, v/v). Se recolectaron las fracciones puras y se eliminaron los componentes orgánicos volátiles al vacío. La fase acuosa se liofilizó a sequedad para proporcionar SC-13 (1.2 g) como un sólido blanco. Método A2; tR: 1.09 min. m/z : 633.3 (M+H)+ Masa exacta: 632.1 A una solución agitada del compuesto SC-13 (1.2 g, 1.9 mmol) y Pd(dppf)C½ (0.1 g, 0.137 mmol) en dioxano anhidro (25 ml_), se añadieron 4,4I4,,4,,5,5I5',5,-octametil-2I2,-b¡(1 I3,2-dioxaborolano) (0.72 g, 2.8 mmol) y KOAc (0.37 g, 3.76 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 minutos, se desactivó con agua y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2SÜ4y se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano: acetato de etilo = 1:1) para proporcionar el compuesto SC-14 (0.756 g) como un sólido amarillo.
Se añadió 3-bromoanilina (186 g, 1080 mmol) a una mezcla de (S)-2-(3-etoxi-3-oxopropanoil)pirrolidin-1-carboxilato de bencilo (460 g, 1440 mmol) en tolueno que contenía ácido acético (86.4 g, 1440 mmol) y se calentó a reflujo durante 8 horas utilizando un aparato de Dean Stark para eliminar el agua de la reacción. La mezcla se concentró a presión reducida y se secó al vacío. El producto crudo se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional (662 g). Un matraz provisto con un agitador, un cabezal de destilación y un embudo de adición se purgó con nitrógeno. Se añadió Dowtherm™ A (90 mL) y a continuación se calentó hasta 240 °C. Se añadió una solución del residuo obtenido anteriormente (662 g) en Dowtherm™ A (900 mL) durante 10 minutos, mientras se mantenía la temperatura en el intervalo de 230-245 °C. La mezcla se calentó durante 1 hora más a 240 °C y a continuación se enfrió hasta temperatura ambiente. Se añadieron éter de petróleo (2000 mL) y heptano (2400 mL). Se formó un residuo oleoso y se decantó el disolvente. El residuo oleoso recolectado se purificó mediante cromatografía flash en columna (eluyente: CH2CI2: EtOAc = desde 0: 1 hasta 1 : 3) para proporcionar el compuesto 4 (38 g). Método B; tR: 5.20 min. m/z : 429.0 (M+H)+ Masa exacta: 428.1. Columnas: AD-H 50 mm * 4.6 mm, 3 µ??; flujo: 4 mUmin; fase móvil: A: C02, B: EtOH (0.05% de dietilamina), de un 5% a un 40% de B en A; temperatura: 40 °C; isómero 4a: tR: 1.53 min; 4b tR: 1.73 min.
El compuesto QO-1 (1.85 g, 4.3 mmol) se disolvió en CHCI3 (10 mL). A continuación, se añadió HCI conc. (10 mL) y la mezcla se agitó en un tubo sellado a 60 °C durante 1 hora. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido (1.6 g) se disolvió en metanol (30 mL) y se añadió EÍ3 (1.8 mL, 13.0 mmol). A continuación, se añadió Boc20 (1.1 g, 5.2 mmol) gota a gota a 0 °C. Después de la adición, la mezcla se agitó durante 0.5 h a 20 °C. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: éter de petróleo: acetato de etilo desde 100:0 hasta 0:100) para proporcionar el compuesto QO-2 (1.08 g). Método A2; tR: 0.97 min. m/z=: 392.9 (M+H)+ Masa exacta: 392.1 El compuesto QO-1 (1 g, 2.3 mmol) y Selectfluor (0.81 g, 2.3 mmol) se agitaron en DMA (10 mL) a 150 °C durante 15 min. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se vertió sobre NaHC03 saturado enfriado previamente (100 mL). El precipitado se filtró, se lavó con H20 y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (eluyente: Ch^Cb/EtOAc, 1/1 ). Las fracciones recolectadas se combinaron y se concentraron al vacío. El residuo obtenido solidificó en THF (3 mL) para proporcionar el compuesto QO-3 (0.13 g).
Método A2; tR: 1.55 min. m/z=: 447.0 (M+H)+ Masa exacta: 446.1 Se añadió acetonitrilo (23.7 g, 580 mmol) a 3-bromoanilina (10 g, 58 mmol) en tolueno (70 mL). La mezcla se enfrió hasta 0 °C y se añadió BCI3 (1 M en CH2CI2, 64 mL, 64 mmol) gota a gota, mientras se mantenía la temperatura por debajo de 10 °C. A continuación, se añadió AICI3 (1 1 .6 g, 87 mmol) en pequeñas porciones a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó hasta 90 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se desactivó con HCI acuoso (2 N, 100 mL). La mezcla se calentó hasta 50 °C durante 1 hora, se enfrió hasta temperatura ambiente y se separó. La fase orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se recolectó, se secó y se concentró, para proporcionar 1 -(2-amino-4-bromofenil)etanona (4 g). Método A2; tR: 0.98 min. m/z=: 215.7 (M+H)+ Masa exacta: 215.0 El compuesto PR-13 (10.6 g, 43.9 mmol), tamices moleculares de 4 A (1.0 g) y 1-(2-amino-4-bromofenil)etanona (9.4 g, 43.9 mmol) se agitaron en xileno (100 mL) y se calentaron a reflujo durante 1 hora. Se añadió 4-(4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio BF4 (DMTMM.BF4, 15.8 g, 48.3 mmol) y la mezcla se agitó y se calentó a reflujo durante 12 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petroleo/Ch C = 5:1 y a continuación éter de petróleo/acetato de etilo = 1/1 v/v) para proporcionar el compuesto QO-4 (10.9 g).
El compuesto QO-4 (10.0 g, 22.9 mmol) y NaOH (evaporado conjuntamente con tolueno, 3.2 g, 80 mmol) se agitaron en dioxano (100 mL) durante 1 hora a 100 °C en atmósfera de N2. La mezcla se vertió sobre NH4CI al 10% (200 mL). La mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 100 mL). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron y se concentraron al vacío.
El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: CH2CI2 y a continuación acetato de etilo). Se recolectaron las fracciones puras y se eliminó el disolvente al vacío. A la quinolinona obtenida (3.0 g) en CH2CI2 (30 mL), se añadió HCI 4 N/dioxano (30 mL) gota a gota. La mezcla se agitó durante 2 horas a 20 °C y a continuación los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo obtenido (3.0 g), el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.9 g, 10.8 mmol), EDCI (2.1 g, 10.8 mmol) y HOBt (0.49 g, 3.6 mmol) se agitaron en CH2CI2 (30 mL) a 0 °C. Se añadió DIPEA (4.7 g, 36 mmol). La mezcla se agitó durante 2 horas a 20 °C. Se añadió H2O (30 mL) y la mezcla se separó por filtración. El sólido se recolectó y se secó para proporcionar el compuesto QO-5. El filtrado se separó y la fase orgánica se lavó con agua H2O (2x30 mL) y salmuera, se secó y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo y a continuación acetato de etilo: CH3OH = 10:1). Se recolectaron las fracciones puras y se concentró el disolvente al vacío para proporcionar más compuesto QO-5 (3 g en total).
A una solución agitada del compuesto PR-14 (6 g, 22.3 mmol) en CH2CI2/piridina (100 mL, 1/1) a 0 °C, se añadió (COCI)2 (5.6 g, 44.6 mmol) gota a gota. La mezcla se agitó a 25 °C durante 0.5 horas. A continuación, la mezcla se añadió a una solución de 1-(2-amino-4-bromofenil)etanona (4.7 g, 22.3 mmol) en CH2CI2 (30 mL). La mezcla se agitó a 25 °C durante 1 hora. La mezcla se vertió sobre H2O (100 mL), se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL) y se separó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano: acetato de etilo = 5:1), para proporcionar el compuesto QO-6 (9 g) como un sólido.
Al compuesto QO-6 (9 g, 19.3 mmol) en tolueno (100 mL), se añadió NaOH (3 g, 77.2 mmol) a 25 °C. La mezcla se agitó a reflujo durante 1 hora. La mezcla se vertió sobre NH4CI acuoso (50 mL), se extrajo con acetato de etilo (3 x 100 mL) y se separó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2SO4. La fase orgánica se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano: acetato de etilo = 0:1), para proporcionar el compuesto QO-7 (3.5 g). Método A2; tR: 1.25 min. m/z=: 449.1 (M+H)+ Masa exacta: 448.1 A una solución del compuesto QO-7 (3.5 g, 7.83 mmol) en CH2CI2 (100 mL), se añadió TFA (10 mL) gota a gota a 25 °C. La mezcla se agitó a 25 °C durante 0.5 horas. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se lavó con éter f-butil metílico y se secó al vacío, el sólido resultante (2.4 g) se agitó en CH2CI2 (100 mL) con el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (1.45 g, 8.3 mmol), HATU (3.15 g, 8.3 mmol) y NEt3 (0.84 g, 8.3 mmol) a 25 °C. La mezcla se agitó a 25 °C durante 1 hora. La mezcla se vertió sobre H2O (50 mL), se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL) y se separó. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron con Na2S04. La fase orgánica se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (hexano: acetato de etilo = 5:1), para proporcionar el compuesto QO-8 (1.5 g) como un sólido. Método A2; tR: 1.11 min. m/z=: 506.2 (M+H)+ Masa exacta: 505.1 ; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 0.85 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.90 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 1.15 - 1.37 (m, 2 H), 1.37 - 1.56 (m, 2 H), 1.56 - 1.79 (m, 3 H), 1.82 - 2.1 1 (m, 3 H), 2.23 - 2.43 (m, 2 H), 3.55 (s, 3 H), 3.93 (t, J=8.7 Hz, 1 H), 4.45 (dt, J=11.7, 5.9 Hz, 1 H), 4.73 (dd, J=10.3, 7.4 Hz, 1 H), 5.89 (s a, 1 H), 7.44 (dd, J=8.6, 1.9 Hz, 1 H), 7.54 (d, J=8.0 Hz, 1 H), 7.73 (d, J=1.9 Hz, 1 H), 7.95 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 1 .63 (s a, 1 H) xileno, reflujo QO-9 La 1-(2-amino-4-bromo-5-fluorofenil)etanona (0.36 g, 1.57 mmol) y el compuesto PR-12 (0.34 g, 1.57 mmol) se calentaron a reflujo en xileno (8 mL) durante 1 hora. Se añadió DMTMM.BF4 (0.57 g, 1.73 mmol) y la mezcla se agitó y se calentó a reflujo durante 8 horas. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: éter de petróleo/acetato de etilo desde 1 hasta 1/2), para proporcionar el compuesto QO-9 (0.5 g).
El compuesto QO-9 (0.5 g, 1.16 mmol) y NaOH (0.16 g, 4.0 mmol) se agitaron en dioxano anhidro (5 mL) a 100 °C durante 1 hora en atmósfera de N2. La mezcla se vertió sobre una solución de NH4CI al 10% (20 mL). El residuo se extrajo con CH2CI2 (2x10 mL), se secó con Na2S04 y se evaporó al vacío. El residuo obtenido (0.5 g) se disolvió en CH2CI2 (5 mL). Se añadió HCI 4 N/dioxano (2 mL) a 0 °C y la mezcla se agitó a continuación a 25 °C durante 20 min. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido (0.5 g), junto con el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.45 g, 2.55 mmol), EDCI (0.49 g, 2.55 mmol) y HOBt (0.34 g, 2.55 mmol) en CH2CI2 (10 mL), se enfrió hasta 0°C y se añadió DIPEA (2.3 mL, 11.6 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 12 horas. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y H20 (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHC03 acuoso saturado (5 mL) y salmuera, y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: metanol/CH2CI2 = 15%), para proporcionar el compuesto QO-10 (150 mg) como un polvo blanco.
Método A2; tR: 0.92 min. m/z=: 470.1 (M+H)+ Masa exacta: 469.0 Se disolvió 4-bromo-1-fluoro-2-nitrobenceno (50 g, 227 mmol) en etanol (600 mL). Posteriormente, se añadió una suspensión de Na2S03 (71.6 g, 568 mmol) en etanol (1000 mL) y agua (1250 mL). La suspensión se agitó a 70 °C durante 15 horas. A continuación, la mezcla de reacción se acidificó a temperatura ambiente con HCI (2 N) hasta obtener un pH = 2 y se concentró al vacío. El residuo remanente se disolvió a reflujo en salmuera (1000 mL). Posteriormente, se añadió agua (100 mL) y la solución se enfrió en un baño de hielo. El precipitado se recolectó por filtración para proporcionar el ácido 4- bromo-2-nitrobencenosulfónico (57.3 g, 89%).
A una solución de cloruro de tionilo (50 ml_), se añadieron el ácido 4-bromo-2-nitrobencenosulfónico (30 g, 106 mmol) y DMF (1 gota) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4 horas. Después de enfriarla, la mezcla de reacción se evaporó conjuntamente con tolueno, formando un azeótropo, tres veces. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de tolueno y a continuación la mezcla resultante se añadió a una mezcla de una solución acuosa concentrada de hidróxido de amonio (1 ml_) y THF (10 mL) a -10 °C. Después de agitar durante 2 horas, la reacción se desactivó añadiendo una solución acuosa de ácido clorhídrico 6 M hasta obtener un pH = 4. La fase orgánica se separó, a continuación se secó y se concentró al vacío. Se añadió éter de petróleo a la suspensión resultante y el producto se recolectó por filtración al vacío para proporcionar 4-bromo-2-nitrobencenosulfonamida.
Se calentó una suspensión de 4-bromo-2-nitrobencenosulfonamida (21.2 g, 75 mmol) en Hl al 57% (250 mL) a 90 °C durante 4 horas. Después de enfriarla hasta temperatura ambiente, la mezcla de color lila oscuro se diluyó con acetato de etilo (500 mL) y a continuación se lavó sucesivamente con Na2S203 ac. saturado, NaHCO3 ac. saturado y salmuera. La fase orgánica incolora se secó con MgSO4 anhidro, se filtró y se concentró a sequedad. El producto crudo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (eluyente: CH3CN/H2O desde 22/78 hasta 52/48 con un 0.01 % de NH3H2O como tampón) para proporcionar 2-amino-4-bromobencenosulfonamida (18.6 g). Método B; tR: 3.36 min. m/z=: 250.9 (M+H)+ Masa exacta: 249.9 TD-1 Se añadió trietilamina (40.5 mL, 296 mmol) a una solución de 2-amino-4-bromobencenosulfonamida (18.6 g, 74 mmol) en acetona (200 mL). Se añadió el compuesto PR-6 (12.8 g, 48 mmol) a la mezcla de reacción con refrigeración. Después de agitar durante 5 horas, la mezcla de reacción se diluyó con agua y se acidificó con HCI 2 N hasta obtener un pH de 4. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración y a continuación se transfirió a otro recipiente. Se añadió una solución de K2C03 (15 g) en agua (100 mL) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 2 horas hasta que la reacción se volvió homogénea. La mezcla de reacción se acidificó con HCI 2 N hasta obtener un pH = 4. El precipitado se separó por filtración y se lavó con agua. El producto crudo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (eluyente: CH3CN/H20 desde 35/65 hasta 65/35 con un 0.75% de CF3COOH como tampón), para proporcionar el compuesto TD-1 (8.3 g, 45%). Método A2; tR: 1.05 min. m/z=: 487.8 (M+Na)+ Masa exacta: 465.0 El compuesto TD-1 (2 g, 4.3 mmol) se disolvió en CH3COOH (20 mL). Se añadió HBr al 40% (30 mL) y la mezcla se agitó a 50 °C durante 3 horas. El disolvente se evaporó al vacío. El residuo obtenido se lavó con éter te/f-butil metílico. El sólido se filtró y se secó con un vacío elevado. Una solución del polvo amarillo resultante (1.7 g) y Boc20 (1.8 g, 8.2 mmol) en metanol (15 mL) se enfrió hasta 0 °C. Se añadió trietilamina (2.3 mL, 16.4 mmol). La mezcla se agitó a 20 °C durante 2 horas y el disolvente se eliminó al vacío. Se añadió CH2CI2 (10 mL) y la mezcla se lavó con H2O (10 mL) y se secó con a2SO4. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se solidificó con éter de petróleo (5 mL) y se filtró. Después de secarlo con un vacío elevado, se obtuvo el compuesto TD-2 (1.7 g). Método G; tR: 1.26 min. m/z=: 453.9 (M+Na)+ Masa exacta: 431.0 OA-1 A oxetan-3-ona (5 g, 69 mmol) en THF (50 mL), se añadieron 2-metilpropan-2-sulfinamida (8.34 g, 69 mmol) y Ti(OEt)4 (20 mL) de forma secuencial. La reacción se calentó hasta 50 °C durante 5 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se desactivó con agua (200 mL). El precipitado se filtró y el filtrado se extrajo con CH2CI2 (2 x 50 mL). La fase orgánica combinada se separó y se lavó con agua (50 mL) y salmuera (50 mL). La fase orgánica se secó y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (CH2CI2) para proporcionar el compuesto OA-1 (5.5 g, 46% de rendimiento).
OA-2 Se disolvió 4-bromo-1-yodo-2-nitrobenceno (3 g, 9.18 mmol) en THF anhidro (20 mL) en atmósfera de N2 y el recipiente se enfrió hasta -78 °C. La mezcla se agitó durante 5 minutos y se añadió n-BuLi (4.4 mL, 2.5 mol/L) lentamente. La mezcla de reacción se volvió oscura y se continuó agitando a -78 °C durante 5 minutos. A continuación, se añadió lentamente el compuesto OA-1 (1.92 g, 11 mmol) a la mezcla. La reacción se agitó durante 30 minutos a -78 °C y a continuación se calentó hasta temperatura ambiente. La mezcla se vertió sobre agua (50 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). Las fases orgánicas se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron con Na2S0 y se concentraron a sequedad. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 3:1), para proporcionar el compuesto OA-2 (1.3 g, 38% de rendimiento).
Método A2; tR: 1.04 min. m/z=: 378.7 (M+H)+ Masa exacta: 378.0 OA-2 OA-3 El compuesto OA-2 (1.3 g, 3.45 mmol) se disolvió en MeOH (10 mL) y se añadió lentamente HCI/dioxano (4 N, 10 mL). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y la mezcla se concentró, para proporcionar un residuo (0.89 g). Método A2; tR: 0.60 min. m/z=: 272.7 (M+H)+. Al residuo obtenido (0.89 g), en un matraz de 50 mL, se añadieron HATU (1.49 g, 3.94 mmol), trietilamina (0.66 g, 6.56 mmol) y ácido (S)-1-(ferí-butoxicarbonil)pirrolidin-2-carboxílico (0.84 g, 3.94 mmol). El residuo se disolvió en CH2CI2 (10 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla se desactivó con agua (20 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 y a continuación se concentró. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: éter de petróleo/acetato de etilo = 2/1) para proporcionar un intermedio de tipo nitro (1.27 g). Este intermedio de tipo nitro (1 g, 2.1 mmol) se disolvió en MeOH/agua (20 mL 1 :1), se añadieron Fe en polvo (0.35 g, 6.3 mmol) y NH4CI (0.55 g, 10.5 mmol) y la mezcla se agitó a reflujo durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y a continuación se concentró a sequedad. El residuo obtenido se lavó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La fase orgánica se separó y se concentró al vacío para proporcionar un intermedio (0.77 g). Método A2; \R 1.07 min. m/z=: 464.0 (M+Na)+ Masa exacta: 441.1. Este intermedio (0.77 g, 1.75 mmol) se disolvió en AcOH (20 mL). La solución resultante se agitó a 80 °C durante 30 minutos. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía en columna (éter de petróleo: acetato de etilo = 1 :1) para proporcionar el compuesto OA-3 (0.49 g, 66%). Método B; tR: 4.06 min. m/z=: 422.0 (M+H)+ Masa exacta: 421.1 Se añadió Pd(PPh3)4 (0.14 g, 0.12 mmol) a una mezcla del compuesto SC-9 (0.5 g, 1.2 mmol), el compuesto QO-1 (0.41 g, 1.2 mmol), Na2C03 (0.51 g, 4.8 mmol), THF (20 mL) y H20 (10 mL) en atmósfera de N2. La mezcla se agitó con irradiación de microondas a 80 °C durante 15 minutos. Se añadieron CH2CI2 (20 mL) y H20 (15 mL) a la mezcla de reacción. La fase orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó con Na2S04. El disolvente se evaporó al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo: éter de petróleo = 3:1) para proporcionar el compuesto 1 (0.43 g). Método A2; tR: 0.89 min. m/z=: 736.3 (M+H)+ Masa exacta: 735.3 El compuesto 1 (0.43 g, 0.58 mmol) se disolvió en CHC (4.3 mL). Se añadió HCI concentrado (4.3 mL). La mezcla se agitó a 60 °C en un tubo sellado durante 1 hora. El disolvente se evaporó al vacío para proporcionar el compuesto 2 (0.6 g). Método A2; XR: 0.92 min. m/z=: 502.3 (M+H)+ Masa exacta: 501.3 A una solución del ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.49 g, 2.78 mmol) en acetonitrilo (20 mL), se añadieron EDCI (0.53 g, 2.78 mmol) y HOBt (0.38 g, 2.78 mmol). Después de agitar durante 1 hora a 10 °C, se añadió el compuesto 2 (0.6 g). A continuación, la mezcla se enfrió hasta 0 °C y se añadió DIPEA (1.5 g, 1 1.6 mmol). La mezcla se agitó a 10 °C durante 12 horas. El sólido se filtró, el filtrado obtenido se concentró y se diluyó con CH2CI2 (20 ml_) y HCI 1 N (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHC03 acuoso saturado (5 mL) y salmuera, y a continuación se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El compuesto 3 obtenido, una mezcla de dos diastereoisómeros 3a y 3b, se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Grace Vydac 250 * 20 mm * 5 pm; fase móvil A: agua (que contenía un 0.075% de TFA, % de VA/); fase móvil B: acetonitrilo (que contenia un 0.025% de TFA, % de VA/); tasa de flujo: 30 mL/min; gradiente: 35-50% de B (v/v) desde 0 hasta 1 1 min). Las dos fracciones puras se recolectaron y se basificaron con NaHC03 hasta obtener un pH = 8. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo obtenido se lavó con acetonitrilo (1 mL) y éter f-butil metílico (1 mL). El sólido se secó con un vacío elevado para proporcionar los dos diastereoisómeros separados: el compuesto 3a (14 mg) y el compuesto 3b (26 mg). 3a: Método B; tR: 4.71 min. m/z : 816.3 (M+H)+ Masa exacta: 815.4 SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: EtOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 8.39 min SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), 40% de B en A; tR: 7.67 min 3b: Método B; tR: 4.79 min. m/z : 816.3 (M+H)+ Masa exacta: 815.4 SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: MeOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 7.41 min SFC: columna: OD-H 150 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: MeOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 9.60 min Una mezcla del compuesto QO-2 (1.0 g, 2.5 mmol), compuesto SC-5 (1.4 g, 2.5 mmol), Na2CO3 (2.1 g, 20 mmol) y Pd(PPh3)4 (0.29 g, 0.25 mmol) en H2O (10 mL), etanol (10 mL) y tolueno (10 mL) se agitó durante 1 hora a 100 °C en atmósfera de N2. Se añadió agua (10 mL) y la mezcla se extrajo con diclorometano (2 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4. Después de filtrarlas, se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: en primer lugar, acetato de etilo: metanol desde 100: 0 hasta 10:1 ; a continuación, didorometano: metanol desde 10:1 hasta 1 :1) para proporcionar el compuesto 4 (1.04 g).
Método A2; tR: 0.99 min. m/z : 750.3 (M+H)+ Masa exacta: 749.3.
El compuesto 4 (1 g, 1.3 mmol) se disolvió en CH2CI2 (10 mL). Se añadió HCI 4 N/dioxano (10 mL). La mezcla se agitó durante 20 minutos a 25 °C. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se evaporó conjuntamente con tolueno ( 0 mL) para proporcionar 0.85 g de residuo. Método A2; tR: 0.84 min. m/z : 550.1 (M+H)+ Masa exacta: 549.2. A este residuo (0.85 g, 1.3 mmol) en CH2CI2 (10 mL), se añadieron el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.51 g, 2.9 mmol), EDCI (0.59 g, 2.9 mmol) y HOBt (0.09 g, 0.67 mmol) y la mezcla se enfrió hasta 0 °C. A continuación, se añadió DIPEA (2.3 mL, 13.3 mmol) y la mezcla se agitó durante 1.5 horas a 25 °C. Se añadieron agua (20 mL) y didorometano (20 mL) y la fase orgánica se separó y se secó con Na2S04. Después de filtrarla, se eliminó el disolvente al vacío. El compuesto 5 (mezcla de los diastereoisómeros 5a y 5b) se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: acetato de etilo: metanol desde 100:0 hasta 6:1 ) para proporcionar un sólido de color amarillo claro. El sólido obtenido se lavó con acetonitrilo y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columna: OJ 250 mm * 30 mm, 5 µ??; fase móvil: A: C02 supercritico, B: isopropanol con un 0.05% de dietilamina, A:B = 65:35 a 55 mL/min; temp. de la columna: 38 °C; presión de la boquilla: 100 Bar; temp. de la boquilla: 60 °C; temp. del evaporador: 20 °C; temp. del trimmer. 25 °C; longitud de onda: 220 nm). Las fracciones obtenidas del compuesto 5a y 5b se lavaron con acetonitrilo y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columna: OJ 250 mm * 30 mm, 5 pm; fase móvil: A: C02 supercritico, B: isopropanol (0.05% de dietilamina), A:B = 65:35 a 55 mL/min; temp. de la columna: 38 °C; presión de la boquilla: 100 Bar; temp. de la boquilla: 60 °C; temp. del evaporador: 20 °C; temp. del trimmer. 25 °C; longitud de onda: 220 nm). Esto proporcionó el compuesto 5a (148 mg) y 5b (200 mg). 5a: Método C; tR: 3.66 min. m/z : 864.4 ( +H)+ Masa exacta: 863.4; SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: ¡PrOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 8.18 min 5b: Método C; tR: 3.72 min. m/z : 864.4 (M+H)+ Masa exacta: 863.4; SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm; flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: ¡PrOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; t : 8.77 min A una solución agitada del compuesto QO-8 (900 mg, 1.78 mmol), el compuesto SC-7 (922 mg, 1.49 mmol) y Pd(dppf)CI2 (100 mg, 1.9 mmol) en THF anhidro (20 mL), se añadió Na2CO3 (10 mL, 2 N). La mezcla de reacción se agitó a reflujo durante 20 minutos, se desactivó con agua (20 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó con Na2S04 y, después de filtrarla, el filtrado obtenido se concentró al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Phenomenex Synergi C18 150 * 20 mm * 5 pm; A: H20 + 0.1% de TFA; B: MeCN; tasa de flujo (mL/min): 40). Las fracciones puras se recolectaron y se neutralizaron con NaHC03 saturado. El disolvente orgánico se concentró al vacío. El precipitado se filtró, se lavó con H20 (10 mL) y se secó con un vacío elevado para proporcionar el compuesto 6 (450 mg).
Método H; tR: 3.68 min. m/z : 818.5 (M+H)+ Masa exacta: 817.4; SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 8.24 min 1H RMN (600 MHz. DMSO-d6) d ppm 0.88 (d, J=6.5 Hz, 3 H), 0.88 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 0.92 (d, J=6.6 Hz, 3 H), 0.95 (d, J=6.7 Hz, 3 H), 1.19 -1.36 (m, 3 H), 1.45 (d, J=11.0 Hz, 1 H), 1.54 (c, J=12.0 Hz, 1 H), 1.60 - 1.69 (m, 1 H), 1.70 - 1.80 (m, 2 H), 1.89 - 2.09 (m, 5 H), 2.10 - 2.21 (m, 2 H), 2.31 -2.44 (m, 2 H), 3.54 (s, 3 H), 3.56 (s, 3 H), 3.83 (t, J=6.2 Hz, 2 H), 3.95 (t, J=8.8 Hz, 1 H), 4.08 (t, J=8.4 Hz, 1 H), 4.48 (dt, J=11.0, 6.3 Hz, 1 H), 4.79 (t, J=8.9 Hz, 1 H), 5.09 (dd, J=7.0, 3.4 Hz, 1 H), 5.88 (s, 1 H), 7.34 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 7.57 (d, J=7.9 Hz, 1 H), 7.71 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.72 (s, 1 H), 7.84 (s a, 1 H), 7.86 (d, J=7.9 Hz, 1 H), 7.93 - 8.00 (m, 3 H), 8.05 (s, 1 H), 8.08 (s, 1 H), 8.12 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 11.76 (s a, 1 H), 11.96 (s a, 1 H) Una mezcla del compuesto QO-10 (0.12 g, 0.26 mmol), compuesto SC-11 (0.15 g, 0.26 mmol), Pd(PPh3)4 (0.030 g, 0.026 mmol) y Na2C03 (0.22 g, 2.05 mmol) en una mezcla de tolueno, etanol y H20 (1 :1 :1 , 4.5 ml_) se agitó durante 2 horas a 100 °C en atmósfera de N2. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. Se añadieron diclorometano (15 ml_) y agua (10 ml_). La fase orgánica se separó y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: en primer lugar, éter de petróleo: EtOAc desde 100:0 hasta 0:100 y a continuación EtOAc: metanol desde 100:0 hasta 10:1). El sólido obtenido se lavó con acetonitrilo y se evaporó conjuntamente con metanol. El sólido obtenido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columnas: OD-3 150 x 4.6 mm de D.I., 3 pm; flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: 40% de metanol (0.05% de dietilamina) en C02), para proporcionar el compuesto 7 (0.1 g) como un polvo blanco. Método H; tR: 3.39 min. m/z : 834.5 (M+H)+ Masa exacta: 833.4; SFC: columna: OD-H 150 mm x 4.6 mm, 3 pm;_flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 6.56 min El compuesto QO-15 (0.30 g, 0.63 mmol), el compuesto SC-5 (0.35 g, 0.63 mmol), Pd(PPh3)4 (0.22g, 0.19 mmol) y Na2CO3 (0.27 g, 2.5 mmol) en tolueno (3 mL), etanol (3 ml_) y H2O (3 ml_) se calentaron a reflujo en atmósfera de N2 durante 12 horas. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. La mezcla se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). Las fases orgánicas se lavaron con salmuera, se secaron y se evaporaron al vacío para proporcionar un residuo (0.5 g). Este residuo (0.50 g) se agitó en CH2CI2 (5 mL) a 0 °C. Se añadió HCI 4 N/dioxano (5 mL). La mezcla se agitó durante 1 hora a 20 °C y los componentes volátiles se eliminaron al vacío para proporcionar un residuo (0.50 g). A este residuo (0.5 g) en CH2CI2 (5 ml_), se añadieron el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.13 g, 0.76 mmol), EDCI (0.22 g, 1.14 mmol) y HOBt (0.043 g, 0.32 mmol) y la mezcla se agitó a 0 °C. A continuación, se añadió DIPEA (0.4 g, 3.2 mmol). La mezcla se agitó durante 2 horas a 20 °C, posteriormente se lavó con agua H2O (2x) y salmuera, se secó con Na2S04 y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (C18, eluyente: CH3CN/H2O desde 15/85 hasta 35/65 con un 0.1% de CF3COOH como tampón). Las fracciones puras se recolectaron y la mezcla se basificó con NaHC03 hasta obtener un pH = 9. El disolvente orgánico se evaporó y la mezcla se separó por filtración. El sólido se secó y se evaporó al vacío para proporcionar el compuesto 8 (140 mg). Método H; \R. 3.52 min. m/z : 890.3 (M+H)+ Masa exacta: 889.4; SFC: columna: AS-H 250 mm x 4.6 mm, 3 pm; flujo: 2.5 mlJmin; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 2.9 min; SFC: columna: OD-3 150 mm x 4.6 mm, 3 pm;_flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02, B: EtOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 5.2 min Una solución de Na2C03 (0.24 g, 2.3 mmol) en H20 (6 ml_) se añadió a una mezcla del compuesto SC-9 (0.6 g, 1.16 mmol), el compuesto QA-1 (0.5 g, 1.16 mmol), etanol (6 ml_) y tolueno (12 mL). Se añadió Pd(PPh3)4 (55 mg, 0.058 mmol) a la mezcla en una porción en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 10 horas a 90 °C. A continuación, la solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se concentró al vacío. El residuo obtenido se disolvió en CH2CI2 (20 mL) y se lavó con agua (3 x 10 mL). La solución se secó con Na2S04 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente en gradiente: EtOAc: diclorometano = desde 1 :3 hasta 2:1 y EtOAc: MeOH = desde 100:1 hasta 100:5). Se recolectó la fracción deseada, se eliminó el disolvente al vacío y el residuo obtenido se secó al vacío para proporcionar el compuesto 9 (0.52 g). Método A2; tR: 1.03 min. m/z : 737.3 (M+H)+ Masa exacta: 736.3 Se hidrogenó una mezcla del compuesto 9 (0.52 g, 0.71 mmol), (Boc)20 (0.307 g, 1.41 mmol), NEt3 (0.212 g, 2.1 mmol) y Pd(OH)2/C al 20% (0.5 g) en metanol (5 mL) (1 atm) a 10 °C durante 1.5 horas. La mezcla se filtró y los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2 (10 mL) y se lavó con H20 (5 mL). La fase orgánica se secó con Na2S04 y se evaporó al vacío. El residuo se lavó con éter í-butil metílico (3 mL). El sólido se filtró y se secó con un vacío elevado para proporcionar el compuesto 10 (0.47 g). Método A2; tR: 1.03 min. m/z : 703.3 (M+H)+ Masa exacta: 702.4 El compuesto 10 (0.47 g, 0.67 mmol) se disolvió en CH2CI2 (5 mL) y se añadió HCI/dioxano (4 N) (0.5 ml_, 2 mmol) gota a gota a 0 °C. La mezcla se agitó a 10 °C durante 1 hora. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se solidificó con éter f-butil metílico (2 mL). El sólido se filtró y se secó con un vacío elevado para proporcionar un polvo amarillo. Método A2¡ tR: 0.79 min. m/z : 503.1 (M+H)+ Masa exacta: 502.3. Este polvo se añadió a una solución obtenida al tratar el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.28 g, 1.61 mmol) en acetonitrilo (5 mL) con EDCI (0.31 g, 1.61 mmol) y HOBt (0.217 g, 1.61 mmol) a 20 °C durante 1 hora. La suspensión se enfrió hasta 0 °C y se añadió DIPEA (0.35 g, 2.7 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. La mezcla se concentró y se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y una solución acuosa de HCI 1 N (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y salmuera, y se concentró al vacío para obtener un compuesto crudo. La mezcla cruda se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa (eluyente: CH3CN/H20 = desde 30/70 hasta 60/40, con un 0.1% de CF3COOH). La fracción deseada se recolectó y el valor de pH de la solución se ajustó hasta aproximadamente 8 mediante la adición de NaHC03 sólido. El exceso de acetonitrilo se eliminó a presión reducida. La fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (3 x 50 mL), las fases orgánicas se combinaron y se secaron con a2S04. La solución obtenida se concentró y el residuo se secó adicionalmente al vacío, para proporcionar el compuesto 11 (0.1 g). Método B; tR: 5.06 min. m/z : 817.3 (M+H)+ Masa exacta: 816.4; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mUmin; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 7.5 min; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 m;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: EtOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 5.25 min Se añadió Na2CO3 (1.7 g, 16 mmol, 10 eq) en H2O (10 mL) a una mezcla del compuesto SC-7 (1 g, 1.6 mmol, 1 eq), compuesto QA-2 (0.73 g, 1.6 mmol, 1 eq), tolueno (10 mL) y etanol (10 mL). Se añadió Pd(PPh3)4 (0.18 g, 0.16 mmol, 0.1 eq). La mezcla se agitó a 100 °C durante 3 horas en atmósfera de N2. Se añadieron CH2CI2 (10 mL) y H2O (5 mL). La fase orgánica se separó, se secó con Na2S04 y se evaporó para proporcionar un residuo crudo (3 g). Una parte de este material crudo (0.9 g) se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Grace Vydac 250 * 20 mm * 5 µ?t?; fase móvil A: agua; fase móvil B: acetonitrilo; tasa de flujo: 30 mL/min; gradiente: 35-50% de B (v/v) desde 0 hasta 11 min). La fracción pura se recolectó y se evaporó al vacío para proporcionar el compuesto 12 (0.1 g). Método H; tR: 3.56 min. m/z : 865.4 (M+H)+ Masa exacta: 864.4; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: EtOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 4.80 min; SFC: columna: AS-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 9.0 min Se añadió Na2CO3 (0.94 g, 8.9 mmol) en H2O (5 mL) a una mezcla del compuesto SC-5 (0.5 g, 0.89 mmol) y el compuesto TD-2 (0.38 g, 0.89 mmol) en tolueno (5 mL) y etanol (5 mL). Se hizo burbujear N2 a través de la solución y a continuación se añadió Pd(PPh3)4 (0.1 g, 0.089 mmol). La mezcla se agitó a 100 °C durante 3 horas en atmósfera de N2. Se añadieron CH2CI2 (20 mL) y H20 (10 mL) y, tras la separación, la fase orgánica se secó con Na2S04 y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo: éter de petróleo desde un 75% hasta un 100%), para proporcionar el compuesto 13 (0.5 g). Método A2; tR: 1.05 min. m/z : 787.4 (M+H)+ Masa exacta: 786.3.
Se añadió HCI/dioxano (2 mL) a una mezcla del compuesto 13 (0.5 g, 0.64 mmol, 1 eq) y CH2CI2 (5 mL) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 10 minutos. El disolvente se eliminó al vacío. Método A2; tR: 0.84 min. m/z : 587.1 (M+H)+ Masa exacta: 586.2. Al residuo obtenido en CH2CI2 (5 mL), se añadieron el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.24 g), EDCI (0.27 g, 1.4 mmol) y HOBt (0.19 g, 1.4 mmol), la mezcla se enfrió hasta 0 °C y se añadió DIPEA (1.1 mL, 6.4 mmol, 10 eq). A continuación, la mezcla se agitó a 20 °C durante 12 horas. La mezcla se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y H20 (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHCC>3 acuoso saturado (5 mL) y salmuera, y se secó con Na2SO4. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Grace Vydac 250 * 20 mm * 5 pm; fase móvil A: agua (que contenía un 0.075% de TFA, % de VA/); fase móvil B: acetonitrilo (que contenía un 0.025% de TFA, % de VA/); tasa de flujo: 30 mL/min; gradiente: 35-50% de B (v/v) desde 0 hasta 11 min). La fracción relevante se recolectó y se basificó con una solución saturada de NaHC03 hasta obtener un pH = 8. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columna: AS 250 mm x 30 mm, 5 pm; fase móvil: A: C02 supercrítico, B: MeOH (0.05% de dietilamina), A:B = 60:40 a 50 mL/min; temp. de la columna: 38 °C; presión de la boquilla: 100 Bar; temp. de la boquilla: 60 °C; temp. del evaporador: 20 °C; temp. del trimmer. 25 °C; longitud de onda: 220 nm). Se recolectó la fracción relevante y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2 (5 mL) y se lavó con una solución saturada de NaHC03 (2 x 5 mL). La fase orgánica se secó con Na2SO4 y se evaporó. El residuo se lavó con éter í-butil metílico (2 mL) y se filtró. El sólido se secó con un vacío elevado para proporcionar el compuesto 14 (0.153 g). Método C; tR: 3.98 min. m/z : 901.3 (M+H)+ Masa exacta: 900.3; SFC: columna: OJ-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: MeOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 7.44 min SFC: columna: AS-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/m¡n; fase móvil: A: CO2, B: EtOH (0.05% de dietilamina), de un 5 a un 40% de B en A; tR: 8.90 min Al compuesto OA-3 (0.49 g, 1.16 mmol), se añadieron (S)-2-(5-(9,9-difluoro-7-(4,4,5,5-tetrametil-1 ,3,2-dioxaborolan-2-il)-9/-/-fluoren-2-il)-1 H-imidazol-2-il)pirrolidin-1-carboxilato de terí-butilo (0.78 g, 1.4 mmol), Pd(dppf)CI2 (45 mg, 0.058 mmol), THF (10 mL) y Na2C03 acuoso (2 mL, 2 N). La mezcla se purgó con nitrógeno gaseoso (3 x). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 15 minutos, se desactivó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 5 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó con Na2S04. Después de eliminar los componentes volátiles, el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: CH2CI2/metanol = 10/1) para proporcionar el compuesto 15 (0.49 g). Método A; tR: 0.99 min. m/z : 779.4 (M+H)+ Masa exacta: 778.4 El compuesto 15 (0.2 g, 0.28 mmol) se disolvió en CH2CI2 (5 mL) y se añadió TFA (5 mL) lentamente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se eliminaron los componentes volátiles para proporcionar un residuo (0.19 g). A una solución de parte del residuo obtenido (45 mg) en CH2CI2 (5 mL), se añadieron el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (26 mg, 0.15 mmol), EDCI (29 mg, 0.15mmol), HOBt (8 mg, 0.058 mmol) y NEt3 (23 mg, 0.23mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se lavó con agua (10 mL) y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La fase orgánica combinada se secó con Na2S04 y, después de filtrarla, el filtrado se concentró, para proporcionar un residuo. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Phenomenex Synergi C18 150 * 30 mm * 4 pm; método: desde un 30 hasta un 50% de B en A en 12 minutos; A: H20 + 0.1% de TFA; B: MeCN; tasa de flujo (mL/min): 25). A las fracciones que contenían el producto, se les añadió Na2C03 hasta obtener un valor de pH de 9. El disolvente orgánico se eliminó al vacío y la fase acuosa se extrajo con CH2CI2 (2 x 20 mL). La fase orgánica se separó, se secó con Na2S04 y, después de filtrarla, se eliminó el disolvente para proporcionar el compuesto 16 (11 mg). Método B; tR: 4.58 min. m/z : 892.4 (M+H)+ Masa exacta: 893.3; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: EtOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR:6.17 min El compuesto QO-3 (0.2 g, 0.44 mmol), el compuesto SC-9 (0.25 g, 0.49 mmol), Pd(PPh3)4 (0.10 g, 0.088 mmol) y Na2C03 (0.21 g, 1.98 mmol) se agitaron en THF (8 mL) y H20 (2.4 mL) a 80 °C con irradiación de microondas durante 5 minutos. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo obtenido se disolvió en CHCI3 y se filtró. El filtrado se concentró y se purificó mediante TLC preparativa (eluyente: acetato de etilo/metanol, 10:1), para proporcionar el compuesto 17 (0.25 g).
El compuesto 17 (0.24 g, 0.32 mmol) en CHCI3 (10 mL) y HCI concentrado (10 mL) se agitaron a 60 °C en un tubo sellado durante 2 horas. La fase acuosa se separó y se concentró al vacío. El residuo (0.2 g) se evaporó conjuntamente con tolueno y THF y se añadió a una solución que se formó al añadir EDCI (0.25 g, 1.32 mmol) y HOBt (0.18 g, 1.32 mmol) a una solución del ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.23 g, 1 .32 mmol) en CH3CN (5 mL) y se agitó a 10 °C durante 1 hora. A continuación, la mezcla se enfrió hasta O °C y se añadió DIPEA (1 mL, 5.6 mmol). La mezcla se agitó a 10 °C durante toda la noche. El disolvente se eliminó al vacío y el compuesto 18 obtenido (mezcla de los diastereoisómeros 18a y 18b) se purificó mediante HPLC preparativa (C18, eluyente: CH3CN, H20, TFA, 40:60:0.05). Se obtuvieron dos fracciones. Las fracciones se neutralizaron con NaHC03 saturado. El disolvente orgánico se evaporó al vacío. El precipitado resultante se filtró y se secó con un vacío elevado, para proporcionar 18a (33 mg, e.e.: 99%) y 18b (33 mg, e.e.: 90%). El compuesto 18b se purificó mediante SFC columna: OD 250 mm * 30 mm, 5 µ?t?; fase móvil: A: CO2 supercrítico, B: EtOH (0.05% de dietilamina), A:B = 60:40 a 50 mL/min; temp. de la columna: 38 °C; presión de la boquilla: 100 Bar; temp. de la boquilla: 60 °C; temp. del evaporador: 20 °C; temp. del trimmer. 25 °C; longitud de onda: 220 nm). Las fracciones recolectadas se combinaron y se concentraron al vacío. El residuo se lavó con NaHCOs saturado y se secó con un vacío elevado para proporcionar el compuesto 18b (26 mg, e.e.: 99%). 18a: Método B; tR: 4.75 min. m/z : 833.4 (M+H)+ Masa exacta: 834.6; SFC: columna: OD-3 150 mm x 4.6 mm, 3 pm;_flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR:6.08 min 18b: Método B; tR: 4.87 min. m/z : 833.4 (M+H)+ Masa exacta: 834.5; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: CO2, B: EtOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 4.25 min Una mezcla del compuesto OA-3 (0.46 g, 1.09 mmol), SC-9 (0.67 g, 1.3 mmol), Pd(dppf)CI2 (45 mg, 0.058 mmol), THF (10 mL) y Na2C03 acuoso (2 mL, 2 N) se purgó con nitrógeno gaseoso tres veces. La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 15 minutos. La mezcla se desactivó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 5 mL). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó con Na2S04. Después de eliminar los componentes volátiles, el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: CH2CI2/metanol = 10/1) para proporcionar el compuesto 19 (0.42 g).
El compuesto 19 (0.2 g, 0.28 mmol) se disolvió en CH2CI2 (5 mL) y se añadió TFA (5 mL) lentamente. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y la mezcla se concentró para proporcionar un residuo (0.19 g). A una parte de este residuo (1 10 mg) en CH2CI2 (5 mL), se añadieron el ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (105 mg, 0.60 mmol), EDCI (1 14 mg, 0.60 mmol), HOBt (13.5 mg, 0.1 mmol) y NEt3 (60 mg, 0.6 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla se lavó con agua (10 mL) y se extrajo con CH2CI2 (2 x 10 mL). La fase orgánica combinada se secó y se concentró para proporcionar un residuo, el cual se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (MeCN/H20; columna: Diamonsil C 8 150 * 20 mm * 5 pm; método: desde un 20 hasta un 40% de B en A en 14 rnin; A: H20 + 0.1 % de TFA; B: MeCN; tasa de flujo (mL/min): 40). A las fracciones que contenían el producto, se les añadió Na2C03 hasta obtener un valor de pH de 9, el disolvente orgánico se eliminó y la fase acuosa se lavó con CH2CI2 (2 x 20 mL). La fase orgánica se separó y se concentró a sequedad para proporcionar el compuesto 20 (40 mg). Método C; tR: 3.48 min. m/z : 845.5 (M+H)+ Masa exacta: 844.4; SFC: columna: OD-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.35 mL/min; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR:8.48 m¡n Se añadió Na2C03 (0.4 g, 3.8 mmol, 2 eq) en H20 (10 mL) a una mezcla del compuesto SC-9 (1 g, 1.9 mmol), el compuesto TD-1 (0.9 g, 1.9 mmol), etanol (10 mL) y tolueno (20 mL). Se añadió Pd(PPh3)4 (0.1 1 g, 0.095 mmol). La mezcla se agitó a 90 °C durante 10 horas en atmósfera protectora de N2. El disolvente orgánico se eliminó al vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (10 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (5 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante una columna flash (eluyente: CH2CI2/metanol = 10:1). El disolvente se evaporó para proporcionar el compuesto 21 (1.7 g).
El compuesto 21 (1.7 g, 1.1 mmol) se disolvió en CH3COOH (20 mL). Se añadió HBr al 40% en H20 (10 mL). La mezcla se agitó a 50 °C durante 3 horas. El disolvente se evaporó al vacío. El residuo se lavó con una mezcla de éter terf-butil metílico y metanol (1 :1). El sólido se filtró y se secó con un vacío elevado para proporcionar un residuo (1.7 g). Parte de este residuo (0.7 g) se añadió a una solución preformada que se había formado añadiendo EDCI (0.46 g, 2.4 mmol) y HOBt (0.32 g, 2.4 mmol) al ácido (S)-2-(metoxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (0.42 g, 2.4 mmol) en acetonitrilo (14 mL) y se agitó a 10 °C durante 1 hora. La suspensión se enfrió hasta 0 °C y se añadió DIPEA (1 g, 8 mmol). La mezcla se agitó a 10 °C durante 12 horas. Se filtró el sólido. El filtrado se concentró y se diluyó con CH2CI2 (20 mL) y HCI 1 N (5 mL). La fase orgánica se separó, se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (5 mL) y salmuera, y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Grace Vydac 250 * 20 mm * 5 µ?t?; fase móvil A: agua, que contenía un 0.075% de TFA, % de V/V; fase móvil B: acetonitrilo, que contenía un 0.025% de TFA, % de V/V; tasa de flujo: 30 mL/min; gradiente: 35-50% de B (v/v) desde 0 hasta 11 min). Las fracciones puras se recolectaron y se basificaron con NaHCOa hasta obtener un pH = 8. Los componentes volátiles se eliminaron al vacío. El residuo se extrajo con CH2CI2 (2 x 15 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (10 mL) y se secó con Na2S04. El disolvente se eliminó al vacío. El residuo se separó mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columna: AS 250 mm x 30 mm, 5 pm; fase móvil: A: C02 supercrítico, B: MeOH (0.05% de dietilamina), A:B = 60:40 a 50 mL/min; temp. de la columna: 38 °C; presión de la boquilla: 100 Bar; temp. de la boquilla: 60 °C; temp. del evaporador: 20 °C; temp. del trimmer. 25 °C; longitud de onda: 220 nm). Se recolectaron las fracciones y se eliminó el disolvente al vacío. El residuo se disolvió en CH2CI2 (5 mL) y se lavó con una solución saturada de NaHC03 (5 mL) y salmuera (5 mL). La fase orgánica se secó con Na2S04 y se evaporó para proporcionar el compuesto 22 (98 mg). Método B; ÍR: 4.94 min. m/z : 853.3 (M+H)+ Masa exacta: 852.4; SFC: columna: AS-H 250 mm x 4.6 mm, 5 pm;_flujo: 2.5 mL/min; fase móvil: A: C02, B: MeOH (0.05% de dietilamina), un 40% de B en A; tR: 4.53 min.
A una solución agitada de SC-14 (800 mg, 1.18 mmol), QA-10 (713 mg, 1.42 mmol) y Pd(dppf)CI2 (100 mg) en THF anhidro (10 mL), se añadió Na2C03 (5 mL, 2 N ac). La mezcla de reacción se agitó a reflujo calentándola en un baño de aceite que se había calentado previamente a 90 °C, durante 20 minutos. A continuación, la mezcla se desactivó con agua (20 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 10 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron con Na2S04 y se concentraron al vacío. El residuo obtenido se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (columna: Phenomenex Synergi C18 150 * 20 mm * 5 pm; método: de un 34 a un 64% de B en A: H20 + 0.1 % de TFA; B: MeCN; tasa de flujo (mL/min): 25). Las fracciones puras se recolectaron y se neutralizaron con NaHC03 saturado. La mezcla se concentró al vacío. El producto obtenido se purificó adicionalmente mediante cromatografía de fluidos supercríticos (columna: Chiralpak OD-3 50 * 4.6 mm de D.I., 3 pm; fase móvil: A: metanol (0.05% de dietilamina), B: CO2, A/B = 40/60; tasa de flujo: 2.5 mL/min; longitud de onda: 220 nm). Se recolectaron las fracciones puras y se eliminaron los componentes volátiles al vacío. El residuo obtenido se disolvió en diclorometano (20 ml_). La fase orgánica se lavó con NaHC03 acuoso saturado (10 mL) y se secó con a2SO4. El disolvente se eliminó al vacío para proporcionar el compuesto 23 (247 mg). Método B; tR: 5.84 min. m/z : 977.7 (M+H)+ Masa exacta: 976.4; 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 12.29 - 12.54 (1 H, m), 12.03 (1 H, s a), 8.12 - 8.21 (1 H, m), 8.01 - 8.1 1 (2 H, m), 7.91 - 8.01 (3 H, m), 7.79 - 7.91 (2 H, m), 7.62 - 7.76 (2 H, m), 7.54 (1 H, d, J=7.3 Hz), 7.32 (1 H, d, J=8.3 Hz), 5.01 - 5.15 (1 H, m), 4.67 - 4.81 (1 H, m), 4.37 - 4.52 (1 H, m), 3.81 - 4.13 (7 H, m), 3.70 - 3.80 (1 H, m), 3.54 (6 H, s a), 2.31 - 2.46 (3 H, m), 2.16 - 2.29 (1 H, m), 1.82 - 2.16 (5 H, m), 1.56 - 1.82 (3 H, m), 1.37 - 1.51 (1 H, m), 1.16 - 1.36 (2 H, m), 0.71 - 0.99 (12 H, m).
EJEMPLOS BIOLÓGICOS Actividad anti-VHC de los compuestos de fórmula I Ensayos de replicón Los compuestos de fórmula I se examinaron para determinar su actividad inhibitoria en el replicón del VHC. Este ensayo celular se basa en un constructo de expresión bicistrónico, según describen Lohmann et al. (Science (1999) 285: 1 0-113; Journal of Virology (2003) 77: 3007-3019) con las modificaciones descritas por Krieger et al. (Journal of Virology (2001) 75: 4614-4624) y Lohmann et al. (Journal of Virology (2003) 77: 3007-3019) para el genotipo 1 b y por Yi et al. (Journal of Virology (2004) 78: 7904-7915) para el genotipo 1a, en una estrategia de cribado con múltiples dianas.
Transfección estable El método se llevó a cabo como se indica a continuación. El ensayo utilizó la línea celular transfectada de forma estable Huh-7 luc/neo (que se denomina en lo sucesivo en la presente Huh-Luc). Esta línea celular contiene un ARN que codifica un constructo de expresión bicistrónico que comprende las regiones NS3-NS5B de origen natural del VHC de tipo 1b traducidas a partir de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (VEMC), precedidas por una porción marcadora (luciferasa de luciérnaga) y una porción marcadora seleccionable (neoR, neomicína-fosfotransferasa). El constructo está flanqueado por NTR (regiones no traducidas) 5' y 3' del VHC de tipo 1b. El cultivo continuado de las células con replicón en presencia de G418 (neoR) depende de la replicación del ARN del VHC. Las células con replicón transfectadas de forma estable que replican el ARN del VHC de forma autónoma y hasta niveles elevados, las cuales codifican la luciferasa entre otras, se utilizaron para analizar los compuestos antivíricos.
Las células con replicón se colocaron en placas de 384 pocilios en presencia de los compuestos de prueba y control, los cuales se añadieron con diferentes concentraciones. Tras una incubación de tres días, la replicación del VHC se midió evaluando la actividad luciferasa (utilizando sustratos y reactivos para el ensayo de la luciferasa estándar y un equipo para la obtención de imágenes de microplacas Perkin Elmer ViewLuxTM ultraHTS). Las células con replicón en los cultivos de control presentan una expresión de la luciferasa elevada en ausencia de cualquier inhibidor. Se monitorizó la actividad inhibitoria del compuesto en las células Huh-Luc, con lo cual se pudo obtener una curva de dosis-respuesta para cada compuesto de prueba. A continuación, se calcularon los valores de CE50, los cuales representan la cantidad de compuesto necesaria para reducir el nivel de actividad luciferasa detectada en un 50% o, más específicamente, para reducir la capacidad para replicarse del ARN del replicón del VHC genéticamente ligado.
Resultados Cuando un compuesto de fórmula I se evaluó más de una vez en el ensayo del replicón, en esta Tabla 1 se proporciona la media de todos los resultados del ensayo.
Transfección transitoria En una configuración transitoria, una linea de carcinoma hepatocelular Huh-7 lunet se transfectó de forma transitoria con un ARN que se replica de forma autónoma y que codifica un constructo de expresión bicistrónico. Este constructo comprende un gen marcador de la luciferasa de luciérnaga que precede a la región subgenómica NS3-NS5B del VHC (genotipo 1a H77 o 1b Con1). La traducción de la región subgenómica del VHC está mediada por un sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis. Además, el constructo está flanqueado por regiones no traducidas 5' y 3' del VHC (genotipo 1a H77 o 1b Con 1 , respectivamente), que hacen posible la replicación del ARN.
Las células se colocaron en placas de 384 pocilios en presencia de los compuestos de prueba y control, los cuales se añadieron con diferentes concentraciones. Tras una incubación de dos días, la replicación del ARN del replicón subgenómico del VHC se midió evaluando la actividad luciferasa (utilizando sustratos y reactivos para el ensayo de la luciferasa estándar y un equipo para la obtención de imágenes de microplacas Perkin Elmer ViewLuxTM ultraHTS). Las células que contienen el replicón subgenómico del VHC en los cultivos de control presentan una expresión de la luciferasa elevada en ausencia de cualquier inhibidor. Se monitorizó la actividad inhibitoria del compuesto, con lo cual se pudo obtener una curva de dosis-respuesta para cada compuesto de prueba. A continuación, se calcularon los valores de CE50, los cuales representan la cantidad de compuesto necesaria para reducir el nivel de actividad luciferasa detectada en un 50% o, más específicamente, para reducir la capacidad para replicarse del ARN subgenómico del VHC genéticamente ligado.
Análisis secundarios Las líneas celulares de los análisis secundarios incluyeron una línea de carcinoma hepatocelular Huh-7, la cual contenía el constructo de tipo promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano-Luc (Huh7-CMV-Luc), y una línea de linfocitos T MT4, la cual contenía una repetición terminal larga-marcador Luc (MT4-LTR-Luc).

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula I (I) o un estereoisómero de este, donde: Y es CH, N o CR4; W es carbonilo, sulfonilo o CR5R6; se selecciona independientemente de un grupo que comprende R y R' se seleccionan independientemente entre -CR1R2R3, arilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados entre halo y metilo, o heterocicloalquilo, donde Ri se selecciona entre alquilo C-M, alquilo C2-4 sustituido con metoxi o hidroxilo, y fenilo opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente entre halo y metilo; R2 es hidroxilo, amino, mono- o di(alquil C- jamino, (alquil Ci^)carbonilamino, (alquiloxi C1-4)carbonilamino; R3 es hidrógeno o alquilo C1-4; R4 es hidrógeno, alquilo C-M O fluoro; R5 y R6 son, cada uno independientemente, alquilo Ci^; o CR5R6 forman conjuntamente un cicloalquilo C3-7, oxetano, tetrahidrofurano; o una sales farmacéuticamente aceptables o un solvato de este. compuesto de conformidad con la reivindicación caracterizado además porque tiene la fórmula I 3. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado además porque tiene la fórmula Ib 4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene la fórmula le 5. El compuesto de fórmula I, la, Ib o le de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque cada L J se selecciona independientemente de un grupo que comprende 6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque al menos cada 7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque R2 es (alquil Ci. 4)carbonilamino o (alquiloxi Ci-4)carbonilamino y R3 es hidrógeno. 8. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque R1 se selecciona entre alquilo 03.4 ramificado, alquilo C2-3 sustituido con metoxi, y fenilo opcionalmente sustituido con 1 sustituyente seleccionado entre halo y metilo. 9. El compuesto de conformidad con cualquiera reivindicaciones 4 a 8, caracterizado además porque tiene la fórmula Id 10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un portador farmacéuticamente aceptable. 11. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, para su uso como un medicamento. 12. El compuesto de conformdidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección provocada por el VHC en un mamífero. 13. Un producto que contiene (a) un compuesto según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y (b) otro inhibidor del VHC, como un preparado combinado para el uso simultáneo, secuencial o por separado en el tratamiento de infecciones provocadas por el VHC. 14. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para preparar un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección provocada por el VHC en un mamífero. 15. El uso de un producto que que contiene (a) un compuesto según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y (b) otro inhibidor del VHC, para preparar un medicamento para el tratamiento de infecciones por el VHC, en donde los componentes (a) y (b) están adaptados para ser administrables de manera simultánea, secuencial o por separado.
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