MX2014001785A - Procedimiento de sintesis enzimatica del acido (7s)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-carboxilico y aplicacion en la sintesis de ivabradina y de sus sales. - Google Patents

Procedimiento de sintesis enzimatica del acido (7s)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-carboxilico y aplicacion en la sintesis de ivabradina y de sus sales.

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Abstract

Procedimiento de síntesis enzimática del compuesto de fórmula (I): (ver Fórmula) Aplicación a la síntesis de la ivabradina y de sus sales de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable.

Description

PROCEDIMIENTO DE SÍNTESIS ENZIMÁTICA DEL ÁCIDO (7S1-3.4- DIMETOXIBICICLOr4.2.01OCTA-1 ,3,5-TRIEN-7-CARBOXILICO Y APLICACIÓN EN LA SÍNTESIS DE IVABRADINA Y DE SUS SALES La presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis enzimática del compuesto de fórmula (I): ó 3-{3-[{[(7S)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa- ,3,5-trien-7-il]metil}(metil)amino]propil}-7,8-dimetoxi-1 ,3,4,5-tetrahidro-2/-/-3-benzazepin-2-ona, de sus sales de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable y de sus hidratos.
La ivabradina, así como sus sales de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable, y más particularmente su hidrocloruro, poseen propiedades farmacológicas y terapéuticas muy interesantes, principalmente propiedades bradicardizantes, que hacen que estos compuestos sean útiles en el tratamiento o la prevención de diferentes situaciones clínicas de isquemia miocárdica tales como angina de pecho, infarto de miocardio y trastornos del ritmo asociados, así como en diferentes patologías que incluyen trastornos del ritmo, principalmente supra-ventriculares, y en la insuficiencia cardiaca.
La preparación y la utilización en terapéutica de la ivabradina y de sus sales de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable, y más particularmente de su hidrocloruro, se han descrito en la patente europea EP 0 534 859.
Esta patente describe la síntesis del hidrocloruro de la ivabradina a partir del compuesto de fórmula (III), la (7S)-1-(3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa- 1 ,3,5-trien-7-il) N-metil metanam El compuesto de fórmula (III) es un intermedio clave en la síntesis de la ivabradina y de sus sales farmacéuticamente aceptables.
La técnica anterior divulga varios métodos de obtención del compuesto de fórmula (III).
La patente EP 0 534 859 describe la síntesis del compuesto de fórmula (III) por reducción del nitrilo de fórmula (IV): por BH3 en tetrahidrofurano, seguido de la adición de ácido clorhídrico, para dar lugar al hidrocloruro de la amina racémica de fórmula (V): que se hace reaccionar con cloroformiato de etilo para dar lugar al carbamato de fórmula (VI): cuya reducción por L1AIH4 da lugar a la amina metilada racémica de fórmula (VII): cuyo desdoblamiento mediante el ácido canfosulfónico da lugar al compuesto de fórmula (III).
Este método tiene el inconveniente de dar lugar al compuesto de fórmula (III) sólo con un rendimiento muy bajo de 2 a 3% a partir del nitrilo racémico de fórmula (IV).
Este rendimiento muy bajo se debe al rendimiento bajo (4 a 5%) de la etapa de desdoblamiento de la amina secundaria de fórmula (VII).
La patente EP 2 166 004 describe la obtención del compuesto de fórmula (III) por resolución óptica del nitrilo racémico de fórmula (IV) por cromatografía quiral, para dar lugar al nitrilo ópticamente puro de fórmula (IX): el cual se reduce por NaBH4 o por hidrogenación catalítica, para dar lugar a la amina primaria de fórmula (VIII).
Después, la amina primaria puede metilarse por la misma secuencia de reacciones que anteriormente (transformación en carbamato y reducción).
El compuesto de fórmula (III) puede obtenerse así en 5 etapas a partir del nitrilo racémico de fórmula (IV), con un rendimiento de 45.6 % para la etapa de desdoblamiento.
La utilización de enzimas hidrolíticas nitrilasas (EC 3.5.5.1 en la clasificación internacional de las enzimas) parecía interesante para permitir la obtención directa del ácido ópticamente puro de fórmula (I) a partir del nitrilo racémico de fórmula (IV), y reducir así el número de etapas para la obtención de la amina metilada de fórmula (III) a partir del nitrilo racémico.
El nitrilo de fórmula (X) se ha descrito como sustrato de nitrilasas del kit de cribado NESK-1400 comercializado por la empresa Almac: Sin embargo, la utilización de estas mismas nitrilasas sobre el nitrilo de fórmula (IV) (véase el Ejemplo comparativo A) ha mostrado una actividad baja y poco selectiva de estas últimas, dando lugar, en la mayor parte de los casos, a la formación simultánea de amida (actividad nitrilo hidratasa) y de ácido, difícilmente explotable con fines de síntesis para la obtención de intermedios en la síntesis del compuesto de fórmula (III).
El problema de la presente invención era por lo tanto encontrar una nitrilasa que permita la síntesis enantioselectiva del ácido ópticamente puro de fórmula (I) a partir del nitrilo racémico de fórmula (IV), minimizando la formación de amida.
El Solicitante ha puesto de manifiesto una actividad nitrilasa de determinados microorganismos enteros a favor de la formación del ácido de fórmula (I), de configuración S. Sobre los microorganismos ensayados, sólo Rhodococcus rhodocrous ha permitido obtener el ácido (S) con una muy buena enantioselectividad, sin formación de amida (véase el Ejemplo comparativo B).
Esta actividad se ha mejorado por la sobreexpresión de la nitrilasa.
De forma sorprendente, la hidrólisis enzimática con esta nitrilasa sobreexpresada no es enantioselectiva sobre el sustrato de fórmula (X) (véase el Ejemplo comparativo C).
Más específicamente, la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula (I) ópticamente puro: por hidrólisis enzimática enantioselectiva del nitrilo racémico o no ópticamente puro de fórmula (IV): mediante la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 sobreexpresada en otro organismo que posee un sistema biológico competente tal como una bactena, una levadura o un hongo, en una mezcla de un disolvente orgánico y de una disolución acuosa a pH de 5 a 10, preferiblemente un tampón a pH de 5 a 10, a una concentración de 1 a 500 g/L, preferiblemente de 2 g a 100 g de nitrilo de fórmula (IV) por litro de mezcla de disolventes, en una proporción E/S de 1/1 a 1/100, a una temperatura de 25°C a 40°C.
Según un aspecto de la invención, la nitrilasa está sobreexpresada en una bacteria que contiene un plásmido reorganizado, tal como Escherichia coli, preferiblemente E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21(DE3)pl_ysS, E. coli BL21star(DE3) o E. coli JM9(DE3).
Según un aspecto de la invención, el disolvente orgánico es un disolvente miscible con agua totalmente o en parte, tal como dimetilsulfóxido, DMF, acetona, acetonitrilo, un alcohol tal como etanol o isopropanol, un éter tal como THF o MTBE.
Según otro aspecto de la invención, el disolvente orgánico no es miscible con agua, por ejemplo un hidrocarburo tal como heptano u octano.
La disolución acuosa es preferiblemente una disolución amortiguadora a pH aproximadamente 7.
Según un aspecto de la invención, las bacterias que sobreexpresan la nitrilasa se utilizan directamente en el procedimiento, en forma de sedimento bacteriano o de liofilizado.
La proporción E/S es preferiblemente de 1/1 a 1/10 en el caso de un sedimento bacteriano y de 1/10 a 1/20 en el caso de un liofilizado.
Según otro aspecto de la invención, la nitrilasa se utiliza en la forma de enzima purificada.
El esquema de la hidrólisis enzimática según la invención es el siguiente: De forma ventajosa, el nitrilo de configuración (R), producto secundario de la reacción, se racemiza por acción de una base orgánica tal como DBU o de una base mineral tal como sosa, potasa, carbonato de potasio o carbonato de sodio, para reciclarse en el proceso de hidrólisis enzimática.
Cuando la etapa de racemización se efectúa in situ, el procedimiento según la invención es un procedimiento de desdoblamiento cinético dinámico (DKR por sus siglas en ingles) que permite obtener el ácido S de fórmula (I) con un ee superior a 98%.
El ácido de fórmula (I) se aisla preferiblemente del medio de reacción después de uno o varios ciclos de hidrólisis enzimática.
Definiciones Por compuesto ópticamente puro, se entiende compuesto cuyo exceso enantiomérico es superior o igual a 90%.
Por nitrilo no ópticamente puro, se entiende nitrilo cuyo exceso enantiomérico es inferior a 90%.
Por nitrilo racémico, se entiende nitrilo en la forma de una mezcla de dos enantiómeros en una proporción 55:45 a 45:55.
Por hidrólisis enantioselectiva de un nitrilo racémico o no ópticamente puro, se entiende hidrólisis preferente de uno de los enantiómeros de la mezcla.
Por sistema biológico competente, se entiende especie (células huésped) biológica(s) cuyo material genético se ha modificado por recombinación genética capacitándola(s) para producir una proteína recombinante de interés. Un vector de expresión (plásmido) construido para este fin permite la transferencia del ADN que codifica el gen de interés en la célula huésped que puede (sobre) expresar así de manera eficiente la proteína funcional.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula (III) solamente en dos etapas a partir del ácido ópticamente puro de fórmula (I), que se transforma en la amida ópticamente pura de fórmula (XI): cuya reducción, preferiblemente por BH3, NaBH4 o LiAIH4, da lugar al compuesto de fórmula (III).
Después, el compuesto de fórmula (III) bien se acopla con un compuesto de fórmula (XII): en el que X representa un átomo de halógeno, preferiblemente un átomo de yodo, bien se somete a una reacción de aminación reductora con un compuesto de fórmula (XIII) en presencia de un agente reductor: en el que R2 representa un grupo elegido entre CHO y CHR3R4, en el que R3 y R4 representan cada uno un grupo alcoxi (Ci-C6) lineal o ramificado, o bien forman junto con el átomo de carbono al que están unidos un ciclo 1 ,3-dioxano, 1 ,3-dioxolano ó 1 ,3-dioxepano, para dar lugar a la ivabradina, que después se transforma en una sal de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable, estando dicha sal en forma anhidra o hidratada.
El compuesto de fórmula (III) puede aplicarse igualmente en la reacción de aminación reductora en la forma de su sal de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable, preferiblemente su hidrocloruro. En este caso, la ivabradina se obtiene directamente en la forma de hidrocloruro.
Entre los ácidos farmacéuticamente aceptables, se pueden citar a título no limitativo los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, tártrico, maleico, cítrico, ascórbico, oxálico, metanosulfónico, bencenosulfónico y canfórico.
Entre los agentes reductores utilizables para la reacción de aminación reductora entre el compuesto de fórmula (III) y el compuesto de fórmula (XIII), se pueden citar a título no limitativo los compuestos donantes de hidruro tal como triacetoxiborohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio y dihidrógeno en presencia de un catalizador tal como paladio, platino, níquel, rutenio, rodio o uno de sus derivados, principalmente en forma soportada o en forma de óxidos.
El agente reductor preferido para la reacción de aminación reductora entre el compuesto de fórmula (III) y el compuesto de fórmula (XIII) es el dihidrógeno catalizado por paladio sobre carbón.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención .
Abreviaturas ATFA Ácido TriFluoroAcético CCM Cromatografía en Capa Fina DBU DiazaBicicloUndeceno DKR Dynamic Kinetic Resolution (Desdoblamiento cinético dinámico) DMF DiMetilFormamida DMSO DiMetiISulfÓxido DO Densidad Óptica E Coeficiente de enantioselectividad ee exceso enantiomérico eq equivalente molar HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía en fase líquida de alta resolución) IPTG IsoPropil ß-D-l-TioGalactopiranósido LB medio de cultivo Lysogeny Broth MeOH Metanol MTBE MetilTercButil Éter po pureza óptica o enantiomérica proporción E/S proporción Enzima/Sustrato, expresada en g/g RMN (Espectroscopia) Resonancia Magnética Nuclear SM Espectrometría de Masas THF TetraHidroFurano TMS TetraMetiISilano EJEMPLO 1 :Ácido (7S)-3,4-dimetoxibiciclo [4.2.0] octa-1 ,3,5-trien-7-carboxílico Sobreexpresión de la nitrilasa: La proteína nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 se describe en las bases de datos proteicas y genómicas. La secuencia del gen investigado está catalogada con el identificador SVA (Sequence Versión Archive) « EF467367 » en el ENA (European Nucleotide Archive) del EMBL-Bank. Esta secuencia corresponde a la referencia « A4LA85 » de la base de datos UniProtKB/TrEMBL.
Se ha utilizado la cepa de producción E. coli BL21 (DE3), transformada con el vector de expresión pET28a-Nit1.
El protocolo de sobreexpresión de la nitrilasa se describe en Applied Biochemistry and Biotechnology 2010, Vol 160(2), p 393-400.
Las células así transformadas se utilizan bien directamente en forma de sedimento bacteriano, bien liofilizadas antes de la utilización.
Hidrólisis enzimática con la nitrilasa sob eexpresada.
Las células transformadas según el protocolo anterior se ponen con agitación a una concentración de 5.6 x 109 células/mL (1 mL de cultivo con DO=1 (600 nm) corresponde a 1.109 bacterias y aproximadamente 10 mg de sedimento bacteriano ó 1.5 mg de liofilizado).
A una disolución de 250 mL de amortiguador fosfato KH2PO4/ Na2HP04 1/15 M a pH 7 se añaden 1 g de liofilizado de E. coli 500 mg (c=2 g/L, 10mM) de 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo en 2% de DMSO (5 mL).
El medio de reacción se mantiene a 30°C, con agitación giratoria 220 rpm durante 6 h.
La reacción se controla por HPLC en fase quiral en condiciones que permiten determinar el exceso enantiomérico del ácido y del nitrilo: Columna chiralpak IB 90 % n-hexano 10 % 2-PrOH + 0. 1 % de ATFA 1 mUmin 30 °C 288 nm coeficiente de enantioselectividad E = ln[1 -c(1 +ee(ácido))] / ln[1 -c(1 -ee(ácido))] El cromatograma de HPLC en fase qu'iral después de 6 h se representa en la Figura 1.
Después de 6 h de reacción, el medio de reacción se acidifica con HCI 1 M con el fin de obtener un pH muy ácido (pH 2), y se extrae con 2x100ml_ de diclorometano. La fase orgánica se retira. Una segunda extracción con tolueno (2x100mL) permite recuperar todo el producto restante en la fase acuosa. Las fases orgánicas se lavan con una disolución de NaCI saturada y se secan con sulfato de magnesio anhidro. Después de evaporar los disolventes, se obtiene el compuesto bruto que se purifica por cromatografía flash en columna de sílice en las condiciones siguientes: Tipo de columna: 80 g SiOH Macherey-Nagel Material y método: Reveleris ® Eluyente: ¡socrático (ciclohexano +1% de ácido acético / acetato de etilo +1% de ácido acético 75/25) Detección: UV 288 nm Caudal: 60 ml/min Resultado: Nitrilo (R): rendimiento 36 % (179 mg), ee (R): 96 % Ácido (S): rendimiento 39 % (246 mg), ee (S) 96% EJEMPLO 2:3,4-dimetoxibiciclo[4.2.01octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo por racemización del nitrilo (R) En un matraz equipado con un refrigerante y una agitación magnética, cargar 100 mg de (R)-(3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-tr¡en-7-¡l)nitrilo (0.53 mmoles), 5 mL de isopropanol y 121 mg de DBU (1.5 eq.). Calentar 2 h a 65°C y dejar que vuelva a temperatura ambiente. Filtrar para obtener el compuesto del título.
EJEMPLO 3: (7S)-3,4-Dimetoxi-N-metilbiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carboxamida Poner en suspensión el ácido (7S)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carboxílico obtenido en el ejemplo 1 (300 mg) en THF (3 mi) a temperatura ambiente y añadir trietilamina (200 µ?). Se añade cloroformiato de etilo (150 µ?) lentamente al medio. El medio de reacción precipita (medio I).
En otro matraz, se pone metilamina en disolución 2M en THF (2.25 mi) con agitación con agua (1 mi) y trietilamina (300 µ?). La agitación se mantiene durante 20 min, este medio se añade al medio I y se deja con agitación a temperatura ambiente durante una noche.
La mezcla de reacción se evapora y se purifica por HPLC preparativa.
La (7S)-3,4-dimetoxi-N-metilbiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carboxamida se obtiene con un rendimiento de 60%. 1H RMN (DMSO-d6, ppm / TMS) = 2.61 (m; 3H); 3.16 (m; 2H); 3.71 (s; 6H); 4.05 (m; 1 H); 6.78 (s; 1 H); 6.81 (s; 1 H); 7.78 (si; 1 H).
EJEMPLO 4: (7S)-3,4-Dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il] N-metil metanamina Poner en suspensión la (7S)-3,4-dimetoxi-N-met¡lbiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carboxamida obtenida en el Ejemplo 3 (450 mg) en tetrahidrofurano (20 mL) y añadir lentamente 1.6 mL de una disolución de LiAIH4 2M en tetrahidrofurano al medio de reacción a temperatura ambiente. Se observa una fuerte emanación gaseosa y el medio de reacción se vuelve límpido. Calentar el medio de reacción a reflujo durante 30 min.
Hidrolizar después de volver a temperatura ambiente, y después extraer con acetato de etilo. Secar sobre MgS04 y evaporar. El residuo obtenido se purifica por HPLC preparativa (eluyente: agua/acetonitrilo/ácido trifluoroacético de 98/2/0.2 a 20/80/0.2) en 30 minutos para dar lugar al producto del título con un rendimiento de 46%. 1H RMN (DMSO-d6, ppm / TMS) = 2.60 (m; 3H); 2.85 (m; 1 H); 3.15 (m; 1 H); 3.25 (dd; 1 H); 3.30 (m; 1 H); 3.62 (m; 1 H); 3.70 (s; 6H); 6.82 (s; 1 H); 6.89 (s;1 H); 8.48 (si; 1 H).
EJEMPLO 5: (7S)-3,4-Dimetoxibiciclo [4.2.0] octa-1,3,5-trien-7-¡l] N-metil metanamina, hidrocloruro Se añaden 20 mL de una disolución molar de BH3 en tetrahidrofurano a temperatura ambiente a la mezcla de 2.2 g (10 mmoles) de (7S)-3,4-dimetoxi-N-metilbiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carboxamida obtenida en el Ejemplo 3 en 45 mL de tetrahidrofurano. Después de 1 h con agitación, se añaden 10 mL de la disolución de BH3 en tetrahidrofurano. Después de una noche de agitación a temperatura ambiente, se añaden gota a gota 20 mL de etanol y la mezcla se agita hasta el final de la emanación gaseosa (1 h aproximadamente). Se añaden gota a gota 20 mL de una disolución de ácido clorhídrico en etanol. Después de 4 h con agitación, el precipitado obtenido (1.2 g de producto del título) se filtra. El filtrado se concentra y se obtienen 0.65 g adicionales de producto del título por concreción en una mezcla acetato de etilo/etanol 80/20.
Los dos precipitados se reúnen para dar lugar a 1.85 g del producto del título (Rendimiento 77%).
EJEMPLO 6: Hidrocloruro de la ivabradina En un autoclave, cargar 5.5 kg de 3-[2-(1 ,3-dioxolan-2-il)etil]-7,8-dimetoxi-1 ,3-dihidro-2H-3-benzazepin-2-ona, 27.5 I de etanol y 550 g de paladio sobre carbón.
Purgar con nitrógeno y con hidrógeno, calentar a 55°C e hidrogenar a esta temperatura bajo una presión de 5 bares hasta la absorción de la cantidad teórica de hidrógeno.
Volver a llevar a temperatura ambiente y descomprimir la autoclave.
Añadir 4 kg de hidrocloruro de (7S)-3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-il] N-metil metanamina, 11 I de etanol, 5.5 I de agua y 1 kg de paladio sobre carbón.
Purgar con nitrógeno y con hidrógeno, calentar a 85°C e hidrogenar a esta temperatura bajo una presión de 30 bares hasta la absorción de la cantidad teórica de hidrógeno.
Volver a temperatura ambiente, purgar el autoclave, filtrar la mezcla de reacción, destilar los disolventes y aislar el hidrocloruro de ivabradina por cristalización en una mezcla tolueno/1 -metil-2-pirrolidinona.
El hidrocloruro de ivabradina se obtiene así con un rendimiento de 85 % y una pureza química superior a 99 %.
EJEMPLO comparativo A: Cribado de nitrilasas comerciales para la hidrólisis enzimática del 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo En un tubo, pesar la nitrilasa estudiada en forma de liofilizado (15 mg) y añadir 4 mi de amortiguador 0.1 M KH2P04 a pH=7 y 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo (20 mg) solubiüzado en 100 µ? de DMSO.
Poner en el incubador a 28°C y 220 rpm.
La tasa de conversión se midió por HPLC al cabo de 24 h y 72 h.
Las nitrilasas NIT 101 , NIT 102, NIT 103, NIT 104, NIT 105, NIT 106, NIT 108, NIT 109, NIT 111 , NIT 112 y NIT 113 (Almac) no hidrolizan el nitrilo después de 24 h (no existe formación de ácido ni de amida).
Los resultados obtenidos con las nitrilasas NIT 107, NIT 1 10, NIT 114 y NIT 115 (Almac) se resumen en la tabla siguiente: Condiciones analíticas: columna phenomenex LUNA HST 50*3 C18(2) 2.5 m 0% a 100% de B en 8 min 0.8 ml/min 40"C A (1.000 agua+25 ACN+1 ATFA) B (1.000 ACN+25 agua+ 1 ATFA) La nitrilasa NIT 115 se aplicó en otro ensayo para determinar si la hidrólisis del nitrilo es enantioselectiva.
La nitrilasa NIT 1 5 (12 mg ; Almac) se utilizó en 6 mL [2 mg/mL] de amortiguador.
El 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo se añadió para conseguir una concentración final de 4 mg/mL en este último.
La enantioselectividad se midió por HPLC utilizando las condiciones analíticas siguientes: columna chiralpak IC 250*4.6 30% etanol absoluto + 0.1%ATFA + 70%heptano + 0.1%ATFA 1 ml/min 30 °C 288 nm Observación: en estas condiciones, los enantiómeros del ácido se separan, pero no los del nitrilo.
El cromatograma obtenido después de 5 h de reacción se representa en la Figura 2.
Conclusión: no se observa ninguna enantioselectividad.
EJEMPLO comparativo B: Cribado de nitriiasas de cepas bacterianas y fúngicas para la hidrólisis enzimática del 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo Un estudio utilizando varios inductores bacterianos (propionitrilo, benzonitrilo, 4-bromobenzonitrilo) ha mostrado que el propionitrilo permitía la mejor inducción de la actividad nitrilasa con el 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo.
Las cepas bacterianas se indujeron con propionitrilo a 72 mM durante 72 h, las células se recogieron en 50 mL (concentradas 2 veces, conc.10 mg/ml en células) de tampón fosfato 0.1 M KH2PO4/K2HPO4 a pH=7.3 y 3,4-dimetoxibiciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo añadido a la concentración de 10 mM en 2% de DMSO v/vfinai.
Las cepas fúngicas se indujeron con valeronitrilo.
El conjunto de los medios de reacción se pone con agitación 220 rpm a 30°C para las bacterias y a 27°C para los hongos y se sigue durante 96 H por HPLC en fase inversa y por HPLC en fase quiral según los métodos descritos a continuación: Análisis en fase inversa columna phenomenex LUNA HST 50*3 C18(2) 2.5 pm 0% de B a 100% de B en 8 min 0.8 ml/min 40°C A (1.000 agua+25 ACN+1 ATFA) B (1.000 ACN+25 agua+ 1 ATFA) Análisis en fase quiral columna chiralpak IC 250*4.6 30% etanol absoluto + 0.1%ATFA + 70%heptano + 0. 1%ATFA 1 ml/min 30 °C 288 nm Los resultados obtenidos se resumen en la tabla siguiente: EJEMPLO comparativo C: Hidrólisis enzimática del biciclo[4.2.0]octa-1,3,5-trien-7-carbonitrilo con la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 sobreexpresada Reparto en placas de LB+agar+kanamicina, incubación estática a 37°C durante 24 h (Cepa 1 1216 de nitrilasa de E. coli recombinante).
Precultivo en 5 mi de LB+kanamicina (50 mg/l), incubación a 37°C, 180 rpm durante una noche.
Cultivo: poner 50 mi de LB y 500 µ? de precultivo en frascos erlenmeyer de 250 mi sin deflectores, incubación a 28°C, 160 rpm hasta que la DO sea igual a 0.6 (es decir, aproximadamente 4 h).
Inducción con IPTG (0.5mM), incubación a 17°C, 160 rpm durante una noche (17 horas).
Ensayo de actividad: centrifugar los cultivos a 4°C, 6.000 rpm durante 20 minutos, resuspender el sedimento en 10 mi de amortiguador fosfato 0.1 M pH 7. Añadir biciclo[4.2.0]octa-1 ,3,5-trien-7-carbonitrilo (10mM) +2% de etanol. Incubar a 220 rpm, 30°C.
Observación: si el cultivo tiene más de 50 mi en el momento de la centrifugación se toman 50 mi y se hace el ensayo de actividad con un sedimento de 50 mi de cultivo.
Seguimiento de la hidrólisis por cromatografía quiral: a 45 min y 2 h.
Columna: Phenomenex® LUNA HST 50*3 C18(2) 2.5 µm Eluyente: A +B (de 0% a 100% de B en 8 min) A: 1.000 agua+25 ACN+1 ATFA B: 1.000 ACN+25 agua+1 ATFA 0.8 ml/min - 40°C - UV 210 nm Resultados: El seguimiento por cromatografía quiral muestra que la reacción no es enantioselectiva.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula (I) caracterizado porque es ópticamente puro: por hidrólisis enzimática enantioselectiva del nitrilo racémico o no ópticamente puro de fórmula (IV): mediante la nitrilasa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216 sobreexpresada en otro organismo que posee un sistema biológico competente, en una mezcla de un disolvente orgánico y de una disolución acuosa a pH de 5 a 10, a una concentración de 1 a 500 g de nitrilo de fórmula (IV) por litro de mezcla de disolventes, en una proporción E/S de 1/1 a 1/100, a una temperatura de 25°C a 40°C.
2. - Procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el organismo que posee un sistema biológico competente es una bacteria que contiene un plásmido reorganizado.
3. - Procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado por que las bacterias que sobreexpresan la nitrilasa se utilizan directamente, en forma de sedimento bacteriano o de liofilizado.
4.- Procedimiento conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el disolvente orgánico se elige entre dimetilsulfóxido, DMF, acetona, acetonitrilo, etanol, ¡sopropanol, THF y MTBE.
5.- Procedimiento de síntesis de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el nitrilo de configuración (R), producto secundario de la reacción: se racemiza por acción de una base en nitrilo racémico de fórmula (IV) para reciclarse en el proceso de hidrólisis enzimática.
6. - Procedimiento de síntesis de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque la base es DBU.
7. - Procedimiento de síntesis de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque la etapa de racemización se efectúa in situ.
8.- Procedimiento de síntesis de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque el ácido de fórmula (I) se aisla después de uno o varios ciclos de hidrólisis enzimática.
9.- Procedimiento de síntesis del compuesto de fórmula (III), caracterizado porque: a partir del nitrilo de fórmula (IV): que se hidroliza en ácido ópticamente puro de fórmula (I): de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se transforma en la amida ópticamente pura de fórmula (XI): cuya reducción da lugar al compuesto de fórmula (III).
10. - Procedimiento de síntesis de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la reducción del compuesto de fórmula (XI) en compuesto de fórmula (III) se efectúa por BH3, NaBH4 o LiAIH .
11. - Procedimiento de síntesis de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque, después, el compuesto de fórmula (III) bien se acopla con un compuesto de fórmula (XII): en el que X representa un átomo de halógeno, bien se somete a una reacción de aminación reductora con un compuesto de fórmula (XIII) en presencia de un agente reductor: en el que R2 representa un grupo elegido entre CHO y CHR3R4, en el que R3 y R4 representan cada uno un grupo alcoxi (C-i-C6) lineal o ramificado, o bien forman junto con el átomo de carbono al que están unidos un ciclo 1 ,3-dioxano, 1 ,3-dioxolano ó 1 ,3-dioxepano, para dar lugar a la ivabradina, que después se transforma en una sal de adición a un ácido farmacéuticamente aceptable en forma anhidra o hidratada.
12. - Procedimiento de síntesis de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado porque X es un átomo de yodo.
13. - Procedimiento de síntesis de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado porque compuesto de fórmula (III) se aplica en la reacción de aminación reductora en la forma de su hidrocloruro, para dar lugar a la ivabradina en la forma de hidrocloruro.
14. - Procedimiento de síntesis de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 13, caracterizado porque la reacción de aminación reductora con el compuesto de fórmula (XIII) se efectúa en presencia de dihidrógeno catalizado por paladio sobre carbón.
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