MX2013013509A - Cepa paenibacillus alvei ts-15 y su uso en el control de organismos patogenicos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una bacteria aislada designada Paenibacillus alvei TS-15 para uso como un agente de biocontrol en la inhibición y/o eliminación de un patógeno humano precedente de los alimentos, por ejemplo, Salmonela, o una planta u órgano de planta, por ejemplo, tomate o plante de tomate. TS-15 o sus mutantes también pueden utilizarse en el control de patógenos de planta.

Description

CEPA PAENIBACILLUS ALVEI TS-15 Y SU USO EN EL CONTROL DE ORGANISMOS PATOGENICOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una nueva y única, cepa de la bacteria identificada como cepa Paenibacillus alvei TS-15 y su uso y/o el uso de cualquiera de sus imitantes en el control y/o eliminación de la contaminación de la contaminación de organismos patogénicos, incluyendo especialmente Salmonela, que puede causar enfermedades o afecciones en plantas o animales .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La prevención de afecciones relacionadas con los alimentos (o afecciones procedentes de los alimentos) por contaminación microbiana es una preocupación principal en la industria de los alimentos, agencias reguladoras, y consumidores alrededor del mundo. Las afecciones procedentes de los alimentos están en el intervalo entre las más serias de preocupación de salud pública y pueden ser causadas por cualqµier número de tipos de patógenos, incluyendo, por ejemplo, bacterias, virus, parásitos, y priones, así como toxinas producidas por tales patógenos. Los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) estiman que, en E.U.A. cada año, se enferman 76 millones de personas, más de 325,000 personas se Ref. 244948 hospitalizan, y 5,000 personas mueren de afecciones procedentes de los alimentos. El costo estimado de tales afecciones se estima en el intervalo de $10-83 billones cada año, que representan gastos médicos, productividad reducida, y dolor y sufrimiento general, entre otros costos.

Un intervalo de alimentos está asociado con afecciones procedentes de los alimentos, incluyendo productos frescos. Los productos se reconocen como un componente importante de la dieta sana porque es una fuente básica de vitaminas, minerales, fibras, y antioxidantes. Los productos pueden jugar un papel importante en la administración del peso también. Debido a que la mayor parte de los productos se cultivan en entornos naturales, son vulnerables a la contaminación con patógenos. Los factores que pueden afectar el grado del tal contaminación incluyen la calidad del agua agrícola, y el uso de estiércol como fertilizante, la presencia de los animales en los campos o las áreas de empaque, y la salud e higiene de los trabajadores que manejan los productos durante la producción, empaque o preparación. El hecho de que el producto por lo general se consume crudo sin ningún tipo de intervención para controlar o eliminar los patógenos antes del consumo, contribuye a su potencial como una fuente de afecciones procedentes de los alimentos.

La CDC estima que, en los 1990' s, al menos 12 por ciento de las afecciones procedentes de los alimentos estuvo enlazado con los artículos de productos frescos. Durante la década pasada, el gobierno federal ha enfocado recursos significativos en la reducción de afecciones procedentes de los alimentos de todas las fuentes. Sin embargo, a pesar de estos esfuerzos, las afecciones procedentes de los alimentos asociadas con productos frescos continúan siendo documentadas. La persistencia de afecciones procedentes de los alimentos asociada con los productos frescos puede atribuirse a un número de factores, pero muchos casos son previsibles. Dada la importancia del consumo de productos y su papel central en una dieta sana, es imperativo que el número de casos de afecciones procedentes de los alimentos asociados con el producto se reduzcan.

Muchos incidentes de afecciones procedentes de los alimentos relacionadas con el producto se refieren a salmonelosis , que pueden ser causada por la ingestión de productos frescos, plantas, frutas o vegetales, u otros productos relacionados con el producto que está contaminado o contiene varias especies no tifoideas de la bacteria de la Salmonela bacteria. Las infecciones por Salmonela causan fiebre y síntomas relacionados gastrointestinales, incluyendo diarrea, vómito y- calambres abdominales de 12 a 72 horas después de la infección. En la mayor parte de los casos, la afección dura de 4 a 7 días y la mayor parte de las personas se recuperan sin tratamiento. Sin embargo, en algunas la diarrea puede ser tan severa que el paciente se deshidrata peligrosamente y requiere hospitalización. El tratamiento puede incluir fluidos intravenosos que combaten la deshidratación, y pueden darse medicamentos, que incluyen antibióticos y medicamentos anti-fiebre para proporcionar alivio sintomático y/o eliminar la infección. En casos severos, la infección por Salmonela puede diseminarse desde los intestinos a la" sangre, y después a otros sitios del cuerpo, y puede causar la muerte a menos que la persona se s tratada rápidamente con antibióticos. Los adultos mayores, niños y los que tienen sistemas inmunitarios alterados es más probable que desarrollen afecciones severas. Algunas personas afligidas son salmonelosis posteriormente experimentan artritis, que puede tener efectos incapacitantes de larga duración.

La contaminación del producto, tal como los jitomates, por patógenos como Salmonela puede ocurrir prácticamente en cualquier punto en la cadena de suministro del producto, es decir, en cualquier punto entre la granja y el mercado. Los puntos vulnerables en la cadena de suministro pueden incluir antes de, durante o después de la siembre, durante la producción en campo abierto o invernadero, la cosecha, en el campo de empaque o planta de embalaje, operaciones de distribución, ventas de alimentos al menudeo, y ventas y preparaciones de servicios de alimentos. Además, la tierra misma ya puede estar contaminada con los organismos antes de utilizar la tierra. Por ejemplo, la tierra puede ser el objetivo de escape de los desperdicios de animales relacionados con la granja que está contaminada con Salmonela.

Las cosechas de productos aparte de proveer un vehículo para ciertos patógenos humanos o de animal, también por lo general sufren significativamente de una amplia variedad de enfermedades de planta, la aparición de las cuales pueden causar una marcada reducción en la producción de las cosechas, la calidad y apariencia de producto, y el valor general .

Dependiendo de una cosecha particular, las enfermedades pueden ser causadas por cualquier número de diferentes tipos de patógenos de planta, incluyendo los que son de bacteria, virus, hongos u otros parásitos.

Como un medio para controlar ambos patógenos de planta y humano/animal, ha habido un amplio arreglo de estrategias previamente implementadas o que continúan siendo utilizadas. Algunas de estas estrategias en general se refieren al control del ambiente de cultivo, el uso de cultivares resistentes a la enfermedad, la aplicación de fungicidas o bactericidas agrícolas y hortícolas, y el control biológico de las enfermedades mediante el uso de materiales orgánicos o similares. De estos, el uso de fungicidas o bactericidas agrícolas y hortícolas u otros agentes anti -patógeno es directo y por lo general más efectivo. Sin embargo, la aplicación de una gran cantidad de los fungicidas o bactericidas es claramente indeseable debido a los efectos dañinos resultantes en el ambiente y la fauna silvestre que se pone en contacto con la región tratada o sus productos. Además, por lo general se utiliza una pluralidad de químicos fungicidas y/o bactericidas para combatir el potencial para resistencia, por lo tanto aumentando el nivel de tales químicos y sus efectos negativos en el ambiente.

Con el fin de resolver el problema de excesiva dependencia en el uso de tales agroquímicos dañinos, se han desarrollado métodos para el control de varias enfermedades de plantas de cultivo y/o patógenos de humano/animal que contaminan tales plantas de cultivo que utilizan agentes de biocontrol naturales. Tales microorganismos pueden ser enemigos naturales de los patógenos objetivo que buscan ser controlados o erradicados, o pueden modificarse genéticamente para ser capaces de migrar o aún eliminar plantas indeseadas y/o patógenos de humano o animal en plantas de cultivo. Sin embargo, la eficacia de tales agentes aún no es suficiente. Los retos presentados en el desarrollo de un agente de biocontrol microbiano efectivo pueden incluir, por ejemplo, pobre supervivencia una vez colocado en contacto con los cultivos o los productos mismos y baja efectividad de la actividad anti-patógeno del agente. Adicionalmente , es en su mayor parte el caso en donde los agentes de biocontrol antimicrobiano se han desarrollado para el control de patógenos a base de plantas, en lugar del control de patógenos de humano o animal asociados con las plantas.

Por consiguiente, los agentes de biocontrol microbianos mejorados que son más efectivos contra patógenos, tienen mayor continuidad una vez que se liberan en el ambiente sin dañar humanos, y que son simultáneamente más efectivos contra ambos patógenos de planta y de human/animal patógenos serían altamente deseables en la técnica.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la identificación de una cepa recién aislada de Paenibacillus alvei y su uso como un agente de biocontrol en el control y/o eliminación de patógenos de planta y/o patógenos de humano o animal que están presentes en o dentro de la planta y órganos de planta, por ejemplo, plantas enteras, frutas y/o flores, y en particular, aquellas plantas que están asociadas con la producción de productos de producción de consumidor, tales como, tomates, pimientos, y otra frutas, vegetales y verduras. La presente invención además se refiere a la cepa Paenibacillus alvei TS-15, que has sido primero descubierta e identificada por los inventores de la presente clasificando la flora nativa de varias tierras de labranza de productos localizadas en la costa media del Atlántico de E.U.A. para posibles bacterias con actividad antagonista contra varios patógenos procedentes de alimentos, incluyendo Salmonela Newport y otros patógenos procedentes de alimentos entéricos, y qué podrían servir, después de la reintroducción como un agente de biocontrol de esos patógenos. De esta forma, la invención se refiere a la identificación y el uso de la cepa Paeníbacillus alvei TS-15— o sus mutantes— como un agente de biocontrol en la provisión de productos— especialmente productos, tales como plantas de tomate y sus órganos— que están libres de contaminación por Salmonela, otros patógenos bacterianos entéricos, y otros patógenos procedentes de los alimentos humanos debido a las actividades antagonistas de TS-15 contra estos organismos.

De esta forma, en otro aspecto, por extensión, la presente invención se refiere al control de afecciones humanas procedentes de los alimentos causadas por esas bacterias patogénicas, tales como, Salmonela, que persisten en cultivos a base de- productos y que son susceptibles de ser inhibidos (por ejemplo, actividad bacteriostática) o aniquilados (actividad bactericida) por el TS-15 de la invención, o mutantes de TS-15 que están dentro del alcance de la invención.. También por extensión, la presente invención también se refiere al control de enfermedades de plantas que son causadas por patógenos de planta que son susceptibles de ser inhibidos (por ejemplo, actividad bacteriostática) o aniquilados (actividad bactericida) por el TS-15 de la invención, o mutantes de TS-15 que están dentro del alcance de la invención.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden la cepa TS-15 para utilizarse como un agente de bio-control que puede suministrarse a una planta u órgano de planta (por ejemplo, semilla, hoja, tallo, raíz, flor, fruto) o como un pre-tratamiento de la tierra antes del cultivo de las plantas objetivo, que es capaz de inhibir o aniquilar patógenos de planta y/o humano o animal en las plantas objetivo. En aún otro aspecto, las composiciones de la invención que comprenden la cepa TS-15 para uso como un agente de biocontrol también pueden comprender un medio de cultivo especializado que favorece el crecimiento y proliferación de TS-15, pero no del patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela . En aún un aspecto más, el medio de cultivo especializado puede favorecer o promover el crecimiento y/o proliferación de TS-15, pero es inhibidor contra el crecimiento y/o proliferación de un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela. En una modalidad especifica, el medio de cultivo contiene D-glucosa como una sola fuente de carbono.. En otra modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-Melezitosa como una sola fuente de carbono. En aún otra modalidad, el medio de cultivo contiene una combinación de D- glucosa y D-Melezitosa como las únicas fuentes de carbono. En otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas— y la única fuente de nitrógeno es provista por extracto de levadura. En aún otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas y la única fuente de nitrógeno es provista por (NH^HPC^ (fosfato de amonio, dibásico) .

En aún un aspecto más, dado que TS-15 es no patogénico para humanos y animales, TS-15 puede ser provisto como un probiótico y administrarse en una cantidad terapéuticamente efectiva a un sujeto que está en riesgo de desarrollar o que ya ha desarrollado afecciones procedentes de los alimentos, tales como, salmonelosis. De esta forma, la presente invención también se refiere al uso terapéutico de TS-15— o uno de sus mutantes efectivos— como un tratamiento a base de probiótico de afecciones procedentes de los alimentos, incluyendo,' especialmente, salmonelosis.

Los inventores de la presente buscan identificar nuevos y naturales medios para proteger el suministro de alimentos de patógenos procedentes de alimentos, por ejemplo, especies de Salmonela. La flora nativa de varias plantas asociadas con el producto, así como plantas asociadas en proximidad a tierras de cultivo de producto, se clasificaron para posible bacteria epifítica con actividad antagonista contra Salmonela Newport, y en otras bacterias entéricas. Utilizando el sistema de clasificación in vitro multi-fase, el aislamiento de varias bacterias asociadas con la planta natural se descubrieron del ambiente que bloquea el crecimiento de S. Newport. El proceso de clasificación reveló dos cepas de bacterias inhibidoras de Salmonela competitivas denotadas coma A6-6i-x y TS-15.

Se ha descubierto que TS-15 tiene actividad antagonista contra varios patógenos de planta también, y de esta forma, la invención contempla el uso de la cepa como un agente de biocontrol de enfermedades de plantas que afectan los cultivos relacionados con el producto, tales como, enfermedades de plantas de tomate.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para la clasificación e identificación de nuevos microorganismos de existencia natural, en particular, la cepa TS-15 y sus mutantes, que tienen actividades antagónicas -y/o inhibidoras contra patógenos procedentes de alimentos, incluyendo, por ejemplo, Salmonela Newport y otros patógenos bacterianos entéricos, así como ciertos patógenos de planta.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a las cepas de bacteria epifítica, en particular, la cepa TS-15 y sus mutantes, con actividad antagónica y/o inhibidora contra patógenos procedentes de alimentos, incluyendo, por ejemplo, Salmonela Newport y otros patógenos bacterianos entéricos, así como ciertos patógenos de planta.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a la caracterización de la bacteria antagónica identificada por los procesos de la invención como teniendo propiedades bactericidas y/o bacteriostáticas significativas contra Salmonela, por ejemplo, S. Newport. En particular, la cepa TS-15 es una bacteria formadora de endosporas Gram-positiva, anaeróbica facultativa que tiene propiedades bactericida y/o bacteriostática contra Salmonela y otras bacterias entéricas.

En aún un aspecto más, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden uno o más microorganismos antagonistas identificados por los métodos de la invención, en donde las composiciones pueden estar en la forma de un rocío, gránulo, líquido, gel, espuma, o similar, y que puede adaptarse para ser administrado a una planta u órgano de planta, por ejemplo, semilla, hoja, fruta, raíz, o planta entera, como un medio para controlar, inhibir o erradicar el crecimiento de patógenos procedentes de alimentos humanos y/o patógenos de planta localizados en la planta, u órgano -. de planta. En ciertas modalidades, las composiciones pueden contener un medio de cultivo que promueve el crecimiento y/o proliferación de TS-15, pero es inhibidor contra el crecimiento y/o proliferación de un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela. En una modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-glucosa como una sola fuente de carbono. En otra modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-Melezitosa como una sola fuente de carbono. En aún otra modalidad, el medio de cultivo contiene una combinación de D-glucosa and D-Melezitosa como las únicas fuentes de carbono. En otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas y la única fuente de nitrógeno es provista por extracto de levadura. En aún otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas y la única fuente de nitrógeno es provista por (NH4)2HP04 (fosfato de amonio, dibásico) . El medio de crecimiento de la invención también puede decirse que "estimula" el cultivo de TS-15 o uno de sus mutantes, mientras se convierte en inhibidora contra el crecimiento un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela .

En aún un aspecto más, la presente invención también se refiere a la caracterización del perfil de antibiótico de un agente de biocontrol identificado por los métodos de la invención a ser efectivo en el control, inhibición o erradicación del cultivo de un patógeno humano procedente de alimentos, tal como, Salmonela. En un aspecto particular, la invención provee la identificación de uno o más antibióticos, por ejemplo, un antibiótico peptídico, que son antagonistas efectivos de un patógeno procedente de alimentos y/o que inhibe el establecimiento de colonias de productos o aún que puede erradicar patógenos procedentes de alimentos de productos u otros tipos de alimentos. En ciertos aspectos, los agentes de biocontrol descubiertos de la invención no son dañinos o patogénicos para el sujeto que experimenta el tratamiento, por ejemplo, un ser humano tratado por infección causada por procedencia de alimentos. De esta forma, en otro aspecto, los agentes de biocontrol de la invención, por ejemplo, la cepa TS-15 o sus mutantes, pueden administrarse como un probiótico a un sujeto que tiene ' o está en riesgo de tener afecciones procedentes de los alimentos, tales como, salmonelosis .

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones de probióticos farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, líquidos, rocíos, pildoras o polvos, para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene una afección procedente de los alimentos, por ejemplo, salmonelosis, en donde tales composiciones comprenden la cepa TS-15 o uno de sus mutantes. La composición también puede estar en la forma de un alimento, tal como, por ejemplo, yogurt o una bebida de yogurt. La composición de probiótico puede formularse para contener un medio de cultivo que promueve el crecimiento y/o proliferación de TS-15, pero es inhibidor contra el crecimiento y/o proliferación de un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela . En una modalidad i específica, el medio de cultivo contiene D-glucosa como una sola fuente de carbono. En otra modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-Melezitosa como una sola fuente de carbono. En aún otra modalidad, el medio de cultivo contiene una combinación de D-glucosa y D-Melezitosa como las únicas fuentes de carbono. En otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas y la única fuente de nitrógeno es provista por extracto de levadura. En aún otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa— o una combinación de ambas y la única fuente de nitrógeno es provista por (NH4)2HP04 (fosfato de amonio, dibásico) .

En un aspecto particular, la invención se refiere a la cepa aislada Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes que es capaz de inhibir o eliminar el cultivo del patógeno humano procedente de alimentos en una planta u órgano de planta, o un patógeno de planta.

En otro aspecto particular, la invención se refiere a una combinación para inhibir o eliminar el cultivo de un patógeno humano en la superficie de una planta u órgano de planta que comprende un extracto extracelular de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes.

En aún otro aspecto particular, la invención se refiere a un método para inhibir, eliminar o prevenir el cultivo de un patógeno humano en la superficie de o dentro de una planta u órgano de planta que comprende poner en contactó la planta u órgano de planta con una composición que comprende la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes, en donde la planta u órgano de planta se pone en contacto con la cepa TS-15 durante cualquiera de las etapas de cultivo, procesamiento o distribución. En modalidades, la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei o uno de sus mutantes se pone en contacto con plantas dentro de las 72 horas después del trasplante de la planta. En modalidades relacionadas, la planta es un semillero inmaduro. En modalidades, la composición se pone en contacto con el semillero inmaduro cuando el semillero se planta inicialmente . En modalidades relacionadas, el semillero inmaduro inicialmente se cultiva en un invernadero .

En aún otro aspecto, la' invención provee un método para elaborar un mutante de la cepa TS-15 de Paenibacillus la cepa TS-15 que comprende, mutagenizar la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei y después aislar uno o más mutantes candidato que retienen el mismo o sustancialmente el mismo nivel de actividad antagonista como el progenitor de la cepa.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un kit que puede utilizarse para tratar plantas y órganos de planta de tal forma que los patógenos de planta y/o humano o animal presentes sobre o dentro de la planta se inhiben o aún se erradican.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un kit para el tratamiento de una planta u órgano de planta in vitro i in situ, tal planta u órgano de planta estando contaminado con el patógeno humano procedente de alimentos o patógeno de planta, en donde el kit comprende la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei o uno de sus mutantes.

En aún otros aspectos, la invención se refiere a un kit para el tratamiento de una planta u órgano de planta in vitro o in situ, tal planta u órgano de planta estando contaminado con patógeno humano procedente de alimentos o patógeno de planta, en donde; el kit comprende un extracto extracelular de la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei — o uno de sus mutantes— o un antibiótico obtenido de la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei es bacteriostático o bactericida contra el patógeno u otro agente activo producido por TS-15 o uno de sus mutantes que inhibe el cultivo de o aniquila el patógeno de una planta o humano/animal , en particular Salmonela .

En ciertas modalidades, los kits o cualquiera de las composiciones de la invención pueden comprender un medio de cultivo que promueve el crecimiento' y/o proliferación de TS-15, pero es inhibidor contra el crecimiento y/o proliferación de un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela . En una modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-glucosa como una sola fuente de carbono. En otra modalidad específica, el medio de cultivo contiene D-Melezitosa como una sola fuente de carbono. En aún otra modalidad, el medio de cultivo contiene una combinación de D-glucosa and D-Melezitosa como las únicas fuentes de carbono. En otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa (o una combinación de ambas) y la única fuente de nitrógeno es provista por extracto de levadura. En aún otra modalidad, la única fuente de carbono en el medio de cultivo es ya sea D-glucosa o D-Melezitosa (o una combinación de ambas) y la única fuente de nitrógeno es provista por {NEL^HPO-t (fosfato de amonio, dibásico) .

En varias modalidades de los aspectos anteriores, el patógeno procedente de alimentos puede ser de Salmonela entérica serovar Newport . En aún otras modalidades, el patógeno procedente de alimentos puede ser E. coli 0157 :H7. En aún otras modalidades, el patógeno procedente de alimentos puede ser una especie de Salmonela, Escherichia, Escherichia , Shigella, Enterobacter y Estafilococo.

En otras modalidades, la planta u órgano de planta puede ser un fruto o vegetal producidos por la planta, por ejemplo, un tomate. En ciertas modalidades, la planta u órgano de planta es el de una planta de tomate y/o pimiento, incluyendo plantas de la familia de las Solanáceas y de la familia de los Pimientos. Las plantas u órganos de plantas también pueden ser otros que son fuentes comunes de patógenos procedentes de alimentos, tales como, pero no limitándose a verduras frondosas, apio, y otros vegetales culinarios, vegetales de vaina, vegetales de bulbo y tallo, vegetales de raíz'! y tubérculos, así como ciertos frutos, tales como,, melón. Los patógenos de planta pueden incluir, por ejemplo, Clavibacter michiganensis pv. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonla solanacearum, y Erwinia carotovora subsp . carotovora, entre otros patógenos de plantas en las de la familia de los Pimientos.

Estas y otras modalidades se describen o son obvias de y están abarcadas por la siguiente Descripción Detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La' siguiente descripción detallada, dada a manera de ejemplo, pero no prevista para limitar la invención solamente a las modalidades específicas descritas, puede entenderse mejor junto con las figuras anexas.

Las FIGS .. 1A- IB. proporcionan imágenes microscópicas de luz de la cepa A6-6i-x y TS-15 teñidas. Fig. 1A - las células se tiñeron con el tinte Gram. Fig. IB - las células se tiñeron con el tinte de endospora .

Las FIGS. 2A-2F son fotografías de los resultados de un ensayo de tapón agar in vitro para evaluar los efectos de la cepa TS-15 P. alvei en la inhibición del crecimiento de patógenos procedentes de alimentos: Fig. 2A E. coli 0157 :H7; Fig. 2B Enterobacter sakazakii; Fig. 2C Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRS A) ; Fig. 2D Salmonela entérica serovar Newport ; Fig. 2E Shigella flexneri; y Fig. 2F Escherichia monocytogen.es en "el día 1, día 2 y día 4 del cultivo en la placa de agar in vitro. El experimento se repitió por duplicado con resultados similares.

Las FIGS. 3A-3B comparan la efectividad antagonista entre TS-15 y A6-6i-x contra S. Newport. Fig. 3A Muestra una gráfica de barras de las zonas de inhibición medida del ensayo de tapón S. Newport. La a es la zona de inhibición inicial mientras que la ß es el crecimiento sobre la zona muerta. Fig. 3B Una curva de crecimiento de S. Newport que muestra la diferencia entre los dos antagonistas y una curva de crecimiento del caldo estándar.

La FIG. 4 es una gráfica que compara el diámetro de la zona de inhibición (mm) medida en el día 1, día 2 y día 4 después de la inoculación utilizando un ensayo de tapón de agar in vitro TS-15 y A6-6i-x contra Salmonela entérica serovar Newport. Enterobacter sakazakii, Escherichia monocytogenes , E. coli 0157 :H7; Shigella flexneri, Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA#8) , Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA#12), Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA#17) , y Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA#29) . Se utilizó un ensayo de tapón de agar in vitro para evaluar la inhibición del crecimiento. El diámetro de la zona de 'inhibición' se midió en el día 1, día 2, y día 4. Se calcula el promedio de las zonas de 'inhibición' de TS-15 y A6-6Í-X contra patógenos principales de procedentes de alimentos indicado anteriormente (n=6) . Las barras de Error representan la desviación estándar.

Las FIGS . 5A-5B son gráficas que describen la inhibición del crecimiento de patógenos principales procedentes de alimentos en sobrenadantes de cultivo libre de células (CFCS, por sus siglas en inglés) P. alvei TS-15 y A6-6i-x. Fig. 5A. Describe los efectos de TS-15 en el cultivo de cepas E. coli 0157 :H7, E. sakazakii, S. Newport, S. flexneri, L. monocytogenes, y MRS en caldo de soja de tripticasa (TSB, por sus siglas en inglés) . El crecimiento se midió determinando los aumentos en la densidad celular (DOS00) a intervalos de 20 min utilizando un instrumento Bioscreen. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos. Fig. 5B- Describe los efectos de A6-6i-x en. el cultivo de las cepas E. coli 0157 :H7, E. sakazakii, S. Newport, S. flexneri, L. monocytogenes, y MRSA en caldo de soja de tripticasa (TSB) . El crecimiento se midió mediante la determinación de los aumentos en densidad celular (DO600) a intervalos de 20 minutos utilizando un instrumento Bioscreen. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos. Ver leyenda para la identidad de las cepas ensayadas.

Las FIGS . 6A-6B muestran gráficas que describen la recuperación de S. Newport de las superficies de la fruta del tomate intactas después del tratamiento con inoculaciones antagonistas de TS-15 o A6-6i-x. En la Fig:. 6A', S.- Newport se inoculó antes de la inoculación con el TS-15 o A6-6i-x. En la Fig. 6B, TS-15 o ?6-6?-? se inocularon antes de la inoculación con S. Newport. Los datos reflejan el promedio de dos experimentos .

Las FIGS. 7A-7D son un grupo de dispersogramas que describen la recuperación de una cepa S. Newport atenuada de plantas de tomate, incluyendo florecimiento, hojas, y fruto del tomate. En el estudio de túnel alto, S. Newport se recuperó de las hojas, florecimiento y tomates después de inoculación por 0, 1, 2, 3, y 5 (para florecimiento) o 6 (para · hojas y tomates) días con S. Newport solamente o S. Newport y una co- inoculación antagónica con TS-15. Los resultados se cuadran para cada combinación de ubicación de planta, antagonista, planta, y día. La recuperación estimada de S. Newport en cada punto de muestra de los datos transformados log en el tratamiento del panel de control (-) y antagonista (+) panel se graficaron en dispersogramas para hojas (Fig. 7A) , florecimiento (Fig. 7B) , y tomate (Fig. 7C) . La Fig. 7D provee una gráfica que resume los resultados de las Figs . 7A-7C.

La FIG. 8 es un dispersograma que muestra plantas con niveles detectables de Salmonela después de la inoculación. En la configuración de tune alto, las hojas, florecimiento y tomates se cosecharon en el día 0, día 1, día 2, día 3, y día 5 (para florecimiento) o día 6 (para hojas y tomates) después de la inoculación para recuperar cualquier S. Newport restante. El porcentaje de plantas que tuvieron un nivel detectable de S. Newport en el tratamiento de los grupos de control (círculo azul) y antagonista (círculo púrpura) se calcularon y graficaron para cada punto en el tiempo después de la inoculación.

La FIG. 9 provee una gráfica que muestra la persistencia de P. alvei TS-15 en plantas de tomate. Se utilizó un método de aspersión para inocular la planta de tomate incluyendo hojas, florecimiento, y tomates, y tierra de lechos de plantación en un campo de tomates localizado en Accomack, Virginia. La supervivencia de TS-15 en diferentes sitios de inoculación se observó en el día 0 (3 horas después de la inoculación), día 1, día 2, día 3, y día 4 post- inoculación. El número de muestras son TS-15. detectable se contó.

Las FIGS. 10A-10B describen el cultivo de P. alvei TS-15 en medio mínimo (MN) con diferentes fuentes de carbono. Utilizando levadura como la única fuente de nitrógeno, P. alvei TS-15 se cultivó en M con combinación de D-glucosa (DG) , D-melezitosa (DM) , D-turanosa (DT) , y DM-gelatina, respectivamente. El cultivo de P. alvei TS-15 (Fig. 10A) y su efecto inhibidor contra S. Newport (Fig. 10B) se midió determinando el aumento en la densidad celular (DO600) a intervalos de 20 minutos utilizando un instrumento Bioscreen. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos .

La FIG. 11 describe el cultivo de P. alvei TS-15 en' medio mínimo con diferentes fuentes de nitrógeno. P. alvei TS-15 se cultivó en MN con combinación de fuentes de nitrógeno seleccionadas ((NH4)2HP04, triptona, y levadura) y fuentes de carbono (D-glucosai, D-melezitosa, y D-turanosa) . El cultivo de TS-15 se midió determinando el aumento en la densidad celular (DO600) a intervalos de 20 minutos utilizando un instrumento Bioscreen. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos.

La FIG. 12 caracteriza el cultivo de S. Newport en sobrenadante de cultivo sin célula (CFCS, por sus siglas en inglés) . El crecimiento de S. Newport en 10 kDa y 5 kDa filtrados y retenatos MWCO, respectivamente, se midió determinando el aumento en la densidad celular (DO600) a intervalos de 20 minutos utilizando un instrumento Bioscreen. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos .

La FIG. 13 es un diagrama que describe un método de paso por paso para inocular y procesar tomates para ensayar la efectividad de Paenibacillus de la invención contra patógenos procedentes de alimentos. Paso 1: Los círculos se marcan en los tomates con un marcador permanente que había sido lavado con agua y después esterilizado con alcohol. Paso 2: 20 µ? de un cultivo nocturno de 107 cfu/ml de S. Newport suspendido en PBS se midieron con pipeta en el círculo. Paso 3: S. Newport se dejó secar con aire. Paso 4: 40 µ? del antagonista se re-suspendidos en TSB fresco se colocaron arriba del punto de S. Newport. Paso 5: Los tomates se dejaron secar en una cámara de humedad. Paso 6: Se agregaron 1.5 L de agua al fondo de la cámara y se cerró la tapa. La caja se incubó a 30% durante la noche. Paso 7: Los tomates se sacaron y colocaron en una bolsa sellable (por ejemplo, ZIPLOCK) . Después se agregaron 30 µ? de PBS y el área circulada se agitó por 1 minuto. Paso 8: Los 30 mi de lavado se midieron con pipeta en un tubo cónico de 50 mi y después se hicieron las diluciones (0, 1 y 3) . Paso 9: Las suspensiones y diluciones se plaquearon en placas XLD frescas y se contaron las colonias positivas negras.

La FIG. 14 es un diagrama que muestra un procedimiento paso a paso para hacer tapones de agar para el método de tapón de agar descrito en la presente, por ejemplo, en el Ejemplo 1. Paso 1: Una placa nocturna del antagonista de elección (por ejemplo, Paenibacillus TS-15) se mezcló con 4 mi de H20 destilada. Paso 2: La suspensión se mezcló con 20 mi de agar TSA fundido. Paso 3: El agar después se vertió en un plato Petri, se dejó secar, incubar durante la noche, y i los tapones se eliminaron de la placa nocturna. Paso 4: Los tapones se colocaron en una placa TSA que se diseminó con 106 cfu/ml de suspensión de S. Newport. Paso 5: La placa se dejó incubar por 1, 3, y 4 días. Paso 6: Las zonas de inhibición y muerte después se midieron con una regla en mm cada día.

Las FIG. 15A-15E muestra los resultados del análisis fenotípico celular de ambas, la cepa TS-15 y S. Newport utilizando el Sistema de icroarreglo Fenotípico Biolog (PM) (Biolog, Inc.) que muestra la clasificación simultánea de aproximadamente 1,200 fenotipos.

La FIG. 16 muestra las poblaciones de Salmonela entérica en la tierra (?, CFU/g) , en hojas (A, CFU/hoja) , y florecimiento (¦, CFU/florecimiento) de plantas de tomate después de la inoculación. Las poblaciones promedio de S. entérica se muestran como líneas: tierra (— —) , hojas ( ) y florecimiento (—) .

Las FIGS. 17A-17E muestran la prevalencia serológica molecular por Salmonela entérica Sainpaul , Typhimurium, Javiana, Montevideo, y Newport en rizófora de tierra, en hojas, y en florecimiento de .plantas de tomate después de la inoculación. Se inoculó un coctel de cinco tinciones en la tierra y sobre las hojas, y las flores de la planta de tomate en el grupo experimental correspondiente. En el día 8 y día 23 después de la inoculación de la tierra (Fig. 17A, 17B) , o inoculación de la hoja (Fig. 7C, Fig. 7D) , o día 7 después de la inoculación del florecimiento (Fig. 7E) , alrededor de 100 colonias de Salmonela con de 6 a 10 colonias de cada muestra positiva para Salmonela se seleccionaron aleatoriamente para vigilancia serológica. Dot representa el porciento estimado para cada una de las cinco serovars en alrededor de 100 colonias de salmonela aisladas de cada muestreo y línea representa el 95% del intervalo de confianza (CI) inferior y superior.

La FIG. 18 muestra la recuperación de cada serovar de Salmonela en y dentro del fruto del tomate derivado del florecimiento inoculado. Se inocularon cinco cocteles de la cepa en florecimientos de plantas de tomate individuales marcadas. Todos los frutos del tomate derivados de flores inoculadas y no inoculadas en el grupo experimental se cosecharon y clasificaron para poblaciones de superficie e internas de Salmonela. La- serotipificación molecular se utilizó para determinar el serovar de colonias asiladas de Salmonela . Las diferentes letras en mayúsculas o diferentes letras en minúsculas representan diferencias significativas entre" los serovars (P<0.05) .

Las FIGS. 19A-19B muestran la colonización endofítica de Salmonela en el tallo. Se inocularon cinco cocteles de la cepa en la tierra de la zona derecha de la raíz de la planta de tomate después del trasplante. Se removieron tallos a 7 dpi y la superficie se esterilizó. Las piezas del tejido del tallo se colocaron inmediatamente después del seccionamiento en la superficie del medio agar XLT-4 en un orden posicional de la parte superior al fondo siguiendo la flecha en la placa. La apariencia de las colonias típicas de Salmonela en XLT-4 dentro de los 3 días a TA seguido por aislamiento adicional y. confirmación es positiva (Fig. 19A) ; de los contrario una muestra es negativa (Fig. 19B) .

La FIG. 20 muestra la eficacia de TS-15 contra tres patógenos de planta principales asociados con las plantas de tomate .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a la identificación de una cepa recién aislada de Paenibacillus alvei y su uso como un agente de biocontrol en el control y/o eliminación de contaminación de planta y órganos de planta, por ejemplo, plantas enteras, frutos y/o florecimiento, por Salmonela y otros patógenos procedentes de los alimentos humanos. Los agentes de biocontrol de la invención, por ejemplo, la cepa TS-15, también pueden ser efectivos contra el control y/o erradicación de ciertos patógenos . que causan, enfermedades en las plantas y por consiguiente . pueden utilizarse para tratar no solamente afecciones procedentes de los alimentos en humanos o animales, sino también en el control de ciertas enfermedades de plantas. En un aspecto particular, la invención se refiere a la identificación y el uso de la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei como un agente de biocontrol en la provisión de productos— especialmente de productos, tales como plantas de tomate y sus órganos— que están libres de contaminación de Salmonela y otros patógenos procedentes de los alimentos humanos. La invención también pertenece a mutantes de TS-15, tales como un imitante resistente a UV, que puede derivarse de o generarse de TS-15 por medio de métodos conocidos para mejorar al menos las características de TS-15. Tales mutantes pueden impartir varias ventajas en TS-15, tales como supervivencia mejorada en el campo debido a la resistencia a UV. En otro aspecto, la invención se refiere a la formulación de TS-15 en una mezcla con uno o más reforzadores de la fuente de carbono (por ejemplo, D-glucosa o D-Melezitosa) que además aceleran el crecimiento y la actividad bactericida de TS-15 contra Salmonela sin ayudar al< cultivo' de Salmonela. La invención además se refiere a la identificación y el uso de nuevos agentes antibióticos, por ejemplo, péptidos bactericidas, producidos por la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei, su aislamiento y caracterización, y el uso de tales agentes en el tratamiento de afecciones y/o enfermedades causadas por patógenos humanos .

De esta forma, la presente invención se refiere a la cepa TS-15 y sus mutantes (por ejemplo, mutantes resistentes a UV) , composiciones que comprende TS-15 o sus mutantes para la aplicación a plantas u órgano de plantas para controlar y/o eliminar patógenos de humanos y/o plantas dañinos de las plantas, composiciones terapéuticas (por ejemplo, composiciones de probióticos) que comprende TS-15 o sus mutantes para la administración a un sujeto que tiene o está en riesgo de tener afecciones procedentes de los alimentos, por ejemplo, salmonelosis , para tratar la afección, y los agentes activos producidos por TS-15 que tienen actividades bactericidas o bacteriostáticas contra estos patógenos que causan afecciones en plantas o humanos, por ejemplo, Salmonela.

Los inventores de la presente buscan identificar nuevos y naturales medios para proteger el suministro de alimentos de patógenos procedentes de alimentos, por ejemplo, las especies de Salmonela . La flora nativa de varias plantas asociadas en el producto, así como plantas asociadas en proximidad a tierras de cultivo de producto, se clasificaron para posible bacteria epifítica con actividad antagonista contra Salmonela. Utilizando un sistema de clasificación in vitro multi-fase, el aislamiento de varias bacterias asociadas con la planta natural se descubrieron del entorno que bloquea el cultivo de S. Newport . El proceso de clasificación reveló dos bacterias inhibidoras de Salmonela competitivas denotadas como A6-6i-x y TS-15.

Varios aspectos de la presente invención se describen con mayor detalle en las siguientes sub-secciones .

Definiciones y Uso de Términos La presente invención puede entenderse más fácilmente por la referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y los Ejemplos incluidos en la presente. Antes de describir y ¦ ' revelar los métodos y técnicas de la. presente, se entiende que esta invención no está limitada a métodos analíticos y científicos específicos como tal pueden, por supuesto variar. También es posible entender que la terminología utilizada en la presente es con el propósito de describir modalidades particulares solamente y no pretende ser limitante. A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención.

Como se utiliza en la presente y en la reivindicaciones anexas, las formas singulares "un, uno" "y," y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De esta forma, por ejemplo, la referencia a "un gen" es una referencia a uno o más genes e incluye sus equivalentes conocidos por el experto en la técnica, etc.

Como se utiliza en la presente, TS-15 es que es "capaz de inhibir o eliminar el cultivo de patógenos humano procedentes de alimentos en una planta u órgano de planta" significa que la cepa TS-15, una vez colocada en contacto con la planta u órgano de planta, resulta en un efecto bacteriostático o bactericida. Es decir, cuando TS-15 es bacteriostático contra patógeno humano procedente de alimentos, se inhibe el crecimiento de patógeno, pero el patógeno no está aniquilado. Preferiblemente, el crecimiento deberá ser inhibido en más del 50% de su índice de crecimiento bajo condiciones similares, o preferiblemente en más de 60%, o 70%, o 80%, o 90%, o 99% de su índice crecimiento normal bajo condiciones similares. Cuando TS-15 es bactericida contra patógeno humano procedente de alimentos, el patógeno se aniquila o aniquila sustancialmente . Preferiblemente, TS-15 deberá eliminar o aniquilar más del 50% de la población de patógenos con la que está en contacto, o deberá eliminar más del 60%, o 70%, o 80%, o 90%, o 99% o 100% de los patógenos.

Como se utiliza en la presente, la referencia a "TS-15" o "la cepa TS-15" es equivalente a la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei.

Como se utiliza en la presente, el término "alimentos basados en plantas" designa cualquier tipo de productos que pueden adaptarse para consumo, incluyendo, por ejemplo, frutos, vegetables (por ejemplo, tomates), semillas, hojas, tallos, raíces, y florecimiento, o cualquier otro órgano de planta.

Como se utiliza en la presente, el término "agente de biocontrol" se refiere a un organismo vivo que puede administrarse a una planta u órgano de planta (por ejemplo, semilla, raíz, tallo, hoja, fruto, florecimiento, etc.) para controlar, reducir, mitigar, erradicar o eliminar la presencia de un patógeno. El patógeno puede ser un patógeno a base de plana, o un patógeno que es capaz de causar una enfermedad 'en" humanos o animales, por ejemplo, Salmonela.

Como se utiliza en la presente, el término "planta u órgano de planta" se refiera a cual parte o componente de una planta, incluyendo el tallo, raíces, hojas, fruto, o florecimiento u órganos reproductores.

Como se utiliza en la presente, el término "patógeno procedente de alimentos" se refiere a un microorganismo que es patogénico para humanos y que inhibe cualquier tipo de alimento que se consume por un humano. "Patogénico" se refiere a la capacidad de un organismo para causar una enfermedad o afección en otro organismo.

Como se utiliza en la presente, el término "antagonista del crecimiento" es equivalente a inhibición del cultivo de un organismo o prevención bactericida del cultivo de un organismo.

Como se utiliza en la presente, el término "sobrenadante de cultivo libre de célula" o "CFCS" se refiere al medio de cultivo consumido después de la remoción de las células TS-15, pero que contendría cualquier componente producido por la célula bactericida o bacteriostático, por ejemplo, antibióticos peptídicos, que inhibirían o aniquilarían los patógenos procedentes de alimentos o patógenos de planta de la invención.

Como se utiliza en la presente, el término "patógeno entérico" se refiere a la familia de Enfcerojacteriaceae que causa afecciones procedentes de. los alimentos en humanos y animales.

Como se utiliza en la presente, el término "epifítico" se refiere a la condición de la bacteria que se encuentra naturalmente en las superficies de la planta.

Como se utiliza en la presente, el término "de existencia natural" se refiere a la condición de la existencia en alguna forma en el mundo natural. Por ejemplo, una bacteria es de existencia natural si existe en una forma viva en la superficie de una planta o en la tierra.

Como se utiliza en la presente, el término "aislado, " como en la cepa aislada, se refiere a la condición de una cepa bacteriana que ha sido removida de su entorno natural, por ejemplo, la tierra o una superficie de planta, y ha sido sustancialmente purificada por la remoción de los componentes del entorno del cual viene, por ejemplo, tierra, minerales, material orgánico, y aislado y/o separado de otros microorganismos.

Como se utiliza en la presente, el término "probiótico" se refiere a microorganismos vivos que se cree son benéficos para los organismos hospederos, y cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud en el hospedero. La bacteria de ácido láctico (LAB, por sus siglas en inglés) y la bifidobacteria con tipos de microbios comunes utilizados como probióticos ; pero ciertas levaduras y bacilos también pueden ser útiles. Los probióticos se consumen comúnmente como parte de los alimentos fermentados con cultivos vivos activos especialmente adicionados; tales como en yogurt, yogurt de soja, o como suplementos dietéticos. Como se contempla en la presente, es TS-15 de la invención y sus imitantes pueden utilizarse como probióticos para tratar o prevenir afecciones procedentes de los alimentos, por ejemplo, salmonelosis. Las "composiciones de probióticos" de la invención se refieren a cualquier formulación ingerible y segura adecuada (que puede incluir un alimento, por ejemplo, yogurt, helado) que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la bacteria de la invención.

Una cepa bacteriana "aislada" o "purificada" está sustancialmente libre de materiales de su entorno natural incluyendo tierra y materia biológica incluyendo otras bacterias o material vegetal. El lenguaje "sustancialmente libre de materiales de su entorno natural" incluye preparaciones o cultivos de la bacteria en los cuales las bacterias se separan de los componentes del entorno en el cual se encuentran naturalmente. En una modalidad, la frase " sustancialmente libre de materiales de su entorno natural" incluye cultivos que tienen menos de aproximadamente 20% (en conteo) de bacteria no TS-15 (también referido en la presente como bacteria contaminante, a bacteria contaminante no incluye mutantes bioactivos o formas modificadas de TS-15) , más preferiblemente menos de 10% (en conteo) de bacteria no TS-15 bacteria y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de bacteria no TS-15.

Cepa TS-15 Paenibacillus La presente invención, en un aspecto, se refiere a las cepas aisladas de Paenibacillus que actúan como agentes inhibidores contra Salmonela y otros patógenos procedentes de alimentos. En una modalidad, la cepa preferida es la cepa TS- 15 de Paenibacillus alveí, que es antagónica contra Salmonela y otros de tales patógenos, incluyendo, pero no limitado a 'especies patogénicas¦ de Salmonela, Escherichia, Escherichia, Shigella , Enterobacter y Estafilococo .

Paenibacillus es un género de la bacteria formadora de ' endospora gram-positiva, anaeróbica facultativa, originalmente incluida dentro del género Bacilo y después reclasificada como un género separado en 1993. La bacteria que pertenece a este género ha sido detectada en una variedad de ambientes tales como: tierra, agua, rizósfera, materia vegetal, forraje y larvas de insecto, así como en muestras clínicas. El nombre refleja este hecho: paene en latín significa casi, y por lo tanto Paenibacilli es literalmente casi Bacilo. El género incluye P. larvae, que se sabe causa enfermedad de las larvas de las abejas Americanas, la P. polymyxa, que es capaz de fijar el nitrógeno y por lo tanto se utiliza en agricultura y horticultura, la Paenibacillus sp. JDR-2 que se sabe es una fuente rica en agentes químicos para aplicaciones de biotencología y cepas formadoras de patrones tales cepas tales como P. vortex y P. dendritiformis descubiertas a los principios de los 90s, que se sabe desarrollan colonias complejas con arquitecturas intricadas .

La cepa TS-15 se aisló por clasificación de la microflora nativa y varios órganos de plantas incluyendo (hojas, brotes, raíces, y florecimiento) y tierra en varias regiones de cultivo de tomate en la Costa Este. Tres gramos de planta material o tierra se mezclaron por aproximadamente 5 minutos en 1 mi de salina regulada en pH con fosfato (PBS) . Se plaquearon 100 µ? sobre agar de Glucosa de Levadura Nutriente (NYGA) . Se seleccionaron diez colonias con morfologías únicas que se desarrollaron dentro de las 48 horas a 30°C bajo condiciones aeróbicas para purificación adicional. Estas colonias también se ensayaron utilizando la prueba de 3% de KOH. La prueba con KOH es una prueba rápida para la diferenciación Gram sin tinción.

Las colonias de cultivos puros después se ensayaron para actividad antagonista in vitro utilizando un método de tapón de agar como se explica en Visser R. y otros, Appl . Environ. Microbiol . 1986 552-555, que se incorpora en la presente en su totalidad. Las características morfológicas de los antagonistas potenciales se observaron por la tinción Gram y tinción de esporas. Los aislados además se ensayaron con el sistema de identificación Bioquímico Vitek® 2 compact (BIOMERIEUX, INC., Durham, NC) . Las tarjetas colorimétricas de VITEK® 2 compact se leyeron e interpretaron automáticamente con el sistema VITEK® 2 compact, versión 01.01b.

Además, el ADN genómico de los aislados se extrajo utilizando el kit de purificación de ADN genómico IZARD® (PROMEGA) . Un par de iniciadores universales específicos para ARNr 16S bacteriano, Eubac27 y R1492 (secuencias disponibles en DeLong y otros, E. F. Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 1992 (89) : 5685-5689, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) , se utilizaron para amplificar el gen de ARNr 16S correspondiente. La amplificación PCR del ARNr 16S se llevó a cabo con un kit de polimerasa de ADN Hotstárt Taq plus (QIAGEN, Valencia, CA) bajo las siguientes condiciones: después de 5 minutos iniciales de incubación a 95°C, la mezcla .se sometió a 30 ciclos, cada uno incluyendo 1 min a 95°C, 1 min a 58°C, y 1 min a 72°C. Se realizó una extensión final a 72°C por 10 min. Los iniciadores 4F, 27F, 357F, 578F, 1000R, y 1492R se utilizaron para secuenciar el algoritmo BLAST que se utilizó para búsqueda de homología contra Genbank. Solamente se consideraron los resultados de esta búsqueda con la puntuación más alta para identificación del filotipo, con 99% de similitud mínima. Con base en estos análisis, el organismo aislado se identificó como la cepa hasta ahora desconocida de . cepa de Paenibacillus alvei, la cepa «TS-15.

TS-15 de la invención puede utilizare en cualquier forma, incluyendo su forma de crecimiento vegetativa o su estado productor de esporas, o como esporas. TS-15 de la invención puede ser provisto en cultivo de crecimiento líquido, placas/colonias de cultivo, seco, esporas o en cualquier otra forma mientras sean capaces de inhibir Salmonela y preferiblemente otros patógenos que causan enfermedades procedentes de alimentos, patógenos, tales como especies patogénicas de Shigella, Escherichia, Enterobacter, . Escherichia o Estafilococo . Como se utiliza en la presente, la capacidad de inhibir Salmonela u otro patógeno puede determinare por medio de métodos conocidos . Los ensayos estándar, tales como los descritos en la presente, pueden utilizarse para determinar la habilidad de la cepa para actuar contra los patógenos bacterianos de interés . Los ensayos estándar pueden conducirse in vitro o en el campo.

Como además se explica en la presente, la cepa TS-15 de la invención puede ser provista en composiciones especialmente diseñadas que tienen fuentes de carbono y nitrógeno definidas que son tales que el crecimiento de TS-15 se mejora o causa que se refuerce; sin embargo el crecimiento de patógenos obj etico se inhibe o al menos no se promueve por las fuentes de carbono y nitrógeno utilizadas.

Mutantes de la cepa TS-15 La invención también pertenece a mutantes bioactivos o formas modificadas de la cepa TS-15 que retienen su efecto inhibidor contra Salmonela u otra bacteria patogénica procedente de alimentos, a pesar de que poseen un cambio en al menos otra característica relativa a TS-15 silvestre (por ejemplo, resistencia mejorada a UV) . Como se utiliza en la presente, el término "mutantes bioactivos o formas modificadas de la cepa TS-1.5" pretende incluir la bacteria que naturalmente se convierte en mutada o ha sido mutada por manipulaciones- tales como, por ejemplo, mutación química o UV o modificación genética o la transformación ha sido modificada para tener otras características tales como, por ejemplo, resistencia a antibióticos.

Como se utiliza en la, presente, ..inhibición es una reducción en el crecimiento o desarrollo del patógeno objetivo, por ejemplo, contra sistemas de control. Los ensayos estándar, tales como los descritos en la presente, pueden utilizarse para determinar la habilidad de la cepa o imitantes bioactivos o sus formas modificadas para actuar i contra los patógenos bacterianos de interés . Los ensayos estándar pueden conducirse in vitro o en el campo.

Los mutantes TS-15 pueden estar en estado vegetativo o de espora. Pueden estar en cultivo, secos, viables, o en cualquier otra forma mientras sean capaces de inhibir Salmonela y preferiblemente . otros patógenos que causan enfermedades procedentes de alimentos, tales como especies patogénicas de Shigella, Escherichia, Enterobacter, Escherichia o Estafilococo. Los mutantes de la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei contemplados por la invención pueden prepararse o aislarse utilizando métodos bien conocidos. Los mutantes aleatorios de TS-15 pueden recolectarse bajo diferentes condiciones inducidas por la selección, tales como, por ejemplo, condiciones que seleccionan resistencia a antibióticos o resistencia a algunas otras tensiones ¦ambientales, tales como resistencia a luz ultravioleta o resistencia a la desecación. Los mutantes aleatorios existen naturalmente en una población de células dado el índice de error en la replicación de ADN y otras condiciones - ambientales que pueden inducir un cambio genético (por ejemplo, luz UV) . Los mutantes también pueden obtenerse por el contacto de la cepa TS-15 con un agente mutagenizante , tal como una fuente química (por ejemplo, agente de intercalación de ADN) o radiación (por ejemplo, luz UV) , que aumentará la apariencia de cambios de nucleótido en el genoma, y de esta forma la apariencia de las células imitantes en la población, que puede propagarse bajo condiciones de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos, resistencia al calor, resistencia al ácido) . Los métodos de mutagénesis son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse descritos con mayor detalle en, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 7,354,715, 7,892,822, 7,871,817, 7,767,454, 7,749,743, 7,732,570, 7,647,184, 7,615,362, 7,504,207, y 7,455,840, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.

Otros mutantes que pueden obtenerse pueden incluir aquellos mutantes que muestran una utilización mejorada de fuentes de carbono y nitrógeno particulares, o que aún pueden inhibir el crecimiento un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela.

Patógenos y Enfermedades TS-15 y sus mutantes demostraron que tienen una actividad antagonista contra Salmonela Newport y otros patógenos bacterianos entéricos en plantas de tomate y otras plantas de la familia de las Solanáceas (la familia Nightshade) , que incluye tomates y pimientos .- Ver Ejemplos. Sin embargo, TS-15 y sus mutantes también pueden ser efectivos contra una variedad de patógenos de planta y humano .

En particular, TS-15 y sus imitantes pueden ser efectivos contra muchas enfermedades de plantas causadas por la bacteria Gram-negativa, tales como las enfermedades causadas por Pseudomonas. Los ejemplos específicos de enfermedades de plantas causadas por tales organismos y organismos relacionados incluyen: gran daño bacteriano de plantas de las Cucurbitáceas, tales como gran daño bacteriano (Pseudomonas áyringae pv. lachrymans) de melón y pepino," y putrefacción de café de vaina (Pseudomonas fuscovaginae) del arroz. Como las enfermedades de plantas causadas por las cepas que pertenecen al género Fusarium, existen costras ejemplificadas (Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum) de cebada, trigo, avena y centeno, marchitación Fusarium (Fusarium oxysporum f . s . cucumerium) de pepino, Fusarium wi-lt (Fusarium oxysporum f. sp . melonis) de melón, y Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp . lycopersici) de tomate.

Las cepas de biocontrol de la invención también pueden ser capaces de controlar enfermedades de plantas causadas por hongos patogénicos de planta comunes, por ejemplo, varios hongos patogénicos tales como las cepas que pertenecen al gene.ro Colletotrichum y las cepas que pertenecen al género Glo erella. Las enfermedades de plantas causadas por las cepas que pertenecen al género Colletotrichum incluyen, por ejemplo, antracnosis de plantas de las Cucurbitáceas, tales como antracnosis (Colletotrichum orbiculare) de pepino, y antracnosis (Colletotrichum acutatum) de la fresa. Las enfermedades de plantas causadas por las cepas que pertenecen al género Glomerella incluyen, por ejemplo, putrefacción madura [Glomerella cingulata) de la uva y antracnosis (Glomerella) de fresa.

Las cepas de biocontrol de la invención también pueden ser efectivas en enfermedades de plantas diferentes de las enfermedades de plantas antes e emplificadas, tales como moho gris (Botrytis cinérea) y putrefacción de tallo (Sclerotinia sclerotiorum) de varias plantas de cultivo; ráfaga (Pyricularia oryzae) , gran daño de vaina ( Thanatephorus cucumeris) y mancha de hoja de helmintospora (Cochliobolus miyabeanus) de arroz; costra (Venturia inaequalis) , mancha de hoja Alternaría (Alternaría malí) y gangrena (Valsa ceratospermd) de manzana; mancha negra (Alternaría kikuchiana) y costra (Venturia nashicold) de pera; melanosis (Diaporthe citri) , hongo azul (Penicillium italicum) y gangrena (Xanthomonas campestris pv. citri) de cítrico; putrefacción Phomopsis (Phomopsis sp.) y putrefacción café (Monilinia fructicola) de durazno; antracnosis (Gloeosporium kaki) y mancha de hoja angular (Cercospora kaki) de caqui Japonés; moho talcoso (Erysiphe graminis) , sarro (Puccinia graminis, P. striformis, P. recóndita) , tizne suelto (Ustilago nuda) y costra (Gibberella zeae, Monographella nivalis) de cebada, trigo, avena y centeno; moho talcoso {Sphaerotheca cucurbitae) , gran daño de tallo gomoso {Didymella bryoniae) y moho blando {Pseudoperonospora cubensis) de pepino; moho de hoja (Fulvia fulva) de tomate; marchitación de Verticilio (Verticillium dahlíae) , putrefacción café (Phytophthora capsici) y marchitación bacteriana (Ralstonia solanacearum) de berenjena; mancha café (Altemariaaltemata) de tabaco; mancha de hoja {Cercospora beticola) de remolacha; gran daño tardío (Phytophthora infestans) de papa; mancha púrpura (Cercospora kikuchii) de soja; moho blando (Pernospora brassicae) de rábano Japonés; moho blando (Peronospora spinaciae) de espinaca; gran daño bacteriano (Xanthomonas campestris pv. vitians) y putrefacción suave bacteriana (Erwinia carotovora subsp . carotovora) de lechuga; putrefacción negra (Xanthomonas campestris pv. campestris) de col; raíz cuadrada (Plasmodiophora brassicae) de vegetables de Cruciferas; gran daño del semillero (Pyythium sp) de varias plantas de cultivo; putrefacción de raíz violeta (Helicobasidium mompa) de árboles frutales; gran parche (Rhizoctonia solani) y gran daño de hoja Curvularia (Curvularia s . ) de césped; etc.

Las cepas de biocontrol. de la invención además pueden ser efectivas contra una variedad de enfermedades de plantas a base de hongos, que incluyen: moho gris (Botrytis cinérea) y putrefacción de tallo (Sclerotinia sclerotiorum) de varias plantas de cultivo; explosión {Pyricularia oryzae) , gran daño de vaina {Thanatephorus cucumeris) y mancha roja de helmintosporio {Cochliobolus miyabeanus) de arroz; costra {Venturia inaequalis) , mancha de hoja Alternaría {Alternaría mali) y gangrena {Valsa ceratosperma) de manzana; mancha negra (Alternaría kikuchiana) y costra {Venturia nashicola) de pera; melanosis {Diaporthe citri) y moho azul {Penicillium italicum) de cítrico; putrefacción Phomopsis {Phomopsis s . ) y putrefacción café {Monilinia fructicola) de durazno; antracnosis {Gloeosporium kaki) y mancha de hoja angular {Cercosporakaki) de caqui Japonés; putrefacción madura (Glomerella cingulata) de uva; moho talcoso (Erysiphe graminis) , sarro {Puccinia graminis, P. striformis, P. recóndita), tizne suelto {Ustilago nuda) y costra {Monographella nivalis) de cebada, trigo, avena y centeno; moho talcoso {Sphaerotheca cucurbitae) , gran daño de tallo gomoso {Didymella bryoniae) antracnosis (Colletotrichum orbiculare) y moho blando {Pseudoperonospora cubensis) de pepino; moho de hoja {Fulvia fulva) de tomate; marchitación de verticilo {Verticillium dahliae) y putrefacción café {Phytophthora capsici) de berenjena; antracnosis {Collectorichu acutatum, Glomerella cingulata) de fresa; mancha café (Alternaría alternata) de tabaco; mancha de hoja {Cercospora beticola) de remolacha; gran daño tardío {Phytophthora infestans) de papa; mancha púrpura {Cercospora kikuchii) de soja; moho blando {Pernospora brassicae) de rábano Japonés; moho blando {Peronospora spinaciae) de espinaca; raíz cuadrada (Plasmodiophora brassicae) de vegetables de Cruciferas; gran daño del semillero (Pythiu sp) de varias plantas de cultivo; putrefacción de raíz violeta (Helicobasidium mompa) de árboles frutales; gran parche {Rhizoctonia solani) y gran daño de hoja Curvularia ( Curvularia sp . ) de césped; etc.

Las cepas de biocontrol de la invención además pueden ser efectivas contra una variedad de enfermedades de plantas a base de virus, incluyendo mosaicos de pepino (cucumovirus de mosaico de pepino, mosaico2 de sandía, potivirus, porivirus mosaico amarillo de calabacín), enfermedades virales del tomate (citorhabdovirus crincle de fresa, virus C latente de fresa, luteovirus miniatura de soja, virus intrincado de fresa, carlavirus de borde amarillo pseudo- ligero de fresa, caulimovirus de banda de vena de fresa, tobamovirus mosaico de tabaco, necrovirus de necrosis de tabaco) , mosaico de col (caulimovirus mosaico de coliflor, cucumovirus mosaico de pepino, porivirus mosaico de nabo) , enfermedades virales de soja (sobemovirus mosaico de fríjol sureño, cucumovirus de atrofia de cacahuate, ..porivirus mosaico común de fríjol, fabavirus de marchitación de fríjol amplio) y enrollamiento de hoja de papa (luteovirus de enrollamiento de hoja de papa) .

Cuando las cepas de la invención se utilizan para controlar enfermedades de plantas, esporas, células vegetativas, cultivos completos o similares de la cepa del género Paenibacillus pueden comúnmente utilizarse. Se pueden preparar de un cultivo obtenido mediante el cultivo de la cepa del género Paenibacillus a través de un método convencional. El cultivo completo obtenido puede prepararse en un polvo de cultivo competo, por ejemplo, por . la liofilización del cultivo completo tal como está. Las células vegetativas pueden prepararse como un precipitado de célula, por ejemplo, por la centrifugación del cultivo completo después del cultivo para remover los contaminantes, además centrifugando el sobrenadante resultante, y después lavando las células precipitadas. Además, las esporas pueden prepararse como polvo de esporas liofilizado, por ejemplo, mediante la suspensión del precipitado de células obtenido anteriormente en agua destilada y liofilizando la suspensión resultante .

A pesar de que la cepa del género Paenibacillus utilizado en la presente invención es usualmente de células viables, pueden ser células aniquiladas por tratamiento con calor o similar. Las células viables referidas en la presente incluyen, como se describe anteriormente, células viables obtenidas del cultivo, células secas obtenidas de células viables, células separadas del cultivo por un método convencional tal como filtración, centrifugación o similar, y células secadas después de la separación y recolección.

TS-15 y los mutantes de la invención pueden cultivarse a través de un método de cultivo convencional para bacteria común. Pueden cultivarse por cualquier método imaginable tal como cultivo sólido o cultivo líquido (por ejemplo cultivo con agitación del tubo de ensayo, cultivo de agitación recíproco, cultivo con agitación giratoria, cultivo en termentador de jarra, o cultivo en tanque) . Como un medio de cultivo, puede utilizarse una combinación de varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales orgánicas y sales inorgánicas apropiada. En general, las fuentes de carbono incluyen, por ejemplo, glucosa, almidón, glicerol, dextrina, sacarosa, y aceitéis animales y vegetales. Las fuentes de nitrógeno orgánicas incluyen, por ejemplo, extracto de levadura, harina de soja, licor residual de maíz, germen de trigo, extracto de carne y peptona. Las fuentes de nitrógeno inorgánicas incluyen, por ejemplo, nitrato de sodio, nitrato de amonio, sulfato de amonio y acetato de amonio. Las sales orgánicas y las sales inorgánicas incluyen, por ejemplo, acetatos tales como acetato de sodio, etc.; carbonates tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, etc.; cloruros tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc.; fosfatos tales como fosfato diácido de potasio, fosfato diácido disódico, etc.; y sulfatos tales como sulfato ferroso, sulfato de zinc, sulfato de cobre, etc. A pesar de que la temperatura del cultivo puede variar apropiadamente mientras puedan crecer los microorganismos, se prefiere que esté en el intervalo de 20°C a 40 °C. Usualmente el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas. Particularmente cuando se lleva a cabo en un termentador de jarra o tanque de cultivo, el cultivo se lleva a cabo mientras sé introduce aire estéril. Un método y condiciones para el cultivo no están particularmente limitados mientras el microorganismo pueda crecer. Como se explica en la presente, las composiciones de la invención pueden comprender fuentes de carbono únicas (por ejemplo, glucosa) y nitrógeno (extracto de levadura) que son particularmente ventajosas para el cultivo de TS-15 o sus mutantes, pero que no se utilizan particularmente o aún se inhiben como el crecimiento de un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela. Tal medio puede ser referido como "reforzadores" de carbono y nitrógeno.

Aparte de ser- efectivo contra Salmonela, TS-15 y sus mutantes pueden ser efectivo contra otros patógenos humanos también, en particular, patógenos Gram-negativos o entéricos que tienden a caiusar infecciones y síntomas gastrointestinales, y que pueden estar presentes como contaminación o flora de cultivos a base de productos. Los ejemplos incluyen, otros diferentes de Salmonela, las especies patogénicas de Escherichia, Escherichia, Shigella, Enterobacter y Estafilococo . Los organismos específicos pueden incluir E. coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo aureus y Escherichia monocytogenes.

Composiciones de bio-control que comprenden TS-15 y/o imitantes TS-15 En un aspecto, la presente invención provee composiciones que comprenden TS-15 y/o mutantes TS-15 que pueden aplicarse a la tierra, planta u órgano de planta que busca, ser tratada como un agente de biocontrol . El ingrediente activo en tales composiciones incluye células TS-15 activas o sus mutantes, o sus esporas, en un portador adecuado que no es dañino para planta u órgano de plantas . Cualquier forma adecuada de tales composiciones se contempla, incluyendo líquidos para aspersión, geles, sólidos, polvos, granulos, cristales, o cualquier otro tipo de forma física que podría aplicarse a la tierra, semilla, plantas u órganos de plantas directamente.

Las formulaciones de bio-control y otras de tales composiciones son bien conocidas en la técnica. Cualquier agente de formato de bio-control podría adaptarse para suministrar TS-15 o sus mutantes de la invención, mientras las composiciones no contengan componentes que sean dañinos, o inhibitorios de TS-15 (o sus mutantes) o para cualquier agente activo bactericida o bacteriostático producido por las células. Una formulación efectiva podría prepararse sin experimentación indebida mediante el ensayo de la efectividad de la formulación con el tiempo utilizando un ensayo conocido, como ensayo de tapón, como se describe en el Ejemplo 1.

Los ejemplos de formulaciones de biocontrol generales que pueden utilizarse por la invención incluyen, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 4,244,729 ("Sustaihed reléase pesticide composiciones and process for making same"), 5,018,299 ("Pesticide delivery device"), 5,464,457 ("Soil fumigation with gasiform pesticide"), 5,662,915 ("Pesticide product derived from the plant Tagetes minuta") , 5,958,463 ( "Agricultural pesticide forraulations " ) , 5,972,915 ("Pesticide containing a synergistic combination of active ingredients " ) , 6,231,865 ("Natural pesticide"), 6,426,082 ( "Aqueous suspensión formulation of encapsulated pesticide"), 6,436,421 ("Pesticide compositions " ) , 6,447,811 ("Pesticide against plant-pathogenic microorganisms " ) , 6,505,436 ("Capsicum based pesticide and method of use"), 6,720,170 ("Pesticide microemulsions and dispersant/penetrant formulations" ) , y 7,563,748 ("Alcohol alkoxylate carriers for pesticide active ingredients"), cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia .y puede utilizarse para suministrar la bacteria de la invención.

Los ejemplos de formulaciones de bio-control que se diseñan específicamente para suministrar ingredientes biológicos, por ejemplo, células bacterianas enteras, incluyendo, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,283,060 ( "Bacilos-containing pesticide granules"), 5,055,293 ("Biological pesticide"), 6,663,860 ("Biological pesticide"), y 7,393,528 ("Biological pesticide"), cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en el suministro de la bacteria de la invención.

La cantidad o concentración de células "en las composiciones de bio-control de la invención puede determinarse sin experimentación indebida. Las cantidades típicas de bacteria pueden incluir, por ejemplo, 102, 103, 104, 10s, 106, 107, 10a, 109, 1010, 1011, 1012, o más unidades formadoras de colonia (CFU, por sus siglas en inglés) por mi de la composición.

Las formulaciones de bio-control de la invención pueden incluir varios portadores sólidos o líquidos.

Los portadores sólidos utilizados en la formulación, incluyen, por ejemplo, polvos minerales (por ejemplo arcilla de caolín, bentonita, tierra diatomácea, óxido de silicón hidratado sintético, talco, cuarzo, vermiculita y perlita) , sales inorgánicas (por ejemplo sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, urea y cloruro de amonio) , polvos orgánicos (harina de trigo, harina de soja, salvado de trigo, quitina, salvado, leche en polvo descremada y polvo de leche entera) , carbono activado y carbonato de calcio. Los portadores líquidos incluyen, por ejemplo, agua, glicerol, aceites vegetales (por ejemplo aceite de soja y aceite de colza) , aceites de animal líquidos (por ejemplo aceite de pescado), etilenglicol , poli (etilenglicoles) , propilenglicol y poli (propilenglicoles) .

Las formulaciones de bio-control de la invención también pueden utilizarse mezcladas con otros insecticidas, nematicidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores del crecimiento de la plante, propagadores, fertilizantes, materiales microbianos, rectificaciones de tierra, y similares, o pueden utilizarse juntos sin mezclarse entre ellos.

En el control de enfermedades de plantas de acuerdo con la presente invención, la dosis de aplicación (dosis húmeda) del ingrediente activo de la cepa del género Paenibacillus utilizada es usualmente de aproximadamente 0.1 g a aproximadamente 10000 g, preferiblemente de aproximadamente 10 g a aproximadamente 1000 g, por 10 ares. Cuando el polvo humectable, la suspensión, microcápsulas o similar se utilizan después de haberse diluido con agua, la concentración celular en el momento de la aplicación es usualmente de aproximadamente 103 CFU/mL a aproximadamente 1011 CFU/ml, preferiblemente de aproximadamente 105 CFU/ml a aproximadamente 109 CFU/ml. Los gránulos, polvo, pasta y similares pueden aplicarse tal como están en la forma de tal formulación sin dilución.

Cuando se utilizan esporas, células vegetativas, o cultivos completos de la cepa del género Paenibacillus, su dosis de aplicación es preferiblemente de aproximadamente 0.1 g a aproximadamente 10000 g (peso húmedo) por 10 acres. Cuando las esporas, o célula vegetativas se utilizan después de ser diluidas con agua, su concentración en el momento de la aplicación es preferiblemente de aproximadamente 103 a aproximadamente 1010 CFU/ml. La dosis de aplicación de la sustancia capaz de inducir resistencia a la enfermedad en planas es preferiblemente de aproximadamente 0.001 g a 10000 g por 10 acres.

En el control de enfermedades de plantas de acuerdo con la presente invención, la cepa del género Paenibacillus o sustancia capaz de inducir resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención preferiblemente se aplica a los tallos y hojas, zona de enraizado y/o semillas de una planta. Para actualmente' aplicar la cepa o sustancia, existen, por ejemplo, métodos convencionales tales como un método para aplicar gránulos al pie de una planta o tierra y un método para aplicar un líquido diluido o un líquido sin diluir al pie de la planta o tierra. Aparte estos métodos, pueden adoptarse, por ejemplo, el mismo método de aspersión como un método para controlar enfermedades en la parte arriba del suelo; un método para cubrir las semillas de la planta con, o sumergiéndolas en, una mezcla o cada una de las cepas del género Paenibacillus o sustancia capaz de inducir resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención, un portador sólido, un agente adhesivo denominado aglutinante, y similar; un método para aplicar la cepa o sustancia mezclada con un fertilizante, una rectificación de tierra, composta y similar o aplicando la cepa o sustancia juntó con éstos sin mezclarlos; "y" un método utilizando material microbiano obtenido por la adsorción de la cepa del género Paenibacillus o sustancia capaz de inducir resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención en un portador sólido y/o sin agregar al mismo nutrientes orgánicos (por ejemplo salvado, extracto de malta y aminoácidos), componentes fertilizantes, etc.

Ambas, la dosis de aplicación y la concentración de aplicación de tales formulaciones varían dependiendo de condiciones tales como la clase de formulación, un tiempo de aplicación, un sitio de aplicación, un método de aplicación, un método de cultivo, la clase de planta de cultivo, la clase de enfermedad de la planta, el grado de daño, etc., y puede aumentarse o disminuirse independientemente de los intervalos antes mencionados.

Generalmente, la administración de tales composiciones puede ocurrir en cualquier punto en el tiempo entre la "la granja y la tienda, " es decir, significa que la intervención con las composiciones de la invención puede ocurrir en cualquier punto en la producción, distribución, y ventas de las planta y órganos de planta de la invención. Por ejemplo, antes del cultivo de una cosecha con una planta de interés (por ejemplo, una planta de tomate) , la tierra misma puede tratarse si se sospecha que lleva contaminación de un patógeno de planta o humano, por ejemplo, Salmonela. La Salmonela puede haber entrado en el -sistema de la tierra escapando de los desperdicios animales cercanos que están contaminados con el organismo. Posteriormente, las semillas y plantaciones jóvenes pueden tratarse mediante la administración de una dosis efectiva de las composiciones de bio-control de la invención. Puede ser provista una, dos, o más rondas de administración de bio-control durante el cultivo de las cosechas. Una vez que se cosechan, las hojas, frutos o vegetables además pueden tratarse con aún otra ronda o más tratamiento. El tratamiento adicional puede administrarse durante cualquier punto posterior'- de almacenamiento, procesamiento, distribución y ventas.

Sustancias activas de TS-15 o sus mutantes Otro aspecto de la invención pertenece a las sustancias activas de TS-15 que tienen la, actividad antagonista contra Salmonela y otros patógenos. Tales sustancias activas pueden ser péptidos, enzimas o pequeñas moléculas producidas por TS-15 o sus mutantes que inhiben o aniquilan un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela . En ciertas modalidades, como tales sustancias activas generalmente se liberan de 1a célula durante la producción, el extracto extracelular de las células TS-15 de la invención que contienen tales sustancias activas puede utilizarse en las composiciones de la invención en combinación con células enteras o independientes de las células. Una de sus sustancias "aislada" o "purificada" está sustáncialmente libre de material celular cuando se produce por extracción de un sistema bacteriano, o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente. El lenguaje "sust ncialmente libre de material celular" incluye preparaciones de una sustancia activa TS-15 que se separa de los componentes celulares de la bacteria, o en particular, las esporas bacterianas en que puede producirse. En una modalidad, cuando la sustancia activa es un péptido, la frase "sustáncialmente libre de material celular" incluye preparaciones que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de péptidos o proteínas no de TS-15 (también referido en la presente como proteína contaminante) , más preferiblemente menos de 20% (en peso seco) de péptidos o proteínas no de - TS-15, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% (en peso seco) de péptidos o proteínas no de TS-15 y más preferiblemente menos de aproximadamente 5% (en peso seco) de péptidos o proteínas no de TS-15.

Las metodologías estándar pueden utilizarse sin experimentación indebida para aislar y purificar sustancias activas de TS-15 que tienen actividad contra un patógeno objetivo, por ejemplo, Salmonela. Por ejemplo, la¾ técnicas de fraccionamiento, tales como cromatografía de columna, pueden utilizarse para separar los componentes de un sobrenadante de cultivo en una pluralidad de fracciones individuales. Las " fracciones pueden ensayarse para identificar aquellas que contienen componentes activos que tienen actividad contra un patógeno objetivo. Las fracciones que tienen actividad presente pueden someterse a purificación adicional y/u otras técnicas analíticas para identificar las sustancias activas de interés.

Composiciones de Probióticos que comprenden TS-15 y/o mutantes TS-15 En otro aspecto, la invención se refiere al uso de TS-15 o sus mutantes como un probiótico, que pueden administrarse a un sujeto que tiene o se sospecha · que tiene afecciones procedentes de los alimentos como un régimen de tratamiento para la afección. Por ejemplo, un individuo que está en riesgo de haber ingerido tomates contaminados con Salmonela puede ingerir un probiótico de la invención que comprende TS-15 o uno de sus mutantes. Una vez ingerido, el TS-15 o uno de sus mutantes contrarresta la Salmonela en la región gastrointestinal para ayudar a inhibir y/o aniquilar el patógeno contaminante o inhibir o bloquear la colonización del patógeno en el tracto gastrointestinal. TS-15 o los mutantes de la invención también pueden utilizarse como probióticos para administración a animales tales como aves de corral para reducir la aparición de patógenos procedentes de alimentos, tales como Salmonela, en la población de animales, por lo tanto reduciendo la exposición de humanos a los patógenos procedentes de alimentos a través del contacto con las aves de corral o el contacto con los productos que se contaminan por tales patógenos.

Se apreciará que la microflora gastrointestinal ha demostrado que juega un número de roles vitales en el mantenimiento de la función del tracto gastrointestinal y la salud fisiológica general. Por ejemplo, el crecimiento y metabolismo de las muchas especies bacterianas individuales que habitan en el tracto gastrointestinal dependen principalmente de los sustratos disponibles para ellos, la mayor parte de los cuales se derivan de la dieta. Ver por ejemplo, Gibson G. R. y otros, 1995. Gastroenterology 106: 975-982; Christi, S. U. y otros, 1992. Gut 33: 1234-1238. Estos hallazagos han conducido a intentos para modificar la estructura y actividades metabólicas de la comunidad a través de dieta, principalmente con probióticos que son suplementos alimenticios de microbios vivos. Los probióticos más conocidos con bacteria productora de ácido láctico (es decir, Lactohacilos) y Bifidobacteria, que se utilizan ampliamente en yogurt y otros productos lácteos . Estos organismos probióticos son no patogénicos y no toxigénicos, retienen la viabilidad durante el almacenamiento, y sobreviven el paso a través del estómago y el intestino delgado. Ya que los probióticos no colonizan al hospedero permanentemente, necesitan ser ingeridos regularmente para que persistan las propiedades promotoras de ' la salud. Las preparaciones de probióticos comerciales generalmente están comprendidas de mezclas de Lactohacilos y Bifidobacterias, a pesar de que la levadura tal como Saccharomyces también se ha utilizado.

Las preparaciones de probióticos se evaluaron inicialmente de forma sistémica para su efecto sobre la salud y longevidad a principios de los 1900 's (ver por ejemplo, Metchinikoff , E., Prolongation de Life, Willaim Heinermann, London 1910) , a pesar de que su utilización ha estado marcadamente limitada desde la llegada de los antibióticos en los 1950 's para tratar microbios patológicos. Ver por ejemplo, inberg, y otros, 1993. Pediatr. Nephrol . 7: 509-514; Malin y otros, Ann. Nutr. Metab. 40: 137-145; y Patente de E.U.A. No. 5,176,911. Similarmente , la bacteria productora de ácido láctico (por ejemplo, las especies . de .Bacilos, Lactohacilos y Estreptococos) se han utilizado como aditivos de alimentos y ha habido algunas argumentaciones de que proveen valores nutricionales y/o terapéuticos. Ver por ejemplo, Gorbach, 1990. Ann. Med. 22: 37-41; Reíd y otros, 1990. Clin. Microbiol. Rev. 3: 335-344. i Por lo tanto, los microorganismos probióticos son aquellos que confieren un beneficio cuando se cultivan en un ambiente particular, por lo general inhibiendo el cultivo de otros organismos biológicos en el mismo ambiente. Los ejemplos de organismos probióticos incluyen bacteria y bacteriófagos que poseen la habilidad de crecer dentro del tracto gastrointestinal, al menos temporalmente, para desplazar o destruir los organismos patogénicos, así como proporcionar otros beneficios al hospedero. Ver por ejemplo, Salminen y otros, 1996. Antonie Van Leeuwenhoek 70: 347-358; Elmer y otros, 1996. JAMA 275: 870-876; Rafter, 1995. Scand. J. Gastroenterol . 30: 497-502; Perdigón y otros, 1995. J Dairy Sci. 78: 1597-1606; Gandí, Townsend Lett . Doctors & Patients, pp. 108-110, Enero 1994; Lidbeck y otros, 1992. Eur. J. Cáncer Prev. 1': 341-353.

" A pesar de que la' microflora gastrointestinal presenta una barrera con base microbiana para invadir los organismos, los patógenos por lo general se establecen cuando se altera la integridad de la microbiota a través de tensión, afección,., tratamiento con antibiótico, cambios en la dieta, o alteraciones fisiológicas dentro del tracto G.I.. Por ejemplo, se sabe que la Bifidohacteria está involucrada en la resistencia de la colonización de patógenos en el intestino grueso. Ver por ejemplo, Yamazaki, S. y otros, 1982. Bifidobacteria y Microflora 1: 55-60. Similarmente , la administración de Bifidobacteria breve a niños con gastroenteritis erradicó la bacteria patogénica causativa (es decir, Campylobacter jejuni) de sus heces (ver por ejemplo, Tojo, M. , 1987. Acta Pediatr. Jpn. 29: 160-167) y la suplementación de leche de fórmula para infantes con Bifidobacteria bifidum y Estreptococos- thermophilus se encontró que reduce la liberación del rotavirus y episodios de diarrea en niños que fueron hospitalizados (ver por ejemplo, Saavedra, J. M . , 1994. The Lancet 344: 1046-109.

Además, algunas bacterias productoras de ácido láctico también producen bacteriocinas de producto que son metabolitos inhibidores responsables de los efectos antimicrobianos de la bacteria. Ver por ejemplo, Klaenhammer, 1993. FEMS Microbiol . Rev. 12: 39-85; Barefoot y otros, 1993. J. Diary Sci . 76: 2366-2379. Por ejemplo, las cepas de Lactobacilo seleccionadas que producen antibióticos han demostrado que son efectivas para el tratamiento de infecciones, sinusitis, hemorroides, inflamaciones dentales, y varias otras afecciones inflamatorias. Ver por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,439,995. Adicionalmente , Lactobacilos reuterí han demostrado que producen antibióticos que poseen actividad antimicrobiana contra la bacteria Gram negativa y Gram positiva, levadura, y varios protozoarios . Ver por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,413,960 y 5,439,678.

De esta forma, de acuerdo con este aspecto de la invención, la cepa TS-15 y sus mutantes pueden utilizarse como probióticos para prevenir o tratar afecciones procedentes de los alimentos, en particular, aquellas que afectan el tracto gastrointestinal. La presente invención describe composiciones y metodologías para la utilización de estas composiciones que' comprenden las cepas del probiótico Paenibacillus no patogénico que pueden utilizarse para mitigar los perjudiciales efectos fisiológicos de los patógenos del tracto gastrointestinal, incluyendo Salmonela y otros patógenos entéricos procedentes de alimentos tanto en humanos como animales, mediante la colonización (o más correctamente, re-colonización) del tracto gastrointestinal con microorganismos probióticos de la invención.

En otra modalidad de la presente invención, la cepa TS-15 de la invención puede combinarse con una dosis terapéuticamente efectiva de un' antibiótico que es efectivo contra un patógeno procedente de alimentos. En modalidades preferidas de la presente invención, el antibiótico puede incluir: Gentamicina Vancomicina; Oxacilina; Tetraciclinas ; Nitroflurantoina; Cloranfenicol ,· Clindamicina; Trimetoprim-sulfametoxasol ; un miembro de la familia de antibióticos de Cefalosporina (por ejemplo, Cefaclor, Cefadroxil, Cefixima, Cefprózil, Ceftriáxona, Cefuroxima, Cefalexina, Loracarbef, y similares) ; un miembro de la familia de antibióticos de Penicilina (por ejemplo, Ampicilina, Amoxicilina/Clavulanato, Bacampicilina, Cloxicilina, Penicilina VK, y similares) ; con un miembro de la familia de antibióticos de Fluoroquinolona (por ejemplo, Ciprofloxacina, Grepafloxacina, Levofloxacina, Lomefloxacina, Norfloxacina , Ofloxacina, Sparfloxacina , Trovafloxacina, y similares) ; o un miembro de la familia de antibióticos de Macrólido (por ejemplo, Azitromicina , Eritromicina, y similares) .

Adicionalmente se describen en la presente composiciones y métodos para utilizar la bacteria de probiótico de la invención, principalmente la cepa TS-15 y sus mutantes, en la administración a humanos y/o animales para tratar o prevenir afecciones procedentes de los alimentos o para bloquear o mitigar la proliferación de esos patógenos, por ejemplo, Salmonela, que causan las afecciones procedentes de los alimentos. La presente invención también describe composiciones terapéuticas, sistemas terapéuticos, y métodos para el uso para el tratamiento y/o prevención de varias infecciones bacterianas del tracto gastrointestinal, particularmente las infecciones asociadas con patógenos , resistentes a antibióticos.

En una modalidad de la presente invención, se describe una composición terapéutica que comprende una bacteria Paenibacillus no patogénica, viable, preferiblemente TS-15 o sus mutantes, en un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para administración oral para el tracto gastrointestinal de un humano o animal,. En otra modalidad, la cepa TS-15 se incluye en la composición terapéutica en la forma de esporas. En otra modalidad, la cepa TS-15 se incluye en la composición en la forma de una masa de células secas.

En otro aspecto de la presente invención, se describe una composición que comprende un producto extracelular de la cepa TS-15 de la invención en un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para administración oral a un humano o animal. En una modalidad preferida, el producto extracelular es un sobrenadante o filtrado de un cultivo de TS-15 o uno de sus mutantes que contiene al menos un agente bactericida o bacteriostático activo que mitiga la colonización o proliferación de un patógeno procedente de alimentos en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, Salmonela.

Otro aspecto de la invención es un método para prevenir o tratar una infección gastrointestinal bacteriana en un humano, por ejemplo, salmonelosis , que comprende los pasos de administrar oralmente a un sujeto humano una formulación de alimento o bebida que contiene unidades formadoras de colonia viables de una .cepa Paenibacillus no patogénica de la invención, preferiblemente la cepa TS-15 o uno de sus mutantes, y permite que la bacteria se cultive en el tracto gastrointestinal del sujeto humano.

En una modalidad del método antes mencionado, el paso de permitir que la bacteria de probiótico se cultive, además incluye inhibir el crecimiento de patógenos gastrointestinales procedentes de alimentos, incluyendo, por ejemplo, Salmonela Newport, un patogénico de la cepa de Shigella , Escherichia, Enterobacter, Escherichia o Estafilococo, E. coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo áureas, o Escherichia monocytogenes, especies de Candida, especies de Estafilococos, especies de Estreptococos, especies Proteus, especies Pseudomonas, especies Escherichia coli, especies de Clostridium, especies de Klehsiella, y especies de Enterococos . Las formulaciones de probióticos y métodos de administración son bien conocidos en la técnica, incluidos en las Patentes de E.U.A. Nos. 7,906,112, 7^807,440, 7,807,151, 7,785,635, 7,759,105, 7,749,509, 7,736,509, 7,731,976, 7,713,726, y 7,708,988, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.

La composición de probióticos de la invención puede • administrarse junto con otras terapias para afecciones procedentes de los alimentos, incluyendo antibióticos.

Usos y métodos de la invención En. otro., aspecto, la invención pertenece al uso de la cepa TS-15 o sus mutantes, o antibióticos o péptidos obtenidos de TS-15 o sus mutantes como un agente que es antagónico contra un patógeno humano procedente de alimentos que reside en los hospederos de la planta. Las cepas bacterianas y imitantes bioactivos o sus formas modificadas de la presente invención pueden utilizarse como agentes de bio- control, y, en particular, como un agente de biocontrol contra patógenos procedentes de alimentos, incluyendo especies patogénicas de Shigella , Escherichia, Enterobacter, Escherichia o Estafilococo, incluyendo Salmonela entérica serovar Newport, E'. · coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo áureas, y Escherichia monocytogenes . Además, la invención contempla el uso de la cepa TS-15 o sus mutantes, o cual componente activo aislable producido por TS-15 o sus mutantes, para controlar enfermedades de plantas causadas por una variedad de bacteria, virus y hongos, incluyendo los enumerados en la presente. En particular, la cepa TS-15 de la invención o sus componentes activos que pueden aislarse del mismo pueden utilizarse para tratar enfermedades de plantas de plantas de la familia de las Solanáceas (o familia ¦ Nightshade) , que incluyen, por ejemplo, plantas de tomate y pimiento. Sin embargo, no se contempla ninguna limitación particular en cuanto cuáles plantes u órganos de plantas pueden tratarse por la cepa TS-15 (o mutantes TS-15) de la invención. Tales plantas u órganos de plantas que . pueden tratarse por las cepas de la invención, pueden incluir, por ejemplo, otras fuentes comunes de patógenos procedentes de alimentos, tales como, pero no limitado a verduras frondosas, apio y otros vegetales culinarios, por ejemplo, vegetales de vaina, vegetales de bulbo y tallo, vegetales de raíz y tubérculos, así como ciertos frutos, tales como, melón.

Se apreciará que las Solanáceas es una familia de plantas con floración que contienen un número de importantes cultivos agrícolas así como muchas plantas tóxicas. La familia también se conoce informalmente como la familia solano - o de papa. La familia incluye, pero no se limita a, Datura (hierba Jimson) , Mandragora (mandrágora) , belladona (solano mortífero) , Pimiento (paprika, chile) , Solanácea (papa, tomate, berenjena) , Nicotiana (tabaco) , y Petunia (petunia) . Con la excepción del tabaco (Nicotianoideae) y petunia ( Petunioideae) , la mayor parte del género económicamente importante está contenido en la sub-familia de las Solanáceas. La familia de las Solanáceas es característicamente etnobotánica , es decir, se utiliza extensivamente por humanos . Es una fuente importante de alimentos, condimentos y medicinas.

Las verduras frondosas y los vegetales de ensalada que están contaminados con patógenos procedentes de alimentos (o patógenos de planta) pueden tratarse utilizando las cepas de la invención. Tales vegetales, pueden incluir, por ejemplo, Amaranto {Amaranthus emeritus) ; Rúcula {Eruca sativa) ; verduras de remolacha (Beta vulgaris subs . vulgaris) ; Hoja amarga (Vernonia calvoana) ; repollo (grupos de Brassica rapa Chino)); Brócoli Rabe {Brassica rapa subsp. rapa); coles de bruselas (grupo Brassica olerácea Gemmifera) ; col (grupo de Brassica olerácea Capitata) ; Catsear (Hypochaeris radicata) ; Apio (Apium graveolens) ; Lechuga (Lactuca sativa var. asparagina) ; espinaca de Ceilán {Basella alba) ; Acelga (Beta vulgaris var. cicla) ; Chaya {Cnidoscolus aconitifolius subsp. aconitifolius) ; Alsine (Stellaria) ; Achicoria (Cichorium intybus) ; col china (grupos- Brassica rapa Pekinensis y Chinensis) ; Malva China (Malva verticillata) ; hojas de Crisantemo (Chrysanthemum coronarium) ; verduras de tipo repollo (Brassica olerácea) ; ensalada de maíz (Valerianella locusta) ; Berro (Lepidium sa ivum) ; diente de león (Taraxacum officinale) ; Escarola (Cichorium endivia) ; Epazote (Chenopodium ambrosioides) ; Amaranto (Chenopodium álbum) ,- Cabeza de violín (Pteridium aquilinum, Athyrium esculentum) ; calabaza acanalada (Telfairia occidentalis) ; Ensalada de rúcula ( Eruca sativa) ; Samfire Dorado (Inula crithmoides) ; Good "King Henry (Chenopodium bonus -henricus) ; Gran Plantío (Plantago major) ; Kai-lan (grupo Brassica rapa Alboglabra) ; col rizada (grupo Brassica olerácea Acephala) ; Komatsuna (grupo Brassica rapa Pervidis o Komatsuna) ; Coca (Adansonia -spp.); Lagos bologi (Talinum fruticosum) ; lechuga de lamb (Valerianella locusta) ; Berro Land (Barjbarea vemd) ; Lechuga (Lactuca sativa) ; cola de lagarto (Houttuynia cordata) ; Melokhia (Corchorus olitorius, Corchorus capsularis) ; Lechuga de minero; verduras Mizuna (grupo Brassica rapa Nipposinica) ; Mostaza {Sinapis alba) ; col Napa (grupo Brassica rapa Pekinensis) ; Espinaca de Nueva Zelanda {Tetragonia tetragonioides) ; Orache {Atriplex hortensis) ; Pak choy (grupo Brassica rapa Chinensis) ; Para-berro (Acmella olerácea) ; brotes/hojas de chícharo [Pisum sativum) ; Polk (Phytolacca americana), Achicoria (Cichorium intybus) ; Samphire (Crithmum 'maritimum) ; Remolacha de mar (Seta vulgaris subsp. marítima) ; Seakale (Crambe marítima) ; bologi de Sierra Leone (Crassocephalum spp.); Soko (Celosía argéntea); Alazán {Rumex acetosa) ; Espinaca {Spinacia olerácea) ; Verdolaga de verano (Portulaca olerácea) ; Acelga Suiza (Beta vulgaris subsp. cicla var . fiavescens) ; Tatsoi (grupo Brassica rapa Rosularis) ; verduras de nabo (grupo Brassica rapa Rapifera) ; Berro {Nasturtium officinale) ; espinaca de agua (Ipomoea aquatica) ; purslane de invierno (Claytonia perfoliata) ; y Milerama (Achillea millefolium) .

Los vegetales de vaina que están contaminados con patógenos procedentes de alimentos (o patógenos de planta) pueden tratarse utilizando las cepas de la invención. Tales vegetables pueden incluir, por ejemplo, cacahuate Americano (Apios americana), fríjol Azuki (Vigna angularis) , chícharo de ojo negro (Vigna unguiculata subsp. unguiculata) , Garbanzo (Cicer arietinum) , fríjol común (Phaseolus vulgaris) , Palillo de tambor (Moringa oleífera) , fríjol Dolichos (Lablab purpureus) , fríjol Fava (Vicia faba) , Garbanzo (Cicer arietinu ) , fríjol Verde (Phaseolus vulgaris) , Guar (Cya opsis tetragonoloba) , Quimbombó (Abelmoschus esculentus) , Horse gram (Macrotyloma uniflorum) , chícharo de India (Lathyrus sativus) , Lenteja (Lens culinaris) , fríjol de Lima (Phaseolus lunatus) , fríjol de polilla (Vigna acontifolia) , fríjol Mung (Vigna radiata) , quimbombó (Abelmoschus esculentus) , Guisante (Pisum sativúm) , cacahuate (Arachis hypogaea) , Guisante paloma (Cajanus cajan) , fríjol de arroz (Vigna umbellata) , judía verde (Phaseolus coccineus) , Soja (Glycine max) , Altramuz (fcarhui, chocho; Lupinus mutabilis) , fríjol Tepary (Phaseolus acutífolius) , Urad bean (Vigna mungo) , Velvet vean (Mucuna pruriens) , Vigna Mungo (Psophocarpus tetragonolobus) , y fríjol Yardlong (Vigna unguiculata subsp . sesquipedales) .

Los bulbos y tallos de los vegetables que están contaminados con patógenos procedentes de alimentos (o patógenos de planta) pueden tratarse utilizando las cepas de la invención. Tales vegetables pueden incluir, por ejemplo, Espárrago (Asparagus officinalis) , Alcachofa (Cynara cardunculus) , Raíz de Apio (Apium graveolens var. rapaceum) , Apio (Apium graveolens), Ajo elefante (Allium ampeloprasum var. ampeloprasum) , Hinojo de Florencia (Foeniculum vulgare var. dulce), Ajo (Allium sativum) , Colinabo (grupo Brassica olerácea Gongylodes) , Kurrat. (Allium ampeloprasum var. kurrat) , Puerro (Allium porrum) , raíz Lotus (Nelumbo nucífera) , Nopal {Opuntiaficus-indica) , Cebolla (Allium cepa) , Cebolla Primavera/Escalonia (Allium wakegi) , Espárrago de Prusia (Ornithogalum pyrenaicum) , Chalote (grupo Allium cepa Aggregatum) , Cebolla Galesa (Allium fistulo sum) , y Puerro silvestre (Allium tricoccum) .

Los vegetales de raíz y tuberculosos que están contaminados con patógenos procedentes de alimentos (o patógenos de planta) pueden tratarse utilizando las cepas de la invención. Tales vegetables pueden incluir, por ejemplo, Ahipa (Pachyrhizus ahipa) , Arracacha (Arracada xanthorrhíza) , brotes de Bambú (Bambusa vulgaris y Phyllostachys edulis) , Raíz de remolacha (Beta vulgaris subsp. vulgaris), Bardana (Arctium lappa) , Hoja ancha de punta de flecha (Sagittaria latifolia) , Camas (Camassia) , Achira (Canna spp . ) , Zanahoria (Daucus carota), Mandioca (Manihot esculenta) , Alcachofa china (Stachys affinis) , Mooli (grupo Raphanus sativus Longipinnatus) , chícharo de maní (Lathyrus tut>erosus) , Batata de pata de elefante (Amorphophallus_paeoniifolius) , Ensete (Bnsete ventricosum) , Jengibre (Zingiber officinale), Gobo (Arctium lappa), perejil de Hamburgo ( Petroselinum crispum var . tuberosum) , Alcachofa de Jerusalén (Helianthus tuberosus) , Jicama (Pachyrhizus erosus) , Mandioca (Manihot esculenta) , Mooli (grupo Raphanus sativus Longipinnatus) , Chiriviá (Pastinaca sativa) , Pignut (Condpodium majus) , Plectranthus (Plectranthus spp.), Papa (Solanum tuberosum) , Nabo der la Pradera (Psoralea esculenta) , Rábano {Raphanus sativus) , Rábano picante (Armoracia rusticana) , Nabo sueco (grupo Brassica napus Napobrassica) , Salsifí (Tragopogón porrifolius) , Scorzonera (Scorzonera hispánica) , Skirret (Siura sisarum) , Colinabo (grupo Brassica napus Napobrassica) , Papa dulce o Kumara (Ipomoea batatas) , Taro (Colocasia esculenta) , Ti (Cordyline fruticosa) , Chufa (Cyperus esculentus) , Nabo (grupo Brassica rapa Rapifera) , Ulluco (Ullucus tuberosus) , castaña de agua (Eleocharis dulcís) , Yacon (Smallanthus sonchifolius) , y Batata (Dioscorea spp.) .

Las composiciones pueden preparase comprendiendo los agentes de biocontrol de la invención, es decir, conteniendo la cepa TS-15 y sus mutantes y/o agentes activos obtenidos y asilados de la cepa TS-15. Las composiciones pueden secares o hidratarse. Cualquier formulación adecuada puede utilizarse. En general, las formulaciones de biocontrol son bien conocidas en la técnica. En una modalidad preferida, la bacteria se aplica en una forma viable que le permite sostenerse a sí misma en la tierra o en las plantas o cosechas que se están tratando para proporcionar un efecto de biocontrol sobre un largo período de tiempo. Los métodos de bioensayo pueden utilizarse para determinar la presencia de la bacteria en el ambiente.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, los agentes activos TS-15 (por ejemplo, obtenidos del sobrenadante de un cultivo TS-15) pueden utilizarse en las composiciones de bio-control de la invención contra los patógenos procedentes de alimentos y/o de planta de la invención. Los agentes activos TS-15 pueden aplicase a un cultivo en cualquier etapa deseada del crecimiento del cultivo contra Sal onela u otros patógenos procedentes' de alimentos y/o patógenos de planta que pueden estar presentes en las plantas objetivo, florecimiento o frutos.

Las cepas bacterianas y cualquier agente activo aislable (por ejemplo, antibióticos peptídicos) . de la presente invención pueden aplicarse como un agente de bio-control en cualquier forma deseada. En una modalidad, las cepas bacterianas o agentes activos se aplican en un portador para facilitar la aplicación y para reducir el tiempo de mantenimiento del cultivo. Una ruta de administración preferida es utilizar un método de aspersión. ' Las ' formulaciones , métodos y sistemas de bio-control por aspersión son bien conocidos en la técnica y los ejemplos se encuentran en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,855,327, 6,541,426, 6,664,213, 6,778,887, 6,855,327, 7,238,365, y 5,626,858, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia.

En el control de estos patógenos procedentes de alimentos y patógenos de planta de interés en plantas u órganos de plantas de la invención, la cepa TS-15 o sus mutantes o cualquier sustancia activa aislable capaz de tener resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención pueden aplicarse a la tierra o a cualquier parte de la plantas que se está tratando, incluyendo los tallos y y hojas, florecimiento (para prevenir la internalización de patógenos en el fruto, por ejemplo, tomate), zona de enraizamiento y/o semillas de la plantas. Para actualmente aplicar la cepa o sustancia, existen, como se menciona en la presente, métodos convencionales tales como un método para aplicar gránulos a una raíz de planta o tierra y un método para aplicar un líquido diluido o un líquido no diluido a la raíz de la planta o tierra. Aparte estos métodos pueden adoptarse, por ejemplo, el mismo método de aspersión como un método para controlar enfermedades en una parte por arriba del suelo un método de revestimiento de semillas de planta con, o sumergiéndolas en, una mezcla o cada una de las cepas del género Paenibacillus o sustancia capaz de' inducir resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención, un portador sólido, un agente adhesivo denominado un aglutinante, y similares; un método para aplicar la cepa o sustancia mezclada con un fertilizante, una reconstrucción de tierra, composta y similares o aplicar la cepa o sustancia junto con éstos sin mezclar; y un método que utiliza un. material microbiano obtenido por la adsorción de la la cepa del género Paenibacillus o sustancia capaz de inducir resistencia a la enfermedad en plantas de la presente invención en un portador sólido y o sin agregarle a la misma nutrientes orgánicos (por ejemplo salvado, extracto de malta y aminoácidos), componentes fertilizantes, etc.

Ambas, a concentración de la dosis y de aplicación de tales formulaciones varían dependiendo de condiciones tales como la clase de la formulación,, un tiempo de aplicación, un sitio de aplicación, un método de aplicación, un método de cultivo, la clase de una planta de cultivo, la clase de una enfermedad de la planta, el grado de daño, etc., y puede aumentarse o reducirse independientemente de los intervalos antes mencionados.

Los siguientes ejemplos además demuestran varias modalidades de esta invención. A pesar de que los ejemplos ilustran la invención, no pretenden limitarla.

EJEMPLOS Las estructuras, materiales, composiciones, y métodos descritos en la presente pretenden ser ejemplos representativos de la invención, y se entenderá que el alcance de la invención no está limitado por el alcance de los ejemplos. Los expertos en la técnica reconocerán que la invención puede practicarse con variaciones en las estructuras, materiales, composiciones y métodos descritos, y tales variaciones son referidas como dentro del ámbito de la invención.

EJEMPLO 1. Identificación y caracterización de la cepa TS-15 de Paenibacillus alvei Las afecciones procedentes de alimentos se clasifican entre las más serias para preocupaciones de la salud pública, y de estas afecciones la salmonelosis permanece como una de las más comunes, causando aproximadamente 30,000 casos de afección gastrointestinal por año en E. U.A. solamente. Los tomates frescos, que se cultivan predominantemente en la Coste Este, han emergido como un vehículo de transmisión potencial y complejo para afecciones humanas causadas por Salmonela entérica serovar Newport . Con el fin de mitigar la incidencia de epidemias procedentes del tomate por Salmonela, son esenciales estrategias de intervención de sonido ecológico.

Este Ejemplo demuestra el descubrimiento de una nueva cepa bacteriana TS-15 en el género Paenibacillus que inhibe el cultivo de Salmonela y otros patógenos •'significativos procedentes de alimentos en la superficie de tomates y plantas de tomate, así como frutos, hojas y florecimiento de otras plantas. La cepa TS-15 no solamente antagoniza el cultivo de Salmonela, sino actualmente elimina las colonias preexistentes del patógeno encontrado . que contamina varios órganos del tomate, incluyendo fruto, hojas y florecimiento, y varios órganos de otras plantas.

El Ejemplo además evalúa la eficacia in vivo de dos antagonistas (A6-6i-x y TS-15) en tomates redondos rojos como agentes de biocontrol contra Salmonela. Los retos del tomate se condujeron después de 24 horas de co- inoculaciones de S. Newport y antagonistas en agua peptona regulada en pH en superficies de tomate esterilizadas. La recuperación en los tomates en donde los patógenos primero se agregaron reveló una reducción de un log en Salmonela viable para la cepa A6-6i-x. Notablemente, se encontró que la cepa TS-15 asociada con plantas de tomate, reveló una reducción de 6 log en Salmonela comparado con tomates inoculados con el patógeno solo. Cuando se agregó primero el antagonista, A6- 6i-x de nuevo reveló una modesta reducción de 1 loga mientras TS-15 produjo una caída precipitosa de cinco log en células vacunadas con Salmonela, previniendo completamente que el patógeno se recuperar en las superficies del fruto. Estos datos sugieren un papel para esta bacteria epifítica, y, en particular, TS-15, endémica para las regiones de cultivo de tomate del Atlántico- medio, como antagonistas naturalmente efectivos en la prevención de la contaminación de tomates por Salmonela .

Introducción : Los patógenos procedentes de alimentos representan un reto significativo y en crecimiento para la salud pública en E.U.A. y alrededor del mundo. La producción a gran escala y el reciente aumento en la importación de un arreglo diverso de comodidades alimentarias ha producido contaminaciones bacterianas que han estado implicadas en un número de i epidemias de enfermedades procedentes de los alimentos. Las afecciones procedentes de los alimentos se clasifican entre las más serias en preocupaciones de salud pública, y de estas afecciones la Salmonelosis sigue siendo la más común, causando aproximadamente 30,000 casos de afecciones gastrointestinales por año'" en. E.U.A. solamente. Muchos de estos casos han implicado tomates como un vehículo de transmisión en múltiples epidemias de Salmonela procedentes de los alimentos.

Debido a la prevalencia de epidemias inducidas por Salmonela y su efecto en la sociedad, tanto a nivel de salud como económica, deben desarrollares nuevas medidas y estrategias combativas e instituirse efectivamente con el fin de limitar la diseminación de epidemias asociadas con Salmonela . Con el fin de encontrar nuevos y naturales medios para proteger -el suministro de alimentos, la flora nativa de varias plantas asociadas con el producto así como plantas silvestres asociadas en proximidad a tierras de cultivo de producto se clasificaron para posible bacteria epifítica con actividad antagonista contra Salmonela Newport, una cepa común asociada con epidemias de tomate. El propósito de conducir la clasificación de bacterias y levaduras asociadas con las plantas fue activar y aislar microorganismos que ya eran nativos para estas tierras de cultivo del Atlántico medio, tienen una eficacia antagonista contra patógenos procedentes de alimentos en esas plantas nativas, y posteriormente, sirven en la re- introducción como un agente de biocontrol .

A través del sistema de clasificación multi-fase in vitro, que involucra el uso de ambos, Bioscreen, para ensayar los efectos de inhibición en caldo, y el uso del ensayo de tapón in vitro para ensayar la bacteria antagónica en micro-arenas competitivas para estudiar las interacciones entre S. Newport y los antagonistas potenciales, el aislamiento de varias bacterias asociadas con la planta natural se descubrieron del ambiente que bloquea el cultivo de S. Newport. El proceso de clasificación reveló dos Salmonela competitivas que inhiben la bacteria denotadas como A6-6i-x y TS-15.

Después de una extensa clasificación in vitro los antagonistas se ensayaron en la superficie de un tomate para atacar S. Newport que se colocó antes o después del antagonista. S. Newport se mezcló con PBS y colocó en la superficie del tomate y dejó secar. Después se colocó una mezcla del antagonista y TSB en la parte superior y dejó secar y después el tomate se colocó en una cámara con humedad en una incubadora a 30°C. Se repitió lo mismo pero colocando el antagonista primero y colocando la Salmonela arriba. El tomate se lavó en una bolsa de plástico estéril y la suspensión se plaqueó en placas XLD y después se contó. Las cepas mostraron diferentes resistencias de inhibición en la superficie del tomate con una surgiendo como un competidor claramente superior, identificado como TS-15. Esta bacteria puede tener un futuro como medidas de bicontrol para Salmonela y otros patógenos en productos del Atlántico medio y otras comodidades similares cultivadas en las" partes Sur y Oeste del país.

Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en este Ejemplo.

Materiales y Métodos : Aislamiento y Clasificación de la Cepa. Las m croflora nativa de varios órganos de planta incluyendo (hojas, brotes, raíces, y florecimiento) y tierra en varias regiones de cultivo de tomate de la Costa Este se examinaron. Tres gramos de material o tierra de planta se mezclaron por aproximadamente 5 minutos en 1 ' mi de salina regulada en pH con fosfato (PBS) . Se plaquearon 100 µ? sobre agar de Glucosa de Levadura Nutriente (NYGA, por sus siglas en inglés) . Se seleccionaron diez colonias con morfologías únicas que se desarrollaron dentro de las 48 .horas a 30°C bajo condiciones aeróbicas para purificación adicional. Estas colonias también se ensayaron utilizando la prueba de 3% de KOH. La prueba de KOH es una prueba rápida para la diferenciación Gram sin tinción.

La colonia de cultivos puros después se ensayó la actividad antagonista in vitro utilizando un método de tapón de agar como se explica en Visser R. y otros, Appl . Environ. Microbiol . 1986 552-555, que se incorpora en la presente en su totalidad.

En resumen, se hicieron placas se vertido de uno de los organismos de prueba mezclando 4 mi suspensión de un cultivo en placa nocturno con agua estéril en 20 mi de agar TSA. Después de la incubación 30°C durante la noche, los tapones de agar se perforaron del agar con un talador de acero inoxidable de 10 mm estéril. Los tapones de agar se colocaron en agar TSA con un césped de 106 células de Salmonela entérica serovar Newport e incubaron a 35°C. Las zonas claras "zonas de inhibición" que rodean los tapones se midieron a períodos de incubación de 24 horas (1 día), 48 horas (2 días), y 96 horas (4 días), respectivamente. El experimento se hizo por triplicado para asegurar la repetibilidad. - Los aislados con zonas más grandes de inhibición contra S. Newport se seleccionaron para pruebas adicionales y caracterización taxonómica.

Caracterizaciones fenotípica y bioquímica de los aislados con actividad antimicrobiana potencial. Las características morfológicas de los antagonistas potenciales se observaron por tinción Gram y tinción de esporas. Los aislados además se ensayaron con el sistema de identificación Bioquímica Vitek® 2 compact (BIOMERIEUX, INC., Durham, NC) . Las tarjetas colorimétricas VITEK® 2 compact se leyeron e interpretaron automáticamente con el sistema VITEK® 2 compact, versión 01.01b.

Amplificación y secuenciacion del gen ARNr 16S. El ADN genómico de los aislados se extrajo utilizando el kit de • purificación ' de ADN genómico WIZARD® (PROMEGA) . Un par de iniciadores universales específicos de ARNr 16S bacteriano, Eubac27 y R1492 (secuencias disponibles en DeLong y otros, E. F. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, " 1992 (89) : 5685-5689, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) , se utilizó para amplificar el gen ARNr 16S correspondiente. La amplificación PCR de ARNr 16S se realizó con un kit de polimerasa de ADN Hotstart Taq (QIAGEN, Valencia, CA) bajo las siguientes condiciones: después de una incubación inicial de 5-min a 95°C, la mezcla se sometió a 30 ciclos, cada uno incluyendo. 1 min a 95°C, 1 min a 58°C, y 1 min at 72°C. Se llevó- a cabo una extensión final a 72°C por 10 min. Los iniciadores 4F, 27F, 357F, 578F, 1000R, y 1492R se utilizaron para la secuenciacion (secuencias disponibles en González- Escalona y otros FEMS Microbiology Letters 2005 (246) : 213- 219, y Turner, S. y otros Journal of Eukaryotic Microbiology 1999 ; (46) : 327-338, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) . Se utilizó el algoritmo BLAST para búsqueda de homología contra Genbank. Solamente los resultados de las consultas con mayor puntaje se consideraron para la identificación del filotipo, con 99% de similitud mínima.

Determinación de la eficacia y amplio espectro de la inhibición in vitro. Los microbios candidato específicos que demostraron actividad antagonista in vitro contra S. Newport y por sí mismos generalmente son referidos como comensales para humanos . y tomates después - de identificación taxonómica después se sometieron al método de tapón de agar descrito anteriormente para determinar la eficacia contra un amplio espectro de patógenos principales procedentes de alimentos incluyendo Escherichla. raonocytogenes, Enterohacter sakazakii, Escherichia coli 0157 :H7, Shigella flexneri, Estafilococo aureus resistente a meticilina (MRSA) , y varias diferentes subespecies 'de Salmonela entérica . Los efectos bactericidas contra las cepas patogénicas en la zona de inhibición se confirmaron cuando los patógenos fueron incapaces dé revivir en placas TSA.

En un experimento separado, las actividades antimicrobianas se caracterizaron utilizando el ensayo Bioscreen. Específicamente, un cultivo durante la noche de S. Newport y otros patógenos principales procedentes de alimentos descritos anteriormente se diluyeron utilizando PBS y agregaron al sobrenadante de uno de los antagonistas candidato con concentración final de 104 cfu/ml células. The El sobrenadante se filtró esterilizado a través de un filtro de 0.22 um para uso. La densidad óptica a 600 nm se midió automáticamente cada 20 min durante 24 h en un Análisis de Curva de Cultivo Microbiológico Automatizado Bioscreen C (GROWTH CURVES USA, Piscata ay, NJ) . Para cada punto en el tiempo, se calculó la densidad óptica promedio de cinco mediciones independientes.

El Análisis de Curva de Cultivo Microbiológico Automatizado Bioscreen C mide directamente el crecimiento del microorganismo. Como con el crecimiento del microorganismo, aumenta la turbiedad de este medio con el tiempo, se puede generar una curva de una densidad óptica (O.D.) . La curva refleja el crecimiento (concentración aumentada) del organismo de interés. La información sobre el uso de una máquina Bioscreen C se puede encontrar en la literatura, por ejemplo, en: Dong Y, Palmer SR, Hasona A, Nagamori S, Kaback HR, Dalbey RE., Brady LJ, Functional overlap but lack of complete cross-complementation of Streptococus mutans and Escherichia coli YidC orthologs, Journal of Bacteriology 190: (2008) 2458-2469; ' George , SM, A. Metris A, Stringer SC, Physiological state of single cllss of Escherichia innocua in organic acids, International Journal of Food icrobiology 124: ,2008. 204-210; de Crecy E, Metzgar D, Alien C, Penicaud M, Lyons B, Hansen CJ, de Crecy-Lagard V, 2007. Development of a novel continuous culture device for experimental evolution of bacterial populations , Applied Microbiology and Biotechnology 77: (2007) 489-496; Tauk-Tornisielo SM, Vieira JM, Govone JS, Use of Bioscreen C for growth of Mucor hiemalis in different carbón and nitrogen sources, Brazilian 5 Journal of Microbiology 38: 2007. 113-117; Escalada MG, Russell AD, Maillard J-Y, Ochs D, Triclosan-bacteria interactions : single or múltiple target sites? Letters in Applied Microbrology 41: (2005) 476-481; y Brehm-Stecher BF, Johnson EA, Single-cell microbiology: tools, technologies, 10 and applications, Microbiology and Molecular Biology Reviews 68: (2004) 538-559, cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.

Evaluación de la Eficacia contra S. Newport en tomates. Se utilizaron tomates maduros redondos rojos (130 + 15 20 g cada uno) en cada experimento. Los tomates se compraron de un supermercado local y se almacenaron at 4°C por un máximo de 3 días antes de utilizarlos en los experimentos. La ¦ >· cepa de S. Newport se cultivó en 5 mi de TSB a · 37 °C durante la noche antes de utilizarla como la vacuna. Las células 20 bacterianas se lavaron dos veces con PBS y resuspendieron en 5 mi de PBS antes de aplicarlas a los tomates. Cada antagonista candidato de la cepa se cultivó en una placa TSA durante la noche para hacer un césped. Un cuarto del césped bacteriano se raspó de la placa TSA con un ciclo de 25 inoculación estéril y se transfirió a 10 mi de PBS. Las suspensiones de células se prepararon lavando las células bacterianas dos veces con PBS y resuspendiendo en 5 mi de TSB i fresco para todos los experimentos .

Los tomates se calentaron a temperatura ambiente (RT, por sus siglas en inglés) antes de cada experimento. Los tomates a RT se lavaron con agua caliente por 30 seg para remover cualquier aceite o cera (es decir, lustre) que se había aplicado' primero y después enjuagado con toallas 'de papel empapadas en 75% de etanol para la esterilización de la superficie. Los tomates limpios se colocaron la cicatriz del tallo hacia abajo en un anaquel de charolas de metal en un gabinete bio-seguro para el secado. Se aplicaron 20 ul de la suspensión de células de Salmonela a un círculo de 3 cm de diámetro en el lado en el que el tomate es equidistante desde ambos extremos del tomate. Después de secarse completamente, se colocaron 40 ul de la suspensión antagonista o 40 ul de TSB solamente arriba de la vacuna de Salmonela. Los tomates inoculados se pusieron en la cámara de humedad después del secado por una hora y media. La cámara de humedad se llenó con 1.5 L de agua, cerró y colocó en una incubadora a 30°C. Después de 24 horas cada tomate se colocó en una bolsa peto con 30 mi de PBS y .se masajeó a mano por 5 minutos para desprender la superficie inoculada con Salmonela. El agua de lavado con PBS se diluyó serialmente en PBS y la superficie se plaqueó en agar XLD .

Pruebas de Campo en túnel alto. El mejor antagonista candidato de la cepa se sometió a pruebas de i campo en un túnel alto por lo que la supervivencia de la Salmonela se reforzó en la presencia del antagonista en hojas, florecimiento y frutos de tomate de las plantas de tomate vivas, intactas, enteras de producción redonda. Las pruebas se realizaron en 2010 (de Julio a Septiembre)1 en cultivares de tomate BHN602 ' en' un túnel alto clasificado para insectos en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés) , en la grande norte del Centro de Investigación Agrícola de Beltsville (BARC, por sus siglas en inglés) , Beltsville, Maryland. Las plantas de tomate partieron de semillas en un invernadero en BARC. Los semilleros se cultivaron en mezcla de turba orgánica y se fertilizaron antes y después del trasplante. En el túnel alto, el fertilizante se suministró de un solo inyector a través de una cinta de goteo suplementada con una fuente de calcio aprobada por OMRI para prevenir la putrefacción del final del florecimiento. Se utilizó un mantillo de plástico negro para cubrir los 8 lechos de la plantación 60.96 x 609.6 cm (21 x 20') cada uno) sobre la cinta de goteo.

Los surcos para plantación se hicieron en un plástico negro a intervalos de 38.10 cm (15") para acomodar 13 trasplantes por lecho. Las plantas se apilaron y adaptaron con cordones de soporte de nailon cuando tuvieron una altura de 25.40 cm (10") . Las plantas se irrigaron inmediatamente después del trasplante y al menos semanalmente para obtener 2.54-3.81 cm (1-1.5") de agua y cumplir con los requerimientos de fertilidad. La humedad de la tierra se monitoreó por irrómetros y digitalmente en la estación climatológica Hobo que está localizada en el centro del túnel alto junto con temperatura, y RH, PAR, y sensores totales SR.

Se utilizó un dis.eño de parcela dividida con el efecto de parcela completa como Salmonela y antagonista [presente o ausente] y una sola dosis como sub-parcela ; los sitios de inoculación incluyendo hojas, florecimiento y fruto del tomate cada uno se asignó a una sub-parcela del segundo nivel, con cada sitio de inoculación como un experimento independiente; y el día de la cosecha después de la inoculación como una medida repetida. El segundo nivel corresponde a cosechas utilizadas para 0 días (2 hrs después de inoculación como un punto de referencia para el % de recuperación), 1 día, 2' días, 3 días, y 5 o 6 días de pruebas de persistencia, respectivamente. Se plantaron trece planas en cada parcela. Una planta en cada extremo de cada lecho sirvió como una planta que colinda no inoculada, dejando 11 replicados por parcela. _ La cepa atenuada S. Newport AtolC::aph y el antagonista la cepa TS-15 se utilizaron en esta prueba de campó. Tres hojas, florecimiento o tomates (en la etapa tardía v interrupción' a ^ojo') de cada planta se utilizaron para inoculación. Las suspensiones de TSB de la cepa S. Newport AtolC::aph después de lavarse dos veces en PBS se inocularon en sitio en las hojas marcadas (20 µ?) , florecimiento (10 µ?) , y tomates (20 µ?) con concentración final de ~109 CFU/ml. Los sitios de inoculación se dejaron secar con aire (~ 1 h) antes de aplicar el antagonista. Las suspensiones de células antagonistas se hicieron de césped de bacteria de la cepa TS-15. Después de un lavado de 2x de PBS, se utilizaron 10 mi de TSB para resuspender las células. Se aplicaron 40 µ? de la suspensión de células antagonista o TSB simple para el mismo sitio de inoculación en hojas y tomates, 10 µ? de florecimiento, de cada planta en el grupo de antagonista 'con' o 'sin', respectivamente.

Las hojas, florecimiento, y tomates se cosecharon en el día 0, día 1, día 2, día 3, y día 5 (para florecimiento) o día 6 (para hojas y tomates) después de la inoculación. Las hojas, florecimiento, o tomates inoculados de cada planta se removieron con tijeras estériles y se colocaron en una bolsa zip-lock de plástico, que se selló y transportó en una nevera portátil al laboratorio para análisis dentro de 1 h. Para las hojas y florecimiento, cada bolsa de muestra se agregó con 15 mi y 10 mi de PBS, respectivamente, y se frotaron a mano por 3 min para desprender las poblaciones de la superficie de Salmonela.

Para el tomate, cada bolsa de muestra se rellenó con 30 mi de PBS y se sometió a sonicación a 55 Hz/min por 30 seg. El PBS se diluyó o concentró a través de filtración (en puntos en el tiempo posteriores del experimento) y la superficie se plaqueó (0.1 mi por duplicado) en TSA-kan (50 pg/ml) . Las placas se incubaron a 37°C durante la noche y se contaron para colonias con resistencia a kanamicina. Se seleccionaron dos colonias aleatoriamente de cada placa TSA-kan y confirmaron por PCR utilizando un grüpo de iniciadores de verificación.

Supervivencia y persistencia de TS-15 en el campo. La supervivencia de la cepa antagonista TS-15 se evaluó en un campo de tomates en el Centro de Investigación Agrícola de la Costa Este de Virgina (AREC, por sus siglas en inglés) . En resumen, las filas del cultivar de tomate BH 602 se plantaron a mano con 1 m entre las hileras. Se seleccionaron quince plantas aleatoriamente para inoculación en cada hilera. Se mantuvieron dos hileras de plantas de tomate para rodear una hilera experimental y una hilera de control para cada punto en el tiempo y no se trataron. La biomasa del antagonista TS-15 se produjo en medio TSB en un matraz de 500 mi y después se transfirió a botellas de aspersión estériles, se transportó al campo sobre hielo, y utilizó dentro de 24 h. Se utilizó un método de inoculación por aspersión para imitar la llegada industrial de la vacuna al campo. La supervivencia de TS-15 en diferentes sitios de inoculación incluyendo hojas, florecimiento, tomates, y lecho de tierra se observaron en el día 0 (3 hrs después de la inoculación) , día 1, día 2, día 3, y día 4 después de la inoculación.

Efectos de diferentes fuentes de nitrógeno y carbono en cultivo in vi tro de TS-15. Con el fin de encontrar una fuente de carbono que soporte mejor el cultivo de TS-15 en medio mínimo e inhiba el cultivo de Salmonela al mismo tiempo, se examinaron ambos TS-15 y S. Newport para fenotipos celulares utilizando el Sistema de Microarreglo Fenotípico Biolog (PM) (Biolog, Inc., Hayward, CA) , que permite la clasificación simultánea de aproximadamente 1,200 fenotipos. Todos los materiales, medios y reactivos para el sistema PM se compraron de Biolog. Los experimentos PM se condujeron utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante, excepto que la bacteria almacenada a -86°C se veteó sobre placas de agar TSA en lugar de placas der agar BUG+B. Las placas PM se incubaron a 37°C en una incubadora Omnilog y las lecturas se registraron cada 15 min por 48 h. La respiración bacteriana se- evaluó dentro dé cada cavidad monitoreando la formación de color que resulta de la reducción del violeta tetrazolio (colorante A para S. Newport y colorante F para TS-15) , y la intensidad de color se expresó en unidades arbitrarias (AU) . .Los datos cinéticos se analizaron con el software OmniLog-PM de Biolog (OL_PM_Par 1.20.02, Dic. 08, 2005) . Los sustratos que mostraron una diferencia de dos veces (área debajo de la curva >15,000, unidades arbitrarias) , entre la cepa TS-15 y S. Newport se consideran como fuente de carbono potencial para TS-15. Los efectos de diferentes combinaciones de fuentes de carbono con diferentes formulaciones de medio mínimo en el cultivo de TS-15 y Salmonela además se caracterizaron utilizando los ensayos Bioscreen descritos anteriormente.

Análisis Estadístico. Los estimados del grado de reducción en conteos bacterianos' se obtuvieron adaptando un modelo lineal robusto de las CFU transformadas log en los días (día desde la inoculación) . Los declives de las líneas adaptadas de superficies tratadas y sin tratamiento se compararon para buscar las diferencias en los grados de reducción. El análisis se llevó a cabo utilizando el paquete de software estadístico R, versión 2.11.1, con la colección robusta. Los resultados se cuadran para cada combinación de ubicación de planta, antagonista, planta, y día. Dentro de cada ubicación der planta, tanto una prueba de regresión como una prueba de clasificación compararon el efecto de utilizar el antagonista con la que no lo usa. La cuenta de las placas dividió la suma de sus conteos por la suma de las masas de la muestra original que recibieron. Un procedimiento de imputación, explicado en Blodgett, R. J. , 2008 Mathematical treatment of platés with colony counts outside the acceptable range. Food Microbiology 25: 92-98 determinó las placas TNTC .

Purificación e identificación de compuestos antagonistas. Se cultivó P. alvei TS-15 en medio mínimo, y el cultivo se centrifugó a 4,000 rpm por 10 min. El sobrenadante se esterilizó por filtración utilizando un filtro de acetato i de celulosa de 0.22 um para obtener el sobrenadante de cultivo libre de células (CFCS) . CFCS se fraccionó utilizando un filtro de rector de 10 kDa de peso molecular (MILLPORE, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El filtrado se diluyó 1:1 utilizando agua de grado HPLC. ;¦ La muestra se acidificó con ácido trifluoroacético (TFA) (0.1% v/v de concentración final) antes del análisis HPLC. La separación se realizó en HPLC de la serie 1100 Agilent utilizando una columna Kinetex C18 (4.6 x 100 mm, PHENOMENEX, Torrance , CA) mantenida a 40°C. La fase móvil A se compuso de 0.1% de TFA mientras el 0.1% de TFA en acetonitrilp comprendió la fase móvil B. En resumen, se cargaron75 µ? de filtrado diluido en la columna y se enjuagaron con 97% fase móvil A a una velocidad de flujo de 1 ml/min para eliminar las sales.

La separación se logró utilizando un gradiente lineal de 97% a 20% de A en 8 min a 1 ml/min. El eluato se monitoreó por detección UV a 210 nm. El método anterior se desarrolló y optimizó utilizando nisina y polimixina B (SIGMA- ALDRICH, St . Louis, MO) como material de referencia.

Resultados: Aislamiento e identificación de la cepa productora antimicrobiana de tierra de tomate Un gran número de aislados ambientales del campo de tomate se clasificaron para actividad antimicrobiana contra S. Newport . Dos aislados, uno de superficie de hoja epifítico de vegetación nativa del Este y el otro de tierra de tomate de la Costa Este, mostraron diferentes áreas de inhibición en el agar TSA basal . Estos aislados formaron colonias pálidas y abundaron vigorosamente en TSA. Morfológicamente, los aislados de bacteria gram-positiva tuvieron forma de varilla, 0.7-0.95 cm por 3.18-3.42 cm (FIGS. 1A-1B) . Después de incubación prolongada en medio agar, las células produjeron endosporas centrales.

Los aislados son positivos para oxidasa, reducción de nitrato, licuefacción de gelatina, hidrolización de almidón, hidrólisis de caseína, fermentación de glucosa, y ureasa pero negativos para catalasa, producción de indol , y formación de H2S . La bacteria creció bien en caldo de TSB bajo , condiciones aeróbicas. El análisis genómico mostró que el gen ARNr 16S de ambos aislados comparte sobre el 99.0% de similitud de secuencia con el de Paenibacillus alvei. El análisis bioquímico VITEK confirmó la alta similitud de ambos aislados (> 99%) con P. alvei. De esta forma, se concluye que ambos aislados pertenecen a P. alvei, y se les dieron designaciones de cepa A6-6i-x y TS-15 respectivamente.

Espectro antimic obiano de células vegetativas y sobrenadantes de cultivo de P. alvei A6-6Í-X y TS-15. Los ensayos de tapón de agar in vi ro mostraron zonas de inhibición contra S. Newport y los otros cinco patógenos procedentes de alimentos principales cuando se retaron con ambos aislados P. alvei (FIGS. 2-A2B) . Notablemente, el antagonista migró hacia afuera del tapón después de la formación de la zona de inhibición en Shigella o Escherichia, y el anillo del cultivo del antagonista se expandió con el tiempo especialmente en el caso de Escherichia . Ambos A6-6i-x y TS-15 tuvieron un amplio intervalo de inhibición contra las especies MRSA (diámetro de zona de 15 a 25 mm) y mostraron fuertes efectos inhibidores en varias cepas MRSA ensayadas a pesar del hecho de que algunas cepas fueron resistentes a hasta 14 diferentes fármacos antimicrobianos. Las zonas de inhibición promedio de ambos A6-6i-x y TS-15 a diferentes puntos en el tiempo se presentan en las Figs . 3A-3B.

Cuando se ensayaron contra el panel de bacteria gram-negativa y gram-positiva utilizando el ensayo Bioscreen, ambos sobrenadantes de cultivo libre de célula (CFCS) A6-6i-x y TS-15 exhibieron un amplio espectro de actividad antimicrobiana, en donde la fase log se extendió significativamente en todos los patógenos ensayados (Fig. 4) . Además, la fase lag en ES (B. sakazakii) , -SF (S. flexneri) , LM (L. monocytogenes) , y algunas cepas MRSA se extendió a casi "24 h en ambos A6-6i-x y TS-15 CFCS. Adicionalmente, CFCS de TS-15 tuvo un efecto inhibidor más fuerte que A6-6i-x CFCS cuando se ensayó SN (S. Newport) .

Eficacia de P. alvei A6-6i-x y TS-15 en el fruto del tomate en cámaras húmedas. S. Newport mostró una reducción significativa en la superficie del tomate por ambos P. alvei A6-6i-x y TS-15. Sin embargo, al comparar el promedio de reducción ¾ log por A6-6i-x, TS-15 tuvo una reducción de 5 log en la población S. Newport que se aplicó al fruto del tomate (FIGS. 6A-6B) . El S. Newport recuperado de la superficie del tomate fue 100 veces menor en promedio que cuando el antagonista se agregó antes de la Salmonela en la superficie del tomate. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el grado de reducción independientemente de si o no el antagonista se inoculó primero o después de la inoculación S .

Pruebas de Campo en túnel alto utilizando P. alvei TS-15. Durante las pruebas de campo (duración de tres meses) la temperatura máxima diaria y RH variaron, respectivamente, entre 26.7 y 37.8°C y entre 56% y 80%: En el Día 0, las variaciones se detectaron entre el grupo sin TS-15 y el grupo con TS-15 en hojas y florecimiento pero no en el tomate en términos de la población de Salmonela después de la inoculación. Tomando todas las variaciones dentro del efecto, la concentración de Salmonela fue significativamente menor (p<0.05) en plantas con TS-15 en hojas, florecimiento, y tomates del día 1 al día 5 (para florecimiento) o día 6 (para hoja y tomate) (Figs. 7A-7D) . Notablemente, cerca del 100% de las planas de ' Salmonela solamente1 aún tienen niveles detectables de Salmonela al final de las pruebas de florecimiento y hoja, mientras solamente 2 plantas (<20%) tuvieron niveles detectables de Salmonela en el 'grupo antagonista' en la prueba de florecimiento y 6 plantas (~ 50%) en la prueba de hoja (FIG. 8) .

Además, el grado de reducción en la concentración bacteriana fue significativamente más alto (p<0.05) en hojas y florecimiento con TS-15 frente a aquellos sin TS-15, 12 veces de reducción por día contra 2.7 veces por día para hojas, y 8.9 veces contra 1.4 veces para florecimiento, respectivamente. Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el grado de mortalidad de Salmonela en el fruto del tomate en este estudio, A pesar, de que después de la inspección (FIG. 7C) , los conteos de Salmonela fueron sustancialmente inferiores en frutos de tomate tratados con TS-15 que en los frutos sin tratar.

Persistencia de P. alvei TS-15 en plantas de tomate en el campo. En la semana de las pruebas de campo hubieron 0.25 cm (0.1 pulgadas) de precipitación cada día en los primeros tres días del experimento. Al final de la prueba, alvei TS-15 persistió bien a través del experimento completo (4 días) en hojas, florecimiento, y tomates en más del 50% (8 de 15) de la plantas. En la tierra, TS-15 persistió por un tiempo mucho más corto. 50% de las muestras de tierra ya no tenían detección de P. alvei TS-15 después de 24 h, y TS-15 se encontró que persistió en solamente dos muestras de tierra de las 15 muestras después de 2 días (FIG. 9) . Es importante observar que no se encontró P. alvei TS-15 en las plantas de la muestra de control que no se inocularon con el antagonista, indicando la recuperación de la cepa introducida solamente.

" Crecimiento de P. alvei TS-15 en medio mínimo utilizando D-glucosa como la única fuente de carbono y levadura como la única fuente de nitrógeno. El impacto de diferentes fuentes de nitrógeno y fuentes de carbono en el cultivo de P. alvei TS-15 y en el efecto inhibidor máximo de P. alvei TS-15 contra S. Newport en el medio mínimo se demuestra en las FIGS . 10A - 11. El mejor cultivo de TS-15 fue en el medio mínimo con glucosa y D-Melezitosa (con o sin gelatina) , mientras el menor cultivo de TS-15 se observó en medio mínimo con tu'rañosa (FIG. 10A) . Además,' la glucosa, como la única fuente de carbono, confirió en TS-15 la respuesta inhibidora máxima contra S. Newport (FIG. 11) .

Además, la levadura es la fuente de nitrógeno que soporta el cultivo óptimo de TS-15 en medio mínimo (FIG. 10B) .

Caracterización de sobrenadante de cultivo libre de célula (CFCS) . El filtrado y retenato después de recorte molecular de 10 kDa (MWCO) filtración, y el filtrado y retenato después de otra filtración de 5 kDa MWCO se sometieron a ensayos de bioscreen para actividad. Los resultados del ensayo bioscreen mostraron que los controles A y B CFCS extendieron la fase lag del cultivo de S. Newport . Similarmente, el filtrado de 10 kDa y 5 kDa MWCO inhibe el cultivo de Salmonela a aproximadamente el mismo grado. En contraste, el retenato de ambos, 10 kDa y 5 kDa MWCO no desplegó inhibición del cultivo de Salmonela como sobrenadante de control (BHI) . Esto indica que los componentes responsables de la inhibición de la partición del crecimiento Salmonela para el filtrado de 5 kDa CFCS.

Conclusiones : Las dos bacterias antagónicas encontradas en el campo mostraron propiedades inhibidoras significativas contra S. Newport. Los datos muestran que la bacteria antagónica bacteria produce compuestos inhibidores que son efectivos contra Salmonela.

La prueba Bioscreen mostró que TS-15 fue significativamente más efectivo en la reducción de la cantidad de Salmonela en los ensayos de clasificación de caldo (FIG. 3B) . Se observó un efecto de línea plana para la cepa ,,TS-15 mientras la cepa A6-6i-x produjo un cambio bruto en la derecha de la curva de crecimiento. A6-6i-x aún fue efectivo pero no produjo un cambio tan grande como su contraparte. Es posible que TS-15 esté produciendo una cantidad mayor de los mismos compuestos que puede ser por lo que es su alineación plana en la curva de crecimiento. La otra posibilidad es que los compuestos que se están produciendo por TS-15 sean más poderosos que los producidos A6-6Í-X. Los compuestos actualmente se están analizando por su formación y propiedades.

La competencia en las placas TSA de ambas cepas contra S. Newport se ensayó en el ensayo de tapón que demostró que A6-6i-x fue capaz de producir zonas más grandes de inhibición y crecimiento que TS-15. Estos resultados implican que la cepa A6-6i-x es un cultivador más rápido que TS-15. Sin embargo puede haber un cambio entre que tan rápido puede crecer contra su producción de péptido antagonista.

Los datos del tomate sugieren que TS-15 es más efectivo en la remoción de Salmonela de la superficie del tomate así como en la prevención de su acoplamiento a la superficie según comparado con la cepa A6-6Í-X. TS-15 demostró un promedio de reducción de 105 log de S. Newport viable en la superficie de un tomate cuando S. Newport se colocó primero (FIG. 6A) . Este número incluye muchos puntos en donde hubo una completa remoción de todo el S. Newport. A6-6i-x mostró un promedio de reducción, de ½ log .cuando se aplicó al tomate que tuvo sobre el mismo S. Newport (FIG. 6B) . Cuando el antagonista se aplicó antes del S. Newport TS-15 mostró una reducción de 105 log mientras que A6-6i-x mostró una reducción de ¾ log. Esto sugiere que la cepa TS-15 es la cepa antagónica superior entre las dos.

Además, los datos muestran que TS-15, cuando se mezcla con fuentes de C y N formuladas (es decir, glucosa y extracto de levadura, respectivamente) , puede tener un efecto mejorado en el cultivo de TS-15, así como un refuerzo de los efectos inhibidores en Salmonela. En particular, la glucosa como la única fuente se carbono confirió sobre. TS-15 la máxima respuesta inhibidora contra S. Newport .

EJEMPLO 2. Mecanismo de internalización de Salmonela sp . en plantas de tomate.

El consumo de tomates frescos ha estado enlazado a numerosas epidemias procedentes de los alimentos que involucran varios serovars de Salmonela entérica . Los recientes avances en el entendimiento de las interacciones de plantas microbianas han demostrado que la bacteria entérica de patógeno humano, incluyendo S. entérica, está adaptada para ' sobrevivir en el ambiente de la planta. En este estudio, las plantas de tomate (cv. Micro-Tom) cultivadas en tierra de arcilla arenosa VES se inocularon con S. entérica serovars para evaluar las rutas de internalización plausibles y para determinar si existe cualquier adaptación de nicho para ciertos serovars.

Los hallazgos de este estudio demuestran que ambos la tierra infestada y los florecimientos contaminados pueden llevar a la contaminación del fruto interno de Salmonela con bajos niveles. Los serovars de Salmonela han desarrollado adaptación en el cultivo de tomate no solamente en la tierra, sino también en diferentes partes de la plana de tomate. De los cinco serovars inoculados, los serovars Newport y Javiana fueron dominantes en tierra de arcilla arenosa; Montevideo y Newport mostraron una gran adaptación en hojas y florecimiento. También se encontró que el serovar Typhimurium sobrevivió en todas "las partes de la planta examinadas aquí , indicando una posible ruta para contaminación de tomate con S. Typhimurium después de la cosecha. Por el otro lado, el serovar Newport fue el serovar más adaptado en la rizósfera de la tierra y en la planta de tomate en general. Las plantas justo después del trasplante (dentro de 3 días) tuvieron un aumentado grado de internalización indicando que las ' lantas justo después del trasplante fueron más susceptibles a la internalización. Estos resultados demuestran que el serovar Salmonela y la etapa de planta fueron dos factores importantes para la internalización a través del sistema de raíz, que puede explicar porque S. Newport se asocia repetidamente con epidemias de afecciones procedentes de los alimentos enlazadas a tomates de VES.

Introducción: Salmonela spp . no tifoidal son algunas de las causas principales de hospitalización debido a las afecciones procedentes de los alimentos En Estados Unidos (Scallan, E. y otros Emerg Infect Dis 2011 17: 7-15) . La incidencia de infección por Salmonela no ha declinado significativamente en i más de una década ((2011) Vital signs: incidence and trends of infection with patogens transmitted commonly through food— foodborne diseases active surveillance network, 10 U.S. sitios, 1996-2010. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 60: 749-755) . Por el otro lado, los frutos y vegetales de tallo de vid están cada vez más implicados como vehículos de Salmonela sp . , en epidemias procedentes de los alimentos ((2011) Surveillance for foodborne disease outbreaks— Estados Unidos, 2008. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 60: 1197-1202) . En particular, el consumo de tomates frescos ha estado enlazado a numerosas epidemias procedentes de los alimentos que involucran varios serovars de Salmonela entérica .

La contaminación de productos puede ocurrir durante la producción en campo o después de la cosecha en la planta de procesamiento. En la etapa de la pre-cosecha, se han examinado previamente · varias rutas potenciales para la colonización e internalización de S. entérica para contaminar frutos del tomate. Estos hallazgos apuntan hacia la irrigación con agua contaminada como una fuente potencial de la contaminación del fruto.

Sin embargo, la evidencia de que los serovars de S. entérica son capaces de entrar en los sistemas de planta de tomate a través de agua de irrigación contaminada permanece inconsistente. Hintz y otros (Hintz, L.D. y otros HortScience 2010 45: 675-678) reportó la aplicación de S. Newport en zona de raíz vía agua de irrigación que puede resultar en la contaminación de varios tejidos de la planta de tomate (cv. Solar Fire) cuando se muestrea a través de diferentes etapas de cultivo de la planta. Yet Jablasone y otros (Jablasone, J. y otros, Journal of the Science of Food and Agriculture 2004 84: 287-289) encontraron que no. se recuperó el tejido de planta de S. Enteritidis después de aplicar agua contaminada directamente sobre la tierra de macetas con tomates 'Cherry Gold' . Además, no hay evidencia de que S. Montevideo sobrevivió en los tallos, hojas, o fruto de la planta de tomate (cv. Trust) (Miles, J.M. y otros J Food Prot 2009 72: 849-852) . El florecimiento del tomate representa otra ruta potencial para contaminación de Salmonela . Cuando las flores del tomate 'Better Boy' se cepillaron con un coctel de cinco cepas de S. entérica (serovars Enteritidis, Hartford, Michigan, Montevideo, y Poona) , 25% del fruto madurado se encontró con al menos uno de los cinco serovars contaminado (Guo, X. y otros Appl Environ Microbiol 2001 67: 4760-4764). Más recientemente, Barak y otros (Barak, J.D. y otros Appl Environ Microbiol 2011 77: 498-504) demostraron que las poblaciones de filoesfera de S. entérica dieron como resultado la contaminación del fruto del tomate en el cultivar Micro-Tom. También se presenta evidencia por Gu y otros (Gu G. y otros PLoS One 2011 6: e27340) de que S. Typhimurium puede internalizarse en plantas de tomate vía las hojas con el agente tensioactivo Silwet L-77 y colonizar frutos a altos niveles sin inducir ninguno de los síntomas de la planta de tomate (cv. Florida lanai) .

La supervivencia de las poblaciones bacterianas en el ambiente de la planta por lo general está asociada directamente con ambos factores, planta y microbios. Entre los .cultivares de tomate, se han observado grados variables de contaminación de S. entérica. Barak y otros hipotetizan un papel para el cultivar de tomate en la interacción de Salmonela-tomate y encontraron que los niveles de población de S. entérica en las hojas de tomate dependen del cultivar. En el mismo estudio, las tricomas de tipo 1 fueron identificadas como sitios de colonización de hoja de tomate preferidos. Sin embargo, la habilidad de S. entérica para colonizar y sobrevivir en la planta de tomate probablemente no solamente depende del cultivar, sino también puede ser específico del serovar de Salmonela . Es decir, ciertos serovar (s) de S. entérica pueden estar mejor adaptados para sobrevivir en el micro-ambiente de la planta de tomate que otros. En este Ejemplo, las plantas de tomate (cv. Micro-Tom) se inocularon con serotipos S. entérica para evaluar las rutas de internalización plausibles y para constatar los niveles relativos de adaptación entre varios serovars más comúnmente asociados con el nicho de la planta de tomate.

Materiales y Métodos: Cultivos Bacterianos. Se obtuvieron cinco serotipos de Salmonela entérica de la colección de cultivo concentrada de la División de Microbiología, del Centro para Seguridad en Alimentos y Nutrición, de la Administración de Alimentos y Fármacos de E.U.A., College Park, MD: S. Newport (serogrupo C2) , S. Saintpaul (serogrupo B) , S. Javiana (serogrupo D) , S. Montevideo (serogrupo CI) , y S. Tphimurium (serogrupo B) . Estas cepas todas se aislaron de tomate o epidemias asociadas con los productos.

Preparación de la vacuna. Los cultivos concentrados se almacenaron en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI, por sus siglas en inglés) con 25% de glicerol a -80°C. Los cultivos se veneraron sobre placas de agar de soja tríptico (TSA) e incubaron a 35°C por 18 h. Posteriormente, se transfirió una sola colonia a. 5 mi de caldo de soja tríptico (TSB) a 35°C por 18 h. Cada cultivo se cosechó y centrifugó a 7,000 x g por 10 min y lavó con 0.01 M de salina regulada en pH con fosfato (pH 7.2) (PBS) tres veces. Los cultivos bacterianos se resuspendieron en 5 mi de PBS a una densidad óptica de 1.0, que se aproxima a 109 CFU/ml. Se combinaron iguale volúmenes de suspensiones de células de cada serotipo como vacuna para plantas de tomate. El coctel de 5 cepas además se diluyó en PBS a proporciones de 1:4 como vacuna para estudios de inoculación de tierra.

Preparación de la Planta. Las semillas de tomate esterilizadas en la superficie (Solarium lycopersicum 1 Micro-Tom') se plantaron en mezcla para macetas (SunGrow Metro-Mix) en el invernadero, USDA-BARC West, Beltsville, MD. A las dos semanas después del semillero, los semilleros se trasplantaron a tierra de la costa Este esterilizada con vapor (-300 g) en macetas de Azalea de 15.24 cm (6") de diámetro en un plato 1 pequeño para servir como un depósito de agua¡ para evitar el riego directo a las plantas. La tierra de la Costa Este se recolectó de la granja estación en Virginia Tech Agricultural Research Extensión Center (AREC) en Painter, VA. Las plantas se transfirieron a cámaras de cultivo con clima controlado Conviron E7/2 (Winnipeg, Canadá) para los experimentos. La temperatura de la cámara de cultivo se mantuvo a 25°C (día) y 23°C (noche) con un ciclo de día y noche de 12 h y humedad relativa de 65%. El pequeño plato se rellenó con aproximadamente 10 mm de agua a intervalos de 2 día '. Adicionalmente , las plantas recibieron tratamiento por aspersión en el tomate y florecimiento, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, según se desarrolló un amarillamiento para acelerar la cosecha y aumentar la producción. El fertilizante de pescado orgánico y .de alga marina de la Cosecha Neptuno (comprad de www.amazon.com) también se aplicó según fue necesario en todo el período de cultivo. Todas las macetas se distribuyeron aleatoriamente en toda la cámara de cultivo, y posteriormente se realizó el análisis de los datos utilizando un diseño completamente aleatorio .

Inoculación de la tierra con S. entérica . Se utilizó un total de veintidós semilleros a 1 semana después del trasplante en el experimento de la tierra. Las plantas se dividieron en dos grupos de tratamiento: un grupo de control (inoculado con PBS, 4 plantas) y un grupo experimental (inoculado con vacuna de tierra, 18 plantas) . Se inyectaron directamente 4 mi de vacuna de tierra (coctel de cinco cepas: PBS como una proporción en volumen de 1:4) o PBS en la tierra rizósfera utilizando una punta de pipeta. Un centro de la muestra de tierra de rizósfera (10 g) de cada planta se tomó con un sacacorchos estéril a 4, 8, y 16 días después de la inoculación para determinar la supervivencia de Salmonela. Alrededor de 100 colonias de Salmonela con 10 y 6 colonias de cada, muestra de tierra positiva a Salmonela se seleccionaron aleatoriamente: para vigilancia serológica" en el día 8 y 23 después de la inoculación, respectivamente. Los tallos de las 18 plantas se utilizaron para la recuperación de la Salmonela endofíticamente colonizada con el método descrito a continuación a 23 dpi (día ..después de la inoculación) .

; Inoculación de Hojas con S. entérica. Un total de veintidós semilleros se dividieron en dos grupos de tratamiento a 14 d después del trasplante: un grupo de control (inoculado con PBS, 4 plantas) y un grupo experimental (inoculado co coctel de cinco cepas, 18 plantas) . De 6 a 9 folíolos por planta se utilizaron para inoculación. Los folíolos se desempolvaron ligeramente con carborundo de malla 400 para desgastar las superficies y crear lesiones necesarias para la entrada de la bacteria. Se diseminó un total de 2 gotas de vacuna (5 µ? / gota) sobre la superficie superior del folíolo. Se muestrearon tres folíolos inoculador de cada planta con el escalpelo estéril a 0, 8, y 16 días después de la inoculación para determinar la supervivencia de Salmonela. Alrededor de 100 colonias de Salmonela con 10 y 8 colonias de cada muestra de ho a positiva a la Salmonela se seleccionó aleatoriamente para vigilancia serológica en el día 8 y 23 después de la inoculación, respectivamente.

Inoculación de la floración con S. entérica . Se dividió un total de 38 plantas en la etapa de florecimiento en dos grupos de tratamiento: un grupo de control (inoculado con PBS, 4 plantas) y un grupo experimental (inoculado con el coctel de cinco cepas, 34 plantas). Sobre 170 floraciones se pintaron con hisopos de algodón con la vacuna del coctel de 5 cepas. El florecimiento inoculado se marcó individualmente. Un florecimiento de cada planta se muestreó con un escalpelo estéril a 0 y 7 días después de la inoculación para determinar la supervivencia de Salmonela . Alrededor de colonias 100 Salmonela con 10 colonias de cada muestra de florecimiento positiva a Salmonela se seleccionó aleatoriamente para vigilancia serológica en el día 7 después de la inoculación.

Inoculación de tierra con S. entérica para el experimento de internalización. Se condujeron dos experimentos estratificados para investigar la translocación de S. entérica en plantas de tomate (cv. Micro.-Tom) de la tierra. En el primer experimento, se utilizó un total de 22 semilleros justo después del trasplante, con 18 inoculados y 4 soportes como controles. En el segundo experimento, se plantó un total de 24 semilleros. Las 24 macetas se distribuyeron uniformemente entre dos cámaras de cultivo. Una cámara contenía las plantas inoculadas justo después del trasplante. La otra cámara contuvo las plantas inoculadas 1 semana después del trasplante. Las plantas en cada cámara se dividieron en dos grupos de tratamiento: un grupo de control ' (inoculado con' PBS, 2 ' plantas) y un grupo experimental (inoculado con vacuna de tierra, 10 plantas) . Se inyectaron directamente en la vacuna de tierra (coctel de cinco cepas: PBS óomo una proporción en volumen de 1:4) o PBS en la tierra rizósfera utilizando una punta de pipeta estéril. Se utilizó un pequeño plato para servir como un depósito de agua para evitar las salpicaduras del riego directamente en la planta y no se hizo contacto entre el tratamiento y el resto de la planta para evitar la contaminación cruzada en todo el experimento. Los tallos de 6 plantas inoculadas en el primer experimento y las 20 plantas inoculadas en el segundo experimento se sometieron a aislamiento de Salmonela a 7 dpi. Las hojas superiores y medias así como las muestras de fruto se recolectaron en la etapa temprana del fruto en el primer experimento.

Procedimientos de Prueba de Muestras de tierra, hojas, y florecimiento. Cada muestra se transfirió asépticamente en una bolsa de filtro Whirl-Pak estéril individual. Se agregó peptona agua modificada con regulador de pH (mBPW) (9) a cada bolsa de muestra de tierra (20 mi) , folíolo (10 mi), o florecimiento (10 mi). Después de masaje a mano por 2 min, el homogenato se diluyó diez veces en PBS y se diseminaron alícuotas de 0.1 mi de las diluciones apropiadas en agar XLT-4 agar (Becton Dickinson y Company, Sparks, MD) . Después de 20 a 24 h de incubación a 37°C, la formación de la colonia típica de S. entérica se considera como presunta positiva. Las colonias presuntas positivas se transfirieron a agar de hierro azúcar triple (TSI) y declives de agar de hierro lisina (LIA) y se incubaron por 24 h a 35CC. El cultivo de los declives TSI positivos presuntos se confirmó como Salmonela con antisuero de grupo somático (Statens Serum Institute, Copenhague, Dinamarca) y la serotipificación molecular de Salmonela utilizando el sistema Luminex Bioplex (Fitzgerald, C. y otros, J Clin Microbiol 2007 45: 3323-3334; y McQuiston, J.R. y otros, J Clin Microbiol 2011 49: 565-573).

Recuperación de Salmonela endofí icamente colonizada de tallos. A 7 o 23 dpi, el tallo de 1 cm por arriba de la tierra se removió asépticamente de la planta. Después de la remoción de todas las ramificaciones laterales, el talló principal permaneció para el análisis. El agua, destilada estéril se utilizó inmediatamente para limpiar el exterior del tallo principal. Después del transporte de regreso al laboratorio en bolsas de plástico zip-lock, las muestras de tallo se sumergieron en 70% de etanol por 1 min, 5% de Clorox por 1 min, 70% de etanol por 1 min, y 1% de nitrato de plata (AgN03) por 20 min, respectivamente para humedecer la superficie y esterilización. Las muestras de tallo después se lavaron con ddH20 estéril por 1 min para eliminar el nitrato de plata. El tallo se dividió en piezas de 0.5 cm de- largo · con un escalpelo estéril "desde¦ arriba hacia el fondo, y la última pieza en el fondo se descartó. Cada pieza del tejido del tallo se colocó inmediatamente después del seccionamiento en la superficie de un medio agar XLT-4 en un orden posicional de arriba hacia abajo (Figs. 19A-19B) . La apariencia de las colonias típicas de Salmonela en XLT-4 se observaron diariamente por 3 días a RT para aislamiento adicional y confirmación como se describe anteriormente .

Las hojas medias y superiores se removieron asépticamente de la planta utilizando tijeras estériles. Las hojas se esterilizaron en la superficie rociando con 70% de etanol y dejando secar bajo una campana de flujo hasta que no quedo solución visiblemente (Hintz, L.D. y otros, Fruit, Roots, Stems, y Leaves . HortScience 2010 45: 675-678; y Miles, J.M. y otros, J Food Prot "2009 72: 849-52). Las hojas extirpadas se combinaron asépticamente en una bolsa peto para cada planta y trataron como una muestra individual.

Procedimiento de M estreo y Ensayo del Fruto. Para cada experimento, se cosecharon tanto frutos de tomate verdes como maduros rojos de plantas en los grupos experimental y de control. Para los experimentos de inoculación de tierra y hoja, se muestrearon aleatoriamente uno o dos frutos de cada planta para probar la presencia de S. entérica. Para experimentos de inoculación del florecimiento, se cosechó un total de 90 tomates, 71 producidos del florecimiento inoculado y 19 de florecimiento no inoculado, en el grupo experimental. Los tomates se recogieron asépticamente en una bolsa de filtro Whirl-Pak estéril individualmente utilizando escalpelos estériles y se transportaron al laboratorio. Se agregaron 10 mi de mBP a cada bolsa de muestra de tomate a temperatura ambiente (RT) . Las poblaciones de superficie potenciales se desprendieron a 2 minutos de restregar la bolsa. El tomate se removió de la suspensión de lavado mBPW y se sumergió en 70% de alcohol por 2 min para desinfectar la superficie y después se dejó secar bajo una campana de flujo laminar hasta que no quedó etanol visible. Los tomates de los grupos de control siempre se trataron al último utilizando el mismo etanol para confirmar la eficiencia de la desinfección cón'étanol . Después de remover asépticamente el pedículo y el cáliz, cada fruto después se colocó en una bolsa de filtro estéril Whirl-Pak con 10 mi de mBPW y se soportó por 60s a 230 rpm con un circulador stomacher® 400 (Seward, Londres, UK) . Ambos, las suspensiones de lavado mBPW y los homogenatos del fruto se incubaron por 24 h a 35°C. Las alícuotas de 0.1 mi de los pre-enriquecimientos incubados se sub-cultivaron a 10 mi de caldo de tetrationato (TT) . El caldo TT se incubó por 24 h a 35 °C. El caldo de enriquecimiento selectivo incubado se veteó (10 µ?) sobre placas de agar XLT-4. Después de 24 h de incubación a 35°C, la formación de la colonia de S. entérica típica se considera como presunta positiva y se transfirió a agar triple de hierro azúcar (TSI) y declives de agar hiero lisina (LIA) por 24 h a 35°C. El cultivo de declives TSI presuntos positivos se confirmó como Salmonela como se describe anteriormente.

Serotipificación Molecular. El protocolo estándar para determinación molecular de serotipo en Salmonela de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) fue seguido (CDC (2009)" por la Determinación Molecular del Protocolo Estándar del Serotipo en Salmonela. Workshop on Molecular determination de Serotype de Salmonela: Centers for Disease Control y Prevention, Atlanta, GA) . En resumen, el ensayo O-grp-1 (una reacción PCR séxtuple) (Fitzgerald, C. y otros, J Clin Microbiol 2007 45: 3323-3334) y el ensayo H-ag (una reacción PCR multiplé de 20 iniciadores) (McQuiston, J.R. y otros, J Clin Microbiol 2011 49: 565-573) se realizaron en un ciclador térmico con los siguientes parámetros: desnaturalización inicial a 15 min; después 30 ciclos de 94°C por 30 s, 48°C por 90 s, y 72°C por 90 s ; y 72 °C por 10 min. Los amplicones PCR después se utilizaron directamente con perlas acopladas (Radix Bio Solutions, Georgetown, TX) en la siguiente reacción de hibridación. Se agregaron 33 µ? de mezcla de perlas correspondiente a 5 µ? del producto de la PCR del ensayo O-grp-1 o ensayo H-ag y 12 µ? de regulador de pH TE en una sola cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades de bajo: perfil (Bio-Rad, Hercules, CA) . La mezcla de reacción se incubó primero por 5 min a 94°C y después por 30 min a 52°C para- desnaturalizar el ADN y permitir la hibridación de las sondas para los amplicones PCR. Las microesferas después se suspendieron en 75 µ? de regulador de pH de detección (R-estreptavidina conjugada con ficoeritrina [Life Technologies, Grand Island, NY] y se diluyeron a 4 pg/ml en regulador de pH de hibridación a 1XTMAC) . Lais muestras se incubaron por 10 minutos más a 52°C y después se analizaron en el Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA) . La intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) para cada grupo de perlas se calculó automáticamente por medio del software BioPlex. Se definió una señal positiva como un rendimiento de MFI de 6X la intensidad de · fluorescencia media para cada grupo de sondas de perlas.

Análisis Estadístico. Para la vigilancia serológica en colonias de Salmonela aisladas de las muestras de hoja, florecimiento y tierra, se calculó un porcentaje estimado y un intervalo de confianza (CI) para cada uno de los cinco serovars utilizado en el estudio. El porciento estimado es igual al número de muestras del serovar especificado dividido entre el número de muestras (alrededor de 100 colonias por cada tipo de muestra) . En el caso de un serovar (Typhimurium) que " no aparece en los datos de vigilancia, su unión de confianza superior fue la proporción más alta de tal forma que se observó que ninguno tuvo una oportunidad de 5% de aparecer. Por el contrario, todos los posibles resultados se ordenaron por el número de serovars del tipo especificado. El método de Clopper, C.J. y Pearson, E.S. se utilizó para calcular CI (Clopper, C.J. y otros, Biometika 1934 26: 404-413) . Es decir, la unión de confianza inferior es p mínimo de tal forma que Pr (todos los posibles resultados > el resultado actual) = 0.025. La unión de confianza superior es la p máxima de tal forma que Pr (todos los posibles resultados < el resultado actual) = 0.025. En ambos casos, p denota la probabilidad de que un serovar fue del tipo especificado .

Resultados : Supervivencia de S. entérica en la planta de tomate. La habilidad de S. entérica para persistir en plantas de tomate se indica por la detección de unidades formadoras de colonia (cfu) de Salmonela en muestras de rizósfera de tierra, folíolo, y florecimiento (Fig. 16) . La tendencia del cultivo de Salmonela varía a través de los sitios de inoculación. Por ejemplo, la Salmonela actualmente se cultiva en el florecimiento a pesar de que las concentraciones promedio de Salmonela disminuyeron en la tierra y en los folíolos durante el mismo transcurso del tiempo. Además, el declive en disminución en la supervivencia de la' Salmonela fue mucho más pronunciado en tierra que en los folíolos. Los números totales promedio de Salmonela cayeron a aproximadamente 104 cfu por gramo en tierra a 8 días después de la inoculación (dpi) , mientras los conteos de Salmonela se mantuvieron a alrededor de 106 cfu por folíolo a 8 dpi.

Colonización de plantas de tomate en nicho específica de serovar de S. entérica . El número de plantas colonizadas de Salmonela fue vio significativamente afectado por el serovar de S. entérica adicionado en tierra de rizósfera (?2=57.61; P<0.0001 en el día 23 después de la inoculación), hoja (?2=38.89; P<0.0001 en el día 23 después de la inoculación) y florecimiento (?2 =36.98; P<0.0001 en el día 7 después de la inoctilación) . Sorprendentemente, se observó un patrón de colonización diferente por los cinco serovar de S. entérica que comprenden el coctel de Salmonela con base en la clasificación de serología molecular (Figs. 17A-17E) . En particular, serovar de S. entérica Newport y Javiana colonizaron más fácilmente que otros serovars a ambos 8 dpi (Newport 33%, 95% de intervalo de confianza, 24% - 43%; Javiana 34%, 95% intervalo de confianza, 25% - 44%) y 23 dpi (Newport 62%, 95% intervalo de confianza, 52% - 71%; Javiana 27%, 95% intervalo de confianza, 19% - 37%) (Figs. 17A y 17B) . Por el otro lado, los serovars Montevideo y Newport mostraron mayor adaptación en hojas con el tiempo (Fig. 17D) . Además, la colonización se observó similarmente entre todos los serovars guardados para S. Typhimurium a 8 dpi (Fig. 17C) . En el florecimiento, se identificaron 51 colonias como S. Montevideo (95% de intervalo de confianza, 41% - 61%) de las 100 colonias positivas a Salmonela muestreadas, indicando su adaptación superior para este órgano de planta (Fig. 17E) . Es interesante notar que casi no se observó colonización de S. Typhimurium en ninguno de los órganos de planta estudiados en la presente.

Contaminación de fruto con S. entérica a través del florecimiento. Se cosecharon en total, 112 tomates cherry rojos/verdes y analizaron para la presencia de Salmonela (Tabla 1) .

Tabla 1. Contaminación de fruto del tomate con Salmonela entérica3.

S. entérica positiva # del tenate Grado Solo Solo Tanto de positivo superficie Adentro superficie como adentro Florecimiento Inoculado 70.4% 21 1 28 Grupo (71) Experimental Florecimiento no inoculado 58% (19) ^ Florecimiento . de control COntro1 (22) a Un coctel de cinco cepas se inoculó con florecimiento marcado individual de plantas de tomate. Todos los frutos del tomate derivados de flores inoculadas y no inoculadas en los grupos de experimental o control se cosecharon y clasificaron para poblaciones en superficie e interna de Salmonela.

Veintidós de estos tomates se originaron de plantas de control no inoculadas con Salmonela, y 90 de plantas inoculadas por cepillado de las flores, con inesperadamente 19 más del florecimiento adyacente que no fue inoculado con Salmonela. Es importante observar no se detectó Salmonela en tomates de plantas de control no inoculadas ya sea por medio de muestras enriquecidas plaqueadas de agua de lavado mBPW u homogenatos de pulpa de tomate. Sin embargo, la Salmonela se detectó en o dentro de los tomates que se desarrollaron de 5 florecimiento experimentalmente inoculado así como florecimiento no inoculado adyacente (Tabla 1) .

Adicionalmente , cincuenta de setenta y un tomates (70%) cosechados de florecimiento inoculado fueron positivos para Salmonela . De los cincuenta tomates positivos a 0 Salmonela, 21 contuvieron el patógeno en la superficie del fruto solamente, como la Salmonela se detectó solamente en agua de lavado mBPW pero no en el homogenato de tomate entero (Tabla 1) . Veintiocho tomates, sin embargo, se encontró que tiene Salmonela tanto en la superficie como internamente, y 5 un tomate se encontró que hospedó el patógeno internamente solamente (Tabla 1). Interesantemente, tres de 19 tomates cosechados del florecimiento no inoculado fueron positivos ' ·' ' para Salmonela también, ' con" dos retenciones de Salmonela en las superficies solamente y una con Salmonela tanto en la 0 superficie como en el interior. Además, se encontró que 17 tomates hospedaron más de un serotipo. Consistente con las observaciones previas anteriores, no se encontró S. Typhimurium dentro o sobre los tomates . A pesar de que serovar de S. entérica de Saintpaul fue el serovar más 5 prevalente aislado de la superficie de los tomates (25/52, 48%), S. Montevideo fue el serovar aislado más frecuentemente dentro de los tomates (11/30, 37%) (Fig. 18) . Aunque no existe una diferencia significativa entre los tomates de maduros de machacado y rojos en términos de grado positivo a Salmonela, se indica una significativa interacción entre la madurez del fruto (Verde contra Rojo/machacado) con respecto al positivismo de la Salmonela (p<0.05) (Tabla 2) .

Tabla 2. Contaminación de Salmonela entérica de frutos de tomate con respecta a la madurez del fruto.

Salmonela positivo (%) „, _. , ., Sobre/en Sobre Dentro Total3 Total de _ ' . , . tomate tomate del tomates , solamente tomate solamente 43 11 6 0 "(39-5%) O Machacado „ . 16(76.2%) 21 o tí U ^ R0^° 26 10 8 1 »(73.1%) a Valores seguidos por letra diferente son significativamente diferentes (P<0.05) Internalización y migración de S. entérica en plantas de tomate vía tierra. En el primer experimento de internalización, se recolectó un total de 48 muestras de planta de plantas inoculadas con 6 tallos recolectados a 7 días post-trasplante (PT) y 12 hojas superiores y medias y 30 frutos recolectados en la etapa temprana del fruto para la recuperación endofítica de Salmonela colonizada. Se recolectaron 18 muestras de planta en la etapa temprana del fruto de cuatro plantas de control (es decir no inoculadas) (4 tallos, 4 hojas, y 10 frutos) . Todas las hojas o frutos de tomate muestreadas se compusieron para cada planta después de la desinfección. Ninguna muestra de las plantas de control fue positiva para la presencia de Salmonela .

De la planas de tomate cultivadas con tierra infestada con Salmonela, 22% (4 de 18) contuvieron Salmonela endofíticamente colonizadas con base en el plaqueo directo o • procedimientos de enriquecimiento, incluyendo dos muestras de: tallo, una muestra de hoja, y una muestra de fruto. S. entérica de Saintpaul se aisló de la muestra de hoja positiva individual y S. Newport se encontró de la superficie y dentro de la muestra de tomate positiva individual. Más interesante, Salmonela fue capaz de moverse hasta 10 cm dentro del tallo en una semana después de la inoculación, y múltiples serovars incluyendo Newport, Montevideo y Saintpaul se recuperaron de diferentes piezas se segmento de tallo (Figs. 19A-19B) .

En el experimento de la segunda hilera, dos de diez muestras " dé tallo (20%) fueron positivas · para Salmonela endofíticamente colonizada cuando la planta se inoculó justo después de PT (dentro de 1-3 días) a pesar de no se recuperó la Salmonela de la plantas inoculadas 7 d PT (Tabla 3) . 1 5 Tabla 3. Recuperación de Sal onela entérica endofíticamente colonizada de planta tomate (cultivar: Micro-Tom)a.

Tiempo de plantas No . de No. de inoculación analizadas en positivos positivos después del cada para en total0 trasplante (PT) experimento Salmonela (%) Justo después de 18b 4 (22%) PT (dentro de 1- 10c 2 (20%) 6/28 A 3 días) 18d 0(0%) 7 d de PT 0/28 B 10c 0(0%) a Un coctel de cinco cepas se inoculó en la tierra de la zona de raíz de plantas de tomate. La presencia de S. entérica dentro de los tejidos de la planta se evaluó esterilizando el exterior de la muestra antes de la plantación directa o enriquecimiento. b Entre 18 plantas, solamente los tallos se muestrearon de 6 plantas en el día 7 día después de la inoculación (dpi) ; las hojas superior y media y los frutos de tomate se' muestrearon de las demás 12 plantas en la etapa temprana del fruto (las plantas tuvieron uno o más frutos verdes) . Las hojas o frutos se compusieron para cada planta después de la desinfección de la superficie. c Solamente los tallos se muestrearon a 7 dpi. d Solamente los tallos se muestrearon de plantas a 23 dpi. e Valores seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes (P<0.05).

La internalización Subce de Salmonela en planta de tomate (cv. Micro-Tom) se evidenció por la recuperación del tallo y fruto, la ventana del tiempo cuando puede ocurrir la internalización de Salmonela también se investigó. Al combinar todos los datos de tallo (Tabla 3) , surge una significativa interacción entre el tiempo de inoculación después del trasplante y la recuperación de Salmonela (?2 =7.7; P<0.01) endofítica. En otras palabras la Salmonela parece más probable que invada los sistemas de raíz y tallo después del trasplante comparado con 7 d de PT.

Conclusiones : Virginia tiene el tercer lugar en la nación, detrás de California y Florida, en la producción de tomate fresco en el mercado (USDA ERS, fecha de presentación. Vegetables and Melons : Tomatoes. USDA Economic Research Service. [En línea.]) . La mayor parte del número de acres de tomate de Virginia se localiza en la' Costa Este (VES) . Casi anualmente, desde el 2002, se ha documentado una epidemia o incidente asociado con el cultivo de tomate VES causados por Salmonela, específicamente S. Newport . Los estudios previos han demostrado la persistencia de Salmonela en varios nichos ecológicos de esta región agrícola (Barak, J. D., y A. S. Liang., PLoS One 2008 3:el657; Gorski, L. y otros, Appl Environ Microbiol 2011 77:2734-48; Hanning, I. B. y otros Foodborne Pathog Dis 2009 6:635-48; y Patchanee, P., B. y otros Foodborne Pathog Dis 2010 7:1113-20). Más recientemente i los datos de supervisión ecológica en granjas de tomate VES proporcionados por Sapkota y otros (Micallef, S. A. y otros, 5 Environmental Research 2012 114:31-39) produjeron evidencia adicional de que la Salmonela persiste en este micro-cosmos de cultivo de tomate. Esto se notó particular, en agua de estanques, por lo general utilizada para irrigación, o agua de arroyos que fluyen en corriente abajo desde el estanque, 0 sedimentos de estanque/arroyo, y tierra de rizósfera. El reciente aislamiento de una cepa S. Newport de un estanque de irrigación que coincide con la epidemia de la cepa (Greene, S. K. y otros, Epidemiol Infect 2005 136: 157-65) demostró que aún es posible que el agua de estanque contribuya a la 5 contaminación con Salmonela en tomates aún con la práctica del uso de irrigación por goteo o plasticultivos . Los estudios se han llevado e? cabo experimentalmente para ·¦' ' examinar posibles rutas para que S. entérica contamine la pre-cosecha de tomates. La Salmonela ha demostrado que se 0 internaliza en las plantas de tomate a través de las raíces (Hintz, L. D. y otros, HortScience 2010 45:675-678), hojas (Gu, G., J. y otros, PLoS One '2011 6:e27340), y florecimiento (Guo, X., J. y otros, Appl Environ Microbiol 2001 67:4760-4; y Shi, X. y otros, J Food Prot 2007 70:2725-31). Aquí, los 5 hallazgos proveyeron evidencia adicional al demostrar con un cultivar Micro-Tom (Barak, J. D. y otros, Appl Environ Microbiol 2011 77:498-504) el cultivo en tierra de arcilla arenosa VES, la Salmonela fue capaz de internalizarse dentro de las plantas de tomate a través ' de las raíces de la tierra y florecimiento inoculados, llevando a la contaminación de los frutos del tomate en desarrollo. Es notable que el grado de contaminación del fruto fue mucho mayor con la introducción de Salmonela a través de las flores (70.4%). Igualmente notable fue la observación de que después de que la Salmonela colonizó el florecimiento, no solamente proliferó sino también persistió al menos 35 días más en el desarrollo del fruto, acentuando el parcialmente alto riesgo, para la seguridad del tomate fresco.

Abundan opiniones contradictorias con respecto a si o no la Salmonela entérica puede internalizarse en las plantas de tomate a través del sistema de raíz (Guo, X. y otros, Appl Environ Microbiol 2002 68:3639-43; Hintz, L. D. y otros, HortScience 2010 45:675-678; y Miles', J. M. y otros, J Food Prot 2009 72:849-52). Los hallazgos descritos en la presente, sin embargo, revelaron que, aparte del cultivar, el tipo de serovar y el tiempo de introducción después del trasplante son dos factores clave que afectan . la internalización de la Salmonela a través del sistema de raíz. Bernstein y otros (Bernstein, N. y otros, Irrig. Sci. 2007 26: 1-8) han demostrado que S. Newport es capaz de persistir en el medio de sembrado por 4.7 a 10 semanas. En este estudio, los serovars Newport y Javiana parece que colonizan tierra de arcilla arenosa mucho mejor que otros serovars incluyendo S. Montevideo, S. Saintpaul, y S. Typhimurium. Específicamente, S. Newport se recuperó de 100% de muestras de plantas de tierra rizósfera clasificadas y 62% de la salmonela aislada 23 días después de la inoculación (dpi) . A través del descubrimiento de Salmonela endofítica de tallos, este estudio ilustra claramente que los factores dependientes del tiempo también son importantes para la internalización de la Salmonela a través del sistema de raíz. Es decir, la inoculación dentro de tres días después del trasplante (promedio 20%) produjo significativamente una recuperación más alta de Salmonela endofíticamente colonizada que una semana después del trasplante (0%) . Las lesiones o tensiones de la planta inducidas por factores abióticos (Hallmann, J. y otros, Canadian Journal of Microbiology 1997 43:895-914) durante el trasplante probablemente acentúan esta alteración observada por la entrada de la Salmonela. En la práctica, el cultivo de tomate se cultiva de plantas iniciadas en invernaderos, lechos calientes o estructuras frías. Los semilleros se trasplantan cuando tienen aproximadamente 5.08 cm (2 pulgadas) de alto. El trasplante tiende a promover el sistema de raíz principal natural en uno más fibroso, permitiendo una maduración temprana del fruto y una temporada más larga de cultivo (Weaver, J. E., y W. E. Bruner. 1927. Cápitulo XXVI: Tomato. Root Development of Vegetable Crops, Primera ed. McGraw-Hill Book Company, Inc., New York) . Sin embargo, la colonización de la raíz interior puede ocurrir pasivamente a través de las lesiones en raíces dañadas durante el trasplante (Hallmann, J. y otros, Canadian Journal of Microbiology 1997 43:895-914). Además, el bromuro de metilo ha tenido un gran "historial de uso en el cultivo de tomate como un fumigante de tierra en el este de Estados Unidos, y un reciente estudio metagenómico demostró que tales prácticas tienen un riesgo potencial aumentado para colonización de Salmonela y persistencia en la tierra. Tomados juntos estos hallazgos indican que la Salmonela puede introducirse en la tierra vía agua de irrigación potencialmente contaminadas. En VES, ciertos serovars, tales como S. Newport , están bien adaptados a la tierra y cultivos de tomate. Durante la etapa de trasplante, una planta de tomate es más susceptible a la internalización, por lo tanto aumentando la aparición de la internalización de Salmonela en la planta, y, posteriormente, causando un riesgo aumentado de contaminación con Salmonela de la pre-cosecha de frutos del tomate .

No de manera sorprendente, este estudio falló al recuperar Salmonela de frutos de tomate vía la hoja inoculada. No puede haber recuperación de Salmonela de otras superficies de la hoja o frutos del tomate debido al uso de pequeños platos como depósitos de agua, de esta forma evitando la salpicadura del agua directa en la planta, y la contaminación cruzada en todo el experimento. La internalización de la Salmonela en la presencia de carborundo u otros agentes tensioactivos , puede no ser significativa para las superficies de las hojas como el grado de contaminación interna del fruto es significativamente bajo a este respecto (Gu, G. y otros, PLoS One 2011 6:e27340) . Con el número de plantas utilizadas en este estudio, cualquier observación de contaminación con Salmonela de frutos del tomate a través de la hoja inoculada puede ser un mero evento aleatorio .

Se han reportado concurrentemente múltiples serovars de Salmonela en la misma agu dulce (Haley, B. J. y otros, Appl Environ Microbiol 2009 75: 1248-55; y Patchanee, P. y otros, Foodborne Pathog Dis 2010 7: 1113-20) y sedimentos (Haley, B . J . - y- otros , Appl Environ Microbiol 2009' 75: 1248-55; Micallef, S. A. y otros, Environmental Research 2012 114:31-39; y Patchanee, P. y otros, Foodborne Pathog Dis 2010 7: 1113-20). Sin embargo, solamente unos cuantos serovars de Salmonela están enlazados repetidamente a epidemias asociadas con tomates sugiriendo que ciertos serovars están más adaptados al entorno de la planta de tomate. En visa de la adaptación de nicho específica de serovar, las cepas de diferentes serovars que previamente se asociaron con epidemias enlazadas a tomate o productos se seleccionaron, y se introdujo un coctel de cinco cepas en este estudio según opuesto a la inoculación de diferentes serovars individualmente. Yendo más allá de una demostración de la competencia de serovar básica, este estudio demuestra claramente las interacciones del serovar-cultivo de tomate específicas en diferentes partes de la planta de tomate incluyendo tierra de rizósfera, hoja, y florecimiento. S. Newport es el más persistente y dominante serovar con el tiempo en la tierra de rizósfera.

Inversamente, no se observaron diferencias entre los serovars en hojas en términos de prevalencia con la excepción de S. Typhimurium a 7dpi . Fue notable, sin embargo, que con el tiempo, S. Montevideo y S. Newport parecen estar mejor adaptados a la supervivencia en el micro-cosmos de la hoja. Guo y otros (Guo, X. y otros, Appl Environ Microbiol 2001 ' 67 : 4760-4) y' Shi .y otros (Shi, X. y otros, J Food Prot 2007 70:2725-31) ambos reportaron que S. Montevideo fue el seroyar más persistente recuperado dentro de los tomates por la introducción a través del lorecimiento de plantas en cultivo. En línea con estos hallazgos, este estudio afirma que la adaptación de S. Montevideo al florecimiento del tomate, seguido por los serovars Newport y Javiana. Todos los serovars de Salmonela se introdujeron en el florecimiento excepto S. Typhiraurium se recuperó dentro del desarrollo de los frutos del tomate a un nivel similar (P>0.05) aunque Montevideo se aisló más frecuentemente dentro de los tomates. Sin embargo, cuando se toma en cuenta el factor de madurez del tomate, ambos, S. Montevideo y S. Newport estuvieron mejor adaptados (P<0.05) que los otros serovars . Consistente con los hallazgos de García (García, R. y otros, Appl Environ Microbiól '2010 76:5025-31), se nota en la presente que S. Typhimurium sobrevivió pobremente en todas las parte de la plana examinadas en este estudio, sugiriendo que la contaminación del tomate por S. Typhimurium puede ser más post-cosecha en esta etiología.

Como se mencionó anteriormente, se observó una significante diferencia en la recuperación de la Salmonela de tomates en términos de madures: del fruto. Los tomates "Asidos a la vid" en la etapa de tomates en la etapa de rojo, medio/tardía de desarrollo puede permitir una gran oportunidad de contaminación con Salmonela, ya que durante la madurez en los tomates, las declinaciones en los niveles de ácido están acompañadas por aumentos en azúcares y licopeno pero se pierde la integridad de la pared celular de la planta (Anthon, G. E. y otros, J Sci Food Agrie 2011 91: 1175-81). Estos cambios favorecen la supervivencia bacteriana mejorada e indican que los tomates asidos a la vid en el campo demasiado tiempo aumenta el riesgo de contaminación en la pre-cosecha de frutos dirigidos hacia el mercado de recién cortados.

En resumen, este estudio aclara la internalización de Salmonela a través de la absorción en la raíz en plantas de tomate sanas. Los resultados descritos en la presente indican que la internalización a través del sistema de raíz es una función del serovar y la etapa de la planta. Estos datos también demuestran categóricamente que ambos, la tierra infestada y el florecimiento contaminado pueden llevar a la. contaminación del fruto. ' : EJEMPLO 3: Eficacia de TS-15 contra tres patógenos principales asociados con tomate/pimiento TS-15 y A6-6Í se sometieron al método de tapón de agar in vitro descrito previamente para determinar la eficacia contra tres patógenos de planta principales asociados con tomate/pimiento incluyendo Pseudomonas syringae pv. Tomato, Ralstonia solanacearum, y Erwinia carotovora subsp . carotovora. La zona de inhibición se midió en el día 1, día 2, y día 4, respectivamente. Las placas de agar representativas del' día 1 se muestran en la Fig. 20. Los resultados demuestran que el agente de control no solamente controlará Salmonela y otros patógenos entéricos humanos procedentes de alimentos, sino también controlarán Ralstonia solanacearum., que causa marchitación bacteriana de tomate y pimiento, y Pseudomonas syringae pv. tomato, que es la causa de manchas bacterianas en el tomate y Arabidopsis. Además, el agente de control también inhibe Erwinia carotovora pv. tomato, que causa ligera putrefacción de los tallos del tomate .

EJEMPLO 4; Para determinar la supervivencia y persistencia de TS-15 en el campo de tomates en medio mínimo con glucosa y extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente, durante un período de tres meses.

La supervivencia del antagonista de la cepa TS-15 durante un período de fres meses se evaluará ;en un campo de tomates en el Centro de Investigación y Extensión Agrícola de la Costa Este de Virginia (AREC) . En resumen, las hileras del cultivar de tomate BHN602 se plantarán a mano con 1 m entre las hileras. Se seleccionaron quince plantas aleatoriamente para inoculación en cada hilera. Las hileras de los bordes de plantas de tomate se mantendrán rodeando una hilera experimental y una hilera de control para cada punto en el tiempo y no se trataran. La biomasa del antagonista TS-15 se producirá en medio mínimo con glucosa y extracto de levadura como' fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente ,¦ enJ un matraz de 500 mi y después se transferirá a botellas de roció estériles, transportadas al campo sobre hielo, y utilizadas dentro de las 24 h. Un método de aislamiento por aspersión se utilizará para imitar la llegada industrial de la vacuna en el campo. La supervivencia de TS-15 a diferentes sitios de inoculación incluyendo hoja, florecimiento, tomate, y lecho de tierra se observará en el día 0 (3 hrs después de la inoculación), 1 mes, 2 meses, y 3 meses después de la inoculación .

EJEMPLO 5; Para desarrollar un mutante más adaptado de TS-15 que guarda mayor resistencia a la radiación UV Esto es importante ya que el agente de control se aplica en el campo en donde será afectado por la radiación UV y solar, particularmente cerca de las áreas corona no sombreadas de las plantas de tomate y pimiento. Esto involucrará una serie de experimentos de selección en el laboratorio con base en los tiempos de exposición determinados y sub- letales para fuentes de radiación UV de la misma longitud de onda emitida por el Sol . Una vez que se encuentran los mutantes con un aumentado vigor al asalto de UV, su rendimiento como cepa de biocontrol contra Salmonela se evaluará. Finalmente su rendimiento bajo condiciones de luz solar actuales se evaluará. Se espera un efecto potenciador debido a que más células persistirán por períodos de tiempo más largos en las coronas de las plantas y a pesar del bombardeo UV durante los meses del verano durante la temporada de cultivo.

EJEMPLO 6: Uso de TS-15 como aplicación de control biológico con otros miembros de la familia Nightshade (Solanácea) y en particular, pimientos en el género Capsicum.

El pimiento Bell y varias variedades de pimientos picantes se someterán en un laboratorio similar y pruebas de túnel alto cepa de biocontrol TS-15 y Salmonela entérica . Dadas las similitudes entre plantas y frutos de tomate y las plantas y pimientos Capsicum, el efecto se espera que sea similar en pimientos como el que se observa en todos los órganos de plantas de tomate.

EJEMPLO 7 : Análisis de microarreglo fenotípico TS-15 y S. Newport se examinaron para fenotipos celulares utilizando el Sistema de Microarreglo Fenotípico Biolog (PM) (BIOLOG, INC., Hayward, CA) , que permite la clasificación simultánea de aproximadamente 1,200 fenotipos. Todos los materiales, medios y reactivos para el sistema PM se compraron de Biolog. Los experimentos PM se condujeron utilizando las condiciones recomendadas por el f bricante. Las placas PM se incubaron a 37 °C en una incubadora Omnilog y las lecturas se registraron cada 15 min por 48 h. La respiración bacteriana se evaluó dentro de cada cavidad monitoreando la formación de color resultante de la reducción de violeta de tetrazolio (tinte A) , y la intensidad de color se expresó en unidades arbitrarias (AU) . Los datos cinéticos se analizaron con el software OmniLog-PM de Biolog (0L_PM_Parl .20.02, Dic. 08, 2005) . Los sustratos de carbono y nitrógeno que muestran diferencias de + 1.5-yeces^ (j15000 área bajo la curva, unidades arbitrarias) entre entre TS-15 (verde) y S. Newport (rojo) se consideran como aditivos potenciales para futuras clasificaciones (amarillo es el área de traslape) . Las fuentes de carbono y nitrógeno después pueden evaluarse para identificar las que permiten o refuerzan el cultivo de TS-15, pero son inhibidoras o al menos no promueven el cultivo de Salmonela . Ver FIGS. 15A-15E.

EJEMPLO 8; Parar determinar el efecto de la aplicación de P. alvei TS-15 en la calidad y cantidad de tomate en la producción comercial Un total de 11 hileras internas (50 plantas / hilera) en una instalación de granja comercial se utilizará para determinar la ventana óptima para la distribución de TS-15 en la producción comercial de plantas de tomate. En este ejemplo, 4 hileras serán hileras experimentales, 4 hileras serán hileras de control, y 3 hileras se utilizarán como hileras de borde entre los grupos de control y de pruebas. Una de las hileras en el bloque experimental se asignará aleatoriamente a uno de los 4 tratamientos, incluyendo (1) aplicación ' de *P. alvei TS-15 en caldo de soja tríptico justo antes del trasplanten; (2) aplicación de P. alvei TS-15 en medio Landy (medio de sal) justo antes de trasplante; (3) aplicación de P. alvei TS-15 en caldo de soja tríptico durante la etapa temprana del fruto; (4) aplicación de P. alvei TS-15 en medio Landy durante la etapa temprana del fruto;. Una de las hileras en el bloque de control se asignará aleatoriamente a uno de los 4 controles, incluyendo (1) la aplicación de caldo de soja tríptico solamente justo antes del trasplante; (2) aplicación de medio Landy justo antes del trasplante; (3) aplicación de caldo de soja tríptico solamente durante la etapa temprana del fruto; (4) aplicación de medio Landy solamente durante la etapa temprana del fruto. En la etapa de recolección del tomate comercial, varias plantas de tomate aleatoriamente recolectadas en cada hilera se someterán a separación' dé arriba hacia abajo para evaluar la calidad y cantidad de tomate bajo el tratamiento en general.

EJEMPLO 9: Estudio de Seguridad en Animales Para evaluar la seguridad de los agentes de biocontrol, se conducirá un estudio de seguridad en animales de dos fases. La fase 1 evaluará la sensibilidad específica del género de exposición oral al organismo de prueba Paenibacillus alvei TS-15 en animales adultos, mientras la Fase 2 evaluará el efecto de la exposición maternal oral al organismo de prueba P. alvei en el desarrollo fetal.

Se utilizará un total de 224 animales en la Fase 1 de este estudio. Se utilizarán Ratas Charles CD IGS VAF/+ (n= 112 hembras; n= 112 machos) , de 8 - 10 semanas de edad en esta fase. Las ratas macho y hembra se asignarán a uno de los . 4 grupos de tratamiento por peso utilizando un procedimiento aleatorio estratificado. Los grupos de prueba incluyen: Grupo 1 = Grupo de Control (caldo de soja tríptico; TSB) ; Grupo 2 = 1 x 108 P. alvei CFU/mlTSB; Grupo 3 =1 x 104 P. alvei CFU/ml TSB; Grupo 4 = 1 x 102 P. alvei CFU/ml TSB . Cada grupo contendrá 28 ratas macho y 28 ratas hembra. Cada grupo se le administrará el organismo de prueba por cebadura al volumen y concentración manifestada anteriormente una vez, este punto en el tiempo se considerará como exposición del día 0. Los animales de cada grupo de tratamiento se sacrificarán en los días 7, 14, 21 o 28 después de la exposición. Durante el curso del estudio, los pesos corporales de los animales, los pesos de las tazas de alimento, los pesos de las botellas de agua y la temperatura se registrarán diariamente. Los animales de todos los grupos experimentales se observarán diariamente para signos de toxicidad aparente de exposición a P. alvei TS-15. Los animales encontrados en una condición mórbida y los animales que mostraron dolor severo y signos permanentes de tensión severa se sacrificarán humanamente. Los animales sacrificados por razones humanas se consideran equívocos para animales. que murieron en la prueba. ¦ Un total de 120 animales se utilizarán en la Fase 2 de este estudio. Se utilizarán Ratas Charles River CD IGS VAF/+ (n= 60 hembras; n= 30 machos) , de 8 - 10 semanas de edad en esta fase. Las ratas macho _ se utilizarán como sementales y no serán expuestas al organismo de prueba. Las ratas hembra se asignarán a uno de los tres grupos de tratamiento por peso utilizando un procedimiento aleatorio estratificado. Los grupos de prueba incluyen: Grupo 1 = Grupo de Control (TSB) ; Grupo 2 =1 x 104 P. alvei CFU/ml TSB ; Grupo 3 = 1 x 102 P. alvei CFU/ml TSB. Cada grupo contendrá 20 ratas hembra. Después del apareamiento, los animales preñados se expondrán al organismo de control o de prueba cada 6° día en todo el período de gestación. El día que se encuentre que una hembra se ha apareado (tapón/esperma positivo) se considerará el día 0 del embarazo. Cada hembra se pesará en este día y se le dará una taza de alimento recién llenada y una botella de fluido fresca. En el día 20 de la gestación (GD-20) los animales preñados se sacrificarán y los úteros grávidos serán removidos totalmente y pesados . El número de corpora lútea, el número de sitios de implante, y el número y posición de los sitios de resorción y fetos (muertos o vivos) se reportarán. Cada feto viable será examinado individualmente y los registros se mantendrán según su posición uterina, sexo, peso, anormalidades externamente visibles y longitud de l corona trasera. Los fetos se sacrificaran utilizando hielo seco y posteriormente se colocaran en fijación Bouins para la evaluación del anormalidades del tejido blanco o en etanol para la evaluación de anormalidades del esqueleto. Los animales para todos los grupos experimentales se observarán diariamente para signos de toxicidad aparente por exposición a P. alvei TS-15. Los animales encontrados en una condición mórbida y los animales que mostraron dolor severo y signos permanentes de tensión severa se sacrificarán humanamente. Los animales i sacrificados por razones humanas se consideran equívocos para animales que murieron en la prueba.

Las siguientes referencias se incorporan en la presente por referencia y pueden citarse como soporte de respaldo adicional de esta especificación. (1) Visser R. Appl . Environ. Microbiol . 1986 552- 555. (2) Wanger, A. Antibiotic Susceptibility Testing. 2009 149-159, in Goldman E., y Green L . H. Practical handbook de icrobiology, 2a edición. (3) DeLong, E. F. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1992 (89) : 5685-5689. (4) González-Escalona y otros 2005 Polymorphism and gen conversión of the 16S rRNA genes in the múltiple rRNA operons of Vibrio parahaemolyticus . FEMS Microbiology Letters 246: 213-219. - (5) Turner, S., Pryer, K.M. , Miao, V.P. ., y Palmer, J.D. 1999. Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis. Journal, of Eukaryotic Microbiology 46: 327-338. (6) Blodgett, R. J., 2008 Mathematical treatment of plates with colony counts outside the acceptable range. Food Microbiology 25: 92-98.

Habiendo descrito de esta forma con detalle las modalidades preferidas de la presente invención, se entiende que la invención definida por los párrafos anteriores no estará limitada a detalles particulares determinados en la descripción anterior como muchas variaciones evidentes la misma son posibles sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia al mismo grado como si cada patente y publicación independiente fuera específica e individualmente indicada para ser incorporada por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (58)

REIVINDICACIONES i Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para inhibir; eliminar o prevenir el cultivo de un patógeno de planta o humano en la superficie de una planta u órgano de planta, caracterizado porque comprende poner el contacto la planta u órgano de planta con una composición que comprende las cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la planta u órgano de planta es una planta de tomate, flor del tomate, tomate, planta de pimiento, pimiento, melón, verduras frondosas, o apio.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacter, Lísteria o Estafilococo.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es Salmonela entérica serovar Newport.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es E. coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo áureas, o histeria monocytogenes .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el patógeno de planta es Clavibacter michiganensis pv. michiganensis , Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum, o Erwinia carotovora subsp. carotovora .

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la composición se pone en contacto con la planta u órgano de planta dentro de 72 horas después del trasplante de la planta.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la planta es un semillero inmaduro.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la composición se pone en contacto con el semillero inmaduro cuando el semillero se planta iniciálmente .

10. Un método para tratar o prevenir una infección procedente de los alimentos en un sujeto que ha sido expuesto a un producto alimenticio contaminado con un patógeno humano procedente de los alimentos, caracterizado porque comprende administrar un probiótico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacter, Listeria o Estafilococo.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es Salmonela entérica serovar Newport .

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es E. coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo áureas, o Listeria monocytogenes .

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque el probiótico es un líquido, pildora, o producto alimenticio.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el producto alimenticio es un producto lácteo.

16. Un método para hacer un mutante de la cepa Paenibacillus alvei TS-15, caracterizado porque comprende mutagenizar la cepa Paenibacillus alvei TS-15 y aislar uno o más mutantes candidato que retienen el mismo o sustancialmente el mismo nivel de actividad antagónica como la cepa progenitora, pero que comprende al menos una características alterada adicional que puede impartir una ventaja selectiva.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la al menos una características alterada adicional es aumentada resistencia a UV, aumentada resistencia a la desecación, y aumentada resistencia a antibióticos .

18. Una cepa aislada de Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes, caracterizada porque es capaz de inhibir o eliminar el cultivo de un patógeno humano procedente de los alimentos o un patógeno de planta en una planta u órgano de planta .

19. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el patógeno humano procedente de los alimentos es una especie de Salmonela, Escherichia, histeria, Shigella, Enterobacter y Estafilococo .

20. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el patógeno humano procedente de los alimentos es Salmonela entérica serovar Newport.

21. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el patógeno humano procedente de los alimentos es E. coli 0157:H7.

22. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el patógeno de planta es Clavibacter michiganensis pv. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum, o Erwinia carotovora subsp . carotovora.

23. La cepa TS-15 o uno de sus imitantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la planta u órgano de planta es de la familia de las Solanáceas (o familia Nightshade) .

24. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la planta u órgano de planta es una planta de tomate o uno de sus órganos.

25. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la planta u órgano de planta es una planta de pimiento o uno de sus órganos.

26. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque la planta u órgano de planta es un fruto o vegetal producido por la planta.

27. La cepa TS-15 o uno de sus mutantes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, caracterizada porque el mutante es un mutante resistente a UV, mutante resistente a desecante, o mutante resistente a antibióticos .

28. Una composición para antagonizar el cultivo de un patógeno humano o patógeno de planta en la superficie de una planta u órgano de planta, caracterizada porque comprende la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes o uno de sus extractos extracelulares , en donde la composición opcionalmente comprende una sola fuente de carbono y nitrógeno que se optimiza para mejorar los efectos de TS-15.

29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la composición es una aspersión .

30. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque el patógeno humano es Salmonela .

31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el patógeno humano es Salmonela entérica serovar Newport.

32. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque el patógeno humano es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacter, Listeria o Estafilococo .

33. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque el patógeno humano es E. coli 0157:H7, Entejrofaacter sakazakii, Estafilococo áureas, o Listeria monocytogenes .

34. La composición de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada porque el patógeno de planta es Clavibacter michiganensis pv. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum, o Erwinia carotovora subsp. carotovora.

35. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 34, caracterizada porque la fuente de carbono es glucosa, o Melezitosa, y la fuente de nitrógeno es extracto de levadura.

36. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada porque la planta u órgano de planta es una planta de tomate, flor del tomate, tomate, planta de pimiento, pimiento, melón, verduras frondosas, o apio.

37. Una composición para inhibir o eliminar el cultivo de un patógeno humano o un patógeno de planta en la superficie de una planta u órgano de planta caracterizada porque comprende un extracto extracelular de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes o uno de sus extractos extracelulares , en donde la composición opcionalmente comprende una sola fuente de carbono y nitrógeno que se optimiza para mejorar los efectos de TS-15.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la composición es una aspersión.

39. La composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizada porque el patógeno humano es Salmonela .

40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el patógeno humano es Salmonela entérica serovar Newport.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizada porque el patógeno humano es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacter, Listeria o Estafilococo.

42. La composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizada porque el patógeno humano es E. coli 0157 :H7, Enterobacter sakazakii, Estafilococo aureus, o Listeria monocytogenes.

43. La composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38, caracterizada porque el patógeno de planta es Clavibacter michiganensis pv. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. tomato, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum, o Erwinia carotovora subsp. carotovora.

44. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43, caracterizada porque la fuente de carbono es glucosa o Melezitosa, y la fuente de nitrógeno es extracto de levadura.

45. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, caracterizada porque la planta u órgano de planta es una planta de tomate, flor del tomate, tomate, planta de pimiento, pimiento, . melón, verduras frondosas, o apio.

46. Un antibiótico aislado de la cepa Paenibacillus alvei TS-15, caracterizado porque es bactericida o bacteriostático contra un patógeno humano procedente de los alimentos .

47. El antibiótico de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el antibiótico es un antibiótico peptidico.

48. El antibiótico de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacte , Listeria o Estafilococo.

49. El antibiótico de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es Salmonela entérica serovar Newport .

50. El antibiótico de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque el patógeno humano procedente de los alimentos es E. coli 0157.-H7, Enterobacter sakazakii , Estafilococo áureas, o Listeria monocytogenes .

51. Un kit para tratar una planta u órgano de planta in vitro o in situ, caracterizado porque la planta u órgano de planta se están contaminando con un patógeno humano procedente de los alimentos o patógeno humano, en donde el kit comprende la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes y una sola fuente de carbono y de nitrógeno de nutrientes que mejoran la actividad.

52. Un kit para tratar una planta u órgano de planta in vitro o in si tu, caracterizado porque la planta u órgano de planta se están contaminando con un patógeno humano procedente de los alimentos o patógeno humano, en donde el kit comprende un extracto celular de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o un antibiótico obtenido de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 que es bacteriostática o bactericida contra el patógeno.

53. El kit de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque además comprende instrucciones para uso.

54. El kit de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque el patógeno de planta es Clavibacter michiganensis pv. michiganensis, Pseudomonas syringae pv. tomafco, Xanthomonas capesiris pv. vesicatoria, Ralstonia solanacearum, o Erwinia carotovora subsp . carotovora .

55. El kit de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque el patógeno de planta es Salmonela entérica serovar Ne port

56. El kit de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque el patógeno humano es una especie de Shigella, Escherichia, Enterobacter, histeria o Estafilococo.

57. El kit de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizado porque el patógeno humano es E. coli 0157 :H7, Enterobacter . sakazakii, Estafilococo áureas, o Listeria monocytogenes.

58. Una composición de probiótico caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la cepa Paenibacillus alvei TS-15 o uno de sus mutantes .