MX2013012390A - Proceso de ph unico para licuacion y sacarificacion de almidon para jarabes de glucosa de alta densidad. - Google Patents

Abstract

Las modalidades de la presente descripción se relacionan con un proceso para producir productos corriente abajo, tal como jarabes de glucosa de densidad alta y materia prima de fermentación con alto contenido de glucosa, a partir de un sustrato que contiene almidón sin un ajuste de pH antes de la sacarificación. La sacarificación se cataliza eficazmente mediante una glucoamilasa a un pH en el intervalo de 5.2 a 5.6.

Description

PROCESO DE PH UNICO PARA LICUACION Y SACARIFICACION DE ALMIDON PARA JARABES DE GLUCOSA DE ALTA DENSIDAD CAMPO DE LA INVENCION Un proceso para producir productos corriente abajo, tal como jarabe de glucosa de alta densidad y materia prima de fermentación, a partir de material que contiene almidón (por ejemplo, grano) sin un ajuste de pH entre licuación y sacarificación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Típicamente, la glucosa puede ser el producto del procesamiento de almidón, el cual podría ser un proceso enzimático de dos etapas que cataliza la descomposición de almidón, que incluye licuación y sacarificación. Durante la licuación, frecuentemente, se hace una suspensión en agua de almidón granular insoluble, se gelatiniza con calor y se hidroliza mediante una alfa-amilasa termoestable . Las alfaamilasas usadas frecuentemente en la mayoría de los procesos de licuación comerciales no son estables a niveles acídicos de pH 4.8 a pH 5.2 y, por lo tanto, el pH de la suspensión se ajusta a aproximadamente pH 5.6 a 6.0 mediante el uso de álcalis adecuados (por ejemplo, hidróxido de calcio o sodio, carbonato de sodio o amoniaco) . Por lo tanto, la licuación se lleva a cabo, normalmente, a un pH de Ref . :243487 aproximadamente 5.6 a 6.0.

Durante la sacarificación, las dextrinas solubles producidas en la licuación son hidrolizadas más aún por glucoamilasas para producir azúcares. Las glucoamilasas son exocarbohidrasas , capaces de hidrolizar los enlaces glucosídicos lineales y ramificados de almidón (por ejemplo, amilosa y amilopectina) . Las glucoamilasas disponibles comercialmente tienen, típicamente, pH óptimo en los intervalos de pH acídico (menor que 5.0) . Como resultado, el pH del licuefacto se ajusta, típicamente, a acídico, en el intervalo de aproximadamente 4.2-4.5, mediante el uso, por ejemplo, de un ácido diluido (por ejemplo, ácido sulfúrico), para llevar a cabo la sacarificación. Por lo tanto, los procesos de licuación y sacarificación actuales para obtener un producto final deseado, tal como jarabes de glucosa de alta densidad y materia prima de fermentación con alto contenido de glucosa, se llevan a cabo a distintos niveles de pH . Las azúcares fermentables , por ejemplo, azucares de bajo peso molecular, tal como glucosa, podrían convertirse, después, en fructosa mediante otras enzimas (por ejemplo, isomerasas de glucosa); cristalizarse; o usarse en fermentaciones para producir numerosos productos finales (por ejemplo, alcoholes, glutamato monosódico, ácido succínico, vitaminas, aminoácidos, 1, 3 -propanodiol y ácido láctico).

Dada la necesidad de ajustar los niveles de pH después de la licuación y antes de la sacarificación, los métodos disponibles actualmente para procesar material que contiene almidón requieren el uso de sustancias químicas extra, lo que aumenta los costos de producción. Los ajustes de pH requeridos después de la etapa de licuación para proporcionar condiciones adecuadas para la sacarificación podrían resultar, además, en una acumulación alta de sal en el medio de reacción y un contenido alto de azufre, lo que crea un problema ambiental de eliminación de residuos. Por lo tanto, persiste la necesidad de obtener un método para producir comercialmente productos finales, tales como jarabes de glucosa de alta densidad y materia prima de fermentación con alto contenido de glucosa, sin tener que llevar a cabo licuación y sacarificación a diferentes niveles de pH.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se proporciona un método para producir jarabes de glucosa de alta densidad y materia prima de fermentación con alto contenido de glucosa mediante un proceso de pH único, sin tener que ajustar el pH después de la licuación y antes de la sacarificación. El método se beneficia con las propiedades distintivas de ciertas glucoamilasas . Las glucoamilasas tales como glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA, por sus siglas en inglés) y sus variantes tienen un pH óptimo más alto que las glucoamilasas conocidas (GA, por sus siglas en inglés) , tales como, por ejemplo, GA de Aspergíllus niger (AnGA, por sus siglas en inglés) y Talaromyces emersonii (TeGA, por sus siglas en inglés) . Por lo tanto, las glucoamilasas usadas en el presente método son capaces de sacarificar un sustrato de almidón para producir eficazmente jarabes de glucosa de densidad alta y materia prima de fermentación con alto contenido de glucosa a un pH en el intervalo de 5.2-5.6 y a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 58 °C a aproximadamente 62 °C. Esta propiedad de las glucoamilasas de HgGA permite que se usen en un proceso de pH único para la licuación y sacarificación de almidón a fin de producir jarabes de glucosa de densidad alta y materia prima de fermentación de glucosa alta. Los métodos descritos actualmente pueden combinar, además, las glucoamilasas con una pululunasa para aumentar la eficacia del proceso.

En un aspecto, la glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste en una glucoamilasa parental de Humicola grísea (HgGA) que comprende la sec. con núm. de ident . : 3 y una variante de esta, en donde la variante tiene al menos 99 % de identidad con la glucoamilasa parental. En otro aspecto, la glucoamilasa tiene una modificación de aminoácido comparada con la glucoamilasa parental. En otro aspecto, la glucoamilasa es HgGA con una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 3. Opcionalmente , la glucoamilasa se produce en una célula huésped de Trichoderma reesei .

En una modalidad, la glucoamilasa se adiciona a una dosis de al menos aproximadamente 0.15 GAU por gramo de almidón de sustancia seca, o al menos aproximadamente 0.20 GAU por gramo de almidón de sustancia seca.

En un aspecto, la sacarificación se lleva a cabo a pH 5.35 a 5.5. En otro aspecto, el sustrato de almidón usado para la sacarificación es almidón licuado. En otro aspecto, la sacarificación logra una concentración de DPI de al menos 95 % a aproximadamente 70 horas.

En una modalidad, el sustrato de almidón es aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, o aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 % de sólidos secos (DS, por sus siglas en inglés) .

En otro aspecto, el sustrato de almidón es almidón granular y la sacarificación logra una concentración de DPI de al menos 95 % a aproximadamente 28 horas y la solubilidad de almidón del sustrato de almidón es al menos 90 ¾.

En una modalidad, la sacarificación logra una concentración de DPI de al menos 96 % a aproximadamente 50 horas y la solubilidad de almidón del sustrato de almidón es al menos 97 %.

Adicionalmente , el contenido de azúcar más alto puede ser inferior a 1 %. Además, el sustrato de almidón puede ser aproximadamente 28 % de sólidos secos (DS) .

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS Un listado de secuencias que comprende las secuencias con núm. de ident . 1-3 se adjunta e incorpora en la presente descripción, en su totalidad, como referencia.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras acompañantes se incorporan en la especificación y proporcionan ilustraciones no limitantes de varias modalidades. En las figuras: La Figura 1 representa el transcurso de tiempo de concentraciones de glucosa acumuladas (DPI) durante el proceso de sacarificación. La sacarificación de pH único se llevó a cabo mediante el uso de HgGA a la dosis de 0.18 unidades de glucoamilasa (GAU, por sus siglas en inglés) por gramo de almidón de sustancia seca, como se describe en el Ejemplo 1 y en la Tabla 1.

La Figura 2 representa el transcurso de tiempo de concentraciones de DPI acumuladas durante un proceso de sacarificación de pH único ( -vivo) . La sacarificación se lleva a cabo con HgGA o HgGA en presencia de pululanasa, mediante el uso de concentraciones enzimáticas y bajo las condiciones que se describen en el Ejemplo 2 y la Tabla 2 (matraces 1-4) .

La Figura 3 representa el transcurso de tiempo de concentraciones de DPI acumuladas durante un proceso de sacarificación, en donde la a-amilasa se desactivó al reducir el pH del licuefacto a por debajo de 4.0 antes de la sacarificación (a-muerto) . La sacarificación se lleva a cabo con HgGA o HgGA en presencia de pululanasa, mediante el uso de concentraciones enzimáticas y bajo las condiciones que se describen en el Ejemplo 2 y la Tabla 2 (matraces 5-8) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente descripción se relaciona con glucoamilasas capaces de sacarificar eficazmente un sustrato de almidón a un pH entre aproximadamente 5.2-5.6, sin tener que ajustar el pH después de la etapa de licuación.

En algunos aspectos, las modalidades de la presente descripción se basan en técnicas de rutina y en métodos usados en el campo de la ingeniería genética y la biología molecular. Los siguientes recursos incluyen descripciones de metodología general útil de conformidad con la descripción: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2.° Ed. , 1989) ; Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990) y Ausubel et al., Eds . CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994) . A menos que se defina de cualquier otra manera en la presente descripción, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.° Ed. , John Wiley and Sons, Nueva York (1994) y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto en la técnica un diccionario general de muchos de los términos usados en esta descripción. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica o en las pruebas de la presente descripción, se describen los métodos y los materiales representativos. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los encabezados proporcionados en la presente descripción no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades que se pueden tomar como referencia para la especificación general. 1. Definiciones y abreviaturas De conformidad con esta descripción detallada se aplican las siguientes abreviaturas y definiciones. Se destaca que tal como se usan en la presente descripción, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales enzimas. 1.1. Definiciones Como se usa en la presente descripción, "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunas instancias, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido"; en algunas instancias, el término "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".

Como se usa en la presente descripción, "secuencia de nucleótidos" o "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de origen genómico, sintético o recombinante que puede ser mono o bicatenaria, dependiendo de si representa la cadena codificante o no codificante. Como se usa en la presente descripción, el término "ácido nucleico" puede referirse a ADN genómico, ADNc, ADN sintético o ARN. Los residuos de un ácido nucleico pueden contener cualquiera de las modificaciones químicas conocidas y usadas comúnmente en la técnica.

"Aislado" significa que el material está al menos prácticamente libre de al menos otro componente al que el material se asocia naturalmente y que se encuentra en la naturaleza .

"Purificado" significa que el material está en un estado relativamente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 % puro, al menos aproximadamente 95 % puro o al menos aproximadamente 98 % puro.

"Oligosacárido" significa una molécula de carbohidrato compuesta por 3-20 monosacáridos .

Como se usa en la presente descripción, "célula transformada" incluye células que se han transformado mediante el uso de técnicas de ADN recombinante. La transformación se produce, típicamente, por la inserción de una o más secuencias de nucleótidos en una célula. La secuencia de nucleótidos insertada puede ser una secuencia de nucleótidos heteróloga, es decir, una secuencia que podría no ser natural para la célula que se transformará, tal como una proteína de fusión.

Como se usa en la presente descripción, "almidón" se refiere a cualquier material que comprende los carbohidratos polisacáridos complejos de las plantas que comprenden amilosa y amilopectina con la fórmula (C6Hio05)x, en donde "X" puede ser cualquier número. Particularmente, el término se refiere a cualquier material de base vegetal que incluye, pero no se limita a, granos, pastos, tubérculos y raíces y, más específicamente, trigo, cebada, maíz, centeno, arroz, sorgo, salvado, mandioca, mijo, papa, camote y tapioca.

Como se usa en la presente descripción, "almidón granular" se refiere a un almidón no cocido (crudo) que no se expuso a gelatinización.

Como se usa en la presente descripción, "gelatinización de almidón" se refiere a la solubilización de una molécula de almidón para formar una suspensión viscosa.

Como se usa en la presente descripción, "temperatura de gelatinización" se refiere a la temperatura más baja en la cual se produce la gelatinización de un sustrato de almidón. La temperatura exacta depende del sustrato de almidón específico y, además, puede depender de la variedad específica y las condiciones de crecimiento de las especies de plantas de las cuales se obtiene el almidón.

"DE" o "equivalente de dextrosa" es un estándar industrial para medir la concentración de los azúcares reductores totales que se calcula como el porcentaje de los sólidos totales que se han convertido en azúcares reductores. El almidón granular que no se hidrolizó tiene un DE de aproximadamente cero (0) , y la D-glucosa tiene un DE de aproximadamente 100.

Como se usa en la presente descripción, "sustrato de almidón" se refiere al almidón granular o al almidón licuado usado en el almidón refinado, granos molidos enteros o granos fraccionados.

Como se usa en la presente descripción, "almidón licuado" se refiere al almidón que pasó por el proceso de solubilización, por ejemplo, el proceso convencional de licuación de almidón.

"Grado de polimerización" (DP, por sus siglas en inglés) se refiere al número (n) de unidades de anhidroglucopiranosa en un sacárido determinado. Los ejemplos de DPI son los monosacáridos , tales como glucosa y fructosa. Los ejemplos de DP2 son los disacáridos, tales como maltosa y sacarosa. Un DP4+ (>DP4) representa polímeros con un grado de polimerización mayor que cuatro.

Como se usa en la presente descripción, "azúcares fermentables" se refiere a sacáridos que se pueden metabolizar bajo condiciones de fermentación. Estos azúcares se refieren, típicamente, a glucosa, maltosa y maltotriosa (DPI, DP2 y DP3 ) .

Como se usa en la presente descripción, "contenido total de azúcar" se refiere al contenido total de azúcar presente en una composición de almidón.

Como se usa en la presente descripción, "ds" se refiere a los sólidos disueltos en una solución.

Como se usa en la presente descripción, "enzima licuante de almidón" se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis o descomposición del almidón granular. Las enzimas licuantes de almidón ilustrativas incluyen alfa-amilasas (EC 3.2.1.1).

"Amilasa" se refiere a una enzima que es capaz, por ejemplo, de catalizar la degradación del almidón.

"Alfa-amilasas (EC 3.2.1.1)" se refiere a endoenzimas que separan los enlaces a-D-(l?4) O-glicosídicos dentro de la molécula de almidón en forma aleatoria. En contraposición, las exoenzimas amilolíticas , tales como beta-amilasas (EC 3.2.1.2; -D- ( 1?4 ) -glucanomaltohidrolasa) y algunas amilasas específicas del producto, como la alfa-amilasa maltogénica (EC 3.2.1.133) , separa la molécula de almidón del extremo no reductor del sustrato. Estas enzimas se han descrito, además, como aquellas que realizan la exo o endohidrólisis de enlaces 1 , 4 -a-D-glucosídicos en polisacáridos que contienen unidades de 1, 4-o¡ D-glucosa. Glicogenasa es otro término que se usa para describir estas enzimas. Las enzimas ilustrativas incluyen alfa-1, 4-glucan 4 -glucanohidrolasa .

Como se usa en la presente descripción, "glucoamilasas" se refiere a la clase de enzimas amiloglucosidasas (EC 3.2.1.3, glucoamilasas , a-?, 4-D-glucano glucohidrolasas) . Estas son exoenzimas y liberan residuos de glucosilo de los extremos no reductores de moléculas de amilosa y/o amilopectina . Las enzimas son capaces, además, de hidrolizar enlaces a-1, 6 y a-1,3; sin embargo, a índices mucho menores que la hidrólisis de enlaces a-1, 4.

Como se usa en la presente descripción, "actividad máxima" se refiere a la actividad enzimática medida bajo las condiciones más favorables, por ejemplo, a un pH óptimo. Como se usa en la presente descripción, "pH óptimo" se refiere a un valor de pH, bajo el cual la enzima muestra la actividad más alta con otras condiciones iguales.

La frase "forma madura" de una proteína o un polipéptido se refiere a la forma funcional final de la proteína o del polipéptido. Una forma madura de una glucoamilasa podría carecer de un péptido señal y/o una metionina iniciadora, por ejemplo. Una forma madura de una glucoamilasa podría producirse a partir de su huésped nativo, por ejemplo, mediante expresión endógena. Alternativamente, una forma madura de una glucoamilasa podría producirse a partir de un huésped no nativo, por ejemplo, mediante expresión exógena. Una glucoamilasa expresada exógenamente podría tener un patrón de glicosilación variado comparada con la contraparte expresada endógenamente .

El término "parental" o "secuencia parental" se refiere a una secuencia que es nativa o de origen natural.

Como se usa en la presente descripción, el término "variante" se usa en referencia a glucoamilasas que tienen algún grado de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de glucoamilasa parental. Una variante es similar a una secuencia parental, pero tiene al menos una sustitución, eliminación o inserción en su secuencia de aminoácidos que hace que sean diferentes en cuanto a secuencia de una glucoamilasa parental. En algunos casos, las variantes se han manipulado y/o modificado para que incluyan al menos una sustitución, una eliminación o una inserción en su secuencia de aminoácidos que las hace diferentes en cuanto a secuencia de un parental. Adicionalmente , una variante de glucoamilasa podría retener las características funcionales de la glucoamilasa parental, por ejemplo, mantener una actividad de glucoamilasa que es al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % la de la glucoamilasa parental.

Como se usa en la presente descripción, "hidrólisis de almidón" se refiere al clivaje de enlaces glucosídicos con la adición de moléculas de agua.

Como se usa en la presente descripción, "producto final" o "producto final deseado" se refiere a una molécula o a un compuesto al cual una enzima y/o un microorganismo convierte un sustrato de almidón.

Como se usa en la presente descripción, "poner en contacto" o "mezclar" se refiere a la colocación de la(s) enzima (s) respectiva (s) suficientemente cerca del sustrato respectivo para permitir que la(s) enzima (s) convierta (n) el sustrato en el producto final. Las personas con experiencia en la técnica reconocerán que las soluciones de mezclado de la enzima con los sustratos respectivos puede afectar el contacto o el mezclado. 1.2. Abreviaturas Se usan las siguientes abreviaturas a menos que se indique de cualquier otra forma: AA alfa-amilasa AmyE alfa-amilasa de Bacíllus subtilis AnGA glucoamilasa de Aspergillus niger cDNA ADN complementario DE equivalente de dextrosa DNA ácido desoxirribonucleico DP3 grado de polimerización con tres subunidades DPn grado de polimerización con n subunidades DS o ds sólido seco dss almidón sólido seco EC comisión de enzimas para la clasificación de enzimas g gramo GAU unidades de glucoamilasa H-GA glucoamilasa de Humicola grísea HgGA glucoamilasa de Humicola grísea HPLC cromatografía líquida de alta presión MOPS ácido 3 - (N-morfolino) ropanosulfónico PEG polietilenglicol RNA ácido ribonucleico RO osmosis inversa TeGA glucoamilasa de Talaromyces emersonii TrGA glucoamilasa de Trichoderma reesei µt? micrómetro 2. Enzimas en el procesamiento de almidón 2.1. Glucoamilasa 2.1.1. Glucoamilasas que tienen el perfil de pH deseado Las glucoamilasas son producidas por numerosas cepas de bacterias, hongos, levaduras y plantas. Muchas glucoamilasas fúngicas son enzimas fúngicas que se producen extracelularmente, por ejemplo, a partir de cepas de Aspergillus (Svensson et al., Carlsberg Res. Commun. 48: 529-544 (1983); Boel et al., EMBO J. 3: 1097-1102 (1984); Hayashida et al., Agrie. Biol . Chem. 53: 923-929 (1989); patente de los Estados Unidos de América núm. 5,024,941; patente de los Estados Unidos de América núm. 4,794,175 y núm. WO 88/09795) ; Talaromyces (patente de los Estados Unidos de América núm. 4,247,637; patente de los Estados Unidos de América núm. 6,255,084; y patente de los Estados Unidos de América núm. 6,620,924); Rhizopus (Ashikari et al., Agrie. Biol. Chem. 50: 957-964 (1986); Ashikari et al., App. Microbio. Biotech. 32: 129-133 (1989) y patente de los Estados Unidos de América núm. 4,863,864); Humicola (patente núm. WO 05/052148 y patente de los Estados Unidos de América núm. 4,618,579); y Mucor (Houghton-Larsen et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 62: 210-217 (2003)). Muchos de los genes que codifican estas enzimas se han clonado y expresado en células de levadura, hongos y/o bacterias.

Comercialmente , las glucoamilasas son enzimas muy importantes y se han usado en una amplia variedad de aplicaciones que requieren la hidrólisis de almidón (por ejemplo, para producir glucosa y otros monosacáridos a partir de almidón) . Las glucoamilasas se usan para producir edulcorantes de maíz con alto contenido de fructosa, los cuales comprenden aproximadamente 50 % del mercado de edulcorantes en los Estados Unidos de América. Generalmente, las glucoamilasas podrían usarse y se usan, comúnmente, con alfa-amilasas en procesos de hidrolización de almidón para hidrolizar almidón a dextrinas y, después, a glucosa. La glucosa podría ser convertida, después, en fructosa por otras enzimas (por ejemplo, isomerasas de glucosa) ; cristalizarse; o usarse en fermentaciones para producir productos finales numerosos (por ejemplo, etanol, ácido cítrico, ácido succínico, productos intermedios de ácido ascórbico, ácido glutámico, glicerina, 1 , 3-propanodiol y ácido láctico).

Las modalidades de la presente descripción usan una glucoamilasa capaz de sacarificar eficazmente un sustrato de almidón a un pH, por ejemplo, entre 5.2 y 5.6. Las glucoamilasas que tienen el perfil de pH deseado incluyen, pero no se limitan a, glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA) .

La HgGA podría ser la glucoamilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident.: 3, la cual se describe en detalle en las patentes de los Estados Unidos de América núm. 4,618,579 y 7,262,041. Este HgGA se describe, además, como una enzima hidrolizadora de almidón granular (GSHE, por sus siglas en inglés) , dado que es capaz de hidrolizar almidón en forma granular. La secuencia genómica que codifica HgGA de Humicola grísea var. thermoidea se presenta como sec. con núm. de ident.: 1, la cual contiene tres intrones putativos (posiciones 233-307, 752-817 y 950-1006) . La HgGA nativa de Humicola grísea var. thermoidea tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. : 2, la cual incluye un péptido señal que contiene 30 residuos de aminoácidos (posiciones 1 a 30 de sec. con núm. de ident. : 2) . La separación del péptido señal resulta en que la HgGA madura tenga la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. : 3. Las modalidades de la presente descripción incluyen, además, una HgGA producida a partir de una célula huésped de Trichoderma, por ejemplo, una célula de Trichoderma reesei. Ver la patente de los Estados Unidos de América núm. 7, 262, 041. 2.1.2. Estructura y función La glucoamilasa de la modalidad de la presente descripción podría ser, además, una variante de HgGA. La variante tiene al menos 99 % de identidad de secuencia con la glucoamilasa parental. Opcionalmente , la variante tiene modificación de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis aminoácidos comparada con la forma madura de la glucoamilasa parental . En una modalidad, la glucoamilasa es una variante de una HgGA parental que comprende la sec . con núm. de ident . : 3, en donde la variante tiene al menos 99 % de identidad de secuencia con la glucoamilasa parental. La variante posee el perfil de pH deseado y capacidad de sacarificar un sustrato de almidón a un pH en el intervalo de 5.2 a 5.6. En algunas modalidades, las variantes podrían tener otras propiedades mejoradas, tales como termoestabilidad mejorada y especificidad mejorada.

Las glucoamilasas consisten en tantos como tres dominios estructurales diferentes: un dominio catalítico de aproximadamente 450 residuos que se conserva estructuralmente en todas las glucoamilasas, generalmente, seguido por una región de enlace que consiste en entre 30 y 80 residuos que se conectan a un dominio de unión de almidón de aproximadamente 100 residuos. La estructura de la glucoamilasa de Trichoderma reesei (TrGA, por sus siglas en inglés) con las tres regiones intactas se determinó a una resolución de 1.8 angstrom. Ver las patentes núms. WO 2009/048488 y O 2009/048487. Mediante el uso de coordinadas determinadas, la estructura se alineó con las coordenadas del dominio catalítico de la glucoamilasa a partir d la cepa de Aspergillus awamori X100 que se determinó previamente (Aleshin, A.E., Hoffman, C, Firsov, L.M. y Honzatko, R.B. Refined crystal structures of glucoamylase f om Aspergillus awamori va . X100. J. Mol. Biol . 238: 575-591 (1994)). Ver ídem. La estructura de los dominios catalíticos de TrGA y glucoamilasa de Aspergillus awamori se superponen en gran medida y es posible identificar residuos equivalentes sobre la base de esta superposición estructural. Ver ídem. Se cree, además, que todas las glucoamilasas comparten la estructura básica. Ver ídem.

Dada la estructura conocida y la relación de función de las glucoamilasas, se han creado y caracterizado exitosamente variantes de glucoamilasa que tienen propiedades alteradas. Las variantes podrían mostrar propiedades mejoradas comparadas con las glucoamilasas parentales . Las propiedades mejoradas podrían incluir, pero no se limitan a, termoestabilidad mejorada y actividad específica aumentada. Por ejemplo, los métodos para elaborar y caracterizar variantes de TrGA con propiedades alteradas se han descrito en la patente núm. WO 2009/067218. Se han identificado variantes de TrGA funcionales que tienen una o más modificaciones de secuencias específicas. Algunas variantes de TrGA, por ejemplo, tienen múltiples modificaciones de secuencias. La patente núm. WO 2009/067218 describe variantes de TrGA con seis o más modificaciones de aminoácidos, por ejemplo. Estas variantes de TrGA muestran al menos tanta actividad como la TrGA parental y, en muchos casos, muestran propiedades mejoradas. Se espera que los cambios de residuos correspondientes en HgGA proporcionen variantes con actividad de glucoamilasa. Las variantes de glucoamilasa útiles en los presentes métodos pueden hidrolizar eficazmente almidón a un pH en el intervalo de 5.2 a 5.6. 2.1.3. Producción de glucoamilasa Las glucoamilasas adecuadas para las modalidades de la presente descripción podrían producirse con tecnología de ADN recombinante en varias células huésped.

En algunas modalidades, las células huésped se seleccionan de células de bacterias, hongos, plantas y levaduras. El término célula huésped incluye células, progenie de las células y protoplastos creados a partir de células que se usan para producir una glucoamilasa variante de conformidad con la descripción. En algunas modalidades, las células huésped son células fúngicas y, típicamente, células huésped de hongos filamentosos. El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (ver, Alexopoulos, C. J. (1962) , INTRODUCTORY MYCOLOGY, iley, Nueva York) . Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos de la presente descripción son diferentes de las levaduras morfológica, fisiológica y genéticamente. El crecimiento vegetativo por parte de hongos filamentosos es por elongación hifal y catabolismo de carbono y es aeróbico obligatorio. En las modalidades de la presente descripción, la célula parental de hongo filamentoso podría ser, pero no se limita a, una célula de una especie de Trichoderma, (por ejemplo, Trichoderma reesei, el morfo asexual de Hypocrea jecorina, clasificado anteriormente como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., (1984) Ap l . Microbiol. Biotechnol 20:46-53; núm. de ATCC 56765 y núm. de ATCC 26921); Penicillium sp.; Humicola sp. (por ejemplo., H. insolens, H. lanuginosa y H. grísea); Chrysosporium sp. (por ejemplo., C. lucknowense) , Gliocladium sp. , Aspergillus sp . (por ejemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans y A. awamori) (Ward et al., (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743 y Goedegebuur et al., (2002) Genet 41:89-98), Fusarium sp., (por ejemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim y F. venenatum) , Neurospora sp., (N. crassa) , Hypocrea sp., Mucor sp., (M. miehei) , Rhizopus sp. y Emericella sp. (ver, además, Innis et al., (1985) Sci . 228:21-26). El término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." o "Trichoderma spp." se refiere a cualquier género fúngico clasificado anterior o actualmente como Trichoderma. En otras modalidades, la célula huésped será una célula huésped modificada genéticamente, en donde se han desactivado genes nativos, por ejemplo, por eliminación en células fúngicas. En donde se desea obtener una célula huésped fúngica que tenga uno o más genes desactivados, podrían usarse métodos conocidos (por ejemplo, los métodos descritos en las patentes de los Estados Unidos de América núm. 5,246,853 y 5,475,101, y la patente núm. O 92/06209). La desactivación de genes podría lograrse mediante eliminación parcial o completa, mediante desactivación insercional o mediante cualquier otro medio que da un gen no funcional para su fin pretendido (de manera que se evite que el gen exprese una proteína funcional) . En algunas modalidades, cuando la célula huésped es una célula de Trichoderma y, particularmente, una célula huésped de T. reesei, los genes cbhl, cbh2, egll y egl2 se desactivarán y/o, típicamente, se eliminarán. Típicamente, las células huésped de Trichoderma reesei que tienen proteínas eliminadas por quad se exponen y describen en la patente de los Estados Unidos de América núm. 5,847,276 y la patente núm. WO 05/001036. En otras modalidades, la célula huésped es una cepa con deficiencia de proteasa o menos proteasa .

Para producir la glucoamilasa de las modalidades de la presente descripción con la tecnología de ADN recombinante, puede construirse un constructo de ADN que comprende ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la glucoamilasa designada y transformarse en, por ejemplo, una célula huésped de Trichoderma reesei . El vector podría ser cualquier vector que cuando se introduce en una célula huésped de Trichoderma reesei puede integrarse en el genoma de la célula huésped y puede replicarse. Se hace referencia al catálogo de cepas del Fungal Genetics Stock Center (FGSC, <www.fgsc.net>) para obtener una lista de vectores. Los ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proporcionan en Sambrook et al., (1989) arriba, y Ausubel (1987) arriba, y van den Hondel et al. (1991) en Bennett and Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGÍ, Academic Press pág. 396-428 y la patente de los Estados Unidos de América núm. 5,874,276. El ácido nucleico que codifica la glucoamilasa puede unirse operativamente a un promotor adecuado, el cual muestra actividad transcripcional en célula huésped de Trichoderma reesei . El promotor podría derivarse de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas a la célula huésped. Los ejemplos no limitantes adecuados de promotores incluyen cbhl, cbh2 , egll, egl2. En una modalidad, el promotor podría ser un promotor de T. reesei nativo. Típicamente, el promotor puede ser T. reesei cbhl, el cual es un promotor inducible y se ha depositado en el GenBank bajo el núm. de acceso D86235. Un "promotor inducible" podría referirse a un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. En otra modalidad, el promotor puede ser uno que es heterólogo a la célula huésped de T. reesei. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de genes de glucoamilasa de A. awamori y A. niger (ver, por ejemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol . 4:2306-2315 y Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1581-1585). Además, podrían ser útiles los promotores del gen de T. reesei xlnl y el gen de celobiohidrolasa 1.

En algunas modalidades, la secuencia codificante de glucoamilasa puede unirse operativamente a una secuencia señal. La secuencia señal podría ser un péptido señal nativo de la glucoamilasa (residuos 1-20 de sec . con núm. de ident . : 2 para HgGA, por ejemplo) . Alternativamente, la secuencia señal podría tener al menos 90 % o al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia señal nativa. En modalidades adicionales, una secuencia señal y una secuencia promotora que comprende un constructo de ADN o un vector que se va a introducir en la célula huésped de T. reesei se derivan de la misma fuente. Por ejemplo, en algunas modalidades, la secuencia señal puede ser la secuencia señal de cdhl que se une operativamente a un promotor cdhl .

En algunas modalidades, el vector de expresión podría incluir, además, una secuencia terminadora. En una modalidad, la secuencia de terminación y la secuencia promotora pueden derivarse de la misma fuente. En otra modalidad, la secuencia de terminación puede ser homologa a la célula huésped. Una secuencia terminadora particularmente adecuada puede derivarse de cbhl de T. reesei. Otros terminadores fúngicos ilustrativos incluyen el terminador del gen de glucoamilasa de A. niger o A. a amori .

En algunas modalidades, un vector de expresión podría incluir un marcador seleccionable . Los ejemplos de marcadores seleccionables representativos incluyen unos que confieren resistencia antimicrobiana (por ejemplo, higromicina y fleomicina) . Los marcadores selectivos nutricionales encuentran uso, además, en la presente descripción e incluyen los marcadores conocidos en la técnica como amdS, argB y pyr4. Los marcadores útiles en sistemas de vectores para transformación de Trichoderma son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Finkelstein, capítulo 6 en BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGÍ, Finkelstein et al. Eds . Butterworth-Heinemann, Boston, Mass. (1992), cap. 6.; y Kinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional , Chapman and Hall, Londres). En una modalidad representativa, el marcador selectivo podría ser el gen amdS, que codifica la enzima acetamidasa, lo que permite que las células transformadas crezcan en acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso del gen de A. nidulans amdS como un marcador selectivo se describe, por ejemplo, en Kelley et al., (1985) EMBO J. 4:475-479 y Penttila et al., (1987) Gene 61:155-164.

Un vector de expresión que comprende un constructo de ADN con un pol inucleótido que codifica la glucoamilasa podría ser cualquier vector capaz de replicarse autónomamente en un organismo huésped fúngico dado o de integrarse en el ADN del huésped. En algunas modalidades, el vector de expresión puede ser un plásmido. En modalidades típicas, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de genes.

El primer vector de expresión podría comprender secuencias de ADN en las cuales el promotor, la región codificante de glucoamilasa y el terminador se originan, todos, a partir del gen que se va a expresar. En algunas modalidades, el truncado de genes puede obtenerse al eliminar secuencias de ADN no deseadas (por ejemplo, ADN que codifica dominios no deseados) para dejar que el dominio se exprese bajo el control de sus propias secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales .

El segundo tipo de vector de expresión podría preensamblarse y contiene secuencias necesarias para una transcripción de alto nivel y un marcador seleccionable . En algunas modalidades, la región codificante para el gen de glucoamilasa o parte de esta puede insertarse en este vector de expresión para usos generales de manera que se encuentre bajo el control transcripcional del promotor del constructo de expresión y las secuencias terminadoras . En algunas modalidades, los genes o partes de estos podrían insertarse corriente abajo de un promotor fuerte, tal como el promotor fuerte de cbhl .

Los métodos usados para ligar el constructo de ADN que comprende un polinucleótido que codifica la glucoamilasa, un promotor, un terminador y otras secuencias, y para insertarlos en un vector adecuado son muy conocidos en la técnica. El enlace puede lograrse, generalmente, por enlace en sitios de restricción convenientes. Si esos sitios no existen, los enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se usan de conformidad con la práctica convencional. (Ver Sambrook (1989) arriba, y Bennett and Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGÍ, Academic Press, San Diego (1991) pag. 70-76.) . Adicionalmente , pueden construirse vectores mediante el uso de técnicas de recombinación conocidas (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).

La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula huésped incluye técnicas tales como transformación; electroporación; microinyección nuclear; transducción; transíección, (por ejemplo, transfección mediada por DEAE-dextrina y lipofección) ; incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles revestidos con ADN; y fusión de protoplasto. Las técnicas de transformación generales son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al., (1987) , arriba, capítulo 9; y Sambrook (1989) arriba, y Campbell et al., (1989) Curr . Genet. 16:53-56) . La expresión de proteína heteróloga en Trichoderma se describe en las patentes de los Estados Unidos de América núm. 6,022,725; 6,268,328; Harkki et al. (1991) ; Enzyme Microb. Technol . 13:227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7:596-603; EP 244,234; EP 215,594; y Nevalainen et al . , "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", en MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) págs . 129-148).

En algunas modalidades, pueden construirse transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores, mediante los cuales el ácido nucleico que codifica glucoamilasa se integra establemente en un cromosoma de cepa huésped. Los transformantes, se purifican, después mediante técnicas conocidas.

En un ejemplo no limitante, los transformantes estables que incluyen un marcador de amdS se distinguen de los transformantes inestables por su velocidad de crecimiento rápida y la formación de colonias circulares con un contorno liso en vez de desgarrado en medio de cultivo sólido que contiene acetamida. Adicionalmente , en algunos casos puede conducirse una prueba adicional de estabilidad al hacer crecer los transformantes en medio sólido no selectivo (es decir, medio que carece de acetamida) , cosechar las esporas de este medio de cultivo y determinar el porcentaje de estas esporas que, subsiguientemente, germinan y crecen en medio selectivo que contiene acetamida. Alternativamente, podrían usarse otros métodos conocidos en la técnica para seleccionar transformantes.

La captación de ADN en la cepa de Trichoderma sp. huésped depende de la concentración de iones de calcio. Generalmente, podrían usarse aproximadamente 10 mM de CaCl2 y 50 mM de CaCl2 en la solución de captación. Además de necesitar iones de calcio en la solución de captación, otros compuestos incluidos generalmente son un sistema amortiguador tal como regulador TE (10 mM de Tris, pH 7.4; 1 mM de EDTA) o regulador de 10 mM de MOPS, amortiguador de pH 6.0 (ácido morfolinopropanosulfónico) y polietilenglicol (PEG) . Se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares y, así, permite que los contenidos del medio se envíen al citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. y el ADN plasmídico se transfiera al núcleo. Esta fusión deja, frecuentemente, múltiples copias del ADN plasmídico integradas en el cromosoma huésped.

Usualmente, en la transformación se usa una suspensión que contiene los protoplastos o las células de Trichoderma sp. que se han sometido a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 107/ml, típicamente, 2 x 106/ml. Un volumen de 100 µ? de estos protoplastos o células en una solución adecuada (por ejemplo, 12.5 M de sorbitol; 50 mM de CaCl2) se mezclan con el ADN deseado. Generalmente, podría adicionarse una concentración alta de PEG a la solución de captación. De 0.1 a 1 volumen de 25 % de PEG 4000 puede adicionarse a la suspensión de protoplastos. Es típico, además, adicionar aproximadamente 0.25 volúmenes de la suspensión de protoplastos. Aditivos tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, spermidina, cloruro de potasio y similares podrían adicionarse a la solución de captación y ayudar en la transformación. Hay disponibles procedimientos similares para otras células huésped fúngicas. Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos de América núm. 6,022,725 y 6,268,328.

Generalmente, la mezcla puede incubarse a aproximadamente 0 °C durante un periodo de entre 10 y 30 minutos. Después, podría adicionarse PEG adicional a la mezcla para aumentar más aun la captación de la secuencia de ADN o el gen deseado. El 25 % de PEG 4000 puede adicionarse, generalmente, en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, podrían ser adecuados volúmenes mayores y menores. El 25 % de PEG 4000 podría ser, típicamente, aproximadamente 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se adicionó PEG, la mezcla de transformación puede incubarse a temperatura ambiente o en hielo antes de la adición de un sorbitol y solución de CaCl2. Después, la suspensión de protoplastos puede adicionarse, además, a alícuotas fundidas de un medio de cultivo. Este medio de cultivo permite el crecimiento de transformantes solamente.

Generalmente, las células se cultivan en un medio estándar que contiene nutrientes y sales fisiológicas (ver, por ejemplo, Pourquie, J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds . Aubert, J. P. et al., Academic Press, pág. 71 86, 1988 e limen, M. et al., (1997) Appl . Environ. Microbiol . 63:1298-1306) . Los medios de cultivo comunes preparados comercialmente (por ejemplo, cultivo de extracto de malta de levadura (YM, por sus siglas en inglés) ) , cultivo de Luria Bertani (LB) y dextrosa de Sabouraud (SD, por sus siglas en inglés) también encuentran uso en las presentes modalidades.

Las condiciones de cultivo también son estándar, por ejemplo, los cultivos se incuban a aproximadamente 28 °C en medio adecuado en termentadores o cultivos de agitación hasta que se logran los niveles deseados de expresión de glucoamilasa . Después de que se estableció el crecimiento fúngico, las células se exponen a condiciones eficaces para causar o permitir la expresión de la glucoamilasa. En casos en donde la secuencia que codifica glucoamilasa está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor (por ejemplo, un azúcar, una sal metálica o un antimicrobiano) puede adicionarse al medio a una concentración eficaz para inducir la expresión de glucoamilasa.

Generalmente, la glucoamilasa producida en cultivos celulares podrían secretarse en el medio y podrían purificarse o aislarse, por ejemplo, al eliminar componentes no deseados del medio de cultivo celular. En algunos casos, la glucoamilasa puede producirse en una forma celular, y necesitar recuperación de un lisado celular. En esos casos, la enzima podría purificarse de las células en las cuales se produjo mediante el uso de técnicas empleadas rutinariamente por las personas con experiencia en la técnica. Los ejemplos de estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad (Tilbeurgh et a., (1984) FEBS Lett. 16: 215), métodos cromatográficos de intercambio de iones (Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl . Microbiol. Biotechnol . 17: 314; Bhikhabhai et al, (1984) J. Ap l. Biochem. 6: 336; y Ellouz et al., (1987) Chromatography 396: 307), que incluyen el intercambio de iones mediante el uso de materiales con poder de alta resolución (Medve et al . , (1998) J. Chromatography A 808: 153), cromatografía de interacción hidrofóbica (ver Tomaz and Queiroz, (1999) J. Chromatography A 865: 123; partición de dos fases (ver Brumbauer, et al., (1999) Bioseparation 7: 287); precipitación con etanol; HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de cationes tal como DEAE, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación de sulfato de amonio y filtración de gel (por ejemplo, Sephadex G-75) . 2.2. Alfa-amilasas Las alfa-amilasas constituyen un grupo de enzimas presentes en microorganismos y tejidos de animales y plantas. Son capaces de hidrolizar enlaces alfa-1, 4-glucosídicos de glicógeno, almidón, polisacáridos relacionados y algunos oligosacáridos . Si bien todas las alfa-amilasas tienen la misma función catalítica, las secuencias de sus aminoácidos varían ampliamente. La identidad de secuencia entre amilasas distintas puede ser prácticamente inexistente, por ejemplo, menor que 25 %. A pesar de la variación considerable en la secuencia de aminoácidos, las alfa-amilasas comparten un esquema topológico general identificado después de haber determinado las estructuras tridimensionales de alfa-amilasas de distintas especies. La estructura tridimensional común revela tres dominios: (1) un barril "TIM" conocido como dominio A, (2) una región de bucle largo conocida como dominio B que se inserta dentro del dominio A, y (3) una región próxima al dominio C-terminal conocida como dominio C que contiene una estructura beta característica con el motivo de una clave griega.

Alfa-amilasas "de tipo Termamyl" se refiere a un grupo de alfa-amilasas ampliamente usadas en la industria del procesamiento de almidón. La alfa-amilasa de Bacillus licheniformis que tiene una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident. : 2 de la patente de los Estados Unidos de América núm. 6,440,716 está disponible comercialmente como Termamyl®. Las alfaamilasas de tipo Termamyl se refieren, comúnmente, a un grupo de alfaamilasas altamente homologas producidas por las esp. de Bacillus. Otros miembros del grupo incluyen las alfa-amilasas de Geobacillus stearothermophilus (conocidas anteriormente como Bacillus stearothermophilus; ambos nombres se usan indistintamente en la presente descripción) y Bacillus amyloliquefaciens , y las derivadas de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 y DSM 9375, la totalidad de las cuales se describen en detalle en la patente de los Estados Unidos de América núm. 6,440,716 y la patente núm. WO 95/26397.

Aunque las alfa-amilasas contienen universalmente los tres dominios mencionados anteriormente, las estructuras tridimensionales de algunas alfa-amilasas, tales como AmyE de Bacillus subtilis, difieren de las alfa-amilasas de tipo Termamyl . Estas enzimas se mencionan colectivamente como alfa-amilasas que no son del tipo Termamyl. "AmyE" para los fines de esta descripción significa una alfa-amilasa de origen natural (EC 3.2.1.1; glucanohidrolasa 1, 4- -D-glucana) de Bacillus subtilis. Las enzimas AmyE representativas y las variantes de estas se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos de América núm. 12/478,266 y 12/478,368, ambas presentadas el 4 de junio de 2009, y 12/479,427, presentada el 5 de junio de 2009. 2.3. Otras enzimas En modalidades de la presente descripción, otra/s enzima/s podría/n complementarse en el procesamiento de almidón, durante la sacarificación y/o la fermentación. Estas enzimas complementarias podrían incluir proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, glicotransferasas de ciclodextrina, lipasas, fitasas, lacasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, xilanasas, pululanasas y/o alfa-glucosidasas . Ver, por ejemplo, la patente patente núm. WO 2009/099783. Las personas con experiencia en la técnica conocen los métodos que usan las enzimas mencionadas anteriormente. 3. Procesamiento de almidón 3.1. Sustratos de almidón y materias primas Las personas con experiencia en la técnica conocen los métodos disponibles que podrían usarse para preparar sustratos de almidón para usar en los procesos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, un sustrato de almidón útil podría obtenerse de tubérculos, raíces, tallos, legumbres, cereales o granos enteros. Más específicamente, el almidón granular viene de plantas que producen altas cantidades de almidón. Por ejemplo, el almidón granular podría obtenerse de maíz, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, chícharos, frijoles, plátanos o patatas. El maíz contiene aproximadamente 60-68 % de almidón; la cebada contiene aproximadamente 55-65 % de almidón; el mijo contiene aproximadamente 75-80 % de almidón; el trigo contiene aproximadamente 60-65 % de almidón; y el arroz pulido contiene aproximadamente 70-72 % de almidón. Los sustratos de almidón contemplados específicamente son almidón de maíz, almidón de trigo y almidón de cebada. El almidón de un grano podría estar molido o entero e incluye sólidos de maíz, tales como granos, salvado y/o mazorcas. El almidón podría ser almidón sin procesar refinado o materia prima de procesos de refinería de almidón. Se encuentran disponibles comercialmente , además, varios almidones. Por ejemplo, el almidón de maíz podría encontrarse disponible de Cerestar, Sigma y Katayama Chemical Industry Co . (Japón) ; el almidón de trigo podría estar disponible de Sigma ; el almidón de camote podría estar disponible de Wako Puré Chemical Industry Co . (Japón) ; y el almidón de patata podría estar disponible de Nakaari Chemical Pharmaceut ical Co . ( Japón) . 3 . 2 . Mol ienda El sustrato de almidón puede ser un almidón crudo de grano entero mol ido , el cual cont iene fracciones sin almidón , por ejemplo, fibras y residuos de germen. La molienda podría comprender molienda en húmedo o en seco . En la molienda en húmedo, los granos enteros pueden empaparse en agua o ácido diluido para separar el grano en sus partes componentes, por ejemplo, almidón, proteína, germen, aceite, fibras de granos . La molienda en húmedo separa eficazmente el germen y la harina (es decir, granulos de almidón y proteína) y puede ser particularmente adecuada para la producción de jarabes . En la molienda en seco, los granos enteros se trituran para formar un polvo fino y se procesan sin fraccionar el gran en sus partes componentes . El grano molido en seco, entonces, comprenderá, cantidades significativas de compuestos de carbohidratos sin almidón, además del almidón. La mayoría del etanol proviene de la molienda en seco. Alternativamente , el almidón que se va a procesar podría ser una calidad de almidón altamente ref inado , por ej emplo , al menos aproximadamente 90 % , al menos aproximadamente 96 % , al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente 99 . 5 % puro . 3.3. Gelatinización y licuación Como se usan en la presente descripción, los términos "licuación" o "licuar" se refieren a un proceso por el cual el almidón se convierte en dextrinas menos viscosas y solubles de cadena más corta . Este proceso incluye la gelatinización del almidón simultáneamente con o seguida por la adición de alfa-amilasas. Opcionalmente, podrían adicionarse enzimas adicionales que inducen la licuación, por ejemplo, una fitasa.

En algunas modalidades, podría hacerse una suspensión con el sustrato de almidón preparado, como se describió anteriormente, y agua. La suspensión de almidón podría contener almidón tal como un porcentaje en peso de sólidos secos de aproximadamente 10-55 %, aproximadamente 20-45 %, aproximadamente 30-45 %, aproximadamente 30-40 % o aproximadamente 30-35 %. A fin de optimizar la actividad y la estabilidad de la alf a-amilasa, el pH de la suspensión podría ajustarse al pH óptimo para las alfa-amilasas. Las alfa-amilasas que permanecen en la suspensión después de la licuación podrían desactivarse al reducir el pH en una etapa de reacción subsiguiente o al eliminar el calcio de la suspensión.

La suspensión de almidón más las alfa-amilasas podrían bombearse continuamente a través de un dispositivo de cocción a chorro, el cual podría calentarse con vapor de aproximadamente 85 °C a hasta aproximadamente 105 °C. La gelatinización sucede muy velozmente bajo estas condiciones, y la actividad enzimática, combinada con las fuerzas de cizalla significativas, comienza la hidrólisis del sustrato de almidón. El tiempo de permanencia en el dispositivo de cocción a chorro puede ser muy breve. El almidón parcialmente gelatinizado podría pasarse a una serie de tubos de retención mantenidos a aproximadamente 85-105 °C y mantenerse durante aproximadamente 5 minutos para completar el proceso de gelatinización. Estos tanques podrían contener deflectores para desalentar un mezclado posterior. Como se usa en la presente descripción, el término "licuación secundaria" se refiere a la etapa de licuación posterior a la licuación primaria, cuando la suspensión se deja enfriar a temperatura ambiente. Esta etapa de enfriamiento puede ser de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 180 minutos, por ejemplo, de aproximadamente 90 minutos a 120 minutos. El grano molido y licuado se conoce, además, como templa. 3.4. Sacarificación Después de la licuación, la pulpa puede hidrolizarse más aún mediante sacarificación a jarabes de glucosa de densidad alta que pueden usarse fácilmente en las aplicaciones corriente abajo. La sacarificación de las presentes modalidades puede llevarse a cabo a un pH en el intervalo de 5.2 a 5.6, mediante el uso de una glucoamilasa como se describió anteriormente. La glucoamilasa podría dosificarse al intervalo de aproximadamente 0.15 a 2.0 GAU /g dss, aproximadamente 0.20 a 1.5 GAU /g dss o 1.0 a 1.5 GAU /g dss. La sacarificación podría llevarse a cabo a aproximadamente 58 °C a aproximadamente 62 °C.

Una etapa de sacarificación completa podría encontrarse, típicamente, en el intervalo de 24 a 96 horas, 24 a 72 horas o 24 a 48 horas. 3.5. Fermentación En algunas modalidades de la presente descripción, las azúcares fermentables podrían someterse a condiciones de fermentación continuas o por lote. Una fermentación por lote clásica es un sistema cerrado, en donde la composición del medio se configura al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Así, al comienzo de la fermentación el medio podría inocularse con el/los organismo/s deseado/s. En este método, la fermentación puede permitirse que ocurra sin la adición de cualquier componente al sistema. Típicamente, una fermentación por lote califica como un "lote" con respecto a la adición de la fuente de carbono y, frecuentemente, se hacen intentos a factores de control como pH y concentración de oxígeno. Las composiciones de biomasa y metabolitos del sistema por lote cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos por lote, las células progresan a través de una fase de latencia estática a una fase logarítmica de crecimiento alto y, finalmente, a una fase estacionaria, en donde la velocidad de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se trataron, las células en la fase estacionaria finalmente mueren. Generalmente, las células en la fase logarítmica son responsables del volumen de producción del producto final.

Una variación en el sistema por lote estándar es el sistema de "fermentación alimentado por lotes", el cual podría usarse en algunas modalidades de la presente descripción. En esta variación de un sistema por lote típico, el sustrato puede adicionarse en incrementos a medida que la fermentación progresa. Los sistemas alimentados por lote son particularmente útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y donde se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración de sustrato real en los sistemas alimentados por lotes podría ser difícil y, por lo tanto, se calcula sobre la base de los cambios de factores medibles tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como C02. Las fermentaciones por lote y alimentada por lotes son comunes y muy conocidas en la técnica.

Por otro lado, la fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido puede adicionarse continuamente a un bioreactor y una cantidad igual de medio acondicionado puede eliminarse simultáneamente para el procesamiento. La fermentación continua, generalmente, mantiene los cultivos a una densidad alta constante, en donde las células se encuentran, principalmente, en crecimiento de fase logarítmica.

La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier cantidad de factores que afectan el crecimiento celular y/o la concentración de producto final. Por ejemplo, en una modalidad, un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o la fuente de nitrógeno puede mantenerse a una velocidad fija mientras otros parámentros pueden moderarse. En otros sistemas, una cantidad de factores que afectan el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras que la concentración celular, medida mediante la turbidez de los medios, podría mantenerse constante. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento en estado estable. Así, la pérdida de células debido a la extracción del medio debe equilibrarse contra con la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de fermentación continua así como las técnicas para maximizar el índice de formación de producto son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial .

En otras modalidades, mediante el uso de microorganismos de fermentación adecuados como se conoce en la técnica, el producto final de fermentación podría incluir, sin limitación, alcohol, 1 , 3 -propanodiol , ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos, proteínas, oligosacáridos funcionales, y derivados de estos. Ver, por ejemplo, la patente núm. O 2008/086811 (fermentación de metanol, etanol, propanol y butanol) ; patente núm. WO 2003/066816, patente de los Estados Unidos de América núm. 5,254,467 y 6,303,352 (fermentación de 1 , 3-propanodiol) ; patentes de los Estados Unidos de América núm. RE 37,393, 6,265,190 y 6,596,521 (fermentación de ácido succínico) ,· patente de los Estados Unidos de América núm. 5,464,760, documento WO 2003/095659, Mercier et al., J. Chem. Tech. Biotechnol. 55: 111-121, Zhang and Cheryan, Biotechnol. Lett. 13: 733-738 (1991), Linko and Javanainen, Enzyme Microb. Technol. 19: 118-123 (1996) y Tsai and Moon, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72: 417-428 (1998) (fermentación de ácido láctico) ; patentes de los Estados Unidos de América núm. 7,320,882, 7,332,309, 7,666,634 y Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 77: 355-366 (2007) (fermentación de varios aminoácidos) .

La lista mencionada anteriormente comprende solamente ejemplos y una persona con experiencia en la técnica conocerá una cantidad de microorganismos de fermentación que podrían usarse adecuadamente para obtener un producto final deseado.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Licuación y sacarificación de pH único mediante el uso de glucoamilasa de Humicola grísea Se evaluó la capacidad de la glucoamilasa de Humicola grísea (HgGA, por sus siglas en inglés) de hidrolizar sustrato de almidón (licuefacto) al pH de 5.6, sin ajuste de pH. Se licuó almidón de maíz mediante un proceso de cocido convencional mediante el uso de CLEARFLOW® AA (Danisco US Inc., Genencor División) para obtener un licuefacto que tiene DE 10. El licuefacto (35 % de DS) se colocó "como estaba" en matraces de vidrio de 50 mi, sin ajuste de pH para desactivar la a-amilasa presente en el licuefacto (es decir, licuefacto a-vivo) . La sacarificación del licuefacto se llevó a cabo mediante el uso de HgGA en presencia de pululanasa OPTIMAX® L-1000 (1129 ASPU/g) , al incubar las matraces de vidrio a 60 °C en baño de agua durante 69.5 horas. La HgGA se usó a las siguientes dosis: 0.18 GAU/g ds, 0.16 GAU/g ds y 0.14 GAU/g ds . Se retiraron muestras de 0.5 mi de las mezclas de reacción de sacarificación a diferentes intervalos de tiempo, se combinaron con 4.5 mi de agua RO y se filtraron a través de filtros de 0.2 µp? Whatman. Las muestras se colocaron, después, en frascos y se sometieron a análisis de HPLC. El análisis de HPLC se condujo mediante el uso de una columna RCM-monosacárido Rezex con una columna de protección de extracción de cenizas Bio-Rad® . La composición de varios azúcares en las mezclas de reacción de sacarificación se presenta en la Tabla 1.

Tabla 1. Composición de azúcares durante la sacarificación Cuando la HgGA se usó a la dosis de 0.18 GAU/g ds para sacarificación del licuefacto sin ajuste de pH y en presencia de pululanasa, el contenido de DPI alcanzó 88 % después de 28 horas de incubación, mientras que el contenido de azúcares más altas disminuyó a 5.6 %. Después de 44.5 horas, el contenido de DPI aumentó a 93.6 %, y el contenido de azúcar más alta disminuyó a aproximadamente 2 %. La concentración de DPI alcanzada después de 69.5 horas fue 95.2 %, mientras que los azúcares más altos fueron solamente 1.15 %. La información en la Tabla 1 indica que la HgGA puede ser eficaz para hidrolizar almidón solubilizado a glucosa en un proceso de pH único.

Ejemplo 2. Licuación y sacarificación de pH único mediante el uso de glucoamilasa de Humicola grísea, y comparación La capacidad de la HgGA para hidrolizar licuefacto de almidón sin ajuste de pH se evaluó al pH de 5.35. El desempeño de la HgGA durante el proceso de pH único (a-vivo) se comparó con su capacidad para hidrolizar licuefacto de almidón cuando el pH del licuefacto se ajustó (a-muerto) antes de la etapa de sacarificación. El licuefacto de almidón de maíz (12.15 DE, 32 % de ds) se preparó mediante un proceso de cocido de laboratorio convencional mediante el uso de SPEZYME® FRED (Danisco US Inc., Genencor División).

Para la sacarificación de pH único (oí-vivo) , el licuefacto se colocó en matraces de vidrio de 50 mi "como estaba", sin ningún ajuste de pH, y se dosificó con enzimas.

Las enzimas usadas fueron cualquiera de las HgGA a las dosificaciones especificadas en la Tabla 2, o la HgGA a las mismas dosificaciones y en presencia de una pululanasa (pululanasa OPTIMA® L-1000, 1129 ASPU/g) . Para la sacarificación de pH no único (a-muerto) , el licuefacto se colocó en matraces de 50 mi y su pH se ajustó a aproximadamente 3.5 a 4.0 para matar la actividad de a-amilasa. El pH del licuefacto, después, se aumentó nuevamente a 5.35 para la sacarificación como un control. Las enzimas se adicionaron a cada matraz que contenía el licuefacto, como se presenta en la Tabla 2. La reacción de sacarificación se llevó a cabo al incubar las matraces a 60 °C en baño de agua durante 75.3 horas. Se retiraron muestras de 0.5 mi de las mezclas de reacción a diferentes intervalos de tiempo, se diluyeron al combinar con .5 mi de agua RO y se filtraron a través de filtros de 0.2 µ??? Whatman. Después, las muestras se colocaron en frascos para análisis de HPLC. El análisis de HPLC se condujo mediante el uso de una columna RCM-monosacárido Rezex con una columna de protección de extracción de cenizas Bio-Rad® . La composición de varios azúcares en las mezclas de reacción de sacarificación se presenta en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de azúcares durante la sacarificación (HgGA) Cuando la sacarificación se llevó a cabo sin ajuste de pH mediante el uso de HgGA a la dosis de 0.20 GAU/g ds en presencia de la pululanasa, el contenido de DPI alcanzado después de 27.3 horas fue 93 %, mientras que el contenido de azúcares más altas disminuyó a 2.13 %. Después de 75.3 horas de sacarificación, el contenido de DPI aumentó a 95.6 % y el contenido de azúcar más alta disminuyó a 0.65 %. La información de la Tabla 2 indica que, cuando se usó la HgGA en el proceso de pH único, su desempeño (por ejemplo, concentraciones de DPI y DP2 alcanzadas) fue comparable con el desempeño de HgGA proceso a-muerto (ver Figura 1 y Figura 3) .

Ejemplo 3. Almidón granular de pH único mediante el uso de glucoamilasa de Humicola grísea Se evaluó la capacidad de la HgGA de hidrolizar almidón granular a pH 5.5, sin ajuste de pH. Se licuó y sacarificó almidón de maíz simuiltáneamente en presencia de HgGA y XTRA SPEZYME™. Se prepararon DS de 28 % de suspensiones de almidón de maíz granular en ¡matraces de vidrio y se colocaron en un baño de agua a 60 C con el pH ajustado a pH 5.5. La licuación y sacarifi¡cación simultáneas del almidón granular se llevó a cabo médiante el uso de HgGA (0.2 GAU/g ds, 0.25 GAU/g ds, 0.3 GAU/g ds) y 2 AAU/g ds de XTRA SPEZYME™, al incubar los matraces de vidrio a 60 °C en el baño de agua durante 55 horas. Se retiraron muestras de 0.5 mi de la reacción de licuación/sacarificación a diferentes intervalos de tiempo, se combinaron con 4.5 mi de agua RO y se hirvieron durante 10 minutos. Las muestras se enfriaron y, después, se filtraron mediante el uso de un filtro de disco de 0.2 µ?? (Titán Syringe Filter PTFE) antes del análisis de HPLC. El análisis de HPLC se condujo mediante el uso de una columna de RHM Phenomenex. La composición de los distintos azúcares y la solubilización del almidón en las mezclas de licuación/sacarificación se presenta en la Tabla 3.

Tabla 3. Composición de azúcares y solubilización de almidón durante la licuación/sacarificación simultánea de almidón granular a 28 ¾ de DS mediante el uso de HgGA.

Como muestra la Tabla 3 , la licuación/sacarif icación simultánea de almidón de maíz granular a un pH único resultó en un 95 %+ de jarabe de glucosa (DPI) con 90+ % de solubilidad de almidón después de 28 horas de incubación para la totalidad de las dosificaciones de HgGA probadas . Después de 50 horas, el contenido de jarabe de glucosa (DPI) aumentó a 96+ % con una solubilidad de almidón de 97 %, el contenido de azúcar más alta (HS, por sus siglas en inglés) está por debajo de 1 % para todas las dosificaciones de HgGA. La información en la Tabla 3 indica que una licuación/sacarif icación simultánea puede lograrse ef icazmente en un proceso de temperatura y pH único con HgGA en conj unto con una alf a-amilasa .

Se hace constar que con relac ión a esta f echa , el mej or método conocido por la sol ic itante para l levar a la práct ica la citada invención , es el que resulta claro de la presente descripc ión de la invención .

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para procesar un almidón, caracterizado porque comprende sacarificar un sustrato de almidón a glucosa en presencia de una glucoamilasa sin un ajuste de pH, en donde la sacarificación se lleva a cabo a pH 5.2 a 5.6 y a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 58 °C a aproximadamente 62 °C, donde además la glucoamilasa se selecciona del grupo que consiste en una glucoamilasa parental de Humicola grísea (HgGA) que comprende la sec. con núm. de ident.: 3 y una variante de esta, en donde la variante tiene al menos 99 % de identidad con la glucoamilasa parental.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además la sacarificación se lleva a cabo en presencia de una pululanasa.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque además la glucoamilasa variante tiene al menos una modificación de aminoácidos comparada con la glucoamilasa parental.

4. El método de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque además la glucoamilasa es HgGA que tiene secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident . : 3.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque además la glucoamilasa se produce en una célula huésped de Trichoderma reesei.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque además la glucoamilasa se adiciona a una dosis de al menos aproximadamente 0.15 GAU por gramo de almidón de sustancia seca.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque además la glucoamilasa se adiciona a una dosis de al menos aproximadamente 0.20 GAU por gramo de almidón de sustancia seca.

8. El método de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque además la sacarificación se lleva a cabo a pH 5.35 a 5.5.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque además el sustrato de almidón es almidón licuado.

10. El método de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque además la sacarificación alcanza una concentración de DPI de al menos 95 % a aproximadamente 70 horas.

11. El método de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque además el sustrato de almidón es aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 % de sólidos secos (DS, por sus siglas en inglés) .

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque además el sustrato de almidón es aproximadamente 30 % a aproximadamente 35 % de sólidos secos (DS, por sus siglas en inglés) .

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque además el sustrato de almidón es almidón granular.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque además la sacarificación alcanza una concentración de DPI de al menos 95 % a aproximadamente 28 horas .

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además la solubilidad del almidón del sustrato de almidón es al menos 90 %.

16. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque además la sacarificación alcanza una concentración de DPI de al menos 96 % a aproximadamente 50 horas.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque además la solubilidad del almidón del sustrato de almidón es al menos 97 %.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, caracterizado porque además el contenido de azúcar más alta está por debajo del 1 %.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-18, caracterizado porque además el sustrato de almidón es aproximadamente 28 % de sólidos secos (DS) .