MX2012014487A - Compuestos para el tratamiento de transtornos y enfermedades del segmento posterior. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de ciertos compuestos de urea, para el tratamiento de trastornos retinianos asociados con angiogénesis y/o neovascularización ocular patológica.

Description

COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS Y ENFERMEDADES DEL SEGMENTO POSTERIOR Esta solicitud reclama la prioridad bajo 35 U.S.C. §119 a la Solicitud de Patente Provisional No. 61/361,003, presentada el 2 de julio del 2010, los contenidos totales los cuales se incorporan en la presente para referencia.

La presente invención se relaciona con el uso de compuestos para el tratamiento de las formas exudativas y no exudativas de degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética y edema retiniano, y otras enfermedades que implican angiogenesis ocular patológica y/o permeabilidad vascular .

Antecedentes de la Invención La AMD es la causa más común de ceguera funcional en individuos con más de 50 años de edad en países industrializados y una causa común de ceguera inevitable alrededor del mundo. La pérdida de visión asociada con AMD tiene lugar típicamente sólo en las etapas más avanzadas de la enfermedad, cuando los pacientes desarrollan AMD no exudativo ("seca") a cualquier AMD exudativa con neovascularización coroidea (CNV) o para atrofia geográfica. Aunque sólo 10% a 20% de todos los pacientes con AMD no exudativas desarrollarán AMD exudativa, esta forma de AMD representan 80-90% de la pérdida de visión funcional asociada con este trastorno. AMD exudativa, también llamada AMD neovascular o húmeda, se caracteriza por el crecimiento de CNV patológica en el espacio subretiniano . LA. CNV tiene una tendencia a filtrar sangre y fluido, causando síntomas tales como escotoma y metamorfopsia, y a menudo se acompaña por la proliferación de tejido fibroso. La invasión de esta membrana fibrovascular dentro de la mácula puede inducir degeneración fotorreceptora que resulta en pérdida de visión progresiva, severa e irreversible. Sin tratamiento, los ojos más afectados tendrán pobre visión central (<20/200) en un lapso de 2 años .

Otro trastorno retiniano conocido como retinopatía diabética proliferativa (PDR) se caracteriza también por neovascularización patológica de segmento posterior (PS V) . La PDR es la causa más común de ceguera legal en pacientes con diabetes mellitus y se caracteriza por NV pre-retiniana patológica. Además, en pacientes con diabetes mellitus, el edema macular diabético (DME) es la mayor causa de deterioro de visión global. La diabetes mellitus se caracteriza por hiperglicemia persistente que produce cambios patológicos reversibles e irreversibles dentro de la microvasculatura de varios órganos. La retinopatía diabética (DR) , por lo tanto, es una enfermedad microvascular retiniana que se manifiesta como una cascada de etapas con niveles cada vez mayores de severidad y pronósticos de empeoramiento para la visión.

La retinopat a diabética no proliferativa ( NPDR ) y el edema macular subsecuente se asocian, en parte, con la isquemia retiniana que resulta de la microvasculopatía retiniana inducida por hiperglicemia persistente. La NPDR abarca una gama de subcategorías clínicas las cuales incluyen DR "de fondo" inicial, en donde se observan pequeños cambios multifocales dentro de la retina (por ejemplo, microaneurismas , hemorragias "en forma de puntos y manchas", e infartos de capa de fibra nerviosa) , a través de DR pre-proliferativa, la cual precede inmediatamente el desarrollo de PNV . Los sellos histopatológicos de NPDR son microaneurismas retiñíanos, engrosamiento de la membrana basal capilar, pérdida de célula endotelial y pericitos, y la oclusión capilar eventual que conduce a isquemia regional. Los datos acumulados a partir de modelos animales y estudios humanos empíricos muestran que la isquemia retiniana se asocia a menudo con niveles locales cada vez mayores de factores de crecimiento pro-inflamatorios y/o pro-angiogénicos y citosinas, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , prostaglandina E2 y factor-1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1), Angiopoyetina 2, etc. El edema macular diabético puede observarse durante cualquier NPDR o PDR . Sin embargo, se observa a menudo en las últimas etapas de NPDR y es un indicador pronóstico de progreso hacia el desarrollo de la etapa más severa, PDR, en donde el término "proliferativo" se refiere a la presencia de neovascularización pre-retiniana como se establece previamente .

La angiogénesis ocular patológica, incluyendo PSNV, se sabe que tiene lugar como una cascada de eventos que se desarrollan a partir de un estímulo de inicio a la formación de nuevas capilaridades anormales. Aunque la o las causas incitantes específicas de PSNV tanto en AMD como PDR exudativa se desconocen aún, la elaboración de varios factores de crecimiento pro-angiogénicas parece ser un estímulo común. Factores de crecimiento solubles, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF o FGF-2 ) , factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1), angiopoyetinas , etc., se han encontrado en tejidos y fluidos removidos de pacientes con angiogénesis ocular patológica. Después del inicio de la cascada angiogénica, la membrana basal capilar y la matriz extracelular se degradan y tienen lugar la proliferación celular endotelial capilar y la migración. Los brotes endoteliales forman anastomosis para formar tubos con formación de lumen evidente subsiguiente. Las nuevas capilaridades han incrementado comúnmente la permeabilidad vascular o pérdida debido a la función de barrera inmadura, la cual puede conducir a edema de tejido. La diferenciación en un tubo capilar maduro se indica por la presencia de una membrana basal continua y cruces endoteliales normales entre otras células endoteliales y células de soporte vascular llamadas pericitos; sin embargo, este proceso de diferenciación se deteriora a menudo durante las condiciones patológicas. Más específicamente, niveles cada vez mayores de PDGF parecen jugar un papel en la maduración de nuevos vasos sanguíneos actuando como un factor de supervivencia para pericitos.

Hasta hace poco, pacientes con PSNV con riesgo de pérdida de visión habían limitado las opciones de tratamiento. Muchas de las terapias aprobadas, tales como fotocoagulación de láser focal para CNV extrafoveal y terapia fotodinámica con Visudyne® para AMD exudativa, a menudo fueron paliativos y podrían asociarse con complicaciones con riesgo de pérdida de visión en sí. Por ejemplo, la fotocoagulación en rejilla o panretiniana con láser e intervenciones quirúrgicas, tales como vitrectomía y remoción de membranas pre-retinianas , son las únicas opciones actualmente disponibles para pacientes con PDR. Sin embargo, la aprobación de terapias anti-VEGF anti-vitreas ha revolucionado el tratamiento de PSNV patológica, específicamente AMD exudativa.

Evidencia sustancial sugiere que el factor de crecimiento soluble, el factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) , juega un papel crítico en la patogénesis de PSNV. Los VEGF (VEGF-A, B, C, D, E y factor de crecimiento placentario [P1GF]), son una familia de glicoproteínas homodiméricas que se unen con afinidades variables a sus receptores de superficie celular, receptor de VEGF l(VEGFRl), VEGFR2 y VEGFR3. VEGF-A, comúnmente se refieren como VEGF, es una proteína glicosilada dimérica de 36-46 kDa con una secuencia de señal N-terminal y un dominio de unión de heparina. Se han identificado seis diferentes variantes de empalme pro-angiogénicas de VEGF; éstas difieren en su número de aminoácidos e incluyen VEGF206, VEGF189, VEGF183, VEGF165/ VEGF145 y VEGF121. Las formas más cortas son más libremente di fundibles, por ejemplo, VEGF121 carecen completamente del dominio de unión de heparina, y VEGF165 es la más abundante de estas variantes de peso molecular inferior. Las variantes más grandes, VEGF206 y VEGF189, son de unión de matriz y es poco probable que se unan a los receptores de células endoteliales .

VEGF es el ligando más ampliamente caracterizado de VEGFR-1 y VEGFR-2, los cuales son receptores de membrana celular principalmente ubicados en la superficie de las células endoteliales vasculares y exhiben actividad intrínseca de tirosina cinasa después de la unión de ligandos. Estas dos tirosinas cinasas de receptor VEGF (RTKs) son los principales contribuidores para morfogénesis vascular y neovascularización patológica mediante dos mecanismos primarios: (1) estimulación de crecimiento de nuevos vasos (vasculogénesis ylo angiogénesis ) y (2) hiper-permeabilidad vascular incrementada. Se han localizado VEGF, VEGFR1 y VEGFR2 en fluidos oculares y membranas neovasculares obtenidas de pacientes con AMD neovascular y retinopatía diabética; quizá más considerablemente, la presencia de estas proteínas se asoció con la severidad cada vez mayor de la enfermedad.

Los agentes anti-VEGF que han sido aprobados para el tratamiento de AMD neovascular son el aptámero de ácido ribonucleico, Macugen®, (pegaptanib, Eyetech/OSI/Pfizer) los cuales unen específicamente VEGF-A165 y Lucentis® (ranibizumab, Genentech/Novartis ) en fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal humanizado que une todas las isoformas de VEGF-A. Aunque Macugen® fue aprobado en 2004, pacientes tratados con Macugen® intravítreo en estudios de Fase III siguieron experimentando pérdida de visión durante el primer año de tratamiento, aunque la velocidad de descenso de visión en el grupo tratado con Macugen® fue más lento que la velocidad en el grupo tratado con placebo. Macugen® fue menos efectivo durante el segundo año de tratamiento que durante el primer año, demostrando beneficio en sólo uno de estos dos estudios pivotales.

En contraste, Lucentis® intravítreo, aprobado en 2006, administrado en intervalos de 4 semanas en pruebas de Fase III mantuvo agudeza visual mejor corregida (BCVA) en 95% de pacientes tratados y BCVA mejorada por 15 ó más letras en 24 .a 40% de pacientes tratados. Estos beneficios notables se apoyaron durante los 24 meses de duración del tratamiento cuando se inyectaba Lucentis cada mes. Sin embargo, cuando se administró Lucentis® en intervalos de 12 semanas seguida de tres dosis de saturación mensual inicial en pacientes con AMD exudativa y seguida por 12 meses de tratamiento con Lucentis® conserva pero no mejora la agudeza visual. Aunque Lucentis® intravítreo representa una mejora marcada en resultados terapéuticos para pacientes con AMD neovascular, estos y otros resultados menos favorables cuando se utilizan frecuencias de dosificación de menos de una inyección por mes sugieren que una mayor necesidad médica no adecuada de terapia anti-VEGF actual es duración de acción.

Una variedad de otras estrategias anti-VEGF se o ha sido investigada en pruebas clínicas humanas para AMD y DME exudativa tal como Avastin® intravítreo (bevacizumab, Genentech) , un anticuerpo monoclonal humanizado de longitud total contra VEGF-A que se mejoró en 200 para tratamiento intravenoso de cáncer colo-rectal ; VEGF intravítreo TrapRiPv2 (Regeneron) una proteína quimérica recombinante de 110 kDa, que comprende porciones de los dominios de unión de ligando extracelular de VEGFRl y VEGFR2 humano combinado con la porción Fe de IgG humana y une todas las isoformas de VEGF-A así como el factor de crecimiento placentario (P1GF) ; la terapia de combinación de Lucentis® intravítreo más un aptámero anti-PDGF (Ophthotech) , en un intento para inducir retroceso de NV a través de bloqueo simultáneo de ECs activas y pericitos; así como el suministro local o sistémico de varios inhibidores de tirosina cinasa receptora (RTKi's) Los inhibidores de tirosina cinasa receptora (RTKi's) son una clase más reciente de compuestos anti-angiogénicos que bloquean la transducción de señal de VEGF inhibiendo la fosforilación de tirosina intrínseca de los receptores de membrana celular. Los RTKi se evalúan clínicamente para indicaciones tanto oftálmicas como no oftálmicas. Una ventaja significativa para el uso de RTKi's en el tratamiento de enfermedades dependientes de angiogénesis es su potencial para proporcionar un bloqueo más completo de señalización de VEGF bloqueando la activación receptora a partir de múltiples ligandos. Sin embargo, debido a que los RTKi's más efectivos bloquean simultáneamente las trayectorias de señalización, estos se anticipan para proporcionar ventajas en la eficacia durante terapias actuales dirigidas en un factor de crecimiento solitario. Como moléculas pequeñas (<500 Da), los RTKi's tienen el potencial para distribución ínter e intracelular mejorada y son más susceptibles de formulación dentro de los dispositivos de suministro sostenido cuando se comparan con grandes moléculas biológicas, tales como anticuerpos o péptidos grandes .

Con relación a las indicaciones oftálmicas, un cuerpo cada vez mayor de evidencia científica sugiere que los RTKi ' s pueden proporcionar ventajas sustanciales en el tratamiento de PSNV patológica y/o edema retiniano. PKC412 (CGP41251, Novartis) un RTKi selectivo contra isoformas PKC así como VEGFRs y PDGFRs, proporcionan reducciones parciales en espesor foveal mejorado como se mide por OCT y una mejora en la agudeza visual después de la administración oral en pacientes con DME existente. Sin embargo, eventos adversos gastrointestinales, tal como diarrea, náusea y vómito, y actividad cada vez mayor de transminasa fueron limitantes de dosis. La administración oral de otro RTKi, PTK787 (vatalanib, Novartis y Shering AG) ha experimentado la investigación clínica en pacientes con AMD neovascular. PTK787 es un inhibidor de VEGF más selectivo en comparación con PKC412 y ha demostrado que proporciona una inhibición significativa de PSNV en modelos de roedor. Aunque no se han liberado resultados a partir de estudio de AMD neovascular de Fase 1/2, los eventos adversos más comunes reportados a partir de estudios publicados de oncología de Fase 1/2 utilizando dosificación diaria oral de PTK787 ha sido fatiga, náusea, mareo, vómito, anorexia y diarrea. Recientemente, el RTKi , Pazopanib (GlaxoSmithKline) se ha incorporado en pruebas clínicas para AMD exudativa utilizando administración ocular tópica.

Un RTKi selectivo, efectivo, suministrado localmente contra angiogénesis ocular patológica, PS V, AMD exudativa, DME, edema retiniano/macular, DR, e isquemia retiniana, podría proporcionar un beneficio sustancial al paciente mediante la inhibición y/o retroceso de angiogénesis e inhibición de permeabilidad vascular incrementada cada vez mayor, por lo que se mantiene o mejora significativamente la agudeza visual. El tratamiento efectivo de estas patologías podría mejorar la calidad de vida y productividad del paciente dentro de la sociedad. También, los costos sociales asociados con la asistencia y el cuidado de la salud a personas con deficiencia visual podrían reducirse dramáticamente .

Compendio de la Invención Esta solicitud se dirige al uso de ciertos compuestos de urea para tratar personas que sufren de trastornos del segmento posterior asociados con angiogénesis/neovascularización ocular patológica y/o edema retiniano, incluyendo las formas exudativas y no exudativas de AMD, retinopatía diabética, la cual incluye retinopatía diabética pre-proliferativa (conjuntamente DR) , DME y PDR, edema retiniana o macular, oclusión de vena retiniana central o ramificada, y retinopatías isquémicas.

Descripción Detallada de la Invención La neovascularización de segmento posterior es la patología con riesgo de pérdida de visión responsable de las dos causas más comunes de ceguera adquirida en países desarrollados: degeneración macular exudativa relacionada con la edad (AMD) y retinopatía diabética proliferativa (PDR) .

Además de los cambios en la microvasculatura retiniana inducida por hiperglicemia en pacientes diabéticos que conducen a edema macular, la proliferación de membranas neovasculares se asocia también con fuga vascular y edema de la retina. En el caso en donde el edema involucra la mácula, la agudeza visual se empeora. En retinopatía diabética, el edema macular es la causa principal de pérdida de visión. Como en desórdenes angiogénicos , la fotocoagulación con láser se utiliza para estabilizar o determinar la condición edematosa. Aunque se reduce el desarrollo adicional de edema, la fotocoagulación con láser es un procedimiento citodestructor , que, desafortunadamente alterará el campo visual del ojo afectado.

Una terapia farmacológica efectiva para NV ocular y edema podría proporcionar una eficacia sustancial al paciente, en muchas enfermedades por lo que se evitan los procedimientos con láser quirúrgicos o dañinos, invasivos. El tratamiento efectivo de la V y edema podrían mejorar la calidad de vida y productividad del paciente dentro de la sociedad. También, costos sociales asociados con la asistencia y el cuidado a la salud a personas ciegas podrían reducirse dramáticamente.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento que ciertos compuestos de urea que inhiben las tirosinas cinasas receptoras son útiles para el tratamiento e AMD, DR, DME, edema retiniano/macular , retinopatías isquémicas y una enfermedad asociada con la neovascularización de segmento posterior (PSNV) . Un RTKi selectivo suministrado localmente, efectivo podría proporcionar un beneficio sustancial al paciente mediante la inhibición y/o retroceso de angiogénesis y la inhibición de permeabilidad vascular cada vez mayor, por lo que se mantiene o mejora significativamente la agudeza visual. Al considerar la lista bien descrita de efectos secundarios adversos asociados con terapia anti-VEGF sistemica en oncología, tales como hipertensión, síndrome nefrótico, eventos tromboembólicos , sangrado, perforaciones gastrointestinales, cambios de voz, toxicidad mucosal, síndrome de mano-pie, fatiga, complicaciones neurológicas (por ejemplo, síndrome de leucoencefalopatía posterior reversible) , mielosupresión y elevaciones de transaminasa, acopladas con la observación de algunas de estas reacciones adversas en pruebas oftálmicas tempranas después de la dosificación sistémica de compuestos anti-VEGF, el suministro ocular local de un RTKi selectivo puede proporcionar ventajas únicas de tratamiento tanto en la seguridad como la eficacia para pacientes con una enfermedad de segmento posterior debilitante. Además, estos compuestos han demostrado que proporcionan un retroceso de PSNV en modelos animales, una característica farmacológica no encontrada cuando se utilizan inhibidores que bloquean únicamente la trayectoria de VEGF, tal como Lucentis® intravítreo. Por lo tanto, la presente invención puede proporcionar un beneficio clínico en una o más de las tres áreas principales: eficacia cada vez mayor, duración de acción cada vez mayor y efectos secundarios sistémicos reducidos .

Los compuestos preferidos para su uso en los métodos de la presente invención son compuestos I a VII establecidos posteriormente.

II Vil Nombres químicos para Compuestos I-VII se muestran la Tabla 1, siguiente.

Se conocen los compuestos I-VII de la presente invención, y sus síntesis se describen en la solicitud estadounidense no. de serie 2006/0178378 (Compuesto I) , la solicitud estadounidense no. de serie 2003/0181468 (Compuesto II), Patente Estadounidense No. 7,297,709 (Compuestos III y IV) y las solicitudes estadounidenses nos. de serie 2005/0020619 y 2005/0026944 (Compuestos V-VII) , cada uno de los cuales se incorpora en la presente para referencia. Además, dos diferentes compuestos de urea relacionados (VIII y IX) que se conocen (véanse estructuras mostradas posteriormente) y sus síntesis se describen en la Patente Estadounidense No. 7,297,709 y demostraron que son inefectivas en los siguientes estudios farmacológicos.

Se contempla también que las sales farmacéuticamente aceptables de cualesquiera compuestos I a Vil, y cualquier combinación de compuestos I-VII pueden utilizarse en los métodos de la presente invención.

Como se utiliza en la presente, los términos "sal farmacéuticamente aceptable" significa cualquier anión de Compuestos I-VII podría ser adecuado para administración terapéutica a un paciente mediante cualquier método convencional sin consecuencias significativas perjudiciales para la salud Ejemplos de aniones farmacéuticamente aceptables, o sales, incluyen cloro, bromo, acetato, benzoato, maleato, fumarato y succinato.

Los compuestos descritos en la presente pueden estar contenidos en diversos tipos de composiciones farmacéuticas, de acuerdo con técnicas de formulación conocidas por aquellos expertos en el arte. Las composiciones farmacéuticas que contienen los Compuestos descritos en la presente pueden administrarse a través de cualquier método o ruta de suministro posible, sin embargo, se prefiere la administración local al ojo. Se contempla que todas las rutas locales al ojo pueden utilizarse incluyendo administración tópica, subconjuntiva , peri-ocular, retrobulbar, subtenón, intracameral , intravítrea, intraocular, sub-retina y supra-coroidea. La administración sistémica o parenteral puede ser factible incluyendo, aunque sin limitarse a suministro intravenoso, subcutáneo y oral. El método más preferido de administración será intravítreo o por inyección subtenón de soluciones o suspensiones, o colocación intravítrea o subtenón de dispositivos bioerosiónables o no bioerosionables , o mediante administración ocular tópica de soluciones o suspensiones o administración juxtascleral de una formulación en gel. Otro método preferido de suministro es la administración intravítrea de un implante bio-erosionable administrado a través de un dispositivo tal como aquel descrito en la publicación de solicitud estadounidense número 2007/0060887.

La presente invención también se dirige a la provisión de composiciones adaptadas para el tratamiento de tejidos principales de la retina y el nervio óptico. Las composiciones oftálmicas de la presente invención incluirán uno o más de los Compuestos I-VII descritos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden utilizarse varios tipos de vehículos . Los vehículos generalmente serán acuosos por naturaleza. Se prefieren generalmente soluciones acuosas, con base en la facilidad de formulación, así como una capacidad del paciente para administrar fácilmente tales composiciones por medio de implantación de una a dos gotas de las soluciones en los ojos afectados. Sin embargo, los compuestos para su uso en la presente invención pueden también incorporarse fácilmente en otros tipos de composiciones, tales como suspensiones, geles viscosos o semi-viscosos u otros tipos de composiciones sólidas o semi-sólidas . Las suspensiones pueden preferirse para compuestos que son relativamente insolubles en agua. Las composiciones oftálmicas de la presente invención pueden también incluir varios otros ingredientes, tales como reguladores, conservadores, co-solventes y agentes de desarrollo de viscosidad.

Un sistema de regulación apropiado (por ejemplo, fosfato de sodio, acetato de sodio o borato de sodio) puede agregarse para evitar que el pH se desplace bajo condiciones de almacenamiento.

Los productos oftálmicos se empacan típicamente en forma de dosis múltiples. Se requieren de este modo, conservadores para evitar la contaminación microbiana durante su uso. Los conservadores adecuados incluyen: cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol , metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetáto disódico, ácido sórbico, poliquaternio-1 u otros agentes conocidos por aquellos expertos en la técnica. Tales conservadores se emplean típicamente en un nivel de 0.001 a 1.0% en peso/volumen ("% p/v").

La ruta de administración (por ejemplo, inyección tópica, ocular, parenteral u oral) y el régimen de dosis se determinará por los médicos experimentados, con base en los factores tales como la naturaleza exacta del padecimiento que se trata, la severidad del padecimiento y la edad y condición física general del paciente.

En general, la dosis utilizada para los propósitos descritos anteriormente variará, aunque será en una cantidad efectiva para evitar o tratar AMD, DR y edema retiniano. Como se utiliza en la presente, el término "cantidad farmacéuticamente aceptable" se refiere a una cantidad de uno o más de los compuestos descritos en la presente los cuales tratarán efectivamente AMD, DR y/o edema retiniano en un paciente humano. La dosis utilizada para cualquiera de los propósitos antes descritos generalmente será de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal (mg/kg) , administrada una a cuatro veces por día. Cuando las composiciones se dosifican tópicamente, generalmente serán en un intervalo de concentración de 0.001 a aproximadamente 10% p/v, con 1-2 gotas administradas 1-4 veces por día.

Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier formulación que es segura, y proporciona el suministro apropiado para la ruta deseada de administración de una cantidad efectiva de por lo menos un compuesto de la presente invención .

Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se apreciará por aquellos expertos en el arte que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas que funcionan bien en la práctica de la invención, y de este modo puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos de experiencia en la técnica deben, debido a la presente descripción, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas, los cuales se describen y obtienen aún un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

La presente invención se basa en el descubrimiento que los compuestos de urea que bloquean la autofosforilación de tirosina podrían seleccionarse de varios géneros utilizando una serie de ensayos de farmacología eficiente para demostrar su capacidad intrínseca para (1) inhibir la neovascularización retiniana y coroidea; (2) causar el retroceso de neovascularización retiniana y coroidea; y (3) bloquear la permeabilidad vascular retiniana. Además, se utilizaron los mismos ensayos farmacológicos para mostrar que otros compuestos de urea a partir del mismo género no tuvieron las mismas propiedades de eficacia intrínseca. Por lo tanto, no se conocían previamente las propiedades farmacológicas descubiertas para estas moléculas de urea. Los resultados de varios compuestos de urea en los ensayos seleccionados se resumen en la tabla posteriormente.

EJEMPLO 1 Ensayo KDR MÉTODOS. Se llevaron a cabo ensayos de cinasa de HTRF de 7 puntos (Fluorescencia de Resolución Temporal Homogénea) utilizando una Estación de Trabajo Robótica Biomek 3000 en un formado de placa de 96 pozos para determinar valores IC50 para los compuestos de prueba para cinasa de KDR (VEGR2) utilizando un kit KinEASE-TK de CisBio. Éste es un kit general para tirosinas cinasas incluyendo cinasa de KDR. La cinasa de KDR se adquirió de Cell Signaling Technology. El ensayo se lleva a cabo en dos etapas. La fosforilación del sustrato de péptido genético etiquetado con biotina (2 mM) se inicia mediante la adición de ATP (10 mM) en la presencia de cinasa de KDR (5 rtg en 50 mi de mezcla de reacción) en la etapa 1 y la reacción se detiene después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente por la adición de una mezcla que contiene dos reactivos de detección de HTRF y EDTA en la etapa 2. El sustrato, enzima y diluciones de ATP se hicieron con el tampón provisto por CisBio. Las diluciones del compuesto se hicieron ya sea en 5% de DMSO o 10:10, (DMSO : Etanol ) para preparar soluciones madre activas 4X. Los reactivos de detección de HTRF fueron un anticuerpo para fosfotirosina, etiquetado con Eu(K) (el donador de HTRF) y una estreptavidina-XL665 (el aceptor de HTRF) . La señal de HTRF resultante (proporción de 665 nm/620 nm) se mide utilizando un lector de placas de HTRF Tecan y se analizaron los datos utilizando un programa de computadora de ajuste sigmoidal iterativo, no lineal (OriginPro 8.0) para generar las constantes de inhibición para los compuestos de prueba.

RESULTADOS. Siete inhibidores de moléculas pequeñas, estructuralmente diferentes, únicos de las tirosinas cinasas receptoras (RTKi's) (Compuestos I-VII) demostraron potencia sustancial en dos ensayos in vitro, incluyendo la eficacia significativa contra proliferación inducida por VEGF en un ensayo celular. Específicamente, todos los RTKi's demostraron un valor IC50 < inM cuando se probó para actividad contra KDR (VEGFR2 humano) en un ensayo basado en enzimas, como se describe en la presente (Tabla 2). Además, los otros dos compuestos de urea relacionados (VIII y IX, Tabla 2) demostraron que no tienen esencialmente actividad contra KDR en comparación con los Compuestos I-VII.

Tabla 2 EJEMPLO 2 Ensayo de BREC MÉTODOS. Debido a su capacidad para inhibir potencialmente VEGR2, cada Compuesto I-VII se evaluó para actividad contra proliferación inducida por VEGF de células endoteliales retinianas de bovino (BRECs) . Las células endoteliales retinianas de bovino se sembraron en 3000 - 7000 células/pozo en placas de 96 pozos recubiertas con fibronectina en medio de crecimiento MCDB-131 con 10% de FBS. Después de 24 horas el medio de crecimiento se remplazó con medio MCDB-131 suplementado con 1% de FBS, glutamina, heparina, hidrocortisona y antibióticos. Después de otras 22-24 horas, las células se tratan con o sin 50 ng7ml de medio de VEGF y los compuestos de prueba en el medio de 1% de FBS. Después de 30 horas se agrega entonces BrdU durante las 16 horas finales de la incubación. Todas las células se preparan y analizan entonces con un kit ELISA de BrdU colorimétrico .

RESULTADOS. Todos los compuestos (I-VII) demostraron inhibición potente y eficaz de proliferación inducida por VEGF, en donde todos los siete Compuestos proporcionaron un EC50 <2 nM, y seis de los siete Compuestos tuvieron un EC50 <0.5 nM (Tabla 2). Además, todos los siete Compuestos exhibieron una potencia relativa >0.5 de un RTKi estándar de referencia conocido porque proporciona eficacia reproducible en modelos animales de la enfermedad del segmento posterior (Tabla 2) . Además, los otros dos compuestos de urea relacionados (VIII y IX, Tabla 2) demostraron que se inactivan completamente contra proliferación inducida por VEGF en comparación con los Compuestos I-VII. Debido a su inactividad tanto en ensayo de KDR como en ensayo de proliferación de BREC, los Compuestos VIII y IX no prosiguieron la prueba in vivo.

EJEMPLO 3 El suministro intravítreo de Compuestos I-VII, inhibe la permeabilidad vascular retiniana inducida por VEGF en la rata MÉTODOS: Se anestesiaron a ratas Sprague-Dawley adultas con cetamina/xilazina intramuscular y sus pupilas se dilataron con gotas cicloplégicas tópicas. Las ratas se asignaron aleatoriamente a grupos de inyección intravítrea de formulaciones de 0% 0.3%, 1.0% y 3.0% de Compuestos I-VII y un control positivo. Diez µ? de cada compuesto se inyectó de forma intravítrea en cada ojo de tratamiento (n= 5~6 animales por grupo) . Tres días después de la primera inyección intravítrea, todos los animales recibieron una inyección intravítrea de 10 uí 500 ng hr VEGF e ambos ojos. Veinticuatro horas después de la inyección de VEGF, se realizó una infusión intravenosa de 3% de tinte azul Evans en todos los animales, en donde se inyectó 50 mg/k de tinte azul Evans a través de la vena lateral de la cola durante la anestesia general. Después que el tinte hubo circulado durante 90 minutos, las ratas fueron sacrificadas. Las ratas se perfundieron sistémicamente entonces con una solución salina equilibrada, y luego ambos ojos de cada rata se enuclearon inmediatamente y las retinas se cosecharon utilizando un microscopio quirúrgico. Después de medir el peso húmedo de la retina, se extrajo el tinte azul Evans colocando la retina en una formamida de 0.2 mi (Sigma) y luego se homogenizaron y ultracentrifugaron. Se centrifugaron muestras de sangre y el plasma se diluyó 100 veces en formamida. Tanto para la retina como para las muestras de plasma, se utilizó 60 µ? de sobrenadante para medir la absorbancia de tinte azul Evans (ABS ) en 620/740 nm. Se calcularon la disolución de barrera retiniana sanguínea y la subsiguiente permeabilidad vascular retiniana como se mide por la absorbancia de tinte como +/s.e.m. promedio de ABS en peso/plasma de ABS/húmeda. Se utilizó A OVA unidireccional para determinar una diferencia total entre los medios de tratamiento, y una prueba o prueba de suma de rangos Man-Whitney se realizó para una comparación en pares entre los grupos de tratamiento, en donde P < 0.05 se consideró significativa.

RESULTADOS. En el modelo de VEGF de rata, cada compuesto se probó inicialmente utilizando una sola inyección ivt de cualquier suspensión de 0.1% ó 1%. Seis de siete Compuestos demostraron la capacidad para inhibir RVP inducida por VEGF, en donde cinco o seis Compuestos proporcionaron >70% de inhibición (*P<0.05), en una o más dosis en comparación con los controles inyectados con vehículo (Tabla 3 ) . Luego, se probó cada compuesto en una manera de respuesta de dosis utilizando una sola inyección ivt (Tabla 4 ) .

Tabla 4 *Los compuestos son de igual potencia para referencia estándar, ya que 95% de límites de confianza (CL) abarca 1.0 (LL < 10 < UL) EJEMPLO 4 Prevención y Retroceso de neovascularización pre-retiniana después del suministro intravítreo de Compuestos I-VII, en el Modelo de Rata de Retinopatxa Inducida por Oxígeno MÉTODOS : Fueron recibidas ratas Sprague-Dawley embarazadas en 14 días de gestación y engendraron subsiguientemente el día 22 ± 1 de gestación. Inmediatamente después del parto, las crías se agruparon y eligieron al azar en carnadas separadas (n=17 crías /carnada), se colocaron en cajas para zapatos separadas dentro de la cámara de suministro de oxígeno, y se sometieron a un perfil de exposición de oxígeno a partir del Día 0-14 después del parto. Las carnadas se colocaron entonces en un aire ambiente a partir del Día 14/0 al Día 14/6 (días 14-20 después del parto) . Para estudios de prevención, cada cría se asignó aleatoriamente en varios grupos de tratamiento en el Día 14/0. Para aquellas elegidas al azar en un grupo de tratamiento de inyección: un ojo recibió una inyección intravítrea de 5 µ? de entre 0.01% - 1% de un RTKi y el ojo contra-lateral recibió una inyección intravítrea de 5 µ? del vehículo. En el día 14/6 (20 días después del parto), todos los animales se sacrificaron. Para estudios de retroceso, cada cría se asignó aleatoriamente como un control expuesto a oxígeno o en varios grupos de tratamiento en el Día 18/0. Para aquellos elegidos al azar en un grupo de tratamiento de inyección: un ojo recibió una inyección intravítrea de 5 µ? de entre 0.01% - 1% de RTKi y el ojo contra-lateral recibió una inyección de 5 µ? de vehículo. En el día 14/7 (21 días después del parto) , todos los animales se sacrificaron.

Inmediatamente después de la eutanasia, se cosecharon las retinas de todas las crías de ratas, se prepararon en 10% de formalina regulada neutra durante 24 horas, se sometieron a tinción de ADPasa, y se prepararon en portaobjetos como montajes completos. Las imágenes digitales se adquirieron de cada montaje plano retiniano que se preparó apropiadamente. Se utilizó un análisis de imagen computarizada para obtener una puntuación de hora del reloj NV a partir de cada muestra legible. Se evalúo cada hora del reloj de un total de 12 para la retina de la presencia o ausencia de NV pre-retiniana . Comparaciones estadísticas utilizan puntuaciones medianas para horas del reloj de NV a partir de cada grupo de tratamiento se utilizaron en análisis no paramétrico. Cada cría no inyectada representa una puntuación de NV tomando el valor promedio de ambos ojos y se utilizó en comparaciones contra cada grupo de dosis. Debido a que las crías se asignaron al azar y no se observó diferencia entre las crías control, expuestas a oxígeno a partir de todas las carnadas, se combinaron las puntuaciones de NV para todos los grupos de tratamiento. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

RESULTADOS: En el modelo OIR de rata, cada Compuesto se probó inicialmente utilizando una sola inyección ivt de cualquier suspensión de 0.1% ó 1% en un paradigma de prevención. Seis de siete Compuestos proporcionaron 100% de inhibición (P<0.05) en la dosis de 1% cuando se compara al vehículo (Tabla 5) . Estudios de prevención de respuestas de dosis subsecuente utilizando una sola inyección de ivt de suspensión demostraron que todos los siete Compuestos fueron aproximadamente >2x más potentes contra neovascularizacion pre-retiniana que un RTKi estándar de referencia conocido porque proporciona eficacia reproducible en el modelo OIR de rata (Tabla 6) . Además, se probaron cuatro de siete compuestos en retroceso de respuesta de dosis, es decir, intervención, los estudios utilizando una sola inyección ivt de suspensión demostraron que todos los cuatro Compuestos fueron casi 2x más potentes en la neovascularización pre-retiniana de retroceso contra el RTKi de referencia (Tablas 7) .

Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 EJEMPLO 5 Prevención y Retroceso de neovascularización coroidea inducida por láser (CNV) después de un suministro intravítreo de Compuestos I-VII, en el ratón.

MÉTODOS . Se generó CNV mediante ruptura inducida por láser de membrana de Bruch. En resumen, se anestesiaron ratones C57BL/6J de 4 a 5 semanas de edad utilizando administración intreperitoneal de clorhidrato de cetamina (100 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) y las pupilas de ambos ojos se dilataron con instilación ocular tópica de 1% de tropicamida y 2.5% de MYDFIN®. Se utilizó una gota de celulosa tópica (GONIOSCOPIC®) para lubricar la córnea. Se aplicó un cubreobjetos manual a la córnea y se utilizó como una lente de contacto para ayudar a la visualización del fondo del ojo. Tres a cuatro quemaduras retinianas se colocaron en el ojo asignado al azar (ojo derecho a izquierdo de cada ratón) utilizando el láser EyeLite de Alcon 532 nm con un sistema de suministro de lámpara de hendidura. Se utilizaron quemaduras con láser para generar una ruptura en la membrana de Bruch, lo cual se indicó of almoscópicamente mediante la formación de una burbuja bajo la retina. Únicamente ratones con quemaduras con láser que produjeron tres burbujas por ojo fueron incluidos en el estudio. Las quemaduras se colocaron típicamente en las posiciones 3, 6, 9 ó 12 del reloj en el polo posterior de la retina, evitando las arterias y las venas retinianas ramificadas.

Cada ratón se asignó al azar en uno de los siguientes grupos de tratamiento: controles no inyectados, controles inyectados con placebo, ratones inyectados con vehículo o uno de tres grupos inyectados con Compuesto. Los ratones control recibieron fotocoagulacion con láser en ambos ojos, en donde un ojo recibió una inyección placebo, es decir, una punción de aguja pars plana. Para animales inyectados en forma intravítrea, un ojo tratado con láser recibió una inyección intravítrea de 2 ó 5 µ? de 0.11 - 31 de un RTKi o vehículo. Para estudios de prevención, se realizó la inyección intravítrea inmediatamente después de la fotocoagulación con láser. Para el retroceso, es decir, la intervención, el estudio con RT is, se realizó la inyección intravítrea en el Día 7 después de la fotocoagulación con láser y un grupo de ratones no inyectados tratados con láser se cosecharon también en · el Día 7 para controles. En el día 14 después del láser, todos los ratones se anestesiaron y se perfusionaron sistémicamente con dextrano etiquetado con fluoresceína . Los ojos se cosecharon entonces y se prepararon como montajes planos coroideos con el lado RPE orientado hacia el observador. Todos los montajes pianos coroideos se examinaron utilizando un microscopio fluorescente. Se capturaron imágenes digitales de la CNV, en donde la CNV se identificó como áreas de hiperfluorescencia dentro del fondo pigmentado. Se utilizó un análisis de imagen computarizada para delinear y medir las dos áreas dimensionales de CNV hiperfluorescente por lesión (um2) para la medición de resultados. El área/quemadura de CNV mediána por ratón por grupo de tratamiento o el área/quemadura de CNV promedio por grupo de tratamiento se utilizó para análisis estadístico dependiendo de la normalidad de distribución de datos; P < 0.05 se consideró significativo.

RESULTADOS. En estudios de prevención pilotos en el modelo de CNV de ratón, dos de los Compuestos probados a la fecha causaron una reducción notable en CNV inducida por láser después de una sola inyección ivt de dosis gue varia de 0.1 - 1.0% de suspensión. Dos de tres compuestos proporcionaron la inhibición estadísticamente significativa en la dosis más elevada probada cuando se compara con los controles inyectados con vehículo (Tabla 8) .

Los resultados al utilizar una sola inyección intravítrea (ivt) del Compuesto I y II.

Estudios de prevención de respuesta de dosis subsiguientes utilizando una sola inyección ivt de suspensión demostraron que el Compuesto I fue más potente, mientras el Compuesto II fue ligeramente menos potente que el RTKi de referencia al inhibir la formación de CNV (Tabla 9). En el estudio de retroceso, el Compuesto I fue equivalente al RTKi de referencia al causar el retroceso de CNV existente cuando se administra mediante una sola inyección ivt en el Día 7 después del láser; y el Compuesto II también demostró un efecto de retroceso de CNV significativo (57.4%, Tabla 9).

Tabla 8 Estudios de CNV en Ratón: eficacia inicial (Prevención) Tabla 9 Estudios de CNV en Ratón: Prevención y Retroceso *Los ccnpuestos son de igual potencia para estándar de referencia, ya que el 95% de los límites de confianza (CL) abarcan 1.0 (LL < 1.0 < UL) # Número de potencia aproximado, ya que las lineas no están paralelas.

Se ha descrito la invención mediante referencia a ciertas modalidades preferidas; sin embargo, se debe entender que puede manifestarse en otras formas o variaciones específicas de la misma sin apartarse del espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas anteriormente se consideran por lo tanto que son ilustrativas en todos los aspectos y no restrictivas, el alcance de la invención se indica por las reivindicaciones anexas en lugar de por la descripción anterior.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar neovascularización del segmento posterior, AMD, DR y/o edema retiniano en un paciente el cual comprende administrar al paciente con necesidad de tal tratamiento una composición oftálmica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de 1- [4- (3-Amino-lH-pirazolo [3 , 4-c]piridin-4-il ) -fenil ] -3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino-tieno[2, 3-d]pirimidin-5-il) -fenil] -3-m-tolil-urea 1- [4- (3-Amino-lH-indazol-4-il) -fenil] -3- (3-hidroxi-5-metil-fenil ) -urea l-{4- [3-Amino-7- ( 2-metoxi-etoxi ) -ltf-indazol-4-il ] -fenil}-3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino-tieno [3 , 2-c]piridin^3-il) -fenil] -3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino-7-piridin-4-il-tieno [3 , 2-c]piridin-3-il ) -fenil ] -3-m-tolil urea 1- [4- (4-Amino-7-piridin-3-il-tieno [3 , 2-c]piridin-3-il ) -fenil ] -3-m-tolil-urea, y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto es 1- [4- (4-Amino-tieno [2 , 3-d]pirimidin-5-il) -fenil] -3-m-tolil-urea.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de tal compuesto en la composición oftálmica es de 0.001% a 10%.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la concentración de tal compuesto en la composición oftálmica es 1%.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la composición oftálmica se administra a través de una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración tópica, subconjuntiva, administración periocular, administración retrobulbar, administración subtenón, inyección intracameral , inyección intravítrea, inyección intraocular, administración subretiniana, administración supracoroidea y administración juxtascleral posterior.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la composición oftálmica se administra a través de inyección intravítrea .

7. Un método para causar retroceso de neovascularización ocular, el método comprende administrar a un paciente con necesidad del mismo una composición oftálmica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de 1- [4- (3-Amino-l H-pirazolo [3 , 4-c]piridin-4-il) -fenil] -3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino-tieno[2, 3-d]pirimidin-5-il ) -fenil] -3-m-tolil-urea 1- [4- (3-Amino-l íí-indazol-4-il ) - fenil ] -3 - (3-hidroxi-5-metil-fenil) -urea l-{4- [3-Amino-7- (2-metoxi-etoxi) -1 tf-indazol-4-il ] -fenil} -3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino- tieno [ 3 , 2-c] iridin-3 -il ) -fenil ] -3-m-tolil-urea 1- [4- (4-Amino-7-piridin-4-il- tieno [3 , 2-c]piridin-3-il ] -fenil- ] -3-m-tolil-urea 1- (4- (4-Amino-7-piridin-3-il-tienO[3, 2-c]piridin-3-il ) -fenil ] -3-m-tolil-urea y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas .

8. El método de la reivindicación 7, en donde el compuesto es 1- [4- ( 4-Amino-tieno [2 , 3-d]pirimidin-5-il ) -fenil] -3-m-tolil-urea .

9. El método de la reivindicación 7, en donde la concentración de tal compuesto en la composición oftálmica es de 0.001% a 10%.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la concentración de tal compuesto en la composición oftálmica es 1%.

11. El método de la reivindicación 7, en donde la composición oftálmica se administra a través de una ruta seleccionada del grupo que consiste de administración tópica, subconjuntiva, administración periocular, administración retrobulbar, inyección subtenón, administración intracameral, inyección intravítrea, inyección intraocular, adminis ración subretiniana, administración supracoroidea y administración juxtascleral posterior.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la composición oftálmica se administra a través de inyección intravítrea .