TW201206929A - Compounds for the treatment of posterior segment disorders and diseases - Google Patents

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201206929 六、發明說明：

t明所屬老L糊ή領起^ J 本發明係有關於化合物用於治療滲出與非滲出型式的 老年性黃斑部病變、糖尿病視網膜病變及視網膜水腫及其他 涉及病理性眼部血管增生及/或血管滲透性之疾病之用途。

|[ J 發明背景 AMD係工業化國家之50歲以上個體的功能性失明之最 常見病因’及為全球不可避免性失明的常見病因。與AMD 關聯的視力喪失’典型地僅在該疾病的最晚期發生，亦即 當病患自非滲出性（“乾性”)AMD惡化為具有脈絡膜新生血 管形成(CNV)之滲出性AMD或惡化為地圖狀萎縮時。雖然 在所有的非滲出性AMD病患中僅1〇%至2〇〇/0將惡化為渗出 性AMD，該形式的AMD佔了與該病症關聯的功能性視力喪 失之80至90%。滲出性AMD亦稱作新生血管型或濕性 AMD，其特徵在於病理性CNV生長進入視網膜下腔。CNV 具有滲漏血液與體液之傾向，造成諸如盲點與視物變形症 之症狀，及通常伴隨著纖維組織之增生。當該纖維血管膜 侵入黃斑部時’可誘發光受體變性，而造成進行性、嚴重 與不可逆的視力喪失。若不治療，大部分的患眼之中心視 力將在2年内變為不良(S20/200)。 另一種致盲性視網膜病症係稱為增生性糖尿病視網犋 病變（PDR)，及其特徵亦在於病理性後房新生血管形戍 (PSNV)。PDR係糖尿病病患之法定失明的最常見病因，及 201206929 其特徵在於病理性視網膜前NV。此外，在糖尿病病患中， 糖尿病性黃斑部水腫(DME)係整體視力受損的主要原因。 糖尿病的特徵在於持續性高血糖症，其在各種器官的微血 管系統内產生可逆與不可逆的病理性變化。因此，糖尿病 視網膜病變(DR)係以嚴重性程度遞增及視力預後日益穿化 的階段級聯表現之一種視網膜微血管疾病。 非增生性糖屎病視網膜病變(NPDR)及其後的黃斑部 水腫，係與源自持續性高血糖症所誘發的視網膜微血管病 變之視網膜缺血部分關聯。NPDR涵蓋一系列的臨床子類， 包括其中在視網膜内觀察到多病灶變化（如微動脈瘤、“點 狀-火焰狀”出血及神經纖維層梗塞）之起初的“背景 期”DR，至發生PNV之前的前增生性DR。NPDR的組織病理 學標誌係視網膜微動脈瘤、微血管基底膜增厚、内皮細胞 與外皮細胞損失及最後微血管閉塞而導致局部缺血。從動 物模式與實證性人類研究所累積的數據顯示，視網膜缺血 係通常與促炎性及/或促血管生成性生長因子及細胞介素 諸如血管内皮生長因子(VEGF)、前列腺素£2、類胰島素生 長因子-l(IGF-l)、血管生成素2等之局部水平增加相關聯。 可在NPDR或PDR期間觀察到糖尿病性黃斑部水腫。然而， 其通常在NPDR的較後期階段觀察到，及係惡化朝向發生最 嚴重的階段即PDR之一預後指標，其中“增生性，，一詞係指 存在如前述之視網膜前新生血管形成。 已知包括PSNV在内的病j里性眼部血管增生係以從起 始刺激惡化至形成異常新生微血管之事件級聯形式發生。 4 201206929 雖然仍未知滲出性AMD與PDR二者中之PSNV的特定引發 原因，各種促血管生成性生長因子的同化作用似乎是一種 共同的刺激。在從患有病理性眼部血管增生的病患所移除 之組織與體液中，已發現可溶性生長因子諸如血管内皮生 長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、驗性纖維母 細胞生長因子（bFGF或FGF-2)、類胰島素生長因子i (IGF-1)、血管生成素等。在血管生成級聯起始之後，微血 管基底膜與細胞外基質被降解，及發生微血管内皮細胞增 生與遷移作用。内皮芽交織形成管及其後形成管腔。新生 微血管由於障壁功能不成熟而通常具有較高的血管滲透性 或滲漏性，其可導致組織水腫。分化成為成熟微血管之作 用’係表現在於連續的基底膜之存在及其他内皮細胞與稱 作外皮細胞的血管支持細胞之間的正常内皮連接；然而， 該分化過程通常在病理性病況期間受損。更詳細地，pdgf 水平之增加似乎藉由作用為外皮細胞的存活因子而在新生 血管的成熟作用中扮演一角色。 直到最近，患有危及視力的PSNV之病患之治療選項有 限。多種核准的療法，諸如用於中央凹外CNV之焦點雷射 光凝療法制於渗出性AMD之Visudyne®的絲力療法，通 常係姑息性及其f本身可能與危及視力的併發症相關聯。 例如柵狀或王視網膜雷射光凝療法及諸如玻璃體切除術 與移除視網膜上膜$λ ^ ^ 、之手術；I入，係患有pDR的病患目前僅 有的k項而，破璃體内抗vegf^法之核准已徹底改變 病理性PSNV及特別是渗出性AMD之治療。 201206929 顯著的證據表明，可溶性生長因子、血管内皮生長因 子-A(VEGF-A)在PSNV的致病機轉中扮演一關鍵性角色。 VEGF(VEGF-A、-B、-C、-D、-E及胎盤生長因子[P1GF])， 係以不同的親和性與其等的細胞表面受體、第1型VEGF受 體（VEGFR1)、VEGFR2及VEGFR3結合之同源二聚體醣蛋 白家族。通常稱為VEGF之VEGF-A係一種36至46千道爾頓 的二聚體醣化蛋白質，其具有一個N端訊息序列與一個肝素 結合域。已發現VEGF之六種不同的促血管生成性剪接變異 體；其等的差異在於其等的胺基酸數目，及包括VEGF206、 VEGFi89、VEGFm、VEGF165、VEGF145及VEGFm。較短 形式可更自由地擴散’如VEGF121完全缺乏肝素結合域，及 VEGFi65係該等較低分子量變異體中之含量最豐富者。較大 型變異體即VEGF2〇6與VEGF,89係基質結合型及不大可能與 内皮細胞受體結合。 VEGF係經最廣泛特性分析之VEGFR-1與VEGFR-2的 配位體，VEGFR-1與VEGFR-2係主要位於血管内皮細胞表 面之細胞膜受體’及在配位體結合作用之後展現固有的赂 胺酸激酶活性。該二種VEGF受體路胺酸激酶(RTK)係經由 下列二種主要機制而為血管形態形成與病理性新生血管形 成之重要貢獻者：（1)刺激新生血管生長（企管生成及/或血 管增生）及（2)增加血管的高滲透性。veGF、VEGFR1及 VEGFR2係偈限位於自患有新生血管型AMD與糖尿病視網 膜病變的病患所得之眼部液體與新生血管膜中；也許更重 要地，該等蛋白之存在係與疾病嚴重性之增加相關聯。 6 201206929 已核准用於治療新生血管型AMD之抗VEGF劑，係與 VEGF-A | η特異性結合之核糖核酸適體Macugen® (眼科技 術（Eyetech)公司/OSI公司/輝瑞（Pfizer)公司之培加他尼 (pegaptanib));及係與所有VEGF-Α異構體結合之一種人化 單株抗體的Fab片段之Lucentis® (基因科技(Genentech)公司 /諾華（Novartis)公司之雷珠單株抗體（ranibizumab))。 Macugen®在2004年獲得核准，然而在第m期研究中經玻璃 體内Macugen®治療的病患在治療的第一年期間持續經歷視 力喪失，雖然Macugen®治療組中之視力下降速率係比假治 療組中的速率緩慢。Macugen®在治療第二年的功效不如第 一年，而僅在該一關鍵研究中之一者展現效益。 相反地’在2006年獲得核准之玻璃體内Lucentis®在第 III期試驗中間隔4個星期投藥，而在95%經治療的病患中維 持最佳矯正視覺敏銳度(BCVA)，及在24至40%的經治療病 患中增進BCVA達15或更多個字母。該等顯著效益在每個月 /主射Lucentis之24個月治療期間持續。然而，在起初每個月 的速效劑量之後’當在患有滲出性AMD的病患中間隔12個 星期投藥Lucentis®達12個月時，Lucentis®治療保持但並未 增進視覺敏銳度。雖然對於患有新生血管型AMD的病患而 言，玻璃體内Lucentis®代表治療結果的顯著改善，然而當 採用低於每個月注射一次之給藥頻率時之該等及其他較差 的結果表明，目前抗VEGF療法未達到的一項醫學需求係在 於其作用時限。 在針對滲出性AMD及/或DME的人類臨床試驗中，正進 201206929 行或已進行其他多種抗VEGF策略之研究，諸如玻璃體内 Avastin®(基因科技公司之貝伐珠單株抗體 (bevacizumab))，其係2004年核准用於靜脈内治療大腸直腸 癌之一種對抗VEGF-A的全長式人化單株抗體；玻璃體内 VEGF TrapRiR2(再生元(Regeneron)公司），其係包含與人類 IgG的Fc部分融合之人類VEGFR1與VEGFR2之細胞外配位 體結合域部分之一種110千道爾頓的重組型嵌合蛋白，及其 與VEGF-A的所有異構體以及胎盤1生長因子（P1GF)結合； 玻璃體内Lucentis®加上一種抗PDGF適體（奥普多科技 (Ophthotech)公司）之合併療法，以試圖經由同時阻斷活性 EC與外皮細胞而誘發NV之消退；以及各種受體酪胺酸激 酶抑制劑(RTKi)之局部或全身性給藥。 受體酪胺酸激酶抑制劑(RTKi)係藉由抑制細胞膜受體 的固有酪胺酸磷酸化作用而阻斷VEGF訊息傳遞之一種較 新類別的抗血管生成化合物。RTKi正進行用於眼科與非眼 科適應症之臨床評估。RTKi用於治療血管增生依賴型疾病 之一項顯著優點，係其等藉由阻斷來自多種配位體的受體 活化作用而更完整地阻斷VEGF傳訊作用之潛力。此外，因 為最有效的RTKi同時阻斷多種訊息傳遞路徑，預期其等提 供功效優於導向單一生長因子的當前療法之優點。相較於 大型生物分子諸如抗體或大型肽，身為小分子(<5〇〇達爾頓) 之RTKi具有用於增進細胞間與細胞内分布之潛力及更適於 持續給藥裝置内之調配物。 就眼科適應症而言，日益增加的科學證據表明RTKi可 8 201206929 在病理性PSNV及/或視網膜水腫的治療方面提供顯著優 點。PKC412(諾華(Novartis)公司之CGP41251)係一種選擇性 對抗PKC異構體以及VEGFR與PDGFR之RTKi，在口服投藥 至患有現存的DME之病患後，部分降低如藉由0CT所測量 之增加的中央凹厚度及增進視覺敏銳度。然而，劑量因諸 如腹瀉、噁心與嘔吐之胃腸不良事件及轉胺酶活性之增加 而受到限制。已在患有新生血管型AMD的病患中進行口服 投予另一種RTKi即PTK787(諾華（Novartis)公司與先靈 (Schering)AG公司之伐他拉尼（vatalanib))之臨床研究。 PTK787係選擇性高於PKC412之一種vEGFR抑制劑，及已 在嚙齒動物模式中顯示對於PSNV的顯著抑制作用。雖然第 1/2期新生血管型AMD研究的結果尚未發布，在已發表之採 用每曰口服給藥PTK787的第1/2期腫瘤學研究中，所報導之 最常見的不良事件係疲勞、噁心、眩暈、嘔吐、厭食及腹 厲。RTKl帕0坐帕尼(Paz〇Panib)(葛蘭素史克(GlaxoSmithKline) 公司）近來已進入針對滲出性AMD之採用局部眼部投藥的 臨床试驗。 對抗病理性眼部血管增生、PSNV、滲出性amd、 DME、視網膜/黃斑部水腫、DR及視網獏缺血之一種有效 的局部給藥型觸性肌1，隸㈣制肖私管增生 及抑制血管渗透性之增加及藉此顯著地維持或增進視覺敏 銳度而提供病患顯著的效益。該等病變之有效治療將增 ，病患：生活品質及社會生產力。此外，可大幅降低用於 提供視障人士協助與醫療保健的相關社會成本。 201206929 【發明内容】 發明概要 ㈣目㈣於狀尿素系化合物在治《患· 、血s 生/新^血#形纽/魏簡水腫相關聯 •^αλΓ症之人士之用途，後房病症包括渗出與非滲出型 二ME盥pD，包括前增生性糖尿病視網膜病變(統稱為DR)、 .〃 在内之糖尿病視網膜病變；視網膜或黃斑部水 周膜中央或分支靜脈閉塞；及缺▲性視網膜病變。 【實雜》冷式】 、 較佳實施例之詳細說明 = 斤生管开》成係造成已開發國家中後天失明的二 種最㊉見病因之危及視力型病變：渗出性老年性黃斑部病 變(AMD)肖㈣i性糖尿$視纟肖㈣$變(pDR)。 示了因糖尿病病患的高血糖症所誘發之視網臈微血管 系統的變化而導致黃斑部水腫之外，新生*管膜的增生作 用亦與視㈣的歸渗漏及水腫相義。當水腫涉及黃斑 P夺視覺敏銳度變差。在糖尿病視網膜病變中，黃斑部 系視力喪失的主要原因。如同血管生成病症，雷射光 凝療法係用來穩定或消财腫病況。雷射光凝療法係一種 ”’田见破壞性程序’其在減少水腫進一步發生之同時，不幸 地會改變患眼的視野。 用於眼部NV與水腫的有效藥理學療法將可能在眾多 疾病中提供病患顯著的功效，藉此避免侵入性手術或破壞 性雷射程序^ N v與水腫之有效治療將增進病患的生活品質 201206929 與社會生產力。此外，可大幅降低用於提供盲人協助與醫 療保徤的相關社會成本。 本發明係部分基於發現抑制受體酪胺酸激酶的特定尿 素系化合物係適用於治療AMD、DR、DME、視網膜/黃斑 P火腫、缺血性視網膜病變及與後房新生血管形成(PSNV) 關聯的疾病。一種有效的局部給藥型選擇性RTKi將經由抑 =及/或消退血管增生及抑制血管滲透性之增加及藉此顯 ^也維持或增進視覺敏銳度，而提供病患顯著的效益。考 里腫瘤學中的全身性抗VEGF療法之相關不良副作用的敘 述疋1清單，諸如高血壓 '腎病症候群、血栓栓塞事件、 出血、月腸穿孔、聲音改變、黏膜毒性、手足症候群、疲 神經性併發症（如可逆性後腦白質病變症候群）、骨髓抑 J及轉胺酶上升，加上早期眼科試驗在抗VEGF化合物的全 身丨生給藥後所觀察到之一些該等不良反應，選擇性尺丁幻的 :P眼。卩給藥作用可在安全與功效方面，提供患有破壞性 後房疾病之病患獨特的治療優點。此外，該等化合物已在 卜物模式中顯不PSNV之消退，其係當使用僅阻斷vegf路 '的抑制劑諸如玻璃體内Lucentis®時所未見之一藥理學特 11。因此，本發明可在三個主要領域中之一或多者提供臨 床欢现.増加功效、增加作用期間及降低全身性副作用。 用於本發明的方法中之較佳化合物係如下所述之化合 物I至VII : 201206929

化合物l-VII的化學名稱係列於下列第1表中： 化合物編號 化合物名稱 I 1-[4-(3-胺基-1//-吼唑并[3,4-c]。比啶-4-基)-苯基]-3-間-曱苯基-尿素 II 1 -[4-(4-胺基-σ塞吩弁[2,3-d]嘴。定-5-基)苯 基]-3-間-甲苯基-尿素 12 201206929 III 1-[4-(3-胺基-1//-吲唑-4-基)-苯基]-3-(3-羥 基-5-甲基-苯基)-尿素 IV 1-{4-[3-胺基-7-(2-曱氧基-乙氧基)-1//-吲 唑-4-基]-苯基}-3-間-曱苯基-尿素 V 1 -[4-(4-胺基-噻吩并[3，2-c]。比啶-3-基）-苯 基]-3-間-甲苯基-尿素 VI 1 -胺基-7-°比定-4 -基-σ塞吩弁[3，2-c]。比 。定-3-基)-苯基]-3-間-曱苯基-尿素 VII 1-[4-(4-胺基-7-吼啶-3-基-噻吩并[3,2-c]吡 °定-3-基)-本基]-3·間-曱苯基-尿素 本發明的化合物Ι-VII係已知者，及其等的合成作用揭 露於美國申請案序號2006/0178378(化合物I)、美國申請案 序號2003/0181468(化合物II)、第7,297,709號美國專利（化合 物III與IV)及美國申請案序號2005/0020619與2005/0026944 (化合物V-VII)中，其中各者在此併入本案以為參考資料。 此外，其他二種相關的尿素系化合物（VIII與IX)係已知（參 見如下所示之結構）及其等的合成作用揭露於第7,297,709 號美國專利中，及其等在下列藥理學研究中顯示為無效。

VIII HN-NrNH2 〇ClHP IX h3c hn-VNH2 0 W \-L /=N V-N F H 亦設想在本發明的方法中可使用化合物I至VII中任一 13 201206929 者之藥學上可接受的鹽類及化合物I至VII的任一組合物。 如用於此之“藥學上可接受的鹽類”一詞係指化合物[至 VII一的任子’其適於藉由任_習用方式㈣療性投藥 至-病患，而無顯著有害健康的後果。藥學上可接受的較 佳陰離子或鹽類之實例包括氣化物、漠化物、乙酸鹽、苯 甲酸鹽、順丁稀二酸鹽、反丁稀二酸鹽及琥賴鹽。 依據該等嫻熟技藝者所知之調配技術，在此所揭露之 化合物可包含於各_型㈣學組成物中。含有此述化合 物之藥學喊物可經由任-可行秘藥方法或途徑投藥， 然而較佳為眼部的局部投藥作用。設想可使賴有投藥至 眼:的局部途徑’包括局部、結膜下、眼周、眼球後、眼 Μ :下⑴房内、玻璃體内、眼内、視網膜下及上脈絡 膜投樂作用。可行的全身性或非經腸投藥作用可包括但不 限於靜脈内、皮下及口服給藥。最佳的«方法將為在玻 璃體内或眼球筋膜下注射溶液或懸浮液，或在玻璃體内或 眼球筋膜下置人生物_性或非生她解性裝置或藉由 溶液或懸浮液的局部眼部投藥作用，或凝膠調配物之後房 近掌膜投藥作I [較佳的給藥方法係經由諸如第丽/ 0060887號美國巾請公開案中所述的—裝置投予之一種生 物蝕解性植入物的玻璃體内投藥作用。 本發月亦有關於提供適於治療視網膜與視神經頭組織 之組成物。本發明的眼用組成物將包括戶斤述化合糾至… 中之或多者&㈣學上可接受的載劑。可使用各類型 的載劑。載劑-般為水溶液性f。基於容易調配以及病患 201206929 藉由在患眼中滴入一或二滴溶液即可投予該組成物之能 力，一般較佳為水溶液。然而，用於本發明中之該等化合 物亦隨時可納入其他類型的組成物中，諸如懸浮液、黏性 或半黏性凝膠或其他類型的固態或半固態組成物中。就水 溶性較低的化合物而言’較佳為懸浮液。本發明的眼用組 成物亦可包括其他各種成分，諸如緩衝劑、防腐劑、共溶 劑及增黏劑。 可添加一種適宜的緩衝劑系統(如磷酸鈉、乙酸鈉或硼 酸鈉），以避免pH值在儲存條件下偏移。 眼用產品係典型地包裝為多劑量形式。因此需要防腐 劑’以避免使用期間的微生物污染。適宜的防腐劑包括： 氣化烧基二曱基苄基錢、乙采硫柳酸鈉、氣丁醇、對經苯 甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二鈉 '山梨 酸、聚季銨鹽-1或嫻熟技藝者所知之其他作用劑。該等防 腐劑典型地係以自0.001至1.0%重量/體積(“％ w/v”)之水平 使用6 將由嫻熟的臨床醫師基於諸如所治療病況的確切性 質、病況嚴重程度及病患的年齡與一般身體狀況等因子， 而決定投藥途徑（如局部、眼部注射、非經腸或口服)及給藥 方案。 一般而言，用於上述目的之劑量將有所不同，但將為 預防或治療A M D、D R及視網膜水腫之一有效量。如用於此 之“藥學上有效量，，一詞，係指此述化合物中之一或多者有 效治療一人類病患中的AMD、DR及/或視網膜水腫之一 15 201206929 置用於上述任-目的之劑量—趣 $ ^ ^肩7母公斤體重約0.01 至約100毫克（毫克/公斤），每曰投藥—至木 物係局部給斜，其等的濃度範園:〜。當該组成 體重/體積，每日投藥一至四次及每次丨至？商〇·001至約10〇/〇 如用於此之“藥學上可接受的_，=係 的調配物，及提供本發明之至少〜 1 女王 種化合物的_古;^旦々 所欲投藥途徑的適宜給藥作用。 里之 下列實例之列入係用來顯示本 熟技藝者應瞭解下列實例中所揭露的技術二=發: 者所發現之技術，俾在實施本發明時運作2 =案發明 視為構成其較佳實施模式。㈣，妙本料=因: 技藝者應㈣可在所減的肢實_巾進㈣種變化，，、、 及仍獲致同類或相似結果而不偏離本發明的精神與範圍。 本發明係基於發現可藉由使用顯示其等在下列各項的 固有能力之-系列的藥理藥效分析，而自不同種類中選: 阻斷路胺酸自姐化作用之尿素系化合物：⑴抑制視網媒 與脈絡膜新生血管形成；（2)造成視網膜與脈絡獏新生血管 形成作用之消退；及(3)阻斷視網膜血管滲透性。此外，使 用同一藥理學分析來顯示，來自同一種類的其他尿素系化 合物並不具有同樣的固有藥效性質。因此’所發現之令等 尿素分子的藥理學性質係先前未知的。各種尿素系化合物 在所選分析中之結果係概述於下列表中。本案發明者係親 自參與下文所提及的所有研究之設計與分析。 第1例 16 201206929 KDR分析 方法。使用一種柏麥克（Biomek) 3000機械工作站

(Robotic Workstation)，以96孔平皿格式進行七點式HTRF (均相時間解析螢光)激酶分析，而使用來自希柏（CisBio)公 司的KinEASE-TK套組測定試驗化合物對於KDR(VEGFR2) 激酶之IC^數值。其係用於包括KDR激酶在内的酪胺酸激酶 之一種通用套組。KDR激酶係購自細胞傳訊科技（ceu Signaling Technology)公司。該分析係以二個步驟進行。在 步驟1中，在KDR激酶(位於50毫升反應混合物之5奈克）的存 在下，藉由添加ATP( 10 mM)而起始經生物素標記的通用肽 受質（2 mM)之磷酸化作用；及在步驟2中，在室溫培養3〇 分鐘後’藉由添加含有二種HTRF檢測試劑與EDTA之一混 合物而終止該反應。以希柏（CisBio)公司提供的緩衝劑製備 受質、酵素及ATP稀釋液。在5% DMS0或10 : 10的(DMSO : 乙醇）中製備化合物稀釋液，以製得4X工作儲備溶液。HTRF 檢測試劑係一種經Eu(K)(HTRF供體）標記的碟酸酪胺酸之 抗體及一種鏈徽抗生物素蛋白_XL665(HTRF受體）。使用帝 肯(Tecan) HTRF平皿讀數器測量所產生的HTRF訊息（665奈 米/620奈米之比例）’及使用一種非線性、疊代、5形擬合電 腦程式(〇riginPr〇8.〇)分析數據，以產生試驗化合物的抑制 常數。 結果。受體酪胺酸激酶之七種獨特、結構上相異的小 分子抑制劑(RTKi)(化合物I至VII)在二種試管内分析中展 現顯著的效力，包括在一細胞分析中對抗VEGF所誘發的増 17 201206929 生作用之顯著功效。具體而言，當在一種以酵素為基礎的 分析中試驗對抗KDR(人類VEGFR2)的活性時，所有RTKi 皆展現IC50<1 nM，如在此所述（第2表）。此外，相較於化 合物I至vii，其他二種相關的尿素系化合*(νιι_ιχ，第2 表）顯示實質上不具有對抗KDR之活性。 第2表 化合物 編號 KDR ICsonM VEGF所誘發 之BREC增生 作用ECsonM 參考基 準之相對效力 I <1 0.16 6.4±3.4 II <1 0.11 14.5±15.1 III <1 0.45±0.05 °-565±0.205 IV <1 0.10±0.01 5.78±1.24 V <1 1.57±1.24 〇.775±0.262 VI <1 0.07±0.069 8.0±2.6 VII <1 0.11±0.086 4.0±1.1 VIII >10,000 不具活性 不適用 IX >10,000 不具活性 不適用 第2例 BREC分析 方法。因其等強力抑制VEGFR2之能力，而評估化合物 I至VII中之各者對抗VEGF所誘發的牛視網膜内皮細胞 (BREC)增生作用之活性。將牛視網膜内皮細胞以3000至 7000個細胞/孔接種至經纖維連接蛋白塗覆的96孔式平孤 中之具有10% FBS的MCDB-131生長培養基中。24小時之 18 201206929 後’以增補1%FBS、麩醯胺酸、肝素、氫皮質酮及抗生素 之MCDB-131培養基置換該生長培養基。再22至24小時之 後，細胞係經具有或不具有50奈克/毫升的VEGF培養基與 位於1%FBS培養基中的試驗化合物處理。然後在30小時之 後’在最後16小時的培養期間添加BrdU。然後將所有細胞 固定，及以一種比色BrdU ELISA套組分析。 結果。所有化合物（I至VII)顯示強力與有效地抑制 VEGF所誘發的增生作用，其中所有七種化合物提供EC50< 2nM，及七種化合物中之六種具有EC5〇<0.5 nM(第2表）。此 外，相對於已知在後房疾病的動物模式中提供再現性功效 之參考標準RTKi，所有七種化合物展現相對效力go.5(第2 表）。此外’相較於化合物I至VII，其他二種相關的尿素系 化合物(VIII與IX，第2表）顯示在對抗VEGF所誘發的增生作 用方面完全無活性。因化合物VIII與IX在KDR分析與BREC 增生分析二者中不具活性，故未繼續進行活體内試驗。 第3例 化合物I至VII之玻璃體内給藥作用抑制大鼠中之VEGF所 誘發的視網膜血管滲透性 方法：以肌内K他命/曱苯噻嗪將成年史普瑞格-道利 (Sprague-Dawley)大鼠麻醉’及使用局部散曈劑讓其等的曈 孔放大。將大鼠隨機分派至化合物I至VII的0%、0.3%、1.0% 及3.0%調配物之玻璃體内注射組及一個正對照組中。在經 治療的各眼之玻璃體内注射1〇微升的各化合物(n=每組5至 6隻動物）。在首次玻璃體内注射作用之3天後，所有動物的 19 201206929 雙眼以玻璃體内注射方式領受10微升的5〇〇奈克小時 VEGF。在VEGF注射作用之24小時後，在所有動物中進行 靜脈内輸注3%的伊凡氏藍染料’其中在全身麻醉期間經由 側尾靜脈注射50毫克/公斤的伊凡氏藍染料。在該染料已循 衣90刀知之後，將大鼠安樂死。然後在大鼠全身灌注平衡 鹽溶液’再立即摘除各大鼠的雙眼，及制手術顯微鏡採 集視網臈。在測量視網膜濕重之後，藉由將視網膜置於〇2 毫升的甲醯胺（西克瑪（Sigma)公司）中而萃取伊凡氏藍染 料後均質化及進行超高速離心。將血液試樣離心，及 在曱醯胺中將血漿稀釋100倍。就視網膜與血漿試樣二者而 吕，使用60微升的上清液來測量伊凡氏藍染料於62〇/74〇奈 米之吸光度(ABS)。以淨ABS/濕重/血漿ABS之平均值+/_測 量標準誤差之形式，計算如藉由染料吸光度所測量之血液· 視’.周膜障壁朋解及其後的視網膜企管滲透性。使用單因子 變異數分析，測定治療方式之間的整體差異。使用一檢定 或曼-懷特尼(Man-Whitney)秩和檢定，進行治療組之間的逐 對比較’其中Ρ<〇·〇5係視為顯著。 結果：在大鼠VEGF模式中，起初使用單次靜脈輸液注 射0.1Λ成懸浮液而5式驗各化合物。七種化合物中之六種 展現抑制VEGF所誘發的RVP之能力，其中相較於注射載劑 的對照組，六種化合物中之五種在一或多種劑量提供>7〇% 的抑制作用（*P<0.05)(第3表）。然後使用單次靜脈輸液注 射，以—種劑量-反應方式試驗各化合物（第4表）。 20 201206929 第3表 化合物 編號 功效 (0.1%) 功效（1%) I 65.4%* 88.9%* II 85.2%* 85.7%* IV 73.9%* -148.2% III -96.7% -316.9% V 64.0% 40.4% VI 106.5%* 70.6%* VII 84%* 73.5%* 第4表 AL# 分子量 ED5〇 (奈莫耳） ED50 (微克） 效力 I 358.5 4.04Λ 1.447 1.2* II 375.5 7.62 2.86 0.392* III 373.4 >80.3 >30 0.028 V 374.5 3·8Λ 1.42 1.38* VI 451.6 1.42 0.64 2.303* VI 431.5 22.3 9.63 0.147 VII 451.6 5.47 2.47 0.621* *化合物係與參考標準等效，因95%信賴界限(CL)涵蓋1.0 (LL < 1.0 < UL) 第4例 在氧所誘發的視網膜病變之大鼠模式中之化合物I至VII的玻 璃體内給藥後之視網膜前新生血管形成作用的預防與消退 方法：懷孕的史普瑞格-道利大鼠在懷孕第14天領受， 及其後在懷孕第22±1天生產。在分娩後，立即將幼鼠匯集 及隨機分派至分開的窩中（n=17隻幼鼠/窩），各窩係置於氧 氣輸送室内之分開的鞋盒籠中，及在產後第0至14天經歷氧 21 201206929 暴露廓型。然後自第14/0天至第14/6天（產後第I4至20天）， 將窩置於室内空氣中。就預防作用之研究而言，在第14/0 天將各幼鼠隨機分派至不同的治療組中。就隨機分派至注 射治療組的該等幼鼠而言：一眼領受玻璃體内注射5微升之 介於0.01%至1%的一種RTKi ’及對側的眼領受玻璃體内注 射5微升的載劑。在第14/6天(產後20天），所有動物皆安樂 死。就消退作用之研究而言，在第18/〇天將各幼鼠隨機分 派至氧暴露對照組或不同的治療組中。就隨機分派至注射 治療組的該等幼鼠而言：一眼領受玻璃體内注射5微升之介 於0.01%至1%的RTKi，及對側的眼領受玻璃體内注射5微升 的載劑。在第14/7天（產後21天），所有動物皆安樂死。 在安樂死後，立即採集所有大鼠幼鼠的視網膜，在經 緩衝的中性10%福馬林中固定24小時，進行ADPase染色， 及固定在載玻片上作為完整封片。取得經適當製備的各視 網膜平坦封片之數位影像。使用電腦化影像分析，以獲得 各可讀試樣之NV鐘時評分。在總共12小時的各鐘時，評估 每個視網膜是否存在視網膜前NV。在無母數分析中所採用 之統計比較，係使用各治療組之NV鐘時的中位評分。藉由 採取雙眼的平均數值，非注射的各幼鼠係代表—健^分 及用來與各劑量組比較。因為幼鼠係隨機分派及在所有& 的氧暴露對照組幼鼠之間未觀察到差異，故將所有治療組 的NV評分合併。P20.05係視為統計上顯著。 結果··在大鼠OIR模式中，起初使用單次靜脈輸液注射 0.1%或1%懸浮液而在預防模式巾試驗各化合物。相較於裁 22 201206929 劑，七種化合物中之六種在1%劑量提供100%抑制作用（P< 0.05)(第5表）。其後使用單次靜脈輸液注射懸浮液之劑量-反應預防作用之研究顯示，所有七種化合物對抗視網膜前 新生血管形成之效力，係比已知在大鼠OIR模式中提供再現 性功效之一種參考標準RTKi強約22倍（第6表）。此外，在使 用單次靜脈輸液注射懸浮液之劑量-反應消退作用亦即介 入之研究中所試驗之七種化合物中的四種顯示，所有四種 化合物在消退視網膜前新生血管形成作用之效力，係比參 考基準RTKi強約2倍（第7表）。 第5表 化合物 編號 功效（0.1%) 中位數值 功效 (1%) 中位數值 I 100%* 100%* II 32.2 100%* IV 100%* 100%* III 1.5% 100%* V 16.9 100%* VI 35.7 88.4* VII 9.6 100* 23 201206929 第6表 大鼠OIR預防作用 化合物 分子量 ED50(奈莫耳） ED5〇(微克） 效力 I 358.5 13.44 4.82 5.75 II 375.5 12.17 4.57 6.23 III 373.4 15.85 5.92 4.03 IV 431.5 13.23 5.71 4.2 V 374.5 24.11 9.03 1.94 VI 451.6 13.31 6.01 3.86 VII 451.6 15.74 7.11 3.23 參考基準 375.4 71.04 26.67 1 第7表 大鼠OIR消退作用 化合物 ed5〇(奈莫耳） ED5〇(微克） 效力 I 25.47 9.13 2.26 II 24.31 9.13 2.3 III - - - IV - - - V - - - VI 39.46 17.82 1.75 VII 20.86 9.42 2.49 參考基準 64.57 24.24 1 第5例 在小鼠中之化合物I至VII的玻璃體内給藥後之雷射所誘發 的脈絡膜新生血管形成作用（CNV)的預防與消退 方法。藉由雷射所誘發的布魯赫氏(Bruch)膜破裂而產 24 201206929 生CNV。簡而言之，使用腹膜内投予的K他命鹽酸鹽（100 毫克/公斤）與甲苯噻嗪（5毫克/公斤）將4至5個星期大的 C57BL/6J小鼠麻醉’及藉由在眼睛局部滴入1%托D比卡胺 (tropicamide)與2.5%MYDFIN®而將雙眼的曈孔放大。使用 一滴的外用纖維素(GONIOSCOPIC®)來潤澤角膜。在角膜 施用一手持式蓋玻片及作為一隱形眼鏡來協助觀測眼底。 使用具有一裂隙燈輸送糸統之愛爾康(Alcon)532奈米的愛 萊特(EyeLite)雷射，在隨機分派的眼(各小鼠的右眼或左眼） 中產生3至4個視網膜燒傷。雷射燒傷係用於造成布魯赫氏 膜的破裂，其就檢眼鏡方式而言係藉由在視網膜下形成小 泡而顯示。在研究中僅納入因雷射燒傷而在各眼產生三個 小泡之小鼠。燒傷係典型地置於視網膜後極的3、6、9或12 點鐘位置，而避開視網膜分支動脈與靜脈。 雷射後14天，將所有小鼠麻醉及全身灌注經 將各小鼠隨機分派至下列治療組中之一組：非注射對 照組、假注射對照組、注射載劑的小鼠或注射三種化合物 中的-者之組別。賴則、鼠的雙眼領受雷射光凝療法， 其中-眼領受假注射作用’亦即在坦部玻璃體的針刺穿作 用。對於在玻频㈣射的動物而言，經雷射治療的一眼 領受玻璃體内注射2或5微升之〇.1%至3%的一種1^幻或載 劑。就預防作狀研究而言，玻璃體内注射係在雷射^凝 療法之後立即進行。就使用RTKi的消退作用亦即介入之研 究而言，玻璃體内注射係在雷射光凝療法後之第7天進一 及一組經雷射的非注射小鼠亦在第7天採集作為對= 丁在 螢光黃標記的 25 201206929 聚葡萄糖。然後採魏睛，及製備麵向觀察者 之脈絡膜平坦封>|。使用—㈣光顯微鏡檢視所有脈絡蹲 平坦封片。捕捉CNV的數位影像，其⑽¥係經認定為著 色背景内的高螢光區域1結果之測量而言，使用電腦化 影像分析來描繪與測量每個病灶之高螢光⑽的二維 (平方微米h依數據分布㈣態性而定，在統計分析甲使用 每個治療組之每個小鼠的中位CNV面積/燒傷或每個治療 組的平均CNV面積/燒傷；P<〇.〇5係視為顯著。 、 乳mv棋式之預防作用的前導性研究中， 迄今所試驗的化合物中之二種在單次靜脈純注射劑量自 (U至i.O%懸浮液之後，造成雷射所誘發的CNV之顯著降 低。相較於注射載劑的對照組，三種化合物中的二種在戶 n 試驗的最高劑4提供崎上顯著的抑制仙（第8表）β 使用單次玻璃體内（靜脈輸液)注射化合物I與II之結果。 使用單次靜脈輸液注㈣浮液之後續劑量反應預防 作用之研究顯示，在抑制CNV形成方面，化合細功效此 參考基準RTKi強’ Μ合倾的功魏參考基準腿i (第9旬。在料_巧究巾，當在雷㈣帛7天經由 靜脈輸液注射投藥時’化合在造成現存CNV之消退方面 二與參考基準RTKl等效；及化合物^亦顯示顯著的C卿消 退效應(57.4%，第9表）。 26 201206929 第8表小鼠CNV研究：初始功效(預防作用） 化合物編號 預防功效 I 2 微克/0.1%=-53.8% 20 微克/1.0%=37.6% II 前導研究 2 微克/0.1%=40.6% 20 微克/1.0%=69.0%* IV 2 微克/0·1%=1·1% 6 微克/0.3%=13.9% 20 微克/1.0%=49.7%* 第9表小鼠CNV研究：預防與消退作用 CNY 化合物 分子量 預防功效 消退功效 I 358.5 5.9 2.64* II 375.5 0.76# NA (未進行劑量反應研究， 1旦在3%-60微克顯示 57.5%消退） 參考基準 375.4 1 1 *化合物係與參考標準等效，因95%信賴界限(CL)涵蓋1.0(LL< 1.0<UL) #約略的功效數值，因該等線並非平行。 已參照特定的較佳實施例說明本發明；然而，應瞭解 其能以其他特定形式或其變化形式體現，而不偏離其精神 或本質特徵。因此上述實施例係在所有方面視為說明性而 非限制性，本發明的範圍係由所附申請專利範圍而非前述 說明所示。 【圖式簡單說明】 (無） 【主要元件符號說明】 (無） 27

Claims (1)

1. 201206929 七、申請專利範圍： 1. -種用於治療後房新生血管形成、AMD、DR及/或視網 膜水腫之眼用組成物，其包含一治療有效量之至少一種 選自由下列所組成之群組之化合物： 1-[4-(3-胺基-1//-吡唑并p，4外比啶_4基)苯基] 間-曱苯基-尿素 1-[4-(4-胺基塞吩并[2,34]嘧啶_5_基)_苯基]_3_間· 甲苯基-尿素 1-[4-(3-胺基-1//-吲唑_4_基)·苯基]3(3羥基_5甲 基·苯基)-尿素 1-{4-[3-胺基-7-(2-甲氧基_乙氧基私吲唑_4基]_ 苯基}-3-間-甲苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-嗟吩并[3,2寸比啶_3基)苯基]3間_ 曱苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-7-吡啶-4-基-噻吩并[3,2_c]吡啶_3•基)一 苯基]-3-間-曱苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-7-吡啶-3-基-噻吩并[3,2_c]吡啶_3_基)_ 本基]-3-間-曱苯基-尿素， 及其藥學上可接受的鹽類。 2. 如申請專利範圍第丄項之眼用組成物，其中該化合物係 1 [4-(4-胺基-噻吩并[2,3-司嘧咬_5_基)_笨基]_3_間-曱苯 基-尿素。 3_如申請專利範圍第1項之眼用組成物，其中該眼用組成 物中的該化合物濃度係自〇 〇〇1%至1〇0/〇。 28 201206929 4. 如申請專利範圍第3項之眼用組成物，其中該眼用組成 物中的該化合物濃度係1%。 5. 如申請專利範圍第1項之眼用組成物，其中該眼用組成 物係經由選自由局部、結膜下投藥、眼周投藥、眼球後 投藥、眼球筋膜下投藥、前房内注射、玻璃體内注射、 眼内注射、視網膜下投藥、上脈絡膜投藥及後房近鞏膜 投藥所組成之群組之一途徑投藥。 6. 如申請專利範圍第5項之眼用組成物，其中該眼用組成 物係經由玻璃體内注射而投藥。 7. —種促使眼部新生血管形成作用消退之眼用組成物，其 包含一治療有效量之至少一種選自由下列所組成之群 組之化合物： 1 - [4-(3 -胺基-1//~ °比 α坐并[3，4-c]π比α定-4 -基）-苯基]-3 _ 間-曱苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-噻吩并[2,3-刃嘧啶-5-基)-苯基]-3-間-甲苯基-尿素 1-[4-(3-胺基-1//-吲唑-4-基)-苯基]-3-(3-羥基-5-曱 基-苯基)-尿素 1-{4-[3-胺基-7-(2-甲乳基-乙氧基)-1//-α引。坐-4-基]_ 苯基}-3-間-甲苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-噻吩并[3,2-cht啶-3-基)-苯基]-3-間-甲苯基-尿素 1-[4-(4-胺基-7-°比啶-4-基-噻吩并[3,2-c]。比啶-3-基)-苯基]-3-間-曱苯基-尿素 29 201206929 l-[4-(4-胺基-7-α比啶-3-基-噻吩并[3,2-c]吼啶-3-基)-苯基]-3-間-曱苯基-尿素，及其藥學上可接受的鹽類。 8. 如申請專利範圍第7項之眼用組成物，其中該化合物係 1-[4-(4-胺基-噻吩并[2,3-c?]嘧啶-5-基)-苯基]-3-間-曱苯 基-尿素。 9. 如申請專利範圍第7項之眼用組成物，其中該眼用組成 物中的該化合物濃度係自0.001%至10%。 10. 如申請專利範圍第9項之眼用組成物，其中該眼用組成 物中的該化合物濃度係1%。 11. 如申請專利範圍第7項之眼用組成物，其中該眼用組成 物係經由選自由局部、結膜下投藥、眼周投藥、眼球後 投藥、眼球筋膜下注射、前房内投藥、玻璃體内注射、 眼内注射、視網膜下投藥、上脈絡膜投藥及後房近鞏膜 投藥所組成之群組之一途徑投藥。 12. 如申請專利範圍第11項之眼用組成物，其中該眼用組成 物係經由玻璃體内注射而投藥。 30 201206929 四、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：第（ ）圖。（無) (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 2