MX2012002133A

MX2012002133A - Aptameros para inhibidor de trayectoria de factor de tejido y su uso como terapeuticos para trastorno de sangrado.

Info

Publication number: MX2012002133A
Application number: MX2012002133A
Authority: MX
Inventors: Robert G Schaub; Kathleen Mcginness; Jennifer Nelson; Ryan Genga; Emily Waters; Jeffrey C Kurz; John L Diener
Original assignee: Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2013-02-15
Also published as: US8252913B2; WO2011022427A1; ES2655589T3; EP2467167A1; AU2010284329B2; NZ598557A; EP2467167A4; CN102869385A; BR112012003806A2; KR20120061086A; RU2012110221A; IN2012DN01984A; US20110098345A1; CA2770762A1; SG178408A1; JP2013502218A; IL218048A0; EP2467167B1; AU2010284329A1; CO6531414A2

Abstract

La invención se refiere en general al campo de ácidos nucleicos y más particularmente a aptámeros que se unen a TFPl, los cuales son útiles como terapéuticos y diagnóstico de trastornos de sangrado y/u otras enfermedades o trastornos en donde TFPI ha sido implicado. Además, los aptámeros TFPI pueden ser utilizados antes, durante y/o después de procedimientos médicos para reducir complicaciones o efectos laterales de los mismos. La invención además se refiere a materiales y métodos para la administración de aptámeros que se unen a TFPI.

Description

APTÁMEROS PARA INHIBIDOR DE TRAYECTORIA DE FACTOR DE TEJIDO Y SU USO COMO TERAPEUTICOS PARA TRASTORNO DE SANGRADO Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud de patente no provisional reivindica el beneficio de prioridad en virtud del título 35 del Código de Estados Unidos § 1 19 (e) con respecto a la Solicitud de Patente Provisional estadounidense serie Nos. : 61 /234, 939, presentada el 18 de agosto de 2009; 61 /353, 374, presentada el 1 0 de junio de 201 0; 61 /366,362, presentada el 21 de julio de 2010 y 61 /367,766, presentada el 26 de julio de 2009; cuyos contenidos se incorporan a la presente en su totalidad para su referencia.

Campo de la invención La invención se refiere en general al campo de ácidos nucleicos y, más particularmente, a aptámeros que se unen al inhibidor de la trayectoria de factor de tejido (TFPI), que son útiles como compuestos terapéuticos y diagnósticos de trastornos hemorrágicos y/u otras patologías, enfermedades o trastornos en los que estuvo implicado el TFPI . La invención se refiere además a materiales y métodos para la administración de aptámeros que se unen al TFPI .

Antecedentes de la invención Aptámeros Un aptámero es un ácido nucleico aislado o purificado que se une con alta especificidad y afinidad a un objetivo a través de interacciones diferentes al par de bases Watson-Crick. Un aptámero tiene una estructura tridimensional que proporciona contactos químicos para unirse específicamente a un objetivo. A diferencia de la unión tradicional de ácido nucleico, la unión de aptámeros no depende de una secuencia de base lineal conservada sino de una estructura secundaria o terciaria particular. Esto es, las secuencias de ácidos nucleicos de aptámeros son secuencias no codificantes. Todo potencial de codificación que pueda tener un aptámero es completamente casual y no tiene incidencia alguna en la unión de un aptámero a un objetivo. Un aptámero minimizado típico tiene un tamaño de 5-1 5 kDa ( 1 5-45 nucleótidos), se une a un objetivo con afinidad nanomolar a sub-nanomolar y se discrimina contra objetivos muy relacionados (por ej . , los aptámeros no se unirán típicamente a otras proteínas de la misma familia funcional o génica).

Se han generado aptámeros a varios objetivos, tales como pequeñas moléculas, carbohidratos, péptidos y proteínas, incluyendo factores de crecimiento, factores de transcripción, enzimas, inmunoglobulinas y receptores.

Los aptámeros son capaces de específicamente unirse a objetivos seleccionados y modular las interacciones de unión o actividad del objetivo, por ej., a través de la unión los aptámeros pueden inhibir o estimular una capacidad de funcionar del objetivo. La unión específica a un objetivo es una propiedad inherente de un aptámero. La actividad funcional, es decir, inhibir o estimular una función del objetivo, no lo es.

A menudo, un aptámero se une a un objetivo y tiene poco efecto o ninguno en la función del objetivo. A veces, un aptámero se une a un objetivo y tiene un efecto inhibidor o estimulador en una función del objetivo.

Los aptámeros tienen una cantidad de características deseables para su uso como compuestos terapéuticos y de diagnóstico, incluyendo alta especificidad y afinidad, actividad biológica, baja inmunogenicidad, propiedades farmacocinéticas sintonizables y estabilidad.

Trastornos hemorrágicos La coagulación es la formación de un tapón hemostático celular/de fibrina estable que es suficiente para detener el sangrado. El proceso de coagulación, que se ilustra en la Figura 1 , implica interacciones celulares y bioquímicas complejas que se pueden dividir en tres etapas. La etapa 1 es la formación del Factor X activado mediante el contacto (intrínseca) o la vía del factor/Vl la tisular (extrínseca). La etapa 2 es la formación de trombina a partir de protrombina por el Factor Xa. La etapa 3 es la formación de fibrina a partir de fibrinógeno por el Factor XI I la.

La hemofilia se define como un trastorno congénito o adquirido de coagulación que normalmente, pero no siempre, implica una deficiencia funcional y/o cuantitativa de una única proteína de coagulación. La deficiencia de los Factores de coagulación VI I I (hemofilia A) y IX (hemofilia B) son los dos trastornos hemorrágicos heredados más comunes. La cantidad total general de pacientes con hemofilia A y B en el mundo es aproximadamente 400,000. Sin embargo, se tratan solamente alrededor de 1/4 (100,000) de estos individuos. La hemofilia A y B se puede dividir además con respecto al alcance del factor deficiencia. La hemofilia leve es 5-40% de niveles normales del factor y representa aproximadamente 25% de la población total con hemofilia. La hemofilia moderada es 1-5% de niveles de factores normales y representa aproximadamente 25% de la población de hemofilia total. La hemofilia grave es <1% de los niveles de factores normales y representa aproximadamente 50% de la población de hemofilia total y los usuarios más altos de terapias actualmente disponibles.

Dado que el descubrimiento de la crioprecipitación por Pool (Pool et al., "High-potency antihaemophilic factor concéntrate prepared from cryoglobulin precipítate", Nature, vol. 203, p. 312 (1964)), el tratamiento de estas deficiencias que amenazan la vida se ha enfocado en el remplazo del factor, con un esfuerzo continuo dirigido a la mejora en la calidad de los concentrados del Factor VIII y IX. La mejora más importante ha sido la disponibilidad de formas recombinantes de los Factores VIII y IX. Estas moléculas recombinantes altamente purificadas tienen un perfil de seguridad y eficacia que las convirtió en la forma principal de factores de remplazo usada en el tratamiento de la hemofilia. La mayoría de los pacientes leves y moderados se tratan "a demanda", esto es cuando sucede un sangrado. Aproximadamente el 50-60% de pacientes graves se tratan "a demanda", en tanto el fragmento de esta población usa terapia profiláctica que implica administrar el factor intravenoso 2-3 veces a la semana.

Desafortunadamente, los factores recombinantes retienen aún algunas de las limitaciones de concentrados y factores derivados del plasma más altamente purificados. Estas limitaciones incluyen la vida media relativamente corta de las moléculas, que requieren inyección frecuente para mantener la concentración plasmática eficaz; alto costo y el desarrollo de respuestas de anticuerpos, en especial al Factor VII I, en una subpoblación de pacientes llamados pacientes inhibidores.

En una mayoría de pacientes que desarrollan anticuerpos inhibidores, el anticuerpo es solamente transitorio. En aquellos pacientes con una respuesta al anticuerpo sostenida (~ 1 5%), algunos responden a protocolos de tolerancia costosos y complejos. Aquellos que no responden a la tolerancia (-5-1 0%) requieren el uso de productos de no Factor VI H/Factor IX para controlar el sangrado. Las Concentraciones del complejo de protrombina (PCC), Agente de desvío del inhibidor del factor ocho (FEI BA) y Factor VI la recombinante (NovoSeven®, FVI Ia) son tratamientos de desvío del Factor VIH/Factor IX eficaces para pacientes inhibidores.

El tratamiento del Factor VI la recombinante (rFVI Ia) es el más usado de estos agentes de desvío. El Factor Vlla forma complejo con el factor tisular endógeno para activar la vía extrínseca. También puede activar directamente el Factor X. La respuesta al tratamiento con rFVI Ia es variable. La respuesta variable, junto con el pobre perfil farmacocinético (PK) de rFVI Ia, puede necesitar varias inyecciones para controlar la hemorragia y limita significativamente su utilidad para el tratamiento profiláctico.

Actualmente, hay un esfuerzo importante en el desarrollo de las moléculas del Factor VI II , IX y Vl la con potencia , estabilidad y vida media en circulación mejorada . Cabe destacar que en todos los casos los productos representan mejoras incrementadas de estabilidad, farmacocinética y/o form ulación de factores de remplazo existentes.

La vía del factor tisular/Vl l a (extrínseca) proporciona una formación rápida de bajos niveles de trombina que puede servir como la respuesta hemostática inicial para in iciar y acelerar la vía intrínseca dependiente del Factor VI I I , V y IX. El factor tisular, Factor Vl la y Factor Xa tienen una gran i ncidencia en esta vía y está muy regulada mediante una célula endotelial asociada con el inh ibidor de proteinasa tipo Kunitz, inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI).

El inhibidor de la vía del factor tisu lar es un inh ibidor de la serina proteasa 40 kDa que está sintetizado en y un ido a superficies celulares endoteliales ("superficie TFPI") , en el plasma a una concentración de 2-4 nM ("plasma TFPI") y está almacenado (200 pM/1 08 plaq uetas) y liberado de plaquetas activadas. Aproximadamente el 10% del TFPI en plasma no está asociado, en tanto el 90% está asociado con partícu las de LDL oxidadas y es inactivo. Hay dos formas princi pales de TFPI , TFPIa y TFPIp (Figuras 2 y 3) .

TFPIa contiene domi nios simulados 3 de Kunitz, K1 , K2 y K3. K1 y K2 imitan los substratos de proteasa y se inhiben mediante unión firme pero reversible a las proteasas objetivo. En el caso de TFPIa , K1 se une a e inhibe el factor tisu lar/Vl la, en tanto K2 se une a e inhibe el Factor Xa. El papel de K3 no se conoce hasta el momento pero puede tener incidencia en la u nión de superficie cel ular y en la mejora de la inhibición del Factor Xa por K2. TFPIa tiene un péptido de extremo C básico que es la región del sitio de unión a la membrana para la molécula. Se estima que el 80% del TFPI de superficie es TFPIa. TFPIa se une principalmente a la superficie endotelial asociada con los proteoglicanos de la membrana. La heparina ha demostrado liberar el TFPIa desde el endotelio cultivado, venas aisladas y luego de la inyección intravenosa (IV) de heparina (sin fraccionar y LMWH). No es clara la naturaleza exacta del mecanismo de liberación (competencia o liberación inducida), pero se pueden aumentar los niveles de TFPI 3-8 veces luego de la administración IV de heparina. Algunos TFPIa se pueden encontrar también unidos a fosfatidilinositol glicosilado (GPI) a través de un co-receptor no identificado.

TFPI es una versión empalmada alternativa de TFPI que está modificada pos-traduccionalmente con un ancla de fosfatidilinositol glicosilado (GPI). Se estima que representa alrededor del 20% del TFPI de superficie en células endoteliales cultivadas. Aunque tiene actividad inhibidora in vitro, es menos clara la incidencia in vivo funcional.

El TFPI de superficie tiene una incidencia más importante en la regulación de coagulación con base en su localización al sitio de formación de trombosis y lesión vascular. El TFPI de superficie representa la proporción más grande de TFPI activo. Datos de varios laboratorios sugieren que el TFPI puede tener también efectos sinérgicos/complementarios a través de interacciones con antitrombina III (ATIII) y proteína C.

El TFPI se une al Factor VI la y Factor Xa a través de sus dominios K1 y K2 y a los proteoglicanos a través de sus dominios K3 y extremo C. El hecho de que el TFPI tiene un papel clave en la inhibición del factor tisular/Vl la y Xa sugiere que la inhibición de TFPI podría proporcionar un único tratamiento o un tratamiento con adyuvante que está dado además de o en combinación con factores purificados recombinantes. Un enfoque para promover un estado protrombótico podría ser a través de la regulación por aumento de la vía extrínseca mediada del factor tisular de coagulación. Se ha sugerido que la inhibición de TFPI podría mejorar la coagulación en el paciente con hemofilia.

Los estudios han demostrado que la deficiencia de TFPI en ratones puede aumentar la formación de trombosis y que los anticuerpos de TFPI mejoran los tiempos de sangrado en los conejos con falta del Factor VI I I y que pueden acortar la coagulación en el plasma de pacientes con hemofilia. En los conejos, la hemofilia A transitoria se indujo mediante el tratamiento de conejos con un anticuerpo del Factor VI II . Esto fue seguido por tratamiento con remplazo del Factor VII I o un anticuerpo específico al TFPI de conejo. El tratamiento con anti-TFPI produjo una reducción en el sangrado y una corrección de la coagulación que fue similar al observado con el remplazo del Factor VI II Liu et al. (Liu ef a/. , "Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP)", Thromb. Haemost. , vol. 95, pp. 68-76 (2006)) informaron los efectos de un polisacárido no anticoagulante aislado de algas pardas que inhiben el TFPI . Un informe posterior por Prasad et al. (Prasad et al. , "Efficacy and safety of a new-class of hemostatic drug candidate, AV51 3, in dogs with hemophilia A", Blood, vol. 1 1 1 , pp. 672-679 (2008)) evaluó también este polisacárido en perros con hemofilia A. En ambos estudios se encontró que la inhibición de TFPI tuvo un efecto positivo en la restauración de un perfil de coagulación normal y, en el modelo de perro, una mejora en el perfil hemostático, incluyendo un tromboelastograma (TEG) mejorado y una reducción en el NAI L tiempo de sangrado. Estos datos sugieren que la inhibición de TFPI podría proporcionar un enfoque para tratar la hemofilia.

Por consiguiente, sería beneficioso identificar nuevas terapias para confrontar el TFPI en el tratamiento de trastornos hemorrágicos, o que se usan junto con procedimientos médicos, o que se usan en combinación con otro fármaco u otra terapia para inducir un estado pro-coagulante. La presente invención proporciona materiales y métodos para satisfacer estas y otras necesidades.

Breve descripción de la invención La invención proporciona aptámeros que se unen al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) , denominado en la presente "aptámeros de TFPI", y métodos para usar dichos aptámeros en el tratamiento de trastornos hemorrágicos y otras patologías, enfermedades o trastornos mediados por TFPI, con o sin otros agentes. Además, los aptámeros de TFPI se pueden usar antes, durante y/o después de procedimientos médicos, con o sin otros agentes, para reducir las complicaciones o efectos colaterales de los mismos.

Los aptámeros de TFPI se unen a o, de otro modo, interactúan con el TFPI o una o más porciones (o regiones) del mismo. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, el TFPI es TFPI humano. De preferencia, los aptámeros de TFPI se unen a TFPI y requieren contactos de unión, al menos en parte, fuera de las regiones K1 y K2, tal como la región K3/extremo C. Más preferentemente, los aptámeros de TFPI se unen al menos en parte a una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) que se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 155-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 170-190, aminoácidos 175-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 195-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150-180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150-210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150-240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos ' 182-241 y aminoácidos 182-276. De preferencia, el aptámero de TFPI tiene una constante de disociación para TFPI de 100 nM o menos.

Los ejemplos de aptámeros de TFPI incluyen, de modo no limitante, aptámeros que comprenden una secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, que se conoce en la presente como ARC26835; SEQ ID NO: 2, que se conoce en la presente como ARC17480; SEQ ID NO: 3, que se conoce en la presente como ARC19498; SEQ ID NO: 4, que se conoce en la presente como ARC19499; SEQ ID NO: 5, que se conoce en la presente como ARC19500; SEQ ID NO: 6, que se conoce en la presente como ARC19501; SEQ ID NO: 7, que se conoce en la presente como ARC31301; SEQ ID NO: 8, que se conoce en la presente como ARC18546; SEQ ID NO: 9, que se conoce en la presente como ARCARC19881 y SEQ ID NO: 10, que se conoce en la presente como ARC19882.

De preferencia, el aptamero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ ID NO: 1 ) (ARC26835), donde "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo (que se conoce también en la técnica como nucleótido que contiene 2'-OMe, 2'-metoxi o 2'-OCH3). En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 1 .

Más preferentemente, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 2) (ARC1 7480), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2.

Aún más preferentemente, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mLI-mU-mG-mG-clC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 3) (ARC19498), donde "NH2" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 3.

Más preferentemente, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: PEG40K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 4) (ARC 19499), donde "NH" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y "PEG" es un polietilenglicol. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 4. En algunas modalidades, el fragmento PEG40K de la SEQ I D NO: 4 es un fragmento de PEG ramificado que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En otras modalidades, el fragmento PEG40K de la SEQ I D NO: 4 es un fragmento de PEG lineal que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En modalidades adicionales, el fragmento PEG40K de la SEQ ID NO: 4 es un fragmento de metoxipolietilenglicol (mPEG) que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En aún modalidades adicionales, el fragmento PEG40K de la SEQ I D NO: 4 es un fragmento de PEG ramificado que contiene dos fragmentos mPEG20K, cada uno tiene un peso molecular de 20 kDa, tal como se muestra en las Figuras 6-9, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa. En una modalidad preferida, el fragmento PEG40K de la SEQ I D NO: 4 es el fragmento PEG40K ramificado mostrado en la Figura 6, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa y está conectado al aptámero tal como se muestra en la Figura 7. En una modalidad más preferida, el fragmento de PEG40K está conectado al aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-amina, tal como se muestra en la Figura 8, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa. En una modalidad más preferida, el fragmento de PEG40K es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular total de 40 kDa y está conectado al aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, tal como se muestra en la Figura 9A y 9B.

De manera alternativa, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-NH2 (SEQ ID NO: 5) (ARC19500), donde "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y "NH2" es de una fosforamidita enlazadora de hexilamina. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5.

De preferencia, el aptámero de TFPI del párrafo

[0029] de la presente es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: PEG20K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-NH-PEG20K (SEQ ID NO: 6) (ARC19501), donde "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo, "NH" es de una fosforamidita enlazadora de hexilamina y "PEG" es un polietilenglicol. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6. En algunas modalidades, el fragmento PEG20K de la SEQ ID NO: 6 son fragmentos de PEG ramificados. En otra modalidad, los fragmentos PEG20K de la SEQ ID NO: 6 son fragmentos de PEG lineales. En modalidades adicionales, los fragmentos PEG20K de la SEQ ID NO: 6 son fragmentos de metoxipolietilenglicol (mPEG) que tienen un peso molecular de 20 kDa. En aún modalidades adicionales, los fragmentos PEG20K de la SEQ ID NO: 6 son fragmentos de mPEG ramificados que contienen dos fragmentos mPEGIOK, cada uno tiene un peso molecular de 10 kDa.

De manera alternativa, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ ID NO: 7) (ARC31301), donde "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 7.

De preferencia, el aptámero de TFPI del párrafo

[0031] de la presente es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG- mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 8) (ARC1 8546), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 8.

Más preferentemente, el aptámero de TFPI del párrafo [0031 ] de la presente es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 9) (ARC19881 ), donde "NH2" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 9.

Aún más preferible para el aptámero de TFPI del párrafo

[0031] de la presente es un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: PEG40K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 10) (ARC19882), donde "NH" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo y "PEG" es un polietilenglicol. En algunas modalidades, el aptámero de TFPI es un aptámero o una sal del mismo que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 10. En algunas modalidades, el fragmento PEG40K de la SEQ ID NO: 10 es un fragmento de PEG ramificado que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En otras modalidades, el fragmento PEG40K de la SEQ ID NO: 10 es un fragmento de PEG lineal que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En modalidades adicionales, el fragmento PEG40K de la SEQ ID NO: 10 es un fragmento de metoxipolietilenglicol (mPEG) que tiene un peso molecular total de 40 kDa. En aún modalidades adicionales, el fragmento PEG40K de la SEQ I D NO: 1 0 es un fragmento de PEG ramificado que contiene dos fragmentos mPEG20K, cada uno tiene un peso molecular de 20 kDa, tal como se muestra en las Figuras 6-9, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa. En una modalidad preferida, el fragmento PEG40K de la SEQ ID NO: 10 es el fragmento PEG40K ramificado mostrado en la Figura 6, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa y está conectado al aptámero tal como se muestra en la Figura 7. En una modalidad más preferida, el fragmento de PEG40K se conecta al aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-amina, como se muestra en la Figura 8, donde "20KPEG" se refiere a un fragmento mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa. En una modalidad más preferida, el fragmento de PEG40K es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular total de 40 kDa y está conectado al aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, como se muestra en la Figura 9A y 9B.

De preferencia, los aptámeros de TFPI están conectados a uno o más fragmentos de PEG, con o sin uno o más enlazadores. Los fragmentos de PEG pueden ser de cualquier tipo de fragmento de PEG. Por ejemplo, el fragmento de PEG puede ser lineal, ramificado, ramificado múltiple, con forma de estrella, con forma de peine o un dendrímero. Además, el fragmento de PEG puede tener cualquier peso molecular. De preferencia, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 5-100 kDa de tamaño. Más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 10-80 kDa de tamaño. Aún más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 20-60 kDa de tamaño. Aún más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 30-50 kDa de tamaño. Más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular de 40 kDa de tamaño, también denominado en la presente "40KPEG".. Los mismos o diversos fragmentos de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI . Se pueden usar los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar los mismos o diferentes fragmentos de PEG a un aptámero de TFPI .

De manera alternativa, los aptámeros de TFPI se pueden conectar a una o más alternativas de PEG (en vez de a uno o más fragmentos de PEG), con o sin uno o más enlazadores. Los ejemplos de alternativas de PEG incluyen, de modo no limitante, polioxazolina (POZ), PoliPEG, hidroxietil almidón (HES) y albúmina. La alternativa de PEG puede ser cualquier tipo de alternativa de PEG, pero debería funcionar del mismo modo o similar al fragmento de PEG , es decir, debería reducir la filtración renal y aumentar la vida media del aptámero de TFPI en la circulación. Las mismas o diversas alternativas de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI . Se pueden usar los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar las mismas o diferentes alternativas de PEG a un aptámero de TFPI . De manera alternativa, una combinación de fragmentos de PEG y alternativas de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI , con o sin uno o más de los mismos o diversos enlazadores.

De preferencia, los aptámeros de TFPI están conectados a un fragmento de PEG o una alternativa de PEG a través de uno o más enlazadores. Sin embargo, los aptámeros de TFPI se pueden conectar a un fragmento de PEG o alternativa de PEG directamente, sin el uso de un enlazador. El enlazador puede ser cualquier tipo de molécula. Los ejemplos de enlazadores incluyen , de modo no limitante, aminas, tioles y azidas. Los enlazadores pueden incluir un grupo fosfato. Preferentemente, el enlazador es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina. En algunas modalidades, fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-12 grupos CH2 consecutivos. En modalidades aún más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 4-8 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 6 grupos CH2 consecutivos, es decir, es una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina. Se pueden usar uno o más de los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar uno o más de los mismos o diferentes fragmentos de PEG o una o más de las mismas o diferentes alternativas de PEG a un aptámero de TFPI.

En modalidades preferidas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde HN'^POaH es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina y el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. De preferencia, el aptámero se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 2 y 8. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En modalidades preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde HN^wuwP02H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina y el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. De preferencia, el aptámero se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En modalidades más preferidas, se proporciona u n aptámero I del m ismo que comprende la siguiente estructura : 5'-aptámero-3' donde el aptámero es un aptámero TFPI de la invención . De preferencia , el aptámero se selecciona del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 2 y 8. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecul ar de 20 kDa .

En modalidades más preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del m ismo que comprende la sig uiente estructura: donde el aptámero es un aptámero TFPI de la i nvención . De preferencia, el aptámero se selecciona del g rupo que consiste en la SEQ I D NO: 1 . El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa . De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En las modalidades más preferidas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la sig uiente estructura: 5 -aDtámero-3' donde "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) y el aptámero es un aptámero de TFPI de la invención, "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno dado que la cantidad de n puede variar ligeramente para un PEG que tiene un peso molecular particular. De preferencia, "n" varía de 400-500 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" varía de 425-475 unidades de óxido de etileno. Aún más preferentemente, "n" varía de 440-460 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" tiene 454 unidades de óxido de etileno. Preferentemente, el aptámero se selecciona del grupo que consiste en las SEQ I D NOs: 2 y 8.

En las modalidades más preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) y el aptámero es un aptámero de TFPI de la invención, "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno dado que la cantidad de n puede variar ligeramente para un PEG que tiene un peso molecular particular. De preferencia, "n" varía de 400-500 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" varía de 425-475 unidades de óxido de etileno. Aún más preferentemente, "n" varía de 440-460 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" tiene 454 unidades de óxido de etileno. De preferencia, el aptámero se selecciona del grupo que consiste en la SEQ I D NO: 1 .

La invención también proporciona aptámeros que tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustancialmente la misma estructura que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros que tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustancialmente la misma estructura que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención proporciona además aptámeros que tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustancialmente la misma capacidad de modular la coagulación sanguínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular la coagulación sanguínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI , sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI, sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular la coagulación sanguínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

Los aptámeros de TFPI pueden comprender a menos una modificación química. De preferencia, la modificación se selecciona del grupo que consiste en: una sustitución química en una posición de azúcar, una sustitución qu ímica en una unión internucleótidos y una sustitución química en una posición de base. De manera alternativa, la modificación se selecciona del grupo que consiste en la incorporación de un nucleótido modificado; un casquete 3'; un casquete 5'; conjugación a un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular; conjugación a un compuesto lipofílico; incorporación de un motivo CpG e incorporación de un fosforotioato o fosforoditioato en la estructura principal del fosfato. El alto peso molecular, compuesto no inmunogénico, es preferentemente polietilenglicol. En algunas modalidades, el polietilenglicol es metoxipolietilenglicol (mPEG). El casquete 3' es preferentemente un casquete de desoxitimidina invertido.

La invención también proporciona aptámeros que se unen a TFPI y tienen una o más de las siguientes características: (i) incluye la secuencia de nucleótidos primaria de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mll-mA (SEQ ID NO: 1); (ii) incluye una secuencia de nucleótidos primaria que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótidos primaria mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 7; (iii) tiene sustancialmente la misma o mejor capacidad de unirse a TFPI como la de un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos primaria que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y/o (iv) tiene sustancialmente la misma o mejor capacidad para modular o inhibir TFPI como la de un aptámero que comprende una secuencia de nucleótidos primaria que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Tal como se usa en la presente, el término secuencia de nucleótidos primaria se refiere a la secuencia lineal 5' a 3' de bases de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico que forma un aptámero, sin importar las modificaciones 3' o 5'. Por ejemplo, ARC26835, ARC17480, ARC19498, ARC19499, ARC19500 y ARC19501 tienen todos la misma secuencia de nucleótidos primaria.

La invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero de TFPI o una sal del mismo, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además un método para tratar, prevenir, retrasar el avance de o mejorar una patolog ía, enfermedad o trastorno mediado por TFPI administrando a un sujeto la composición farmacéutica anterior. De preferencia, el sujeto es un mamífero. Más preferentemente, el sujeto es un humano. Preferentemente, la patología, enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en: deficiencias del factor de coagulación, congénitas o adquiridas, leves o moderadas o severas, incl uyendo hemofilia A (deficiencia del Factor VI I I), hemofilia B (deficiencia del Factor IX) y hemofilia C (deficiencia del Factor XI); hemofilia A o B con inhibidores; otras deficiencias de factores (V, VII , X, XI I I , protrombina, fibrinógeno); deficiencia del inhibidor de a2-plasmina; deficiencia del inhibidor del activador de plasminógeno 1 ; deficiencia de múltiples factores; anormalidades del factor funcional (por ej. , disprotrombinemia); hemorragia de articulaciones (hemartrosis), incluyendo, de modo no limitante, tobillo, codo y rodilla; hemorragia espontánea en otras ubicaciones (músculo, gastrointestinales, boca, etc); choque hemorrágico; hemorragia intracraneal; laceraciones y otras hemorragias asociadas con trauma; coagulopatía traumática aguda; coagulopatía asociada con cáncer (por ej. , leucemia promielocítíca aguda); enfermedad de von Willebrand; coagulación intravascular diseminada; enfermedad hepática; menorragia; trompocitopenia y hemorragia asociada con el uso de anticoagulantes (por ej. , antagonistas de la vitamina K, antagonistas de FXa, etc.).

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante varias vías de administración. De preferencia, las composiciones se administran intravenosamente (IV). Más preferentemente, las composiciones se administran subcutáneamente (SC o SQ).

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando varios regímenes de tratamiento. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido, tal como cuando un paciente no sufre de un episodio hemorrágico. De manera alternativa, las composiciones se pueden administrar a demanda, es decir, según se necesite, tal como cuando un paciente sufre de un episodio hemorrágico. En una modalidad alternativa, las composiciones se pueden administrar como una combinación de terapia de mantenimiento y terapia a demanda. En dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso la dosificación de las composiciones se aumentarían en una dosis requerida hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se disminuiría la dosificación de las composiciones hasta el nivel de mantenimiento anterior. En otra dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se administraría al paciente otra terapia de trastorno hemorrágico (tal como, Factor VII I) hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se discontinuaría la otra terapia de trastorno hemorragico. Durante todo este tiempo, se continuarían las composiciones a administrar como una terapia de mantenimiento. En aún otra dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se disminuiría la dosificación de las composiciones (tal como, Factor VI I I) hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se aumentaría la dosificación de las composiciones hasta el nivel de mantenimiento anterior y se discontinuaría la otra terapia de trastorno hemorrágico. En otra dicha modalidad, se puede administrar otra terapia de trastorno hemorrágico (tal como, Factor VI I I) como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se administrarían las composiciones al paciente hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se discontinuaría la terapia con las composiciones. Durante todo este tiempo, se seguiría administrando la otra terapia de trastorno hemorrágico como una terapia de mantenimiento. En aún otra dicha modalidad, se puede administrar otro trastorno hemorrágico (tal como, Factor VI I I) como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se disminuiría la dosificación de la otra terapia de trastorno hemorrágico y se administrarían las composiciones al paciente hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se aumentaría la dosificación de la otra terapia de trastorno hemorrágico hasta el nivel de mantenimiento anterior y se discontinuaría la terapia con composiciones.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar también antes de, durante y/o después de un procedimiento médico. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar junto con (antes, durante y/o después) con procedimientos médicos, tales como: profilaxis y/o tratamiento asociado con hemorragia causada por procedimientos dentales, cirugía ortopédica incluyendo, de modo no limitante, artroplastia (por ej. , remplazo de caderas), sinovectomía quirúrgica o con radionúclidos (RSV), cirugía mayor, venipunctura, transfusión y amputación.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar también en combinación con otro fármaco, tal como: concentrados de complejo de protrombina activado (APCC), Agente de desvío del inhibidor del factor ocho (FEIBA®), Factor VI la recombinante (por ej. , NovoSeven®), Factor VIII recombinante (Advate®, Kogenate®, Recombinate®, Helixate®, ReFacto®), Factor VI I I derivado de plasma (Húmate P®, Hemofil M®), Factor IX recombinante (BeneFIX®), Factor IX derivado de plasma (Bebulin VH®, Konyne®, Mononine®), crioprecipitado, acetato de desmopresina (DDAVP), ácido épsilon-aminocaproico o ácido tranexámico. De manera alternativa, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con otra terapia, tal como: transfusión de sangre o productos de sangre, plasmaferesis, terapia de inducción de la tolerancia inmunológica con altas dosis de factor de remplazo, terapia de tolerancia inmunológica con agentes inmunodepresores (por ej . , prednisona, rituximab) o terapia del dolor.

Los aptámeros de TFPI se pueden usar para la identificación de la proteína de TFPI . Específicamente, se pueden usar los aptámeros de TFPI para identificar, cuantificar o, de otro modo, detectar la presencia de la proteína de TFPI en una muestra, tal como una muestra biológica u otra muestra derivada del sujeto. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden usar en ensayos in vitro, por ej. , ELISA, para detectar los niveles de TFPI en una muestra de paciente.

La invención proporciona también un método para regular el TFPI en cuya molécula se une a o, de otro modo, interactúa con una o más porciones de TFPI, donde al menos una porción está fuera de los dominios K1 y K2 de TFPI, tal como la región K3/extremo C. La molécula puede ser cualquier tipo de molécula, tal como, por ejemplo, un compuesto orgánico de molécula pequeña, un anticuerpo, una proteína o un péptido, un polisacárido, un ácido nucleico, un siRNA, un aptámero o cualquier combinación de los mismos. De preferencia, la molécula es un compuesto orgánico de molécula pequeña. Más preferentemente, la molécula es un anticuerpo. Más preferentemente, la molécula es un aptámero. Por ejemplo, la molécula se puede unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . Una molécula se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando la molécula se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Una molécula se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando la molécula se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante piegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, la molécula se une al menos en parte a una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) que se selecciona del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 1 50-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 1 75-195, aminoácidos 1 80-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 1 95-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 1 50-175, aminoácidos 1 50-1 80, aminoácidos 1 50-1 85, aminoácidos 1 50-190, aminoácidos 1 50-1 95, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 1 50-210, aminoácidos 1 50-21 5, aminoácidos 150-220, aminoácidos 1 50-225, aminoácidos 1 50-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 1 50-240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 1 50-250, aminoácidos 1 50-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 1 50-265, aminoácidos 1 50-270, aminoácidos 1 50-275, aminoácidos 1 50-276, aminoácidos 1 90-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161 -181 , aminoácidos 162-181 , aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. La molécula comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante del mismo, de menos de 1 00 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona adicionalmente el uso de un aptámero de TFPI en la fabricación de un medicamento en el tratamiento, prevención, retraso del avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico. Por ejemplo, se usan ARC26835, ARC17480, ARC19498, ARC19499, ARC19500, ARC19501 , ARC31301 , ARC 1 8546, ARC1 9881 y ARC19882 en la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir, retrasar el avance de o, de otro modo, mejorar un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona un aptámero de TFPI para usar en un método de tratamiento, prevención, retraso de avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona el uso de un aptámero de TFPI en la fabricación de una composición o producto de diagnóstico para usar en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. En algunas modalidades, el método de diagnóstico es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona un aptámero de TFPI para usar en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. En algunas modalidades, el método de diagnóstico es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona el uso de un aptámero de TFPI para el diagnóstico in vitro. En algunas modalidades, el uso in vitro es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

La invención se refiere adicionalmente a agentes que invierten los efectos de los aptámeros de TFPI , denominados en la presente "agentes de inversión de TFPI". El agente de inversión de TFPI puede ser cualquier tipo de molécula, tal como una proteína, anticuerpo, compuesto orgánico de molécula pequeña o un oligonucleótido. De preferencia, un agente de inversión de TFPI es un oligonucleótido que tiene 10-15 nucleótidos de longitud. De preferencia, un agente de inversión de TFPI se une a un aptámero de TFPI . De preferencia, dicha unión se realiza a través de par de bases complementario. Sin pretender limitarse por la teoría, un agente de inversión de TFPI actúa mediante hibridación a un aptámero de TFPI , desestabilizando así la estructura del aptámero de TFPI y previniendo la unión del aptámero de TFPI a TFPI .

Los ejemplos de agentes de inversión de TFPI incluyen, de modo no limitante: SEQ I D NO: 1 5, que es ARC23085; SEQ ID NO: 16, que es ARC23087; SEQ I D NO: 1 7, que es ARC23088; SEQ I D NO: 18, que es ARC23089.

De preferencia, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mA-mG-mC-mC-mA-mA-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mU-mC-mC (SEQ ID NO: 15), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo (que se conoce también en la técnica como un residuo que contiene 2'-OMe, 2'- metoxi o 2'-OCH3) .

De manera alternativa, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mU-mA-mU-mA-mU-mA-mC-mG-mC-mA-mC-mC-mU-mA-mA (SEQ I D NO: 16), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo.

De manera alternativa, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mC-mU-mA-mA-mC-mG-mA-mG-mC-mC (SEQ I D NO: 17), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo.

De manera alternativa, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mC-mA-mC-mC-mU-mA-mA-mC-mG-mA-mG-mC-mC-mA-mA (SEQ I D NO: 18), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo.

La invención proporciona adicionalmente un método para tratar, prevenir, retrasar el avance de y/o mejorar un trastorno hemorrágico, dicho método comprende el paso de administrar un agente de inversión de TFPI a un paciente que necesita dicho tratamiento.

La invención proporciona el uso de un agente de inversión de TFPI en la fabricación de un medicamento en el tratamiento, prevención, retraso del avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico.

Por consiguiente, la invención proporciona el uso de un agente de inversión de TFPI en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención, retraso de avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico en un paciente donde el método implica administrar el agente de inversión de TFPI al paciente para controlar y/o modular el efecto terapéutico de un aptámero de TFPI administrado al paciente. El aptámero de TFPI se puede administrar antes del agente de inversión de TFPI, simultáneamente con el agente de inversión de TFPI o después del agente de inversión de TFPI y se puede administrar como parte de una terapia de combinación. De preferencia, el aptámero de TFPI se administra al paciente para tratar, prevenir, retrasar el avance de y/o mejorar un trastorno hemorrágico en el paciente.

La invención proporciona también el uso de un agente de inversión de TFPI en la fabricación de un medicamento para usar en el control y/o modulación del tratamiento de un trastorno hemorrágico, donde el trastorno hemorrágico se trata con un aptámero de TFPI .

En una modalidad, la invención proporciona un agente de inversión de TFPI para usar en el tratamiento, prevención, retraso de avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico.

Por consiguiente, la invención proporciona un agente de inversión de TFPI para usar en el tratamiento, prevención , retraso de avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico en un paciente donde el método implica administrar el agente de inversión de TFPI al paciente para controlar y/o modular el efecto terapéutico de un aptámero de TFPI administrado al paciente.

La invención proporciona también un agente de inversión de TFPI para usar en el control y/o modulación del tratamiento de un trastorno hemorrágico, donde el trastorno hemorrágico se trata con un aptámero de TFPI .

En una modalidad, la invención proporciona el uso de un agente de inversión de TFPI en la fabricación de una composición o producto de diagnóstico para usar en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. En algunas modalidades, el método de diagnóstico es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona un agente de inversión de TFPI para usar en un método de diagnóstico practicado en el cuerpo humano o animal. En algunas modalidades, el método de diagnóstico es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

En una modalidad, la invención proporciona el uso de un agente de inversión de TFPI para el diagnóstico in vitro. En algunas modalidades, el uso in vitro es para el diagnóstico de un trastorno hemorrágico.

La invención proporciona también un kit que comprende al menos un recipiente que comprende una cantidad de uno o más aptámeros de TFPI, junto con instrucciones para usar dichos uno o más aptámeros de TFPI en el tratamiento, prevención, retraso del avance y/o mejora de un trastorno hemorrágico. Por ejemplo, el kit incluye ARC26835, ARC17480, ARC19498, ARC19499, ARC19500, ARC19501, ARC31301, ARC18546, ARC19881 o ARC19882 y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los aptámeros se formulan como una composición farmacéutica. El kit puede comprender adicionalmente un agente de inversión de TFPI, junto con instrucciones con respecto a la administración del agente de inversión.

La invención proporciona también un método para producir un aptámero que se une a TFPI, dicho método comprende el paso de sintetizar químicamente un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de un aptámero que se une a TFPI tal como se describe en la presente. El método comprende además el paso de formular una composición farmacéutica mezclando la secuencia de ácido nucleico sintetizada o una sal de la misma, con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona adicionalmente un método para producir un agente de inversión, dicho método comprende el paso de sintetizar químicamente un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de un agente de inversión de TFPI tal como se describe en la presente. El método puede comprender además el paso de formular una composición farmacéutica mezclando la secuencia de ácido nucleico sintetizada o una sal de la misma, con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además aptámeros que se han identificado por el proceso SELEX™, que comprende los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI en condiciones en las que ocurre la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI; (c) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de unir, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a TFPI .

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI , que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión ; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI ; (c) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una porción de TFPI . Este método puede incluir también la intervención o ciclos adicionales con unión a TFPI de longitud completa, seguido de dividir y amplificar. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-1 70, aminoácidos 1 50-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-1 85, aminoácidos 170-190, aminoácidos 1 75-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185- -205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 195-215, aminoácidos 200- -220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215- -235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230- -250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245· -265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260- -276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150- -180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-¦195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150- -210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-¦225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150-¦240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-¦255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-¦270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190- 240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-•276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona también métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI, que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI ; (c) eluir específicamente los ácidos nucleicos unidos con una porción de TFPI o un ligando que se une TFPI de longitud completa o una porción de TFPI; (d) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (e) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir, eluir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 1 50-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 170-190, aminoácidos 1 75-195, aminoácidos 1 80-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-21 0, aminoácidos 195-21 5, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 1 50-175, aminoácidos 150-1 80, aminoácidos 150- 185, aminoácidos 1 50-190, aminoácidos 150-195, aminoácidos 1 50-200, aminoácidos 1 50-205, aminoácidos 1 50-210, aminoácidos 1 50-215, aminoácidos 1 50-220, aminoácidos 1 50-225, aminoácidos 1 50-230, aminoácidos 1 50-235, aminoácidos 150-240, aminoácidos 1 50-245, aminoácidos 1 50-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 1 50-265, aminoácidos 150-270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 1 50-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161 -181 , aminoácidos 1 62-181 , aminoácidos 182-240, aminoácidos 1 82-241 y aminoácidos 1 82-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 1 00 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM , menos de 1 00 nM , preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI , que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión en presencia de un ligando de TFPI (un ligando que se une a TFPI) que bloquea uno o más epítopes en TFPI de la unión al aptámero; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI; (c) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI. En otras modalidades de este método, la inclusión de un ligando de TFPI que bloquea una o más porciones en TFPI de la unión de aptámeros puede ocurrir durante el paso de poner en contacto, el paso de dividir o ambos. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 155-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 170- -190, aminoácidos 175-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185· -205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 195-215, aminoácidos 200· -220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215- -235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230- -250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245- -265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260- -276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150- -180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-¦195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150-¦210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-¦225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150-¦240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-¦255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-¦270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-•240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-•276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM , menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI , que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI ; (c) dividir los ácidos nucleicos unidos que tienen una propiedad funcional deseada de los ácidos nucleicos unidos que no tienen una propiedad funcional deseada; (d) amplificar los ácidos nucleicos unidos que tienen una propiedad funcional deseada para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (e) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI . Los pasos (b) y (c) pueden ocurrir secuencial o simultáneamente. De preferencia, la propiedad funcional deseada es la inhibición de la interacción de TFPI con FXa, FVI Ia, receptor de TFPI o el glicocalix. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 155-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 170-190, aminoácidos 175-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185-205, aminoácidos 190-21,0, aminoácidos 195-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150-180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150-210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 50-240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 n , preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona además un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular humano (TFPI) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, donde el aptámero modula la inhibición mediada por TFPI de coagulación sanguínea, y donde el aptámero compite por la unión a TFPI con un aptámero de referencia que comprende una secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4 (ARC19499), SEQ ID NO: 1 (ARC26835), SEQ ID NO: 2 (ARC17480), SEQ ID NO: 3 (ARC19498), SEQ ID NO: 5 (ARC19500), SEQ ID NO:6 (ARC19501), SEQ ID NO: 7 (ARC31301), SEQ ID NO: 8 (ARC18546), SEQ ID NO: 9 (ARC19881) y SEQ ID NO: 10 (ARC19882). De preferencia, el aptámero de referencia comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 (ARC19499).

La invención proporciona además un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular humano (TFPI) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, donde el aptámero se une a una porción lineal o una porción conformacional de TFPI en la cual al menos una porción de la región reconocida por el aptámero es diferente a la región de TFPI unida por el Factor Vlla, Factor Xa, o ambos Factor Vlla y Factor Xa. De preferencia, el aptámero se une a una o más regiones que comprenden al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 que se selecciona del grupo que consiste en : residuos de aminoácidosl 8-170, residuos de aminoácidos 150-170, residuos de aminoácidos 155-175, residuos de aminoácidos 160-180, residuos de aminoácidos 165-185, residuos de aminoácidos 170-190, residuos de aminoácidos 175-195, residuos de aminoácidos 180-200, residuos de aminoácidos 185-205, residuos de aminoácidos 190-210, residuos de aminoácidos 195-215, residuos de aminoácidos 200-220, residuos de aminoácidos 205-225, residuos de aminoácidos 210-230, residuos de aminoácidos 215-235, residuos de aminoácidos 220-240, residuos de aminoácidos 225-245, residuos de aminoácidos 230-250, residuos de aminoácidos 235-255, residuos de aminoácidos 240-260, residuos de aminoácidos 245-265, residuos de aminoácidos 250-270, residuos de aminoácidos 255-275, residuos de aminoácidos 260-276, residuos de aminoácidos 148-175, residuos de aminoácidos 150-175, residuos de aminoácidos 150-180, residuos de aminoácidos 150-185, residuos de aminoácidos 150-190, residuos de aminoácidos 150-195, residuos de aminoácidos 150-200, residuos de aminoácidos 150-205, residuos de aminoácidos 150-210, residuos de aminoácidos 1 50-21 5, residuos de aminoácidos 1 50-220, residuos de aminoácidos 1 50-225, residuos de aminoácidos 1 50-230, residuos de aminoácidos 1 50-235, residuos de aminoácidos 1 50-240, residuos de aminoácidos 1 50-245, residuos de aminoácidos 1 50-250, residuos de aminoácidos 1 50-255, residuos de aminoácidos 150-260, residuos de aminoácidos 1 50-265, residuos de aminoácidos 1 50-270, residuos de aminoácidos 1 50-275, residuos de aminoácidos 1 50-276, residuos de aminoácidos 1 90-240, residuos de aminoácidos 1 90-276, residuos de aminoácidos 240-276, residuos de aminoácidos 242-276, residuos de aminoácidos 1 61 -1 81 , residuos de aminoácidos 1 62-1 81 , residuos de aminoácidos 1 82-240, residuos de aminoácidos 182-241 y residuos de aminoácidos 182-276. Más preferentemente, el aptámero compite con un aptámero de referencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 4 (ARC19499) para unirse a TFPI .

La invención proporciona también un aptámero que se une a la misma región en un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 1 como la región unida por un aptámero de TFPI que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 4 (ARC19499).

La invención proporciona además un aptámero que se une a una región en un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que comprende una o más porciones de la SEQ ID NO: 1 1 , donde dichas una o más porciones se seleccionan del grupo que consiste en: residuos de aminoácidos148-170, residuos de aminoácidos 150-1 70, residuos de aminoácidos 155-175, residuos de aminoácidos 160-180, residuos de aminoácidos 165-1 85, residuos de aminoácidos 170-190, residuos de aminoácidos 175-195, residuos de aminoácidos 180-200, residuos de aminoácidos 185-205, residuos de aminoácidos 190-210, residuos de aminoácidos 195-215, residuos de aminoácidos 200-220, residuos de aminoácidos 205-225, residuos de aminoácidos 210-230, residuos de aminoácidos 215-235, residuos de aminoácidos 220-240, residuos de aminoácidos 225-245, residuos de aminoácidos 230-250, residuos de aminoácidos 235-255, residuos de aminoácidos 240-260, residuos de aminoácidos 245-265, residuos de aminoácidos 250-270, residuos de aminoácidos 255-275, residuos de aminoácidos 260-276, residuos de aminoácidos 148-175, residuos de aminoácidos 150-175, residuos de aminoácidos 150-1 80, residuos de aminoácidos 150-185, residuos de aminoácidos 150-1 90, residuos de aminoácidos 150-195, residuos de aminoácidos 150-200, residuos de aminoácidos 150-205, residuos de aminoácidos 150-21 0, residuos de aminoácidos 150-21 5, residuos de aminoácidos 150-220, residuos de aminoácidos 150-225, residuos de aminoácidos 150-230, residuos de aminoácidos 150-235, residuos de aminoácidos 150-240, residuos de aminoácidos 150-245, residuos de aminoácidos 150-250, residuos de aminoácidos 150-255, residuos de aminoácidos 150-260, residuos de aminoácidos 150-265, residuos de aminoácidos 150-270, residuos de aminoácidos 150-275, residuos de aminoácidos 150-276, residuos de aminoácidos 190-240, residuos de aminoácidos 190-276, residuos de aminoácidos 240-276, residuos de aminoácidos 242-276, residuos de aminoácidos 161 -181 , residuos de aminoácidos 162-181 , residuos de aminoácidos 182-240, residuos de aminoácidos 182-241 y residuos de aminoácidos 182-276.

La invención proporciona adicionalmente un aptamero que se une a un inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y presenta una o más de las siguientes propiedades: a) compite para la unión a TFPI con cualquiera de las SEQ I D NOs: 1 -10; b) inhibe la inhibición de TFPI del Factor Xa; c) aumenta la generación de trombina en plasma hemofilia; d) inhibe la inhibición de TFPI del complejo tenasa intrínseco; e) restaura la hemostasis normal, tal como se midió por la tromboelastografía (TEG®) en sangre y plasma; f) restaura la coagulación normal, tal como se indicó por un tiempo de coagulación más corto, formación de coagulación más rápida o desarrollo de coagulación más estable, tal como se midió por la tromboelastografía (TEG®) o tromboelastometría rotacional (ROTEM) en sangre y plasma o g) disminuye el tiempo de coagulación, tal como se midió por el tiempo de protrombina diluida (dPT), tiempo de coagulación activado por el factor tisular (TF-ACT) o cualquier otra medición de tiempo de coagulación sensible al TFPI .

La invención proporciona también un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano donde el aptámero compite para la unión de TFPI con un aptámero de referencia que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ I D NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ I D NO: 10.

La invención proporciona además un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano donde el aptámero compite, tanto directa como indirectamente, para la unión de TFPI con un anticuerpo de referencia que se selecciona del grupo que consiste en: AD4903.

La invención proporciona también un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y comprende un motivo tallo y bucle que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 4, donde: a) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 1 , 2, 3, 4, 6, 8, 1 1 , 12, 1 3, 1 7, 20, 21 , 22, 24, 28, 30 y 32 se pueden modificar de un sustitución 2'-OMe a una sustitución 2'-desox¡; b) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 5, 7, 15, 1 9, 23, 27, 29 y 31 se pueden modificar de un 2'-OMe uracilo a un 2'-desoxi uracilo o un 2'-desoxi timina; c) el nucleótido 1 8 se puede modificar de un 2'-OMe uracilo a un 2'-desox¡ uracilo; y/o d) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 14, 16 y 25 se pueden modificar de un 2'-desoxi citosina a un 2'-OMe citosina o un 2'-fluoro citosina .

La invención proporciona adicionalmente un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y comprende los nucleótidos 7-28 de la SEQ I D NO: 2.

La invención proporciona además un método para tratar un trastorno hemorrágico que comprende administrar cualquiera de los aptámeros anteriores.

La invención proporciona además un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), donde el aptámero comprende una secuencia de ácido nucleico primaria que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ I D NOs. : 4, 1 , 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es una representación esquemática de la cascada de coagulación.

La Figura 2 es una ilustración de las formas de TFPI , que están asociadas con el endotelio vascular o en el grupo de plasma.

Las Figuras 3A-B son una representación esquemática de las dos formas de TFPI encontradas en el endotelio, (Figura 3A) TFPIa y (Figura 3B) TFPI .

La Figura 4 es una representación esquemática del proceso de selección de aptámeros in vitro (SELEX™) de grupos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria.

La Figura 5 es una ilustración de la secuencia de aminoácidos de la proteína de TFPI humana madura.

La Figura 6 es una ilustración de un PEG ramificado de 40 kDa. La Figura 7 es una ilustración de un PEG ramificado de 40 kDa que está unido al extremo 5' de un aptámero de amina.

La Figura 8 es una ilustración de un PEG ramificado de 40 kDa que está unido al extremo 5' de un aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-amina.

La Figura 9A es una ilustración de un PEG ramificado de 40 kDa que está unido al extremo 5' de un aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina. La Figura 9B es una ilustración alternativa de un PEG ramificado de 40 kDa que está unido al extremo 5' de un aptámero usando una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina.

La Figura 10A es una ilustración de un aptámero de TFPI , que está comprendido de nucleótidos de 2'-0 Metilo (círculos) y 2'-desoxi (cuadrados) y está modificado en su extremo 5' con un fragmento de PEG de 40 kDa y en su extremo 3' con un residuo de desoxitimidina invertida (3T, que también se conoce en la técnica como idT). La Figura 10B es una ilustración de un aptámero de TFPI, que está comprendido de nucleótidos de 2'-0 Metilo (círculos) y 2'-desoxi (cuadrados) y está modificado en su extremo 5' con un fragmento de PEG de 40 kDa y enlazador, y en su extremo 3' con un residuo de desoxitimidina invertida (3T). La Figura 10C es una ilustración de la estructura putativa de ARC19499, que está comprendida de nucleótidos de 2'-0 Metilo (círculos) y 2'-desoxi (cuadrados) y está modificado en su extremo 5' con un fragmento de PEG de 40 kDa y un enlazador que contiene fosfato de hexilamina, y en su extremo 3' con un residuo de desoxitimidina invertida (3T).

La Figura 11 es una ilustración que describe varias estrategias de PEGilación, tal como mono-PEGilación estándar, PEGilación múltiple y oligomerización a través de PEGilación.

La Figura 12A es una gráfica que muestra que ARC17480 se une firmemente a TFPI de longitud completa. Los datos se ajustan a los modelos monofásicos y bifásicos para determinar una KD para la unión. La Figura 12B es una gráfica que muestra que el tRNA cambia la afinidad de ARC17480 por TFPI. El aptámero aún se une firmemente a TFPI en presencia de tRNA, lo que indica que la unión de ARC17480 a TFPI es específica.

Las Figuras 13A-E describen los resultados de experimentos de unión-competencia con ARC 1 7480 radiomarcado, TFPI de longitud completa y varios aptámeros sin marcar. ARC17480 y ARC1 9499 no marcados (Figura 1 3A); ARC 19498 (Figura 1 3B), ARC 1 8546 (Figura 13C); ARC26835 y ARC31 301 (Figura 1 3D); ARC 19500, ARC19501 , ARC19881 y ARC 19882 (Figura 13E) compiten todos para la unión con ARC17480 radiomarcado.

Las Figuras 14A-D son un conjunto de gráficas que muestran experimentos de unión con ARC17480 y varias proteínas, incluyendo factores de coagulación, inhibidores de proteasa y zimógenos de coagulación. La Figura 14A es una gráfica de un experimento de unión con ARC1 7480 y va rias prote ínas . La F i g u ra 14B es u na g ráfica de un experimento de unión con ARC 17480 y TFPI o varios factores de coagulación activados. La Figura 14C es una gráfica de un experimento de unión con ARC1 7480 y TFPI o varios inhibidores de proteasa. La Figura 14D es una gráfica de un experimento de unión con ARC17480 y TFPI o varios zimógenos de coagulación. ARC1 7480 mostró unión significativa a TFPI pero no a cualquiera de las otras proteínas analizadas.

La Figura 15 es una gráfica que muestra datos de un ensayo basado en placas que demuestra la unión de ARC1 9499 a TFPI recombinante.

La Figura 16 es una gráfica que muestra datos de un ensayo de competencia basado en placas que demuestra la unión de ARC19498 a TFPI en competencia con ARC1 9499.

La Figura 1 7A describe los resultados de un ensayo de unión con ARC17480 radiomarcado, TFPI de longitud completa y TFPI-His. La Figura 17B describe los resultados de un ensayo de unión con ARC17480 radiomarcado, TFPI de longitud completa, TFPI-K1 K2 truncado, proteína de dominio K3-extremo C de TFPI y el péptido que contiene la región del extremo C de TFPI en presencia de neutravidina.

La Figura 1 8A describe los resultados de un ensayo de unión con ARC17480 radiomarcado y TFPI de longitud completa en ausencia o presencia de 0.1 mg/mL de heparina. La Figura 1 8B describe los resultados de un ensayo de competencia de unión con ARC17480 radiomarcado, 12.5 nM de TFPI de longitud completa y diferentes concentraciones de heparina y heparina de bajo peso molecular (LMWH) como competidores.

Las Figuras 19A- B, ilustran la competencia de varios anticuerpos anti-TFPI con ARC19499 en un ensayo de unión basado en placas.

Las Figuras 20A-C, ilustran la competencia de varios anticuerpos anti-TFPI con ARC19499 en un ensayo de filtración (dot-blot) de nitrocelulosa.

Las Figuras 21 A-B son una serie de gráficas que muestran la actividad de ARC 1 9499 en el ensayo de inhibición Xasa extrínseco. En la Figura 21 A, se trazó la velocidad (mOD/min) contra tiempo (minutos). En ausencia de TFPI , la velocidad fue lineal. 1 nM de TFPI disminuyó la velocidad dramáticamente. Concentraciones en aumento de ARC19499 de 0.01 a 1000 nM aumentaron la velocidad en una forma dependiente de la dosis hasta casi el nivel de ausencia de TFPI . En la Figura 21 B, las velocidades en el momento de tiempo de 4 minutos se normalizaron a la velocidad en ausencia de TFPI en 4 minutos. ARC 19499 mostró una mejora dependiente de la dosis en la velocidad de ensayo, alcanzando niveles cercanos a los de en ausencia de TFPI mediante un aptámero de 10 nM. Los datos para la Figura 21 A fueron representativos a partir de tres experimentos. Los datos para la Figura 21 B representan el error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 22A-C, describen los resultados de un ensayo de actividad del Factor Xa (FXa) con TFPI de longitud completa y ARC17480, ARC18546, ARC26835, ARC31 301 , ARC1 9498, ARC1 9499, ARC19500, ARC19501 , ARC1 9881 o ARC19882. La velocidad ajustada de la degradación del sustrato FXa se traza como una función de concentración de aptámeros. Las velocidades se ajustan mediante resta de la velocidad observada con FXa y TFPI en ausencia del aptámero. Todos los aptámeros inhiben TFPI , lo que da como resultado un aumento dependiente de la concentración en actividad de FXa en este ensayo.

La Figura 23 es una gráfica que muestra la protección de la actividad de Factor Xa (FXa) mediante ARC19499 a partir de la inhibición de TFPI en un ensayo de actividad de FXa cromogénico.

La Figura 24 es una gráfica que muestra la protección de la FXasa extrínseca por ARC19499 de la inhibición del TFPI en un ensayo cromogénico de la activación del Factor X (FX).

La Figura 25 es una gráfica que muestra la protección del complejo TF: FVI Ia por ARC 19499 de la inhibición del TFPI en un ensayo fluorogénico de la actividad de TF: FVI Ia.

La Figura 26 es una gráfica que muestra el efecto de ARC 19499 en la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en una Proteoma de coagulación sintética normal (SCP).

La Figura 27 es una gráfica que muestra el efecto de ARC19499 en la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en una Proteoma de coagulación sintética de hemofilia A.

La Figura 28 es una gráfica que muestra el efecto de ARC19499 en la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en una Proteoma de coagulación sintética de hemofilia B.

La Figura 29 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones del Factor VI I I (FVI I I) en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en ausencia de ARC1 9499.

La Figura 30 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones del Factor VI I I (FVI I I) en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 1 .0 nM de ARC1 9499.

La Figura 31 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones del Factor VI I I (FVI I I) en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 2.5 nM de ARC19499.

La Figura 32 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones de ARC19499 en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en ausencia del Factor VI II (FVIII).

La Figura 33 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones de ARC1 9499 en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 100% del Factor VI I I (FVI I I).

La Figura 34 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones de ARC19499 en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 2% del Factor VII I (FVI I I).

La Figura 35 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones de ARC1 9499 en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 5% del Factor VI I I (FVI I I).

La Figura 36 es una gráfica que muestra el efecto de concentraciones de ARC19499 en aumento sobre la generación de trombina iniciada por el factor tisular (TF) en presencia de 40% del Factor VI I I (FVI I I).

Las Figuras 37A-E son una serie de gráficas que muestran la actividad de ARC 19499 en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en plasma normal agrupado (PNP) iniciado con 0.1 pM del factor tisular (TF; Figura 37A) o 1 .0 pM de TF (Figura 37B). El potencial de trombina endógena (ETP; Figura 37C) y trombina pico (Figura 37D) mostraron un aumento dependiente de la dosis con concentraciones en aumento de ARC1 9499 en ambas concentraciones de TF. El tiempo de demora (Figura 37E) mostró una disminución dependiente de la dosis con concentraciones en aumento de ARC 1 9499 en ambas concentraciones de TF.

Las Figuras 38A-D son una serie de gráficas que muestran la actividad de ARC 19499 en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en plasma sin TFPI iniciado con 0.01 , 0.1 o 1 .0 pM del factor tisular (TF). La Figura 38A muestra las curvas de generación de trombina en concentraciones de ARC 19499 en aumento con tres concentraciones de TF diferentes. El potencial de trombina endógena (ETP; Figura 38B), trombina pico (Figura 38C) y tiempo de demora (Figura 38D) mostró poco o ningún cambio sobre todas las concentraciones de ARC 19499 analizadas en todas las concentraciones de TF analizadas.

Las Figuras 39A-F es una serie de gráficas que muestran la actividad de ARC19499 en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en plasma normal agrupado (PN P) previamente tratado con un anticuerpo anti-TFPI policlonal neutralizador. El ensayo se inició con 0.01 pM de factor tisular (TF; Figura 39A), 0.1 pM de TF (Figura 39B) o 1 .0 pM de TF (Figura 39C). El potencial de trombina endógena (ETP; Figura 39D), trombina pico (Figura 39E) y tiempo de demora (Figura 39F) permanecieron en gran medida sin cambio en todas las concentraciones de ARC 1 9499 independientes de la concentración de TF.

Las Figuras 40A-E son una serie de gráficas que muestra un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) con ARC 17480 (Figura 40A), ARC1 9498 (Figura 40B) y ARC1 9499 (Figura 40C) en varias concentraciones. El potencial de trombina endógena (ETP; Figura 40D) y trombina pico (Figura 40E) medidos con varias concentraciones de ARC 17480, ARC 1 9498 y ARC 19499 en plasma de hemofilia A eran similares entre sí, con ARC 1 9499 teniendo actividad levemente mayor, alcanzando una meseta de ETP cercana a niveles de plasma normales mediante 30 nM de aptámero. Las curvas de generación de trombina (Figura 40A-C) son datos representativos. Los datos de ETP (Figura 40D) y trombina pico (Figura 40E) representan el error medio ± estándar, n=3.

La Figura 41 es una gráfica de generación de trombina en el plasma normal pobre de plaquetas de un único y saludable voluntario. El plasma se trató con un anticuerpo anti-FVI I I para generar un estado tipo hemofilia A. ARC19499 mostró un aumento dependiente de la dosis en la generación de trombina en el plasma tratado con anticuerpo.

Las Figuras 42A-B son una serie de gráficas que muestran un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) con ARC19499 (Figura 42A), ARC1 7480 (Figura 42B) en varias concentraciones en plasma de hemofilia B.

La Figura 43 es una serie de gráficas que muestra el efecto de ARC19499 (diamantes) y ARC17480 (triángulos) sobre el potencial de trombina endógena (ETP), trombina pico y tiempo de demora en plasma de hemofilia B. La línea sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. La línea sombreada designa el nivel de cada parámetro en plasma normal agrupado (PN P) sin cualquier fármaco adicional. Los datos representan error medio ± estándar, n=3. Ambos aptámeros se comportaron de manera muy similar entre sí en el plasma de hemofilia B.

Las Figuras 44A-C son una serie de gráficas que muestran los efectos de ARC 19499 en comparación con un aptámero de control negativo en la generación de trombina tal como se midió por el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en plasmas de pacientes con hemofilia A (Figura 44A), hemofilia A con inhibidores (Figura 44B) o hemofilia B (Figura 44C). Los resultados se proporcionan en términos de concentración del tiempo de demora (izquierda), potencial de trombina endógena (ETP) (medio) y trombina pico (derecha). En todas las gráficas, las líneas representan la actividad de plasma normal (sólidas) y plasma con insuficiencia de factor (punteadas) en ausencia de aptámero, y las sombras alrededor de las líneas representan el error estándar del medio.

Las Figuras 45A-D describen los resultados de experimentos de generación de trombina con ARC 17480, ARC1 8546, ARC26835 y ARC31 301 en plasma de hemofilia A. Los valores del potencial de trombina endógena ajustada (ETP; Figuras 45A y C) y trombina pico ajustada (Figuras 45B y D) se trazan como una función de la concentración del aptámero. Los valores de ETP y trombina pico para el plasma de hemofilia se restaron de cada valor para dar los valores ajustados. ARC 17480, ARC 1 8546, ARC26835 y ARC31 301 aumentan la generación de trombina en una manera dependiente de la concentración en el plasma de hemofilia A.

Las Figuras 46A-B describen los resultados de experimentos de generación de trombina con ARC 1 7480, ARC19500, ARC19501 , ARC19881 y ARC19882 en plasma de hemofilia A. Los valores del potencial de trombina endógena ajustada (ETP; Figura 46A) y trombina pico ajustada (Figura 46B) se trazan como una función de la concentración del aptámero. Los valores de ETP y trombina pico para el plasma de hemofilia se restaron de cada valor para dar los valores ajustados. ARC 17480, ARC19500, ARC 19501 , ARC 1 9881 y ARC1 9882 aumentan la generación de trombina en una manera dependiente de la concentración en el plasma de hemofilia A.

Las Figuras 47A-C son una serie de gráficas de los experimentos de generación de trombina que muestra el efecto de NovoSeven® (triángulos vacíos) y ARC1 9499 (diamantes rellenos) en el potencial de trombina endógena (ETP; Figura 47A), trombina pico (Figura 47B) y tiempo de demora (Figura 47C) en el plasma normal. La línea negra sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 48A-C son una serie de gráficas de los experimentos de generación de trombina que muestra el efecto de NovoSeven® (triángulos vacíos) y ARC1 9499 (diamantes rellenos) en el potencial de trombina endógena (ETP; Figura 48A), trombina pico (Figura 48B) y tiempo de demora (Figura 48C) en el plasma de hemofilia A. La línea negra sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. La línea punteada designa el nivel de cada parámetro en plasma normal agrupado (PNP) sin cualquier fármaco adicional. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 49A-C son una serie de gráficas de los experimentos de generación de trombina que muestra el efecto de NovoSeven® (triángulos vacíos) y ARC19499 (diamantes rellenos) en el potencial de trombina endógena (ETP; Figura 49A), trombina pico (Figura 49B) y tiempo de demora (Figura 49C) en el plasma del inhibidor de hemofilia A. La línea negra sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. La línea punteada designa el nivel de cada parámetro en plasma normal agrupado (PNP) sin cualquier fármaco adicional. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 50A-C son una serie de gráficas de experimentos que muestra el efecto de NovoSeven® (triángulos vacíos) y ARC19499 (diamantes rellenos) en el valor R (Figura 50A), ángulo (Figura 50B) y amplitud máxima (MA; Figura 50C) en un ensayo de tromboelastografía (TEG®) en sangre cifrada de voluntarios saludables. La línea negra sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 51A-B son una serie de gráficas de experimentos que muestra el efecto de NovoSeven® (triángulos vacíos) y ARC19499 (diamantes rellenos) en el valor R (Figura 51A), ángulo (Figura 51B) y amplitud máxima (MA; Figura 51C) en un ensayo de tromboelastografía (TEG®) en sangre cifrada de voluntarios saludables tratados con un anticuerpo anti-FVIII. La línea negra sólida designa el nivel de cada parámetro en ausencia de cualquier fármaco. La línea punteada designa el nivel de cada parámetro en sangre no tratada con anticuerpo. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 52A-C son una serie de gráficas de experimentos de tromboelastografía que muestra el tiempo de demora (Figura 52A), trombina pico (Figura 52B) y potencial de trombina endógena (ETP; Figura 52C). Cada línea representa la respuesta a la dosis de ARC19499 en presencia de un porcentaje diferente del Factor VI II (diamantes rellenos, 0%; triángulos vacíos, 1 .4%; cuadrados rellenos, 2.5%; triángulos rellenos, 5%; cuadrados vacíos, 14% y círculos rellenos, 140%). La l ínea punteada designa el nivel de cada parámetro en presencia de plasma normal agrupado (PNP) solo. La línea sólida designa el nivel de cada parámetro en plasma de hemofilia A sin ninguna adición. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

Las Figuras 53A-B son una serie de gráficas de experimentos de generación de trombina que demuestra la actividad de ARC 1 9499 en el plasma con varias concentraciones del Factor VI I I (FVI I I). En la Figura 53A, el potencial de trombina endógena (ETP) se traza como una función de la concentración de ARC 19499. Las líneas punteadas representan el ETP después de la adición de diferentes cantidades de FVI I I al plasma de hemofilia A. Las líneas sólidas muestran que ARC19499 aumenta el ETP en el plasma de hemofilia A (línea con triángulos) y plasma de hemofilia A con 5% de FVI I I agregado (línea con diamantes). En la Figura 53B, el ETP se traza contra la concentración de FVI II . Los datos de ETP se muestran con y sin la adición de 300 nM de ARC1 9499.

Las Figuras 54A-B ilustran el diseño experimental del modelo de coagulación espacial. La Figura 54A es un diagrama de la cámara de coagulación espacial. La Figura 54B es una ilustración esquemática de los componentes del sistema para medir el avance del coágulo en la cámara.

Las Figuras 55A-B muestran dos gráficas que ilustran la propagación del coágulo en el modelo de coagulación espacial, tal como se midió por la dispersión de luz, trazado como una función de distancia desde la superficie de activación. La coagulación se activó mediante el factor tisuiar de baja densidad en plasma agrupado normal en ausencia (Figura 55A) y presencia (Figura 55B) de 300 nM de ARC1 9499.

La Figura 56 es una gráfica de tamaño de coágulo contra tiempo, en ausencia (línea negra gruesa) y presencia (línea gris delgada) de 300 nM de ARC 1 9499 en plasma agrupado normal. Los parámetros que se pueden derivar de esta gráfica incluyen tiempo de demora (tiempo hasta que comienza el crecimiento del coágulo), velocidad inicial (a o V¡n¡ci ai ¡ pendiente media durante los primeros 1 0 minutos de crecimiento), velocidad fija (ß o Vf¡ja ; pendiente media durante los próximos 30 minutos de crecimiento) y tamaño del coágulo después de 60 minutos (un parámetro integral de la eficacia de formación del coágulo).

Las Figuras 57A-D son una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 57A), V¡n ¡ c¡ai (Figura 57B), Vfija (Figura 57C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 57D) en plasma agrupado normal, cada uno se trazó como una función de la densidad del factor tisuiar en presencia (círculos) y ausencia (cuadrados) de ARC19499.

Las Figuras 58A-D son una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 58A), Vi n i ciai (Figura 58B), Vf¡j3 (Figura 58C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 58D) en plasma agrupado normal, cada uno se trazó como una función de la concentración de ARC 1 9499 en condiciones de densidad del factor tisular de baja superficie.

Las Figuras 59A-D son una serie de gráficas que ilustra el efecto de ARC 1 9499 en el tiempo de demora (Figura 59A), V¡ n¡c¡ai (Figura 59B), Vfija (Figura 59C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 59D) en plasma agrupado normal en condiciones de densidad del factor tisular de baja superficie. Un asterisco indica una diferencia estadísticamente importante ± ARC19499 (P<0.05).

Las Figuras 60A-D son una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 60A), Vi n¡c¡ai (Figura 60B) , Vf ija (Figura 60C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 60D) en plasma agrupado normal, cada uno se trazó como una función de la concentración de ARC1 9499 en condiciones de la densidad del factor tisular de superficie media.

Las Figuras 61 A-D son una serie de gráficas que ilustra el efecto de ARC1 9499 en el tiempo de demora (Figura 61 A), V¡ n ¡ c¡ ai (Figura 61 B), fija (Figura 61 C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 61 D) en plasma agrupado normal en condiciones de densidad del factor tisular de superficie media. Un asterisco indica una diferencia estadísticamente importante ± ARC1 9499 (P<0.05).

Las Figuras 62A-C comparan la propagación del coágulo en plasma agrupado normal (Figura 62A) a plasma agrupado normal que contiene 100 nM de ARC1 9499 (Figura 62B) o 1 00 nM del factor Vl la recombinante (rVl la o Novoseven®; Figura 62C) en condiciones de la densidad del factor tisular de baja superficie.

La Figura 63 es una ilustración que muestra una serie de imágenes de dispersión de luz del modelo de coagulación espacial. Cada fila describe la propagación del coágulo desde una superficie (inferior) durante el tiempo de 0, 1 0, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos. La fila superior muestra la propagación del coágulo en plasma de hemofilia A grave, seguido de plasma de hemofilia A grave que contiene 100 nM de ARC19499 en la segunda fila y plasma de hemofilia A grave que contiene 1 00 nM del factor Vl la recombinante (rVl la) en la tercera fila.

La Figura 64 es una gráfica del tamaño de coágulo contra tiempo, en plasma normal (línea punteada, verde oscuro), plasma de hemofilia A grave (línea sólida, negra), plasma de hemofilia A grave que contiene 100 nM de ARC19499 (línea sólida, verde claro) o 1 00 nM del factor Vl la recombinante (rVl la) (línea punteada, verde claro) .

La Figura 65 es una tabla que resume la demografía de pacientes con hemofilia A a partir de los cuales se tomaron las muestras de plasma para experimentos de formación de coágulos espaciales.

Las Figuras 66A-D muestran los efectos de ARC 19499 o factor Vl la recombinante (rVlla), titulado en plasma de hemofilia A grave del Paciente 1 , sobre la formación del coágulo espacial activado con densidad del factor tisular de baja superficie. Los efectos de ARC19499 y rVlla sobre el tiempo de demora se describen en las Figuras 66A y B, respectivamente, en tanto los efectos de ARC 19499 y rVl la sobre Vl n i ci ai se describen en las Figuras 66C y D, respectivamente.

Las Figuras 67A-D muestran los efectos de ARC 19499 o factor Vl la recombinante (rVl la), titulado en plasma de hemofilia A grave del Paciente 2, sobre la formación del coágulo espacial activado con densidad del factor tisular de baja superficie. Los efectos de ARC1 9499 y rVl la sobre el tiempo de demora se describen en las Figuras 67A y B, respectivamente, en tanto los efectos de ARC 19499 y rVl la sobre V¡n¡c¡ai se describen en las Figuras 67C y D, respectivamente.

Las Figuras 68A-D muestran los efectos de ARC1 9499 o factor Vl la recombinante (rVl la), titulado en plasma de hemofilia A grave del Paciente 3, sobre la formación del coágulo espacial activado con densidad del factor tisular de baja superficie. Los efectos de ARC1 9499 y rVl la sobre el tiempo de demora se describen en las Figuras 68A y B, respectivamente, en tanto los efectos de ARC 19499 y rVl la sobre Vi n ici ai se describen en las Figuras 68C y D, respectivamente.

La Figura 69 muestra los efectos de ARC 1 9499 (símbolos negros) o factor Vl la recombinante (rVl la; símbolos grises) sobre Vfija en muestras de plasma de hemofilia A de los Pacientes 1 -3, activados con densidad del factor tisular de baja superficie.

Las Figuras 70A-B muestran los efectos de ARC1 9499 (Figura 70A) o factor Vl la recombinante (rVl la; Figura 70B) sobre tamaño del coágulo a los 60 minutos en muestras de plasma de hemofilia A de los Pacientes 1 -3, activados con densidad del factor tisular de baja superficie.

Las Figuras 71 A-D son una serie de gráficas que ilustra el efecto de 300 nM de ARC19499 en el tiempo de demora promedio (Figura 71 A), Viniciai (Figura 71 B), Vf¡ja (Figura 71 C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 71D) en plasma de hemofilia A con densidad del factor tisular de baja superficie (n=3). Un asterisco indica una diferencia estadísticamente importante ± ARC19499 (P<0.05).

Las Figuras 72A-D son una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 72A), ViniCiai (Figura 72B), Vfija (Figura 72C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 72D) en plasma de hemofilia A del Paciente 4 activado con densidad del factor tisular de superficie media. Cada parámetro se traza como una función de ARC19499 (cuadrados) o factor VI I a recombinante (rVlla; círculos).

Las Figuras 73A-D son una serie de gráficas que muestran el tiempo de demora (Figura 73A), V¡„¡c¡ai (Figura 73B), Vfija (Figura 73C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 73D) en plasma de hemofilia A del Paciente 5 activado con densidad del factor tisular de superficie media. Cada parámetro se traza como una función de ARC19499 (cuadrados) o factor VI la recombinante (rVlla; círculos).

Las Figuras 74A-D son una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 74A), Viniciai (Figura 74B), Vfija (Figura 74C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 74D) en plasma de hemofilia A del Paciente 6 activado con densidad del factor tisular de superficie media. Cada parámetro se traza como una función de ARC19499 (cuadrados) o factor VI I a recombinante (rVlla; círculos).

Las Figuras 75A-D es una serie de gráficas que ilustra el efecto de 300 nM de ARC19499 en el tiempo de demora promedio (Figura 75A), Vjniciai (Figura 75B), Vf¡ja (Figura 75C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 75D) en plasma de hemofilia A con densidad del factor tisular de superficie media (n=3).

La Figuras 76A-D son una serie de gráficas que muestran el tiempo de demora (Figura 76A), Vi nic¡ai (Figura 76B), Vfija (Figura 76C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 76D) en plasma normal en comparación con el plasma de hemofilia A o plasma de hemofilia A que contiene 300 nM de ARC19499, activado con densidad del factor tisular de baja superficie.

La Figura 77 es una gráfica de barras que ilustra la eficacia de ARC19499 en la promoción de la propagación del coágulo en plasma normal (barras sólidas) contra plasma de hemofilia A (barras sombreadas) como se reflejó en el tiempo de demora (blanco), V¡n ic¡ai (verde claro), Vfija (gris medio) y tamaño del coágulo después de 60 minutos (negro). La eficacia se define como la proporción del parámetro determinado en presencia de 300 nM de ARC1 9499 al parámetro en ausencia de ARC 19499.

Las Figuras 78A-B ilustra la dependencia de concentración del tiempo de demora (Figura 78A) y tamaño del coágulo a los 60 minutos (Figura 78B) sobre ARC 19499 en plasma de hemofilia A activado con la densidad del factor tisular de baja superficie. Estos datos se usaron para calcular los valores de IC5o mostrados en la tabla a continuación de las gráficas.

Las Figuras 79A-D es una serie de gráficas que muestra el tiempo de demora (Figura 79A), V¡n ¡c¡ai (Figura 79B), Vf¡i a (Figura 79C) y tiempo de coagulación después de 60 minutos (Figura 79D) en plasma de hemofilia A solo en comparación con el plasma de hemofilia A que contiene 300 nM de ARC1 9499 o 300 nM de factor Vlla recombinante (rVl la), activado con densidad del factor tisular de baja superficie.

Las Figuras 80A-B compara el tiempo de demora (Figura 80A) y iniciai (Figura 80B) en plasma sin TFPI activado con densidad del factor tisular de baja superficie. Cada gráfica muestra los parámetros medidos en plasma sin TFPI solo ("PBS"), plasma sin TFPI complementado con ±10 nM de TFPI recombinante ("TFPI"), plasma sin TFPI que contiene 300 nM de ARC1 9499 ("ARC") y plasma sin TFPI complementado con 1 0 nM de TFPI recombinante y 300 nM de ARC19499 ("ARC+TFPI").

La Figura 81 es una serie de tablas que muestra los efectos de ARC1 9499 en el ensayo de tiempo de coagulación activado por TF (TF-ACT) en muestras de sangre a partir de individuos normales con hemofilia A grave y hemofilia B grave.

La Figura 82 es una serie de tablas que muestra los efectos de ARC1 9499 en el ensayo de tiempo de protombrina diluida (dPT) en muestras de plasma a partir de individuos normales con hemofilia A grave y hemofilia B grave.

La Figura 83 muestra el efecto de concentraciones de ARC 19499 diferentes en parámetros ROTEM en muestras de sangre (sin inhibidor de tripsina de maíz (CTI)) a partir de pacientes con hemofilia (cuadrados rellenos) y controles saludables (círculos vacíos). Se analizaron los siguientes parámetros: el tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación del coágulo (CFT), la máxima firmeza del coágulo (MCF) y el ángulo alfa (alfa).

La Figura 84 muestra el efecto de concentraciones de ARC 19499 diferentes en el tiempo de coagulación (CT) en muestras de sangre a partir de controles saludables (círculos vacíos) en comparación con pacientes con hemofilia A estratificados de acuerdo con el nivel de FVI I I : <1 % (cuadrados rellenos), 1 -5% (triángulos invertidos y rellenos), >5% (triángulos rellenos). La región sombreada indica el intervalo en controles saludables.

La Figura 85 muestra el efecto de concentraciones de ARC 19499 diferentes en parámetros ROTEM en muestras de sangre (con inhibidor de tripsina de maíz (CTI)) a partir de pacientes con hemofilia (cuadrados rellenos) y controles saludables (círculos vacíos). Se analizaron los siguientes parámetros: el tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación del coágulo (CFT), la máxima firmeza del coágulo (MCF) y el ángulo alfa (alfa).

La Figura 86 muestra el efecto de las concentraciones de ARC19499 diferentes sobre los parámetros ROTEM en muestras de sangre a partir de un único paciente con hemofilia A adquirida. Se analizaron los siguientes parámetros: el tiempo de coagulación (CT), el tiempo de formación del coágulo (CFT), la máxima firmeza del coágulo (MCF) y el ángulo alfa (alfa).

La Figura 87 muestra los parámetros ROTEM para sangre de control saludable preincubada con un anticuerpo FVI I I neutralizador. Las gráficas muestran el tiempo de coagulación (CT) (panel izquierdo) y tiempo de formación del coágulo (CFT) (panel derecho) en los mismos controles; en el lado izquierdo de cada párrafo se describen los valores después de la inhibición por un anticuerpo FVI I I.

La Figura 88 muestra las curvas de generación de trombina a partir del ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en el plasma de un paciente con hemofilia A grave (panel izquierdo) representativo y un control saludable (panel derecho). Ambas gráficas muestran los resultados en presencia (círculos vacíos) y ausencia (cuadrados rellenos) de 200 nM de ARC1 9499.

La Figura 89 muestra gráficos de parámetros de trombograma automatizado calibrado (CAT) contra la concentración de ARC1 9499, incluyendo el potencial de trombina endógena (ETP), tiempo de pico, concentración de trombina pico y extremo de comienzo. En cada gráfica, la respuesta a ARC19499 en el plasma de pacientes con hemofilia (cuadrados rellenos) se compara con controles saludables (círculo vacíos).

La Figura 90 es un gráfico de tiempo de demora de trombograma automatizado calibrado (CAT) contra la concentración de ARC1 9499, en comparación con la respuesta en pacientes con hemofilia (cuadrados rellenos) a controles saludables (círculos vacíos).

La Figura 91 muestra el efecto de concentraciones de ARC 19499 diferentes en la trombina pico en muestras de plasma a partir de controles saludables (círculos vacíos) en comparación con pacientes con hemofilia A estratificados de acuerdo con el nivel de FVI I I: <1 % (cuadrados rellenos), 1 -5% (triángulos invertidos y rellenos), >5% (triángulos rellenos). La región sombreada indica el intervalo observado en controles saludables.

La Figura 92 muestra las curvas de generación de trombina en el plasma de un único paciente con hemofilia A adquirida que contiene 0 nM (cuadrados rellenos) 2 nM (asteriscos), 20 nM (círculos vacíos) o 200 nM (estrellas rellenas) de ARC1 9499.

La Figura 93 muestra parámetros de trombina automatizada calibrada (CAT) para plasma de control saludable preincubado con un anticuerpo de FVI I I neutralizador. Las gráficas muestran el potencial de trombina endógena (ETP) (panel izquierdo) y trombina pico (panel derecho) en los mismos controles; en el lado izquierdo de cada gráfica se describen los valores después de la inhibición por un anticuerpo FVI I I.

La Figura 94 muestra datos representativos de trombograma automatizado calibrado (CAT) de un voluntario saludable (ARC HV 01 ).

La Figura 95 muestra datos representativos de trombograma automatizado calibrado (CAT) de un paciente con hemofilia A grave (ARC SHA 05).

La Figura 96 muestra datos representativos de trombograma automatizado calibrado (CAT) de un paciente con hemofilia A moderada (ARC MoHA 01 ).

La Figura 97 muestra datos representativos de trombograma automatizado calibrado (CAT) de un paciente con hemofilia A leve (ARC MiHA 03).

La Figura 98 es una serie de gráficas que describe parámetros medios de trombograma automatizado calibrado (CAT), (potencial de trombina endógena (ETP), trombina pico, tiempo de demora y tiempo para pico), medidos en muestras de plasma frescas de pacientes con hemofilia A grave (diamantes vacíos), hemofilia A moderada (cuadrados vacíos), hemofilia A leve (triángulos vacíos) o hemofilia B grave (triángulos rellenos) en comparación con controles saludables (círculos rellenos).

La Figura 99 es una serie de gráficas que describe parámetros medios de trombograma automatizado calibrado (CAT), (potencial de trombina endógena (ETP), trombina pico, tiempo de demora y tiempo para pico), medidos en muestras de plasma congeladas/descongeladas de pacientes con hemofilia A grave (diamantes vacíos), hemofilia A moderada (cuadrados vacíos), hemofilia A leve (triángulos vacíos) o hemofilia B grave (triángulos rellenos) en comparación con controles saludables (círculos rellenos).

La Figura 100 muestra datos representativos de tromboelastografía de sangre (TEG®) de un voluntario saludable (ARC HV 01 ).

La Figura 101 muestra datos representativos de tromboelastografía de sangre (TEG®) de un paciente con hemofilia A grave (ARC SHA 02).

La Figura 1 02 muestra datos representativos de tromboelastografía de sangre (TEG®) de un paciente con hemofilia A moderada (ARC MoHA 01 ).

La Figura 103 muestra datos representativos de tromboelastografía de sangre (TEG®) de un paciente con hemofilia A leve (ARC MiHA 01 ).

La Figura 1 04 es una serie de gráficas que describe parámetros medios de tromboelastrografía (TEG ) , (tiempo R, K y ángulo), medidos en muestras de sangre de pacientes con hemofilia A grave (diamantes vacíos), hemofilia A moderada (cuadrados vacíos), hemofilia A leve (triángulos vacíos) o hemofilia B grave (triángulos rellenos) en comparación con controles saludables (círculos rellenos).

La Figura 105 muestra datos representativos de tromboelastografía de plasma (TEG®) de un paciente con hemofilia A grave (ARC SHA 02).

La Figura 106 muestra datos representativos de tromboelastografía de plasma (TEG®) de un paciente con hemofilia A moderada (ARC oHA 01 ).

La Figura 107 muestra datos representativos de tromboelastografía de plasma (TEG®) de un paciente con hemofilia A leve (ARC MiHA 03).

La Figura 1 08 es una serie de gráficas que describe parámetros medios de tromboelastrografía (TEG®), (tiempo R, K y ángulo), medidos en muestras de plasma de pacientes con hemofilia A grave (diamantes vacíos), hemofilia A moderada (cuadrados vacíos), hemofilia A leve (triángulos vacíos) o hemofilia B grave (triángulos rellenos) en comparación con controles saludables (círculos rellenos).

Las Figuras 1 09A-C son una serie de gráficas que muestran que la actividad de ARC1 9499 se puede invertir. ARC 19499 (línea punteada) mejoró la generación de trombina en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) en comparación con el plasma de hemofilia A solo (línea sólida), como se midió mediante el potencial de trombina endógena (ETP; Figura 1 09A) y trombina pico (Figura 109B). La adición de ARC23085 (diamantes rellenos), ARC23087 (triángulos vacíos), ARC23088 (cuadrados rellenos) y ARC23089 (triángulos rellenos) puede invertir esta mejora en concentraciones >100 nM, alcanzando niveles similares a la ausencia de ARC1 9499. En la Figura 109C, los valores R del ensayo de tromboelastografía (TEG®) mostraron que 500 nM de ARC19499 acortan el valor R que se prolonga en el plasma de hemofilia A. 1 µ? de ARC23085 invirtió parcialmente esta mejora con y sin una preincubación de 5 minutos a 37 °C. ARC23087 invirtió la mejora con la adición de una preincubación de 5 minutos a 37 °C. ARC23088 mostró poca inversión en cualquiera de las condiciones. ARC23089 también invirtió la mejora de ARC 19499 con una preincubación de 5 minutos a 37 °C.

Las Figuras 1 1 0A-G son una serie de curvas de generación de trombina a partir del ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) que muestra la actividad de ARC 1 9499 en el plasma de hemofilia A en presencia de 0.00 (Figura 1 10A), 0.1 56 (Figura 1 1 0B), 0.312 (Figura 1 10C), 0.625 (Figura 1 10D), 1 .25 (Figura 1 1 0E), 2.50 (Figura 1 10F) o 5.00 l U/mL (Figura 1 10G) de heparina de bajo peso molecular (LMWH).

Las Figuras 1 1 1 A-B son una serie de gráficas que muestran que el potencial de trombina endógena (ETP; (Figura 1 1 1 A) y trombina pico (Figura 1 1 1 B) de ensayos de trombograma automático calibrado (CAT) realizados en plasma de hemofilia A con concentraciones cada vez mayores de ARC 1 9499 y LMWH. La concentración de LMWH se indica en el eje x en unidades de l U/mL En dosis terapéuticas de LMWH (=1 .25 l U/mL), la actividad procoagulante de ARC 19499 se invirtió.

Las Figuras 1 12A-B son una serie de gráficas que muestran que el potencial de trombina endógena (ETP; (Figura 1 12A) y trombina pico (Figura 1 12B) de ensayos de trombograma automático calibrado (CAT) realizados en plasma de hemofilia A con concentraciones cada vez mayores de ARC 19499 y LMWH. La concentración de LMWH se indica en el eje x en unidades de µ? . Los datos en estas gráficas se analizaron por ajuste de curva para generar estimados de IC50 de LMWH en presencia de diversas concentraciones de ARC19499. Los valores IC50 se pueden encontrar en la tabla debajo de las gráficas.

Las Figuras 1 13A-F son una serie de gráficas que muestran la estabilidad in vitro de diversos aptámeros de TFPI en suero. La estabilidad de ARC 19498 (Figura 1 1 3A), ARC 19499 (Figura 1 1 3B), ARC19500 (Figura 1 1 3C), ARC19501 (Figura 1 1 3D), ARC19881 (Figura 1 13E) y ARC 1 9882 (Figura 1 1 3F) en suero de humanos, monos y ratas se midió durante el transcurso de 72 horas.

La Figura 1 14 es una gráfica del ensayo de tromboelastografía (TEG®) donde el plasma de los monos cinomólogos que se habían tratado previamente con un anticuerpo FVI I I antihumano se mezcló con concentraciones cada vez mayores de ARC19499 y se analizaron para detectar la actividad . La línea sólida representa el plasma de monos no tratados y la línea punteada representa el plasma de monos tratados con anticuerpo, ambos en ausencia del aptámero. Los datos representan el error medio ± estándar, donde las áreas sombreadas representan el error estándar de las muestra de no aptámero.

La Figura 1 15 es una gráfica que muestra que sin importar el tratamiento luego de la inyección de anticuerpo Factor VI I I en los monos cinomólogos, la actividad del Factor VII I disminuyó a < 1 % y permaneció allí por la duración del estudio (5.5 horas). Los datos representan error medio ± estándar, n=3-6.

La Figura 1 16 es una serie de gráficas que muestran los tiempos de protrombina (PT) y tromboplastina activada parcial (aPTT) antes y después del tratamiento con ARC 1 9499 en monos cinomólogos.

Las Figuras 1 17A-C son una serie de gráficas del análisis de tromboelastografía (TEG®) que muestra que los valores R (Figura 1 17A), una medición de tiempo de coagulación; ángulos (Figura 1 17B), una medición de tasa de formación de coágulos y amplitudes máximas (MA; Figura 1 1 7C) , una medición de fuerza de coagulación se determinaron en monos tratados con solución salina (triángulos rellenos), NovoSeven® (x) , 600 de g/kg ARC 19499 (cuadrados vacíos), 300 de pg/kg ARC1 9499 (triángulos vacíos) o 1 00 de pg/kg ARC 1 9499 (diamantes vacíos). El transcurso del tiempo del estudio se indica en el eje x. Los datos representan error medio ± estándar, n=3-6.

Las Figuras 1 18A-C son una serie de gráficas del análisis de tromboelastografía (TEG®) que muestra que los valores R (Figura 1 1 8A), una medición de tiempo de coagulación; ángulos (Figura 1 18B), una medición de tasa de formación de coágulos y amplitud máxima (MA: Figura 1 18C), una medición de fuerza de coagulación se determinaron en monos adicionales tratados con NovoSeven® (*) o 300 de pg/kg ARC 19499 (triángulos) durante un período de tiempo más largo que en las Figuras 1 1 7A-C. El transcurso del tiempo del estudio se indica en el eje x. Los datos representan el error medio ± estándar, n=5 para el tratamiento con NovoSeven® y n=6 para el tratamiento con ARC19499.

La Figura 1 19 es una gráfica que muestra los niveles TFPI en monos cinomologos luego de una dosis intravenosa de 20 mg/kg (IV, sólido) o subcutánea (SC, sombreado) de ARC 19499 en nM en el eje y. El transcurso del tiempo se indica en el eje x. El patrón de liberación TFPI fue muy similar tanto para dosificaciones IV y SC. Los datos representan error medio ± estándar, n=3.

La Figura 1 20 muestra el cronograma para la evaluación de tiempo de sangrado y anticuerpo FVI I I relacionado y dosificación de ARC 1 9499 y muestro de sangre en el modelo de sangrado de primate no humano (NHP).

Las Figuras 121 A-D son una serie de gráficas que muestran los niveles de actividad de FVI I I en muestras de plasma de distintos grupos de dosificación de monos cinomologos tratados con anticuerpo FVIII y ARC1 9499: El Grupo 1 , monos cuyos tiempo de sangrado se corrigieron con una dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Figura 121 A) ; el Grupo 2, monos cuyos tiempos de sangrado se corrigieron con dos dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Figura 121 B) ; el Grupo 3, los monos cuyos tiempos de sangrado se corrigieron con tres dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Figura 121 C); y el Grupo 4, monos cuyos tiempos de sangrado no se corrigieron con tres dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 (Figura 121 D).

Las Figuras 122A-B muestran los tiempos de sangrado de un grupo promedio para monos del Grupo 1 en segundos (Figura 122A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 122B).

Las Figuras 123A-B muestran los tiempos de sangrado individuales del Grupo 1 en segundos (Figura 123A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 123B).

Las Figuras 1 24A-B muestran los tiempos de sangrado de un grupo promedio para monos del Grupo 2 en segundos (Figura 124A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 1 24B).

Las Figuras 125A-B muestran los tiempos de sangrado individuales del Grupo 2 en segundos (Figura 125A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 125B).

Las Figuras 126A-B muestran los tiempos de sangrado de monos del Grupo 3 en segundos (Figura 126A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 1 26B).

Las Figuras 127A-B muestran los tiempos de sangrado de monos del Grupo 4 en segundos (Figura 127A) y en términos de % de tiempo de sangrado de referencia (Figura 127B).

La Figura 128 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre grupo promedio en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 1 . El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y el tiempo de dosificación de ARC1 9499 se indica con un asterisco (*).

La Figura 129 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 1 . El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y el tiempo de dosificación de ARC 1 9499 se indica con un asterisco (*).

La Figura 1 30 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre grupo promedio en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 2. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC19499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 1 31 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 2. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VII I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 1 32 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 3. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VII I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 133 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de sangre individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 4. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC 1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 134 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma de grupo promedio en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 1 . El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y el tiempo de dosificación de ARC 19499 se indica con un asterisco (*).

La Figura 135 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 1 . El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y el tiempo de dosificación de ARC 1 9499 se indica con un asterisco (*).

La Figura 136 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma de grupo promedio en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 2. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC 1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 1 37 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 2. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VII I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 1 38 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 3. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VI I I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC 1 9499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 139 es una gráfica de valores R de tromboelastografía (TEG®) de plasma individual en comparación con el punto de tiempo de muestreo para monos del Grupo 4. El tiempo de dosificación del anticuerpo anti factor VII I se indica con un signo de más (+) y los tiempos de dosificación de ARC 19499 se indican con asteriscos (*).

La Figura 140 describe derivados de ARC 1 7480 que contienen 2' sustituciones simples y múltiples en la secuencia ARC17480. Se sombrean las diferencias con relación a ARC 1 7480.

La Figura 141 describe derivados de ARC 17480 que contienen una sustitución simple de fosforotioato entre cada par de residuos en la secuencia ARC 17480. Cada fosforotioato se indica con una "s" entre los pares de residuos en la secuencia. Se sombrean las diferencias con relación a ARC 17480.

La Figura 142A describe 2' sustituciones toleradas y no toleradas mapeadas en la estructura secundaria supuesta de ARC 1 7480. La Figura 142B describe los derivados de ARC17480 activo con sustistituciones 2'-desoxi a 2'-0 Metil y/o sustituciones 2'-fluoro en los cuatro residuos de desoxicitidina de ARC17480 (residuos 9, 14, 16 y 25).

La Figura 143 ilustra derivados de ARC1 7480 que contienen eliminaciones simples o múltiples en la secuencia de ARC17480 Las diferencias con respecto a ARC1 7480 se resaltan en negro.

La Figura 144A ilustra las eliminaciones de residuos simples tolerados y no tolerados mapeados en la supuesta estructura secundaria de ARC17480. ARC17480 está comprendido de nucleótidos 2'-0 Metilo (círculos) y 2'-desoxi (cuadrados) y se modifica en su extremo 3' con un residuo de desoxitimidina invertido (3T). La eliminación de residuo doble correspondiente se describe también en casos donde dos nucleótidos adyacentes eran idénticos. Las eliminaciones toleradas se resaltan en gris y las eliminaciones no toleradas se resaltan en negro. Se indican eliminaciones dobles toleradas y no toleradas. La Figura 144B describe derivados de ARC 17480 activo ARC33889 y ARC33895. Cada una de estas moléculas tiene siete de los residuos ARC1 7480 eliminados que se representan con círculos negros.

Las Figuras 145A-B describen los resultados de un experimento de creación de trombina con derivados de ARC 1 9499 3' truncado. ARC19499, ARC21 383, ARC21385, ARC21 387 y ARC21389 todos aumentan la creación de trombina de forma dependiente de la concentración en plasma de hemofilia A, tal como se mide con el potencial de trom bina endógena (ETP; Figura 145A) y trombina pico (Figura 145B).

Descripción detallada de la invención Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en la descripción adjunta a continuación. Si bien en la práctica o análisis de la invención se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, los métodos, dispositivos y materiales preferidos se describen ahora. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción. En la descripción , la forma singular incluye el plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción.

La invención proporciona aptámeros que se unen al TFPI , que se describen en la presente como "aptámeros de TFPI", y métodos para usar dichos aptámeros en el tratamiento de trastornos hemorrágicos y otras patologías, enfermedades o trastornos mediados por TFPI , con o sin otros agentes. Además, los aptámeros de TFPI se pueden usar antes, durante y/o después de procedimientos médicos, con o sin otros agentes, para reducir o, de otro modo, retrasar el avance de las complicaciones o efectos colaterales de los mismos.

Identificación de aptámeros Los aptámeros descritos en la presente se identifican preferentemente a través de un método conocido en la técnica como evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial, o SELEX™, que se muestra generalmente en la Figura 4. Más específicamente, comenzar con una mezcla que contiene un grupo de partida de ácidos nucleicos, el método SELEX™ incluye los pasos de: (a) poner en contacto la mezcla con un objetivo en condiciones favorables para la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron al objetivo; (c) amplifica los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para proporcionar aptámeros altamente específicos, de alta afinidad al objetivo. En aquellas instancias donde se están seleccionando los aptámeros transcritos, tales como aptámeros de RNA, el paso de amplificación del método SELEX™ incluye los pasos de: (i) transcripción inversa de ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-objetivo o de otra manera la transmisión de información de secuencia en una secuencia de DNA correspondiente; (ii) amplificación de PCR y (iii) transcripción de ácidos nucleicos amplificados por PCR o de otra manera la transmisión de información de secuencia en una secuencia de RNA correspondiente antes de recomenzar el proceso. El grupo de partida de ácidos nucleicos pueden ser DNA, RNA o híbridos de DNA/RNA modificados o no modificados y las modificaciones aceptables incluyen modificaciones en una base, azúcar y/o unión internucleótida. La composición del grupo de partida depende de las propiedades deseadas del aptámero final. Las selecciones se pueden llevar a cabo con secuencias de ácido nucleico incorporando nucleótidos modificados para, por ej. , estabilizar los aptámeros contra la degradación in vivo. Por ejemplo, la resistencia a la degradación de nucleasa se puede aumentar en gran medida mediante la incorporación de grupos de modificación en la posición 2'.

En una modalidad, la invención proporciona aptámeros que incluyen sustituyentes 2' simples en todas las bases o combinaciones de modificaciones 2'-OH , 2'-F, 2'-desoxi, 2'-NH2 y 2'-OMe de los nucleótidos de trifosfato de adenosina (ATP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de citidina (CTP), trifosfato de timidina (TTP) y trifosfato de uridina (UTP). En otra modalidad, la invención proporciona aptámeros que incluyen combinaciones de modificaciones 2'-OH, 2'-F, 2'-desox¡, 2'-O e, 2'-NH2 y 2'-metoxiet¡lo de los nucleótidos de ATP; GTP, CTP, TTP y UTP. En una modalidad adicional, la invención proporciona aptámeros que incluyen todos o sustancialmente todos los nucleótidos de ATP, GTP, CTP, TTP y/o UTP modificados 2'-OMe.

En algunas modalidades, los aptámeros modificados por 2' de la invención se crean usando polimerasas modificadas, por ej . , un RIMA-polimerasa modificado que tiene una tasa de incorporación de nucleótidos modificados que tienen sustituyentes voluminosos en la posición 2' de furanosa que es mayor a la de las polimerasas de tipo salvaje. En una modalidad, el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 muíante en la cual la tirosina en la posición 639 se cambió a fenilalanina (Y639F). En oíra modalidad, el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 muíaníe en la cual la tirosina en la posición 639 se cambió a fenilalanina y la Usina en la posición 378 se cambió a arginina (Y639F/K378R). En aún oíra modalidad, el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 muíante en la cual la tirosina en la posición 639 se cambió a fenilalanina, la histidina en la posición 784 se cambió a una alanina y la lisina en la posición 378 se cambió a arginina (Y639F/H784A/K378R) , y la mezcla de reacción de transcripción requiere una adición de 2'-OH GTP para la transcripción. En una modalidad adicional, el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 mutaníe en la cual la lirosina en la posición 639 se cambió a fenilalanina y la histidina en la posición 784 se cambió a alanina (Y639F/H784A).

En una modalidad , el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 mutante en la cual la tirosina en la posición 639 se cambió a leucina (Y639L). En otra modalidad, el RNA-polimerasa modificado es una polimerasa T7 mutante en la cual la tirosina en léi posición 639 se cambió a leucina y la histidina en la posición 784 se cambió a alanina (Y639L/H784A). En aún otra modalidad , el RNA -polimerasa modificado es una polimerasa T7 mutante en la cual la tirosina en la posición 639 se cambió a leucina, la histidina en la posición 784 se cambió a alanina y la Usina en la posición 378 se cambió a arginina (Y639L/H784A/K378R).

Otra polimerasa de RNA adecuada que tiene una velocidad de incorporación de nucleotidos modificados que tienen sustituyentes; voluminosos en la posición 2' furanosa que es mayor a los de las; polimerasas de tipo salvaje es, por ejemplo, una polimerasa de RNA T mutante. En una modalidad , el RNA-polimerasa T3 mutante tiene una mutación en la posición 640, donde la tirosina en la posición 640 se: remplaza con una fenilalanina (Y640F). En otra modalidad, el RNA-polimerasa T3 mutante tiene mutaciones en las posiciones 640 y 785, donde la tirosina en la posición 640 se remplaza con una leucina y la histidina en la posición 785 se remplaza con una alanina (Y640L/H785A).

Los oligonucleótidos modificados en 2' se pueden sintetizar completamente de nucleotidos modificados o con un subconjunto de nucleótidos modificados. Las modificaciones pueden ser las mismas o diferentes. Se pueden modificar algunos o todos los nucleótidos y aquellos que se modifican pueden contener la misma modificación. Por ejemplo, todos los nucleótidos que contienen la misma base pueden tener un tipo de modificación, en tanto los nucleótidos que contienen otras bases pueden tener diferentes tipos de modificación . Todos los. nucleótidos de purina pueden tener un tipo de modificación (o no están modificados), en tanto todos los nucleótidos de pirimidina pueden tener otro tipo diverso de modificación (o no están modificados). En este sentido, las transcripciones o grupos de transcripciones se generan usando cualquier combinación de modificaciones, incluyendo, por ejemplo, ribonucleótidos (2'-OH), desoxirribonucleótidos (2'-desoxi), nucleótidos 2'-amino (2'-NH2), nucleótidos 2'-fluoro (2'-F) y nucleótidos 2'-0-metilo (2'-OMe).

Tal como se usa en la presente, una mezcla de transcripción que contiene solamente 2'-OMe A, G, C y U y/o T trifosfatos (2'-OMe ATP, 2'-OMe UTP y/o 2"-OMe TTP, 2'-OMe CTP y 2'-OMe GTP) se refiere a una mezcla MNA o mRmY y aptámeros seleccionados de de la misma se refieren a aptámeros MNA o aptámeros mRmY y contienen solo nucleótidos 2'-0-metilo. Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe C y U y/o T, y 2'-OH A y G se conoce como una mezcla de "rRmY" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rRmY". Una mezcla de transcripción que contiene desoxi A y G, y 2'-OMe U y/o T, y C se conoce como una mezcla de "dRmY" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "dRmY". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, C y U y/o T, y 2'-OH G se conoce como una mezcla de "rGmH" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rGmH".

Una mezcla de transcripción que contiene alternativamente 2'-OMe A, C y U y/o T y G, y 2'-OMe A, U y/o T, y C, y 2'-F G se conoce como una "mezcla alternativa" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "mezcla alternativa". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OH A y G, y 2'-F C y U y/o T se conoce como una mezcla de "rFrY" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rFrY". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A y G, y 2'-F C y U y/o T se conoce como una mezcla de "mRfY" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "mRfY". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, U y/o T, y C, y 2'-F G se conoce como una mezcla de "fGmH" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "fGmH". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, U y/o T, C y G, donde hasta 1 0% de las G son ribonucleótidos se conoce como una mezcla de "r/mGmH" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "r/mGmH". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, U y/o T, y C, y dedoxi G se conoce como una mezcla de "dGmH" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "dGmH". Una mezcla de transcripción que contiene desoxi A, y 2'-OMe C, G y U y/o T se conoce como una mezcla de "dAmB" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "dAmB". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OH A, y 2'-OMe C, G y U y/o T se conoce como una mezcla de "rAmB" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rAmB".

Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OH A y 2'-OH G, y 2' -desoxi C y 2'-desoxi T se conoce como una mezcla de "rRdY" y los: aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rRdY". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, U y/o T, y G, y desoxi C se conoce como una mezcla de "dCmD" y los aptámeros; seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "dCmD".. Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, G y C, y desoxi T se conoce como una mezcla de "dTmV" y los aptámeros seleccionados; de los mismos se conocen como aptámeros de "dTmV". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, C y G, y 2'-OH U se conoce como una mezcla de "rUmV" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rUmV". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-OMe A, C y G, y 2'- desoxi U se conoce como una mezcla de "dUmV" y los aptámeros seleccionados de los m ismos se conocen como aptámeros de "dUmV". Una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos 2'-OH se conoce como una mezcla de "rN" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "rN", "rRrY" o RNA. Una mezcla de transcripción que contiene todos los nucleótidos desoxi se conoce como una mezcla de "dN" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "dN", "dRdY" o DNA. Una mezcla de transcripción que contiene 2'-F C y 2'-OMe A, G y U y/o T se conoce como una mezcla de "fCmD" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "fCmD". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-F U y 2'-OMe A, G y C se conoce como una mezcla de "fUmV" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "fUmV". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-F A y G, y 2'-OMe C y U y/o T se conoce como una mezcla de "fRmY" y los aptámeros seleccionados: de los mismos se conocen como aptámeros de "fRmY". Una mezcla de transcripción que contiene 2'-F A y 2'-OMe C, G y U y/o T se conoce como una mezcla de "fAmB" y los aptámeros seleccionados de los mismos se conocen como aptámeros de "fAmB".

Se determinó una cantidad de factores útiles para optimizar las. condiciones de transcripción usadas para producir los aptámeros; descritos en la presente. Por ejemplo, se puede incorporar una secuencia líder en la secuencia fija en el extremo 5' de una plantilla de transcripción de DNA. La secuencia líder tiene típicamente 6-1 5 nucleótidos de longitud, por ej. , 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 1 , 12, 13, 14 o 1 5 nucleótidos de longitud, y puede estar compuesto todo de purinas o una mezcla de nucleótidos de purina y pirimidina.

Para las composiciones que contienen 2'-OMe GTP, otro factor útH puede ser la presencia o concentración de 2'-OH guanosina o monofosfato de guanosina (GMP). La transcripción se puede dividir en dos fases: la primera fase es la iniciación , durante la cual el RNA se extiende en alrededor de 10-12 nucleótidos; la segunda fase es la elongación, durante la cual la transcripción procede más allá de la adición del primero de alrededor de 10-1 2 nucleótidos. Se ha encontrado que 2'-OH GMP o guanosina agregada a la mezcla de transcripción que contiene un exceso de 2'-OMe GTP es suficiente para permitir que la polimerasa inicie la transcripción. La transcripción de cebadores con 2'- OH guanosina, por ej . , o GMP es útil debido a la especificidad de léi polimerasa para el nucleótido de iniciación. La concentración preferida de GMP es 0.5 mM y, aún más preferentemente, 1 mM.

Otro factor útil para optimizar la incorporación de nucleótidos; sustituidos con 2'-OMe en transcripciones es el uso del magnesio y manganeso divalentes en la mezcla de transcripción. Se encontró que combinaciones diferentes de concentraciones de cloruro de magnesio y cloruro de manganeso afectan las proporciones de transcripciones: modificadas con 2'-0, con la concentración óptima de cloruro de magnesio y manganeso que depende de la concentración de NTP en la mezcla de reacción de transcripción que forma complejos de iones; metálicos divalentes.

Otros reactivos que se pueden incluir en la reacción de transcripción incluyen amortiguadores, tales como amortiguador del ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES); un reactive de reducción-oxidación, tal como ditiotreitol (DTT); un policatión, tal como espermidina, espermina; un tensioactivo, tal como Tritón X100 y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la concentración del amortiguador de HEPES puede variar de 0 a 1 M. La invención contempla también el uso de otros; agentes amortiguadores que tienen una pKa entre 5 y 1 0 incluyendo, por ejemplo, Tris-hidroximetil-aminometano. En algunas modalidades, ?e? concentración de DTT puede variar de 0 a 400 mM. Los métodos de la invención proporcionan también el uso de otros agentes de reducción incluyendo, por ejemplo, mercaptoetanol. En algunas modalidades, la concentración de espermidina y/o espermina puede variar de 0 a 20 mM. En algunas modalidades, la concentración de PEG-8000 puede variar de 0 a 50% (p/v). Los métodos de la invención proporcionan también el uso de otros polímeros hidrofílicos incluyendo, por ejemplo, otros pesos moleculares de PEG u otros polialquilenglicoles. En algunas, modalidades, la concentración de Tritón X-100 puede variar de 0 a 0.1 % (p/v). Los métodos de la invención proporcionan también el uso de otros, detergentes no iónicos incluyendo, por ejemplo, otros detergentes, incluyendo otros detergentes de Triton-X. En algunas modalidades, la concentración de MgCI2 puede variar de 0.5 mM a 50 mM. La concentración de MnCI2 puede variar de 0.15 mM a 1 5 mM. En algunas modalidades, la concentración de 2'-OMe NTP (cada NTP) puede variar de 5 µ? a 5 mM. En algunas modalidades, la concentración de 2'-OH GTP puede variar de 0 µ? a 300 µ?. En algunas modalidades, la concentración de 2'-OH GMP puede variar de 0 a 5 mM. El pH puede variar de pH 6 a pH 9.

Las variaciones del proceso SELEX se pueden usar también para identificar aptámeros. Por ejemplo, uno puede usar un SELEX agonista, SELEX alterado, SELEX 2' modificado o SELEX contador. Cada una de estas variaciones del proceso SELEX se conocen en la técnica.

Aptámeros del TFPI La invención incluye aptámeros de ácido nucleico, preferentemente de 20-55 nucleótidos de longitud, que se unen al inhibidor de la vía de factor tisular (TFPI) y que, en algunas modalidades, funcionalmente modulan, por ej. , estimulan, bloquean o, de otro modo, inhiben o estimulan, la actividad del TFPI .

Los aptámeros de TFPI se unen al menos en parte al TFPI o una variante o una o más porciones (o regiones) del mismo. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica.

Una variante de TFPI , tal como se usa en la presente, abarca variantes que realizan esencialmente la misma función que las funciones de TFPI , incluye preferentemente de manera sustancial la misma estructura y, en algunas modalidades, incluye al menos 70% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 80% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos 90% de identidad de secuencia, y más preferentemente al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos del TFPI, humano que se muestra en la Figura 5 como SEQ ID NO: 1 1 .

De preferencia, los aptámeros de TFPI se unen a TFPI de longitud completa. Si un aptámero se une a una o más porciones de TFPI , es preferible que el aptámero requiera contactos de unión u otra interacción* con una porción de TFPI , al menos en parte, fuera de las regiones K1 y K2, tal como la región K3/extremo C. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, ¡nteractuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. Más preferentemente, los aptámeros de TFPI se unen al menos en parte a una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) que se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 175-1 95, aminoácidos 1 80-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 195-21 5, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 1 50-1 75, aminoácidos 1 50-180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-195, aminoácidos 150-200 aminoácidos 150-205, aminoácidos 150-210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150-240, aminoácidos 150-245r aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276: aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276.

El TFPI puede ser de cualquier especie, pero es preferentemente humano.

Los aptámeros de TFPI comprenden preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos, y más preferentemente 500 pM o menos. En algunas modalidades, la constante de disociación se determina por titulación dol: blot.

Los aptámeros de TFPI pueden ser ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico, ácidos nucleicos modificados (por ejemplo, 2'-modificados) o ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico y ácidos nucleicos modificados mezclados, o cualquier combinación de los mismos. Los aptámeros pueden ser ácido ribonucleico de cadena única , ácido desoxirribonucleico, ácidos nucleicos modificados (por ejemplo, 2'·· modificados) ácido ribonucleico y ácido nucleico modificado, ácido desoxirribonucleico y ácido nucleico modificado o ácido ribonucleico mezclado, ácido desoxirribonucleico y ácidos nucleicos modificados o cualquier combinación de los mismos.

En algunas modalidades, los aptámeros de TFPI comprenden a l menos una modificación química. En algunas modalidades, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en: una sustitución química en una posición de azúcar, una sustitución química en una unión internucleótidos y una sustitución química en una posición de base. En otras modalidades, la modificación química se selecciona del grupo que consiste en la incorporación de un nucleótido modificado; un casquete 3'; un casquete 5'; conjugación a un compuesto no inmunogénico de alto peso molecular; conjugación a un compuesto lipofílico; incorporación de un motivo CpG e incorporación de un fosforotioato o fosforoditioato en la estructura principal del fosfato. En una modalidad preferida, el compuesto no inmunogénico y de alto peso molecular es polialquilenglicol y, más preferentemente, es polietilenglicol (PEG). En algunas modalidades, el polietilenglicol es metoxipolietilenglicol (mPEG). En otra modalidad preferida, el casquete 3' es un casquete de desoxitimidina invertida.

Las modificaciones descritas en la presente pueden afectar la estabilidad del aptámero, por ej . , la incorporación de un fragmento de recubrimiento puede estabilizar el aptámero en comparación con la degradación de endonucleasa. De manera adicional, las modificaciones; descritas en la presente pueden afectar la afinidad de unión de un aptámero a su objetivo, por ej. , la incorporación específica del sitio de: un nucleótido modificado o conjugación a un PEG puede afectar l.i afinidad de unión. El efecto de dichas modificaciones en la afinidad de: unión se puede determinar usando una variedad de métodos reconocidos! en la técnica, tales como, por ej . , ensayos funcionales, tal como ELISA, o ensayos de unión en los cuales el aptámero de traza etiquetado se incuba con concentraciones objetivo que varían y los complejos se capturan en nitrocelulosa y se cuantifican para comparar las afinidades, de unión antes y luego de la incorporación de una modificación.

De preferencia, los aptámeros de TFPI se unen al menos en parte a TFPI o una variante o una o más porciones del mismo y actúan como un antagonista para inhibir la función de TFPI .

Los aptámeros de TFPI inhiben, reducen, bloquean o, de otro modo, modulan completa o parcialmente la inhibición mediada por TFPI de la coagulación sanguínea. Se considera que los aptámeros de TFPI modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o, de otro modo, interfieren completamente con la actividad biológica de TFPI, tal como inhibición mediada por TFPI de coagulación sanguínea, cuando el nivel de inhibición mediada por TFPI en presencia del aptámero de TFPI disminuye en al menos 95%, por ej. , 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con el nivel de inhibición mediada por TFPI en ausencia del aptámero de TFPI Se considera que los aptámeros de TFPI modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o, de otro modo, interfieren completamente con la actividad biológica de TFPI , tal como inhibición mediada por TFPI , cuando el nivel de inhibición mediada por TFPI en presencia del aptámero de TFPI disminuye menos de 95%, por ej. , 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% en comparación con el nivel de actividad de TFPI en ausencia del aptámero de TFPI .

Los ejemplos de aptámeros que se unen a y modulan la función de TFPI para utilizar como compuestos terapéuticos y/o diagnósticos, incluyen, de modo no limitante, ARC26835, ARC 1 7480, ARC1 9498, ARC19499, ARC1 9500, ARC 1 9501 , ARC31301 , ARC18546, ARC19881 y ARC19882.

De preferencia, los aptámeros de TFPI comprenden una de las siguientes secuencias de ácido nucleico: (ARC26835) mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ ID NO: 1 ), donde "dN° es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleotido que contiene 2'-0 Metilo (que se conoce también en la técnica como nucleotido que contiene 2'-OMe, 2'-metoxi o 2'-OCH3) y (ARC 1 7480) mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 2), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleotido que contiene 2'-0 Metilo y (ARC 19498) NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 3), donde "NH2" es de una fosforamidita enlazadora de 5'·· hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo y (ARC19499) PEG40K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 4) , donde "NH" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y "PEG" es un polietilenglicol y (ARC19500) NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-NH2 (SEQ ID NO: 5), donde "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo, "NH" es de una fosforamidita enlazadora de hexilamina y (ARC19501) PEG20K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-NH-PEG20K (SEQ ID NO: 6), donde "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo, "NH" es de una fosforamidita enlazadora de hexilamina y "PEG" es un polietilenglicol y (ARC31301) mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ I D NO: 7) , donde "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene: 2'-0 Metilo y (ARC 18546) mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-rnC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-rnG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO : 8), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y (ARC 1 9881 ) NHa-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-rnG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-rnA-3T (SEQ ID NO: 9), donde "NH2" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo y (ARC 19882) PEG40K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 1 0), donde "NH" es de una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido, "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo y "PEG" es un polietilenglicol.

El nombre químico de ARC26835 es 2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2,-OMe-adenilil-(3'-?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adeniMI-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'- OMe-adenilil-ÍS^S'J^'-desoxicitidilil-ÍS^S'J^'-OMe-uracilil-ÍS^S')^'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2,-O e-guanilil-(3'?5')-2'-desox¡cit¡dilil-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2,-desox¡citid¡lil-(3'-?5')-2,-OMe-guanilil-(3,?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-??ß^?3???-(3'?5 2'-??ß-?G3???-(3'?5 2,-??ß^ß????-(3'?5,)-2·-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5,)-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenililo.

El nombre químico de ARC17480 es 2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'- OMe-guanilil-(3'-?5')-2,-O e-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5,)-2,-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-desoxicitidili!-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2,-OMe-uraciMI-(3,?5,)-2,-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5,)-2,-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OMe-guan¡lil-(3'?5,)-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'-?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-(3'?3')-2'-desoxitimidina.

El nombre químico de ARC19498 es 6-aminohexilil-(1?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2,-OMe-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-OMe-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2,-desoxicitid¡lil-(3,?5,)-2,-OMe- uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2,-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-desoxicitid¡lil-(3,?5,)-2,-OMe-urac¡l¡l-(3'?5,)-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-guaniMI-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-O e-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2,-O e-guanilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3'?5,)-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5,)-2'-OMe-aden¡l¡l-(3'?5,)-2,-OMe-uraciMI-(3'?5')-2'-OMe-adeniMI-(3'?5')-(3'?3')-2'-desoxitimidina.

El nombre químico de ARC 19499 es N-(metoxi-polietilengl¡col)-6-am¡nohexilil-(1?5')-2'-O e-guan¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-guan¡lil-(3,?5,)-2'-OMe-aden¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3,?5')-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3,?5,)-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2"-O e-aden¡lil-(3'?5')-2'-desox¡citid¡lil-(3,?5·)-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2'-OMe-urac¡l¡l-(3,?5·)-2,-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-O e-guanilil-(3,?5')-2,-desoxicitidilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-desox¡c¡t¡d¡lil-(3'?5')-2'-OMe-guan¡l¡l-(3'-?5,)-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5,)-2,-OMe-urac¡lil-(3'-?5,)-2,-OMe-aden¡lil-(3,?5')-2'-OMe-guanim-(3'?5,)-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5,)-2,-OMe-uracilil-(3,?5,)-2'-OMe-guan¡lil-(3'?5')-2,-desoxic¡tidil¡l-(3'?5,)-2,-OMe-guan¡l¡l-(3,?5')-2¦-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2·-OMe-aden¡lil-(3,?5,)-2'-OMe-urac¡l¡l-(3,?5')-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2,-O e-adenilil-(3,?5')-(3'?3')-2'-desoxitimidina.

El nombre químico de ARC1 9500 es 6-aminohexil¡l-( 1?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2,-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OI\/le-aden¡lil-(3'?5,)-2,-OMe-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2,-OMe- uracilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5,)-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-OMe-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5,)-2'-desoxicitid¡lil-(3'?5')-2'-OMe-guan¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-urac¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenMil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenililo-6-aminohexililo.

El nombre químico de ARC19501 es N-(metoxi-polietilenglicol)-6-am¡nohex¡l¡l-(1?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-CS^S^^'-OMe-adenilil-ÍS'-^S'J^'-OMe-uracilil-ÍS'-^S')^'-OMe-aden¡lil-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2'-OMe-aden?l¡l-(3'?5')-2,-desoxicitidilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2'-OMe-guan¡l¡l-(3,?5')-2'-desoxic¡t¡dilil-(3,?5,)-2,-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-desoxicitidilil-(3'?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guan¡l¡l-(3'?5')-2'-desox¡c¡tidil¡l-(3'?5')-2,-OMe-guan¡lil-(3,?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-aden¡lil-(3'?5')-2'-OMe-urac¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-adenil¡l-6-aminohexilil-N-(metoxi-polietilenglicol).

El nombre químico de ARC31301 es 2'-O e-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3"?5')-2'-OMe-adenilil-(3,?5,)-2'-OMe-adenilil-(3,?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3'-*5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5,)-2'-desoxicitid??il-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3,?5,)-2,- OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guaniMI-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-desoxicitidilil-(3'-?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uraciMI-(3'?5')-2'-OI\/le-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OI\/le-citidiMI-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-urac¡l¡l-(3'?5,)-2'-OMe-aden¡lil-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2,-OMe-adenililo.

El nombre químico de ARC1 8546 es 2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2' OMe-guan¡l¡l-(3,?5')-2,-OMe-aden¡l¡l-(3'?5')-2,-OMe-aden¡l¡l-(3'?5')-2,-OMe-urac¡l¡l-(3,?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3,?5')-2,-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2'-OMe-adenil¡l-(3'?5')-2'-desox¡c¡t¡d¡l¡l-(3'-?5')-2'-OMe-urac¡l¡l-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'-?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-desoxicitidiMI-(3,?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5,)-2,-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2,-OMe-guani!il-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5,)-2,-OMe-citidilil-(3'?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2,-OMe-uracil'il-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3,?5')-2"-O e-uracilil-(3'?5,)-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3,-?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3'?5')-(3'?3')-2'-desox¡t¡mid¡na.

El nombre químico de ARC 19881 es 6-aminohexilil-(1?5')-2'-OMe guan¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2'-OMe-aden¡lil-(3'?5')-2'-OMe-adenil¡l-(3'-?5,)-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2'-OMe-aden¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenil¡l-(3'?5')-2'-desoxicit¡dilíl-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2'-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2,-OMe-guanilil-(3'?5,)-2,-OMe- guan¡lil-(3,?5')-2,-OMe-c¡t¡dilil-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2'-desoxicit¡d¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-uracil??-(3'?5')-2'-OMe-aden¡h?-(3,?5')-2'-OMe-guan??il-(3'?5')-2,-Olv1e-guan¡l¡l-(3'?5')-2'-OMe-uracil¡l-(3'?5')-2·-OMe-guanilil-(3'-?5')-2,-OMe-citidilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adeniMI-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-(3'?3')-2'-desoxitimidina.

El nombre químico de ARC19882 es N-(metoxi-polietilenglicol)-6-aminohex¡lil-(1?5')-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2'-OMe-guanil¡l-(3'?5')-2,-OMe-adenihl-(3,?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'-?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-desoxicitidilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2,-OMe-citidilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-desoxicitidilil-(3,?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3,?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-adeniMI-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3,?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3'?5')-2,-OMe-guanilil-(3'?5,)-2'-OMe-uracilil-(3'?5,)-2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3,-?5')-2'-OMe-adeniMI-(3'-?5')-2'-OMe-uracilil-(3'-?5')-2,-OMe-adenilil-(3'?5')-(3'?3')-2'-desoxitimidina.

Los aptámeros de TFPI de la invención pueden tener cualquier estructura secundaria. Preferentemente, los aptámeros de TFPI comprenden un motivo de tallo y bucle, tal como se muestra en las Figuras 10A y B. La supuesta estructura secundaria de ARC19499 se ilustra en la Figura 10C, que comprende un motivo de tallo y bucle.

De preferencia, los aptámeros de TFPI están conectados a uno o más fragmentos de PEG, con (Figura 1 0B) o sin (Figura 10A) uno o más enlazadores. Los fragmentos de PEG pueden ser de cualquier tipo de fragmento de PEG. Por ejemplo, el fragmento de PEG puede ser lineal, ramificado, ramificado múltiple, con forma de estrella, con forma de peine o un dendrímero. Además, el fragmento de PEG puede tener cualquier peso molecular. De preferencia, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 5-100 kDa de tamaño. Más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 10-80 kDa de tamaño. Aún más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 20-60 kDa de tamaño. Aún más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular que varía de 30-50 kDa de tamaño. Más preferentemente, el fragmento de PEG tiene un peso molecular de 40 kDa de tamaño. Los mismos o diferentes fragmentos de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI . Se pueden usar los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar los mismos o diferentes fragmentos de PEG a un aptámero de TFPI .

De manera alternativa, los aptámeros de TFPI se pueden conectar a una o más alternativas de PEG (en vez de a uno o más fragmentos de PEG), con o sin uno o más enlazadores. Los ejemplos de alternativas de PEG incluyen, de modo no limitante, polioxazolina (POZ), PoliPEG, hidroxietil almidón (HES) y albúmina. La alternativa de PEG puede ser cualquier tipo de alternativa de PEG, pero debería funcionar del mismo modo o similar al fragmento de PEG, es decir, debería reducir la filtración renal y aumentar la vida media del aptámero de TFPI en la circulación. Las mismas o diferentes alternativas de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI . Se pueden usar los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar las mismas o diferentes alternativas de PEG a un aptámero de TFPI . De manera alternativa, una combinación de fragmentos de PEG y alternativas de PEG se pueden conectar a un aptámero de TFPI , con o sin uno o más de los mismos o diversos enlazadores.

De preferencia, los aptámeros de TFPI se conectan a un fragmento de PEG at ravés de un enlazador (Figura 10B) . Sin embargo, los aptámeros de TFPI se pueden conectar a un fragmento de PEG directamente, sin el uso de un enlazador (Figura 1 0A). El enlazador puede ser cualquier tipo de molécula. Los ejemplos de enlazadores incluyen, de modo no limitante, aminas, tioles y azidas. Por ejemplo, se pueden usar aminas (RNH2) y ésteres activados (R'C(=0)OR") o anhídridos (R'C(=0)OC(=0)R") como enlazadores para proporcionar una amida (R'(C=0)NR). Los ésteres activados incluyen, de modo no limitante, NHS (N-hidroxisuccinimida) y derivados sulfo de NHS, ésteres de nitrofenilo y otros derivados aromáticos sustituidos. Los anhídridos pueden ser cíclicos, tales como derivados anhídridos de ácido succínico. Se pueden usar aminas (RNH2) y carbonatos activados (R'OC(=0)OR") para proporcionar carbamatos (ROC(=0)NR). Los carbamatos activados incluyen, de modo no limitante, NHS (N-hidroxisuccinimida) y derivados sulfo de NHS, carbamatos de nitrofenilo. Se pueden usar aminas (RNH2) e isotiocianatos (R'N=C=S) como enlazadores para proporcionar isotioureas (RN HC(=S)NHR'). Se pueden usar aminas (RNH2) e isocianatos (R'N=C=0) como enlazadores para proporcionar isoureas (RNHC(=0)NH R'). Se pueden usar aminas (RNH2) y azidas de acilo (R'(C=0)N2) como enlazadores para proporcionar amidas (RNH(C=0)R'). Se pueden usar aminas (RNH2) y aldehidos o glioxales (R'(C=0)H) como enlazadores para proporcionar ¡minas (R'CH=NR) o aminas a través de la reducción (R'CH2=NHR). Se pueden usar aminas (RNH2) y cloruros de sulfonilo (R'S02CI) como enlazadores para proporcionar sulfoamidas (R'S02NHR). Se pueden usar aminas (RNH2) y epóxidos y oxiranos como enlazadores para dar a-hidroxiaminas. Se pueden usar tioles (RSH) e yodoacetilos (R'(C=0)CH2l) como enlazadores para proporcionar tioéteres (RSCH2(0=C)R'). Se pueden usar tioles (RSH) y maleimidas o derivados de maleimida como enlazadores para dar tioéteres. Se pueden usar tioles (RSH) y aziridinas como enlazadores para dar tioéteres de a-amina. Se pueden usar tioles (RSH) y derivados de acriloilo (R'CH=CH2) como enlazadores para dar tioéteres (R'CH2CH2SR). Se pueden usar tioles (RSH) y disulfuros (R'SSR") como enlazadores para dar disulfuros (RSSR' o R"). Se pueden usar tioles (RSH) y vinilsulfonas (CH2=CHS02R') como enlazadores para proporcionar éteres de tiol (RSCH2CH2S02R'). Se pueden usar azidas (RN3) y alquinos (R'C=H) como enlazadores para proporcionar triazolinas. De preferencia, el enlazador contiene un grupo fosfato. Preferentemente, el enlazador es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina. En algunas modalidades, fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-12 grupos CH2 consecutivos. En modalidades aún más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 4-8 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 6 grupos CH2 consecutivos, es decir, es una fosforamidita enlazadora de 5'-hexilamina. Se pueden usar uno o más de los mismos o diferentes enlazadores o no enlazadores para conectar uno o más de los mismos o diferentes fragmentos de PEG o una o más de las mismas o diferentes alternativas de PEG a un aptámero de TFPI .

En modalidades preferidas, se proporciona un aptámero o una sal del m ismo que comprende la siguiente estructura: donde HN P03H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina y el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde HN P03H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina, y el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 2), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y En algunas modalidades, fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-12 grupos CH2 consecutivos. En modalidades aún más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 4-8 grupos CH2 consecutivos. En las modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 6 grupos CH2 consecutivos. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: donde HN PO3 H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina, y el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA- mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 8), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y En algunas modalidades, fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-12 grupos CH2 consecutivos. En modalidades aún más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 4-8 grupos CH2 consecutivos. En las modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 6 grupos CH2 consecutivos. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En modalidades preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde HN^^ P02H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina y el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. El fragmento 20 PEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad alternativa particular, el aptámero, o una sal del mismo, comprende la siguiente estructura donde HN ^ P02H es de una fosforamidita enlazadora de 5'-amina, y el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ ID NO: 1), donde "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. En algunas modalidades, fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-18 grupos CH2 consecutivos. En modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 2-12 grupos CH2 consecutivos. En modalidades aún más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 4-8 grupos CH2 consecutivos. En las modalidades más preferidas, la fosforamidita enlazadora de 5'amina comprende 6 grupos CH2 consecutivos. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En modalidades más preferidas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia , el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 2), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-rnU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 8), donde "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En modalidades más preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde el aptámero es un aptámero TFPI de la invención. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En una modalidad alternativa particular, el aptámero, o una sal del mismo, comprende la siguiente estructura donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEO. I D NO: 1 ), donde "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. El fragmento 20KPEG puede ser cualquier fragmento de PEG que tenga un peso molecular de 20 kDa. De preferencia, el fragmento 20KPEG es un fragmento de mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

En las modalidades más preferidas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: 5-aptámero-3- donde "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) y el aptámero es un aptámero de TFPI de la invención, "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno dado que la cantidad de n puede variar ligeramente para un PEG que tiene un peso molecular particular. De preferencia, "n" varía de 400-500 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" varía de 425-475 unidades de óxido de etileno. Aún más preferentemente, "n" varía de 440-460 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" tiene 454 unidades de óxido de etileno.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 2) , donde "n" es aproximadamente 450, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y Este aptámero también se conoce como ARC 19499.

En una modalidad particular, el aptámero o una sal del mismo comprende la siguiente estructura: 5'-aptámero-3' donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-mC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-mC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 8), donde "n" es aproximadamente 450, "3T" es una desoxitimidina invertida, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo y Este aptámero también se conoce como ARC19882.

En las modalidades más preferidas alternativas, se proporciona un aptámero o una sal del mismo que comprende la siguiente estructura: donde "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno (PEG = 20 kDa) y el aptámero es un aptámero de TFPI de la invención, "n" tiene alrededor de 454 unidades de óxido de etileno dado que la cantidad de n puede variar ligeramente para un PEG que tiene un peso molecular particular. De preferencia, "n" varía de 400-500 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" varía de 425-475 unidades de óxido de etileno. Aún más preferentemente, "n" varía de 440-460 unidades de óxido de etileno. Más preferentemente, "n" tiene 454 unidades de óxido de etileno.

En una modalidad alternativa particular, el aptámero, o una sal del mismo, comprende la siguiente estructura donde el aptámero tiene la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ I D NO: 1 ), donde "n" es aproximadamente 450, "dN" es un desoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 Metilo. Este aptámero también se conoce como ARC 1 9501 .

La invención también proporciona aptámeros que tienen sustanciaimente la misma capacidad de unirse a TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustanciaimente la misma estructura que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros que tienen sustanciaimente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustanciaimente la misma estructura que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1 0. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustanciaimente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustanciaimente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención proporciona además aptámeros que tienen sustanciaimente la misma capacidad de unirse a TFPI y sustanciaimente la misma capacidad de modular la coagulación sanguínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustanciaimente la misma estructura y sustanciaimente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. La invención también proporciona aptámeros que tienen sustanciaimente la misma estructura y sustanciaimente la misma capacidad de modular la coagulación sanguínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI , sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica de TFPI que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas modalidades, los aptámeros tienen sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI , sustancialmente la misma estructura y sustancialmente la misma capacidad de modular la coagulación sangu ínea que cualquiera de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Tal como se usa en la presente, sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI significa que la afinidad se encuentra dentro de uno o dos órdenes de magnitud de la afinidad de las secuencias de ácido nucleico y/o aptámeros descritos en la presente. Se encuentra dentro del método de los expertos en la técnica el determinar si una secuencia dada tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a TFPI . En algunas modalidades, el aptámero que se une a TFPI tiene una secuencia de ácido nucleico al menos 70%, 80%, 90% o 95% idéntica a las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1 0.

La capacidad de un aptámero de unirse a TFPI se puede evaluar en un ensayo de competencia, por ej . , tal como se describe en el Ejemplo 34, en el cual uno de los aptámeros mostrados en las SEQ ID NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 se pueden seleccionar como el competidor actuando como un aptámero de control. Por ejemplo, un ensayo adecuado puede implicar la incubación de 10 nM de TFPI humano (American Diagnostica, Stamford, CT, catálogo #4500PC) con cantidades traza de aptámero de control radiomarcado y 5000 nM, 16667 nM, 556 nM, 1 85 nM , 61 .7 nM, 20.6 nM, 6.86 nM , 2.29 nM, 0.76 nM o 0.25 nM de aptámero competidor no marcado. Un aptámero de control está incluido en cada experimento. Para cada molécula, se usa el porcentaje de aptámero de control radiomarcado unido en cada concentración de aptámero competidor para su análisis. Se traza el porcentaje de aptámero de control radiomarcado unido como una función de concentración de aptámero y se ajusta a la ecuación y=(máx/(1 + x/IC50)) + int, donde y=el porcentaje de aptámero de control radiomarcado unido, x=la concentración de aptámero, máx=el máximo aptámero de control radiomarcado unido e int=intercepción y, para generar un valor de IC50 para unión-competencia. El IC50 de cada aptámero se compara con la IC50 del aptámero de control evaluado en el mismo experimento. Un aptámero que tiene sustancialmente la misma capacidad de unión puede incluir un aptámero que tiene una IC50 que se encuentra dentro de una o dos órdenes de magnitud de la IC5o del aptámero de control, y/o un aptámero que tiene una IC50 que no es más que 5 veces mayor al del aptámero de control evaluado en el mismo experimento.

La capacidad de un aptámero de modular una función biológica y/o de modular la coagulación sanguínea se puede evaluar en un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT), por ej. , tal como se describe en el Ejemplo 34, en el cual uno de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 se pueden seleccionar como un aptámero de control. Por ejemplo, un ensayo adecuado puede implicar la evaluación en un ensayo de CAT en plasma de hemofilia A agrupada en 500 nM , 167 nM , 55.6 nM , 1 8.5 nM, 6. 17 nM y 2.08 nM de concentración de aptámeros. Un aptámero de control está incluido en cada experimento. Para cada molécula, se usan los valores de potencial de trombina endógena (ETP) y trombina pico en cada concentración de aptámero para análisis. El valor de ETP o trombina pico para el plasma de hemofilia A sola se resta del valor correspondiente en presencia de aptámeros para cada molécula en cada concentración. Luego, se trazan los valores de ETP y pico corregidos como una función de concentración de aptámeros y se ajustan a la ecuación y=(máx/(1 + IC50/x)) + i nt, donde y=ETP o trombina pico, x=concentración del aptámero, máx=ETP o trombina pico máximo e i nt= la intersección y, para generar un valor de IC50 para ETP y trombina pico. La IC50 de cada aptámero se compara con la IC50 del aptámero de control que se evalúa en el mismo experimento. Un aptámero que tiene sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica y/o modular la coagulación sanguínea puede incluir un aptámero que tiene una IC50 que se encuentra dentro de una o dos órdenes de magnitud de la IC50 del aptámero de control, y/o un aptámero para el cual una o ambas IC50 de ETP y trombina pico de esa molécula no es más que 5 veces mayor al del aptámero de control evaluado en el mismo experimento.

La capacidad de un aptámero de modular una función biológica y/o de modular la coagulación sanguínea se puede evaluar mediante evaluación de la inhibición de TFPI en un ensayo de actividad del Factor Xa (FXa), por ej. , tal como se describe en el Ejemplo 34, en el cual uno de los aptámeros mostrados en las SEQ I D NOs: 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 se puede seleccionar como un aptámero de control. Un ensayo adecuado puede implicar medir la capacidad de FXa de escindir un sustrato cromogénico en presencia y ausencia de TFPI , con o sin la adición de aptámeros. Por ejemplo, se incuban 2 nM de FXa humano con 8 nM de TFPI humano. Luego, se agregan 500 µ? de sustrato cromogénico y aptámeros y se mide la escisión de FXa del sustrato mediante la absorbancia a 405 nm (A405) como una función de tiempo. Los aptámeros se analizan a concentraciones de 500 nM, 125 nM, 31 .25 nM, 7.81 nM , 1 .95 nM y 0.49 nM. Un aptámero de control está incluido en cada experimento. Para cada concentración de aptámero, se traza el A405 como una función de tiempo y se ajusta la región lineal de cada curva a la ecuación y=mx + b, donde y=A4 05 , x=la concentración de aptámeros, m = la tasa de escisión del sustrato y b=la intersección y, para generar una tasa de escisión del sustrato FXa. La tasa de escisión del sustrato FXa en presencia de TFPI y ausencia de aptámeros se resta del valor correspondiente en presencia de ambos TFPI y aptámeros para cada molécula en cada concentración. Luego, se trazan las tasas corregidas como una función de concentración de aptámero y se ajustan a la ecuación y=(Vmáx/(1 + IC50/x)), donde y=la tasa de escisión del sustrato, x=concentración de aptámero y Vmáx=la tasa máxima de escisión de sustrato, para generar un valor de IC5o y (Vmax) máximo. Los valores de IC50 y Vmáx de cada aptámero se comparan con los valores de I C50 y Vmáx del aptámero de control evaluado en el mismo experimento. Un aptámero que tiene sustancialmente la misma capacidad de modular una función biológica y/o de modular la coagulación sangu ínea puede incluir un aptámero que tiene una IC50 que se encuentra dentro de una o dos órdenes de magnitud de la IC50 del aptámero de control, y/o un aptámero que tiene una IC50 que no es más de 5 veces mayor al del aptámero de control evaluado en el mismo experimento, y/o un aptámero que tiene un valor Vmáx no menor a 80% del valor de Vmáx del aptámero de control evaluado en el mismo experimento.

Los términos "identidad de secuencia" o "% de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o proteínas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos cuando se comparan y alinean para una máxima correspondencia, tal como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Para la comparación de secuencias, típicamente actúa una secuencia como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias de prueba. Las secuencias de alineación óptimas para comparación se pueden llevar a cabo, por ej . , mediante el algoritmo de homolog ía local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1 981 ); mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48: 443 (1 970); mediante la búsqueda para el método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85: 2444 (1988); mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.); o mediante inspección visual (véase en general, Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc. y Wiley-l nterscience (1987)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineación local básica (en lo sucesivo "BLAST"), véase, por ej . , Altschul et al. , J Mol. Biol. 21 5: 403-41 0 (1990) y Altschul et al. , Nucleic Acids Res. , 15: 3389-3402 (1 997), que está disponible al público a través del Centro Nacional para información biotecnológica (en lo sucesivo "NCBI").

Los aptámeros de la invención que incluyen de modo no limitante, aptámeros identificados por el método SELEX™, SELEX™ 2'modificado, aptámeros minimizados, aptámeros optimizados y aptámeros químicamente sustituidos, se pueden fabricar usando cualquier técnica de síntesis de oligonucleótido conocida en la técnica, tales como técnicas de síntessis de oligonucleótido de fase sólida (véase, por ej. , Gualtiere, F. Ed. , New Trends in Synthetic Medicinal Chemistry, Ch. 9, Chemistry of Antisense Oligonucleotides, p. 261 -335, 2000, Wiley-VCH, Nueva York). La fabricación de los aptámeros que usan técnicas de síntesis de oligonucleótidos de fase sólida también se puede realizar a escala comercial. Los métodos de fase de solución , tales como métodos de síntesis de triéster (véase, por ej . , Sood eí al. , Nucí. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al. , Tet. Lett. , 28:2449 (1978)), se pueden usar también para fabricar aptámeros de la invención, así como medios recombinantes.

Además, se puede introducir una variedad de grupos funcionales durante la síntesis de fase sólida. La funcionalidad puede ser un enlazador simple que ocasiona un grupo funcional, tal como una amina o tiol, o puede ser una construcción más compleja, tal como una biotina o un tinte fluorescente. Típicamente, se introducen enlazadores de grupos funcionales o fragmentos más complejos usando una fosforamidita, o se pueden introducir post-sintéticamente (es decir, después de la síntesis de fase sólida) . De manera alternativa, utilizando un soporte sólido adecuado, se puede introducir una variedad de funcionalidades en el extremo 3' del oligonucleótido, permitiendo así una variedad más amplia de técnicas de conjugación.

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI , que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión ; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI ; (c) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una porción de TFPI . Este método puede incluir también la intervención o ciclos adicionales con unión a TFPI de longitud completa, seguido de dividir y amplificar. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-1 70, aminoácidos 1 50-1 70, aminoácidos 155-175, aminoácidos 1 60-180, aminoácidos 165-1 85, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 1 75-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185-205, aminoácidos 1 90-21 0, aminoácidos 1 95-21 5, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 21 5-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150-180, aminoácidos 150-185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150-195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150-210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150-225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150-240, aminoácidos 150-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-270, aminoácidos 150-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161-181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona también métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI, que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI ; (c) eluir específicamente los ácidos nucleicos unidos con TFPI de longitud completa o una porción de TFPI o un ligando que se une TFPI de longitud completa o una porción de TFPI; (d) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (e) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir, eluir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI . Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 1 50-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 170-190, aminoácidos 1 75-195, aminoácidos 180-200, aminoácidos 185-205, aminoácidos 1 90-21 0, aminoácidos 1 95-21 5, aminoácidos 200- -220, aminoácidos 205- -225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215- -235, aminoácidos 220- -240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230· -250, aminoácidos 235- -255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245- -265, aminoácidos 250- -270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260- -276, aminoácidos 148- -175, aminoácidos 150-175, aminoácidos 150- -180, aminoácidos 150- -185, aminoácidos 150-190, aminoácidos 150- -195, aminoácidos 150- -200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 150- -210, aminoácidos 150-¦215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 150- -225, aminoácidos 150-¦230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 150- -240, aminoácidos 150-¦245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-¦255, aminoácidos 150-¦260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 150-¦270, aminoácidos 150-¦275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-¦240, aminoácidos 190-¦276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-¦276, aminoácidos 161-¦181, aminoácidos 162-181, aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación paraTFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 100 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI, que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión en presencia de un ligando de TFPI (un ligando que se une a TFPI) que bloquea uno o más epítopes en TFPI de la unión al aptámero; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI ; (c) amplificar los ácidos nucleicos unidos para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (d) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI. En otras modalidades de este método, la inclusión de un ligando de TFPI que bloquea una o más porciones en TFPI de la unión de aptámeros puede ocurrir durante el paso de poner en contacto, el paso de dividir, o ambos. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 175-1 95, aminoácidos 180-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 1 95-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-1 75, aminoácidos 1 50-175, aminoácidos 1 50-180, aminoácidos 1 50-1 85, aminoácidos 1 50- 190, aminoácidos 1 50-195, aminoácidos 1 50-200, aminoácidos 150-205, aminoácidos 1 50-210, aminoácidos 150-215, aminoácidos 1 50-220, aminoácidos 1 50-225, aminoácidos 1 50-230, aminoácidos 150-235, aminoácidos 1 50-240, aminoácidos 1 50-245, aminoácidos 150-250, aminoácidos 150-255, aminoácidos 150-260, aminoácidos 1 50-265, aminoácidos 1 50-270, aminoácidos 1 50-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 1 90-240, aminoácidos 1 90-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161 -181 , aminoácidos 162-1 81 , aminoácidos 182-240, aminoácidos 182-241 y aminoácidos 182-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 1 00 µ?, menos de 1 µ? , menos de 500 nM, menos de 100 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona además métodos para identificar aptámeros que se unen al menos en parte a o, de otro modo, interactúan con una o más porciones de TFPI , que comprenden los pasos de (a) poner en contacto una mezcla de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI en condiciones en las que ocurre la unión; (b) dividir los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se unieron a TFPI de longitud completa o una o más porciones de TFPI ; (c) dividir los ácidos nucleicos unidos que tienen una propiedad funcional deseada de los ácidos nucleicos unidos que no tienen una propiedad funcional deseada; (d) amplificar los ácidos nucleicos unidos que tienen una propiedad funcional deseada para proporcionar una mezcla enriquecida con ligandos de ácidos nucleicos y, opcionalmente, (e) reiterar los pasos de poner en contacto, dividir, dividir y amplificar con tantos ciclos como se desee para obtener aptámero/s que se una/n a una o más porciones de TFPI . Los pasos (b) y (c) pueden ocurrir secuencial o simultáneamente. Por ejemplo, los aptámeros de TFPI se pueden unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI El aptámero de TFPI se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Un aptámero de TFPI se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando el aptámero se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, dichas una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) se seleccionan del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-1 70, aminoácidos 155-1 75, aminoácidos 160-180, aminoácidos 165-185, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 175-1 95, aminoácidos 1 80-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 1 95-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-1 75, aminoácidos 1 50-1 75, aminoácidos 1 50-180, aminoácidos 1 50-1 85, aminoácidos 1 50-190, aminoácidos 1 50-195, aminoácidos 1 50-200, aminoácidos 1 50-205, aminoácidos 1 50-21 0, aminoácidos 150-215, aminoácidos 1 50-220, aminoácidos 1 50-225, aminoácidos 150-230, aminoácidos 1 50-235, aminoácidos 1 50-240, aminoácidos 1 50-245, aminoácidos 1 50-250, aminoácidos 1 50-255, aminoácidos 1 50-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 1 50-270, aminoácidos 1 50-275, aminoácidos 150-276, aminoácidos 190-240, aminoácidos 190-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161 -1 81 , aminoácidos 162-181 , aminoácidos 182-240, aminoácidos 1 82-241 y aminoácidos 1 82-276. El aptámero comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI HUMANO o una variante o una o más porciones del mismo, de menos de 1 00 µ? , menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 1 00 nM , preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 10 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

La invención proporciona también un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO: 1 1 , donde el aptámero modula la inhibición mediada por TFPI de coagulación sanguínea, y donde el aptámero compite por la unión a TFPI con un aptámero de referencia que comprende una secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ I D NO: 4 (ARC1 9499), SEQ ID NO: 1 (ARC26835), SEQ ID NO: 2 (ARC1 7480), SEQ ID NO: 3 (ARC19498), SEQ ID NO: 5 (ARC1 9500), SEQ ID NO:6 (ARC1 9501 ), SEQ I D NO: 7 (ARC31301 ), SEQ ID NO: 8 (ARC 18546), SEQ I D NO: 9 (ARC 1 9881 ) y SEQ I D NO: 10 (ARC1 9882). De preferencia, el aptámero de referencia comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 4 (ARC 1 9499).

I La invención proporciona además un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO: 1 1 , donde el aptámero se une a una porción lineal o una porción conformacional de TFPI en la cual al menos una porción de la región reconocida por el aptámero es diferente a la región de TFPI unida por el Factor VI la, Factor Xa, o ambos Factor VI la y Factor Xa. De preferencia, el aptámero se une a una o más regiones que comprenden al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 que se selecciona del grupo que consiste en : residuos de aminoácidosl 48-170, residuos de aminoácidos 150-170, residuos de aminoácidos 155-175, residuos de aminoácidos 160-180, residuos de aminoácidos 165-185, residuos de aminoácidos 170-190, residuos de aminoácidos 175-195, residuos de aminoácidos 180-200, residuos de aminoácidos 185-205, residuos de aminoácidos 190-210, residuos de aminoácidos 195-215, residuos de aminoácidos 200-220, residuos de aminoácidos 205-225, residuos de aminoácidos 210-230, residuos de aminoácidos 215-235, residuos de aminoácidos 220-240, residuos de aminoácidos 225-245, residuos de aminoácidos 230-250, residuos de aminoácidos 235-255, residuos de aminoácidos 240-260, residuos de aminoácidos 245-265, residuos de aminoácidos 250-270, residuos de aminoácidos 255-275, residuos de aminoácidos 260-276, residuos de aminoácidos 148-175, residuos de aminoácidos 150-175, residuos de aminoácidos 150-180, residuos de aminoácidos 150-185, residuos de aminoácidos 150-190, residuos de aminoácidos 150-195, residuos de aminoácidos 150-200, residuos de aminoácidos 150-205, residuos de aminoácidos 150-210, residuos de aminoácidos 150-215, residuos de aminoácidos 150-220, residuos de aminoácidos 150-225, residuos de aminoácidos 150-230, residuos de aminoácidos 150-235, residuos de aminoácidos 150-240, residuos de aminoácidos 150-245, residuos de aminoácidos 150-250, residuos de aminoácidos 150-255, residuos de aminoácidos 150-260, residuos de aminoácidos 1 50-265, residuos de aminoácidos 1 50-270, residuos de aminoácidos 1 50-275, residuos de aminoácidos 1 50-276, residuos de aminoácidos 1 90-240, residuos de aminoácidos 1 90-276, residuos de aminoácidos 240-276, residuos de aminoácidos 242-276, residuos de aminoácidos 1 61 -181 , residuos de aminoácidos 162-1 81 , residuos de aminoácidos 1 82-240, residuos de aminoácidos 182-241 y residuos de aminoácidos 1 82-276. Más preferentemente, el aptámero compite con un aptámero de referencia que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 (ARC1 9499) para unirse a TFPI .

La invención proporciona también un aptámero que se une a la misma región en un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO: 1 1 como la región unida por un aptámero de TFPI que comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ I D NO: 4 (ARC1 9499) .

La invención proporciona además un aptámero que se une a una región en un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano que comprende una o más porciones de la SEQ I D NO: 1 1 , donde dichas una o más porciones se seleccionan del grupo que consiste en: residuos de aminoácidos 148-170, residuos de aminoácidos 150-1 70, residuos de aminoácidos 1 55-175, residuos de aminoácidos 160-180, residuos de aminoácidos 165-1 85, residuos de aminoácidos 170-190, residuos de aminoácidos 1 75-195, residuos de aminoácidos 180-200, residuos de aminoácidos 1 85-205, residuos de aminoácidos 190-21 0, residuos de aminoácidos 195-21 5, residuos de aminoácidos 200-220, residuos de aminoácidos 205-225, residuos de aminoácidos 210-230, residuos de aminoácidos 21 5-235, residuos de aminoácidos 220-240, residuos de aminoácidos 225-245, residuos de aminoácidos 230-250, residuos de aminoácidos 235-255, residuos de aminoácidos 240-260, residuos de aminoácidos 245-265, residuos de aminoácidos 250-270, residuos de aminoácidos 255-275, residuos de aminoácidos 260-276, residuos de aminoácidos 148-175, residuos de aminoácidos 150-1 75, residuos de aminoácidos 150-180, residuos de aminoácidos 150-1 85, residuos de aminoácidos 150-1 90, residuos de aminoácidos 150-195, residuos de aminoácidos 150-200, residuos de aminoácidos 150-205, residuos de aminoácidos 150-210, residuos de aminoácidos 150-21 5, residuos de aminoácidos 150-220, residuos de aminoácidos 150-225, residuos de aminoácidos 150-230, residuos de aminoácidos 150-235, residuos de aminoácidos 150-240, residuos de aminoácidos 150-245, residuos de aminoácidos 150-250, residuos de aminoácidos 150-255, residuos de aminoácidos 150-260, residuos de aminoácidos 150-265, residuos de aminoácidos 150-270, residuos de aminoácidos 150-275, residuos de aminoácidos 150-276, residuos de aminoácidos 190-240, residuos de aminoácidos 190-276, residuos de aminoácidos 240-276, residuos de aminoácidos 242-276, residuos de aminoácidos 161 -181 , residuos de aminoácidos 162-1 81 , residuos de aminoácidos 182-240, residuos de aminoácidos 1 82-241 y residuos de aminoácidos 182-276.

La invención proporciona adicionaimente un aptámero que se une a un inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y presenta una o más de las siguientes propiedades: a) compite para la unión a TFPI con cualquiera de las SEQ I D NOs: 1 -10; b) inhibe la inhibición de TFPI del Factor Xa; c) aumenta la generación de trombina en plasma hemofilia; d) inhibe la inhibición de TFPI del complejo tenasa intrínseco; e) restaura la hemostasis normal, tal como se midió por la tromboelastografía (TEG®) en sangre y plasma; f) restaura la coagulación normal, tal como se indicó por un tiempo de coagulación más corto, formación de coagulación más rápida o desarrollo de coagulación más estable, tal como se midió por la tromboelastografía (TEG®) o tromboelastometría rotacional (ROTEM) en sangre y plasma o g) disminuye el tiempo de coagulación, tal como se midió por el tiempo de protrombina diluida (dPT), tiempo de coagulación activado por el factor tisular (TF-ACT) o cualquier otra medición de tiempo de coagulación sensible al TFPI .

La invención proporciona también un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular humano donde el aptámero compite para la unión de TFPI con un aptámero de referencia que se selecciona del grupo que consiste en: SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6, SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ I D NO: 10.

La invención proporciona también un aptámero que se une a un polipéptido inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano y comprende un motivo tallo y bucle que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 4, donde: a) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 1 , 2, 3, 4, 6, 8, 1 1 , 12, 13, 17, 20, 21 , 22, 24, 28, 30 y 32 se pueden modificar de un sustitución 2'-OMe a una sustitución 2'-desoxi; b) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 5, 7, 1 5, 19, 23, 27, 29 y 31 se pueden modificar de un 2 -OMe uracilo a un 2'-desoxi uracilo o un 2'-desoxi timina; c) el nucleótido 1 8 se puede modificar de un 2'-OMe uracilo a un 2'-desoxi uracilo; y/o d) cualesquiera uno o más de los nucleótidos 14, 16 y 25 se pueden modificar de un 2'-desoxi citosina a un 2'-OMe citosina o un 2'-fluoro citosina.

La invención proporciona además un aptámero que se une al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), donde el aptámero comprende una secuencia de ácido nucleico primaria que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOs. : 4, 1 , 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Una secuencia de ácido nucleico primaria de un aptámero se refiere solamente a los nucleótidos (adenina, guanina, citosina, uracilo, timina), sin ninguna modificación (tal como una modificación 2'-0 Metilo, 2'-fluoro, 3T o PEG).

Química medicinal de aptámeros Una vez que se identifican los aptámeros que se unen a TFPI, se pueden realizar opcionalmente varias técnicas para aumentar adicionalmente las características de unión, estabilidad, potencia y/o funcionales de las secuencias de aptámeros identificadas.

Los aptámeros que se unen a TFPI se pueden truncar para obtener la mínima secuencia de aptámeros que tiene las características funcionales y/o de unión deseadas (conocidas también en la presente como "construcción minimizada" o un "aptámero minimizado"). Un método para lograr esto es usando programas de plegamiento y análisis de secuencia, por ej., alineación de secuencias de clones que resulta de una selección para buscar motivos conservados y/o covariación para informa el diseño de construcciones minimizados. Los programas de plegamiento adecuados incluyen, por ejemplo, el programa de estructura de RNA (Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, S.J.; Zuker, M. y Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure," 2004. Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 101, 7287-7292). Los experimentos de sondeo bioquímicos se pueden llevar a cabo también para determinar los límites 5' y 3" de una secuencia de aptámeros para informar el diseño de construcciones minimizadas. Las construcciones minimizadas luego se pueden sintetizar y analizar químicamente para características funcionales y de unión, en comparación con la secuencia no minimizada a partir de la cual se derivaron. Las variantes de una secuencia de aptámeros que contiene una serie de 5', 3' y/o eliminaciones internas también se pueden sintetizar y analizar químicamente de manera directa para características funcionales y/o de unión, en comparación con la secuencia de aptámeros no minimizada a partir de la cual se derivaron.

Adicionalmente, las reselecciones dopadas se pueden usar para explorar los requisitos de las secuencias dentro de una secuencia de aptámero activo simple o una secuencia de aptámero minimizado simple. Las reselecciones dopadas se realizan usando un grupo sintético, degenerado que fue diseñado con base en la secuencia simple de interés. El nivel de degeneración varía normalmente de 70% a 85% de la secuencia de tipo salvaje, es decir, la única secuencia de interés. En general, las secuencias con mutaciones neutras se identifican a través del proceso de reselección dopado pero en algunos casos los cambios en la secuencia pueden dar como resultado mejoras en la afinidad. La información de la secuencia de composición de los clones identificados usando reselecciones dopadas se pueden usar luego para identificar el motivo de unión m ínimo y ayudar en los esfuerzos de optimización.

Las secuencias de aptámero y/o secuencias de aptámero minimizado también se pueden optimizar luego de SELEX™ usando química medicinal de aptámero para realizar mutagénesis al azar o dirigida de la secuencia para aumentar la afinidad de unión y/o características funcionales o alternativamente para determinar qué posiciones en la secuencia son esenciales para la actividad de unión y/o características funcionales.

La química medicinal de aptámeros es una técnica de mejora de aptámeros en la cual se sintetizan químicamente conjuntos de aptámeros variantes. Estos conjuntos de variantes difieren típicamente del aptámero principal por la introducción de un único sustituyente y difieren entre sí por la ubicación de este sustituyente. Estas variantes se comparan luego entre sí y con la principal. Las mejoras en características pueden ser tan profundas que la inclusión de un único sustituyente puede ser todo lo necesario para lograr un criterio terapéutico particular.

De manera alternativa, la información que se recoge del conjunto de variantes únicas se puede usar para diseñar otros conjuntos de variantes donde más de un sustituyente se introduce simultáneamente. En una estrategia de diseño, se clasificaron todas las variantes únicas de sustituyentes, se escogen las mejores 4 y se sintetizan y ensayan las combinaciones posibles dobles (6), triples (4) y cuádruples ( 1 ) de estas 4 únicas variantes de sustituciones. En una segunda estrategia de diseño, la mejor variante de sustituyente único se considera la nueva original y todas las variantes de sustituyente doble posibles que incluyen esta variante de sustituyente único con mayor puntuación se sintetizan y someten a ensayo. Se pueden usar otras estrategias y estas estrategias se pueden aplicar repetidamente de modo que se aumente gradualmente la cantidad de sustituyentes en tanto se identifiquen continuamente las variantes adicionalmente mejoradas.

Se puede usar particularmente la química medicinal de aptámeros como un método para explorar la introducción local , en vez de global, de sustituyentes. Dado que se descubren los aptámeros dentro de bibliotecas que se generan mediante transcripción, se debe introducir globalmente todo sustituyente que se introduzca durante el proceso SELEX™. Por ejemplo, si se desea introducir uniones de fosforotioato entre nucleotidos entonces solo se pueden introducir en cada A (o cada G, C, T, U, etc.) si se sustituyen globalmente. Los aptámeros que requieren fosforotioatos en algunas A (o algunas G, C, T, U, etc. ) (sustituidos localmente) pero no pueden tolerarlos en otras A (o algunas G, C, T, U, etc.) no pueden descubrirse fácilmente por este proceso.

Los tipos de sustituyentes que se pueden utilizar por los procesos de química medicinal de aptámeros están únicamente limitados por la capacidad de introducirlos en un esquema de síntesis de oligómeros. El proceso no está desde luego limitado a nucleotidos solos. Los esquemas de química medicinal de aptámeros pueden incluir sustituyentes que introducen volumen estérico, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilicidad, lipofobicidad, carga positiva, carga negativa, carga neutra, zwiteriones, polarizabilidad, resistencia a la nucleasa, rigidez conformacional, flexibilidad conformacional, características de unión a las proteínas, masa, etc. Los esquemas medicinales de aptámeros pueden incluir modificaciones de base, modificaciones de azúcar o modificaciones de unión a fosfodiéster.

Cuando se considera que los tipos de sustituyentes que tienen posibilidad de ser benéficos dentro del contexto de un aptámero terapéutico, se puede desear introducir susituyentes que se encuentran en una o más de las siguientes categorías: (1 ) Los sustituyentes que ya están presentes en el cuerpo, por ej. , nucleótidos de 2'-desox¡, 2'-ribo, 2'-0-metilo, inos¡na o citosina 5- metilo; (2) Sustituyentes que ya forman parte de un compuesto terapéutico aprobado, por ej. , nucleótidos 2'-fluoro o (3) Sustituyentes que se hidrolizan, degradan o metabolizan a una de las dos categorías anteriores, por ej. , oligonucleótidos unidos a metilfosfonato u oligonucleótidos unidos a fosforotioato.

Los aptámeros de la invención incluyen aptámeros desarrollados a través de la química medicinal de aptámeros, tal como se describe en la presente.

La afinidad de unión objetivo de los aptámeros de la invención se puede evaluar a través de una serie de reacciones de unión entre el aptámero y el objetivo (por ej. , una proteína) en los cuales se incuba un aptámero marcado con 3 P de traza con una serie de dilución del objetivo en un medio regulado y luego se analiza mediante filtración de nitrocelulosa usando un colector de filtración al vacío. En la presente se hace referencia a ensayo de unión dot blot, este método usa un medio de filtrado de tres capas que consiste en (de arriba a abajo) nitrocelulosa, filtro nailon y papel de transferencia de gel. El aptámero que está unido al objetivo se captura en el filtro de nitrocelulosa, donde se captura el aptámero unido no objetivo en el filtro de nailon. El papel secante de gel está incluido como un medio de soporte para los otros filtros. Luego de la filtración, las capas del filtro se separan, secan y exponen en una pantalla de fósforo y se cuantifican usando un sistema de fosforimagen. Los resultados cuantificados se pueden usar para generar curvas de unión a aptámeros a partir de las cuales se pueden calcular las constantes de disociación (KD). En una modalidad preferida, el medio tamponado usado para llevar a cabo las reacciones de unión es 1 x PBS de Dulbecco (con Ca++ y Mg++) más 0.1 mg/mL de BSA.

En general, la capacidad de un aptámero de modular la actividad funcional de un objetivo se puede evaluar usando modelos in vitro e in vivo, que variará dependiendo de la función biológica del objetivo. En algunas modalidades, los aptámeros de la invención pueden inhibir una función biológica conocida del objetivo. En otras modalidades, los aptámeros de la invención pueden estimular una función biológica conocida del objetivo. La actividad funcional de aptámeros de: la invención se puede evaluar usando modelos in vitro e in vivo diseñados para medir una función conocida de TFPI .

Las secuencias del aptámero y/o secuencias de aptámero minimizado también se pueden optimizar usando una química medicinal de aptámero dirigidida al perfil metabólico para la identificación específica del sitio de sitios de escisión y modificaciones para optimizar la estabilización de las secuencias de aptámero y/o secuencias de aptámero minimizado.

La química medicinal de aptámero dirigida al perfil metabólico implica la incubación de un aptámero original con un fluido de prueba para dar como resultado una mezcla. Luego, la mezcla se analiza para determinar la tasa de desaparición del aptámero principal o la cantidad o el porcentaje de aptámero remanente luego de la incubación, el perfil metabólico de aptámero específico y las secuencias de metabolitos de aptámero específicas. El conocimiento de las secuencias de los metabolitos específicos formados permite que se identifiquen los sitios de escisión de nucleasa con base en la masa del o de los metabolitos. Luego de llevar a cabo sistemáticamente el perfil metabólico y de identificar los sitios de escisión de aptámeros específicos, el método implica introducir sustituciones o modificaciones qu ímicas en o cerca de los sitios de escisión que están diseñados para optimizar la estabilidad de las secuencias de aptámeros y/o secuencias de aptámeros minimizadas.

En una modalidad, un aptámero se identifica y modifica mediante a) incubación de un aptámero principal con un fluido de prueba para dar como resultado una mezcla; b) análisis de la mezcla para identificar metabolitos del aptámero principal, detectando de este modo al menos un sitio de escisión del aptámero en el aptámero principal y c) introducir una sustitución química en una posición próxima a dicho al menos sitio de escisión del aptámero para dar como resultado un aptámero modificado. Esto potencia la estabilidad del aptámero y, en particular, la estabilidad del aptámero a endonucleasas y exonucleasas.

En algunas modalidades, el fluido de prueba es una matriz biológica, en particular una matriz biológica que se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: suero; plasma; fluido espinal cerebral; extractos tisulares, incluyendo fracción citosólica, fracción S9 y fracción microsomal; humor acuoso; humor vitreo y homogenatos tisulares. En algunas modalidades, la matriz biológica se deriva de una especie que se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: ratón, rata, mono, cerdo, humano, perro, cobayo y conejo. En algunas modalidades, el fluido de prueba comprende al menos una enzima purificada, en particular al menos una enzima purificada que se selecciona del grupo que consiste en: fosfodiesterasa de veneno de serpiente y DNAsa I .

En algunas modalidades, el paso de análisis incluye analizar el aptámero resultante usando cromatografía líquida y espectrometría de masas, en particular ionización por electroaspersión-cromatografía liquida-espectrometría de masas, electroforesis de gel de poliacrilamida o electroforesis capilar para determinar una posición de al menos un sitio de escisión del aptámero. En algunas modalidades, el paso de análisis incluye analizar el aptámero resultante usando un método bioanal ítico que se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (PAGE); electroforesis capilar; cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida-espectrómetría de masas (LC/MS), particularmente LC/MS/MS o LC/MS/MS/MS y, más particularmente, ionización por electroaspersión LC/MS (ESI-LC/MS), ESI-LC/MS/MS y ESI-LC/MS/MS/MS.

En algunas modalidades, la posición próxima incluye una posición que se selecciona del grupo que consiste en: una posición inmediatamente 5' al sitio de escisión del aptámero, una posición 5' en o dentro de tres nucleótidos del sitio de escisión del aptámero, una posición inmediatamente 3' al sitio de escisión del aptámero, una posición 3' en o dentro de tres nucleótidos del sitio de escisión del aptámero y en la unión de internucleótidos escindida.

En algunas modalidades, la sustitución química se selecciona del grupo que consiste en: una sustitución química en una posición de azúcar; una sustitución química en una posición de base y una sustitución química en una unión de internucleótidos. Más particularmente, una sustitución se se selecciona del grupo q ue consiste en: un nucleótido sustituido por un nucleótido diferente; una sustitución de purina por una pirimidina; una sustitución de 2'-am ina por cualquier nucleótido; una sustitución de 2'-desoxi dihidrouridina por una uridina; un 2'-desoxi-5-metil citidina por una citidina; una sustitución de 2-amino purina por una purina; un fosforotioato sustituido por un fosfodiéster; un fosforoditioato sustituido por un fosfodiéster; un nucleótido de 2'-desoxi sustituido por un nucleótido de 2'-OH , un nucleótido de 2'-OMe o un nucleótido de 2'-fluoro; un nucleótido de 2'-OMe sustituido por un nucleótido de 2'-OH, un nucleótido de 2'-desoxi o un nucleótido de 2'-fluoro; un nucleótido de 2'-fluoro sustituido por un nucleótido de 2'-OH, un nucleótido de 2'-desoxi o un nucleótido de 2'-OMe; o un nucleótido de 2'-0-metoxietilo sustituido por un nucleótido de 2'-OH, 2'-fluoro o 2'-desoxi; un nucleótido de 2'-0-metoxietil o nucleótido de desoxi por un nucleótido de 2'-fluoro; y la adición de uno o más PEG u otros polímeros u otros PK o endidad que influencia la distribución.

En modalidades adicionales, el paso de introducir estos métodos incluye además introducir más de una sustitución química en uno o más sitios de escisión o en un único sitio de escisión o ambos.

En otra modalidad, donde se detecta más de un sitio de escisión del aptámero, el paso de introducir estos métodos incluye además introducir al menos una sustitución química en la posición próxima asociada del sitio de escisión del aptámero determinada a ocurrir primero en el tiempo durante el paso de incubación o en cualquier otro(s) sitio(s) de escisión que proporciona las propiedades deseadas tras la introducción de una sustitución química.

En otras modalidades, estos métodos incluyen además el paso de analizar la estabilidad del aptámero modificado en el fluido de prueba. En algunas modalidades, la estabilidad del aptámero se evalúa para determinar el porcentaje del aptámero modificado que permanece intacto en el fluido de prueba en comparación con el porcentaje del aptámero principal que permanece intacto en el fluido de prueba. En algunas modalidades, el porcentaje de aptámero intacto se evalúa mediante un método bioanalítico que se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (PAGE); electroforesis capilar; HPLC y LC/MS, particularmente LC/MS/MS o LC/MS/MS/MS y, más particularmente, ESI-LC/MS, ESI-LC/MS/MS y ESI-LC/MS/MS/MS. En otras modalidades, el aptámero modificado es más estable en el fluido de prueba que el aptámero principal, preferentemente al menos 2 veces, más preferentemente al menos 5 vees y más preferentemente al menos 10 veces más estable.

En modalidades adicionales, estos métodos incluyen además determinar una constante de disociación o IC50 del aptámero modificado para su objetivo. En algunas modalidades, las sustituciones químicas se introducen individualmente en cada posición o en varias combinaciones en el aptámero y se determina la constante de disociación o IC50 para cada aptámero resultante. Se introducen las sustituciones químicas en una posición próxima al sitio de escisión del aptámero de modo q ue resulte una ú nica modificación quím ica en u na constante de disociación para el aptámero modificado que es la misma o menor a la del aptámero principal . En otra modalidad de la invención, el método incluye seleccionar un aptámero modificado q ue tiene una constante de disociación o I C50 para su objetivo que es la misma o menor a la del aptámero principal .

En otras modalidades, el aptámero modificado se une a un objetivo que tiene una actividad biológ ica y el método incl uye además analizar la actividad biológica del objetivo en presencia y ausencia del aptámero modificado. En otra modalidad, el método incluye además seleccionar u n aptámero modificado que se une a un objetivo que tiene una actividad biológica que es la misma o mejor a la del aptámero principal . La actividad biológ ica se puede medir en cualquier ensayo relevante, tal como un ensayo ELI SA o u n ensayo basado en cél u las .

En algunas modal idades, los pasos de i ncubar, analizar, introducir y probar se repiten frecuentemente hasta que se alcance la estabilidad deseada.

Los aptámeros de la invención se pueden adaptar de manera rutinaria con fines de diagnóstico de acuerdo con cualquier cantidad de técnicas empleadas por los expertos en la técnica. El uso de d iagnóstico puede incluir aplicaciones de diag nóstico in vivo o in vitro. Los agentes de diagnóstico solo necesitan ser capaces de permitir al usuario identificar la presencia de un objetivo dada en un sitio o concentración particular. Simplemente la capacidad de formar pares de unión con el objetivo puede ser suficiente para provocar una señal positiva con fines de diagnóstico. Los expertos en la técnica podrían también adaptar cualquier aptámero mediante procedimientos conocidos en la técnica para incorporar una etiqueta marcadora para rastrear la presencia de dicho ligando. Dicha etiqueta se podría usar en una cantidad de procedimientos de diagnóstico.

Aptámeros que tienen motivos inmunoestimuladores La invención proporciona aptámeros que se unen a TFPI y modulan su función biológica.

El reconocimiento de DNA bacteriano por el sistema inmune vertebrado se basa en el reconocimiento de dinucleótidos CG no metilados, en particular contextos de secuencia ("motivos CpG") Un receptor que reconoce dicho motivo es el receptor tipo Toll 9 ("TLR 9"), un miembro de una familia de receptores tipo Toll (~1 0 de miembros) que participan en la respuesta inmunitaria innata mediante el reconocimiento de componentes microbianos distintos. El TLR 9 se activa mediante secuencias CpG de oligodesoxinucleótido no metilado ("ODN") en una manera específica de secuencia. El reconocimiento de motivos CpG provoca mecanismos de defensa que conducen a respuestas inmunitarias finalmente adquiridas. Por ejemplo, la activación de TLR 9 en ratones induce la activación de células que presentan antígenos, regulación por aumento de moléculas MHC de clase I y M y expresión de citocinas y moléculas coestimuladoras importantes incluyendo I L-12 y IL-23. Esta activación potencia directa e indirectamente las respuestas de células B y T, incluyendo una regulación por aumento firme de la citocina TH1 IFN-gamma. En su conjunto, la respuesta a las secuencias CpG conduce a: protección contra enfermedades infecciosas, respuesta inmunitaria mejorada para vacunas, una respuesta eficaz contra el asma y citotoxicidad mediada por células dependiente del anticuerpo mejorada. De este modo, los ODN de CpG pueden proporcionar protección contra enfermedades infecciosas, funcionan como inmunoadyuvantes o medicamentos para el cáncer (monoterapia o en combinación con un mAb u otros medicamentos) y puede disminuir el asma o la respuesta alérgica.

Se ha identificado una variedad de diferentes clases de motivos CpG, cada una es el resultado del reconocimiento en una cascada diferente de eventos, liberación de citocinas y otras moléculas y activación de determinados tipos celulares. Véase, por ej . , CpG Motifs in Bacterial DNA and Their Immune Effects, Annu. Rev. Immunol. 2002, 20:709-760, la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Los motivos inmunoestimulatorios adicionales se describen en las siguientes Patentes estadounidenses, cada una de las cuales se incorporan a la presente mediante esta referencia: Patente estadounidense No. 6,207,646; Patente estadounidense No. 6,239, 1 16; Patente estadounidense No. 6,429, 199; Patente estadounidense No. 6,214,806; Patente estadounidense No. 6,653,292; Patente estadounidense No. 6,426,334; Patente estadounidense No. 6,514,948 y Patente estadounidense No. 6,498, 148. Cualquiera de estos CpG u otros motivos inmunoestimulatorios se pueden incorporar en un aptámero. La elección de aptámeros depende de la enfermedad o trastorno a tratar. Los motivos inmunoestimulatorios preferidos son como sigue a continuación (mostrado 5' a 3', izquierda a derecha) donde "r" designa una purina, "y" designa una pirimidina y "X" designa cualquier nucleótido: AACGTTCGAG (SEO. ID NO: 12); AACGTT; ACGT; rCGy; rrCGyy; XCGX; XXCGXX y X^CGY^; donde X, es G o A, X2 no es C, Yi no es G e Y2 es preferentemente T.

En aquellos casos donde se incorpora un motivo CpG en un aptámero que se une a un objetivo específico diferente a un objetivo conocido por unirse a motivos CpG y tras la unión estimula una respuesta inmunitaria (una "objetivo no CpG"), el CpG se ubica preferentemente en una región no esencial del aptámero. Las regiones no esenciales de aptámeros se pueden identificar mediante mutagénesis dirigida al sitio, análisis de eliminación y/o análisis de sustitución. Sin embargo, se puede usar cualquier ubicación que no interfiera significativamente con la capacidad del aptámero de unirse al objetivo no CpG. Además de estar incrustado dentro de la secuencia de aptámeros, el motivo CpG se puede agregar a cualquiera o ambos extremos 5' y 3' o, de otro modo, unir al aptámero. Se puede usar cualquier ubicación o medio de unión siempre y cuando la capacidad del aptámero de unirse al objetivo no CpG no sea significativamente interferida.

Tal como se usa en la presente, "estimulación de una respuesta inmunitaria" puede significar (1) la introducción de una respuesta específica (por ej., inducción de una respuesta Th1) o la producción de determinadas moléculas o (2) la inhibición o supresión de una respuesta específica (por ej . , inhibición o supresión de la respuesta Th2) o de determinadas moléculas.

Los aptámeros de la invención, incluyendo aptámeros que tienen uno o más CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias, se pueden identificar o generar mediante una variedad de estrategias usando, por ej. , el proceso SELEX™ descrito en la presente. Las secuencias inmunoestimulatorias incorporadas pueden ser DNA, RNA, DNA o RNA sustituido, y/o una combinación de DNA/RNA sustituido o no sustituido. En general, las estrategias se pueden dividir en dos grupos. Para ambos grupos de estrategias, los motivos CpG se incluyen para: a) estimular la respuesta inmunitaria para contrarrestar situaciones donde una respuesta inmunitaria reprimida es relevante para el desarrollo de la enfermedad (es decir, enfermedades de deficiencia inmune, tal como AI DS) y b) enfocar una respuesta inmunitaria estimulada contra un objetivo o tipo celular particular (es decir, células cancerosas) o para alterar una respuesta inmunitaria hacia un estado TH 1 y lejos del estado TH2 o TH 1 7 (es decir, incluyendo motivos CpG en un aptámero contra un objetivo antialérgica tal como IgE para contrarrestar una afección alérgica).

En el grupo uno, las estrategias se dirigen a identificar o generar aptámeros incluyendo tanto un motivo CpG u otra secuencia inmunoestimuladora como un sitio de unión para un objetivo, donde el objetivo (en lo sucesivo "objetivo no-CpG") es un objetivo diferente a la que se sabe que reconoce los motivos CpG u otras secuencias inmunoestimuladoras. En algunas modalidades de la invención, el objetivo no CpG es un objetivo de TFPI . La primera estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo no-CpG específica, preferentemente un objetivo que usa un grupo de oligonucleótidos donde un motivo CpG se ha incorporado a cada miembro del grupo como una región fija, o como una parte de la misma, por ej. , en algunas modalidades, la región aleatorizada de los miembros del grupo incluyen una región fija que tiene un motivo CpG incorporado allí y que identifica un aptámero que incluye un motivo CpG. La segunda estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ -para obtener un aptámero a un objetivo no-CpG específica y luego de la selección, unir un motivo CpG al extremo 5' y/o 3' u organizar un motivo CpG en una región, preferentemente una región no esencial, del aptámero. La tercera estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo no-CpG específica, donde durante la síntesis del grupo, la proporción molar de los diversos nucleótidos se polariza en uno o más pasos de adición de nucleótidos de forma tal que la región aleatorizada de cada miembro del grupo se enriquezca en motivos CpG e identificar un aptámero que incluye un motivo CpG. La cuarta estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo no-CpG específica e identificar un aptámero que incluye un motivo CpG. La quinta estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo no-CpG específica e identificar un aptámero que, tras la unión, estimula una respuesta inmunitaria pero que no incluye un motivo CpG.

En el grupo dos, las estrategias se refieren a identificar o generar aptámeros incluyendo un motivo CpG y/u otras secuencias que están unidas por los receptores para los motivos CpG (por ej. , TLR9 o los otros receptores tipo Toll) y tras la unión estimulan una respuesta inmunitaria. La primera estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo que se sabe que se une a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias y tras la unión estimulan una respuesta inmunitaria usando un grupo de oligonucleótidos donde un motivo CpG se ha incorporado a cada miembro del grupo como una región fija, o como una parte de la misma, por ej. , en algunas modalidades, la región aleatorizada de los miembros del grupo incluyen una región fija que tiene un motivo CpG incorporado allí y que identifica un aptámero que incluye un motivo CpG. La segunda estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo que se sabe que se une a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias y tras la unión estimulan una respuesta inmunitaria y luego unir un motivo CpG al extremo 5' y/o 3' u organizar un motivo CpG en una región, preferentemente una región no esencial, del aptámero. La tercera estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo que se sabe que se une a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias y tras la unión estimulan una respuesta inmunitaria, donde durante la síntesis del grupo, la proporción molar de los diversos nucleótidos se polariza en uno o más pasos de adición de nucleótidos de forma tal que la región aleatorizada de cada miembro del grupo se enriquezca en motivos CpG e identificar un aptámero que incluye un motivo CpG . La cuarta estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo que se sabe que se une a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias y tras la unión estimulan una respuesta inmunitaria e identificar un aptámero que incluye un motivo CpG. La quinta estrategia de este grupo incluye realizar SELEX™ para obtener un aptámero a un objetivo que se sabe que se une a motivos CpG u otras secuencias inmunoestimulatorias e identificar un aptámero que, tras la unión, estimula una respuesta inmunitaria pero no incluye un motivo CpG.

Modulación de farmacocinética y biodistribución de compuestos terapéuticos de aptámeros Es importante unir las propiedades farmacocinéticas para todos los compuestos terapéuticos basados en oligonucleótidos, incluyendo aptámeros, a la aplicación farmacéutica deseada. Los aptámeros deben poder distribuirse a órganos y tejidos objetivos y permanecen en el cuerpo (sin modificación) por un período de tiempo coherente con el régimen de dosificación deseado.

La invención proporciona materiales y métodos para afectar la farmacocinética de las composiciones de aptámeros y, en particular, la capacidad de comprobar la farmacocinética de aptámeros. La de (es decir, la capacidad de modular) la farmacocinética de aptámeros se logra a través de la conjugación de fragmentos de modificación (por ej., polímeros de PEG) al aptámero y/o la incorporación de nucleotidos modificados (por ej. , 2'-fluoro o 2'-0-metilo) o uniones de internucleótidos modificados para alterar la composición química del aptámero. La capacidad de ajustar la farmacocinética del aptámero se usa en la mejora de las aplicaciones terapéuticas existentes o, de forma alternativa, en el desarrollo de nuevas aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, por ej. , en marcos de cuidado anti-neoplástico o agudo donde se puede desear la rápida eliminación o inactivación del fármaco, se desea disminuir los tiempos de permanencia de los aptameros en la circulación. De manera alternativa, en otras aplicaciones terapéuticas, por ej. , terapias de mantenimiento donde se desea la circulación sistémica de un compuesto terapéutico, se desea aumentar los tiempos de residencia de aptámeros en la circulación.

Además, la capacidad de ajuste de la farmacocinética del aptámero se usa para modificar la disposición, por ejemplo la absorción, distribución, metabolismo y eliminación (ADME) de un aptámero para ajustar su objetivo terapéutico en un sujeto. La capacidad de ajuste de la farmacocinética de un aptámero puede afectar la forma y extensión de la absorción del aptámero, la distribución de un aptámero a través de los fluidos y tejidos del cuerpo, las transformaciones metabólicas consecutivas del aptámero y su(s) metabolito(s) y finalmente, la eliminación del aptámero y su(s) metabolito(s). Por ejemplo, en algunas aplicaciones terapéuticas, se puede desear la alteración de la biodistribución de un compuesto terapéutico de aptámeros en un esfuerzo por dirigir un tipo particular de tejido o un órgano específico (o conjunto de órganos) o aumentar la propensión de ingresar tipos celulares específicos. En estas aplicaciones, el producto terapéutico de aptámero preferentemente se distribuye en tejidos específicos y/u órganos y se acumula allí para causar un efecto terapéutico. En otras solicitudes terapéuticas, se puede desear que los tejido objetivo exhiban un marcador celular o un síntoma asociado con una enfermedad dada, lesión celular u otra patolog ía anormal, de modo que el compuesto terapéutico de aptámeros se acumule preferentemente en el tejido afectado. Por ejemplo, la PEGIIación de un producto terapéutico de aptámero (por ej . , PEGilación con un polímero PEG de 20 kDa u otro polímero o entidad de conjugación) se usa para dirigirse a los tejidos inflamados, de forma tal que el producto terapéutico del aptámero PEGilado preferentemente se acumule en el tejido inflamado.

Para determinar los perfiles farmacocinéticos de los productos terapéuticos de aptámero (por ej. , conjugados de aptámero o aptámeros que tienen químicas alteradas, tal como nucleótidos modificados), una variedad de parámetros se estudian en sujetos normales, por ej. , animales o humanos de prueba o en sujetos enfermos, por ej. , modelos animales específicos de TFPI , tales como modelos animales de hipercoagulación o hipocoagulación o humanos con una deficiencia de coagulación. Dichos parámetros incluyen, por ejemplo, la vida media de distribución o eliminación (ti/2), la depuración plasmática (CL), el volumen de distribución (Vss), el área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC), la concentración máxima de suero o plasma observada (Cmáx) y el tiempo de permanencia promedio (MRT) de una composición de aptámeros. Tal como se usa en la presente, el término "AUC" se refiere al área bajo la curva de concentración plasmática de un compuesto terapéutico de aptámeros contra el tiempo después de la administración de aptámeros. El valor de AUC se usa para estimar la exposición del aptámero y se usa también para determinar la biodisponibilidad de un aptámero después de una vía de administración extravascular, tal como, por ej. , administración subcutánea. La biodisponibilidad se determina tomando la proporción de la AUC obtenida después de la administración subcutánea en comparación con la AUC obtenida después de la administración intravenosa y normalizándolas en comparación con las dosis usadas después de cada administración (es decir, la proporción porcentual del aptámero administrado después de la administración subcutánea en comparación con el mismo aptámero administrado mediante administración intravenosa en la misma dosis o dosis normalizada). El valor CL es la medición de la remoción del producto terapéutico de aptámero original de la circulación sistémica. El volumen de distribución (Vd) es un término que relaciona la cantidad de aptámero en el cuerpo en un momento con su concentración plasmática. El Vd se usa para determinar cuán bien se elimina un fármaco del plasma y se distribuye a tejidos y/u órganos. Un Vd mayor implica una distribución amplia, unión tisular extensa o ambas distribución amplia y unión tisular extensa. Hay tres volúmenes básicos de distribución: (i) el volumen aparente o inicial de distribución en el momento cero obtenido de extrapolación retrógrada de la curva de concentración-tiempo; (ii) el volumen calculado una vez que se completó la distribución, aproximándose a Vdss, donde el volumen del área depende de la cinética de eliminación y (iii) el volumen de distribución calculado una vez que se completó la distribución. El parámetro que se debería medir idealmente es Vdss dado que el parámetro es independiente de la cinética de eliminación. Si el Vss para el aptámero es mayor al volumen sanguíneo, se sugiere que se distribuya el aptámero fuera de la circulación sistémica y es probable que se encuentre en los tejidos u órganos. También se pueden usar los parámetros farmacodinámicos para evaluar las características del fármaco.

Para determinar la distribución de productos terapéuticos de aptámeros (por ej. , conjugados de aptámeros o aptámeros que tienen químicas alteradas, tales como nucleótidos modificados), se usa un estudio de distribución de tejido o autorradiografía de cuerpo completo cuantitativa usando un aptámero radiomarcado que se administra a un modelo animal normal o modelo animal específico objetivo enfermo. Se puede cuantificar la acumulación del aptámero radiomarcado en el sitio específico.

La farmacocinética y biodistribución de un aptámero descrito en la presente, tal como un aptámero estabilizado, se puede modular de una manera controlada mediante conjugación de un aptámero a un fragmento modulador, tal como, de modo no limitante, una molécula, péptido o polímero pequeño, o mediante incorporación de nucleótidos modificados en un aptámero. La conjugación de un fragmento modificador y/o composición química de nucleótido de alteración altera aspectos fundamentales del tiempo de permanencia del aptámero en la circulación y distribución dentro y para los tejidos y células.

Además del metabolismo por nucleasas, los medicamentos de oligonucleótidos se someten a la eliminación mediante filtración renal. Como tal, un oligonucleótido resistente a nucleasa administrado intravenosamente presenta típicamente una vida media in vivo de <30 minutos, a menos que se pueda bloquear la filtración. Esto se puede lograr mediante facilitación de una rápida distribución fuera de la corriente sanguínea en tejidos o medíante aumento del peso molecular aparente del oligonucleótido por encima del corte de tamaño eficaz para el glomérulo. La conjugación de medicamentos de bajo peso molecular a un polímero de PEG (PEGilación), tal como se describe a continuación, puede alargar dramáticamente los tiempos de residencia de los aptámeros en la circulación, disminuyendo así la frecuencia de dosificación y mejorando la efectividad contra objetivos vasculares.

También se pueden usar los nucleótidos modificados para modular la depuración plasmática de aptámeros. Por ejemplo, un aptámero no conjugado que incorpora, por ejemplo, 2'-fluoro, 2'-Ome y/o químicas estabilizantes de fosforotioato, que son títpícos de aptámeros de generación actual ya que presente un alto grado de resistencia a la nucleasa in vitro e in vivo, muestra una rápida distribución a los tejidos, principalmente al hígado y riñon, en comparación con el aptámero no modificado.

Acidos nucleicos derivados de PAG Tal como se describe anteriormente y como se muestra en la Figura 1 1 , la derivación de ácidos nucleicos con polímeros no inmunogénicos de alto peso molecular tiene el potencial de alterar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de ácidos nucleicos que los convierte en agentes terapéuticos más eficaces y/o seguros. Los cambios favorables en la actividad pueden incluir resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, filtración disminuida por los ríñones, exposición disminuida al sistema inmune y distribución alterada del compuesto terapéutico a través del cuerpo.

Las composiciones de aptámeros de la invención se pueden derivar con uno o más fragmentos de polialquilenglicol ("PAG"). Los polímeros típicos usados en la invención incluyen polietilenglicol ("PEG"), también conocido como óxido de polietileno ("PEO") y polipropilenglicol (incluyendo poliisopropilenglicol). De manera adicional, se pueden usar copolímeros aleatorios o de bloque de diferentes óxidos de alquileno en varias aplicaciones. En una forma común, un polialquilenglicol, tal como PEG, es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: HO-CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2-OH. Este polímero, alfa-, omega-dihidroxilpolietilenglicol, puede estar representado también como HO-PEG-OH, donde se entiende que el símbolo -PEG- representa la siguiente unidad estructural: -CH2CH20-(CH2CH20) n-CH2CH2-, donde n varía típicamente de 4 a 10,000.

Los polímeros de PAG adecuados para indicaciones terapéuticas tienen típicamente las propiedades de solubilidad en agua y en varios solventes orgánicos, falta de toxicidad y falta de inmunogenicidad. Un uso de PAG es la unión covalente del polímero a moléculas insolubles para hacer al "conjugado" de molécula de PAG resultante soluble. Por ejemplo, se ha demostrado que el fármaco insoluble en agua paclitaxel, cuando se acopla a PEG, se hace soluble en agua. Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60:331-336 (1995). Los conjugados de PAG se usan a veces no solo para potenciar la solubilidad y estabilidad sino también para prolongar la vida media de circulación sanguínea de moléculas y distribución posterior dentro del cuerpo.

Los compuestos derivados de PAG conjugados a los aptámeros de la invención tienen típicamente entre 5 y 80 kDa de tamaño, sin embargo, se puede usar cualquier tamaño. La elección depende del aptámero y la aplicación. Otros compuestos derivados de PAG de la invención tienen entre 10 y 80 kDa de tamaño. Aún otros compuestos derivados de PAG de la invención tienen entre 10 y 60 kDa de tamaño. En algunas modalidades, los fragmentos de PAG derivados a composiciones de la invención son fragmentos de PEG que tienen un peso molecular que varía de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 kDa de tamaño. En algunas modalidades, el PEG es PEG lineal, en tanto en otras modalidades, el PEG es PEG ramificado. En aún otras modalidades, el PEG es un PEG ramificado de 40kDa tal como se describe en la Figura 6. En algunas modalidades, el PEG ramificado de 40 kDa está unido al extremo 5' del aptámero tal como se describe en la Figura 7.

La producción de los PEG de alto peso molecular (>10 kDa) puede ser difícil, ineficaz y costosa. Para sintetizar los conjugados ácido nucleico-PEG de alto peso molecular, se generan PEG activados de peso molecular más alto. Los métodos para generar dichas moléculas implican la formación de un PEG activado lineal o un PEG activado ramificado en el cual se unen dos o más PEG a un núcleo central que porta el grupo activado. Las porciones terminales de estas moléculas de PEG de peso molecular más alto, es decir, los fragmentos hidroxilo (-OH) relativamente no reactivos, se pueden activar o convertir en fragmentos funcionales para la unión de uno o más de los PEG a otros compuestos en sitios de reacción en el compuesto. Los PEG activados ramificados tendrán más de dos extremos y, en casos donde se han activado dos o más extremos, dichas moléculas de PEG activadas de peso molecular más alto se conocen en la presente como, PEG multi-activados. En algunos casos, no todos los extremos en una molécula de PEG ramificado están activados. En casos donde cualesquiera dos extremos de una molécula de PEG ramificado están activados, dicha molécula de PEG se conoce como un PEG bi-activado. En algunos casos donde solo un extremo en una molécula de PEG ramificado está activado, dicha molécula de PEG se conoce como mono-activada. En otros casos, la molécula de PEG lineal es di-funcional y a veces se conoce como "PEG dio!". Las porciones terminales de la molécula de PEG son fragmentos hidroxilo no reactivos, los grupos -OH, que se pueden activar o convertir en fragmentos funcionales para la unión del PEG a otros compuestos en sitios reactivos sobre los compuestos. Dichos PEG dioles activados se conocen en la presente como PEG homo bi-activados. Las moléculas se generan usando cualquiera de una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Además de activar PEG usando uno de los métodos descritos anteriormente, se puede modificar una o ambas funcionalidades del alcohol terminal de la molécula de PEG para permitir diferentes tipos de conjugación a un ácido nucleico. Por ejemplo, convertir una de las funcionalidades del alcohol terminal a una amina o tiol permite el acceso a conjugados de urea y tiouretano. Otras funcionalidades incluyen, por ej . , maleimidas y aldehidos.

En varias aplicaciones, es deseable cubrir la molécula de PEG en un extremo con un fragmento esencialmente no reactivo de modo que la molécula de PEG sea mono-funcional (o mono-activada). En el caso de los tratamientos de proteína, que generalmente muestran múltiples sitios de reacción para las PEG activadas, las PEG activadas homo bifuncionales llevan a la reticulación extensiva, proporcionando agregados poco funcionales. Para generar PEG mono-activados, un fragmento hidroxilo en el extremo de la molécula de PEG diol se sustituye típicamente con un fragmento de extremo metoxi no reactivo, -OCH3. En esta modalidad, el polímero puede estar representado por eO-CH2CH20-(CH2CH20)n-CH2CH2-OH y se conoce normalmente como "mPEG", donde n varía típicamente de 4 a 10,000.

El otro extremo no cubierto de la molécula de PEG se convierte típicamente en un fragmento de extremo reactivo que se puede activar para la unión en un sitio reactivo en una superficie o una molécula, tal como una proteína, péptido u oligonucleótido.

En algunos casos, es deseable producir un reactivo de PEG hetero bi-funcional, donde un extremo de la molécula de PEG tiene un grupo reactivo, tal como N-hidroxisuccinimida o carbonato de nitrofenilo, en tanto el extremo opuesto contiene una maleimida u otro grupo de activación. En estas modalidades, dos funcionalidades diferentes, por ejemplo, amina y tiol, se pueden conjugar al reactivo de PEG activado en momentos diferentes.

Composiciones farmacéuticas La invención incluye también composiciones farmacéuticas que comprenden un aptámero que se une a TFPI . En algunas modalidades, las composiciones incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero de TFPI farmacológicamente aceptable o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, solo o en combinación, con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticalmente aceptables.

Las composiciones pueden comprender uno o más aptámeros de TFPI . Por ejemplo, las composiciones pueden comprender ARC1 9499. De manera alternativa, las composiciones pueden comprender ARC19882. De manera alternativa, las composiciones pueden comprender ARC19499 y otro aptámero de TFPI . En modalidades donde la composición incluye al menos dos aptámeros que pueden ser el mismo aptámero o dos aptámeros diferentes, los aptámeros se pueden, opcionalmente, enlazar o, de otro modo, acoplar entre sí. De preferencia, las composiciones comprenden ARC 19499, solas o en combinación con otro aptámero de TFPI . De manera alternativa, las composiciones comprenden un aptámero de TFPI en combinación con otro agente. De preferencia, las composiciones comprenden ARC 19499 en combinación con otro agente.

Tal como se usa en la presente, el térm ino "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a formas sali nas del compuesto activo que se preparan con contraiones q ue son no tóxicos en las condiciones de uso y son compatibles con u na formulación estable. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables de aptámeros de TFP I incluyen clorh idratos, sulfatos, fosfatos , acetatos, fu maratos, maleatos y tartratos.

Los términos "portador farmacéuticamente aceptable", "medio farmacéuticamente aceptable" o "exci piente farmacéuticamente aceptable", tal como se usan en la presente , significan ser compati bles con los otros ing redientes de la formulación y no perjud iciales a quien los recibe. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técn ica . Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables se pueden encontrar en , por ejem plo, Goodman y Gillmans, The Pharmacological Basis oí Therapeutics, última edición.

Las composiciones farmacéuticas inclu irán generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz del o de los componentes activos de la terapia, por ej . , un aptámero de TFPI de la invención que está disuelto o disperso en un portador o medio farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables preferidos incluyen, de modo no limitante, solución salina fisiológica, solución salina amortiguada con fosfato y solución de g lucosa . Sin em bargo, se contempla que se pueden usar también otros portadores farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de otros medios o portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en las composiciones incluyen, de modo no limitante, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias amortiguadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicérido parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de hidrógeno potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietienglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros bloquedaores de polietilen-polioxipropilen, polietilenglicol y grasa de lana. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener también excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes conservantes, estabilizadores, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales o amortiguadores para modificar o mantener el pH, osmoralidad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, tasa de disolución o absorción de la formulación. Para las composiciones sólidas, los excipientes incluyen grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

Las composiciones farmacéuticas se preparan de acuerdo con métodos de mezcla, granulación o recubrimiento convencionales, y contienen típicamente 0.1 % a 99.9%, por ejemplo, 0.1 % a 75%, 0.1 % a 50 %, 0.1 % a 25%, 0.1 % a 1 0%, 0.1 a 5%, preferentemente 1 % a 50%, del componente activo.

Un experto en la técnica conoce la formulación de composiciones farmacéuticas. Típicamente, dichas composiciones se pueden formular como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en líquidos antes de la inyección; como comprimidos u otros sólidos para administración oral; como cápsulas de liberación de tiempo para formulaciones de liberación lenta, o en cualquier otra forma usada actualmente, incluyendo inhalantes, bálsamos, lociones, cremas, gotas para los ojos y similares. Las composiciones se pueden formular también como supositorios, usando, por ejemplo, polialquilenglicoles como el portador. En algunas modalidades, los supositorios se preparan a partir de suspensiones o emulsiones grasas. El uso de formulaciones estériles, tal como lavados basados en solución salina, mediante cirujanos, médicos o trabajadores de la salud para tratar un área particular en el campo de operación puede ser también particularmente útil.

Las composiciones se pueden formular como formas de dosificación oral, tales como comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, elíxires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Por ejemplo, para administración oral en forma de un comprimido o cápsula (por ej. , una cápsula de gelatina), el componente de fármaco activo se puede combinar con un portador farmacéuticamente aceptable no tóxico oral, tal como etanol, glicerol, agua y similares. Asimismo, cuando se desea o necesita, también se pueden incorporar aglutinantes, lubricantes, agentes desintegrantes y agentes colorantes adecuados a la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de aluminio-magnesio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales, tal como glucosa o beta-lactosa, endulzantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tal como acacia, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol y similares. Los desintegrantes incluyen, de modo no limitante, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantano, agar, ácido alg ínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes y similares. Los diluyentes incluyen, por ej. , lactosa, dextrosa , sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular también en sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas se pueden formar de una variedad de fosfolípidos que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

En algunas modalidades, una película de componentes lipidíeos se hidrata con una solución acuosa del fármaco para formar una capa lipídica que encapsula el fármaco, tal como se describe en la patente estadounidense No. 5,262,564. Por ejemplo, los aptámeros descritos en la presente se pueden proporcionar como un complejo con un compuesto lipofílico o no inmunogénico, compuesto de alto peso molecular construido usando métodos conocidos en la técnica. De manera adicional, los liposomas pueden cargar aptámeros en su superficie para dirigir y portar agentes citotóxicos internamente para mediar la muerte celular. Un ejemplo de complejos asociados con ácido nucleico se proporciona en la patente estadounidense No. 6,01 1 ,020.

Las composiciones de la invención pueden acoplarse también con polímeros adecuados como portadores de fármacos dirigidos. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil-metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol o polietilenóxidopolilisina sustituido con residuos de palm itoilo. Asimismo, las composiciones de la invención se pueden acoplar a una clase de polímeros biodegradables útiles en el logro de la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque anfipáticos o reticulados de hidrogeles.

Las composiciones de la invención también se pueden usar junto con dispositivos médicos.

La cantidad de ingrediente activo y volumen de la composición a administrar depende del animal hospedador a tratar. Las cantidades precisas de compuesto activo requeridas para la administración dependen del juicio del médico y son específicas para cada individuo.

Se utiliza típicamente un volumen mínimo de una composición requerida para dispersar el compuesto activo. Los reg ímenes adecuados para administración también son variables, pero se caracterizarían mediante administración inicial del compuesto y control de los resultados y luego una proporción de dosis controladas adicionales en intervalos adicionales.

Administración Las composiciones se pueden administrar a un vertebrado, preferentemente un mam ífero y, más preferentemente, un humano. Los términos "paciente" y "sujeto" se usan de manera intercambiable a lo largo de la solicitud y estos términos incluyen tanto los sujetos humanos como veterinarios.

En modalidades donde los aptámeros de TFPI son aptámeros antagonistas, las composiciones de aptámeros de TFPI proporcionadas en la presente se administran a los sujetos en una cantidad eficaz para inhibir, reducir, bloquear o, de otro modo, modular la inhibición mediada por TFPI de la coagulación sanguínea. Las composiciones de aptámeros de TFPI pueden inhibir, reducir, bloquear o, de otro modo, modular completa o parcialmente la inhibición mediada por TFPI de la coagulación sanguínea. Se considera que los aptámeros de TFPI inhiben o, de otro modo, modulan la actividad de TFPI cuando los aptámeros ocasionan un aumento en la generación de trombina (tal como, por ejemplo, trombina pico, potencial de trombina endógena o tiempo de demora) sobre el plasma hemofílico que es equivalente a al menos 1 -2% del remplazo de factor.

Las composiciones se pueden administrar mediante varias vía de administración. Dichas vías de administración incluyen, de modo no limitante, vías orales; vías tópicas, tal como intranasalmente, vaginalmente o rectalmente; y vías parenterales, tal como administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intraarticular e intratecal. Las vías de administración adecuadas también se pueden usar en combinación, tal como administración intravenosa, seguido de administración subcutánea. Sin embargo, la vía de administración la determina el médico tratante. De preferencia, las formulaciones se administran intravenosamente. Más preferentemente, las formulaciones se administran subcutáneamente.

Las formas de dosificación oral se pueden administrar como comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, elíxires, tinturas, suspensiones, jarabes o emulsiones.

Las formas de dosificación tópica incluyen cremas, ungüentos, lociones, atomizadores en aerosol y geles para veh ículos intranasales, inhalantes o parches transdérmicos.

Las formas de dosificación parenteral incluyen jeringas prellenadas, y soluciones y polvos liofilizados que se reconstituyen antes de la administración.

El régimen de dosificación que utiliza los aptámeros de la invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y afección médica del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente y el aptámero particular o la sal del mismo empleados. Un médico o veterinario experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del fármaco requerido para prevenir, contrarrestar o detener el avance de la afección.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando varios regímenes de tratamiento. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido, tal como cuando un paciente no sufre de un episodio hemorrágico. De manera alternativa, las composiciones se pueden administrar a demanda, es decir, según se necesite, tal como cuando un paciente sufre de un episodio hemorrágico. En una modalidad alternativa adicional, las composiciones se pueden administrar como una combinación de terapia de mantenimiento y terapia a demanda. En dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso la dosificación de las composiciones se aumentaría según se necesite hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se disminuiría la dosificación de las composiciones hasta el nivel de mantenimiento anterior. En otra dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se administra al paciente otra terapia de trastorno hemorrágico (tal como, Factor VI I I) hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se discontinuaría la otra terapia de trastorno hemorrágico. Durante todo este tiempo, las composiciones se continuarían administrando como una terapia de mantenimiento. En aún otra dicha modalidad, las composiciones se pueden administrar como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se disminuiría la dosificación de las composiciones y se administraría otra terapia de trastorno hemorrágico al paciente (tal como, Factor VI I I) hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se aumentaría la dosificación de las composiciones hasta el nivel de mantenimiento anterior y se discontinuaría la otra terapia de trastorno hemorrágico. En otra dicha modalidad, se puede administrar otra terapia de trastorno hemorrágico (tal como, Factor VI I I) como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se administrarían las composiciones al paciente hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se discontinuaría la terapia con las composiciones. Durante todo este tiempo, se seguiría administrando la otra terapia de trastorno hemorrágico como una terapia de mantenimiento. En aún otra dicha modalidad, se puede administrar otra terapia de trastorno hemorrágico (tal como, FVI II) como una terapia de mantenimiento en una dosis definida durante un período de tiempo definido hasta que ocurra una hemorragia, en cuyo caso se disminuiría la dosificación de la otra terapia de trastorno hemorrágico y se administrarían las composiciones al paciente hasta que se detenga la hemorragia, en cuyo momento se aumentaría la dosificación de la otra terapia de trastorno hemorrágico hasta el nivel de mantenimiento anterior y se discontinuaría la terapia con las composiciones.

Indicaciones Las composiciones se usan para tratar, prevenir, retrasar el avance de o mejorar las patolog ías mediadas por el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), incluyendo el tratamiento de patologías de trastornos hemorrágicos que implican la inhibición mediada por TFPI de la coagulación sangu ínea. Las patolog ías a ser tratadas, prevenidas, demoradas o mejoradas se seleccionan del grupo que consiste en: deficiencias del factor de coagulación, congénitas o adquiridas, leves o moderadas o graves, que incluyen hemofilia A (deficiencia del Factor VII I), hemofilia B (deficiencia del Factor IX) y hemofilia C (deficiencia del Factor XI); hemofilia A o B con inhibidores; otras deficiencias del factor (V, VII , X, XI I I , protrombina, fibrinógeno); deficiencia de un inhibidor de a2-plasmina; deficiencia del inhibidor activador de plasminógeno 1 ; deficiencia de múltiples factores; anormalidades del factor funcional (por ej. , disprotrombinemia); hemorragia de las articulaciones (hemartrosis), incluyendo, de modo no limitante, tobillo, codo y rodilla; hemorragia espontánea en otras ubicaciones (músculo, gastrointestinales, boca, etc.); choque hemorrágico; hemorragia intracranial; laceraciones y otras hemorragias asociadas con traumatismos; coagulopatía traumática aguda; coagulopatía asociada con cáncer (por ej . , leucemia promielocítica aguda); enfermedad de von Willebrand; coagulación intravascular diseminada; enfermedad hepática; menorragia; trombocitopenia y hemorragia asociada con el uso de anticoagulantes (por ej . , antagonistas de la vitam ina K, antagonistas de FXa, etc.).

Las composiciones se pueden administrar también antes de, durante y/o después de un procedimiento médico. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar junto con (antes, durante y/o después de) procedimientos médicos, tales como: profilaxis y/o tratamiento asociado con hemorragia causada por procedimientos dentales, cirug ía ortopédica incluyendo, de modo no limitante, artroplastía (por ej. , remplazo de caderas), sinovectom ía quirúrgica o con radionúclidos (RSV), cirug ía mayor, venipuntura, transfusión y amputación.

Justificación terapéutica Sin pretender limitarse por la teoría con respecto al mecanismo de acción, la siguiente justificación terapéutica se ofrece únicamente a modo de ejemplo.

Se esperaría que los inhibidores del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) potencien la generación de trombina a través de la vía del factor tisular/Factor VI I a (también conocida como la vía extrínseca). En un individuo normal, la activación de la vía extrínseca estimula la iniciación de la respuesta a la generación de trombina, lo que resulta en una cantidad pequeña de trombina activada. Luego de la iniciación, esta vía se desactiva rápidamente mediante la acción inhibitoria de TFPI. La propagación subsiguiente de la respuesta a la generación de trombina depende de la activación de la retroalimentación mediada por trombina de la vía intrínseca, que incluye el Factor VI I I (FVI I I) y Factor IX (FIX). La propagación es necesaria para generar una cantidad suficientemente grande de trombina para catalizar la formación de un coágulo estable. Los individuos con una insuficiencia del Factor VI I I (hemofilia A) o Factor IX (hemofilia B) tienen una respuesta deteriorada a la propagación. Los individuos con una insuficiencia grave (<1 %) no pueden producir trombina a través de la vía intrínseca que depende de estas proteínas. Esta condición da como resultado la incapacidad de producir suficiente trombina para tener una activación de plaquetas adecuada, generación de fibrina y formación de coágulos estable. Sin embargo, estos individuos tienen una vía extrínseca intacta. La inhibición del TFPI podría permitir la continuación de la respuesta de iniciación y permitir que la propagación ocurra a través de la vía extrínseca, lo que permite una generación suficiente de trombina para remplazar parcial o completamente la vía intrínseca insuficiente y reducir así el riesgo de hemorragia. Los individuos con insuficiencia leve o moderada en estos factores, que también están en riesgo de hemorragia aumentada, se podrían beneficiar también de la coagulación sanguínea potenciada ocasionada por la inhibición del TFPI . Además, en pacientes con vías intrínseca y extrínseca normales que tienen hemorragias debido a otras razones, tal como traumatismos, la inhibición del TFPI puede proporcionar un estímulo hemostático que podría controlar la hemorragia. Los pacientes con otras insuficiencias de factores de coagulación, insuficiencias plaquetarias y defectos vasculares asociados con la hemorragia, también se podrían beneficiar por un tratamiento que inhibiría el TFPI .

Terapia combinada Una modalidad de la invención comprende un aptámero de TFPI o una sal del mismo o una composición farmacéutica usada en combinación con uno o más tratamientos adicionales para enfermedades o trastornos hemorrágicos, tales como otros factores procoagulantes u otros inhibidores de las moléculas reguladoras de la cascada de coagulación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar también en combinación con otro fármaco, tal como: concentrados de complejo de protrombina activado (APCC), Agente de desvío del inhibidor del factor ocho (FEI BA®), Factor Vl la recombinante (por ej . , Novoseven®), Factor VI I I recombinante (Advate®, Kogenate®, Recombinate®, Helixate®, ReFacto®), Factor VI I I derivado de plasma (Húmate P®, Hemofil M®), Factor IX recombinante (BeneFIX®), Factor IX derivado de plasma (Bebulin VH®, Konyne®, Mononine®), crioprecipitado, acetato de desmopresina (DDAVP), ácido épsilon-aminocaproico o ácido tranexámico. De manera alternativa, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en combinación con otra terapia, tal como: transfusión de sangre o productos sanguíneos, plasmaferesis , terapia de inducción de la tolerancia inmunológica con altas dosis del factor de remplazo, terapia de la tolerancia inmunológica con agentes inmunodepresores (por ej . , prednisona, rituximab) o terapia del dolor. En general, estarán disponibles las formas de dosificación actualmente disponibles de los agentes terapéuticos conocidos y los usos de terapias sin fármaco para usar en dichas combinaciones.

La "terapia combinada" (o "co-terapia") incluye la administración de un aptámero de TFPI y al menos un segundo agente o tratamiento como parte de un régimen de tratamiento específico que pretende proporcionar el efecto beneficioso de la co-acción de estos tratamientos o agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, de modo no limitante, co-acción farmacocinética o farmacodinámica que resulta de la combinación de tratamientos o agentes terapéuticos. La administración de estos tratamientos o agentes terapéuticos en combinación se lleva a cabo típicamente durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).

La terapia combinada puede, pero en general no se pretende para, abarcar la administración de dos o más de estos tratamientos o agentes terapéuticos como parte de reg ímenes de monoterapia separados que ocasionan casual y arbitrariamente las combinaciones de la invención. La terapia combinada es pretendida para abarcar la administración de los tratamientos o agentes terapéuticos de una manera secuencial. Esto es, donde cada tratamiento o agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos tratamientos o agentes terapéuticos, o al menos dos de los tratamientos o agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, medíante la administración al sujeto de una única inyección que tiene una proporción fija de cada agente terapéutico o en inyecciones únicas múltiples para cada uno de los agentes terapéuticos.

La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada tratamiento o agente terapéutico se puede llevar a cabo mediante cualquier vía adecuada incluyendo, de modo no limitante, vías tópicas, vías intravenosas, vías subcutáneas, vías intramusculares y absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. Los tratamientos o agentes terapéuticos se pueden administrar mediante la misma vía o diferentes vías. Por ejemplo, un primer tratamiento o agente terapéutico de la combinación seleccionada se puede administrar mediante inyección en tanto los otros tratamientos o agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar subcutáneamente. De manera alternativa, por ejemplo, todos los tratamientos o agentes terapéuticos se pueden administrar subcutáneamente, o todos los tratamientos o agentes terapéuticos se pueden administrar mediante inyección. La secuencia en la cual se administran los tratamientos o agentes terapéuticos no es crítica a menos que se observe lo contrario.

La terapia combinada puede abarcar también la administración de los tratamientos o agentes terapéuticos tal como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos. En los casos en que la terapia combinada comprende un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos se puede llevar a cabo en cualquier momento adecuado siempre y cuando se logre un efecto beneficioso de la co-activación de la combinación del agente terapéutico y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en casos adecuados, el efecto beneficioso aún se logra cuando se retira temporalmente el tratamiento sin fármacos de la administración del agente terapéutico, tal vez por días o aún semanas.

Agentes de inversión La invención se refiere además a agentes que invierten los efectos de los aptámeros de TFPI , conocidos en la presente como "agentes de inversión del TFPI". El agente puede ser cualquier tipo de molécula, tal como una proteína, anticuerpo, compuesto orgánico de molécula pequeña o un oligonucleótido.

De preferencia, un agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que tiene 10-1 5 nucleótidos de longitud. Sin embargo, no hay límites para la longitud del agente de inversión.

De preferencia, un agente de inversión de TFPI se une a un aptámero de TFPI . Un agente de inversión se puede unir a un aptámero de TFPI de longitud completa o un fragmento del mismo. Dicha unión se puede realizar a través de interacciones iónicas, enlace covalente, apareamiento de bases complementario, enlace de hidrógeno o cualquier otro tipo de enlace químico. De preferencia, dicha unión se realiza a través del apareamiento de bases complementario. Sin pretender limitarse por la teoría, un agente de inversión de TFPI actúa mediante la hibridación a un aptámero de TFPI , desestabilizando así la estructura secundaria y terciaria del aptámero de TFPI y previniendo la unión del aptámero de TFPI a TFPI . Mediante la prevención de la unión del aptámero de TFPI a TFPI , el efecto de la interacción de unión, por ej. , efecto terapéutico, y/o la estimulación o inhibición de la vía molecular, se puede modular, proporcionando un medio para controlar el alcance de la interacción de unión y el efecto asociado.

Un agente de inversión de TFPI puede ser un ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico y desoxírribonucleico mezclado. De preferencia, un agente de inversión de TFPI es monocatenario. De preferencia, un agente de inversión de TFPI comprende todos los residuos de 2'-0 Metilo y una 3'-desoxitimidina invertida. Sin embargo, un agente de inversión de TFPI puede contener cualesquiera nucleótidos, modificados o no modificados, junto con cualquier otra modificación 3' o 5' que se puede encontrar en los aptámeros.

Los ejemplos de agentes de inversión de TFPI incluyen, de modo no limitante: SEQ I D NO: 1 5, que es ARC23085; SEQ I D NO: 16, que es ARC23087; SEQ I D NO: 17, que es ARC23088; SEQ I D NO: 18, que es ARC23089.

De preferencia, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mA-mG-mC-mC-mA-mA-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mU-mC-mC (SEQ ID NO: 1 5), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo (que se conoce también en la técnica como un residuo que contiene 2'-0Me, 2'- metoxi o 2'-OCH3).

De manera alternativa, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mU-mA-mU-mA-mU-mA-mC-mG-mC-mA-mC-mC-m U-mA-mA (SEQ ID NO: 16), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo.

De manera alternativa, el agente de inversión de TFPI es un ácido nucleico que comprende la estructura establecida a continuación: mC-mU-mA-mA-mC-mG-mA-mG-mC-mC (SEQ ID NO: 17), donde "mN" es un residuo que contiene 2'-0 Metilo.

El nombre químico de ARC23085 es 2'-OMe-adenil¡l-(3'?5')- 2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-guanilil-(3'?5 2'-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2'-OMe-aden¡lil-(3'?5')- 2'-OMe-urac¡lil-(3,?5')- 2'-OMe-uracilil-(3'?5')-2,-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidililo.

El nombre químico de ARC23087 es 2'-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'- OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2,-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-c¡tidilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-c¡tidilil-(3,?5')- 2'-OMe-aden¡lil-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-urac¡lil-(3'?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenililo.

El nombre químico de ARC23088 es 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidil¡l-(3'?5')- 2'-OMe-citidililo.

El nombre químico de ARC23089 es 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'- OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-uracilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenil¡l-(3'?5')-2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenilil-(3'?5')-2'-OMe-guanilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'?5')- 2'-OMe-citidilil-(3'-?5')-2'-OMe-adenilil-(3'?5')- 2'-OMe-adenililo.

La invención incluye también agentes de inversión de TFPI que tienen 70% de identidad o más con respecto a cualquiera de las SEQ I D NOs: 15, 16, 1 7 o 1 8. Por ejemplo, los agentes de inversión de TFPI pueden tener 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 1 00% de identidad con respecto a cualquiera de las SEQ I D NOs: 15, 16, 17 o 1 8.

La invención incluye también composiciones farmacéuticas que contienen agentes de inversión de TFPI que se unen a aptámeros de TFPI . En algunas modalidades, las composiciones incluyen una cantidad eficaz de un agente de inversión del TFPI farmacológicamente activo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, solo o en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Las composiciones pueden contener uno o más agentes de inversión del TFPI diferentes. Los agentes de inversión del TFPI se administran a sujetos en una cantidad eficaz para invertir el efecto terapéutico del aptámero de TFPI . Las composiciones se pueden adm inistrar mediante varias vías de administración , tal como, por ejemplo, tópicamente, intranasalmente o parenteralmente. El régimen de dosificación para u n agente de inversión del TFPI dependerá de una variedad de factores incluyendo tipo, especie, edad , peso, sexo y afección médica del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de admin istración ; la función renal y hepática del paciente: la cantidad de aptámero de TFPI usado para tratar a un paciente y el agente de inversión del TFPI particular o sal del mismo empleados. U n físico o veterinario experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del agente de inversión del TFPI requerida para invertir el efecto terapéutico de un aptámero de TFP I .

La invención incl uye además agentes q ue neutralizan la actividad hemostática del aptámero de TFPI . Dicho agente se puede unir al TFPI y prevenir su inhibición por el aptámero de TFPI , o el agente puede inhibir factores de coagulación corriente abajo (por ej . , FXa o trombi na) en una manera que contrarresta la actividad hemostática del aptámero de TFPI. Dicho agente puede incluir, de modo no lim itante, anticoagulantes, tal como heparina no fraccionada o heparina de bajo peso molecular. Un estudio de Wesselschmidt (Wesselschm idt et al. , "Structural requirements for tissue factor pathway inh ibitor interactions with factor Xa and heparin" , Blood Coagul Fibrinolysis, vol. 4, pp. 661 -669 ( 1 993)) muestra que la hepari na se une al TFP I a través de interacciones con los dom inios K3 y de extremo C, q ue podrían interferir tanto directa como indirectamente con la capacidad de los aptámeros de TFPI de unirse al TFPI . Asim ismo, en el mismo estudio, se observó que la unión a la heparina facilita la actividad inhibitoria de FXa del TFPI , lo que tendería a contrarrestar adicionalmente la actividad hemostática de los aptámeros de TFPI . Finalmente, la heparina es bien conocida por inhibir la trombina, el FXa y otros factores de coagulación a través de un mecanismo dependiente de la antitrombina. Estas actividades podrían neutralizar la capacidad de los aptámeros de TFPI de estimular la generación de trombina y la formación de coágulos. En el caso en que los efectos hemostáticos de los aptámeros de TFPI indujeran la trombosis, se podría administrar uno de estos agentes para detener su avance. Un físico o veterinario experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del anticoagulante u otro agente neutralizante requerido para invertir el efecto hemostático de un aptámero de TFPI .

Kits Las composiciones farmacéuticas también pueden estar envasadas en un kit. El kit comprenderá la composición, junto con instrucciones con respecto a la administración del aptámero de TFPI. El kit puede comprender también uno o más de los siguientes: una jeringa o jeringa prellenada, una bolsa o botella intravenosa, un frasco, el mismo aptámero de TFPI en una forma de dosificación diferente u otro aptámero de TFPI . Por ejemplo, el kit puede comprender tanto una formulación intravenosa como una formulación subcutánea de un aptámero de TFPI de la invención. De manera alternativa, el kit puede comprender un aptámero de TFPI liofilizado y una bolsa intravenosa de solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato. La forma del kit es particularmente ventajosa cuando los componentes separados se deben administrar en formas de dosificación diferentes (es decir, parenteral y oral) o se administran en intervalos de dosificación diferentes. El kit puede comprender adicionalmente un agente de inversión de TFPI , junto con instrucciones con respecto a la administración del agente de inversión. El kit puede contener tanto una formulación intravenosa como una formulación subcutánea del aptámero de TFPI de la invención. De manera alternativa, el kit puede contener un agente de inversión del TFPI liofilizado y una bolsa intravenosa de solución.

De preferencia, los kits se almacenan a 5±3°C. Los kits se pueden almacenar a temperatura ambiente o se pueden congelar a -20°C.

Regulación del TFPI La invención proporciona también un método para regular el TFPI en el cual una molécula se une o, de otro modo, interactúa con una o más porciones del TFPI , donde al menos una porción está fuera de los dominios K1 y K2 del TFPI , tal como la región K3/extremo C. La molécula puede ser cualquier tipo de molécula, tal como, por ejemplo, un compuesto orgánico de molécula pequeña, un anticuerpo, una proteína o un péptido, un ácido nucleico, un siRNA, un aptámero o cualquier combinación de los mismos. De preferencia, la molécula es un compuesto orgánico de molécula pequeña. Más preferentemente, la molécula es un anticuerpo. Más preferentemente, la molécula es un aptámero. Por ejemplo, la molécula se puede unir a o, de otro modo, interactuar con una porción lineal o una porción conformacional del TFPI . Una molécula se une a o, de otro modo, interactúa con una porción lineal de TFPI cuando la molécula se une a o, de otro modo, interactúa con una extensión contigua de residuos de aminoácidos que están unidos por enlaces peptídicos. Una molécula se una a o, de otro modo, interactúa con una porción conformacional de TFPI cuando la molécula se une a o, de otro modo, interactúa con residuos de aminoácidos no contiguos que están unidos mediante plegamiento u otros aspectos de la estructura secundaria y/o terciaria de la cadena polipeptídica. De preferencia, la molécula se une al menos en parte a una o más porciones de TFPI maduro (por ejemplo, Figura 3A) que se selecciona del grupo que consiste en: aminoácidos 148-170, aminoácidos 150-170, aminoácidos 1 55-175, aminoácidos 160-1 80, aminoácidos 165-185, aminoácidos 1 70-190, aminoácidos 1 75-1 95, aminoácidos 180-200, aminoácidos 1 85-205, aminoácidos 190-210, aminoácidos 195-215, aminoácidos 200-220, aminoácidos 205-225, aminoácidos 210-230, aminoácidos 215-235, aminoácidos 220-240, aminoácidos 225-245, aminoácidos 230-250, aminoácidos 235-255, aminoácidos 240-260, aminoácidos 245-265, aminoácidos 250-270, aminoácidos 255-275, aminoácidos 260-276, aminoácidos 148-1 75, aminoácidos 150-175, aminoácidos 1 50-180, aminoácidos 1 50-1 85, aminoácidos 1 50-190, aminoácidos 1 50-195, aminoácidos 150-200, aminoácidos 1 50-205, aminoácidos 1 50-21 0, aminoácidos 1 50-215, aminoácidos 150-220, aminoácidos 1 50-225, aminoácidos 1 50-230, aminoácidos 1 50-235, aminoácidos 1 50-240, aminoácidos 1 50-245, aminoácidos 1 50-250, aminoácidos 1 50-255, aminoácidos 1 50-260, aminoácidos 150-265, aminoácidos 1 50-270, aminoácidos 1 50-275, aminoácidos 1 50-276, aminoácidos 1 90-240, aminoácidos 1 90-276, aminoácidos 240-276, aminoácidos 242-276, aminoácidos 161 -1 81 , aminoácidos 162-181 , aminoácidos 1 82-240, aminoácidos 1 82-241 y aminoácidos 182-276. La molécula comprende preferentemente una constante de disociación para TFPI humano o una variante del mismo, de menos de 1 00 µ?, menos de 1 µ?, menos de 500 nM, menos de 1 00 nM, preferentemente 50 nM o menos, preferentemente 25 nM o menos, preferentemente 1 0 nM o menos, preferentemente 5 nM o menos, más preferentemente 3 nM o menos, aún más preferentemente 1 nM o menos y más preferentemente 500 pM o menos.

Se pueden realizar varias modificaciones y variaciones de la invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen a modo de ejemplo únicamente, y la invención estará limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los cuales tiene derecho dichas reivindicaciones.

Todas las publicaciones y los documentos de patentes citadas en la presente se incorporan a la presente mediante esta referencia como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o documento se incorpora a la presente mediante esta referencia. La mención de publicaciones y documentos de patentes no se pretende como una admisión de que cualquiera es técnica previa pertinente, tampoco constituye admisión alguna con respecto al contenido o fecha de las mismas. Habiendo sido ahora descrita la invención a modo de descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se puede poner en práctica en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos a continuación tienen fines de ilustración y no limitación de las reivindicaciones que siguen a continuación.

Ejemplos En los ejemplos, se usaron uno o más de los siguientes aptámeros de TFPI para realizar los diversos experimentos. ARC26835 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 1. ARC17480 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 2. ARC19498 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 3. ARC19499 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 4. ARC19500 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 5. ARC19501 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 6. ARC26835 es la secuencia de aptámeros núcleo para cada ARC17480, ARC19498, ARC19499, ARC19500 y ARC19501. ARC31301 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 7. ARC18546 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 8. ARC19881 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 9. ARC19882 es el aptámero descrito en la SEQ ID NO: 10. ARC31301 es la secuencia de aptámeros núcleo para cada ARC18546, ARC19881 y ARC19882.

Ejemplo 1 Este ejemplo demuestra cómo se generó ARC 1 9499.

Los experimentos de selección in vitro se realizaron usando un grupo de moléculas de oligonucleótidos modificadas, cada una de las cuales contenía residuos de dC, mA, mG y m U , e inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) humano recombinante, que se obtuvo de American Diagnostica (catálogo #4500PC, Stamford, CT). Se realizaron rondas frecuentes de selección para unión al TFPI , seguido de amplificación, para generar ARC14943, un precursor de 84 nucleótidos de longitud de ARC19499. ARC14943 se minimizó de 84 nucleótidos a 32 nucleótidos (ARC26835) usando programas de predicción de plegamiento computacional y eliminación sistemática. La adición de un residuo de 3' desoxitimidina invertida a ARC26835 dio como resultado ARC 17480, una molécula de 33 nucleótidos de longitud. La adición de un grupo 5'-hexilamina a ARC 1 7480 dio como resultado ARC 1 9498. Luego esta molécula se PEGiló a través del grupo 5'-hexilamina con un fragmento de PEG de 40 kDa para dar como resultado ARC 1 9499.

Ejemplo 2 Este ejemplo demostró que ARC 17480 se une firmemente al TFPI in vitro en un experimento de unión dot-blot, en ausencia y presencia de tRNA competidor.

Se incubó ARC17480 radiomarcado con diferentes concentraciones de TFPI . ARC 17480 unido al TFPI se capturó luego en una membrana de filtro de nitrocelulosa. La proporción de ARC17480 radiomarcado unido al filtro de nitrocelulosa sobre ARC 17480 radiomarcado total agregado se determinó y trazó como el porcentaje de ARC17480 unido como una función de concentración de proteína. Un ejemplo de una traza de unión de ARC17480/TFPI se muestra en la Figura 12A. Los datos se ajustaron a modelos de unión monofásica y bifásica de aptámero y proteína. Este experimento se repitió once veces y se determinaron las KD usando modelos de unión monofásica y bifásica para cada conjunto de datos. La KD media usando un ajuste monofásico fue 4.0 ± 1 .5 nM y usando un ajuste bifásico fue 1 .7 ± 0.7 nM. Los ajustes monofásicos y bifásicos a los datos asumen modelos diferentes para la interacción de ARC 17480 al TFPI , aunque los ajustes en y de ellos no soportan explícitamente ningún modelo de unión. Independientemente del modelo usado para ajustar los datos, la KD determinada para la unión de ARC 1 7480 al TFPI fue esencialmente la misma. Cuando las KD determinadas de los ajustes monofásico y bifásico se tomaron en consideración , la KD media de la unión de ARC1 7480 al TFPI fue 2.9 ± 1 .6 nM. Esta KD media no supone un modo de interacción de unión entre ARC17480 y TFPI y, como tal, es la determinación más firme de la interacción de unión entre el aptámero y la proteína. ARC1 7480 mantuvo la unión al TFPI humano en presencia de tRNA, lo que indica que la unión fue específica. Se observó un cambio en la afinidad de unión de ARC 1 7480 a TFPI en presencia de 0.1 mg/mL de tRNA con una KD media de 42 ± 1 2 nM. En la Figura 12B se muestra una gráfica de ejemplo de unión de ARC1 7480 al TFPI en presencia y ausencia de tRNA.

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que ARC1 7480, ARC1 9498, ARC 19499, ARC26835, ARC1 9500, ARC 1 9501 , ARC31301 , ARC 18546, ARC19881 y ARC19882 no marcados compiten con ARC1 7480 radiomarcado para la unión al TFPI . Este ejemplo demuestra también que todos estos aptámeros tienen afinidades por el TFPI que son similares a las observadas con ARC 1 7480.

Se evaluó cada aptámero para determ inar la unión al TFPI en un ensayo de competencia de unión. Para estos experimentos, se incubó el TFPI humano (American Diagnostica, Stamford, CT, catálogo #4500PC) con cantidades traza de ARC1 7480 radiomarcado y diferentes concentraciones del aptámero competidor no marcado (5000 nM-0.25 nM para todos los aptámeros excepto ARC1 9499; 000 nM-0.05 nM para ARC19499). Para experimentos con ARC 1 7480 y ARC 19499 en la Figura 13A, se usaron 60 nM del TFPI . Para todos los otros experimentos (Figuras 13B-E), se usaron 10 nM del TFPI . Se incluyó ARC 1 7480 como un competidor en cada experimento como un control. Para cada aptámero, se usó el porcentaje de ARC 17480 radiomarcado unido en cada concentración de aptámero competidor para su análisis. Se trazó el porcentaje de ARC 1 7480 radiomarcado unido como una función de concentración de aptámero y se ajustó a la ecuación y=(máx/(1 + x/IC50)) + int, donde y=el porcentaje de ARC1 7480 radiomarcado unido, x=la concentración de aptámero, máx=el máximo de ARC 17480 radiomarcado unido e int=intercepción y, para generar un valor de IC50 para competencia de unión. Las Figuras 13A-E muestran gráficas de experimentos de competencia con ARC1 7480, ARC1 9498, ARC 19499, ARC26835, ARC1 9500, ARC 1 9501 , ARC31301 , ARC 18546, ARC 19881 y ARC19882. Todas estas moléculas compiten de manera similar con ARC17480 radiomarcado para unirse al TFPI . Estos experimentos demuestran que ARC 17480, ARC1 9498, ARC1 9499, ARC26835, ARC19500, ARC1 9501 , ARC31 301 , ARC 18546, ARC 19881 y ARC19882 se unen todos de manera similar al TFPI de longitud completa.

Ejemplo 4 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI se unen específicamente al TFPI .

En este experimento, se analizó ARC1 7480 para determinar la unión a una variedad de proteínas que son moléculas clave en la cascada de coagulación, moléculas cuya inhibición mostraría un perfil similar a la inhibición del TFPI , o moléculas que son similares en estructura o función para el TFPI. Las proteínas investigadas fueron TFPI, Factor Va (FVa), Factor XI I (FXI I), antitrombina (ATI 11), cofactor II de la heparina (HCI I), alfa-trombina, protrombina, Factor Vl la (FVI Ia), Factor IXa (FlXa), Factor Xa (FXa), Factor Xla (FXIa), calicreína, plasmina, alfa-1 antitripsina (serpina-A1 ), TFPI-2 y GST-TFPI-2. En presencia de hasta 0.5-1 µ? de cada proteína, ARC1 7480 no tuvo afinidad significativa alguna para las proteínas analizadas relacionadas mecánicamente y con la secuencia (Figuras 14A-D). ARC17480 mostró algo de unión a FXI I en concentraciones mayores de proteína. Esta unión se eliminó en presencia de 0.1 mg/mL de tRNA (Figura 14D), lo que indica que la unión era probablemente no específica.

Estos experimentos indican que cualquier efecto en la coagulación que están mediados por los aptámeros de TFPI probablemente se deben a la unión e inhibición directas del TFPI.

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra que ARC19499 se une firmemente al TFPI en un ensayo de unión basado en placas. Este ejemplo demuestra también que ARC19498 se une firmemente al TFPI debido a su competencia con ARC19499 para unirse al TFPI en un ensayo de unión basado en placas.

Para evaluar la afinidad de unión de ARC19499 al TFPI, se diluyó la proteína del TFPI humano recombinante (0.5 mg/mL) en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) hasta una concentración final de 15 µg/mL, y se agregaron 100 µ? a una placa Maxisorb de 96 pocilios y se incubó durante la noche a 4°C. Luego se retiró la solución del TFPI y la placa se lavó posteriormente 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado (DPBS + 0.05% de Tween 20) a temperatura ambiente. Luego se bloqueó la placa con 200 µL· de 10 mg/mL de albúmina en suero bovino (BSA) en DPBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró la solución de bloqueo de BSA y la placa se lavó de nuevo 3 veces con 200 ? de amortiguador de lavado. Luego se agregó ARC19499 diluido en serie en DPBS con 0.1% de BSA a la placa y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego de lavar 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado, 100 µ? de 0.5 µ9/G??_ de anticuerpo anti-PEG monoclonal de conejo (Epitomics) se agregó a la placa y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró la solución del anticuerpo anti-PEG y la placa se lavó tal como se describe anteriormente. Luego, 100 µ? de anticuerpo secundario IgG-HRP anti-conejo (Cell Signaling Technology), diluidos 1000 veces en amortiguador de ensayo, se agregaron a cada pocilio y se incubaron durante 30 minutos. Después de lavado 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado, se agregaron 100 µ? de solución de TMB (Pierce) a cada pocilio y se incubaron durante 2 minutos antes de agregar 100 µ? de solución de detención H2S04 2N) a cada pocilio para detener la reacción. Luego se leyó la placa de ensayo a 450 nm usando un contador multietiqueta Victor3V 1420 (Perkin Elmer). Cinco experimentos de unión diferentes sugirieron que la afinidad de unión entre ARC19499 y TFPI recombinante es de 30 nM en el ensayo de unión basado en placas. Los datos de uno de estos experimentos se muestra en la Figura 15.

Para evaluar la afinidad de ARC19498 hacia la proteína del TFPI, se estableció un ensayo de competencia de unión ARC19499:TFPI. Se diluyó la proteína del TFPI humano recombinante (0.5 mg/mL) en DPBS hasta una concentración final de 15 pg/mL, y se agregaron 100 pL a una placa Maxisorb de 96 pocilios y se incubó durante la noche a 4°C. Luego se retiró la solución del TFPI y la placa se lavó posteriormente 3 veces con 200 pL de amortiguador de lavado (DPBS + 0.05% de Tween 20) a temperatura ambiente. Luego se bloqueó la placa con 200 µ? de 10 mg/mL de BSA en DPBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Luego se retiró la solución de bloqueo de BSA y la placa se lavó de nuevo 3 veces con 200 µ?_ de amortiguador de lavado. Se diluyó en serie ARC19498 y se mezcló en concentraciones diferentes con 20 nM de ARC19499 en DPBS en 0.1% de BSA. Las mezclas ARC19498:ARC19499 se agregaron a la placa y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego de lavar 3 veces con 200 pL de amortiguador de lavado, 100 pL de 0.5 pg/mL de anticuerpo anti-PEG monoclonal de conejo (Epitomics) se agregó a la placa y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró la solución del anticuerpo anti-PEG y la placa se lavó tal como se describe anteriormente. Luego, 100 pL de anticuerpo secundario IgG-HRP anticonejo (Cell Signaling Technology), diluidos 1000 veces en amortiguador de ensayo, se agregaron a cada pocilio y se incubaron durante 30 minutos. Después de lavado 3 veces con 200 pL de amortiguador de lavado, se agregaron 100 pL de solución de TMB (Pierce) a cada pocilio y se incubaron durante 2 minutos antes de agregar 100 pL de solución de detención (H2S04 2N) a cada pocilio para detener la reacción. Luego se leyó la placa de ensayo a 450 nm usando un contador multietiqueta Victor3V 1420 (Perkin Elmer). La inhibición porcentual de la unión de ARC19499 se calculó usando 0 nM de ARC19498 en 20 nM de ARC19499 como 0% de inhibición, y 0 nM de ARC19498 y 0 nM de ARC19499 como 100% de inhibición. La IC50 se calculó con base en logística de 4 parámetros usando el software Graphpad Prism 4. La Figura 16 muestra dos réplicas de este experimento, las cuales dieron una IC50 de 20 nM para la competencia de ARC19498 con ARC19499 en este ensayo. Estos resultados sugieren que ARC 1 9498 tiene una afinidad de unión para TFPI en el ensayo de unión basado en placas que es similar a la observada para ARC1 9499.

Ejemplo 6 Este ejemplo examina las regiones en el TFPI donde se une ARC1 7480. Los experimentos de unión dot blot se llevaron a cabo con ARC17480 radiomarcado y varias proteínas del TFPI truncadas, y los experimentos de competencia de unión se llevaron a cabo con ARC17480 radiomarcado, TFPI y heparina o heparina de bajo peso molecular (LMWH). Las proteínas usadas para los experimentos de unión se describen en la Tabla 1 a continuación.

Los rastros de ARC 1 7480 radiomarcado se incubaron con concentraciones diferentes (500 nM-0.7 nM) de TFPI de longitud completa y TFPI-His (Tabla 1 ). La Figura 1 7A muestra que ARC 17480 tuvo unión reducida a TFPI-His en comparación con su unión al TFPI de longitud completa. Este experimento sugirió que los 20 aminoácidos del extremo C del TFPI, que no están en TFPI-His pero están presentes en el TFPI de longitud completa, contribuyen a la unión de ARC17480 a TFPI .

Los rastros de ARC1 7480 radiomarcado se incubaron con concentraciones diferentes de TFPI-K1 K2 truncado (500 nM-0.008 nM) y la proteína de dominio 3-extremo C (500 nM-0.7 nM) (Tabla 1 ). La Figura 1 7B muestra que ARC 1 7480 no tuvo unión detectable a TFPI-K1 K2 truncado y unión muy débil a la proteína de dominio K3-extremo C que fue solamente detectable en concentraciones mayores de la proteína. Los rastros de ARC1 7480 radiomarcado se incubaron con concentraciones diferentes del péptido del extremo C (1 0 µ?-0.17 nM) (Tabla 1 ). Luego se agregó neutravidina (~100 nM de monómero) a la solución de unión para ayudar en la captura de los complejos de aptámero: péptido en un filtro de nitrocelulosa. La cantidad de aptámero radiomarcado capturado en un filtro de nitrocelulosa se cuantificó y comparó con la cantidad total de aptámero radiomarcado para generar una curva de unión, que se muestra en la Figura 17B. ARC 1 7480 mostró unión débil al péptido del extremo C en concentraciones mayores del péptido.

Los rastros de ARC 1 7480 radiomarcado se incubaron con concentraciones diferentes del TFPI de longitud completa (500 nM-0.008 nM) en ausencia o presencia de 0.1 mg/mL de heparina no fraccionada (Figura 18A). La inclusión de heparina en el experimento de unión suprimió completamente la unión de ARC1 7480 al TFPI . En un experimento separado, Los rastros de ARC1 7480 radiomarcado se incubaron con 1 2.5 nM del TFPI de longitud completa y concentraciones diferentes (5 µ?-0.25 nM) de heparina no fraccionada o heparina de bajo peso molecular (LMWH). La Figura 18B muestra que tanto la heparina no fraccionada como la LMWH compitió con ARC1 7480 por la unión al TFPI de una forma dependiente de la concentración. La heparina fue un competidor más eficaz que la LMWH. Las regiones de K3-extremo C del TFPI han estado implicadas en la unión de glicocálix y esta es la región de la proteína donde deberían unirse la heparina y la LMWH. Estos experimentos sugieren que la región de K3-extremo C del TFPI es importante para la unión de ARC 17480 al TFPI .

En conjunto, estos experimentos demuestran que el dominio del extremo C participa de manera similar en la unión de ARC17480 al TFPI. Estos experimentos demuestran también que la región de unión de ARC17480 en el TFPI no está completamente contenida dentro de la región K1 -K2 de la proteína, o dentro de la región K3-extremo C de la proteína. Las regiones requeridas para la unión de ARC 1 7480 abarcan probablemente más de un dominio de la proteína.

Tabla 1 : Proteínas usadas para los experimentos de unión extremo C + 242-276 Ejemplo 7 Este ejemplo examina las regiones en el TFPI donde se unen ARC1 7480 y ARC 1 9499. Para estos experimentos, los anticuerpos que se unen a diferentes regiones en el TFPI se usaron para competir en la unión al TFPI con ARC1 9499 en un ensayo de unión basado en placas, o para competir en la unión al TFPI con ARC17480 en un ensayo de unión dot-blot. Los anticuerpos usados para la competencia se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Este ejemplo dem uestra q ue el a nticuerpo AD4903 (America n Diagnostica, catálogo #4903) compitió para la unión de ARC1 9499 a TFPI en un ensayo de unión basado en placas y compitió para la unión de ARC 1 7480 a TFPI en un ensayo de unión dot-blot (Figura 19A y Figura 20C). El anticuerpo AD4903 se cultivó contra un fragmento del TFPI que contiene residuos de aminoácidos 22-87 del dominio K1 y se une al TFPI en algún lugar de esta región (Tabla 2). Este ejemplo demuestra también que el anticuerpo ACJK-4, que se cultivó contra un péptido que contenía los residuos de aminoácidos 148-1 62 que son parte de la región que interviene entre los dominios K2 y K3 del TFPI , compitió débilmente con ARC1 7480 para la unión al TFPI en un ensayo de unión dot-blot (Figura 20B). Este ejemplo también demuestra que los anticuerpos ACJK-1 y ACJK-2, que provocan péptidos que contenían residuos de aminoácidos 261 -276 y 245-262, respectivamente, que son parte del dominio de extremo C de TFPI , parcialmente competían para la unión de ARC 1 9499 con TFPI en un ensayo de unión basado en placas (Figura 19B). Este ejemplo demuestra además que varios anticuerpos diversos que se unen a regiones diferentes del TFPI no compitieron con la unión de ARC1 9499 al TFPI en un ensayo de unión basado en placas y no compitieron con ARC 17480 en la unión al TFPI en un ensayo de unión basado en dot-blot. Los anticuerpos usados para los experimentos de competencia se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Para los experimentos de unión basados en placas, se usaron 400 ng/pocillo del TFPI (American Diagnostics, cat# 4900PC) en 100 µ?_ de solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) para recubrir una placa axisorb de 96 pocilios a 4°C. Luego se retiró la solución del TFPI y posteriormente se lavó la placa 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado (DPBS + 0.05% de Tween 20) a temperatura ambiente. Luego se bloqueó la placa con 200 µ? de 10 mg/mL de albúmina en suero bovino (BSA) en DPBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se retiró la solución de bloqueo de BSA y la placa se lavó 3 veces con 200 µ? de amortiguador de lavado. Los anticuerpos de competencia se mezclaron y diluyeron en serie con ARC19499 en la concentración final de 25 nM de ARC19499 y 0.1 % de BSA en DPBS, y luego se agregó la mezcla a la placa de ensayo y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. ARC 19498 se mezcló de manera similar con ARC19499 y se usó como un control positivo en el ensayo de competencia de anticuerpos. Luego se lavaron los pocilios, tal como se describe anteriormente. Para los experimentos que usan los anticuerpos AD4903, AD4904 y 7035-A01 para la competencia, se agregaron 100 µ?_ de 0.5 µg/mL de anticuerpo anti-PEG monoclonal de conejo (Epitomics, cat # 2061-1) en un amortiguador de ensayo a la placa y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente. Luego se retiró la solución de anticuerpo anti-PEG y la placa se lavó tal como se describe anteriormente, seguido de la adición de 100 µ? de anticuerpo secundario IgG-HRP anti-conejo diluido 1:1000 en amortiguador de ensayo a cada pocilio (Cell Signaling Technology, cat # 7074) y se incubó durante 30 minutos. Se retiró la solución del anticuerpo secundario y la placa se lavó, tal como se describe anteriormente. Para los anticuerpos ACJK1-ACJK5, se agregaron 0.5 µg/mL de 100 µ? de anticuerpo anti-PEG monoclonal de conejo biotinilado (Epitomics, cat # 2173) en amortiguador de ensayo a la placa de ensayo y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente, seguido de lavaron, tal como se describe anteriormente. Luego se retiró el anticuerpo y se lavó la placa tal como se describe anteriormente, seguido de la adición de 100 µ? de estreptavidina-HRP (4800-30-06) de R&D Systems (Minneapolis, MN) diluida 200 veces en DPBS y se incubó durante 1 hora adicional a temperatura ambiente. La estreptavidina-HRP se retiró luego y la placa se lavó tal como se describe anteriormente. Luego se agregaron 100 µ? de solución de TMB (Pierce, #34028) a cada pocilio y se incubaron durante 2 minutos, seguido de la adición de 100 µ?. de solución de detención (H2S04 2N) a cada pocilio para detener la reacción. Luego se leyó la placa de ensayo a 450 nm usando un contador multietiqueta Victor3V 1420 (Perkin Elmer). La inhibición porcentual de unión se calculó usando 0 nM de anticuerpo en 25 nM de ARC19499 como 0% de inhibición, y 0 nM de anticuerpo y 0 n de ARC19499 como 100% de inhibición. La IC50 se calculó con base en log ística de 4 parámetros usando el software Prism 4 Graphpad.

Tal como se muestra en la Figura 1 9A, el anticuerpo AD4903, que se une al dominio K1 del TFPI , compitió con ARC1 9499 para la unión al TFPI recombinante en el ensayo de unión basado en placas. Los anticuerpos ACJK-1 y ACJK-2, que se unen a regiones dentro de la región del extremo C del TFPI , compitió parcialmente para la unión de ARC19499 al TFPI en el ensayo de unión basado en placas (Figura 19B). Los anticuerpos AD4904, ACJK-3, ACJK-4, ACJK-5 y 7035-A01 no mostraron competencia para la unión de ARC 19499 al TFPI en el ensayo de unión basado en placas (Figura 19A y B). Estos experimentos sugieren que la región K1 y la región del extremo C del TFPI están implicadas en la unión de ARC 1 9499 al TFPI .

Los anticuerpos en la Tabla 2 también se analizaron en un ensayo de unión de competencia basado en dot-blot. En estos experimentos, Los rastros de ARC17480 radiomarcado se incubaron con 1 0 nM de TFPI recombinante, con o sin la adición del anticuerpo. Los anticuerpos se analizaron en 1000 nM, 333 nM , 1 1 1 nM, 37.0 nM, 1 2.4 nM , 4.12 nM, 1 .37 nM, 0.46 nM, 0.15 nM y 0.051 nM. Se incluyó ARC1 7480 como un competidor en cada experimento como un control. Para cada molécula, se usó el porcentaje de ARC 17480 radiomarcado unido en cada concentración de aptámero competidor para su análisis. Se trazó el porcentaje de ARC 1 7480 radiomarcado unido como una función de concentración de aptámero y se ajustó a la ecuación y=(máx/(1 + x/IC5o)) + int, donde y=el porcentaje de ARC 17480 radiomarcado unido, x=la concentración de aptámero, máx=el máximo de ARC17480 radiomarcado unido e int=intercepción y, para generar un valor de IC50 para competencia de unión. Las Figuras 20 muestran los experimentos de competencia de unión levados a cabo con ACJK- 1 , ACJK-2, ACJK-3, ACJK-4, ACJK-5, AD4903 y AD4904. Estos experimentos demuestran que el anticuerpo AD4903 compitió para la unión de ARC17480 al TFPI en el ensayo de competencia dot blot (Figura 20C). ACJK-4 compitió parcialmente para la unión en este ensayo (Figura 20B), en tanto ACJK-1 , ACJK-2, ACJK-3, ACJK-5 y AD4904 no mostraron competencia significativa para la unión con ARC 17480 (Figuras 20A-C) . Estos experimentos sugieren que la región K1 y las regiones que intervienen K2-K3 del TFPI están implicadas en la unión de ARC 17480 al TFPI .

En conjunto, estos experimentos demuestran que la región K1 del TFPI está implicada probablemente en la unión de ARC17480/ARC 19499 al TFPI . Estos experimentos sugieren también que la región C y las regiones que intervienen K2-K3 del TFPI pueden estar implicadas en la unión de aptámeros. La falta de competencia de unión de anticuerpos a otras regiones del TFPI no impide su participación en la unión de aptámeros.

Tabla 2: Anticuerpos usados en los ensayos de competencia de ARC19499 Ejemplo 8 Este ejemplo demuestra que ARC 19499 tiene actividad in vitro que inhibe el TFPI en el ensayo de inhibición de tenasa extrínseca (Xasa).

En este ensayo, se mezcló el factor tisular (TF) con el Factor VI la (FVIIa) y vesículas de fosfolípidos. Se agregó el Factor X (FX) y se retiraron alícuotas y se inactivaron en varios momentos de tiempo. En este momento, se agregó un sustrato cromogénico para el Factor Xa (FXa) y se midió la absorbancia a 405 nm durante el curso de una hora para determinar las velocidades de generación del FXa. Cuando se incluyó 1 nM de TFPI , la velocidad de generación del FXa se disminuyó significativamente. Esto se observó en la Figura 21 A cuando se compararon los diamantes rellenos (sin TFPI) con los círculos vacíos ( 1 nM de TFPI). Cuando se incluyeron también concentraciones en aumento de ARC 1 9499 junto con 1 nM de TFPI , hubo una mejora dependiente de la dosis en la velocidad de generación del FXa. 1000 nM de ARC19499 (diamantes vacíos) ocasionaron velocidades de generación del FXa que eran cercanas a la velocidad de generación del FXa en ausencia del TFPI (diamantes rellenos) (Figura 21A). Estas velocidades se normalizaron dividiendo la velocidad en un momento de tiempo específico (en este caso, en 4 minutos) entre la velocidad alcanzada sin TFPI en el mismo momento de tiempo (Figura 21 B). De esta forma, el TFPI redujo la velocidad de generación del FXa en 4 minutos en casi 70% . Las concentraciones en aumento de ARC1 9499 mejoraron esta velocidad alcanzando niveles cercanos al de sin TFPI con 10-1000 nM de aptámero (Figura 21 B).

Este experimento indica que ARC 19499 inhibidor TFPI en un ensayo de inhibición de tenasa extrínseca in vitro.

Ejemplo 9 Este ejemplo demuestra que ARC26835, ARC1 7480, ARC 19498, ARC19499, ARC19500, ARC 1 9501 , ARC31301 , ARC18546, ARC 19881 y ARC19882 tienen actividad inhibitoria del TFPI en el ensayo de actividad del Factor Xa (FXa).

Se evaluó cada aptámero para la inhibición de TFPI en un ensayo de actividad del Factor Xa (FXa). Se midió la capacidad de FXa para escindir un sustrato cromogénico en presencia y ausencia del TFPI , con o sin la adición de aptámeros. Para estos experimentos, se incubaron 2 nM de FXa humano con 8 nM de TFPI humano. Luego, se agregaron 500 µ? de sustrato cromogénico y aptámeros, y se midió la escisión de FXa del sustrato mediante absorbancia a 405 nm (A40s) como una función de tiempo. Los aptámeros se analizaron en concentraciones de 500 nM, 125 nM, 31 .25 nM, 7.81 nM, 1.95 nM y 0.49 nM. ARC 17480 se incluyó como un control en cada experimento. Para cada concentración de aptámero, se trazó el A405 como una función de tiempo y se ajustó la región lineal de cada curva a la ecuación y=mx + b, donde y=A405, x=la concentración de aptámeros, m=la tasa de escisión del sustrato y b=la intersección y, para generar una tasa de escisión del sustrato FXa. La tasa de escisión del sustrato FXa en presencia de TFPI y ausencia de aptámeros se restó del valor correspondiente en presencia de ambos TFPI y aptámeros para cada aptámero en cada concentración. Luego, se trazaron las tasas ajustadas como una función de concentración de aptámero y se ajustaron a la ecuación y=(Vmáx/(1 + IC5o/x)). donde y=la tasa de escisión del sustrato, x=concentración de aptámero y Vmáx=la tasa máxima de escisión de sustrato, para generar un valor de IC50 y (Vmáx) máximo. Las Figuras 22A-C muestran gráficas de ensayos de actividad del FXa con ARC26835, ARC17480, ARC1 9498, ARC 19499, ARC19500, ARC19501 , ARC31301 , ARC18546, ARC19881 y ARC 19882. Estos aptámeros inhibieron todos el TFPI en estos ensayos, tal como se prueba mediante un aumento en la actividad de FXa como una función de la concentración de aptámeros. Estos aptámeros tuvieron todos una actividad similar en el ensayo de FXa.

Ejemplo 10 Este ejemplo demuestra que ARC19499 protege el Factor Xa (FXa) de la inhibición mediante TFPI en un ensayo cromogénico con componentes purificados.

FXa (1 nM), TFPI (2.5 nM), ARC 1 9499 (0-500 nM) y sustrato cromogénico de espectrozima Xa (American Diagnostica) (200 µ?) se incubaron en solución salina amortiguada con HEPES (20 mM de HEPES, 1 50 mM de NaCI, pH 7.4) que contiene 2 mM de CaCI2 y 0.1 % de PEG-6,000 (amortiguador HBSP2) a 37°C hasta que se logró equilibrio (5 minutos). La velocidad de hidrólisis de espectrozima FXa se determinó usando un instrumento ThermoMax (Molecular Devices) y se trazó como la actividad de FXa % en comparación con ausencia de (100%). Concentraciones en aumento de ARC 19499 ocasionaron un aumento en la actividad de FXa (Figura 23), lo que demuestra que ARC19499 protegió a FXa de la inhibición por el TFPI . Con base en estos datos, la constante de disociación (KD) aparente de ARC 19499 para el TFPI fue 1 .8 nM. ARC1 9499 es específico para el TFPI y no inhibió la actividad de FXa en ausencia del TFPI (no se muestran datos).

Ejemplo 1 1 Este ejemplo demuestra que ARC1 9499 protege el complejo FXasa extrínseco, que está compuesto por factor tisular, Factor VI la (FVI Ia) y Factor Xa (FXa), de la inhibición por TFPI en un ensayo de actividad cromogénico con componentes purificados.

Factor tisular relipidado (TF; 20 pM), FVI Ia ( 1 nM) , vesículas de PCPS (75% fosfatidilcolina/25% de fosfatidilserina; 20 µ?) y ARC 1 9499 (0-1000 nM) se incubaron en amortiguador HBSP2 a 37°C durante 10 minutos, seguidos por la adición simultánea de FX (1 µ?) y TFPI (2.5 nM). Las alícuotas se retiraron cada 30 segundos durante 5 minutos y se inactivaron en amortiguador HBS que contenía 20 mM de EDTA y 0.1 % de PEG. Se agregó sustrato de espectrozima FXa (200 µ?), se midió la velocidad de hidrólisis del sustrato y se estimó la concentración de FXa activo a partir de una curva de calibración. Concentraciones en aumento de ARC 19499 ocasionaron un aumento en la actividad del FXa (Figura 24) hasta 70% de la velocidad medida en ausencia del TFPI , lo que demuestra que ARC1 9499 protegió sustancialmente el complejo extrínseco de FXasa de la inhibición por TFPI .

Ejemplo 12 Este ejemplo demuestra que ARC1 9499 protege el complejo de factor tisular:FVI Ia de la inhibición de TFPI en un ensayo fluorogénico de la actividad del factor tisular: FVI I a llevado a cabo con componentes purificados.

Se incubaron el factor tisular (TF¡ 1 nM), FVI Ia (2 nM) y ARC19499 (0-7.5 nM) en HBSP2 a 37°C durante 10 minutos, seguido de la adición simultánea de un sustrato fluorogénico SN-17c (50 µ?) y TFPI (8 nM). La velocidad de hidrólisis del sustrato se midió en un lector de placa de fluorescencia (BioTek). El TFPI inhibió aproximadamente el 50% de actividad de TF. FVI Ia en estas condiciones (Figura 25). La adición de una concentración estequiométrica de ARC 1 9499 (8 nM) restableció completamente la actividad de TF: FVI Ia completa en comparación con un control sin TFPI (Figura 25), lo que demuestra que ARC1 9499 protegió de manera eficaz el complejo TF: FVI Ia de inhibición del TFPI . Una titulación de concentraciones de ARC1 9499 en aumento en presencia de 8 nM de TFPI aumentó la actividad del complejo TF: FVI Ia en una manera dependiente de la concentración de ARC19499, alcanzando el punto medio de la actividad en ~1 nM de ARC 19499. Los análisis de datos indicaron que la KD aparente de ARC 1 9499 para el TFPI en este ensayo fue 1 .2 nM. ARC19499 es específico para el TFPI y no inhibió la actividad de TF: FVI Ia en ausencia del TFPI (no se muestran datos).

Ejemplo 13 Este ejemplo demuestra que ARC 19499 inhibe el TFPI en una proteoma de coagulación sintética que modela la hemofilia A y hemofilia B. Estos datos muestran que ARC1 9499 recuperó la generación normal de trombina en presencia de insuficiencia de Factor VI I I (FVI I I) o Factor IX (FIX) completo (0%). ARC1 9499 recuperó también la generación normal de trombina en presencia de insuficiencia de FVI I I (2%, 5% o 40%) incompleto.

La generación de trombina se inició con 5 pM de factor tisular (TF) relipidado agregados a una mezcla de procoagulantes e inhibidores de coagulación (Factores V, VI I , VI I a, VI I I, IX, X, XI , protrombina, antitrombina y TFPI ; todos en concentraciones fisiológicas promedio) y 50 µ? de PCPS (75% de fosfatidilcolina/25% de fosfatidilserina). La generación de trombina en el tiempo se midió en un ensayo cromogénico usando el sustrato de espectrozima TH (American Diagnostica). Se analizó ARC 19499 en concentraciones en aumento de 1 nM , 2.5 nM, 5 nM y 10 nM en un sistema completamente reconstituido (control saludable) o en sistemas reconstituidos en los cuales se omitió el FVI II (hemofilia A grave) o FIX (hemofilia B grave).

En presencia de todas las proteínas en sus concentraciones fisiológicas promedio ("control saludable"; Figura 26), la fase de iniciación (lag) de generación de trombina iniciada con 5 pM de TF relipidado fue aproximadamente 6 minutos, y la concentración máxima de trombina activa observada fue 270 nM (diamantes rellenos). La omisión de TFPI acortó significativamente la fase de iniciación (hasta 2 minutos) y aumentó la concentración de trombina máxima hasta 374 nM (círculos rellenos). Las adiciones de concentraciones de ARC1 9499 en aumento en presencia de nM de TFPI disminuyeron la duración de la fase de iniciación y aumentaron la concentración máxima de trombina de una manera dependiente de ARC 19499, y en 10 nM (cuadrados vacíos) el perfil de generación de trombina de ARC1 9499 fue casi idéntico al observado en ausencia de ambos TFPI y ARC 19499 (Figura 26).

En ausencia de FV I I I , se suprimió significativamente la generación de trombina iniciada de TF (Figura 27). La fase de iniciación se extendió de 6 minutos en el "control saludable" (diamantes rellenos) a 10 minutos en hemofilia A (diamantes vacíos), y la actividad máxima de trombina disminuyó de 270 nM a 34 nM. La omisión del TFPI en ausencia de F I 11 recuperó la generación normal de trombina (concentración máxima de trombina activa aumenta hasta 264 nM) y la duración de la fase de iniciación disminuyó hasta 2 minutos (círculos rellenos). En ausencia de FVI I I y en presencia de 2.5 nM del TFPI , la adición de 5 nM de ARC19499 (asteriscos) recuperó la generación de trombina hasta el nivel observado en el "control saludable" con la fase de iniciación de 3 minutos. En presencia de 10 nM de ARC1 9499 (cuadrados vacíos) y 2.5 nM de TFPI y en ausencia de FVI I I , el perfil de generación de trombina se convirtió en similar al observado en ausencia de TFPI , FVII I y ARC19499.

El efecto de inhibición de TFPI por ARC 1 9499 en una proteoma de coagulación sintética de hemofilia B (sin FIX) fue similar al observado para el modelo de hemofilia A, es decir, ARC19499 en 5 nM de concentración y en ausencia de FIX recuperó la generación de trombina hasta el nivel similar al observado en el "control saludable" (Figura 28).

El efecto de ARC1 9499 en la generación de trombina iniciada con TF se evaluó en el proteoma de coagulación sintética al 0% , 2% (0.014 nM), 5% (0.035 nM), 40% (0.28 nM) y 1 00% (0.7 nM) FVI I I . Las concentraciones de FVI I I seleccionadas abarcaron el intervalo observado en grave (<1 %), moderado (1 -5%) y leve (5-40%) en pacientes con hemofilia A. En ausencia de ARC 1 9499 (Figura 29), se suprimió la generación de trombina en todas las concentraciones de FVI I I analizadas, hasta e incluyendo 40% . El nivel de trombina pico observado en 40% del proteoma de FVI I I (asteriscos) fue aproximadamente 50% del "control saludable" (diamantes rellenos). La adición de ARC19499 en una concentración de 1 nM fue suficiente para impulsar significativamente la generación de trombina acortando la fase de iniciación y aumentando los niveles de trombina pico (Figura 30). La adición de 2.5 nM de ARC1 9499 normalizó esencialmente la generación de trombina en presencia de 0-5% de FVI I I (Figura 31 ), en tanto en 40% y 100% de FVI I I , 2.5 nM de ARC 1 9499 indujo acortamiento adicional de la fase de iniciación y aumentó la trombina pico, casi hasta el control "sin TFPI".

La Figura 32 muestra datos de proteoma de coagulación sintética adicional para 0% de FVI I I en presencia de una serie de concentraciones de ARC19499 (0, 1 , 2.5, 5 y 1 0 nM) en comparación con un "control saludable" y un "control sin TFPI". La Figura 33 muestra los datos para 1 00% de FVI I I para el mismo intervalo de concentraciones de ARC1 9499. Las Figuras 34, 35 y 36 muestran los datos para 2%, 5% y 40% de FVI I I en presencia de 0, 1 y 2.5 n de ARC19499, respectivamente. En todas las condiciones, ARC1 9499 mostró una respuesta procoagulante significativa, lo que dio como resultado que la fase de iniciación (tiempo de demora) disminuyera y la trombina pico aumentara. En todos los casos de insuficiencia de FVI II (0-40% de FVI II), ARC19499 fue capaz de recuperar un perfil de generación normal de trombina.

Ejemplo 14 Este ejemplo demuestra que la actividad in vitro de ARC 19499 es específica para la presencia del TFPI .

En este experimento, la capacidad de ARC1 9499 de afectar la generación de trombina en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT), que mide la generación de trombina durante el tiempo tras la iniciación de la vía de coagulación del factor tisular, se analizó en tres condiciones plasmáticas diferentes. En la primera condición, se agregaron las concentraciones en aumento de ARC19499 a plasma normal agrupado (PNP) y se mezclaron con una solución que contenía el factor tisular (TF) y fosfolípidos de modo que la concentración del TF fuera 0.1 o 1 .0 pM en el volumen de reacción final (Figuras 37A-E). La generación de trombina se inició mediante la adición de una mezcla que contiene cloruro de calcio y un sustrato fluorogénico para trombina. La reacción tuvo lugar a 37°C y la intensidad de fluorescencia se midió periódicamente durante 1 hora. ARC19499 se analizó en las siguientes concentraciones en el plasma: 0.1 , 1 , 1 0, 100 y 1 000 nM.

Con cualquiera de las concentraciones del TF, ARC19499 en aumento aumentó la generación de trombina en el plasma de PNP (Figura 37A-B). Tanto el potencial de trombina endógena (ETP - área bajo la curva) y valores de trombina pico (nivel más alto de trombina producida en cualquier punto en el ensayo) aumentaron en una forma dependiente de la dosis con ARC1 9499 (Figura 37C-D). El tiempo de demora (tiempo que demora en comenzar la generación de trombina) disminuyó en una forma dependiente de la dosis con ARC19499 (Figura 37E). Estos resultados se observaron en ambas concentraciones del TF.

El ensayo de CAT que mide la actividad de ARC19499 se repitió en plasma sin TFPI . El plasma que se inmunoredujo para TFPI y liofilizó se obtuvo de American Diagnostica (Stamford, CT) y se resuspendió antes del uso. La generación de trombina se midió tal como se describe anteriormente con 0.01 , 0.1 o 1 .0 pM de TF. Los resultados en la Figura 38A muestra que las curvas de generación de trombina medidas para cada concentración de TF fueron distintos entre sí, pero dentro de una concentración de TF específica no hubo esencialmente diferencia alguna en la generación de trombina mientras se aumentó la concentración de ARC19499. Esto se observó también en los parámetros medidos en el ensayo de CAT. Hubo poco o ningún cambio en ETP, trombina pico o tiempo de demora mientras aumentaba la concentración de ARC19499 (Figuras 38B-D), independiente de la concentración de TF.

La actividad de ARC 19499 se analizó en un tercer conjunto de condiciones plasmáticas. En este caso, se incubó PNP con un anticuerpo policlonai contra el TFPI para neutralizar toda la actividad del TFPI . Luego se agregó ARC 1 9499 a este plasma tratado con anticuerpo (Figuras 39A-F). De nuevo, la generación de trombina se inició con 0.01 , 0.1 o 1 .0 pM de TF. La adición del anticuerpo policlonai potenció la generación de trombina en las tres concentraciones del TF dado que se neutralizó el TFPI. Sin embargo, concentraciones en aumento de ARC19499 parecieron no ocasionar aumentos adicionales en la generación de trombina (Figuras 39A-C) . Hubo poco o ningún efecto en ETP, trombina pico o tiempo de demora cuando se agregó ARC 19499 (Figuras 39D-F).

Estos experimentos indican que ARC1 9499 solo tiene actividad procoagulante cuando el TFPI en funcionamiento está presente en el plasma y, por lo tanto, ARC 19499 es específico para el TFPI .

Ejemplo 15 Este ejemplo demuestra que ARC1 7480, ARC 1 9498 y ARC19499 inhiben la actividad del TFPI in vitro.

En este experimento, se midió la actividad inhibitoria de los aptámeros de TFPI (ARC 17480, ARC 1 9498 y ARC1 9499) in vitro en plasma de hemofilia A agrupado (insuficiencia de Factor VI I I) en un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT). Los aptámeros se titularon en concentraciones diferentes en plasma de hemofilia A agrupado, y la cantidad de trombina generada se comparó con un control de plasma normal agrupado (Figuras 40A-C), usando 1 .0 pM de TF en la reacción final. Tanto el potencial de trombina endógena (ETP), que es el área bajo la generación de trombina contra la curva de tiempo, como la trombina pico, que es la concentración más grande trombina generada durante el curso de este experimento, proporcionaron medidas indirectas de inhibición de aptámeros de TFPI . Los tres aptámeros tuvieron una actividad similar en este ensayo, siendo ARC 1 9499 quien tuvo actividad levemente mayor que los otros dos. ARC 19499 corrigió el ETP hasta niveles casi normales en 30 nM (Figura 40D). Los niveles trombina pico aumentaron también con concentraciones en aumento de aptámeros (Figura 40E).

Estos resultados muestran que ARC17480, ARC 1 9498 y ARC19499 inhiben la actividad del TFPI in vitro.

Ejemplo 16 Este ejemplo demuestra que ARC 1 9499 aumenta la generación de trombina en plasma humano normal tratado con anticuerpo anti-Factor VI I I para generar un estado tipo hemofilia A.

El plasma pobre en plaquetas de un voluntario saludable y normal se trató con un anticuerpo anti-FVI I I para generar un estado tipo hemofilia A. La generación de trombina es este plasma tratado con anticuerpos fue similar a la observada con el plasma de hemofilia A (Figura 41 ). La adición de ARC 19499 al plasma tratado con anticuerpos ocasionó un aumento dependiente de la dosis en la generación de trombina. Estos resultados demuestran que ARC 1 9499 puede corregir la generación de trombina en plasma con niveles bajos de FVI I I que son el resultado del tratamiento con un anticuerpo anti-FVI I I .

Ejemplo 17 Este ejemplo demuestra que ARC1 7480 y ARC 19499 inhiben la actividad del TFPI in vitro y tienen actividad biológica.

Los efectos del aptámero inhibidor de TFPI núcleo no PEGilado ARC17480 y el aptámero PEGilado ARC1 9499 se evaluaron para una actividad de generación de trombina in vitro en el plasma de hemofilia B (insuficiencia de FIX) usando el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT).

Estos estudios se realizaron en plasma agrupado de dos pacientes con hemofilia B con < 1 % de niveles del Factor IX (comercialmente disponible de George King Bio-Medical, Inc, Overland Park, KS) . En este ensayo, se mezclaron el plasma y el aptámero y se agregaron a un reactivo que contiene fosfolípidos y factor tisular. La generación de trombina se inició mediante la adición de una mezcla que contiene cloruro de calcio y un sustrato fluorogénico para trombina. La reacción tuvo lugar a 37°C y la intensidad de fluorescencia se midió periódicamente durante 1 hora. Las concentraciones finales del factor tisular y fosfol ípidos fueron 1 pM y 4 µ?, respectivamente. Los aptámeros se analizaron en las siguientes concentraciones en el plasma: 0.3, 1 , 3, 10, 30, 100, 300 y 1000 nM. Las curvas de generación de trombina individual se muestran en las Figuras 42A-B, que ilustran los efectos de concentraciones en aumento de ARC 1 9499 (Figura 42A) o ARC17480 (Figura 42B) en el alcance de generación de trombina en plasma de hemofilia B en comparación con plasma normal agrupado. En la Figura 43 se muestra el cuadro de ETP, la trombina pico y tiempo de demora. Los resultados con ARC1 9499 se trazan en el lado izquierdo y los resultados con ARC1 7480 se trazan en el lado derecho.

Los niveles de ETP y trombina pico disminuyeron -85% y ~95%, respectivamente, en el plasma del grupo de hemofilia B en comparación con el plasma normal agrupado, coherentes con una insuficiencia en la generación de trombina debido a la pérdida del Factor IX. Tanto ARC1 7480 (triángulos) y ARC1 9499 (diamantes) corrigieron en gran medida el defecto en la generación de trombina, tal como se midió por ambos de estos parámetros (Figura 43). En 1 00 nM, ambos aptámeros demostraron un ETP casi equivalente al alcanzado con plasma normal agrupado y una trombina pico casi equivalente en 300 nM de ARC 1 7480 (Figura 43). La trombina pico se estabilizó en 300 nM de ARC1 9499. ARC17480 y ARC1 9499 disminuyeron el tiempo de demora en plasma de hemofilia B, bajo lo que se alcanzó con plasma normal agrupado y plasma de hemofilia B sin fármaco alguno (Figura 43).

Estos resultados muestran que ARC 1 7480 y ARC 19499 inhiben el TFPI con potencia similar en el plasma de hemofilia B in vitro.

Ejemplo 18 Este ejemplo demuestra que ARC19499 inhibe la actividad del TFPI in vitro y tiene actividad biológica en comparación con un aptámero de control negativo.

La capacidad de ARC19499 de potenciar la generación de trombina se analizó en tres plasmas de hemofilia pobre en plaquetas: plasma agrupado de 7-8 pacientes con hemofilia A grave (<1 % de niveles de F VI 11 ; conocido como "plasma de hemofilia A"), plasma de tres pacientes con hemofilia A diferentes con altos títulos de anticuerpos anti-FVI I (=1 60 de unidades Bethesda (BU)/ml_; conocido como "plasma inhibidor"), y plasma agrupado de dos pacientes con hemofilia B grave (<1 % de niveles de FIX; conocido como "plasma de hemofilia B"). Todos los plasmas eran de George King Bio-Medical (Overland Park, KS). La generación de trombina se midió usando el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT). En este ensayo, se mezclaron el plasma y el aptámero y se agregaron a un reactivo que contiene fosfolípidos y factor tisular. La generación de trombina se inició mediante la adición de una mezcla que contiene cloruro de calcio y un sustrato fluorogénico para trombina. La reacción tuvo lugar a 37°C y la intensidad de fluorescencia se midió periódicamente durante 1 hora. Las concentraciones finales del factor tisular y fosfolípidos fueron 1 pM y 4 µ?, respectivamente. La generación de trombina en presencia de ARC19499 (0.3, 1 , 3, 10, 30, 100, 300 y 1 000 nM ) se comparó con un aptámero de control negativo (0.1 , 1 , 1 0, 100 y 1000 nM). Gráficas de ETP, trombina pico y tiempo de demora (promedio ± s.e. m. ) se muestran en las Figuras 44A-C.

El plasma de hemofilia A tuvo un tiempo de demora levemente más corto y un ETP y trombina pico marcadamente disminuidos (~50% y ~75%, respectivamente) en comparación con el plasma normal. Las concentraciones en aumento de ARC 19499 corrigió en gran medida el defecto en la generación de trombina. El ETP se corrigió hasta niveles casi normales con 3 nM de ARC1 9499 y la trombina pico se corrigió con 100 nM de aptámero (Figura 44A). El plasma inhibidor también tuvo ETP y trombina pico disminuidos (~50% y ~70%, respectivamente) en comparación con el plasma normal. Como con el plasma de hemofilia A grave, ARC19499 aumentó la generación de trombina en este plasma. Con 30 nM de ARC19499, tanto el ETP como la trombina pico estaban en niveles normales (Figura 44B). La hemofilia B tuvo un defecto aún mayor en la generación de trombina, con ETP y trombina pico significativamente disminuidos (~70% y ~90%, respectivamente) y un tiempo de demora aumentado. Como con los plasmas de hemofilia A, las concentraciones en aumento de ARC19499 mejoraron la generación de trombina en este plasma, alcanzando niveles de ETP normales con 30 nM de ARC19499, y niveles normales de trombina pico con 100-300 nM de aptámero (Figura 44C). En conjunto, estos resultados demuestran que 30-100 nM de ARC19499 es eficaz en recuperar la coagulación en tres tipos diferentes de plasma de hemofilia. Se analizó también un aptámero de control negativo en tres plasmas diferentes y no demostraron corrección de la generación de trombina (Figuras 44A-C).

La secuencia del aptámero de control negativo, ARC32603, usado en este ejemplo fue: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-mG-dC-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 152).

Ejemplo 19 Este ejemplo demuestra que ARC17480, ARC26835, ARC19500, ARC19501, ARC31301, ARC18546, ARC19881 y ARC19882 tienen actividad biológica en el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT).

La actividad inhibitoria del TFPI de cada aptámero se evaluó en el ensayo de CAT en plasma de hemofilia A agrupada en concentración de aptámeros de 500 nM , 167 nM, 55.6 nM, 1 8.5 nM, 6.1 7 nM y 2.08 nM. Se incluyó ARC 17480 en cada experimento como un control. Para cada aptámero, se usaron los valores de potencial de trombina endógena (ETP) y trombina pico en cada concentración de aptámero para análisis. El valor de ETP o trombina pico para el plasma de hemofilia A solo se restó del valor correspondiente en presencia de aptámero para cada molécula en cada concentración. Luego, se trazaron los valores de ETP y pico ajustados como una función de concentración de aptámero y se ajustó a la ecuación y=(máx/(1 + IC50/x)) + int, donde y=ETP o trombina pico, x=concentración de aptámero, máx=ETP o trombina pico e int=la intercepción y, para generar un valor de IC50 para ambos el ETP y la trombina pico. Las Figuras 45A-D y Figuras 46A-B muestra gráficas de experimentos de CAT con ARC17480, ARC26835, ARC19500, ARC19501 , ARC31 301 , ARC 18546, ARC19881 y ARC 19882. Se muestran el potencial de trombina endógena (ETP) y trombina pico ajustados. Estos experimentos demuestran que ARC1 7480, ARC26835, ARC19500, ARC19501 , ARC31301 , ARC1 8546, ARC 1 9881 y ARC 1 9882 todos inhibieron funcionalmente el TFPI en el ensayo de CAT, tal como se prueba mediante un aumento dependiente de la concentración en ambos ETP y trombina pico en el plasma de hemofilia A. Estas moléculas tuvieron todas una actividad similar en el ensayo de CAT.

Ejemplo 20 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI se tienen actividad biológica.

En este experimento, la capacidad de ARC 1 9499 de afectar la generación de trombina en comparación con la de NovoSeven® se analizó usando el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT). El ensayo de CAT genera una cantidad de parámetros para comparar la generación de trombina. El tiempo de demora es una medición de la longitud de tiempo que lleva el comienzo de la generación de trombina. La trombina pico es una medición de la cantidad más grande de trombina a ser generada en cualquier momento. El potencial de trombina endógena (ETP) es el área bajo la curva de generación de trombina.

Estos estudios se realizaron en presencia de tres plasmas diferentes: plasma pobre en plaquetas de tres voluntarios, un grupo de plasma de pacientes con hemofilia A con <1 % de niveles del Factor VII I (comercialmente disponible de George King Bio-Medical, Inc, Overland Park, KS), y plasma de pacientes con hemofilia A con un alto título de anticuerpo inhibidor al Factor VII I (comercialmente disponible de George King Bio-Medical, Inc, Overland Park, KS). En el ensayo de CAT, se mezclaron plasma y fármaco (ARC19499 o NovoSeven®) y se agregaron a un reactivo que contiene fosfolípidos y factor tisular. La generación de trombina se inició mediante la adición de una mezcla que conteiene cloruro de calcio y un sustrato fluorogénico para trombina. La reacción tuvo lugar a 37°C y la intensidad de fluorescencia se midió periódicamente durante 1 hora. Las concentraciones finales del factor tisular y fosfolípidos fueron 1 pM y 4 µ?, respectivamente. Los fármacos se analizaron en las siguientes concentraciones en el plasma: 0.3, 1 , 3, 10, 30, 100 y 300 nM .

En el plasma de voluntarios sanos, no hubo cambio en el ETP en el intervalo de concentraciones analizadas con ambos ARC 1 9499 y NovoSeven® (Figura 47A). Los niveles de trombina pico aumentaron levemente en las dosis más altas, con ARC 19499 y NovoSeven® comportándose en una manera casi idéntica (Figura 47B). ARC 1 9499 no tuvo efecto sobre el tiempo de demora de generación de trombina, mientras que NovoSeven® demostró una disminución dependiente de la dosis en el tiempo de demora, alcanzando un tiempo de demora m ínimo en 30 nM (Figura 47C).

Los niveles de ETP y trombina pico disminuyeron ~40% y ~75%, respectivamente, en el plasma del grupo de hemofilia A, coherentes con una insuficiencia en la generación de trombina debido a la pérdida del Factor VI II . ARC 19499 y NovoSeven® corrigieron en gran medida el defecto en la generación de trombina, tal como se midió por ambos de estos parámetros. Estos agentes demostraron un efecto casi equivalente sobre el ETP, alcanzando un ETP máximo en 30 nM (Figura 48A). NovoSeven® tuvo un efecto levemente mayor en la trombina pico alcanzando un nivel máximo en 30 nM . ARC1 9499 alcanzó el mismo nivel de trombina pico en 300 nM (Figura 48B). Tal como se observa en el plasma de voluntarios saludables, ARC1 9499 no tuvo efecto sobre el tiempo de demora, mientras que NovoSeven® mostró una disminución dependiente de la dosis en el tiempo de demora, alcanzando un efecto máximo en 30 nM (Figura 48C).

Se observaron resultados similares en el plasma de pacientes con un alto título anticuerpos. Ambos fármacos aumentaron el ETP y trombina pico de la misma manera (Figuras 49A-B). De nuevo, ARC19499 no tuvo efecto sobre el tiempo de demora, mientras que NovoSeven® mostró una disminución dependiente de la dosis del tiempo de demora (Figura 49C). El error estándar asociado con el plasma inhibidor fue mayor al observado en el plasma saludable o grupo de hemofilia A. Esto fue más probable debido a la diferencia en los títulos entre los tres pacientes inhibidores ( 160 BU/mL, 533 BU/m L y 584 BU/mL).

En general, con la excepción del tiempo de demora, ARC19499 y NovoSeven® tuvieron efectos muy comparables en la generación de trombina en todos los plasmas analizados.

Ejemplo 21 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI tienen actividad biológica En este experimento, la capacidad de ARC 1 9499 de afectar la formación de coágulos en comparación con la de NovoSeven® se analizó usando el ensayo de trombograma tromboelastografía (TEG®). El ensayo de TEG® mide las propiedades mecánicas de un coágulo en desarrollo. En el ensayo de TEG®, una taza que contiene el producto sanguíneo y cualquier activador oscila libremente alrededor de un perno unido a un hilo de torsión. Mientras se desarrolla el coágulo, hebras de fibrina recientemente formadas conectan la taza oscilante al perno fijo y comienza a presionar sobre el perno, generando así fuerza en el hilo de torsión. Esta fuerza se convierte en una señal por la computadora para controlar la formación de coágulos, y se exhibe como una traza de altura de señal contra tiempo. De esta traza, se puede extraer una cantidad de parámetros para medir varios aspectos de formación de coágulos. El valor R mide el tiempo que demora en desarrollarse un coágulo. El ángulo es una medida de la velocidad a la que se forma el coágulo. La amplitud máxima (MA) es una medida de la fuerza y estabilidad del coágulo.

Estos estudios se realizaron en sangre citrada de voluntarios saludables. En el primer ensayo, los fármacos se analizaron en sangre sin tratar. En el segundo ensayo, la sangre se trató primero con un anticuerpo policlonal de oveja contra el Factor VI II humano durante tres horas a 37°C antes de la adición de fármacos. En ambos ensayos, se agregó NovoSeven® o ARC 1 9499 a la sangre (tratada con anticuerpo o no) en concentraciones finales de sangre de 0.01 , 0.1 , 1 , 1 0 o 100 nM. La activación de coagulación ocurrió tras la adición del factor tisular (Innovin) en una dilución final de 1 :200000 (~6 fM) y cloruro de calcio en una concentración final de 1 1 mM.

En la sangre sin tratar, ambos ARC 19499 y NovoSeven® demostraron una disminución moderada y dependiente de la dosis en el valor R que apareció alcanzar un valor m ínimo en 1 0 nM. (Figura 50A). El ángulo y los valores MA permanecieron sin cambios en las combinaciones probadas (Figuras 50B-C).

En la sangre tratada con el anticuerpo de Factor VII I , ambos fármacos tuvieron efectos similares en el valor R. El valor R se prolongó en sangre tratada con anticuerpo en comparación con la sangre sin tratar. Mientras aumentaba la concentración de ARC 1 9499 o NovoSeven®, el valor R se restableció al mismo nivel que estaba en la sangre sin tratar (Figura 51 A). El tratamiento con anticuerpo disminuyó la velocidad de formación de coágulos en la sangre, que se observó como el ángulo. NovoSeven® tuvo un fuerte efecto en el ángulo, aumentándolo de manera lineal desde 0.1 a 100 nM de NovoSeven®. Este aumento sobrepasó el ángulo alcanzado con la sangre sin tratar. ARC1 9499 también aumentó el ángulo, pero el valor pareció estabilizarse en 1 0 nM de aptámero, en un nivel similar al alcanzado con la sangre sin tratar (Figura 51 B). El efecto en MA fue mínimo con ambos fármacos, principalmente dado que no parece haber una gran diferencia en el MA de sangre, con o sin tratamiento de anticuerpo de FVI I I . Ambos fármacos ocasionaron valores de MA que se encontraron entre los alcanzados con sangre sin tratar y los alcanzados con sangre tratada con anticuerpos (Figura 51 C).

Como se observa en el ensayo de CAT, ARC19499 y NovoSeven® tuvieron efectos muy comparables en la formación de coágulos en sangre, aunque la sangre no tenga el Factor VI I I o no. La principal diferencia entre los dos fármacos se observó en el efecto sobre la velocidad de formación de coágulos (ángulo) , con NovoSeven® mostrando un aumento más lineal en la velocidad mientras aumentaba la concentración, pero ARC 19499 igualmente aumentó la velocidad.

Ejemplo 22 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI tienen una actividad biológica.

En este experimento se analizó, la sinergia entre el ARC 19499 y el Factor VI I I en la generación de trombina usando el ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT). Estos estudios se realizaron en presencia de un grupo de plasma de pacientes con hemofilia A con < 1 % de niveles del Factor VI I I (FVI I I) (comercialmente disponible de George King Bio-Medical, I nc, Overland Park, KS). Las concentraciones en aumento de ARC 1 9499 (de 1 a 300 nM) se analizaron en presencia de 0, 1 ,4, 2,5, 5, 14 y 140% del Factor VI II (Estándar Internacional de la Organización Mundial de la Salud). Los resultados se compararon con las respuestas del punto de referencia para hemofilia A y para plasmas normales agrupados en ausencia de ARC19499.

Suponiendo que los plasmas normal y de hemofilia A sean por lo demás equivalentes, la ausencia del Factor VI I I en el plasma de hemofilia A causó una disminución marginal en el tiempo de demora de la línea de base para la generación de la trombina en comparación con el plasma normal (Figura 52A), una disminución del triple o cuádruple en la concentración pico de la trombina (Figura 52B) y una disminución de 1 ,5 .-1 ,6 veces en el ETP (endogenous trombina potential, potencial de trombina endógena) (Figura 52C) en este experimento. En la ausencia del Factor VI I I , el ARC 1 9499 tuvo poco o ningún efecto sobre el tiempo de retardo para la generación de trombina, pero ocasionó un incremento función de dosis y en el ETP. La adición de Factor VI I I exógeno causó cambios incrementadas en todos los parámetros, observándose los mayores efectos sobre la concentración pico de la trombina (Figura 52B). La reconstitución con 140% de Factor VI I I restauró este parámetro a un nivel similar al observado en el plasma normal, observándose mejoras más pequeñas a 14% de Factor VI I I y menos. Además, la disminución incremental en la trombina pico causada por cada concentración de Factor VI I I fue casi idéntica en todas las concentraciones de ARC1 9499, lo que sugiere que los efectos de los dos agentes sobre la generación de trombina son aditivos en lugar de ser sinérgicas. Con el ETP, el Factor VI I I aplanó la curva de dosis de ARC1 9499 en respuesta a un efecto aditivo observado solamente con las concentraciones más bajas de ARC 1 9499 (Figura 52C). Una vez que se llegó a 10 nM de ARC1 9499, no pareció que el Factor VI I I adicional tuviera un efecto beneficioso. La Figura 53A muestra el ETP del plasma de hemofilia A con diferentes concentraciones de FVI I I añadido (línea de puntos). La adición de ARC 19499 tuvo como resultado una disminución, función de la dosis, de la generación de trombina en el plasma de hemofilia A y en el plasma de hemofilia A con 5% de FVI I I añadido. El ARC19499 medió un efecto procoagulante en el plasma de hemofilia A que fue similar al del 14% de FVI I I con 1 -10 nM de aptámero cuando se evaluó el ETP (Figura 53A) o con 10-30 nM cuando se evaluó la tombina pico. Cuando se añadió una cantidad saturante de ARC1 9499 (300 nM) al plasma con diferentes concentraciones de FVII I , los niveles de generación de trombina eran cercanos a los observados con plasma normal, lo que indica que el ARC 1 9499 no tiene un efecto protrombótico severo (Figura 53B). Aún con niveles de 140% de Factor VI I I , nunca se lograron niveles de ETP de plasma normal. Por ello, mediante esta medida la adición de Factor VI I I pareció obviar la necesidad de un agente de bypass tal como ARC1 9499, en lugar de facilitar su acción. Es interesante observar que el ARC19499 pareció disminuir el tiempo de retardo a las concentraciones más elevadas del Factor VI I I (Figura 52A) .

En este caso, la inhibición de TFPI puede permitir una propagación más rápida, en función del Factor VI I I , de la generación de trombina.

Ejemplo 23 Este ejemplo demuestra que el ARC 19499 puede mejorar la coagulación en un modelo espacial de la formación de coágulos, en plasma de hemofilia activado con factor de tejidos inmovilizado.

La propiedad clave del modelo espacial experimental es que la coagulación del plasma de la sangre es activada mediante una superficie cubierta con TF (tissue factor, factor de los tejidos) inmovilizado. El gel de fibrina se propaga seguidamente en la masa del plasma. La coagulación tiene lugar en una cámara especialmente diseñada (Figura 54A). Se introducen las muestras de plasma en la cavidad de la cámara que es seguidamente colocada en el termostato. Todos los experimentos se llevan a cabo a 37 °C. Se inicia la coagulación por inmersión de un inserto con TF inmovilizado en su extremo frontal en la cámara. Se registra la formación del coágulo mediante dispersión de la luz desde gel de fibrina para lo cual se utiliza una cámara CCD (Figura 54B). La cámara se ilumina uniformemente con luz monocromática, y se capturan las imágenes cada 1 5 segundos. La serie adquirida de imágenes es seguidamente procesada mediante computadora, y se calculan los parámetros de la dinámica espacial de la coagulación de la sangre.

A los fines de este conjunto de experimentos, se derivaron las superficies con densidades de TF en el intervalo de 1 -1 00 pmol/m2. La densidad del TF sobre la superficie se caracterizó por la capacidad de activar el Factor X (Enzyme Research Laboratories) en la presencia de de un exceso de Factor Vl la (Novoseven®; Novo Nordisk) mediante un sustrato cromogénico S-2765de Factor Xa (Chromogenix). Se midió la velocidad del desdoblamiento de S-2765 mediante absorción de la luz (405 nm) y se comparó con una curva de calibración que había sido preparada mediante un conjunto de soluciones de TF Standard (American Diagnostica) para calcular la concentración de TF.

Se procesó cada imagen de dispersión de la luz mediante el cálculo de la intensidad media de la dispersión de la luz (basada en la intensidad de pixeles) a lo largo de una línea perpendicular trazada con respecto a la superficie activante. Los datos de cada imagen fueron ilustrados como una única línea de contorno sobre un gráfico de intensidad de la dispersión de la luz versus la distancia con respecto a la superficie activante (Figuras 55A-B). Se ilustró la propagación de los coágulos de manera cualitativa mediante líneas de contorno sucesivas de intensidad creciente de la luz de dispersión, determinados a partir de imágenes tomadas en momentos de tiempo consecutivos de hasta 90 minutos (Figuras 55A-B), o de manera cuantitativa, graficando el tamaño del coágulos versus tiempo (Figura 56). Se determinó el tamaño de cada coágulo correspondiente a cada imagen en forma de coordinadas (en micrones o milímetros) a lo largo de la línea de contorno donde la intensidad de dispersión es semimáxima. En base a los gráficos de tamaño de los coágulos versus tiempo, se calcularon los siguientes parámetros: tiempo de retardo (retardo entre el contacto del plasma con el activador y el inicio de la formación del coágulo) , velocidad inicial del crecimiento del coágulo (a o Vi n ici ai ; pendiente media de la curva de tamaño de los coágulos versus tiempo durante los primeros 10 minutos desde el tiempo de retardo), velocidad espacial o estacionaria del crecimiento del coágulo (ß o Ve stac¡onaria ; pendiente media durante los 30 minutos siguientes), y tamaño de los coágulos después de 60 minutos del experimento (un parámetro integro de la eficiencia en la formación de los coágulos). Para cada experimento se trazaron cuatro líneas perpendiculares desde puntos diferentes a lo largo de la superficie del activador. Se analizaron los perfiles de tamaño de los coágulos versus tiempo, se obtuvieron cuatro valores de cada parámetro de coagulación, y se promedió para obtener el valor medio.

Este estudio se llevó a cabo primariamente mediante plasma recién preparado (en lugar de plasma comercial o de plasma congelado) de donantes normales y de pacientes con hemofilia A. Se recolectó sangre de donantes voluntarios sanos y de pacientes con hemofilia A con una relación de 9:1 volumen/volumen en una solución que contiene de citrato de sodio al 3,8% + 0,2 mg/ml de CTI (Institute of Protein Research, Russian Academy of Sciences), y seguidamente se lo procesó mediante centrifugación a 1,500 g durante 15 minutos de manera de obtener un plasma pobre en plaquetas. Se sometió a una centrifugación adicional a 10,000 g durante 5 minutos de manera de obtener plasma pobre en plaquetas. Se prepararon conjuntos frescos de plasma normal de 3 donantes sanos cada uno. A los 15 minutos antes de un experimento, se complementaron 300 µ?_ de plasma con 18 µ?_ de ARC19499 o de Factor Vlla recombinante (que como alternativa lleva la designación de Factor rVlla o Novoseven®). En unos experimentos de control sin ARC19499 ni Factor rVlla, se complementó plasma con el mismo volumen de solución salina amortiguada con fosfato. Se recalcificó el plasma mediante la adición de 6 µ?_ 1 M de CaCI2, se mezcló, y se colocaron 300 µ?_ de plasma recalcificado en la cámara experimental. Seguidamente se colocó el inserto con la superficie derivada de TF en la cámara, a efectos de iniciar la coagulación (Figura 54A).

El resultado de un experimento típico de formación espacial de coágulos, activado por 1 pmol/m2 de densidad de TF en plasma normal reunido, sin y con 300 nM de ARC19499, se muestra en la Figuras 55A y B, respectivamente. Los gráficos muestran contornos de dispersión de la luz como una función de la distancia desde el activador. El tiempo entre dos contornos es de 2,5 minutos y el tiempo total de cada experimento es de 90 minutos. El refuerzo de la dispersión de la luz en cada instante de tiempo en la Figura 55B, comparado con la Figura 55A indica que la adición de ARC 19499 mejoró la formación espacial de los coágulos. Sin embargo, los efectos de ARC 1 9499 sobre la formación de los coágulos pueden verse más claramente en un gráfico de tamaño de los coágulos versus tiempo (Figura 56) derivado de los datos de dispersión procesados, donde pueden observarse mejoras en el tiempo de retardo, jniciai (a) y en el tamaño de los coágulos a los 60 minutos.

Los parámetros de la formación de los coágulos fueron graficados como una función de la densidad de superficie de TF en las Figuras 57A-D. Las barras de error verticales indican SD (standard deviations, desviaciones estándar) para los parámetros de los coágulos, mientras que "n" es la cantidad de experimentos llevados a cabo con una densidad específica. Las barras horizontales son SD para las determinaciones de la densidad de TF (n=2 para cada serie de activadores). La Figura 57A muestra la dependencia del tiempo de retardo promediado con respecto a la densidad del TF activador. La magnitud de la inhibición de TFPI por ARC 1 9499 depend ía de la densidad de TF, y se hizo significativo a medida que la densidad disminuía (hasta un acortamiento de 2,5 veces del tiempo de retardo con densidades de 1 -3 pmol/m2). La Figura 57B muestra la dependencia del tiempo de retardo promediado con respecto a la densidad del TF activador. Nuevamente, el efecto de ARC1 9499 fue significativo solamente con bajas densidades de TF ( 1 -3 pmol/m2) donde se observó un incremento de ~1 ,8-veces la velocidad inicial. En la Figura 57C se ilustra la dependencia de la velocidad de crecimiento de los coágulos estacionarios con respecto a la densidad del TF activador. El ARC19499 tuvo poco efecto sobre la velocidad de propagación de los coágulos a través de la gama completa de activadores. Finalmente, la Figura 57D muestra el tamaño promediado de los coágulos después de 60 minutos. La inhibición de TFPI afectó el tamaño de los coágulos a densidades de 1 -4 pmol/m2 TF; los efectos de ARC19499 se hicieron insignificantes a medida que disminuía la densidad del TF. En base a estos datos, se eligieron dos densidades de TF para estudios adicionales de ARC 1 9499: bajo, 1 -2 pmol/m2, y medio, 1 0-20 pmol/ m2. Se prepararon varios lotes de activadores para cada una de estas densidades; los valores medios para los activadores de densidad baja y media eran: 2,0 ± 0,68 (n=22 lotes) y 20,6 ± 8,90 pmol/m2 (n=5 lotes) , respectivamente.

Se evaluó la influencia de diferentes concentraciones de ARC19499 (de 0 a 1 000 nM) sobre la coagulación espacial en plasma normal reunido, para examinar la dependencia en función de la dosis, de los efectos de ARC1 9499. Las Figuras 58A-D muestran valores medios y errores estándar de la media (SEM) para experimentos con diferentes conjuntos de plasma normal (n=4) y bajas superficies de TF. El tiempo de retardo (Figura 58A) disminuyó al aumentar la concentración de ARC19499 hasta 30 nM, y seguidamente se estabilizó. La velocidad inicial (Figura 58B) aumentó en aproximadamente un 30% al aumentar la concentración de ARC1 9499, mientras que la velocidad estacionaria (Figura 58C) no fue afectada de manera significativa a lo largo de la totalidad de las concentraciones. Hubo una disminución detectable en el tamaño de los coágulos a los 60 minutos (Figura 58D) al aumentar la concentración de ARC1 9499. Para todos los parámetros afectados, los efectos máximos de ARC 19499 se lograron claramente mediante 300 nM, y la concentración del efecto semimáximo fue <10 n . Las Figuras 59A-D muestran valores medios (±SEM) de parámetros de coagulación para 0 y 300 nM de ARC19499 a baja densidad de TF que combina los datos brutos de las Figuras 57 y 58 (n=6). Para calcular la significancia estadística del efecto de ARC 19499, para cada experimento se calculó la diferencia entre cada valor de parámetro, con y sin ARC 1 9499, y se comparó la distribución de estas diferencias con cero mediante el t-test. Los asteriscos indican una significancia estadística ((P<0,05), y que la diferencia entre los valores ± ARC1 9499 era diferente de cero. El efecto sobre la totalidad de los cuatro parámetros fue estadísticamente significativo, si bien los efectos sobre el tiempo de retardo y el tamaño de los coágulos fueron los más grandes.

Las Figuras 60 muestran parámetros medios (±SEM) para experimentos con diferentes recolecciones unificadas de plasma normal (n=3) y densidades de TF de superficie medios, graficados como una función de la concentración de ARC 1 9499. En este experimento el efecto de ARC19499 sobre la coagulación fue sustancialmente menos significativo. Las Figuras 61 A-D muestra el análisis estadístico en el que se comparan 0 y 300 nM ARC 19499 para la totalidad de los cuatro parámetros de coagulación. Si bien algunas de las diferencias parecen ser estadísticamente significativas (indicadas mediante un asterisco), los efectos de ARC 1 9499 sobre la coagulación en el plasma normal activado por una densidad media de TF fueron muy pequeños.

En las Figuras 62 se muestran la formación espacial típica de coágulos activada por el TF de baja densidad en el plasma de hemofilia A. Los gráficos muestran perfiles de dispersión de la luz como una función de la distancia con respecto al activador para el plasma de hemofilia A solamente (Figura 62A) y plasmas de hemofilia A que contienen 100 nM de ARC 19499 (Figura 62B) o 100 nM de rVl la (Figura 62C). Las imágenes de dispersión de la luz dadas a título de ejemplo a partir de las cuales se han derivado estos datos se muestran en la Figura 63, y en la Figura 64 se muestra un gráfico de tamaño de los coágulos versus tiempo derivado de los datos procesados, habiéndose incluido un perfil de plasmas normales para fines de comparación. En base a estos datos, el ARC19499 mejoró la formación espacial de los coágulos por el hecho de acortar el tiempo de retardo y de incrementar el tamaño de los coágulos. Como se muestra en la Figura 64, el 100 nM ARC1 9499 normalizo parcialmente la formación de los coágulos, al facilitar la propagación de los coágulos. En cambio, el 1 00 nM rVl la estimuló una potente coagulación independiente de TF. En lugar de estimular la normalización de la propagación espacial de los coágulos desde la superficie activante, en esta concentración el rVl la indujo la coagulación a través de la cámara de reacción.

En otros experimentos se caracterizaron los efectos, dependientes de la concentración, de ARC19499 en los plasmas de diversos pacientes de hemofilia. La parte demográfica del conjunto de pacientes de los cuales se tomaron muestras, se muestra en la tabla de la Figura 65.

Todos los pacientes tenían deficiencias FVI I I entre severas (< 1 %) o moderadas (1 -5%). Las Figuras 66, 67 y 68 muestran el efecto de ARC19499 y rVl la sobre la formación espacial de los coágulos activada por el TF de baja densidad en plasmas de los pacientes #1 , #2 y #3, respectivamente. Por ello las barras de error indican SEM para n=4 regiones a lo largo del frente de la propagación de coágulos de fibrina dentro de un experimento individual. Los paneles A y B de estas figuras muestran la dependencia del tiempo de retardo con respecto a las concentraciones de ARC1 9499 y rVl la, respectivamente. El tiempo de retardo disminuyó en 2 veces al aumentar las concentraciones de ARC19499 de 0 a 30 nM, sin cambios significativos en el tiempo de retardo para mayores concentraciones de ARC 1 9499. Los paneles C y D de estas mismas Figuras muestran la dependencia de la velocidad inicial con respecto a las concentraciones de ARC 1 9499 y rVl la, respectivamente. La velocidad inicial aumentó dos veces al aumentar las concentraciones de ARC 1 9499 desde 0 a 30 nM, sin cambios significativos a concentraciones más superiores. La Figura 69 muestra la dependencia de la velocidad estacionaria del crecimiento de los coágulos con respecto a las concentraciones de ARC1 9499 y rVl la para la totalidad de los 3 pacientes en un gráfico. El ARC19499 no tuvo efecto sobre la velocidad estacionaria en todo el intervalo investigado de concentraciones, mientras que la adición de rVlla condujo a un fuerte incremento de este parámetro. Finalmente, las Figuras 70A-B muestran la dependencia del tamaño de los coágulos a los 60 minutos con respecto a ARC1 9499 (Figura 70A) y rVl la (Figura 70B). El tamaño de los coágulos a los 60 minutos aumentó 1 ,5-2 veces al aumentar las concentraciones de ARC19499 desde 0 hasta 30 nM, sin otros cambios significativos a concentraciones de ARC 19499 más elevadas. Un análisis estadístico de los datos de TF de baja intensidad, en el que se compara cada parámetro para 0 y 300 nM ARC 1 9499, se muestra en las Figuras 71 A-D. El ARC1 9499 tuvo significativos efectos sobre el tiempo de retardo (Figura 71 A), velocidad inicial (Figura 71 B) y tamaño de los coágulos a los 60 minutos (Figura 71 D), pero no tuvo efecto sobre la velocidad estacionaria (Figura 71 C).

Las Figuras 72A-D, 73A-D y 74A-D muestran el efecto de ARC19499 y rVlla sobre la formación espacial de los coágulos por el TF de densidad media en los plasmas de los pacientes #4, #5 y #6, respectivamente. El ARC19499 tuvo poco efecto sobre los parámetros de coagulación para el activador de media densidad a través del intervalo entero de concentraciones ensayadas. Un análisis estadístico de los datos de TF de densidad media en el que se compara cada parámetro para 0 y 300 nM ARC1 9499 se muestra en las Figuras 75A-D. Bajo estas condiciones, el ARC19499 no tuvo efectos significativos sobre ninguno de los cuatro parámetros de coagulación.

A efectos de estimar la amplitud de la normalización de la coagulación por el ARC 1 9499 bajo condiciones de TF de baja intensidad, en las Figuras 76A-D se muestran los parámetros medios de coagulación para la hemofilia A y para la hemofilia A con 300 nM de ARC19499 en comparación con el plasma normal. El ARC 19499 acortó el tiempo de retardo debajo del nivel normal, y normalizó la velocidad inicial, pero no tuvo efecto sobre la velocidad estacionaria. El ARC 1 9499 aumentó el tamaño de los coágulos a los 60 minutos aproximadamente 2 veces de 30% o 60% del valor normal. A efectos de verificar si los efectos de ARC1 9499 difieren del plasma normal y de hemofilia A, se graficaron las relaciones con y sin 300 n de ARC 19499 para la totalidad de los cuatro parámetros de coagulación [relación= (Parámetro)+ARc i 9499 / (Parámetro) -ARC 19499] (Figura 77). Tanto en el plasma normal como en el plasma de hemofilia A, la relación del tiempo de retardo fue de aproximadamente 0,5, lo que indica que la adición de 300 nM ARC 19499 disminuyó el tiempo de retardo en aproximadamente la mitad, para cada una. Las relaciones para Ve s t a Cio n a na también fueron similares entre los plasmas. Sin embargo, se observaron relaciones más grandes a los 60 minutos en la hemofilia A en comparación con el plasma normal, lo que sugiere que el máximo efecto de ARC 1 9499 en el plasma de hemofilia A superó ligeramente el valor correspondiente al plasma normal.

Para determinar un IC50 para ARC 19499 en el plasma de hemofilia A, se gráfico el tiempo medio de retardo y el tamaño de los coágulos como una función de la concentración de ARC 19499 (hasta 1 0 nM) para TF de baja intensidad (Figuras 78A-B). El efecto semimáximo, calculado mediante ajuste de curva, fue de aproximadamente 0,7 nM para ambos parámetros.

En las Figuras 79A-D se comparan los parámetros de la coagulación para el plasma de hemofilia A solo con 300 nM ARC19499 o con 30 nM rVl la. Las Figuras 79A-D muestra tiempo de retardo, velocidad inicial del crecimiento de los coágulos, velocidad estacionaria y tamaño de los coágulos después de 60 minutos, respectivamente. A diferencia con el rVl la, el ARC1 9499 aumentó el tamaño de los coágulos primariamente por el hecho de acortar el tiempo de retardo y de incrementar la velocidad inicial; no tuvo efecto sobre la etapa de propagación espacial (Ves tac¡onario) - También se llevaron a cabo experimentos en TF de baja intensidad en plasma del que se había retirado el TFPI , para obtener una visión en el mecanismo de acción del ARC 19499 y en la regulación de la coagulación espacial por el TFPI. Se compró plasma liofilizado del que se había retirado el TFPI , de American Diagnostica, se resuspendió en agua desionizada, y se añadió CTI a razón de 0,2 mg/mL. Se añadió TFPI recombinante (rTFPI ; R&D Systems) en el plasma con una concentración de 0 o 10 nM , con o sin ARC1 9499 (0 o 300 nM), para la medición de la formación espacial de los coágulos en la presencia de TF de baja densidad de superficie. La adición de rTFPI aumentó de manera significativa el tiempo de retardo (Figuras 80A-B) en la ausencia de ARC19499, pero no tuvo efecto en la presencia de 300 nM ARC 1 9499, lo que sugiere que está completamente inhibido. El ARC19499 no tuvo efecto sobre la coagulación en el plasma del que se había eliminado el TFPI en la ausencia de rTFPI complementario, lo que indica que sus efectos eran específicos para TFPI. En este experimento, ni el rTFPI ni el ARC 19499 tuvieron efecto alguno sobre la velocidad inicial.

En conclusión, el ARC1 9499 mejoró de manera significativa la coagulación en plasma normal y en plasma de A en el sistema espacialmente heterogéneo con TF de baja intensidad (1 -3 pmol/m2). Se abrevió el tiempo de retardo, y la velocidad inicial de la propagación espacial y el tamaño de los coágulos a los 60 minutos se aumentaron por ARC 1 9499 hasta en dos veces, con poco efecto sobre la velocidad de propagación espacial lejos del activador. En el plasma de hemofilia A, esto tuvo como resultado una normalización completa de los parámetros tiempo de retardo y velocidad inicial , mientras que el tamaño de los coágulos a los 60 minutos se normalizó parcialmente (incrementos de 30% a 60% de lo normal al añadirse ARC 1 9499). Con incrementos en la densidad de TF, el efecto del aptámero se hizo más pequeño y casi no hubo efecto con TF > 20 pmol/m2. En este experimento, la acción del ARC1 9499 sobre la coagulación con un TF de baja intensidad fue específico para TFPI , por cuanto el ARC 1 9499 no tuvo efecto sobre la coagulación en el plasma deficiente en TFPI .

Ejemplo 24 Este ejemplo demuestra que el ARC 19499 puede mejorar la coagulación en la sangre entera en ensayos de coágulos libre de células (plasma)-tiempo, en muestras tomas en pacientes que tienen hemofilia A y hemofilia B.

Se tomaron muestras de sangre (20 mL) de 12 sujetos que incluían siete con hemofilia A severa (los sujetos #1 , 3, 5, 8, 10, 1 1 y 12), dos con hemofilia B severa (#4 y 9) y tres controles sanos (#2, 6 y 7). Se reunió la sangre en 0,5 mM EDTA y 0, 1 mg/mL de inhibidor de tripsina de maíz (CTI ; Haematologic Technologies I nc.). Se utilizó aproximadamente la mitad de cada m uestra para ensayos de sang re entera, mientras q ue la otra mitad fue centrifugada para preparar plasma pobre en plaq uetas (PPP; platelet poor plasma).

El tiempo de coag ulación activado por TF (TF-ACT) es un ensayo con sang re entera que se lleva a cabo mediante el Hemochron® Response Whole Blood Coag ulación System (I nternational Technidyne Corp. ), q ue es un sistema de uso común para medir las respuestas de los pacientes frente a heparina no fraccionada y protamina. Los valores estándar medidos mediante este instrumento utilizan tubos que contienen un activador de la trayectoria de "contacto" o "intrínseca" de la coagu lación (por ejemplo, celita o caol ín) . Sin em bargo, para los TF-ACTs, los tu bos diseñados para medir ACTs estándar fueron enjugados para retirar el agente activador del contacto. En su lugar se añadieron 12 µ1_ de 1 M CaCI2, una cantidad deseada de ARC 1 9499, y 2 µ? de 5 nM de TF relipidado, recombinante (Haematolog ic Technologies). Al añadirse 2 ml_ de sangre entera a esta mezcla , se midió el tiem po de coágulo mediante el instrumento Hemochron® Response como para el ACT estándar. Los resu ltados se muestran en forma tabu lar en la Figura 81 . En los sujetos normales se observó un ACT de TF de l ínea de base, promedio, de 335 ± 22 segundos. Se observaron moderadas disminuciones en TF-ACT (de hasta 75 seg undos) , indicativos de un efecto procoagulante, en estos i ndividuos para concentraciones de ARC1 9499 en el intervalo de 44 a 700 nM . Los dos sujetos con hemofilia B muestran TF-ACTs de l ínea de base de 528 y 580 segundos. El TF-ACT dism inuyó en 160-205 segundos a 88 nM ARC 1 9499 en estos dos individuos, seguidamente aumentó moderadamente a mayores concentraciones de ARC19499 (hasta 350 nM). Se observó un intervalo relativamente ancho de valores de TF-ACT de línea de base en el grupo de hemofilia A, con un valor promedio de 578 ± 140 segundos. Se observó un acortamiento sustancial del TF-ACT dependiente de ARC19499, en 6 de los 7 de estos individuos, y en dos de los mismos (los sujetos #1 y 1 1 ) se observaron valores en el intervalo normal, o debajo del mismo. Se observó solamente una moderada disminución de hasta 47 segundos en el sujeto #12, pero este sujeto también presentaba el TF-ACT de línea de base más corto (328 segundos) del grupo. Estos datos sugieren que la supresión del TFPI por el ARC1 9499 era capaz de mejorar la actividad de la coagulación en un ensayo de coagulación simple, con sangre entera.

Se llevaron a cabo ensayos de tiempo de protrombina diluida (dPT) sobre PPP preparado a partir de las mismas muestras de sangre descritas para los ensayos TF-ACT. Se llevó a cabo el tiempo de protrombina estándar (PT) mediante la adición de tromboplastina, consistente en factor de los tejidos (aproximadamente 1 nM), cloruro de calcio y fosfol ípidos, al plasma, para evaluar la integridad de la trayectoria de la coagulación del "factor de los tejidos" o "extrínseca". El tiempo de coagulación en una muestra de plasma normal, medido mediante el protocolo PT estándar es típicamente de aproximadamente 1 1 segundos. El TP se utiliza comúnmente para medir las respuestas de un paciente a la warfarina, y es ampliamente insensible a las deficiencias en los factores de trayectorias de contacto tales como FVI II y FIX. A diferencia del PT estándar, el dPT utiliza una concentración de TF muy baja, y los tiempos de coagulación medidos mediante este ensayo son sensibles a los factores tanto en las trayectorias de TF como de contacto. En este experimento particular, se diluyó reactivo tromboplastina (Innovin; Dade-Behring) en solución salina tris-amortiguada (20 mM tris, pH 7,5, 150 mM NaCI) de manera de obtener una concentración de 0,3 pM de TF. Se llevó a cabo el dPT mediante el mezclado de 120 µ?_ de PPP con 60 µ?. de la solución diluida de TF e incubando a 37 °C durante 3 minutos antes de añadir 60 µ? de 25 mM CaCI2 a la mezcla de plasma/TF. Se registró el tiempo de coagulación mediante un coagulómetro ACL-8000 (de Instrumentation Laboratory, Bedford, MA), y los datos para la totalidad de los sujetos se muestran en formato de tabla en la Figura 82. Los tiempos de coagulación de la línea de base en las muestras de PPP de todos los sujetos normales y con hemofilia B, y de 6 ó 7 sujetos con hemofilia A, eran >360 segundos, que era el tiempo de coagulación medible máximo prerregulado en el coagulómetro. Uno de los sujetos con hemofilia A (#10) presentó un dPT de línea de base de 169 segundos. Las concentraciones crecientes de ARC19499 añadidos al PPP típicamente resultaron en menores tiempos de coagulación dPT. En el PPP de sujetos normales, 2 nM de ARC19499 eran suficientes para reducir de manera significativa el tiempo de coagulación (promedio = 278 ± 15 segundos) referido a línea de base, pero no tuvo efecto aparente en el plasma de sujetos como hemofilia A o B. Sin embargo, 8 nM de ARC19499 redujeron el tiempo de coagulación en PPP de casi todos los sujetos. Se observaron excepciones en PPP del sujeto #10, en el que se observó un dPT de l ínea de base, bajo, y en el sujeto # 12, que pareció no responder a ARC 19499. Con la excepción de estos dos individuos, el tiempo de coagulación promedio en el grupo A para 8nM ARC 19499 era de 188 ± 8 segundos. Los tiempos de coagulación promedios para los grupos normal y de hemofilia B bajo las mismas condiciones, eran de 204 ± 37 segundos y de 226 ± 22 segundos, respectivamente. Las concentraciones más elevadas de ARC19499 causaron solamente mayores disminuciones moderadas en los tiempos de coagulación. Los tiempos de coagulación promedios a 500 nM de ARC19499 fueron de 6 segundos, 200 ± 21 segundos y 161 ± 3 segundos para los grupos normal, de hemofilia A (excluidos #10 y #1 2) y de hemofilia B, respectivamente. Estos datos indican que la supresión de TFPI por ARC 1 9499 era capaz de mejorar la actividad de coagulación en un ensayo de coagulación simple, basado en plasma.

Ejemplo 25 Este ejemplo demuestra que el ARC 19499 puede mejorar la coagulación in muestras de sangre entera tomadas de pacientes de hemofilia A y hemofilia B, medida mediante tromboelastometría de rotación (ROTEM).

Se recolectaron muestras de sangre de 39 voluntarios saludables ((27 varones y 12 mujeres) y de 40 pacientes con hemofilia (todos varones). De los 40 pacientes con hemofilia, 3 pacientes de hemofilia B (HB) y 28 pacientes de hemofilia A (HA) recibieron un diagnóstico de severo (actividad del factor de línea de base <1 %), un paciente HA y un paciente H B adolecían de hemofilia moderadamente severa (factor de actividad de línea de 1 -5%), cuatro pacientes de HA y dos pacientes de HB tenían hemofilia moderada (factor de actividad de línea de base >5%). Mediante una aguja mariposa calibre 21 , se introdujeron muestras de sangre en tubos de material plástico Vacuette (Greiner Bio-One) que contiene citrato de sodio al 3,8% con una relación de volumen de 1 :9.

Se analizó la coagulación mediante ROTEM (Pentapharm GmbH), basado en el sistema original de tromboelastografía (TEG™). En un experimento ROTEM típico, se incubó sangre a 37 °C en una copa caliente. A medida que se forma fibrina entre la copa y el vástago, se detecta la impedancia de la rotación del vástago y se genera una huella, lo que indica la formación de coágulos a lo largo del tiempo. Pueden analizarse los siguientes parámetros a partir de la huella del ROTEM: el tiempo de coagulación(CT), el tiempo para la formación del coagulo(CFT), la máxima firmeza del coagulo (MCF), y el ángulo alfa. El tiempo de coagulación (CT) caracteriza el periodo desde el inicio del análisis hasta la iniciación del coágulo. El tiempo para la formación del coágulo (CFT) describe el periodo subsiguiente hasta que se alcanza una amplitud de 20 mm. El ángulo alfa está dado por el ángulo entre la línea de centro y una tangente a la curva a través del punto de amplitud de 2 mm . Tanto el CFT como el ángulo alfa designan la velocidad del desarrollo del coágulo. El MCF se calcula a partir de la máxima amplitud de la huella de ROTEM, y describe la estabilidad y resistencia del coagulo; el MCF depende ampliamente de la función del fibrinógeno y de las plaquetas.

En este conjunto de experimentos, 300 µ?_ de sangre entera tachonada con ARC19499 (0, 0,2, 0,6, 2, 6, 20, 60, 200 ó 600 nM de ARC19499) fueron transferidos a copas de material plástico precalentadas. Unas muestras de sangre fueron recalcificadas mediante 20 pL 0,2 M CaCI2 y se activó la coagulación mediante ~33 fM de TF (tissue factor, factor de los tejidos) (Innovin, Dade Behring, diluido 1:200,000). Todos los análisis se llevaron a cabo a 37 °C. Se efectuaron las medidas sea sin CTI (corn trypsin inhibitor, inhibidor de tripsina de maíz) sea con la adición de 100 pg/mL de CTI (Haematologic Technologies Inc). Las comparaciones entre diferentes concentraciones de ARC19499 en cualquiera de los parámetros medidos se calcularon mediante el test de rango firmado por Wilcoxon con una Corrección Bonferroni. Para comparar los controles saludables con los pacientes, se utilizó un test U de Mann-Whitney. Para analizar la correlación entre los parámetros hemostáticos con la actividad del Factor VIII ( F VI II). se utilizó el coeficiente de correlación de rango de Spearman. Un valor p-igual o menor a 0,05 es considerado como estadísticamente significativo.

El perfil de coagulación de la sangre entera de la línea de base se caracterizó por una prolongada fase de inacción (como se muestra mediante un CT prolongado) y una fase de propagación disminuida de coagulación de la sangre entera (CFR prolongado y un ángulo alfa más pequeño) en comparación con los controles saludables (p<0,01 para la totalidad) en la ausencia de CTI (Figura 83).

Las concentraciones de ARC19499 >2nM reforzaron la coagulación de sangre entera de manera significativa tanto en los pacientes con hemofilia como en los controles saludables (p<0,01 ). El máximo efecto hemostático de ARC 1 9499 se obtuvo con concentraciones = 60nM. En sangre con hemofilia, el ARC 1 9499 disminuyó el CFT y aumentó el ángulo alfa a valores iguales a los de los controles saludables (p>0,4). El tiempo de coagulación se mejoró sustancialmente mediante el ARC19499, pero no se normalizó por completo. El MCF, a pesar de no ser significativamente diferente entre los controles y los pacientes, aumentó de manera significativa por el ARC 1 9499 (p<0,05 para 0 nM ARC19499 en comparación con=2 nM en pacientes con hemofilia y 200 nM en los controles saludables).

Una comparación entre los niveles de la actividad coagulante de FVI I I (FVI II :C) en las muestras de pacientes con hemofilia A y el CT de línea de base indica una significativa correlación (p<0,01 ). Por ello, los datos de CT de pacientes con hemofilia A fueron estratificados en tres grupos (<1 % FVI I I :C, 1 -5% FVI I I . C, y >5% FVI I I :C) y regraficados junto con los datos de CT de los controles saludables (Figura 84). Como se indicó en lo que precede, las concentraciones = 2nM ARC1 9499 acortaron significativamente el tiempo de coagulación (p<0,01 ). Los valores de CT para pacientes con hemofilia y controles saludables permanecieron significativamente diferentes (p<0,05), pero el ARC1 9499 acortó el CT de los pacientes con hemofilia en un máximo de hasta 38%, y el de los controles saludables en hasta 19%, en comparación con los valores de línea de base. El ARC 1 9499 tenía el efecto más grande sobre el CT en pacientes en los que la medición indicaba FVI 11 : C < 1 %. Si bien el CT de pacientes con FVI 11 : C <1 % no se normalizó por completo, el ARC19499 abrevió el CT al intervalo de los controles saludables y a valores iguales a los de los pacientes con un FVI 11 :C >5%.

Se llevaron a cabo análisis ROTEM adicionales en sangre que contiene CTI , para lo cual se utilizaron muestras de 28 pacientes con hemofilia y 1 1 controles saludables varones. Nuevamente, los perfiles de coagulación fueron significativamente diferentes para pacientes y controles saludables (p<0,01 ) para la totalidad de los parámetros con la excepción del MCF (Figura 85). De manera similar a las mediciones en la ausencia de CTI , la adición de ARC1 9499 a sangre que contiene CTI abrevió significativamente el CT y el CFT, y aumentó el ángulo alfa y el MCF (concentraciones= 20 nM , p=0,01 ). En sangre que contiene CTI , el efecto pro-hemostático era más pronunciado que en sangre sin CTI . Al añadirse 200 nM de ARC 19499 a sangre que contiene CTI , el CT no sólo se abrevió de manera significativa (p<0,01 ), sino que también ya no era más diferente del CT de l ínea de base de los controles saludables (p=0,06). El ARC 1 9499 también normalizó el CFT y el ángulo alfa en sangre entera de CTI , como se observó anteriormente en sangre entera que carece de CTI . Los parámetros de la sangre hemofílica tachonada con = 60nM de ARC19499 son iguales a los valores de base de los controles saludables (p>0, 1 ).

Se reclutó un paciente con hemofilia A adquirida. Este paciente mostró una actividad de FVI II :C del 7%, 8, 5 BU/mL de inhibidor de FVI II y un PTT elevado, de 63 segundos. Este paciente había recibido dos infusiones de FEI BA (actividad que deriva Vl l l l), la más reciente dentro de las 8 horas de la venipunctura. Como consecuencia de ello, el CT y CFT de este paciente ya eran normales (valores del paciente: CT=496 segundos, CFT=21 3 segundos; valores medios de control saludables: CT=607 segundos, CFT=251 segundos). El ARC19499 abrevió el CT y CFT más aún, y más todavía que en los controles y en los pacientes con hemofilia hereditaria (CT: 47% vs. 19% y 30%, CFT: 45% vs. 38% y 22%). El ARC 1 9499 también aumentó el ángulo alfa, como se muestra en la Figura 86.

Ya que los pacientes con hemofilia adquirida son sumamente raros, se repitió el experimento con el ROTEM sobre sangre normal que había sido tratada con un anticuerpo neutralizante con respecto a FVI I I. Se preincubó sangre tomada de controles saludables con un anticuerpo policlonal FVI I I antihumano de oveja (actividad específica 2300 BU/mg; Haematologic Technologies Inc). La Figura 87 muestra el CT (panel a la izquierda) y el CFT (panel a la derecha) en los mismos controles; sobre el lado izquierda de cada gráfico, se han ilustrado los valores después de la inhibición por el anticuerpo de FVI I I . La adición de 60 n M ARC19499 normalizó tanto el CT como el CFT en la sangre tratada con anticuerpo.

Estos datos muestran que el ARC 19499 tenía un efecto procoagulante sobre la coagulación en muestras de sangre tomadas de controles saludables y pacientes de hemofilia medidos mediante ROTEM. Adicionalmente, el ARC1 9499 fue capaz de normalizar los parámetros de ROTEM de la coagulación en la sangre extraída de pacientes con hemofilia.

Ejemplo 26 Este ejemplo demuestra que el ARC 19499 puede mejorar la generación de la trombina en muestras de plasma tomadas de pacientes con hemofilia A y hemofilia B, medida mediante trombografía automatizada calibrada (CAT).

Se recolectaron unas muestras de sangre de 39 voluntarios saludables ((27 varones y 12 mujeres) y 40 pacientes de hemofilia (todos varones). De los 40 pacientes con hemofilia, 3 pacientes con hemofilia B (HB) y 28 pacientes con hemofilia A (HA) recibieron un diagnóstico de severo (actividad del factor en l ínea de base <1 %), un paciente de HA y un paciente de HB adolecían de una hemofilia moderadamente severa (factor de actividad de la línea de base 1 -5%), y cuatro pacientes de HA y dos pacientes de HB tenían hemofilia moderada (factor de actividad de la línea de base >5%). Para ello se utilizó una aguja mariposa calibre 21 , y unas muestras de sangre fueron introducidas en tubos de material plástico Vacuette (Greiner Bio-One) que contienen citrato de sodio al 3,8% con una relación de volúmenes 1 :9. Se preparó PPP (plasma pobre en plaquetas) a partir de esas muestras mediante dos pasos de centrifugación a temperatura ambiente; con un primer giro a 1 0,000 x g durante 1 0 min seguido por un segundo giro a 18,000 x g durante 15 minutos. Una cantidad de PPP que contiene 1 00 pg/mL de inhibidor de tripsina de maíz (CTI; Haematologic Technologies Inc.) fue tachonada con diferentes concentraciones de ARC19499 (0, 0,2, 0,6, 2, 6, 20, 60, 200 ó 600 nM ARC19499) para su uso en el ensayo.

Se llevaron a cabo ensayos de CAT mediante la adición de 80 p ide PPP a 20pL de una mezcla de TF (factor de los tejidos) y fosfolípidos (PPP-Reagent Low, Trombinaoscope BV) en una placa de microtitulación de 96 cavidades. Las concentraciones finales de TF y fosfolípidos fueron de 1 pM y 4 µ?, respectivamente. Se inició la reacción mediante la adición 20 µ ?_ de sustrato fluorogénico (FluCa Kit, Trombinaoscope BV) y se detectó la fluorescencia para lo cual se utilizó un fluorómetro Fluoroskan Ascent (Thermo Fisher Scientific). El análisis mediante software de Trombinaoscope resultó en la generación de curvas de trombina con trombina (nM) sobre el eje de las y, y tiempo (en minutos) sobre el eje de las x. El software determinó valores para una cantidad de parámetros que incluyen: tiempo de retardo (minutos; tiempo hasta el inicio de la generación inicial de la trombina); ETP (potencial endógeno de trombina; nM; área bajo la curva de la generación de la trombina); trombina pico (nM; cantidad más elevada de trombina generada en cualquier punto del ensayo); tiempo hasta pico (minutos; tiempo pora llegar a la concentración pico de la trombina ); y cola de inicio ((minutos; instante de tiempo cuando se llega a la generación final de la trombina) . Las comparaciones entre diferentes concentraciones de ARC19499 en cualquiera de los parámetros medidos se calcularon con el test firmado de Wilcoxon con una Corrección de Bonferroni. Para comparar los controles saludables con los pacientes, se utilizó un test U de Mann-Whitney. Un valor de p inferior o igual a 0, 05 fue considerado como estad ísticamente significativo.

En la Figura 88 se muestran ejemplos de datos de CAT para un paciente representativo de hemofilia A (panel a la izquierda) y para un control saludable (panel a la derecha), en donde se compara la generación de la trombina en la presencia de y en la ausencia de 200 nM de ARC 1 9499. La adición de ARC 19499 normalizó la curva de la generación de la trombina en la muestra del paciente de hemofilia A, y aumentó la generación de la trombina en la muestra del control saludable.

En la Figura 89 se muestran parámetros de CAT promedios para la totalidad de los pacientes de hemofilia y de los controles saludables varones. En la línea de base, el grupo de pacientes de hemofilia presentó un tiempo a pico prolongado, una menor generación pico de la trombina y un ETP severamente comprometido. En la ausencia de ARC1 9499, los siguientes parámetros de CAT fueron significativamente diferentes entre controles saludables varones y pacientes de hemofilia: tiempo a pico, generación pico de la trombina, ETP y cola de inicio (p<0,001 ). No hubo una diferencia significativa en el tiempo de retardo entre les controles saludables y los pacientes de hemofilia (Figura 90). La adición de ARC 19499 reforzó de manera significativa la totalidad de los parámetros evaluados por el ensayo CAT (Figuras 89 y 90). Las concentraciones superiores a 60 nM de ARC1 9499 normalizaron los parámetros de CAT en los pacientes de hemofilia. Ya no hubo una diferencia significativa entre los valores de l ínea de base de los controles saludables y los valores medidos con la adición de =60 nM ARC19499 en los pacientes de hemofilia en los siguientes parámetros de CAT: cola de inicio, tiempo a pico y ETP (p >0,05) (Figura 89). La trombina pico siguió siendo significativamente diferente entre los pacientes y los controles, pero 600 nM de ARC1 9499 aumentó la trombina pico en 185% en los pacientes de hemofilia, de 47 nM a la línea de base a 1 35 nM, con lo que se llegó al intervalo normal de los controles saludables (media de trombina pico en los controles saludables 1 67 nM, mínimo 1 00 nM, máximo 297 nM) . El ARC1 9499 abrevió el tiempo de retardo significativamente en ambos grupos (p<0,001 para concentraciones superiores a 0,6 nM) pero las diferencias entre los grupos siguieron siendo no significativos (Figura 90).

La Figura 91 muestra los datos de trombina pico estratificados en tres grupos (< 1 % actividad coagulante FVI I I (FVI I I :C), 1 -5% FVI I I :C, y >5% FVI I I :C) y regraficados junto a los datos de la trombina pico de los controles saludables. Las concentraciones crecientes de ARC19499 aumentaron la generación pico de la trombina en la totalidad de los cuatro grupos. El ARC1 9499 no normalizó completamente la trombina pico en el plasma < 1 % FVI I LC con referencia a los valores promedios de control saludable en la línea de base, pero los valores a >60 nM ARC1 9499 fueron superiores a los de la línea de base de los pacientes con concentración de FVI 11 :C >5% y se hallaban en el intervalo de valores observados para los controles saludables (región con trazos oblicuos en la Figura 91 ).

También se llevaron a cabo ensayos de CAT sobre muestras tachonadas con ARC1 9499-tomadas de un paciente con hemofilia adquirida. Este paciente muestra una actividad de FVI I LC de 7%, 8,5 BU/mL de inhibidor de FVII I inhibitor y un elevado aPTT de 63 segundos.

Este paciente había recibido dos infusiones de actividad que deriva FVI II (FEIBA), la más reciente dentro de las 8 horas de la venipunctura. Como consecuencia de ello, los parámetros de ROTEM de la coagulación en paciente ya eran normales (valores del paciente : CT=496 segundos, CFT=213 segundos; valores medios de control saludables: CT=607 segundos, CFT=251 segundos). 251 segundos). La generación de las curvas de trombina medidas en la presencia de 0, 2, 20 y 200 nM ARC1 9499 se muestran en la Figura 92. Si bien este paciente presentó valores de ROTEM normales, los valores de la línea de base del CAT estaban severamente comprometidos. Como para los pacientes con hemofilia heredada , las concentraciones crecientes de ARC 19499 normalizaron la generación de la trombina en muestras tomadas de este paciente. El ARC1 9499 ten ía la mayor influencia sobre la trombina pico y sobre el ETP del paciente, y ambos aumentaron más de 2,5 veces. La trombina pico se normalizó (trombina pico: l ínea de base 54 nM - máx. 165 nM; valores medidos de la línea de base de los controles saludables: 164 nM). Además el ARC 19499 (200 nM) aumentó el ETP a valores superiores a los de los controles saludables (ETP: línea de base 973 nM - máx. 2577 nM; valor media de la línea de base controles saludables: ETP 1322 nM).

Se repitió el experimento de CAT sobre plasma normal que había sido tratado con un anticuerpo neutralizante con respecto a FVII I . Una cantidad de PPP tomada de controles saludables fue pre-incubada con anticuerpo policlonal FVI I I antihumano de oveja (actividad específica 2300 BU/mg; Haematologic Technologies Inc) . La Figura 93 muestra el ETP (panel a la izquierda) y la trombina pico (panel a la derecha) en los mismos controles; sobre el lado izquierda de cada gráfico, se ilustran los valores después de la inhibición por el anticuerpo FVIII. La adición de 60 nM ARC19499 normalizó tanto el ETP como la trombina pico en el plasma tratado con anticuerpo.

Estos datos muestran que el ARC19499 tuvo un efecto procoagulante sobre la generación de la trombina en muestras de sangre tomadas de controles saludables y de pacientes de hemofilia, como se midió mediante CAT. La adición de ARC19499 fue capaz de normalizar los parámetros de CAT en el plasma tomado de pacientes de hemofilia.

Ejemplo 27 Este ejemplo demuestra que el ARC19499 puede mejorar los tiempos para la generación de la trombina (TGT) en muestras de plasma tomadas de pacientes de hemofilia A severa, moderada y suave, y de pacientes con hemofilia B severa, como se midió mediante trombograma automatizada calibrada (CAT).

Se recolectó sangre en tubos Vacuette de 3,2 mL que contienen citrato de sodio al 3,2% y 250 ? de CTI (corn trypsin inhibitor, inhibidor de tripsina de maíz) 1,3 mg/mL; la concentración final del CTI era de 100 pg/mL. Se recolectaron muestras de pacientes con hemofilia A severa (<1% FVIII; n=10), moderada (1-5% FVIII; n=7) y suave (5-40% FVIII; n=5), pacientes con hemofilia B severa (<1% FIX, n=5) y voluntarios saludables (n=10). Para preparar plasma pobre en plaquetas (PPP) para los ensayos de CAT, unos tubos fueron centrifugados a 2500xg durante 15 minutos, el material sobrenadante fue transferido a tubos de Eppendorf frescos, y seguidamente se centrifugó nuevamente a 11000xg durante 5 minutos. El plasma se utilizó de inmediato o se congeló a -80 °C para su uso ulterior. Para analizar el efecto del ARC19499 sobre la generación de la trombina, se añadió ARC19499 a plasma con concentraciones de 10, 100, 300, 1000, 3000 o 10,000 ng/mL (0,9, 9,0, 27,1, 90,3, 271 ó 903 nM).

Los ensayos para determinar el tiempo de la generación de la trombina (TGT) se llevaron a cabo mediante trombograma automatizada calibrada (CAT) en un instrumento Trombinaoscope (Trombinoscope, Maastricht, Países Bajos) consistente en un fluorómetro de placa de micro titulación Thermo Scientific Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (serie no. 374-90031C) programado con el software versión 2,6 de Trombinaoscope. Se mezclaron 80 µ?_ de plasma con 20 pL de TF (factor de los tejidos relipidado recombinante (TF; concentración final 1 pM) y se inició el ensayo mediante la adición de 20 µ?_ de sustrato FluCa. El análisis de los datos por el software de Trombinaoscope resultó en la generación de curvas de trombina con trombina (nM) sobre el eje de las y el tiempo (minutos) sobre el eje de las x. El software determinó valores para una cantidad de parámetros que incluyen: tiempo de retardo (minutos; tiempo hasta la ocurrencia de la generación inicial de la trombina), EPT (potencial de trombina endógena) (ETP; nM; área bajo la curva de generación de la trombina), trombina pico (nM; máxima cantidad de trombina generada en cualquier punto individual del ensayo) y tiempo pico (minutos; tiempo para llegar a la concentración pico de la trombina). Todas las mediciones se llevaron a cabo por duplicado. Se testearon las diferencias en los valores medios de cada Grupo, para lo cual se utilizó un test t de Student o un ANOVA, como fuera adecuado.

Las Figuras 94-97 muestran datos de CAT representativos de un voluntario saludable (HV), de un paciente con hemofilia A severa (SHA), de un paciente con hemofilia A moderada (MoHA) y de un paciente con hemofilia A suave (MiHA). Los datos medianos correspondientes a los voluntarios saludables, de la totalidad de los tres grupos pacientes con hemofilia A, y del grupo de pacientes con hemofilia B severa, se muestran en la Figura 98 para los experimentos llevados a cabo en plasma procesado en fresco. Los parámetros de la trombina pico de ETP de línea de base y de trombina pico, disminuyeron en todos los pacientes de los grupos de hemofilia en comparación con los controles saludables, y el tiempo a pico aumentó. La severidad o gravedad de la deficiencia de FVI I I no tuvo efecto sobre la generación observada de la trombina, ya que los valores de la línea de base fueron esencialmente indistinguibles entre los tres grupos de pacientes con hemofilia A. La deficiencia de FVI I I tuvo poco efecto sobre el tiempo de retardo en la línea de base en comparación con los controles saludables, pero la deficiencia de FIX resultó en una prolongación de ~2 veces del tiempo de retardo en la línea de base. La congelación del plasma tuvo poco efecto sobre la generación de la trombina ya que se observaron para los parámetros de CAT similares a los observados en muestras de plasma que habían sido sometidos a congelación - descongelación (Figura 99).

Como se muestra en los gráficos de datos individuales (Figuras 95-97) y de valores medianos (Figuras 98 y 99), la adición de ARC19499 mejoró la generación de la trombina en el plasma de hemofilia. El ETP aumentó con concentraciones crecientes de ARC 19499 hasta valores de 10,000 ng/mL (903 nM), llegándose a un nivel normal en todos los grupos de hemofilia (Figuras 98 y 99). También se observó una tendencia hacia una mejora en la trombina pico. Si bien no se logró una normalización de este parámetro, se observaron mejoras de 3-5-veces en todos los grupos de pacientes. El ARC1 9499 tuvo poco efecto sobre el tiempo de retardo en ninguno de los grupos de pacientes con hemofilia A, pero si mejoró ligeramente el tiempo de retardo en el plasma de hemofilia B. También se observó una ligera mejora en el tiempo a pico para la totalidad de los grupos de pacientes. En el plasma de voluntarios saludables, la adición de ARC 1 9499 tuvo poco efecto sobre ninguno de los parámetros de CAT.

En las siguientes tablas se presentan datos de valores medianos de CAT con intervalos intercuartiles para plasma fresco y congelado: Tabla 3, hemofilia A severa (SHA); Tabla 4 hemofilia A moderada (MoHA); Tabla 5, hemofilia A suave (MiHA); Tabla 6, hemofilia B severa (SHB); y Tabla 7, normal. Tomados en conjunto, los datos muestran que el ARC19499 mejoró la generación de la trombina en el plasma de pacientes con hemofilia A en todos los niveles de severidad, y en el plasma de hemofilia B severa.

Tabla 3: TGT sobre PPP citrado con CTI - SHA (n=1 0) Tabla 4: TGT sobre PPP citrado con CTI - MoHA (n=7) Tabla 5: TGT sobre PPP citrado con CTI - Suave HA PPP (n=5) Tabla 6: TGT sobre PPP citrado con CTI - SHB PPP (n=5) Tabla 7: TGT sobre PPP citrado con CTI - PPP normal (n Ejemplo 28 Este ejemplo demuestra que el ARC19499 puede mejorar la coagulación en la sangre entera y en muestras de plasma tomadas de pacientes con hemofilia A y hemofilia B, como se midió mediante tromboelastografía (TEG).

Se recolectó sangre en tubos Vacuette de 3,2 mL que contienen citrato de sodio al 3,2% y 250 µ?_ 1,3 mg/mL de inhibidor de tripsina de maíz (CTI); la concentración final del CTI era de 100 pg/mL Se recolectaron muestras de pacientes con hemofilia A severa (<1% FVIII; n = 10), moderada (1-5% FVIII; n=7) y suave (5-40% FVIII; n=5), de pacientes con hemofilia B severa (<1% FIX, n=5) y de voluntarios saludables (n=10). Para preparar plasma pobre en plaquetas (PPP) para los ensayos de CAT, los tubos fueron centrifugados a 2500xg durante 15 minutos, el material sobrenadante fue transferido a tubos de Eppendorf frescos, y seguidamente se centrifugó nuevamente a 11000*g durante 5 minutos. El plasma fue utilizado de inmediato o congelado a -80°C para su utilización ulterior. Para analizar el efecto del ARC19499 sobre la generación de la trombina, se añadió ARC19499 al plasma con concentraciones de 10, 100, 300, 1000, 3000 o 10,000 ng/mL (0,9, 9,0, 27,1, 90,3, 271 o 903 nM).

Se llevaron a cabo ensayos de tromboelastografía(TEG) para lo cual se utilizó un instrumento TEG serie 5000 de Haemoscope. Se llevaron a cabo ensayos TEG con sangre entera mediante la adición de 300 L de sangre entera a 40 µ?_ de 9 pM de factor de los tejidos (TF) y 20 µ?_ de 0,2 ? CaCI2 en una copa de reacción descartable. Las huellas de amplitud versus tiempo fueron analizadas para obtener el tiempo R (duración de tiempo para iniciar la formación de los coágulos, amplitud=2 mm), el valor K (medida de la velocidad de la formación de los coágulos, igual al tiempo requerido para llegar a una amplitud de 20 mm) y el ángulo (otra medida de la velocidad de la formación de los coágulos, calculado a partir de la tangente del trazo de amplitud dibujado hasta su origen establecido en el tiempo R). Los ensayos de TEG de plasma se llevaron a cabo de manera similar, con la salvedad de que se incluyeron fosfolípidos complementarios (PL). En estos ensayos se mezclaron 300 pL de PPP con 10 pL de 38 pM TF, 30 µ? de 48 µ? PL (20 % de fosfatidil serina, 20 % de fosfatidil etanolamina, 60% de fosfatidil colina, Avanti Polar Lipids) y 20 µ? de 0,2 M CaCI2. La concentración final de PL en estas reacciones era de 4 µ?.

En las Figuras 100-103 se muestran datos representativos de TEG de sangre entera TEG tomada de un voluntario saludable (HV), de un paciente con hemofilia A severa (SHA), de un paciente con hemofilia A moderada (MoHA) y de un paciente con hemofilia A suave (MiHA). En la Figura 104 se muestran datos para los voluntarios saludables, para la totalidad de los tres grupos de pacientes con hemofilia A, y para el grupo de pacientes con hemofilia B severa. Los valores de la línea de base R-tiempo fueron elevados en todos los grupos de pacientes con hemofilia en comparación con los controles saludables, lo que indica un retardo en la iniciación del coágulo, observándose el efecto más significativo en las muestras de hemofilia A y B severas. Además, los valores de K aumentaron y los ángulos disminuyeron en las muestras de pacientes con hemofilia en comparación con los controles saludables. Estos dos efectos indican una formación menos rápida de los coágulos en comparación con lo normal, si bien los efectos fueron similares en todos los grupos de pacientes independientemente de la gravedad de deficiencia del factor.

Como se muestra en los gráficos individuales (Figuras 101 -1 03) y de los datos de valores medios (Figura 1 04), la adición de ARC19499 mejoró la formación de los coágulos en la sangre entera, como se midió mediante TEG. La concentraciones crecientes de ARC1 9499 (hasta valores de 10,000 ng/mL, 903 nM) normalizaron sustancialmente la totalidad de los parámetros de TEG en la totalidad de los grupos de pacientes (Figura 104). El RC1 9499 restauró la iniciación normal de los coágulos (tiempo R) y el desarrollo (valor de K y ángulo).

Se observaron resultados similares en los ensayo TEG con plasma. En las Figuras 105- 107 se muestran datos de TEG individuales de pacientes representativos con hemofilia A severa (SHA), hemofilia A moderada (MoHA), y hemofilia A suave (MiHA), y los datos de los valores medios se presentan en la Figura 1 08. Los efectos de la coagulación de línea de base muestran una tendencia hacia una correlación con la gravedad de la enfermedad en la totalidad de los tres parámetros de TEG, observándose los efectos más sustanciales para las muestras de hemofilia A y B severas (Figura 1 08). La adición de ARC19499 mejoró la totalidad de los tres parámetros que describen la formación de los coágulos. Las concentraciones crecientes de ARC19499 parecieron normalizar la coagulación en la totalidad de los grupos de pacientes, como se midió mediante tiempo R y valor de K. En cambio, mientras que el ARC19499 pareció normalizar el ángulo tanto en los grupos de hemofilia A moderada como suave, el ángulo en los grupos de hemofilia A y B severa no se corrigió por completo, ni siquiera bajo las concentraciones de ARC 19499 más elevadas ensayadas. Sin embargo, se observó una mejora sustancial en la totalidad de los grupos.

Los datos de valores medios con intervalos ¡nterquartiles se presentan para las mediciones con sangre entera en las tablas siguientes: Tabla 8, hemofilia A severa (SHA) ; Tabla 9, hemofilia A moderada (MoHA); Tabla 10, hemofilia A suave (MiHA) ; Tabla 1 1 , hemofilia B severa (SHB); y Tabla 12, normal. Las tablas adicionales muestran datos de valores medios con intervalos ¡nterquartiles para medidas de TEG sobre plasma: Tabla 1 3, hemofilia A severa (SHA); Tabla 14, hemofilia A moderada (MoHA); Tabla 15, hemofilia A suave (MiHA); Tabla 16, hemofilia B severa (SHB); y Tabla 1 7, normal. En la totalidad de las tablas, el intervalo normal previsto para cada parámetro se muestra en bastardilla en el encabezamiento de las columnas. En su conjunto, los datos muestran que el ARC 1 9499 mejora la formación de los coágulos en el plasma de los pacientes de hemofilia A de todos los niveles de gravedad , y en el plasma de los pacientes con hemofilia B severa.

Tabla 8: TEG sobre sangre citrada con CTI - SHA (n=10) Tabla 9: TEG sobre sangre citrada con CTI - MoHA (n=7) Tabla 10: TEG sobre sangre citrada con CTI - MiHA (n Tabla 11: TEG sobre sangre citrada con CTI - SHB (n=5) Tabla 12: TEG sobre sangre citrada con CTI - HV (n=1 0) Tabla 13: TEG sobre PPP citrado con CTI - SHA (n = 1 0) Tabla 14: TEG sobre PPP citrada con CTI - MoHA (n=7) Tabla 15: TEG sobre PPP citrada PPP con CTI - MiHA (n=5) Tabla 16: TEG sobre PPP citrado con CTI - SH B (n=5) Tabla 17: TEG sobre PPP citrado con CTI - HV (n = 10) Ejemplo 29 Este ejemplo demuestra que la actividad in vitro del ARC19499 puede ser invertida.

Se mezclaron cuatro agentes (ARC23085, ARC23087, ARC23088 y ARC23089) con ARC19499 y se efectuaron ensayos tanto con trombograma automatizada calibrada(CAT) como con tromboelastografía (TEG), sobre plasma de hemofilia A (Figuras 109A-C).

Para el ensayo CAT, se incubó ARC19499 con cada agente de inversión individualmente durante 5 minutos a 37 °C. Seguidamente se adicionó la mezcla a plasma de hemofilia A con una concentración final de 100 nM ARC19499 y concentraciones crecientes de ARC23085, ARC23087, ARC23088, o ARC23089 (2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, y 320 nM). Seguidamente se llevó a cabo el ensayo CAT como descrito anteriormente para lo cual se utilizo una concentración final de TF de 1,0 pM. El ARC19499 solo mejoró el ETP del plasma de hemofilia A de ~600 nM a ~900 nM (Figura 109A). La totalidad de los cuatro agentes de inversión bloquearon esta mejora cuando se ensayó con concentraciones >80 nM. El ARC23085 y el ARC23089 invirtieron casi por completo la actividad de ARC19499 a 160 nM, mientras que el ARC23087 y el ARC23088 invirtieron casi por completo la actividad del ARC19499 a 320 nM. Si se observa la trombina pico (Figura 109B), los cuatro agentes de inversión mostraron una inversión parcial similar de la actividad de ARC19499 a 80 nM. Nuevamente, a 160 nM, el ARC23085 y el ARC23089 invirtieron por completo la actividad del ARC19499, mientras que los otros dos agentes de inversión lo hicieron a 320 nM.

Para el ensayo de TEG®, el ARC19499 y cada uno de los cuatro agentes de inversión fueron mezclados con plasma de hemofilia A, y se inició la coagulación con la adición de TF y CaCI2. Esto se llevó a cabo con y sin un preincubación de cinco minutos de ARC19499 y la adición de agente de inversión a 37 °C. Cuando el ARC19499 fue ensayado solo, el aptámero corrlgió el valor R prolongado del plasma de hemofilia A de 54 minutos a 8,3 minutos (Figura 109C). El ARC23085 invirtió parcialmente esta mejora con valores de R de 30 y 24 minutos con y sin la preincubación de 5 minutos, respectivamente. El ARC23087 no demostró ninguna capacidad para invertir el ARC19499 cuando no había preincubación, pero con la incubación de hecho invirtió la actividad del ARC19499, resultando un valor de R de 38 minutos. El ARC23088 demostró poca o ninguna capacidad de revertir la actividad del ARC19499 en este ensayo, independientemente de cualquier preincubación. De manera similar al ARC23087, el ARC23089 muestra poca capacidad de invertir la actividad de ARC19499 cuando no hay preincubación. Pero, cuando el agente de inversión se incubó con ARC19499 antes del ensayo, invirtió la actividad del ARC19499 casi por completo, resultando un valor de R de 42 minutos (Figura 109C).

Estos experimentos indican que es posible invertir la actividad in vitro del ARC 19499.

Ejemplo 30 Este ejemplo demuestra que el ARC19499 no inhibe la actividad anticoagulante in vitro de la heparina de bajo peso molecular (LMWH).

En este ensayo, concentraciones crecientes de ARC19499 y concentraciones crecientes de LMWH fueron mezcladas entre si y añadidas al plasma de hemofilia A. La generación de la capacidad de la trombina de estas mezclas de plasma fue analizada para lo cual se utilizó el ensayo trombograma automatizada calibrada(CAT). Las Figuras 110A-G muestra la generación de curvas de trombina de las concentraciones crecientes de aptámero en la presencia de cada concentración de LMWH. El ARC19499 fue ensayado a 0,1, 1, 10, 100 y 1000 nM. El LMWH fue ensayado a 0 (Figura 110A), 0,156 (Figura 110B), 0,312 (Figura 110C), 0,625 (Figura 110D), 1,25 (Figura 110E), 2,5 (Figura 110F) y 5,0 IU (unidades internacionales)/mL (Figura 110G).

En la Figura 111 A, fueron graficados los valores de ETP para cada combinación a lo largo del eje de las y, con las concentraciones de LMWH a lo largo del eje de las x. Lo mismo era cierto para los valores pico de trombina en la Figura 111B. En ambos casos, las dosis terapéuticas de LMWH (0,5-1,0 lU/mL) inhibieron fuertemente la generación de la trombina, y las concentraciones más elevadas impidieron casi por completo cualquier generación de trombina, aún en la presencia de valores de hasta 1000 nM ARC19499 (Figuras 111A-B). Los valores de IC50 de 381 ± 24,3 nM y 299 ± 18,0 nM para el LMWH se calcularon a partir de los datos de ETP y de trombina pico, respectivamente, en la ausencia de ARC19499, y estos resultados son compatibles con mediciones anteriores (Robert et al., Is generation of thrombin the new rapid, reliable and relevant pharmacological tool for the development de anticoagulant drugs?, Pharmacol Res. 2009; 59:160-166). Las concentraciones crecientes de ARC19499 no parecieron alterar de manera significativa el IC50 del LMWH (Figuras 112A-B), lo que indica que el ARC19499 no interfiere con la actividad anticoagulante del LMWH.

Este experimento indica que aún en la presencia de de 1000 nM ARC19499, las dosis terapéuticas de LMWH sigue siendo anticoagulantes en un ensayo in vitro.

Ejemplo 31 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI son estables frente a las nucleasas de suero.

En este experimento, 50 µ? de cada aptámero fueron incubados en 90% de suero humano, de mono cinomólogo o de rata, reunido, durante 72 horas a 37 °C. Las muestras fueron analizadas mediante HPLC, y se determinó el porcentaje restante como una función del tiempo de incubación, como se muestra en las Figuras 113A-F.

Tanto el ARC19498 como el ARC19499 fueron >95% estables a lo largo de 72 horas en suero humano, de mono o rata (Figuras 113A y 113B).

El ARC19500 fue >92% estable a lo largo de 72 horas en suero humano, de mono o de rata (Figura 113C), y el ARC19501 fue >80% estable a lo largo de 72 horas en suero humano, de mono o de rata (Figura 113D).

El ARC19881 fue >78% estable a lo largo de 72 horas en suero humano, de mono o de rata (Figura 113E), y el ARC19882 fue >91% estable a lo largo de 72 horas en suero humano, de mono o de rata (Figura 113F).

Ejemplo 32 Este ejemplo demuestra que los aptámeros de TFPI tienen una actividad biológica.

En este experimento, se creó un modelo primate no humano de hemofilia A inyectándose en un mono cinomólogo un único bolo intravenoso (IV) de anticuerpo policlonal de oveja contra Factor VI II humano (20 mg; 50,000 Bethesda Units). 3,5 horas después de la inyección IV, se trataron los monos sea con solución salina (1 mL/kg), Factor VI la recombinante (rFVI Ia) (NovoSeven®; 90 pg/kg de bolo) o ARC19499 (600 pg/kg , 300 pg/kg o 100 pg/kg de bolo). Se adquirieron muestras de sangre citradas antes de la administración de anticuerpo (línea de base), 2, 5 horas después de la administración del anticuerpo, 15 minutos después del tratamiento con fármaco/solución salina (tiempo = 3,75 horas), y 1 y 2 horas después del tratamiento con fármaco/ solución salina (tiempo =4,5 y 5,5 horas, respectivamente). Se procesó la sangre para generar plasma, y se ensayaron muestras de plasma citradas pára establecer el tiempo de protrombina (PT), tiempo de protrrombina parcial activado (apTT), función de Factor VI II y tromboelastografía (TEG®). El mono tratado con solución salina recibió un tratamiento de ARC1 9499 (600 pg/kg) después de haberse trazado el punto R de 5,5 horas. Quince minutos después de recibir este tratamiento, se le extrajo otra muestra cifrada de sangre, y se procesó para obtener el plasma.

A los efectos de asegurar que el ARC 1 9499 inhibe el TFPI de mono, se mezcló plasma tomado de monos después del tratamiento con anticuerpo, ex vivo, con concentraciones crecientes de ARC1 9499 de 1 a 1 000 nM, y se ensayó en un ensayo de TEG (Figura 1 14) . El plasma mezclado con aptámero fue comparado con el plasma con aptámero, tanto antes como después del tratamiento con anticuerpo (líneas llenas y de trazos, respectivamente). El tratamiento con anticuerpo solamente prolongó el valor de R. La adición de ARC 19499 a este plasma tratado con anticuerpo corrigió el valor de R a niveles cercanos a la línea de de base, lo que sugiere que el aptámero reaccionaba cruzadamente con el plasma de mono.

En la muestra de plasma extraída 2, 5 después de la inyección de anticuerpo, los niveles del Factor VI I I estaban debajo del 0,6% y permanecieron allí durante el transcurso del ensayo de 5, 5 horas (Figura 1 1 5). Como se preveía, el PT, que es insensible al FVI I I , permaneció sin cambios después de la administración del anticuerpo (Figura 1 16A); sin embargo, al inyectarse rFVI Ia, hubo una ligera caída en los valores de PT de 13,0 ± 0,4 a 1 0,7 ± 0,4 segundos. Los valores de PTT aumentaron después de la administración del anticuerpo de Factor VIII (Figura 1 16B). Como puede verse en el ensayo de PT, la administración de rFVI Ia resultó en una disminución en el tiempo de coagulación en el ensayo de aPTT. No hubo cambio en los valores de aPTT en el tratamiento con solución salina. El tratamiento con ARC1 9499 (en todas las concentraciones) resultó en una prolongación en aPTT. El animal tratado con solución salina que recibió un bolo de ARC 1 9499 después del punto R de 5,5 horas, también mostró una prolongación en un aPTT después de la administración del aptámero. El efecto del tratamiento con ARC19499 sobre el desarrollo de los coágulos en este modelo similar a la hemofilia A fue sometido a ensayo, para lo cual se utilizó TEG activado con factor de los tejidos (TF). En la totalidad de los animales testeados, la administración de anticuerpo resultó en una prolongation en el valor de R (Figura 1 17A). El tratamiento con solución salina no tuvo mayor efecto sobre el valor de R, mientras que los tratamientos tanto con rFVI Ia como con 600 pg/kg y 300 pg/kg de ARC 19499 resultaron en una disminución del valor de R a niveles cercanos a la línea de base. La dosis de 100 pg/kg de ARC1 9499 fue una dosis inefectiva y no tiene un efecto positivo sobre el valor de R. En el mono tratado con solución salina, la inyección adicional de ARC19499 al final del estudio, tuvo un efecto inmediato sobre la disminución del valor de R. Ambos, el ángulo (Figura 1 1 7B) y la amplitud máxima, quedaron reducidos después de la administración del anticuerpo. Los tratamientos con 600 pg/kg y 300 pg/kg de ARC 1 9499 parecieron tener efectos incrementadores sobre the ángulo similares al efecto de NovoSeven®; mientras que el tratamiento de 1 00 pg/kg de ARC19499 se comportó de manera similar al tratamiento con solución (Figura 1 1 7B). La totalidad de los tratamientos, que incluyen solución salina, parecieron no tener ningún efecto adicional sobre MA (Figura 1 1 7C).

En un segundo conjunto de experimentos relacionados, unos monos fueron tratados con la misma concentración de anticuerpo anti-FVI I I seguido por 300 pg/kg de ARC 19499 o de 90 pg/kg de NovoSeven® 1 hora después. Se adquirieron muestras citradas de sangre y se las procesó para detectar plasma en la línea de base, 60 minutos después de la administración del anticuerpo, y 60, 1 20, 180, 240, 300 y 420 minutos después de la administración del fármaco. Unas muestras de plasma fueron ensayadas para lo cual se utilizó el ensayo TEG (R) por TF, arriba descrito. Como anteriormente, la administración del anticuerpo resultó en valores de R crecientes (Figura 1 1 8A), y disminuyó el ángulo y los valores de MA valores (Figuras 1 1 8B-C). El ARC 19499 y el NovoSeven® se comportaron de maneras muy similares, y restauraron los valores de R a niveles de casi la línea de base, y mejoraron tanto el ángulo como los valores de MA (Figuras 1 18A-C).

Tomados en conjunto, el Factor VI I I , aPTT y TEG® indican, todos ellos, la inducción exitosa de un estado similar a la hemofilia en estos monos. Lo más probable que la prolongación moderada del aPTT al inyectarse ARC19499 refleje en mayor grado la inhibición no específica de la cascada intrínseca, que ha sido anteriormente observada con otros aptámeros. Sin embargo, la clara corrección del tiempo de coagulación (valor de R) en el plasma activado por TF mediado por el ensayo de TEG® sugiere que el efecto hemostático debido a la pérdida del Factor VI I I fue superada con éxito por ARC 1 9499 del TFPI .

Una observación adicional del tratamiento de ARC 19499 es que pareció resultar en un incremento en los niveles de plasma, en el TFPI. En un experimento preliminar, las concentraciones de TFPI en muestras tomadas de estos experimentos con monos cinomologos mencionados arriba, después del tratamiento con ARC19499, superó el l ímite superior de cuantificación del TFPI ELISA cuando se diluyó 1 : 40. Este efecto fue analizado más de cerca midiendo los niveles de TFPI en muestras de plasma de EDTA tomadas de monos cinomólogo que habían recibido una dosis muy elevada de (20 mg/kg) de ARC 1 9499 por administración sea IV sea subcutánea (SC). Se extrajeron muestras de sangre periódicamente a lo largo de dos semanas, lo que permitió evaluar después de una exposición más prolongada a ARC 19499. Se midieron las concentraciones de TFPI en muestras de plasma diluidas en serie (diluidas hasta valores de 1 : 1600) en los siguientes puntos de tiempo: pre-dosis, 0,083 (IV solamente), 0,5, 2, 6, 12, 36, 72, 1 20, 168, 240 y 336 horas post-dosis. En animales tratados con una dosis IV o SC de ARC19499, los niveles de TFPI aumentaron de inmediato desde ~0,2 nM (predosis) a 5-7 nM en el primer instante en el tiempo, y seguidamente mas gradualmente en el tiempo R a niveles pico de 91 ± 1 2 y 71 ± 2 nM, respectivamente (Figura 1 19). El patrón de los niveles de TFPI fue similar en los monos tratadas con la dosis IV o SC, y aumentó a niveles pico a las 72- 120 horas seguido por una declinación gradual Sin embargo, las estimaciones de tma de ARC19499 eran de 5 minutos y 24 horas para la dosis de IV y SC, respectivamente (no se muestran los datos). Por lo tanto, si bien el ARC 19499 estimuló un incremento en el TFHP del plasma in vivo, los cambios en las concentraciones de TFPI y ARC19499 a lo largo del tiempo R no están necesariamente correlacionados entre si. El mecanismo para el incremento en TFPI es desconocido, pero es posible que la exposición inicial al ARC19499 haya causado la rápida liberación de TFPI a partir de la superficie endotelial mientras que los incrementos subsiguientes eran debidos a una liberación de TFPI desde los depósitos intracelulares, la regulación ascendente de la expresión de TFPI , y/o la inhibición del mecanismo de la eliminación del TFPI . Este incremento en los niveles de TFPI en los niveles de plasma en ocasión del tratamiento con aptámero fue específico para ARC 19499. Un aptámero contra un objetivo diferente de TFPI no pareció incrementar los niveles de TFPI , en especial no al mismo nivel que el ARC 19499 (no se muestran los datos).

Ejemplo 33 Este ejemplo demuestra que el ARC19499 abrevia el tiempo de sangrado en un modelo de primate no humano (NHP) de hemofilia A y que este acortamiento del tiempo de sangrado se refleja en la mayoría de los casos por una corrección concomitante en el valor del R de tromboelastografía (TEG®) (una medida del tiempo para la formación inicial del coágulo) a partir del valor R prolongado asociado con la hemofilia A y presente en el modelo NHP que se describe en lo sigue.

El tiempo de sangrado, con y sin tratamiento con el ARC1 9499, fue evaluado en un modelo NH P de hemofilia A en el que unos monos cinomólogos recibieron dosis de un anticuerpo anti-FVI I I (FVI I I Ab) para inducir un estado similar a la hemofilia A. Tal como se diagramó en la Figura 120, se midió el tiempo de sangrado al inicio del experimento (línea de base), y seguidamente 2,5 horas después de la administración de VI I I Ab. Seguidamente se empezó el tratamiento con dosis de 1 mg/kg de bolo de ARC1 9499. Se midió el tiempo de sangrado 1 hora después de la primera dosis de t ARC 19499 para la totalidad de los grupos de monos. Para aquellos monos cuyos tiempos de sangrado no se corrigieron, se evaluó nuevamente el tiempo de sangrado a los 17 minutos después de la segunda dosis de ARC 1 9499. Para aquellos monos cuyos tiempos de sangrado todavía no se habían corregido, se evaluó el tiempo nuevamente a los 1 7 minutos después de la tercera dosis de ARC19499 (Grupos 3 y 4).

Para la evaluación del tiempo de sangrado y la recolección de muestras de sangre, se anestesió un mono, y se colocó una línea en la vena femoral para determinar la presión de la sangre, y la vena safena en el lado opuesto de la vena safena utilizada para la evaluación del tiempo de sangrado fue cateterizada con un catéter calibre 22 para dosificación y extracción de muestras. En la Figura 120 se indica el programa para la evaluación del tiempo de sangrado y para la dosificación relacionada de FVI I I Ab y extracción de sangre. Se tomó una muestra de sangre en línea de base de pretratamiento y un tiempo de sangrado (tiempo de sangrado de pretratamiento, BT0) a los 10 y 5 minutos, respectivamente, antes de dosificar con FVI I I Ab. Se tomaron muestras de sangre extrayendo primero aproximadamente 3-4 mL de sangre mezclada con solución salina, que fue seguidamente puesta aparte. Seguidamente se tomó una muestra de sangre no diluida, para lo cual se utilizó una jeringa. La sangre recolectada fue inmediatamente inyectada en tubos que contienen citratos e invertida en tiempos de mezclado. Una muestra de la sangre cifrada entera fue analizada mediante TEG® y la sangre citrada remanente fue procesada para obtener plasma para su análisis. La primera muestra de sangre- solución fue seguidamente reinyectada en el mono, seguido por un barrido de solución salina equivalente la muestra de sangre tomada.

Se expuso la vena safena para la evaluación del tiempo de sangrado. Se curvó con cuidado una aguja hipodérmica de 1 pulgada calibre 22 (Kendall Monoject, Kendall Healthcare, Mansfield, MA) al bisel de un ángulo de 90 para lo cual se utilizó un hemostato; la curva era de 5 mm desde la punta de la aguja. Se insertó la aguja en la vena expuesta hasta los valores del curvado en la aguja, perforándose solamente una pared de la vena. Se tomó sangre desde la vena para lo cual se utilizó Papel de Secante para Tiempo de Sangrado Surgicutt (ITC, Edison, NJ); se tomó cuidado de no tocar el sitio real del pinchazo. Se midió el tiempo desde el momento en que empezó el sangrado hasta el cese del sangrado, lo que se determinó mediante la incapacidad de retirar sangre por mechado. Se tomaron lecturas de la presión de la sangre de una a cinco minutos antes y después de la evaluación del tiempo de sangrado. Después de la evaluación del tiempo de sangrado, se cerró la herida con Gluture (Abbott Labs, Abbott Park, I L).

Se administró F VI 11 Ab (anticuerpo policlonal FVI I I antihumano de oveja, Lote Y121 7, de Haematologic Technologies I nc (Essex Junction, VT)) a monos por via intravenosa (IV) en forma de dosis de bolo individual lento, mediante un catéter calibre 22 colocado en la vena safena en el lado opuesto de la vena safena utilizada para la evaluación del tiempo de sangrado. Se lo mantuvo congelado a aproximadamente -80 °C hasta su utilización, y se descongeló y recongeló no más de 3 veces antes de su utilización. Cada mono recibió 12,641 unidades de Bethesdas/kg de FVI I I Ab. Dos horas después de la administración de FVI I I Ab, se tomó otra muestra de sangre; a los 30 minutos se evaluó el tiempo de sangrado (tiempo de sangrado post FVI I I , BTFVin). Se administró una primera dosis de ARC 1 9499 por vía IV en forma de bolo individual lento. En la totalidad de los casos antes de dosificar sea el FactorVI l l Ab sea el ARC 19499, se retiraron 0,5-1 ,0 ml_ de fluido desde el catéter, se administró el FVI II Ab o el ARC19499, y se inundó y lavó seguidamente el catéter con 2-3 ml_ de solución salina tibia. Se tomó una muestra de sangre 55 minutos más tarde. Una hora después de la administración de la primera dosis de ARC 1 9499, se evaluó el tiempo de sangrado (tiempo de sangrado post primera dosis, ??? ) . Seguidamente se determinó si el tiempo de sangrado había sido corregido por la primera dosis de ARC1 9499. Se consideró que se había alcanzado la corrección si la diferencia entre la línea de base del pretratamiento y los tiempos de sangrado de post primera dosis de ARC 19499 era inferior a la mitad de la diferencia entre la l ínea de base del pretratamiento y los tiempos de sangrado post FVI I I (es decir, (??? - BT0) / (BTFVin - BT0) < 0,5). Si el tiempo de sangrado fue corregido éxito, el estudio del tiempo de sangrado había sido completado para dicho animal. Si el tiempo de sangrado no había sido corregido, se administró una segunda dosis de 1 mg/kg de ARC19499 diez minutos después de la iniciación de la evaluación anterior del tiempo de sangrado. Se tomó una muestra de sangre 1 2 minutos más tarde; se empezó una evaluación del tiempo de sangrado 17 minutos después de la segunda inyección de ARC 19499 (tiempo de sangrado post segunda dosis de ARC 1 9499 dosis, BT2) . Se determinó si el tiempo de sangrado había sido corregido por la segunda dosis de ARC1 9499. Si el tiempo de sangrado fue corregido con éxito, se había completado el estudio del tiempo de sagrado para dicho animal. Si el tiempo de sangrado no había sido corregido, se administró una tercera dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 diez minutos después de la iniciación de la evaluación anterior del tiempo de sangrado. Se tomó una muestra de sangre 12 minutos más tarde; se empezó una evaluación del tiempo de sangrado a los 1 7 minutos después de la segunda inyección de ARC1 9499 (tiempo de sangrado post tercera dosis de ARC19499s, BT3). Seguidamente se determinó si el tiempo de sangrado había sido corregido por la tercera dosis de ARC1 9499. Independientemente de si el tiempo de sangrado había sido corregido con éxito o no, se completa el estudio del tiempo de sagrado para dicho animal. Si el tiempo de sangrado no había sido corregido, se administró una cuarta dosis de 3 mg/kg de ARC19499 a los 1 8 minutos después de la iniciación de la evaluación anterior del tiempo de sangrado; se tomó una muestra de sangre para análisis por TEG R de sangre entera, pero no se evaluaron otras muestras debido a la falta de vena disponible de tipo similar al utilizado en el estudio. Se administro ARC 1 9499 adicional (de 1 a 3 mg/kg) antes de la recuperación de cada animal como una precaución contra sangrado a lo largo de las siguientes 24 horas. Los puntos de tiempo real para la toma de muestras, la dosificación de los compuestos y la evaluación del tiempo de sangrado para cada animal, se hallan dentro de los 5 minutos del instante de tiempo consignado.

Los niveles de actividad de FVI I Ia en el plasma citrado de los monos en este estudio fueron mediados, para lo cual se utilizó el ensayo Coamatic FVI I I de Cromogenix (Diapharma, Columbus OH) . Las muestras obtenidas durante el estudio fueron comparadas con la curva estándar generada a partir de una recolección combinada de muestras de plasmas de la l ínea de base del pretratamiento. Todas las muestras y estándares fueron diluidos 80* en tampón de reacción provisto por el kit. La reacción fue llevada a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, leyéndose el cambio en la absorción a 405 nm a lo largo de 45 minutos. En la Tabla 8 en las Figura 21 A-B se muestran los niveles de actividad de FVI II asociados con muestras de plasma de los monos cinomólogo (Tabla 18A y Figura 121 A: Grupo 1 : monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con una dosis de 1 mg/kg de ARC19499; Tabla 18B y Figura 121 B: Grupo 2: monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499; Tabla 18C y Figura 121 C: Grupo 3: monos cuyos tiempos de sangrado fue corregido con tres dosis de 1 mg/kg de ARC19499; Tabla 1 8D y Figura 1 21 D: Grupo 4: mono cuyos tiempos de sangrado no habían sido corregidos con tres dosis de 1 mg/kg de ARC19499). Antes del tratamiento con anticuerpo, el plasma de todos los niveles de actividad de FVII I eran muy elevados, que variaban entre 57,6% y 93, 5% (Tabla 1 8). Después del tratamiento con anticuerpo, esta actividad decayó por debajo de niveles medibles (inferiores al 0, 1 %) en la totalidad de los animales, y permaneció baja durante el transcurso del ensayo (Figuras 1 21 A-D). Es más importante que no se observó una diferencia mediante este ensayo en el nivel de la desactivación de FVI I I entre los diferentes grupos de animales, lo que índica que la dosis de ARC 19499 requerida para corregir el tiempo de sangrado no estaba relacionada con los diferentes niveles de la actividad de FVIII post administración de FVIII Ab. Tabla 18. Niveles de actividad de FVIII Los tiempos de sangrado medios del grupo (± SEM) para los monos del Grupo 1 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con una dosis de 1 mg/kg de ARC19499) se muestran en la Tabla 19. Los tiempos de sangrado medios para este grupo también están graficados en función puntos de tiempo de las muestras de sangre en las Figuras 122A-B (Figura 122A: en segundos, Figura 122B: en términos de % del tiempo de sangrado de la línea de base). El tratamiento con el anticuerpo anti-FVI I I resultó en una prolongación del tiempo de sangrado medio del grupo a 203 ± 1 5% del tiempo de sangrado medio de la línea de base. El tratamiento de los monos con 1 mg/kg de ARC19499 corrigió tiempo de sangrado medio del grupo de regreso a esencialmente los niveles de la línea de base s (1 02 ± 1 1 % del tiempo de sangrado medio de la línea de base). Los tiempos de sangrado individuales para los monos del Grupo 1 se muestran en la Tabla 20; los tiempos de sangrado individuales de los monos también están graficados en las Figuras 123A-B (Figura 123A: en segundos, Figura 1 23B: en términos de % de tiempo de sangrado de la línea de base). Todos los monos en este grupo muestran una prolongación de sus tiempos de sangrado en respuesta a la administración de F VI 11 Ab en comparación con sus tiempos de sangrado de línea de base (intervalo: de 162 a 252% del tiempo de sangrado de la línea de base). Todos los monos en este grupo también presentaban una corrección de sus tiempos de sangrado en respuesta a la administración de 1 mg/kg de ARC 19499 en comparación con sus tiempos de sangrado de línea de base (intervalo: de 82 a 152% del tiempo de sangrado de línea de base).

Tabla 1 9: tiempos de sangrado medios en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 1 ) Tabla 20: tiempos de sangrado individuales en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 1 ) Los tiempos de sangrado medios del grupo para los monos del Grupo 2 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499) se muestran en la Tabla 21 . Los tiempos de sangrado medios del grupo también están graficados en función de puntos de tiempo de las muestras de sangre en las Figuras 124A-B (Figura 1 24A: en segundos, Figura 124B: en términos de % del tiempo de sangrado de la línea de base). El tratamiento con el anticuerpo anti- FVII I resultó en una prolongación del tiempo de sangrado medio del grupo a 195 ± 26% del tiempo de sangrado medio de la línea de base. Después del tratamiento de los monos con 1 mg/kg de ARC 19499, el tiempo de o medio de sangrado disminuyó, pero solamente a 175 ± 20% del tiempo de sangrado medio de la línea de base del grupo. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC 1 9499 redujo subsiguientemente el tiempo de sangrado medio del grupo a esencialmente los niveles de base (94 ± 17% del tiempo de sangrado medio de la línea de base). Los tiempos de sangrado individuales para los monos del Grupo 2 se muestran en la Tabla 22; los tiempos de sangrado individuales de los monos en cada instante de tiempo también están graficados en las Figuras 125A-B (Figura 1 25A: en segundos, Figura 125B: en términos de % del tiempo de sangrado de la línea de base). Todos los monos en este grupo muestran una prolongación de sus tiempos de sangrado en respuesta a la administración de FVI I I ab en comparación con sus tiempos de sangrado pretratamiento de la línea de base (intervalo: de 143 a 63% del tiempo de sangrado de la línea de base). Después de la administración de 1 mg/kg de ARC 19499, tres de los monos presentaron una ligera disminución de sus tiempos de sangrado mientras que un mono mostró un pequeño incremento en el tiempo de sangrado. Todos los monos en este grupo presentaron una corrección de sus tiempos de sangrado en respuesta a una segunda dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 (intervalo: de 61 a 138% del tiempo de sangrado de la l ínea de base).

Tabla 21 . Tiempos de sangrado medios en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 2) Tabla 22. Tiempos de sangrado individuales en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 (Grupo 2) Los tiempos de sangrado para el mono del Grupo 3 se muestran en la Tabla 23; los tiempos de sangrado también están graficados en función el instante de tiempo de las muestras de sangre en las Figuras 126A-B (Figura 126A: en segundos, Figura 126B: en términos de % de tiempo de sangrado de la línea de base). Este mono muestra una prolongación de su tiempo de sangrado en respuesta a la administración de FVIII Ab al 220% del tiempo de sangrado de la línea de base. En respuesta al tratamiento con dosis de 1 mg/kg de ARC19499, el tiempo de sangrado aumentó al 330% de la línea de base. El tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 produjo una reducción del tiempo de sangrado al 21 0% del tiempo de sangrado de la línea de base. Para confirmar que de hecho esta segunda dosis no corrigió el tiempo de sangrado, se llevó a cabo una evaluación adicional 38 minutos después de la administración de la segunda dosis de ARC 9499. Este tiempo de sangrado de 45 segundos fue muy cercano a los 42 segundos medidos 12 minutos después de haberse dado la segunda dosis de ARC1 9499, lo que confirma que el tiempo de sangrado no había sido corregido por las dos dosis de ARC19499. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC19499 corrigió el tiempo de sangrado al 85% del tiempo de sangrado de la línea de base.

Tabla 23. Tiempos de sangrado en mono cuyo tiempo de sangrado fue corregido por tres dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 3) Los tiempos de sangrado para el mono del Grupo 4 se muestran en la Tabla 24; los tiempos de sangrado también están graficados en función el instante de tiempo de las muestras de sangre en las Figuras 127 (Figura 127A: en segundos, Figura 127B: en términos de % del tiempo de sangrado de la línea de base). Este mono muestra una prolongación de su tiempo de sangrado en respuesta a la administración de F I 11 Ab al 143% del tiempo de sangrado de la línea de base. En respuesta al tratamiento con dosis de 1 mg/kg de dosis de ARC1 9499, el tiempo de sangrado aumentó marcadamente a 1 93% del tiempo de sangrado de la línea de base. El tiempo de sangrado después del tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 seguidamente disminuyó a 1 54% del tiempo de sangrado de la línea de base. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC1 9499 no pudo cambiar de manera significativa el tiempo de sangrado, que era ahora el 1 59% del tiempo de sangrado de la l ínea de base. No fue posible efectuar una evaluación adicional del tiempo de sangrado sobre este animal debido a la ausencia de una vena compatible con la utilizada para las evaluaciones precedentes.

Tabla 24. Tiempos de sangrado en mono cuyo tiempo de sangrado de sangrado no había sido corregido por tres dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 4) Se analizó el estatus de coagulación para la sangre entera de cinomólogo para lo cual se utilizó el ensayo TEG® sobre muestras de sangre entera cifrada. Para iniciar la reacción de coagulación, se añadió 330 [iL de sangre citrada entera en una copa descartable (Haemonetics Corp, cat no. 6211) que contiene 20 µ?_ de 0,2 M [Haemonetics Corporation (Braintree, MA)] y 10 µ?_ de factor de los tejidos (TF) (dilución final de 1:200000 a 37 °C). Innovin (Dade-Behring, Newark, DE) que fue utilizada como fuente de factor de los tejidos (TF), reconstituido en agua de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y se diluyó 1:5555 en solución saina al 0,9% antes de su uso.

Se almacenó el material de trabajo Inmovin reconstituido a 4°C durante menos de 4 semanas .Se midió el tiempo para la formación inicial del coágulo (valor de R) para lo cual se utilizó el sistema Haemoscope TEG® 5000 (Haemonetics Corporation, Braintree, MA).

Los valores de R medios para los grupos (± SEM) para los monos del Grupo 1 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con una dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499) se muestran en la Tabla 25. Los valores de R medios para los grupos también están graficados en función el instante de tiempo de la muestra de sangre (Figura 128). El tratamiento con FVI I I Ab resultó en una prolongación del valor R medio del grupo a aproximadamente 4,8 veces el valor de R medio del grupo en la línea de base. Mientras que el tratamiento de los monos con 1 mg/kg de ARC1 9499 redujo el valor de R medio del grupo con respecto al obtenido después del tratamiento con FVI I I Ab, este valor de R era todavía de aproximadamente 3,2 veces el valor de R medo de la línea de base. Los valores de R individuales para los monos del Grupo 1 se muestran en la Tabla 26; los valores de R individuales también están graficados en función del instante de tiempos de la muestra de sangre en la Figura 129. Todos los monos en este grupo mostraron una prolongación de sus valores de R en respuesta a la administración de FVII I ab en comparación con sus valores de R de pre tratamiento de la línea de base (intervalo de 2, 9 a 9,4-veces). Todos los monos salvo uno también presentaron una reducción de sus valores R en respuesta a la administración de 1 mg/kg de ARC1 9499 en comparación con valores de R de pre tratamiento de la línea de base (intervalo de 1 ,4 a 5,3-veces).

Uno de los monos, el NH P0701565, mostró un ligero incremento en el valor de R después de la administración de 1 mg/kg de ARC1 9499.

Tabla 25. Valores medios R TEG de sangre entera en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 1 ) Tabla 26. Valores de R TEG individuales de sangre entera en momos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 1 ) Los valores de R medios de los grupos (± SE ) para los monos del Grupo 2 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499) se muestran en la Tabla 27. Los valores de R medios de los grupos también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 1 30. El tratamiento con el anticuerpo anti-FVI I I resultó en una prolongación del valor de R medio del grupo en aproximadamente 5, 9 veces el valor de R medio del grupo en la l ínea de base. En respuesta al tratamiento con dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R medio del grupo se redijo a aproximadamente 4,0 veces el valor de R medio de la línea del grupo. El tratamiento de los monos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que de hecho corrigió el tiempo de sangrado en este grupo, redujo el valor de R medio del grupo, en mayor grado que después del tratamiento con FVI I I Ab, si bien este valor de R todavía de aproximadamente 3,5 veces el valor de R medio del grupo de la línea de base. Los valores de R individuales para los monos del Grupo 2 se muestran en la Tabla 28; los valores de R individuales también están graficados en función de los puntos de tiempo de la muestra de sangre en la Figura 131 . Todos los monos en este grupo mostraron una prolongación de sus valores de R en respuesta la administración de FVI II Ab a diferencia de sus valores de R de línea de base de pretratamiento (intervalo de 4,0 a 9, 1 -veces). Todos los monos, excepto uno, también presentaron una reducción de sus valores de R en respuesta a la administración de 1 mg/kg de ARC 1 9499 en comparación con sus valores de R de pretratamiento de línea de base (intervalo de 2,4 a 5,0-veces); el tratamiento de estos monos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que de hecho corrigió la totalidad de los tiempos de sangrado en este grupo, redujo más aún los valores de R en dos de estos monos, y aumentó ligeramente el valor de R en el tercer mono. Uno de los monos, el NHP061 1655, mostró un incremento del 1 03% en el valor de R en comparación con el valor de R post inyección de FVI II Ab después de la administración de 1 mg/kg de ARC1 9499; el tratamiento de este mono con 1 mg/kg adicional de ARC19499, que de hecho corrigió el tiempo de sangrado, produjo una disminución en el valor de R a 6,4 veces el valor de R de la línea de base R.

Tabla 27. Valores de R medios de TEG de sangre entera en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 2) Tabla 28. Valores de R TEG individual de sangre entera en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 2) Los valores de R para los monos del Grupo 3 se muestran en la Tabla 29; los valores de R también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 1 32. Este mono mostró, en respuesta a la administración de FVI I I Ab, una prolongación de su valor de R a 7,6 veces su valor de R de la línea de base. En respuesta al tratamiento con una dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R se redujo a 6, 1 -veces el valor de R de la línea de base. El tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que tampoco corrigió el tiempo de sangrado en este mono, redujo más aún el R ligeramente, a 5,8 veces el valor de R de la línea de base. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC1 9499, que sí corrigió el tiempo de sangrado, redujo el valor de R a 3 veces el valor de R de la línea de base.

Tabla 29. Valores de R TEG de sangre entera en un mono cuyo tiempos de sangrado fue corregido mediante tres dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 3) Los valores de R para el mono del Grupo 4 se muestran en la Tabla 30; los valores de R también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 133. Este mono mostró, en respuesta a la su valor de R administración de FVI II Ab, una prolongación a 2,9-veces el valor de R de su línea de base. En respuesta al tratamiento con una dosis de 1 mg/kg de ARC19499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R se redujo a 1 ,6 veces el valor de R de la línea de base. El tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC19499, que tampoco corrigió el tiempo de sangrado en este mono, redujo más aún el valor de R ligeramente, a 1 ,5-veces el valor de R de la línea de base. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC19499, que tampoco corrigió el tiempo de sangrado, redujo el valor de R ligeramente más de 1 ,2 veces el valor de R de la línea de base. Una cuarta dosis de 3 mg/kg de ARC 1 9499 tuvo poco efecto sobre el valor de R, que era ahora de 1 , 1 veces el valor de R de la línea de base del pretratamiento. No pudo efectuarse ninguna evaluación adicional de los tiempos de sangrado sobre este animal debido a la ausencia de suficiente vena disponible compatible con la utilizada para ensayos anteriores.

Tabla 30. Valores de R TEG® de sangre entera en un mono cuyos tiempos de sangrado no habían sido corregido por tres dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 4) También se analizó el estatus de coagulación del plasma de cinomólogo, para lo cual se utilizó el ensayo TEG® sobre plasma de las muestras de sangre citradas. Unas muestras de sangre entera citrada fueron mantenidas a temperatura ambiente hasta el procesamiento del plasma. Unas muestras fueron centrifugadas a 2,000xg durante 1 5 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el plasma y se retiró de inmediato a -80 °C hasta su despacho para análisis. Antes del análisis, las muestras de plasma fueron descongeladas rápidamente a 37 °C. Para iniciar la reacción de coagulación, 330 µ?_ de plasma citrado fueron añadidos a una copa descartable (Haemonetics Corporation, Braintree, MA, cat no. 621 1 ) que contiene 20 µ?. de 0,2 M (Haemonetics Corporation (Braintree, MA)) y 10 µ?_ de TF (dilución final de 1 :200000 a 37 °C). Se utilizó Innovin (Dade-Behring, Newark, DE) como fuente de factor de los tejidos (TF), se reconstituyó en agua de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, se diluyó 1 :5555 en solución salina al 0,9% antes del uso. La Innovin de materia de trabajo reconstituida fue almacenada a 4 °C durante menos de 4 semanas. Se midió el tiempo hasta la formación inicial de los coágulos (valor de R), para lo cual se utilizó el sistema Haemoscope TEG 5000 (Haemonetics Corporation, Braintree, MA).

Los valores de R medios de los grupos (± SE ) de muestras de plasma de monos del Grupo 1 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con una dosis de 1 mg/kg de ARC 19499) se muestran en la Tabla 31 . Los valores de R medios de los grupos también están graficados en función de los puntos de tiempos de la muestra de plasma (Figura 1 34). El tratamiento con F VI 11 Ab resultó en una prolongación del valor de R medio del grupo a aproximadamente 2,8 veces el valor de R medio del grupo en la l ínea de base. Mientras que el tratamiento de los monos con 1 mg/kg de ARC 19499 redujo el valor de R medio del grupo con respecto al obtenido después del tratamiento con FVI I I Ab, este valor de R era todavía aproximadamente 1 ,9 veces el valor de R medio del grupo de la línea de base. Los valores de R individuales para los monos del Grupo 1 se muestran en la Tabla 32; los valores de R individuales también están graficados en función de los puntos de tiempo de la muestra de plasma en la Figura 1 35. Todos los monos en este grupo mostraron una prolongación de sus valores de R en respuesta a la administración de FVI I I Ab en comparación con los valores de R de su línea de base de pretratamiento (intervalo de 1 ,7 a 5, 1 -veces). Todos los monos de este grupo, menos uno, también presentaron una reducción de sus valores de R en respuesta a la administración de 1 mg/kg de ARC1 9499 en comparación con los valores de R de su línea de base de pretratamiento (intervalo de 1 ,3 a 1 ,8 veces). Uno de los monos, el NHP0603477, mostró un incremento del 50'% en el valor de R en comparación con el valor de R post inyección de FVI II Ab después de la administración de 1 mg/kg de ARC19499; en cambio, el análisis de sangre por TEG® mostró una disminución del 53% en el valor de R en comparación con el valor de R post inyección de FVI II A después de la administración de 1 mg/kg de ARC19499. El análisis TEG® del plasma de NHP0701565, cuyo análisis de sangre entera por TEG® mostró un ligero incremento en el valor de R en respuesta a la administración de 1 mg/kg de ARC 1 9499, estaba de hecho 66% por debajo del valor de R post inyección de FVI I I Ab después de la administración de 1 mg/kg de ARC1 9499.

Tabla 31 . Valores de R medios de plasma por TEG® en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC19499 (Grupo 1 ) Tabla 32. Valores de R de plasma individuales por TEG en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por una dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 1 ) Los valores de R medios de los grupos (± SEM) de muestras de plasma de monos del Grupo 2 (cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC19499) se muestran en la Tabla 33. Los valores de R medios de los grupos también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 136. El tratamiento con el anticuerpo anti-FVI II resultó en una prolongación del valor de R medio del grupo a aproximadamente 4, 0-veces el valor de R medio del grupo en la línea de base. En respuesta al tratamiento con una dosis de 1 mg/kg dosis de ARC1 9499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R medio del grupo se redujo a aproximadamente 2,2-veces tiempos el valor de R medio del grupo de la línea de base. El tratamiento de los monos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que sí corrigió el tiempo de sangrado en este grupo, no redujo de manera significativa más aún el valor de R medio del grupo con respecto al obtenido después del tratamiento con FVI I I Ab. Los valores de R individuales para los monos del Grupo 2 se muestran en la Tabla 34; los valores de R individuales también están graficados en función de los puntos de tiempos de la muestra de sangre en la Figura 137. Todos los monos en este grupo mostraron una prolongación de sus valores de R en respuesta a la administración de FVI I I Ab en comparación con los valores de R de su línea de base (intervalo de 1 , 1 a 6,4-veces). En respuesta al tratamiento con 1 mg/kg dosis de ARC 1 9499, que no corrigió los tiempos de sangrado, los valores de R del plasma de todos los monos en este grupo se redujeron con respecto al valor medio de R de la línea de base del grupo (intervalo de 0,5 a 4,5 veces). El tratamiento de los monos con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499, que sí corrigió la totalidad de los tiempos de sangrado en este grupo, produjo valores de R sin cambios o más reducidos aún, si bien en dos monos los valores de R fueron todavía mayores que los de la l ínea de base del pretratamiento (intervalo de 0,5 a 3,2-veces).

Tabla 33. Valores de R medios de plasma por TEG® en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499 (Grupo 2) Tabla 34. Valores de R medios de plasma por TEG R-valores en monos cuyos tiempos de sangrado fueron corregidos por dos dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 2) Los valores de R de las muestras de plasma del mono del Grupo 3 se muestran en la Tabla 35; los valores de R también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 138. Este mono mostró, en respuesta a la administración de FVIII Ab, una prolongación de su valor de R a 3,5 veces el valor de R de su línea de base. En respuesta al tratamiento con una dosis de 1 mg/kg dosis de ARC1 9499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R se redujo a 1 , 3 veces el valor de R de la línea de base. El tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 19499, que tampoco corrigió el tiempo de sangrado en este mono, redujo más aún el valor de R a 1 , 1 veces el de la l ínea de base. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC1 9499, que sí corrigió el tiempo de sangrado, redujo el valor de R a 0,9 veces el valor de R de la línea de base.

Tabla 35. Valores de R de plasma según TEG R-valores en un mono cuyo tiempo de sangrado fue corregido por tres dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 3) Los valores de R de muestras de plasma del mono del Grupo 4 se muestran en la Tabla 36; los valores de R también están graficados en función de los puntos de tiempo de las muestras de sangre en la Figura 139. Este mono mostró, en respuesta a la administración de FVI II Ab, una prolongación a 2,9 veces el valor de R de su línea de base. En respuesta al tratamiento con una dosis de 1 mg/kg dosis de ARC 19499, que no corrigió el tiempo de sangrado, el valor de R se redujo con respecto al valor de R de la línea de base a 1 , 1 veces el valor de R de la línea de base. El plasma de sangre tomada después del tratamiento de este mono con dos dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que tampoco corrigió el tiempo de sangrado en este mono, presentó un valor de R ligeramente superior, de 1 ,2 veces el valor de R de la línea de base. Una dosis adicional de 1 mg/kg de ARC 1 9499, que todavía no corrigió el tiempo de sangrado, redujo el valor de R ligeramente más de 1 ,0 veces el valor de R de la línea de base. Una cuarta dosis de 3 mg/kg de ARC1 9499 redujo el valor de R a menos de la línea de base del pretratamiento (0,9 veces el valor de R de la línea de base del pre tratamiento). No pudo efectuarse ninguna evaluación adicional de los tiempos de sangrado sobre este animal debido a la ausencia de suficiente vena disponible compatible con la utilizada para ensayos anteriores.

Tabla 36. Valores de R de plasma por TEG en un mono cuyos tiempos de sangrado no habían sido corregidos por tres dosis de 1 mg/kg de ARC1 9499 (Grupo 4) El ejemplo precedente muestra que los monos tratados con el FVI I I Ab presentaron un sangrado prolongado después de punzada la vena safena. Lo que es una observación compatible con el sangrado prolongado que es la característica de la hemofilia. En una mayoría de los monos ensayadas en este estudio (1 1 de 12), el tratamiento con valores de hasta 3 mg/kg de ARC1 9499 corrigió este tiempo de sangrado prolongado. Solamente seis de los monos requirieron una dosis de 1 mg/kg de ARC 1 9499 para presentar esta corrección, el tiempo de sangrado en cuatro otros monos fue corregido con dos dosis de 1 mg/kg de ARC19499. Los valores de R en el análisis por TEG® de la sangre entera de estos monos presentaron la elevación prevista después de la administración de FVII I Ab; esta elevación se redujo a niveles de la línea de base después del tratamiento con ARC 1 9499; se observó un patrón similar en el análisis del plasma de estas muestras de sangre. Estos datos muestran que el ARC 1 9499 puede corregir el sangrado prolongado en un modelo de hemofilia inducida, lo que respalda la potencial utilidad clínica del ARC 19499 como un agente terapéutico en el tratamiento de pacientes de hemofilia inhibidor y no inhibidor.

Ejemplo 34 Este ejemplo es una evaluación de sustituciones toleradas y no toleradas en n ARC1 7480 por intermedio de la química médica de los aptámeros.

Se generaron moléculas para los ensayos con modificaciones en la posición 2' o dentro de la estructura básica de fosfato de residuos en el ARC 17480, como se muestra en la siguiente Tabla 37 y en las Figuras 140 y 141 . Cada residuo 2' desoxi individual en el ARC17480 se reemplazó por el correspondiente residuo que contiene 2'-metoxi o 2'-fluor, resultando ARC1 8538-ARC 1 8541 y ARC1 9493-ARC1 9496, respectivamente (Figura 140). Adicionalmente, algunas moléculas con múltiples residuos 2'-deoxi a 2'-metox¡ y/o 2'-deoxi a 2'-fluor fueron generados en los cuatro residuos deoxicitidina en ARC17480 en las posiciones 9, 14, 1 6 y 25, resultando ARC 1 8545, ARC1 8546, ARC18549, ARC 19476, ARC1 9477, ARC19478, ARC 1 9484, ARC 19490 y ARC19491 (Figura 140). Cada residuo 2'-metoxi individual en ARC17480 se reemplazó con el correspondiente residuo 2'-deoxi, reemplazándose residuos 2'-metoxiuridina con ambos residuos 2'-deoxitimidina y 2'-deoxiuridina, resultando ARC 19448-ARC1 9475 y ARC33867-ARC33877 (Figura 140). El fosfato entre cada par de nucleótidos en ARC17480 se reemplazó individualmente con un fosforotioato, resultando ARC19416-ARC 19447 (Figura 141 ).

Las moléculas de ARC 1 7480 modificadas fueron ensayadas para establecer su ligación y función. Los ensayos utilizados para esta evaluación fueron el ensayo, de trombograma automatizada calibrada (CAT), un ensayo de competición de ligación de dot-blot y un ensayo de actividad de FXa. Los resultados de estos ensayos se han resumido en la Tabla 37 e ilustrado en las Figuras 142A-B. Una sustitución era considerada en cuanto a su actividad si satisfacía los criterios de por lo menos dos ensayos que fueron llevados a cabo. Las sustituciones que eran toleradas ("sí") y no toleradas ("no") han sido identificadas en la Tabla 37. Los detalles experimentales y los criterios utilizados para cada ensayo se describen en los párrafos siguientes.

La actividad inhibidora de TFPI de cada molécula fue evaluada en el ensayo CAT en plasma recolectado unificado de hemofilia A a 500 nM, 166,67 nM, 55, 56 nM, 18,52 nM, 6, 1 7 nM y 2, 08 nM de concentración de aptámero. El ARC1 7480 fue incluido en cada experimento, como un control. Para cada molécula, para el análisis se utilizaron el potencial de trombina endógena (ETP) y los valores pico de trombina para cada concentración de aptámero. El ETP o trombina pico valor para plasma de hemofilia A solo fue restado del correspondiente valor en la presencia de aptámero para cada molécula y para cada concentración. Seguidamente, el ETP corregido y los valores pico fueron graficados como una función de la concentración del aptámero y se ajustó a la ecuación y=(max/(1 + IC50/x)) + int, donde y=ETP o trombina pico, x=concentración de aptámero, max= el ETP máximo o trombina pico, e int= el y-intersección, a efectos de generar un valor de IC5o tanto para el ETP como para la trombina pico. El IC5o de cada aptámero fue comparado con el I C5o de ARC17480 que había sido evaluado en el mismo experimento. Una sustitución fue considerada como tolerada en el CAT de ensayo si el IC50 de tanto el ETP como de la trombina pico de dicha molécula no eran más de cinco veces más grande que el del ARC17480 evaluado en el mismo experimento. Las sustituciones toleradas están indicadas en la Tabla 37 por el hecho de satisfacer los criterios de ensayo ("sí") y por no satisfacer los criterios del ensayo ("no").

Cada molécula fue evaluada en cuanto a la ligación a inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI) en un ensayo de competición de ligación. Para estos experimentos, 10 nM de TFPI humano (American Diagnostica, Stamford, CT, catalogo #4500PC) fueron incubados con cantidades vestigiales de ARC 1 7480 radioetiquetado y 5000 nM, 1666,67 nM , 555,56 nM, 1 85, 1 9 nM, 61 ,73 nM, 20,58 nM , 6,86 nM, 2,29 nM , 0,76 nM o 0,25 nM de aptámero competidor no etiquetado. El ARC 17480 fue incluido como un competidor en cada experimento como un control. Para cada molécula, para el análisis se utilizó el porcentaje de ARC 17480 radioetiquetado ligado a cada concentración de aptámero competidor. El porcentaje de ARC1 7480 radioetiquetado ligado fue graficado como una función de la concentración del aptámero, y se ajustó a la ecuación y=(max/(1 + x/IC50)) + int, donde y= el porcentaje de ARC 17480 radioetiquetado ligado, x= la concentración de aptámero, max=el máximo de ARC 1 7480 radioetiquetado ligado, e int=el y-intersección, a efectos de generar un valor de IC50 para la ligación-competición. El ICS0 de cada aptámero fue comparado con el IC50 del ARC1 7480 que fue evaluado en el mismo experimento. Una sustitución fue considerada tolerada en el ensayo de ligación-competición si el IC5o de dicha molécula no era de más de 5 veces mayor que el del ARC 17480 evaluado en el mismo experimento. Las sustituciones toleradas están indicadas en la Tabla 37 por el hecho de satisfacer los criterios de ensayo ("sí") y por no satisfacer los criterios del ensayo ("no").

Cada molécula fue evaluada para establecer la inhibición del TFPI en un ensayo de actividad de Factor Xa (FXa). La capacidad del FXa para desdoblar un sustrato cromogénico fue medida en la presencia y ausencia de TFPI , con o sin la adición de aptámero. Para estos experimentos, 2 nM de FXa humano fueron incubados con 8 nM de TFPI humano. A continuación se añadieron 500 µ? de sustrato cromogénico y aptámeros y el desdoblamiento de FXa se midió mediante absorción a 405 nm (A405) como una función de tiempo. Los aptámeros fueron ensayados con concentraciones de 500 nM, 125 nM, 31,25 nM, 7,81 nM, 1,95 nM y 0,49 nM. Se incluyó ARC17480 como un control en cada experimento. Para cada concentración de aptámero, se graficaron los A405 como una función de tiempo y se ajustó la región lineal de cada curva con respecto a la ecuación y=mx + b, donde y=A405, x= la concentración del aptámero, m= el coeficiente del desdoblamiento del substrato, y b= el y-intersección, a efectos de generar un coeficiente de desdoblamiento del substrato de FXa. El coeficiente de desdoblamiento del substrato de FXa en la presencia de TFPI y en la ausencia del aptámero, fue restado del correspondiente valor en la presencia de tanto el TFPI como del aptámero para cada molécula y para cada concentración. A continuación los coeficientes corregidos fueron graficados como una función de la concentración del aptámero y se ajustó a la ecuación y=(Vmax/(1 + IC50/x)), donde y= el coeficiente de desdoblamiento del substrato, x= concentración del aptámero, y Vmax= el coeficiente máximo de desdoblamiento del substrato, a efectos de generar un IC50 y un valor máximo (Vmax) valor. Los valores de IC50 y Vmax de cada aptámero fueron comparados con los valores de IC50 y Vmax del ARC17480 que habían sido evaluados en el mismo experimento. Una sustitución fue considerado tolerada en el ensayo de actividad de FXa si el IC50 de dicha molécula no era de más 5 veces mayor que el del ARC17480 evaluado en el mismo experimento y si el valor de Vmax no era inferior al 80% del valor de Vmax del ARC17480 evaluado en el mismo experimento. Las sustituciones toleradas se indican en la Tabla 37 por el hecho de satisfacer los criterios ("sí") o de no cumplir los criterios del ensayo ("no").

Este ejemplo demuestra que múltiples 2'-sustituciones individuales en el ARC1 7480 son toleradas en cuanto a ligación y actividad, y que algunas combinaciones de 2'-sustituciones también son toleradas (Tabla 37 y Figuras 142A-B). Este ejemplo también demuestra que una sustitución de fosforotioato es tolerada entre cada par de nucleótidos en el ARC1 7480 (Tabla 37). Las combinaciones adicionales de 2'- sustituciones toleradas y/o sustituciones de fosforotioato en el ARC17480 serán similarmente toleradas en cuanto a ligación y actividad.

Tabla 37: Sustituciones toleradas y no toleradas en el ARC17480 Ejemplo 35 Este ejemplo es una evaluación de supresiones toleradas y no toleradas en el ARC 1 7480.

Se generaron moléculas para ensayo con residuos individuales o múltiples suprimidos en la secuencia de ARC1 7480, como se muestra en la siguiente Tabla 38 y en la Figura 1 3. Cada residuo normal en ARC17480 fue suprimido a razón de uno por vez, resultando ARC32301 , ARC33120-ARC33143, y ARC18555. En aquellos casos en que dos nucleótidos adyacentes eran idénticos, también se generó la correspondiente supresión doble, resultando ARC32302 y ARC33144-ARC33148. Se generaron moléculas adicionales con múltiples supresiones, resultando ARC32303, ARC32305, ARC32306, ARC32307, ARC33889, ARC33890, ARC33891 , ARC33895, ARC33900 y ARC33907.

Las moléculas de ARC1 7480 con supresiones fueron ensayadas en cuanto a ligación y función. Los ensayos utilizados para esta evaluación fueron el ensayo de trombograma automatizada calibrada (CAT) y un ensayo de la actividad de ligación de FXa dot-blot. Los resultados de estos ensayos se han resumido en la Tabla 38 y en las Figuras 144A-B. Una sustitución era considerada como tolerada en cuanto a la actividad si cumplía los criterios de por lo menos dos de los tres ensayos que se llevaron a cabo. Las sustituciones que fueron toleradas ("sí") y no toleradas ("no") se han identificado en la Tabla 38. Los datos experimentales y los criterios utilizados para cada ensayo se describen en los párrafos siguientes.

La actividad inhibidora de TFPI de cada molécula fue evaluada en el ensayo CAT en plasma recolectado unificado plasma de hemofilia A a 500 nM, 166,67 n , 55, 56 nM, 1 8,52 nM, 6, 17 nM y 2,08 nM de concentración de aptámero. El ARC 1 7480 fue incluido en cada experimento como un control. Para cada molécula, para el análisis se utilizaron el potencial de trombina endógena (ETP) y los valores de trombina pico para cada concentración del aptámero. El ETP o el valor pico de la trombina pico para el plasma de hemofilia A solo fue restado del correspondiente valor en la presencia de aptámero para cada molécula en cada concentración. A continuación se graficaron el ETP corregido y los valores pico como una función de la concentración del aptámero y se ajustó a la ecuación y=(max/(1 + IC5o/x)) + int, donde y=ETP o trombina pico, x=concentración de aptámero, max=el TP máximo o trombina pico, e int=the y-intersección, a efectos de generar un valor de IC50 tanto para ETP como para la trombina pico. El IC50 de cada aptámero fue comparado con el IC5o de ARC 1 7480 que fue evaluado en el mismo experimento. Una sustitución fue considerada como tolerada en el ensayo CAT si el IC50 de tanto el ETP como de la trombina pico de dicha molécula no eran de más de 5 veces el del ARC1 7480 evaluado en el mismo experimento. Las sustituciones toleradas se han indicado en la Tabla 38 por el hecho de satisfacer los criterios de ensayo ("sí") o de no satisfacerlos ("no").

Cada molécula fue evaluada en cuanto a ligación con el inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI) en un ensayo de ligación-competición . Para estos experimentos, se incubaron 1 0 nM de TFPI humano (American Diagnostica, Stamford, CT, catalogo #4500PC) con las trazas de ARC 1 7480 radioetiquetado y 5000 nM, 1666,67 nM, 555,56 nM, 185, 1 9 nM , 61 ,73 nM, 20, 58 nM, 6,86 nM, 2,29 nM, 0,76 nM o 0,25 nM de aptámero competidor no etiquetado. Se incluyó el ARC17480 como un competidor en cada experimento, como un control. Para cada molécula, para el análisis se utilizó el porcentaje de ARC1 7480 radioetiquetado ligado a cada aptámero competidor, en base a la concentración. El porcentaje de ARC 1 7480 radioetiquetado ligado fue graficado como una función de la concentración del aptámero, y se ajustó a la ecuación y=(max/(1 + x/IC5o)) + i nt, donde y= el porcentaje de ARC 17480 radioetiquetado ligado, x= la concentración de aptámero, max=el máximo ARC1 7480 radioetiquetado ligado, e int=el y-intersección, a efectos de generar un valor de IC50 para la ligación-competición. El IC50 de cada aptámero fue comparado con el IC5o de ARC17480 que había sido evaluado en el mismo experimento. Una sustitución fue considerada tolerada en el ensayo de ligación-competición si el IC50 de dicha molécula no era de más 5 veces mayor que el del ARC 17480 evaluado en el mismo experimento. En la Tabla 38 se han consignado las sustituciones toleradas por el hecho de satisfacer los criterios de ensayo ("sí") o de no satisfacer los criterios de ensayo ("no").

Cada molécula fue evaluada en cuanto a la inhibición de TFPI en un ensayo de activación de Factor Xa (FXa). La capacidad del FXa para desdoblar un sustrato cromogénico fue medida en la presencia y ausencia de TFPI , con o sin la adición de aptámero. Para estos experimentos, 2 nM de FXa humano fueron incubados con 8 nM de TFPI humano. A continuación se añadieron 500 µ? de sustrato cromogénico y aptámeros y se hizo el desdoblamiento por FXa, del sustrato, medido mediante absorción a 405 nm (A405) como una función de tiempo. Los aptámeros fueron ensayados con concentraciones de 500 nM, 125 nM, 31 ,25 nM, 7,81 nM, 1 ,95 nM y 0,49 nM. Se incluyó ARC 17480 como un control en cada experimento. Para cada concentración de aptámero, se graficaron los A40s como una función del tiempo y se ajustó la región lineal de curva a la ecuación y=mx + b, donde y=A405 , x= la concentración del aptámero, m= el coeficiente de desdoblamiento del substrato, y b= el y-intersección, a efectos de generar un coeficiente de desdoblamiento por FXa, del substrato. El coeficiente del desdoblamiento por FXa, del substrato en la presencia de TFPI y en la ausencia del aptámero, fue restado del correspondiente valor en la presencia tanto de TFPI y como de aptámero para cada molécula en cada concentración. A continuación los coeficientes corregidos fueron graficados como una función de la concentración del aptámero y se ajustó a la ecuación y=(Vmax/(1 + IC50/x)), donde y= el coeficiente de desdoblamiento del substrato, x= la concentración del aptámero, y Vmax= el coeficiente máximo de desdoblamiento del substrato, a efectos de generar un IC50 y un valor máximo(Vmax) . Los valores de IC50 y Vmax de cada aptámero fueron comparados con los valores de IC50 y max de ARC17480 que había sido evaluado en el mismo experimento. Una sustitución fue considerada tolerada en el ensayo de activación de FXa si el IC50 de dicha molécula no era de más de cinco veces 5-veces el del ARC17480 evaluado en el mismo experimento y si el valor Vmax no era inferior al 80% del valor Vmax del ARC 17480 evaluado en el mismo experimento. En la Tabla 38 se han consignado las sustituciones toleradas por el hecho de satisfacer los criterios de ensayo ("sí") o de no satisfacer los criterios de ensayo ("no").

Este ejemplo demuestra que múltiples supresiones individuales en ARC17480 son toleradas en cuanto a ligación y actividad, y que algunas combinaciones de supresiones también son toleradas (véase la Tabla 38 y las Figuras 144A-B). Cada uno de ARC33889 y ARC3389, tolera un total de siete supresiones en sus extremos 5'- y 3'-, resultando moléculas núcleo que tienen una longitud de veinticinco nucleótidos. Las combinaciones adicionales de supresiones en el ARC17480 pueden ser toleradas en cuanto a ligación y actividad, con o sin cambios adiciónales en la molécula.

Tabla 38: Tolerada y No-tolerada Supresiones in ARC17480 Ejemplo 36 Este ejemplo demuestra que los derivados 3'-truncados de ARC19499 tienen una actividad funcional en el ensayo CAT.

El ARC21 383, ARC21 385, ARC21387 y ARC21 389 tienen supresiones simples sucesivas en su extremo 3'- con respecto al ARC19499 (Tabla 39). Estas moléculas están pegiladas en su extremos 5' con un PEG de 40 kDa. Estas moléculas fueron añadidas a plasma de hemofilia A con diferentes concentraciones (300 nM - 1 ,2 nM) y se midió la generación de trombina. Se utilizó ARC9499 como un control en el experimento. Estas moléculas 3'truncadas tuvieron, todas ellas, una actividad en el ensayo CAT que era similar al observado con ARC1 9499, con respecto a potencial de trombina endógena (ETP; Figura 145A) como con respecto a la trombina pico (Figura 145B).

Este ejemplo demuestra que el ARC 1 9499 puede ser truncado mediante la remoción de los nucleotidos de núcleo 3'-3T y de los tres 3' y todavía conservar una actividad en el ensayo CAT que es similar al de la molécula genitora ARC 19499.

Tabla 39: versiones 3'-truncadas de ARC 1 9499 Ejemplo 37 Este ejemplo describe una estrategia para identificar aptámeros que se ligan por lo menos parcialmente a, o que de alguna otra manera interactuar con una o más porciones de inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI). Para estos experimentos, como objetivo de selección se utiliza una proteína o péptido de TFPI que comprende la región a la cual hay que apuntar. Para este experimento puede utilizarse cualquier porción de la proteína de TFPI . Por ejemplo, una proteína de TFPI que solamente contiene los dominios C-terminales de TFPI de longitud completa (K3-C TFPI ; aminoácidos 1 82-276) es el objetivo para la selección. Se incuba una colección unificada de ácido nucleico con K3-C TFPI a efectos de permitir que tenga lugar la ligación, se partición la mezcla para separar los ácidos nucleicos ligados con respecto a los ácidos nucleicos no ligados, y los ácidos nucleicos ligados se fluyen a partir de la proteína, y se amplían. Opcionalmente se repite este proceso durante múltiples ciclos hasta que se identifique un aptámero. Para algunos ciclos, se utiliza TFPI de longitud completa a efectos de asegurar que el aptámero se ligue a la región K3-C- de la proteína en el contexto de la proteína de longitud completa. Estos experimentos tienen como resultado la identificación de aptámeros de TFPI-ligación cuyo epítope de ligación se halla contenido, por ejemplo, dentro de la región K3-C- de la proteína.

Ejemplo 38 Este ejemplo describe una estrategia para identificar aptámeros que se ligan por lo menos parcialmente a, o que de alguna otra manera interactúan con, una o más porciones de inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI). Para estos experimentos, se utiliza un TFPI de longitud completa como objetivo de selección y se utiliza una porción de TFPI o un ligando que se liga a TFPI , para eluir los aptámeros que se ligan a una porción de la proteína de TFPI . Como objetivo de selección también es posible utilizar una proteína o péptido que contiene solamente una porción de TFPI . Por ejemplo, para la elución se utiliza un péptido que comprende los aminoácidos 1 50-1 90 de TFPI . Se incuba una recolección unificada de ácidos nucleicos para la elución . Se incuba una recolección unificada de ácidos nucleicos con TFPI de longitud completa para que tenga lugar la ligación, se particiona la mezcla para separar los ácidos nucleicos ligados de los ácidos nucleicos no ligados, los ácidos nucleicos ligados son eluídos desde la proteína mediante incubación con el péptido TFPI 150-190, y se amplifica. Se repite este proceso durante múltiples ciclos hasta que se identifique un aptámero. Estos experimentos tienen como resultado la identificación de aptámeros de TFPI-ligación cuyo epítope de ligación contiene por ejemplo, la totalidad o parte de la región 1 50 - 190 de TFPI .

Ejemplo 39 Este ejemplo describe una estrategia para identificar aptámeros que se ligan por lo menos parcialmente o que de alguna otra manera interactúan con una o más o porciones de inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI). Para estos experimentos, se utiliza TFPI de longitud completa como un objetivo de selección y se incluye un ligando que se liga a TFPI en la selección a efectos de bloquear los epítopes contra la ligación de aptámero para impulsar la ligación del aptámero a sitios alternativos sobre la proteína. Como objetivo de selección también podría utilizarse una proteína o péptido que contiene solamente una porción de TFPI. El ligando de bloqueo está incluido en el objetivo de selección y/o en el paso de partición como un método de captura o como un reactivo de lavado. Por ejemplo, en la selección se incluye un anticuerpo que se liga al terminal C de TFPI . Se incuba un recolección unificada de ácidos nucleicos con TFPI en la presencia del anticuerpo para que tenga lugar la ligación, se particiona la mezcla a efectos de separar los ácidos nucleicos ligados de los ácidos nucleicos no ligados, y se eluyen los ácidos nucleicos ligados a partir de la proteína, y se amplifica. Se repite este proceso durante múltiples ciclos hasta que se identifique un aptámero. Algunos ciclos incluyen el anticuerpo en la solución de lavado durante el paso de la partición, y algunos pasos utilizan el anticuerpo como un método de partición para capturar complejos de TFPI-aptámero, en conjunción con o en lugar de la Inclusión del anticuerpo en el paso de la ligación. Estos experimentos tienen como resultado la identificación de aptámeros de TFPI-ligación cuyo epítope de ligación no se halla contenido, por ejemplo, dentro de la región de anticuerpo-ligación del terminal -C de TFPI .

Ejemplo 40 Este ejemplo describe una estrategia para identificar aptámeros que se ligan por lo menos parcialmente o que de alguna otra manera interactúan con una o más porciones de inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI). Para estos experimentos, se utiliza TFPI de longitud completa como un objetivo de selección y se emplea un paso de partición que separa los aptámeros con una propiedad funcional deseada de los ácidos nucleicos que no tienen dicha propiedad funcional. También podría utilizarse una proteína o péptido que contiene solamente una porción de TFPI , como el objetivo de selección. Por ejemplo, la propiedad funcional deseada del aptámero es la inhibición de la interacción de TFPI con el Factor Xa (FXa). Para estos experimentos, se incuba una recolección unificada de ácidos nucleicos con TFPI bajo condiciones que permiten la ligación, y seguidamente se partitiona para separar los ácidos nucleicos no ligados de los aptámeros que están ligados a TFPI . Los aptámeros TFPI-ligados son seguidamente incubados con FXa que está ligado a una placa hidrófoba. El TFPI libre y el TFPI ligado con aptámeros que no interfieren con la interacción TFPI-FXa se ligan al FXa sobre la placa, mientras que el TFPI ligado con aptámeros que no interfieren con la interacción de TFPI-FXa no se ligan a la placa. Los aptámeros de los complejos TFPI no ligado-aptámero son seguidamente amplificados. Se repite este proceso durante múltiples ciclos hasta que se haya identificado un aptámero. Estos experimentos resultan, por ejemplo, en la identificación de aptámeros que se ligan a una región de la proteína de TFPI que media la inhibición de la interacción funcional entre TFPI y FXa.

Ejemplo 41 Este ejemplo describe una estrategia para identificar anticuerpos que se ligan por lo menos parcialmente o que de alguna otra manera interactúan con una o más porciones de inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI). El antigeno puede ser una o más porciones cualesquiera de TFPI que sean de interés. Por ejemplo, el antígeno puede ser una proteína de TFPI que solamente contiene los dominios K3 y C-terminal de TFPI de longitud completa (K3-C TFPI ; aminoácidos 1 82-276). El antígeno se expresa en un sistema de expresión o se sintetiza en un sintetizador automatizado de proteínas. Seguidamente se inmunizan ratones con el antígeno en solución. A continuación se aislan células productoras de anticuerpos de los ratones inmunizados, y se fusionan con células de mieloma de manera de formar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Seguidamente se cultivan los hibridomas en un medio selectivo. Las células resultantes se aplican seguidamente sobre placas mediante dilución en serie, y se ensaya para establecer la producción de anticuerpos que de manera específica se ligan al antígeno. A continuación se cultivan hibridomas seleccionados que segregan anticuerpos monoclonales. Seguidamente se purifican los anticuerpos a partir del material sobrenadante de células de hibridoma del medio de cultivo. Estos experimentos tienen como resultado la identificación de anticuerpos TFPI-ligación cuyo epítope de ligación está contenido, por ejemplo, dentro de la región K3-C-terminal de la proteína.

Habiéndose ahora descrito la invención mediante esta descripción escrita y los ejemplos, las personas con habilidad en la técnica reconocerán que es posible llevar la invención a la práctica en una variedad de formas de realización, y que la memoria descriptiva y los ejemplos arriba descritos tienen una finalidad puramente ilustrativa, y no tienen por objeto delimitar las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVI N DICACION ES

1 . Un aptámero que se liga a un inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI) , en donde el aptámero comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en las SEQ I D NOs. : 4, 1 , 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 y 1 0.

2. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el TFPI es TFPI humano.

3. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el aptámero tiene una constante de disociación para TFPI humano de 100 nM o menos.

4. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 1 , 2 ó 3, en donde el aptámero comprende por lo menos una modificación química.

5. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la modificación está seleccionada del grupo consistente en: una sustitución química en una posición de azúcar, una sustitución química en un enlace internucleótido, y una sustitución química en una posición de base.

6. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la modificación está seleccionada del grupo consistente en: la incorporación de un nucleótido modificado; un casquete 3'; un casquete 5' cap; la conjugación a un compuesto no inmuno génico de elevado peso molecular; la conjugación a un compuesto lipófilo; la incorporación de un motivo CpG; y la incorporación de un fosforotioato o fosforoditioato en el esqueleto de fosfato.

7. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 6, en donde compuesto no inmuno génico de elevado peso molecular es polietilenglicol.

8. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde el casquete 3' es un casquete de deoxitimidina invertido.

9. El aptámero de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal de mismo, que comprende la secuencia de ácido nucleico indicada a continuación: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA (SEQ I D NO: 1 ) (ARC26835), en donde "dN" es un deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-OMe.

10. El aptámero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal del mismo, que comprende la secuencia de ácido nucleico indicada a continuación: mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 2) (ARC 1 7480), en donde "3T" es una deoxitimidina invertida, "dN" es un deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-O e.

1 1 . El aptámero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal del mismo, que comprende la secuencia de ácido nucleico indicada a continuación: NH2-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 3) (ARC 19498), en donde "NH2" es de una fosforamidita ligador 5'- hexilamina; "3T" es una deoxitimidina invertida, "dN" es deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-OMe.

12. El aptámero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una sal del mismo, que comprende la secuencia de ácido nucleico indicada a continuación: PEG40K-NH-mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ I D NO: 4) (ARC19499), en donde "NH" es de una fosforamidita ligador 5'-hexilamina, "PEG" es un polietilenglicol; "3T" una deoxitimidina invertida, "dN" es un deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-O e.

13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del aptámero de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 12 o una sal del mismo, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables.

14. Un método para tratar, prevenir, retardar la progresión o realizar una mejoría en un trastorno de sangrado mediado por TFPI , que comprende administrar a un sujeto la composición de acuerdo con la reivindicación 1 3.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el sujeto es un mamífero.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 5, en donde el mamífero es un ser humano.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde el trastorno de sangrado se selecciona del grupo consistente en: profilaxis y/o terapia a pedido para deficiencias del factor de coagulación, congénitas o adquiridas, suave/moderada/severa, que incluyen Hemofilia A (deficiencia del Factor VIII), Hemofilia B (deficiencia del Factor IX) y Hemofilia C (deficiencia del Factor XI); Hemofilia A o B con inhibidores; otros factores de deficiencia (V, VII, X, XIII, protrombina, fibrinógeno); deficiencia del inhibidor de a2-plasmina; deficiencia del inhibidor 1 activador del plasminógeno; deficiencia de muestras factores; anomalías de factores funcional (por ejemplo, disprotrombinaemia); hemorragia de las articulaciones (hemartrosis) que incluyen sin limitación tobillo, codo y rodilla; sangrado espontáneo en otros lugares (músculos, gastrointestinal, boca, etc.); accidente cerebrovascular hemorrágico; hemorragia intracraneal; laceraciones y otras hemorragias asociadas con trauma; coagulopatía traumática aguda; coagulopatía asociada con cáncer (por ejemplo, leucemia promielocítica aguda); la Enfermedad de von Willebrand; coagulación intravascular diseminada; enfermedad del hígado; menorragia y trombocitopenia.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde se administra la composición antes, durante y/o después de un procedimiento médico.

19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde se administra la composición en combinación con otro fármaco.

20. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en donde se administra la composición en combinación con otra terapia.

21. Un kit, que comprende el aptámero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

22. Un aptámero o una sal del mismo, que se liga al inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), en donde el aptámero comprende la siguiente estructura: 5 -aptámero-3- en donde HN1™* P03H es de una fosforamidita ligador 5'-amina, y en donde el aptámero comprende la secuencia de ácido nucleico de mG- mG-mA-m A-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG- mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEO. ID NO: 2), en donde "3T" es una deoxitimidina invertida y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo, y en donde 20KPEG independientemente es una parte mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

23. El aptámero de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el ligador está seleccionado del grupo consistente en: 2-18 grupos CH2 consecutivos, 2-12 grupos CH2 consecutivos, 4-8 grupos CH2 consecutivos y 6 grupos CH2 consecutivos.

24. Un aptámero o una sal del mismo, que se liga a un inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), en donde el aptámero comprende la estructura siguiente: 5'-aptámero-3' en donde el aptámero comprende la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 2), en donde "3T" es una deoxitimidina invertida, "dN" es un deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo, y en donde 20KPEG es una parte mPEG que tiene un peso molecular de 20 kDa.

25. Un aptámero o una sal del mismo que se liga a un inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), en donde el aptámero comprende la estructura siguiente: en donde el aptámero comprende la secuencia de ácido nucleico de mG-mG-mA-mA-mU-mA-mU-mA-dC-mU-mU-mG-mG-dC-mU-dC-mG-mU-mU-mA-mG-mG-mU-mG-dC-mG-mU-mA-mU-mA-mU-mA-3T (SEQ ID NO: 2), en donde "n" es de aproximadamente 450, "3T" es una deoxitimidina invertida, "dN" es un deoxinucleótido y "mN" es un nucleótido que contiene 2'-0 metilo.

26. Un agente de inversión que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en SEQ ID NO: 15 (ARC23085), SEQ I D NO: 16 (ARC23087); SEQ I D NO: 17 (ARC23088) y SEQ I D NO: 18 (ARC23089).

27. Un método para producir un aptámero que se liga a un inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), comprendiendo el método el paso de sintetizar químicamente un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 2 o de 22 a 25.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 27 en donde el método comprende además formular una composición farmacéutica mediante el mezclado de la secuencia de ácido nucleico sintetizada, de una sal del mismo, con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables.

29. Un método para producir un agente de inversión, comprendiendo el método el paso de sinterizar qu ímicamente un ácido nucleico que tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 26.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 28 en donde el método comprende además formular una composición farmacéutica mediante el mezclado de una secuencia de ácido nucleico sintetizada o una sal del mismo, con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptables

31 . Un aptámero que se liga a un polipéptido inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos(TFPI) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ I D NO: 1 1 , en donde el aptámero modula la inhibición mediata por TFPI , de la coagulación de la sangre, y en donde el aptámero compite para la ligación al TFPI con un aptámero de referencia que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo consistente en: SEQ ID NO: 4 (ARC19499), SEQ ID NO: 1 (ARC26835), SEQ ID NO: 2 (ARC17480), SEQ ID NO: 3 (ARC19498), SEQ ID NO: 5 (ARC19500), SEQ ID NO:6 (ARC19501), SEQ ID NO: 7 (ARC31301), SEQ ID NO: 8 (ARC18546), SEQ ID NO: 9 (ARC19881) y SEQ ID NO: 10 (ARC19882).

32. Un aptámero que se ligan a una región sobre un polipéptido inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos(TFPI) que comprende una o más porciones de la SEQ ID NO: 11, en donde la una o más porciones están seleccionadas del grupo consistente en: los residuos aminoácidos 148- -170, residuos aminoácidos 150-170, residuos aminoácidos 155-¦175, residuos aminoácidos 160-180, residuos aminoácidos 165- -185, residuos aminoácidos 170-190, residuos aminoácidos 175- -195, residuos aminoácidos 180-200, residuos aminoácidos 185- -205, residuos aminoácidos 190-210, residuos aminoácidos 195· ¦215, residuos aminoácidos 200-220, residuos aminoácidos 205-¦225, residuos aminoácidos 210-230, residuos aminoácidos 215-¦235, residuos aminoácidos 220-240, residuos aminoácidos 225-¦245, residuos aminoácidos 230-250, residuos aminoácidos 235-¦255, residuos aminoácidos 240-260, residuos aminoácidos 245-¦265, residuos aminoácidos 250-270, residuos aminoácidos 255-¦275, residuos aminoácidos 260-276, residuos aminoácidos 148-•175, residuos aminoácidos 150-175, residuos aminoácidos 150-¦180, residuos aminoácidos 150-185, residuos aminoácidos 150- -190, residuos aminoácidos 150-195, residuos aminoácidos 150- -200, residuos aminoácidos 150-205, residuos aminoácidos 150· -210, residuos aminoácidos 150-215, residuos aminoácidos 150- -220, residuos aminoácidos 150-225, residuos aminoácidos 150- -230, residuos aminoácidos 150-235, residuos aminoácidos 150- -240, residuos aminoácidos 150-245, residuos aminoácidos 150- -250, residuos aminoácidos 150-255, residuos aminoácidos 150- -260, residuos aminoácidos 150-265, residuos aminoácidos 150- -270, residuos aminoácidos 150-275, residuos aminoácidos 150-•276, residuos aminoácidos 190-240, residuos aminoácidos 190-¦276, residuos aminoácidos 240-276, residuos aminoácidos 242-¦276, residuos aminoácidos 161-181, residuos aminoácidos 162-•181, residuos aminoácidos 182-240, residuos aminoácidos 182-241, y residuos aminoácidos 182- 276.

33. Un aptámero que se liga a uninhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI) y que presenta una o más de las siguientes propiedades: a) compite para la ligación a TFPI con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-10; b) inhibe la inhibición por TFPI, del Factor Xa; c) incrementa la generación de la trombina en el plasma de hemofilia; d) inhibe la inhibición por TFPI, sobre el complejo intrínseco de tenasa; e) restaura la hemostasis normal, medida mediante tromboelastografía (TEG) en sangre entera y plasma; f) restaura la coagulación normal, indicada por un tiempo R de coagulación más corto, un formación más rápida de los coágulos o un desarrollo más estable de los coágulos, medidos mediante tromboelastografía (TEG) o mediante tromboelastometría rotacional (ROTEM) en sangre entera y plasma; o g) disminuye el tiempo de coagulación, como se midió mediante tiempo de protrombina diluida (dpT), tiempo de coagulación activado por el factor de los tejidos (TF-ACT) o mediante cualquier otra medición del tiempo de coagulación sensible al TFPI.

34. Un aptámero que se liga a inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), en donde el aptámero compite para la ligación al TFPI con un aptámero de referencia seleccionado del grupo consistente en: SEQ ID NO: 4, SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ I D NO: 5, SEQ I D NO. 6, SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

35. Un aptámero que se liga a inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos(TFPI) , en donde el aptámero compite, directa o indirectamente, para su ligación con el TFPI , con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo consistente en: AD4903.

36. Un aptámero que se liga a inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), y que comprende un motivo de tallo y bucle que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ I D NO: 4, en donde: a) cualquiera de los nucleótidos 1 , 2, 3, 4, 6, 8, 1 1 , 1 2, 1 3, 17, 20, 21 , 22, 24, 28, 30 y 32 puede ser modificado a partir de una sustitución de 2'-OMe a una sustitución 2'-deoxi; b) cualquiera de los nucleótidos 5, 7, 1 5, 1 9, 23, 27, 29 y 31 puede ser modificado a partir de un 2'-OMe uracilo a sea un 2'-deoxi uracilo sea una 2'-deoxi timina; c) el nucleótido 1 8 puede ser modificado desde un 2'-OMe uracilo a un 2'-deoxi uracilo; y/o d) cualquiera de los nucleótidos 14, 16 y 25 puede ser modificado desde una 2'-deoxi citosina a sea una 2 -OMe citosina o una 2'-fluor citosina.

37. Un aptámero que se liga a inhibidor de la trayectoria de factor de los tejidos (TFPI), en donde el aptámero comprende a secuencia de ácido nucleico primaria seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID NOs. : 4, 1 , 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.