MX2011010258A - Inhibicion de organismos de biopelicula. - Google Patents

Inhibicion de organismos de biopelicula.

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Abstract

La presente invención se refiere a un producto que comprende al menos dos agentes antibiopelícula en donde al menos uno de los agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano; el segundo agente antibiopelícula es generalmente un dispersante o un agente antiadhesivo; asimismo se provee el uso del producto en el tratamiento de una infección microbiana.

Description

INHIBICIÓN DE ORGANISMOS DE BIOPELÍCULA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a productos, composiciones, métodos y usos que son útiles en relación con la prevención y tratamiento de biopeliculas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una biopelícula microbiana es una comunidad de células microbianas incluidas en una matriz extracelular de sustancias poliméricas y adherentes a una superficie biológica o no biótica. Un rango de microorganismos (bacterias, hongos y/o protozoarios, con bacteriófagos y otros virus asociados) se puede encontrar en estas biopeliculas. Las biopeliculas son de naturaleza ubicua, se encuentran comúnmente en un amplio rango de ambientes. Las biopeliculas están siendo reconocidas cada vez más por la comunidad científica y médica como implicadas en muchas infecciones, y en especial su contribución a la resistencia al tratamiento de infecciones.
Las biopeliculas son agentes etiológicos para una serie de estados de enfermedad en mamíferos y están implicadas en 80% de las infecciones en humanos. Ejemplos incluyen infecciones de la piel y de heridas, infecciones del oído medio, infecciones del tracto gastrointestinal, infecciones de la membrana peritoneal, infecciones del tracto urogenital, infecciones del tejido blando oral, formación de placa dental, infecciones de los ojos (incluyendo contaminación de lentes de contacto), endocarditis, infecciones en fibrosis quística, e infecciones de dispositivos médicos permanentes tales como prótesis de articulaciones, implantes dentales, catéteres e implantes cardiacos.
Microbios del plancton (es decir, microorganismos suspendidos o que crecen en un medio líquido) son típicamente usados como modelos para investigación de susceptibilidad antimícrobiana como es descrito por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) y el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST). Los microbios en las biopelículas son significativamente más resistentes al tratamiento antimicrobiano que sus contrapartes del plancton. No obstante, no existe un método estandarizado para el estudio de susceptibilidad a antibióticos de microbios de biopelículas.
La formación de biopelículas no se limita únicamente a la habilidad de los microbios de adherirse a una superficie. Los microbios que crecen en una biopelícula son capaces de interactuar más entre si que con el sustrato físico real sobre el cual se desarrolló inicialmente la biopelícula. Por ejemplo, este fenómeno favorece la transferencia de genes por conjugación, que ocurre a un índice mayor entre células en biopelículas que entre células del plancton. Esto representa una oportunidad incrementada para transferencia de genes horizontal entre bacterias, y es importante porque esto puede facilitar la transferencia de genes determinantes de resistencia a antibióticos o virulencia desde microbios resistentes a susceptibles. Las bacterias se pueden comunicar entre sí por medio de un sistema conocido como percepción de quorum, a través del cual moléculas de señalización son liberadas en el ambiente y su concentración puede ser detectada por los microbios circundantes. La percepción de quorum permite que las bacterias coordinen su comportamiento, aumentando así su capacidad de sobrevivir. Las respuestas a la percepción de quorum incluyen adaptación a la disponibilidad de nutrientes, defensa contra otros microorganismos que pueden competir por los mismos nutrientes y evitar compuestos tóxicos potencialmente peligrosos para las bacterias. Es muy importante que las bacterias patógenas durante la infección de un hospedero (por ejemplo, humanos, otros animales o plantas) coordinen su virulencia a fin de escapar a la respuesta inmune del hospedero a fin de poder establecer una infección exitosa.
La formación de biopelículas juega un papel clave en muchas enfermedades infecciosas, tales como fibrosis quística y periodontitis, en infecciones de la corriente sanguínea y del tracto urinario y como consecuencia de la presencia de dispositivos médicos permanentes. Los mecanismos sugeridos mediante los cuales los microorganismos asociados con biopelículas provocan enfermedades en su hospedero incluyen los siguientes: (i) penetración retardada del agente antimicrobiano a través de la matriz de biopelícula, (ii) separación de células o agregados de células de biopelículas de dispositivos médicos permanentes, (iii) producción de endotoxinas, (iv) resistencia al sistema inmunológico del hospedero, (v) provisión de un nicho para la generación de organismo resistentes a través de transferencia de genes horizontal de genes determinantes de resistencia antimicrobiana y/o de virulencia, y (vi) índice de crecimiento alterado (es decir, inactividad metabólica) (Donlan y Costerton, Clin Microbiol Rev 15: 167-193, 2002; Parsek y Singh, Annu Rev Microbiol 57: 677-701 , 2003; Costerton JW, Resistance of biofilms to stress. In The biofilm primer'. (Springer Berlín Heidelberg). pp. 56-64.2007).
Evidencia experimental reciente ha indicado la existencia dentro de biopelículas de una pequeña subpoblacion de células persistentes no metabolizantes especializadas (células inactivas). Se cree que estas células pueden ser responsables de la alta resistencia/tolerancia de la biopelícula a agentes antimicrobianos. Células persistentes tolerantes a multifármacos están presentes en poblaciones tanto de plancton como de biopelícula y parece que levaduras y bacterias han desarrollado estrategias análogas que asignan la función de supervivencia a esta subpoblacion. La protección ofrecida por la matriz polimérica permite que las células persistentes eviten la eliminación y sirvan como una fuente para repoblación. Existe evidencia de que las células persistentes pueden ser en gran parte responsables de la tolerancia a multifármacos de biopelículas microbianas (LaFleur et al., Antimicrob Agents Chemother. 50: 3839-46, 2006; Lewis, Nature Reviews Microbiology 5, 48-56 2007).
Permanece la necesidad de mejores terapias para prevenir la formación de biopeliculas y tratar las condiciones asociadas con biopeliculas antimicrobianas.
Declaraciones de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se provee un producto que comprende al menos dos agentes antibiopelícula en donde al menos uno de los agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano. El otro agente antibiopelícula puede ser un dispersante o un agente antiadhesivo.
El término "agente antibiopelícula" se usa en la presente para describir un agente que es capaz de destruir o inhibir el crecimiento de una biopelícula microbiana. El agente antibiopelícula puede ser capaz de alterar la estructura de la biopelícula, por ejemplo, la matriz mucosa extracelular, o puede ser capaz de destruir o inhibir el crecimiento de células microbianas dentro de la biopelícula.
La invención provee además un método de prevención de formación de biopelícula en un ambiente que comprende el paso de administrar al ambiente un péptido antimicrobiano. De manera favorable el método comprende el paso de administrar al ambiente un producto de acuerdo con la invención.
La invención provee además un método para tratar una infección microbiana, particularmente una biopelícula microbiana, por medio de profilaxis o terapia, que comprende la administración en una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido catiónico. Típicamente el método incluye la administración consecutiva o combinada en una cantidad terapéuticamente efectiva de: • un primer agente antibiopelicula; y • un segundo agente antibiopelicula diferente del primero; en donde al menos uno del primer y segundo agentes antibiopelicula es un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido catiónico.
Los agentes activos antes mencionados se pueden administrar como combinaciones libres o fijas. Las combinaciones libres se pueden proveer como paquetes de combinación que contienen todos los agentes activos en combinaciones libres. Las combinaciones fijas son con frecuencia tabletas o cápsulas.
Incluido en la invención se encuentra el uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana, particularmente una infección por biopelícula microbiana, por medio de profilaxis o terapia de los péptidos antimicrobianos, o combinaciones de los agentes activos antes explicados de manera resumida.
Los productos tienen la ventaja de que demuestran actividad antibacteriana contra, entre otras cosas, las células persistentes presentes en las biopelículas, que es un paso esencial hacia la erradicación de biopelículas.
Los agentes de la invención se pueden administrar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir del compuesto original que contiene una porción básica o ácida por medio de métodos químicos convencionales. En general, dichas sales se pueden preparar haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; en general, medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol, o acetonitrilo se prefieren. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., EEUU, 1985, p. 1418, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia; ver también Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use", Verlag Helvética Chimica Acta y Wiley-VCH, 2002. La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para hacer referencia a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico seguro, adecuados para usar en contacto con los tejidos de seres humanos o, según sea el caso, un animal sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesiva u otro problema o complicación, en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable.
La invención incluye asi sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en donde el compuesto original es modificado haciendo sales ácidas o básicas de los mismos, por ejemplo, las sales no tóxicas convencionales de las sales de amonio cuaternario que se forman, por ejemplo, a partir de ácidos o bases inorgánicos u orgánicos. Ejemplos de dichas sales ácidas edición incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodecilsulfato, etansulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietansulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metal alcalino tales como sales de sodio y potasio, sales de metal alcalinotérreo tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, y sales con aminoácidos tales como arginina, Usina, etc. Asimismo, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con dichos agentes como halogenuros de alquilo inferior, tales como cloruro, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; dialquilsulfatos como dimetilo, dietilo, dibutilo; y diamil sulfatos, halogenuros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, halogenuros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo y otros.
Por lo tanto, la invención incluye productos farmacéuticos que comprenden generalmente por lo menos: • un primer agente antibiopelícula; y • un segundo agente antibiopelícula diferente del primero en donde al menos uno del primer y segundo agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido catiónico.
El primer agente antibiopelícula El primer agente antibiopelícula puede ser un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antibacteriano. De preferencia, el primer agente antibiopelícula es un péptido antimicrobiano, en adelante llamado "el primer agente antimicrobiano". El primer agente antimicrobiano puede comprender aminoácidos de acuerdo con la fórmula I: ((X)l(Y)m)n (I) en donde I y m son enteros de 1 a 10, por ejemplo, 1 a 5; n es un entero de 1 a 10; X y Y, que pueden ser iguales o diferentes, son independientemente un aminoácido hidrofóbico o catiónico.
De preferencia el primer agente antimicrobiano comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula (I) en donde X y Y son aminoácidos catiónicos.
El péptido antimicrobiano puede comprender de 2 a 200 aminoácidos, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, o 7 hasta 100 aminoácidos, incluyendo 3, 4, 5, 6, o 7 hasta 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos. De acuerdo con una modalidad, el péptido antimicrobiano comprende 3 o 4 a 50 aminoácidos. De manera alternativa, el péptido puede comprender más de 27 aminoácidos, típicamente 27 a 300 aminoácidos, de manera adecuada 27 a 200 aminoácidos.
El péptido puede comprender 100 a 200 aminoácidos, 20 a 100, 20 y 45 aminoácidos tales como 20, 25, 30, 35, 40, 42 o 45 aminoácidos. El péptido puede comprender entre 3 y 15 aminoácidos, por ejemplo, 5 a 15 aminoácidos.
Como se usa en la presente, el término "hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que tiene una cadena lateral que no tiene carga a pH fisiológico, que no es polar y que generalmente es repelido por solución acuosa.
Como se usa en la presente, el término "catiónico" se refiere a aminoácidos que tienen una carga neta que es mayor que o igual a 0. En general, el término "catiónico" se refiere a aminoácidos que tienen una carga neta que es mayor que cero.
Generalmente un residuo amino hidrofóbico tiene una hidrofobicidad mayor que o igual a -1.10 y una carga mayor que o igual a 0.
Aminoácidos hidrofóbicos pueden incluir, leucina fenilalanina, prolina, alanina, triptófano, valina, isoleucina y metionina.
De preferencia X y/o Y son aminoácidos catiónicos, por ejemplo, seleccionados del grupo que consiste de histidina, arginina y lisina. De preferencia aún X y/o Y son arginina o lisina. X y/o Y se pueden seleccionar de aminoácidos no naturales, por ejemplo, el aminoácido catiónico ornitina.
X y/o Y pueden ser isómeros ópticos de un aminoácido catiónico como se define en la presente, por ejemplo, aminoácidos D o L. Más aún, X y/o Y pueden ser aminoácidos alternantes.
Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. La invención incluye también isómeros conocidos (estructurales, estéreo-, de conformación y de configuración) y análogos estructurales de los aminoácidos anteriores, y aquellos modificados ya sea en forma natural (por ejemplo, modificación post-traduccional) o química, incluyendo, mas no exclusivamente, fosforilación, glucosilación.sulfonilación y/o hidroxilación.
De acuerdo con una modalidad el péptido puede incluir una o más sustituciones de los aminoácidos catiónicos o hidrofóbicos X y Y. Sin embargo, el péptido comprendería de manera predominante los aminoácidos catiónicos o hidrofóbicos X y Y. Típicamente, el péptido puede comprender 1 a 5 sustituciones, de manera adecuada 1 a 3 sustituciones, generalmente una sustitución. Las sustituciones pueden ser terminales o no terminales.
Las sustituciones pueden consistir de aminoácidos, o elementos distintos de aminoácidos. Las sustituciones pueden tener carga o no tener carga. Típicamente una o más de las sustituciones son aminoácidos sin carga. De manera alternativa o adicional una o más de las sustituciones pueden ser elementos distintos de aminoácidos tales como cisteamina.
De preferencia X y Y son iguales y son lisina o arginina.
De acuerdo con una modalidad, el péptido comprende predominantemente aminoácidos arginina que pueden ser sustituidos con uno o más aminoácidos que no son arginina.
Generalmente el péptido comprende 7 a 20 aminoácidos arginina, opcionalmente sustituidos con 1 a 5 aminoácidos distintos de arginina, típicamente 3 a 5 sustituciones distintas de arginina.
De manera alternativa, el péptido puede comprender 7 a 20 aminoácidos lisina, opcionalmente sustituidos con 1 a 5 aminoácidos distintos de lisina, típicamente 3 a 5 sustituciones distintas de lisina.
De acuerdo con otra modalidad, el péptido puede comprender 27 a 300 aminoácidos lisina, generalmente 27 a 200 aminoácidos lisina. Típicamente el péptido no comprende sustituciones no terminales con aminoácidos distintos de lisina.
En el péptido de fórmula (I) I y m pueden ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y n puede ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En el péptido de fórmula (I) I puede ser 1 , n puede ser 1 y m puede ser entre 4 y 9, por ejemplo, m puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9.
En el péptido de fórmula (I) I, n y/o m pueden ser entre 1 y 5, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4 o 5.
En el péptido de fórmula (I) I y m pueden ser un entero entre 0 y 7 y n puede ser un entero entre 1 y 10.
En el péptido de fórmula (I) I y m pueden ser 0, 1 o 2 y n puede ser un entero entre 1 y 10.
En el péptido de fórmula (I) X y Y pueden ser iguales, I puede ser O, m puede ser 1 y n puede ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
En el péptido de fórmula (I) X y Y pueden ser iguales, I y m pueden ser 1 y n puede ser 2, 3, 4 o 5.
En el péptido de fórmula (I) X y Y pueden ser iguales, I puede ser 1 , m puede ser 2 y n puede ser 1 , 2, 3 o 4.
En el péptido de fórmula (I) X y Y pueden ser iguales, I y m pueden ser 2 y n puede ser 1 , 2, 3 o 4.
De preferencia, el primer agente antimicrobiano comprende una secuencia de péptidos seleccionada del grupo que consiste de polilisina y poliarginina.
En una modalidad, el primer agente antimicrobiano comprende una polilisina.
En una modalidad alternativa, el primer agente antimicrobiano comprende poliarginina.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se provee el uso del primer agente antimicrobiano en el tratamiento de prevención de una biopelícula.
Típicamente el primer agente antimicrobiano está en forma del producto de la invención como se describe más adelante.
El segundo agente antibiopelícula El segundo agente antibiopelícula puede ser cualquier agente que inhiba la formación de biopelícula. A manera de ejemplo, el segundo agente antibiopelícula puede inhibir la adhesión bacteriana, hidrofobicidad o producción de lama. El segundo agente antibiopelícula se puede seleccionar de un dispersante y un agente antiadhesivo.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención el segundo agente antibiopelícula no es un péptido.
Se pretende que el término "dispersante" incluya cualquier agente capaz de dispersar las partículas de una biopelícula. En particular, el dispersante puede promover la dispersión de lama producida por microbios tales como bacterias, moco que forma parte de la biopelícula, por ejemplo, moco producido por las células al cual los microbios de película se adhieren, y microbios de biopelícula tales como bacterias.
El dispersante puede ser un agente mucolítico. El agente mucolitico puede ser una enzima, por ejemplo, una ADNasa, alginasa, proteasa y carobohidrasa. De manera alternativa, el agente mucolítico puede ser una molécula pequeña, por ejemplo, una amina tal como un aminotiol o un ácido tal como ácido etilendiamintetraacético (EDTA). La amina se puede seleccionar de acetilcisteína y cisteamina.
Se pretende que el término "agente antiadhesivo" incluya cualquier agente capaz de inhibir la adhesión entre células, proteínas y organismos, por ejemplo, microbios, previniendo así la formación de biopelículas o promoviendo la autodestrucción de biopelículas. En particular, el agente antiadhesivo puede prevenir la adhesión a una superficie o sustrato de todos los tipos de células encontrados en biopelículas microbianas en particular microbios de vida libre, es decir, células del plancton. Agentes antiadhesivos pueden incluir, mas no se limitan a, hialuronano, heparina o Carbopol 934.
El segundo agente antibiopelícula puede ser un agente antibacteriano. El agente antibacteriano puede ser un agente mucolítico, por ejemplo, un agente mucolítico que tiene actividad tanto mucolitica como antibacteriana. De preferencia el agente antibacteriano es cisteamina.
Los productos de la invención El producto de la presente invención puede comprender un péptido antimicrobiano.
Un producto preferido comprende un péptido antimicrobiano y un agente mucolítico.
La relación del primer agente antibiopelícula al segundo agente antibiopelícula en los productos de la invención puede ser de 1 :10 a 10: 1 ; en general al menos 2:1 , por ejemplo, al menos 3:1 o 4:1. De acuerdo con una modalidad, la relación del primer agente antibiopelícula al segundo agente antibiopelícula es aproximadamente 1 :1. De preferencia el primer agente antibiopelícula es un péptido catiónico y el segundo agente antibiopelícula es un agente mucolítico y la relación de péptido catiónico: agente mucolítico varía de 2:1 hasta 4: 1. De acuerdo con otra modalidad la relación puede ser aproximadamente 1 :1.
Los agentes activos se pueden administrar de manera simultánea, consecutiva o por separado. Los agentes activos se pueden proveer como un paquete de combinación. El paquete de combinación puede contener el producto de la invención junto con instrucciones para administración simultánea, separada o consecutiva de cada uno de los agentes activos. Para administración consecutiva, los agentes activos se pueden administrar en cualquier orden.
Los agentes activos del producto de la invención se pueden proveer como composiciones farmacéuticas que contienen adicionalmente uno o más diluyentes, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Esto aplica a combinaciones tanto fijas como libres.
Los agentes activos de la presente invención se pueden administrar por medio de cualquier vía adecuada conocida para los expertos en la técnica, de preferencia en forma de una composición farmacéutica adaptada a dicha vía, y en una dosis efectiva para el tratamiento deseado. Los compuestos activos y la composición se pueden, por ejemplo, administrar en forma parenteral, oral, intranasal, intrabronquial, enteral, transdérmica, sublingual, rectal, vaginal, ocular o tópica. Se contempla la administración tanto local como sistémica.
Para los propósitos de administración parenteral ("parenteral" como se usa en la presente, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, enteral, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular de las cuales la intravenosa (incluyendo administración intravenosa continua) se prefiere en forma superlativa. Soluciones en propilenglicol acuoso se pueden emplear, así como soluciones acuosas estériles de las sales solubles en agua correspondientes. El pH de tales soluciones acuosas se puede regular de manera adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido se puede hacer primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para propósitos de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles empleados son fácilmente obtenibles mediante técnicas estándar bien conocidas para los expertos en la técnica.
Los productos de la invención se pueden administrar también intranasalmente o mediante inhalación y son suministrados de manera conveniente en forma de un inhalador de polvo seco o una presentación de atomizador de aerosol de un contenedor presurizado, bomba, rociador, atomizador, nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado.
De manera alternativa los productos de la invención se pueden administrar en forma de un supositorio o pesario, o se pueden aplicar tópicamente en forma de un gel, hidrogel, loción, solución, crema, ungüento o polvo. Los productos de la invención se pueden administrar dérmica o transdérmicamente, por ejemplo, mediante el uso de un parche para la piel, inyección de liberación lenta o subcutánea. También se pueden administrar por las vías pulmonar o rectal.
Para administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, una tableta, cápsula, suspensión o líquido. La composición farmacéutica se hace de preferencia en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad particular del ingrediente activo. Ejemplos de tales unidades de dosificación son cápsulas, tabletas, polvos, gránulos o una suspensión, con aditivos convencionales tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de papa; con aglutinantes tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, acacia, almidón de maíz o gelatinas; con desintegrantes tales como almidón de maíz, almidón de papa o carboximetilcelulosa de sodio; y con lubricantes tales como talco o estearato de magnesio. El ingrediente activo puede ser administrado también por medio de inyección como una composición en donde, por ejemplo, solución salina, dextrosa o agua se pueden usar como un vehículo adecuado.
Los productos de la invención pueden encontrar también aplicación como/en una formulación oral en donde el producto es formulado en un vehículo, por ejemplo, seleccionado de películas, cintas, geles, microesferas, pastillas, goma de mascar, pastas dentales y enjuague bucal.
La cantidad de compuesto terapéuticamente activo que se administra y el régimen de dosificación para tratar una condición de enfermedad con los compuestos y/o composiciones de esta invención dependen de una variedad de factores, incluyendo la edad, peso, sexo y condición médica del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la vía y frecuencia de administración, y el compuesto particular empleado, así como las propiedades farmacocinéticas del individuo tratado, y por ende pueden variar mucho. La dosificación generalmente será más baja si los compuestos son administrados localmente en lugar de sistémicamente, y para prevención más que para tratamiento. Dichos tratamientos se pueden administrar tan a menudo como sea necesario y durante el periodo de tiempo que el médico tratante juzgue necesario. Un experto en la técnica entenderá que el régimen de dosificación o cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor a ser administrado puede necesitar ser optimizado para cada individuo. Las composiciones farmacéuticas pueden contener ingrediente activo en el rango de aproximadamente 0.1 a 2000 mg, de preferencia en el rango de aproximadamente 0.5 a 500 mg y con preferencia superlativa entre aproximadamente 1 y 200 mg. Una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a 100 mg/kg de peso corporal, de preferencia entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y con preferencia superlativa de aproximadamente 1 a 20 mg/kg de peso corporal, puede ser apropiada. La dosis diaria puede ser administrada en una a cuatro dosis por día.
Los productos de la invención son de preferencia administrados al tracto respiratorio. Por ende, la presente invención provee también formulaciones farmacéuticas en aerosol que comprenden un producto de la invención. Asimismo se provee un nebulizador o inhalador que contiene un producto de la invención.
De manera adicional, los productos de la invención pueden ser adecuados para formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Las formulaciones pueden ser constituidas de modo tal que liberen los agentes activos, por ejemplo, en una parte particular del tracto intestinal o respiratorio, posiblemente durante un periodo de tiempo. Revestimientos, cubiertas y matrices protectoras se pueden hacer, por ejemplo, a partir de sustancias poliméricas, tales como poliláctido-glicolatos, liposomas, microemulsiones, micropartículas, nanopartículas o ceras. Estos revestimientos, cubiertas y matrices protectoras son útiles para cubrir dispositivos permanentes, por ejemplo, stents, catéteres, tubos de diálisis peritoneal, dispositivos de drenado y similares.
Los productos de la invención pueden incluir cantidades sinergísticamente efectivas de cada agente activo definido en la presente. Por lo tanto, la invención incluye productos que comprenden una cantidad sinergísticamente efectiva de (i) un primer agente antibiopelícula, (ii) un segundo agente antibiopelícula que es diferente del primer agente antibiopelícula y es típicamente un péptido antimicrobiano. El producto puede ser para usar en la fabricación de un medicamento, para administración simultánea, separada o consecutiva de dichos agentes en el tratamiento de una infección microbiana, por ejemplo, una infección por biopelícula. "Sinergísticamente", como se usa en la presente, puede describir la acción de los dos o más agentes del producto de la invención trabajando juntos para producir un efecto mayor que el efecto combinado esperado de los agentes usados por separado.
En otro aspecto de la invención se provee un sustrato al cual un producto de la invención es aplicado o adherido. De preferencia, el sustrato es adecuado para aplicación a heridas o para suministrar a lugares de heridas.
De preferencia, el sustrato permite la transferencia de los agentes activos del producto de la invención del sustrato a la base de una herida para lograr su efecto antibiopelícula. El sustrato puede ser un aposito, por ejemplo, aposito para heridas. El aposito puede comprender un material de tela o puede ser un material tipo colágeno. El sustrato puede estar en cualquier forma adecuada para aplicación a una herida, típicamente el sustrato puede estar en forma de un hidrogel, coloide, ungüento, crema, gel, espuma o aspersión.
Los productos de la invención también pueden encontrar aplicación como/en un desinfectante o biocida. En este contexto, el péptido o composiciones farmacéuticas de la invención se pueden aplicar, ya sea solos o en combinación con otros agentes desinfectantes, a una superficie a tratar. Como se usa en la presente una "superficie a tratar" puede ser un sustrato como se define en la presente y puede incluir dispositivos médicos y dispositivos permanentes, por ejemplo, stents, catéteres, tubos de diálisis peritoneal, dispositivos de drenado, prótesis de articulaciones, implantes dentales y similares.
Métodos y uso La invención provee un método de prevención de formación de biopelícula en un ambiente que comprende el paso de administrar al ambiente un producto de acuerdo con la invención. El método puede ser in vivo o ex vivo.
De acuerdo con una modalidad, el método comprende el paso de administrar un péptido antimicrobiano.
De manera favorable el método comprende el paso de administrar • un primer agente antibiopelícula; y · un segundo agente antibiopelícula diferente del primero en donde al menos uno del primer y segundo agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido catiónico.
El ambiente puede comprender cualquier microorganismo formador de biopelícula seleccionado de bacterias, hongos, levaduras, virus y protozoarios.
Típicamente el microorganismo es una bacteria, por ejemplo, una bacteria gram-positiva o una bacteria gram-negativa. Un agente patógeno bacteriano se puede derivar de una especie bacteriana seleccionada del grupo que consiste de: Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., por ejemplo, Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Listería spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., por ejemplo, Streptococcus Grupo A o B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., por ejemplo, Helicobacter pylori; Neisseria spp. , por ejemplo, Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., por ejemplo, Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., por ejemplo, Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., por ejemplo, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisella fularensis; Bacillus spp., por ejemplo, Bacillus anthracis; Clostridia spp., por ejemplo, Clostridium botulinum; Yersinia spp., por ejemplo, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; por ejemplo, Burkholderia mallei y B pseudomallei.
En particular la bacteria puede incluir Pseudomonas spp., por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis; Haemophilus spp. , por ejemplo, Haemophilus influenza; Burkholderia spp., por ejemplo, Burkholderia cepacia; Streptococcus spp., Propionibacterium spp., por ejemplo, Propionibacterium acnés. De preferencia la bacteria se selecciona de Pseudomonas spp., por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.
Un agente patógeno viral se puede derivar de un virus seleccionado del grupo que consiste de: Virus de Inmunodeficiencia Humana (HTV1 y 2); Virus de la Leucemia de Células T Humanas (HTLV 1 y 2); virus del ébola; virus del papiloma humano (por ejemplo, HPV-2, HPV-5, HPV-8 HPV-16, HPV-18, HPV-31 , HPV-33, HPV-52, HPV-54 y HPV-56); papovavirus; rinovirus; poliovirus; herpesvirus; adenovirus; virus de Epstein Barr; virus de la influenza, virus de la hepatitis B y C, virus de la Varióla, rotavirus o coronavirus del SARS (Síndrome Respiratorio Agudo Severo).
Un agente patógeno parasitario se puede derivar de un agente patógeno parasitario seleccionado del grupo que consiste de Trypanosoma spp. (Trypanosoma cruzi, Trypansosoma brucei), Leishmania spp., Giardia spp., Trichomonas spp., Entamoeba spp., Naeglería spp., Acanthamoeba spp., Schistosoma spp., Plasmodium spp. , Crytosporidiwn spp., Isospora spp., Balantidium spp., Loa Loa, Ascaris lumbricoides, Dirofilaria immitis, Toxoplasma ssp., por ejemplo, Toxoplasma gondii. Un agente patógeno fúngico se puede derivar de un agente patógeno fúngico que es del género Candida spp., (por ejemplo, C.albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporiim spp., Trichophyton spp., (por ejemplo, T.rubrum y T.interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauvería spp., Chrysosporíum spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaería spp., Malassezia spp., Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp. , Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp. , Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Tríchosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., VerticiHium spp., Wangiella spp.
De acuerdo con otra modalidad el microorganismo puede ser un hongo, en particular Candida.
El método de la invención se puede usar para reducir al mínimo y, de preferencia, prevenir la formación de biopeliculas en una variedad de ambientes incluyendo, mas no limitados a, casa, lugar de trabajo, laboratorio, ambiente industrial, ambiente acuático (por ejemplo, sistemas de tubería), dispositivos médicos incluyendo dispositivos permanentes tales como se definen en la presente, dispositivos dentales o implantes dentales, cuerpo animal, por ejemplo, cuerpo humano.
El método de la invención se puede usar, por ende, en la boca para prevenir la formación de placa o caries en un diente humano o implante dental, por ejemplo, una dentadura artificial.
El método de la invención se puede usar para prevenir o limitar la formación de una biopelícula en el cuerpo humano en especial en el tratamiento de infecciones microbianas. Condiciones asociadas con infecciones por biopelícula pueden incluir infecciones tópicas, infecciones orales e infecciones sistémícas. Las infecciones tópicas pueden incluir heridas, úlceras y lesiones, por ejemplo, heridas cutáneas tales como cortadas o quemaduras, y condiciones asociadas con las mismas.
Infecciones orales pueden incluir gingivitis, periodontitis y mucositis.
Las infecciones sistémicas pueden incluir fibrosis quística y otras condiciones asociadas con infecciones de las mucosas, por ejemplo, infecciones gastrointestinales, urogenitales y respiratorias.
Otro aspecto de la invención reside en métodos de tratamiento, prevención o retardo de la progresión de una enfermedad o condición asociada con la presencia de una infección por biopelicula microbiana en un mamífero, en especial, un humano, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un producto de la invención al mamífero.
Por una cantidad "efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende una cantidad de una o más sustancias activas que, dentro del alcance del juicio médico correcto, es suficiente para proveer un efecto deseado sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otro problema o complicación, en proporción con una relación beneficio/riesgo razonable.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el método comprende el paso de administrar un péptido antimicrobiano.
De manera favorable el método comprende el paso de administrar • un primer agente antibiopelícula; y • un segundo agente antibiopelícula diferente del primero en donde al menos uno del primer y segundo agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano, por ejemplo, un péptido catiónico.
La invención provee además el uso de un producto de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana, particularmente una infección por biopelícula microbiana, por medio de profilaxis o terapia de las combinaciones de agentes activos antes explicados de manera resumida.
De manera adicional la presente invención provee el uso del péptido antimicrobiano antes descrito en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana, particularmente una infección por biopelícula microbiana, por medio de profilaxis o terapia.
Por ende, el producto de la invención puede ser útil en la prevención de, retardo de la progresión de, o tratamiento de una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de infecciones de la piel y de heridas, infecciones del oído medio, infecciones del tracto gastrointestinal, infecciones de la membrana peritoneal, infecciones del tracto urogenital, infecciones del tejido blando oral, formación de placa dental, infecciones de los ojos (incluyendo contaminación de lentes de contacto), endocarditis, infecciones en fibrosis quística, e infecciones de dispositivos médicos permanentes tales como se describe en la presente.
Asimismo la invención incluye métodos de tratamiento en los cuales un producto de la invención es administrado a un mamífero junto con uno o más de otros agentes antibacterianos, por ejemplo, un antibiótico.
Los inventores han encontrado de manera sorprendente que ciertos dispersantes, en particular agentes mucolíticos, inhiben el crecimiento de células persistentes de biopelícula. Por ende, la invención incluye también un método de tratamiento/prevención de formación de biopelícula en un ambiente que comprende administrar a dicho ambiente un agente mucolítico, por ejemplo, cisteamina. El agente mucolítico se puede administrar solo o en combinación con otro agente antimicrobiano, por ejemplo, un péptido antimicrobíano.
La invención provee también un método para tratar una infección microbiana, particularmente una por biopelícula microbiana, por medio de profilaxis o terapia, que comprende la administración en una cantidad terapéuticamente efectiva de un dispersante, en particular un agente mucolítico, por ejemplo, cisteamina.
La invención provee además el uso de un dispersante, en particular un agente mucolítico, por ejemplo, cisteamina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana, particularmente una infección por biopelícula microbiana.
Los agentes activos mencionados en esta especificación pueden existir en diferentes formas, tales como ácidos libres, bases libres, ésteres y otros profármacos, sales y tautómeros, por ejemplo, y la invención incluye todas las formas variantes de los agentes.
En toda la descripción y reivindicaciones de esta especificación, el singular incluye el plural al menos que el contexto requiera otra cosa. En particular, donde se usa el artículo indefinido, se debe entender que la especificación contempla la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto requiera otra cosa.
Se debe entender que las peculiaridades, enteros, características, compuestos, porciones químicas o grupos descritos junto con un aspecto, modalidad o ejemplo particular de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, modalidad o ejemplo descritos en la presente a menos que sean incompatibles con los mismos.
En toda la descripción y reivindicaciones de esta especificación, las palabras "comprender" y "contener" y variantes de las palabras, por ejemplo, "que comprende" y "comprende", significan "incluyendo mas no limitado a", y no se pretende que excluyan (y no excluyan) otras porciones, aditivos, componentes, enteros o pasos.
En general, se pretende que el término "aproximadamente" incluya un rango de 10% o menos de cualquier valor numérico al cual es aplicado.
Otros aspectos y modalidades de la invención se exponen en la siguiente descripción y reivindicaciones.
La invención se describirá ahora a manera de ejemplos solamente con referencia a las siguientes figuras en las cuales: Figura 1 : actividad antibacteriana de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de plancton P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figura 2: actividad antibacteriana de combinaciones de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de plancton P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figura 3: actividad antibacteriana de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de plancton S. aureus DSM 11729.
Figura 4: actividad antibacteríana de combinaciones de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de plancton S. aureus DSM 11729.
Figura 5: actividad de NP339 contra células de biopelícula de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 6: actividad de NP339 contra células persistentes de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 7: actividad de NP341 contra células de biopelícula de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 8: actividad de NP341 contra células persistentes de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 9: actividad de NM001 (cisteamina) contra células de biopelícula de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 10: actividad de NM001 (cisteamina) contra células persistentes de bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Figura 1 1 : actividad antibacteriana de combinaciones de NP 08 y NM001 (cisteamina) contra células de biopelícula P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figura 12: actividad antibacteriana de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células persistentes P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figura 13: actividad antibacteriana de combinaciones de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células persistentes P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figuras 14A-14D: actividad antibacteriana de combinaciones de NP339 y NM001 (cisteamina) contra células de biopelícula (14A) P. aeruginosa DSM 1 128, (14B) P. aeruginosa ATCC BAA-47, (14C) P. aeruginosa DSM 1299 y (14D) P. aeruginosa ATCC 27853.
Figuras 15A-15B: actividad antibacteriana de combinaciones de NP339 y NM001 (cisteamina) contra células persistentes (15A) P. aeruginosa DSM 1 128 y (15B) P. aeruginosa ATCC BAA-47.
Figura 16: actividad antibacteriana de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de biopelícula S. aureus DSM 1729.
Figura 17: actividad antibacteriana de combinaciones de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células de biopelícula S. aureus DSM 1 1729.
Figura 18: actividad antibacteriana de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células persistentes S. aureus DSM 1 1729.
Figura 19: actividad antibacteriana de combinaciones de NP108 y NM001 (cisteamina) contra células persistentes S. aureus DSM 1 1729.
Figuras 20A-21 B: actividad de los agentes mucolíticos N-acetilcisteina (Figuras 20A y 20B) y NM001 (cisteamina) (Figuras 21A y 21 B) solos y en combinación con NP341 contra células de plancton P. aeruginosa 27853.
Figura 22A: control sin tratar biopelícula de S. aureus después de 24 horas.
Figura 22B: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con NM001 (cisteamina) a 2 mg/ml.
Figura 22C: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con Colistina a 0.2 mg/ml.
Figura 22D: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con péptido NP108 a 2 mg/ml.
Figura 23A: control sin tratar biopelícula de S. aureus después de 24 horas.
Figura 23B: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con NM001 (cisteamina) a 2 mg/ml.
Figura 23C: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con Colistina a 0.2 mg/ml.
Figura 23D: biopelícula de S. aureus 24 horas después de tratamiento con péptido NP108 a 2 mg/ml.
Figura 24A: control sin tratar biopelícula de P. aeruginosa después de 24 horas.
Figura 24B: biopelícula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con NM001 (cisteamina) a 2 mg/ml.
Figura 24C: biopelícula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con Colistina a 0.2 mg/ml.
Figura 24D: biopelícula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con péptido NP108 a 2 mg/ml.
Figura 25A: control sin tratar biopelícula de P. aeruginosa después de 24 horas.
Figura 25B: biopelícula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con NM001 (cisteamina) a 2 mg/ml.
Figura 25C: biopelícula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con Colistina a 0.2 mg/ml.
Figura 25D: biopelicula de P. aeruginosa 24 horas después de tratamiento con péptido NP108 a 2 mg/ml.
Figura 26: actividad de NP432 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de P.aeruginosa PA01.
Figura 27: actividad de NP445 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de P.aeruginosa PA01.
Figura 28: actividad de NP458 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de P.aeruginosa PA01.
Figura 29: actividad de NP462 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de P.aeruginosa PA01.
Figura 30: actividad de NP432 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de S.aureus ATCC25923.
Figura 31 : actividad de NP445 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de S.aureus ATCC25923.
Figura 32: actividad de NP458 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de S.aureus ATCC25923.
Figure 33: actividad de NP462 solo y en combinación con NM001 (cisteamina) o en combinación con NP108 contra biopelicula de S.aureus 25923.
Cuadro 1 : Resumen de la actividad de los agentes antimicrobianos sometidos a prueba contra las cepas de P. aeruginosa gram-negativa y el Staphylococcus spp. gram-positivo.
Cuadro 2: Resumen de la actividad de los agentes antimicrobianos sometidos a prueba contra S. epidermidis, S. aureus y P. aeruginosa.
CUADRO 2 MIC ( g/ml) a pH 7 Exp#1-2 NP Secuencia S. epidermidis S. aureus S. aureus P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa ATCC12228 ATCC25923 DSMZ1 172 DSMZ1128 DSMZ1299 ATCCBAA-47 9 NP432 RRRFRFF <7.8 31 .25 62.5 62.5 15.6 15.6 FRFRRR NP438 HHHFRFF <7.8 >500 >500 >500 500 >500 FRFRRR NP441 HHPRRK >500 >500 >500 >500 >500 >500 PRRPKR HH NP445 KKFPWRL <7.8 500 500 62.5 31.25 31.25 RLRYGR R NP449 KKPRRKP 31.25 250 125 250 125 250 RRPKRKK -cyst NP451 HHPRRK 125 500 500 >500 >500 >500 PRRPKR HH-cyst NP457 RRRRR- 31.25 125 125 >500 >500 250 cyst NP458 RRRRRH 31.25 250 250 250 125 62.5 H-cyst CUADRO 2 (Continuación) MBC (pg/ml) después de MIC a pH 7 Exp#3 NP P. S. S. S. P P. P. aeruginosa epidermidis aureus aureus aeruginosa aeruginosa aeruginosa DSMZ1299 ATCC12228 ATCC25923 DSMZ1 1729 DSMZ1 128 DSMZ1299 ATCCBAA- 47 NP432 16 250 500 250 (2) 32 (2) 250 NP438 125 >500 >500 >500 >500 >500 NP441 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 NP445 62.5 >500 >500 250 125 250 NP449 125 >500 250 500 (2) 250 (2) >500 NP451 >500 125 >500 >500 >500 >500 >500 NP457 >500 125 (2) 62.5 125 (2) >500 >500 >500 NP458 500 125 250 >500 >500 >500 CUADRO 2 (Continuación) Exp# Exp#3 Exp#4 M!C (Mg/ml) pH5.5 MIC (pg/ml) pH5.5, MBC (Mg/ml) a pH5.5 MBC (pg/ml) pH5.5, 320 mM NaCI 320 mM NaCI P. S. P. S. P. S. P. S. P. aeruginosa aureus aeruginosa aureus aeruginosa aureus aeruginosa aureus aeruginosa DS Z1299 1 1729 ATCCBAA- 1 1729 ATCCBAA- 1 1729 ATCCBAA- 1 1729 ATCCBAA- 47 47 47 47 NP432 >500 125 >500 125 >500 125 >500 >500 NP438 >500 125 >500 62.5 >500 >500 >500 >500 NP441 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 NP445 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 NP449 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 NP451 >500 >500 >500 >500 >500 >500 250 >500 >500 NP457 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 NP458 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 EJEMPLOS Actividad de agentes antimicrobianos contra biopeliculas bacterianas Materiales y métodos 1.1 Cepas bacterianas Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, P. aeruginosa BAA-47 (PA01 ), P. aeruginosa DSM1128, P. aeruginosa DSM1299 y S. epidermidis ATCC35984, S. epidermidis ATCC 12228 Staphylococcus aureus 25923 y Staphylococcus aureus DSM 1 1729 (MRSA) resistente a meticilina (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se usaron en este estudio. Cuatro aislados clínicos de P. aeruginosa (NH57388A-D, Hoffmann et al., 2005, 2007) fueron obtenidos y usados para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. 1.2 Preparación de compuestos antimicrobianos Los agentes antimicrobianos sometidos a prueba en este estudio fueron el péptido catiónico NP108, el cual corresponde a poli-L-lisina de 10 -20 kDa, bromhidrato y cisteamina (NM001 ). Ambos agentes se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Gillingham, Reino Unido) y se prepararon soluciones de reserva a 20 mg/ml en 14-18 MQ.cm agua pura (sistema de purificación de agua Purite HP40, Oxon, Reino Unido). Una vez disueltas, las preparaciones fueron esterilizadas por filtración usando filtros de 0.22 pm ( illipore, Watford, Inglaterra) y almacenadas a -20°C.
Los siguientes péptidos antimicrobianos NovaBiotics fueron también investigados.
Los péptidos antimicrobianos NovaBiotics fueron sintetizados por NeoMPS (Strasbourg, Francia) usando síntesis Fmoc y fueron por lo menos 95% puros. 1.3 Preparación del inoculo bacteriano El inoculo bacteriano fue establecido por el método de dilución a partir de cultivos de crecimiento activo en caldo Mueller-Hinton, estandarizado con el estándar de turbiedad McFarland de 0.5 como se describe en el método CLSI M26-A. 1.4 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) Para determinar la prevención de formación de biopelicula, tanto el inoculo bacteriano como los agentes antimicrobianos fueron agregados simultáneamente a las placas. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 24h y la densidad óptica fue leída a 625 nm en un lector de placa de microtitulación (BioTek Powerwave XS, Winooski, EEUU). La MIC se obtuvo como la concentración más baja de agente antimicrobiano mostrando una inhibición total de crecimiento bacteriano. 1.5 Determinación de la Concentración Inhibitoria Fraccionaria ÍFIC] La FIC corresponde a un coeficiente de interacción que indica si la combinación de agentes antimicrobianos es sinergística, aditiva, antagonista o neutra. La FIC se determina comparando la actividad de un agente en combinación (MIC del agente A + agente B) con la actividad del agente solo (MIC del agente A o agente B) como sigue (Singh et al., 2000): FIC = MICA[combinac¡ón) MICA[SOIO] + M lCeicombinación] MICB[SOIO] Combinaciones aditivas de dos agentes antimicrobianos son indicadas por un índice FIC de 1 , mientras que un índice FIC < 1 indica combinaciones sinergísticas. Las combinaciones neutrales darían una FIC entre 1 y 4, un índice FIC superior a 4 indica efectos antagonistas entre los dos agentes antimicrobianos.
La FIC se calculó también para evaluar la interacción de dos agentes antimicrobianos en combinación contra biopelículas bacterianas. Se aplicaron las mismas fórmulas, usando MBEC en lugar de MIC. 1.6 Determinación de la Concentración de Erradicación de Biopelícula Mínima (MBEC) Un volumen total de 100 µ? de inoculo bacteriano en Mueller-Hinton se agregó a cada cavidad de placas de 96 cavidades (placas de desafío) y las placas fueron incubadas a 37°C durante 24h sobre una plataforma de agitación girorrotatoria (Grant-bio PS-3D, Shepreth, Inglaterra) a 24 rpm para permitir la formación de biopelícula.
Las placas de desafío fueron después enjuagadas una vez con PBS estéril (1x) y diluciones consecutivas de dos veces de agentes antimicrobianos en Mueller-Hinton fueron agregadas a las placas de desafío. Las placas de desafío fueron incubadas a 37°C durante 24h en una plataforma de agitación girorrotatoria (Grant-bio PS-3D, Shepreth, Inglaterra) a 24 rpm.
Los sobrenadantes de cada una de las placas de desafío fueron transferidos a placas nuevas y la densidad óptica fue medida a 625 nm en un lector de placa de microtitulación (BioTek Powerwave XS, Winooski, EEUU). La MBEC se obtuvo mediante la concentración más baja de agente antimicrobiano sin mostrar crecimiento bacteriano. 1.7 Estimación de las células persistentes en las biopelículas Después de la transferencia del sobrenadante desde las placas de desafio, las biopelículas fueron enjuagadas una vez con PBS estéril (1 x) y 100 µ! de solución de tinción fluorescente BacLight live/dead (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) que contenía 4 µ? SYT09 y 20 µ? yoduro de propidio (Pl) en PBS estéril (1x) se añadieron a las cavidades de las placas de desafío. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min y la fluorescencia fue leída a 485(ex)/528(em) y 485(ex)/645(em) para SYT09 y fluorescencia Pl, respectivamente en un lector de placa de microtitulación de fluorescencia (BioTek Synergy HT, Winooski, EEUU) con la sensibilidad ajustada a 50 y la posición óptica inferior fue seleccionada. La observación directa de las biopelículas con un microscopio de fluorescencia Axiovert 40 (Zeiss, Gottingen, Alemania) permitió identificar la presencia de bacterias vivas y muertas y se tomaron imágenes de las biopelículas a un aumento de 100 a 400 veces.
La viabilidad relativa de células persistentes fue determinada mediante la relación de mediciones de fluorescencia vivo/muerto y observaciones con el microscopio se usaron para confirmar la presencia o ausencia de células vivas. 2 Resultados 2.1 Prevención de formación de biopelícula A fin de evaluar la prevención de formación de biopelícula por bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas, el inoculo bacteriano y agentes antimicrobianos se agregaron simultáneamente en las placas. El rango de concentraciones de agentes antimicrobianos fue 0-500 pg/ml NP108 y 0-320 Mg/ml cisteamina contra las bacterias P. aeruginosa ATCC BAA-47 gram-negativas y 0-1000 pg/ml NP108 y 0-320 pg/ml cisteamina contra la MRSA gram-positiva. 2.1.1 Actividad contra P. aeruginosa ATCC BAA-47 La MIC de NP108 fue 62.5 pg/ml y 320 pg/ml para cisteamina.
NP108 fue bactericida a 250 pg/ml mientras que cisteamina no fue bactericida hasta 320 pg/ml (los datos no se muestran).
En presencia de 160 pg/ml de cisteamina la MIC de NP108 fue reducida a 31.25 Mg/ml. Cuando la concentración de cisteamina fue duplicada (es decir, 320 p m') no se observó crecimiento a pesar de la concentración de NP108.
La determinación de la FIC para esta combinación indica que los agentes antimicrobianos tienen efectos aditivos (FIC = 1 ). Más aún, actividad bactericida se obtuvo en presencia de 125 ig/vr\ de NP108 y 320 g/ml de cisteamina (los datos no se muestran), lo cual confirma el efecto aditivo de estos agentes. 2.1.2 Actividad contra S. aureus DSM 1 1729 La MIC de NP108 fue 125 pg/ml y más de 320 pg/ml para cisteamina. NP108 fue bactericida a 125 pg/ml mientras que cisteamina no fue bactericida hasta 320 pg/ml (los datos no se muestran).
Concentraciones crecientes de cisteamina mostraron una inhibición de crecimiento más alta para cualquier concentración de NP108 dada. En presencia de 40 pg/ml de cisteamina la MIC de NP108 se redujo a 31.25 pg/ml y a 15.625 µg/ml cuando se añadieron 320 pg/ml de cisteamina.
La determinación de la FIC para esta combinación indica que los agentes antimicrobianos tienen por lo menos efectos aditivos (FIC < 1). Más aún, actividad bactericida se obtuvo en presencia de 31.25 pg/ml de NP108 y = 160 pg/ml de cisteamina así como 62.5 pg/ml de NP108 y > 80 pg/ml de cisteamina (los datos no se muestran), lo cual confirma el efecto aditivo de estos agentes.
El apéndice 1 muestra la actividad en el transcurso del tiempo de los péptidos de arginina lineales cortos (NP339, NP340, NP341 y NP352) contra células de plancton S. aureus DSM 11729.
El apéndice 2 provee un resumen de la actividad de NP108, cisteamina, ambos compuestos en combinación así como la actividad de NP339 y NP341 contra S. aureus DSM 1 1729 y células de plancton P. aeruginosa BAA-47. 2.2 Destrucción de biopeliculas formadas La evaluación de la actividad de NP108 y cisteamina contra biopeliculas bacterianas se llevó a cabo con biopeliculas de 24 h de antigüedad y la actividad de ambos compuestos en combinación se determinó también. La actividad de los agentes antimicrobianos contra biopeliculas bacterianas se determinó por medio de su actividad contra las células de biopelícula y contra las células persistentes. 2.2.1 Actividad de NP339 contra biopeliculas bacterianas La Figura 5 muestra la actividad alta de NP339 contra biopeliculas de 3 especies de Staphylococcus, dando como resultado una MBEC de 156 a 625 pg/ml. Es probable que el incremento en densidad óptica a la dosis más alta de NP339 contra S. aureus 25923 sea un error debido a la naturaleza compleja y heterogénea de las biopeliculas microbianas. En contraste NP339 redujo el crecimiento de P. aeruginosa BAA-47 (PA01), pero aún la dosis más alta sometida a prueba (es decir, 5 mg/ml) no fue suficiente para inhibir 100% de las células de biopelícula.
La Figura 6 provee evidencia de que NP339 es activo contra células persistentes. A diferencia de la actividad de NP339 contra las células de biopelícula de las 4 cepas sometidas a prueba, fue menos activo contra las células persistentes de especies de Staphylococcus que aquellas de P. aeruginosa BAA-47 (PA01 ). NP339 fue capaz de inhibir la viabilidad de células persistentes P. aeruginosa BAA-47 (PA01 ) a 625 pg/ml. 2.2.2 Actividad de NP341 contra biopelículas bacterianas De manera similar a NP339 (Figura 5), NP341 mostró una reducción significativa en la viabilidad de células de biopelicula. La MBEC para MRSA 1 1729 y S. epidermidis 12228 fue 625 pg/ml. NP341 redujo la viabilidad de células de biopelicula de MRSA 1 1729 y P. aeruginosa BAA-47 (PA01) en un factor de 2 a 3 veces.
Como se ve con NP339, la viabilidad de células persistentes de P. aeruginosa fue totalmente inhibida a 625 pg/ml NP341. La viabilidad de las células persistentes de las 3 especies de Staphylococcus fue reducida en 25 a 50%. 2.2.3 Actividad de cisteamina contra biopelículas bacterianas La Figura 9 provee evidencia de que la cisteamina tiene actividad antimicrobiana contra células de biopelicula de las bacterias gram-positivas y gram-negativas sometidas a prueba.
La Figura 10 muestra la actividad de la cisteamina contra células persistentes de las bacterias gram-negativas y gram-positivas sometidas a prueba.
Los resultados presentados aquí muestran la actividad antimicrobiana de los péptidos catiónicos cortos lineales NP339 y NP341 contra biopelículas de bacterias gram-positivas y gram-negativas. Estos compuestos parecen más efectivos contra las células de biopelicula de bacterias gram-positivas que bacterias gram-negativas, mientras que es lo opuesto contra células persistentes. La cisteamina mostró actividad contra células de biopelícula a concentraciones altas; sin embargo, suprimió la viabilidad de células persistentes tanto gram-positivas como gram-negativas a la concentración más baja sometida a prueba (es decir, 6.25 mg/ml). 2.2.4 Actividad de NP108 y cisteamina en combinación contra P. aeruainosa ATCC BAA-47 La combinación de estos dos agentes antimicrobianos mostró una completa inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de 250 pg/ml NP108 y 62.5 a 500 pg/ml cisteamina. La adición de 31.25 pg/ml cisteamina a 500 pg/ml NP108 tuvo un efecto similar, mientras que 31.25 pg/ml cisteamina más 250 pg/ml NP108 mostraron solamente una inhibición parcial del crecimiento bacteriano.
La FIC obtenida con esos valores MBEC (MBECNpio8[soio) > 500 pg ml, MBECNPl08[comb¡nac¡ón] = 250 pg ml, MBECc¡steam¡na[comb¡nación] = 62.5 pg/ml, MBECc¡steam¡na[soio] = > 100,00 pg/ml,) fue ~ 0.5, lo que indica un efecto sinerglstico entre estos dos agentes antimicrobianos. Esto es consistente con las observaciones realizadas de la actividad de la combinación NP 08 / cisteamina contra las células de plancton (Figura 2).
La actividad de NP108 y cisteamina contra las células persistentes fue evaluada usando un método de tinción de fluorescencia para determinar la viabilidad relativa de las células. Las moléculas fluorescentes que se unen a ácido nucleico usadas fueron SYT09 y Pl, las cuales penetran todas las células bacterianas (fluorescencia verde) y células con la membrana rota (fluorescencia roja), respectivamente. Por lo tanto la relación de fluorescencia verde (vivo)/roja (muerto) emitida da una indicación de la viabilidad relativa de la población bacteriana y se usa para estimar la presencia de células vivas residuales correspondientes a células persistentes dentro de la biopelícula.
La Figura 12 muestra que la viabilidad relativa de las biopelículas tratadas ya sea con NP108 o cisteamina siguió siendo significativa, indicando la falta de actividad de estos compuestos contra las células persistentes de P. aeruginosa JCC AA-47.
La Figura 13 provee evidencia de que la combinación de NP108 y cisteamina mostró una actividad más alta contra las células persistentes de P. aeruginosa ATCC BAA-47 que cualquiera de los dos compuestos solo (Figura 12). Las combinaciones más eficientes contra esas células fueron 250-500 g/ml NP108 y 62.5-500 pg/ml cisteamina. Estas combinaciones mostraron la viabilidad relativa más baja dentro de las biopelículas. Resultados similares se obtuvieron con 31.25 pg/ml NP108 y 500 pg/ml cisteamina con solamente inhibición parcial observada con 250 pg/ml cisteamina.
La actividad de estos compuestos contra células persistentes muestra similitudes con el perfil de combinaciones óptimas obtenidas contra las células de biopelícula (Figura 1 1 ). Más aún, observaciones con el microscopio directas de las biopelículas teñidas en forma fluorescente confirmaron la actividad de estas combinaciones contra las células persistentes ya que no se pudieron observar células vivas en presencia de 250-500 pg/ml NP108 y 62.5-500 pg/ml cisteamina (los datos no se muestran). 2.2.5 Actividad de NP339 y cisteamina en combinación contra P. aeruginosa Las Figuras 14A-14D muestran la actividad de 3 concentraciones de NP339: 1 pg/ml, 10 pg/ml y 100 pg/ml en combinación con concentraciones crecientes de cisteamina hasta 10 mg/ml contra 4 cepas de Pseudomonas aeruginosa.
Estos datos demuestran claramente la actividad antimicrobiana incrementada contra células de biopelícula de P. aeruginosa de NP339 en combinación con cisteamina. Las siguientes figuras muestran ejemplos de la actividad de estas combinaciones contra células persistentes de 2 de estas cepas.
La Figura 16 muestra la actividad de NP108 y cisteamina contra células de biopelícula S. aureus DSM 1 1729. La MBEC para cisteamina fue 250 pg/ml, mientras que NP 08 inhibió el crecimiento de esas células a 125 pg/ml.
La combinación de NP108 y cisteamina mostró una completa inhibición del crecimiento bacteriano en presencia de 31.25 pg/ml NP108 y 62.5 pg/ml cisteamina y una inhibición parcial con concentraciones más bajas de cualquiera de los dos compuestos (Figura 17). Por ende, la FIC obtenida con esas MBEC (MBECNPIO8[SOIO] 125 pg/ml, MBECNPio8[comt>¡nac¡ón] = 31 .25 g/ml, MBECc¡steamina[soio] = 250 Mg/ml, MBECc¡steam¡na[combinac¡ón] = 62.5 g/ml) fue 0.5 indicando así un efecto sinergistico entre estos dos agentes antimicrobianos contra la biopelícula de estas bacterias gram-positivas. Resultados similares se observaron para biopelícula bacteriana gram-negativa (Figura 1 1 ). Asimismo esto es consistente con las observaciones realizadas a partir de la actividad de la combinación NP 08 / cisteamina contra la células de plancton de S. aureus DSM 1 1729 (Figura 4).
De manera similar a la falta de actividad observada contra células persistentes P. aeruginosa ATCC BAA-47 (Figura 12), la viabilidad relativa de las biopelículas de S. aureus DSM 1 1729 tratadas ya sea con NP108 o cisteamina siguió siendo significativa, indicando la falta de actividad de estos compuestos a concentraciones bajas contra las células persistentes de estas bacterias gram-positivas (Figura 8).
La combinación de NP108 y cisteamina mostró una actividad más alta contra las células persistentes de S. aureus DSM 1 1729 que cualquiera de los dos compuestos solos (Figura 19). Las combinaciones más eficientes contra esas células fueron 250-500 Mg/ml NP108 y 125-250 g/ml cisteamina. Estas combinaciones mostraron la viabilidad relativa más baja dentro de las biopelículas. Resultados similares se obtuvieron con 62.5 Mg/ml NP108 y 500 ^g/vn\ cisteamina. Las combinaciones con concentraciones más bajas de cualquiera de los dos compuestos mostraron una viabilidad relativa alta dentro de las biopelículas.
A diferencia de las células persistentes gram-negativas, observaciones con el microscopio directas de las biopelículas de S. aureus DSM 1 1729 teñidas en forma fluorescente indicaron la presencia de células vivas residuales a las concentraciones combinadas más altas de NP108 y cisteamina (los datos no se muestran).
El Cuadro 1 provee un resumen de la actividad de los péptidos de arginina cortos NP339, NP341 , la poli-L-lisina NP108, cisteamina y la combinación de NP108 con cisteamina contra bacterias gram-positivas y gram-negativas.
Cuadro 1 : Resumen de la actividad de los agentes antimicrobíanos sometidos a prueba contra la cepas de P. aeruginosa gram-negativas y la Staphylococcus spp. gram-positiva. El número entre paréntesis indica el número máximo de cepas sometidas a prueba. MIC: concentración de inhibición mínima; MBEC: concentración de erradicación de biopelícula mínima; FIC: concentración inhibitoria fraccionaria.
CUADRO 1 P. aeruginosa Staphylococcus cepas (7) SPP (4) MIC (Mg/ml) NP108 31.25 - 500 16 - 125 NP339 62.5 4 - 128 NP341 31.25 250 Cisteamina 300 - 2,500 300 - 625 NP108/ Cisteamina 31.25/160 31.25/40 FIC: NP108/ Cisteamina 1 0.6 MBEC (pg/ml) NP108 250 - >500 125-250 NP339 >5,000 156-625 NP341 >5,000 625 - >5,000 Cisteamina >5,000 > 25,000 NP108/ Cisteamina 125/125- 31.25/62.5- 250/62.5 125/125 FIC: NP108/ Cisteamina <0.75 0.5- 1 Células persistentes (Mg/ml) NP108 250 - >500 >500 NP339 625 625 - >5,000 NP341 625 625 - >5,000 Cisteamina 500 - 6,250 6,250 - 12,500 NP108/ Cisteamina 62.5/250 - >250/>250 250/62.5 FIC: NP108/ Cisteamina 0.75-1 <0.5 Notas. 1 El Apéndice 1 muestra la MIC de los antimicrobianos de arginina cortos sometidos a prueba contra Staphylococcus aureus DSM 11729. 2 El Apéndice 2 muestra la actividad de los agentes mucolíticos cisteamina y N-acetilcisteina en combinación con NP341 contra P. aeruginosa ATCC 27853.
Apéndice 1 : Los datos (no se muestran) demuestran la actividad de péptidos de arginina lineales cortos durante un período de 48 h contra células de plancton de S. aureus (MRSA) DSM 11729 resistente a meticilina. El rango de concentraciones sometidas a prueba como se muestra en las leyendas es en mg/ml. Los datos (no se muestran) demuestran la actividad de péptidos de arginina lineales cortos durante un periodo de 48 h contra células de plancton de S. aureus (MRSA) DSM 1 1729 resistente a meticilina. La actividad en el transcurso del tiempo demuestra que la inhibición del crecimiento bacteriano está asociada con la dosis de agente antimicrobiano y con el tiempo de exposición a las células. Una actividad bactericida completa se observó para NP339, NP 340 y NP352 a concentraciones superiores a 0.5 mg/ml durante el periodo de 48 h; 0.125 y 0.25 mg/ml mostraron una inhibición completa durante al menos 24 h, y concentraciones más bajas tales cómo 0.06 y 0.03 mg/ml mostraron una inhibición completa durante al menos 20 h y 15 h, respectivamente. Resultados similares se obtuvieron con NP341 , excepto que 0.25 mg/ml mostró una inhibición completa durante el periodo de 48 h.
Apéndice 2: En combinación con 3-6 mg/ml de N-acetilcisteina, sin embargo, solamente 205 g/ml de NP341 son necesarios para alcanzar la MBEC (Figura 20A). Una actividad incrementada similar para la combinación de estos 2 compuestos se observó contra células persistentes: 1024 pg/ml NP341 + 3128 pg/ml N-acetilcisteína inhibieron aproximadamente 75% de las células persistentes, que es una inhibición mucho más alta que aquella obtenida con cualquiera de los dos compuestos solo (Figura 20B).
La combinación de cisteamina o N-acetilcisteina con NP341 muestra una actividad antibacteriana incrementada en comparación con la actividad de cualquiera de los dos compuestos solo. La MBEC de NP341 solo contra P. aeruginosa ATCC27853 fue más de 2 mg/ml y más de 100 mg/ml para cisteamina (Figura 21A). Esto indica que no hay efecto cooperativo entre los dos compuestos contra las células de biopelícula de P. aeruginosa ATCC27853. No obstante, dicha cooperación fue observada contra las células persistentes: 205 pg/ml NP341 + 3 mg/ml cisteamina inhiben aproximadamente 75% de las células persistentes, que es mucho más alto que cualquiera de los dos compuestos solo (Figura 21 B).
Cuando se usa en combinación con NP339, se observó que la adición de cisteamina aún en pequeñas cantidades ayuda a reducir los valores MBEC de NP339 (Figuras 14A-14D). De manera más interesante, la combinación de NP339 y cisteamina mostró también una actividad incrementada contra células persistentes de P. aeruginosa DSM 128 y P. aeruginosa BAA-47 (Figuras 15A-15B).

Claims (57)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un producto que comprende al menos dos agentes antibiopelicula en donde al menos uno de los agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano.
2. - El producto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el otro agente antibiopelicula es un dispersante o un agente antiadhesivo.
3. - El producto de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque el péptido antimicrobiano es un péptido antibacteriano.
4. - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el péptido antimicrobiano comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula I: en donde I y m son enteros de 1 a 10, por ejemplo, 1 a 5; n es un entero de 1 a 10; X y Y, que pueden ser iguales o diferentes, son independientemente un aminoácido hidrofóbico o catíónico.
5. - El producto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el péptido antimicrobiano comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula (I) en donde X y Y son aminoácidos catiónicos.
6 - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el péptido antimicrobiano comprende entre 2 y 200 aminoácidos.
7.- El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque X y/o Y son aminoácidos catiónicos.
8. - El producto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque X y/o Y se seleccionan del grupo que consiste de histidina, arginina y lisina.
9. - El producto de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque X y/o Y se seleccionan de arginina y lisina.
10. - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado además porque el dispersante es un agente capaz de dispersar las partículas de una biopelícula.
11. - El producto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el dispersante es un agente mucolítico.
12. - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 , caracterizado además porque el dispersante es una enzima.
13. - El producto de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la enzima se selecciona del grupo que consiste de ADNasa, alginasa, proteasa y carobohidrasa.
14 - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado además porque el dispersante es una amina.
15 - El producto de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la amina es un aminotiol.
16 - El producto de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la amina se selecciona de acetilcisteína y cisteamina.
17 - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado además porque el dispersante es un ácido.
18 - El producto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el ácido es ácido etilendiamintetraacético (EDTA).
19 - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado además porque el agente antiadhesivo es un agente capaz de inhibir la adhesión entre células, proteínas y organismos.
20. - El producto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el agente antiadhesivo se selecciona del grupo que consiste de hialuronano, heparina y Carbopol 934.
21. - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende una cantidad sinergísticamente efectiva de (i) un primer agente antibiopelícula, y (ii) un segundo agente antibiopelícula en donde el segundo agente antibiopelícula es diferente del primer agente antibiopelícula y es un péptido antimicrobiano.
22 - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para usarse como un desinfectante o biocida.
23. - El producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para usarse como un medicamento.
24. - Un sustrato al cual un producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores es aplicado o adherido.
25. - El sustrato de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste de apositos, dispositivos médicos y dispositivos permanentes.
26. - El sustrato de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el dispositivo permanentes se selecciona del grupo que consiste de stents, catéteres, tubos de diálisis peritoneal, dispositivos de drenado, prótesis de articulaciones e implantes dentales.
27. - Una composición farmacéutica que comprende un producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y uno o más diluyentes, excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
28 - El uso del producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana o enfermedad o condición asociada con la misma.
29. - El uso de un péptido antimicrobiano que comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula I como se define en la reivindicación 4 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una infección microbiana o enfermedad o condición asociada con la misma.
30. - El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29 en donde la infección, o enfermedad o condición asociada con la misma, se selecciona del grupo que consiste de infecciones de la piel y de heridas, infecciones del oído medio, infecciones del tracto gastrointestinal, infecciones de la membrana peritoneal, infecciones del tracto urogenital, infecciones del tejido blando oral, formación de placa dental, infecciones de los ojos, endocarditis, infecciones en fibrosis quística, e infecciones de dispositivos médicos permanentes.
31. - Un método de prevención de formación de biopelícula en un ambiente que comprende el paso de administrar al ambiente un producto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 o un sustrato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en donde el ambiente no es un cuerpo animal.
32. - Un método de prevención de formación de biopelícula en un ambiente que comprende el paso de administrar al ambiente un péptido antimicrobiano que comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula I como se define en la reivindicación 4, en donde el ambiente no es un cuerpo animal.
33. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 y 32, caracterizado además porque el ambiente comprende un microorganismo formador de biopelícula seleccionado de bacterias, hongos, levaduras, virus y protozoarios.
34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque el microorganismo es una bacteria.
35 - El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la bacteria se selecciona del grupo que consiste de Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Burkholderia spp. , Streptococcus spp. , Propionibacterium spp.
36.- El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado además porque la bacteria se selecciona de Pseudomonas spp. , y Staphylococcus spp.
37. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la bacteria es Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermidis.
38. - El método de conformidad con la reivindicación 32 para la prevención de la formación de placa o caries o implante dental.
39. - El uso de un primer agente antibiopelícula; y un segundo agente antibiopelícula diferente del primero; en donde al menos uno del primer y segundo agentes antibiopelícula es un péptido antimicrobiano, en la elaboración de un medicamento para tratar o prevenir una infección microbiana en donde el primer agente antibiopelícula y el segundo agente antibiopelícula están adaptados para ser administrables de manera consecutiva o simultánea.
40 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde el primer agente antibiopelícula es un péptido antimicrobiano y el segundo agente antibiopelícula se selecciona de un dispersante y un agente antiadhesivo.
41 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39 o 40, en donde la infección microbiana es una infección tópica.
42 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 41 , en donde la infección tópica se selecciona de una herida, úlcera y lesión.
43 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39 o 40, en donde la infección microbiana es una infección oral.
44. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 43, en donde la infección oral se selecciona de gingivitis, periodontitis y mucositis.
45. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39 o 40, en donde la infección microbiana es una infección sistémica.
46 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la infección sistémica es una infección de las mucosas.
47. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 46, en donde la infección de las mucosas es una infección gastrointestinal, urogenital o respiratoria.
48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 46 o 47, en donde la infección de las mucosas es fibrosis quística.
49. - Un método de tratamiento o prevención de formación de biopelicula en un ambiente que comprende administrar a dicho ambiente una cantidad efectiva de cisteamina, en donde el ambiente no es un cuerpo animal.
50. - El uso de una cisteamina en la elaboración de un medicamento en el tratamiento de una infección microbiana, en particular una infección por biopelicula microbiana.
51. - El uso de un péptido antimicrobiano que comprende aminoácidos de acuerdo con la fórmula I como se define en la reivindicación 4 en la elaboración de un medicamento para prevenir la formación de biopelicula en la boca.
52. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 51 , en donde el microorganismo formador de biopelicula se selecciona de bacterias, hongos, levaduras, virus y protozoarios.
53. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde el microorganismo es una bacteria.
54. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 53, en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Pseudomonas spp. ; Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Burkholderia spp.; Streptococcus spp. , Propionibacterium spp.
55.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 54, en donde la bacteria se selecciona de Pseudomonas spp.; y Staphylococcus spp.
56.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 55, en donde la bacteria es Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus o Staphylococcus epidermis.
57 - El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 51-56, para la prevención de la formación de placa o caries en un diente humano.
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