WO2014016979A1 - 微生物活性調節剤及び微生物の活性を調節する方法 - Google Patents

微生物活性調節剤及び微生物の活性を調節する方法 Download PDF

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activity
homoserine lactone
activity regulator
microorganism
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稲葉　英樹
庸平 橋本
野村　暢彦
雅典 豊福
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住友重機械工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism activity regulator and a method for regulating the activity of microorganisms.
  • microorganisms transmit information through intercellular signal transmitters (hereinafter referred to as “signal substances”) and control the secretion of pathogenic substances and biofilm production depending on the density of the microorganisms. It has been.
  • signal substances intercellular signal transmitters
  • Such an information transmission mechanism is called quorum sensing (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a microbial activity regulator with improved operability.
  • the present invention also aims to provide a method for regulating the activity of microorganisms.
  • the present invention provides a microbial activity regulator comprising a microbial activity regulator and a transport medium.
  • the present invention also provides the use of a composition comprising a microbial activity modulator and a carrier medium for microbial activity modulation.
  • the microbial activity regulator or use of the present invention described above regardless of whether the microbial activity regulator is hydrophilic or not, it can be easily added to an aqueous system to diffuse the microbial activity regulator into the environment where microorganisms are present. Can be delivered to the microorganism, and the activity of the microorganism can be efficiently regulated. For this reason, the operability of the microbial activity regulating substance can be improved.
  • the above-mentioned microbial activity-regulating substance may be one or more substances selected from the group consisting of a signal substance, a nucleic acid that affects prokaryotic activity, and a protein that affects prokaryotic activity.
  • the activity of the microorganism can be regulated.
  • the transport medium may be one or more substances selected from the group consisting of liposomes, vesicles, micelles, emulsions, peptides, proteins, metal nanoparticles, carbon nanotubes, fullerenes and polymers.
  • the polymer as the transport medium may be in the form of a hydrogel, nanosphere, microsphere, or dendrimer.
  • the microbial activity regulator or use of the present invention can further improve the operability of the microbial activity regulator by including such a transport medium.
  • the transport medium may be modified with a sugar chain, an antibody, or a polymer.
  • the polymer that modifies the delivery medium may be in the form of a hydrogel, nanosphere, microsphere, or dendrimer.
  • the carrier medium is modified with these substances, so that the above-mentioned microbial activity regulator can be selectively delivered to microorganisms having a specific antigen, or the survivability (remaining time) of the microbial activity regulator can be adjusted. Is possible.
  • microorganism activity regulator or use may be for microorganisms present in a reaction tank of a biological wastewater treatment facility.
  • the above microbial activity regulator or use is particularly suitable for regulating the activity of microorganisms involved in wastewater treatment.
  • the present invention also provides a method for regulating the activity of a microorganism, comprising the step of administering the above-mentioned microorganism activity regulator to a microorganism.
  • the activity of microorganisms can be adjusted easily and efficiently.
  • the present invention is also a method for adjusting the activity of microorganisms present in a reaction tank of a biological wastewater treatment facility, the step of adding the above microorganism activity regulator to the reaction tank of a biological wastewater treatment facility.
  • a method comprising:
  • the activity of microorganisms present in the reaction tank of the biological wastewater treatment facility can be adjusted easily and efficiently. For this reason, the waste water treatment performed in the reaction tank can be promoted or suppressed as necessary.
  • a microbial activity regulator with improved operability can be provided.
  • the method of adjusting the activity of microorganisms can be provided.
  • the microbial activity regulator of the present invention comprises a microbial activity regulator and a transport medium.
  • the microbial activity regulating substance include an intercellular signal transduction substance (signal substance), a nucleic acid that affects the prokaryotic activity, a protein that affects the prokaryotic activity, and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the microbial activity regulating substance may be a substance that improves the activity of the microorganism or a substance that decreases the activity of the microorganism.
  • Signal substances include N-acyl-L-homoserine lactones, AI2 (4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione), HHQs (2-alkyl-4-quinolone), PQSs (2-alkyl- Quinolones and quinolines such as 3-hydroxy-4-quinolone), indoles, peptides, cyclic dipeptides, diketopiperazines and the like.
  • N-acyl-L-homoserine lactones include N-butanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxobutanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone, N- -Pentanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxopentanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxypentanoyl-L-homoserine lactone, N-hexanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxohexanoyl -L-homoserine lactone, N-3-hydroxyhexanoyl-L-homoserine lactone, N-heptanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxoheptanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxyheptan
  • the signal substance may be prepared by chemical synthesis, or may be prepared by purifying the signal substance secreted into the medium by the signal substance-producing bacteria. Moreover, you may use the culture of a signal substance producing microbe as a signal substance, without refine
  • the signal substance-producing bacteria include Gram-negative bacteria such as Paracoccus, Burkholderia, Pseudomonas, Vibrio, Aeromonas, Bacillus, Streptomyces, Streptococcus, and Lactobacillus.
  • nucleic acids that affect the activity of prokaryotes include enzymes involved in protein synthesis and synthesis inhibition, and DNA and RNA encoding ATP synthase expression. These DNAs are preferably linked downstream of the promoter so that they can be expressed.
  • Nucleic acids that affect the activity of prokaryotes can be obtained by PCR or the like using prokaryotic genomic DNA such as E. coli and Bacillus as a template. Nucleic acids that affect the activity of prokaryotes are cloned into vectors such as pGEM (Promega), pBluescript (Stratagene), pUC (Takara Bio Inc.), and introduced into Escherichia coli, for example. Can be maintained. Moreover, it can prepare in large quantities from the said E. coli if necessary.
  • Proteins that affect prokaryotic activity include polymerases, galactosidases, proteases, and the like.
  • Proteins that affect the activity of prokaryotes may be prepared by purification from microorganisms that produce the proteins, for example.
  • an expression vector incorporating a DNA encoding a protein that affects the prokaryotic activity may be expressed in a large amount in a body such as Escherichia coli and purified for preparation.
  • the microbial activity regulator includes a microbial activity regulator and a transport medium.
  • the carrier medium may contain a microbial activity-regulating substance, or may form a complex with the microbial activity-regulating substance by a covalent bond or a non-covalent bond.
  • Specific examples of the transport medium include liposomes, vesicles, micelles, emulsions, peptides, proteins, metal nanoparticles, carbon nanotubes, fullerenes, polymers, and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
  • Liposomes are vesicles composed of a lipid bilayer composed mainly of phospholipids.
  • phospholipid phosphatidylcholine, sphingomyelin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, cholesterol and the like can be used.
  • Liposomes incorporating a hydrophobic substance can be easily added to water and allowed to diffuse.
  • a vesicle is a vesicle formed of a lipid bilayer having the same structure as a liposome, and is secreted by microorganisms.
  • Micelle is a collection of amphiphilic compounds in a spherical shape.
  • the lipophilic part of the amphiphilic compound is gathered toward the center of the sphere and the hydrophilic part is gathered towards the outside of the sphere. For this reason, the micelle can take in a hydrophobic substance and dissolve it in water.
  • the amphiphilic compound include a copolymer of a hydrophilic polymer (such as polyethylene glycol) and a hydrophobic polymer (such as polyamino acid).
  • Emulsion is one in which two liquids that do not mix together become fine droplets and are dispersed in the other phase.
  • an oil phase in which a hydrophobic substance is dissolved, it can be easily diffused into water.
  • the oil phase include cyclohexane, dodecane, and ethyl acetate.
  • Examples of carbon nanotubes that can be used as a transport medium include single-walled carbon nanotubes and multi-walled carbon nanotubes. By utilizing the hydrophobic properties of carbon nanotubes and the space inside, it is possible to attach a substance and use it as a transport medium. A commercially available carbon nanotube can be used.
  • Fullerene is a spherical substance composed of many carbon atoms.
  • Examples of the fullerene that can be used as a transport medium include C 60 fullerene and higher-order fullerene having 70 , 74 carbon atoms and the like.
  • Various substances can be attached to fullerenes by covalent bonding or the like and used as a transport medium.
  • polymers that can be used as a transport medium include polyethyleneimine, polyamidoamine, and polyethylene glycol. These polymers can be used as a transport medium because they can stably hold a substance inside by interaction with the substance. It is also characterized by being able to be stably maintained in an environment where microorganisms are present.
  • the polymer as the transport medium may be in the form of a hydrogel, nanosphere, microsphere or dendrimer. Since these polymers form a three-dimensional structure, they are suitable as a carrier medium.
  • Hydrogel is a polymer that is cross-linked to form a three-dimensional network structure, and has a solvent incorporated therein.
  • a substance can be encapsulated in a solvent.
  • Specific examples of the hydrogel include gelatin, carboxymethylcellulose, collagen, alginic acid, acrylamide, and polyvinyl alcohol.
  • a spherical substance composed of a polymer having a diameter of 1 ⁇ m or less is called a nanosphere. Moreover, a thing with a diameter of several micrometers is called a microsphere. Substances can be encapsulated in nanospheres and microspheres by the interaction between the polymer and the substance. Specific examples of the nanosphere / microsphere include a lactic acid glycolic acid copolymer.
  • Dendrimer is a spherical polymer with a regularly branched structure. Substances can be held in the internal space by ionic interaction. Specific examples of the dendrimer include polyamidoamine and porphyrin.
  • the microbial activity regulator includes a microbial activity regulator and a transport medium.
  • the microbial activity regulator can be prepared, for example, as follows. First, a phospholipid dissolved in an organic solvent is mixed with a microbial activity-regulating substance solution. Subsequently, after removing the organic solvent, purified water is added and heated to a temperature equal to or higher than the phase transition temperature of the phospholipid. Thereby, a liposome can be produced. At this time, the microbial activity-regulating substance can be encapsulated in the liposome by a hydrophobic interaction between the phospholipid and the microbial activity-regulating substance.
  • the microbial activity regulator can be prepared, for example, as follows.
  • a microorganism that secretes the target microbial activity regulating substance in the form of a vesicle is cultured in the medium
  • the vesicle encapsulating the microbial activity regulating substance in the culture is secreted.
  • This vesicle can be used as a microbial activity regulator.
  • the vesicle encapsulating the microbial activity regulator may be used after being purified from the above culture, or the above culture may be used as a microbial activity regulator without purification.
  • Examples of microorganisms that secrete microbial activity-regulating substances in the form of vesicles include Paracoccus and Pseudomonas.
  • a microbial activity regulator can be prepared by forming micelles by hydrophobic interaction or electrostatic interaction between an amphiphilic compound and a microbial activity regulator.
  • an emulsion When an emulsion is used as the transport medium, it can be prepared, for example, by adding a surfactant to an oil phase in which a microbial activity regulator is dissolved and dispersing it in water.
  • a microbial activity regulator can be prepared by binding the peptide or protein and a microbial activity regulator by a hydrophobic interaction or the like.
  • a microbial activity regulator can be prepared by physically adsorbing metal nanoparticles and a microbial activity regulator.
  • a microbial activity regulator can be prepared by attaching a microbial activity regulator to the surface or modification group of the carbon nanotubes by hydrophobicity, adsorption, or the like.
  • a microbial activity regulator can be prepared by binding a polymer and a microbial activity regulator by a hydrophobic interaction or the like.
  • the microbial activity regulator is retained in the network structure of the hydrogel by swelling the hydrogel in a solvent in which the microbial activity regulator is dissolved or dispersed. Can be prepared.
  • the microbial activity regulator is mixed with the microbial activity regulator by mixing the microbial activity regulator and the nanosphere / microsphere in a solvent.
  • a microbial activity regulator can be prepared by encapsulating in nanospheres or microspheres.
  • the microbial activity is regulated in the internal space of the dendrimer by the hydrophobic interaction and ionic interaction between the dendrimer and the microbial activity modulator by mixing the microbial activity modulator and the dendrimer in a solvent.
  • the substance can be retained.
  • the carrier medium may be modified with a sugar chain, an antibody or a polymer. Since the carrier medium is modified with these substances, it becomes possible to selectively deliver the above-mentioned microbial activity regulator to a microorganism having a specific antigen or to regulate the persistence of the microbial activity regulator.
  • the sugar chain that modifies the transport medium include oligosaccharide, galactose, and fucose.
  • the antibody that modifies the transport medium include those that use lipopolysaccharide, flagella, capsule, pili and the like as antigens.
  • the polymer that modifies the transport medium include polyethylene glycol, polyethyleneimine, and polyamidoamine.
  • the polymer that modifies the delivery medium may be in the form of a hydrogel, nanosphere, microsphere, or dendrimer.
  • Examples of the method for modifying the transport medium with a sugar chain, an antibody or a polymer include a method of binding a sugar chain, an antibody or a polymer to a molecule constituting the transport medium using a chemical cross-linking agent.
  • Chemical crosslinking agents include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
  • the activity of the microorganism can be regulated.
  • the microbial activity refers to an activity in which a microorganism decomposes a specific substance (pollutant substance). Improvement of microbial activity means that the ability of a unit amount of microorganisms to decompose a specific pollutant is improved. In addition, a decrease in microbial activity means a decrease in the ability of a unit amount of microorganisms to decompose a specific pollutant.
  • the pollutant examples include saccharides such as glucose and maltose; alcohols such as methanol; aldehydes such as formaldehyde; organic solids such as straw; starch, protein, ammonia, nitrate, dimethyl sulfoxide (DMSO), and the like.
  • saccharides such as glucose and maltose
  • alcohols such as methanol
  • aldehydes such as formaldehyde
  • organic solids such as straw
  • starch protein, ammonia, nitrate, dimethyl sulfoxide (DMSO), and the like.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • microorganisms in which the above-described microbial activity improver effectively acts include Vibrio, Aeromonas, Streptomyces, Streptococcus, Lactobacillus, Alcaligenes, Ralstonia, Achromobacter, and Halomonas. ), Burkholderia, Pseudomonas, Rhodobacter, Paracoccus, Sphingobacterium, Flavobacterium, and Flavobacterium.
  • a biofilm is a structure formed by microorganisms, and is formed when microorganisms attached to a substrate secrete extracellular polysaccharides or secretions called EPS (Extracellular Polysaccharide S).
  • EPS Extracellular Polysaccharide S
  • Staphylococcus aureus or the like may form a biofilm in a catheter.
  • Microorganisms in biofilms can be problematic because they are highly resistant to antibiotics and immunity.
  • the activity of microorganisms involved in biofilm degradation in opportunistic infections can be improved, resulting in inhibition of biofilm formation and antibiotics reaching pathogens. It becomes possible.
  • the above-described method for regulating the activity of microorganisms can be applied to various objects such as marine structures and pipelines that are affected by biofilm formation.
  • a microbial battery it can be applied to a technique for forming a dense biofilm on an anode and a cathode.
  • it can be applied to a technology for forming a biofilm to prevent the attachment of large organisms to offshore structures.
  • the microbial activity regulator is for microorganisms present in a reaction vessel of a biological wastewater treatment facility.
  • the activity of the microorganisms present in the reaction tank can be improved or decreased. Thereby, the waste water treatment performed in the reaction tank can be promoted or suppressed as necessary.
  • MLSS Mated liquor suspended solids
  • the measurement of MLSS was performed by the following method. First, the activated sludge sample was placed in a centrifuge tube, centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was discarded. Next, water was added to the resulting precipitate and mixed well, followed by centrifugation in the same manner as above to discard the supernatant. The obtained precipitate was put in a pre-weighed evaporating dish and dried in a dryer at 105 to 110 ° C. for half a day. Subsequently, the mixture was allowed to cool in a desiccator and weighed. The mass obtained by subtracting the mass of the empty evaporating dish from the measured mass was taken as MLSS.
  • C16-HSL N-hexadecanoyl-L-homoserine lactone
  • N-3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone (hereinafter sometimes referred to as “3oxoC12-HSL”) was encapsulated in liposomes to prepare a microbial activity regulator.
  • the composition of the liposome was hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) 29 g / L and cholesterol 13 g / L. Liposomes were made by the following procedure known as the Brugam method.
  • HSPC, cholesterol and 3oxoC12-HSL (1 mM) were dissolved in 10 mL of chloroform. Subsequently, chloroform was removed using an evaporator, and a lipid film was formed on the bottom of the eggplant-shaped flask. Subsequently, a phosphate buffer was added to the eggplant-shaped flask on which the lipid film was formed, and hydrated and dispersed at 60 ° C. while stirring using a vortex mixer. By the above operation, a microbial activity regulator containing 3oxoC12-HSL was obtained.
  • a phosphate buffer hydrated with liposomes was prepared in the same manner as the above-mentioned microbial activity regulator, except that activated sludge was added to the inorganic salt medium and no 3oxoC12-HSL was contained. What added the same volume as a culture medium was used. At the start of the experiment, after 24 hours, 48 hours and 72 hours of culture, the ammonia nitrogen concentration in the medium was analyzed by ion chromatography. The results are shown in FIG. In the system to which a microbial activity regulator containing 3oxoC12-HSL was added, it was shown that the rate of decrease of ammonia nitrogen was increased and the nitrification reaction was accelerated as compared with the negative control.
  • a high homoserine lactone-producing bacterium was screened from activated sludge using a reporter strain that produces violetsein, a violet pigment. More specifically, the strain Chromobacterium violaceum CV026 responding to N-acyl-L-homoserine lactone (C4 to C8-HSL) having 4 to 8 carbon atoms in the acyl group and 10 to 10 carbon atoms in the acyl group.
  • homoserine lactone to which CV026 strain responds includes N-butanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxobutanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxybutanoyl-L-homoserine lactone, N- Pentanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxopentanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxypentanoyl-L-homoserine lactone, N-hexanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxohexanoyl- L-homoserine lactone, N-3-hydroxyhexanoyl-L-homoserine lactone, N-heptanoyl-
  • the homoserine lactone to which the VIR07 strain responds includes N-decanoyl-L-homoserine lactone, N-3-oxodecanoyl-L-homoserine lactone, N-3-hydroxydecanoyl-L-homoserine lactone, N-undecanoyl-L.
  • the activated sludge was diluted and applied to an agar medium to obtain an isolated strain.
  • An isolated strain and a reporter strain obtained from activated sludge were applied to adjacent positions on the agar medium. After culturing for several days, the isolated strain was judged to be a homoserine lactone-producing bacterium for the reporter strain that secreted a purple pigment (violacein).
  • the results are shown in Table 1. In the table, the greater the number of “+”, the greater the amount of violacein produced.
  • the AS6 strain which is a high homoserine lactone-producing bacterium, was obtained.
  • the AS6 strain was deposited on May 18, 2012 at the Patent Microorganism Depositary, National Institute of Technology and Evaluation, under the accession number NITE P-1363.
  • Optiprep trade name, Axis Shield
  • HEPES-NaCl solution 40%, 35, 30, 25, 20, 15, 10 (v / v)% of Optiprep (trade name, Axis Shield) mixed in HEPES-NaCl solution.
  • a gradient layer was formed by overlaying in a centrifuge tube, and a pellet dissolved in a 40 (v / v)% Optiprep-HEPES-NaCl solution was added on top.
  • the gradient was ultracentrifuged at 100,000 ⁇ g for 3 hours. After ultracentrifugation, each layer was collected, protein concentration was determined by Bradford method (Bradford, M. 1976. Anal. Biochem. 72, 248-254.), And Stewart method (Stewart, J. 1980. Anal. Biochem. 104, 10-14.) And the phospholipid concentration was analyzed.
  • a layer having a high protein concentration and a high phospholipid concentration was defined as a layer from which vesicles were extracted
  • C16-HSL produced by the AS6 strain is secreted in the form of vesicles.
  • the operability may be poor, for example, it is necessary to use an organic solvent to dissolve in water.
  • C16-HSL produced by the AS6 strain was hydrophilic because it was secreted in the form of vesicles, and it was revealed that it can be used as it is added to the aqueous system.
  • the attribution taxon of the AS6 strain was estimated by 16S rDNA (16S rRNA gene) base sequence analysis, morphology observation and physiological / biochemical tests.
  • the AS6 strain was cultured on an agar medium at 30 ° C. for 24 hours to extract DNA.
  • the base sequence of 16S rDNA was determined based on the general method described in the above, and homology search with a database and simple molecular phylogenetic analysis were performed. Simplified molecular phylogenetic analysis was performed using the Apollon DB-BA database Ver. 7.0 (trade name, Techno Suruga Laboratories, March 2011 edition, search date May 2, 2012).
  • Fig. 3 shows the results of simple molecular phylogenetic analysis.
  • the lower left line represents the scale bar, and the number located at the branch of the system branch represents the bootstrap value.
  • the T at the end of the stock name indicates that type of reference stock.
  • the base sequence of 16S rDNA of AS6 strain showed high homology to the base sequence of rDNA belonging to the genus Paracoccus.
  • the AS6 strain is contained in a cluster formed by species of the genus Paracoccus, and is closely related to P. versustus and P. bengalerensis. It has been shown. However, there was a possibility that the AS6 strain was attributed to Paracoccus verustus or Paracoccus bengalensis and a different species from these, and the species name was not identified.
  • Morphological observation and physiological / biochemical test Morphological observation with an optical microscope and, for example, “BARROW and FELTHAM, Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition. Based on the method described by the University University, 1993, Cambridge University. Tests were performed for reaction, aoxidase reaction, acid / gas evolution from glucose, and glucose oxidation / fermentation.
  • API20NE kit (trade name, manufactured by bioMerieux), nitrate reduction, indole production, glucose acidification, arginine dihydrolase, urease, esculin hydrolysis, gelatin hydrolysis, ⁇ -galactosidase and thyrochrome oxidase Chemical tests and glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-D-glucosamine, maltose, potassium gluconate, n-capric acid, adipic acid, dl-malic acid, sodium citrate, An assimilation test on phenyl acetate was performed.
  • test for the presence or absence of growth under anaerobic conditions and the presence or absence of growth at 20 ° C. and the assimilation test for glycerol, saccharose, D-fructose, L-alanine, L-sodium aspartate and sodium lactate Went.
  • Results are shown in Tables 2-4.
  • the AS6 strain was a gram-negative bacillus having no motility, did not oxidize glucose, and both the catalase reaction and oxidase reaction were positive.
  • the AS6 strain did not reduce nitrate, assimilated glucose, L-arabinose and D-mannose, and did not assimilate n-capric acid and sodium citrate. These properties were similar to those of Paracoccus verustus and Paracoccus bengalensis but were not completely consistent.
  • the AS6 strain is a bacterium belonging to the genus Paracoccus which is closely related to Paracoccus verustus and Paracoccus bengalensis.

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Abstract

　微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む微生物活性調節剤、及び、上記微生物活性調節剤を微生物に投与する工程を含む、微生物の活性を調節する方法は、操作性が改善されており有用である。

Description

微生物活性調節剤及び微生物の活性を調節する方法
　本発明は、微生物活性調節剤及び微生物の活性を調節する方法に関する。
　微生物は細胞間情報伝達物質（以下、「シグナル物質」という。）を介して情報伝達を行い、微生物の密度に依存して病原性物質の分泌やバイオフィルムの生産を制御していることが知られている。このような情報伝達機構のことをクオラムセンシングという（例えば、非特許文献１を参照）。
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１５，４９５－５０２．
　しかしながら、シグナル物質を含む微生物活性調節物質には、水に不溶性のものが多く存在する。このような微生物活性調節物質を水に溶解するためには、有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。そこで、本発明は、操作性が改善された微生物活性調節物質を提供することを目的とする。本発明はまた、微生物の活性を調節する方法を提供することを目的とする。
　本発明は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、微生物活性調節剤を提供する。また、本発明は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む組成物の微生物活性調節のための使用を提供する。
　上記本発明の微生物活性調節剤又は使用によれば、微生物活性調節物質が親水性であるか否かにかかわらず、容易に水系に添加して微生物の存在する環境中に微生物活性調節物質を拡散させ、微生物に送達することができ、効率よく微生物の活性を調節することができる。このため、微生物活性調節物質の操作性を改善することができる。
　上記の前記微生物活性調節物質は、シグナル物質、原核生物の活性に影響を与える核酸及び原核生物の活性に影響を与えるタンパク質からなる群より選択される１種以上の物質であってよい。
　このような微生物活性調節物質を微生物に送達することにより、微生物の活性を調節することができる。
　上記の運搬媒体は、リポソーム、ベシクル、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン及びポリマーからなる群より選択される１種以上の物質であってよい。また、運搬媒体としてのポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。
　本発明の微生物活性調節剤又は使用は、このような運搬媒体を含むことにより、微生物活性調節物質の操作性をより改善することができる。
　上記の運搬媒体は、糖鎖、抗体又はポリマーで修飾されていてもよい。運搬媒体を修飾するポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。
　運搬媒体がこれらの物質で修飾されていることにより、上記の微生物活性調節剤を選択的に特定の抗原を有する微生物に送達したり、微生物活性調節剤の残存性（残存時間）を調節することが可能になる。
　上記の微生物活性調節剤又は使用は、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用であってもよい。
　上記の微生物活性調節剤又は使用は、特に排水処理に関わる微生物の活性調節に適している。
　本発明はまた、微生物の活性を調節する方法であって、上記の微生物活性調節剤を微生物に投与する工程を含む方法を提供する。
　上記本発明の方法によれば、容易に効率よく微生物の活性を調節することができる。
　本発明はまた、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法であって、生物学的排水処理設備の反応槽に、上記の微生物活性調節剤を添加する工程を含む方法を提供する。
　上記本発明の方法によれば、容易に効率よく生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節することができる。このため、反応槽で行われる排水処理を促進させ、又は、必要に応じて抑制することができる。
　本発明により、操作性が改善された微生物活性調節物質を提供することができる。また、微生物の活性を調節する方法を提供することができる。
硝化反応の促進の結果を示すグラフである。 硝化反応の促進の結果を示すグラフである。 パラコッカスＡＳ６株の簡易分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。
（微生物活性調節物質）
　本発明の微生物活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。微生物活性調節物質としては、細胞間情報伝達物質（シグナル物質）、原核生物の活性に影響を与える核酸、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。微生物活性調節物質は、微生物の活性を向上させる物質であっても、微生物の活性を低下させる物質であってもよい。
　シグナル物質としては、Ｎ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン類、ＡＩ２（４，５－ジヒドロキシ－２，３－ペンタンジオン）、ＨＨＱ類（２－アルキル－４－キノロン）、ＰＱＳ類（２－アルキル－３－ヒドロキシ－４－キノロン）等のキノロン・キノリン類、インドール類、ペプチド、環状ジペプチド、ジケトピペラジン類等が挙げられる。Ｎ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン類としては、例えば、Ｎ－ブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－オクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－デカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－トリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－テトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン等のアシル基の炭素数が４～１６であるＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトンが挙げられるが、これらに限定されない。
　シグナル物質は、化学合成により調製してもよく、シグナル物質産生菌が培地中に分泌したシグナル物質を精製して調製してもよい。また、シグナル物質産生菌の培養物を、精製することなくシグナル物質として使用してもよい。シグナル物質産生菌としては、パラコッカス、バークホルデリア、シュードモナス、ビブリオ、アエロモナス、バチルス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、ラクトバチルスなどのグラム陰性菌が例示できる。
　原核生物の活性に影響を与える核酸としては、タンパク質の合成や合成抑制に関わる酵素やＡＴＰ合成酵素の発現をコードするＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。これらのＤＮＡは、プロモーターの下流に発現可能に連結されていることが好ましい。
　原核生物の活性に影響を与える核酸は、大腸菌、バチルス等の原核生物のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって取得することができる。原核生物の活性に影響を与える核酸は、ｐＧＥＭ（プロメガ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）、ｐＵＣ（タカラバイオ株式会社）等のベクターにクローニングし、例えば大腸菌に導入して大腸菌の菌体内でプラスミドの形態で維持することができる。また、必要に応じて上記大腸菌から大量に調製することができる。
　原核生物の活性に影響を与えるタンパク質としてはポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ等が挙げられる。
　原核生物の活性に影響を与えるタンパク質は、例えば、当該タンパク質を生産する微生物から精製して調製してもよい。あるいは、原核生物の活性に影響を与えるタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを用いて、大腸菌等の体内で大量発現させ、これを精製して調製してもよい。
（運搬媒体）
　微生物活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。運搬媒体は、微生物活性調節物質を内包するものであってもよく、微生物活性調節物質と共有結合又は非共有結合により複合体を形成するものであってもよい。運搬媒体の具体例としては、リポソーム、ベシクル、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン、ポリマー等が挙げられる。これらは１種類を単独で又は複数種類を組み合わせて使用することができる。
　リポソームとは、リン脂質を主成分とする脂質二重膜からなる小胞である。リン脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、コレステロール等を使用することができる。疎水性の物質を取り込んだリポソームは、容易に水に添加して拡散させることができる。
　ベシクルとは、リポソームと同様の構造を有する脂質二重膜で形成された小胞であり、微生物が分泌するものである。
　ミセルとは、両親媒性化合物が球状に集合したものである。ミセルにおいて、両親媒性化合物の親油性部分は球の中心部を向き、親水性部分は球の外側を向いて集合している。このため、ミセルは、疎水性の物質を取り込んで水に溶解させることができる。両親媒性化合物としては、親水性ポリマー（ポリエチレングリコール等）と疎水性ポリマー（ポリアミノ酸等）との共重合体等が挙げられる。
　エマルションとは、混じり合わない二つの液体のうち、一方が微細な液滴となって他方の相の中に分散したものである。疎水性の物質を溶解した油相をエマルション化することで容易に水に拡散させることができる。油相としては、シクロヘキサン、ドデカン、酢酸エチル等が挙げられる。
　運搬媒体として使用可能なペプチド及びタンパク質としては、アルブミン、ａ１－酸性糖タンパク質、エラスチン等が挙げられる。タンパク質やペプチドは、特定の部位に対する親和性が高く、生物に取り込まれやすいため、運搬媒体として使用できる。
　運搬媒体として使用可能な金属ナノ粒子としては、金、白金等が挙げられる。これらの金属ナノ粒子には、チオール基を介してポリエチレングリコール等の様々な化合物を結合させることができるため、様々な物質を付着させて運搬媒体として使用することができる。金属ナノ粒子は、市販のものを使用することができる。
　運搬媒体として使用可能なカーボンナノチューブとしては、単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ等が挙げられる。カーボンナノチューブの有する疎水的性質や、内部に空間を有することを利用して、物質を付着させて運搬媒体として使用することができる。カーボンナノチューブは、市販のものを使用することができる。
　フラーレンは、多数の炭素原子で構成される球状の物質である。運搬媒体として使用可能なフラーレンとしては、Ｃ６０フラーレン及び炭素数７０、７４等の高次フラーレンが挙げられる。フラーレンに共有結合等で様々な物質を付着させて運搬媒体として使用することができる。
　運搬媒体として使用可能なポリマーとしては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらのポリマーは、物質との相互作用により、内部に物質を安定して保持することができるため、運搬媒体として使用することができる。また、微生物の存在する環境内で安定して維持できることも特徴である。
　運搬媒体としてのポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。これらのポリマーは、立体的な構造を形成するため、運搬媒体として適している。
　ハイドロゲルとは、ポリマーが架橋して３次元の網目構造が形成されたものであり、内部に溶媒を取り込んでいる。溶媒中に物質を内包させることができる。具体的なハイドロゲルとしては、例えば、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、アルギン酸、アクリルアミド、ポリビニルアルコールが挙げられる。
　ポリマーで構成される球状の物質で直径１μｍ以下のものをナノスフェアという。また、直径が数μｍのものをマイクロスフェアという。ポリマーと物質との相互作用によりナノスフェア・マイクロスフェアに物質を内包させることができる。具体的なナノスフェア・マイクロスフェアとしては、例えば、乳酸グリコール酸共重合体が挙げられる。
　デンドリマーは、規則的に分岐した構造を持つ球状のポリマーである。イオン相互作用により内部の空間に物質を保持することができる。具体的なデンドリマーとしては、例えば、ポリアミドアミン、ポルフィリンが挙げられる。
（微生物活性調節剤の調製方法）
　微生物活性調節剤は、微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む。運搬媒体としてリポソームを用いる場合、微生物活性調節剤は、例えば次のようにして調製することができる。まず、有機溶媒に溶解したリン脂質を微生物活性調節物質の溶解液と混合する。続いて、有機溶媒を除去した後、精製水を加え、リン脂質の相転移温度以上の温度となるように加温する。これにより、リポソームを作製することができる。この時、リン脂質と微生物活性調節物質との疎水性相互作用等により、微生物活性調節物質をリポソームに内包させることができる。
　運搬媒体としてベシクルを用いる場合、微生物活性調節剤は、例えば次のようにして調製することができる。目的の微生物活性調節物質をベシクルの形態で分泌する微生物を培地中で培養すると、培養物中に微生物活性調節物質を内包したベシクルが分泌される。このベシクルを微生物活性調節剤として用いることができる。微生物活性調節物質を内包したベシクルは、上記の培養物から精製して用いてもよいし、上記の培養物を、精製することなく微生物活性調節剤として使用してもよい。微生物活性調節物質をベシクルの形態で分泌する微生物としては、パラコッカス、シュードモナス等が挙げられる。
　運搬媒体としてミセルを用いる場合、例えば、両親媒性化合物と微生物活性調節物質との疎水性相互作用や静電相互作用によってミセルを形成させることにより、微生物活性調節剤を調製することができる。
　運搬媒体としてエマルションを用いる場合、例えば、微生物活性調節物質を溶解した油相に界面活性剤を添加して水中に分散させることで調製することができる。
　運搬媒体としてペプチドやタンパク質を用いる場合、例えば、ペプチドやタンパク質と微生物活性調節物質とを疎水性相互作用等によって結合させることにより、微生物活性調節剤を調製することができる。
　運搬媒体として金属ナノ粒子を用いる場合、例えば、金属ナノ粒子と微生物活性調節物質とを物理吸着させることにより、微生物活性調節剤を調製することができる。
　運搬媒体としてカーボンナノチューブを用いる場合、例えば、微生物活性調節物質を、カーボンナノチューブの表面や修飾基に、疎水性、吸着作用等により付着させることにより、微生物活性調節剤を調製することができる。
　運搬媒体としてポリマーを用いる場合、例えば、ポリマーと微生物活性調節物質とを、疎水的相互作用等によって結合させることにより、微生物活性調節剤を調製することができる。
　ポリマーがハイドロゲルである場合には、微生物活性調節物質を溶解又は分散させた溶媒中でハイドロゲルを膨潤させることにより、ハイドロゲルの網目構造中に微生物活性調節物質を保持させ、微生物活性調節剤を調製することができる。
　ポリマーがナノスフェア・マイクロスフェアである場合には、溶媒中で微生物活性調節物質とナノスフェア・マイクロスフェアを混合することにより、ナノスフェア・マイクロスフェアと微生物活性調節物質との相互作用により、微生物活性調節物質をナノスフェア・マイクロスフェアに内包させ、微生物活性調節剤を調製することができる。
　ポリマーがデンドリマーである場合には、溶媒中で微生物活性調節物質とデンドリマーを混合することにより、デンドリマーと微生物活性調節物質との疎水性相互作用、イオン相互作用によりデンドリマーの内部の空間に微生物活性調節物質を保持することができる。
（運搬媒体の修飾）
　上記の運搬媒体を、糖鎖、抗体又はポリマーで修飾してもよい。運搬媒体がこれらの物質で修飾されていることにより、上記の微生物活性調節剤を選択的に特定の抗原を有する微生物に送達したり、微生物活性調節剤の残存性を調節することが可能になる。運搬媒体を修飾する糖鎖としては、オリゴ糖、ガラクトース、フコース等が挙げられる。また、運搬媒体を修飾する抗体としては、リポ多糖、鞭毛、莢膜、線毛等を抗原とするものが挙げられる。また、運搬媒体を修飾するポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン等が挙げられる。運搬媒体を修飾するポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーの形状であってもよい。
（運搬媒体の修飾方法）
　運搬媒体を糖鎖、抗体又はポリマーで修飾する方法としては、例えば、化学架橋剤を用いて、運搬媒体を構成する分子に、糖鎖、抗体又はポリマーを結合させる方法が挙げられる。化学架橋剤としては、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）等が挙げられる。
（微生物の活性を調節する方法）
　上記の微生物活性調節剤を微生物に投与することにより、微生物の活性を調節することができる。ここで、微生物活性とは、微生物が特定の物質（汚濁物質）を分解する活性をいう。微生物活性の向上とは、単位量の微生物が特定の汚濁物質を分解する能力が向上することをいう。また、微生物活性の低下とは、単位量の微生物が特定の汚濁物質を分解する能力が低下することをいう。汚濁物質としては、グルコース、マルトースなどの糖類；メタノールなどのアルコール類；ホルムアルデヒドなどのアルデヒド類；厨芥などの有機性固形物；でんぷん、タンパク質、アンモニア、硝酸塩、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。
　上記の微生物活性向上剤が有効に作用する微生物としては、ビブリオ、アエロモナス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アクロモバクター属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、スフィンゴバクテリウム属（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）アシドバクテリウム属（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アクロモバクター属（ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）、アエロバクター属（ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コマモナス属（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スピリラム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ズーグレア属（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、デハロコッカス属（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）、アミノモナス属（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、デサルホモナス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ）、デサルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、シントロフォバクター属（Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノリネア属（Ｍｅｔｈａｎｏｌｉｎｅａ）メタノブレビバクター属（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）、メタノサエタ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）等が挙げられる。
　微生物の活性を調節することにより、例えば微生物のバイオフィルムの形成を制御することが可能となる。バイオフィルムとは、微生物により形成される構造体であり、基質に付着した微生物が、細胞外多糖又はＥＰＳ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒ　Ｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ　Ｓ）と呼ばれる分泌物を分泌することにより形成される。例えば、医療においては、カテーテル内に黄色ブドウ球菌等がバイオフィルムを形成する場合がある。バイオフィルム内の微生物は、抗生物質や免疫に対する抵抗性が高いため、問題となる場合がある。
　上記の微生物の活性を調節する方法により、例えば、日和見感染症におけるバイオフィルムの分解に関与する微生物の活性を向上させ、結果としてバイオフィルムの形成を阻害し、抗生物質を病原菌に到達させることが可能となる。
　上記の微生物の活性を調節する方法は、海洋構造物、パイプラインなど、バイオフィルム形成が影響する様々な対象に適用できる。例えば、微生物電池においてはアノード及びカソードに緻密なバイオフィルムを形成させる技術に応用できる。また、海洋構造物の大型生物付着防止のためにバイオフィルムを形成させる技術に応用できる。
（生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法）
　一実施形態において、上記の微生物活性調節剤は、生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用である。生物学的排水処理設備の反応槽に、上記の微生物活性調節剤を添加することにより、反応槽中に存在する微生物の活性を向上又は低下させることができる。これにより、反応槽で行われる排水処理を促進させ、又は、必要に応じて抑制することができる。
（ＭＬＳＳ）
　以下の実験において、活性汚泥の量は、ＭＬＳＳ（Ｍｉｘｅｄ　ｌｉｑｕｏｒ　ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ　ｓｏｌｉｄｓ；活性汚泥浮遊物質）に基づいて測定した。ＭＬＳＳの測定は、以下の方法により行なった。まず、活性汚泥サンプルを遠心管にとり、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった後、上清を捨てた。次に、得られた沈殿物に水を加えてよく混合した後、再び上記と同様に遠心分離して上清を捨てた。得られた沈殿物を、予め秤量された蒸発皿に入れ、乾燥機中で１０５～１１０℃で半日乾燥した。続いて、デシケーター中で放冷後、秤量した。測定された質量から、空の蒸発皿の質量を除いた質量をＭＬＳＳとした。
（ベシクルに内包されたＮ－ヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトンの調製）
　Ｎ－ヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン（以下、「Ｃ１６－ＨＳＬ」という場合がある。）をベシクル（メンブレンベシクル）の形態で分泌する、パラコッカスＡＳ６株を培地中で培養し、その培養物をベシクルに内包されたＣ１６－ＨＳＬとして使用した。パラコッカスＡＳ６株については後述する。Ｃ１６－ＨＳＬの濃度は質量分析法により測定した。
（硝化反応の促進の検討）
　試験管に、アンモニア態窒素（ＮＨ４ ＋）が５０ｍＭとなるように調製した無機塩培地を入れた。続いて、上記の試験管に、活性汚泥をＭＬＳＳが５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。さらに、上記の試験管に、ベシクルに内包されたＣ１６－ＨＳＬを１０μＭの終濃度となるように添加した。ベシクルに内包されたＣ１６－ＨＳＬは、Ｃ１６－ＨＳＬが疎水性の物質であるにもかかわらず、容易に培地中に拡散させることができた。陰性対照としては、上記の無機塩培地に活性汚泥のみを添加したものを用いた。実験開始時、２４時間培養後及び４８時間培養後に、培地中のアンモニア態窒素濃度をイオン電極法により測定した。結果を図１に示す。ベシクルに内包されたＣ１６－ＨＳＬを添加した系では、陰性対照と比較して、アンモニア態窒素の減少速度が速くなり、硝化反応が促進されたことが示された。
（Ｎ－３－オキソドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトンを含む微生物活性調節剤の調製）
　Ｎ－３－オキソドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン（以下、「３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬ」という場合がある。）をリポソームに内包させ、微生物活性調節剤を調製した。リポソームの組成は水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）２９ｇ／Ｌ、コレステロール１３ｇ／Ｌであった。リポソームはＢａｈｎｇａｍ法として知られる次の手順により作製した。
　まず、クロロホルム１０ｍＬにＨＳＰＣ、コレステロール及び３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬ（１ｍＭ）を溶解した。続いて、エバポレーターを用いてクロロホルムを除去し、ナス型フラスコの底に脂質フィルムを形成させた。続いて脂質フィルムを形成させたナス型フラスコにリン酸バッファを添加し、ボルテックスミキサーを使用して撹拌しながら、６０℃で水和及び分散させた。以上の操作により、３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬを含む微生物活性調節剤が得られた。
（硝化反応の促進の検討）
　試験管に、アンモニア態窒素（ＮＨ４ ＋）が１４ｍＭとなるように調製した無機塩培地を入れた。続いて、上記の試験管に、活性汚泥をＭＬＳＳが５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。さらに、上記の試験管に、微生物活性調節剤（３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬを内包したリポソーム溶液）を培地と同容量添加した。１０μＭの終濃度となるように添加した。上記の微生物活性調節剤は、３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬが疎水性の物質であるにもかかわらず、容易に培地中に拡散させることができた。陰性対照としては、上記の無機塩培地に活性汚泥を添加した後、３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬを含まない点以外は上記の微生物活性調節剤と同様にして調製した、リポソームを水和したリン酸バッファを、培地と同容量添加したものを用いた。実験開始時、２４時間、４８時間及び７２時間培養後に、培地中のアンモニア態窒素濃度をイオンクロマトグラフィーにより分析した。結果を図２に示す。３ｏｘｏＣ１２－ＨＳＬを含む微生物活性調節剤を添加した系では、陰性対照と比較して、アンモニア態窒素の減少速度が速くなり、硝化反応が促進されたことが示された。
（パラコッカスＡＳ６株）
（ホモセリンラクトン高生産菌のスクリーニング）
　培地中にホモセリンラクトンが存在すると紫色の色素であるビオラセインを生産するレポーター株を利用して、活性汚泥からホモセリンラクトン高生産菌をスクリーニングした。より具体的には、アシル基の炭素数が４～８のＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ４～Ｃ８－ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウムＣＶ０２６株及びアシル基の炭素数が１０～１６のＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（Ｃ１０～Ｃ１６－ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウム　ＶＩＲ０７株を使用した。ここで、ＣＶ０２６株が応答するホモセリンラクトンとしては、Ｎ－ブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－オクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン等が挙げられる。また、ＶＩＲ０７株が応答するホモセリンラクトンとしては、Ｎ－デカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－トリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－テトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン等が挙げられる。
　活性汚泥を希釈して寒天培地に塗布し、単離株を得た。寒天培地上の近接する位置に、活性汚泥から得られた単離株及びレポーター株を塗布した。数日培養後、レポーター株が紫色の色素（ビオラセイン）を分泌したものについて、単離株をホモセリンラクトン生産菌と判断した。結果を表１に示す。表中、「＋」の数が多い程ビオラセインの生産量が多かったことを示す。この方法により、ホモセリンラクトン高生産菌である、ＡＳ６株を得た。ＡＳ６株は、２０１２年５月１８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１３６３として寄託した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ＡＳ６株が生産しているシグナル物質の解析）
　ＡＳ６株をＬＢ培地で培養し、培養液を６，０００×ｇ、１５分間遠心分離した。続いて、遠心上清をポアサイズ０．２μｍの酢酸セルロースフィルターで濾過した後、１５０，００００×ｇ、３時間、４℃で超遠心した。上清を捨てた後、ペレットをＨＥＰＥＳ－ＮａＣｌ溶液（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－０．８５（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ）で洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ－ＮａＣｌ溶液中にＯｐｔｉｐｒｅｐ（商品名、アクシスシールド社）を４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０（ｖ／ｖ）％混合したものを、濃度が高いものが下に来るように遠心管内に重層してグラジエント層を作成し、一番上に４０（ｖ／ｖ）％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ－ＨＥＰＥＳ－ＮａＣｌ溶液に溶解したペレットを添加した。続いて、このグラジエントを１００，００００×ｇ、３時間超遠心した。超遠心分離後、それぞれの層を回収し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８－２５４．）によりタンパク質濃度を、スチュワート法（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．１９８０．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，１０－１４．）によりリン脂質濃度を分析した。タンパク質の濃度及びリン脂質の濃度が高い層をベシクルが抽出された層とした。
（ベシクルの確認）
　上記のベシクルが抽出された層のサンプルを、ネガティブ染色を用いた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により観察した。その結果、ベシクルが存在することが確認された。
（シグナル物質の同定）
　質量分析により、上記のベシクルが抽出された層のサンプルを解析し、シグナル物質の標準品との比較により、物質の同定及び濃度測定を行った。その結果、ＡＳ６株は、培養液中に１．０μＭ程度のＣ１６－ＨＳＬを分泌しており、また、その中の少なくとも半分量がベシクルに内包された状態で存在することが明らかとなった。Ｃ１６－ＨＳＬのような疎水性の物質は、細胞膜に留まりやすいと考えられている。このため、ＡＳ６株は、ベシクルにＣ１６－ＨＳＬを内包して細胞外に排出することにより大量のＣ１６－ＨＳＬを分泌していると考えられた。
　以上の結果から、発明者らは、ＡＳ６株が生産するＣ１６－ＨＳＬが、ベシクルの形態で分泌されることを発見した。疎水性のシグナル物質を化学合成した場合、水に溶解するために有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。これに対し、ＡＳ６株が生産したＣ１６－ＨＳＬは、ベシクルの形態で分泌されているため親水性であり、そのまま水系に添加して用いることができることが明らかとなった。
（ＡＳ６株の同定）
　１６Ｓ　ｒＤＮＡ（１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学試験により、ＡＳ６株の帰属分類群を推定した。
（１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列解析）
　ＡＳ６株を寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、ＤＮＡを抽出した。例えば、「中川恭好、川崎浩子、遺伝子解析法　１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、『放線菌の分類と同定』、Ｐ．８８－１１７、日本学会事務センター（２００１）」に記載された、一般的な方法に基づいて、１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、データベースとの相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。簡易分子系統解析は、アポロンＤＢ－ＢＡデータベース　Ｖｅｒ．７．０（商品名、テクノスルガ・ラボ社、２０１１年３月版、検索日２０１２年５月２日）に基づいて作成した。
　図３に簡易分子系統解析の結果を示す。図３において、左下の線はスケールバーを表し、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を表す。また、株名の末尾のＴはその種の基準株であることを示す。相同性検索の結果、ＡＳ６株の１６Ｓ　ｒＤＮＡの塩基配列は、パラコッカス属のｒＤＮＡの塩基配列に対して高い相同性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ＡＳ６株は、パラコッカス属の種で形成されるクラスター内に含まれ、パラコッカス・ベルスタス（Ｐ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ）及びパラコッカス・ベンガレンシス（Ｐ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）に近縁であることが示された。しかしながら、ＡＳ６株がパラコッカス・ベルスタス又はパラコッカス・ベンガレンシスに帰属する可能性及びこれらとは異なる種である可能性が考えられ、種名の同定には至らなかった。
（形態観察及び生理・生化学試験）
　光学顕微鏡による形態観察、及び、例えば「ＢＡＲＲＯＷ及びＦＥＬＴＨＡＭ、Ｃｏｗａｎ　ａｎｄ　Ｓｔｅｅｌ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｏｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ．　３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ．　１９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ」に記載された、一般的な方法に基づいて、カタラーゼ反応、アオキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス発生、ブドウ糖の酸化／発酵について試験を行った。また、ＡＰＩ２０ＮＥキット（商品名、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）を用いて、硝酸塩還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β－ガラクトシダーゼ及びチロクロームオキシダーゼについての生化学試験、並びに、ブドウ糖、Ｌ－アラビノース、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、マルトース、グルコン酸カリウム、ｎ－カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ－リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニルについての資化性試験を行った。さらに、嫌気条件下での生育の有無及び２０℃での生育の有無についての試験、並びに、グリセロール、サッカロース、Ｄ－フルクトース、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムについての資化性試験を行った。
　結果を表２～４に示す。ＡＳ６株は、運動性を有しないグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は共に陽性を示した。ＡＰＩ２０ＮＥキットを用いた試験の結果、ＡＳ６株は硝酸塩を還元せず、グルコース、Ｌ－アラビノース及びＤ－マンノース等を資化し、ｎ－カプリン酸及びクエン酸ナトリウムを資化しなかった。これらの性状はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスの性状と類似していたが完全には一致しなかった。特に、Ｄ－マンノースを資化する点ではパラコッカス・ベンガレンシスの性状と異なり、ラクトースを資化する点ではパラコッカス・ベルスタスの性状と異なり、硝酸塩を還元しない点はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスのいずれとも異なっていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の結果から、ＡＳ６株は、パラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスに近縁なパラコッカス属細菌であると推定された。
[規則26に基づく補充 09.01.2013]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (9)

  1. 　微生物活性調節物質及び運搬媒体を含む、微生物活性調節剤。
  2. 　前記微生物活性調節物質は、細胞間情報伝達物質、原核生物の活性に影響を与える核酸及び原核生物の活性に影響を与えるタンパク質からなる群より選択される１種以上の物質である、請求項１に記載の微生物活性調節剤。
  3. 　前記運搬媒体は、リポソーム、ベシクル、ミセル、エマルション、ペプチド、タンパク質、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ、フラーレン及びポリマーからなる群より選択される１種以上の物質である、請求項１又は２に記載の微生物活性調節剤。
  4. 　前記ポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーである、請求項３に記載の微生物活性調節剤。
  5. 　前記運搬媒体が、糖鎖、抗体又はポリマーで修飾されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の微生物活性調節剤。
  6. 　前記ポリマーは、ハイドロゲル、ナノスフェア、マイクロスフェア又はデンドリマーである、請求項５に記載の微生物活性調節剤。
  7. 　生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物用である、請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物活性調節剤。
  8. 　微生物の活性を調節する方法であって、請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物活性調節剤を微生物に投与する工程を含む方法。
  9. 　生物学的排水処理設備の反応槽中に存在する微生物の活性を調節する方法であって、生物学的排水処理設備の反応槽に、請求項７に記載の微生物活性調節剤を添加する工程を含む方法。
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