MX2011009272A - Uso de inhibidores de serina proteasa en el tratamiento de neutropenia. - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con compuestos terapéuticos los cuales son inhibidores de serinas proteasas, con composiciones farmacéuticas de los mismos y con su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de neutropenia que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de serina proteasa. La invención también comprende la prevención de apoptosis de células mieloides (1) durante y después de la transfección de células de médula ósea realizada por genoterapia, (2) durante la movilización de blastocitos sanguíneos realizada para reconstitución de hematopoyesis y (3) durante la infusión de células de la línea mieloide para reconstitución de hematopoyesis para genoterapia o para el tratamiento de neutropenia por infusión de neutrófilos.

Description

USO DE INHIBIDORES DE SERINA PROTEASA EN EL TRATAMIENTO DE NEUTROPE IA CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con compuestos terapéuticos los cuales son inhibidores de serinas proteasas, con composiciones farmacéuticas de los mismos y con su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal. De manera más específica, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de neutropenia que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismos de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de serina proteasa. La invención también comprende la prevención de apoptosis de células mieloides (1) durante y después de la transfección de células de médula ósea realizada para genoterapia, (2) durante la movilización de blastocitos sanguíneos realizada para reconstitución de hematopoyesis y (3) durante la administración por infusión de células de la línea mieloide para reconstitución de hematopoyesis para genoterapia o para el tratamiento de neutropenia por infusión de neutrófilos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La invención se relaciona con el uso de compuestos los cuales son inhibidores de serinas proteasas. Las profesas o enzimas proteoliticas son esenciales en organismos, desde las bacterias y virus hasta los mamíferos. Las proteasas digieren y degradan proteínas mediante hidrólisis de enlaces peptídicos. Las serinas proteasas (EC. 3.4.21) tienen características comunes en el sitio activo, principalmente un residuo serina activo. Existen dos tipos principales de serinas proteasas: las similares a quimiotripsina/tripsina/elastasa y las similares a subtilisina, las cuales tienen una distribución espacial idéntica de His, Asp y Ser catalíticos, pero que son muy diferentes en el andamiaje proteínico. No obstante, se han identificado más de veinte familias (S1-S27) de serinas proteasas que se han agrupado en 6 clanes en base en la similitud estructural y otras pruebas funcionales, SA, SB, SC, SE, SF y SG. La familia de las serinas proteasas similares a quimiotripsina/tripsina/elastasa se han subdividido en dos clases. La clase "grande" (aproximadamente 230 residuos) incluye las enzimas de la mayor parte de los mamíferos tales como tripsina, quimiotripsina, elastasa, calicreína y trombina. La clase "pequeña" (aproximadamente 190 residuos) incluye las enzimas bacterianas.

Los residuos His, Asp y Ser catalíticos están flanqueados por residuos de cadenas laterales de aminoácidos de sustrato que se unen a receptáculos denominados SI', S2', S3' , etc. en la parte C terminal o el lado "prima" del sustrato y SI, S2, S3, etc. en el lado N terminal. Esta nomenclatura es como se describe en Structure and echanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, Alan Fersht, 1999 (W. H. Freeman and Company) páginas 40-43 y Brik et al., Org. Biomol. Chem. , 2003, 1, 5-14. Las serinas proteasas similares a quimiotripsina/tripsina/elastasa también se pueden subdividir adicionalmente por los residuos presentes en el receptáculo SI como se describe en Introduction to Protein Structure, Cari Branden and John Tooze, 1991 (Garland Publishing Inc) páginas 231-241. Las subdivisiones son similares a quimiotripsina (Gly-226, Ser-189 y Gly 216 en el receptáculo SI), similares a tripsina (Gly-226, Asp-189 y Gly-216 en SI) y similares a elastasa (Val-226 y THr-216 en SI) en donde los residuos numerados se toman de la numeración de quimiotripsina estándar. Las serinas proteasas similares a tripsina prefieren sustratos los cuales colocan ya sea Lys o Arg en el receptáculo Si.

Las serinas proteasas tienen un mecanismo catalítico común caracterizado por un residuo Ser reactivo particularmente en la posición 195 utilizando el sistema de numeración de quimiotripsina. Los ejemplos de serinas proteasas incluyen tripsina, triptasa, quimiotripsina, elastasa, trombina, plasmina, calicreina, complemento Cl, proteasa acrosómica, proteasa lisosómica, cocunasa, proteasa a-litíca, proteasa A, proteasa B, serina carboxipeptidasa p, subtilisina, urocinasa (uPA) , factor Vila, Factor IXa y factor Xa. Las serinas proteasas se han investigado extensamente durante muchos años y son el objetivo principal de investigaciones como un objetivo de para medicamentos debido a su papel en la regulación de una amplia variedad de procesos fisiológicos.

L°s procesos que involucran serinas proteasas incluyen coagulación, fibrinolisis , fertilización, desarrollo, cánceres malignos, patrones neuromusculares e inflamación. Es bien sabido que estos compuestos inhiben una diversidad de proteasas circulantes asi como proteasas que son activadas o liberadas en tejido. También se sabe que los inhibidores de serina proteasa inhiben procesos celulares críticos tales como adición, migración, producción de radicales libres y apoptosis. Además, los experimentos en animales indican que los inhibidores de serina proteasa administrados por vía intravenosa, variantes o células que expresan inhibidores de serina proteasa proporcionan protección contra daño en tejido.

Se ha predicho que algunos 'inhibidores de proteasa tendrán usos benéficos potenciales en el tratamiento de enfermedades en una amplia variedad de áreas químicas tales como oncología, hematología, neurología, medicina pulmonar, inmunología, inflamación y enfermedades infecciosas. Los inhibidores se serina proteasa también pueden ser benéficos en el tratamiento de enfermedades trombóticas, asma, enfisema, cirrosis, artritis, carcinoma, melanoma, restenosis, ateroma, traumatismo, choque y daño por reperfusión. Una revisión útil se encuentra en Expert Opin. Ther. Patents (2002), 12(8). Los inhibidores de serina proteasa se describen en la solicitudes de patentes publicadas de E.U.A. US 2003/0100089 y 2004/0180371 y en las patentes de E.U.A. 6,784,182; 6,656,911; 6, 656, 910; 6,608,175; 6,534,495 y 6,472,393.

La leucopenia se refiere a una disminución en la cuenta leucocítica total por debajo de aproximadamente 4.0 x 109 células/1. Habitualmente, la reducción es el resultado de una disminución en el número de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) (neutropenia) sus números habitualmente son menores de 2.0 x 109 células/1 y con frecuencias inferiores a 1.0 x 109 células/1. La neutropenia puede resultar de infecciones virales (por ejemplo influenza, sarampión, virus de hepatitis, varicela, dengue y fiebre amarilla, VIH) o de infecciones bacterianas muy grandes que incluyen tuberculosis miliar y septicemia. Además, se - - desarrolla neutropenia debido a irradiación o tratamiento con medicamentos utilizados, por ejemplo, en la quimioterapia de enfermedades malignas o cancerosas o en vasculitis y enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de neutropenia inducida por medicamentos son sulfonamidas, medicamentos antitiroideos, antihistaminas , agentes antimicrobianos, fenotiazinas y diversos analgésicos, sedantes y agentes antiinflamatorios o diversas sustancias químicas tóxicas. La inducción de muerte celular por agentes infecciosos, medicamentos y sustancias químicas tóxicas o anticuerpos puede alterar a los neutrófilos y/o sus células precursoras en la médula ósea. Los anticuerpos para las células de la línea mieloide se observan en enfermedades mediadas por el sistema inmunitario tales como lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide juvenil. Finalmente, aunque no menos importante, se han descrito diversas formas de neutropenia congénita. La neutropenia resulta no solo del daño de PMN en la circulación sino también del daño de los blastocitos y células mitóticas en la médula ósea por agentes infecciosos, medicamentos, irradiación y sustancias químicas tóxicas o debido a un frenado de divisiones celulares, bloqueo de duplicación de cadena de ADN, formación de ARN o interrupción de los microtubulos del huso mitótico.

La neutropenia, por ejemplo debido a quimioterapia para cánceres malignos hematológicos , tumores sólidos o carcinomas genera una respuesta deteriora del hospedador con morbilidad y mortalidad significativa debido a infecciones. Por ejemplo, la quimioterapia o el cáncer temprano de mama con ciclofosfamida , metotrexato y fluorouracilo resulta en eventos neutropénicos en 30% de los pacientes con septicemia quienes requieren retraso del tratamiento anticancerigeno adicional o reducción de la dosis. Reducciones de dosis de 20-30% se han relacionado con tasas de respuesta completa menores y una supervivencia disminuida en pacientes con linfoma o con supervivencia libre de recaída inferior. Pese a las mejoras en el tratamiento antibacteriano para septicemia neutropénica cada año aproximadamente 5% de los pacientes quienes reciben quimioterapia mielotóxica mueren debido a infección por complicaciones relacionadas.

El manejo in vitro de neutrófilos y sus células precursoras, por ejemplo para genoterapia o para preparación de infusiones de neutrófilos se asocia con un incremento de muerte celular debido a la inducción de apoptosis de células mieloides.

Los presentes agentes utilizados para el tratamiento de neutropenia incluyen G-CSF, GM-CSF y G-CSF conjugados a polietilenglicol como G-CSF pegilado. Pese a la disponibilidad y eficacia considerable de los agentes aprobados anteriores para reducir el riesgo de neutropenia sus complicaciones permanecen como preocupación significativa en oncología. Rara vez . la ruptura del bazo, pero con mayor frecuencia el incremento' del volumen del bazo, alteraciones del intercambio de gas en el pulmón y casos sencillos de apoplejía y de daño agudo así como infarto al miocardio se han observado en donadores sanos que reciben G-CSF para recolectar blastocitos de sangre periférica. Las pruebas de que G-CSF provoca síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda es menos claro y requiere ser analizado con estudios prospectivos adicionales a largo plazo.

Aunque estos enfoques han demostrado ser promisorios, existe la necesidad de enfoques terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico mejorados para el tratamiento de neutropenia. La presente invención proporciona un método mejorado y confiable para el tratamiento, diagnóstico o profilaxis de neutropenia que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de serina proteasa.

Este y otros objetivos como serán evidentes de lo anterior se obtienen por la presente invención.

DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un método para el tratamiento o prevención de pacientes que padecen de - - neutropenia, que comprende la administración a los pacientes en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidores de serina proteasa. Preferiblemente, los inhibiores de serina proteasa es un inhibidor de calicreina y preferiblemente el inhibidor de calicreina se selecciona de entre los inhibidores hK2, hK3, hK4 , hK5, hK6, hK7, hK8, hK9, hKIO, hKll, hK12, hK13, hK14, hK15 o mezclas de los mismos. El inhibidor de calicreina más preferido se selecciona de entre los inhibidores hK2, hK4 , hKll, hK5, hK14 o mezclas de los mismos. De manera incluso más preferible los inhibidores de calicreina es un inhibidor de hK2. Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

También se describen inhibidores de serina proteasa para uso en un método para tratar o evitar neutropenia en pacientes los cuales desarrollan, debido a infecciones, septicemia, quimioterapia, irradiación, sustancias químicas tóxicas o efectos secundarios de cualquier medicación. Preferiblemente el número y/o el estado de activación de neutrófilos se deteriora. Los inhibidores de serina proteasa también son para uso en un método para tratar o evitar úlceras en la piel en pacientes con diabetes en los cuales neutrófilos experimentan muerte celular o úlceras de la piel que se desarrollan en pacientes con enfermedad arterial periférica asociada con condiciones hipóxicas en la piel y disfunción de neutrófilos y apoptosis. También los inhibidores de serina proteasa mencionados son para uso en un método para tratar o evitar daño inducido por irradiación de células mieloides como se produce en el curso del tratamiento de cánceres malignos, accidentes en plantas nucleares o el uso de armas nucleares. Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa es un inhibidor de calicreina y preferiblemente el inhibidor de calicreina se selecciona de entre los inhibidores hK2 , hK3, hK4, hK5, hK6, hK7 , hK8 , hK9, h IO, hKll, hK12, hK13, hK14, hK15 o mezclas de los mismos. Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

Se describen adicionalmente inhibidores de serina proteasa para uso en la preparación in vitro de neutrófilos y sus precursores de médula ósea para realizar manipulaciones moleculares para genoterapia antes de la infusión de células mieloides a - 1 - pacientes con neutropenia o trastornos genéticos del sistema mieloide, o para usar neutrófilos y sus precursores de médula ósea para infusión a pacientes con neutropenia o disfunción de neutrófilos.

Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

La invención proporciona adicionalmente un método para la prevención de apoptosis de células mieloides de pacientes, que comprende la administración a los pacientes en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidores de serina proteasa: (1) durante y después de la transfección de células de médula ósea realizada para genoterapia, (2) durante la movilización de blastocitos de la sangre realizada para reconstitución de hematopoyesis y/o (3) durante la infusión de células de la linea mieloide para reconstitución de hematopoyesis para genoterapia o para el tratamiento de neutropenia por infusión de neutrófilos.

Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

La invención también proporciona un equipo para el diagnóstico, pronóstico, profilaxis o tratamiento de neutropenia en un mamífero, caracterizado porque el equipo comprende inhibidores de serina proteasa, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para uso. Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa comprenden una etiqueta detectable o se pueden unir a una etiqueta detectable para formar un complejo detectable. Además, preferiblemente los inhibidores de serina proteasa es un inhibidor de calicreína y preferiblemente el inhibidor de calicreína de entre inhibidores hK2, hK3, hK4 , hK5p hK6, hK7 , hK8, hK9, hKIO, hKll, hK12, hKl3, hK14, hK15 o mezclas de los mismos. Preferiblemente, los inhibidores de serina proteasa ¦ se seleccionan del grupo que comprende la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

Otros objetivos y ventajas se volverán evidentes para aquellos expertos en el ámbito a partir de una revisión de la descripción detallada siguiente la cual se realizará - 1 - con referencia a las siguientes figuras ilustrativas y las reivindicaciones anexas.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1: se muestra tinción con anexina-V de neutrófilos y linfocitos T por incubación con inhibidores de proteasa MDPK67b y MD0KG9. (a) tinción con anexina-V de neutrófilos y linfocitos T por incubación con MDPK67b. Las células se incubaron durante 24 ó 48 horas con MDPK67b a concentraciones que varían de 6 µ? a 60 µ?, como se indica, o PBS como control. Se determinó la apoptosis por tinción con anexina V y análisis FACS. Las poblaciones de leucocitos indicadas se activan en base en su apariencia en una prueba dot plot de dispersor directo/dispersor lateral FACS (neutrófilos) o por tinción positiva para CD3 (linfocitos T) . (b) tinción con anexina-V de neutrófilos antiincubación con MDPK67b o MDOKG9 (OKDG9) .

Se incuban los neutrófilos durante 18 horas con concentraciones de MDPK67b o MDOKG9 que varían de 60 µ? (dilución 1) a 60 pM (dilución 7) como se ha indicado. La apoptosis se determina como se indica antes.

Figura 2: se muestra la comparación de varias condiciones de cultivo celular a través de tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con MDPK67b.

Los neutrófilos se cultivaron las concentraciones indicadas de MDPK67b. PBS sin MDPK67b sirve como un control. Los neutrófilos se siembran en placas (100 µ?/????) ya sea a 5 x 106/ml (densidad elevada) o 3 x 10 /ml (densidad baja) y se determinó la apoptosis de neutrófilos por tinción con anexina-V . y análisis FACS . El cultivo de 5 x 106/ml de neutrófilos en medio libre de suero (X-Vivo . 15) en vez de RPMI con FCS 10% se determinó en paralelo.

Figura 3: muestra la reversión de protección de neutrófilos mediada por MDPK67b por inhibidores de tirosina cinasa (a) Efecto de MDPK67b en las concentraciones de CD16 y CDllb de neutrófilos cultivados. Los neutrófilos se cultivaron con las concentraciones indicadas de MDPK67b y el porcentaje de neutrófilos que expresan niveles altos de CD16 o CDllb se determinó por FACS. Se muestran gráficas de FACS representativas. (b) Reversión del efecto de MDPK67b sobre los niveles de neutrófilos de CD16 y CDllb por PP2. Se cultivaron los neutrófilos con las concentraciones indicadas de MDPK67b en presencia o ausencia del inhibidor de tirosina cinasa Src PP2 (concentración final, 10 µ?) . se midió por análisis FACS la apoptosis y las frecuencias relativas de neutrófilos que expresan altas concentraciones de CDllb y CD16.

La figura 4 muestra el efecto de G-CSF sobre la apoptosis in vitro de neutrófilos.

Se cultivaron neutrófilos con las concentraciones indicadas de G-CSF y neutrófilos (a) apoptosis y (b) regulación por disminución de la expresión de CD16 se analizaron por FACS. (c) se cultivaron los neutrófilos con MDPK67b (0.6 µ?) y cantidades tituladas de G-CSF (concentraciones como se indican) . Los neutrófilos cultivados en medio y PBS (sin DPK67b) sirvieron como control.

La figura 5 muestra una tinción con anexina-V y CD16 de neutrófilos tratados con MDPK67b y etopósido. (a) tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con MDPK67b y etopósido. Las células se incuban durante 18 horas con MDPK67b (6 µ?) más etopósido (125 µg/ml), etopósido solo o PBS. La apoptosis se determina por tinción de anexina-V y análisis FACS. Las poblaciones de leucocitos relevantes se activan en base en su apariencia en una prueba dot plot de FACS de dispersión directa y dispersión lateral. (b) la tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con poco MDPK67b y con concentraciones en aumento de etopósido. Las células se incubaron durante 18 horas con DPK67b (0.06 µ?) solo o con MDPK67b (0.06 µ?) más concentraciones en aumento de etopósido (en µg/ml) como se indica o PBS. La apoptosis se determinó por tinción con anexina-V y el análisis de FAGS se realizó como se menciona en lo anterior. (c) tinción con CD16 de neutrófilos tratados con MDPK67b y etopósido. Se incubaron células durante 18 horas con MDPK67b (0.06 µ? solo o DPK67b (0.06 µ?) más concentraciones en aumento de etopósido (en µ?/???) como se indica o PBS . Los porcentajes de neutrófilos que expresan concentraciones elevadas de CD16 se determinaron por análisis FACS.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Algunas de las serinas proteasas de la superfamilia de quimiotripsina, que incluyen a t-PA, plasmina, u-PA y las proteasas de la cascada de la coagulación sanguínea son moléculas grandes que contienen, además del dominio catalítico de serina proteasa, otros dominios estructurales responsables, en parte, para regulación de su actividad (Barrett, 1986; Gerard et al., 1986; Blasi et al., 1986).

Entre las serinas proteasa importantes están las enzimas similares a tripsina, tales como tripsina, triptasa, trombina, calicreína y factor Xa. L'os objetivos de serina proteasa se asocian con procesos tales como coagulación sanguínea; lisis mediada por complemento, la respuesta inmunitaria, inflamación, detección de dolor, glomerulonefritis, pancreatitis, cáncer, regulación de la - 1 - fertilización, infección bacteriana y maduración viral. Al inhibir serinas proteasas las cuales tienen una alta especificidad por un objetivo particular, uno puede vivir numerosos procesos biológicos in vivo lo cual puede tener efectos perceptibles en un hospedador.

Los inhibidores de serina proteasa (las serpinas) comprenden un grupo diverso de proteínas que forman una superfamilia que ya incluye a más de 100 miembros, de a partir de organismos tan diversos como virus, plantas y humanos. Las serpinas han evolucionado durante 500 millones de años y se han diversificado filogenéticamente en proteínas con función inhibidora y función no inhibidora (Hunt y Dayhoff, 1980). Las serpinas no inhibidoras tales como la ovalbúmina carecen de actividad inhibidora de proteasa (remold-O' Donnell, 1993). La función primaria de los miembros de la familia de la serpina parece ser la neutralización de la actividad de serina proteinasa sobreexpresada (Potempa et al., 1994) . Las serpinas juegan un papel en el remodelado de la matriz extracelular , modulación de la respuesta inflamatoria y migración celular (Potempa et al., 1994).

Los inhibidores de serina proteasa se dividen en las siguientes familias: en la familia del inhibidor de tripsina pancreática bovina (Kunitz) , también conocido como inhibidor de proteasa básica (Ketcham et al., 1978); la - 1 - familia Kazal; la familia inhibidora de subtilisina de Streptomyces ; la familia serpina; la familia de inhibidor de tripsina de soya (Kunitz), la familia inhibidora de papa; y la familia de Bowman-Birk (Laskowski et al., 1980; Read et al., 1986; Laskowski et al., 1987). Los inhibidores de serina proteasa que pertenecen a la familia serpina incluyen los inhibidores de activador de plasminógeno PAI-1, PAI-2 y PAI-3, inhibidor de esterasa Cl, alfa-2-antiplasmina, contrapsina, alfa-l-antitripsina, antitrombina III, proteasa nexin I, alfa-l-antiquimiotripsina, inhibidor de proteina C, cofactor II de heparina y proteina regulada por hormona del crecimiento (Carrelletal . , 1987; Sommeretal., 1987; Suzuki et al., 1987; Stump et al., 1986).

Muchos de los inhibidores de serina proteasa tienen una especificidad amplia y son capaces de inhibir tanto a la superfamilia quimiotripsina de proteasas que incluyen serinas proteasas de la coagulación sanguínea y la superfamilia de subtilisina de Streptomyces de serinas proteasas (Laskowski et al., 1980) . La inhibición de serinas proteasas por serpinas ha sido revisada en Travis et al. (1983); Carrelletal (1985); y Sprengers et al. (1987). Están disponibles datos cristalográficos para una gran cantidad de inhibidores intactos que incluyen miembros de las familias BPTI, Kazal, SSI, tripsina de soya e inhibidor de papa y para la forma separada de la serpina alfa-l-antitripsina (Read et al., 1986). Pese al hecho de que los inhibidores de serina proteasa son proteínas de tamaño de secuencia diversos, los inhibidores intactos estudiados hasta ahora tienen todos en común un bucle característico, denominado el bucle de sitio reactivo, que se extiende desde la superficie de la molécula que contiene la secuencia de reconocimiento para el sitio activo de la serina proteasa afín (Levin et al., 1983). La similitud estructural de los bucles en los diferentes inhibidores de serina proteasa es notable (Papamokos et al., 1982). La especificidad de cada inhibidor se considera que está determinada principalmente por la identidad del aminoácido que está inmediato a la pa.rte amino terminal al sitio de ruptura potencial del inhibidor por la serina proteasa. Este aminoácido, conocido como el residuo del sitio Pi , se considera que forma un enlace acilo con la serina en el sitio activo de la serina proteasa (Laskowski et al., 1980) . El hecho de que una serpina posea o no una función inhibidora depende fuertemente de la secuencia de consenso localizada en la región de bisagra del bucle de sitio reactivo cerca de la parte carboxi terminal de la región codificante. Fuera del bucle de sitio reactivo, los inhibidores de serina proteasa de diferentes familias generalmente no están relacionados estructuralmente, aunque la familia Kazal y la familia de subtilisina de Streptomyces de los inhibidores muestran ciertas similitudes estructurales y en la secuencia.

De la manera en que se utiliza en la presente, se proporcionan las siguientes definiciones con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención.

Los términos "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más".

El término "comprende" generalmente se utiliza en el sentido de incluir, es decir, de permitir la presencia de una o más características o componentes.

De la manera en que se utiliza en la presente, los términos "proteína", "polipéptido" , "polipeptídico" , "péptido" y "peptidico" o "cadena peptídica" se utilizan de manera intercambiable en la presente para designar una serie de residuos aminoácidos conectados a los otros por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes .

Un "residuo aminoácido" significa cualquier residuo aminoácido conocido por aquellos expertos en el ámbito. Esto abarca aminoácidos como se encuentran de manera natural (que incluyen, pro ejemplo, utilizando el código de tres letras, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), así como aminoácidos raros y/o sintéticos y derivados de los mismos (que incluyen, por ejemplo, Aad, Abu, Acp, Ahe, Aib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Hyl, McLys, McVal, Nva, y similares.

El residuo aminoácido o derivado del mismo puede ser cualquier isómero, especialmente cualquier isómero quiral, por ejemplo la isoforma L o D.

Mediante el derivado de aminoácido, por la presente se quiere indicar cualquier derivado de aminoácido que es conocido en el ámbito. Por ejemplo, los derivados de aminoácido incluyen residuos derivables de aminoácidos naturales que presentan cadenas laterales adicionales, por ejemplo cadenas laterales alquilo y/o sustituciones de heteroátomo . el término "fragmentos" se refiere a secuencias que comparten por lo menos 40% de aminoácidos de longitud con la secuencia respectiva del sitio activo de sustrato. Estas secuencias se pueden utilizar en la medida en que muestren las mismas propiedades que la secuencia nativa de la cual se deriva. Preferiblemente, esta secuencias comparten más de 70%, preferiblemente más de 80%, e incluso de manera más preferible más de 90%, en particular más de 95% de aminoácidos de longitud con la secuencia respectiva del sitio activo del sustrato.

La presente invención también incluye variantes de la secuencia de sitio activo de sustrato. El término "variantes" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren en cierta medida de un polipéptido de secuencia nativa que son secuencias de aminoácidos que varían de la secuencia nativa por sustituciones conservadoras de aminoácidos, por lo que uno o más aminoácidos están sustituidos por otro con las mismas características y papeles conformacionales . Las variantes de secuencia de aminoácido poseen sustituciones, supresiones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia nativa de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos en la presente se definen como cambios dentro de uno de los siguientes cinco grupos : I. residuos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly II. residuos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys III. residuos polares cargados negativamente; y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln IV. residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp V. residuos grandes, alifáticos y no polares: et, Leu, lie, Val, Cys .

El término "calicreína" se relaciona con las calicreinas glandulares o tisulares. Las calicreinas glandulares o tisulares son una subfamilia de las serinas proteasas con un alto grado de especificidad de sustrato y expresión diversa en diversos tejidos y fluidos biológicos. El término "calicreina" aparece en la literatura por primera vez en la década de 1930, cuando se encontraron grandes cantidades de enzimas proteasas en aislados de páncreas (páncreas es "calicreas" en griego) (Kraut et al., 1930, Werle 1934). Actualmente las enzimas calicreinas se dividen en dos grupos, calicreinas plasmáticas y tisulares, las cuales difieren significativamente en su peso molecular, especificidad de sustrato, características inmunológicas , estructura genética y tipo de cinina relacionada.

Las calicreinas comprenden una familia de 15 homólogos de cadena sencilla, serina endopeptidasas secretadas de ~ 25-30 kDa, con ortólogos presentes en especies desde por lo menos seis ordenes de mamífero. Estas calicreinas son hK2, hK3, hK , hK5, hK6, hK7, hK8, hK9, hKIO, hKll, hK12, hK13, hK14, hK15. Preferiblemente, las calicreinas son hK2, hK4, hKll y hK14.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a una clase de proteínas plasmáticas producidas por los linfocitos B del sistema inmunitario después de estimulación con por un antígeno. Los anticuerpos de mamífero (es decir, de humanos) son inmunoglobulina de las clases IgG, M, A, E o D. El término "anticuerpo", como' se utiliza para los propósitos de esta invención incluye, pero no se limita a anticuerpos policlonales , monoclonales , quiméricos, humanizados, humanos, internalizantes, neutralizantes, anticuerpos anti-idiotípicos, fragmentos inmunologicamente activos o derivados de los mismos, proteínas recombinantes que tienen actividad inmunológica e inmunoconj ugados los cuales se unen a una calicreína o a una serina proteasa anclada en membrana.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la condición fisiológica en los mamíferos que típicamente está caracterizada por crecimiento celular no regulado.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "enfermedad" se refiere a una condición patológica de una parte, órgano o sistema de un organismo que resulta de varias causas, tales como infección, defecto genético, tensión ambiental y caracterizado por un grupo identificable de signos o síntomas.

Para propósitos de tratamiento, un "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de casa o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas, monos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano .

El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya presentan el trastorno así como aquellos en los cuales se va a evitar el trastorno. Por lo tanto, el mamífero que va a ser tratado en la presente puede haber sido diagnosticado que tiene el trastorno o que puede estar predispuesto o susceptible al trastorno.

El término "sujeto" se refiere a pacientes de humanos u otros mamíferos e incluye cualquier individuo que se desee examinar o tratar utilizando los métodos de acuerdo con la presente invención. No obstante, se entenderá que "paciente" no implica automáticamente que los síntomas o enfermedades estén presentes.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y que típicamente no producen una fracción alérgica o similar no deseada tal como malestar gástrico, mareos y similares, cuando se administra a un humano .

Como se utiliza en la presente, el término "proteasa" se refiere a una clase de enzimas las cuales reconocen una molécula y separan una secuencia de activación en la molécula. La proteasa puede ser una endopeptidasa, la cual separa enlaces peptidicos internos. De manera alternativa, la proteasa puede ser una exopeptidasa la cual hidroliza los enlaces peptidicos de la parte N terminal o el extremo C terminal del polipéptido o molécula proteinica. La proteasa se pliega en una conformación para formar un sitio catalítico el cual recibe y separa la secuencia de activación .

Los "inhibidores" se refieren a un polipéptido o a un compuesto químico que inhibe específicamente la función de una calicreína o serina proteasa mediante, preferiblemente, unión a la calicreína o serina proteasa.

Un "bucle de serpina reactivo" o "bucle de sitio reactivo" o RSL se refiere a un bucle de sitio reactivo flexible que se encuentra en serpina y el cual está implicado en la interacción con la proteasa objetivo putativa. A partir del residuo en el lado de aminoácidos del enlace escindible, y se mueve alejándose del enlace, los residuos convencionalmente se denominan Pl, P2, P3, etc. Los residuos que siguen al enlace escindible se denominan Pl', ?2', P3', etc. Habitualmente el RSL está constituido de 6 a 12 residuos aminoácidos .

Una "serina proteasa" o serpina de acuerdo con la invención se puede seleccionar del grupo que comprende a-1 antiquimiotripsina (ACT) , inhibidor de proteina C (PCI), a-lantiproteinasa (ATT) humana, precursor de proteina relacionado con a-1 antitripsina humana (ATR) , inhibidor de a-2-plasmina (AAP) , precursor de antitrombina III humana (ATIII), inhibidor 10 de proteasa (PI10), precursor de proteina 2 de unión de colágeno humano (CBP2), inhibidor 7 de proteasa (PI7), leuserpina 2 inhibidora de proteasa (HLS2), inhibidor Cl de proteasa de plasma humano (Cl INH) , inhibidor de elastasa de monocito/neutrófilos (M/NEI), inhibidor 3 de activador de plasminógeno (PAI3), inhibidor 4 de proteasa (PI4), inhibidor 5 de proteasa (PI5), inhibidor 12 de proteasa (PI12), precursor de inhibidor 1 activador de plasminógeno humano endotelial (PAI-1), inhibidor-2-placental activador de plasminógeno humano (PAI2), precursor de factor derivado de epitelio de pigmento humano (PEDF), inhibidor 6 de proteasa (PI6), inhibidor 8 de proteasa (PI8), inhibidor 9 de proteasa (PI9), antigeno 1 de carcinoma de célula escamosa humana (SCCA-1) , antigeno 2 de carcinoma de célula escamosa humana (SCCA-2), globulina que une T4 (TBG) , megsina e inhibidor 14 de proteasa (PI14), fragmentos de los mismos, quimeras moleculares de los mismos, combinaciones de los mismos y/o variantes de los mismos.

Dado que la mayor parte de estas serpinas tienen nombres diferentes, el solicitante incluye en lo siguiente una tabla que resume sus especificaciones: TABLA I (INHIBIDOR DE PROTEASA 10) CBP2, PRECURSOR DE PROTEINA sp P504541 GNPFDQDIYGREELRSPKLF 2 DE UNION DE COLAGENO HUMANO CBP2 (COLIGINA 2) PI7 o PN1, PRECURSOR DE sp P070931 GTKASAATTAILIARSSPP NEXINA DERIVADO DE NEUROGLIA HUMANO GDN (GDN) (PROTEASA NEXINA 1) (PN-1) (INHIBIDOR 7 DE PROTEASA) HCF2 , PRECURSOR DE COFACTOR sp P055461 GTQATTVTTVGFMPLSTQVR II DE HEPARINA HUMAN HEP2 (HC-II) (LEUSERPINA 2 INHIBIDORA DE PROTEASA) (HLS2) C1NH o C1IN, PRECURSOR DE sp P051551 GVEAAAASAISVARTLLVFE INHIBIDOR DE PROTEASA I Cl PLASMATICA HUMANA (Cl INH) ELANH2 o PI2, INHIBIDOR DE sp P30740 | GTEAAAATAGIATFCMLMPE ELASTASA DE LEUCOCITOS HUMANO ILEU (LEI) (INHIBIDOR DE ELASTASA DE MONOCITO/NEUTROFILO) (M/NEI) (El) PCI o PLANH3 o PROCI, sp P0515 1 GTRAÁAATGTIFTFRSARLN Ventajosamente, el inhibidor de serina proteasa de la invención puede ser con enzima serina proteasa similar a tripsina y preferiblemente un inhibidor de calicreina. Los inhibidores de calicreina de la invención se seleccionan de entre los inhibidores hK2 , hK3 , hK4 , hK5, hK6, hK7 , hK8 , hK9, hKIO, hKll, hK12, hK13, hK14 o hK15. Preferiblemente, los inhibidores de calicreina se seleccionan de entre los inhibidores hK2, hK4 , hKll, hK5 y hKl4. De manera más preferible, el inhibidor de calicreina es un inhibidor hK2.

Abarcado por la presente invención están las proteínas inhibidoras recombinantes de una calicreína que comprende una secuencia de serpina en donde el bucle de serpina reactivo P6-P6' de la secuencia de serpina comprende por lo menos una secuencia de sitio activo de sustrato específica para la calicreína, fragmentos biológicamente activos de la misma, una quimera molecular de la misma y una combinación de los mismos y/o variantes de los mismos. Por lo menos una secuencia de sitio activo de sustrato específica para la calicreína es un péptido de sustrato que se selecciona de calicreína utilizando la biblioteca de pentapéptido aleatorio presentado por fago como se describe en la solicitud de patente internacional PCT/IB2004 /001040 (Universidad de Lausana) .

En particular, en caso de que el inhibidor de calicreína sea un inhibidor dirigido contra hK2, el inhibidor se puede seleccionar de entre los descritos en la solicitud de patente internacional PCT/IB200 /001040 cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Preferiblemente, el inhibidor de calicreína de la invención se puede seleccionar del grupo que comprende MD820, MD62, MD61, D67 y MDCI. De manera más preferible, este inhibidor es MD62 o MD61 e incluso de manera más preferible el inhibidor es DPK67b. Esta solicitud describe una proteína inhibidora quimérica de una proteasa que comprende una secuencia polipeptidica inhibidora y por lo menos una secuencia polipeptidica de un sitio de interacción sustrato-enzima especifico para una proteasa asi como un método para producir la proteina inhibidora quimérica de una proteasa. Preferiblemente, la secuencia de ADN purificada y aislada que codifica para el inhibidor de serina proteasa de la invención se selecciona del grupo que comprende SEC ID NO: 1, SEC ID N0:3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID N0:11, SEC ID NO: 13 Y SEC ID NO: 15. De manera más preferible, la secuencia de ADN purificada y aislada que codifica para el inhibidor de serina proteasa de la invención es la SEC ID NO: 15.

Como un ejemplo de inhibidor de serina proteasa de acuerdo con la invención, los solicitantes han encontrado sorprendentemente 6 proteínas inhibidoras quiméricas nuevas específicas para la proteasa hK2 como se resumen en lo siguiente en la tabla II, estos inhibidores son: TABLA II Inhibidores Otros nombres SEC. ID NO: quiméricos (proteína) rACT8.2o MD820 2 rACT6.2 MD62 4 rACT8.3 MD83 6 - 3 - rACT6.7 MD67 8 rACT6.i MD61 10 ACT5.18 MD518 12 MDCI · 14 MDPK67b 16 Estas proteínas inhibidoras quiméricas se han obtenido al modificar el RSL de a?-antiquimiotripsina (rACT) , el cual se sabe que inhibe un panel grande de enzimas humanas tales como quimiotripsina, quimasa de blastocitos, catepsina G, calicreínas prostáticas hK2 y PSA (hK3) con el fin de cambiar la especificidad de esta serpina. Las secuencias peptídicas, que se seleccionan como sustratos para la enzima hK2 por tecnología de presentación de fago como se explica en la solicitud de patente internacional PCT/IB2004/001040 se han utilizado para sustituir el enlace escindible y los residuos aminoácidos vecinos del RSL. Los inhibidores recombinantes se producen en bacterias y se purifican por cromatografía de afinidad.

Adicionalmente, los solicitantes también han encontrado que al sustituir los residuos P3-P3' localizados en la estructura RSL de rACTWT por pentapéptido sustrato que codifica para el RSL del inhibidor de proteína C (PCI) lleva a la producción de un inhibidor quimérico (MDCI) , el cual es - - capaz de inhibir las calicreinas hK2 y hK3.

En el caso de que el inhibidor de calicreina sea un inhibidor dirigido contra hK14, entonces el inhibidor se puede seleccionar de entre aquellos descritos en la solicitud de patente internacional de prioridad PCT/IB2005/000504 , cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Preferiblemente, el inhibidor recombinante se puede seleccionar del grupo que comprende AATGi, AATGGiG, ATTcn, AATCIIG, AATE5, AATE8, AATF11, AATF3, AATG9, ACTGi, AcTG1G, ACTcu, ACTCHG, ACTE5, ACTE8, ACTFn, ACTF3, ACTG9 (SEC ID NO: 17), ACTciv y ACTciiD- Preferiblemente, la proteina inhibidora de una proteasa hK14 es AATGi, AATGiG, AATCn, AATcnG, AATE5, AATE8, AATF3, AATG9, ACTG1G, AC cu, ACTCnG, ACTE5, ACTE8, ACTF , ACTF3, ACTG9 (SEC ID NO: 18), ACTG1V o ACTCnD. Esta solicitud describe una proteina inhibidora quimérica de una proteasa hK14 que tiene una secuencia polipeptidica inhibidora y por lo menos una secuencia polipeptidica de un sitio de interacción sustrato-enzima especifico para la proteasa hK14, en donde la proteina inhibidora quimérica de una proteasa h 14 tiene, bajo condiciones fisiológicas: i) una estequiometria de inhibición (SI) igual o inferior a 11.7 después de por lo menos 4 horas de incubación, ii) una velocidad de asociación (Ka) de por lo menos 7, 500 M-1s_1, iii) una actividad inhibidora de 100% después de por lo menos 30 minutos de incubación.

Además, la secuencia polipeptidica inhibidora del inhibidor de proteasa también se puede seleccionar a partir de una cisteína proteasa puesto que existe ahora varias instancias bien documentadas de inhibición de cisteina proteasas por serpinas (Gettins P.G.W., 2002 "Serpin structure, mechanism, and function" in Chem. Rev, 102, 4751-4803). Estos ejemplos incluyen inhibición de catepsinas K, L y S por el antigeno 1 de carcinoma de célula escamosa de serpina, inhibición de la prohormona tiol proteinasa por la -1-antiquimiotripsina e inhibición de miembros de la familia de caspasa, que incluyen caspasa 1 (enzima convertidora de interleucina 1ß), caspasa 3 y caspasa 8 por la serpina viral crmA y caspasas 1, 4 y 8 por la serpina humana PI9.

También se contempla por la presente invención mezclas de inhibidores de serina proteasa, anticuerpos, peptacuerpos y fragmentos biológicamente activos de los mismos .

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden unir selectivamente a una calicreina o una serina proteasa y no se unirán (o se unirán débilmente) a un polipéptido que no es el objetivo. También se pueden unir a calicreína o serina proteasa que se encuentren de manera natural a un polipéptido recombinante de los mismos. Los anticuerpos de la invención se pueden unir a calicreína o serina proteasa expresada por una célula, es decir, expresada por una célula incluye las formas de superficie celular, unida a membrana, citoplásmica o secretada. También se pueden unir uno o más dominios en la calicreína o la serina proteasa que incluyen los dominios citoplásmico, transmembranal y/o extracelular . De manera alternativa, se pueden unir a cualquiera de la calicreína o serina proteasa en su forma nativa y/o desnaturalizada.

Se entiende por aquellos expertos en el ámbito que las regiones o epítopos de la calicreína o serina proteasa a los cuales está dirigido el anticuerpo pueden variar con la aplicación destinada.

El anticuerpo de acuerdo con la invención puede reconocer y unirse a cualquier porción de la calicreína o la serina proteasa que incluyen dominio citoplásmico, el dominio transmembranal y/o el dominio extracelular o cualquier porción del mismo tales como fragmentos o derivados de los mismos .

Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser preparaciones policlonales las cuales incluyen una población de anticuerpos diferentes dirigidos contra un epítopo diferente en el inmunógeno, tal como una calicreina o serina proteasa utilizada como un inmunógeno.

Los anticuerpos policlonales se pueden producir por métodos bien conocidos en el ámbito. En general, cualquier anticuerpo (por ejemplo monoclonal, policlonal y similar) se puede generar utilizando una calicreina aislada o una serina proteasa o un fragmento como el inmunógeno. Además, el inmunógeno puede ser una proteina de fusión que incluye la totalidad o una porción de los polipéptidos objetivo fusionados a V5, His, proteina que une maltosa, GST o Ig humana. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales han sido generados previamente utilizando una proteina de fusión que tiene un dominio extracelular, por ejemplo de hepsina humana fusionada a proteina que une maltosa (Y Kazama, et al., 1995 J Biol Chem 270:66-72) . Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser anticuerpos monoclonales que unen un sitio antigénico especifico presente en la calicreina o la serina proteasa.

Los métodos para preparar un inmunógeno e inmunizar a un animal son bien conocidos en el ámbito (Kohler and Milstein 1975 Nature 256:495-497; Brown et al. 1981 J Immunol 127:539-46; Brown et al., 1980 J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al., 1976 Proc Nati Acad Sci USA 76:2927-31; Yeh et al., 1982 Int J Cáncer 29:267-75; Kozbor et al., 1983 Immunol - 4 - Today 4:72; Colé et al., 1985 Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96; Patente de Estados Unidos Número 4,816,567; Clackson, et al., 1991 Nature 352:624-628; Marks, et al., 1991 J Mol Biol 222:581-597).

La presente invención también considera el caso en donde los inhibidores de calicreina y/o los inhibidores de serina proteasa están en forma de peptacuerpos.

Un "peptacuerpo" , como se describe en O 98/18943 (Kajava et al.) y WO2004087766 (Université de Lausanne) , los cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) es una molécula de alta avidez la cual utiliza el concepto de multimerización para inducir señales de células aberrantes. El dominio de multimerización consiste de una parte de una proteina de matriz oligomérica de cartílago (COMP) humana, la cual se fusiona a una región de bisagra o separador (que preferiblemente contiene 19 aminoácidos para IgA humana) y un dominio (dominio de unión) capaz de unirse a un aceptor (ligando) . El concepto de molécula peptacuerpo permite una unión estrecha sobre células o tejidos que expresan un alto nivel de marcador de calicreina y serina proteasa. Los "decacuerpos" se construyen sobre el mismo principio con la diferencia de que poseen diez brazos y en consecuencia diez dominios de unión.

Habitualmente, las enfermedades de acuerdo con la invención son enfermedades en las cuales el número de leucocitos polimorfo nucleares, los neutrófilos se han vuelto un problema al estar disminuidos debido a infecciones, septicemia, irradiación, quimioterapia, efectos secundarios de medicamentos o la acción de sustancias químicas tóxicas.

La invención también incluye aplicación tópica de inhibidores de calicreína en úlceras cutáneas diabéticas para evitar la muerte celular de neutrófilos y de esta manera restaurar la celularidad y funciones de los neutrófilos.

La invención también incluye el uso in vitro de inhibidores de calicreína o los inhibidores de serina proteasa para la preparación de neutrófilos y sus precursores de médula ósea para realizar manipulaciones moleculares para genoterapia o para uso de neutrófilos y sus precursores de médula ósea para infusiones a pacientes.

La invención incluye el tratamiento de pacientes que reciben blastocitos o células precursoras mieloides o transfusiones de neutrófilos con inhibidores de calicreína o l°s inhibidores de serina proteasa.

La presente invención también se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de calicreína y/o el inhibidor de serina proteasa como se describe en la presente como un agente activo, opcionalmente en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables .

Preferiblemente, la composición, como una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, se va a administrar a un paciente en necesidad de tratamiento vía cualquier ruta adecuada, habitualmente por vía oral o por inyección a la corriente sanguínea o al CSF, o por vía subcutánea o directamente del sitio de interés o cercano a este sitio.

Preferiblemente, la composición de acuerdo con la invención también se puede agregar a soluciones de infusión preparadas para infusiones de células de médula ósea, células mieloides y neutrófilos.

De acuerdo con otra modalidad, la composición de la invención también se puede agregar a soluciones las cuales se utilizan en manipulaciones in vitro de células de médula ósea y neutrófilos para genoterapia o en el congelamiento de células para almacenamiento de las células.

De acuerdo con una modalidad adicional, la composición de la invención se puede aplicar localmente a la piel en ulceras cutáneas diabéticas o isquémicas.

La dosis precisa dependerá de varios factores que incluyen si la composición es para profilaxis o para tratamiento, la naturaleza precisa de la composición y la - 4 - naturaleza de la etiqueta detectable o funcional unida al inhibidor de calicreina o el inhibidor de serina proteasa.

La presente composición farmacéutica comprende como una sustancia activa una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición como se describe, opcionalmente en combinación con portadores, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables .

Una "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a un material químico o compuesto el cual, cuando se administra a un organismo humano o animal induce un efecto farmacológico y/o fisiológico detectable.

La cantidad farmacéuticamente ef,icaz de una unidad de dosificación del inhibidor de calicreina y/o el inhibidor de serina proteasa como se describe en la presente habitualmente está en el intervalo de 0.001 ng a 100 \iq por kg de peso corporal del paciente que va a ser tratado.

La composición farmacéutica puede contener uno o más portadores, diluyentes y adyuvantes farmacéuticamente aceptables .

Los portadores, diluyentes y adyuvantes aceptables los cuales facilitan el procesamiento de los compuestos activos en la preparación los cuales pueden ser utilizados farmacéuticamente son no tóxicos a receptores a dosificaciones y concentraciones utilizadas y que incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butil orbencilico; alquilparabenos tales como etil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menor de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteína.) ; y/o tensioactivos no iónicos tales como T EENMR; PLURONICSMR o polietilenglicol (PEG) . La forma de administración de la composición farmacéutica puede ser sistémica o tópica. Por ejemplo, la administración de la composición pueden ser diversas vías parenterales tales como subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica, ruta bucal o por medio de un - - dispositivo implantado y también se puede suministrar por medios peristálticos.

La composición farmacéutica, como se describe en la presente, también se puede incorporar o impregnar en una matriz bioabsorbible, con la matriz que es administrada en forma de una suspensión de matriz, un gel o un soporte sólido. Además, la matriz puede estar constituida de un biopolimero .

Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen al anticuerpo, matrices las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidas (patente de E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y [gama] etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOTMR (microesferas inyectables constituidas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .

Las formulaciones para ser utilizadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de esterilización por filtración.

Se entiende que la dosificación adecuada de la presente composición dependerá de la edad, sexo, salud y peso del receptor, la clase de tratamiento concurrente, si lo hay y la naturaleza del efecto deseado.

La forma de dosificación apropiada dependerá de la enfermedad, el inhibidor y el modo de administración; las posibilidades incluyen tabletas, cápsulas, grageas, pastas dentríficas, supositorios, inhalantes, soluciones, ungüentos y depósitos parenterales .

Puesto que las modificaciones de aminoácidos de los aminoácidos (por ejemplo, del inhibidor) también están abarcados por la presente invención, esto puede ser útil para reticulado del inhibidor a una matriz insoluble en agua u otros portadores macromoleculares o para mejorar la solubilidad, adsorción y permeabilidad a través de la barrera hematoencefálica . Tales modificaciones son bien conocidas en el ámbito y de manera alternativa pueden eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable posible del péptido y similares .

Habitualmente, los inhibidores de calicreina de los inhibidores de serina proteasa de la invención pueden comprender una marca detectable o se pueden unir a una marca detectable para formar un complejo detectable.

Las "marcas detectables" son moléculas detectables o porciones de detección para propósitos de diagnóstico tales como enzimas o péptidos que tienen una propiedad de unión particular, por ejemplo estreptavidina o peroxidasa de rábano. La porción de detección incluye además porciones químicas tales como biotina las cuales se pueden detectar vía unión a una porción detectable afín específica, por ejemplo, avidina marcada.

Preferiblemente, las marcas detectables incluyen marcas fluorescentes y marcas utilizadas convencionalmente en el ámbito para generación de imágenes por MRI-CT. Se conocen numeroso materiales fluorescentes y se pueden utilizar como marcas. Estos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, rojo Texas, azul AMCA y amarillo Lucifer.

Los inhibidores de calicreína o los inhibidores de serina proteasa de la invención pueden portar una marca radioactiva como la porción de detección, tales como los isótopos 3H, 14C, 3 P, 35S, 36C1, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 121I, 124I, 125I, 131I, mln, 211At, 198Au, 67Cu, 225Ac, 213bu, 99Tc y 186Re. Cuando se utilizan marcas radioactivas, se pueden utilizar los procedimientos de conteo disponibles actualmente conocidos para identificar y cuantificar los miembros de unión específicos.

En el caso en donde la marca es una enzima, la detección se puede llevar a cabo por cualquiera de las técnicas colorimétricas, espectrofotométricas, flouoroespectrofotométricas, amperométricas o gasométricas utilizadas actualmente, conocidas en el ámbito.

En caso de generación de imágenes in vivo, las marcas de la presente invención se pueden conjugar a un agente generador de imagen en vez de uno o varios radioisótopos, que incluyen pero que no se limitan a un agente mej orador de imagen por resonancia magnética. Los ejemplos de grupos quelantes incluyen EDTA, porfirinas, poliaminas, éteres corona y polioximas.

Los ejemplos de iones paramagnéticos incluyen gadolinio, hierro, manganeso, renio, europio, lantano, holmio y erbio.

Otra materia objeto de la presente invención es proporcionar un equipo para el diagnóstico, pronostico, profilaxis o tratamiento de neutropenia en un mamífero, el equipo comprende la composición de la invención, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para uso.

El equipo de la presente invención puede comprender además una forma de dosificación farmacéutica separada que comprende, por ejemplo, un agente anticancerígeno que se selecciona del grupo que consiste de agentes quimioterapéuticos , anticuerpos receptores de factor de crecimiento antiepidérmico, agentes radioinmunoterapéuticos y combinaciones de los mismos.

Generalmente, el equipo comprende un recipiente y una marca o inserto de empaque sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes se pueden conformar de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente mantiene una composición la cual es eficaz para tratar la condición y puede tener un puesto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón susceptible de ser perforado por una aguja para inyección hipodérmica) . La etiqueta o el inserto de empaque indican que la composición se utiliza para tratar la condición de elección, tal como neutropenia.

De manera alternativa o adicional, el equipo puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua para inyección bacterioestática (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario que incluye - - otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

La presente invención también describe el uso de la composición de la invención como una herramienta farmacológica en el desarrollo y estandarización de sistema de prueba in vitro e in vivo para el diagnóstico, pronostico, profilaxis o tratamiento de neutropenia en mamíferos.

También se abarca por la presente invención un análisis de detección para el diagnóstico, pronostico, profilaxis o tratamiento de neutropenia en una muestra de tejido que comprende poner en contacto la muestra de tejido con la . composición de la invención, determinar y medir la cantidad de marca detectada y correlacionar esta cantidad con la presencia o ausencia de neutropenia en la muestra de tej ido .

Los expertos en el ámbito apreciarán que la invención descrita en la presente es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye la totalidad de tales variaciones y modificaciones sin por esto apartarse del espíritu o características esenciales del mismo. La invención también incluye la totalidad de las etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o indicados en esta especificación, de manera individual o colectiva, y cualquiera y la totalidad de combinaciones o cualquiera dos o más de las etapas o características. Por lo tanto, la presente descripción se debe considerar en todos los aspectos ilustrados y no limitantes, el alcance de la invención está indicado por las reivindicaciones anexas y todos los cambios, los cuales provienen dentro del significado y alcance de equivalencia se consideran abarcados por la misma.

Varias referencias se mencionan en la especificación, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

La descripción siguiente se entenderá de manera más completa con referencia a los ejemplos que siguen. No obstante, tales ejemplos son ejemplares de los métodos para llevar a la práctica la presente invención y no se pretende que limiten el alcance de la invención.

EJEMPLOS Efecto in vitro de MDPK67B sobre la supervivencia de célula de neutrófilo Para determinar la viabilidad de neutrófilos in vitro, se lisan los eritrocitos de sangre periférica de donadores sanos y se aislan los neutrófilos o células mononucleares de sangre periférica (PB C). Los cultivos en RPMI con FCS 10% se realizan en placas de microtitulación de 96 pozos (5 x 105 células/pozo), a menos que se indique en otro sentido. El porcentaje de neutrófilos apoptósicos o PBMC se determina en base en la unión de proteina anexina V fluorescente y la unión o medición de expresión de superficie de CDllb o CD16 por análisis FACS (clasificador de células activado por fluorescencia) .

Ejemplo 1 : apoptosis reducida por MDPK67b de neutrófilos in vitro de una manera dependiente de la dosis pero no tiene efecto significativo sobre la supervivencia de linfocitos T Figura 1: tinción con anexina-V de neutrófilos y linfocitos T cuando se incuban con inhibidores de proteasa MDPK67b y MD0KG9.

Figura la: tinción con anexina-V de neutrófilos y linfocitos T cuando se incuban con células MDPK67b que se incubaron durante 24 ó 48 horas con MDPK67b a una concentración que varia de 6 µ? a 60 µ?, como se indica, o PBS como control. Se determinó apoptosis por tinción con anexina-V y análisis FACS. Las poblaciones de leucocitos indicadas se activaron en base en su apariencia en una prueba dot plot de FACS dispersada hacia adelante/dispersada lateralmente (neutrófilos) o por tinción positiva para CD3 (linfocitos T) .

Figura Ib: tinción con anexina-V de neutrófilos cuando se incuban con MDPK67b o DOKG9 (OKDG9) .

Los neutrófilos se incuban durante 18 horas con MDPK67b o MD0KG9 en concentraciones que varían de 60 µ? (dilución 1) a 60 pM (dilución 7) como se indican. La apoptosis se determinó como se indica antes.

Conclusión: MDPK67b a dosis que varían de 60 µ? en y que descienden hasta 0.6 µ? inhiben la apoptosis de neutrófilos. MDOKG9 presentó un efecto similar protegiendo a lo neutrófilos evitando que presentarán apoptosis. Este efecto fue específico para neutrófilos y MDPK67B no inhibió la apoptosis de monocitos o linfocitos.

Ejemplo 2 : la protección mediada por MDPK67b de neutrófilos contra apoptosis es independiente de las condiciones de cultivo.

Figura 2: Comparación de varias condiciones de cultivo celular a través de tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con MDPK67b.

Los neutrófilos se cultivaron con las concentraciones indicadas de MDPK67b. Como control se utilizó PBS sin MDPK67b. Los neutrófilos se sembraron en placa (100 µ?/????) ya sea a 5 x 106/ml (densidad alta) o 3 x 105/ml (densidad baja) y la apoptosis de neutrófilos se determinó por tinción con anexina-V y análisis FACS. El cultivo de 5 x 106/ml neutrófilos en medio libre de suero (X-Vivo 15) en vez de RPMI con FCS 10% se determinó en paralelo.

Conclusión: MDPK67b inhibe la apoptosis de neutrófilos in vitro independientemente de- la densidad celular y la presencia o ausencia de suero en el medio de crecimiento.

Ejemplo 3: El inhibidor PP2 de Src tirosina cinasa invierte la disminución mediada por MDKP67b en la apoptosis de neutrófilos.

Figura 3: Inversión de protección de neutrófilos mediada por MDPK67b por inhibidores de tirosina cinasa.

Figura 3a: Efecto de MDPK67b sobre las concentraciones de CD16 y CDllb de neutrófilos cultivados. Se cultivan neutrófilos con las concentraciones indicadas de MDPK67b y el porcentaje de neutrófilos que expresan ambas concentraciones de CD16 o CDllb se determina por FACS. Se muestran gráficas de FACS representativas.

Figura 3b: Inversión del efecto de MDPK67b en las concentraciones de CD16 y CDllb de neutrófilos por PP2. Se cultivaron neutrófilos con las concentraciones indicadas de MDPK67b en presencia o ausencia de inhibidor de PP2 de Src tirosina cinasa (cóncentración final, 10 µ?) . La apoptosis y frecuencias relativas de neutrófilos que expresan concentraciones elevadas de CDllb y CD16 se miden por análisis FACS.

Conclusión: MDPK67b incrementa la dependencia en la dosis y la frecuencia de neutrófilos que expresan CD16 y CDllb en concentraciones altas, lo cual se asocia con apoptosis disminuida. La frecuencia aumentada de neutrófilos que expresan concentraciones elevadas de CDllb y la apoptosis disminuida en presencia de MDPK67b se puede invertir en presencia del inhibidor PP2 de Src tirosina cinasa. Se observaron efectos similares con otros inhibidores de cinasa que bloquean las vías de muestreo intracelular que incluyen el inhibidor PI3K, Ly294002 y el inhibidor ERK PD98059.

Ejemplo 4 : Efecto superior de MDPK67b en comparación con G-CSF en la protección de neutrófilos de apoptosis Figura 4: Efecto de G-CSF en la apoptosis in vitro de neutrófilos.

Se cultivaron neutrófilos con las concentraciones indicadas de G-CSF y se analizó la apoptosis de neutrófilos (a) y la regulación por disminución de la expresión de CD16 (b) por FACS. (c) Se cultivaron neutrófilos con MDPK67b (0.6 µ?) y en cantidades tituladas de G-CSF (concentraciones según se indica) . Los neutrófilos se cultivaron en medio y PBS (sin MDPK67b) se sirvió como un control.

Conclusión: El efecto de MDPK67b en la apoptosis de neutrófilos no es afectada por G-CSF el cual únicamente tiene sólo un efecto de protección ligera sobre la apoptosis de neutrófilos .

Ejemplo 5: NDPK67b reduce la apoptosis citostática inducida por droga de neutrófilos Figura 5: Tinción con anexina-V y CD16 de neutrófilos tratados con MDPK67b y etoposido.

Figura 5a: Tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con MDPK67b y etoposido.

Las células se incubaron durante 18 horas con MDPK67b (6 µ?) más etoposido (125 µg/ml) , etoposido sólo o PBS . La apoptosis se determinó por tinción con anexina-V y análisis FACS. Las poblaciones de leucocitos relevantes se activaron en base en su apariencia en una gráfica de puntos (dot plot) FACS de dispersor delantero o dispersor lateral.

Figura 5b: Tinción con anexina-V de neutrófilos tratados con MDPK67b bajo e incremento en las concentraciones de etoposido.

Las células se incubaron durante 18 horas con MDPK67b (0.06 µ?) sólo o MDPK67b (0.06 µ ) más concentraciones en aumento de etoposido (en g/ml), como se indica o PBS. La apoptosis se determinó por tinción con anexina-V y se realizó el análisis FACS, como se menciona en lo anterior.

Figura 5c: Tinción con CD16 de neutrófilos tratados con MDPK67b y etoposido.

Se incubaron las células durante 18 horas con MDPK67b (0.06 µ? sólo o MDPK67b (0.06 µ?) más concentraciones en aumento de etopósido (en µ?/???) como se indica, o PBS. Los porcentajes de neutrófilos que expresan CD26 elevados se analizaron por análisis FACS .

Conclusión: Incluso dosis elevadas (hasta 125 µ /ml) de medicamento citostático etopósido bloquean sólo parcialmente el efecto reductor de apoptosis de MDPK67b.

E emplo 6 : Análisis por RT-PCR de la expresión de KLK en lineas de células leucémicas y células mononucleares derivadas de donador y neutrófilos .

Materiales y Métodos: Se cultivaron las lineas celulares DU-145, PC-3, T47D, OVCAR-3, HL-60, THP1 y U937 en medio estándar apropiado con suero bovino fetal desactivado 10% y se incubaron a 37°C con C02 5%. Las células mononucleares y de neutrófilos se aislaron. El ARN total se extrae de las células utilizando reactivo Trizol (Life Technologies, Inc.) y el equipo PureLink Micro-to-Midi (Invitrogen) y dos µg de ARN total se sometió a transcripción inversa en una primera cadena de ADNc utilizando Superscript III (Invitrogen) en una reacción de 20 µ? siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las reacciones de PCR se realizaron utilizando cebadores específicos para cada uno de los cebadores de calicreína y actina como control. Todos los cebadores ya se han descrito en la literatura (Harvey TJ et al., J Biol Chem, 2000 Diciembre 1; 275(48): 37397-406. Yousef GM et al., J Biol Chem. 2001, Enero 5; 276 (1): 53-61. Yousef GM et al., Cáncer Res. 2001 Abril 15; 61 ( 8 ): 3425-31 ) . Dependiendo de la reacción de PCR, el ARN aislado de diferentes lineas de células que incluye DU-145, PC-3, T47D, OVCAR-3 se utilizaron como controles positivos para expresión de KLK (Harvey TJ et al., J Biol Chem, 2000 Diciembre 1; 275 (48 ): 37397-406) .

Las condiciones de ciclado dependen del gen objetivo y principalmente como se describe en Harvey TJ et al., (J Biol Chem, 2000 Diciembre 1; 275 (48 ): 37397-406) . La mezcla de PCR se somete a electroforesis en un gel de agarosa 2% y se visualiza por tinción con bromuro de etidio. Cuando se indica, las bandas de ADN del tamaño predicho se cortan del segundo gel de agarosa 2% siguiendo electroforesis y se secuencia el ADN recuperado.

Cebadores utilizados para amplificación por RT-PCR de KLK: KLK15R ATCACACGGGTGGTCATGT Resultados : Tabla 2: Expresión de patrones de los 15 genes para KLK obtenidos por análisis RT-PCR en líneas de células leucémicas y células mononucleares derivadas de donador y neutrófilos. Los siguientes símbolos utilizados representan ++, expresión moderada/alta; +, expresión baja; (1) productos de PCR del tamaño predicho secuenciado y confirmado que es la secuencia correcta.

Conclusión El análisis por RT-PCR en los niveles de expresión de KLK en lineas de células leucémicas y células de sangre humana aisladas indica que las KLK múltiples se expresan y que las diferentes células tienen patrones de expresión muy diversos para la familia de proteasa KLK. Tales diferencias en los niveles de expresión de KLK pueden estar involucrados en inhibidores de calicreina con efectos diferentes que tienen cultivos in vivo de estas células como la protección descrita contra apoptosis en células de neutrófilos.

LISTADO DE SECUENCIAS Secuencia de AND, variantes de ACT : MD 820 SEQ ID NO: 1 ATGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCACCCTCCGTTCTCGAGCAGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteinica, variante de ACT: MD 820 SEQ ID NO: 2 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDK EEVEAMLLPETLKR RDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKITLRSRAVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de ADN que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de AND, variante de ACT : MD 62 SEQ ID NO: 3 ArGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATGACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGÁTGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteínica, ' variante de ACT: MD 62 SEQ ID NO: 4 RGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKR RDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKITRRSIDVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de AND, variante de ACT: MD 83 SEQ ID NO: 5 ArGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteinica, variante de ACT: MD 83 SEQ ID NO: 6 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKK VMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKIRGRSELVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQ IFFMSKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de ADN, variante de ACT : MD 67 SEQ ID NO: 7 ATGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteinica, variante de ACT: MD 67 SEQ ID NO: 8 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFIÍAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKIKLRTTLVETRTIVRFNRPFLMI IVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y- con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de AND, variante de ACT: MD 61 SEQ ID NO: 9 ArGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCATGACAAGATCTAACGCAGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteinica, variante de ACT: MD 61 SEQ ID NO: 10 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKA.PDKN VI FSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKK VMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKR RDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKIMTRSNAVETRTIVRFNRPFLMI IVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de ADN, variantes de ACT: MD 518 SEQ ID NO: 11 ATGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteínica, variantes de ACT: MD 518 SEQ ID No: 12 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWE PFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKR RDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKITERVSPVETRTIVRFNRPFLMIIVPTDTQNIFF SKVTNPKQA* Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de ADN, variantes de ACT: MDCI SEQ ID NO: 13 ArGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAATCACCTTTAGATCTGCATTAGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Secuencia proteinica, variantes de ACT: MD CI SEQ ID No: 14 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQT MVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPM SLHHLTIPYFR - 7 - DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKR RDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKITFRSALVETRTIVRFNRPFL IIVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Secuencia de ADN de MDPK67b SEQ ID NO: 15 ATGCATCCGAACAGCCCGCTGGATGAAGAAAACCTGACCCAGGAAAACCAGGATCGCGGCA CCCATGTGGATCTGGGTCTGGCCAGCGCGAACGTGGATTTTGCGTTCAGCCTGTATAAACA GCTGGTGCTGAAAGCGCCGGATAAAAACGTGATTTTTAGCCCGCTGTCTATTAGCACCGCG CTGGCCTTTCTGAGCCTGGGCGCGCATAACACCACCCTGACCGAAATTCTGAAAGGCCTGA AATTTAACCTGACCGAAACCAGCGAAGCGGAAATTCATCAGAGCTTTCAGCATCTGCTGCG TACCCTGAACCAGAGCAGCGATGAACTGCAGCTGTCTATGGGCAACGCGATGTTTGTGAAA GAACAGCTGTCTCTGCTGGATCGTTTTACCGAAGATGCGAAACGTCTGTATGGCAGCGAAG CGTTTGCGACCGATTTTCAGGATAGCGCGGCGGCGAAAAAACTGATTAACGATTATGTGAA AAACGGCACCCGTGGCAAAATTACCGATCTGATCAAAGATCTGGATAGCCAGACCATGATG GTGCTGGTGAACTACATCTTCTTCAAAGCGAAATGGGAAATGCCGTTTGATCCGCAGGATA CCCATCAGAGCCGTTTTTACCTGAGCAAAAAAAAATGGGTGATGGTGCCGATGATGAGCCT GCATCATCTGACCATTCCGTATTTTCGTGATGAAGAACTGAGCTGCACCGTGGTGGAACTG AAATATACCGGCAACGCGAGCGCGCTGTTTATTCTGCCGGATCAGGATAAAATGGAAGAAG TGGAAGCGATGCTGCTGCCGGAAACCCTGAAACGTTGGCGTGATAGCCTGGAATTTCGTGA AATTGGCGAACTGTATCTGCCGAAATTTAGCATTAGCCGCGATTATAACCTGAACGATATT CTGCTGCAGCTGGGCATTGAAGAAGCGTTTACCAGCAAAGCGGATCTGAGCGGCATTACCG GTGCGCGTAACCTGGCCGTGAGCCAGGTGGTGCATAAAGCGGTGCTGGATGTGTTTGAAGA AGGCACCGAAGCGAGCGCGGCGACCGCGGTGAAAATTAAACTGCGTACCACCCTGGTGGAA ACCCGTACCATTGTGCGTTTTAACCGTCCGTTTCTGATGATTATTGTGCCGACCGATACCC AGAACATCTTTTTCATGAGCAAAGTGACCAATCCGAAACAGGCGTAA Secuencia de aminoácidos de MDPK67b SEQ ID NO: 16 MHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKNVIFSPLSISTA LAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDELQLSMGNAMFV EQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITDLIKDLDSQTMM VLVNYI FFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWV VPMMSLHHLTI PYFRDEELSCTVVEL KYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLP FSISRDYNLNDI LLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATAVKIKLRTTLVE TRTIVRFNRPFL I IVPTDTQNI FFMSKVTNPKQA Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN Subrayado y con fondo gris: secuencia de AND que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de ADN de ACT-G9 (nombres alternativos: MDOKG9, OKDG9) SEQ ID NO: 17 - - ATGAGAGGATCCCATCACCATCACCATCACTCTAGACACCCTAACAGCCCACTTGACGAGG AGAATCTGACCCAGGAGAACCAAGACCGAGGGACACACGTGGACCTCGGATTAGCCTCCGC CAACGTGGACTTCGCTTTCAGCCTGTACAAGCAGTTAGTCCTGAAGGCCCCTGATAAGAAT GTCATCTTCTCCCCACTGAGCATCTCCACCGCCTTGGCCTTCCTGTCTCTGGGGGCCCATA ATACCACCCTGACAGAGATTCTCAAAGGCCTCAAGTTCAACCTCACGGAGACTTCTGAGGC AGAAATTCACCAGAGCTTCCAGCACCTCCTGCGCACCCTCAATCAGTCCAGCGATGAGCTG CAGCTGAGTATGGGAAATGCCATGTTTGTCAAAGAGCAACTCAGTCTGCTGGACAGGTTCA CGGAGGATGCCAAGAGGCTGTATGGCTCCGAGGCCTTTGCCACTGACTTTCAGGACTCAGC TGCAGCTAAGAAGCTCATCAACGACTACGTGAAGAATGGAACTAGGGGGAAAATCACAGAT CTGATCAAGGACCTTGACTCGCAGACAATGATGGTCCTGGTGAATTACATCTTCTTTAAAG CCAAATGGGAGATGCCCTTTGACCCCCAAGATACTCATCAGTCAAGGTTCTACTTGAGCAA GAAAAAGTGGGTAATGGTGCCCATGATGAGTTTGCATCACCTGACTATACCTTACTTCCGG GACGAGGAGCTGTCCTGCACCGTGGTGGAGCTGAAGTACACAGGCAATGCCAGCGCACTCT TCATCCTCCCTGATCAAGACAAGATGGAGGAAGTGGAAGCCATGCTGCTCCCAGAGACCCT GAAGCGGTGGAGAGACTCTCTGGAGTTCAGAGAGATAGGTGAGCTCTACCTGCCAAAGTTT TCCATCTCGAGGGACTATAACCTGAACGACATACTTCTCCAGCTGGGCATTGAGGAAGCCT TCACCAGCAAGGCTGACCTGTCAGGGATCACAGGGGCCAGGAACCTAGCAGTCTCCCAGGT GGTCCATAAGGCTGTGCTTGATGTATTTGAGGAGGGCACAGAAGCATCTGCTGCCACCGCG GTCAAAACCGTTGACTACGCTGCTCTGGTGGAGACGCGTACCATTGTGCGTTTCAACAGGC CCTTCCTGATGATCATTGTCCCTACAGACACCCAGAACATCTTCTTCATGAGCAAAGTCAC CAATCCCAAGCAAGCCTAA Cursivas: codón de inicio ATG Negrillas: etiqueta His Subrayado: mutación de ADN - - Subrayado y con fondo gris: secuencia de ADN que codifica para la mutación RSL.

Secuencia de aminoácidos de: ACT-G9 (nombres alternativos: MD0KG9 , 0KDG9) SEQ ID NO: 18 MRGSHHHHHHSRHPNSPLDEENLTQENQDRGTHVDLGLASANVDFAFSLYKQLVLKAPDKN VIFSPLSISTALAFLSLGAHNTTLTEILKGLKFNLTETSEAEIHQSFQHLLRTLNQSSDEL QLSMGNAMFVKEQLSLLDRFTEDAKRLYGSEAFATDFQDSAAAKKLINDYVKNGTRGKITD LIKDLDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVP MSLHHLTIPYFR DEELSCTVVELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGELYLPKF SISRDYNLNDILLQLGIEEAFTSKADLSGITGARNLAVSQVVHKAVLDVFEEGTEASAATA VKTVDYAALVETR IVRFNRPFLMI IVPTDTQNIFFMSKVTNPKQA* Cursivas y negrillas: metionina de inicio Negrillas y subrayado: etiqueta His Subrayado: mutación de aminoácido (agregado) Subrayada y con fondo gris: mutación RSL

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento o prevención de pacientes que padecen de neutropenia, caracterizado porque comprende la administración a los pacientes en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidores de serina proteasa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa es un inhibidor de calicreina.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inhibidor de calicreina se selecciona de entre los inhibidores hK2, hK3, hK4, hK5, hK6, hK7, hK8 , hK9, hKIO, hKll, hK12, hK13, hK14, hK15 o mezclas de los mismos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el inhibidor de calicreina se selecciona de entre los inhibidores hK2, hK4, hKll, hK5, hK14 o mezclas de los mismos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el inhibidor de calicreina es un inhibidor de hK2.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

7. Inhibidores de serina proteasa para uso en un método para tratar o evitar neutropenia en pacientes la cual se desarrolla debido a infecciones, septicemia, quimioterapia, irradiación, sustancias químicas tóxicas o como efectos secundarios de cualquier medicación.

8. Inhibidores de serina proteasa para uso en un método de tratamiento o prevención de neutropenia de conformidad con la reivindicación 7, en donde el número y/o estado de activación de neutrofilos está deteriorado.

9. Inhibidores de serina proteasa de conformidad con la reivindicación 8, para uso en un método para tratar o evitar úlceras cutáneas en pacientes con diabetes en el cual los neutrofilos experimentan muerte celular o úlceras cutáneas que se desarrollan en pacientes con enfermedad arterial periférica asociada con condiciones hipóxicas en la piel y disfunción de neutrofilos y apoptosis.

10. Inhibidores de serina proteasa de conformidad con la reivindicación 7, para uso en un método para tratar o evitar daño inducido por irradiación de células mieloides como se produce en el curso de tratamiento de cánceres malignos, accidentes en plantas nucleares o uso de armas nucleares .

11. Los inhibidores de serina proteasa de conformidad con la reivindicación 7 a 10, caracterizados porque los inhibidores de serina proteasa es un inhibidor de calicreina .

12. Los inhibidores de serina proteasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizados porque el inhibidor de calicreina se selecciona de inhibidores desde hK2, hK3, hK4, hK5, hK6, hK7 , hK8 , hK9, hKIO, hKll, hK12, hK13, hKl4, hK15 o mezclas de los mismos.

13. Inhibidores de serina proteasa de conformidad con las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

14. Inhibidores de serina proteasa para uso en la preparación in vitro de neutrófilos y sus precursores de médula ósea para realizar manipulaciones moleculares para genoterapía antes de la infusión de. células mieloides a pacientes con neutropenia o trastornos genéticos del sistema mieloide, o para utilizar neutrófilos y sus precursores de médula ósea para infusión a pacientes con neutropenia o disfunción de neutrófilos.

15. Los inhibidores de serina proteasa de conformidad con la reivindicación 14, caracterizados porque los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC'lD NO: 18 o mezclas de los mismos.

16. Un método para la prevención de apoptosis en células mieloides de pacientes, caracterizado porque comprende la administración a los pacientes en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidores de serina proteasa: (1) durante y después de la transfección de células de médula ósea realizada para genoterapia, (2) durante la movilización de blastocitos sanguíneos realizada para reconstitución de hematopoyesis y/o (3) durante la infusión de células de la línea mieloide para reconstitución de hematopoyesis para genoterapia o para el tratamiento de neutropenia por infusión de neutrófilos.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.

18. Un equipo para diagnóstico, pronóstico, profilaxis o tratamiento de neutropenia en un mamífero, caracterizado porque el equipo comprende inhibidores de serina proteasa, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones para uso.

19. El equipo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa comprenden una marca detectable o se pueden unir a una marca detectable para formar un complejo detectable .

20. El equipo de conformidad con las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa es un inhibidor de calicreína.

21. El equipo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el inhibidor de calicreína se selecciona de entre los inhibidores hK2, hK3, hK4, hK5, hK6, hK7, hK8, hK9, hKIO, hKll, hKl2, hK13, hK14, hK15 o mezclas de los mismos.

22. El equipo de conformidad con las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque los inhibidores de serina proteasa se seleccionan del grupo que comprende SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 18 o mezclas de los mismos.