MX2011003366A - Peptido antagonista de la actividad de la interleucina-15. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con la rama de la farmacología molecular, en particular con un péptido derivado de la secuencia de la Interleucina-15 (IL-15), que fue optimizado para inhibir la actividad biológica de esta molécula. En la presente invención se muestra que el péptido, al unirse a la subunidad alfa del receptor (IL-15Ra), inhibe la proliferación de células T inducida por la IL-15, la inducción de Factor de Necrosis Tumoral a(TNFa) por IL-15, y la expresión de la IL-8 e IL-6 por la IL-15Ra. La invención se relaciona, además, con el uso del péptido en el tratamiento de patologías donde la expresión anormal de la IL-15 o IL-15Ra está relacionada con el curso de la enfermedad, como la artritis reumatoide (AR) y el cáncer de próstata.

Description

PEPTIDO ANTAGONISTA DE LA ACTIVIDAD DE LA INTERLEUCINA-15 Campo de la invención La presente invención se relaciona con la rama de la farmacología molecular, y en particular se refiere a un péptido derivado de la Interleucina-15 (IL-15) , que impide la unión de la citocina a la subunidad alfa del receptor (IL-15Ra) , por lo que es útil para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la expresión anormal de la IL-15 y/o de la IL-15Ra en el curso de la enfermedad.

? Antecedentes de la invención La citócina conocida como IL-15 es una glicoprotelna de 14-15 kDa, que fue identificada simultáneamente por dos grupos, como un factor que activa células T (Grabstein, .H. et al., Science 1994, 264, 965 -968; Burton, J.D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1994, 91, 4935-4939). El acido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-15 está presente en una amplia variedad de células y tejidos, sin embargo la proteína es s raramente encontrada en el sobrenadante de cultivo de estas células que expresan el transcripto, ya que existe un fuerte control post-trancripcional de su expresión al nivel de la* traducción y el trafico intracelular (Bamford RN. et al., J. Immunol 1998, 160: 4418-4426; Kurys G, et al., J Biol Chem 2000, 275: 30653-30659). Además, se ha descrito REF . : 219029 que la IL-15 puede existir en forma activa como una proteína de membrana (Musso et al. Blood 1999, 93: 3531-3539) y más recientemente se observó que puede funcionar como ligando o como receptor. La IL-15 expresada como proteína integral de membrana actúa como receptor y al unirse la subunidad alfa del receptor soluble induce la secreción de las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-8, la activación de las quinasas llamadas MAPK y FAK, y promueve la migración en células de carcinoma de próstata (PC-3) que expresan la IL-15 en la membrana celular (Budalgian et al., J. Biol Chem 2004, 40: 42192-42201) .

Los efectos biológicos de la IL-15 como ligando, son mediados a través de la unión de la IL-15 a un receptor en la membrana celular compuesto por tres subunidades, llamadas a, ß, y y. La tres subunidades pueden co-expresarse en una misma célula o puede ocurrir que la IL-15 unida a la subunidad alfa sea presentada a células que expresan solo las subunidades ß y ? e inducir la señalización en esta célula, un fenómeno conocido como señalización en trans (Burkett et al . J Exp . Med 2004, 200: 825-834) . La subunidad ß del receptor es compartida con la IL-2, citocina con la cual la IL-15 presenta una alta homología estructural, y la subunidad ? es compartida con otras citocinas, como IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-21. La IL-15Roc, es específica para la IL-15, a la cual se une con muy alta afinidad (Kd 10"11) y puede encontrarse como receptor de membrana o en forma soluble (Budagian V. et al . J Biol Chem. 2004 24:40368-75; Mortier et al., J. of Immunology 2004, 173 : 1681-1688) .

Se han encontrado altos niveles de expresión de la IL-15 asociados a la patogénesis de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, como la enfermedad de Crohn (Kirman I., Am. J. Gastroent^rol . 1996, 91: 1789-1794), la soriasis (Rückert R. J. Immunol 2000, 165: 2240-2250), leucemias (Yamada Y. Leukemia and Limphoma 1999, 35: 37-45) y artritis reumatoide (AR) (Mclnnes I.B., Immunology Today 1998, 19: 75-79).

En la AR, Mclnnes y colaboradores encontraron anormalidades en la' expresión de la IL-15, altas concentraciones en el fluido sinovial y la expresión de la citocina en células de la membrana sinovial. Ellos sugirieron que la IL-15 precede al Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa) en la cascada de citocinas, proponiendo un mecanismo dependiente del contacto celular en el cual células T activadas por IL-15 inducen la síntesis de TNFa por macrófagos . Proponen, además, que la IL-15 actúa como un importante factor en la migración de células T hacia el fluido sinovial (Mclnnes et al., Nat Med 1997, 3: 189-195). Ziolkowska y colaboradores informaron que la IL-15 induce la expresión de la IL-17 en la articulación de pacientes con AR y es conocido que esta citocina estimula la liberación por sinoviocitos de mediadores de la inflamación como IL-6, IL-8, Factor de Estimulación de Colonias de Granulocitos-Macrófagos, y prostaglandina E2 , sugiriendo un papel importante a la IL-15 en la patogénesis de la AR (Ziolkowska et al., J Immunology 2000,164: 2832-2838) . Recientemente, se demostró que la IL-15 exacerba la artritis inducida por colágeno (del inglés collagen induced artritis , abreviado CIA) en un ratón transgénico de esta citocina (Yoshihara et al., Eur J. Immunol . 2007, 37: 2744-2752) . Todos estos elementos sugieren que la acción de un antagonista de la IL-15 tiene un potencial terapéutico en el tratamiento de la AR y otras enfermedades autoinmunes e inflamatorias.

Se ha descrito previamente que el residuo Acido Aspártico en la posición 56 de la molécula de IL-15 es importante en la unión a la subunidad ß del receptor y que el residuo Glutamina en la posición 156 es importante en la unión a la subunidad ? del receptor. Muteínas (proteínas mutadas) de estos aminoácidos se comportan como moléculas antagonistas de la IL-15 que se unen a la subunidad a del receptor e impiden la traducción de señal a través de las subunidades ß y ?. Anticuerpos que reconocen estos aminoácidos también actúan como antagonistas de la IL-15 (patente No. US6177079, patente No. US6168783, patente No. US6013480, patente No. US6001973, patente No. US9706931, Solicitud de' patente internacional No. W09741232) .

El uso de antagonistas de la citocina ha sido efectivo en modelos animales de soriasis (Villadsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 2003, 112: 1571-1580) y en AR ( Ferrari -Lacraz S. et al, J. Immunol 2004, 173: 5818-5826) .

Ruchatz y colaboradores generaron un fragmento soluble de la IL-15Ra murina y demostraron que la administración de este fragmento inhibe la artritis inducida por colágeno en ratones DBA/1 (Ruchatz H, J. Immunology 1998, 160: 5654-5660) . Posteriormente, se encontró que la IL-15Roc puede actuar como un potente agonista de la función biológica de la IL-15 (Mortier E. J. Biol. Chem. 2006, 281:1612-1619; Rubinstein MP, PNAS 2006, 103: 9166-9171) .

Genmab posee la patente de anticuerpos humanos específicos para IL-15 (Solicitud de patente No. WO03017935) , en ella se describen cuatro anticuerpos. Dos de ellos llamados 146B7 y 146H5 que se unen a la IL-15 en la región que interactúa con la subunidad ? del receptor, e inhiben la proliferación celular inducida por IL-15 de la línea celular CTLL-2 ^ en, células mononucleares de sangre periférica (del inglés peripheral blood mononuclear cells, abreviado PBMC) , y los anticuerpos llamados 404A8 y 404E4 que no inhiben la proliferación. De estos anticuerpos el 146B7, se encuentra en Fase clínica II para el tratamiento de la AR por la compañía Amgen, con la denominación de AMG714.

Bernard y colaboradores en el 2004 identificaron dos secuencias de unión de la IL-15 a la subunidad a del receptor. Estas secuencias están comprendidas entre el aminoácido (aa) 44 al 52 y 64 al 68 de la proteína madura, y describen muteínas que pueden actuar como agonistas o antagonistas de la IL-15 (Bernard J. et al. J Biol Chem 2004, 279 : 24313-24322) .

Santos y colaboradores describieron un péptido antagonista de la IL-15 (Solicitud de patente No. O2006/029578 ) . La aplicación de un péptido de pequeña talla (10 aa) como antagonista de IL-15 tiene la ventaja de bloquear selectivamente la unión de la IL-15 a la subunidad del receptor y mediar o impedir los efectos de la IL-15 debidos a la interacción con la subunidad receptora.

Sin embargo, la identificación de secuencias peptídicas antagonistas de la IL-15 que posean una mayor solubilidad y actividad biológica que el mencionado péptido posee singular importancia .

Breve descripción de la invención Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado al proporcionar un péptido más soluble y más activo que el péptido descrito en la Solicitud de patente No. WO2006/029578 , obteniéndose una disminución en la concentración inhibitoria 50, o sea en la concentración de la sustancia que produce un 50% de inhibición (IC50) , de 130 µ? a 8 µ , producto del cambio de la segunda Lys por el aminoácido Thr y la obtención de la forma dimérica. La secuencia (SEQ ID NO. 12) , sintetizada como un péptido lineal de 10 aminoácidos, interactúa con la subunidad del receptor y muestra capacidad antagonista de la IL-15.

La optimización consistió en la realización de sustituciones puntuales de los aminoácidos del péptido para identificar los aminoácidos esenciales en su actividad antagonista de la IL-15. En las sustituciones que contemplan cambios de carga, en el caso particular de la segunda lisina del mencionado péptido por treonina con una carga neutra o por ácido glutámico que aporta una carga negativa, se obtuvo un incremento en la actividad antagonista del péptido 10 veces superior. Además se encontró que la forma dimérica de este péptido formada entre dos moléculas de péptido a través de la cisteina libre es 7 veces más activa que forma monomérica .

Como resultado se encontró que, en específico, la sustitución antes mencionada da como resultado un péptido 10 veces más :..,activo en el ensayo de proliferación de la línea celular CTLL-2 dependiente de IL-15. Este péptido mantiene la capacidad de unión a la subunidad ot del receptor para la IL-15.

El péptido ^resultante, que constituye la esencia de esta invención, tiene la secuencia aminoacidica que aparece como SEQ ID NO. 12 en el listado de secuencias. Este aumento en la actividad del péptido como resultado del cambio indicado del aminoácido Lys por Thr resulta sorprendente. Sobre la base de la información disponible, para las personas versadas en este campo de la técnica no se esperaba que el cambio en la estructura primaria del péptido generara un aumento tan marcado en la actividad biológica del péptido, como el que se demuestra en los ejemplos de realización de la presente invención .

Al obtener por síntesis química un dímero del péptido que aparece en la Lista de Secuencias como SEQ ID No. 12 a través de la Cys libre, este resulta 7 veces más activo que la forma monomérica y 15 veces más activo que el péptido original descrito en la solicitud de patente No. WO2006/029578.

El péptido con la secuencia aminoacídica listada como SEQ ID No. 12 al unirse a la cadena alfa soluble, como se describe en la presente invención, puede inhibir el efecto de señalización inversa a través de la IL-15 de membrana referido por Budalgian y colaboradores en el 2004 (Budalgian et al., J. Biol Chem 2004, 40: 42192-42201).

La presente invención contempla el uso del mencionado péptido en el tratamiento de la AR, solo o en combinación con alguna otra molécula apropiada, como por ejemplo drogas esteroidales anti- inflamatorias (como los corticosteroides ) y drogas modificadoras del curso de la enfermedad (por ejemplo, el methotrexato) .

Es también objeto de la presente invención el uso tópico de este péptido en el tratamiento de enfermedades que se manifiestan en la piel y en cuyas lesiones se detecta la expresión de la IL-15 en el curso de la enfermedad, como en la soriasis y el Linfoma de células T cutáneo.

En una modalidad de la invención, el péptido se utiliza para inhibir la unión de la subunidad ot del receptor soluble a la IL-15 expresada en la membrana de la célula tumoral e inhibir su migración.

El. péptido objeto de la presente invención puede tener una estructura lineal o puede estar dimerizado, y se caracteriza fundamentalmente por su capacidad antagonista de la IL-15. Por otro lado, se demuestra el efecto in vitro que produce el péptido objeto de la presente invención en un ensayo celular de proliferación en la línea murina CTLL-2, y "en la línea humana de Leucemia linfocítica Kit225.

Para la identificación del péptido descrito en esta invención se realizó el mapeo de alanina del péptido descrito en la solicitud de patente No. WO2006/029578. Cada péptido mutante se sintetizó químicamente por el método de síntesis en fase sólida. Después se purificaron por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (del inglés High Performance Liquid Chromatography, abreviado HPLC) y se analizaron por espectrometría de masa, obteniéndose en todos los casos más de 95% de pureza. Cada péptido se evaluó en cuanto a su efectividad para inhibir la actividad biológica de la IL-15.

El péptido objeto de la presente invención inhibe la expresión de IL-8 inducida por IL-15R . Este mismo péptido inhibe la expresión de IL-6 y la liberación de TNF alfa (TNF ) inducida por IL-15Ra.

En una modalidad de la invención el péptido es obtenido por manipulación génica o por síntesis química. En una materialización de la invención el péptido es obtenido como dímero formado entre dos moléculas de péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12. En una modalidad particular, el dímero es obtenido a partir de dos moléculas de péptido que se dimerizan a través de la cisteina libre.

Es también objeto de la presente invención el acido desoxirribonucleico (ADN) que codifica para el péptido cuya secuencia es la SEQ ID No. 12, su producto de expresión es capaz de unirse a la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 o a su fracción soluble, e inhibe la actividad biológica de la Interleucina-15. En una materialización de la invención, un vector que contenga la secuencia de ADN puede ser usado como alternativa para la expresión de la secuencia peptídica.

Los resultados obtenidos sugieren el empleo del péptido reivindicado en la presente invención como herramienta terapéutica en el tratamiento de enfermedades relacionadas con una sobreexpresión de la IL-15, como las mencionadas anteriormente, en las cuales se justifica la utilización de antagonistas de la IL-15.

Por tanto, es también objeto de la presente invención una composición farmacéutica terapéutica capaz de inhibir la actividad biológica de la IL-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 caracterizada porque contiene un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12. En una materialización de la invención, la composición farmacéutica terapéutica comprende el péptido dimerizado. En una modalidad de la invención, la composición farmacéutica comprende el péptido monomérico o dimérico conjugado, o mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables. En otra materialización, la composición farmacéutica terapéutica capaz de inhibir la actividad biológica de la IL-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 contiene la cadena de ácido nucleico que codifica para el péptido (SEQ ID No . 12) .

Es también objeto de la presente invención el uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la soriasis y para el tratamiento del cáncer de próstata.

Breve descripción de las figuras Figuras 1A-1C. Efecto de diferentes concentraciones de péptido sobre la proliferación de la línea CTLL-2 inducida por IL-15. Las células CTLL-2 se incubaron con 300 pg/mL de IL-15 en combinación con diluciones seriadas de los péptidos. La proliferación se midió utilizando la tinción mitocondrial con 3- (4 , 5dimetiltiazol-2-il) 2,5 bromurodifeniltetrazolio (MTT) . Figura 1A: Evaluación de los péptidos con SEQ ID No . 4 y SEQ ID No. 5; Figura IB: Evaluación de los péptidos SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3; Figura 1C: Evaluación de los péptidos SEQ ID No. 7, SEQ ID No .8 y SEQ ID No . 9.

Figura 2. Gráfico que muestra la unión de la IL-15Ra humana a los péptidos. Se evaluó el desplazamiento de la unión de la IL-15 a la lL-l5Ra por los péptidos mediante ELISA.

Figura 3. Efecto de diferentes concentraciones de péptido sobre la proliferación de la línea KÍT225 inducida por IL-15. Las células KÍT225 se incubaron con 300 pg/mL de IL-15 en combinación con diluciones seriadas de los péptidos. La proliferación se midió usando la tinción mitocondrial MTT.

Figura 4. Efecto del péptido sobre la proliferación de la línea CTLL-2 inducida por diferentes concentraciones de IL-15 y una concentración fija de péptido. Las concentraciones de IL-15 utilizadas fueron: 75 pg de IL-15/ml (1); 150 pg de IL-15/ml (2); 300 pg de IL-15/ml (3).

Figuras 5A-5B . Gráficas que muestran el efecto inhibitorio del péptido sobre la inducción del ARNm de la IL-8 (Figura 5A) y la IL-6 (Figura 5B) en las células de la línea celular PC-3 por incubación con la IL-15R a.

Figura 6. Inhibición de la liberación de TNF alfa inducida por IL-15 al incubar células de fluido sinovial con el péptido. Células de fluido sinovial de pacientes con AR se incubaron con IL-15 (100 ng/mL) en combinación con una concentración de 65 µ? del péptido por 48h. La cantidad de TNF alfa se midió por ELISA. Se muestran datos de controles con derrame de líquido sinovial por trauma.

Descripción detallada de la invención La presente invención se explica a través de los siguientes ejemplos de realización: E emplo 1. Optimización de un péptido de la IL-15 que se une a la IL-15RO. e inhibe la función biológica de la IL-15.

Diseño A partir del péptido reivindicado en la solicitud de patente No. WO2006/029578 , se diseñó un panel de péptidos en los que se realizó la sustitución de cada aminoácido por el aminoácido alanina (Ala) . En otro grupo de péptidos se realizó la sustitución de la cisteina (Cys) por Ser, y Lys por Thr o Glu.

Síntesis de péptidos Los péptidos se sintetizaron por la estrategia Fmoc/tBu en eringuillas. Se utilizó la resina Fmoc-AM-MBHA a 0,54 mmol/g y se siguió el protocolo de síntesis con agitación mecánica. Después del tratamiento con ácido trifluoracético, los péptidos se liofilizaron y se caracterizaron por HPLC y espectrometría de masa. Todos los péptidos fueron obtenidos con más del 95% de pureza y hubo correspondencia entre la masa obtenida y la esperada para la secuencia de aminoácidos correspondiente .

Ejemplo 2. Efecto de los péptidos descritos sobre la proliferación de las lineas celulares CTLL-2 y KÍT225.

Las líneas CTLL-2 y KÍT225 son dependientes de IL-15 y proliferan en presencia de la citocina. Moléculas que se unen a la IL-15 e impiden la transducción de señal a través del receptor inhiben la proliferación de estas líneas.

Para evaluar la capacidad neutralizante de los péptidos de la presente invención se realizaron diluciones seriadas de los mismos en placas de cultivo de 96 pocilios (Costar, Estados Unidos) en un volumen de 25 L de medio RPMI (Gibco) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Gibco) . Se añadieron las células CTLL-2 o KÍT225 (previamente lavadas) a una concentración de 5 x 103 células por pocilio y se permitió la incubación por 30 min, luego una cantidad saturante de IL-15 de 300 pg/mL se añadió a cada pocilio.

Se evaluó también la capacidad antagonista de los péptidos variando la concentración de IL-15 a una concentración fija de péptido de 260 uM. Se incubó por 72 h a 37 °C y 5% de C02. Para medir la proliferación se usó la tinción mitocondrial MTT (Cosman et al., Nature 1984, 312: 768-771) . El MTT es reducido por la deshidrogenasa mitocondrial de la célula viva a formazan púrpura. Se determinó la IC50 de cada péptido para una concentración de IL-15 de 300 pg/mL.

Tabla 1. Listado de péptidos evaluados y valor de la IC50 obtenido en el ensayo de proliferación en la línea CTLL-2 Péptido IC50 (µ?) KVTAMKCFLL 130 KVTAMKCFLA 260 KVTAMKCFAL 200 KVTAMKCALL 0 KVTAMKAFLL 0 KVTAMACFLL n.d KVTAAKCFLL 130 Péptido ic50 (µ ) KVAA KCFLL 130 KATAMKCFLL 130 AVTAMKCFLL n.d KVTAMKSFLL 0 KVTAMTCFLL 24 , 6 KVTAMECFLL 0 KVTAMTCYLL 57, 7 n.d:" No determinado Este ensayo se empleó en la evaluación de todos los péptidos, permitiendo obtener la IC50 mostrada en la Tabla I. Los valores de IC50 muestran la pérdida del efecto inhibitorio del péptido en los mutantes Cys-Ala, Cys-Ser, Phe-Ala y Gly-Glu; y la afectación de este efecto en casi un 50% en los mutantes Leu-Ala. Se obtiene una actividad inhibitoria 5 veces superior en el mutante Lys-Thr y 15 veces superior en la forma dimérica del mutante Lys-Thr.

En las Figuras 1A, IB y 1C aparece representado el comportamiento de la Densidad Optica (DO) a 576 nm obtenida para las diferentes concentraciones de péptido para los mutantes Phe-Ala, Cys-Ala, Leul-Ala, Leu2-Ala, Met-Ala, Thr-Ala, Val -Ala. En la Figura 3 se muestra el comportamiento para el mutante Lys-Thr en su forma monomérica y dimérica, donde se observa que el efecto inhibitorio es dependiente de la concentración del péptido y un mayor efecto inhibitorio para la forma dimérica del mutante Lys-Thr.

Se evaluó también la capacidad antagonista de los péptidos variando la concentración de IL-15 a una concentración fija de péptido. En la Figura 4 se observa que el efecto antagonista del péptido mutante Lys-Thr es dependiente de la concentración de IL-15.

Ejemplo 3. ELISA de competencia para estudiar la capacidad de los péptidos de desplazar la unión a la IL-15Ra.

Los péptidos fueron caracterizados por la unión a la IL-15R a por ELISA. Brevemente, placas de 96 pocilios fueron recubiertas con IL-15 purificada en PBS y bloqueadas con albúmina bovina al 1% en tampón fosfato salino (del inglés Phosphate Buffered Saline, abreviado PBS) . Diluciones de cada péptido fueron añadidas a los pocilios y la incubación se realizó por 1 hora a 37°C. La placa se lavó con PBS-Tween 20 y se incubó con IL-15Ra-Fc por 1 hora a 37°C. Se repitieron los lavados y se incubó con un conjugado anti Fc-IgG humana-peroxidasa por 1 hora a 37°C. Se repitieron los lavados y se reveló la reacción antigeno-anticuerpo en presencia del sustrato y 3, 3', 5, 5 'Tetrametilbencidina (TMB) obteniéndose la lectura de DO a 450nm. Los resultados se muestran en la Figura 2, donde se observa que el mutante Cys-Ala (SEQ ID No. 5) no desplaza la unión de la IL-15Rot a la IL-15 y el mutante Phe-Ala (SEQ ID No . 4) desplaza solo un 10% de la unión.

Ejemplo 4. Evaluación del efecto del péptido (SEQ ID No. 12) sobre la expresión de IL-8 y de la IL-6 en la linea de cáncer de próstata PC-3. ' Se evaluó el efecto del péptido (SEQ ID No. 12) sobre la expresión de la IL-8 e IL-6 que es mediada por la unión de la IL-15R0C a la IL-15 presente en la membrana de las células PC-3 (Budagian V., et al. J. Biol. Chem 2004 279: 42192-42201). El experimento se realizó en placas de 24 pocilios incubando 1, 5 xlO6 células con una concentración de 100 µ? /mL de los péptidos SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 12 y de la IL15Ralfa (1 ng/mL) y combinaciones de IL-15Roc con los péptidos SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 12.

El ARN se aisló por el método de TriReagent (Sigma) y se analizó por medida de la DO a 260/280 nm y por electroforesis en gel de agarosa. Se realizó la Transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real empleando Quantitect Reverse Transcription Kit y QuantiTect SYBR Green PCR (QUIAGEN) en un equipo Rotor Gene 6000.

En las Figuras 5A y 5B se observa que el péptido SEQ ID No. 12 inhibe la transcripción de las citocinas pro-inflamatorias IL-8 e IL-6 inducida por IL-15R .

Ejemplo 5. Inhibición dé la producción de TNF alfa inducida por IL-15 por el péptido SEQ ID No. 12 dimerizado, en células de fluido sinovial de pacientes con Artritis reumatoide (AR) .

El líquido sinovial de pacientes con AR, después de obtener el consentimiento informado, fue extraído e incubado con hialuronidasa a 10 pg por mL de fluido por 45 min a 37°C. Después de centrifugación a 1200 revoluciones por minuto por 10 min se obtuvieron las células del fluido sinovial.

En placa de 96 pocilios se incubaron 2xl05 células por pocilio con 50µg/mL de péptido, 60 ng/mL de IL-15 y combinación de péptido más IL-15. Después de 48 horas de incubación se colectó el sobrenadante y se guardó a -70 °C para su evaluación. La cantidad de TNFoc se cuantificó por ELISA (R&D DTA50) .

En la Figura 6 se muestra que el péptido con la SEQ ID No. 12 inhibe la secreción de TNFa en células del fluido sinovial de paciente con AR.

Ejemplo 6: Modelo xenotransplante en ratones SCID de psoriasis humana.

Ratones SCID (2-3 meses de edad) fueron transplantados con una pieza de piel de 1,5 cm x 1,5 cm proveniente de paciente con soriasis . Tres semanas después del trasplante, r * t los ratones fueron aleatorizados en tres grupos: placebo, ratones tratados con el péptido SEQ ID No. 12 a una dosis de 10 mg/kg de peso y tratados con ciclosporina A a una dosis de 10mg/Kg, en días alternos durante 2 semanas. Una semana después de la última inyección, los ratones fueron sacrificados y una biopsia de 4mm se tomó de cada xenotransplante . Las biopsias se fijaron en formalina para la incrustación de parafina, y se tiñeron con hematocilina y eosina (H & E) .

Como resultado del experimento se observó que la piel proveniente de pacientes con soriasis tratada con el péptido SEQ ID No. 12 o su forma dimérica, muestran una reducción en la severidad de la enfermedad, una reducción importante en el espesor de la epidermis, en el número de células inflamatorias y el ciclo de los queratinocitos , así como en el grado de parakeratosis de las lesiones soriáticas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un péptido antagonista de la actividad de la Interleucina-15 caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12.

2. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se une a la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 (IL-15Rcc) o a su fracción soluble.

3. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la actividad biológica de la Interleucina-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor (IL-15Ra) .

4. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la expresión de IL-8 inducida por IL-15RCX.

5. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la expresión de IL-6 inducida por IL-15Ra.

6. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la liberación de TNF alfa (TNFct) inducida por IL-15.

7. Un péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a la 6, caracterizado porque el péptido es obtenido por manipulación génica o por síntesis química.

8. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el péptido es obtenido como dímero formado entre dos moléculas de péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12.

9. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el dímero es obtenido a partir de dos moléculas de péptido que se dimerizan a través de la cisteina libre .

10. Secuencia de ácido nucleico caracterizada porque codifica para un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12, su producto de expresión es capaz de unirse a la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 o a su fracción soluble, e inhibe la actividad biológica de la Interleucina-15.

11. Cadena de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque es capaz de inhibir la actividad biológica de la IL-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor formando parte de un vector de expresión.

12. Composición farmacéutica terapéutica capaz de inhibir la actividad biológica de la IL-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 caracterizada porque contiene un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12.

13. Composición farmacéutica terapéutica de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende el péptido (SEQ ID No. 12) dimerizado.

1 . Composición farmacéutica terapéutica de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende el péptido monomérico o dimérico conjugado, o mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables.

15. Composición farmacéutica terapéutica capaz de inhibir la actividad biológica de la IL-15 dependiente de la subunidad alfa del receptor celular de la Interleucina-15 caracterizada porque comprende la cadena de ácido nucleico de la reivindicación 10.

16. Uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide.

17. Uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Crohn.

18. Uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12 ¾ar Ia fabricación de un medicamento para el tratamiento de -la soriasis.

19. Uso de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en el listado de secuencia como SEQ ID No. 12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer de próstata.