CN102203118B - 白介素-15活性的肽拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子药理学领域，特别涉及衍生自白介素-15(IL-15)序列的肽，其中所述肽经优化以抑制该分子的生物学活性。在本发明中显示：该肽抑制IL-15诱导的T细胞增殖，肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导，以及IL-15受体α亚基(IL-15Rα)诱导的IL-8和IL-6的表达，所有这些效应是通过该肽与IL-15Rα的结合介导的。本发明还涉及肽用于治疗病症的用途，其中在所述病症中IL-15或IL-15Rα的异常表达与疾病的进程相关，所述病症是例如类风湿性关节炎(RA)和前列腺癌。

Description

白介素-15活性的肽拮抗剂
技术领域
本发明涉及分子药理学领域，特别描述了衍生自白介素-15(IL-15)的阻断该细胞因子与其受体的α亚基(IL-15Rα)的结合的肽，该肽用于治疗涉及在进展过程中异常表达IL-15和/或IL-15Rα的疾病。
现有技术
被称作IL-15的细胞因子是14-15kDa的蛋白，其由两个研究小组同时鉴定为T细胞激活因子(Grabstein，K.H.等人，Science 1994，264，965-968；Burton，J.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，4935-4939)。该细胞因子的信使核糖核酸(mRNA)存在于众多细胞和组织中，但是在表达转录本的培养的细胞的上清液中很少见到该蛋白，这是由于在翻译水平和细胞内运输水平上的强烈的转录后控制(Bamford RN.等人，J.Immunol 1998，160：4418-4426；Kurys G，等人，J Biol Chem 2000，275：30653-30659)。此外，已经描述了IL-15的活性形式可以以膜蛋白的形式出现(Musso等人Blood 1999，93：3531-3539)，最近发现，其可以作为配体和作为受体发挥作用。当以膜整合蛋白的形式表达时，IL-15通过与可溶性IL-15Rα的结合而作为受体发挥作用，激发IL-6和IL-8促炎性细胞因子的分泌，激活所谓的MAPK和FAK激酶并促进前列腺癌细胞(PC-3)的迁移，所述细胞在细胞膜上表达IL-15(Budalgian等人，J.Biol Chem 2004，40：42192-42201)。
IL-15的生物学效应是通过该细胞因子与存在于细胞膜上的受体的结合而介导的，所述受体包含3个亚基，即α、β和γ。它们可以在同一细胞上共表达，或者与α亚基结合的IL-15可以呈递至表达β和γ亚基的细胞，通过被称作反式信号传导的过程进一步诱导细胞信号传导(Burkett等人J Exp.Med 2004，200：825-834)。IL-15Rβ亚基被IL-2共享，IL-2是显示出与IL-15具有高度结构同源性的细胞因子，并且IL-15Rβ亚基也被其它细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-21共享。IL-15Rα亚基对于IL-15是特异性的，其介导非常高亲和性的结合(Kd＝10-11)，并且可以以膜受体或可溶性形式存在(Budagian V.等人J Biol Chem.200424：40368-75；Mortier等人，J.Immunol 2004，173：1681-1688)。
高水平的IL-15表达与自身免疫性和炎性疾病的致病相关，例如克罗恩病(Kirman I.，Am.J.Gastroenterol.1996，91：1789-1794)、牛皮癣(Rückert R.J.Immunol  2000，165：2240-2250)、白血病(Yamada Y.Leukemia and Limphoma 1999，35：37-45)和类风湿性关节炎(RA)(McInnes I.B.，Immunology Today 1998，19：75-79)。
McInnes等人发现了在RA中IL-15的异常表达、滑液中的高浓度的IL-15以及滑膜细胞中的IL-15的表达。他们提出：在细胞因子级联中，IL-15处于肿瘤坏死因子α(TNFα)之前，从而提出了巨噬细胞中IL-15激活的T细胞诱导的TNFα合成的细胞接触介导的机制。他们还提出，在T细胞向滑液的迁移中，IL-15是非常相关的因子(McInnes等人，Nat Med 1997，3：189-195)。Ziolkowska等人报道：IL-15诱导RA患者的关节中的IL-17表达，并且还知道，该细胞因子刺激滑液细胞分泌炎性介导子，例如IL-6和IL-8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和E2前列腺素，从而说明IL-15在RA致病中具有重要作用(Ziolkowska等人，J Immunology 2000，164：2832-2838)。最近证明，IL-15在该细胞因子的转基因小鼠中使胶原诱导的关节炎(CIA)加剧(Yoshihara等人，Eur J.Immunol.2007，37：2744-2752)。所有这些要素说明IL-15的拮抗性可作为治疗RA和其它自身免疫性和炎性疾病的潜在治疗剂。
之前已经描述了IL-15分子的位置56处的天冬氨酸残基与和IL-15Rβ的结合相关，并且位置156处的谷氨酰胺与和IL-15Rγ亚基的结合相关。突变的蛋白质，也称作突变蛋白(mutein)，作为拮抗分子，其拮抗IL-15与IL-15Rα的结合，并阻碍从IL-15Rβ和γ亚基的信号转导。识别这些氨基酸(aa.)的抗体也作为IL-15的拮抗剂(专利号US6177079、专利号US6168783、专利号US6013480、专利号US6001973/专利号US9706931、国际专利申请号WO9741232)。
该细胞因子的拮抗剂的使用已经被证明可用于牛皮癣的动物模型(Villadsen L.S.等人J.Clin.Invest.2003，112：1571-1580)和RA的动物模型(Ferrari-Lacraz S.et al，J.Immunol 2004，173：5818-5826)。
Ruchatz等人产生了鼠IL-15Rα的可溶性片段，当施用至DBA/1小鼠时，其抑制CIA(Ruchatz H，J.Immunology 1998，160：5654-5660)。随后发现，IL-15Rα可以作为IL-15的生物功能的有力的激动剂(Mortier E.J.Biol.Chem.2006，281：1612-1619；RubinsteinMP，PNAS USA 2006，103：9166-9171)。
Genmab拥有一项关于IL-15特异性抗体的专利(专利申请号WO03017935)，其中描述了4种抗体。其中2种被命名为146B7和146H5的抗体靶向与IL-15Rγ相互作用的IL-15区域，并且抑制CTLL-2细胞系和外周血单核细胞(PBMC)中IL-15诱导的细胞增殖。该专利还描述了抗体404A8和404E4，它们不抑制细胞增殖。在这4种抗体中，抗体146B7正在由Amgen公司进行针对RA的II期临床试验的测试，其被命名为AMG714。
Bernard等人在2004年鉴定了用于与IL-15Rα结合的IL-15分子的2个序列。这些序列包含成熟蛋白中的氨基酸44-52和64-68，并且他们还描述了可作为IL-15的激动剂或拮抗剂的突变蛋白(Bernard J.等人，J Biol Chem 2004，279：24313-24322)。
Santos等人描述了IL-15拮抗肽(专利申请号WO2006/029578)。使用小的(10个氨基酸)肽作为IL-15的拮抗剂是有利的，因为其选择性阻断IL-15与IL-15Rα的结合，并且介导或消除该相互作用的效应。
另一方面，鉴定相对于之前提及的肽具有更高的溶解性和增强的生物学活性以拮抗IL-15的肽序列是特别重要的。
具体实施方式
本发明通过提供比专利申请号WO2006/029578中描述的肽可溶性和活性更高的肽而促成了上述问题的解决，通过将第二个Lys替换为Thr并获得肽二体而使其抑制性浓度50(IC50)(即产生50％的抑制时该物质的浓度)从130μM降低到8μM。以10个氨基酸的线性肽的形式合成所述序列SEQ ID No.12，其与IL-15Rα相互作用并显示出IL-15拮抗剂能力。
通过点氨基酸替换对所述肽进行优化以鉴定对于其针对IL-15的拮抗活性而言必不可少的氨基酸。特别是对于第二个Lys，影响到电荷的替换，例如，将其替换为中性的Thr残基或带负电的Glu氨基酸，使该肽获得了10倍的拮抗活性。此外发现，通过游离的半胱氨酸连接的两个肽分子之间形成的二体的活性比单体高7倍。
获得了在CTLL-2细胞系的IL-15依赖性增殖测定中活性高10倍的肽，其是根据上述替换获得的。该肽还保留了与IL-15Rα结合的能力。
得到的肽，其为本发明的目标，包含如序列表中SEQ ID No.12所示的肽序列。在指明的Lys改变为Thr氨基酸之后发现的增加的活性是令人惊奇的。对其初级序列作出此改变之后，该肽的生物学活性的这样的增加对于本技术领域的任意技术人员而言是预料不到的(基于以前的发现)，如本发明的实施方式的实施例中所示。
通过游离的Cys连接序列为序列表中SEQ ID No.12的单体而获得的化学合成的肽二体的活性比单体高7倍，比专利号WO2006/029578中描述的最初的肽高15倍。
序列为SEQ ID No.12的氨基酸序列的肽可以通过其与可溶性α链的结合而抑制如Budalgian等人在2004年所报道的(Budalgian等人，J.Biol Chem 2004，40：42192-42201)通过膜IL-15进行的相反的信号传导效应。
本发明包括使用所述肽来治疗RA，单独使用或者与任何其它合适的分子例如类固醇抗炎药物(例如皮质类固醇)和影响疾病进程的药物(例如氨甲蝶呤)组合使用。
本发明的另一个实施方式包括该肽的局部施用以治疗皮肤疾病，其中在损伤中，在疾病例如牛皮癣和皮肤T细胞淋巴瘤的进程中检测到IL-15。
在本发明的另一个实施方式中，该肽用于抑制可溶性IL-15Rα与肿瘤细胞膜上表达的IL-15的结合，并且用于抑制肿瘤细胞迁移。
本发明的肽可以是线性肽或形成二体，主要特征在于其对IL-15的拮抗活性。另一方面，在CTLL-2鼠细胞系和人淋巴细胞Kit225白血病细胞系的细胞增殖测定中证明了本发明的肽的体外效应。
本发明中描述的肽是通过对专利申请号WO2006/029578中描述的肽进行Ala扫描鉴定的。通过固相合成方法化学地合成每种突变的肽。通过高效液相色谱(HPLC)纯化得到的肽并通过质谱法分析，纯度为95％以上。评估每种肽的抑制IL-15生物学活性的有效性。
本发明的肽抑制IL-15Rα诱导的IL-8的表达。同样的肽抑制IL-15Rα诱导的IL-6的表达和肿瘤坏死因子(TNFα)的释放。
在本发明的另一个实施方式中，通过基因操作或通过化学合成获得本发明的肽。在本发明的一个实施方式中，获得二体形式的肽，所述二体是由包含SEQ ID No.12所示的氨基酸序列的肽的两个分子形成的。在具体的实施方式中，所述二体是两个肽分子通过游离半胱氨酸进行二聚化而获得的。
本发明的另一个方面是，编码具有SEQ ID No.12所示的序列的肽的脱氧核糖核酸(DNA)，其表达产物，所述表达产物能够结合IL-15Rα或其可溶性部分并抑制IL-15的生物学活性。在本发明的一个实施方式中，携带所述DNA序列的载体可用于表达肽序列。得到的结果说明本发明中要求保护的肽作为治疗工具来治疗如上所述的疾病的用途，所述疾病的特征在于过度表达IL-15；并且证明了IL-15拮抗剂的用途。
因此，本发明的另一个方面是，能够抑制依赖于IL-15Rα的IL-15的生物学活性的治疗性药物组合物，其中所述药物组合物包含序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方式中，所述治疗性药物组合物包含二聚化的肽。在本发明的另一个实施方式中，所述的能够抑制IL-15Rα依赖性的IL-15生物学活性的治疗性药物组合物包含单体或二体形式的肽，其与可接受的药学赋形剂缀合或混合。在另一个实施方式中，所述的能够抑制IL-15Rα依赖性的IL-15生物学活性的治疗性药物组合物包含编码所述肽(SEQ ID No.12)的核酸链。
本发明的另一个方面是，包含如序列表SEQ ID No.12所示的氨基酸序列的肽在制备用于治疗类风湿性关节炎、克罗恩病、牛皮癣和前列腺癌的药物中的用途。
附图说明
图1.不同浓度的肽对于IL-15诱导的CTLL-2细胞系的增殖的效应。将CTLL-2细胞与300pg/mL IL-15以及连续稀释的肽一起温育。通过以3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑氢溴酸盐(MTT)进行线粒体染色来测定增殖。图1A：肽SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的评价；图1B：肽SEQ ID No.2和SEQ ID No.3的评价；图1C：肽SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9的评价。
图2的图显示了肽与人IL-15Rα的结合。通过ELISA测定肽对于IL-15与IL-15Rα的结合的置换。
图3.不同浓度的肽对于IL-15诱导的KiT225细胞系的增殖的效应。将KiT225细胞与300pg/mL IL-15以及连续稀释的肽一起温育。通过MTT线粒体染色来测定增殖。
图4.固定浓度的肽对于不同浓度的IL-15诱导的CTLL-2细胞系的增殖的效应。IL-15的浓度是75pg/mL(1)；150pg/mL(2)；300pg/mL(3)。
图5中的图显示了肽对于以IL-15Rα温育的PC-3细胞系的细胞中的IL-8(图5A)和IL-6(图5B)的mRNA的诱导的抑制性效应。
图6.通过以肽温育滑液细胞而对TNFα释放的抑制。将来自RA患者的滑液细胞与IL-15(100ng/mL)和肽(65μM)一起温育48小时。通过ELISA测定TNFα的量。显示了对照数据，其显示了由外伤引起的滑膜炎。
具体实施方式
通过以下实施例解释本发明。
实施例1.结合IL-15Rα并抑制IL-15的生物学功能的IL-15肽的优化
设计
通过将专利申请号WO2006/029578中要求保护的肽的序列中的每个氨基酸替换为丙氨酸(Ala)设计了一组肽。在另一组肽中，将半胱氨酸(Cys)替换为Ser，将Lys替换为Thr或Glu。
肽的合成
使用Fmoc/tBu策略在注射器中合成肽。使用浓度为0.54mmol/g的Fmoc-AM-MBHA树脂，在机械搅拌的条件下进行合成程序。使用三氟乙酸处理肽并冻干，进一步通过HPLC和质谱法表征。获得的所有的肽纯度都大于95％，并且其相应质量正如从其氨基酸序列所预期的。
实施例2.所描述的肽对于CTLL-2和KiT225细胞系的增殖的效应
CTLL-2和KiT225细胞系依赖于IL-15并且当存在该细胞因子时，这些细胞增殖。那些能够结合IL-15并阻断从IL-15R的信号转导的分子抑制这两种细胞系的增殖。
为了评估本发明的肽的中和能力，在96-孔板(Costar，USA)中的25μL体积的补充了10％胎牛血清(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中进行这些肽的连续稀释。以5x103个细胞/孔的密度加入之前经过洗涤的CTLL-2或KiT225细胞，并温育30分钟，并且每孔加入饱和量的300pg/mL IL-15。
还通过将每种肽的浓度固定在260μM而改变IL-15的浓度评估了肽的拮抗活性。在37℃和5％CO2中温育72h。通过使用MTT线粒体染色法(Cosman等人，Nature 1984，312：768-771)测定增殖。MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原为红色的甲臢。测定IL-15浓度为300pg/mL时每种肽的IC50。
表1.所评估的肽的列表和在CTLL-2细胞系增殖测定中获得的IC50值
  肽  IC50(μM)
  KVTAMKCFLL  130
  KVTAMKCFLA  260
  KVTAMKCFAL  200
  KVTAMKCALL  0
  KVTAMKAFLL  0
  KVTAMACFLL  n.d
  KVTAAKCFLL  130
  KVAAMKCFLL  130
  KATAMKCFLL  130
  AVTAMKCFLL  n.d
  KVTAMKSFLL  0
  KVTAMTCFLL  24.6
  KVTAMECFLL  0
  KVTAMTCYLL  57.7
n.d：未测定
该测定用于评估所有的肽，以获得表1所示的IC50值。这些IC50值显示：在Cys-Ala、Cys-Ser、Phe-Ala和Gly-Glu突变体中肽的抑制效应的丧失；在几乎50％的Leu-Ala突变体中该效应受到影响。对于Lys-Thr突变体获得了5倍的抑制活性，对于Lys-Thr突变体的二体形式获得了15倍的抑制活性。
图1A、1B和1C显示了不同浓度的肽Phe-Ala、Cys-Ala、Leu1-Ala、Leu2-Ala、Met-Ala、Thr-Ala和Val-Ala突变体在576nm处的光密度(O.D.)情况。图3显示了单体和二体形式的Lys-Thr突变体的性质，其显示出肽浓度依赖性的抑制效应，并且二体形式的Lys-Thr突变体的抑制效应更高。
还通过固定肽浓度而改变IL-15的浓度评估了肽的拮抗活性。图4显示了肽突变体Lys-Thr的拮抗活性对于IL-15浓度的依赖性。
实施例3.用于研究肽置换与IL-15Rα的结合的竞争性ELISA
通过ELISA表征肽与IL-15Rα的结合。简而言之，以磷酸盐缓冲液(PBS)中的纯化的IL-15包被96-孔板并以PBS中的1％的牛白蛋白封闭。向孔中加入每种肽的稀释物，将平板在37℃温育1小时。以PBS-Tween 20洗涤平板并与IL-15Rα-Fc在37℃一起温育1小时。再次以PBS-Tween 20洗涤平板，并与抗Fc-人IgG-过氧化物酶缀合物在37℃一起温育1小时。洗涤之后，通过加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)进行抗原-抗体反应，在450nm处读取O.D.。结果显示于图2，图中显示Cys-Ala突变体(SEQ ID No.5)不置换IL-15与IL-15Rα的结合，并且突变体Phe-Ala(SEQ ID No.4)仅置换10％的IL-15。
实施例4.肽(SEQ ID No.12)对于前列腺癌细胞系PC-3中的IL-6和IL-8表达的效应的评估
评估了肽(SEQ ID No.12)对于IL-6和IL-8的表达的效应，其表达由IL-15与PC-3细胞的细胞膜上的IL-15Rα的结合所介导(Budagian V.，等人J.Biol.Chem 2004279：42192-42201)。
实验在24孔板中进行：将1.5x106个细胞与浓度为100μg/mL的肽SEQ ID No.1和SEQ ID No.12与IL-15Rα(1ng/mL)一起温育，以及与IL-15Rα与肽SEQ ID No.1和SEQ ID No.12的组合一起温育。
通过TriReagent法(Sigma)分离RNA并通过测定O.D.260/280nm比例和琼脂糖凝胶电泳进行分析。通过使用Quantitect ReverseTranscription Kit和QuantiTect SYBR Green PCR(QIAGEN)在Rotor Gene 6000仪器中进行实时逆转录和聚合酶链式反应。
图5A和5B显示：肽SEQ ID No.12抑制IL-15Rα介导的促炎性细胞因子IL-6和IL-8的转录。
实施例5.二体形式的肽SEQ ID No.12对于RA患者的滑液细胞中IL-15介导的TNFα产生的抑制
在获得书面知情同意之后，从RA患者提取滑液并与透明质酸酶(10μg/mL液体)在37℃温育45分钟。在1200rpm离心10分钟后获得滑液细胞。
将细胞以2x105个细胞/孔的密度铺板于96孔板并与50μg/mL的肽和60ng/mL的IL-15一起温育，也与肽+IL-15的组合一起温育。温育48小时后，收集上清液并储存于-70℃，直至进行评估。通过ELISA(R&D DTA50)定量TNFα的量。
图6显示：肽SEQ ID No.12抑制RA患者的滑液细胞中的TNFα的分泌。
实施例6：人牛皮癣的异种移植SCID小鼠模型
将来自牛皮癣患者的1.5cmx1.5cm的皮肤移植物移植进入2-3月龄的SCID小鼠。3周后，将小鼠随机分成3个组：安慰剂、以浓度为10mg/kg体重的肽SEQ ID No.12处理的小鼠和以浓度为10mg/kg的环孢霉素处理的小鼠，所述处理为隔天处理，持续2周。最后1次注射后1周，处死小鼠并从每个异种移植物获取4mm的活组织检查样品。将所述活组织检查样品固定于福尔马林中以进行石蜡包埋，并以苏木精-伊红染料(H&E)染色。
结果：观察到经过肽SEQ ID No.12或二体形式的肽处理的小鼠中的来自牛皮癣患者的皮肤移植物显示出疾病严重性的降低，表皮厚度的显著降低，炎性细胞数目和角化细胞周期的显著降低以及牛皮癣损伤中的角化不全程度的降低。
Figure IDA0000056490490000011
Figure IDA0000056490490000021

Claims (16)

1.拮抗IL-15的活性的肽，其特征在于由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1的肽，其中所述肽能够结合IL-15的细胞受体的α亚基（IL-15Rα）或结合其可溶性部分。
3.根据权利要求1的肽，其中所述肽抑制依赖于IL-15Rα的IL-15的生物学活性。
4.根据权利要求1的肽，其中所述肽抑制由IL-15Rα介导的IL-8的表达。
5.根据权利要求1的肽，其中所述肽抑制由IL-15Rα介导的IL-6的表达。
6.根据权利要求1的肽，其中所述肽抑制由IL-15介导的肿瘤坏死因子α（TNFα）的释放。
7.根据权利要求1-6任一项的肽，其中所述肽是通过基因操作或通过化学合成获得的。
8.二体形式的肽，其中所述二体是通过两个序列为SEQ IDNO:12的肽分子中的游离半胱氨酸发生二聚化而获得的。
9.核酸序列链，其特征在于编码由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成的肽，其中其表达产物能够结合IL-15的细胞受体的α亚基或结合其可溶性部分，并且抑制IL-15的生物学活性。
10.能够抑制依赖于IL-15的细胞受体的α亚基的IL-15生物学活性的治疗性药物组合物，其中所述组合物含有由如序列表中SEQ IDNo.12所示的氨基酸序列组成的肽。
11.根据权利要求10的治疗性药物组合物，其中所述组合物包含权利要求8所述的二体形式的肽。
12.根据权利要求10的治疗性药物组合物，其中所述组合物包含SEQ ID No.12的肽，其为单体或缀合的二体或与可接受的药学赋形剂混合，其中所述二体是通过两个序列为SEQ ID NO:12的肽分子中的游离半胱氨酸发生二聚化而获得的。
13.由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成的肽在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
14.由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成的肽在制备用于治疗克罗恩病的药物中的用途。
15.由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成的肽在制备用于治疗牛皮癣的药物中的用途。
16.由如序列表中SEQ ID No.12所示的氨基酸序列组成的肽在制备用于治疗前列腺癌的药物中的用途。
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