MX2011002731A - Modulacion de bcl11a para tratamiento de hemoglobinopatias. - Google Patents

Modulacion de bcl11a para tratamiento de hemoglobinopatias.

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Abstract

La invención se relaciona a métodos y usos de la modulación de la expresión de hemoglobina fetal (HbF) en células progenitoras hematopoyéticas por la vía de inhibidores de la expresión o actividad de BCL11A, tales como RNAi y anticuerpos.

Description

MODULACIÓN DE BCLllA PARA TRATAMIENTO DE HEMOGLOBINOPATÍAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hemoglobina de adulto normal comprende cuatro proteínas de globina, dos de las cuales son proteínas alfa (a) y dos de. las cuales son proteínas beta (ß) . Durante el desarrollo fetal mamífero, particularmente en humanos, el feto produce hemoglobina fetal, que comprende dos proteínas de gamma (?) -globina en lugar de las dos proteínas de ß-globina. En algún punto durante el desarrollo fetal o la infancia, dependiendo de la especie e individuo particular, un cambio de globina ocurre, referido como el "cambio fetal", punto en el cual, los eritrocitos en el feto cambian de hacer predominantemente ?-globina a hacer predominantemente ß-globina. El cambio de desarrollo de la producción de hemoglobina predominantemente fetal o HbF (a2?2) a la producción de hemoglobina adulta o HbA (a2ß2) comienza en aproximadamente 28 a 34 semanas de gestación y continúa poco tiempo después del nacimiento hasta que HbA llega a ser predominante. Este cambio resulta principalmente de la transcripción disminuida de los genes de gamma-globina y la transcripción incrementada de los genes de beta-globina . En promedio, la sangre" de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2% de HbF, aunque los niveles de HbF residuales tienen una variación de arriba de 20 veces en adultos sanos (At eh; Semin. Hematol. 38(4): 367-73 (2001)).
Las hemoglobinopatías abarcan un número de anemias de origen genético en el cual hay una producción disminuida y/o destrucción (hemolisis) incrementada de glóbulos rojos (RBCs) . Estos también incluyen defectos genéticos que dan por resultado la producción de hemoglobinas anormales con una capacidad deteriorada concomitante para mantener la concentración . de oxigeno. Algunos de tales desórdenes involucran la falla para producir ß-globina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la falla para producir ß-globina normal completamente. Estos desórdenes asociados con la proteína de ß-globina son referidos generalmente como ß-hemoglobinopatías . Por ejemplo, las ß-talasemias resultan de un defecto parcial o completo en la expresión del gen de ß-globina, conduciendo a HbA deficiente o ausente. La anemia de célula falciforme resulta de una mutación puntual en el gen estructural de ß-globina, que conduce a la producción de una hemoglobina anormal (falciforme) (HbS) . Las RBCs de HbS son más frágiles que las RBCs normales y se someten a la hemolisis más fácilmente, conduciendo eventualmente a anemia (Atweh, Semin. Hematol. 38 (4) : 367-73 (2001) ) .
Recientemente, la investigación para el tratamiento se dirigió en la reducción del desequilibrio de la cadena de globina en pacientes con ß-hemoglobinopatías que se ha enfocado sobre la manipulación farmacológica de la hemoglobina fetal ( 2?2; HbF) . El potencial terapéutico de tales procedimientos es sugerido por las observaciones del fenotipo leve de individuos con co-herencia de ß-talasemiá homocigota y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH) , así como por aquellos pacientes con °-talasemia homocigota quienes no sintetizan hemoglobina adulta, pero en quienes un requerimiento reducido para transfusiones se observa en la presencia de concentraciones incrementadas .de hemoglobina fetal. Además, se ha observado que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anormalidades de ß-cadena tienen niveles más altos que los normales de hemoglobina fetal (HbF) , y se han observado que tienen un curso clínico más leve de enfermedad que los pacientes con los niveles de adultos normales de HbF. Por ejemplo, un grupo de pacientes de anemia de célula falciforme de Arabia Saudita quienes expresan 20-30% de HbF tienen solamente manifestaciones clínicas leves de la enfermedad (Pembrey, y colaboradores, Br. J. Haematol. 40:415-429 (1978)). Ahora se acepta que los desórdenes de hemoglobina, tal como la anemia de célula falciforme y las ß-talasemias, son aminoradas por la producción de HbF incrementada (Revisado en Jane y Cunningham Br. J. Haematol. 102:415-422 (1998) y Bunn, N. Engl. J. Med. 328:129-131 (1993)).
Como es mencionado anteriormente, el cambio de hemoglobina fetal a hemoglobina adulta (a2?2; HbA) usualmente procede dentro de seis meses después del parto. Sin embargo, en la mayoría de pacientes con ß-hemoglobinopatías, los genes de ? globina corriente arriba están intactos y completamente funcionales, de modo que si estos genes llegan a ser reactivados, la síntesis de hemoglobina funcional podría ser mantenida durante' la etapa adulta, y así aminorar la severidad de la enfermedad (Atweh, Semin. Hematol. 38(4) :367- 73 (2001)). Desafortunadamente, los mecanismos moleculares in vivo que involucran el cambio de globina no son bien entendidos.
La evidencia que sustenta la factibilidad de reactivación de la producción de hemoglobina fetal proviene de experimentos en los cuales se mostró que la sangre periférica, que contiene células clonogénicas , cuando se da la combinación apropiada de factores de crecimiento, produce colonias eritroides y estallidos en el cultivo semisólido. Las células individuales en tales colonias pueden acumular hemoglobina fetal (HbF) , hemoglobina adulta (HbA) o una combinación de ambas. En cultivos de sangre de adulto, las células rojas nucleadas acumulan ya sea (F-A+) solamente, o una combinación de HbF y HbA (F+A+) ( Papayannopoulou, y colaboradores, Science ' 199 : 1349-1350 (1978); Migliaccio, y ¦colaboradores, Blood 76:1150-1157 (1990)). Importantemente, las colonias individuales contienen ambas de las células F+ y F-, indicando que ambos tipos son progenie de las mismas células madre en circulación. Asi, durante las etapas tempranas de desarrollo en cultivo, las células ejecutan una opción, a través de mecanismos actualmente desconocidos, que ya sea o no expresan HbF. La proporción de células F+ adultas que se desarrollan en cultivo no aparecen para ser reprogramadas in vivo, sino aparecen para depender de las condiciones de cultivo: Un cambio en la ruta de expresión de HbF y HbA combinada, por ejemplo, se puede lograr in vitro mediante altas concentraciones en el suero, debido a la actividad de un compuesto no identificado que puede ser absorbido en carbón activado (Bohmer, ¦ y colaboradores, Prenatal Diagnosis 19:628-636 (1999); Migliaccio, y colaboradores, Blood 76:1150 (1990); Rosenblum, y colaboradores, in: Experimental Approaches for the Study of Hemoglobin 397 (1985)).
Globalmente, la identificación de moléculas que desempeñan una función en el cambio de globina es importante para el desarrollo de estrategias terapéuticas novedosas que interfieren con la hemoglobina adulta e inducen la síntesis de hemoglobina fetal. Tales moléculas proporcionarían nuevos objetivos para el desarrollo de intervenciones terapéuticas para una variedad de hemoglobinopatías en las cuales la reactivación de la síntesis de hemoglobina fetal significativamente aminoraría la severidad y morbidez de la enfermedad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ¦ La invención se relaciona a métodos y usos de modulación de la expresión de hemoglobina fetal (HbF) por la vía de BCL11A.
La invención está basada, en parte, en la identificación de una función de la proteina BCL11A, específicamente que la proteína BCL11A actúa como un regulador específico de etapa de la expresión de hemoglobina fetal.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, que comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en la célula progenitora hematopoyética, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto.
La célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo, in vitro o in vivo. En una modalidad adicional, la célula progenitora hematopoyética que está en contacto es del linaje eritroide.
En una modalidad, la composición inhibe la expresión de BCL11A. En una modalidad, el inhibidor de la expresión de BCL11A se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico. En una modalidad preferida, el inhibidor es un ácido nucleico que comprende un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA o un vector que codifica un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA. En una modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID N0:l-6.
En una modalidad, la composición inhibe la actividad de BCLllA. En una modalidad, el inhibidor de la actividad de BCLllA se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCLllA o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña, y un ácido nucleico. En una modalidad más preferida, el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA, un vector que codifica un agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCLllA. En una modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende la etapa de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética en el mamífero, con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCLllA, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.
En una modalidad, el mamífero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía . En una modalidad adicional, la hemoglobinopatía es una ß-hemoglobinopatía . En otra modalidad, la hemoglobinopatía es una enfermedad de célula falciforme. La enfermedad de célula falciforme puede ser anemia de célula falciforme, enfermedad de hemoglobina C falciforme (HbSC) , beta-plus-talasemia falciforme (HbS/ +) y beta-cero-talasemia falciforme (HbS/ß?). En otra modalidad, la hemoglobinopatía es ß-talasemia.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto con la composición ex vivo o in vitro, y la célula o su progenie se administra al mamífero. En una modalidad adicional, la célula progenitora hematopoyética que se pone en contacto es del linaje eritroide .
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto con una composición que comprende un inhibidor de BCL11A y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, la composición que comprende un inhibidor de BCL11A se administra mediante inyección, infusión, instilación o ingestión.
En una modalidad, la composición que comprende un inhibidor de BCL11A inhibe la expresión de BCL11A. En otra modalidad, el inhibidor de la expresión de BCL11A se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A o un vector que codifica un agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCL11A. En una modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
En una modalidad, la composición que comprende un inhibidor de BCL11A inhibe la actividad BCL11A. En otra modalidad, el inhibidor de la actividad de BCL11A se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCL11A o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico. En una modalidad preferida, el inhibidor de ácido nucleico de la actividad de BCL11A es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A, un vector que codifica un agente de interferencia de RNA o un aptámero que enlaza BCL11A. En otra modalidad, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1-6.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para identificar un modulador de la actividad o expresión de BCL11A, el método que comprende poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una composición que comprende un compuesto de prueba, y medir el nivel de hemoglobina fetal o mRNA de hemoglobina fetal en la célula progenitora hematopoyética o su progenie, en donde un incremento en la hemoglobina fetal es indicativo de que el compuesto de prueba es un inhibidor candidato de la actividad o expresión de BCL11A.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto in vivo, ex vivo o in vitro. En una modalidad, la célula es de un origen humano, primate no humano o mamífero. En una modalidad, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, anticuerpo o ácido nucleico. En una modalidad preferida, la composición causa un incremento en la expresión de hemoglobina fetal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1B muestran la expresión de BCL11A en progenitores eritroides humanos.
La Figura 1A muestra las isof.ormas de BCL11A mayores presentes en extractos nucleares de células eritroides humanas.
La Figura IB compara la expresión de BCL11A y de hemoglobina fetal en. células eritroides en diferentes etapas de la ontogenia humana.
La Figura 2A demuestra que la variante común rs4671393 está asociada con la expresión de BCL11A en líneas de células linfoblastoides humanas de las poblaciones HapMap Europeas (CEU) y Africanas (YRI) .
La Figura 2B son manchados de Western de lisados de eritroblastos de medula ósea (BM) humana primaria, eritroblastos de hígado fetal (FL) del segundo trimestre, eritroblastos primitivos en circulación del primer trimestre y células K562. Los eritroblastos correspondientes en etapa humana primaria se aislaron al clasificar para la población doble positiva CD235 y CD71. Las bandas XL y L migran conjuntamente aquí como un resultado de la separación reducida sobre este manchado.
Las Figuras 3A-3D representan la metodología de clasificación de afinidad proteómica utilizada para, identificar proteínas asociadas de BCL11A en células eritroides.
La Figura 3A representa el esquema utilizado para la purificación por afinidad en células de eritroleucemia de ratón (MEL) .
La Figura 3B tabula los resultados de la clasificación sustractiva.
La Figura 3C exhibe los re3sultados de los análisis de los arreglos de Affymetrix.
La Figura 3D resalta la porción encontrada en BCL11A y otras diversas proteínas sugeridas para mediar las interacciones con el complejo represor NuRD.
Las Figuras 4A-4E muestras confirmaciones, de las interacciones de BCL11A con GATA-1, FOG-1, y el complejo NuRD en células eritroides.
La Figura 4A muestra los datos de inmunoprecipitación que confirma las interacciones de BCL11A con GATA-1, FOG-1, MTA2 y RBBP7 en células eritroides (MEL) .
La Figura 4B representa las interacciones de BCL11A con MTA2, GATA-1 y FOG-1 utilizando fracciones de filtración de gel de extractos nucleares eritroides.
Las Figuras 4C y 4D muestran datos de inmunoprecipitación que confirma las interacciones de BCL11A con GATA-1 y FOG-1 respectivamente mediante la expresión exógena en células Cos7.
La Figura 4E muestra los datos de inmunoprecipitación que mapea la interacción de BCL11A sobre la molécula GATA-1.
Las Figuras 5A-5E demuestran que BCL11A actúa como un represor del gen de ?-globina.
La Figura 5A demuestra que la inactivación mediada por siRNA de BCL11A da por resultado elevaciones de niveles de mRNA de ?-globina en células progenitoras eritroides humanas .
La Figura 5B representa la expresión del gen global que no es modificado . grandemente en células dirigidas con siRNA de BCL11A.
La Figura 5C muestra que el suministro de shRNA mediado por lentiviral a los progenitores eritroides humanos da por resultado una inactivación de 60%-97%.
La Figura 5D representa que las células dirigidas de sHRNA son morfológicamente indistinguibles de las células tratadas de control.
La Figura 5E muestra la inducción de mRNA de ?-globina en células en respuesta a la inactivación de BCL11A.
La Figura 5F muestra los hemolizados preparados de células en el día 12 de diferenciación que muestran la presencia de HbF madura.
La Figura 6A-H muestran que la ?-globina humana es principalmente expresada en células eritroides primitivas del ratón de la ß-posición.
La Figura 6A es una gráfica de FACS representativa que muestra" FSC (escala lineal) contra SSC (escala log) para la sangre embriónica E13.5. La confinación se muestra para permitir el enriquecimiento de linajes primitivos y definitivos.
La Figura 6B es un histograma que muestra la expresión relativa del gen e? globina de murino, el gen e embriónico humano y los genes de ?-globina humanos en la población primitiva (P), como es comparado con la población definitiva (D) . Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (n>3 por grupo). P=0.98 para una prueba t de dos lados que compara el enriquecimiento relativo de e? con ?-globina .
La Figura 6C-H son manchados inmunohistoquímicos representativos con un anticuerpo anti-HbF de hígados fetales E13.5 humanos y de murino. Tales imágenes se toman con un objetivo 60X.
La Figura 6C muestra los hígados fetales humanos que contienen numerosos eritroblastos , que todos manchan positivo para la expresión de ?-globina.
La Figura 6D y 6E muestra los eritroblastos definitivos del hígado, fetal de murino que no muestran manchado de ?-globina mayor y solamente células ocasionales con morfología primitiva megaloblástica muestra el manchado ( flechas ) .
La Figura 6E y 6F muestra muchas células primitivas megaloblásticas en la circulación que tiene el manchado altamente positivo (cabezas de flechas en la Fig. 6E; flechas en la Fig. 6F) , mientras que los eritrocitos definitivos más pequeños son negativos (en la Fig. 6F como círculos grises claros más pequeños) .
La Figura 6G y 6H muestran el manchado realizado en las líneas A2 0 y A8 58 de YAC de una sola copia que muestran patrones de manchado similares. El manchado positivo se determinó en comparación con el manchado antecedente para los controles de carnada negativos de transgén.
La Figura 7A-D muestra los análisis de PT-FISH que revelan que la expresión de ?-globina está en paralelo a las globinas embriónicas murinas en células eritroides primitivas. Dos lineas independientes de ratones YAC transgénicos, A85 (Fig. 7A y 7C) y A20 (Fig. 7B y 7D) se analizaron utilizando la fluorescencia de RNA de transcripto primario de cuatro colores de hibridación in situ (PT-FISH). Para el primer conjunto de experimentos, las sondas se hicieron para dirigirse a la a-globina de murino (mo¡) , ß-globina humana (?ß) , y ?-globina humana (hy) . Adicionalmente DAPI se utilizó para identificar núcleos de células.
Las Figuras 7A y B muestran la expresión de y-globina que predomina dentro de las dos lineas en las poblaciones primitivas observadas circulando en células de sangre primitivas (PBC) de embriones El 1.5 y E13.5. La expresión menor se observa en las poblaciones definitivas maduras del higado fetal (FL) en E13.5. Muchas de estas células pueden representar células primitivas encontradas dentro del parénquima FL.
La Figura 7C y 7D muestra una expresión paralela de msy y hy para PBC en E13.5 y FL en E13.5, respectivamente. Las gráficas representan el porcentaje de posiciones activas y se miden para =100 núcleos por conjunto de sondas en cada punto de tiempo.
La Figura 8A-8B muestran que la expresión de BCLllA varia entre humanos y ratones, indicando un modelo para la variación de trans-acción en la expresión del gen de ß-globina.
La Figura 8A muestra que las proteínas de longitud completa de células humanas de BCL11A (isoformas XL/L) se reducen dentro de las poblaciones de células que expresan altos niveles de ?-globina, incluyendo células primitivas y de hígado fetal.
La Figura 8B es un modelo esquemático que resume la ontogenia de la regulación del gen de globina similar a ß en humanos, ratones y ratones de ß-posición. La ontogenia de eritropoyesis mamífera y poblaciones progenitoras se muestra en la parte superior. Las poblaciones progenitoras, incluyendo las poblaciones eritroides primitivas (EryP-CFC) , células madre hematopoyéticas definitivas (HSC) , y células de unidad de formación de estallido eritroide definitivo (BFU-E) son representadas. El gonado-mesonefros de aorto (AGM) y la placenta son sitios de hematopoyesis definitiva. Los patrones de globina similar a ß y la expresión de BCL11A observada en las dos especies se muestran enseguida.
La Figura 9A-9F muestra que los ratones BCL11A -/-no logran silenciar la expresión de las globinas similares a ß embriónicas de ratón y los genes de ß-globina.
La Figura 9A muestra que el patrón de expresión CD71/Terll9 para células de hígado fetal de embriones E14.5, revelando eritropoyesis gruesamente normal con estos marcadores fenotípicos. Los porcentajes medios para las poblaciones de cada cuadrante se muestran en rojo (n=6 para fl/+ controles y n=4 para -/- mutantes) . El P > 0.1 por una prueba t de dos lados para todas las poblaciones confinadas se analizó.
La Figura 9B muestra que la expresión de las globinas embriónicas como un porcentaje de las globinas similares a ß de ratón total para los ratones de control (fl/+), BCLllA heterocigoto (+/-), y ratones nulos (-/-) en E14.5 (n=10, 14, 11 respectivamente).
La Figura 9C muestra que la expresión de las globinas embriónicas como un porcentaje de las globinas similares' a ß de ratón totales de 18.5 (n=9, 9, 7 respectivamente) .
La Figura 9D muestra que la inmunohistoquimica se realizó en E14.5 FLs de animales BCLllA fl/+ y -/- para la e? de globina embriónica. Las secciones representativas en aumento de 40X con un lente objetivo de 10X se muestran.
La Figura 9E muestra el manchado de IHC similar que se realizó para la globina ß?? . En ambos casos se observa expresión robusta en los eritroblastos dispersados del FL en -/-, pero no en los ratones de control.
La Figura 9F muestra la expresión de los genes de la posición de ß-globina humana para animales con los diversos genotipos BCLllA en la presencia del trasgén YAC de la posición ß (YAC+) en E14.5 (n=4, 6, 4 para los animales fl/+, +/-, y -/-, respectivamente) y E18.5 (n=4, 7, 4). Todos los niveles de ?- y ß-globina para los diferentes genotipos son significativamente diferentes (P < 1X10"5 por una prueba t de dos lados) . Todos los datos se grafican como la media ± la desviación estándar de la medición.
La Figura 10 muestra la incapacidad para recapitular las respuestas de estrés en ratones ß-YAC adultos. Los ratones ß-posición adulto se indujeron con una variedad de respuestas estimulantes de ?-globina.
La Figura 11 muestra el RNA de BCLllA se expresa en células definitivas de ratón, pero no en células primitivas.
La Figura 12 muestra que los ratones BCLllA -/- son morfológicamente normales y completamente carecen de la expresión de proteina BCLllA en el hígado fetal.
La Figura 12A son ejemplos de ratones de control (fl/+) y mutantes (-/-) de la misma carnada en E18.5. Los ratones se obtuvieron en relaciones mendelianas esperadas en E18.5 y los mutantes fueron indistinguibles morfológicamente de las carnadas de control.
La Figura 12B son la expresión de proteína de datos de BCLllA estimado en hígados fetales E18.5 y mostraron la expresión reducida en animales heterocigotos , con la expresión ausente en animales nulos. GAPDH se analizó como un control de carga.
La Figura 13 muestra que los ratones BCLllA -/-tiene eritropoyesis fenotípica normal en E18.5. La maduración eritroide se estimó utilizando los marcadores CD71 y Ter-1 19 en los hígados fetales de animales E18.5 (Sankaran, V. G., y colaboradores, 2008, Genes Dev 22, 463-475). Los valores medios en cada cuadrante se muestran (n=9 para los controles y 7 para los animales nulos) .
La Figura 14 muestra que los ratones BCL11A -/-tiene morfología eritroide normal. Las preparaciones de citospina de ejemplo de suspensiones de células únicas del hígado fetal manchado con la mancha de May-Grunwald-Giemsa se muestra de E14.5 y E18.5. Todas las imágenes se visualizaron con un objetivo 10X y con los aumentos de lente mostrados.
La Figura 15A y B son análisis histológicos de hígados fetales de ratones BCL11A -/- que revelan la histología gruesa normal y la eritropoyesis morfológica.
La Figura 15A muestra secciones sagitales que se muestran en baja resolución y muestran que no hay anormalidades histológicas gruesas observadas en estos ratones (en aumento de 5X) .
La Figura 15B muestra secciones . histológicas manchadas con hematoxilina y eosina (H&E) que se muestran en dos aumentos (objetivo 10X con un lente 40X) de hígados fetales E14.5 y E18.5. Estas secciones revelan agrupaciones de eritroblastos dentro del hígado fetal que aparecen para ser similares en cantidad y morfológicamente normales.
La Figura 16A y 16B muestran que · BCLllA -/- tiene una regulación hacia arriba de globinas embriónicas en el hígado fetal.
La Figura 16A muestra la expresión de RNA relativa de los genes de globina similar a ß que es mostrado para controles (BCL11A fl/+) , animales heterocigotos (BCL11A -/+) , y animales nulos (BCL11A -/-) en E14.5 (n=10, 14, 11 para estos grupos, respectivamente. Adicionalmente se muestra la expresión relativa del RNA de BCL11A. La expresión relativa se normaliza con respecto a GAPDH (con el- conjunto de GAPDH ajustado a un valor de 1) . Todos los datos se muestran como la media ± del error estándar de la medición.
La Figura 16B muestra la expresión de RNA relativa (normalizada a GAPDH) de los genes de globina similares a ß para controles, animales heterocigotos y animales nulos en E18.5 (n=9, 9, 7 para estos grupos, respectivamente). Todos los datos se muestran como la media ± la desviación estándar.
La Figura 17 es la inmunohistoquímica de ratones BCL11A -/- que muestra una regulación hacia arriba de globinas embriónicas en el hígado fetal. La inmunohistoquímica se realizó en E18.5 FLs de animales BCL11A fl/+ y -/- para la globina embriónica ß??. Secciones representativas en aumento de 40X con un lente objetivo de 10X son mostradas. El manchado de IHC similar se realizó para la globina e? como es marchado en la figura.
La Figura 18A exhibe los porcentajes de todos los genes de globina similares a ß humanos + la desviación estándar en E14.5 en las cruzas de ratones de ß-posición con los ratones mutantes BCLllA.
La Figura 18A exhibe los porcentajes para todos los genes de globina similares a ß humanos ± la desviación estándar en E18.5, en cruzas de ratones de ß-posición con ratones mutantes BCLllA. Todos los niveles de ?- y ß-globina para los diferentes genotipos son significativamente diferentes (P < 1X10"5 por una prueba t de dos lados) .
La Figura 19 muestra que BCLllA ocupa regiones discretas en la posición de ß-globina humana en progenitores eritroides adultos. La posición de ß-globina humana se representa en la parte superior con regiones que muestran el enlace significante sombreado en gris en la gráfica del histograma abajo. Los resultados se representan como la media con la desviación estándar como barras de error (n=3 por grupo) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos novedosos para la regulación de la síntesis de hemoglobina fetal (HbF) para el tratamiento de ß-hemoglobinopatías y métodos de clasificación en los mismos.
La invención está basada en la identificación de una función novedosa para la proteína BCLllA, específicamente que la proteína BCLllA actúa como un regulador específico de etapa de. la expresión de hemoglobina fetal y que la expresión de BCLllA reprime la inducción de ?-globina. Por consiguiente, la invención proporciona métodos novedosos para la regulación de la expresión de ?-globina en células eritroides. Más específicamente, estas actividades pueden ser aprovechadas en métodos para el tratamiento de ß-hemoglobinopatías mediante la inducción de ?-globina por la vía de la inhibición del producto génico de BCLllA.
La hemoglobina fetal (HbF) es un tetrámero de dos polipéptidos de a-globina de adulto y dos polipéptidos de ?-globina similar a ß fetales. Durante la gestación, los genes de ?-globina duplicados · constituyen los genes predominantes transcritos de la posición de ß-globina. Después del nacimiento, la ?-globina llega a ser progresivamente reemplazada por ß-globina de adulto, un proceso referido como el "cambio fetal" (3) . Los mecanismos moleculares que implican- este cambio han permanecido grandemente no definidos y han sido un sujeto de intensa investigación. El cambio de desarrollo de la producción de hemoglobina fetal predominantemente o HbF (a2?2) a la producción de hemoglobina de adulto o HbA (a2ß2) comienza en aproximadamente 28 a 34 semanas de gestación y continua poco tiempo después del nacimiento punto en el cual HbA llega a ser predominante. Este cambio resulta principalmente de la transcripción disminuida de los genes de gamma-globina y la transcripción incrementada de los genes de beta-globina . En promedio, la sangre de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2% de HbF, aunque los niveles de HbF residuales tienen una variación de arriba de 20 veces en adultos sanos (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)).
Las hemoglobinopatias abarcan un número de anemias de origen genético en las cuales hay una producción disminuida y/o destrucción (hemolisis) incrementada de glóbulos rojos (RBCs). Estos desórdenes también incluyen defectos genéticos que dan por resultado la producción de hemoglobinas anormales con una habilidad deteriorada concomitante para mantener la concentración de oxigeno. Algunos de tales desórdenes involucran la falla para producir ß-globina normal en cantidades suficientes, mientras que otros involucran la falla para producir ß-globina normal completamente. Estos desórdenes específicamente asociados con la proteina de ß-globina son referidos generalmente como ß-hemoglobinopatías . Por ejemplo, las ß-talasemias resultan de un defecto parcial o completa en la expresión del gen de ß-globina, que conduce a la HbA deficiente o ausente. La anemia de célula falciforme resulta de una mutación puntual en el gen estructural de ß-globina, que conduce a la producción de una hemoglobina anormal (falciforme) (HbS). Las RBCs de HbS son más frágiles que las RBCs normales y se someten a la hemolisis más fácilmente, conduciendo eventualmente a la anemia (Atweh, Semin. Hematol . 38(4): 367-73 (2001)). Por otra parte, la presencia de una variante genética de BCL11A, variación HBS1L-MYB, aminora la severidad clínica en la beta-talasemia. Esta variante se ha mostrado que está asociada con niveles de HbF. Aquí, se mostró que hay una relación impar de 5 para tener una forma menos severa de beta-talasemia con la variante alta en HbF (Galanello S. y colaboradores, 2009, Blood, in press) .
Recientemente, la investigación para el tratamiento se dirigió en la reducción del desequilibrio de la cadena de globina en pacientes con ß-hemoglobinopatías que se ha enfocado en la manipulación farmacológica de la hemoglobina fetal (a2?2; HbF) . El potencial terapéutico importante de tales procedimientos es sugerido por las observaciones del fenotipo leve de individuos con co-herencia de tanto la ß-talasemia homocigota y la persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal (HPFH) , así como por aquellos pacientes con ß°-?3?336p??3 homocigota quienes no sintetizan hemoglobina de adulto, pero en quienes un requerimiento reducido para transfusiones se observa en la presencia de concentraciones incrementadas de hemoglobina fetal. Además, se ha observado que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anormalidades de la cadena ß tienen niveles más altos que los normales de hemoglobina fetal (HbF) , y se han observado que tienen un curso clínico más leve de enfermedad que ' los pacientes con niveles adultos normales de HbF. Por ejemplo, un grupo de pacientes de anemia de célula falciforme de Arabia Saudita quienes expresan 20-30% de HbF tienen solamente manifestaciones clínicas leves de la enfermedad (Pembrey, .y colaboradores, Br. J. Haematol . 40:415-429 (1978)). Ahora se acepta que la ß-hemoglobinopatías, tal como la anemia de célula falciforme y las ß-talasemias, son aminoradas por la producción de HbF incrementada (revisado en Jane y Cunningham Br. J. Haematol. 102:415-422 (1998) y Bunn, N. Engl. J. Med. 328:129-131 (1993)).
Mientras que los mecanismos moleculares que controlan el cambio de desarrollo in vivo de la expresión del gen ?- a ß-globina son actualmente desconocidos, hay evidencia acumulativa de que factores externos pueden influenciar la expresión del gen de ?-globina.. El primer grupo de compuestos descubiertos que tienen actividad de reactivación de HbF fueron los fármacos citotóxicos. La habilidad para causar síntesis de novo de HbF mediante la manipulación farmacológica primero se mostró utilizando 5-azacitidina en animales experimentales (DeSimone, Proc Nati Acad Sci U S A. 79 ( 14 ): 4428-31 (1982)). Estudios subsecuentes confirmaron la habilidad de 5-azacitidina para incrementar HbF en pacientes con ß-talasemia y enfermedad de célula falciforme (Ley, y colaboradores, N. Engl. J. Medicine, 307:1469-1475 (1982), y Ley, y colaboradores, Blood 62:370- 380 (1983)). Experimentos adicionales demostraron que los babuinos tratados con dosis citotóxicas de arabinosilcitosina (ara-C) respondieron con elevaciones acentuantes de F-reticulocitos ( Papayannopoulou y colaboradores, Science. 224 (4649) : 617-9 (1984)), y que. el tratamiento con hidroxiurea condujo a la inducción . de ?-globina en monos o babuinos (Letvin y colaboradores, N Engl J Med. 310 ( 1 ): 869-73 (1984) ) .
El segundo grupo de compuestos investigados para la habilidad para causar la actividad de reactivación de HbF fueron los ácidos grasos de cadena corta. La observación inicial en las células progenitoras de la sangre del codón fetal condujo al descubrimiento de que el ácido ?-aminobutirico puede actuar como un inductor de hemoglobina fetal (Perrine y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun.148 (2) : 694-700 (1987)). Estudios subsecuentes mostraron que la producción de globina estimulada con butirato en babuinos adultos (Constantoulakis y colaboradores, Blood. Dec; 72 (6): 1961-7 (1988)), y esto indujo la ?-globina en progenitores eritroides en animales adultos o pacientes con anemia de célula falciforme (Perrine y colaboradores, Blood. 74(1): 454-9 (1989)). Los derivados de ácidos grasos de cadena corta tales como fenilbutirato (Dover y colaboradores, Br J Haematol." 88(3): 555-61 (1994)) y ácido valproico (Liakopoulou y colaboradores, 1: Blood. 186(8) :3227- 35 (1995) ) también se han mostrado que inducen HbF in vivo. Dado el número grande de análogos o derivados de ácido graso de cadena corta de esta familia, hay un número de compuestos potenciales, de esta familia más potentes que el butirato. Los ácidos fenilacético y fenilalquílico (Torkelson y colaboradores, Blood Cells Mol Dis. 22(2): 150-8. (1996)), que se descubrieron durante estudios subsecuentes, se consideraron inductores de HbF potenciales ya que ellos pertenecieron a esta familia de compuestos. Actualmente, sin embargo, el uso de butirato o sus análogos en la linea de célula falciforme y ß-talasemia permanece experimental y no puede ser recomendada para el tratamiento fuera de experimentos clínicos.
Los experimentos clínicos se dirigieron a la activación de la síntesis de hemoglobina fetal la línea de célula falciforme y ß-talasemia que han incluido la administración a corto plazo y a largo plazo de tales compuestos como 5-azacitidina, hidroxiurea, eritropoyetina humana recombinante y análogos de ácido butírico, así como combinaciones de estos agentes. Después de estos estudios, la hidroxiurea se utilizó para la inducción de HbF humanos y después llegó a ser el primer y único fármaco aprobado por la Food and Drug Administration (FDA) para el tratamiento de hemoglobinopatías . Sin embargo, las desventajas variantes han contraindicado el uso a largo plazo de tales agentes o terapias, incluyendo efectos secundarios indeseados y variabilidad en las respuestas del paciente. Por ejemplo, mientras que la hidroxiurea estimula la producción de HbF y se ha mostrado que reduce clínicamente la crisis falciforme, eso es potencialmente limitado por la mielotoxicidad y el riesgo de carcinogénesis . La carcinogenicidad a largo potencial también existiría en las terapias basadas' en 5-azacitidina. Las terapias basadas en eritropoyetina no se han probado consistentes entre un intervalo de poblaciones de pacientes. Las vidas medias cortas del ácido butírico in vivo se han visualizado como un obstáculo potencial en la adaptación de estos compuestos para el uso en intervenciones terapéuticas. Además, muy altas dosis de ácido butírico son necesarias para inducir la expresión del gen de ?-globina, requiriendo la cateterización para la infusión continua de compuesto. Por otra parte, estas dosis altas de ácido butírico se pueden asociar con neurotoxicidad y daño de multiórganos' (Blau, y colaboradores, Blood 81:529-537 (1993)). Mientras que aun incrementos mínimos en niveles de HbF son útiles en enfermedades de célula falciforme, las ß-talasemias requieren un incremento mucho más alto que no es confiablemente, o seguramente, logrado por cualquiera de los agentes actualmente utilizados (Olivieri, Seminars in Hematology 33:24-42 (1996)).
La identificación de reguladores naturales de la inducción y producción de HbF podría proporcionar un medio para idear intervenciones terapéuticas que superen las diversas desventajas de los compuestos descritos en lo anterior. Los estudios asociados del . genoma amplio reciente hay producido discernimientos en la base genética de numerosas enfermedades complejas y atributos (McCarthy y colaboradores, Nat Rev Genet 9, 356 (2008) y Manolio y colaboradores, J Clin Invest 118, 1590 (2008)). Sin embargo, en la basta mayoría de casos, el enlace funcional entre una asociación genética con la patofisiologia implícita permanece para ser descubierta. El nivel de hemoglobina fetal (HbF) es heredada como un atributo cuantitativo y clínicamente importante, dada su función mencionada en lo anterior bien caracterizada en aminorar la severidad de las ß-hemoglobinopatías principales, enfermedad de célula falciforme y ß-talasemia (Nathan y colaboradores, Nathan y Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp. 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003)). Dos estudios asociados con el genoma amplio han identificado tres posiciones mayores qué contienen un conjunto dé cinco polimorfismos de nucleótido individual (SNPs) comunes que tienen en cuenta ~20% de la variación de los niveles de HbF (Lettre y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A (2008); Uda y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S 105, 1620 (2008); Menzel y colaboradores, Nat Genet 39, 1197· (2007)). Por otra parte, varias de estas variantes aparecen para predecir la severidad clínica de la enfermedad de célula falciforme (Lettre y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A (2008)) y por lo menos uno de estos SNPs también pueden afectar el efecto clínico en la ß-talasemia (Uda y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A 105, 1620 (2008)) . El SNP con el tamaño de efecto más grande, que explica arriba de 10% de la variación en HbF, está localizado en el segundo intrón de un gen en el cromosoma 2, BCL11A. Mientras que BCL11A, un factor de transcripción de dedo de zinc tipo C2H2, se ha investigado para su función en el desarrollo de linfocito (Liu y colaboradores, Nat Immunol 4, 525 (2003) y Liu y colaboradores, Mol Cáncer 5, 18 (2006)), su función en la producción de glóbulos rojos en la regulación del gen de globina no se ha estimado previamente.
En el inicio de la era de DNA recombinante, los estudios de la estructura del gen de globina proporcionaron un fundamento molecular fuerte para interrogar el cambio de globina fetal. Esfuerzo considerable se ha enfocado en delinear los elementos cis dentro de la posición de ß-globina necesarios para la regulación apropiada de los genes dentro de la agrupación de globina similar a la ß. Estos estudios dependieron de mutaciones que ocurren naturalmente · y supresiones que influencian notablemente los niveles de HbF en adultos, y se han complementado por la generación de ratones transgénicos que albergan porciones de la agrupación (Nathan y colabofadores , Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood ed. 6th, pp . 2 v. (xiv, 1864, xli p.) 2003) y G . Stamatoyannopoulos, Exp Hematol 33, 259 (2005)).. Aunque los elementos cis precisos requerido para el cambio de globina permanecen mal definidos, los descubrimientos en ratones transgénicos han indicado fuertemente que los genes de ?-globina son autónomamente silenciados en la etapa adulta, un. descubrimiento que es más compatible con la ausencia de activadores específicos de etapa fetal o la presencia de un represor específico de etapa. Los resultados de los estudios de asociación genética recientes proporcionan genes candidatos para interrogar su involucramiento en el control de los genes de ?-globina, tal como BCL11A.
Los inventores identificaron un represor específico de etapa novedoso en los genes de ?-globina, específicamente BCL11A, en donde la expresión de la proteína BCL11A actúa como un regulador negativo de la expresión de los genes de ?-globina.
Métodos para. Incrementar la Hemoglobina Fetal en vina Célula La presente invención proporciona métodos mejorados para incrementar la producción de hemoglobina fetal en una célula, mediante la administración de composiciones que contienen inhibidores de BCL11A. Los datos demuestran que la inhibición de BCL11A conduce a la expresión 'incrementada de los genes de ?-globina y agentes en donde se logra esta inhibición .
Como se divulga en la presente, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en una célula.
Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal expresados por una célula, que comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en la célula, o su progenie, con relación a la célula antes de tal contacto.
En relación con el contacto a una célula con un inhibidor de BCL11A, "incremento de los niveles de hemoglobina fetal" en una célula indica que la hemoglobina fetal es por lo menos 5% más alta en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, que en la población de control, comparable, en donde no está presente el inhibidor de BCL11A. Se prefiere que el porcentaje de la expresión de hemoglobina total en una población tratada con el inhibidor de BCL11A sea por lo menos 10% más alta, por lo menos 20% más alta, por lo menos 30% más alta, por lo menos 40% más alta, por lo menos 50% más alta, por lo menos 60% más alta, por lo menos 70% más alta, por lo menos ' 80% más alta, por lo menos 90% más alta, por lo menos 1 veces más alta, por lo menos 2 veces más alta, por lo menos 5 veces más alta, por lo menos 10 veces más alta, por lo menos 100 veces más alta, por lo menos 1000 veces más alta, o más que una población tratada de control de tamaño comparable y condiciones de cultivo. El término "población tratada de control" se utiliza en la presente para describir una población de células que se ha tratado con medios idénticos, inducción viral, secuencias de ácido nucleico, temperatura, confluencia, tamaño del matraz, pH, etc., con la excepción de la adición del inhibidor de BCLllA.
Un "inhibidor" de BCLllA, como el término se utiliza en la presente, puede funcionar en una manera competitiva o no competitiva, y puede funcionar, en una modalidad, al interferir con la expresión de la proteina de BCLllA. Cualquiera de un número de diferentes procedimientos se puede tomar para inhibir la expresión en la actividad de BCLllA. Un inhibidor de BCLllA incluye cualquier entidad química o biológica que, en el tratamiento de una célula, da por resultado la inhibición de la actividad biológica causada por la activación de BCLllA en respuesta a señales celulares. Los inhibidores de BCLllA, incluyen, pero no están limitados a, moléculas pequeñas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de enlace de antígeno, intracuerpos, aptámeros, constructos de antisentido, agentes de interferencia de RNA y ribozimas.
Inhibidores de Anticuerpo de BCLllA Los anticuerpos que específicamente enlazan BCLllA se pueden utilizar para la inhibición del factor in vivo. Los anticuerpos para BCLllA son comercialmente disponibles y se pueden cultivar por uno de habilidad en la técnica utilizando métodos bien conocidos. La actividad inhibidora de BCLllA de un anticuerpo dado, o, para esa material, cualquier inhibidor de BCLllA, se puede estimar utilizando métodos conocidos en la técnica o descritos en la presente, para evitar duda, un anticuerpo que inhibe BCLllA causará un incremento en la expresión de hemoglobina fetal. Los inhibidores de anticuerpo de BCLllA pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales y derivados de enlace de antigeno o fragmentos de los mismos.. Los fragmentos de enlace de antigeno bien conocidos incluyen, por ejemplo, anticuerpos de dominio individual (dAbs; que consisten esencialmente de dominios de anticuerpo VL o VH individuales), fragmento Fv, incluyendo el fragmento Fv de cadena individual (scFv) , fragmento Fab y fragmento F(ab')2. Los métodos para la construcción de tales moléculas de anticuerpo son bien conocidos en la técnica.
Inhibidores de Ácido Nucleico de la Expresión de BCLllA Un procedimiento potente para inhibir . la expresión de polipéptidos objetivos seleccionados es a través del uso de agentes de interferencia de RNA, la interferencia de RNA (RNAi) utiliza duplexes de RNA de interferencia pequeña (siRNA) que se dirigen al RNA mensajero que codifica el péptido objetivo para la degradación selectiva. El silenciamiento post-transcripcional dependiente de siRNA de la expresión génica involucra la segmentación de la molécula de RNA mensajera objetivo en un sitio -guiado por el siRNA. "La interferencia de (RNAi)" es un proceso evolucionariamente conservado mediante lo cual la expresión o introducción de RNA de una secuencia que es idéntica o altamente similar a un gen objetivo da por resultado la degradación especifica de secuencia o el silenciamiento del gel post-transcripcional especifico (PTGS) del RNA mensajero (mRNA) transcrito de ese gen dirigido (ver Coburn, G. y Cullen, B. (2002) J. of Virology 6 ( 18 ) : 9225 ) , para de esta manera inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad, el RNA es RNA de doble hebra (dsRNA) . Este proceso se ha descrito en plantas, invertebrados y células mamiferas. En la naturaleza, el RNAi es iniciado por el Dicer de endonucleasa especifico de dsRNA, que promueve el segmentamiento procesivo del dsRNA largo en fragmentos de doble hebra llamados siRNAs. Las siRNAs son incorporadas en un complejo de proteina (llamado complejo de silenciamiento inducido por RNA" o "RISC") que reconoce y segmenta los mRNAs objetivo. El RNAi también puede ser iniciado al introducir en moléculas de ácido nucleico, por ejemplo siRNAs sintético o agentes de interferencia de RNA, para inhibir o silenciar la expresión de genes objetivo. Como se utiliza en la presente, "inhibición de la expresión del gen objetivo" incluye cualquier disminución de expresión o actividad de proteina o el nivel del gen objetivo o proteina codificada por el gen.de interés como es comparado con una situación en donde no sea inducido interferencia de RNA. La disminución será de por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más como es comparado con la -expresión de un gen objetivo o la actividad o nivel de la proteina codificada por un gen objetivo que no sea dirigido por un agente de interferencia de RNA.
Los términos "agente de interferencia de RNA" y "interferencia de RNA" como se utiliza en la presente se proponen para abarcar aquellas formas del silenciamiento del gen mediado por el RNA de doble hebra, sin considerar si el agente de interferencia de RNA comprende un siRNA, miRNA, shRNA u otra molécula de RNA de doble hebra. "RNA de interferencia corta" (siRNA), también referido en la presente como "RNA de interferencia pequeña" se define como un agente de RNA que funciona para inhibir la expresión de un gen objetivo, por ejemplo, mediante RNAi . Un siRNA puede ser químicamente sintetizado, puede ser producido mediante la transcripción in vitro, o se puede producir dentro de una célula hospedera. En una modalidad, el siRNA es una molécula de RNA de doble hebra (dsRNA) de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleótidos en longitud, de preferencia aproximadamente 15 a aproximadamente 28 nucleótidos, más de preferencia aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en longitud, y más de preferencia aproximadamente 19, 20, 21, 22, o 23 nucleótidos en longitud, y puede contener una saliente 3' y/o 5' en cada hebra que tiene una longitud de aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, o 5 nucleótidos. La longitud de la saliente es independiente entre las dos hebras, es decir, la longitud de la saliente en una hebra no es dependiente de la longitud de la saliente sobre la segunda hebra. De preferencia, el siRNA es capaz de promover la interferencia de RNA a través de la degradación o el silenciamiento del ejemplo post-transcripcional especifico (PTGS) del RNA mensajero objetivo (mRNA) .
Los siRNAs también incluyen RNAs de horquilla pequeña (también llamada vuelta de tallo) (shRNAs) . En una modalidad, estos shRNAs están compuestos de una hebra de antisentido corta (por ejemplo, aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos), seguido por una vuelta de nucleótidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 nucleótidos, y la hebra de sentido análoga. Alternativamente, la hebra de sentido puede preceder la estructura de vuelta de nucleótidos y la hebra de antisentido puede seguir. Estos shRNAs pueden estar contenidos en plásmidos, retrovirus, y lentivirus y expresados de, por ejemplo, el promotor pol III U6, u otro promotor (ver, por ejemplo, Stewart, y colaboradores (2003) RNA Apr; 9 ( 4 ) : 3-501 , incorporada por referencia en la presente en su totalidad),. El gen objetivo o secuencia del agente de interferencia de RNA pueden ser un gen celular o secuencia genómica, por ejemplo, la secuencia BCL11A. Una siRNA puede ser sustancialmente homólogo al gen objetivo o secuencia genómica, o un fragmento del mismo. Como se utiliza en este contexto, el término "homólogo" se define como que es sustancialmente idéntico, suficientemente complementario, o similar al mRNA objetivo, o un fragmento del mismo, para efectuar la interferencia de RNA del objetivo. Además de las moléculas de RNA nativas, el RNA adecuado para inhibir o interferir con la expresión de una secuencia objetivo incluyen derivados y análogos de RNA. De preferencia, el siRNA es idéntico a su objetivo. El siRNA de preferencia redirige solamente una secuencia. Cada uno de los agentes de interferencia de RNA, tales como siRNAs, se pueden clasificar para los efectos fuera de objetivo potenciales mediante, por ejemplo, el perfilamiento de expresión. Tales métodos son conocidos para un experto en la técnica y son descritos, por ejemplo, en Jackson y colaboradores Nature Biotechnology 6:635-637, 2003. Además del perfilamiento de expresión, uno también puede clasificar las secuencias objetivos potenciales para secuencias similares en las bases de datos de secuencia para identificar secuencias potenciales que pueden tener efectos fuera del objetivo. Por ejemplo, de acuerdo con Jackson y colaboradores (Id.), 15, o quizás tan pocos como 11 nucleótidos contiguos, de identidad de secuencia son suficientes para dirigir el silenciamiento de transcriptos no dirigidos. Por lo tanto, inicialmente se puede clasificar los siRNAs propuestos para evitar el silenciamiento fuera ' del objetivo potencial utilizando el análisis de identidad de secuencia mediante cualquiera de los métodos de comparación de secuencia conocidos, tal como BLAST. Las secuencias siRNA se seleccionan para maximizar la captación de la hebra de antisentido (guia) del siRNA en RISC y de esta manera maximizar la habilidad de RISC al mRNA de GGT humano objetivo para la degradación. Esto se puede realizar al explorar secuencias que tienen la energía libre más baja de enlace en el 5'- terminal de la hebra de antisentido. La menor energía libre conduce a un aumento del desenrrollamiento del extremo 5' de la hebra de antisentido del dúplex de siRNA, para de esta manera asegurar que la hebra de antisentido será captada por el RISC y dirigirá la segmentación específica de secuencia del mRNA de BCL11A humano. Las moléculas de siRNA no necesitan ser limitadas a esas moléculas que contienen solamente RNA, sino, por ejemplo, además abarcan nucleótidos químicamente modificados y no nucleótidos, y también incluyen moléculas en donde una molécula de azúcar de ribosa es sustituida por otra molécula de azúcar o una molécula que realiza una función similar. Por otra parte, un enlace no ' natural entre los residuos de nucleótidos se puede utilizar, tal como un enlace de fosforotioato . La hebra de. RNA puede ser derivada con un grupo funcional reactivo de un grupo reportador, tal como un fluoróforo. Los derivados particularmente útiles son modificados en una terminal o terminales de una hebra de RNA, típicamente el 3' terminal de la hebra de sentido. Por ejemplo, el 2' -hidroxilo en el 3' terminal puede ser fácilmente y selectivamente derivado con una variedad de grupos. Otros derivados de RNA útiles incorporan nucleótidos que tienen- porciones de carbohidrato modificadas, tales como residuos 2 ' -O-alquilados o derivados 2'-0-metil ribosilo y derivados 2'-0-fluoro ribosilo. Las bases de RNA también pueden ser modificadas. Cualquier base modificada útil para inhibir o interferir con la expresión de una secuencia objetivo se puede utilizar. Por ejemplo, las bases halogenadas, tales como 5-bromouracilo y 5-yodouracilo se pueden incorporar. Las bases también pueden ser alquiladas, por ejemplo, 7-metilguanosina se puede incorporar en lugar de un residuo de guanosina. Las bases no naturales que ' producen la inhibición exitosa también se pueden incorporar. Las modificaciones de siRNA mucho más preferidas incluyen 2'-deoxi-2 ' -fluorouridina o los nucleótidos de ácido nucleico fijados (LAN) nucleótidos y dúplexes de RNA que contienen ya sea fosfodiéster o números variantes de enlace de fosforotioato . Tales modificaciones son conocidas para un experto en la técnica y son descritos, por ejemplo, en Braasch y colaboradores, Biochemistry, 42:7967-7975, 2003. La mayoría de las modificaciones útiles a las moléculas de siRNA se pueden introducir utilizando químicas establecidas para la tecnología de oligonucleótido de antisentido. De preferencia, las modificaciones involucran la modificación de 2'-0-metilo mínima, de preferencia excluyendo tal modificación. Las modificaciones también de preferencia incluyen modificaciones de los grupos 5' -hidroxilo libres del siRNA. Los ejemplos en la presente proporcionan ejemplos específicos de agentes de interferencia de RNA, tales como moléculas de shRNA que efectivamente dirigen mRNA de BCLllA.
En una modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA se suministra o administra en un portador farmacéuticamente aceptable. Los agentes portadores adicionales, tales como liposomas, se pueden adicionar por al portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, el agente de interferencia de RNA se suministra por un vector que codifica RNA de horquilla pequeña (shRNA) en un portador farmacéuticamente aceptable de las células en un órgano de un individuo. El shRNA se convierte por las células después de la transcripción en siRNA capaz de la dirección, por ejemplo, BCLllA.
En una modalidad, el vector es un vector regulable, tal como el vector inducible por tetraciclina . Los métodos descritos, por ejemplo, en ang y colaboradores Proc. Nati.
Acad. Sci. 100:5103-5106, using pTet-On vectors (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) pueden ser utilizado. En una modalidad, los agentes de interferencia de RNA utilizados en los métodos descritos en la presente son captados activamente por las células in vivo después de la inyección intravenosa, por ejemplo, inyección hidrodinámica, sin el uso de un vector, ilustra el suministro in vivo eficiente de los agentes de interferencia de RNA. Un método para suministrar los siRNAs es la cateterización del vaso de suministro de sangre del órgano objetivo. Otras estrategias para el suministro de los agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, los siRNAs o shRNAs utilizados en los métodos de la invención, también se pueden emplear, tales, por ejemplo, el suministro por un vector, por ejemplo, un plásmido o vector viral, por ejemplo, un vector lentiviral. Tales vectores se pueden utilizar como es descrito, por ejemplo, en Xiao-Feng Qin y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 100:183-188. Otros métodos de suministro incluyen el suministro de los agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, los siRNAs o shRNAs de la invención, utilizando un péptido básico al conjugar o mezclar el agente de interferencia de RNA con un péptido básico, por ejemplo, un fragmento de un péptido TAT, al mezclar con lípidos catiónicos o al formular particular. Los agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, los siRNAs que se dirigen a mRNA de BCL11A, se puede suministrar individualmente, o en combinación con otros agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, siRNAs, tales como, por ejemplo siRNAs dirigidos a otros genes celulares. Los siRNAs de BCL11A también se pueden administrar en combinación con otros agentes farmacéuticos que se utilizan para tratar o prevenir enfermedades o desórdenes asociados con el estrés oxidante, especialmente enfermedades respiratorias y más especialmente asma. Las moléculas de siRNA sintéticas, incluyendo moléculas de shRNA, se pueden obtener utilizando un número de técnicas conocidas para aquellos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, la molécula de siRNA se puede sintetizar químicamente o producir recombinantemente utilizando métodos conocidos en la técnica, tal como la utilización de fosforamiditas de ribonucleósido apropiadamente protegidas y un sintetizador de DNA/RNA convencionales (ver, por ejemplo, Elbashir, S.M. y colaboradores (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S.M., W. Lendeckel y T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. y colaboradores, (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J.R. y colaboradores (2001) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 98:8012-8017; y Tuschl, T. y colaboradores, (1999) Genes & Development 13:3191-3197). Alternativamente, varios proveedores de síntesis de RNA comerciales están disponibles incluyendo, pero no limitados a Proligo (Hamburgo, Alemania), Dharmacon Research (Lafayette, CO, USA) , Pierce Chemical (part of Perbio Science , Rockford, IL , USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA, USA) , y Cruachem (Glasgow, UK) . Como tal, las moléculas de siRNA no son sobrepuestas difíciles de sintetizar y fácilmente se proporciona una calidad adecuada para el RNAi . Además, los dsRNAs se pueden expresar como estructuras de vuelta de tallo codificado por los vectores de plásmido, retrovirus y lentivirus (Paddison,' PJ. y colaboradores (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M.T. y colaboradores (2002) RNA 8:842-850; Paul, CP. y colaboradores (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508; Miyagishi, M. y colaboradores (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, G. y colaboradores (2002) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. y colaboradores (2002) Cáncer Cell 2:243; Lee, N.S., y colaboradores (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J.Y., y colaboradores (2002) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., y colaboradores (2002) Mol. Cell 9:1327-1333; Rubinson, D.A., y colaboradores (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S.A., y colaboradores (2003) RNA 9:493-501). Estos vectores generalmente tienen un promotor polIII corriente arriba del dsRNA y pueden expresar hebras de RNA de antisentido separadamente y como estructuras de horquilla. Dentro de las células, Dicer procesa el RNA de horquilla corta (shRNA) en siRNA efectivo. La región dirigida de la molécula de .siRNA de la presente invención se pueden seleccionar de una secuencia de gen objetivo dada, por ejemplo, una secuencia de codificación de BCL11A, que comienza de aproximadamente 25 a 50 nucleótidos, de aproximadamente 50 a 75 nucleótidos, o de aproximadamente 75 a 100 nucleótidos corriente abajo del codón de inicio. Las secuencias de nucleótidos pueden contener 5' o 3' UTRs y regiones cercanas al codón de inicio. Un método para diseñar una molécula de siRNA de la presente invención involucra identificar la porción de secuencia de 23 nucleótidos AA(N1 9)TT (SEQ. ID. NO. 21) (donde N puede ser cualquier nucleótido) y seleccionar los aciertos con por lo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% de contenido de G/C. La porción "??" de la secuencia es opcional. Alternativamente, si no se encuentra tal secuencia, la búsqueda puede ser extendida utilizando la porción NA(N21), donde N puede ser cualquier nucleótido. En esta situación, el extremo 3' del siRNA de sentido puede ser convertido a TT para permitir la generación de un dúplex simétrico con respecto a la composición de secuencia de las salientes 3' de sentido y antisentido. La molécula de siRNA de antisentido luego se puede sintetizar como el complemento a las posiciones de nucleótido 1 a 21 de la porción de secuencia de 23 nucleótidos. El uso de las salientes 3' RR simétricas puede ser ventajoso para asegurar que las partículas de ribonucleoproteína de interferencia pequeña (siRNPs) se formen con relaciones aproximadamente iguales de siRNPs de segmentación de RNA objetivo de sentido y antisentido (Elbashir y colaboradores, (2001) supra y Elbashir y colaboradores, 2001 supra) . El análisis de las bases de datos de secuencia, incluyendo pero no limitadas a NCBI, BLAST, Derwent y GenSeq asi como compañías de oligosíntesis comercialmente disponibles tal como OLIGOENGINE®, también se pueden utilizar para seleccionar secuencias de siRNA contra librerías de EST para asegurar que son solamente un gen es dirigido.
Suministro de Agentes de Interferencia de RNA Los métodos para suministrar agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, un siRNA, o vectores que contienen un agente de interferencia de RNA, a las células objetivo, por ejemplo, linfocitos u otras células objetivo deseadas, .para la captación incluyen la inyección de una composición que contiene el agente de interferencia de RNA, por ejemplo, un siRNA, o directamente poner en contacto la célula, por ejemplo, un linfocito, con una composición que comprende un agente de interferencia de RNA, por ejemplo, un siRNA. En otra modalidad, el agente de interferencia de RNA, por ejemplo, un siRNA, puede ser inyectado directamente en cualquier vaso sanguíneo, tal como la vena, arteria, vénula o arteria, vía, por ejemplo, la inyección hidrodinámica o cateterización. La administración puede ser mediante una sola inyección o por dos o más inyecciones. El agente de interferencia de RNA se suministra en un portador farmacéuticamente aceptable. Uno o más agentes de interferencia de RNA se pueden utilizar simultáneamente. En una modalidad preferida, solamente un siRNA que se dirige al BCL11A humano es utilizado. En una modalidad, las células especificas se dirigen con interferencia a RNA, limitar los efectos secundarios potenciales de la interferencia de RNA causada por la dirección no especifica de la' interferencia de RNA. El método puede utilizar, por ejemplo, un complejo o una molécula de fusión que comprende una porción de dirección de célula y una porción de enlace de interferencia de RNA que se utiliza para suministrar la interferencia de RNA efectivamente en las células. Por ejemplo, una proteina de fusión de anticuerpo-protamina cuando se mezcla con siRNA, enlaza siRNA y selectivamente suministra el siRNA en células que expresan un antigeno reconocido por el anticuerpo, dando por resultado el silenciamiento de la expresión génica solamente en aquellas células que expresan el antigeno. El siRNA o porción de enlace de molécula que induce a interferencia de RNA es una proteina o un dominio de enlace de ácido nucleico o fragmento de una proteina, y la porción de enlace se fusiona a una porción de la porción de dirección. La ubicación de la porción de dirección puede ser ya sea en el extremo carboxilo-terminal o amino-terminal del constructo o en la parte media de la proteina de fusión. Un mecanismo de suministro mediado por viral también se puede emplear para suministrar siRNAs a células in vitro e in vivo como es descrito en Xia, H. y colaboradores (2002) Nat Biotechnol, 20 ( 10) : 1006) . Los mecanismos de suministro mediados por plásmido viral de shRNA también se pueden emplear para suministrar shRNAs a células in vitro e in vivo como es descrito en Rubinson, D.A., y colaboradores ((2003) Nat. Genet. 33:401-406) y Stewart, S.A., y colaboradores ((2003) RNA 9:493-501). Los agentes de inteferencia de RNA, por ejemplo, los siRNAs o shRNAs, se pueden introducir- junto con los componentes que realizan una o más de ' las siguientes actividades: aumento de captación de los agentes de interferencia de RNA, por ejemplo, siRNA, por la célula, por ejemplo, linfocitos u otras células, inhibidores de cocido de hebras individuales, estabilizar hebras individuales, o de otra manera facilitar suministro a la célula objetivo e incrementar la inhibición del gen objetivo, por ejemplo, BCL11A. La dosis del agente de interferencia de RNA particular estará en una cantidad necesaria para efectuar la interferencia de RNA, por ejemplo, el silenciamiento de gen post-traduccional (PTGS) , del gen objetivo particular, para de esta manera conducir a la inhibición de la expresión génica objetivo o inhibición de la actividad o nivel de la proteina codificada por el gen objetivo.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro. En una modalidad especifica, la célula que es puesta en contacto es una célula de linaje eritroide. En una modalidad, la composición inhibe la expresión de BCLllA.
"Célula progenitora hematopoyética" como el término se utiliza en la, presente, se refiere a células de un linaje de célula madre que da origen a todos los tipos de célula de sangre incluyendo el mieloide (monicotis y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas , células dendriticas ) , y los linajes linfoides (células T, células B, células NK) . Una "célula de linaje eritroide" indica que la célula que es puesta en contacto es una célula que se somete a eritropoyesis tal que la diferenciación final forma un eritrocito o glóbulo rojo (RBC) . Tales células pertenecen a uno de los tres linajes, eritroide, linfoide y mieloide, que se origina de las células progenitoras hematopoyéticas de médula ósea. En la exposición a factores de crecimiento especifico y otros componentes del microambiente hematopoyético, las células progenitoras hematopoyéticas pueden madurar a través de una serie de tipo celular y de diferenciación intermedia, todos los intermediarios del linaje eritroide, en RBCs. Asi, las células del "linaje eritroide", como el término se utiliza en la presente, comprenden células progenitoras hematopoyéticas, ubriblastos, prorubricitos , eritroblastos , metarubricitos, reticulocitos y eritrocitos.
En algunas modalidades, la célula progenitora hematopoyética tiene por lo menos una de las características de marcador de superficie celular de las células progenitoras hematopoyéticas: CD34 + , CD59+ , Thyl/CD90+ , CD3810/-, y C-kit/CD117+. De Preferencia, las células progenitoras hematopoyéticas tienen varios de estos marcadores.
En algunas modalidades, las células progenitoras hematopoyéticas de linaje de eritroide tiene la característica de marcadores de superficie celular de linaje eritroide: CD71 y Terll9.
Las células madre, tales como células progenitoras hematopoyéticas, son capaces de la proliferación y dan origen a células más progenitoras que tiene la habilidad para generar un número grande de células madre que a su vez pueden dar origen a células hijas diferenciadas o diferenciables . Las células hijas por si mismas se pueden inducir para proliferar y producir progenie que subsecuentemente se diferencian en uno o más tipos de células maduras, mientras que también retienen una o más células con potencial de desarrollo parental. . El término "célula madre" se refiere entonces, a una célula con capacidad o potencial, bajo circunstancias particulares, a diferenciarse a un fenotipo más especializado o diferenciado, y que retiene la capacidad, bajo ciertas circunstancias, para proliferar sin sustancialmente diferenciarse. En una modalidad, el término célula progenitora o madre se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) , se especializan, frecuentemente en diferentes direcciones, por diferenciación, por ejemplo, al adquirir características completamente individuales, como ocurre en la diversificación progresiva de células embriónicas y tejidos. La diferenciación celular es un proceso complejo que ocurre típicamente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente que por si misma es derivada de una célula multipotente, y así sucesivamente. Mientras que cada una de estas células multipotentes se pueden considerar células madre, la gama de tipo de célula puede dar origen a lo que puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también pueden tener la capacidad para dar origen a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede ser inducida artificialmente en el tratamiento con varios factores. En muchos casos biológicos, las células madre también son "multipotentes" debido a que pueden producir progenie de más de. un tipo de célula distinta, pero esto no es requerido para el "origen". La autorenovación es la otra parte clásica de la definición de célula madre, y es esencial como se utiliza en este documento. En teoría, la autorenovación puede ocurrir por cualquiera de dos mecanismos mayores. Las células madre pueden dividirse asimétricamente, con una hija que retiene el estado de origen y la otra hija que expresa alguna otra función especifica distinta y fenotipo. Alternativamente, algunas de las células madre en una población pueden dividirse simétricamente en dos orígenes, así manteniendo algunas células madre en la población como un conjunto, mientras que otras células en la población no da origen a la progenie diferenciada solamente. Generalmente, las "células progenitoras" tiene un fenotipo celular que más primitivo (es decir, es en una etapa temprana a los largo de una ruta de desarrollo o progresión que es una célula completamente diferencia) . Frecuentemente, las células progenitoras también tienen potencial significante o muy altamente proliferativo . Las células progenitoras pueden dar origen a múltiples tipos de células diferenciadas distintas o a un solo tipo de célula diferenciada, dependiendo de la ruta de desarrollo y sobre el medio ambiente en el cual la célula se desarrollan y se diferencian .
En el contexto de la ontogenia de célula, el adjetivo "diferenciado" o "diferenciación" es un término relativo. Un "célula diferenciada" es una célula que ha progresado adicionalmente hacia abajo a la ruta de desarrollo que la célula que está siendo comparada. Así, las células madre pueden diferenciarse a células precursoras restringidas de linaje (tal como una célula progenitora hematopoyética ) que a su vez puede diferenciarse en otros tipos de células precursoras además hacia abajo de la ruta (tal como un precursor de eritrocito) y luego una célula diferenciada final, tal como un eritrocito, que desempeña una función característica en cierto tipo de tejido, y puede o no puede retener la capacidad para proliferar adicionalmente .
En una modalidad, el inhibidor de la expresión de BCL11A se selecciona de una molécula pequeña en un ácido nucleico. Alternativamente y de preferencia, el inhibidor de la expresión de BCL11A es un agente de interferencia de RNA específico de BCL11A, o un vector que codifica el agente de interferencia de RNA específico de BCL11A. En una modalidad específica, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótido de la SEQ ID NO: 1-6.
Como se utiliza en la presente, el término "molécula pequeña" se refiere a un agente químico que incluye, pero no limitado a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, polinucleótidos, análogos de polinucleótido, aptámeros, nucleótidos, análogos de nucleótido, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen- un peso molecular menor que aproximadamente 10,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 5,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 1,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tiene un peso molecular menor que aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ásteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.
Un "ácido nucleico" como es descrito en la presente, puede ser RNA o DNA, y puede ser de una sola o doble hebra, y se puede seleccionar, por ejemplo, del un grupo que incluye: ácido nucleico que codifica una proteína de interés, oligonucleótidos , análogos de ácido nucleico, por ejemplo péptido-ácido nucleico (PNA) , PNA pseudo complementario (pc-PNA) , ácido nucleico fijado (LNA) etc. Tales secuencias de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, pero no están limitadas a, secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas, por ejemplo, que actúan como represores transcripcionales, moléculas de antisentido, ribosimas, secuencias de ácido nucleico inhibidoras pequeñas, por ejemplo, pero no limitadas a RNAi, shRNAi, siRNA, micro RNAi (mRNAi) , oligonucleicos de antisentido, etc.
Como se divulga en la presente, es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero en necesidad del mismo, el método que comprende la etapa de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética en el mamífero con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, por medio de lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa, con relación a la expresión antes de tal contacto.
En relación con el contacto de una célula en un mamífero con un inhibidor de BCL11A, "incremento de niveles de hemoglobina fetal en un mamífero" indica que la hemoglobina fetal en el mamífero es por lo menos 5% más alta en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, que una población de control, comparable, en donde no está presente el inhibidor de BCL11A. Se prefiere que la expresión de hemoglobina fetal en el mamífero tratado con el inhibidor de BCL11A sea por lo menos 10% más alta, por lo menos 20% más alta, por lo menos 30% más alta, por lo menos 40% más alta, por lo menos 50% más alta, por lo menos 60% más alta, por lo menos 70% más alta, por lo menos 80% más alta, por lo menos 90%, más alta, por lo menos 1 veces más alta, por lo menos 2 veces más alta, por lo menos 5 veces más alta, por lo menos 10 veces más alta, por lo menos 100 veces más alta, por lo menos 1000 veces más alta, o más que un mamífero tratado de control comparable. El término "mamífero tratado de control comparable" se utiliza en la presente para describir un mamífero que se ha tratado idénticamente, con la excepción de la adición del inhibidor de BCL11A- El término "mamífero" se propone para abarcar un "mamífero" singular y "mamífero" plurales incluye, pero no está limitado a humanos; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos tales como perros y lobos; félidos tales como gatos, leones y tigres; équidos tales como caballos, burros y zebras; animales alimenticios tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados tales como ciervos y jirafas; roedores tales como ratones, ratas, hámsters y conejillos de india; y osos. En algunas modalidades preferidas, un mamífero es un humano.
Por consiguiente, en una modalidad, el mamífero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía . En una modalidad adicional, la hemoglobinopatía es una ß-hemoglobinopatía . En una modalidad preferida, la hemoglobinopatía es una enfermedad de célula falciforme. Como se utiliza en la presente, "enfermedad de célula falciforme" puede ser anemia de célula falciforme, enfermedad de hemoglobina C falciforme (HbSC) , beta-plus-talasemia falciforme (HbS/p+) , o beta-zero-talasemia falciforme (HbS/ß?) . En otra modalidad preferida, la hemoglobinopatía es una ß-talasemia.
Como se utiliza en la presente, el término "hemoglobinopatía" significa cualquier defecto en la estructura o función de cualquier hemoglobina de un individuo e incluye defectos en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la hemoglobina causada por cualquier mutación, tal como mutaciones de supresión o mutación de sustitución en regiones de codificación del gen de ß-globina, o mutaciones en, o supresiones de, los promotores o aumentadores de transgenes que causan una reducción en la cantidad de hemoglobina producida como es comparado con una condición normal o estándar. El término además incluye cualquier disminución en la cantidad o efectividad de hemoglobina, ya sea normal o anormal, causado por factores externos tales como enfermedad, quimioterapia, toxinas, venenos o los similares.
El término "cantidad efectiva", como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad que es segura y suficiente para tratar, aumentar la probabilidad de, o retardar el desarrollo de una hemoglobinopatia. La cantidad si puede curar o dar por resultado el aminoramiento de los síntomas de la hemoglobinopatia, detener el curso de progresión de enfermedad de hemoglobinopatia, detener o inhibir un síntoma de una hemoglobinopatia, detener o inhibir el establecimiento de síntomas secundarios de una hemoglobinopatia o inhibir el desarrollo de un síntoma secundario de una hemoglobinopatia. La cantidad efectiva para el tratamiento de la hemoglobinopatia depende del tipo de hemoglobinopatia que es tratado, la severidad de los síntomas, el sujeto que es tratado, la edad y la condición general del sujeto, el modo de administración y así sucesivamente. Así, no es posible o prudente especificar una "cantidad efectiva" exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una "cantidad efectiva" apropiada se puede determinar por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando solamente la experimentación de rutina.
El tratamiento de acuerdo con la presente invención aminora uno o más síntomas asociados con el desorden al incrementar la cantidad de hemoglobina fetal en un individuo. Los síntomas típicamente asociados con una hemoglobinopatía, incluyen por ejemplo, anemia, hipoxia de tejido, disfunción del órgano, valores de hematocrito anormal, eritropoyesis inefectiva, reticulocito anormal (eritrocito) conteo, carga de hierro anormal, la presencia de sideroblastos de anillo, esplenomegalia , hepatomegalia, flujo de sangre periférica deteriorada, dipnea, hemolisis incrementada, ictericia, crisis de dolor anémico, síndrome de pecho agudo, secuestración esplénica, priapismo, ataque apoplético, síndrome de mano-pie, y dolor tal como angina pectoris.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro, y la célula o su progenie se administra al mamífero. En una modalidad adicional, la célula progenitora hematopoyética es una célula de linaje eritroide.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto con una composición que comprende un inhibidor de BCL11A y un portador o diluyente o farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición se administra mediante inyección, infusión, instilación, o ingestión .
Como se utiliza en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" y variaciones gramaticales del mismo, como se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se utilizan intercambiablemente y representan que los materiales son capaces de la administración a o en un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como nausea, vértigo, trastorno gástrico y los similares. Cada portador también debe ser" "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la ' formulación. Un portador farmacéuticamente aceptable no promoverá el surgimiento de una respuesta inmune o un agente con el cual se mezcla, a menos que sea así deseado. La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma será entendido en la técnica y no necesita estar limitado basado en la formulación. La formulación farmacéutica contiene un compuesto de la invención en combinación con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables. El portador también puede estar en la forma de un sólido, semisólido o diluyente líquido, crema o una cápsula. Típicamente tales composiciones se preparan como inyectables ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en líquido antes del uso. La preparación también se puede emulsificar o presentar como una composición de liposoma. El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para el uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o los similares y combinaciones de los mismos. Además, si es deseado, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes , agentes de regulación del pH y los similares que aumentan la efectividad del ingrediente activo. La composición terapéutica . de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos de amino libre del polipéptido) que se forman¦ con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico fosfórico, o tales ácidos orgánicos como ácido acético, tartárico, mandélico y los similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y tales bases orgánicas como isopropilamina , trimetilamina, 2-emilaminoetanol, histidina, procaina y los similares. Los portadores fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Los portadores' líquidos ejemplares son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen una solución reguladora tal como fosfato de sodio en valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambas, tal como solución salina regulada con fosfato. Todavía, adicionalmente, los portadores acuosos pueden contener más de una sal amortiguadora, así como sales tales como cloruro de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de y a la exclusión de agua. Ejemplares de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales, tal como aceite de semilla de algodón, y emulsiones de agua-aceite. La cantidad de un agente activo utilizado en la invención que se hará efectiva en el tratamiento de un desorden o condición particular dependerá de la naturaleza del desorden o condición, y se puede determinar por técnicas clínicas estándares. La frase "portador o diluyente farmacéuticamente aceptable" significa un material, composición o. vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un líquido o rellenador sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrado en llevar o transportar el agente presente de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo.
Como se utiliza en la presente "administrado" se refiere a la colocación de un inhibidor de BCL11A en un sujeto mediante un método o ruta que da por resultado la localización por lo menos parcial del inhibidor en un sitio deseado. Un agente que inhibe BCL11A se puede administrar mediante cualquier ruta apropiada que da por resultado el tratamiento efectivo en el sujeto, es decir, la administración da por resultado el suministro en una ubicación deseada en el sujeto donde por lo menos una porción de la composición suministrada, es decir, por lo menos un agente que inhibe BCL11A, es activo en el sitio deseado por un período de tiempo. El periodo de tiempo del inhibidor activo depende de la vida media in vivo después de la administración a un sujeto, y puede ser tan corta como una cuantas horas, por ejemplo, veinticuatro horas, a unos cuantos días, hasta varios años. Los modos de administración incluyen inyección, infusión, instilación o ingestión. "Inyección" incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular , intraorbital , intracardiaca , intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticular , intraarticular , subcapsular, subaracnoide , intraespinal, intracerebroespinal e inyección intrasternal e infusión.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética de un mamífero que necesita del tratamiento se pone en contacto con una composición que inhibe la expresión de BCLllA.
Por "inhibe la expresión de BCLllA" se propone que la cantidad de expresión de BCLllA es por lo menos 5% menor en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCLllA, que una población de control, comparable, en donde no está presente el inhibidor de BCLllA. Se prefiere que el porcentaje de expresión de BCLllA en una población tratada con el inhibidor de BCLllA sea por lo menos 10% menor, por lo menos 20% menor, por lo menos 30% menor, por lo menos 40% menor, por lo menos 50% menor, por lo menos 60% menor, por lo menos 70% menor, por lo menos 80% menor, por lo menos 90% menor, por lo menos 1 vez menor, por lo menos 2 veces menor, por lo menos 5 veces menor, por lo menos 10 veces menor, por lo menos 100 veces menor, por lo menos 1000 veces menor, o más que una población tratada de control comparable en la cual no se adicionan el inhibidor de BCLllA.
En una modalidad, el inhibidor de la expresión de BCLllA se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A o un vector que codifica el agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCL11A. En una modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de, las secuencias de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1-6.
En una . modalidad, la célula progenitora hematopoyética de un mamífero que necesita el tratamiento se pone en contacto con una composición que inhibe la actividad de BCL11A.
Por "inhibe la actividad de BCL11A" se propone que la cantidad de actividad funcional de BCL11A es por lo menos 5% menor en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, con una población de control comparable, donde no está presente el inhibidor de BCL11A. Se prefiere que el porcentaje de actividad de BCL11A en una población tratada con el inhibidor ce BCL11A sea por lo menos 10% menor, por lo menos 20% menor, por lo menos 30% menor, por lo menos 40% menor, por lo menos 50% menor, por lo menos 60% menor, por lo menos 70% menor, por lo menos 80% menor, por lo menos 90% menor, por lo menos 1 vez menor, por lo menos 2 veces menor, por lo menos 5 veces menor, por lo menos 10 veces menor, por lo menos 100 veces menor, por lo menos 1000 veces menor, o más que una población tratada de control comparable en la cual no se adiciona el inhibidor de BCL11A. En un mínimo, la actividad BCLllA puede ser ensayada al determinar la cantidad de expresión de 3CL11A en la proteina o niveles de mRNA, utilizando técnicas estándares en el arte. Alternativamente, o además, la actividad de BCLllA se puede determinar utilizando un constructo reportador, donde el constructo reportador es sensible a la actividad de BCLllA. La secuencia de posición de ?-globina es reconocible por la posición de enlace de ácidos nucleicos del constructo de BCLllA. Alternativamente, o además, la actividad de BCLllA puede ser ensayada al medir la expresión de hemoglobina fetal en el mRNA o nivel de proteina después del tratamiento con un inhibidor de BCLllA candidato. Un incremento en la expresión de hemoglobina fetal de por lo menos 10% es indicativa de un compuesto que es un inhibidor de BCLllA candidato.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de BCLllA se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCLllA o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA, o un vector que codifica el agente de interferencia de RNA, un aptámero y enlaza BCLllA. En otra modalidad preferida, el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótido de la SEQ ID NO: 1-6.
Un "anticuerpo" que se puede utilizar de acuerdo con los métodos descritos en la presente incluye inmunoglobulinas completas, fragmentos de enlace de antigeno de inmunoglobulinas, asi como proteínas de enlace de antígeno que comprende dominios de enlace de antígeno de inmunoglobulinas. Los fragmentos de enlace de antígeno de inmunoglobulinas incluyen, por ejemplo, Fab, Fab' , F(ab')2, scFv y dAbs . En los formatos de anticuerpo modificados que se han desarrollado que retienen la especificidad de enlace, pero tiene otras características que pueden ser deseables, incluyendo, por ejemplo, biespecificidad, multivalencias (más de dos sitios de enlace) , y tamaño compacto (por ejemplo, dominios de enlace solos) . Los anticuerpos de cadena individual carecen de algunos o todos los dominios constantes de los anticuerpos completos de los cuales se deriva. Por lo tanto, se pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de anticuerpos completos. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena individual tienden a estar libres de ciertas interacciones indeseadas entre las regiones constantes de cadena pesada y otras moléculas biológicas. Adicionalmente, los anticuerpos de cadena individual son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos y pueden tener más grande permeabilidad que los anticuerpos completos, que permite que los anticuerpos de cadena ¦ individual localicen y enlacen a los sitios de enlace de antígeno objetivo más eficientemente. Además, el tamaño relativamente pequeño de los anticuerpos de cadena individual los hace menos probables de provocar una respuesta inmune indeseada en un recipiente que los anticuerpos completos. Los anticuerpos de cadena sencilla múltiples, cada cadena individual que tiene un dominio VH y un dominio VL covalentemente enlazado por un primer enlazador de péptido, se pueden enlazar covalentemente por al menos uno o más enlazadores de péptido para formar anticuerpos de cadena sencilla multivalentes, que pueden ser monoespecificos o multiespecificos . Cada cadena de un anticuerpo de cadena individual multivalente incluye un fragmento de cadena ligera variable y un fragmento de cadena pesada variable, y está enlazada por un enlazador de péptido a por lo menos otra cadena. El enlazador de péptido está compuesto de por lo menos quince residuos de aminoácido. El número máximo de residuos de aminoácido del enlazador es aproximadamente cien. Dos anticuerpos de cadena individual se pueden combinar para formar un diacuerpo, también conocido como un dimero bivalente. Los diacuerpos tienen dos cadenas y dos sitios de enlace, y pueden ser monoespecificos o biespecificos . Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio VH conectado a un dominio VL. Los dominios están conectados con enlazadores que son bastante cortos para prevenir el emparejamiento entre los dominios de la mínima cadena, así induciendo el emparejamiento entre dominios complementarios sobre diferentes cadenas para recrear los dos sitios de enlace de antigeno. Tres anticuerpos de cadena individual se pueden combinar para formar triacuerpos, también conocidos como trímeros trivalentes. Los triacuerpos se construyen con el aminoácido terminal de un dominio VL o VH directamente fusionado al carboxilo terminal de un dominio VL o VH, es decir, sin cualquier secuencia enlazadora. El triacuerpo tiene tres cabezas Fv con los polipéptidos arreglados en un aspecto de cabeza a cola, cíclico. Una conformación posible del triacuerpo .es plana con los tres sitios de enlace localizados en un plano en un ángulo de 120 grados entre sí. Los triacuerpos pueden ser monoespecífieos , biespecífieos o triespecífieos . Así, los anticuerpos utilizaron métodos descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos que ocurren naturalmente, fragmentos bivalentes tal como (Fab')2, fragmentos monovalentes tal como Fab, anticuerpos de cadena individual, Fv de cadena individual (scFv), anticuerpos de cadena individual, anticuerpos de cadena individual multivalente, diacuerpos, triacuerpos y los similares que enlazan específicamente con un antígeno.
Los anticuerpos también se pueden crear contra un polipéptido o una porción de un polipéptido por métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los anticuerpos se crean fácilmente en animales tales como conejos o ratones mediante la inmunización con. el producto génico, o un fragmento del mismo. Los ratones inmunizados son particularmente útiles para proporcionar fuentes de células B para la manufactura de hibridomas, que a su vez se cultivan para producir cantidades grandes de anticuerpos monoclonales. Los métodos de manufactura de anticuerpos se describen en detalle, por ejemplo, en Harlow y colaboradores, 1988. Mientras que ambos anticuerpos policlonales y monoclonales se pueden utilizar en los métodos descritos en la presente, se prefiere que un anticuerpo monoclonal se . utilice donde las condiciones requieren especificidad incrementada para una proteina particular.
En una modalidad, el inhibidor de la actividad de BCL11A interfiere con las interacciones de BCL11A con los asociados de enlace de BCL11A. En una modalidad, los asociados de enlace son GATA-I, FOG-1, y componentes del complejo NuRD. En otra modalidad, los asociados de enlace son matrin-3, MTA2 y RBBP7.
Por "interfiere con interacciones de BCL11A con asociados de enlace de BCL11A" se propone que la cantidad de interacción de BCL11A con el asociado de enlace de BCL11A es por lo 'menos 5% menor en poblaciones tratadas con un inhibidor de BCL11A, de una población de control, comparable, en donde no está presente inhibidor de BCL11A. Se prefiere que la cantidad de interacción de BCL11A con el asociado de enlace BCL11A en una población tratada con inhibidor de BCL11A sea por lo menos 10% menor, por lo menos 20% menor, por lo menos 30% menor, por lo menos.40% menor, por lo menos 50% menor, por lo menos 60% menor, por lo menos 70% menor, por lo menos 80% menor, por lo menos 90% menor, por lo menos 1 vez menor, por lo menos 2 veces menor, por lo menos 5 veces menor, por lo menos 10 veces menor, por lo menos 100 veces menor, por lo menos 1000 veces menor, o más que una población tratada de control comparable en la cual no se adicione inhibidor de BCL11A. En un mínimo, la interacción de BCL11A se puede ensayar al determinar la cantidad de enlace de BCL11A al asociado de enlace de BCL11A utilizando técnicas estándares en el arte, incluyendo, pero no limitado a, espectrometría de masas, inmunoprecipitación o ensayo de filtración de gel. Alternativamente, o además, la actividad de BCL11A se pueden ensayar al medir la expresión de hemoglobina fetal en el mRNA o nivel de proteína después del tratamiento con un inhibidor de BCL11A candidato.
En una modalidad, la actividad de BCL11A es la interacción de BCL11A con sus asociados de enlace: GATA-1, FOG-1, componentes del complejo NuRD, matrin-3, MTA2 y RBBP7. Por consiguiente, cualquier anticuerpo o fragmento del mismo, molécula pequeña, sustancia química o compuesto que puede bloquear esta interacción se considera un inhibidor de la actividad de BCLllA.- En una modalidad, cualquier método conocido en la técnica se puede utilizar para medir un incremento en la expresión de hemoglobina fetal, por ejemplo, el análisis de Manchado de Western de la proteina ?-globina fetal y la cuantificación de mRNA de la ?-globina fetal.
Como se divulga en la presente, también abarcado dentro de los objetivos de la presente invención están métodos para clasificar moduladores de la actividad o expresión de BCL11A para la identificación de inhibidores de BCL11A.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método para identificar un modulador de la actividad o expresión de BCL11A, el método que comprende poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una composición que comprende un compuesto de prueba, y medir el nivel de hemoglobina fetal o mRNA de hemoglobina fetal en la célula o su progenie, en donde un incremento en la hemoglobina fetal es indicativo de que el compuesto de prueba es un inhibidor candidato de la actividad o expresión de BCL11A.
En una modalidad, la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto in vivo, ex vivo, o in vitro. En una modalidad, la célula es de un origen humano, primate no humano o mamífero. En una modalidad, el compuesto de prueba es una molécula pequeña, anticuerpo o ácido nucleico. En una modalidad, la composición causa un incremento en la expresión de hemoglobina fetal.
Definiciones Por conveniencia, ciertos términos empleados en la solicitud completa (incluyendo la especificación, ejemplos y reivindicaciones adjuntas) se recolectan aquí. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece.
Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere .a una vuelta de DNA de doble hebra circular en la .cual se puede ligar segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vectores es un vector viral, en donde segmentos de ácido nucleico adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula hospedera en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedera en la introducción de la célula hospedera, y de esta manera se replican junto con el genoma hospedero. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" , o más simplemente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinantes están frecuentemente en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se pueden utilizar intercambiablemente como el plásmido que es la forma más comúnmente utilizada del vector. Sin embargo, la invención se propone para incluir tales de otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, lentivirus, adenovirus y virus adeno asociados), que sirven para funciones equivalentes. En una modalidad, los lentivirus se utilizan para suministrar una o más moléculas de siRNA de la presente invención en una célula.
Dentro de un vector de expresión, "operablemente enlazado" se propone para dar a entender que la secuencia de nucleótidos de interés es enlazado a la secuencia (s) reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula objetivo cuando el vector se introduce en la célula objetivo) . El término "secuencia reguladora" se propone para incluir promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) . Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, .Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la . expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospederas (por ejemplo, secuencias reguladoras especificas de tejido). Además, los agentes de interferencia de RNA se pueden suministrar por medio de un vector que comprende una secuencia reguladora para dirigir la síntesis de los tres siRNAs de la invención en intervalos específicos, o durante un período de tiempo específico. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que el diseño de vector de expresión puede depender de tales factores como la elección de la célula objetivo, el nivel de expresión de siRNA deseado y los similares .
Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en célula objetivo para de esta manera producir moléculas de siRNA de la presente invención. En una modalidad, una plantilla de DNA, por ejemplo, una plantilla de DNA que codifica la molécula de siRNA dirigida contra el alelo mutante, se puede ligar en un vector de expresión bajo el control de RNA polimerasa III (Pol III), y suministrar una célula objetivo. Pol III dirige la síntesis te transcriptos de no codificación pequeños cuyos extremos 3' son determinados por la terminación con un estiramiento de 4-5 timidinas. Por consiguiente, las plantillas de DNA se pueden utilizar para sintetizar, in vivo, hebras tanto de sentido como de antisentido de siRNAs que efectúan RNAi (Sui, y colaboradores (2002) PNAS 99(8):5515).
Como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo, las referencias a "el método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en la presente y/o que llegarán a ser evidentes para aquellas personas expertas en la técnica en la lectura de esta descripción y así sucesivamente. Se entiende que la descripción detallada anterior y los siguientes ejemplos son ilustrativos solamente y no van a ser tomados como limitaciones al alcance de la invención. Varios cambios y modificaciones a las modalidades divulgadas, que serán evidentes para aquellos de habilidad en la técnica, se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Además, todas las patentes, solicitudes de patente, y publicaciones identificadas se incorporan expresamente en la presente por referencia para el propósito de descripción y divulgación, por ejemplo, de las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en relación con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación dé la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no son intitulados a la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha de representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible a los solicitantes y no constituyen alguna admisión en cuanto a la corrección de las fechas o contenidos de estos documentos.
La presente invención se puede definir en cualquiera de los siguientes párrafos alfabetizados: [A] Un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, el método que comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en la célula, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto.
[B] El método del párrafo [A] , en donde la célula progenitora hematopoyética es una célula de linaje eritroide .
[C] El método del párrafo [A] , en donde la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vi tro.
[D] El método del párrafo [A] , en donde la composición que comprende un inhibidor de BCLllA inhibe la expresión de BCLllA.
[E] El método del párrafo [D] , en donde el inhibidor de la expresión de BCLllA se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico.
[F] El método del párrafo [E] , en donde el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA, o un vector que codifica un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA.
[G] El método del párrafo [F] , en donde el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 1-6.
[H] El método del párrafo [A] , en donde la composición que comprende un inhibidor de BCLllA inhibe la actividad de BCLllA.
[I] El método del párrafo [H] , en donde el inhibidor de la actividad de BCLllA se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCLllA o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico.
[J] El método del párrafo [I] , en donde el ácido nucleico . es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A, un vector que codifica la interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCL11A.
[K] El método del párrafo [J] , en donde el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótido de SEQ ID NO: 1-6.
[L] Un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero en necesidad del mismo, el método que comprende la etapa de poner un contacto una célula progenitora hematopoyética del mamífero con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.
[M] El método del párrafo ' [L] , en donde el mamífero se ha diagnosticado con una hemoglobinopatía .
[N] El método del párrafo [M] , en donde la ¦hemoglobinopatía es una ß-hemoglobinopatía .
[O] El método del párrafo [M] , en donde la hemoglobinopatía es la enfermedad de célula falciforme .
[P] El método del párrafo [M] , en donde la hemoglobinopatia es ß-talasemia.
[Q] El método del párrafo [L] , en donde la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro, y la célula o su progenie se administra al mamífero.
[R] El método del párrafo [L] , en donde el contacto comprende poner en contacto la célula con una composición que comprende un inhibidor de BCLllA y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
[S] El método del párrafo [L] , en donde la composición se administra por inyección, infusión, instilación o ingestión.
[T] El ' método del párrafo [L] , en donde la composición que comprende un inhibidor de BCLllA inhibe la expresión de BCLllA.
[U] El método del párrafo [T] , en donde el inhibidor de la expresión de BCLllA se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico.
[V] El método del párrafo [U] , en donde el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA específico de BCLllA o un vector que codifica un agente de interferencia, o un aptámero que enlaza BCL11A.
[ ] El método del párrafo [V], en donde el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
[X] El método del párrafo [L] , en donde la composición que comprende un inhibidor de BCL11A inhibe la actividad de BCL11A.
[Y] El método del párrafo [X] , en donde el inhibidor de la actividad de BCL11A se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCL11A o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico.
[Z] El método del párrafo [Y] , en donde el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A, un vector que codifica el agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCL11A.
[AA] El método del párrafo [Z] , en donde el agente de interferencia de RNA comprende uno o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
[BB] Un método para identificar un modulador de la actividad o expresión de BCL11A, el método que comprende poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una composición que comprende un compuesto de prueba, y medir el nivel de hemoglobina fetal o mRNA de hemoglobina fetal en la célula o su progenie, en donde un incremento en la hemoglobina fetal es indicativo de que el compuesto de prueba es un inhibidor candidato de la actividad o expresión de BCL11A.
[CC] El método del párrafo [AA] , en donde la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto in vivo, ex vivo o in vitro.
[DD] El método del párrafo [AA] , en donde la célula es de un origen humano, primate no humano o mamífero .
[EE] El método del párrafo [AA] , en donde el compuesto de prueba es una molécula pequeña, anticuerpo o ácido nucleico.
[FF] El método del párrafo [AA] , en donde la composición causa un incremento en RNA de hemoglobina fetal o expresión de proteina. Esta invención además se ilustra por el siguiente ejemplo que no debe ser considerado como limitante. Los contenidos de todas las referencias citadas por toda esta solicitud, así como las figuras y la tabla se incorporan en la presente por referencia.
EJEMPLO 1 Materiales y Métodos Cultivo de Células Células de eritroleucemia de ratón (MEL) se cultivaron y los subclones que llevan la enzima BirA y versiones etiquetadas de BCL11A se crearon como es descrito previamente ( oo y colaboradores, Mol Cell Biol 28, 2675 (2008)). Todas las construcciones se crearon utilizando técnicas de DNA recombinante estándares. Las células MEL se mantuvieron en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de ternero fetal al 10% (FCS) y penicilina al 2%-estreptomicina (P/S). Se adicionaron antibióticos apropiados al medio como es necesario para la selección o mantenimiento de clones, como es descrito (Woo y colaboradores, Mol Cell Biol 28, 2675 (2008)).
Las células COS-7 y 293T se mantuvieron DMEM con FCS al 10%. Estas células se transíectaron con los reactivos FuGene 6 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las células CD34+ humanas primarias se obtuvieron de muestras mononucleares magnéticamente clasificadas de sangre periférica movilizada con G-CSF de donadores y se congelaron después del aislamiento. Las células se obtuvieron de Yale Center of Excellence in Molecular Hematology (YCEMH) . Las células se descongelaron y se lavaron en RPMI 1640 con FCS al 10%, y luego se sembraron en el Medio StemSpan SFEM (StemCell Technologies Inc.) con la mezcla de citoquina IX CC100 (StemCell Technologies Inc.) y P/S al 2%. Las células se mantuvieron en este medio de expansión a una densidad de 0.1-1 X 106 células/ml con cambios del medio entre si o cada tercer día como es necesario. Las células se mantuvieron en el medio de expansión por un total de 6 días. En el día 6, las células se resembraron en el Medio StemSpan SFEM con P/S al 2%, 20 ng/ml de SCF, 1 U/ml de Epo, 5 ng/ml de IL-3, 2 micromolar dexametasona, y 1 micromolar ß-estradiol. Las células se mantuvieron en el medio de diferenciación, con los cambios del medio entre si o cada tercer dia como es necesario. Las células se mantuvieron en una densidad de 0.1-1 X 106 células/ml. Por el dia 3 de diferenciación, estallidos más grandes homogéneos estuvieron presentes en el cultivo. Por el Dia 5, la mayoría de células tuvieron morfología proeritroblasto y en el día 7 la mayoría de las células tuvieron morfología de eritroblasto basofílico. Por el día 12 de diferenciación, la mayoría de células fueron de morfología de eritroblasto ortocromatofilico y policromatofilico .
Los hemolizados se prepararon de células en el día 12 de diferenciación, como se ha descrito (Sankaran y colaboradores, Genes Dev. 22:463 (2008)), utilizando la lisi's osmótica en agua y tres ciclos de congelación-descongelación rápidos. Los restos celulares se evacuaron mediante la centrifugación y los lisados se almacenaron a -80°C y por unos cuantos días a 4°C. La electroforesis de hemoglobina con acetato de celulosa y la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) se llevó a cabo en los laboratorios clínicos del Hospital de Brigham and Women' s utilizando estándares clínicamente calibrados para las hemoglobinas humanas.
Extracción de RNA y qRT-PCR El aislamiento de RNA se realizó utilizando el reactivo Trizol (Sigma) o con el Mini Equipo RNeasy (Qiagen) . El RNA objetivo utilizando el método reactivo Trizol se trató subsecuentemente con la RQ1 DNasa (Promega) antes de que ocurriera la síntesis de cDNA. Una digestión de DNAsa en columna (Qiagen) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el Mini Equipo RNeasy. cDNA se sintetizó con el equipo de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad) . La PCR en tiempo real se realizó utilizando el iQ SYBR Green Mastermix (Bio-Rad) , como es descrito previamente (Sankaran y colaboradores, Genes Dev. 22:463 (2008)). La expresión relativa se cuantificó utilizando el método AACt como es descrito previamente (Sankaran y colaboradores, Genes Dev 22, 463 (2008)). Las secuencias de cebadores utilizados para RT-PCR son disponibles en petición. La preparación de muestras para el análisis ce microarreglo de expresión se hizo como es descrito previamente (Sankaran y colaboradores, Genes Dev 22, 463 (2008)) y el microarreglo se procesaron por el Dana-Farber Cáncer Institute Microarray Core Facility. El procesamiento de datos se realizó utilizando dChip en el Laboratorio de Computadora del Sitio de la Red Mundial de la Universidad de Harvard y la organización del r-proyecto del sitio de la Red Mundial) con la filtración realizada como es descrito previamente (Sankaran y colaboradores, Genes Dev 22, 463 (2008); Mootha y colaboradores, Nat Genet 34, 267 (2003); Su y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . U. S. A. 101:6062 (2004); y Su y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 99:4465 (2002)). Puesto que el trabajo previo ha sugerido que los niveles de diferencia promedio Affymetrix de <100 para por lo menos una muestra representa RNAs que son no probablemente expresados (Su y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 99:4465 (2002)), esto se utilizó como los criterios de filtración para todos los análisis realizados aquí .
Análisis Proteóxaico El análisis de asociados de interacción de proteina utilizando las versiones etiquetadas de afinidad de BCL11A se realizó como es descrito previamente (Woo y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 28:2675 (2008)). El análisis espectrométrico de masa se realizó en el Taplin Biological Mass Spectrometry Facility en Harvard Medical School. Después de la identificación de péptidos en muestras individuales (con tres muestras enviadas por franja de gel), se colapso la redundancia. Un procedimiento sustractivo luego se empleó para identificar proteínas que se purificaron específicamente en los extractos de BCL11A y no en los extractos de control en las líneas de células MEL parentales que contiene la enzima BirA. Los datos luego se consideraron al identificar proteína que fueron comunes en experimentos independientes. Todas las preparaciones de extracto nucleares (NE) , inmunoprecipitaciones candidatas (IPs), filtración en gel de NEs, expresión exógena transiente con IPs, y estudios de mapeo se llevaron a cabo utilizando métodos que se han descrito previamente (Woo y colaboradores, Mol Cell Biol 28, 2675 (2008) ) .
Inactivación de siRNA y shRNA Muestras de siRNA acumuladas se obtuvieron de Dharmacon. Esto incluyó una acumulación no de dirección (D- 001810-10) y una acumulación de dirección de BCL11A (L- 006996-00) . Las secuencias objetivo de siRNA de BCL11A utilizadas se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1: Estos siRNAs se prepararon como extractos de 100 µ?, como es recomendado por el fabricante. Alícuotas se almacenaron a -80°C hasta el uso. Las siRNAs se introdujeron en células CD34 expandidas y diferenciantes utilizando el Microporator-Mini (Digital Bio Technology). Los protocolos del fabricante se si-guieron ' y después de la clasificación de un número de condiciones, se encontró que con un solo impulso de 1800 V (utilizando un ancho de impulso de 20 ms) se obtuvo la mejor eficiencia de transducción, como es estimado utilizando un plásmido portador de GFP. La eficiencia de traducción se estimó que es -50-60% de células viables. Típicamente -250,000 células se transdujeron con 4 µ? de siRNAs en un volumen de -15 µ? . Las células luego se sembraron en el medio de diferenciación fresco.
Clones shRNA en el vector pLKO se obtuvieron de una recolección grande de shRNAs que se ha descrito previamente (Moffat y colaboradores, Cell 124:1283 (2006)). Dos BCL11A de dirección de shRNAs se obtuvieron con las secuencias presentadas en la Tabla 2: Estos shRNAs se eligieron, puesto que son el objetivo de ambas de las isoformas mayores de BCL11A encontradas en células eritroides. Los lentivirus se prepararon y la infección de células se llevó a cabo como es descrito (Moffat y colaboradores, Cell 124:1283 (2006)). Las células se lavaron dos veces con PBS y el medio de cambió 24 horas después de la infección. La selección con puromicina se inició en 48 horas después de la infección, que generalmente correspondió al tiempo cuando las células se sembraron en el medio de diferenciación.
Resultados Correlación inversa de los niveles de BCLllA y HbF Como una primera etapa en la búsqueda como la variación de la posición de BCLllA podría relacionarse con la expresión de globina, se examinó la expresión de BCLllA en células eritroides. En células eritroides humanas adultas primarias, BCLllA se expresa como dosis o formas mayores en los niveles de proteína y RNA (Fig. 1A) . Estas isoformas se han designado previamente isoformas 1 y 2 o XL y L (Liu y colaboradores, Mol Cáncer 5, 18 (2006)) . Las isoformas XL y L difieren solamente en la utilización del exón 3' terminal y aparecen para enlazarse entre sí y funcionar de manera similar en otras instalaciones (Liu y colaboradores, Mol. Cáncer 5, 18 (2006) ) . Un manchado de western muestra las isoformas mayores, XL y L, de extractos nucleares de células eritroides humanas (A) . Estas dos isoformas, que podrían ser confirmadas por RT-PCR de todos los exones conocidos y predichos, se presentan en el lado derecho de este panel con los números de exón apropiados mostrados arriba del diagrama. La interrogación del patrón de expresión de BCLllA en una recolección .de datos de expresión de células humanas (Su y colaboradores, Proc. Nati. Acad. , Sci . U. S. A. 101:6062 (2004)) revela una correlación inversa entre la expresión de BCL11A y , aquella del gen de ß-globina en células de linaje eritroide (Fig. IB) . La expresión de BCL11A en células eritroides en diferentes etapas de la ontogenia humana y con patrones variantes de la expresión del gen de globina son mostradas (Fig. IB), como es estimado de una recolección grande de dtos de expresión en tejidos humanos y tipos de células (Su y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 101:6062 (2004)). El panel superior muestra la expresión normalizada (a través de un panel 79 tipos de células humanas, realizado por lo menos por duplicado para cada tipo de célula) de. BCL11A en diferentes tipos de células eritroides y las etapas listadas en el fondo de la sonda 219497_s_at. Resultados similares se observaron con las sondas de BCL11A 219498_s_at y 210347_s_at. El panel del fondo muestra los niveles normalizados de globinas humanas fetales y embriónicas de este conjunto de datos. Los datos se normalizaron, para el panel superior y luego los porcentajes relativos se calcularon basado en todos los genes de ß-globina humana (incluyendo los genes e-, ?-, d- y ß-globinas) . Notablemente, la expresión de BCL11A' es muy baja en las células eritroides del hígado fetal y la línea de célula eritroide embriónica K562. La correlación inversa indica que la expresión de BCL11A es · restringida desarrolladamente en etapa. Además, el patrón temporal es consistente con el accionamiento de BCL11A como un represor potencial de la expresión de ?-globina.
Las variantes genéticas en el intrón 2 del gen BCL11A están significativamente asociadas con niveles de HbF en individuos normales y pacientes con desórdenes de hemoglobina (Lettre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. ' (2008); Uda y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U S A 105:1620 (2008); y Menzel y colaboradores, Nat. Genet . 39, 1197 (2007)) . La señal de asociación se ha mapeado recientemente de manera más final a una sola variante que está en desequilibrio de enlace cercado (LD) con el SNP rs4671393 (Lettre y colaboradores, supra (2008)) . Puesto que esta asociación se ha confirmado en múltiples poblaciones diaspóricas Europeas y Africanas independientes, la expresión de BCL11A como una función del genotipo en rs4671393 en lineas de células linfoblastoides de los grupos Europeos HapMap (CEU) y Africana (YRI) se examinó. Como se muestra en la Fig. 2A, la variante común rs4671393 está asociada con la expresión de BCL11A en lineas de células linfoblastoides humanas de las poblaciones Europeas HapMap (CEU) y Africana (YRI) . qRT-PCR se realizó en el RNA de estas lineas de células y se normalizó al nivel de la ß-actina humana. Dos reacciones de PCR separadas se realizaron que podrían individualmente estimar en niveles de las isoformas XL (Superior) y L (Fondo) basado en las diferencias en el extremo 3' de estos genes. Resultados similares se obtuvieron al analizar secuencias · 5' comunes utilizando qRT PCR. Los resultados se representan como la media con el error estándar mostrado por barras de error. Las diferencias entre los genotipos se calcularon utilizando la prueba t 'del Estudiante. El patrón de incremento de los niveles de HbF para cada uno de estos genotipos se muestra en la parte superior (Lettre y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A (2008) ) .
Una diferencia acentuante se observó en la expresión para arabas de las isoformas XL y L entre individuos homocigotos para el bajo alelo HbF (GG) , heterocigotos para ambos alelos, u homocigotos para el alelo menor asociado con altos niveles de HbF (AA) (Fig. 2A) . Las células homocigotas para los alelos de "alto HbF" expresados en nivel menor de transcriptos de BCL11A que estos homocigotos para alelos de "bajo HbF" o heterocigotos para ambos alelos. Asi, la expresión de BCL11A en las diferentes variantes humanas está inversamente correlacionada con los niveles de HbF asociados. La diferencia en la expresión entre el HbF "alto" y "baj.o" de los alelos .BCL11A asociados en aproximadamente 3 veces. Por consiguiente, diferencias relativamente moderadas en la expresión de BCL11A para asociarse con cambios en la expresión de HbF. Tomados conjuntamente con el pátrón de desarrollo de expresión de BCL11A, estos resultados proporcionan apoyo independiente, todavía indirecto, para un modelo en el cual BCLllA podría actuar como un represor de la expresión de ?-globina.
De manera sorprendente, la línea de células de eritroleucemia embriónica K562 se observó que expresa muy pocas si las hay, de las isoformas XL y L, pero en cambio expresaron proteínas variantes más cortas (Fig. 2B) . Para estimar si la diferencia entre los eritroblastos adultos y las células K562 ya que dejaron el control específico de etapa de desarrollo de BCLllA o la naturaleza maligna de estas células, se examinaron eritroblastos CD71+/CD235+, igualados en etapa aislados de médula ósea adulta, hígado fetal del segundo trimestre (FL), células primitivas del primer trimestre circulantes. FL y eritroblastos primitivos, que expresan robustamente ?-globina (C. Peschle y colaboradores, 1985, Nature 313, 235), expresaron variantes de BCLllA predominantemente más corta (Fig. 2B) . Mientras que los inventores están actualmente investigando la estructura de estas proteínas variantes, los descubrimientos en la presente indican que la posición de BCLllA es desarrolladamente regulada, tal que las isoformas XL y L de longitud completa se expresan casi exclusivamente en eritroblastos de etapa adulta. Independientemente, los datos genéticos fuertemente argumentan que el nivel de isoformas XL y L están influenciados por variantes de secuencia en el gen BCLllA.
BCLllA enlaza el complejo represor de NuRD, GATA-1, y FOG-1 en células erltrold.es Para mejor entender el mecanismo de acción de BCLllA en células eritroides, las proteínas con las cuales BCLllA interactúa se ha caracterizado. Primero, la versiones etiquetadas de afinidad de BCLllA en células de eritroleucemia de ratón (MEL) se prepararon (Fig. 3A) . Estas células representan un modelo conveniente de células eritroides de tipo adulto que expresan exclusivamente globinas adultas (Papayannopoulou y colaboradores, Cell 46:469 (1986)). El esquema utilizado para la purificación de afinidad en las células de eritroleucemia de ratón (MEL) se representa en este diagrama. Una vez que se realizó la elución de péptido FLAG, la espectrometría de masas de franja completa de geles de acrilamida se hizo como es descrito en lo anterior. Para identificar interacciones específicas, un procedimiento sustractivo que involucra un extracto simultáneo en células Mel-BirA parental (MB) se utilizó. Los resultados de esta clasificación sustractivo se muestran (Fig. 3B) con el número de péptidos obtenidos en cada experimento listados adyacentes a la proteína identificada. Los diversos componentes del complejo NuRD se muestran en azul en esta tabla (Fig. 3D) .
Nada de cambios transcripcionales globales mayores por el análisis de microarreglo se observaron en la expresión de versiones etiquetadas de BCLllA en estas células (Fig. 3C) . La intensidad normalizada log2 de sondas filtradas de arreglos Affymetrix 430 2.0 sobre las células MB parentales y una recolección de cuatro clones que contienen versiones FLAG-Biotag de BCLllA (clones FBB) se muestran en rojo. Una regresión lineal se muestra como una linea negra (r2 = 0.9753). el análisis de microarreglo y la filtración se realizaron como es descrito en la presente. El coeficiente de correlación global (r2) fue 0.9753 para la intensidad normalizada log2 de sondas de la linea de células parental comparada con una recolección de clones que expresan etiquetados, indicando una estrecha similitud en la actividad transcripcional de estas células (con valores de r2 de 0.9678, 0.9445, 0.9667, y 0.9736 para clones individuales que muestran, respectivamente, 1, 1, 4, y 9 veces de expresión del BCLllA etiquetado comparado con los niveles endógenos) . Después de la purificación de afinidad de complejos de proteina que contienen BCLllA etiquetado y la sec.uenciación de péptido espectrométrica de masas, los inventores identificaron numerosos péptidos de BCLllA, consistentes con la observación de que BCLllA puede autoasociarse y que estos complejos aparecen para involucrar múltiples isoformas (Liu y colaboradores, Mol Cáncer 5, 18 (2006)) (Fig. 3B) . Todos los componentes de la remodelación de nucleosoma y el complejo represivo de histona deacetilasa (NuRD) se recuperaron, sugiriendo una asociación física entre BCL11A y el complejo en células eritroides (Fig. 3B, azul), consistente con las observaciones previas de BCL11A en células B y el BCL11A homólogo en células T (Cismasiu y colaboradores, Oncogene 24:6753 (2005)). Compatible con esta interacción observada, BCL11A contiene una porción N-terminal que se cree que en otras proteínas recluta el complejo NuRD (Fig. 3D) (Lauberth y colaboradores, J. Biol. Chem. 281:23922 (2006) y Hong y colaboradores, Embo J. 24:2367 (2005)).
También se encontró que la proteína de matriz nuclear, matrin-3 (Nakayasu y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 88:10312 (1991)), consistentemente co-purificada con BCL11A, que puede ser responsable en parte para -la lcoalización de BCL11A a la matriz nuclear (Liu y colaboradores, Mol. Cáncer 5, 18 (2006)) (Fig. 3B) . el trabajo previo ha mostrado que la posición de ß globina está estrechamente asociado con la matriz nuclear hasta las etapas posteriores de eritripoyesis cuando ocurre la transcripción del gen de globina de alto nivel (Ragoczy y colaboradores, Genes Dev. 20:1447 (2006)). Adicionalmente , los complejos de BCL11A contienen péptidos derivados de GATA-1, el factor de transcripción eritroide principal (Martin, Nature 338:435 (1989) ) '(Fig. 3B) .
Esta interacción además se caracterizó y se validó.
Mediante la inmunoprecipitación (IP) , se confirmó que GATA-1 específicamente se asocia con BCLllA en células eritroides (Fig. 4A) . Las inmunoprecipitaciones (IPs) se realizaron con cuentas de M2-agarosa. Por otra parte, se encontró que el cofactor de GATA-1 FOG-1 (Tsang y colaboradores, Cell 90:109 (1997) ) también específicamente se asocia con BCLllA y la interacción con componentes de NuRD en células eritroides se confirmó adicionalmente (Fig. 4A) . El trabajo previo ha mostrado que FOG-1 también se enlaza al complejo NuRD (Hong y colaboradores, Embo J. 24:2367 (2005)) y estos resultados sugieren que BCLllA puede sinergizar con esta interacción en el contexto de la posición específica.
Las fracciones de filtración de gel (cada 4a fracción de : fracciones de 1 mi se muestran en el manchado) de extractos nucleares eritroides se muestran y se manchan para BCLllA, MTA2, GATA-1, y FOG-1. En el fraccionamiento de tamaño de extractos nucleares eritroides, sobreposición considerable entre los componentes NuRD y BCLllA en complejos de megadalton grande se observó (Fig. 4B) . La sobreposición de BCLllA con los polipéptidos GATA-1 y FOG-1 fue menos extensiva (Fig. 4B) . Háy sobreposición significante entre BCLllA y MTA2, con un pico pequeño de GATA-1 y FOG-1 observado aquí también. Las interacciones de BCLllA con GATA-1 (Fig. 4C) y FOG-1 (Fig. 4D) podría ser confirmado por la expresión exógena en células Cos7 utilizando versiones etiquetadas con FLAG de GATA-1 o FOG-1 y versiones etiquetadas con V5 de BCL11A. Utilizando esta misma estrategia, fragmentos de GATA-1 (todos los cuales muestran la expresión robusta aquí) podrían ser utilizados para mapear la interacción con BCL11A (Fig. 4E) . Sin desear que sea limitado por una teoría, es posible que solamente una fracción menor de estos factores se han enlazado con el BCL11A y los complejos NuRD. Alternativamente, la asociación in vivo podría ser más grande pero la disociación de los componentes de los complejos de proteína ocurre durante la preparación del extracto y el fraccionamiento de tamaño. GATA-1 y FOG-1 inmunoprecipitado con BCL11A en la expresión exógena en células no eritroides, lo cual sugiere que estas proteínas directamente interactúan (Fig. 4C y 4D) . Este procedimiento se utilizó para mapear las determinantes que 'median la asociación de GATA-1 y BCL11A (Fig. 4E) . Se encontró que BCL11A interactúa con los dedos de zinc de GATA- 1 (aminoácidos 200-338) y esta interacción aparece para ser parcialmente inhibida por la región N-terminal de GATA-1. La región N-terminal de GATA-1 se conoce que es importante para la eritropoyesis normal en humanos (Hollanda y colaboradores, Nat. Genet. 38:807 (2006)) y se muta somáticamente en un desorden mieloproliferativo infantil y leucemia que surge en pacientes son síndrome de Down (Wechsler y colaboradores, Nat. Genet. 32:148 (2002); y Vyas y colaboradores, Curr Opin Pediatr 19:9 (2007)). Conjuntamente, los datos proteómicos indican que BCL11A enlaza el complejo NuRD junto GATA-1 y FOG-1 en células eritroides. Estos factores asociados son probablemente para ser críticos para la acción de BCL11A como un represor transcripcional en células eritroides.
Estimación funcional de BCL11A como un represor de la expresión de HbF Los resultados presentados hasta ahora proporcionan evidencia genética, de desarrollo y bioquímica en el apoyo para una función potencial para BCL11A como represor de la expresión del gen de ?-globina. Para probar esta hipótesis, la modulación del nivel de BCL11A en células eritroides humanas primarias se intentó. Como un sistema celular en el cual realizar experimentos, precursores eritroides de progenitores hematopoyéticos humanos CD34+ purificados se expandieron y se diferenciaron. El efecto de la introducción transiente de siRNAs que se dirigen al mRNA de BCL11A se examinó. Cuando los siRNAs se introdujeron en progenitores eritroides en el día 0 de diferenciación, se logró 40-45% de inactivación de los niveles de mRNA de BCL11A, como es estimado en el día 4 de diferenciación. Con esta inactivación, un incremento de -2.3 veces en el nivel de ?-globina mediante qRT-PCR en la etapa de eritroblasto basofílico en el día 7 de diferenciación se observó (Fig. 5A) . con esta inactivación, un incremento 2.3 veces en el nivel de RNA de ?-globina se observó (de un promedio de 7 a 15.7%) en la etapa de eritroblasto basofilico en el día 7 de diferenciación (Fig. 5A) . Se encontró que como estos siRNAs se introdujeron en puntos de tiempo posteriores durante la diferenciación a eritroide, menor inducción del gen de ?-globina se observó (con la inducción de ?-globina promedio de 1.7 y 1.4 veces observada al adicionar siRNAs en los días 1 y 2 de diferenciación) .
Los resultados observados de la inactivación de siRNA de BCL11A podría ser debido al efecto amplio sobre . el estado de diferenciación celular, que se ha mostrado que altera la expresión de ?-globina (Nathan y colaboradores, Nathan and Oski's hematology of infancy and childhood. 6th, pp. 2 V. (x9) (2003) and Stamatoyannopoulos , Exp. Hematol. 33:259 (2005)), o reflejan acciones más directa en un número limitado de objetivos, incluyendo el gen de ?-globina. Para distinguir estas posibilidades, el perfilamiento de expresión de microarreglo de las células después de la inactivación de BCL11A y la diferenciación subsecuente se realizó. El perfilamiento de microarreglo de estas células utilizando el arreglo Affymetrix U133 Plus 2.0 revela que hay estrecha similitud en el. perfil de expresión de no dirección y las células tratadas con siRNA de BCL11A (r2 = 0.9901). La gráfica se muestra con intensidades de sonda normalizada log2. Los perfiles transcripcionales de genes en el intervalo cuantitativo del arreglo (que excluyó las globinas) fue notablemente similar entre las células en el día 7 después del tratamiento con siRNAs de BCLllA y los siRNAs de no dirección (NT) en el día 0, con un r2 de 0.9901 para las intensidades normalizadas log2 (Fig. 5B) . Adicionalmente, la morfología de estos dos grupos de células fue indistinguible a través de la diferenciación. Conjuntamente, estos resultados sugieren que la inactivación de BCLllA es capaz de alterar la expresión de globina sin causar cambios globales en el estado de diferenciación de las células.
Para examinar los efectos de la reducción más persistente de la expresión de BCLllA, la inactivación mediada con shRNA de lentiviral de la expresión de BCLllA con selección de células transducidas se utilizó (Moffat y colaboradores, Cell 124, 1283 (2006)). Dos construcciones de shRNA independiente se seleccionaron para este propósito. Cuando las células se infectaron con dos lentivirus de shRNA de BCLllA y la selección del fármaco ' se impuso en la iniciación de la diferenciación, un promedio de 97 y 60 por ciento de inactivación de BCLllA en el nivel de proteína por el día 5 de la diferenciación eritroide se observó, basado en la densitometría de los manchados de western (Fig. 5C) . En el día 6 de diferenciación (proeritroblasto a la etapa de eritroblasto basofílico) , la célula aparece para ser indistinguible como ocurre morfológicamente en otras etapas de diferenciación también. Nada de diferencia morfológica entre los grupos de células podría ser notado durante el curso de diferenciación, sugiriendo gue, en el caso de los experimentos de siRNA, la inactivación de BCL11A no fue perturbadora de la diferenciación eritroide global (Fig. 5D) .
El nivel de ?-globina en el día 7 de diferenciación se elevó notablemente por 6.5 y 3.5 veces (de un promedio de 7.4 a 46.8 y 26%) en los dos conjuntos de inactivación mediada por shRNA de células tratadas con BCL11A comparado con las células infectadas de control (Fig. 5E) . Este efecto robusto es probable que sea . el resultado de tanto la selección para células transducidas así como la expresión continua de los shRNAs después de la transducción viral. La inducción de RNA de ?-globina se acompañó a niveles correspondientes de HbF madura, como es mostrado por la electroforesis de hemoglobina y la cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) (Fig. 5F) . Los hemolisados preparados de las células en el día 12 de diferenciación muestra la presencia de HbF madura. Esto podría ser estimado utilizando la electroforesis de hemoglobina de acetato de celulosa, con el embarramiento de HbF mostrado en los péneles superiores y la medición correspondiente en promedio de la densitometría mostrada enseguida de estos péneles. Este también podría ser más precisamente cuantificado por el HPLC de hemoglobina, como se muestra en el fondo. Los picos de HbF se marcan con una fleche en cada cromatograma , con el primer pico correspondiente a HbF acetilada y el segundo HbF no modificada. El HPLC reveló que una fracción sustancial de la hemoglobina Madura en estas células fue HbF (con un nivel promedio de 35.9 y 23.6%, comparado con niveles no detectable en el control) . Basado en la variación en el grado de inactivación de BCLllA de los experimentos de siRNA y shRNA y el grado concomitante de inducción de ?-globina observada, aparece que BCLllA puede funcionar como un reóstato molecular para regular el silenciamiento del gen ?-globina.
. - Los estudios moleculares del cambio de globina durante la ontogenia han servido como un paradigma para el control de desarrollo de genes mamíferos. A pesar del estudio extensivo, los mecanismos moleculares exactos que implican este proceso permanecen para ser descubiertos. Si se desea que sea limitado por la teoría, los resultados descritos en la presente sugieren que BCLllA es pos si mismo un modulador desarrolladamente regulado y' crítico para este proceso. Los inventores han mostrado que BCLllA reprime la expresión del gen de ?-globina en células eritroides humanas adultas primarias. Los datos de proteína de los inventores sugieren que BCLllA funciona de acuerdo con el complejo represor NuRD, GATA-1 y FOG-1. Como es notable, los inhibidores de histona deacetilasas (HDACs) aparecen para inducir algo de HbF en pacientes con desórdenes de hemoglobina (Perrine, Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program, 38 (2005)). HDAC1 y HDAC2 son ambos componentes de núcleo del componente NuRD y esta asociación con BCL11A sugiere que este complejo puede ser el objetivo molecular de estas terapias. Es evidente en el trabajo en la genética humana que la modulación de BCL11A puede elevar los niveles de HbF y aminorar la severidad de estas enfermedades (Lettre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. (2008); Uda y colaboradores, Proc Nati Acad Sci U S A 105, 1620 (2008) y Menzel y colaboradores, Nat Genet 39, 1197 (2007) ) . Como un componente especifico de etapa involucrado en la represión de la expresión de ?-globina, BCL11A emerge como un nuevo objetivo terapéutico para la activación de HbF en la enfermedad de célula falciforme y las ß-talasemias . Es probable que el estudio adicional de BCL11A y sus factores asociados en la regulación del gen de globina conduzca a un entendimiento mecanistico mejorado del cambio fetal y la manipulación dirigida de HbF en humanos.
EJEMPLO 2 Materiales y Métodos Animales Experimentales Todos los experimentos realizados con los ratones ß-posición, K-RasG12D, BCL11A -/-, GATAl-Cre, y Mxl-Cre fueron aprobados por el comité de ética de animales de Children' s Hospital Boston y el comité ético del Fred Hutchinson Cáncer Research Center.
Las razas de ratones transgénicos YAC de posición de ß-globina de tipo silvestre (ß-YAC) que se utilizaron en este estudio exhiben un patrón similar de la expresión del gen de globina humana y son representativos de varias razas de ratones transgénicos que albergan la posición de ß-globina humana completa (Peterson, K.R. y colaboradores 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . U. S. A. 90:7593-7; Peterson, K.R., y colaboradores 1998, Hum. Mol. Genet . 7:2079-88; Harju, S., y colaboradores, 2005, Mol. Cell Biol . 25:8765-78; Porcu, S. y colaboradores 1997, Blood 90:4602-9; Gaensler, K.M., y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 90:11381-5; Strouboulis, J. , y colaboradores, 1992, Genes Dev. 6:1857-64). Una linea de ratón transgénico fue proporcionada por K. Peterson y se creó con la inserción de un posición de ß-globina humana del YAC de 213 kb que contiene la posición de ß-globina humana intacta completa y se ha descrito y caracterizado previamente (Peterson, K.R. y colaboradores 1993; Peterson, K.R., y colaboradores 1998; Harju, S., y colaboradores, 2005, supra) . Esta linea ß-YAC contiene tres copias intactas de la posición de ß-globina humana integrada en una sola posición genómica. Dos lineas ß-YAC (A20 y A85) que albergan una sola copia de un YAC de posición de ß-globina de ~150 kb también se utilizaron en este estudio y se han descrito previamente (Porcu, S. y colaboradores 1997, supra) (proporcionada como obsequio por K. Gaensler) . Estos transgenes se mantuvieron en el estado hemicigoto.. Los animales se mantuvieron en un fondo C57B1/6 puro para todos los experimentos que involucran análisis hematopoyético adulto. Un desorden mieloproliferativo de tipo leucemia mielomonocitica juvenil se indujo al cruzar la linea Mxl-Cre con el alelo adicional K-rasG12D (Chan, LT . y colaboradores, J. 2004, Clin. Invest . 113:528-38; Braun, B.S. y colaboradores, 2004, Proc. Nati. Acad. Sci . .U. S. A. 101:597-602), junto con el transgén ß-YAC de . Peterson. Los ratones congénitos B6. SJL-PtprcaPep3b/BoyJ (Ptprca or CD45.1) se compraron de Taconic Farms o de Jackson 'Laboratory. Los ratones que contiene un alelo floxeado BCL11A (con los sitios loxP que flanquean el exón 1) se crearon a través de procedimientos de elección del gen y serán descritos en trabajo futuro (G.C.I., S.D.M, y P.W.T., no publicado) . Para obtener el alelo nulo de BCL11A, estos ratones se cruzaron con ratones GATAl-Cre y se clasificaron para la supresión de la linea germinal (Garrick, D. y colaboradores 2006, PLoS Genet. 2:e58; Jasinski, M., y colaboradores, 2001, Blood 98:2248-55) .
Análisis Hematopoyético Adulto Los análisis de la hematología adulta, trasplantes de médula ósea y la inducción de 5-fluorouracilo (5-FU) se realizaron como es descrito previamente (Sankaran, V. G., y colaboradores, 2008, Genes Dev. 22:463-475; Walkley, C.R., y colaboradores, 2005, Nat . Cell Biol. 7:172-8) . PB completa se analizó en un analizador hematológico Beckman Coulter AcT ( Jasinski, M. , y colaboradores, 2001, supra) . Los ratones recipientes (CD45.1) se irradiaron con un total de ?-radiación de 10.5Gy (5Gy y 5.5Gy, 3 horas aparte) en el dia de la transplantación. BM completas se aisló y se acumuló de ratones ß-YAC. Un total de 2X106 células/ratón se inyectaron retroorbitalmente en los recipientes. La RNA se obtuvo de las sangre utilizando el QiaAmp Blood Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) y la RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) se realizó como es descrito (Sankaran, V. G., y colaboradores, 2008, supra; Sankaran, V. G. y colaboradores, 2008, Science 322:1839-42) (utilizando los cebadores del gen de globina humana listados enseguida o cebadores de murino previamente reportados (Kingsley, P.D.' y colaboradores, 2006, Blood 107:1665-72) . Los cebadores del gen de globina humana fueron el exón 1 de e-globina 5' -GAGAGGCAGCAGCACATATC-3' delantero (SEQ. ID. NO. 7), exón 2 de e-globina 5' -CAGGGGTAAACAACGAGGAG-3 ' trasero (SEQ. ID. NO. 8), exón 2 de ?-globina 5' -TGGATGATCTCAAGGGCAC-3' delantero (SEQ. ID. NO. 9), exón 3 de ?-globina 5' -TCAGTGGTATCTGGAGGACA- 3 ' trasero (SEQ. ID. NO. 10), exón 1 de ß-globina 5'-CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA- 3 ' delantero (SEQ. ID. NO. 11), y exón 2 de ß-globina 5' -AGCATCAGGAGTGG ACAGAT-3 ' trasero (SEQ. ID. NO. 12) . Los cebadores del gen de globina de eratón utilizado fueron el exón 1 de e? globina 5' -TGGCCTGTGGAGTAAGGTCAA-3' delantero (SEQ. ID. NO. 13), exón 2 de e? globina 5'-GAAGCAGAGGACAAGTTCCCA-3' trasero (SEQ. ID. NO. 14), exón 2 de ß?? globina 5 ' -TGGACAACCTCAAGGAGACC-3 ' delantero (SEQ. ID. NO. 15), exón 3 de ß?? globina 5 ' -ACCTCTGGGGTGAATTCCTT-3' trasero (SEQ. ID. NO. 16), exón 2 de p mayor/ß menor globinas 5' -TTTAACGATGGCCTGAATCACTT-3 ' delantero (SEQ. ID. NO. 17), y exón 3 p-mayor/ -menor globinas 5' -CAGCACAATCACGATCATATTGC-3' trasero (SEQ. ID. NO. 18) . Los cebadores de qRT-PCR BCL11A de ratón fueron 5 ' -AACCCCAGCACTTAAGCAAA-3 ' delantero (SEQ. ID. NO. 19) y 5' -ACAGGTGAGAAGGTCGTGGT-3 ' trasero (SEQ. ID. NO. 20) .
Análisis Hematopoyético de Desarrollo Embriones se obtuvieron del apareamiento sincronizado, se sangraron y las células positivas de Terll9 se clasificaron basadas en la dispersión delantera y lateral similar a lo que se ha descrito previamente (Kingsley, P.D. y colaboradores, 2006, supra) . Las células se mantuvieron en solución salina regulada con fosfato (PBS) con suero de ternero fetal al 5% (FCS) . Heparina no fraccionada en PBS se adicionó a esta solución a una concentración final de 12.5 pg/ml. La dnmunohistoquimica utilizando un anticuerpo policlonal anti-HbF se realizó en secciones incrustadas en parafina fijadas como es descrito (Choi, J.W., y colaboradores, 2001, Int. J. Hematol. 74:277-80). Los hígados fetales de embriones murinos E13.5 se diseccionaron y se creó una sola suspensión de células. De manera similar, las células de médula ósea se recolectaron como se ha descrito previamente de ratones (Sankaran, V. G., y colaboradores, 2008, Genes Dev. 22:463-475). En ambos casos, las células se marcaron con Ter-119 y CD71, asi como 7-AAD. Las poblaciones Ter-119+/CD71+ se clasificaron como es descrito, previamente (Sankaran, V. G. , y colaboradores, 2008, supra) . Las muestras humanas igualadas en la etapa se obtuvieron y se clasificaron como es descrito previamente (Sankaran, V. G. y colaboradores, 2008, Science 322:1839-42). Estas muestras humanas fueron proporcionadas por obsequio por H. Mikkola y B. Van Handel.
Análisis de Manchado de Western de BCL11A La expresión de BCL11A se realizó utilizando el anticuerpo 14B5 (Abeam Inc., abl9487), como es descrito previamente (Sankaran, V.G. y colaboradores, 2008, Science 322:1839-42) . La expresión de GAPDH se estimó como un \ estándar utilizando el anticuerpo policlonal de conejo FL-335 (Santa Cruz Biotechnology Inc., sc-25778).
FISH de Transcripto Primario de RNA FISH de RNA de transcripto primario se realizó grandemente como es descrito previamente (Wijgerde, M., y colaboradores, 1995, Nature 377:209-13; Ragoczy, T., y colaboradores, 2006, Genes Dev. 20, 1447-57) con algunas modificaciones. Antes de la hibridación, las platinas se equilibraron en formamida al 50%/2X SSC, pH 7.0. Las son das de DNA de_ una sola hebra contra los intrones de los genes de a- y e?- y ?- ß-globina humana de murino se generaron mediante la transcripción in vitro de fragmentos de intrón clonados seguido por la transcripción inversa y la inclusión ( de DIG-ll-dUTP, biotina-16-dUTP (Roche) o DNP-ll-dUTP (Perkin Elmer) en las reacciones como es descrito (Bolland, DJ. y colaboradores 2004, Nat . Immunol. 5:630-7). Las sondas marcadas se hibridaron a las células en formamida al 50%/sulfato de dextrano al 10%/2XSSC/complejo de vanadato de ribonucleótido 5 m /BSA al 0.05%/0.1 mg/ml Cot-1 DNA/1 ug/ l de tRNA de E.coli. Las sondas se desnaturalizaron con calor a 80°C durante 5 minutos, se prerecocieron a 37°C, y luego se hibridaron durante la noche a 37 °C en una cámara húmeda. Las platinas se lavaron en formamida al 50%/2XSSC, pH 7 a 37°C, se enjuagaron en 2X SSC y se bloquearon en NaCL 145 mM/Tris 0.1 pH 7.5/BSA al 2%/complejo de vanadato de ribonucleótido 2 m . Los focos de transcripto primario se detectaron mediante la inmunofluorescencia directa con anticuerpos conjugados con Cy3-, Alexa Fluor 488 y 647 incluyendo una o dos capas de amplificación de señal, como es descrito (Trimborn, T., y colaboradores, 1999, Genes Dev. 13, 112-24).
Adquisición y Análisis de Imagen de FISH Apilamientos de imagen (secciones Z espaciadas 0.25 µ?t? aparte) se capturaron en un microscopio Olympus 1X71 (objetivo de Olympus 100X/1.40, UPLS Apo) equipado con una cámara de CCD enfriada utilizando el software Deltavision SoftWorx (Applied Precisión) . La presencia de los transcriptos primarios del gen de globina se determinó en proyecciones 2D de los apilamientos Z utilizando Photoshop (Adobe) . Aproximadamente 100-200 núcleos se analizaron para cada conjunto de sonda y la etapa de maduración.
Izvmmoprecipitación de cromatizia (ChIP) de células eritroides primarias Los progenitores . eritroides derivados de CD34 humana se recolectaron en el día 5 de diferenciación (etapa de proeritroblasto) . Las células se fijaron utilizando una concentración final de 1% de formaldehído y la relación se dejó procesar durante 10 minutos. Glicina a una concentración final de 125 mM luego se .introdujo para determinar la reticulación. Las células se lavaron dos veces en PBS y pelotillas de células se almacenaron a -80°C. Típicamente -15-20 X106 células se utilizaron por reacción de ChIP. Los ensayos de ChIP se realizaron de una manera similar a lo que se ha descrito previamente en J. Kim, y colaboradores, 2008, Cell 132:1049.! La solución reguladora de sonícación se modificó con el uso de SDS al 0.5%, en lugar de 0.1%. El procedimiento de sonícación se modificó con el uso de 4 a 6 impulsos de 30 segundos, cada uno que involucra sonícación constante. Este procedimiento exacto típicamente produce fragmentos en el intervalo de 300-1000 pares de bases con este procedimiento. Los siguientes anticuerpos se utilizaron para el procedimiento ChIP: BCLI1A [14B5] (Abeam, abl9487), BCL11A [15E3AC11] (Abeam, abl8688), BCL11A (Novus Biologicals, Inc. NB600-261), y Rabbit IgG (Upstate, 12-370). Resultados similares se obtuvieron con todos los anticuerpos BCL11A en todas las regiones probadas.
Las muestras ChIP se analizaron mediante la PCR cuantitativa en tiempo real (BioRad) . Todos los cebadores se probaron para la eficiencia de PCR como es recomendado por el fabricante (BioRad) . Una curva estándar se preparó para cada conjunto de cebador utilizando la titulación serial del DNA de entrada. La cantidad relativa de cromatina precipitada (por ciento de entrada) se calculó de las curvas estándares específicas de cebador utilizando el software y el Análisis de Datos iCycler. Los cebadores específicos se diseñaron para amplificar secuencias en el HS3; región de promotor HBGl; región corriente abajo HBGl (+ 3 kb) ; región corriente arriba de HBD (-1 kb) ; y la región de promotor HBB de la posición de ß-globina humana. Adicionalmente, un conjunto de cebadores degenerados que enlazó a los promotores de tanto HBG2 y HBGl se utilizó y mostró el resultado similares al conjunto de cebadores de promotor HBGl (sin enriquecimiento detectado) .
Resultados La contribución de cambios en los elementos reguladores cis y los factores de acción trans a diferencias de interespecies en la expresión génica no es bien entendido. La posición de ß-globina mamifera ha servido como un paradigma para la regulación génica durante el desarrollo. Los ratones transgénicos que albergan la posición de ß-globina humana, que consisten de los genes embriónicos (e), fetales (?) y adultos (ß) enlazados, se ha utilizado como un sistema modelo para estudiar el cambio temporal de hemoglobina fetal a adulta, como ocurre en humanos. Los inventores muestran que los genes de ?-globina humana en estos ratones se comportan como los genes de globina embriónica de murino, revelando una limitación del modelo y demostrando que las diferencias críticas en el medio de acción trans han surgido durante la evolución mamifera. Los inventores muestran que la expresión de BCL11A, un represor de la expresión de ?-globina humana identificada a través de estudios de asociación de genoma amplio, difiere entre el ratón y el humano. El silenciamiento de desarrollo de los genes de globina embriónica de ratón y ?-globina humana no logra presentarse en ratones en la ausencia de BCL11A. Así, BCL11A es un mediador . crítico del cambio de globina divergente de la .especie. Al comparar la ontogenia de la regulación del gen de ß-globina en ratones y humanos, los inventores han mostrado que las alteraciones en la expresión de un factor de acción trans constituye un impulsor ético de los cambios de expresión génica durante la evolución.
El grado al cual los cambios en los elementos reguladores cis o el ambiente de acción trans tiene cuentas de diferencias en la expresión génica en las especies estrechamente relacionadas es el sujeto de debate (Carroll, S.B., 2008, Cell 134:25-36; Hoekstra, H.E. y Coyne, J.A., 2007, Evolution 61:995-1016). Algunos estudios sugieren que los cambios en los elementos reguladores cis son grandemente responsables para muchas diferencias de interespecies en la expresión génica (Wallace, H. A. y colaboradores, 2007, Cell 128:197-209; Wilson, M.D. y colaboradores, 2008, Science 322': 434-8) . La contribución de las alteraciones en el medio de acción trans es menos establecida. Con los cambios temporal de la expresión de globina, la posición de ß-globina mamífera sirve como un paradigma para la regulación génica de desarrollo ( cGrath, K. & Palis, J. , 2008, Curr. Top. Dev. Biol. 82:1-22). Para estudiar la regulación de los elementos cis humanos en el ambiente de acción trans de ratón, los inventores emplearon ratones transgénicos de posición de ß-globina humana (ratones de ß-posición) . La regulación de la posición de ß-globina humana se ha estudiado ampliamente utilizando tales modelos de ratón (Wijgerde, ., y colaboradores, 1995, Nature 377:209-13; Peterson, K.R., y colaboradores, 1998, Hum. Mol. Genet . 7:2079-88; Porcu, S. y colaboradores, 1997, Blood 90:4602-9). Generalmente se acepta que estos ratones proporcionan un sistema válido para evaluar la regulación del gen de globina de desarrollo humana, aunque algunas diferencias se han notado entre humanos y estos ratones. Por ejemplo, el inicio de la expresión de ?-globina ocurre durante la etapa del saco de huevo embriónico de eritropoyesis en el ratón, mientras que la expresión de alto nivel de este en ocurre durante la etapa de hígado fetal en el hombre. Por otra parte, el cambio de ?-globina a ß-globina adulta ocurre durante la eritropoyesis de hígado fetal temprano en estos ratones (Wijgerde, M., y colaboradores, 1995; Peterson, K.R., y colaboradores, 1998, Porcu, S. y colaboradores, . 1997, supra) , mientras que esto ocurre alrededor del tiempo del nacimiento en humanos (Pésenle, C. y colaboradores, 1985, Nature 313, 235-8) . Además, se han notado diferencias en la capacidad de estos ratones a responder a las respuestas que inducen la hemoglobina fetal (HbF) que son activas en humanos (Sloane- Stanley, J. , 2006, Br. J. Haematol. 135:735-7; Pace, B., y colaboradores, 1994, Blood 84:4344-53). Los inventores comenzaron a evaluar si estos ratones responden a los estímulos que incrementan consistentemente el nivel de HbF humanos ( Papayannopoulou, T., y colaboradores, 1984, Science 224:617-9). Los inventores encontraron que estos ratones tienen niveles básales mucho menores de expresión de ?-globina que los humanos adultos y no lograron responder a los estímulos que dan por resultado niveles elevados de HbF en humanos (Fig. 10) . La gráfica muestra, respectivamente, la medición de línea de base en ratones adultos (n=10), trasplantes .de médula ósea con el donador 2X106 (ratón de ß-posición) células de médula (Alter, B. P., y colaboradores, 1976, Blood 48:843-53) (n=10) en días 10 y 17 de post-trasplante, el tratamiento de 5-FU cuando las citopenias están su nadir en el día 7 (n=10), y un tipo de leucemia mielomonocítica juvenil (JMML) de desorden mieloproliferativo de la activación de K-ras (Braun, B. S. y colaboradores 2004, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 101:597-602; Chan, L . y colaboradores 2004, J. Clin. Invest .113 : 528-38) (n=3) . Los datos se grafican como el porcentaje de ?-globina sobre los niveles del gen de globina similar a ß humana total calculado basado en los resultados de qRT-PCR. Los resultados se muestran como la media ± desviación estándar de la media. Como es notable, el nivel de línea de base de ?-globina es 50 a 100 veces menor que en humanos adultos (Oneal, P.A. y colaboradores 2006, Blood 108:2081-6; Nathan, D. G., y colaboradores, 2003, in Hematology of infancy and childhood, 2 v. (xiv, 1864, xlip.) (Saunders, Philadelphia, Pa.) . También, en un modelo de leucemia mielomonocítica juvenil creada en estos ratones, no se observó elevación en los niveles de ?-globina, en contraste a los altos niveles de ?-globina observada en humanos con este síndrome (Weatherall, DJ. y colaboradores, 1975, Nature 257:710-2) .
Los genes de ?-glóbina fetales humanos se comportan como genes emb iónicos en el ratón Para proseguir la base implícita de estas diferencias de especies, los inventores reestimaron la ontogenia de la expresión de ?-globina humana durante el desarrollo del ratón. Los inventores primero aislado la sangre circulante de embriones en un tiempo cuando se observa la expresión de ?-globina (E13.5) (Wijgerde, M. , y colaboradores, 1995, Nature 377:209-13; Peterson, K.R., y colaboradores, 1998, Hum. Mol. Genet . 7:2079-88; Porcu, S. y colaboradores, 1997, Blood 90:4602-9) . Utilizando diferencias en el tamaño de células que permiten la separación de células de linaje primitivo y definitivo circulantes utilizando citometría de flujo (Kingsley, P.D. y colaboradores, 20.06, Blood, 107:1665-72; Fraser, S.T., y colaboradores, 2007, Blood, 109:343-52), los inventores enriquecieron las células eritroides en la sangre del día embriónico 13.5 (El 3.5) del ratón de ß-posición (Fig. 6A) . Como es anticipado, la expresión del gen embriónico de ratón e? globina, un gen confinado al linaje eritroide primitivo junto con la globina ß?? de ratón (Kingsley, P.D. y colaboradores, 2006, Blood, 107:1665-72; Fraser, S.T., y colaboradores, 2007, Blood, 109:343-52), se enriqueció (aproximadamente 5 veces) en la población primitiva con relación a la población definitiva (Fig. 6B) . Consistente con esta distribución, los transcriptos de e-globina embriónica humana se enriquecieron similarmente en la población primitiva (Fig. 6B) . De manera sorprendente, no hubo diferencia observada entre el enriquecimiento relativo de los genes embriónicos y el grado de enriquecimiento de los transcriptos de ?-globina humana en la población eritroide primitiva comparada con las células definitivas (Fig. 6B) . Este descubrimientos indica que los genes de ?-globina humana no se expresan robustamente en las células eritroides definitivas tempranas en los ratones de ß- posición .
Los inventores luego utilizaron la inmunohistoquímica (IHC) de ?-globina en embriones E13.5 para examinar su distribución celular. IHC de hígado fetal humano (FL) reveló la marcación positiva de todos los eritroblastos (Fig. 6C) . En contraste, la mayoría de eritroblastos •presentes en el FL de murino de los ratones de ß-posición no lograron manchar para la ?-globina. Los inventores observaron células megaloblásticas , nucleares grandes ocasionales en el FL positivo para ?-globina (Fig. 6D y 6E) . Morfológicamente estas células se asemejan a las células primitivas que continúan circulando en números sustanciales durante este período de gestación (McGrath, K. & Palis, J. , 2008, Curr. Top. Dev. Biol. 82:1-22). Consistente con esta interpretación, las numerosas células positivas de ?-globina observadas en la circulación todas fueron células primitivas megaloblásticas , mientras que las células definitivas más pequeñas, enucleadas fueron uniformemente negativas (Fig. 6E y 6F) . Para generalizar este descubrimiento, los inventores realizaron el manchado inmunohistoquimico similar en otras lineas independientemente derivadas de los ratones de ß-posición (Fig. 6G y 6H) (Porcu, S. y colaboradores, 1997, Blood 90:4602-9). En todas las lineas, la expresión de ?-globina (como es indicado por IHC positivo) se confinó a las células megaloblásticas circulantes que fueron infrecuentes en el parénquima de FL. Como observaciones similares se han hecho en ratones de ß-posición independientemente derivados, los descubrimientos de los inventores demuestran un aspecto característico de los ratones de ß-posición.
El análisis de célula, individual confirma el comportamiento divergente de las posiciones de ß-globina humana en ratones Para ganar discernimiento adicional en el nivel de célula individual, los inventores emplearon la hibridación in situ de fluorescencia de RNA de transcripto primario (PT-FISH) para examinar la expresión relativa de los genes de globina de ratón y humanos endógenos en diferentes etapas de ontogenia (Ragoczy, T., y colaboradores, 2006, Genes Dev. 20:1447-57;: Trimborn, T., 1999, Genes Dev. 13:112-24). Primero, los inventores examinaron la expresión relativa de la ?- y ß-globina humana (con la a-globina de murino como un control) en células eritroides primitivas E11.5 de dos lineas transgénicas independientes (A20 y A85) . Consistente con los análisis previos que demuestran la expresión de alto nivel de ?-globina en la etapa eritroide primitiva en los ratones de ß-posición, los inventores notaron relativamente alta expresión de ?-globina mediante PT-FISH, con la expresión baja o ausente de ß-globina humana (Fig. 7A y 2B) . Entre las células primitivas circulantes de una etapa posterior de desarrollo (E13.5) se observó un patrón similar, aunque más expresión de ß-globina humana se observó y una reducción total en el porcentaje de células con una señal de PT-FISH (utilizando el control de a-globina de murino) se notó, con solamente una fracción de células (-1/3) que muestra posiciones transcripcionalmente activas en un solo · punto de tiempo (Fig. 7A y 7B) . Ejemplos de las células utilizadas en este análisis se muestran (datos no mostrados). Una observación interesante hecha con el análisis de PT-FISH concomitante de y- y ß-globina humana es el grado de cotranscripcion, que representa la presencia concomitante de dos señales de transcripto primarias dentro de la misma posición del gen (datos no' mostrados) .
Análisis de la cotranscripcion mediante el análisis de hibridación in situ de fluorescencia de transcripto primario (PT-FISH) La cotranscripción se define como la presencia simultánea de dos señales de transcripto primarias de la misma posición de gen en una sola célula. La alta frecuencia de cotranscripción se observa en este análisis, particularmente en etapas cuando se expresa poco del gen de ?-globina maduro. En las células de sangre periférica (células primitivas circulantes) del día embrión'ico 13.5 (E13.5), 19 y .21% (en las lineas A85 y A20, respectivamente) de las células que expresan ?-globina muestran cotranscripción de ß-globina (datos no mostrados) . En las células de hígado fetal de E13.5, este grado de sobreposición se incrementa notablemente, con 52 y 55% de células que expresan ?-globina que muestra cotranscripción de ß-globina (datos no mostrados) . La naturaleza de tal cotranscripción está incierta. Previamente se ha adscrito un mecanismo de flip-flop rápido de la región de control de posición (LCR) con los genes de globina corriente abajo (Wijgerde, M., y colaboradores, 1995, Nature 377:209-13). Los resultados sugieren que los transcriptos primarios pueden ser generados mediante la cotranscripción aun en la ausencia de la transcripción robusta (como es indicado por ?-globina en células E13.5 FL) . Puesto que PT-FISH está limitado a un solo disparo corto de transcripción, es incierto sin la velocidad de transcripción de las posiciones cotranscritas es comparable. Estos descubrimientos sugieren que la velocidad y/o eficiencia de estas posiciones concomitantemente transcritas probablemente varían y por lo tanto la presencia de transcriptos primarios, particularmente en el contexto de cotranscripción, puede no indicar producción eficiente de transcriptos maduros.
La comparación de e?-globina embriónica de ratón con ?-globina reveló expresión similar del gen embriónico de ratón con la g-globina humana en células primitivas circulantes de E13.5 (Fig. 7C y 7D) . Este descubrimiento indica que la expresión de los genes de ?-globina humana está en paralelo- a aquella de los genes similares a ß-embriónicos de ratón en el ambiente de acción trans de ratón. Las células FL de E13.5 se analizaron de una manera similar, al examinar la expresión de e? de ratón y ?-globina humana mediante PT-FISH en estas células. Solamente un bajo porcentaje de células mostró manchado para ya sea e? o ?-globina (Fig. 7C y 7D) , comparado con la transcripción robusta de ß-globina humana en la misma etapa (Fig. 7A y 7B) . Consistente con el análisis de desarrollo previo en ratones (Kingsley, P.D. y colaboradores, 2006, Blood, 107:1665-72; Trimborn, T., 1999, Genes Dev. 13:112-24), las células positivas para e? de ratón representan células primitivas circulantes presentes dentro del hígado fetal de ratón. Las células que son positivas para la expresión de ?-globina humana también son probables que sean células eritroides primitivas, y es importante reconocer que en estas células solamente una fracción (-1/3) de posiciones son activas en cualquier punto de tiempo individual, limitando de esta manera el grado de expresión concomitante observada. Como es notable, 45 y 54% (en las lineas A85 y A20, respectivamente) de las células primitivas de E13.5 (PBC) con el transcripto de ?-globina mostró expresión de e? globina, soportando la noción de que la ?-globina se trata como un gen embriónico en el ambiente de acción trans de ratón. De manera interesante, un análisis temprano de transgenes de muy baja expresión que carecen de la región de posición critica de las secuencias reguladoras ha sugerido que la ?-globina en realidad se comportó como un gen embriónico, ya que los inventores hay mostrado que para los ratones que contienen la ß-posición humana robustamente expresada (Chada, K., y colaboradores, 1986, Nature 319:685-9) · BCLllA restringe la. expresión de globina. similar a ß e briónica de ratón al linaje primitivo A partir de estos resultados se concluyó que el ambiente de acción trans eritroide de ratón homólogo difiere de aquel del humano, presumiblemente con respecto a la composición o regulación de reguladores transcripcionales críticos. Recientemente se ha mostrado que el gen BCLllA, que alberga variantes genéticas que afectan los niveles de HbF en humanos (Uda, M. y colaboradores, 2008, Proc. Nati. Acad.
Sci. U. S. A . 105:1620-5; Lettre, G. y colaboradores, 2008, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A . 105:11869-74; enzel, S. y colaboradores, 2007, Nat . Genet . 39:1197-9; Sedgewick, A.E. y colaboradores, 2008, Blood Cells Mol. Dis. 41:255-8), codifica un represor especifico de etapa de desarrollo de los genes de ?-globina humana (Sankaran, V. G. y colaboradores, 2008, Science 322:1839-42). Los descubrimientos previos se confinaron a un análisis de células eritroides huma as, que los inventores encontraron que forma BCLllA de longitud completa que se expresaron robustamente en eritroblastos de médula ósea de adulto, en niveles sustancialmente menores en FL, y ausente dentro de eritroblastos primitivos. Por otra parte, las formas variantes más cortas de BCLllA se expresan en eritroblastos primitivos humanos y FL, ambos de los cuales se expresa ?-globina. Para investigar las diferencias de especies potenciales en la expresión de proteina BCLllA, los inventores examinaron poblaciones clasificadas de FACS, igualadas en etapa de células eritroides de ratón y humanas. Notablemente, la comparación de la expresión de BCLllA en las muestras de ratón y humanas revelan diferencias acentuantes (Fig. 8A, Fig. 11). La expresión de RNA de BCLllA medido por qRT-PCR en poblaciones de células igualadas en etapa clasificada (clasificadas para CD71 y Ter-119) de diferentes etapas de desarrollo de ratones demuestra que RNA de BCLllA se expresa en niveles similares en todas las poblaciones definitivas de células de murino, pero estuvo ausente o se expresó en niveles notablemente reducidos . en células primitivas (normalizado a GAPDH) . Primero, la proteina BCLllA y los transcriptos de RNA están ausentes en células eritroides primitivas de ratones. Segundo, las formas de longitud completa de BCLllA se expresan en niveles similares en células eritroides definitivas de tanto la FL de ratón y la médula ósea, mientras que nada de formas variantes más cortas podrían ser identificadas en ratones (Fig. 8A) . Adicionalmente, las formas variantes cortas están presentes en estas etapas de desarrollo tempranas. Todas las células humanas se clasificaron para la expresión CD235 y CD71. En contraste, en células de murino, la expresión de proteína BCLllA de longitud completa es evidente en todas las poblaciones progenitoras definitivas, incluyendo las células eritroides de hígado fetal E13.5 y de médula ósea igualadas en etapa, clasificadas- (todas las poblaciones se clasificaron para Terll9+/CD71+) . No se detectó expresión de BCLllA dentro de las poblaciones de células primitivas de murino. Estos resultados resaltan las diferencias de interespecie importantes que podrían potencialmente desempeñar una función en mediar la regulación del gel de globina divergente. Un modelo basado en los descubrimientos de los inventores de .la expresión de desarrollo de los genes de globina similares a ß en humanos, ratones y los ratones de ß-posición se muestra, junto con un resumen de la expresión de BCL11A en estas dos especies (Fig. 8B) .
Los inventores demostraron que la expresión de los genes de ?-globina humana estrictamente está en paralelo a aquella de los genes embriónicos de ratón, e? y ß??, en el contexto del ambiente de acción trans de ratón. Por otra parte, el patrón de la expresión de BCL11A sugiere una función por toda la eritropoyesis definitiva en ratones, como es opuesto a su función predominante después del nacimiento en humanos. Asi, se plantea como hipótesis que los cambios en la expresión de BCL11A pueden ser responsables, por lo menos en parte, para la expresión divergente de interespecies observada de los genes de globina similares a ß. Para probar directamente una función potencial para BCL11A en el silenciamiento de los genes embriónicos endógenos en el linaje eritroide definitivo, se examinó los ratones inactivados de BCL11A. Como es descrito previamente (Liu, P. y colaboradores 2003, Nat. Immunol. 4:525-32), los ratones BCL11A -/- murieron en el periodo perinatal de causas desconocidas. Los ratones BCL11A -/- en E14.5 y E18.5 durante la gestación se examinaron cuando la eritropoyesis definitiva robusta está tomando lugar dentro del FL (Fig. 12) . Mediante procedimientos fenotipicos y morfológicos (Sankaran, V.G. y colaboradores, 2008, Genes Dev. 22:463-475; Zhang, J. , y colaboradores, 2003, Blood, 102:3938-46), la eritropoyesis apareció ostentablemente normal dentro de estos embriones (Fig. 9A, Figs. 13-15) . Luego, se estimó la expresión de los genes de globina de ratón. En fuerte apoyo de la hipótesis de los inventores, se observó que el silenciamiento de la expresión de los genes de globina embriónica de ratón no logra ocurrir en las células eritroides E14.5 y E18.5 FL (Fig. 9B-E, Fig. 16) . La restricción de la expresión de globina embriónica al linaje primitivo se pierde. La expresión de los genes de globina e? y ß?? son regulados hacia arriba por 70 y 350 veces, respectivamente, en E14.5 (Fig. 9B) . Con untamente estos genes de globina embriónicos tienen en cuenta 50 por ciento de los genes de globina similar a ß totales en esta etapa, comparado con 0.4 por ciento de los controles. En E18.5, mientras que la contribución de sus transcriptos a los transcriptos de globina similar a ß totales fue un poco reducida, los transcriptos de globina e? y ß?? fueron 2600 y 7600 veces elevado comparado con los controles (Fig. 9C) . Para determinar la distribución celular de las globinas embriónicas de ratón, se realizó la inmunohistoquimica . Utilizando este procedimiento los inventores encontraron que las globinas ß?? y e? se expresaron robustamente en células eritroides definitivas (Fig. 9D y 9E, Fig. 17), mientras que normalmente estas globinas embriónicas son confinadas al linaje eritroide primitivo (McGrath, K. & Palis, J. , 2008, Curr. Top. Dev. Biol. 82:1-22) (Fig. 8B) .
El silenciami ento de la expresión de ?-globina humana depende de BCLllA Los inventores luego examinaron la consecuencia de la pérdida de BCLllA en la regulación de los genes de globina humana en los ratones de ß-posición. Al introducir el transgén de ß-posición en el ambiente de inactivación, los inventores encontraron que en la ausencia del silenciamiento de desarrollo de BCLllA del gen de ?-globina es notablemente deteriorado en el linaje eritroide definitivo (Fig 9F, Fig. 18) . En BCLllA -/-, +/-, y los ratones de control de carnada el RNA de ?-globina comprendió 76, 20, y 0.24 por ciento del RNA del gen de globina similar a ß total en E18.5, respectivamente (Fig 9F, Fig. 18). La relajación del silenciamiento del gen de ?-globina en heterocigotos de BCLllA +/- es consistente con la asociación genética de BCLllA y los niveles de HbF y extiende las observaciones previas de los inventores utilizando los procedimientos de inactivación en células humanas (Sankaran, V.G. y colaboradores, 2008, Science 322:1839-42) que conjuntamente apuntan a BCLllA como un regulador cuantitativo de la expresión de ?-globina. la falla del silenciamiento del gen de ?-globina en el frente de otra manera ostentablemente la eritropoyesis normal proporciona evidencia competente de que BCLllA es un regulador mayor de. los cambios de globina en la ontogenia de ratón y humana.
En principio, BCL11A podría influenciar la expresión del gen de globina ya sea directamente al interactuar con los elementos reguladores cis dentro de la agrupación de ß-globina o indirectamente al afectar el ciclo celular u otras rutas gue finalmente impactan la expresión de HbF. Para discriminar estas posibilidades, se utilizó la inmunoprecipitación de cromatina (Ch.IP) para estudiar los progenitores eritróides humanos primarios. No se detectó la ocupación de nada de los promotores próximo de ?- o ß-globina. Mas bien, el enlace robusto en otras diversas regiones de la agrupación de ß-globina se observó (Fig. 19) . Estos incluyen el tercer5 sitio de hipersensibilidad {HS3) de la región de control de posición (LCR) (P. A. Navas y colaboradores, 1998, Mol. Cell. Biol . 18:4188), la región de la supresión Corfú asociada HbF alta corriente arriba del gen de d-globina (A. Bank, 2006, Blood 107:435), y otra región corriente abajo del gen de ??-globina gue es comúnmente suprimido en ciertas formas de persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (A. Bank, 2006, Blood 107:435) . De particular mención, todos estos elementos cis se han sugerido que desempeñan una función del silenciamiento de ?-globina. Los presentes resultados fuertemente argumentan que BCL11A actúa dentro de la agrupación de ß-globina. Las variantes de BCL11A más cortas presentes en las células que activamente expresan ?-globina pueden participar en otros aspectos de la regulación transcripcional dentro de la agrupación de ß-globina. Asi BCL11A, en diferentes niveles y en sus formas variantes, se configura la posición de ß-globina en diferentes etapas de desarrollo.
Conclusión Tomados conjuntamente, los descubrimientos aquí demuestran como los cambios en la expresión de un solo factor de transacción durante el curso de evolución puede conducir a la expresión génica de desarrollo alterada. Mostrada en la presente en que los elementos cis dentro de la posición de ß-globina humana son insuficientes para recapitular la regulación de desarrollo apropiada en un contexto de ratón. Previamente se ha postulado que la evolución de la expresión del gen de globina similar a ß es grandemente mediada a través de cambios en los elementos cis (Johnson, R.M. y colaboradores 2006, Proc. Nati.. Acad. Sci. U. S. A. 103:3186-91). Estos descubrimientos en la presente argumentan persuasivamente que los cambios en los factores de transacción pueden ejercer efectos acentuantes en el cambio del gen durante, el desarrollo. BCL11A sirve para silenciar los genes embriónicos en células eritroides definitivas de ratón, en contraste a su función en humanos donde actúan para silenciar la expresión de ?-globina después del nacimiento. Por otra parte, los inventores muestran que BCL11A es un regulador poderoso de los cambios de globina divergentes de las especies al demostrar que el gen de ?-globina se escapa del silenciamiento de desarrollo apropiado en un ambiente de BCL11A -/- de transacción de ratón. Los descubrimientos en la presente indican un modelo en el cual uno (o más) silenciadores de acción trans de los genes de globina embriónica, inicialmente expresados a través de la eritropoyesis definitiva, se han alterado durante la evolución del primate, tal que su expresión es desplazada en una fase posterior de eritropoyesis definitiva, permitiendo la evolución de una etapa de expresión de hemoglobina fetal única. Aquí, se muestra que BCL11A representa uno de los factores mayores que regulan este cambio. Estos descubrimientos permiten la simplificación de modelos moleculares que tienen en cuenta esta transición de desarrollo critica. Este trabajo proporciona no solamente discernimientos únicos en cómo las alteraciones en la expresión génica ocurren en el curso de la evolución, sino también revela indicios mecanisticos adicionales para el cambio de hemoglobina fetal-a-adulta clínicamente importante en humanos.

Claims (32)

REIVINDICACIONES
1. Un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en una célula, el método caracterizado porque comprende las etapas de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCL11A, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en la célula, o su progenie, con relación a la célula antes del contacto .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula progenitora hematopoyética es una célula de linaje eritroide.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto' ex vivo o in vitro.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado ' porque la composición que comprende un inhibidor de BCL11A inhibe la expresión de BCL11A.
5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el inhibidor de la expresión de BCL11A se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico .
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A, o un vector que codifica un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID N0:l-6.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición que comprende un inhibidor de BCL11A inhibe la actividad de BCL11A.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de BCL11A se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCL11A o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCL11A, un vector que codifica un agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCL11A.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO:l-6.
12. Un método para incrementar los niveles de hemoglobina fetal en un mamífero en necesidad del mismo, el método caracterizado porque comprende la etapa de poner en contacto una célula progenitora hematopoyética en el mamífero con una cantidad efectiva de una composición que comprende un inhibidor de BCLllA, mediante lo cual la expresión de hemoglobina fetal se incrementa en el mamífero, con relación a la expresión antes del contacto.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el mamífero se ha diagnosticado con hemoglobinopatía .
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la hemoglobinopatía es una ß-hemoglobinopatía .
15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la hemoglobinopatía es la enfermedad de célula falciforme.
16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la hemoglobinopatía es ß-talasemia.
17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto ex vivo o in vitro, y la célula o su progenie se administra al mamífero.
18. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el contacto comprende poner en contacto la célula con una composición que comprende un inhibidor de BCLllA y un portador diluyente farmacéuticamente aceptable .
19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición se administra por inyección, infusión, instilación o ingestión.
20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición que comprende un inhibidor de BCLllA inhibe la expresión de BCLllA.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el inhibidor de la expresión de BCLllA se selecciona de una molécula pequeña y un ácido nucleico .
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el ácido nucleico es un agente de interferencia de RNA especifico de BCLllA o un vector que codifica un agente de interferencia de RNA, o un aptámero que enlaza BCLllA.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
24. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la composición que comprende un inhibidor de BCLllA inhibe la actividad de BCLllA.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el inhibidor de la actividad de BCLllA se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo contra BCLllA o un fragmento de enlace de antigeno del mismo, una molécula pequeña y un ácido nucleico.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ácido nucleico es un ajente de interferencia de RNA especifico de BCLllA, un vector que codifica el agente de interferencia, o un aptámero que enlaza BCLllA.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el agente de interferencia de RNA comprende una o más de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1-6.
28. Un método para identificar un modulador de la actividad o expresión de BCLllA, el método caracterizado porque comprende poner en contacto una célula progenitora hematopoyética con una composición que comprende un compuesto de prueba, y medir el nivel de hemoglobina fetal o mRNA de hemoglobina fetal en la célula o su progenie, en donde un incremento en la hemoglobina fetal es indicativo de que el compuesto de prueba es un inhibidor candidato de la actividad o expresión de BCLllA.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la célula progenitora hematopoyética se pone en contacto in vivo, ex vivo, o in vitro.
30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la célula es de un origen humano, primate no humano o mamífero.
31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el compuesto de prueba es una molécula pequeña, anticuerpo o ácido nucleico.
32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la composición causa un incremento en el mRNA de hemoglobina fetal o la expresión de proteína.
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