MX2011002226A - Hidrolasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para producirlos y utilizarlos. - Google Patents

Hidrolasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para producirlos y utilizarlos.

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Tim Hitchman
Jonathan Lyon
Christopher L G Dayton
Analia Bueno
Joslin G Cuenca
Katie A Kline
Mark L Miller
Mark A Wall
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Abstract

Se proporcionan hidrolasas, incluyendo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, y polinucleótidos que las codifican, y métodos para producir y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos. Se proporcionan además polipéptidos, por ejemplo, enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas y métodos para preparar aceites con bajas grasas saturadas o bajas grasas trans, tales como aceites vegetales o animales con bajas grasas saturadas o bajas grasas trans, por ejemplo, aceites de soya o de canola.

Description

HIDROIASAS, ÁCIDOS NUCLEICOS QUE LAS CODIFICAN Y MÉTODOS PARA PRODUCIRLOS Y UTILIZARLOS REFERENCIA CRUZADA PARA LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Norteamericana No. 12/202,204, presentada el 29 de Agosto de 2008, la cual se incorpora aquí por este medio por referencia en su totalidad.
LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud se presenta con un Listado de Secuencias propuesto como el nombre de archivo 011631-0045-228_ListadoDeSecuencias.txt, con tamaño de 46,086 bytes, el cual se creó el 25 de Agosto de 2009. El Listado de Secuencias se incorpora aquí por referencia en su totalidad.
CAMPO TÉCNICO Se proporcionan aquí polipéptidos que tienen actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, polinucleótidos que los codifican, y métodos para producir y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos. También se (proporcionan aquí péptidos y polipéptidos, por ejemplo, enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, y métodos para ' tratamiento de grasas y aceites con tales péptidos y polipéptidos para preparar productos de aceites hidrolizados tales como aceites animales o vegetales de baja saturación, por ejemplo, aceites de soya o de cañóla, los productos de aceite así tratados, y los productos que comprenden tales aceites tratados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las aplicaciones industriales principales para las hidrolasas, por ejemplo, las lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , incluyen la industria de alimentos y de bebidas, como agentes conservadores para productos de panadería, y en la producción de margarina y otros productos para untar con sabores de mantequilla natural; en los sistemas de desecho; y en la industria farmacéutica donde se utilizan como adyuvantes digestivos.
Las grasas y los aceites procesados son un componente principal de los alimentos, aditivos alimenticios y adyuvantes del procesamiento de alimentos, y también son materias primas renovables importantes para la industria química. Están disponibles en. grandes cantidades a partir del procesamiento de semillas de . aceite de plantas como salvado de arroz, maíz, semilla de colza, cañóla, girasol, olivo, palma o soya. Otras fuentes de grasas y aceites valiosos incluyen pescado, desperdicio de restaurantes, y grasas animales resulatentes . Estas grasas y aceites son una mezcla de triacilglicéridos o lípidos, es decir ácidos grasos (FA) esterificados en un soporte de glicerol. Cada aceite o grasa contiene una amplia variedad de estructuras de lípido diferentes, definidas por el contenido de FA y su distribución regio-quimica en la estructura principal del glicerol. Estas propiedades de los lipidos individuales determinan las propiedades físicas del triacilglicérido puro. Por lo tanto, el contenido de triacilglicéridos de una grasa o aceite en un grado extenso determina las propiedades físicas, químicas y biológicas del aceite. El valor de los lipidos incrementa en gran medida como una función de su pureza. Se puede lograr una alta pureza mediante destilación o cromatografía fraccionada, separando el triacilglicérido deseado del entorno mixto de la fuente de grasa o aceite. Sin embargo, esto es costoso y los rendimientos son a menudo limitados por los bajos niveles en los cuales existe de manera natural el triacilglicérido. Además, la facilidad de purificación del producto está a menudo comprometida por la presencia de muchos triacilglicéridos estructuralmente y físicamente o químicamente similares en el aceite.
Una alternativa para purificar triacilglicéridos u otros lipidos a partir de una fuente natural es sintetizar los lipidos. Los productos de tales procesos son llamados lipidos estructurados debido a que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre la estructura principal de glicerol. El valor de los lipidos también incrementa en gran medida mediante el control del contenido de ácidos grasos y la distribución dentro del lípido. La eliminación de triglicéridos , grasas o aceites de FA indeseable, o el reemplazo del FA con propiedades indeseables por ácidos grasos con propiedades químicas, físicas o biológicas mejores o más deseables, incrementa el valor de los lípidos. En particular, existe una necesidad por lipasas que puedan hidrolizar, por ejemplo selectivamente hidrolizar, un ácido graso saturado (una "saturasa") , o aquellas que en particular, puedan hidrolizar, por ejemplo selectivamente hidrolizar, un ácido palmítico (una "palmitasa") o un ácido esteárico (una "estearatasa") de una estructura principal de glicerol. Las lipasas, tales como las saturasas, por ejemplo, las palmitasas y/o estearatasas se pueden utilizar para efectuar tal control donde los FAs que se remueven, agregan o reemplazan son ácidos grasos saturados, por ejemplo ácido palmitático o ácido esteárico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aquí polipéptidos que tienen actividad de hidrolasa, incluyendo actividad de lipasa. En un aspecto, se proporcionan aquí nuevas clases de lipasas llamadas "saturasas", "palmitasas" y "estearatasas". También se proporcionan polinucleótidos que codifican los polipéptidos que tienen actividad de saturasa, por ejemplo actividad de palmitasa y/o estearatasa, y métodos para producir y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos. En un aspecto, se proporcionan aquí polipéptidos, por ejemplo, enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa que tienen actividad de enzima (catalítica) termoestable y/o termotolerante . Las actividades enzimáticas de los polipéptidos y péptidos según se proporciona aquí incluyen (comprenden o consisten de) una actividad de saturasa o una actividad de lipasa, incluyendo hidrólisis de lípidos, reacciones de acidólisis (por ejemplo, para reemplazar un ácido graso esterificado con un ácido graso libre) , reacciones de transesterificación (por ejemplo, intercambio de ácidos grasos entre triacilglicéridos) , síntesis de éster, reacciones de intercambio de éster y actividad de lípido acil hidrolasa (LAH) . En otro aspecto, los polipéptidos según se proporciona aquí se utilizan para sintetizar productos quirales enantioméricamente puros.
Los polipéptidos según se proporciona aquí se puede utilizar en una variedad de contextos farmacéuticos, agrícolas e industriales, incluyendo la manufactura de cosméticos y nutracéuticos . Adicionalmente , los polipéptidos según se proporciona aquí se pueden utilizar en el procesamiento de alimentos, fabricación de cerveza, aditivos de baño, producción de alcohol, síntesis de péptidos, enantioselectividad, preparación de cuero en la industria de cuero, manejo de desechos y degradación de desechos animales, recuperación de plata en la industria fotográfica, tratamiento médico, desgomado de la seda, degradación de biopelícula, conversión de biomasa a etanol, biodefensa, agentes antimicrobianos y desinfectantes, cosméticos y cuidado personal, reactivos biotecnológicos, en incrementar el rendimiento del almidón a partir de la molienda húmeda de maíz, y como fármacos tales como adyuvantes digestivos y agentes antiinflamatorios (antiflogísticos) .
En ciertas modalidades, se proporcionan aqui composiciones (por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas ) y métodos para producir aceites bajo saturados, por ejemplo, aceites con un bajo contenido de ácidos grasos saturados, incluyendo aceites bajos en ácidos grasos palmitato, estearato, miristato, laurato o butirato y/o ácido caprílico (ácido octanoico) . Cualquier aceite vegetal, por ejemplo aceite de cañóla, aceite de soya, o grasa o aceite animal, por ejemplo, el sebo, se puede tratar con una composición, o por un método, según se proporciona aquí. Cualquier alimento, artículo comestible, u horneado, producto de freidura o de cocina (por ejemplo, salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, aceites de horneado, mayonesa, aceites de cocina, aceites para ensalada, aderezos cuchareables y vertibles, y similares, y los productos hechos con los mismos) puede comprender un aceite vegetal o una grasa animal que se ha tratado con una composición o por un método según se proporciona aquí. Los aceites vegetales modificados para ser aceites de baja saturación se pueden utilizar en cualquier alimento, articulo comestibles u horneado o producto de cocina, por ejemplo, salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, aceites de horneado, mayonesa, aceites de cocina, aceites para ensalada, aderezos cuchareables y vertibles y similares. En una modalidad, se proporciona aquí aceites, tales como aceites vegetales, por ejemplo, aceite de cañóla o aceite de soya, y alimentos o productos de horneado o de cocina, incluyendo salsas, adobos, condimentos, aceites en aerosol, margarinas, mayonesa, aceites de horneado, aceites de cocina, aceites de freidura, aceites para ensalada, aderezos cuchareables y vertibles, y similares, en donde el aceite o el alimento, producto de horneado o de cocina se ha modificado utilizando una enzima según se proporciona aquí. En un aspecto, estos aceites vegetales, por ejemplo aceite de cañóla, aceite de castor, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de maíz, aceite de · semilla de algodón, aceite de avellana, aceite de cáñamo, aceite de linaza, aceite de hierba de la pradera, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de cacahuate, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cártamo, aceite de sasanqua, aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de bogol, aceite de camelia, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones de ácidos grasos alterados por medio de Organismos Genéticamente Modificados (GMO) o "cultivo" tradicional tales como aceites bajo saturados o con un alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linolénico (aceite de cañóla con un alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con un bajo contenido de ácido linolénico o aceite de girasol con un alto contenido de ácido esteárico) , grasas animales (sebo, manteca de cerdo, grasa de la mantequilla, y grasa de pollo) , aceites de pescado (aceite de eulacón, aceite de hígado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque, y aceite de lacha) , o mezclas de cualesquiera de lo anterior, y los alimentos o productos de horneado, freidura o de cocina, comprenden aceites con un contenido más bajo de ácidos grasos saturados, incluyendo aceites bajos en ácido palmítico, ácido miristico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octanoico) , etcétera, procesados utilizando una composición o método según se proporciona aquí .
En un aspecto, se proporcionan aquí polipéptidos , por ejemplo, enzimas y anticuerpos catalíticos, que tienen una actividad de hidrolasa, por' ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estéaratasa, incluyendo actividades enzimáticas termoestables y termotolerantes, y actividades selectivas de ácido graso o específicas de ácido graso, y actividades enzimáticas tolerantes de bajo o alto pH, y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluyendo vectores, células hospederas, plantas transgénicas y animales no humanos, y métodos para producir y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos .
En otro aspecto, se proporcionan aquí ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que comprenden (a) un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica al menos un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más de identidad de secuencia a, o identidad de secuencia completa (100%) a: (i) SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:22 o SEQ ID NO:23, o (ii) el ácido nucleico de SEQ ID NO:l que tiene uno o más cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) que codifica uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o más o todos los cambios de aminoácidos (o el equivalente de los mismos) como se establece en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico de (i) o (ii) codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, o codifica un polipéptido o péptido capaz de generar un anticuerpo (un polipéptido o péptido que actúa como un epítopo o inmunogen) especifico a la hidrolasa (por ejemplo una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa), el ácido nucleico (polinucleótido) de (a) , en donde las identidades de secuencia se determinan: (A) mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, o (B) sobre una región de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, : 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 o más residuos, o la longitud completa de un ADNc, transcrito (ARNm) o gen, el ácido nucleico (polipéptido) de (a) o (b) , en donde, el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde una configuración de filtro se establece a blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se establecen a predeterminado, un ácido nucleico (polinucleótido ) que codifica al menos un polipéptido o péptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas al complemento del ácido nucleico de (a), (b) o (c) , en donde las condiciones rigurosas comprenden una etapa de lavado que comprende un lavado en 0.2X SSC en una temperatura de aproximadamente 65°C durante aproximadamente 15 minutos, un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, que tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro, o más o todos los cambios de aminoácidos (o el equivalente de los mismos) como se establece en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, un ácido nucleico (polinucleótido) que codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, en donde el polipéptido comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID N0:20 o fragmentos enzimáticamente activos de las mismas, (A) el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (f) y que codifica un polipéptido que tiene al menos una sustitución de aminoácido conservativa y que retiene su actividad de hidrolasa, por ejemplo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, o, (B) el ácido nucleico de (g) (A) , en donde la al menos una sustitución de aminoácido conservativa comprende sustituir un aminoácido con otro aminoácido de características similares; o, una sustitución conservativa comprende: el reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o vice versa; el reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que alberga un grupo amida con otro residuo que alberga un grupo amida; el intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o el reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (g) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o uña actividad de estearatasa pero que carece de una secuencia señal, el ácido nucleico (polinucleótido) de cualquiera de (a) a (h) que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa que comprende además una secuencia heterologa, (j) el ácido nucleico (polinucleótido) de (i), en donde la secuencia heterologa comprende, o consiste de una secuencia que codifica: (A) una secuencia señal heterologa, (B) la secuencia de (A) , en donde la secuencia señal heterologa se deriva a partir de una enzima heterologa, o, (C) una etiqueta, un epitopo, un péptido dirigido a un objetivo, una secuencia escindible, un radical detectable o una enzima, o (k) una secuencia de ácidos nucleicos (polinucleótido) totalmente (completamente) complementaria para la secuencia de cualquiera de (a) a (j).
En un aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante codifica un polipéptido o péptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, el cual es termoestable . Los polipéptidos y péptidos codificados mediante ácidos nucleicos según se proporciona aquí, o cualquier polipéptido o péptido según se proporciona aquí, puede retener actividad de enlace o enzimática (por ejemplo, de enlace al sustrato) bajo condiciones que comprenden un rango de temperatura de entre aproximadamente -100 °C hasta aproximadamente -80°C, aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -40°C, aproximadamente -40°C hasta aproximadamente -20°C, aproximadamente -20°C hasta aproximadamente 0°C, aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 5°C, aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 15°C, aproximadamente 15°C hasta apro imadamente 25°C, aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C, aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 45°C, aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 55°C, aproximadamente 55°C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 75°C, aproximadamente 75°C hasta aproximadamente 85°C, aproximadamente 85°C hasta aproximadamente 90°C, aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 95°C, aproximadamente 95°C hasta aproximadamente 100°C, aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 105°C, aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 110°C, aproximadamente 110°C hasta aproximadamente 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 98° C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108 °C, 109° C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o más. Se proporcionan aquí los polipéptidos termoestables que retienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en una temperatura en los rangos descritos anteriormente, en aproximadamente pH 3.0, aproximadamente pH 3 .5, aproximadamente PH 4.0, aproximadamente pH 4 • 5, aproximadamente PH 5.0, aproximadamente pH 5 .5, aproximadamente pH 6.0, aproximadamente pH 6 • 5, aproximadamente pH 7.0, aproximadamente pH 7 • 5, aproximadamente pH 8.0, aproximadamente pH 8 .5, aproximadamente PH 9.0, aproximadamente pH 9. 5, aproximadamente pH 10.0, aproximadamente pH 10 • 5, aproximadamente PH 11.0, aproximadamente pH 11.5, aproximadamente pH 12.0 o más .
En un aspecto, los polipéptidos según se proporciona aquí pueden ser termotolerantes y pueden retener una actividad de hidrolasa, por ejemplo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa después de la exposición a una temperatura en el rango desde aproximadamente -100°C hasta aproximadamente -8 0°C, aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -40°C, aproximadamente -40°C hasta aproximadamente -20°C, aproximadamente -20°C hasta aproximadamente 0°C, aproximadamente 0°C hasta aproximadamente 5°C, aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 15°C, aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 25°C, aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 37°C, aproximadamente 37°C hasta aproximadamente 45°C, aproximadamente 45°C hasta aproximadamente 55°C, aproximadamente 55°C hasta aproximadamente 70°C, aproximadamente 70°C hasta aproximadamente 75°C, aproximadamente 75°C hasta aproximadamente 85°C, aproximadamente 85°C hasta aproximadamente 90°C, aproximadamente 90°C hasta aproximadamente 95°C, aproximadamente 95°C hasta aproximadamente 100°C, aproximadamente 100°C hasta aproximadamente 105°C, aproximadamente 105°C hasta aproximadamente 110°C, aproximadamente 110°C hasta aproximadamente 120°C, o 95°C, 96°C, 97°C, 9E }°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C,< 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C o más.
En algunas modalidades, los polipéptidos termotolerantes retienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, después de la exposición a una temperatura en los rangos descritos anteriormente, en aproximadamente pH 3.0, aproximadamente pH 3.5, aproximadamente pH 4 .0, aproximadamente pH 4. 5, aproximadamente PH 5. 0, ' aproximadamente PH 5. 5, aproximadamente pH 6. o, ; aproximadamente PH 6. 5, aproximadamente PH 7. 0, aproximadamente pH 7. 5, aproximadamente pH 8. 0, aproximadamente pH 8. 5, aproximadamente PH 9. 0, aproximadamente pH 9. 5, aproximadamente pH 10. o, aproximadamente pH 10. 5, aproximadamente PH 11. 0, aproximadamente pH 11. 5, aproximadamente pH 12.0 o más.' En una modalidad, los ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes comprenden una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico según se proporciona aquí, por ejemplo, un ácido nucleico ejemplar según se proporciona aquí que comprende una secuencia como se establece en SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO: 23, o una secuencia como se establece en SEQ ID NO:l que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos (modificaciones de secuencia a la SEQ ID N0:1) establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o fragmentos o sub-secuencias de las mismas, y las secuencias (totalmente) complementarias para las mismas. En un aspecto, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. El ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o más residuos de longitud o la longitud completa de un gen o transcrito que comprende la SEQ ID NO:l, y que tiene una secuencia como se establece en la SEQ ID NO:l que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos (modificaciones de la secuencia de aminoácidos) para la SEQ ID N0:1 establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y las secuencias (totalmente) complementarias para la misma. En un aspecto, las condiciones rigurosas incluyen una etapa de lavado que comprende un lavado en 0.2X SSC en una temperatura de aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 15 minutos.
En una modalidad, una sonda de ácido nucleico, por ejemplo, una sonda para identificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende una sonda que comprende o que consiste de al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más, bases consecutivas de una secuencia según se proporciona aquí, o fragmentos o sub-secuencias de la misma, en donde la sonda identifica el ácido nucleico mediante enlace o hibridación; La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 hasta 50, aproximadamente 20 hasta 60, aproximadamente 30 hasta 70, aproximadamente 40 hasta 80, o aproximadamente 60 hasta 100 bases consecutivas de una secuencia que comprende una secuencia según se proporciona aqui, o fragmentos o sub-secuencias de la misma. La sonda puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 hasta 50, aproximadamente 20 hasta 60, aproximadamente 30 hasta 70, aproximadamente 40 hasta 80, o aproximadamente 60 hasta 100 bases consecutivas de una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí, o una sub-secuencia de la misma.
En una modalidad, un par de secuencias de cebador de amplificación para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprende un par de cebadores que comprende o que consiste de un par de cebadores capaz de amplificar un ácido nucleico que comprende una secuencia según se proporciona aquí, o fragmentos o sub-secuencias de la misma. Uno o cada miembro del par de secuencias de cebador de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 hasta 50 bases consecutivas de la secuencia.
En una modalidad, los métodos para amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, comprenden la amplificación de un ácido nucleico del molde mácromolecular con un par de secuencias de cebador de amplificación capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aqui, o fragmentos o sub-secuencias de la misma.
En una modalidad, la expresión que los casetes comprende un ácido nucleico según se proporciona aqui o una sub-secuencia del mismo. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender el ácido nucleico que se enlaza de manera operativa a un promotor. El promotor puede ser un promotor viral, bacteriano, mamífero o de planta. En un aspecto, el promotor de planta puede ser un promotor de papa, arroz, maíz, trigo, tabaco o cebada. El promotor puede ser un promotor constitutivo. El promotor constitutivo puede comprender CaMV35S. En otro aspecto, el promotor puede ser un promotor inducible. En un aspecto, el promotor puede ser un promotor específico al tejido o un promotor ambientalmente regulado o un promotor regulado por desarrollo. De esta manera, el promotor puede ser, por ejemplo, un promotor específico a la semilla, un promotor específico a la hoja, un promotor específico a la raíz, un promotor específico al tallo o un promotor inducido por abscisión. En un aspecto, el cásete de expresión puede comprender además una planta o vector de expresión de virus dé planta.
En una modalidad, los vehículos de clonación comprenden un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) según se proporciona aquí o un ácido nucleico según se proporciona aquí. El vehículo de clonación puede ser un vector viral, un plásmido, un fago, un fagómido, un cósmido, un fósmido, un bacteriófago o un cromosoma artificial. El vector viral puede comprender un vector de adenovirus, un vector retroviral o un vector viral adeno-asociado . El vehículo de clonación puede comprender un cromosoma artificial bacteriano (BAC) , un plásmido, un vector derivado de bacteriófago Pl (PAC) , un cromosoma artificial de levadura (YAC) , o un cromosoma artificial mamífero (MAC) .
En una modalidad, las células transformadas comprenden un ácido nucleico según se proporciona aquí o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) según se proporciona aquí, o un vehículo de clonación según se proporciona aquí. En un aspecto, la célula transformada puede ser una célula bacteriana, una célula mamífera, una célula fungoidea o fúngica, una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de planta. En un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, trigo,' arroz, maíz, tabaco o cebada. La célula transformada puede ser cualquiera de las células hospederas familiares para aquellos expertos en el arte, incluyendo células procarioticas, células eucarióticas , tales como células bacterianas, células fungoideas, células de levadura, células mamíferas, células de insecto, o células de planta. Las células bacterianas ejemplares incluyen cualquier especie dentro del género Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella , Pseudomonas y Staphylococcus, incluyendo, por ejemplo, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium , Pseudomonas fluorescens . Las células fungoideas ejemplares incluyen cualquier especie de Aspergillus. Las células de levadura ejemplares incluyen cualquier especie de Pichia, Saccharomyces , Schizosaccharomyces, o Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe. Las células de insecto ejemplares incluyen cualquier especie de Spodoptera o Drosophila , incluyendo Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las células animales ejemplares incluyen melanoma Bowes, COS o CHO o cualquier linea celular de ratón o humana.
En una modalidad, las plantas transgénicas comprenden un ácido nucleico según se proporciona aquí o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) según se proporciona aquí. La planta transgénica puede ser una planta de maíz, una planta de papa, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de semilla de aceite, una planta de semilla de colza, una planta de soya, una planta de arroz, una planta de cebada o una planta de tabaco.
En una modalidad, las semillas transgénicas comprenden un ácido nucleico según se proporciona aquí o un cásete de expresión (por ejemplo, un vector) según se proporciona aquí. La semilla transgénicas puede ser arroz, una semilla de maiz, una semilla de trigo, una semilla de aceite, una semilla de colza, una semilla de soya, una semilla de palma, una semilla de girasol, una semilla de sésamo, una semilla de planta de tabaco o cacahuate.
En una modalidad, los polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, o los polipéptidos capaces de generar una respuesta inmune especifica para una hidrolasa, por ejemplo una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa (por ejemplo, un epitopo) ; y en aspectos alternativos los péptidos y péptidos según se proporciona aquí comprenden una secuencia: (a) que tiene al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más , o tiene 100% (completa) de identidad de secuencia a: la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos enzimáticamente activos de la misma, y que tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, veintiuno, veintidós, veintitrés, veinticuatro o más o todos de los cambios de residuos de aminoácidos (o el equivalente de los mismos) como se establece en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o (ii) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO : , SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, o SEQ ID NO:20 en donde el polipéptido o péptido de (i) o (ii) tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa, o el polipéptido o péptido es capaz de generar un anticuerpo (un polipéptido o péptido que actúa como un epitopo o inmunogen) especifico a la hidrolasa (por ejemplo una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa) , el polipéptido o péptido de (a) , en donde las identidades de secuencia se determinan: (A) mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante una inspección visual, o (B) sobre una región de al menos aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 o más residuos de aminoácidos, o sobre la longitud completa del polipéptido o péptido o enzima, y/o sub-secuencias (fragmentos) enzimáticamente activas de los mismos, el polipéptido o péptido de (b) , en donde el algoritmo de comparación de secuencias es un algoritmo BLAST versión 2.2.2 donde una configuración de filtro se establece a blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, y todas las otras opciones se establecen a predeterminado; una secuencia de aminoácidos codificada mediante el ácido nucleico aquí provisto, en donde el polipéptido tiene (i) una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una · actividad de palmitasa y/o actividad de estearatasa, o, . (ii) tiene actividad inmunogénica en que es capaz de generar un anticuerpo que específicamente se enlaza a un polipéptido que tiene una secuencia de (a) , y/o sub-secuencias (fragmentos) enzimáticamente activas de la misma; la secuencia de aminoácidos de cualquiera de (a) a (d) , y que comprende al menos una sustitución conservativa del residuo de aminoácidos, y el polipéptido o péptido retiene una actividad de hidrolasa, una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa; la secuencia de aminoácidos de (e) , en donde la sustitución conservativa comprende el reemplazo de un aminoácido alifático con otro aminoácido alifático; el reemplazo de una serina con una treonina o vice versa; el reemplazo de un residuo ácido con otro residuo ácido; el reemplazo de un residuo que alberga un grupo amida con otro residuo que alberga un grupo amida; el intercambio de un residuo básico con otro residuo básico; o, el reemplazo de un residuo aromático con otro residuo aromático, o una combinación de los mismos, la secuencia de aminoácidos de (f ) , en donde el residuo alifático comprende alanina, valina, leucina, isoleucina o un equivalente sintético de las mismas; el residuo ácido comprende ácido aspártico, ácido glutámico o un equivalente sintético de los mismos; el residuo que comprende un grupo amida comprende asparagina, glutamina o un equivalente sintético de las mismas; el residuo básico comprende lisina, arginina, histidina o un equivalente sintético de las mismas; o, el residuo aromático comprende fenilalanina, tirosina, triptofan o un equivalente sintético de los mismos; el polipéptido de cualquiera de (a) a (f) que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa pero que carece de una secuencia señal, el polipéptido de cualquiera de (a) a (h) que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo una actividad de lipasa, una actividad de saturasa, una actividad de palmitasa y/o una actividad de estearatasa que comprende además una secuencia heteróloga; el polipéptido de (i) , en donde la secuencia heteróloga comprende, o consiste de: (A) una secuencia señal heteróloga, (B) la secuencia de (A) , en donde la secuencia señal heteróloga se deriva a partir de una enzima heteróloga, y/o, (C) una etiqueta, un epitopo, un péptido dirigido a un objetivo, una secuencia escindible, un radical detectable o una enzima; o que comprende una secuencia de aminoácidos codificada mediante cualquier secuencia de ácidos nucleicos según se proporcionan aquí.
Las secuencias ejemplares de polipéptidos o péptidos según se proporciona aquí incluyen la SEQ ID NO: 2, y sub-secuencias de la misma y variantes de la misma, por ejemplo, al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 o más residuos de longitud, o sobre la longitud completa de una enzima, todas teniendo uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos (modificaciones de la secuencia de aminoácidos a la SEQ ID NO : 2 ) establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23. Las secuencias ejemplares de polipéptidos o péptidos según se proporciona aquí incluyen la secuencia codificada mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí. Las secuencias ejemplares de polipéptidos o péptidos según se proporciona aqui incluyen polipéptidos o péptidos específicamente enlazados por un anticuerpo según se proporciona aquí. En un aspecto, un polipéptido según se proporciona aquí tiene al menos una actividad de hidrolasa, por ' ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la actividad es una actividad regioselectiva y/o quimioselect iva .
En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender el polipéptido según se proporciona aquí que carece de una secuencia señal (péptido) , por ejemplo, que carece de su secuencia señal homologa, y en un aspecto, comprende una secuencia señal (péptido) heteróloga. En un aspecto, el polipéptido aislado, sintético o recombinante puede comprender el polipéptido según se proporciona aquí que comprende una secuencia señal heteróloga, tal como una hidrolasa heteróloga o secuencia señal no hidrolasa (por ejemplo, no lipasa, no saturasa o no palmitasa) . En un aspecto, las proteínas quiméricas comprenden un primer dominio que comprende una secuencia señal según se proporciona aquí y al menos un segundo dominio. La proteína puede ser una proteína de fusión. El segundo dominio puede comprender una enzima. La enzima puede ser una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí, u, otra hidrolasa.
En un aspecto, la actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una actividad específica en aproximadamente 37 °C en el rango desde aproximadamente 100 ha^ta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteína. En otro aspecto, la actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una actividad específica desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 750 unidades por miligramo de proteína. Alternativamente, la actividad de hidrolasa comprende una actividad especifica en 37°C en el rango desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteina. En un aspecto, la actividad de hidrolasa comprende una actividad especifica en 37 °C en el rango desde aproximadamente 750 hasta aproximadamente 1000 unidades por miligramo de proteina. En otro aspecto, la termotolerancia comprende la retención de al menos la mitad de la actividad especifica de la hidrolasa en 37 °C después de ser calentada a una temperatura elevada. Alternativamente, la termotolerancia puede comprender la retención de la actividad especifica en 37 °C en el rango desde aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1200 unidades por miligramo de proteina después de ser calentada a una temperatura elevada.
En una modalidad, los polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes según se proporciona aquí comprenden al menos un sitio de glicosilación . En un aspecto, la glicosilación puede ser una glicosilación N-enlazada. En un aspecto, el polipéptido se puede glicosilar después de ser expresado en P. pastoris o S. pombe o en plantas, tales como plantas que producen aceite por ejemplo semilla de soya, cañóla, arroz, girasol, o variantes genéticamente modificadas (GMO) de estas plantas .
En un aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa o estearatasa) bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5 o pH 4.0 o menos. En otro aspecto, el polipéptido puede retener una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) bajo condiciones que comprenden aproximadamente pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12.0 o más.
En una modalidad, las preparaciones de proteínas comprenden un polipéptido según se proporciona aquí, en donde la preparación de proteínas comprende un líquido, un sólido o un gel.
En un aspecto, los heterodímeros según se proporciona aquí comprenden un polipéptido y un segundo dominio. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un polipéptido y el heterodímero puede ser una próteína de fusión. En un aspecto, el segundo dominio puede ser un epítopo o una etiqueta. En un aspecto, los homodímeros según se proporciona aquí comprenden un polipéptido según se proporciona aquí.
En una modalidad, los polipéptidos inmovilizados según se proporciona aquí tienen una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en donde el polipéptido comprende un polipéptido según se proporciona aquí, un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí, o un polipéptido que comprende un polipéptido según se proporciona aquí y un segundo dominio. En un aspecto, un polipéptido según se proporciona aquí se puede inmovilizar sobre una célula, una vejiga, un liposoma, una película, una membrana, un metal, una resina, un polímero, , una cerámica, un vidrio, un microelectrodo, una partícula grafitica, una cuenta, un gel, una placa, un cristal, una tableta, una pildora, una cápsula, un polvo, un aglomerado, una superficie, una estructura porosa, un arreglo o un tubo capilar, o materiales tales como granos, cascarillas, corteza, piel, pelo, esmalte, hueso, concha y los materiales que se derivan de éstos. Los polinucleótidos , los polipéptidos y las enzimas según se proporciona aquí se pueden formular en una forma sólida tal como un polvo, una preparación liofilizada, gránulos, una tableta, una barra, un cristal, una cápsula, una pildora, un pelet, o en una forma líquida tal como una solución acuosa, un aerosol, un gel, una pasta, una suspensión, una emulsión acuosa/aceitosa, una crema, una cápsula, o una suspensión vesicular o micelar.
En una modalidad, los suplementos alimenticios para un animal comprenden un polipéptido según se proporciona aquí, por ejemplo, un polipéptido codificado mediante el ácido nucleico según se proporciona aquí. En un aspecto, el polipéptido en el suplemento alimenticio se puede glicosilar. En una modalidad, las matrices de entrega de enzimas comestibles comprenden un polipéptido según se proporciona aquí, por ejemplo, un polipéptido codificado por el ácido nucleico según se proporciona aquí. En un aspecto, la matriz de entrega comprende un pelet. En un aspecto, el polipéptido se puede glicosilar. En un aspecto, la actividad de hidrolasa es termotolerante . En otro aspecto, la actividad de hidrolasa es termoestable .
En una modalidad, los métodos para aislar o identificar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprenden las etapas de: (a) proporcionar un anticuerpo según se proporciona aquí; (b) proporcionar una muestra que comprende polipéptidos ; y (c) contactar la muestra de la etapa (b) con el anticuerpo de la etapa (a) bajo condiciones en donde el anticuerpo puede específicamente enlazar el polipéptido, aislando o identificando por consiguiente un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, >palmitasa y/o estearatasa) .
En una modalidad, los métodos para producir un anticuerpo anti-hidrolasa comprenden administrar a un animal no humano un ácido nucleico según se proporciona aquí o un polipéptido según se proporciona aquí o sub-secuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune humoral, produciendo por consiguiente un anticuerpo anti-hidrolasa. Se proporcionan aquí métodos para producir un anticuerpo anti-hidrolasa que comprende administrar a un animal no humano un ácido nucleico según se proporciona aquí o un polipéptido según se proporciona aquí o sub-secuencias de los mismos en una cantidad suficiente para generar una respuesta inmune.
En una modalidad, los métodos para producir un polipéptido recombinante comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico según se proporciona aquí enlazado de manera operativa a un promotor; y (b) expresar el ácido nucleico de la etapa (á) bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido, produciendo por consiguiente un polipéptido recombinante. En un aspecto, el método puede comprender además transformar una célula hospedera con el ácido nucleico de la etapa (a) seguido por expresar el ácido nucleico de la etapa (a) , produciendo por consiguiente un polipéptido recombinante en una célula transformada.
En una modalidad, los ' métodos para identificar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido según se proporciona aquí; o un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí; (b) proporcionar un sustrato de hidrolasa; y (c) contactar el polipéptido o un fragmento o variante del mismo de la etapa (a) con el sustrato de la etapa (b) y detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, en donde una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción detecta un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .
En una modalidad, los métodos para identificar un sustrato de hidrolasa comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido según se proporciona aquí; o un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí; (b) proporcionar un sustrato de prueba; y (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con el sustrato de prueba de la etapa (b) detectar una disminución en la cantidad de sustrato o un incremento en la cantidad de producto de reacción, en donde una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción identifica el sustrato de prueba como un sustrato de hidrolasa (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .
En una modalidad, los métodos para determinar si un compuesto de prueba específicamente se enlaza a un polipéptido comprenden las siguientes etapas: (a) expresar un ácido nucleico o un vector que comprende el ácido nucleico bajo condiciones permisivas para la traducción del ácido nucleico a un polipéptido, en donde el ácido nucleico comprende un ácido nucleico según se proporciona aquí, o, proporcionar un polipéptido según se proporciona aquí; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) contactar el polipéptido con el compuesto de prueba; y (d) determinar si el compuesto de prueba de la etapa (b) específicamente se enlaza al polipéptido.
En una modalidad, los métodos para identificar un modulador de una actividad , de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido según se proporciona aquí o un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí; (b) proporcionar un compuesto de prueba; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con el compuesto de prueba de la etapa (b) y medir una actividad de la hidrolasa, en donde un cambio en la actividad de hidrolasa medido en la presencia del compuesto de prueba comparado a la actividad en la ausencia del compuesto de prueba proporciona una determinación que el compuesto de prueba modula la actividad de hidrolasa. En un aspecto, la actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) se puede medir proporcionando un sustrato de hidrolasa y detectando una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad de un producto de reacción, o, un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad de un producto de reacción. Una disminución en la cantidad del sustrato o un incremento en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba según se compara a la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un activador de la actividad de hidrolasa. Un incremento en la cantidad del sustrato o una disminución en la cantidad del producto de reacción con el compuesto de prueba según se compara á la cantidad de sustrato o producto de reacción sin el compuesto de prueba identifica el compuesto de prueba como un inhibidor de la actividad de hidrolasa.
En una modalidad, los sistemas de computadora comprenden un procesador y un dispositivo de almacenamiento de datos en donde dicho dispositivo de almacenamiento de datos tiene almacenada una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí (por ejemplo, un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aquí) . En un aspecto, el sistema de computadora puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias y un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene al menos una secuencia de referencia almacenada ahí. En otro aspecto, el algoritmo de comparación de secuencias comprende un programa de computadora que indica los polimorfismos. En un aspecto, el sistema de computadora puede comprender además un identificador que identifica una o más características en dicha secuencia. En una modalidad, los medios legibles por computadora tienen almacenada una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí.
En una modalidad, los métodos para identificar una característica en una secuencia comprenden las etapas de: (a) leer la secuencia utilizando un programa de computadora que identifica una o más características en una secuencia, en donde la secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí; y (b) identificar una o más características en la secuencia con el programa de computadora.
En otra modalidad, se proporcionan aquí métodos para comparar una primera secuencia a una segunda secuencia que comprenden las etapas de: (a) leer la primera secuencia y la segunda secuencia a través del uso de un programa de computadora que compara secuencias, en donde la primera secuencia comprende una secuencia de polipéptidos o una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí; y (b) determinar las diferencias entre la primera secuencia y la segunda secuencia con el programa de computadora. La etapa de determinar las diferencias . entre la primera secuencia y la segunda secuencia puede comprender además la etapa de identificar los polimorfismos. En un aspecto, el método puede comprender además un identificador que identifica una o más características en una secuencia. En otro aspecto, el método puede comprender leer la primera secuencia utilizando un programa de computadora e identificar una o más características en la secuencia.
En una modalidad, los métodos para aislar o recuperar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa (por ejemplo, de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) a partir de una muestra comprende las etapas de: (a) proporcionar un par de secuencias de cebador de amplificación para . amplificar un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, en donde el par de cebadores es capaz de amplificar un ácido nucleico según se proporciona aquí; (b) aislar un ácido nucleico a partir de la muestra o tratar la muestra tal que el ácido nucleico en la muestra sea accesible para hibridación al par de cebadores de amplificación; y, (c) combinar el ácido nucleico de la etapa (b) con el par de cebadores de amplificación de la etapa (a) y amplificar el ácido nucleico a partir de la muestra, aislando o recuperando por consiguiente un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa a partir de una muestra. En una modalidad, la muestra es una muestra ambiental, por ejemplo, una muestra de agua, una muestra de líquido, una muestra de tierra, una muestra de aire o una muestra biológica, por ejemplo una célula bacteriana, una célula protozoo, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula de planta, una célula fungoidea o una célula mamifera. Uno o cada miembro del par de secuencias de cebador de amplificación puede comprender un oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 10 hasta 50 o más bases consecutivas de una secuencia según se proporciona aquí .
En una modalidad, los métodos para incrementar la termotolerancia o la termoestabilidad de un polipéptido de hidrolasa comprenden glicosilar un polipéptido de hidrolasa, en donde el polipéptido comprende al menos treinta aminoácidos contiguos de un polipéptido según se proporciona aquí; o un polipéptido codificado mediante una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí, incrementando por consiguiente la termotolerancia o termoestabilidad del polipéptido de hidrolasa. En un aspecto, la actividad especifica de la hidrolasa puede ser termoestable o termotolerante en una temperatura en el rango desde mayor que aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 95 °C.
En una modalidad, los métodos para sobre-expresar un polipéptido de hidrolasa (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) ' recombinante en una célula comprenden expresar un vector que comprende un ácido nucleico según se proporciona aquí o una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí, en donde las identidades de secuencia se determinan mediante análisis con un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual, en donde la sobre-expresión se efectúa mediante el uso de un promotor de alta actividad, un vector dicistrónico o mediante amplificación del gen del vector.
En una modalidad, las composiciones de detergente que comprenden un polipéptido según se proporciona aquí o un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aqui comprenden una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la hidrolasa puede ser una hidrolasa no activa en la superficie. En otro aspecto, la hidrolasa puede ser una hidrolasa activa en la superficie.
En una modalidad, los métodos para lavar un objeto comprenden las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, en donde el polipéptido comprende: un polipéptido según se proporciona aqui o un polipéptido codificado mediante un ácido nucleico según se proporciona aqui; (b) proporcionar un objeto; y (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) y el objeto de la etapa (b) bajo condiciones en donde la composición puede lavar el objeto.
En una modalidad, los métodos para producir una planta transgénica comprenden las siguientes etapas: (a) introducir una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula de planta, en donde la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende una secuencia de ácidos nucleicos según se proporciona aquí, produciendo por consiguiente una célula de planta transformada; y (b) producir una planta transgénica a partir de la célula transformada. En un aspecto, la etapa (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga mediante electroporación o microinyección de protoplastos de células de planta. En otro aspecto, la etapa (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga directamente al tejido de la planta mediante bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, la etapa (a) puede comprender además introducir la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en el ADN de la célula de planta utilizando un huésped Agrobacterium turnefaciens . En 'un aspecto, la célula de planta puede ser una célula de papa, maíz, arroz, trigo, tabaco, o cebada .
En una modalidad, los métodos para expresar una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en una célula de planta comprenden las siguientes etapas: (a) transformar la célula de planta con una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga enlazada de manera operativa a un promotor, en donde la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga comprende un ácido nucleico según se proporciona aquí; (b) cultivar la planta bajo condiciones en donde la secuencia de ácidos nucleicos heteróloga se expresa en la célula de planta.
En una modalidad, un primer método para la síntesis biocatalítica de un lípido estructurado comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Sn2 del triacilglicérido (TAG), produciendo por consiguiente un 1 , 3-diacilglicérido (DAG); (d) proporcionar un éster Rl; (e) proporcionar una hidrolasa específica a Rl, y . (f ) contactar el 1,3-DAG de la etapa (c) con el éster Rl de la etapa (d) y la hidrolasa específica a Rl de la etapa (e) bajo condiciones en donde la hidrolasa específica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente el lípido estructurado. La hidrolasa según se proporciona aquí puede ser una lipasa específica a Sn2. El lípido estructurado puede comprender un alternativo de manteca de cacao (CBA) , una manteca de cacao sintética, una manteca de cacao natural, 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1, 3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2 , 3-dimiristoilglicerol (? ?) .
En una modalidad, un segundo método para la síntesis biocatalítica de un lípido estructurado comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG), produciendo por consiguiente un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover la migración del acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, produciendo por consiguiente una composición que comprende un 1,3-DAG.
Este segundo método puede comprender además proporcionar un éster Rl y una lipasa específica a Rl, y contactar el 1,3-DAG de la etapa (d) con el éster Rl y la lipasa específica a Rl bajo condiciones en donde la lipasa específica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente un lípido estructurado. La hidrolasa por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa según se proporciona aquí puede ser una enzima específica a Snl o una enzima específica a Sn3. El lípido estructurado puede comprender cualquier aceite vegetal, por ejemplo, un i aceite de soya, un aceite de cañóla, alternativo de manteca de cacao (CBA) , una manteca de cacao sintética, una manteca de cacao natural, 1, 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1, 3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2 , 3-dimiristoilglicerol (OMM) .
El éster Rl puede comprender un radical de menor saturación que el residuo de !acilo hidrolizado, en cuyo caso el lipido estructurado asi producido es una grasa o aceite menos saturado que el TAG original. El éster Rl puede comprender uno o más de un ácido graso omega-3, un ácido graso omega-6, un ácido graso mono-insaturado, un ácido graso poli-insaturado, un f"osf"o-grupo, un éster de fitosterol, y orizanol. Más específicamente el éster Rl puede comprender un radical seleccionado del grupo que consiste de ácido alfa-linolénico, ácido eicosapentaénoico, ácido docosahexaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol, coumestrol, dietilstilbestrol , y orizanol.
En un aspecto de este segundo método, la etapa (d) comprende además utilizar resinas de intercambio iónico. Las condiciones cinéticamente controladas pueden comprender condiciones de no equilibrio que dan como resultado la producción de un producto terminado que tiene mayor que una proporción 2:1 de 1,3-DAG a 2,3-DAG. La composición de la etapa (b) puede comprender un ácido graso (FA) fluorogénico . La composición de la etapa (b) puede comprender un umbelliferil éster del FA. El producto terminado puede ser enantioméricamente puro.
En una modalidad, un método para producir una grasa o aceite menos saturado comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido (una hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui; (b) proporcionar un aceite o grasa, y (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con el aceite o grasa de la etapa (b) bajo condiciones en donde la hidrolasa puede modificar el aceite o grasa, por ejemplo, remover al menos un ácido graso saturado, por ejemplo, ácido palmitico, esteárico, láurico, caprilico (ácido octanoico) y similares. La modificación puede comprender una hidrólisis catalizada por hidrolasa de la grasa o aceite. La hidrólisis puede ser una hidrólisis completa o una hidrólisis parcial de la grasa o aceite. El aceite hidrolizado puede comprender un éster de glicerol de un ácido graso poliinsaturado que puede reemplazar el ácido graso saturado removido, o un aceite de pescado, animal, o vegetal. El aceite vegetal puede comprender un aceite de oliva, cañóla, girasol, palma, soya o láurico o aceite de salvado de arroz o una combinación de los mismos .
En una modalidad, un método para producir una grasa o aceite menos saturado, que puede incluir ácidos grasos esenciales, comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG), produciendo por consiguiente un 1,2-G o 2,3-DAG; y (d) promover la migración del acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, produciendo por consiguiente un 1,3-DAG.
El método puede comprender además proporcionar un éster Rl y una lipasa especifica a Rl, y contactar el 1,3-DAG de la etapa (d) con el éster Rl y la lipasa especifica a Rl bajo condiciones en donde la lipasa especifica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente un lipido estructurado. El éster Rl puede comprender un radical de menor saturación que el residuo de acilo hidrolizado, en cuyo caso el lipido estructurado asi producido es una grasa o aceite menos saturado que el TAG original. El éster Rl puede comprender un ácido graso omega-3 (alfa-linolénico, eicosapentaenoico (EPA) , docosahexaenoico (DHA) ) , un ácido graso omega-6 (gamma-linolénico, dihomo-gama-linolénico (DGLA) , o araquidónico) , un ácido graso mono-insaturado (oleico, palmoleico, y similares) , fosfo-grupos (colina y serina) , ésteres de fitosterol (beta-sitosterol, coumestrol, y dietilstilbestrol), y orizanol. La hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa según se proporciona aqui puede ser una enzima especifica a Snl o una enzima especifica a Sn3. La grasa o aceite menos saturado se puede producir mediante la hidrólisis anteriormente descrita de cualquier aceite de algas, aceite vegetal, o una grasa o aceite animal, por ejemplo, aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornmutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta , aceite de Nannochloris species, aceite de Spirulina species, aceite de Chlorophycease (algas verdes), y aceite de Bacilliarophy, aceite de cañóla, aceite de castor, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de avellana, aceite de cáñamo, aceite de linaza, aceite de hierba de la pradera, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de cacahuate, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cártamo, aceite de sasanqua,' aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de bogol, aceite de camelia, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones de ácidos grasos alterados por medio de Organismos Genéticamente Modificados (GMO) o "cultivo'' tradicional tales como aceites bajo saturados o con un alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linolénico (aceite de cañóla con un alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con un bajo contenido de ácido linolénico o aceite de girasol con un alto contenido de ácido esteárico) , grasas animales (sebo, manteca de cerdo, grasa de la mantequilla, y grasa de pollo) , aceites de pescado (aceite de eulacón, aceite de hígado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque, y aceite de lacha) , o mezclas de cualesquiera de lo anterior. La grasa o aceite menos saturado así producido se puede utilizar en alimentos o en productos de horneado, freidura o de cocina que comprenden aceites o grasas con un contenido más bajo de ácidos grasos, incluyendo aceites bajos en ácido palmítico, ácido oleico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octanoico) , etcétera, procesados utilizando una composición o método según se proporciona aquí.
En una modalidad, un método para refinar un lubricante comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) proporcionar un lubricante; y (c) tratar el lubricante con la hidrolasa bajo condiciones en donde la hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí puede selectivamente hidrolizar aceites en el lubricante, refinándolo por consiguiente. El lubricante puede ser un aceite hidráulico.
En una modalidad, un : método para tratar una tela comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí, en donde la hidrolasa puede selectivamente hidrolizar ésteres carboxílieos ; (b) proporcionar una tela; y , (c) tratar la tela con la hidrolasa bajo condición en donde la hidrolasa puede selectivamente hidrolizar ésteres carboxílieos tratando por consiguiente la tela. El tratamiento de la tela puede comprender la mejora de la manipulación y plegado de la tela final, del teñido, obteniendo retardo de llama, obteniendo repelencia al agua, obteniendo brillo óptico, u obteniendo acabado de resina. La tela puede comprender algodón, viscosa, rayón, lyocell, fibra de lino, lino, ramio, todas las mezclas de los mismos, o mezclas de los mismos con poliésteres, lana, poliacrílieos o acrílicos de poliamidas. En una modalidad, una tela, un hilo o una fibra que comprende una hidrolasa según se proporciona aquí se puede adsorber, absorber o inmovilizar en la superficie de la tela, hilo o fibra.
En una modalidad, un método para remover o disminuir la cantidad de una mancha de alimento o de aceite comprende contactar una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui con la mancha de alimento o de aceite bajo condiciones en donde la hidrolasa puede hidrolizar el aceite o la grasa en la mancha. La hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui puede tener una estabilidad mejorada a la desnaturalización mediante agentes surfactantes y a la desactivación por calor. La hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui pueden tener un detergente o una solución de lavandería.
En una modalidad, una composición de dieta comprende una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí. La composición de dieta puede comprender además una base nutricional que comprende una grasa. La hidrolasa se puede activar mediante una sal biliar. La composición de dieta puede comprender además una fórmula infantil basada en leches de vaca. La hidrolasa puede hidrolizar ácidos grasos de cadena larga.
En una modalidad, un método para reducir el contenido de grasa en las composiciones de dieta basadas en vegetales o leche comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) proporcionar una composición que comprende una leche o un aceite vegetal, y (c) tratar la posición de la etapa (b) con la hidrolasa bajo condiciones en donde la hidrolasa puede hidrolizar el aceite o grasa en la composición. En una modalidad, una composición de dieta para un humano o para animales no rumiantes, comprende una base nutricional, en donde la base comprende una grasa y no comprende o comprende poca hidrolasa, y una cantidad efectiva de una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí para incrementar la absorción de grasa y el crecimiento del humano o animal no rumiante.
En una modalidad, un método para catalizar una reacción de interesterificación para producir nuevos triacilglicéridos comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui, en donde el polipéptido puede catalizar una reacción de interesterificación; (b) proporcionar una mezcla de triacilglicéridos y ácidos grasos libres; (c) tratar la mezcla de la etapa (b) con el polipéptido bajo condiciones en donde el polipéptido puede catalizar el intercambio de los ácidos grasos libres con los grupos acilo de los triacilglicéridos , produciendo por consiguiente nuevos triacilglicéridos enriquecidos en los ácidos grasos agregados. El polipéptido puede ser una lipasa especifica a Snl,3.
En una modalidad, un método de interesterificacion para preparar un aceite que tiene un bajo contenido de ácidos grasos trans y un bajo contenido de ácidos grasos de cadena intermedia, comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una mezcla de reacción de interesterificacion que comprende un material fuente de ácido esteárico seleccionado del grupo que consiste de ácido esteárico, monoésteres del ácido esteárico de alcoholes monohidricos de bajo peso molecular y mezclas de los mismos, (b) proporcionar un aceite vegetal liquido; (c) proporcionar un polipéptido (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí, en donde el polipéptido comprende una actividad de lipasa 1, 3-especifica; (d) interesterificar el material fuente de ácido esteárico y el triacilglicérido del aceite vegetal, (e) separar los componentes de ácidos grasos libres interesterificados de los componentes del glicérido de la mezcla de interesterificacion para proporcionar un producto de aceite de margarina interesterificada y una mezcla de ácidos grasos que comprende ácidos grasos, monoésteres de ácidos grasos o mezclas de los mismos liberados del aceite vegetal, y (f) hidrogenar la mezcla de ácidos grasos. En una modalidad del método de interesterificación, la reacción de interesterificación continúa hasta que haya un equilibrio sustancial de los grupos éster en las posiciones 1-, 3- del componente del glicérido con los componentes del ácido graso no glicérido de la mezcla de reacción.
En una modalidad, un método para producir una composición que comprende l-palmitoil-3-estearoil-2-monoleina (POSt) y 1 , 3-distearoil-2-monoleina (StOSt), comprende proporcionar un polipéptido (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí, en donde el polipéptido es capaz de interesterificación catalizada por lipasa 1, 3-especifica de la 1 , 3-dipalmitoil-2-monoleina (POP) con ácido esteárico o tristearina, y contactar dicho polipéptido con una composición que comprende dicha POP en la presencia de una fuente de estearina tal como ácido esteárico o triteariná para producir un producto enriquecido en la l-palmitoil-3-estearoil-2-monoleina (POSt) o 1 , 3-distearoil-2-monoleina (StOSt) .
En una modalidad, un método para mejorar o prevenir la toxicidad mediada por lipopolisacáridos (LPS) comprende administrar a un paciente una composición farmacológica que comprende una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí. En una modalidad, un método para desintoxicar una endotoxina comprende contactar la endotoxina con una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui . En una modalidad, un método para desacilar una cadena de ácidos grasos 2' o una cadena de ácidos grasos 3' de un lipido A comprende contactar el lipido A con un polipéptido según se proporciona aqui.
En una modalidad, los métodos para alterar la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de una enzima lipasa parental (hidrolasa de ácido graso) que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 comprenden la etapa de generar (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o más mutaciones de residuos de aminoácidos en la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, generando por consiguiente una nueva enzima hidrolasa que tiene una secuencia de aminoácidos modificados y una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato alterada según se compara a la enzima lipasa parental (hidrolasa de ácido graso) SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácido graso) comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido palmitico de un aceite, o, la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácido graso) comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido esteárico de un aceite.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos modificados (según se compara a la SEQ ID NO: 2 "parental") comprende al menos una modificación del aminoácido A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E1161; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; 1151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos, y/o al menos una modificación del codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 5 (GGA) ; (GCG) 92 (GCT) , (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CTG) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG) ; (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (GTG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) , o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos, y la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácido graso) comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido palmitico de un aceite. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos modificados (según se compara a la SEQ ID NO: 2 "parental") comprende I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; , G215C; G215V; G215W A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de los mismos, y la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima lipasa (hidrolasa de ácido graso) comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido esteárico de un aceite.
En una modalidad, los métodos para producir una enzima que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato comprenden la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido palmitico de un aceite, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima hidrolasa parental (por i ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial del ácido palmitico de un aceite, en donde la enzima hidrolasa parental (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tiene una secuencia según se proporciona aqui; y (b) hacer al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o más modificaciones de residuos de aminoácidos a la enzima hidrolasa parental (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) , en donde las modificaciones de residuos de aminoácidos corresponden a las mutaciones de secuencias de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, generando por consiguiente una enzima que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido palmitico de un aceite.
En una modalidad, los métodos para producir una enzima que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato comprenden la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido esteárico de un aceite, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una enzima hidrolasa parental (por ejemplo, una lipasa, saturasa; palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial del ácido esteárico de un aceite, en donde la enzima hidrolasa parental (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) tiene una secuencia según se proporciona aquí; y (b) hacer al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11 o 12 o más modificaciones de residuos de aminoácidos a la enzima hidrolasa parental (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), en donde las modificaciones de residuos de aminoácidos corresponden a las mutaciones de secuencias de aminoácidos a la SEQ ID NO: 2 como se muestra en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, generando por consiguiente una enzima que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial o incrementada del ácido esteárico de un aceite.
En una modalidad, los métodos para producir una enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato comprenden la hidrólisis preferencial de un ácido graso particular, que comprende las etapas de (a) proporcionar una secuencia de enzimas hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aqui; (b) generar (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o más mutaciones de residuos base en el ácido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a aquellos cambios de secuencia como se establece en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) probar la actividad de la enzima recién generada por una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial de , un ácido graso particular, produciendo por consiguiente la nueva enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial de un ácido graso particular. En un aspecto, la enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico o ácido esteárico.
En una modalidad, los métodos para producir una enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato comprenden la hidrólisis preferencial de un ácido graso particular, y comprenden las etapas de (a) proporcionar secuencia de ácidos nucleicos que codifica una enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí; (b) generar; (insertar) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o más mutaciones de residuos base en el ácido nucleico, en donde las mutaciones corresponden a aquellos cambios de secuencia como se establece en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23; y, (c) expresar el ácido nucleico generado para producir la nueva enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa), produciendo por consiguiente una enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) que tiene una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato que comprende la hidrólisis preferencial de un ácido graso particular .
En un aspecto, la secuencia que codifica la enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) comprende una secuencia como se establece en la SEQ ID N0:1. En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico o ácido esteárico. En un aspecto, la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) es ácido palmitico según se compara a una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato de ácido esteárico para la enzima hidrolasa de ácido graso parental (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) , o la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva enzima hidrolasa de ácido graso (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) es ácido esteárico según se compara a una especificidad al sustrato o preferencia al sustrato de ácido palmitico para la enzima hidrolasa de ácido graso parental (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) .
En una modalidad, las lipasas comprenden una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero también comprenden al menos una modificación del residuo de aminoácidos A48C; D49R; D61A; . D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; ! I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; o A225S, o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos, y/o al menos una modificación del codón (GCG) 35 (GCT) ; (GGC) 45 (GGA) ; (GCG) 2 (GCT) , (GTG) 102 (GTT) ; (AGC) 108 (AGT) ; (CTG) 117 (CTT) ; (CTG) 124 (TTG); (CGG) 126 (AGG) ; (GTC) 128 (GTG) ; (AGT) 133 (TCT) ; (TTC) 135 (TTT) ; (GTG) 183 (GTT) ; (ACC) 188 (ACG) , o el equivalente de los mismos, o una combinación de los mismos.
En un aspecto, la especificidad al sustrato o la preferencia al sustrato de la nueva lipasa comprende la hidrólisis preferencial o incrementada de un ácido graso de un aceite según se compara a la SEQ ID NO: 2 "parental". En un aspecto, el ácido graso es ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico o ácido esteárico.
Los detalles de una o más modalidades según se proporciona aquí se establecen en los dibujos acompañantes y la descripción debajo. Otras caracteristicas , objetos, y ventajas según se proporciona aquí serán aparentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, secuencias del Banco de Genes y depósitos ATCC, aquí citados se incorporan expresamente por este medio por referencia para todos los propósitos.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos son ilustrativos de las modalidades según se proporciona aquí y no pretenden limitan el alcance de las reivindicaciones.
La patente o el archivo de solicitud contiene al menos un dibujo hecho a color. Las copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo (s) a color se proporcionarán por la Oficina tras la petición y el pago de la retribución necesaria.
La Figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema de computadora .
La Figura 2 es un diagrama de flujo, que ilustra un aspecto de un proceso para comparar un nuevo nucleótido o secuencia de proteínas con una base de datos de secuencias para determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos.
La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso en una computadora para determinar si dos secuencias son homologas.
La Figura 4 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 300 identificador para detectar la presencia de una característica en una secuencia.
La Figura 5 ilustra un método ejemplar según se proporciona aquí que comprende el uso de lipasas según se proporciona aquí para procesar un lípido, por ejemplo, un lípido de un aceite de soya, para selectivamente hidrolizar un ácido palmitico para producir un "aceite de soya reducido en ácido palmitico".
La Figura 6a ilustra los efectos de mutaciones ejemplares de palmitasa GSSMSM sobre la hidrólisis del palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 parental, como se discute en detalle en el Ejemplo 4, debajo. La Figura 6b ilustra los efectos de mutaciones ejemplares de estearatasa GSSMSM sobre la hidrólisis del palmitato y estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 parental como se discute en detalle en el Ejemplo 4, debajo.
La Figura 7 muestra la SEQ ID NO: 2, con las posiciones de mutación del palmitato y estearato particulares listadas en letra negrita de una fuente mayor. Las mutaciones subrayadas (por ejemplo 61A, E) son posiciones alternativas del residuo de aminoácidos (secuencias alternativas para modalidades alternativas) para mejorar la hidrólisis del palmitato. Las mutaciones en letras itálicas (por ejemplo, 20L) son posiciones alternativas del residuo de aminoácidos (secuencias alternativas para modalidades alternativas) para mejorar la hidrólisis del estearato. La posición 116 es una posición alternativa de la mutación del residuo de aminoácidos (una secuencia alternativa para una modalidad alternativa) para mejorar la hidrólisis tanto del palmitato como del estearato.
La Figura 8 muestra datos confirmatorios del ensayo del aceite de soya para clones seleccionados de la genoteca de la palmitasa.
Símbolos de referencia similares en los diversos dibujos indican elementos similares.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Las modalidades alternativas comprenden polipéptidos, incluyendo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, polinucleótidos que los codifican, y métodos para producir y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos . Las modalidades alternativas comprenden polipéptidos, por ejemplo, enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo actividad de hidrolasa termoestable y termotolerante, y polinucleótidos que codifican estas enzimas, y preparar y utilizar estos polinucleótidos y polipéptidos. Las actividades de hidrolasa de los polipéptidos y péptidos según se proporciona aquí incluyen actividad de lipasa (hidrólisis de lipidos), reacciones de interesterificacion, síntesis de éster, reacciones de intercambio de éster, actividad de acil hidrolasa de lipido (LAH) y actividad enzimática relacionada. Para los propósitos de esta solicitud de patente, las reacciones de interesterificacion pueden incluir reacciones de acidólisis (que involucran la reacción de un ácido graso y un triacilglicérido) , alcoholisis (que involucra la reacción de un alcohol y un triacilglicérido) , glicerólisis (que involucra la reacción de un glicerol y un triacilglicérido) y reacciones de transesterificación (que involucran la reacción de un éster y un triacilglicérido) . Los polipéptidos según se proporciona aquí se pueden utilizar en una variedad de contextos farmacéuticos, agrícolas e industriales, incluyendo la manufactura de cosméticos y nutracéuticos . En otro aspecto, los polipéptidos según se proporciona aquí se utilizan para sintetizar productos quirales enantioméricamente puros .
En ciertas modalidades, las enzimas según se proporciona aquí pueden ser catalizadores altamente selectivos. Pueden tener la habilidad para catalizar reacciones con estéreo-, regio-, y quimio- selectividades no posibles en la química sintética convencional. En una modalidad, las enzimas según se proporciona aquí pueden ser versátiles. En varios aspectos, pueden funcionar en solventes orgánicos, operar en pHs extremos (por ejemplo, altos pHs y bajos pHs) , temperaturas extremas (por ejemplo, altas temperaturas y bajas temperaturas) , niveles de salinidad extrema (por ejemplo, alta salinidad y baja salinidad), y catalizar reacciones con compuestos que son estructuralmente no relacionados a sus sustratos naturales, fisiológicos.
En un aspecto, los polipéptidos según se proporciona aquí comprenden hidrolasas que tienen actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa y se pueden utilizar, por ejemplo, en la síntesis biocatalítica de lípidos estructurados (lípidos que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida en la estructura principal del glicerol) , incluyendo cualquier aceite vegetal, por ejemplo, cañóla, soya, alternativas de aceite de soya, alternativas de manteca de cacao, 1,3-diacil glicéridos (DAGs), 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs), tales como 1 , 3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1 , 3-distearoil-2-oleoilglicerol (StOSt), l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POSt) o 1-oleoil-2 , 3-dimiristoilglicerol (OMM) , ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga tales como ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico (DHA) y ácido eicosapentaenoico (EPA) .
En cierta modalidad, las enzimas y los métodos según se proporciona aquí se pueden utilizar para remover, agregar o intercambiar cualquier ácido graso de una composición, por ejemplo, preparar un aceite con un contenido más bajo de ácidos grasos saturados (por ejemplo, un aceite "bajo saturado") o un contenido diferente de ácidos graso (por ejemplo, convertir un aceite que comprende ácidos grasos "saturados" a un aceite que comprende ácidos grasos "no saturados"¦ alternativos) .
Ejemplos de ácidos grasos saturados que se pueden remover, agregar o "re-arreglar" en un lipido, por ejemplo, un aceite, utilizando una enzima o practicando un método según se proporciona aquí incluyen: Acético: CH3COOH Butírico: CH3 (CH2) 2C00H Caproico: CH3 (CH2) 4C00H Caprílico: CH3 (CH2) 6C00H Cáprico: CH3 (CH2) 8COOH Undecanoico: CH3 (CH2) 9COOH Láurico : (ácido dodecanoico) : CH3 (CH2 ) 10COOH Mirístico : (ácido tetradecanoico) : CH3 (CH2 ) i2COOH Pentadecanoico : CH3 (CH2) 13COOH Palmítico : (ácido hexadecanoico) : CH3 (CH2) 14COOH Marqárico: CH3 (CH2) 15COOH Esteárico (ácido octadecanoico) : CH3 (CH2) i6C0OH Araquídico (ácido eicosanoico) : CH3 (CH2) isCOOH Behénico: CH3 (CH2) 20COOH Ejemplos de ácidos grasos insaturados omega-3 que se pueden remover, agregar o "re-arreglar" en un lípido, por ejemplo, un aceite, utilizando una enzima o practicando un método según se proporciona aquí incluyen: g-linolénico (ALA) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 7COOH estearaiadónico (octadecatetraenoico) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 4COOH eicosapentaenoico (EPA) : CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 3C00H docosahexaenoico (DHA) CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 2COOH Ejemplos de ácidos grasos insaturados omega-6 que se pueden remover, agregar o "re-arreglar" en un lípido, por ejemplo, un aceite, utilizando una enzima o practicando un método según se proporciona aquí incluyen: Linoleico (ácido 9, 12-octadecadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) 7C0OH Gamma-linolénico (ácido 6 , 9 , 12-octadecatrienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 4C00H Eicosadienoico (ácido 11, 14-eicosadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) gCOOH Dihomo-gamma-linolénico (ácido 8, 11, 14-eicosatrienoico) : CH3 ( CH2 ) CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH ( CH2 ) 6COOH Araquidónico (ácido 5, 8, 11, 14-eicosatetraenoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 3C00H Pocosadienoico (ácido 13, 16-docosadienoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CH (CH2) nC00H Adrénico (ácido 7 , 10, 13, 16-docosatetraenoico) : CH3 (CH2) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 5COOH Docosapentaenoico (ácido 4 , 7, 10, 13, 16-docosapentaenoico) : CH3 ( CH2 ) 4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH ( CH2 ) 2COOH Ejemplos de ácidos grasos omega-9 que también se pueden remover, agregar o "re-arreglar" en un lipido, por ejemplo, un aceite, utilizando una enzima o practicando un método según se proporciona aquí, incluyen: Oleico (ácido 9-octadecenoico) ': CH3 ( CH2 ) 7CH=CH ( CH2 ) 7COOH Eicosenoico (ácido 11-eicosenoico) CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 9C00H Aguamiel (ácido 5 , 8 , 11-eicosatrienoico) : CH3 (CH2) 7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH (CH2) 3C00H Eurico (ácido 13-docosenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) uCOOH Nervónico (ácido 15-tetracosenoico) : CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) i3C00H .
Palmitoleico: CH3 (CH2) 7CH=CH (CH2) 5COOH En un aspecto, se proporcionan aquí nuevas clases de lipasas llamadas "saturasas", por ejemplo "palmitasas" y "estearatasas". El término "saturasa" como se utiliza previamente en la literatura describió una enzima que lleva a cabo la saturación de enlaces específicos en una trayectoria metabólica, por ejemplo la hidrogenación de un doble enlace (Moise, et al., J Bioi Chem, 2005, 280 (30) : 27815-27825) . Sin embargo, se proporcionan aquí "saturasas" nuevas y previamente no descritas, en donde las saturasas aquí descritas hidrolizan ésteres de ácidos grasos saturados, en donde los ésteres hidrolizados pueden ser ésteres de ácidos grasos saturados y glicerol, umbelliferol u otros alcoholes.
También se proporciona aquí "palmitasas" y "estearatasas" previamente no descritas, en donde las palmitasas y las estearatasas hidrolizan ácido palmítico y ácido esteárico, respectivamente, por ejemplo, a partir de la estructura principal del glicerol. Las "saturasas" aquí descritas también se pueden llamar "hidrolasas saturadas". De modo semejante, las "palmitasas" aquí descritas también se pueden llamar "hidrolasas de palmitato" y las "estearatasas" aquí descritas también se pueden llamar "hidrolasas de estearato" .
En otro aspecto, las saturasas aquí descritas selectivamente hidrolizan al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos saturados. En otro aspecto, las palmitasas aquí descritas selectivamente hidrolizan ácidos grasos tal que al menos 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados son ácido palmítico. En otro aspecto, las estearatasas aquí descritas selectivamente hidrolizan ácidos grasos tal que al menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%,: 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, '79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los ácidos grasos hidrolizados son ácido esteárico.
En un aspecto, como se ilustra en la Figura 5, los métodos para utilizar una enzima según se proporciona aqui pueden procesar un lipido, por ejemplo, un lipido de un aceite de soya u otro aceite vegetal, para selectivamente hidrolizar un ácido graso saturado, por ejemplo, un ácido palmitico o un ácido esteárico, (por ejemplo, de un aceite que contiene estos ácidos grasos saturados) para producir un "aceite bajo (o menos) saturado", por ejemplo, un "aceite reducido en ácido palmitico",' tal como un "aceite vegetal reducido en ácido palmitico", por ejemplo, un "aceite de soya reducido en ácido palmitico". Las enzimas según se proporciona aquí también se pueden utilizar para selectivamente hidrolizar cualquier ácido graso, particularmente ácidos grasos saturados, a partir de una estructura principal de glicerol para producir un "aceite bajo (o menos) saturado", incluyendo selectivamente hidrolizar un ácido graso saturado, por ejemplo, un ácido palmitico o un ácido esteárico, de una posición Snl o una posición Sn2 de una estructura principal de glicerol, además de la hidrólisis de una posición Sn3 (por ejemplo, la hidrólisis del ácido palmitico de la posición Sn3 ilustrada en la Figura 5) .
En un aspecto, se proporciona una síntesis ejemplar de aceites, grasas o triglicéridos bajos saturados. Esta síntesis ejemplar puede utilizar ya sea ácidos grasos libres o ásteres de ácidos grasos, dependiendo de la enzima utilizada. En un aspecto, las hidrolasas, por ejemplo las lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, según se proporciona aquí se utilizan para remover o hidrolizar ácidos grasos saturados, tales como ácido acético, ácido butírico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido undecanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido pentadecanoico, ácido palmitico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido aquídico, o ácido behénico de un triglicéridp, aceite o grasa. En un aspecto, los ácidos grasos removidos o hidrolizados se reemplazan por ácidos grasos con beneficios mejorados para la salud (tales como correlación reducida con padecimiento cardiovascular) , o propiedades químicas mejoradas (tales como reactividad o estabilidad oxidativa) o propiedades físicas mejoradas (tales tales como punto de fusión, o sensación en la boca) . En un aspecto los ácidos grasos agregados son ácidos grasos insaturados omega-3, tales como ácido -linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico (EPA) , o ácido docosahexaenoico (DHA) , o PUFAs o ácidos grasos de aceite de pescado. En un aspecto los ácidos grasos agregados son ácidos grasos no saturados omega-6, tales como ácido linoleico, ácido gamma-linoleico, ácido eicosadienoico, ácido dihomo-gamma-linoleico, ácido araquidónico, ácido docosadienoico, ácido adrénico, o ácido docosapentaenoico. En un aspecto los ácidos grasos agregados son ácidos grasos insaturados omega-9, tales como ácido oleico, ácido eicosaenoico, ácido de aguamiel, ácido erúcico, ácido nervónico, o ácido palmitoleico . En un aspecto los ácidos grasos agregados (por ejemplo omega-3, omega-6, u omega-9) se agregan mediante reacción de ácidos grasos con los triglicéridos , aceite o grasa después de la remoción o hidrólisis de ácidos grasos saturados mediante las hidrolasas, por ejemplo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , según se proporciona aquí. En un aspecto los ácidos grasos agregados (por ejemplo omega-3, omega-6, u omega-9) se agregan mediante reacción de ésteres de ácidos grasos, incluyendo ésteres de glicerol, o etil o metil ésteres, con los triglicéridos, aceite o grasa después de la remoción o hidrólisis de los ácidos grasos saturados mediante las hidrolasas, por ejemplo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas , según se proporciona aquí. En un aspecto la reacción para agregar ácidos grasos (por ejemplo omega-3, omega-6, u omega-9) es catalizada mediante una hidrolasa o lipasa, tal como una lipasa no especifica (incluyendo no regio-especifica y no especifica al ácido graso), o una lipasa especifica a Snl,3, o una lipasa especifica a Snl, o una lipasa especifica a Sn3, o una lipasa especifica a Sn2, o una lipasa especifica al ácido graso.
Los métodos y composiciones (hidrolasas, por ejemplo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí se pueden utilizar en la producción de nutracéuticos (por ejemplo, aceites y ácidos grasos poli-insaturados ) , varios alimentos y aditivos alimenticios (por ejemplo, emulsificadores , reemplazadores de grasas, margarinas y productos para untar) , cosméticos (por ejemplo, emulsificadores, cremas), agentes farmacéuticos y de entrega de fármacos (por ejemplo, liposomas, tabletas, formulaciones), y aditivos de forraje para animales (por ejemplo, ácidos grasos poli-insaturados , tales como ácidos linoleicos) .
En un aspecto, las lipasas según se proporciona aquí pueden actuar sobre los ésteres de ácidos grasos (FA) fluorogénicos , por ejemplo, los umbelliferil ésteres del FA. En un aspecto, los perfiles de especificidades de FA de las lipasas producidas o modificadas por los métodos según se proporciona aquí se pueden obtener midiendo sus actividades relativas en una serie de umbelliferil ésteres del FA, tales como ésteres de palmitato, estearato, oleato, laurato, PUFA, o butirato.
En un aspecto, un polipéptido (por ejemplo, anticuerpo o enzima - por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) según se proporciona aquí para estas reacciones se inmoviliza, por ejemplo, como se describe debajo. En aspectos alternativos, los métodos según se proporciona aqui no requieren un solvente orgánico, pueden proseguir con velocidades de reacción relativamente rápidas. Vea, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,552,317; 5,834,259.
En ciertas modalidades, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aqui se pueden utilizar para hidrolizar (incluyendo selectivamente hidrolizar) aceites, tales como aceites de pescado, animales y vegetales, y lipidos, tales como ácidos grasos poli-insaturados . En un aspecto, los polipéptidos según se proporciona aqui se utilizan para producir aceites bajo saturados, por ejemplo, removiendo (hidrolizando) al menos un ácido graso de un aceite; y la hidrólisis puede ser una hidrólisis selectiva, por ejemplo, que sólo remueve un ácido graso particular, tal como un ácido palmitico, esteárico, u otro ácido graso saturado, o simplemente removiendo un ácido graso de una posición, por ejemplo, Snl, Sn2 o Sn3. En un aspecto, los polipéptidos según se proporciona aqui se utilizan para procesar ácidos grasos (tales como ácidos grasos poli-insaturados ) , por ejemplo, ácidos grasos de aceite de pescado, por ejemplo, para el uso en o como un alimento o aditivo de forraje, o un aceite de cocina, freidura, horneado o comestible. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas ) según se proporciona aqui se pueden utilizar para selectivamente hidrolizar ásteres saturados sobre ésteres no saturados en ácidos o alcoholes. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aqui se pueden utilizar para tratar látex para una variedad de propósitos, por ejemplo, para tratar látex utilizados en composiciones fijadoras del^ pelo para remover olores desagradables. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aqui se pueden utilizar en el tratamiento de una deficiencia de lipasa en un animal, por ejemplo, un mamífero, tal como un humano. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturases, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí se pueden utilizar para preparar lubricantes, tales como aceites hidráulicos. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí se pueden utilizar en producir y utilizar detergentes. En otra modalidad, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí se pueden utilizar en procesos para el acabado químico de telas, fibras o hilos. En un aspecto, los métodos y composiciones (lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí se pueden utilizar para obtener retardo de llama en una tela utilizando, por ejemplo, un ácido carboxílico substituido con halógeno o un éster del mismo, es decir, un ácido carboxílico fluorado, clorado o bromado o un éster del mismo. En un aspecto, se proporcionan métodos para generar lipasas a partir de genotecas ambientales. ; En una modalidad, las "hidrolasas" según se proporciona aquí abarcan polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos, enzimas) y péptidos (por ejemplo, "sitios activos") que tienen cualquier actividad de hidrolasa, es decir, los polipéptidos según se proporciona aquí pueden tener cualquier actividad de hidrolasa, incluyendo por ejemplo, una actividad de lipasa, saturase, palmitasa y/o estearatasa. En otra modalidad, las "hidrolasas" según se proporciona aquí incluyen todos los polipéptidos que tienen cualquier actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, incluyendo actividad de síntesis de lípido o de hidrólisis de lípido, es decir, los polipéptidos según se proporciona aquí pueden tener cualquier actividad de lipasa, saturasa', palmitasa y/o estearatasa. En otra modalidad, las lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas según se proporciona aquí incluyen enzimas activas en la bioconversión de lípidos a través de la catálisis de las reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificación y aminólisis. En un aspecto, las hidrolasas (por ejemplo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) según se proporciona aquí pueden hidrolizar emulsiones de lípidos. En un aspecto, las enzimas según se proporciona aquí pueden actuar preferiblemente sobre los enlaces Sn-1, Sn-2 o Sn-3 de los triacilglicéridos para liberar uno o más ácidos grasos de la estructura principal del glicerol. Por ejemplo, la actividad de hidrolasa, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipéptidos según se proporciona aquí incluye la síntesis de manteca de cacao, ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs), 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs) . En otra modalidad, la actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa de los polipéptidos según se proporciona aquí también comprende la producción de aceites bajo saturados, por ejemplo, aceite de soya o cañóla, removiendo un ácido graso, por ejemplo, un ácido palmítico, oleico, láurico o esteárico.' En aspectos alternativos, las enzimas según se proporciona aquí también pueden hidrolizar y/o isomerizar enlaces en altas temperaturas, bajas temperaturas, pHs alcalinos y en pHs ácidos. En un aspecto la hidrolasa por ejemplo la lipasa según se proporciona aquí es una saturasa que cataliza las reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificacion y aminólisis donde el ácido carboxílico o el ácido graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido graso saturado tal como ácido acético, ácido butírico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico o ácido araquídico. En un aspecto la hidrolasa por ejemplo la lipasa o saturasa según se proporciona aquí es una palmitasa que cataliza las reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificacion y aminólisis donde el ácido carboxílico o el ácido graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido palmítico. En un aspecto la hidrolasa por ejemplo la lipasa o saturasa según se proporciona aquí es una estearatasa que cataliza las reacciones de hidrólisis, alcohólisis, acidólisis, esterificacion y aminólisis donde el ácido carboxílico o el ácido graso en la molécula formada o reaccionada es un ácido esteárico.
En ciertas modalidades, se proporcionan aquí enzimas que comprenden variantes de hidrolasa (por ejemplo, "variante de lipasa", "variante de saturasa", "variante de palmitasa" o "variante de estearatasa" ) de las enzimas según se proporciona aquí; estas enzimas pueden tener una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de un "precursor". El precursor puede incluir una hidrolasa existente de manera natural y/o una hidrolasa recombinante . La secuencia de aminoácidos de la variante de hidrolasa se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de hidrolasa precursora mediante la sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos precursora. Tal modificación; es de la "secuencia de ADN precursora" que codifica la secuencia de aminoácidos de la lipasa precursora en vez de la manipulación de la enzima hidrolasa precursora per se. Los métodos adecuados para tal manipulación de la secuencia de ADN precursora incluyen los métodos aquí descritos, así como también los métodos conocidos por aquellos expertos en el arte Generación y Manipulación de Ácidos Nucleicos En un aspecto, se proporcionan aquí ácidos nucleicos, incluyendo casetes de expresión tales como vectores de expresión, que codifican los polipéptidos (por ejemplo, las hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, y anticuerpos) . En otro aspecto, se proporcionan aquí ácidos nucleicos que tienen una secuencia como se establece en la SEQ ID N0:1 y que tienen al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o el equivalente de los mismos) . En una modalidad, se proporcionan aquí ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2 y que tienen al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos descritos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23 (o el equivalente de los mismos) .
SEQ ID NO: 1 ATGCTGAAACCGCCTCCCTACGGACGCCTGCTGCGCGAACTGGCCGATATC CCGGCCATCGTGACGGCACCGTTCCGGGGCGCTGCGAAAATGGGCAAACTG GCGGATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCCGACGACAAC GCCACCTCGGTGCTGCGCAAGACCTTCGATGTCGCGGGCTTTGCCTGTTCG GGCTGGGAACGCGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCGTGGACCGG CTGGTCGACCGGCTGCGGGCGGTGTCGGAGGCGGCCGGTGGTCAGAAGGT GATCGTGGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGCCTCTATGCGCGCGAGCTGGGCCA CAAGGCGCCCGAACTGATCCGGATGGTCGTCACGCTCGGCAGTCCGTTCGC GGGCGACCTCCACGCCAACCATGCGTGGAAGATCTACGAGGCGATCAACAG CCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGGTCGATTTCCAGATTAAGCCGCC GGTGCGCACCATCGCGGTGTGGTCGCCGCTCGACGGGGTGGTGGCGCCGG AGACCTCGGAAGGCTCGCCCGAGCAGTCGGACGAGCGGCTAGAGCTGGCG GTGACCCACATGGGCTTTGCCGCATCGAAGACCGGGGCCGAGGCTGTGGTC CGGCTGGTCGCGGCGCGGCTCTAG SEQ ID N0:2 (codificada mediante la SEQ ID NO:l): Código de 1 letra: MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATSVLR KTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRAVSEAAGGQ VIVVGWSLGGL YARELGH APELIRMVVTLGSPFAGDLHANHAWKIYEAINSHTVDNLPIPVDFQI PP VRTIAVWSPLDGVVAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAEAVVRLVAAR Código de 3 letras: Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu Ala Asp lie Pro Ala lie Val Thr Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val Ala Gly Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly lie Arg Gly Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser Glu Ala Ala Gly Gly Gln Lys Val lie Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu lie Arg Met Val Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn His Ala Trp Lys lie Tyr Glu Ala lie Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro He Pro Val Asp Phe Gln lie Lys Pro Pro Val Arg Thr lie Ala Val Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gln Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala Ala Arg Leu SEQ ID NO: 3: ATGGCCGGCCACCAGGGCGCGCGGGGCCCCAAAGACGGTCCGCCGGCGATGGTG ATCCCGGGCTTCCTCGCCCACGACAGGCACACGACACGATTGCGCCGGGAACTC GCCGAGGCGGGG1TCAGGGTTCACCCCTGGCGGCAGGGCTGGAACATGGGAGCG CGTGCCGACACGCTCGAGAAATTGAAGCGGGCAGTGGACCAGTGCGGTCATGAC GAGCCGATCCTGCTGGTCGGCTGGAGTCTGGGCGGGCTCTACGCGAGGGAGGTC GCGCGCGCCGAGCCGGATCAGGTGCGGGCGGTGGTCACTCTTGGTTCCCCGGTGT CGGGCGACCGGCGCCGCTACACCAACGTGTGGAAGCTGTACGAATGGGTGGCGG GTCACCCGGTGGACGACCCGCCGATCCCCGACAAGGAGGAAAAGCCGCCGGTGC CGACCCTGGCTTTGTGGTCGGCGGATGACGGGATCGTCGGCGCCCCGTCGGCGCG CGGGACTCAGTTATCTCACGACAAGGCGGTCGAGATGCGAACGAGCCACATGGG CTTTGCCATGTCGGCGAAGAGCGCACGCTTTGTTGTCGCCGAGATCGTGAAGTTC CTGAAGAAAACCGAAGGTTCCGAGTCGCACGATTGA SEQ ID NO: (codificada mediante la SEQ ID NO: 3): MAGHQGARGPKDGPPAMVIPGFLAHDRHTTRLRRELAEAGFRVIIPWRQGWNMGA RADTLE L RAVDQCGHDEPILLVGWSLGGLYAREVARAEPDQVRAVVTLGSPVSG DRRRYTNVWKLYEWVAGHPVDDPPIPDKEE PPVPTLALWSADDGIVGAPSARGTQ LSHDKAVEMRTSHMGFAMSAKSARFVVAEIV FL KTEGSESHD SEQ ID NO: 5: GTGAGCGAGAAAGGCGCACCCAAGGGAAGGCAGCGGCTGAAGGAGATCGGCGC GCTTCTGTTCCACGCGCCTCGCAGCTTGGGCCATCTGGGCGCGCGCGGCCCCAAG GACGGTCCTCCGGTGATGGTCATCCCGGGATTCCTCGCGCACGACTTGCATACGA CGCAGTTGCGCCGGGCGCTCGCGAAGGCAGGCTTCCGAGTGCATCCGTGGCGGC AGGGGATGAACCTTGGAGCGCGCGCCGATACGCTCGAAATTCTGAAGCGCGCGG TGGATTCCTGCGGCTCGAGCGAGCCGATGCTGCTCGTCGGCTGGAGCCTGGGCGG TCTCTATGCCCGGGAGATCGCGCGTGCGGAGCCGGACCGGGTGCGGGCGGTGGT GACGATGGGATCGCCGGTGTGGGGCGACCGCAGGCGCTACACCAACGTGTGGAA GCTGTACGAACGGATTGCCGGCCATCCGGTCGACAAGCCGCCGATCCCGGACAA GAGCCAGAAGCCGCCGGTGCCGACTCTGGCTTTGTGGTCGCAGCATGATGGCATC GTCGGCGCGCCCTCGGCGAGAGGGACGAAGAAGACCCGCGACAAGGCGGTCGC CATCGACACGACTCACATGGGGTTTGCCATGTCGCCCAAGACGACGCGCGCGGC AGTGCGTGAGATCGTGGGCTTTTTGAATGAAGTCGAAGGCGGTTCGTCACCCCGG GCGTGA SEQ ID NO:6 (codificada mediante la SEQ ID NO:5): MSEKGAP GRQRLKEIGALLFHAPRSLGHLGARGP DGPPVMVIPGFLAHDLHTTQL RRALAKAGFRVHPWRQGMNLGARADTLEILKRAVDSCGSSEPMLLVGWSLGGLYA REIARAEPDRVRAVVTMGSPVWGDRRRYTNVWKLYERIAGHPVDKPPIPD SQKPP VPTLALWSQHDGIVGAPSARGT KTRDKAVAIDTTHMGFAMSP TTRAAVREIVGF LNEVEGGSSPRA SEQ ID NO:7: ATGAGGCTGCGCGAGGGGGGCGCGCTCGTATCGCGGGCCTATCGCGCCTTCGGG CGCCTCGGCGAGCGCGGCCCGGCGGACGGGCCGCCGCTGATGGTGATCCCGGGC TTCCTCGCCACCGATCGCACCACTTTGGGGCTGCAGCGGGCGCTGGCCAAGGGCG GCTACAAGGTGACCGGATGGGGCATGGGCCTCAACAGCGGCGTCACCGAAGACA TAGTCGACCGCATCGCCGCTCGGGTCGAAAGGTTTGGAGCCGGCCGCAAAGTGA TCCTCGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGACTCTACGCGCGCGTGGTCGCGCAGGAGC GGCCGGATCTCGTCGACAAGGTGGTCACGCTCGGCTCGCCCTTTTCGGGCGACAG GCGCCGCAACAACAATGTCTGGCGGCTCTACGAGTTCGTC GCCGGCCATCCGGTCAACAGCCCGCCGATCGACAAGGACCCCGAGGTGAAGCCG CCGGTGCCGACGCTCGCTATCTGGTCGCGGCGCGACGGCATCGTCTCTCCGGCGG GCGCGCGCGGGCGGGAGGGAGAGCGCGACGCCGAGCTCGAGCTCGACTGCAGC CACATGGGCTTTGCGGTCAGCGCCAGGGCTTATCCCAAGATCGTGGAGGCGGTG CGGGCGTTTCCGGAAAACATCCGTTCGCGCTGA SEQ ID N0:8 (codificada mediante la SEQ ID N0:7) : MRLREGGALVSRAYRAFGRLGERGPADGPPLMVIPGFLATDRTTLGLQRALA GGY KVTGWGMGLNSGVTEDIVDRIAARVERFGAGRKVILVGWSLGGLYARVVAQERPD LVDKVVTLGSPFSGDRRR NNVWRLYEFVAGHPVNSPPIDKDPEV PPVPTLAIWSR RDGIVSPAGARGREGERDAELELDCSHMGFAVSARAYPKJVEAVRAFPEN1RSR SEQ ID NO: : ATGAAGCCGCCGCCCGGATGGATGAAGATCCGGGAGGCGGGCTCGCTCCTCGCG CGCTTCTACCGCGCGTTCGGCAAGCTCGAGCCGCGCGGGCCGGCGGACGGGCCG AAGCTGATGGTGATCCCGGGTTTCCTCGCGGGCGACAGGACGACGCTCGGGCTG CAGCGAGCGCTGGCCGGCGGCGGCTACCGGGTCGCCGGCTGGGGGCTGGGGGTG AACCGCGGCGTTTCGGAGGACGTGGTCGACCGGATCGGCCAGCAAGTCGCGCGG TTCGGGGCGGGCGAGAAGGTGATCCTGGTCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCGCGCGTGGTGGCGCAGGAGCGGCCCGACCTCGTCGAGAAGGTGGTGACCTTG GGCTCGCCGTTTTCGGGCGACCGGCGGCGCAACAACAATGTGTGGCGGCTCTATG AGTGGGTGGCTGGGCATCCGGTGAACGATCCGCCGATCGACAAGGACCCGGCGA AGAAGCCCCCGGTGCCGACGCTCGCGÁTCTGGTCGCGGCGTGATGGGATCGTGG CGGTCGAAGGCGCGCGGGGGCGGCCGGAGGAGCGGGATGCCGAGCTGGAGATC GATTGCAGCCACATGGGGTTTGGGGTCAGCGGCAAGGCGTTTCCCCGAATCGTA GAGGCGGTGAAGGGGTTCTAA SEQ ID NO: 10 (codificada mediante la SEQ ID NO: 9) : MKPPPGWMKIREAGSLLARFYRAFGKLEPRGPADGP LMVIPGFLAGDRTTLGLQR ALAGGGYRVAGWGLGVNRGVSEDVVDRIGQQVARFGAGEKVILVGWSLGGLYAR VVAQERPDLVEKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEWVAGHPVNDPPIDKDPA KPP VPTLAIWSRRDGIVAVEGARGRPEERDAELEIDCSHMGFGVSGKAFPRIVEAVKGF SEQ ID NO: 11 GTGTTGGTGCTGCCGGCGTTCCTCGCCAACGACCTTCCCACTTCGCTTCTCCGCAG GACGCTGAAGGCGAACGGGTTTCGCCCGTTCGGCTGGGCGAACGGTTTCAACTTA GGTGCACGGCCGGACACGCTCCAGCGCCTGAGCGCACGGCTCGATGCGGTGGTT CAGGAAGCGGGCAGGCCGGTTGCATIOATCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT GCCCGAGAGCTGGCGAAACGCAGGTCGGCTGAGGTGTCGGCAGTGATCACGCTC GGCACGCCCTTCTCGGTTGACCTCAGACGCAACAACGCCTGGAAGCTGTACGAG CTCATCAACGATCATCCTGTCGATGCCCCTCCCTTGGATGTTCAGGTCGACGCGA AGCCACCCGTCCGAACCTTCGCTTTGTGGTCGCGTCGCGACGGGATCGTAGCGCC CGCGAGCGCGCACGGCATGGAGGGCGAGTTCGACCAGGCGATCGAGCTGCAGTG CACGCACAACGAGATGGTCAGTGATCCGGAGGCCCTCTCCACGATCGTTACCTTG CTGCGGGAAAATGTTGGCTCCTGA SEQ ID NO: 12 (codificada mediante la SEQ ID NO: 11): MLVLPAFLANDLPTSLLRRTLKANGFRPFGWANGFNLGARPDTLQRLSARLDAVVQ EAGRPVALIGWSLGGLYARELAKRRSAEVSAVITLGTPFSVDLRRNNAWKLYELIND HPVDAPPLDVQVDA PPVRTFALWSRRDGIVAPASAHGMEGEFDQAIELQCTHNEM VSDPEALSTIVTLLRENVGS SEQ ID NO: 13: GTGAATACAGCCGACCTATTGAAGCCACCACCCGCAAGCATGACAGTTCTCGAG GCGAGAGCGCTGCTGGACATATGCAAGATGAGCGCCCCATTGGCGCGCTTGCTA TTCAAAAAGAACTCGCCCTGGCGCAAACAACGGGTTCTCGTAATACCTGGCTTTG GCGCTGATGATCGCTACACCTGGCCGTTGCGCAATTTCGTCCAGGCACAGGGCTA TGCCACGACTGGCTGGGGCCTGGGCACCAACAAGGCAGGTCTCAATATGCCGCA TCAACTATCCGACGTCCACCCCAGATGGAAGCTAAAACCCAAGACGCCGTACCG TGGTGAGGCGGGCGTACCTTACGTGATTGACCGCTTGATCGAACGGTTTGACGAA TTGGCATCGACGGATCCGCAACCCATCGCACTTATAGGTTGGAGTCTGGGTGGTT TCATGGCCCGTGAAGTTGCCCGAGAGCGCCCAAACCAGGTGAGTCAGGTTATTA CCCTCGGTTCTCCTGTCATCGGAGGCCCAAAATACACCCTCGCTGCATCGGCTTT CATCCGGCGCAAATACGATTTGGACTGGGTGGAGCAAGTGATCGCGGAGCGGGA AGATCGCCCCATTACTGTTCCTATTACAGCAATAGTCAGCCAGTCTGATGGCATC GTCGGATATTCAGCGGCAATCGATCACCACAGTCCCGCTGTGCAGCATTTACATA TGGATGTTGCCCATTTGGGCTTTCCTTACAACACGAGGGTTTGGTCAGAAATCGC CAATGCGCTCAACTCTTTAGAGGTGGAGAAGGAGCGTGTTTAG SEQ ID NO: 14 (codificada mediante la SEQ ID NO: 13) : MNTADLL PPPASMTVLEARALLDIC SAPLARLLFKK SPWRKQRVLVIPGFGA DDRYTWPLRNFVQAQGYATTGWGLGTN AGLNMPHQLSDVHPRW LKP TPYRG EAGVPYVIDRLIEI^DELASTDPQPIALIGWSLGGFMAREVARERPNQVSQVITLGSPV IGGPKYTLAASAFIRJRXYDLDWVEQVIAERJEDRPITVPITAIVSQSDGIVGYSAAIDHH SPAVQHLHMDVAHLGFPYNTRVWSEIANALNSLEVEKERV SEQ ID NO: 15: ATGGAGCTCGCCAAGGTCACCGCCCTGATGAAGGCCACCGCCCTCGAGATCGCG ATCCTCACCGGCCACCTCGTCCTCTACCCCTCCGGGATCGTGGCCGAGCGCCTCG CGGCCGCCCCCTCTTCACCGTCCTCCCCGTCCGCGGGCCCGACGGGCCGACGTCC GGTCGTCCTGCTGCACGGTTTCGTGGACAACCGCTCGGTCTTCGTCCTGCTGCGC CGTGCCCTCACCCGGAGCGGCCGTGACTGCGTCGAGTCGCTCAACTACTCGCCGC TCACCTGCGACCTGCGGGCCGCCGCCGAACTGCTGGGGCGCCGGGTGGACGAGA TCCGCGCCCGGACCGGACACGCCGAGGTCGACATCGTCGGCCACAGCCTGGGCG GGCTCATCGCCCGTTATTACGTACAGCGTCTCGGCGGTGACAGCCGGGTGCGCAC CCTGGTCATGCTCGGCACCCCGCACTCCGGCACCACCGTGGCCCGGCTCGCCGAC GCGCATCCGCTGGTGCGGCAGATGCGGCCGGGTTCGGAGGTGCTGCGGGAGCTC GCCGCGCCCTCGCCCGGCTGCCGTACCCGGTTCGTGAGCTTCTGGAGCGACCTC GACCAGGTGATGGTGCCGGTGGACACGGCCTGCCTGGACCACCCCGACCTGCTG GTGCACAACGTCCGGGTCAGCGGGATCGGTCATCTCGCGCTGCCGGTCCATCCCA CGGTGGCGGCCGGGGTCCGGGAGGCCCTCGACGCGAGCGGCGCGGGGGTCCCGG GGGTGCGGGAGGAGGGGCCCGGCGCCGGCGCCGTGGCGTGA SEQ ID NO: 16 (codificada mediante la SEQ ID NO: 15): MELAKVTALMKATALEIAILTGHLVLYPSGIVAERLAAAPSSPSSPSAGPTGRRPVVL LHGFVDNRSVFVLLRRALTRSGRDCVESLNYSPLTCDLRAAAELLGRRVDE1RARTG HAEVDIVGHSLGGLIARYYVQRLGGDSRVRTLVMLGTPHSGTTV ARLAD AHPLVRQ MRPGSEVLRELAAPSPGCRTRFVSFWSDLDQVMVPVDTACLDHPDLLVH VRVSGI GHLALPVHPTVAAGVREALDASGAGVPGVREEGPGAGAVA SEQ ID NO: 17: GTGGCCGCCGCGGACAGCGGGACGGCGGAAGGGCAAAGGCTTCGGCCGCCGAG CCTGTTCCTGATGCTGGCCGAGGCGAGGGGCTTGCTCGAACTGAACTCGAGCCTG TTGTTGTCGCCGCTGTTGTTGCGGGCGCCGAAGGGCGACGGACATCCGGTGCTGG CGCTGCCGGGCTTTCTCGCCAGCGATCTGTCGATGGCGCCGATGCGGCGCTATCT GAAAGAACTCGGCTACGATGCCCATGCGTGGAACATGGGCCGCAATCTCGGCGG CGTCGCGTCCAAGCGCGAAGCCTTGCGCGACCTGTTGCGGCGCATTTACAGCCAG ACGGGCCGCAAGGTCAGCCTGGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGC GATCTCGCTTTGCAGGCGCCCGACATGGTGCGTTCCGTGATCACGCTCGGCAGTC CGTTTGCCAGCGACATCAGGGCGACCAACGCCACGCGGCTCTACGAGGCGCTGT CGGGAGAAAGGGTCGACGACAATCCGGAGTTAACAGCGGCGATCGCCGGCGACC TGCCGGTGCCGGCGACCTCGATCTATTCCCGTACCGACGGTATCGTGAACTGGCA CACCAGCCTGCTGCGTCCTTCCGCAACGGCTGAAAACATCGAGGTTTACTTCGCC AGCCATATCGGGCTCGGCGTCAACCCGGCAGCGCTGTGGGCGGTGGCCGACCGC CTGGCGCAGCCCGAGGGGGAATTTAAGCATTTTGACCGGTCGGGTCCCTTTGCCA TTGCCTATGGCCCCCCTGAAAATGCACAATCCTGA SEQ ID NO: 18 (codificada mediante la SEQ ID NO: 17) : MAAADSGTAEGQRLRPPSLFLMLAEARGLLELNSSLLLSPLLLRAP GDGHPVLALP GFLASDLSMAPMRRYL ELGYDAHAWNMGR LGGVASKREALRDLLRRIYSQTGR VSLVGWSLGGVYARDLALQAPDMVRSVITLGSPFASDIRATNATRLYEALSGERV DDNPELTAAIAGDLPVPATSIYSRTDGIVNWHTSLLRPSATAENIEVYFASHIGLGVNP AALWAVADRLAQPEGEFKHFDRSGPFAIAYGPPENAQS SEQ ID NO: 19: ATGCCGGAGCGAAACGAAGCGCAGGCCCCGCCGCGTCTTCGTCCGCCGGGGCTC GGGCTGTTCCTCGCCGAAGCGCGGGGCATTTTCGAGCTCAACGCGAGCCTGTTGC TGTCGCCGCTTCTGTTGCGCGCGCCGCGCGGCGACGGCCATCCGGTGCTGGCGTT GCCGGGCTTTCTTGCCAGTGATCTATCGATGGCGCCGTTGCGCCGCTACCTCACC GAGCTCGGCTACGACACCCACGCCTGGCGCATGGGCCGCAATGTCGGCGGCATC GCGAAGATGCGGATCGCGCTGCTCGAGCGGCTCACGCAGATCCATGCCGAGTGC GGCCGCAAGGTCTCGATTGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGCGACC TCGCGTTGCAGGCGCCCGAGATGGTGCGCTACGTCGTCACCCTCGGCAGCCCCTT CGCCAGCGACGTCCGCGCCACCAATGCGACGCGGCTCTATGAGGCGATGTCGGG CGAAACGGTCGGCGACAATGTCGACCTCGTGCAGGCGATTGCCGGCGACCTGCC GGTTCCCGTGACCTCGATCTA1TCGAAGAGCGACGGCATCGTGAACTGGCGGACC TGCCTGCTGCGCCCGTCCGCGACCGCCGAGAATATCGAGGTCTATTTCGCGAGCC ATGTCGGCATCGGCGTCAATCCGGCCGCGCTGTGGGCGATCGCGGACCGGCTGG CCCAGCGGGAAGGCGAATTCCGCCCCTTCGACCGGTCCGGTCCTTTTGCCATTGC CTACGCGCCCCCGGAACAGGCACAATCGATCTGA SEQ ID NO:20 (codificada mediante la SEQ ID NO: 19): MPERNEAQAPPRLRPPGLGLFLAEARGIFELNASLLLSPLLLRAPRGDGHPVLALPGF LASDLSMAPLRRYLTELGYDTHAWRMGRNVGG1A MRIALLERLTQIHAECGRKVS 1VGWSLGGVYARDLALQAPEMVRYVVTLGSPFASDVRATNATRLYEAMSGETVGD NVDLVQAIAGDLPVPVTSIYSKSDGIV WRTCLLRPSATAENIEVYFASHVGIGVNPA ALWAIADRLAQREGEFRPFDRSGPFAIAYAPPEQAQSI Se proporcionan aquí métodos para descubrir nuevas secuencias de hidrolasa utilizando los ácidos nucleicos según se proporciona aqui. También se proporcionan métodos para modificar los ácidos nucleicos según se proporciona aqui mediante, por ejemplo, tecnologías GSSMSM y GeneReassemblySM.
Los ácidos nucleicos según se proporciona aquí se pueden producir, aislar y/o manipular mediante, por ejemplo, clonación y expresión de genotecas de ADNc, amplificación del mensaje o ADN genómico mediante PCR, y similares.
La fuente inicial de polipéptidos y ácidos nucleicos ejemplares seleccionados son: En la práctica de los métodos según se proporciona aqui, los genes homólogos se pueden modificar manipulando un ácido nucleico del molde macromolecular , como se aqui describe. La materia reclamada se puede practicar en conjunción con cualquier método o protocolo o dispositivo conocido en el arte, que son bien descritos en la literatura científica y de patente .
Técnicas Generales En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que incluyen ARN, ARNi, (por ejemplo, ARNsi, ARNmi) , ácido nucleico antisentido, ADNc, ADN genómico, vectores, virus o híbridos de los mismos, ácidos nucleicos aislados de una variedad de fuentes, creadas por ingeniería genética, amplificadas y/o expresadas/generadas recombinantemente . Los péptidos recombinantes generados de estos ácidos nucleicos se pueden aislar individualmente o clonar y analizarse para una actividad deseada (por ejemplo, hidrolasa, tal como por ejemplo, una actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) . Se puede utilizar Cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas de expresión de células de mamífero, levaduras, hongos, insectos o plantas.
Alternativamente, estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro mediante técnicas de síntesis químicas bien conocidas, como se describe en, por ejemplo, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radie. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett.- 22:1859; Patente Norteamericana No. 4,458,066.
Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, subclonación, sondas de etiquetado (por ejemplo, etiquetado con imprimadores aleatorios utilizando polimerasa de Klenow, traducción por muescas, amplificación) , secuenciación> hibridación, y similares se describen adecuadamente en la literatura científica y literatura de patentes, ver, por ejemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED. ) , Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory^ (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993) .
Otros medios útiles para obtener y manipular ácidos nucleicos utilizados para practicar los métodos que se proporcionan en la presente es clonar de muestras genómicas, y, si se desea, seleccionar y re-clonar insertos aislados o amplificados de, por ejemplo, clones genómicos o clones ADNc. Las fuentes de ácido nucleico utilizadas en los métodos que se proporcionan en la presente incluyen genotecas genómicas o de ADNc contenidas en, por ejemplo, cromosomas artificiales mamíferos (MACs) , ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,721,118; 6,025,155; cromosomas artificiales humanos, ver, por ejemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; cromosomas artificiales de levaduras (YAC) ; cromosomas artificiales bacterianos (BA) ; cromosomas artificiales Pl, ver, por ejemplo, Woon (1998) Genomics 50:306-316; vectores derivados de Pl (PACs) , ver, por ejemplo, Biotechniques 23:120-124; cósmidos, virus recombinantes, fagos o plásmidos.
Las frases "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" pueden incluir un , oligonucleótido o nucleótido, polinucleótido, o un fragmento de cualquiera de estos, ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético el cual puede ser, de una sola hebra o de doble hebra y puede representar una hebra sentido o antisentido, un ácido nucleico de péptido (PNA), o cualquier material semejante a ARN o semejante . a ADN, de origen natural o sintético, que incluye, por ejemplo, ARNi (ARN "interférente" de doble hebra), ribonucleoproteínas (por ejemplo, iRNPs) . El término abarca ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos , que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término también abarca estructuras semejantes del ácido nucleico con estructuras sintéticas, ver por ejemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156.
Cuando se utiliza en la presente, el término "promotor" incluye todas las secuencias capaces de manipular la transcripción de una secuencia de codificación en una célula, por ejemplo, una célula vegetal. Por consiguiente, los promotores utilizados en los constructos que se proporcionan en la presente incluyen elementos de control de transcripción que actúa en cis y segundas reguladoras que están implicadas en regular o modular relación y/o velocidad de transcripción de un gen. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control de transcripción que actúa en cis, que incluye un intensificador, promotor, un terminador de transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3' , o una secuencia de intrones, los cuales están implicados en la regulación de transcripción. Estas secuencias que actúan en cis típicamente interactúan con proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción. Los promotores1 "constitutivos" son aquéllos que manipulan la expresión continuamente bajo la mayoría de estados o condiciones de desarrollo o diferenciación celular. Los promotores "inducibles o "regulables" dirigen la expresión del ácido nucleico que se proporcionan bajo la influencia de condiciones ambientales o condiciones de desarrollo. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por medio de promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, sequedad, o la presencia de luz.
Los promotores de "tejido específico" son elementos de control de transcripción que solamente son activos en células o tejidos u órganos particulares, por ejemplo, en plantas o animales. La regulación de tejido específico puede lograrse mediante ciertos factores intrínsecos los cuales aseguren que se expresen genes codifiquen proteínas específicas para un tejido dado. Se sabe que tales factores existen en mamíferos y plantas de manera que permiten el desarrollo de tejidos específicos.
El término "planta" incluye plantas completas, partes de plantas (por ejemplo, hojas, tallo, flores, raíces, etc.), protoplastos de plantas, semillas y células de plantas y progenie de las mismas. La clase de plantas que se puede utilizar en el método que se proporciona en la presente generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores tratables en técnicas de transformación, que incluyen angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), así como gimnospermas . La misma incluye plantas de una variedad de niveles de ploidía, que incluyen estados polipoloides , diploides, haploides y hemicigotos. Cuando se utiliza en la presente, el término "planta transgénica" incluye plantas -o células de plantas en las cuales se ha insertado una secuencia de ácido nucleico heterólogo, por ejemplo, los ácidos nucleicos y varios constructos recombinantes (por ' ejemplo, casetes de expresión) que se proporcionan en la presente.
En un aspecto, un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se- proporciona en la presente, se ensambla en una fase apropiada con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción del polipéptido traducido o fragmento del mismo.
En una modalidad, se proporcionan en la presente proteínas de fusión y ácidos nucleicos que codifican los mismos. Un polipéptido que se proporciona en la presente se puede fusionar a un péptido o polipéptido heterólogo, tal como péptidos de identificación N-terminales los cuales imparten características deseadas, tales como estabilidad incrementada o purificación simplificada. Los péptidos y polipéptidos que se proporcionan en la presente · también se pueden sintetizar y expresar como proteínas de fusión con uno o más dominios adicionales enlazados a las mismas para, por ejemplo, producir un péptido más inmunógeno, para aislar más fácilmente un péptido sintetizado recombinantemente, para identificar y aislar anticuerpos y células B que expresan anticuerpos, y similares. Los dominios que facilitan la detección y purificación incluyen por ejemplo, péptidos de quelación de metal tales como tractos de polihistidina y módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación con extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA) . La inclusión de una secuencia de enlace escindible, tal como el Factor Xa o secuencias de escisión de enterocinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre un dominio de purificación y el péptido o polipéptido, pueden facilitar la purificación. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica epitopes, enlazada a seis residuos de histidina seguido por una tiorredoxina y un sitio de escisión de enterocinasa (ver por ejemplo, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414) . Los residuos de histidina facilitan la detección y purificación mientras que el sitio de escisión de enterocinasa proporciona un medio para purificar el epitope del resto de la proteína de fusión. La tecnología perteneciente a los vectores que codifican proteínas de fusión y a la aplicación de proteínas de fusión se describen adecuadamente en la literatura científica y literatura de patentes, ver por ejemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53.
Secuencias de control de transcripción y traducción En otra modalidad, se proporcionan en la presente secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARNi, enlazadas operativamente a secuencia (s) de control de expresión (por ejemplo, de traducción o transcripción) , por ejemplo, promotores o intensificadores, para dirigir o modular la síntesis/expresión de AR . La secuencia de control de expresión puede estar en un vector de expresión. Los promotores bacterianos ejemplars incluyen lad, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucariotes ejemplars incluyen CMV inmediato temprano, timidina cinasa de HSV (Virus herpes simple) , SV40 (Virus símico) temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotioneína de ratón.
Los promotores adecuados para expresar un polipéptido en bacterias incluyen los promotores lac o trp de E. coli, el promotor lacl, el promotor lacZ, el promotor T3, el promotor T7, el promotor gpt, el promotor PR ' lambda, el promotor PL lambda, promotores de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como la cinasa de 3-fosfoglicerato (PGK), y el promotor de fosfatase. Los promotores eucariotes incluyen el promotor temprano inmediato del CMV, el promotor de timidina cinasa del HSV, promotores de choque térmico, el promotor SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y el promotor de metalotioneína I de ratón. También pueden utilizarse otros virus conocidos para controlar la expresión de genes en células procariotas y eucariotas o sus virus.
Promotores de Plantas de Tejido Específico En una modalidad, en la presente se proporcionan casetes de expresión que se pueden utilizar en la manera de un tejido específico, por ejemplo, que pueda expresar una hidrolasa que se proporciona en la presente en la manera de un tejido específico. En otra modalidad, se proporcionan en la presente plantas o semillas que expresan una hidrolasa como se proporciona en la presente en la manera de un tejido específico. La especificidad del tejido puede ser de semilla especifica, tallo especifico, hoja especifica, raíz especifica, fruta especifica, y similares.
En un aspecto, se puede utilizar un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S para expresión en partes especificas de la planta o semilla o en toda la planta. Por ejemplo, para la sobre-expresión de una hidrolasa que se proporciona en la presente, se puede emplear un fragmento de promotor de planta el cual dirigirá la expresión de un ácido nucleico en alguno o todos los tejidos de una planta, por ejemplo, una planta regenerada. Tales promotores "constitutivos" son activos bajo la mayoría de condiciones y estados ambientales de desarrollo o diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de transcripción del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1' ó 2' derivado del T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidos para aquellos expertos en la técnica. Tales genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank No. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); el gen que codifica la desaturasa de la proteína portadora de estearoil-acilo de Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physíol. 104:1167-1176); GPcl del maíz (GenBank No. XI 5596; Martínez (1989) J. Mol. Biol 208 : 551-565 ) ; el Gpc2 del maíz (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); promotores de plantas descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,962,028; 5,633,440.
En una modalidad, se proporcionan en la presente promotores de tejidos específicos o promotores constitutivos derivados de virus los cuales pueden incluir, por ejemplo, el promotor subgenómico de tobamovirus (Kumagai (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:1679-1683; el virus baciliforme del tungro del arroz (RTBV) ; el cual se replica solamente en células de floema en plantas de arroz infectadas; con su promotor el cual manipula la expresión genética del indicador del floema específico, fuerte, el promotor del virus del mosaico de la vena (CMV) , con actividad más alta en los elementos vasculares, en las células del parénquima de la hoja, y en las puntas de la raíz (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 1129-1139) .
Alternativamente, el promotor de la planta puede dirigir la expresión de un ácido nucleico que expresa la hidrolasa en un tejido, órgano o tipo de célula específico (es decir, promotores de tejidos específicos) o de otra manera puede ser bajo un control preciso del ambiente o desarrollo o bajo el control de un promotor inducible. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción incluyen condiciones anaeróbicos, temperatura elevada, la presencia de luz, o rociarse con sustancias químicas/hormonas. En una modalidad, en la presente se proporcionan promotor inducibles con sequedad del maíz (Busk (1997) supra) ; el promotor inducible con frío, sequía, y ambiente alto en sal de la papa (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897 909) .
Los promotores de tejido específico pueden promover la transcripción solamente dentro de una cierta trama de tiempo de la etapa de desarrollo dentro de ese tejido. Ver, por ejemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800, que caracteriza el promotor del gen LEAFY de la Arabidopsis . Ver también Cardón (1997) Plant J 12:367-77, que describe 1 factor SPL3 de transcripción, que reconoce una porción conservada de secuencia en la región promotora del gen API de la identidad del meristemo floral de A. thaliana; y Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, pp 995-1004, que describe el promotor eIF4 del meristemo. Se pueden utilizar promotores de tejidos específicos que son activos en todo el ciclo de vida de un tejido particular. En un aspecto, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se enlazan operablemente a un promotor activo principalmente sólo en células de fibra de algodón. En un aspecto, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se enlazan operablemente a un , promotor activo principalmente durante las etapas de alargamiento de las células de fibra de algodón, por ejemplo, como se describe por Rinehart (1996) supra. Los ácidos nucleicos se pueden enlazar operablemente al promotor del gen Fbl2A que preferencialmente se expresa en células de fibra de algodón (Ibid.) . Ver también, John (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., Patentes Norteamericanas Nos. 5,608,148 y 5,602,321, que describen promotores de fibras de algodón especificas y métodos para la construcción de plantas de algodón transgénicas . Los promotores de raices especificas también pueden utilizarse para expresar los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente. Los ejemplos de promotores de raices especificas incluyen: el promotor del gen de deshidrogenasa de alcohol (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 39-60) . Otros promotores que se pueden utilizar para expresar los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente incluyen, por ejemplo, promotores de óvulos específicos, embriones específicos, endospermos específicos, tegumentos específicos, cáscaras ' de la semilla específicas, o alguna combinación de los mismos; un promotor de hoja específico (ver, por ejemplo, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, que describe un promotor de hoja específica en el maíz); el promotor 0RF13 de Agrobacterium rhízogenes (que exhibe alta actividad en las raíces, ver, por ejemplo, Hansen (1997) supra) ; un promotor de polen : específico del maíz (ver, por ejemplo, Guerrero (1990) Mol. Genet . 224:161 168); se puede utilizar un promotor del tomate activo durante la maduración del fruto, senescencia y abscisión de la hojas y, a en un menor grado, de las flores (ver, por ejemplo, Blume (1997) Plant J. 12:731 746); un promotor específico del pistilo del gen SK2 de la papa (ver, por ejemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425 431); el gen Blec4 del guisante, el cual es activo en el tejido epidérmico de los ápices del brote vegetativo y floral de alfalfa transgénica que se vuelve una herramienta útil para enfocar la expresión de genes extraños a la capa epidérmica de ápices o fibras que crecen activamente; el gen BEL1 de óvulos específicos (ver, por 1 ejemplo, Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944); y/o, el promotor en Klee, Patente Norteamericana No. 5,589,583, que describe una región del promotor de planta, es capaz de conferir niveles altos de transcripción en tejido meristemático y/o que divide rápidamente las células.
Alternativamente, los promotores que son inducibles en su exposición a hormonas de plantas, tales como auxinas, se utilizan para expresar los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente. En una modalidad, se proporcionan en la presente promotores que comprende un fragmento del promotor El de elementos de respuesta a la auxina (AuxREs) en la soya (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407); el promotor GST6 de la Arabidopsis que responde a la auxina (también; sensible al ácido salicílico y peróxido de hidrógeno) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); el promotor parC inducible con auxina del tabaco (Sakai (1996) 37:906-913); un elemento de respuesta a la biotina vegetal (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937); y, el promotor que responde al ácido abscisico de la hormona del estrés (Sheen (1996) Science 274:1900-1902) .
Los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente también se pueden enlazar operablemente a promotores de plantas que son inducibles en su exposición a reactivos químicos los cuales se pueden aplicar a la planta, tales como herbicidas o antibióticos. Por ejemplo, el promotor In2-2 del maíz, activado por protectores herbicidas de bencensulfonamida, se puede utilizar (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); la aplicación de diferentes protectores herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en las raíces, hidátodos, y el meristemo apical del brote. Las secuencias de codificación pueden estar bajo el control de, por ejemplo, un promotor inducible con tetraciclina , por ejemplo, como se describe con las plantas de tabaco transgénico que contienen el gen de arginina decarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o, un elemento que responde al ácido salicílico (S.tange (1997) Plant J. 11:1315-1324) . Utilizando promotores inducidos químicamente (por ejemplo, con hormonas o pesticidas), es decir, un promotor que responde a una sustancia química la cual se puede aplicar a la planta transgénica en el campo, la expresión de un polipéptido que se proporciona en la presente se puede inducir en una etapa particular de desarrollo de la planta. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente plantas transgénicas que contienen un gen inducible que codifica los polipéptidos que se proporcionan en la presente cuyo rango de hospedaje se limita e especies de plantas objetivo, tales como el maíz, arroz, cebada, trigo, papa u otros cultivos, inducibles en, cualquier etapa de desarrollo del cultivo.
Los promotores de plantas de tejido especifico pueden manipular la expresión de secuencias enlazadas operablemente en tejidos diferentes al tejido objetivo. Por consiguiente, un promotor de tejido especifico es uno que manipula la expresión preferencialmente en el tejido o tipo de célula objetivo, aunque también puede realizarse en alguna expresión en otros tejidos también.
Los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente también se pueden enlazar operablemente a promotores de plantas que son inducibles en su exposición a reactivos químicos. Estos reactivos incluyen, por ejemplo, herbicidas, auxinas sintéticas, o antibióticos los cuales se pueden aplicar, por ejemplo, rociándose, en plantas transgénicas. La expresión inducible de los ácidos nucleicos que producen hidrolasa que se proporcionan en la presente permitirán al agricultor seleccionar plantas con la relación óptima de almidón : azúcar . El desarrollo de partes de plantas por consiguiente se puede controlar.
En una modalidad, se proporcionan en la presente medios para facilitar la cosecha de plantas y partes de plantas. Por ejemplo, en varias modalidades, se utiliza el promotor In2-2 del maíz, activado mediante protectores herbicidas de bencensulfonamida (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577); la aplicación de diferentes ' protectores herbicidas induce distintos patrones de expresión genética, incluyendo la expresión en las raíces, hidátodos, y el meristemo apical de los brotes. Las secuencias de codificación que se proporcionan en la presente también pueden estar bajo el control de un promotor inducible con tetraciclina, por ejemplo, como se describe con las plantas de tabaco transgénico que contienen el gen de arginina decarboxilasa de Avena sativa L. (avena) (Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473); o, un elemento que responde al ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324) .
Si se desea una expresión de polipéptidos apropiada, deberá incluirse una región de poliadenilacion en el extremo 3' de la región de codificación. La región de poliadenilacion se puede derivar del gen natural, de una variedad de otros de genes de plantas, o de genes en el T-ADN de Agrobacterium. Vectores de expresión y vehículos de clonación En una modalidad, se proporcionan en la presente vectores de expresión, casetes de expresión y vehículos de clonación que comprenden ácidos nucleicos, por ejemplo, secuencias que codifican las hidrolasas y anticuerpos. Los vectores de expresión y vehículos de clonación que se proporcionan en la presente pueden comprender partículas virales, baculovirus, fago, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, cromosomas artificiales de bacterias, ADN viral (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, seudorrabias y derivados de SV40), cromosomas artificiales a base de Pl, plásmidos de levaduras, y cualquier otro vector específico para los hospederos específicos de interés (tales como bacilos, Aspergillus y levaduras) . Los vectores que se proporcionan en la presente pueden influir secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los grandes números de vectores adecuados son conocidos para aquellos expertos en la técnica, y están disponibles comercialmente. Los vectores de ejemplo incluyen bacterianos: vectores pQE (QÍagen) , plásmidos pBLUESCRIPT™, vectores pNH, (vectores lambda-ZAP (Stratagene) ; ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariontes: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia) . Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido u otro vector siempre que los mismos sean replicables y viables en el hospedero. Puede emplearse un número bajo de copias o número alto de copias de vectores.
En una modalidad, un "cásete de expresión" como se proporciona en la presente , comprende una secuencia de nucleótidos que sea capaz de efectuar la expresión de un gen estructural (es decir, una secuencia de codificación de proteínas, tal como una hidrolasa que se proporciona en la presente) en un hospedero compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión incluyen al menos un promotor enlazado operablemente con la secuencia de codificación de polipéptidos ; y, opcionalmente, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de transcripción. También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo, intensificadores . "Enlazado operablemente" como se utiliza en la presente se refiere a un enlace de un promotor corriente arriba de una secuencia de ADN de tal manera que el promotor medie la transcripción de la secuencia de ADN. Por consiguiente, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes-, cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante , y similares. Un "vector" comprende un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir temporal o permanentemente una célula. Se reconocerá que un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico con complejo de proteína o lípido. El vector opcionalmente comprende ácidos nucleicos virales y bacterianos y/o proteínas y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura de lípidos virales, etc.) . Los vectores incluyen, pero no están limitados a replicones (por ejemplo, replicones de ARN, bacteriófagos) a los cuales pueden anexarse fragmentos de ADN y replicarse. Los vectores por consiguiente incluyen, pero no están limitados a ARN, ADN o ARN circular o lineal auto-replicante, autónomo (por ejemplo, plásmidos, virus, y similares, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,217,879), e incluye plásmidos tanto de expresión como no expresión. Cuando un microorganismo recombinante o cultivo de células se describe que hospeda un "vector de expresión" que incluye ADN circular y lineal extra-cromosómico y ADN que ha sido incorporado en el (los) cromosoma (s) hospedero (s) . Cuando un vector que se mantiene por una célula hospedera, el vector puede ya sea replicarse de manera estable, mediante por medio de las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o incorporarse dentro del genoma del hospedero.
El vector de expresión puede comprender un promotor, un sitio de enlace de ribosomas para iniciación de traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede, incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Los vectores de expresión mamífera puede comprender un origen de replicación, cualquier sitio necesario de enlace de ribosomas, un sitio de poliadénilación, donador de empalme y sitios aceptores, secuencias de terminación de transcripción, y secuencias no transcritas de flanqueo 5' . En algunos aspectos, pueden utilizarse secuencias de ADN derivadas del empalme SV40 y sitios de poliadenilación para proporcionar los elementos genéticos, no transcritos, requeridos .
En un aspecto, los vectores de expresión contienen uno o más genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células hospederas que contienen el vector. Tales marcadores seleccionables incluyen genes que codifican la dihidrofolato reductasa o genes que confieren resistencia a la neomicina al cultivo de células eucariotas, genes que confieren resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli, y el gen TRP1 de S. cerevisiae. Se pueden seleccionar regiones promotoras de cualquier gen deseado utilizando vectores de cloranfenicol transferasa (CAT) u otros vectores con marcadores seleccionables.
Los vectores para expresar el polipéptido o fragmento del mismo en células eucariotas también pueden contener intensificadores para incrementar los niveles de expresión. Los intensificadores son elementos que actúan en cis de ADN, de manera usual desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 bp (pares base) de longitud que actúan en un promotor para incrementar .su transcripción. Los ejemplos incluyen el intensificador SV40 en el lado posterior del origen de replicación de bp 100 a 270, el intensificador promotor temprano de citomegalovirus , el intensificador de polioma en el lado final o tardío del origen de replicación, y los intensificadores de adenóvirus.
Una secuencia de ADN puede insertarse en un vector •mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se liga a la posición deseada en el vector que sigue de la digestión del inserto y el vector con endonucleasas de restricción apropiadas. Alternativamente, pueden ligarse extremos romos tanto en el inserto como en el vector. Una variedad de técnicas de clonación son conocidas en el arte, como se describe en Ausubel y Sambrook. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica.
El vector puede estar eri la forma de un plásmido, una partícula viral, o un fago. Otros vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, derivados de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de pago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmido y ADN de fago, ADN viral tales como vaccinia, adenóvirus, virus dé viruela aviar, y seudorrabias . Una variedad de vectores de clonación y expresión para usarse con hospederos procariontes y eucariontes, se describe por, por ejemplo, Sambrook.
Los vectores bacterianos particulares que pueden utilizarse incluyen los plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) , GEMI™ (Promega Biotec, Madison, I, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pDlO, psiX174 Pbluescript II KS™, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene) , ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR40, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 y pCM7. Los vectores eucariotas particulares incluyen 2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro vector siempre que el mismo sea replicable y viable en la célula hospedera.
Los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se pueden expresar en casetes de expresión, vectores o virus y expresarse temporal o establemente en células y semillas de plantas. Un sistema de expresión temporal, ejemplar, utiliza sistemas de expresión episomal, por ejemplo, ARN viral del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) que contienen ADN superenrollado, ver, por ejemplo, Covey (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Alternativamente, las secuencias de codificación, es decir, la totalidad o sub-fragmentos de secuencias que se proporcionan en la presente se pueden insertar en un genoma de células hospederas de plantas que se vuelven una parte integral del ADN cromosomico hospedero. Los transcriptos sentido o antiseritido se pueden expresar de esta manera. Un vector que comprende las secuencias (por ejemplo, promotores o regiones de codificación) de ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente, pueden comprender un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable en una célula de planta o una semilla. Por ejemplo, el marcador puede codificar la resistencia al biocida, particularmente resistencia a antibióticos, tales como la resistencia a la kanamicina, resistencia a G418, bleomicina, higromicina, o herbicida, tal como la resistencia al clorosulforón o Basta.
Los vectores de expresión capaces de expresar ácidos nucleicos y proteínas en plantas son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir por ejemplo, vectores de Agrobacterium spp., virus X de la papa (ver, por ejemplo, Angelí (1997) E BO J. 16:3675-3684), virus del mosaico del tabaco (ver, por ejemplo, Casper (1996) Gene 173:69-73), virus del achaparrado del tomate (ver, por ejemplo, Hillman (1989) Virology 169:42-50), virus del grabado del tabaco (ver, por ejemplo, Dolja (1997) Virology 234:243-252), virus del mosaico dorado del frijol (ver, por ejemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476), virus del mosaico de la coliflor (ver, por ejemplo, Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento invertible Ac/Ds del maíz (ver, por ejemplo, Rubín (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), y el elemento invertible del supresor-mutágeno (Spm) del maíz (ver, por ejemplo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32: 17-725); y derivados de los mismos.
En un aspecto, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación para permitir que el mismo se mantenga en dos organismos, por ejemplo en células de mamíferos, levaduras, hongos o insectos para expresión y en un hospedero procariota para clonación y amplificación. Además, para integrar vectores de expresión, el vector de expresión puede contener al menos una secuencia homologa al genoma de células hospederas. El mismo puede contener dos secuencias homologas que flanquean el constructo de expresión. El vector de integración se puede dirigir a un locus específico en la célula hospedera seleccionando la secuencia homologa apropiada para su inclusión en el vector. Los constructos para integrar ¡vectores son bien conocidos en la técnica.
Los vectores de expresión que se proporcionan en la presente también pueden incluir un gen marcador seleccionable para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas, por ejemplo, genes que producen las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol , eritromicina, kanamicina, neomicina, y tetraciclina . Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como aquéllos en las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.
Células hospederas y células transformadas En una modalidad, se proporcionan en la presente células transformadas que comprenden una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia que codifica una hidrolasa o un anticuerpo, o un vector que se proporciona en la presente. La célula hospedera puede ser cualquiera de las células hospederas familiares para aquellos expertos en la técnica, que incluyen células procariotas, células eucariotas, tales como células bacterianas, células fúngicas, células de levaduras, células de mamíferos, células de insectos, o células de plantas.
Las enzimas que se proporcionan en la presente se pueden expresar en cualquier célula hospedera, por ejemplo, cualquier célula bacteriana, cualquier célula de levadura, cualquier Saccharomyces o Schizosaccharomyces spp., cualquier Pichia spp., por ejemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe. Las células bacterianas ejemplars incluyen cualquier Streptomyces o Bacillus spp., por ejemplo, E. coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium o cualquier especie dentro del género Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus . Las células de insectos ejemplars incluyen Drosophila S2 y Spodoptera Sf9. Las células de animales ejemplars incluyen CHO, COS o melanoma de Bowes o cualquier línea de células de ratón o humano. La selección de un hospedero apropiado dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y se describen en la literatura técnica y científica. Ver, por ejemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet . 22:421-477, Patente Norteamericana No. 5,750,870.
El vector puede introducirse en las células hospederas utilizando cualquiera de una variedad de técnicas, incluyendo la transformación, transíección, transducción, infección viral, pistolas genéticas, o transferencia de genes mediada con Ti. Los métodos particulares incluyen transfección con fosfato de calcio, transferencia mediada con DEAE-Dextrano, lipofección, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) .
Cuando es apropiado, las células hospederas diseñadas se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados que son apropiados para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que se proporcionan en la presente. La siguiente transformación de una cepa hospedera adecuada y crecimiento de la cepa hospedera a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado puede inducirse con medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células pueden cultivarse durante un período adicional para permitir a las mismas producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.
En un aspecto, los ácidos nucleicos o vectores que se proporcionan en la presente se , introducen en las células para selección, por consiguiente, los ácidos nucleicos entran a las células de una manera adecuada para la subsecuente expresión del ácido nucleico. El método de introducción se dicta mayormente por el tipo de célula objetivo. Los métodos ejemplars incluyen precipitación con CaP04, precipitación, fusión de liposomas, lipofección (por ejemplo, LIPOFECTIN™) , electroporacion, infección viral, etc. Los ácidos nucleicos candidatos pueden integrarse de manera estable en el genoma de la célula hospedera (por ejemplo, con introducción retrovirica) o puede existir ya sea temporal o establemente en el citoplasma (es decir a través del uso de plásmidos tradicionales, utilizando secuencias reguladoras estándar, marcadores de selección, etc.). Las modalidades alternativas comprenden vectores retroviricos capaces de transfectar tales objetivos (por ejemplo, células de mamífero, humano) debido a que, por ejemplo, muchas selecciones farmacéuticamente importantes requieren objetivos de células humanas o de mamífero modelo.
Las células se pueden cosechar mediante centrifugación, alterarse con medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se mantiene para: purificación adicional. Las células microbianas empleadas para la expresión de proteínas se pueden alterar por medio de un método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica, o el uso de agentes de lisis celular. Tales métodos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. El polipéptido expresado o fragmento del mismo se puede recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa , cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Se pueden utilizar etapas de redoblamiento proteínico, cuando sea necesario, para completar la configuración del polipéptido. Si se desea, se puede emplear cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para etapas de purificación final.
También se pueden emplear varios sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono y otras líneas de células capaces de expresar proteínas de un vector compatible, tal como las líneas de células C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK.
Los constructos en células hospederas se pueden utilizar de una manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante . Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos producidos por las células hospederas que contienen el vector pueden glicosilarse o pueden no glicosilarse. Los polipéptidos que se proporcionan en la presente pueden o no pueden también incluir un residuo de aminoácido de metionina inicial.
También se pueden emplear sistemas de traducción libres de células para producir un polipéptido que se proporciona en la presente. Los sistemas de traducción libres de células pueden utilizar ARNms transcritos desde un constructo de ADN que comprende un promotor enlazado operablemente a un ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento del mismo. En algunos aspectos, el constructo de ADN puede linearizarse antes de realizar una reacción de transcripción in vitro. El ARNm transcrito se incuba entonces con un extracto de traducción libre de células, apropiado, tal como un extracto de reticulocitos de conejo, para producir el polipéptido deseado o fragmento del mismo.
Los vectores de expresión pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotipico para la selección de células hospederas transformadas tal como resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomicina para cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E . coli .
Amplificación de Ácidos Nucleicos En otra modalidad, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos , o se pueden producir ácidos nucleicos modificados, por ejemplo, mediante amplificación. En una modalidad, se proporcionan en la presente pares cebadores de amplificación para amplificar ácidos nucleicos que codifican una hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o esteratasa, donde los pares cebadores son capaces de amplificar las secuencias de ácido nucleico que se proporcionan en la presente. Un experto en la técnica puede diseñar pares de secuencia de cebadores de amplificación para cualquier parte de una longitud completa de estas secuencias.
Las reacciones de amplificación también se pueden utilizar para cuantificar la cantidad de ácido nucleico en una muestra (tal como la cantidad de mensaje en una muestra de célula) , etiquetar el ácido nucleico (por ejemplo, aplicarlo en un arreglo o un manchado) , detectar el ácido nucleico, o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico especifico en una muestra. En un aspecto que se proporciona en la presente, se amplifica el mensaje aislado de una célula o una genoteca de ADNc. El experto puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación de oligonucléotidos adecuados. Los métodos de amplificación también son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa, PCR (ver, por ejemplo, PCR PR0T0C0LS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena con ligasa (LCR) (ver, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificación de transcripción (ver, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:1173); y, replicación de secuencia auto-sostenida (ver, por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificación con Q Beta replicasa (ver, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación automática con Q-beta replicasa (ver, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas con polimerasa de ARN (por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, 1 Ontario) ; ver también Berger (1987) ethods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; Patentes Norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.
En una modalidad, se proporcionan en la presente pares cebadores que comprenden secuencias que se proporcionan en la presente, por ejemplo,, en donde el par cebador comprende un primer miembro que tiene una secuencia que se establece aproximadamente por los primeros (el 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 ó más residuos de un ácido nucleico que se proporciona en la presente, y un segundo miembro que tiene una secuencia que se establece aproximadamente por los primeros (el 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 ó más residuos de la hebra complementaria del primer miembro.
Determinación del grado de identidad de secuencia En una modalidad, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que tienen al menos ácido nucleico, o identidad de secuencia (100%) con un ácido nucleico que se proporciona en la presente, por ejemplo, un ácido nucleico ejemplar que se proporciona en la presente (por ejemplo, que tiene una secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 Ó SEQ ID NO: 23, ó SEQ ID NO: 1 modificada para codificar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones base descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas) ; y polipéptidos que tienen al menos una identidad de secuencia del 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó más, o completa (100%) con un polipéptido que se proporciona en la presente, por ejemplo, un polipéptido ejemplar que tiene una secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, S EQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 12, S EQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ó SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones ácidas descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas) . En aspectos alternativos, la identidad de secuencia puede ser sobre una región de al menos aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más residuos consecutivos, o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. El grado de identidad de secuencia (homología) puede determinarse utilizando cualquier programa informático y parámetros asociados, incluyendo aquéllos descritos en la presente, tales como BLAST 2.2.2. ó FASTA versión 3.0t78, con los parámetros predeterminados. Cuando se utilizan en la i presente, los términos "computadora", "programa de computadora" y "procesador" se utilizan en sus contexto generales más amplios e incorporan la totalidad de tales dispositivos, que se describen con detalle, más adelante.
La tabla posterior describe características seleccionadas de ácidos nucleicos ejemplares y polipéptidos que se proporcionan en la presente, incluyendo la comparación de identidad de secuencia de las secuencias ejemplares con bases de datos públicas para identificar la actividad de las enzimas que se proporcionan en la presente mediante análisis de homología (identidad de secuencia) . Todas las secuencias descritas en la tabla (todas las secuencias ejemplares que se proporcionan en la presente) se han sometido a una búsqueda BLAST (como SE describe con detalle, más adelante) contra dos conjuntos de bases de datos. El primer conjunto de base de datos se establece a través de NCBI (Centro Nacional de Información de Biotecnología) < Todos los resultados de las búsquedas contra estas bases de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripción NR", "Código de Acceso NR", "valor E NR" u "Organismo NR". "NR" se refiere a la base de datos de nucleótidos No Redundantes mantenida por NCBI. Esta base de datos es una combinación de GenBank, actualizaciones de GenBank, y actualizaciones EMBL. Las. entradas de datos en la columna "Descripción NR" se refieren a la línea de definición en cualquier registro NCBI dado, el cual incluye una descripción de la secuencia, tal como el organismo fuente, nombre del gen/nombre de la proteína, o alguna descripción de la función de la secuencia - identificando por consiguiente una actividad de las enzimas ejemplares listadas que se proporcionan en la presente mediante análisis de homología (identidad de secuencia) . Las entradas de datos en la columna "Código de Acceso NR" se refieren al identificador único dado a un registro de secuencia. Las entradas de datos en la columna "Valor E de NR" se refieren al Valor esperado (Valor E) , que representa la probabilidad de que una puntuación de alineación sea tan buena como una encontrada entre la secuencia de consulta (las secuencias que se proporcionan en la presente) y una secuencia de base de datos podría encontrarse en el mismo número de comparaciones entre las secuencias aleatorias que se hizo en la presente búsqueda BLAST . Las entradas de datos en la columna "Organismo NR" se refieren al organismo fuente de la secuencia identificada como el acierto BLAST más cercano (homología de secuencia) . El segundo conjunto de bases de datos es conocido colectivamente como la base de datos GENESEQ™, la cual está disponible a través de Thomson Derwent ( Philadelphia, PA) . Todos los resultados de las búsquedas contra esta base de datos se encuentran en las columnas tituladas "Descripción de Proteína GENESEQ™", "Código de Acceso de la Proteína GENESEQ™" , "Valor E de la Proteína GENESEQ™", "Descripción del ADN GENESEQ™", Código de Acceso del ADN GENESEQ™" o "Valor E del ADN GENESEQ™". La información encontrada en estas columnas es comparable con la información encontrada en las columnas NR descritas anteriormente, excepto que la misma se derivó de las búsquedas BLAST contra la base de datos GENESEQ™ en vez de las bases de datos NCBI . Las columnas "Longitud del ADN de Consulta" y "Longitud de la Proteina de Consulta" se refieren al número ce nucleótidos o el número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia como se proporciona en la presente que se buscó o consultó contra cualquiera de las bases de datos NCBI o GENESEQ™. Las columnas "Longitud de ADN GENESEQ™ o NR" y "Longitud de Proteina GENESEQ™ o NR" se refieren al número de nucleótidos o el número de aminoácidos, respectivamente, en la secuencia de la coincidencia máxima de la búsqueda BLAST. Los resultados se proporcionan en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valor E más bajo, ya sea de las bases de datos NCI o la base de datos Geneseq. Las columnas "% de ID de Proteina GENESEQ™/NR" y "% de ID del ADN GENESEQ™/NR" se refiere al porcentaje de identidad de secuencia entre la secuencia que se proporciona en la presente y la secuencia de la coincidencia máxima de BLAST. Los resultados provistos en estas columnas son de la búsqueda que devolvió el valor E más¦¦ bajo, ya sea de las bases de datos NCBI o la base de datos GENESEQ™.
Las secuencias homologas también incluyen secuencias de ARN en las cuales las uridinas reemplazan las timinas en las secuencias de ácido nucleico. La secuencia homologa puede obtenerse utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en la presente o puede dar como resultado la corrección de un error de secuenciación . Se apreciará que las secuencias de ácido nucleico que se establecen en la presente se pueden representar en el formato tradicional de un solo carácter (ver, por ejemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd Ed., W. H Freeman & Co . , New York), o en cualquier otro formato que registre la identidad de los nucleótidos en una secuencia .
Se pueden utilizar varios programas de comparación de secuencias identificados en la presente y conocidos para un experto en la técnica para la comparación de secuencias. Las identidades (homologías) de secuencia de proteínas y/o ácido nucleico y programas conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no están limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 (8) : 2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3) : 03-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22 (2) : 4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (3) : 403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993) .
La homología o identidad se puede medir utilizando programa informático de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, I 53705) . Tal programa informático coteja secuencias similares asignando grados de homología a varias eliminaciones, sustituciones y otras modificaciones. Los términos "homología" e "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos , se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son iguales cuando se comparan y alinean para un máximo de correspondencia por encima de una ventana de comparación o región designada que se mide utilizando cualquier número de algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Para la comparación de secuencias, una secuencia puede actuar como una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos ejemplar que se proporciona en la presente) con la cual se comparan las secuencias de análisis). Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de análisis y referencia se ingresan en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar parámetros del programa preestablecidos o se puede designar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de análisis relacionadas con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación" que se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera de los números de residuos contiguos. Por ejemplo, en los aspectos alternativos que se proporcionan en la presente, los residuos contiguos que varían donde sea desde 20 a la longitud completa de un polipéptido ejemplar o secuencia de ácido nucleico, se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Si la secuencia de referencia tiene la identidad de secuencia requerida para una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos, ejemplar, por ejemplo, en aspectos alternativos, una identidad de secuencia del 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó más, o completa (100%) con una secuencia ejemplar de ácidos nucleicos o polipéptidos que se proporciona en la presente, esa secuencia está dentro del alcance que se proporciona en la presente. En modalidades alternativas, las subsecuencias que varían desde aproximadamente 200 hasta 600, desde aproximadamente 50 hasta 200, y desde aproximadamente 100 hasta 150, se comparan con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineación de secuencia para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & aterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante la búsqueda del método de similitud de Person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Programas isconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, I), o mediante alineación manual e inspección, visual. Otros algoritmos para determinar la homología o identidad incluyen, por ejemplo, además de un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information) , ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences) , AMPS (Protein Múltiple Sequence Alignment) , ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node) , BLIMPS (BLocks IMProved Searcher) , FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, CONSENSUS, algoritmo Smith-Waterman, DARWIN, algoritmo Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program) , GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison) , LALIGN (Local Sequence Alignment) , LCP (Local Content Program) , MACAW (Múltiple Alignment Construction & Analysis Workbench) , MAP (Múltiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA ( Pattern-Induced Multi-sequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) y WHAT-IF. También se pueden utilizar tales programas de alineación para seleccionar bases de datos para identificar secuencias de ( polinucleótidos que tengan secuencias sustancialmente idénticas. Está disponible un número de bases de datos de genomas, por ejemplo, una porción sustancial del genoma humano está disponible como parte del Proyecto de Secuenciación del Genoma Humano (Gibbs, 1995) . Se han secuenciado varios genomas, por ejemplo, M. genitalium (Fraser et al., 1995), M. jannaschii (Bult et al., 1996), H. influenzae (Fleischmann et al., 1995), E. coli (Blattner et al., 1997), y levadura (S. cerevisiae) (Mewes et al., 1997), y D. melanogaster (Adams et al., 2000) . También se ha hecho un progreso significativo en la secuenciación de los genomas de organismos modelo, tales como ratón, C. elegans, y Arabadopsis sp. Las bases de datos que contienen información genómica anotada con alguna información funcional, son mantenidas por diferentes organizaciones, y son accesibles a través de internet.
También se utilizan algoritmos BLAST, BLAST 2.0 y BLAST 2.2.2. Los mismos se describen, por ejemplo, en Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 403-410. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología. Este algoritmo involucra primer identificar pares de secuencia de puntuación elevada (HSPs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que ya sea coincidan o cumplan alguna puntuación T de umbral valuado positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se menciona como el umbral de puntuación de palabra de proximidad (Altschul (1990) supra) . Estos aciertos de proximidad inicial actúan como simientes para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que contienen los mismos. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta el grado en que la puntuación de alineación acumulativa se pueda incrementar. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >Q) . Para secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye por la cantidad X de su valor logrado máximo; la puntuación acumulativa va de cero o por debajo, debido a que la acumulación de una o más alineaciones de residuos con puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como operaciones por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas tendencias. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como operaciones por defecto una longitud de palabra de 3, y expectativas (E) de 10, y las alineaciones (B) de la matriz de puntuación (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:10915) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas tendencias. El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873) . Una medida de similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos podría ocurrir por casualidad. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a ;una secuencia de referencia si la probabilidad de suma es más pequeña en una comparación del ácido nucleico de análisis con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0.2, o de manera alternativa, menos de aproximadamente 0.01, o de manera alternativa, menos de aproximadamente 0.001.
En un aspecto, las homologías se secuencias de proteínas y ácidos nucleicos se evalúan utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica ("BLAST") . Por ejemplo, se pueden utilizar cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea: (1) BLASTP y BLAST3 compara una secuencia de consulta de aminoácidos contra una base de datos de consulta de aminoácidos contra una base de secuencia de proteínas; (2) BLASTN compara una secuencia de consulta de nucleótidos contra una base de datos de secuencia de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos o ; cuadros de una secuencia de nucleótidos de consulta (ambas tendencias) contra una base de datos de secuencia de proteínas; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteínas de consulta contra una base de datos de secuencia de nucleótidos traslada en todos los seis marcos de lectura (ambas tendencias); .y (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos contra las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencia de nucleótidos.
En un aspecto, los programas BLAST identifican secuencias homologas identificando segmentos similares, los cuales se mencionan en la presente como "pares de segmento de alta puntuación", entre una secuencia de amino o ácido nucleico de consulta y una secuencia de análisis la cual se obtiene alternativamente de una base de datos de secuencia de proteínas o ácidos nucleicos. Los pares de segmento de alta puntuación se pueden identificar alternativamente (es decir, alinearse) por medio de una matriz de puntuación, muchos de los cuales son conocidos en la técnica. En un aspecto, la matriz de puntuación utilizada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., Science 256:1443-1445, 1992; Henikoff y Henikoff, Proteins 17:49-61, 1993). En un aspecto, también pueden utilizarse matrices PAM ó PAM250 (ver, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds . , 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
En un aspecto, para determinar si un ácido nucleico tiene la identidad de secuencia requerida que está dentro del alcance que se proporciona en la presente, se utiliza el programa NCBI BLAST 2.2.2, opciones predeterminadas para blastp. Existen aproximadamente 38 opciones de configuración en el programa BLAST 2.2.2. En esta característica ejemplar que se proporciona en la presente, se utilizan todos los valores predeterminados excepto¦ la configuración de filtración predeterminada (es decir, todos los parámetros se establecen como predeterminados excepto . la filtración la cual se establece como OFF (desactivado) ; en su lugar se utiliza una configuración "-F F", la cual desactiva la filtración. El uso de filtración predeterminada frecuentemente da como resultado infracciones Karlin-Atschul debido a la longitud corta de la secuencia.
Los valores predeterminados utilizados en esta característica ejemplar que se' proporcionan en la presente, incluyen: "Filtro de baja complejidad": ACTIVADO (ON) Tamaño de Palabra: 3 Matriz: Blosum62 Costos de Espacios Vacíos: Existencia: 11 Extensión: 1" Otras configuraciones predeterminadas son: filtro para baja complejidad OFF, tamaño de palabra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidad de existencia de vacíos de -11 y una penalidad de extensión , de vacíos de -1. En una característica, la opción "-W" se predetermina a 0. Esto significa que, sin o se establece, el tamaño de palabra se predetermina a 3 para proteínas , y 11 para nucleótidos.
Sistemas informáticos y productos de programa informáticos Para determinar e identificar identidades de secuencia, homologías estructurales, porciones y similares in silico (hechas por computadora) , la secuencia que se proporciona en la presente se puede almacenar, registrar, y manipular en cualquier medio que se pueda leer e ingresar con una computadora. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente computadoras, sistemas informáticos, medios legibles en computadora, productos de programas informáticos y similares, que contienen los mismos (que comprende) secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos que se proporcionan en la presente registradas o almacenadas en los mismos. Cuando se utilizan en la presente, las palabras "registrado" y "almacenado" se refieren a un proceso para almacenar información en un medio informático. Un experto en la técnica se puede adoptar fácilmente cualquier método conocido para registrar la información en un medio legible en computadora para generar fabricantes que comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos y/o polipéptidos que se proporcionan en la presente .
Otro aspecto que se proporciona en la presente es un medio legible en computadora que tiene registrada en el mismo al menos una secuencia de ácidos nucleicos y/o polipéptidos que se proporcionan en la presente. Los medios legibles en computadora incluyen medios legibles magnéticamente, medios legibles ópticamente, medios legibles electrónicamente y medios magnéticos/ópticos. Por ejemplo, los medios legibles en computadora pueden ser disco duro, un disco flexible, una cinta magnética, CD-ROM (Disco Compacto de Sólo Lectura), Disco Digital Versátil (DVD) , Memoria de Acceso Aleatorio (RAM) , o Memoria de Sólo Lectura (ROM) asi como con otros tipos de otros medios conocidos para aquellos expertos en la técnica .
Los aspectos que se proporcionan en la presente incluyen sistemas (por ejemplo, sistemas a través de internet), particularmente sistemas informáticos, que almacenan y manipulan las secuencias e información de secuencia descrita en la presente. Un ejemplo de un sistema 100 computarizado se ilustra en forma de diagrama de bloques en la Figura 1. Cuando se utiliza en la presente, "un sistema computarizado" se refiere a los componentes del equipo, componentes de programas informáticos, y componentes de almacenamiento de datos utilizados para analizar una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que se proporcionan en la presente. El sistema 100 computarizado puede incluir un procesador para procesar, ingresar y manipular los datos de secuencia. El procesador 105 puede ser cualquier tipo bien conocido de unidad de procesamiento central, tal como> por ejemplo, el Pentium III de Intel Corporation, o procesador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD or International Business Machines. El sistema 100 computarizado es un sistema de propósitos generales que comprende el procesador 105 y uno o más componentes 110 de almacenamiento de datos internos para almacenar datos, y uno o más dispositivos de recuperación de datos para recuperar los datos almacenados en los componentes de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que son adecuados cualquiera de los sistemas informáticos actualmente disponibles.
En un aspecto, el sistema 100 computarizado incluye un procesador 105 conectado a un enlace común que está conectado a una memoria 115 principal (alternativamente implementada como RAM) y uno o más dispositivos 110 de almacenamiento de datos internos, tal como una unidad o lector de disco duro y/u otro medio legible en computadora que tiene datos registrados en los mismos. El sistema 100 computarizado puede incluir además uno o más dispositivos 118 de recuperación de datos para leer los datos almacenados en los dispositivos 110 de almacenamiento de datos internos. El dispositivo 118 de recuperación de datos puede representar, por ejemplo, una unidad de disco flexible, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta magnética, o un módem capaz de conexión a un sistema remoto de almacenamiento de datos (por ejemplo, a través de internet) etc. En algunas modalidades, el dispositivo 110 interno de almacenamiento de datos es un medio legible en computadora, extraible, tal como un disco flexible, un disco compacto, una cinta magnética, etc., que contiene lógica de control y/o datos registrados en el mismo. El sistema 100 computarizado puede incluir venta osamente o programarse mediante un programa informático apropiado para leer la lógica de control y/o los datos del componente de almacenamiento de dato una vez insertado en el dispositivo de recuperación de datos. El sistema 100 computarizado incluye una pantalla 120 la cual se utiliza para mostrar la salida de datos a un usuario de computadora. También deberá observarse que el sistema 100 computarizado se puede enlazar a otros sistemas 125a-c informáticos en una red o red de área amplia para proporcionar acceso centralizado al sistema 100 computarizado. El programa informático para ingresar y procesar las secuencias de nucleótidos o aminoácidos que se proporciona en la presente, puede residir en la memoria 115 principal durante su ejecución. En algunos aspectos, el sistema 100 computarizado puede comprender además un algoritmo de comparación de secuencias para comparar una secuencia de ácidos nucleicos que se proporciona en la presente. Un "algoritmo de comparación de secuencias" se refiere a uno o más programas que se implementan (local o remotamente) en el sistema 100 computarizado para comparar una secuencia de nucleótidos con otras secuencias de nucleótidos y/o compuestos almacenados dentro de un medio almacenamiento de datos. Por ejemplo, el algoritmo de comparación de secuencias puede comparar las secuencias de nucleótidos que se proporcionan en la presente, almacenarse en un medio legible en computadora para secuencias de referencia almacenadas en un medio legible en computadora para identificar homologías o porciones estructurales .
Los parámetros utilizados con los algoritmos anteriores pueden adaptarse dependiendo de la longitud de secuencia y grado de homología estudiada. En algunos aspectos, los parámetros pueden ser los parámetros predeterminados utilizados por los algoritmos en la ausencia de instrucciones del usuario. La Figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra un aspecto de un proceso 200 para comparar una nueva secuencia de nucleotidos o proteínas con base de datos de secuencias con el fin de determinar los niveles de homología entre la nueva secuencia y las secuencias en la base de datos. La base de datos de secuencias puede ser una base de datos privada almacenada dentro del sistema 100 computarizado, o una base de datos pública tal como GENBANK que está disponible a través de internet. El proceso 200 comienza en un estado 201 de inicio y luego pasa a un estado 202 en donde la nueva secuencia a compararse se almacena en una memoria en un sistema 100 computarizado. Como se discute anteriormente, la memoria podría ser cualquier tipo de memoria, incluyendo la RAM o un dispositivo de almacenamiento interno. El proceso 200 pasa entonces a un estado 204 en donde una base de datos de secuencias se abre para análisis y comparación. El proceso 20 pasa entonces a un estado 206 en donde la primera secuencia almacenada en la base de datos se lee en una memoria en la computadora. Una comparación se realiza entonces en un estado 210 para determinar si la primera secuencia es la misma que la segunda secuencia. Es importante observar que esta etapa no se limita a realizar una comparación,.' exacta entre la nueva secuencia y la primera secuencia en la base de datos. Los métodos bien conocidos son reconocidos por aquellos expertos en la técnica por comparar dos secuencias de nucleótidos o proteínas, incluso si los mismos no son idénticos. Por ejemplo, se pueden introducir vacíos en una secuencia con el fin de aumentar el nivel de homología entre las dos secuencias analizadas. Los parámetros que controlan si se introducen vacíos u otras características en una secuencia durante la comparación, normalmente se ingresan por el usuario del sistema computarizado . Una vez que se ha realizado una comparación de las dos secuencias en el estado 210, se hace una determinar en un estado 210 de decisión donde las dos secuencias son iguales. Por supuesto, el término "igual" no se limita a secuencias que son absolutamente idénticas. Las secuencias que están dentro de los parámetros de homología ingresados por el usuario se marcarán como "iguales" en el proceso 200. Si se hace una determinación de que las dos secuencias son iguales, el proceso 200 pasa a un estado 214 en donde el nombre de. la secuencia de la base de datos es mostrado al usuario. Este estado notifica al usuario que la secuencia con el nombre mostrado cumple las limitaciones de homología que se ingresaron. Una vez que el nombre de la secuencia almacenada se muestra al usuario, el proceso 200 pasa a un estado 218 de decisión en donde se hace una determinación de si existen más secuencias en la base de datos. Si no existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 termina en un estado 220 final. Sin embargo, si existen más secuencias en la base de datos, entonces el proceso 200 pasa a un estado 224 en donde un punto indicador se mueve a la siguiente secuencia en la base de datos de modo que la misma se pueda comparar con la nueva secuencia. De esta manera, la nueva secuencia se alinea y compara con cada secuencia en la base de datos. Deberá observarse que si se ha hecho una determinación en el estado 212 de decisión que la secuencias no fueron homologas, entonces el proceso 200 podría pasar inmediatamente al estado 218 de decisión con el fin de determinar si estaba disponible cualquier otra secuencia en la base de datos para comparación. De acuerdo con esto, un aspecto que se proporciona en la presente es un sistema computarizado que comprende un procesador, un dispositivo de almacenamiento de datos que tiene almacenada en el mismo una secuencia de ácido nucleico que se proporciona en la presente y un comparador de secuencias para realizar la comparación. El comparador de secuencias puede indicar un nivel de homología entre las secuencias comparadas o identificar porciones estructuras, o puede identificar porciones estructurales en secuencias que se comparan con estos códigos de ácido nucleico y códigos de polipéptidos . La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra una modalidad de un proceso 250 en una computadora para determinar si dos secuencias son homologas. El proceso 250 comienza en un estado 252 de inicio y luego pasa a un estado 254 en donde una primera secuencia a compararse se almacena en una memoria. La segunda secuencia a compararse se almacena entonces en una memoria en un estado 256. El proceso 250 pasa entonces a un estado 260 en donde el primer carácter en la primera secuencia se lee y luego a un estado 262 en donde se lee el primer carácter de la segunda secuencia. Deberá entenderse que si la secuencia es una secuencia de nucleótidos, luego el carácter normalmente podría ser cualquiera de A, T, C, G ó U. Si la secuencia es una secuencia de proteínas, entonces la misma puede ser un código de aminoácido de una sola letra de modo que la primera y segunda secuencias se puedan comparar fácilmente. Se hace entonces una determinación en un estado 264 de decisión donde los dos caracteres son iguales. Si son iguales, entonces el proceso 250 pasa a un estado 268 en donde se leen los siguientes caracteres en la primera y segunda secuencias. Una determinación se hace entonces si los siguientes caracteres son iguales. Si los mismos son, entonces el proceso 250 continúa este bucle hasta que los dos caracteres no son iguales. Si se hace una determinación de que los siguientes dos caracteres no son iguales, el proceso 250 pasa a un estado 274 de decisión para determinar si hay más caracteres en cualquier secuencia por leer. Si no hay más caracteres para leer, entonces el proceso 250 pasa a un estado 276 en donde el nivel de homología entre la primera y segunda secuencia se muestra al usuario. El nivel de homología se determina calculando la proporción de caracteres entre las secuencias que son iguales del número total de secuencia en la primera secuencia. Por consiguiente, si cada carácter en una primera secuencia de 100 nucleótidos se alinea con cada carácter en una segunda secuencia, el nivel de homología podría ser del 100%.
Alternativamente, el programa informático puede comparar una secuencia de referencia con una secuencia que se proporciona en la presente para determinar si la secuencia difiere en uno o más posiciones. El programa puede registrar la longitud e identidad de residuos de nucleótidos o aminoácidos insertados, eliminados o sustituidos con respecto a la secuencia ya sea de referencia o una secuencia que se proporciona en la presente. El programa informático puede ser un programa que determine puede ser un programa que determine si una secuencia de referencia contiene un polimorfismo de nucleótido único (SNP) con respecto a una secuencia que se proporciona en la presente, o, si una secuencia que se proporciona en la presente comprende un SNP de una secuencia conocida. Por consiguiente, en ¡ algunos aspectos, el programa informático es un programa que identifica los SNPs. El método puede implementarse mediante los sistemas computarizados descritos anteriormente y el método ilustrado en la Figura 3. El método se puede realizar leyendo una secuencia que se proporciona en la presente y las secuencias de referencia a través del uso del programa informático e identificando las diferencias con el programa informático.
En otros aspectos el sistema para computadora comprende un identificador para identificar características dentro del ácido nucleico o polipéptido' que se proporciona en la presente. Un "identificador" se refiere a uno o más programas que identifican ciertas características dentro de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un identificador puede comprender un programa , que identifique un marco de lectura abierto (ORF) en una secuencia de ácido nucleico. La Figura 4 es un diagrama ¦ de flujo que ilustra una característica de un proceso! 300 del identificador para detectar la presencia de una característica en una secuencia. El proceso 300 comienza en un< estado 302 de inicio y luego pasa a un estado 304 en donde una primera secuencia que se va a verificar para características, se almacena en una memoria 115 en el sistema 100 computarizado . El proceso 300 pasa entonces a un estado 306 en donde una base de datos de características de secuencia está abierta. Tal base de datos podría incluir una lista de cada atributo de la característica junto con el nombre de la característica. Por ejemplo, un nombre de característica podría ser "Initiation Codon" y el atributo podría ser VATG". Otro ejemplo podría ser el nombre de la característica "TAATAA Box" y el atributo de la característica podría ser "TAATAA". Un ejemplo de tal base de datos se produce por el Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin. Alternativamente, las características pueden ser porciones de polipéptidos estructurales tales como hélices alfa, láminas beta, o porciones de polipéptidos funcionales tales como sitios activos enzimáticos, porciones de hélice-giro-hélice u otras porciones conocidas para aquéllos expertos en la técnica. Una vez que la base de datos de características está abierta en el estado 306, el proceso 300 pasa a une estado 308 en donde la primera característica se lee desde la base de datos. Una comparación del atributo de la primera característica con la primera secuencia se hace entonces en un estado 310. Se hace entonces una determinación en un estado 316 de decisión si el atributo de la característica se encontró en la primera secuencia. Si el atributo se encontró, entonces el proceso 300 pasa a un estado 318 en donde el nombre de la característica encontrada se muestra al usuario. El proceso 300 pasa entonces a un estado 320 de decisión en donde se hace una determinación de si pasan las células existentes en la base de datos. Si no existen más características, entonces el proceso 300 termina en un estado 324 final. Sin embargo, si existen más características en la base de datos, entonces el proceso 300 lee la siguiente característica de la secuencia en un estado 326 y se repite de regreso al estado 310 en donde el atributo de la siguiente característica se compara contra la primera secuencia. Si el atributo de la característica no se encuentra en la primera secuencia en el estado 316 de decisión, el proceso 300 pasa directamente al estado 320 de decisión con el fin de determinar si existen más características en la base de datos. Por consiguiente, en un aspecto, un programa para computadora que identifica marcos de lectura abiertos (ORFs) .
Una secuencia de polipéptidos o ácido nucleico que se proporciona en la presente puede almacenarse y manipularse en una variedad de programas procesadores de datos en una variedad de formatos. Por ejemplo, una secuencia se puede almacenar como texto en un archivo para procesamiento de textos, tales como MICROSOFTWORD™ o WORDPERFECT™ como un archivo ASCII en una variedad de programas de base de datos familiares para aquellos expertos en la técnica, tales como DB2, SYBASE, o ORACLE™. Además, pueden utilizarse muchos programas y bases de datos como algoritmos de comparación de secuencias, identificadores , o fuetes de secuencias de nucleótidos de referencia o secuencias de polipéptidos a compararse con una secuencia de ácido nucleico que se proporciona en la presente. Los programas y base de datos pueden comprender: ACPATTERN™ (EMBL) , DI SCOVERYBASE™ (Molecular Applications Group) , GENEMINE™ (Molecular Applications Group) , LOOK™ (Molecular Applications Group) , MACLOO ™ (Molecular Applications Group) , BLAST y BLAST2 (NCBI), BLASTN y BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 85: 2444, 1988), FASTDB™ (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), CATALYST™ (Molecular Simulations Inc.), CATALYST™/SHAPE™ (Molecular Simulations Inc.), CERIUS2. DBACCESS™ (Molecular Simulations Inc.), HYPOGEN™ (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), DISCOVER™ (Molecular Simulations Inc.), CHARMm™ (Molecular Simulations Inc.), FELIX™ (Molecular Simulations Inc.), DELPHI™s (Molecular Simulations Inc.), QUANTEMM™, (Molecular Simulations Inc.), HOMOLOGY™ (Molecular Simulations Inc.), MODELER™ (Molecular Simulations Inc.), ISIS™ (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ Di ersity Explorer (Molecular Simulations Inc.), GENE EXPLORER™ (Molecular Simulations Inc.), SEQFOLD™ (Molecular Simulations Inc.), la base de datos MDL Available Chemicals Directory, la base de datos MDL Drug Data Report, la base de datos Comprehensive Medicinal C emistry, base de datos World Drug Index de Derwent, la base de datos BioByteMasterFile , la base de datos Genbank, y la base de datos Genseqn. Muchos otros programas y bases de datos podrían ser evidentes para un experto en la técnica que da la presente descripción .
Las porciones que pueden detectarse utilizando los programas anteriores incluyen secuencias que codifican cremalleras de leucina, porciones hélice-giro-hélice, sitios de glicosilación, sitios de ubiquitinación, hélices alfa, y laminillas beta, secuencias de señal que codifican péptidos de señal que dirigen la secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la regulación de transcripción tales como grupos de genes homeóticos, alargamientos acídicos, sitios activos enzimáticos, sitios de enlace de substratos, y sitios de escisión enzimática.
Hibridación de ácidos nucleicos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes que se hibridizan bajo condiciones severas al ácido nucleico proporcionado en la presente, por ejemplo, una secuencia ejemplar proporcionada en la presente, por ejemplo, una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1, SEQ NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 ó SEQ ID NO: 23, ó SEQ NO: 1 modificada para codificar uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones base descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de los mismos, y subsecuencia y secuencias complementarias de las mismas, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que se proporciona en la presente. Las condiciones severas pueden ser condiciones altamente severas, condiciones de severidad media, condiciones de baja severidad, incluyendo las condiciones de severidad alta y reducida descritas en la presente.
"Hibridación" se refiere al proceso mediante el cual una hebra de ácido nucleico se une con una hebra complementaria a través de apareamiento de bases,. Las reacciones de hibridación pueden ser sensibles y selectivas de modo que una secuencia particular de interés se pueda identificar incluso en muestras en las cuales la misma esté presente en bajas concentraciones. Se pueden identificar condiciones severas, por ejemplo, mediante las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de pre-hibridación e hibridación, o mediante la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la severidad se puede incrementar reduciendo la concentración de sal, incrementando la concentración de formamida, o elevando la temperatura de hibridación, alterando el tiempo de hibridación, como se describe con detalle más adelante. En aspectos alternativos, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se definen por su capacidad de hibridizarse bajo varias condiciones de severidad (por ejemplo, alta, media, y baja) , como se establece en la presente.
En modalidades alternativas, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente que se definen por su capacidad de hibridizarse bajo condiciones severas, pueden estar entre aproximadamente cinco residuos y la longitud completa del ácido nucleico que se proporciona en la presente, por ejemplo, los mismos pueden ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más residuos de longitud. También se incluyen ácidos nucleicos más cortos que la longitud completa. Estos ácidos nucleicos pueden ser útiles como, por ejemplo, sondas de hibridación, sondas de etiquetado, sondas de oligonucleótidos PCR, ARNi, antisentido o secuencias que codifican péptidos de enlace de anticuerpos (epitopes), porciones, sitios activos y similares.
En un aspecto, los ácidos, nucleicos que se proporcionan en la presente definidos por su capacidad de hibridizarse bajo severidad elevada, comprenden condiciones de aproximadamente formamida al 50% de aproximadamente 37 °C a 42 °C. En un aspecto, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente definidos por su capacidad de hibridizarse bajo severidad reducida que comprende condiciones en formamida de aproximadamente 35 a 25% de aproximadamente 30 °C a 35 °C.
Alternativamente, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se definen por su capacidad de hibridizarse bajo severidad elevada que comprende condiciones a 42°C en formamida al 50%, S.SPE 5X, SDS 0.3%, y un ácido nucleico de bloqueo de secuencias repetitivas, tal como cot-1 ó ADN de esperma de salmón (por ejemplo, 200 ug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado) . En un aspecto, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se definen por su capacidad de hibridizarse bajo condiciones de severidad reducida que comprenden 35% de formamida a una temperatura reducida de 35 °C.
Después de la hibridación, el filtro puede lavarse con SSC 6X, SDS al 0.5% a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por arriba de 25% de formamida y condiciones "bajas" por debajo de 25% de formamida. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 30%. Un ejemplo de condiciones de hibridación de "baja severidad" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 10%.
El rango de temperatura correspondiente a un nivel particular de severidad puede estrecharse aún más calculando la relación de purina respecto a la pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura de acuerdo a esto. Los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente también se definen por su capacidad de hibridizarse bajo condiciones de severidad elevada, media, y baja como se estable en Ausubel y Sambrook. Las variaciones en los rangos y condiciones anteriores son bien conocidas en la técnica. Las condiciones de hibridación se discuten aún más, posteriormente .
El procedimiento anterior puede modificarse para identificar ácidos nucleicos que tienen niveles cada vez menores de homología con la secuencia de sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos dé homología cada vez menor con la sonda detectable, pueden utilizarse condiciones menos severas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede disminuirse en incrementos de 5°C de 68 °C a 42 °C en un amortiguador de hibridación que tiene una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. Después de la hibridación, el filtro puede lavarse con SSC 2X SDS al 0.5% a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por arriba de 50°C y condiciones "bajas" por debajo de 50°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza a 55°C. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "severidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza a 45°C.
Alternativamente, la hibridación puede llevarse a cabo en amortiguadores, tales como SSC 6X, que contiene formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentración de formamida en el amortiguador de hibridación puede reducirse en incrementos del 5% desde 50% hasta 0% para identificar clones que tengan niveles cada vez menores de homología con la sonda. Después ,de la hibridación, el filtro puede lavarse con SSC 6X, SDS al 0.5% a 50°C. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por arriba de formamida al 25% y condiciones "bajas" por debajo de formamida al 25%. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 30%. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "bajas" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 10%.
Sin embargo, la selección de un formato de hibridación no es crítica - es la severidad de las condiciones de lavado que establecen las condiciones que determina si un ácido nucleico está dentro del alcance que se proporciona en la presente. Las condiciones de lavado utilizadas para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance que se proporciona en la presente incluyen, por ejemplo: una concentración de sal de aproximadamente 0.02 molar a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C o de aproximadamente 55 °C hasta 60 °C; o, una concentración de sal de aproximadamente NaCl 0.15 M a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos; o, una concentración de sal de aproximadamente SSC 0.2X a una temperatura de al menos aproximadamente 50 °C o desde aproximadamente 55°C hasta 60°C durante aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20 minutos; o, el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración de sal de aproximadamente SSC 2X que contiene SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego se lava dos veces con SSC 0. IX que contiene SDS al 0.1% a 68 °C durante 15 minutos; o, condiciones equivalentes. Ver Sambrook, Tijssen y Ausubel para una descripción del amortiguador SSC y condiciones equivalentes.
Estos métodos pueden utilizarse para aislar los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente.
Sondas de oligonucleótidos y métodos para utilizar las mismas En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente sondas de ácido nucleico para identificar ácidos nucleicos que codifican un polipéptido en una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En un aspecto, la sonda comprende al menos 10 bases consecutivas de un ácido nucleico que se proporciona en la presente. Alternativamente, una sonda que se proporciona en la presente puede ser de al menos aproximadamente 5, 6, 7, 8-, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 o más, o de aproximadamente 10 a 50, aproximadamente de 20 a 60 de aproximadamente 30 a 70, bases consecutivas de una secuencia que se establece en un ácido nucleico que se proporciona en la presente. Las sondas identifican un ácido nucleico mediante enlace y/o hibridación. Las sondas se pueden utilizar en arreglos que se proporcionan en la presente, ver la discusión posterior, incluyendo, por ejemplo, los arreglos capilares. Las sondas que se proporcionan en la presente también se pueden utilizar para aislar otros ácidos nucleicos o polipéptidos .
Las sondas que se proporcionan en la presente se pueden utilizar para determinar si una muestra biológica, tal como una muestra de suelo, contiene un organismo que tiene una secuencia de ácido nucleico como se proporciona en la presente (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una hidrolasa) o un organismo a partir del cual se obtuvo el ácido nucleico. En tales procedimientos, se obtiene una muestra biológica que potencialmente alberga el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico y los ácidos nucleicos se obtienen de la muestra. Los ácidos nucleicos entran en contacto con la sonda bajo condiciones que permiten a la sonda hibridizarse específicamente en cualquier secuencia complementaria presente en la muestra. Cuando es necesario, las condiciones que permiten a la sonda hibridizarse específicamente en secuencias complementarias pueden determinarse colocando la sonda en contacto con secuencias complementarias de muestras conocidas que contienen la secuencia complementaria, así como en secuencias de control que no contienen la secuencia complementaria. Las condiciones de hibridación, tales como la concentración de sal del amortiguador de hibridación, o la temperatura de hibridación, pueden variarse para identificar condiciones que permitan a la sonda hibridizarse específicamente en ácidos nucleicos complementarios (ver la discusión sobre condiciones de hibridación) .
Si la muestra contiene el organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico, entonces se detecta la hibridación específica de la sonda. La hibridación puede detectarse etiquetando la sonda con un agente detectable tal como un isótopo radioactivo, un tinte fluorescente o una enzima capaz de catalizar la formación de un producto detectable. Muchos métodos para utilizar las sondas etiquetadas para detectar la presencia de ácidos nucleicos complementarios en una muestra son familiares para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen Transferencias de Southern, Transferencias de Northern procedimientos de hibridación de colonias, y transferencias en mancha. Los protocolos para cada uno de estos procedimientos se proporcionan en Ausubel y Sambrook.
Alternativamente, más de una sonda (al menos una de las cuales es capaz de hibridizarse específicamente en cualquier secuencia complementaria que esté presente en la muestra de ácido nucleico) , puede utilizarse en una reacción de amplificación para determinar si la muestra contiene un organismo que contenga una secuencia de ácido nucleico como se proporciona en la presente (por ejemplo, un organismo a partir del cual se aisló el ácido nucleico) . En un aspecto, las sondas comprenden oligonucleótidos . En un aspecto, la reacción de amplificación puede comprender una reacción PCR. Los protocolos PCR se describen en Ausubel y Sambrook (ver discusión sobre reacciones de amplificación) . En tales procedimientos, los ácidos nucleicos en la muestra entrar en contacto con las sondas, se realiza la reacción de amplificación, y se detecta cualquier producto de amplificación resultante. El producto de amplificación puede detectarse realizando electroforesis en gel en los productos de reacción y tiñendo el gel con un intercalador tal como bromuro de etidio. Alternativamente, una o más de las sondas pueden etiquetarse con un isótopo radioactivo y la presencia de un producto de amplificación radioactivo puede detectarse mediante auto-radiografía después de electroforesis en gel.
Las sondas derivadas de secuencias cercanas a los extremos 3' ó 5' de una secuencia de ácido nucleico como se proporciona en la presente también se pueden utilizar en procedimientos de desplazamiento sobre el cromosoma para identificar clones que contengan por ejemplo, secuencias genómicas adicionales. Tales métodos permiten el aislamiento de genes que codifican proteínas adicionales de interés del organismo hospedero.
En un aspecto, las secuencias de ácido nucleico que se proporcionan en la presente se utilizan como sondas para identificar y aislar ácidos nucleicos relacionados. En algunos aspectos, los ácidos nucleicos relacionados así identificados pueden ser ADNcs o ADNs genómicos de organismos diferentes a partir del cual se aisló primero el ácido nucleico que se proporciona en la presente. En tales procedimientos, una muestra de ácido nucleico se pone en contacto con la sonda bajo condiciones que permitan a la sonda hibridizarse específicamente en secuencias relacionadas. La hibridación de la sonda en ácidos nucleicos del organismo relacionado se detecta entonces utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente.
En reacciones de hibridación de ácido nucleico, variarán las condiciones utilizadas para lograr un nivel particular de severidad, dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se hibridizan. Por ejemplo, la longitud, grado de complementariedad, composición de secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido GC v. AT) , y tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN v. ADN) de las regiones de hibridación de los ácidos nucleicos, se puede considerar al seleccionar condiciones de hibridación. Una consideración adicional es si uno de los ácidos nucleicos se inmoviliza, por ejemplo, en un filtro. La hibridación puede llevarse a cabo bajo condiciones de severidad baja, severidad moderada o severidad elevada. Como un ejemplo de hibridación de ácido nucleico, una membrana de polímero que contiene ácidos nucleicos desnaturalizados, inmovilizados, primero se pre-hibridiza durante 30 minutos a 45°C en una solución que consiste de NaCl 0.9 M, aH2P04 50 mM, pH 7.0, Na2EDTA 5.0 mM, SDS al, 0.5%, Denhardt's 10X, y ácido polirriboadenílico 0.5 mg/ml. Aproximadamente 2 X 107 cpm (actividad específica 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleótido etiquetada en el extremo con 32P, se agregan entonces a la solución. Después de 12-16 horas de incubación, la membrana se lava durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) en SET IX (NaCl 150 mM, clorhidrato de Tris 20 mM, pH o 7.8, Na2EDTA 1 mM) que contiene SDS al 0.5%, seguido por un lavado de 30 minutos en SET IX a Tm-10°C para la sonda de oligonucleótido. La membrana se expone entonces a una película auto-radiográfica para la detección de señales de hibridación.
Variando la severidad de las condiciones de hibridación utilizadas para identificar ácidos nucleicos, tales como ADNcs o ADNs genómicos, que se hibridizan en la sonda detectable, se pueden identificar y aislar ácidos nucleicos que tengan diferentes niveles de homología con la sonda. La severidad puede variarse realizando la hibridación a varias temperaturas por debajo de las temperaturas de fusión de las sondas. La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura (bajo resistencia y pH iónicos definidos) en la cual 50% de la secuencia objetivo se hibridiza en una sonda perfectamente complementaria. Se seleccionan condiciones muy severas que sean iguales a o aproximadamente 5°C más bajas que la Tm para una sonda particular. La temperatura de fusión de la sonda puede calcularse utilizando las siguientes fórmulas ejemplars. Para sondas de entre 14 y 70 nucleótidos de longitud la temperatura de fusión (Tm) se calcula utilizando la fórmula: Tm=81.5+16.6 (log [Na+])+0.41 (fracción G+C)-(600/N) donde N es la longitud de la sonda. Si la . hibridación se lleva a cabo en una solución que contiene formamida, la temperatura de fusión puede calcularse utilizando la ecuación: Tm=81.5+16.6 (log [Na+])+0.41 (fracción G+C) -( formamida al 0.63%) - (600/N) donde N es la longitud de la sonda. La prehibridacion puede llevarse a cabo en SSC 6X, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5%, ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 µg, formamida al 50%. Las fórmulas para SSC y Denhardt y otras soluciones se listan, por ejemplo, en Sambrook.
En un aspecto, la hibridación se realiza agregando la sonda detectable a las soluciones de prehibridacion listadas anteriormente. Cuando la sonda comprende ADN de doble hebra, la misma se desnaturaliza antes de la adición a la solución de hibridación. El filtro se pone en contacto con la solución de hibridación durante un periodo suficiente de tiempo para permitir a la sonda hibridizarse en secuencias que contienen ADNcs o ADNs genómicos que contiene secuencias complementarias a las mismas u homologas a las mismas. Para sondas de más de 200 nucleótidos de longitud, la hibridación puede llevarse a cabo a 15-25°C por debajo de la Tm. Para sondas más cortas, tales sondas de oligonucleótidos , la hibridación puede realizarse a 5-10°C por debajo de la Tm. En un aspecto, las hibridizaciones en SSC 6X se realizan aproximadamente 68°C. En un aspecto, las hibridizaciones en soluciones que contienen formamida al 50% se realizan aproximadamente a 42°C. Todas las hibridizaciones antes mencionadas podrían considerarse que están bajo condiciones de severidad elevada.
En un aspecto, después de la hibridación, el filtro se lava para remover cualquier sonda detectable no enlazada específicamente. La severidad utilizada para lavar los filtros también se puede variar dependiendo de la naturaleza de los ácidos nucleicos que se hibridizan, la longitud de los ácidos nucleicos que se hibridizan, el grado de complementariedad, la composición de secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido GC v. AT) , y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN v. ADN) . Los ejemplos de lavados a condición de severidad más elevada progresivamente son como sigue: SSC 2X, SDS al 0.1% a temperatura ambiente durante 15 minutos (severidad baja); SSC 0.1X, SDS al 0.5% a temperatura ambiente durante 30 minutos (severidad moderada),-' SSC 0.1X, SDS al 0.5% a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos a temperatura entre la temperatura de hibridación y 68 °C (severidad elevada); y NaCl 0.15 durante 15 minutos a 72°C (severidad muy elevada) . Un lavado a severidad baja final se puede realizar en SSC 0. IX a temperatura ambiente. Los ejemplos anteriores son meramente ilustrativos de un conjunto de condiciones que se pueden utilizar para filtros de lavado. Un experto en la técnica sabrá que existen numerosas recetas para lavados de diferente severidad.
Los ácidos nucleicos que se han hibridizado en la sonda se pueden identificar por auto-radiografía u otras técnicas convencionales. El procedimiento anterior puede modificarse para identificar ácidos nucleicos que tengan niveles cada vez menores de homología con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener ácidos nucleicos de homología cada vez menor con la sonda detectable, pueden utilizarse condiciones menos severas. Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede disminuirse en incrementos de 5°C desde 68°C hasta 42°C en un amortiguador de hibridación que tenga una concentración de Na+ de aproximadamente 1M. Después de la hibridación, el filtro puede lavarse con SSC 2X, SDS al 0.5% a la temperatura de hibridación. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por arriba de 50°C y condiciones "bajas" por debajo de 50 °C. Un ejemplo de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza a 55°C. Un ejemplo de condiciones de hibridación de "severidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza a 45°C.
Alternativamente, la hibridación puede llevarse a cabo en amortiguadores, tales como SSC 6X, que contienen formamida a una temperatura de 42°C. En este caso, la concentración de formamida en el amortiguador de hibridación puede reducirse en incrementos de 5% desde 50% hasta 0% para identificar clones que tengan niveles cada vez menores de homología con la sonda. Después de la hibridación, el filtro puede lavarse con SSC 6X, SDS al 0.5% a 50 °C. Estas condiciones se considera que son condiciones "moderadas" por arriba de formamida al 25% y condiciones "bajas" por debajo de formamida al 25%. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación "moderadas" es cuando la hibridación anterior se realiza en formamida al 30%. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación de "severidad baja" es cuando la hibridación anterior se realiza en ¦ formamida al 10%.
Estas sondas y métodos que se proporcionan en la presente se pueden utilizar para aislar, o identificar (por ejemplo, utilizando un arreglo) , ácidos nucleicos que tengan una secuencia con al menos aproximadamente 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico que se proporciona en la presente que comprende al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, o más bases consecutivas de las mismas, y las secuencias complementarias a las mismas. La homología puede medirse utilizando un algoritmo de alineación, como se discute en la presente. Por ejemplo, los polinucleótidos homólogos pueden tener una secuencia de codificación que es una variante alélica de origen natural de una de las secuencias de codificación descritas en la presente. Tales variantes alélicas pueden tener una sustitución, eliminación o adición de uno o más nucleótidos cuando se comparan con un ácido nucleico que se proporciona en la presente.
Adicionalmente, las sondas y métodos que se proporcionan en la presente pueden utilizarse para aislar, o identificar (por ejemplo, utilizando un arreglo) , ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan al menos aproximadamente 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 99%, o más identidad (homología) de secuencia con un polipéptido que se proporciona en la presente que comprende al menos least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ó 150 ó más aminoácidos consecutivos de los mismos que se determinan utilizando un algoritmo de alineación de secuencias, por ejemplo, tal como el algoritmo FASTA versión 3.0t78 con los parámetros preestablecidos, o un programa BLAST 2.2.2 con las configuraciones ejemplars establecidos en el mismo.
Expresión de Inhibición de Hidrolasas En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos complementarios a (por ejemplo, secuencias antisentido a) las secuencias de ácido nucleico que se proporcionan en la presente, por ejemplo, secuencias que codifican hidrolasas. Las secuencias antisentido son capaces de inhibir el transporte, acoplamiento o transcripción de genes que codifican hidrolasas. La inhibición se puede efectuar a través de la destinación de ADN genómico o ARN mensajero. La inhibición se puede efectuar utilizando ADN, por ejemplo, una ribozima inhibidora, o un ARN, por ejemplo, un ARNi de doble hebra, que comprende una secuencia que se proporciona en la presente. La transcripción o función de ácido nucleico concreto se puede inhibir, por ejemplo, mediante hibridación y/o escisión. Se proporcionan en la presente conjuntos de inhibidores que comprenden oligonucleótidos capaces de enlazar un gen y/o mensaje de hidrolasa, ya sea en el caso de prevenir o inhibir la producción o función de hidrolasa. La asociación puede ser a través de hibridación especifica de secuencias. Otra clase útil de inhibidores incluye oligonucleotidos que causan la inactivación o escisión del mensaje de hidrolasa. El oligonucleotido puede tener una actividad enzimática que cause tal escisión, tal como las ribozimas. El oligonucleotido se puede modificar químicamente o conjugarse con una enzima o composición capaz de escindir el ácido nucleico complementario. Se puede seleccionar un agrupamiento de muchos diferentes oligonucleotidos por aquéllos con la actividad deseada .
Oligonucleotidos Antisentido En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente oligonucleotidos antisentido capaces de enlazar el mensaje de hidrolasa el cual puede inhibir la actividad de la hidrolasa mediante ARNm objetivo o ADN genómico. Las estrategias para diseñar oligonucleotidos antisentido se describen adecuadamente en la literatura científica y literatura de patentes, y el experto en la técnica puede diseñar tales oligonucleotidos de hidrolasa utilizando los nuevos reactivos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, los protocolos de mapeo de desplazamiento de genes/ARN para seleccionar oligonucleotidos antisentido efectivas, son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, que describe un ensayo de mapeo de ARN, el cual se basa en técnicas moleculares estándar para proporcionar un método fácil y confiable para la selección de secuencias antisentido, potentes. Ver también Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:91-198.
En un aspecto, se utilizan ácidos nucleicos de origen natural generados o, aislados, como oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de cualquier longitud; por ejemplo, en aspectos alternativos, los oligonucleótidos antisentido están entre aproximadamente 5 a 100, aproximadamente 10 a 80, aproximadamente 15 a 60, aproximadamente 18 a 40. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser de ARN o ADN de una sola hebra o de doble hebra. Lo longitud óptima se puede determinar mediante selección de rutina. Los oligonucleótidos antisentido pueden estar presentes en cualquier concentración. La concentración óptima se puede determinar mediante selección de rutina. Se conoce una amplia variedad de nucleótidos que no son de origen natural, sintéticos, y análogos de ácido nucleico que trata este problema potencial. Por, ejemplo, se pueden utilizar ácidos nucleicos de péptidos (PNAs) que contienen estructuras no iónicas, tales como unidades de N- (2-aminoetil ) -glicina . También se pueden utilizar oligonucleótidos antisentido que tienen enlaces de fosforotioato, como se describe en WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Farmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics , ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N. J., 1996). Se proporcionan en la presente oligonucleótidos antisentido que tengan análogos de estructura de ADN sintético, los cuales también pueden incluir ácidos nucleicos de ditioato de fosforo, metilfosfonato, fosforamidato, fosfotriéster ' de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen (metilimino) , 3' -N-carbamato, y carbamato de morfolino, como se describe anteriormente.
Se puede utilizar metodología de química combinatoria para crear vastos números de oligonucleótidos que puedan seleccionar rápidamente oligonucleótidos específicos que tengan afinidades y especificidades de enlace apropiadas hacia cualquier objetivo, tal como las secuencias de hidrolasa sentido y antisentido que se proporcionan en la presente (ver, por ejemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).
Ribozimas Inhibidoras En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ribozimas capaces de enlazar el mensaje de hidrolasa que pueda inhibir la actividad de hidrolasa mediante ARNm de objetivo. Las estrategias para diseñar ribozimas y seleccionar la secuencia antisentido específica de hidrolasa para dirigirse al objetivo, se describen adecuadamente en la literatura científica y literatura de patente, y el experto en la técnica puede diseñar tales ribozimas utilizando los nuevos reactivos que se proporcionan en la presente. Los ribozimas actúan enlazándose a un ARN objetivo a través de la porción de enlace del ARN objetivo de un ribozima el cual se mantiene en proximidad cercana con una porción enzimática del ARN que escinde el ARN objetivo. Por consiguiente, el ribozima reconoce y enlaza un ARN objetivo a través de apareamiento de bases, complementario, y una vez enlazada al sitio correcto, actúa enzimáticamente para escindir e inactivar el ARN objetivo. La escisión de un ARN objetivo de tal manera destruirá su capacidad de dirigir la síntesis de una proteína codificada si la escisión ocurre en la secuencia de codificación. Después de que una ribozima ha enlazado y escindido su ARN objetivo, la misma típicamente se libera del ARN y así puede enlazar y escindir nuevos objetivos repetidamente.
En algunas circunstancias, la naturaleza enzimática de un ribozima puede ser ventajosa por encima de otras tecnologías, tales como la tecnología antisentido (donde una molécula de ácido nucleico simplemente se enlaza a un ácido nucleico objetivo para bloquear su transcripción, traducción o asociación con otra molécula) cuando la concentración efectiva de ribozima necesaria para efectuar un tratamiento terapéutico puede ser más bajar que la de un olígonucleótido antisentido. Esta ventaja potencial refleja la capacidad de la ribozima para actuar enzimáticamente. Por consiguiente, una sola molécula de ribozima es capaz de escindir muchas moléculas de ARN objetivo. Además, una ribozima de manera típica es un inhibidor altamente específico, con la especificidad de inhibición dependiendo no solamente del mecanismo de apareamiento de bases de enlace, sino también del mecanismo mediante el cual la molécula inhibe la expresión del ARN al cual la misma se enlaza. Es decir, la inhibición es causa por la escisión del ARN objetivo y asi la especificidad se define como la relación de la velocidad de escisión del ARN objetivo por encima de la escisión del ARN no objetivo. Este mecanismo de escisión depende de factores adicionales a los involucrados en el apareamiento de bases. Por consiguiente, la especificidad de acción de una ribozima puede ser mayor a la del enlace de oligonucleótidos antisentido que enlazan el mismo sitio de ARN.
La molécula de ARN del ribozima enzimático se puede formar en una porción en forma de cabeza de martillo, aunque también puede formarse en la porción de una horquilla, virus de hepatitis delta, intrón del grupo I o ARN semejante a P RNasa (en asociación con una secuencia guía de ARN) . Los ejemplos de tales porciones en forma de cabeza de martillo, se describen por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; las porciones de horquilla por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, y Hampel (1990) Nuc . Acids Res. 18:299; la porción de virus hepatitis delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; la porción de RNasaP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; y el intrón del grupo I por Cech (Patente Norteamericana No. 4,987,071) . No se pretende que la enumeración de estas porciones específicas sea limitativa; aquellos expertos en la técnica reconocerán que una molécula de ARN enzimática que se proporciona en la presente puede tener un sitio de enlace de substrato especifico complementario a una o más de las regiones de ARN de gen especifico, y tiene una secuencia de nucleótidos dentro o alrededor de ese sitio de enlace de substrato que imparte una actividad de escisión de ARN a la molécula.
Interferencia de ARN (ARNi) En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente moléculas inhibidoras de ARN, las asi llamadas moléculas "ARNi" , que comprenden una secuencia de hidrolasa en la presente. La molécula ARNi puede comprender una molécula de ARN de doble hebra (ARNds) , por ejemplo, AR si y/o ARNmi . El ARNi puede inhibir la expresión de un gen o transcripto de hidrolasa (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) . En un aspecto, la molécula ARNi, por ejemplo, ARNsi y/o ARNmi, es de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 ó más nucleótidos dobles de longitud. Aunque la invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular, el ARNi puede entrar a una célula y causar la degradación del ARN de una sola hebra (ARNss) de secuencias similares o idénticas, incluyendo ARNms endógenas. Cuando una célula se expone a ARN de doble hebra (ARNds) , el ARNm del gen homólogo se degrada selectivamente mediante un proceso llamado interferencia de ARN (ARNi) . Un posible mecanismo básico detrás del ARNi es la ruptura de un ARN de doble hebra (ARNds) que iguala una secuencia de gen especifico en pedazos cortos llamado ARN de interferencia corta, el cual desencadena la degradación del ARNm que iguala su secuencia.
En un aspecto, los ARNis que se proporcionan en la presente se utilizan en terapias de silenciamiento génico, ver, por ejemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para degradar selectivamente el ARN utilizando los ARNis. El proceso puede practicarse in vivo, ex vivo o in vivo. En un aspecto, las moléculas de ARNi que se proporcionan en la presente se pueden utilizar para generar una mutación de pérdida de función en una célula, un órgano o un animal. Los métodos para hacer y utilizar moléculas de ARNi para degradar selectivamente el ARN, son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,506,559; 6,511,824; 6,515,109; 6,489,127, Modificación de Ácidos Nucleicos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para generar variantes de los ácidos nucleicos, por ejemplo, aquéllos que codifican una hidrolasa o un anticuerpo que se proporciona en la presente. Estos métodos se pueden repetir o utilizar en varias combinaciones para generar hidrolasas o anticuerpos que tengan una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente a la de una hidrolasa o anticuerpo codificado por el ácido nucleico de plantilla. Estos métodos también se pueden repetir o utilizar en varias combinaciones, por ejemplo, para generar variaciones en la expresión de genes/mensajes, traducción de mensajes o estabilidad de mensajes. En otro aspecto, la composición genética de una célula se altura, por ejemplo, mediante la modificación de un gen homólogo ex vivo, seguido por su reinserción en la célula.
El término "variante" puede incluir polinucleótidos o polipéptidos que se proporcionan en la presente, modificados en uno o más pares base, codones, intrones, exones, o residuos de aminoácidos (respectivamente) que aún retienen todavía la actividad biológica de una hidrolasa que se proporciona en la presente. Se pueden producir variantes mediante cualquier número de medios incluidos métodos tales como, por ejemplo, PCR propensa a error, recomposición o barajado, mutagénesis dirigida con oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por cásete, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis de centros específicos, GeneReassembly, GSSMSM y cualquier combinación de las mismas. Se incluyen en las mismas técnicas para producir hidrolasas variantes que tienen actividad a un pH o temperatura, por ejemplo, que es diferente de una hidrolasa de cepa natural.
Un ácido nucleico que se proporciona en la presente se puede alterar mediante cualquier medio. Por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos, o, métodos no estocásticos , o de "evolución dirigida", ver, 1 por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,361,974. Los métodos para mutación aleatoria de genes son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,830,696. Por ejemplo, se pueden utilizar mutágenos para mutar aleatoriamente un gen. Los mutágenos incluyen, por ejemplo, luz ultravioleta o irradiación gamma, o un mutágeno químico, por ejemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoralenos fotoactivados , solos o en combinación, para inducir rupturas de ADN sensibles para repararse mediante recombinación. Otros mutágenos químicos incluyen, por ejemplo, bisulfito de sodio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina o ácido fórmico. Otros mutágenos son análogos de precursores de nucleótidos, por ejemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracilo, 2-aminopurina, o acridina. Estos agentes se pueden agregar a una reacción PCR en lugar del precursor de nucleótidos mutando así la secuencia. También se pueden utilizar agentes de intercalación tales como proflavina, acriflavina, quinacrina y similares.
Se puede utilizar cualquier técnica en biología molecular, por ejemplo, mutagénesis de PCR aleatoria, ver, por ejemplo, Rice (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; o, mutagénesis por cásete, múltiple, combinatoria, ver, por ejemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196.
Alternativamente, los ácidos nucleicos, por ejemplo, genes, se pueden re-ensamblar después de una fragmentación aleatoria, o "estocástica", ver, por ejemplo, la Patentes Norteamericanas Nos. 6,291,242; 6,287,862; 6,287,861; 5,955,358; 5,830,721; 5,824,514; 5,811,238; 5,605,793. En aspectos alternativos, se introducen modificaciones, adiciones o eliminaciones mediante PCR propensa a error, recomposición o barajado, mutagénesis dirigida con oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por cásete, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis de centros específicos, Gene Site Saturation utagenesisSM (GSSMSM) , re-ensamblaje de ligación sintética (SLR ó GeneReassembly) , recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis con dúplex con espacios vacío, mutagénesis de reparación de apareamientos erróneos puntuales, mutagénesis de cepa hospedera carente de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de eliminación, mutagénesis de selección por restricción, mutagénesis de purificación por restricción, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácido nucleico quimérico, y/o una combinación de estos y otros métodos.
Las siguientes publicaciones describen una variedad de procedimientos y/o métodos de recombinación recursiva los cuales se pueden incorporar en los métodos que se proporcionan en la presente: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinión in Chemical Biology 3:284-290; Christians ' (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylatxon using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinión in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage librarles by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide librarles through display on a lac repressor ^eadpiece dimer' " Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York, pp. 447-457; Crarneri y Stemme (1995) "Combinatorial múltiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; y Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Los métodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2) : 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis usihg the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol . 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet . ,19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Cárter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; y Kunkel (1987)' "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis que utilizan plantillas que contienen uracilo (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-speci ic mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382; y Bass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); oligonucleotide-directed mutagenesis (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors : an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; y Zoller & Smith (1987) Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers , and a single-stranded DNA témplate" Methods in Enzymol. 154:329-350); mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucí. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucí. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakaraaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucí. Acids Res. 16:791-802; y Sayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucí. Acids Res. 16: 803-814); mutagénesis que utiliza ADN dúplex con espacios vacíos (Kramer et al. (1984) "The gapped dúplex DNÁ approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucí. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped dúplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped dúplex DNA approach to nucleotide-directed construction of mutations" Nucí. Acids Res. 16: 7207; y Fritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped dúplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucí. Acids Res. 16: 6987-6999) .
Los protocolos adicionales utilizados en los métodos que se proporcionan en la presente incluyen reparación de apareamientos erróneos puntuales (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), mutagénesis utilizando cepas hospederas carentes de reparación (Cárter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagénesis using M13 vectors" Nucí. Acids Res. 13: 4431-4443; y Cárter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagénesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), mutagénesis de eliminación (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to genérate large deletions" Nucí. Acids Res. 14: 5115), selección por restricción y selección por restricción y purificación por restricción (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans . R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagénesis mediante sintetizas génica total (Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar y Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin) " Nucí. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagénesis: an efficient method for generation of múltiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; y Grundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagénesis by microscale ^shot-gun' gene synthesis" Nucí. Acids Res. 13: 3305-3316), reparación de ruptura de doble hebra (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinión in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break. repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181) . Se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymology Volumen 154, el cual también describe controles útiles para el descubrimiento de problemas con varios métodos de mutagénesis.
Los protocolos adicionales utilizados en los métodos que se proporcionan en la presente incluyen los discutidos en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,605,793 de Stemmer (Feb. 25, 1997) , "Methods for In Vitro Recombination" ; Patente Norteamericana No. 5,811,238 de Stemmer et al. (Sep. 22, 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"; Patente Norteamericana No. 5,830,721 de Stemmer et al. (Nov. 3, 1998) , "DNA Mutagenesis , by Random Fragmentation and Reassembly" ; Patente Norteamericana No. 5,834,252 de Stemmer, et al. (Nov. 10, 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction"; Patente Norteamericana No. 5,837,458 de Minshull, et al. (Nov. 17, 1998), "Methods and Compositions fpr Cellular and Metabolic Engineering"; WO 95/22625, Stemmer y Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; WO 96/33207 de Stemmer y Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction"; WO 97/20078 de Stemmer y Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination" ; WO 97/35966 de Minshull y Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering" ; WO 99/41402 de Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccirie Vectors"; WO 99/41383 de Punnonen et al. "Antigen Library Immunization" ; WO 99/41369 de Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"; WO 99/41368 de Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"; EP 752008 de Stemmer y Crameri, "DNA utagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"; EP 0932670 de Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"; WO 99/23107 de Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"; WO 99/21979 de Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"; WO 98/31837 por del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"; WO 98/27230 de . Patten y Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"; WO 98/27230 de Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection", WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Librarles", WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences", WO 98/42832 de Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers", WO 99/29902 de Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences", WO 98/41653 de Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library", WO 98/41622 de Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", y WO 98/42727 de Pati y Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination" .
Los protocolos que se pueden utilizar (que proporcionan detalles respecto a varios métodos de diversidad) se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana no. de serie (USSN) 09/407,800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" de Patten et al., presentada el 28 Sep. de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" por del Cardayre et al., Patente de Estados Unidos No. 6,379,964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" dé Crameri et al., Patentes de Estados Unidos Nos. 6,319,714; 6,368,861; 6,376,246; 6,423,542; 6,426,224 y PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" de Welch et al., Patente de Estados Unidos No. 6,436,675; METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentada el 18 de Enero de 2000, (PCT/USOO/01202) y, por ejemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" de Selifonov et al., presentada el 18 de Julio de 2000 (U.S.
Ser. No. 09/618,579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SI ULATIONS" de Selifonov y Stemmer, presentada el 18 de Enero de 2000 ( PCT/üSOO/01138 ) ; y "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAG ENT ISOLATION" de Affholter, presentada el 6 de Sep. de 2000 (U.S. Ser. No. 09/656, 549); y Patentes de Estados Unidos Nos. 6,177,263; 6,153,410.
Los métodos no estocásticos o de "evolución dirigida", incluyen, por ejemplo, mutagénesisSM de saturación de sitio de genes (GSSMSM) , re-ensambla e de ligación sintética (SLR o GeneReassembly ) , o una combinación de los mismos se utilizan para modificar los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente para generar hidrolasas con propiedades nuevas o alteradas (por ejemplo, actividad bajo condiciones altamente ácidas o alcalinas, temperaturas elevadas, y similares) . Los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos modificados se pueden seleccionar para una actividad antes de analizar la actividad proteolitica u otra : actividad. Se puede utilizar cualquier modalidad de análisis o protocolo, por ejemplo, utilizando una plataforma de arreglo capilar. Ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,361,974; 6,280,926; 5,939,250.
Tecnología de mutagénesis de saturación, o GSS SM En un aspecto que se proporciona en la presente, se utiliza modificación de genes no estocástica, un "proceso de evolución dirigida", para generar hidrolasas y anticuerpos con propiedades nuevas o alteradas. Las variaciones de este método se han denominado "Mutagénesis de Saturación de Sitios de Genes", "mutagénesis de saturación de sitios", "mutagénesis de saturación" o simplemente "GSSMSM". El mismo se puede utilizar en combinación con otros procesos de mutagenización . En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para hacer enzimas y anticuerpos utilizando la tecnología GSSMSM, por ejemplo, como se describe en la presente y también en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,171,820; 6,579,258; 6,238,884.
En un aspecto la tecnología GSSMSM comprende proporcionar un polinucleotido de plantilla y una pluralidad de oligonucleótidos, en donde cada oligonucleótido comprende una secuencia homologa al polinucleotido de plantilla, enfocando así una secuencia específica dél polinucleotido de plantilla, y una secuencia que es una; variante del gen homólogo; generando polinucleótidos progenie que comprenden variaciones de secuencia no estocásticas replicando el polinucleotido de plantilla con los oligonucleótidos, generando así polinucleótidos que comprende variaciones de secuencias génicas homologas.
En un aspecto, se utilizan cebadores de codones que contienen una secuencia N,N,G/T degenerada para introducir mutaciones puntuales en un polinucleotido, para generar un conjunto de polipéptidos progenie en los cuales un rango completo de sustituciones de un solo aminoácido está representado en cada posición de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido en un sitio activo de enzimas o sitio de enlace de ligandos objetivo que se va a modificar. Estos oligonucleótidos pueden comprender una primera secuencia homologa contigua, una secuencia N,N,G/T degenerada, y, opcionalmente, una segunda secuencia homologa. Los productos de traducción de progenie corriente abajo a partir del uso de tales oligonucleótidos incluyen todos los posibles cambios de aminoácidos en cada sitio de aminoácido a lo largo del polipéptido, debido a que la degeneración de la secuencia N,N,G/T incluye codones para todos los 20 aminoácidos. En un aspecto, se. utiliza tal oligonucleótido degenerado (comprendido de, por ejemplo, un cásete N,N,G/T degenerado) para someter cada codón original en una plantilla de polinucleótido parental a un rango completo de sustituciones de codón. En otro aspecto, se utilizan al menos dos casetes degenerados - ya sea en el mismo oligonucleótido o no, para someter al menos dos codones originales en una plantilla de polinucleótido parental a un rango completo de sustituciones de codón. Por ejemplo, más de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligonucleótido para introducir mutaciones de aminoácidos en más de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T puede estar directamente contigua, o separada por una o más secuencia (s) de nucleótidos adicional (es) . En otro aspecto, se pueden utilizar oligonucleótidos servibles para introducir adiciones y eliminaciones ya sea solas o en combinación con los codones que contienen una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinación o permutación de , adiciones, eliminaciones, y/o sustituciones de aminoácidos.
En un aspecto, se hace una mutagénesis simultánea de dos o más posiciones de aminoácidos contiguos utilizando un oligonucleótido que contiene tripletes o tercetos N,N,G/T contiguos, es decir, una secuencia N,N,G/T degenerada. En otro aspecto, se utilizan casetes degenerados que tienen menos degeneración que la secuencia N, , G/T . Por ejemplo, puede ser deseable en algunos casos utilizar (por ejemplo, en un oligonucleótido) una secuencia de triplete degenerado comprendida de solamente N, donde dicho N puede estar en la primera posición o tercera posición del triplete. Cualquier otra base que incluye cualquier combinación y permutación del mismo se puede utilizar en las posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser deseable en algunos casos utilizar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete ?,?,? degenerada.
En un aspecto, el uso de tripletes degenerados (por ejemplo, tripletes N,N,G/T) permiten la generación sistémica y i fácil de un rango completo ?ß· posibles aminoácidos naturales (para un total de 20 aminoácidos) , en todas y cada una las posiciones de aminoácidos en un polipéptido (en aspectos alternativos, los métodos también incluyen la generación de menos de la totalidad de posibles sustituciones por residuo de aminoácido, o codón, posición) . Por ejemplo, para un polipéptido de 100 aminoácidos, se pueden general 2000 distintas especies (es decir 20 posibles aminoácidos por posición X 100 posiciones de aminoácidos) . A través del uso de un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que contienen un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales pueden codificar todos los 20 aminoácidos naturales posibles. Por consiguiente, en un recipiente de reacción en el cual una secuencia de polipéptido parental se somete a mutagénesis de saturación utilizando al menos tal oligonucleótido, existen 32 distintos polinucleótidos de progenie, generados, que codifican 20 polipéptidos distintos. En contraste, el uso de un oligonucleótido no degenerado en mutagénesis de centros específicos lleva sólo a un polipéptido de progenie por recipiente de reacción. Pueden utilizarse opcionalmente oligonucleótidos no degenerados para generar mutaciones puntuales específicas en un polinucleótido de trabajo. Esto proporciona un medio para generar mutaciones puntuales silenciosas, mutaciones puntuales que conducen a los correspondientes cambios de aminoácidos, y mutaciones puntuales que causan la generación de codones de detención y la correspondiente expresión de fragmentos de polipéptidos.
En un aspecto, cada recipiente de reacción para mutagénesis de saturación contiene polinucleótidos que codifican al menos 20 moléculas de polipéptidos de progenie (por ejemplo, hidrolasa, por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) de tal manera que todos los 20 aminoácidos naturales se representan en la posición de aminoácido especifico correspondiente a la posición de codón mutagenizada en el polinucleótido parental (otros aspectos utilizan menos de la totalidad de 20 combinaciones naturales) . Los polipéptidos de progenie 32 veces degenerados, generados de cada recipiente de reacción para mutagénesis de saturación, se pueden someter a amplificación clonal (por ejemplo, clonarse en un hospedero adecuado, por ejemplo, hospedero de E. coli, utilizando un vector de expresión) y someterse a selección de expresión. Cuando un polipéptido de progenie se identifica mediante selección por mostrar un cambio favorable en su propiedad (cuando se. compara con el polipéptido parental, tal como una selectividad incrementada para hidrólisis de ésteres de palmitato versus hidrólisis de esteres de oleato) , el mismo se puede secuenciar para identificar la sustitución de aminoácido correspondientemente favorable contenida en el mismo.
En un aspecto, al mutagenizar todas y cada una de las posiciones de aminoácidos en un polipéptido parental utilizando la mutagénesis de saturación que se da a conocer en la presente, pueden identificarse cambios de aminoácidos favorables en más de una posición de aminoácido. Se puede generar una o más moléculas de progenie que contienen una combinación de la totalidad o parte de estas sustituciones de aminoácidos favorables. Por ejemplo, si se identifican 2 cambios de aminoácidos favorables en cada una de las 3 posiciones de aminoácidos en un polipéptido, las permutaciones incluyen 3 posibilidades en cada posición (sin cambio del aminoácidos original, y cada uno de los dos cambios favorables) y 3 posiciones. Por consiguiente, existen 3 x 3 x 3 ó 27 posibilidades totales, incluyen 7 que se examinaron previamente - 6 mutaciones puntuales individuales (es decir 2 en cada una de tres posiciones) y sin cambió en ninguna posición .
En otro aspecto, se puede utilizar mutagénesis de saturación de sitios junto con otros medios estocásticos o no estocásticos para variar la secuencia, por ejemplo, reensamblaje de ligación sintética (ver más adelante), recomposición o barajado, quimerización, recombinación y otros proceso de mutagenización y agentes mutagenizantes . Se proporciona (n) en la presente proceso (s) de mutagenización, incluyendo mutagénesis de saturación, utilizada de una manera iterativa.
Reensamblaje de Ligación Sintética (SLR) En un aspecto se proporcionan en la presente sistemas de modificación genética no estocásticos , denominados "reensamblaje de ligación sintético", o simplemente "SLR", también conocidos como tecnología "GeneReassembly", un "proceso de evolución dirigida", para generar polipéptidos , por ejemplo, enzimas (tal como hidrolasas, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas ) o anticuerpo que se proporcionan en la presente, con propiedades nuevas o alteradas. SLR es un método para ligar fragmentos de oligonucleótidos conjuntamente no estocásticamente . Este método difiere de la recomposición o barajado de oligonucleótidos estocásticos en que los bloques de construcción de ácido nucleico no se reordenan, concatenan o quimerizan al azar, sino que más bien se ensamblan no estocásticamente. Ver, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 6,773,900; 6,740,506; 6,713,282; 6,635,449; 6,605,449; 6, 537, 776.
En un aspecto, SLR comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polinucleotido de plantilla, en donde el polinucleotido de plantilla comprende la secuencia que codifica un gen homólogo; (b) proporcionar una pluralidad de polinucleótidos de bloques de construcción, en donde los polinucleótidos de bloque de construcción se diseñan para entrecruzar el reensamblaje con; el polinucleotido de plantilla en una secuencia predeterminada, y un polinucleotido de bloque de construcción comprende una secuencia que es una variante del gen homólogo y una secuencia homologa al polinucleótido de plantilla que flanquea la secuencia variante; (c) combinar un polinucleótido de bloque de construcción con un polinucleótido de plantilla para generar polinucleótidos que comprendan variaciones de secuencia de genes homólogos.
SLR no depende de la presencia de altos niveles de homología entre los polinucleótidos a arreglar. Por consiguiente, este método se puede utilizar para generar no estocásticamente bibliotecas (o conjuntos de moléculas de progenie comprendidas de más de 10100 diferentes quimeras. SLR se puede utilizar para generar bibliotecas comprendidas de más de 10100 diferentes quimeras dé progenie. En un aspecto se proporcionan en la presente métodos no estocásticos para producir un conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico, finalizado, que tiene un orden de ensamble · total que se elige por diseño. Este método incluye las etapas de generar por diseño una pluralidad de bloques de construcción de ácidos nucleicos específicos que tienen extremos que se pueden ligar mutuamente compatibles, servibles, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, y ensamblar estos bloques de construcción de ácidos nucleicos, de tal manera que se logre un orden de ensamble total, diseñado.
Los extremos que se pueden ligar, mutuamente compatibles, de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se ensamblan, se consideran "servibles" para ese tipo de ensamble ordenado si los mismos permiten a los bloques de construcción acoplarse en órdenes predeterminados. Por consiguiente, el orden ensamble total en el cual se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos, se especifica por el diseño de los extremos que se pueden ligar. Si se va a utilizar más de un paso de ensamble, entonces el orden de ensamble total en el cual se pueden acoplar los bloques de construcción de ácidos nucleicos, también se especifica por el orden secuencial de las etapa (s) de ensamble. En un aspecto, las piezas de construcción endurecidas se tratan con una enzima, tal como una ligasa (por ejemplo, ligasa de ADN T4), para lograr un enlace covalente de las piezas de construcción.
En un aspecto, se obtiene el diseño de los bloques de construcción de oligonucleótidos analizando un conjunto de plantillas de secuencia de ácido nucleico progenitor que sirve como base para producir un conjunto de progenies de polinucleótidos quiméricos finalizados. Estas plantillas de oligonucleótidos parentales por consiguiente sirven como una fuente de información de secuencia que ayuda en el diseño de los bloques de construcción de ácidos nucleicos que se van a mutagenizar, por ejemplo, quimerizar o reordenar. En un aspecto de este método, las secuencias de una pluralidad de plantillas de ácido nucleico parental, se alinean con el fin de seleccionar uno o más puntos de demarcación. Los puntos de demarcación se pueden ubicar en un área de homología, y están comprendidos de uno o más nucleótidos. Estos puntos de demarcación alternativamente se comparten por al menos dos de las plantillas progenitoras . Los puntos de demarcación se pueden utilizar por lo tanto para delinear los limites de los bloques de construcción de oligonucleotidos a generarse con el fin de reorganizar los polinucleótidos parentales. Los puntos de demarcación identificados y seleccionados en las moléculas progenitoras sirven como potenciales puntos de quimerización en el ensamble de las moléculas de progenies quiméricas, finales. Un punto de demarcación puede ser un área de homología (comprendida de al menos una base de nucleótidos homólogos) compartida por al menos dos secuencias de polipéptido parentales. Alternativamente, un punto de demarcación puede ser un área de homología que es compartida por al menos la mitad de las secuencias de polinucleótidos parentales, o, el mismo puede ser un área de homología que es compartida por al menos dos tercios de las secuencias de polinucleótidos parentales. En, modalidades alternativas, un punto de demarcación servible es un área de homología que es compartida por al menos tres cuartos de las secuencias de polinucleotido parentales, o, el mismo se puede compartir por casi todas las secuencias de polinucleótidos parentales. En un aspecto, un punto de demarcación es un área de homología que es compartida por todas las secuencias de polinucleótidos parentales .
En un aspecto, el proceso de reensamblaje de ligación se realiza exhaustivamente con el fin de generar una biblioteca exhaustiva de polinucleótidos quiméricos de progenie. En otras palabras, se representan todas las combinaciones ordenadas posibles de los bloques de construcción de ácido nucleico en el conjunto de moléculas de ácido nucleico quimérico, finalizado. Al mismo tiempo, en otro aspecto, el orden de ensamble (es decir el orden de ensamble de cada bloque de construcción en la secuencia 5' a 3 de cada ácido nucleico quimérico finalizado) en cada combinación es por diseño (o no estocástico) como se describe anteriormente. Se proporcionan en la presente métodos que reducen la posibilidad de productos secundarios no deseados.
En otro aspecto, el método de reensamblaje de ligación se realiza sistemáticamente. Por ejemplo, el método se realiza con el fin de generar una biblioteca sistemáticamente compartimentalizada de moléculas de progenie, con compartimentos que se pueden seleccionar sistémicamente , por ejemplo, uno a uno. En la presente se proporcionan métodos que comprenden el uso selectivo y juicioso de reacciones de ensamble en etapas secuenciales , se puede lograr un diseño donde se hacen conjuntos específicos de productos de progenie en cada uno de los diversos recipientes de reacción. Esto permite realizar un examen sistemático y procedimiento de selección. Por consiguiente, estos métodos permiten examinar un número potencialmente muy grande de moléculas de progenie sistemáticamente en grupos más pequeños. Debido a su capacidad de realizar quimerizaciones de una manera que es muy flexible incluso exhaustiva y sistemática también, particularmente cuando hay un bajo nivel de homología entre las moléculas progenitoras , estos métodos proporcionan la generación de una biblioteca (o conjunto) comprendida de un gran número de moléculas de progenie. Debido a la naturaleza no estocástica de los métodos de reensamblaje de ligación instantánea, las moléculas de progenie generadas pueden comprender una biblioteca de moléculas de ácido nucleico quimérico que tienen un orden ensamble total que se elige por el diseño. La mutagénesis de saturación y métodos s de evolución dirigida optimizada también se pueden utilizar para generar diferentes especies moleculares de progenie.
En un aspecto, los métodos de la presente proporcionan la libertad de elección y control respecto a la selección de puntos de demarcación, el tamaño y número de los bloques de construcción de ácido nucleico, y el tamaño y diseño de los acoplamientos. El requerimiento de homología intermolecular puede ser muy relajado. De hecho, los puntos de demarcación incluso se pueden elegir en área de poca o nada de homología intermolecular. Por ejemplo, debido a la oscilación de codones, es decir la degeneración de codones, se pueden introducir sustituciones de nucleótidos en bloques de construcción de ácido nucleico sin alterar el aminoácido originalmente codificado en la correspondiente plantilla progenitora. Alternativamente, un codón se puede alterar de tal manera en que se altere la codificación de un aminoácido original. En un aspecto, se pueden introducir sustituciones en el bloque de construcción de ácidos nucleicos con el fin de incrementar la incidencia de puntos de demarcación homólogos intermoleculares y por consiguiente para permitir lograr un número incrementado de acoplamientos entre los bloques de construcción, los cuales a su vez permiten generar un gran número de moléculas quiméricas de progenie.
En otro aspecto, la naturaleza sintética de la etapa en la cual se generan los bloques de construcción, permite que el diseño e introducción de nucleótidos (por ejemplo, uno o más nucleótidos, los cuales, por ejemplo, pueden ser codones o intrones o secuencias reguladoras) que más tarde se pueden remover opcionalmente en un proceso in vitro (por ejemplo, mediante mutagénesis) o en un proceso in vivo (por ejemplo, utilizando la capacidad de acoplamiento de genes de un organismo hospedero) . Se aprecia que en muchos casos la introducción de estos nucleótidos también puede ser deseable por muchas otras razones además del beneficio potencial de crear un punto de demarcación servible.
En un aspecto, se utiliza un bloque de construcción de ácidos nucleicos para introducir un intrón. Por consiguiente, se introducen intrones funcionales en un gen hecho por el hombre, fabricado de acuerdo a los métodos descritos en la presente. El (los) intrón(es) introducido ( s ) artificialmente puede (n) ser funcional (es) en una célula hospedera para acoplamiento de genes tanto como la manera en que los intrones de origen natural sirven funcionalmente en el acoplamiento de genes .
Sistema de Evolución Dirigida Optimizada En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente sistemas de modificación genética, no estocásticos , denominados "sistemas de evolución dirigida optimizada" para generar hidrolasas y anticuerpos con propiedades nuevas o alteradas. La evolución dirigida optimizada está dirigida al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación y selección que permiten la evolución molecular dirigida de ácidos nucleicos a través de la recombinación. La evolución molecular dirigida optimizada permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionadas, en donde la población generada se enriquece significativamente para que las secuencias tengan un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento .
Un evento de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimérica donde ocurre un cambio en la secuencia de una variante parental a otra variante parental. Tal punto normalmente está en la unión donde se ligan conjuntamente los oligonucleótidos de dos progenitores para forma una sola secuencia. Este método permite el cálculo de las concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótido de modo que la población quimérica final de secuencias se enriquece para el número elegido de eventos de entrecruzamiento . Esto proporciona más control sobre variantes quiméricas de elección que tienen un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento.
Además, este método proporciona un medio conveniente para explorar una tremenda cantidad del posible espacio de variante de proteína en comparación con otros sistemas. Previamente, si se generan, por ejemplo, 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, podría ser extremadamente difícil analizar una actividad particular de tal gran número de variantes quiméricas. Además, una porción significativa de la población de progenie podría tener un número muy alto de eventos de entrecruzamiento los cuales dan como resultado proteínas que es menos probable que tengan niveles incrementados de una actividad particular. Utilizando estos métodos, la población de moléculas quiméricas se puede enriquecer para que aquellas variantes tengan un número particular de eventos de entrecruzamiento. Por consiguiente, aunque todavía se pueden generar 1013 moléculas quiméricas durante una reacción, cada una de las moléculas elegidas para un análisis posterior, es más probable que tenga, por ejemplo, solamente tres eventos de entrecruzamiento . Debido a que la población de progenie resultante se puede inclinar a tener un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento, se reducen los limites de la variedad funcional entre las moléculas quiméricos. Esto proporciona un número más manejable de variables al calcular cuál oligonucleótido de los polinucleótidos parentales originales podría ser el responsable de afectar una característica particular.
Un método para crear una secuencia de polinucleótidos de progenie quiméricos, es crear oligonucleótidos correspondientes a fragmentos o porciones de cada secuencia parental. En modalidades alternativas, cada oligonucleótido incluye una región única de superposición de modo que el mezclado de los oligonucleótidos conjuntamente de como resultado una nueva variante que tenga cada fragmento de oligonucleótido ensamblado en el orden correcto. Alternativamente se pueden encontrar protocolos para practicar estos métodos que se proporcionan en la presente, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,773,900; 6,740,506; 6,713,282; 6,635,449; 6,605,449; 6,537,776; 6,361,974.
El número de oligonucleótidos generados para cada variante parental lleva una relación respecto al número total de entrecruzamientos resultantes en la molécula quimérica que se crea al final. Por ejemplo, podrían proporcionarse tres variantes de secuencia de nucleótidos parentales para someterse a una reacción de ligación con el fin de encontrar una variante quimérica que tenga, por ejemplo, actividad mayor a temperatura elevada. Como un ejemplo, se puede generar un conjunto de 50 secuencias de oligonucleotidos correspondiente a cada una de las porciones de cada variante parental. De acuerdo con esto, durante el proceso de reensamblaje de ligación podría haber hasta 50 eventos de entrecruzamiento dentro de cada una de las secuencias quiméricas. La probabilidad de que cada uno de los polinucleótidos quiméricos generados contendrá oligonucleotidos de cada variante parental en orden alternante, es muy baja. Si cada fragmento de oligonucleótido está presente en la reacción de ligación en la misma cantidad molar es probable que en algunas posiciones los oligonucleotidos del mismo polinucleótido parental se ligue seguidamente a otro y por consiguiente no da como resultado un evento de entrecruzamiento. Si la concentración de cada oligonucleótido de cada progenitor se mantiene constante durante cualquier etapa de ligación en este ejemplo, existe un 1/3 de oportunidad (asumiendo 3 progenitores) de que un oligonucleótido de la misma variante parental se ligará dentro de la secuencia quimérica y no producirá entrecruzamiento.
De acuerdo con esto, se puede determinar una función de densidad de probabilidad (PDF); para predecir la población de eventos de entrecruzamiento que es probable que ocurran durante cada etapa en una reacción de ligación que da un número de conjuntos de variantes parentales, un número de oligonucleótidos correspondientes a cada variante, y las concentraciones de cada variante durante cada etapa en la reacción de ligación. La estadística y matemáticas detrás de la determinación de la PDF se describen más adelante. Utilizando estos métodos, se puede calcular tal función de densidad de probabilidad, y por consiguiente enriquecer la población de progenie quimérica para un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento resultante de una reacción de ligación particular. Además, se puede determinar un número objetivo de eventos de entrecruzamiento, y el sistema se programa entonces para calcular las cantidades de partida de cada oligonucleótido parental durante cada etapa en la reacción de ligación que da como resultado una función de densidad de probabilidad que se centra en el número predeterminado de eventos de entrecruzamiento. Estos métodos están dirigidos al uso de ciclos repetidos de reclasificación reductiva, recombinación y selección que permiten la evolución molecular dirigida de un ácido nucleico que codifica un polipéptido a través de recombinación. Este sistema permite la generación de una gran población de secuencias quiméricas evolucionada, en donde la población generada se enriquece significativamente para que las secuencias tengan un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento. Un evento de entrecruzamiento es un punto en una secuencia quimérica donde ocurre un cambio en la secuencia de una variante parental a otra variante parental. Tal punto normalmente está en la unión de donde los oligonucleótidos de dos progenitores se ligan conjuntamente para formar una sola secuencia. El método permite el cálculo de las ' concentraciones correctas de secuencias de oligonucleótidos de modo que la población quimérica final de secuencia se enriquezca para el número elegido de eventos de entrecruzamiento. Esto proporciona más control sobre las variantes quiméricas de elección que tienen un número predeterminado de eventos de entrecruzamiento.
Determinación de Eventos de Entrecruzamiento En la presente se proporcionan aspectos que incluyen un sistema y programa informático que reciben una función de densidad de probabilidad (PDF) de entrecruzamiento deseada, el miembro de genes progenitores a re-ensamblarse, y el número de fragmentos en el reensamblaje como entradas de datos. La salida de datos de este programa es un "fragmento PDF" que se puede utilizar para determinar una receta para producir genes re-ensamblados, y la PDF de entrecruzamiento, estimada, de esos genes. El procesamiento descritos en la presente se realiza alternativamente en MATLAB™ (The Mathworks, Natick, Massachusetts ) un lenguaje de programación y entorno de desarrollo integrado para informática técnica.
Procesos Iterativos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente procesos que se pueden repetir iterativamente. Por ejemplo un ácido nucleico (o, el ácido nucleico) responsable de una hidrolasa alterada o fenotipo de anticuerpo se identifica, re-aisla, se modifica de nuevo, se re-analiza su actividad. Este proceso se puede repetir iterativamente hasta que se diseñe un fenotipo deseado. Por ejemplo, se puede diseñar una vía anabólica o catabólica, bioquímica, entera, en una célula, incluyen la actividad proteolítica .
De manera similar, si se determina que un oligonucleótido particular no tiene efecto en toda la característica deseada (por ejemplo, un nuevo fenotipo de hidrolasa) , el mismo se puede remover como una variable sintetizando oligonucleótidos parentales más grandes que incluye la secuencia a remover. Puesto que al incorporar la secuencia dentro de una secuencia más grande evita cualquier evento de entrecruzamiento, ya no habrá ninguna variación de esta secuencia en los polinucleótido de progenie. Esta práctica iterativa para determinar cuáles oligonucleótidos están más relacionados con la característica deseada, y cuáles no están relacionados, permite una exploración más eficiente de todas las posibles variantes de proteína que podrían proporcionar una característica o actividad particular.
Recomposición o barajado in vivo La recomposición in vivo de moléculas se utiliza en los métodos que se proporcionan en la presente que proveen variantes de los polipéptidos que se proporcionan en la presente, por ejemplo, anticuerpos, hidrolasas, y similares. La recomposición in vivo se puede realizar utilizando la propiedad natural de las células de recombinar multimeros. Aunque la recombinación in vivo ha provisto la principal via natural para diversidad molecular, la recombinación genética sigue siendo un proceso relativamente complejo que involucra 1) el reconocimiento de homologías; 2) escisión de hebras, invasión de hebras, y etapas metabólicas que conducen a la producción de quiasma recombinante, y finalmente 3) la resolución del quiasma en moléculas recombinadas discretas. La formación del quiasma requiere el reconocimiento de secuencias homologas .
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente método para producir un polinucleotido híbrido de al menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido. En otras modalidades, se proporcionan en la presente métodos utilizados para producir un polinucleotido híbrido introduciendo al menos un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido los cuales comparten al menos una región de homología de secuencia parcial en una célula hospedera adecuada. Las regiones de homología de secuencia promueven procesos que dan como resultado el reconocimiento de secuencia que produce un polinucleotido híbrido. En un aspecto, el término "polinucleotido híbrido" abarca cualquier secuencia de nucleótidos resultante de un método que se proporciona en la presente, y en una modalidad contiene la secuencia de al menos dos secuencias de polinucleotidos originales. Tales polinucleotidos híbridos pueden resultar de eventos de recombinación intermolecular que promueven la integración de secuencias entre moléculas de ADN . Además, tales polinucleotidos pueden resultar de procesos de reclasificación reductiva, intramolecular, los cuales utilizan secuencias repetidas para alterar una secuencia de nucleótidos dentro de una molécula de ADN.
Producción de variantes de secuencia En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para hacer variantes de secuencia del ácido nucleico y secuencias de hidrolasa y anticuerpos que se proporcionan en la presente o para aislar hidrolasas utilizando los ácidos nucleicos y polipéptidos que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente variantes de un gen de hidrolasa que se proporcionan en la presente, las cuales se pueden alterar mediante cualquier medio, incluyendo, por ejemplo, métodos aleatorios o estocásticos , o métodos de "evolución dirigida" o no estocásticos , que se describen anteriormente.
En la presente se proporcionan métodos para generar una variante de un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, que comprenden las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico de plantilla que comprende un ácido nucleico que se proporciona en la presente; y (b) modificar, eliminar o agregar uno o más nucleótidos en la secuencia de plantilla, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, el método puede comprender además el ácido nucleico variante para generar una hidrolasa variante, por ejemplo, un polipéptido de lipasa, saturasa, palmitasa o estearatasa. Las modificaciones., adiciones o eliminaciones se pueden introducir mediante un método que comprende PCR propensa a error, recomposición o barajado, mutagénesis dirigida con oligonucleótidos , PCR de ensamblaje, mutagénesis de PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis por cásete, mutagénesis de ensamblaje recursivo, mutagénesis de ensamblaje exponencial, mutagénesis de centros específicos, MutagénesisSM de Saturación de Sitios de Genes (GSSMSM) , reensamblaje de ligación sintética (SLR o GeneReassembly ) o una combinación de las mismas. En otro aspecto, las modificaciones, adiciones o eliminaciones se introducen mediante un método que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con espacios vacío, mutagénesis de reparación de apareamientos erróneos puntuales, mutagénesis de cepa hospedera carente de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis de eliminación, mutagénesis de selección por restricción, mutagénesis de purificación por restricción, síntesis de genes artificiales, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácido nucleico quimérico, y una combinación de las mismas.
En un aspecto, el método se puede repetir iterativamente hasta que se produzca una hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o estearatasa que tiene una actividad alterada o diferente o una estabilidad alterada o diferente a la de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de plantilla. En un aspecto, la hidrolasa variante, por ejemplo, polipéptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa es termo-tolerante, y mantiene alguna actividad después de exponerse a una temperatura elevada. En otro aspecto, la hidrolasa variante, por ejemplo, polipéptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa tiene una glicosilación incrementada en comparación con la hidrolasa, por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa codificada por un ácido nucleico de plantilla. Alternativamente, la hidrolasa variante, por ejemplo, polipéptido de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa tiene actividad de hidrolasa, por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa bajo una temperatura elevada, en donde la actividad de hidrolasa, por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa codificada por el ácido nucleico de plantilla no es activo bajo la temperatura elevada. En un aspecto, el método se puede repetir iterativamente hasta que se produzca una secuencia de codificación de hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, una saturasa, una palmitasa y/o una estearatasa que tenga un uso de codón alterado al del ácido nucleico de plantilla. En otro aspecto, el método se puede repetir iterativamente hasta que se produzca un gen de hidrolasa, por ejemplo, un gen de lipasa, un gen de saturasa, un gen de palmitasa y/o un gen de estearatasa, tenga niveles más altos o más bajos de expresión o estabilidad de mensaje a los del ácido nucleico de plantilla. En otro aspecto, la formulación del producto de hidrolasa final, por ejemplo, un producto de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, permite un incremento o modulación del desempeño de la hidrolasa, por ejemplo lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa en el producto.
Las variantes aisladas pueden ser de origen natural. Las variantes también se pueden crear in vitro. Las variantes pueden crearse utilizando técnicas de ingeniería genética tales como mutagénesis de centros específicos, mutagénesis de química aleatoria, procedimientos de eliminación con Exonucleasa III, y técnicas de clonación estándar. Alternativamente, tales variantes, fragmentos, análogos, o derivados pueden crearse utilizando síntesis química o procedimientos de modificación. Otros métodos para hacer variantes también son familiares para aquellos expertos en la técnica. Estos incluyen procedimientos en los cuales las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas de aislados naturales se modifican para generar ácidos nucleicos que codifiquen polipéptidos que tengan características que mejoren su valor en aplicaciones industriales 1 o de laboratorio. En tales procedimientos, se genera y caracteriza un gran número de secuencias de variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Estas diferencias de nucleótidos pueden dar como resultado cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptido codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, pueden crearse variantes utilizando PCR propensa a error, la PCR se realiza bajo condiciones donde la fidelidad de copiado de la polimerasa de ADN es baja, de tal manera que se obtenga una relación elevada de mutaciones puntuales a lo largo de la longitud completa del producto PCR. La PCR propensa a erro se describe, por ejemplo, en Leung, D. ., et al., Technique, 1:11-15, 1989) y Cald ell, R. C. & Joyce G.F., PCR ethods Applic, 2:28-33, 1992. Brevemente, en tales procedimientos, los ácidos nucleicos a mutagenizarse se mezclan con cebadores PCR, amortiguador de reacción MgCl2, MnCl2, polimerasa Taq y una concentración apropiada de dNTPs para lograr una relación elevada de mutación puntual a lo largo de la longitud completa del producto PCR. Por ejemplo, la reacción puede realizarse utilizando 20 fmoles de ácido nucleico a mutagenizarse, 30 pmoles de cada cebador PCR, un amortiguador de reacción que comprende KCl 50 mM, Tris HC1 10 mM (pH 8.3) y 0.01% de gelatina, MgCl2 7 mM, MnCl2 0.5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, dGTP 0.2 mM, dATP 0.2 mM, dCTP 1 mM, y dTTP 1 mM. La PCR puede realizarse durante 30 ciclos de 94 °C durante 1 min, 45°C durante 1 min, y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variarse cuando sea apropiado. Loa ácidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados .
También pueden crearse variantes utilizando mutagénesis dirigida con oligonucleótidos para generar mutaciones de centros específicos en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Brevemente, en tales procedimientos una pluralidad de oligonucleótidos de doble hebra que llevan una o más mutaciones a introducirse en el ADN clonado, se sintetizan e insertan en el ADN clonado a mutagenizarse. Se recuperan clones que contengan el ADN mutagenizado y se evalúan las actividades de los polipéptidos que se codifican.
Otro método para generar variantes es PCR de ensamblaje. La PCR de ensamblaje involucra el ensamblaje de un producto PCR de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Un gran número de diferentes reacciones PCR ocurre en paralelo al mismo vial, con los productos de una reacción cebando los productos de otra reacción. La PCR de ensamble se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,965,408.
Todavía otro método para generar variantes es la mutagénesis de PCR sexual. En la mutagénesis de PCR sexual, la recombinación homologa forzada ocurre entre moléculas de ADN de una secuencia de ADN diferente pero altamente relacionada in vitro, como resultado de una fragmentación aleatoria de la molécula de ADN en base a la homología de secuencia, seguido por la fijación del entrecruzamiento mediante extensión de cebador en una reacción PCR. La mutagénesis de PCR sexual se describe, por ejemplo, en Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Brevemente, en tales procedimientos una pluralidad de ácidos nucleicos a recombinarse se digiere con DNasa para generar fragmentos que tengan un tamaño promedio de 50-200 nucleótidos. Los fragmentos del tamaño promedio deseado se purifican y re-suspenden en una mezcla de PCR. La PCR se realiza bajo condiciones que faciliten la recombinación entre los fragmentos de ácido nucleico. Por ejemplo, la PCR puede realizarse re-suspendiendo los fragmentos purificados a una concentración de 10-30 ng/1 en una solución de 0.2 raM de cada uno de dNTP, gCl2 2.2 mM, CL 50 mM, Tris HC1 10 mM, pH 9.0, y 0.1% de Tritón X-100. 2.5 unidades de polimerasa Taq por 100:1 de la mezcla de reacción se agrega y la PCR se realiza utilizando el siguiente régimen: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos (30-45 veces) y 72 °C durante 5 minutos. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variarse cuando sea apropiado. En algunos aspectos, pueden incluirse oligonucleótido en las reacciones PCR. En otros aspectos, el fragmento de Klenow de la polimerasa I de ADN puede utilizarse en un primer conjunto de reacciones PCR y puede utilizarse polimerasa Taq en un conjunto subsecuente de reacciones PCR. Las secuencias recombinantes se aislan y se evalúan las actividades de los polipéptidos que se codifican.
También pueden crearse variantes mediante mutagénesis in vivo. En algunos aspectos, se generan mutaciones aleatorias en una secuencia de interés propagando la secuencia de interés en una cepa bacteriana, tal como una cepa de E. coli, que lleva mutaciones en una o más vías de reparación de ADN. Tales cepas "mutagénicas" tienen una relación de mutación aleatoria más alta que la de un progenitor de cepa natural. La propagación del ADN en estas variantes eventualmente generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutagénicas para usarse en mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT No. WO 91/16427.
También pueden generarse variantes utilizando mutagénesis por cásete. En la mutagénesis por cásete una pequeña región de una molécula de ADN de doble hebra se reemplaza con un "cásete" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia natural. El oligonucleótido con frecuencia contiene una secuencia natural completa y/o parcialmente aleatorizada .
También puede utilizarse mutagénesis de ensamblaje recursivo para generar variantes. La mutagénesis de ensamblaje recursivo es un algoritmo para el diseño de proteínas (mutagénesis de proteínas) desarrollado para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retro alimentación para controlar las sucesivas rondas de mutagénesis por cásete combinatoria. La mutagénesis de ensamblaje recursivo se describe, por ejemplo, en Arkin (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815.
En algunos aspectos, se crean variantes utilizando mutagénesis de ensamblaje exponencial. La mutagénesis de ensamblaje exponencial es un proceso para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en donde pequeños grupos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conduzcan a proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamblaje exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552. La mutagénesis aleatoria o de centros específicos se describen, por ejemplo, en Arnold (1993) Current Opinión in Biotechnology 4:450-455.
En algunos aspectos, las variantes se crean utilizando procedimientos de recomposición o barajado en donde se fusionan conjuntamente porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican distintos polipéptidos para crear secuencias de ácidos nucleicos quiméricos que codifican los polipéptidos quiméricos que se describen en, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,965,408; 5,939,250.
En la presente se proporcionan variantes de polipéptidos que comprenden secuencias en las cuales uno o más de los residuos de aminoácidos (por ejemplo, de un polipéptido ejemplar, por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ,ó SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 2 que tienen uno, dos, tres cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas) se sustituyen con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (por ejemplo, un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no puede codificarse por el código genético. Las sustituciones conservativas son aquéllas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Por consiguiente, los polipéptidos de la presente incluyen aquéllos con sustituciones conservativas de secuencias, por ejemplo, las secuencias ejemplars que se proporcionan en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ó SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 2, que tienen uno, dos, tres cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas), que incluyen pero no están limitados a los siguientes remplazos: reemplazos de un aminoácido alifático tal como alanina, valina, isoleucina con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; reemplazo de residuo ácido tal como ácido aspártico y ácido glutámico con otro residuo ácido; reemplazo de un residuo que lleva un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro residuo que lleva un grupo amida; intercambio de un residuo básico tal como lisina y arginina con otro residuo básico; y el reemplazo de un residuo aromático tal como fenilalanina, tirosina, o triptófano con otro residuo aromático. Otras variantes son aquéllas en las cuales uno o más de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos que se proporcionan en la presente incluyen un grupo sustituyente .
Otras variantes dentro del alcance que se proporcionan en la presente son aquéllas en las cuales el polipéptido está asociado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido, por ejemplo, polietilenglicol . Las variantes adicionales dentro del alcance que se proporcionan en la presente son aquéllas en las cuales aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido, tal como una secuencia líder, una secuencia secretoria, una secuencia de proproteínas o una secuencia que facilite la purificación, enriquecimiento, o estabilización del polipéptido. En algunos aspectos, las variantes, fragmentos, derivados y análogos que se proporcionan en la presente mantienen la misma función o actividad biológica que los polipéptidos ejemplars, por ejemplo, una actividad proteolítica, que se describe en la presente. En otros aspectos, la variante, fragmento, derivado, o análogo incluye una proproteína, de tal manera que la variante, fragmento, derivado, o análogo se pueda activar mediante la escisión de la porción de proproteína para producir un polipéptido activo.
Optimización de codones para lograr altos niveles de expresión de proteína en células hospederas En ciertas modalidades, sé proporcionan en la presente métodos para modificar ácidos nucleicos que codifican hidrolasas para modificar el uso del codón. En una modalidad, se proporcionan en la presente métodos para modificar codones en un ácido nucleico que codifica una hidrolasa para incrementar o disminuir su expresión en una célula hospedera, por ejemplo, una célula de bacteria, insecto, mamífero, levadura o planta. Además se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican una hidrolasa modificada para incrementar su expresión en una célula hospedera, hidrolasa así modificada, y métodos para hacer las hidrolasas modificadas. El método comprende identificar un codón "no preferido" o un codón "menos preferido" en el ácido nucleico que codifica la hidrolasa y reemplazando uno o más de estos codones no preferidos o menos preferidos con un "codón preferido" que codifique el mismo aminoácido que el codón reemplazado y al menos un codón no preferido o menos preferido en el ácido nucleico ha sido reemplazado por un codón preferido que codifique el mismo aminoácido. Un codón preferido es un codón sobre-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera y un codón no preferido o menos preferido es un codón sub-representado en secuencias de codificación en genes en la célula hospedera.
Las células hospederas para expresar los ácidos nucleicos, casetes de expresión y vectores que se proporcionan en la presente incluyen células de bacterias, levaduras, hongos, plantas, células de insectos y células de mamíferos. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para optimizar el uso de codón en todas estas células, ácidos nucleicos y polipéptidos con codones alterados hechos mediante los ácidos nucleicos con codones alterados. Las células hospederas ejemplars incluyen bacterias gram negativas, tales como Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens; bacterias gram positivas, tales como Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus crémoris, Bacillus subtilis . Las células hospederas ejemplars también incluyen organismos eucariotas, por ejemplo, varias levaduras tales como Saccharomyces sp., incluyendo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, y Kl uyveromyces lactis, Hansenula polymorpha , Aspergillus niger, y células líneas y celulares de mamíferos y células y líneas celulares de insectos. Otras células hospederas ejemplars incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, células fúngicas, tales como Aspergillus, levadura tal como cualquier especie Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, incluyendo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, o Schizosaccharomyces pombe, células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes y adenovirus. La selección de un hospedero apropiado está dentro de las capacidades de aquellos expertos en la técnica. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos y polipéptidos optimizados para expresión en estos organismos y especies .
Por ejemplo, los codones de un ácido nucleico que codifique una hidrolasa aislada de una célula bacteriana se modifican de tal manera que el ácido nucleico se exprese óptimamente en una célula bacteriana diferente de las bacterias a partir de las cuales se derivó la hidrolasa, una levadura, un hongo, una célula de planta, una célula de insecto o una célula de mamífero. Los métodos para optimizar codones son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,795,737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Ver también Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, que describe la optimización de codones en sistemas de ratones; Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. , 24:18-24, que describe la optimización de codones en levaduras; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409; que describe la optimización de codones en E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, que describe la optimización del uso de codones que afecta la secreción de E. coli.
Animales no humanos transgénicos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente animales no humanos, transgénicos, que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (por ejemplo, una hidrolasa o un anticuerpo que se proporciona en la presente) , un cásete de expresión, un vector, una célula transfectada o transformada que se proporciona en la presente. Los animales no humanos, transgénicos pueden ser, por ejemplo, cabras, conejos, ovejas, cerdos, vacas, ratas y ratones, que comprendan los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente. Estos animales se pueden utilizar, por ejemplo, como modelos in vivo para estudiar la actividad de la hidrolasa, o, como modelos para seleccionar agentes que cambien la actividad de la hidrolasa in vivo. Las secuencias de codificación para los polipéptidos que se expresan en los animales no humanos transgénicos se puede diseñar para que sea constitutiva, o, que esté bajo el control de factores reguladores de transcripción inducible, o de desarrollo especifico, tejido especifico. Los animales, no humanos, transgénicos se pueden diseñar y generar utilizando cualquier método conocido en la técnica; ver, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,211,428; 6,187,992; 6, 156,952; 6,118,044; 6,111,166; 7,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 7,742; 5,087,571, que describen la creación y uso de células y huevos transformados y ratones, ratas, conejos, ovejas, cerdos y vacas transgénicos. Ver también, por ejemplo, Pollock (1999) J. Immunol . Methods 231:147-157,; que describe la producción de proteínas recombinantes en la : leche de animales lecheros transgénicos; Baguisi (1999) Nat . Biotechnol. 17:456-461, que demuestran la producción de cabras transgénicas . La Patente Norteamericana No. 6,211,428, describe la creación y uso de mamíferos no humanos, transgénicos, que expresan en sus cerebros un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de AD . La Patente Norteamericana No. 5, 387, 742, describe la inyección de secuencias de ADN recombinante o sintético, clonado, en óvulos de ratón fertilizados, implantando los óvulos inyectados en hembras pseudo-preñadas , y dejando crecer hasta término los ratones transgénicos cuyas células expresan proteínas relacionadas con la patología de la enfermedad de Alzheimer. La Patente Norteamericana No. 6,187,992, describe la creación y uso de un ratón transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen que codifica una proteína precursora amiloidea (ÁPP) .
También se pueden utilizar "animales nuligénicos o genosuprimidos" para practicar los métodos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, en un aspecto, los animales transgénicos o modificados que se proporcionan en la presente comprenden un "animal nuligénico", por ejemplo, un "ratón nuligénico", diseñado para no expresar un gen endógeno, el cual se reemplaza con un gen que expresa una hidrolasa, o, una proteína de fusión que comprende una hidrolasa que se proporciona en la presente. Como se indica anteriormente, también se pueden generar genosupresiones funcionales utilizando las secuencias antisentido que se proporcionan en la presente, por ejemplo, moléculas ARNi de doble hebra.
Plantas y Semillas Transgénicas En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente plantas y semillas transgénicas que comprenden un ácido nucleico, un polipéptido (polipéptido, una hidrolasa o un anticuerpo que se proporciona en la presente) , un cásete o vector de expresión o una célula transfectada o transformada que se proporciona en la presente. La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledóneas (una monocot) . En una modalidad, se proporcionan en la presente métodos para crear y utilizar estas plantas y semillas transgénicas. La planta o célula de planta transgénica que expresa un polipéptido que se proporciona en la presente puede construirse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. Ver, por ejemplo,, la Patente Norteamericana No. 6,309,872.
Los ácidos nucleicos y constructos de expresión que se proporcionan en la presente se pueden introducir en una célula de planta mediante cualquier medio. Por ejemplo, se pueden introducir ácidos nucleicos o constructos de expresión en el genoma de un hospedero de planta deseada, o, los ácidos nucleicos o constructos de expresión pueden ser episomas. La introducción en el genoma de una planta deseada puede ser de tal manera que la producción de hidrolasa del hospedero se regule mediante elementos de control de transcripción o traducción endógena. En un aspecto, se proporcionan en la presente "plantas nuligénicas" donde la inserción de la secuencia genética mediante, por ejemplo, recombinación homologa, ha alterado la expresión del gen endógeno. Los medios para generar plantas "nuligénicas" son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Strepp (1998) Proc Nati. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J 7:359-365. Ver la discusión sobre plantas transgénicas, más adelante.
Los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se pueden utilizar para conferir características deseadas esencialmente en cualquier planta, por ejemplo, en plantas que producen semillas oleaginosas, incluyendo salvado de arroz, colza (cañóla) , girasol, olivo, palma o soya, y similares, o en plantas que producen glucosa o almidón, tales como maíz, papa, trigo, arroz, cebada, y similares. Se pueden utilizar ácidos nucleicos para manipular las rutas metabólicas de una planta con el fin de optimizar o alterar la expresión de una hidrolasa o un substrato o producto de una hidrolasa, por ejemplo, un aceite, un lípido, tal como mono-, di- o tri-glicérido y similares. El puede cambiar las relaciones de lipidos, conversión de lipidos y recambio en una planta. Esto puede facilitar el procesamiento industrial de una planta. Alternativamente, las hidrolasas que se proporcionan en la presente se pueden utilizar en la producción de una planta transgénica para producir un compuesto no producido de manera natural por esa planta. Esto puede reducir los costos de producción o crear un nuevo producto.
En un aspecto, la primera etapa en la producción de una planta transgénica involucra hacer un constructo de expresión para la expresión en una célula de planta. Estas técnicas son bien conocidas en el arte. Los mismos pueden incluir seleccionar y clonar un promotor, una secuencia de codificación para facilitar un enlace eficiente de ribosomas a ARNm y la selección de las secuencias terminadores de genes apropiado. Un promotor constitutivo ejemplar es Ca V35S, del virus del mosaico de la coliflor, que generalmente da como resultado un alto grado de expresión en plantas. Otros promotores son más específicos y responden a indicios en el ambiente interno o externo de la planta. Un promotor inducible con luz, ejemplar, es el promotor del gen cab, que codifica la principal proteína de enlace a/b de la clorofila.
En un aspecto, el ácido nucleico se modifica para lograr mayor expresión en una célula de planta. Por ejemplo, es probable que una secuencia que se proporciona en la presente tenga un porcentaje más alto de pares de nucleótidos ?-? en comparación con el visto en una planta, alguno de los cuales prefieren pares de nucleótidos G-C. Por lo tanto, los nucleótidos A-T en la secuencia de codificación se pueden sustituir con nucleótidos G-C sin cambiar significativamente la secuencia de aminoácidos para mejorar la producción del producto genético en células de plantas.
Se puede agregar un gen marcador seleccionable al constructo genético con el fin de identificar células o tejidos de plantas que han integrado exitosamente el transgen. Esto puede ser necesario puesto que el logro de la incorporación y expresión de genes de células de plantas es un caso raro, que ocurre en solo' un pequeño porcentaje de los tejidos o células objetivo. Los genes marcadores seleccionables codifican proteínas que proporcionan resistencia a agentes que normalmente son tóxicos para plantas, tales como antibióticos o herbicidas. Solamente las células de plantas que han integrado el mercador seleccionable sobrevivirán cuando crezcan en un medio que contiene el antibiótico o herbicida. En lo que se refiere a otros genes insertados, los genes marcadores también requieren secuencias promotoras y de terminación para una función apropiada.
En un aspecto, la creación de plantas o semillas transgénicas comprende incorporar las secuencias que se proporcionan en la presente y, opcionalmente, genes marcadores en un constructo de expresión objetivo (por ejemplo, un plásmido, un fago) , junto con el posicionamiento del promotor y las secuencias terminadoras . Esto puede involucrar transferir el gen modificado en la planta a través de un método adecuado. Por ejemplo, puede introducirse un constructo directamente en el ADN genómico de la célula de la planta utilizando técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células de plantas, o los constructos se pueden introducir directamente al tejido de la planta utilizando métodos balísticos, tales como bombardeo de partículas de ADN. Por ejemplo, ver, por ejemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet . Syst. 72:63-69, que discute el uso de bombardeo de partículas para introducir transgenes en trigo; y Adam (1997) supra, para el uso de bombardeo de partículas para introducir YACs en células de plantas. Por ejemplo, Rinehart (1997) supra, utilizó bombardeo de partículas para generar plantas de algodón transgénico. Un aparato para aceleración de partículas se describe en la Patente Norteamericana No. 5,015,580; y, el instrumento de aceleración de partículas PDS-2000 de BioRad (Biolistics) comercialmente disponible; ver también, John, Patente Norteamericana No. 5,608,148; y Ellis, Patente Norteamericana No. 5,681,730, que describe la transformación de gimnospermas mediada con partículas.
En un aspecto, los protoplastos se pueden inmovilizar e inyectar con ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión. Aunque la regeneración de plantas a partir de protoplastos no es fácil con cereales, la regeneración de plantas es posible en legumbres utilizando embriogénesis somática de callos derivados de protoplastos . Los tejidos organizados se pueden transformar con ADN desnudo utilizando la técnica de pistola genética, donde el ADN se recubre en microproyectiles de tungsteno, tiro 1/100 el tamaño de las células, que llevan el ADN profundamente a las células y orgánulos. El tejido transformado se induce entonces para regenerar, usualmente mediante embriogénesis somática. Esta técnica ha sido exitosa en varias especies de cereal incluyendo maiz y arroz.
También se pueden introducir ácidos nucleicos, por ejemplo, constructos de expresión, en células de plantas utilizando virus recombinantes . Las células de plantas se pueden transformar utilizando vectores virales, tales como, por ejemplo, vectores derivados del virus de mosaico del tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999), ver Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants", Mol. Biotechnol. 5:209-221.
Alternativamente, se pueden combinar ácidos nucleicos, por ejemplo, un constructo de expresión, con regiones de flanqueo de T-ADN adecuadas e introducirse en un vector hospedero Agrobacterium turnefaciens convencional. Las funciones de virulencia del hospedero Agrobacterium tumefaciens dirigirá la inserción del constructo y marcador adyacente en el ADN de la célula de la planta cuando la célula se infecta por la bacteria. Las técnicas de transformación mediadas con Agrobacteriu tumefaciens, incluyendo la desactivación y uso de vectores binarios, se describen adecuadamente en la literatura científica. Ver, por ejemplo, Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. ( Springer-Verlag, Berlín 1995) . El ADN en una célula de A. tumefaciens está contenido en el cromosoma bacteriano así como en otra estructura conocida como un plásmido Ti (inductor de tumores) . El plásmido Ti contiene un tramo de ADN terminado en T de ADN (~20 kg de longitud) que se transfiere a la célula de la planta en el proceso de infección y una serie de genes vir (virulencia) que dirigen el proceso de infección. Una A. tumefaciens solamente puede infectar una planta a través de laceraciones: cuando una raíz y tallo de la planta está lacerado el mismo emite ciertas señales químicas, en respuesta a las cuales, los genes vir de A. tumefaciens se activan y dirigen una serie de eventos necesario para la transferencia del T-ADN del plásmido Ti al cromosoma de la planta. El T-ADN entra entonces a la célula de la planta a través de la laceración. Una especulación es que el T-ADN espera hasta que el ADN de la planta se replique o transcriba, luego se inserta por sí solo en el ADN de la planta expuesta. Con el fin de utilizar A. tumefaciens como un vector transgénico, tiene que removerse la sección inductora de tumores de T-ADN, al mismo tiempo que mantiene las regiones colindantes del T-ADN y los genes vir. El transgen se inserta entonces entre las regiones colindantes de T-ADN, donde el mismo se transfiere a la célula de la planta y se integra en los cromosomas de la planta.
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para la transformación de planas monocotiledóneas que utilizan los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente, incluyen cereales importantes, ver Hiei (1997) Plant Mol. Biol . 35:205-218. Ver también, por ejemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Nati. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, que describe un proceso para la integración estable de un ADN que comprende un gen que es funcional en una célula de un cereal, u otra planta monocotiledónea .
En un aspecto, la tercera etapa puede involucrar la selección y regeneración de plantas completas capaces de transmitir el gen objetivo incorporado a la siguiente generación. Tales técnicas de regeneración se apoyan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, que típicamente se apoya en un marcador biocida y/o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótido deseadas. La regeneración de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también se puede obtener del callo de la planta, explantes, órganos, o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys . 38:467-486. Para obtener plantas completas de tejidos transgénicos tales como embriones inmaduros, los mismos se pueden hacer crecer bajo condiciones ambientales controladas en una serie de medios que contienen nutrientes y hormonas, un proceso conocido como cultivo de tejido. Una vez que se generan y producen plantas completas, comienza la evaluación de la progenie.
Después de que el cásete de expresión se incorpora de manera estable en plantas transgénicas, el mismo se puede introducir en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera de una serie de técnicas de reproducción estándar, dependiendo de la especie a cruzarse. Puesto que la expresión de los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente lleva a cambios fenotípicos, las plantas que comprenden los ácidos nucleicos recombinantes que se proporcionan en la presente se pueden cruzar sexualmente con una segunda planta para obtener un producto final. Por consiguiente, la semilla que se proporciona en la presente se puede derivar de una cruza entre una planta que se proporciona en la presente y otra planta. Los efectos deseados (por ejemplo, expresión de los polipéptidos que se proporcionan en la presente para producir una planta con contenido de lipidos o aceite alterado, incrementado y/o disminuido) se pueden mejorar cuando ambas plantas parentales expresan los polipéptidos que se proporcionan en la presente. Los efectos deseados se pueden pasar a futuras generaciones de plantas mediante medios de propagación estándar.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos que se proporcionan en la presente se expresan en o se insertan en cualquier planta o semilla. Las plantas transgénicas que se proporcionan en la presente pueden ser dicotiledóneas o monocotiledóneas . Los ejemplos de plantas transgénicas monocotiledóneas que se proporcionan en la presente son pastos, tales como poa (pasto azul, Poa) , pasto de forraje tal como festuca (pastos perennes) , raigrás, paso frugal, tal como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, y maiz (grano) . Los ejemplos de plantas transgénicas dicot que se proporcionan en la presente son tabaco, legumbres, tales como lupinos, papa, remolacha azucarera, guisante y soya, y plantas cruciferas (familia Brassicaceae) , tal como la coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado ñrabidopsis thaliana . Por consiguiente, las plantas y semillas transgénicas que se proporcionan en la presente incluyen un amplio rango de plantas, que incluyen, pero no están limitadas a, especies del género Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, . Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucúrbita , Daucus, Elaeis, Fragaria , Glycine, Gossypíum, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, y Zea.
En modalidades alternativas, los ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente se expresan en plantas que contienen células de fibra, incluyen, por ejemplo, algodón, árbol de algodón de seda (Kapok, Ceiba pentandra) , sauce del desierto, matorral de creosota, planta floreciente winterfat, madera de balsa, ramio, kenaf (cáñamo de la India) , cáñamo, cáñamo Rosella, yute, sisal abacá y lino. En modalidades alternativas, las plantas transgénicas que se proporcionan en la presente pueden ser miembros del género Gossypium, incluyendo los miembros de cualquier especie Gossypium, tal como G. arboreum; G. herbaceum, G. barbadense, y G. hirsutum.
En ciertas modalidades, las plantas transgénicas se pueden utilizar para producir grandes cantidades de los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos, hidrolasas) que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, ver Palmgren (1997) Trends Genet . 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296 (que produce beta-caseina de la proteina de leche humana en plantas de papa transgénica utilizando un promotor de mannopina sintasa (masl',2') bidireccional , inducible con auxina con métodos de transformación de disco de hoja mediados con Agrobacterium turnafaciens) .
Utilizando procedimientos conocidos, un experto en la técnica puede seleccionar las plantas que se proporcionan en la presente detectando el incremento o disminución de ARNm transgénico o proteina en plantas transgénicas . Los medios para la detección y cuantificación de ARNms o proteínas son bien conocidos en la técnica.
En la presente se proporcionan ácidos grados o derivados de ácido graso de plantas transgénicas que se proporcionan en la presente, por ejemplo, plantas oleaginosas transgénicas. En un aspecto, se producen plantas que comprende al menos una hidrolasa que se proporciona en la presente. En un aspecto, la planta transgénica comprende un gen de hidrolasa enlazado operablemente a un promotor, que permite una expresión del gen ya sea en compartimientos celulares, extracelulares o tejido diferentes a aquéllos en los cuales se acumulan los lípidos de plantas, o permitiendo una inducción exógena de la hidrolasa. En un aspecto, se recolectan semillas y/o frutos que contienen los lípidos de las plantas, las semillas y/o frutos se trituran (si es necesario después del tratamiento de inducción genética con hidrolasa (por ejemplo, lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) para poner en contacto los lipidos y la hidrolasa que se proporcionan en la presente, contenidos en las semillas y/o frutos. La mezcla se puede dejar incubar para permitir la hidrólisis enzimática de los lipidos del material molido mediante la acción catalítica de la lipasa que se proporcionan en la presente, contenida en el material triturado. En un aspecto, los ácidos grasos formados mediante la hidrólisis se extraen y/o se convierten con el fin de obtener los derivados de ácido grado deseados.
Este proceso de hidrólisis enzimática que se proporcionan en la presente utiliza condiciones de operación moderadas y puede ser a escala reducida y utilizar instalaciones económicas. En este aspecto la planta que se proporciona en la presente se induce para producir la hidrolasa para la transformación de lipidos de plantas. Utilizando esta estrategia, se previene que la enzima entre en contacto con lipidos de plantas almacenados para evitar cualquier riesgo de hidrólisis prematura ("auto-degradación de la plana") antes de cosecharse. Las unidades de trituración e incubación pueden ser ligeras y de escala reducida; muchas son conocidas en la industria agrícola y se pueden llevar a cabo en los sitios donde se cosechan las plantas.
En un aspecto, las plantas transgénicas que se proporcionan en la presente se producen mediante la transformación de plantas oleaginosas naturales. Las plantas transformadas genéticamente que se proporcionan en la presente se reproducen entonces sexualmente para producir las semillas transgénicas que se proporcionan en la presente. Estas semillas se pueden utilizar para obtener una progenie de planta transgénica.
En un aspecto, el gen de hidrolasa se enlaza operablemente a un promotor inducible para prevenir cualquier contacto prematuro de la hidrolasa y lipido de la planta. Este promotor puede dirigir la expresión del gen en compartimentos diferentes a aquéllos donde los lipidos se acumulan o el promotor puede iniciar la expresión de la hidrolasa en un momento deseado mediante una inducción exógena.
Polipéptidos y péptidos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes , que tienen una identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 50% de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ó SEQ ID NO: 20 ó la SEQ ID NO: 2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que tienen una secuencia establecida en la NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ó SEQ ID NO: 20 ó la SEQ ID NO: 2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas.
La identidad de secuencia pude exceder la longitud completa del polipéptido, o, la identidad puede exceder una región de al menos aproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700 ó más residuos. Los polipéptidos que se proporcionan en la presente también pueden ser más cortos que la longitud completa de los polipéptidos ejemplificantes. En un aspecto se proporcionan en la presente polipéptidos que comprenden solamente una subsecuencia de una secuencia que se proporciona en la presente, las subsecuencias ejemplificantes pueden ser de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o más residuos. En aspectos alternativos, los polipéptidos (péptidos, fragmentos) pueden variar en tamaño entre aproximadamente y la longitud completa de un polipéptido, por ejemplo, una enzima que se proporciona en la presente; los tamaños e emplificantes son de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, o más residuos, por ejemplo, residuos contiguos de una hidrolasa ejemplificante que se proporciona en la presente. Los péptidos que se proporcionan en la presente pueden ser útiles como, por ejemplo, sondas de etiquetado, antigenos, tolerágenos, porciones, sitios activos de hidrolasa.
Los polipéptidos que se proporcionan en la presente también incluyen anticuerpos capaces de enlazarse a una hidrolasa que se proporciona en la presente.
Los polipéptidos que se proporcionan en la presente también incluyen secuencias de aminoácidos que son "sustancialmente idénticas" a las secuencias que se proporcionan en la presente, incluyendo las secuencias que difieren de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, eliminaciones, o inserciones de aminoácidos conservativos o no conservativos, particularmente cuando tal sustitución ocurre en un sitio ,que no es el sitio activo de la molécula, y siempre que el polipéptido mantenga esencialmente sus propiedades funcionales. Una sustitución de aminoácido conservativa, por ejemplo, sustituye un aminoácido por otro de la misma clase (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina, o metionina, por otro, o sustitución de un aminoácido polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina) . Uno o más ácidos se pueden etiquetar, por ejemplo, a partir de una hidrolasa, que de como resultado la modificación de la estructura del polipéptido, sin, alterar significativamente su actividad biológica. Por ejemplo, se pueden remover aminoácidos de amino- o carboxilo-terminal que no sean requeridos para la actividad de hidrolasa.
El "aminoácido" o "secuencia de aminoácidos" puede incluir un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteínas, o un fragmento, porción, o subunidad de cualquiera de estos, y moléculas de origen natural o sintéticas.
Los términos "polipéptido" y "proteína" pueden influir aminoácidos unidos entre sí mediante uniones de péptidos o uniones de péptidos modificadas, es decir, isoésteres de péptidos, y pueden contener aminoácidos modificados diferentes a los aminoácidos con 20 genes codificados. El término "polipéptido" también incluye péptidos y fragmentos de polipéptidos , porciones y similares. El término también incluye polipéptido glicosilados . Los péptidos y polipéptidos que se proporcionan en la presente también incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" , que se describen con más detalle, posteriormente.
Los polipéptidos que se proporcionan en la presente incluyen hidrolasas en una forma activa o inactiva. Por ejemplo, los polipéptidos que se proporcionan en la presente incluyen proproteinas antes de la "maduración" o procesamiento de secuencias prepro, por ejemplo, mediante una enzima de procesamiento de proproteinas, tal como una convertasa de proproteina para generar una proteina madura "activa". Los polipéptidos que se proporcionan en la presente incluyen hidrolasas inactivas por otras razones, por ejemplo, antes de la "activación" mediante un evento de procesamiento post-traducción, por ejemplo, una acción de endo- o exo-peptidasa o proteinasa, un evento de fosforilación, una amidación, una glicosilación o una sulfatación, un evento de dimerización, y similares. Los métodos para identificar secuencias de dominio "prepro" y secuencias de señal son bien conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4 (2 ) : 115-136. Por ejemplo, para identificar una secuencia prepro, la proteina se purifica a partir del espacio extracelular y la secuencia de proteina N-terminal se determina y compara con la forma no procesada.
Los polipéptidos que se proporcionan en la presente incluyen todas las formas activas, incluyen subsecuencia activas, por ejemplo, dominios catalíticos o sitios activos, de una enzima que se proporciona en la presente. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente dominios o sitios activos como se establece más adelante. En otras modalidades, se proporcionan en la presente péptidos o polipéptidos que comprende o consisten de un dominio de sitio activo que se predice a través del uso de una base de datos tal como Pfam (la cual es una gran recolección de múltiples alineaciones de secuencia y modelos Markov escondidos que abarcan muchas familias de proteínas comunes. La base de datos de las familias de proteínas Pfam, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Et iller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones , .L. Howe, M. Marshall, y E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30 (1) : 276-280, 2002) ó equivalente.
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente polipéptidos con o sin una secuencia de señal y/o secuencia prepro . En una modalidad, se proporcionan en la presente polipéptidos con secuencias de señal heterólogos y/o secuencias prepro. La secuencia prepro (incluyendo una secuencia que se proporciona en la presente utilizada como un dominio prepro heterólogo) se puede ubicar en el extremo amino terminal o carboxi terminal de la proteína. En otra modalidad, se proporcionan en la presente secuencias de señal aisladas, sintéticas o recombinantes , secuencias prepro y dominios catalíticos (por ejemplo, "sitios activos" que comprende o consisten de secuencias que se proporcionan en la presente. La secuencia de señal, dominios prepro y/o dominio catalítico que se proporcionan en la presente pueden ser parte de una proteína de fusión, por ejemplo, como un dominio heterólogo en una proteína quimérica. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs), dominios prepro y secuencias de señal (SPs, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/consiste de residuos amino terminales de un polipéptido que se proporciona en la presente) . En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente secuencias de señal que comprenden un péptido que comprende/consiste de una secuencia que se establece en los residuos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, l a 17, 1 a 18, 1 a 19, l a 20, 1 a 21, 1 a 22, l a 23, 1 a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, 1 a 28, l a 28, 1 a 30, 1 a 31, l a 32, 1 a 33, 1 a 34, l a 35, 1 a 36, l a 37, 1 a 38, 1 a 39, l a 40, 1 a 41, 1 a 42, l a 43, 1 a 44, 1 a 45, l a 46, 1 a 47, 1 a 48, 1 a 49 ó 1 a 50, de un polipéptido que se proporciona en la presente.
Los polipéptidos y péptidos que se proporcionan en la presente se pueden aislar de fuentes naturales, pueden ser polipéptidos sintéticos, o pueden generarse recombinantemente . Los péptidos y proteínas se pueden expresar recombinantemente in vitro o in vivo. Los péptidos y polipéptidos que se proporcionan en la presente se pueden hacer y aislar utilizando cualquier método conocido en la técnica. El polipéptido y péptido que se proporcionan en la presente también se pueden sintetizar, completos o en partes, utilizando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por ejemplo, la síntesis de péptidos se puede realizar utilizando varias técnicas de fase sólida (ver por ejemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) y la síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, utilizando el ABI 43 IA Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante.
Los péptidos y polipéptidos que se proporcionan en la presente también se pueden glicosilar. La glicosilación se puede agregar posterior a la traducción ya sea químicamente o mediante mecanismos biosintéticos celulares, en donde la última incorpora el uso de porciones de glicosilación conocidas, las cuales pueden ser naturales para la secuencia o se pueden agregar como un péptido o agregarse en la secuencia que codifica el ácido nucleico. La glicosilación se puede enlazar con O ó se pueden enlazar con O.
Los polipéptidos o proteínas "recombinantes" se refieren como polipéptidos o proteínas producidas mediante tánicas de ADN recombinante; es decir, producidas a partir de células transformadas por un constructo de ADN exógeno que codifica el polipéptido o proteína deseados. Los ácidos nucleicos "sintéticos" (incluyendo los oligonucleótidos ) , polipéptidos o proteínas que se proporcionan en la presente, incluyen aquéllos preparados mediante cualquier síntesis química, por ejemplo, como se describe, más adelante.
Los "fragmentos" que se utilizan en la presente son una porción de una proteína de origen natural que puede existir en al menos dos diferentes conformaciones. Los fragmentos pueden tener la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína de origen natural. Los "fragmentos enzimáticamente activos" que se utilizan en la presente son una porción de una secuencia de aminoácidos (que codifica una proteína) la cual mantienen al menso una actividad funcional de la proteína con la cual el mismo está relacionado. "Sustancialmente igual" significa que una secuencia de aminoácidos es mayormente, aunque no totalmente, igual, aunque mantiene al menos una actividad funcional de la secuencia con la cual el mismo está relacionado. En general dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente iguales" o "sustancialmente homologas" si las mismas son al menos aproximadamente 85% idénticas. También se incluyen fragmentos que tienen diferentes estructuras tridimensionales a la de la proteína de origen natural. Un ejemplo de esto, es una molécula de "pro-forma", tal como una proproteína de baja actividad que se puede modificar mediante escisión para producir una enzima madura con actividad significativamente más alta.
Los péptidos y polipéptidos que se proporcionan en la presente, como se define anteriormente, incluyen todas las formas "miméticas" y "peptidomiméticas" . Los términos "mimético" y "peptidomimético" se refieren a un compuesto químico sintético el cual tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales de los polipéptidos que se proporcionan en la presente. El mimético puede estar ya sea completamente compuesto de análogos sintéticos, no naturales, de aminoácidos, o, es una molécula quimérica de aminoácidos de péptidos parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El mimético también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservativas, siempre y cuando tales sustituciones tampoco alteren sustancialmente la estructura y/o actividad del mimético. Al igual que los polipéptidos que se proporcionan en la presente los cuales son variantes conservativas, la experimentación rutinaria determinará si un mimético está dentro del alcance que se proporciona en la presente, es decir, que su estructura y/o función no se altera sustancialmente. Por consiguiente, en un aspecto, una composición mimética está dentro del alcance que se proporciona en la presente si la misma tiene una actividad de hidrolasa .
Las composiciones miméticas de polipéptidos que se proporcionan en la presente pueden contener cualquier combinación de componentes estructurales no naturales. En un aspecto alternativo, las composiciones miméticas que se proporcionan en la presente incluyen uno o todos los siguientes tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes a los enlaces de unión de amida natural ("unión de péptido"); b) residuos no naturales en vez de residuos de aminoácidos de origen natural; o c) residuos que induzcan un mimetismo estructural secundario, es decir, que induzcan o estabilicen una estructura secundaria, por ejemplo, un giro beta, giro gamma, laminilla beta, conformación de hélice alfa, y similares. Por ejemplo, un polipéptido que se proporcionan en la presente se puede caracterizar como un mimético cuando todos o algunos de sus residuos se unen mediante medios químicos diferentes a las uniones de péptidos naturales. Los residuos peptidomiméticos individuales se pueden unir mediante uniones de péptidos, otras uniones químicas o medios de acoplamiento, tales como, por ejemplo, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida , maleimidas bifuncionales , N, N' -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o ?,?'-diisopropilcarbodiimida (DIC) . Los grupos de enlace que pueden ser una alternativa a los enlaces de unión de amida tradicional ("unión de péptido") incluyen, por ejemplo, quetometileno (por ejemplo, C(=0)-CH2 para -C(=0)-NH-), aminometileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH2-0) , tioéter (CH2-S), tetrazol (CN4-)., tiazol, retroamida, tioamida, o éster (ver, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol . 7, pp. 267-357, "Peptide Backbone Modifications" , Marcell Dekker, NY) .
Un polipéptido que se proporciona en la presente también se puede caracterizar como un mimético que contiene todos o algunos residuos no naturales en vez de residuos de aminoácidos de origen natural. Los residuos no naturales se describen adecuadamente en la literatura científica y de patente; unas cuantas composiciones no naturales, ejemplificantes, útiles como miméticos de residuos de aminoácidos naturales y guías se describen más adelante. Los miméticos de aminoácidos aromáticos se pueden generar reemplazando con, por ejemplo, D- o L-nafilalanina ; D- o L-fenilglicina ; D- ó L-2 tieneilalanina ; D- o L-l, -2, 3-, ó 4-pireneilalanina; D- o L-3 tieneilalanina; D- o L-(2-piridinil) -alanina; D- o L- ( 3-piridinil ) -alanina; D- o L-(2-pirazinil) -alanina; D- o L- ( 4-isopropil ) -fenilglicina; D-(trifluorometil) -fenilglicina; D- ( trifluorometil ) -fenilalanina ; D-p-fluoro-fenilalanina ; D- o L-p-bifenilfenilalanina; D- o L-p-metoxi- bifenilfenilalanina; D-o L-2-indol (alquil ) alaninas ; y,, D- o L-alquilaininas , donde el alquilo puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotilo, iso-pentilo substituido o no substituido, o un aminoácido no ácido. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos aromáticos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, y piridilo.
Se pueden generar miméticos de aminoácidos acidicos mediante sustituciones por, por ejemplo, aminoácidos que no son de carboxilato mientras que se mantiene una carga negativa; ( fosfono) alanina ; treonina sulfatada. También se pueden modificar selectivamente grupos secundarios de carboxilo (por ejemplo, aspartilo o glutamilo) mediante reacción con carbodiimidas (R' -N-C-N-R' ) tal como, por ejemplo, l-ciclohexil-3 (2-morfolinil- ( -etil) carbodiimida ó 1-etil-3 ( 4-azonia-4 , 4-dimetolpentil ) carbodiimida . El aspartilo o glutamilo también se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones de amonio. Los miméticos de aminoácidos se pueden generar mediante sustitución con, por ejemplo, (además de lisina y arginina) los aminoácidos ornitina, citrulina, o (guanidino) -ácido acético, o (guanidino) alquil-ácido acético, donde el alquilo se define anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene la porción CN en vez de COOH) se puede sustituir por asparagina o glutamina. Los residuos asparaginilo y glutaminilo se pueden desaminar en los correspondientes residuos de aspartilo o glutamilo. Se pueden generar miméticos de residuo de arginina haciendo reaccionar arginilo con, por ejemplo, uno o más reactivos convencionales, que incluyen, por ejemplo, fenilglioxal, 2 , 3-butadiona, 1 , 2-ciclo-hexandiona, o ninhidrina, alternativamente bajo condiciones alcalinas. Se pueden generar miméticos del residuo tirosina haciendo reaccionar tirosilo con, por ejemplo, compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano . Se puede utilizar N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de 0-acetil tirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Se pueden generar miméticos de residuo de cisteina haciendo reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, alfa-haloacetatos tales como ácido 2-cloroacético o cloroacetamida y correspondientes aminas; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . También se pueden generar miméticos de residuo de cisteina haciendo reaccionar residuos de cisteinilo con, por ejemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta- ( 5-imidozoil ) propiónico ; cloroacetil-fosfato, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo; 2-piridil-disulfuro de metilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4 nitrofenol; o, cloro-7-nitrobenzo-oxa-l , 3-diazol . Se pueden generar miméticos de lisina (y los residuos amino terminales se pueden alterar) haciendo reaccionar lisinilo con, por ejemplo, anhídridos succínicos u otro anhídridos de ácido carboxílico. También se pueden generar miméticos de residuos de lisina y residuos otros que contienen alfa-amino mediante la reacción con imidoésteres , tales como picolinimidato, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitro-bencensulfónico, O-metilisourea, 2,4, pentandiona, y reacciones catalizadas por transamidasa con glioxilato. Se pueden generar miméticos de metionina mediante reacción con, por ejemplo, sulfóxido de metionina. Los miméticos de prolina incluyen, por ejemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidin-carboxilico, 3- ó 4-hidroxi-prolina, deshidroprolina, 3- ó 4-metilprolina, ó 3 , 3-dimetilprolina . Se pueden generar miméticos de residuos de histina haciendo reaccionar histidilo con, por ejemplo, dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo . Otros miméticos incluyen, por ejemplo, aquéllos generados mediante la hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo; metilación de los . grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la amina N-terminal; metilación de residuos de amida de cadena principal o sustitución con aminoácidos de N-metilo; o amidación de grupos carboxilo C-terminales .
Un residuo, por ejemplo, un aminoácido, de un polipéptido que se proporciona en la presente también se puede reemplazar por un aminoácido (o residuo peptidomimético) de la asimetría opuesta. Por consiguiente, cualquier aminoácido presente de manera natural en la configuración L (que también puede referirse como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) se puede reemplazar con el aminoácido del mismo tipo estructural químico ó un peptidomimético, aunque de la asimetría opuesta, referido como el aminoácido D, aunque también puede referirse como la forma R o S.
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente métodos para modificar los polipeptidos que se proporcionan en la presente mediante ya sea procesos naturales, tales como procesamiento post-traducción . (por ejemplo, fosforilación, acilación, etc. ) , o mediante técnicas de modificación química, y los polipéptidos modificados resultantes. Las modificaciones pueden presentarse en cualquier parte en el polipeptido, incluyendo el armazón del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y el amino o carboxilo terminal. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en los qrados iguales o variables en varios sitios en un polipéptido dado. También un polipéptido dado puede tener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación con ADP, amidación, unión adhesión de flavina, adhesión covalente de una porción heme, adhesión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, adhesión covalente de un lípido o derivado de lípido, adhesión covalente de un fosfatidilinositol , ciclización de reticulación, formación de uniones de disulfuro, desmetilación, formación de1 reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoliación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, y adición mediada con ARN de transferencia de aminoácidos a una proteina tal como arginilación . Ver, por ejemplo, Creighton, T.E., Proteins -Structure and Molecular Properties 2nd Ed. , .H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983) .
También se pueden utilizar 1 métodos de síntesis de péptido químicos de fase sólida para sintetizar los polipéptidos , o fragmentos de los mismos, que se proporcionan en la presente. Tal método ha sido conocido en la técnica desde principios de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154, 1963) (Ver también Stewart, J. M. y Young, J. D. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed. , Pierce Chemical Co . , Rockford, 111., pp. 11-12)) y recientemente se han empleado en un kits de síntesis y diseño de péptidos de laboratorio comercialmente disponible (Cambridge Research Biochemicals ) . Tales kits o equipos de laboratorio comercialmente disponibles generalmente han utilizado las enseñanzas de H. M. Geysen et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 81 :3998 (1984) y proporcionan péptidos de sintetización en las puntas de una multitud de "varillas" o "agujas" todas las cuales se conectan a un sola placa. Cuando tal sistema se utiliza, una placa de varillas o agujas se invierte e inserta en una segunda placa de pozos o depósitos correspondientes, los cuales contienen soluciones para anexar o anclar un aminoácido apropiado para las puntas de la varilla o aguja. Repitiendo tal etapa del proceso, es decir invirtiendo e insertando las puntas de la varilla o aguja en soluciones apropiadas, se construyen aminoácidos en péptidos deseados. Además, un número de péptidos FMCO disponibles, están disponibles sistemas de síntesis. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un montaje de un polipéptido o fragmento en un soporte sólido . utilizando ün sintetizador de péptidos automatizado de Applied Biosystems, Inc. Model 431A™. Tal equipo proporciona fácil acceso a los péptidos que se proporcionan en la presente, ya sea mediante síntesis directa o mediante la síntesis de una serie , de fragmentos que se pueden acoplar utilizando otras técnicas conocidas.
Enzimas En ciertas modalidades, se proporcionan · en la presente hidrolasas, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, por ejemplo, proteínas que comprenden al menos aproximadamente una identidad de secuencia del 50%, 51%, 52%, 53%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó más, o completa (100%), con un polipéptido ejemplificante que se proporciona en la presente (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, ó SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 2 que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más (varios) o todas las variaciones de aminoácidos descritas en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 ó Tabla 23, o el equivalente de las mismas, anticuerpos que enlazan las mismas, y métodos para hacer y utilizar las mismas. Los polipéptidos que se proporcionan en la presente pueden tener una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa. En aspectos alternativos, una actividad de una enzima que se proporciona en la presente comprende hidrólisis o síntesis de lípidos o aceites. Las hidrolasas que se proporcionan en la presente pueden modificar aceites mediante hidrólisis, acidólisis, alcohólisis, glicerólisis , esterificación, trans-esterificación y/o intra-esterificación, incluyen reacciones de "migración forzada".
En aspectos alternativos, las hidrolasas que se proporcionan en la presente pueden tener actividades modificadas o nuevas en comparación con las hidrolasas ejemplificantes o las actividades descritas en la presente. En la presente se proporcionan hidrolasas con y sin las secuencias de señal mismas. En la presente se proporcionan hidrolasas inmovilizadas, anticuerpos anti-hidrolasa y fragmentos de los mismos. En la presente se proporcionan proteínas para inhibir la actividad de la hidrolasa, por ejemplo, anticuerpos que se enlazan al sitio activo de la hidrolasa. En la presente se proporcionan homodímeros y heterocomplej os , por ejemplo, proteínas de fusión, heterodímeros , etc. que comprenden las hidrolasas que se proporcionan en la presente. En la presente se proporcionan hidrolasas que tienen actividad por encima de un amplio rango de temperaturas y pHs altos y bajos (por ejemplo, condiciones acuosas acídicas y básicas) .
En un aspecto, una o más hidrolasas (por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas) que se proporcionan en la presente, se utiliza para la síntesis biocatalítica de lípidos estructurados, es decir, lípidos que contienen un conjunto definido, de ácidos grasos distribuidos de una manera definida en el armazón de glicerol, incluyendo alternativas de manteca de ; cacao, ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) , 1, 3-diacil-glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs) .
En la presente se proporcionan métodos para generar enzimas que tengan Kcat/Km alterado (más alto o más bajo) . En un aspecto, se utiliza mutagénesis de centros específicos para crear enzimas de hidrolasa adicionales con especificidades de substrato alternativas. Esto se puede hacer, por ejemplo, rediseñando la región de enlace del substrato o el sitio activo de la enzima. En un aspecto, las hidrolasas que se proporcionan en la presente son más estables a temperaturas elevadas, tales como 80°C a 85°C a 90°C a 95°C, en comparación con las hidrolasas de organismos convencionales o moderados.
Varias proteínas que se proporcionan en la presente tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, actividad de lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa, bajo varias condiciones. En la presente se proporcionan métodos para hacer hidrolasas con diferente eficiencia catalítica y estabilidades para con la temperatura, agentes oxidantes y condiciones de pH. Estos métodos pueden utilizar, por ejemplo, las técnicas de mutagénesis de centros específicos y/o mutagénesis aleatoria. En un aspecto, se puede utilizar evolución dirigida para producir hidrolasas con especificidades y estabilidad alternativas.
Las proteínas que se proporcionan en la presente se utilizan en métodos que pueden identificar moduladores de hidrolasa, por ejemplo, activadores o inhibidores. Brevemente, se agregan muestras de análisis (por ejemplo, compuestos, tales como los miembros de bibliotecas de péptidos o combinatorias, caldos, extractos, y similares) a ensayos de hidrolasa para determinar su capacidad de modular, por ejemplo, inhibir o activar, la escisión de substrato. Estos inhibidores se pueden utilizar en la industria e investigación para reducir o prevenir una isomerización indeseada. Los moduladores encontrados utilizando los métodos que se proporcionan en la presente se pueden utilizar para alterar (por ejemplo, disminuir o incrementar) el espectro de actividad de una hidrolasa.
• En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para descubrir hidrolasas, utilizando los ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos que se proporcionan en la presente. En un aspecto, se seleccionan bibliotecas de fagos lambda para el descubrimiento a base de expresión de hidrolasas. En la presente se proporcionan bibliotecas de fago lambda que se utilizan en una selección que permita la detección de clones tóxicos; acceso mejorado al substrato; necesidad reducida de manipular genéticamente un hospedero, pasando el potencial de cualquier probabilidad resultante de la excisión de masa de la biblioteca; y, crecimiento más rápido a densidades bajas de clones.
La selección de bibliotecas de fago lambda puede estar en fase liquida o fase sólida. En la presente se proporcionan métodos para selección en fase liquida. Esto puede dar una mayor flexibilidad en condiciones de ensayo; flexibilidad de substratos adicionales; sensibilidad más alta a clones débiles; y facilidad de automatización por encima de la selección de fase sólida.
En otras modalidades, se proporcionan en la presente métodos de selección que utilizan las proteínas y ácidos nucleicos que se proporcionan en la presente que involucran automatización robótica. Esto permite la ejecución de muchos miles de reacciones biocataliticas y ensayos de selección en un periodo corto de tiempo, por ejemplo, por día, asegurando también un alto nivel de exactitud y reproducibilidad (ver la discusión de arreglos, más adelante) . Como resultado, se puede producir una biblioteca de compuestos derivados en cuestión de semanas.
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente enzimas de hidrolasa que son hidrolasas de origen no natural que tienen una actividad de hidrolasa diferente, estabilidad, especificidad de substrato, perfil de pH y/o características de desempeño en comparación con la hidrolasa de origen no natural. Estas hidrolasas tienen una secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza. Las mismas se pueden derivar mediante la sustitución de una pluralidad de residuos de aminoácidos de una hidrolasa precursora con diferentes aminoácidos. La hidrolasa precursora puede ser una hidrolasa de origen natural o una hidrolasa recombinante . En un aspecto, las variantes de hidrolasa abarcan la sustitución de cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural en las posiciones de residuos de aminoácidos diseñados.
Secuencias de señal de hidrolasa, dominios prepro y catalíticos En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente secuencias de señal (por ejemplo, péptidos de señal (SPs)), dominios prepro y dominios catalíticos (CDs) . Los SPs, dominios prepro y/o CDs que se proporcionan en la presente se pueden ser péptidos aislados, : sintéticos o recombinantes o pueden ser parte de una proteina de fusión, por ejemplo, como un dominio heterólogo en una proteina quimérica. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican estos dominios catalíticos (CDs) , dominios prepro y secuencias de señal (SPs, por ejemplo, un péptido que tiene una secuencia que comprende/que consiste de residuos amino terminales de un polipéptido que se proporciona en la presente) . En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente secuencias de señal que comprenden un péptido que comprende/que consiste de una secuencia que se establece en los residuos 1 a 12, 1 a 13, l a 14, 1 a 15, 1 a 16, l a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, l a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, l a 26, 1 a 27, l a 28, 1 a 28, 1 a 30, l a 31, 1 a 32, 1 a 33, l a 34, 1 a 35, 1 a 36, l a 37, 1 a 38, 1 a 39, l a 40, 1 a 41, 1 a 42, l a 43, 1 a 44 (o un péptido más) de un polipéptido que se proporciona en la presente. En una modalidad, se proporcionan en la presente secuencias de señal aisladas, sintéticas o recombinantes que comprende/que consiste de una secuencia de señal que se proporciona en la presente derivada de otra enzima que se proporciona en la presente, u otro tipo de enzima o polipéptido.
Las secuencias de señal de hidrolasa (SPs) , CDs, y/o secuencias prepro que se proporcionan en la presente pueden ser péptidos aislados, o, secuencias unidas a otra hidrolasa o un polipéptido de no hidrolasa, por ejemplo, como una proteina de fusión (quimérica) . En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente polipéptidos que comprenden secuencias de señal de hidrolasa que se proporcionan en la presente. En un aspecto, los polipéptido que comprende secuencias de señal de hidrolasa SPs, CDs, y/o prepro que se proporcionan en la presente, comprenden secuencias heterólogas a las hidrolasas que se proporcionan en la presente (por ejemplo, una proteina de fusión que comprende un SP, CD, y/o prepro que se proporciona en la presente y secuencias de otra hidrolasa o una proteina de no hidrolasa) . En la presente se proporcionan hidrolasa que se proporcionan en la presente con SPs, CDs, y/o secuencias prepro heterologos, por ejemplo, secuencias con una secuencia de señal de levadura. Una hidrolasa que se proporciona en la presente puede comprender un SP y/o prepro heterólogo en un vector, por ejemplo, un vector serie pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA) .
En un aspecto, los SPs, CDs, y/o secuencias prepro que se proporcionan en la presente se identifican después de la identificación de nuevos polipéptidos de hidrolasa. Las rutas mediante las cuales las proteínas se clasifican y transportan a su propia ubicación celular frecuentemente se mencionan como rutas de destinación de proteínas. Uno de los elementos más importantes en todos estos sistemas de destinación es una secuencia de aminoácidos corta en el amino terminal de un polipéptido recién sintetizado llamado la secuencia de señalo. Esta secuencia de señal dirige una proteina a su ubicación apropiada en la célula y se remueve durante el transporte o cuando la proteina alcanza su destino final. La mayoría de proteínas lisosómicas, de membrana, o secretadas tienen una secuencia de señal amino-terminal que marca las mismas para su desplazamiento en el lumen del retículo endoplásmico . Las secuencias de señal pueden variar en longitud de 13 a 45 o más residuos de aminoácidos. Varios métodos de reconocimiento de secuencias de señal son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, en un aspecto, se identifican nuevos péptidos de señal de hidrolasa mediante un método referido como SignalP. SignalP utiliza una red neural combinada que reconoce ambos péptidos de señal y sus sitios de escisión. (Nielsen, et al., "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites". Protein Engineering, vol. 10, no. 1, p. 1-6 (1997) .
Deberá entenderse que en algunos aspectos las hidrolasas que se proporcionan en la presente pueden no tener SPs y/o secuencias prepro, y/o dominios catalíticos (CDs) . En un aspecto, se proporcionan en la presente polipéptidos (por ejemplo, hidrolasa) que carecen de la totalidad o parte de un SP, un CD y/o un dominio prepro. En otro aspecto, se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican una secuencia de señal (SP) , un CD, y/o prepro de una hidrolasa enlazada operablemente a una secuencia de anteriormente de una diferente hidrolasa u, opcionalmente, puede desearse una secuencia de señal (SPs) y/o dominio prepro de una proteína de no hidrolasa.
En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprende secuencias de señal (SPS) , dominio prepro y/o dominios catalíticos (CDs) que se proporcionan en la presente y secuencias heterólogas. Las secuencias heterólogas son secuencia asociadas de manera no natural (por ejemplo, a una hidrolasa) con un SP, dominio prepro y/o CD. La secuencia a la cual el SP, dominio prepro y/o CD no se puede asociar de manera natural en extremo amino terminal, extremo carboxi terminal de SPs, dominio prepro y/o CD, y/o ambos extremos del SP y/o CD. En ciertas modalidades, se proporcionan en la presente polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que comprende (o consisten de) un polipéptido que comprende una secuencia de señal (SP) , dominio prepro y/o dominio catalítico (CD) que se proporcionan en la presente con la condición de que el mismo no esté asociado con ninguna secuencia a la cual el mismo esté asociado de manera natural (por ejemplo, secuencia de hidrolasa) . En la presente se proporcionan ácidos nucleicos aislados o recombinantes que codifican estos polipéptidos. Por consiguiente, en un aspecto, el ácido nucleico aislado, sintético o recombinante que se proporciona en la presente comprende la secuencia de codificación para una secuencia de señal (SP) , dominio prepro y/o dominio catalítico (CD) que se proporciona en la presente y una secuencia heterologa (es decir, una secuencia no asociada de manera natural con una secuencia de señal (SP) , dominio prepro y/o dominio catalítico (CD) que se proporciona en la presente) . La secuencia heterologa puede estar en el extremo 3' , extremo 5' terminal, y/o en ambos extremos de la secuencia de codificación de SP, dominio prepro y/o CD.
En ciertas modalidades, se proporciona en la presente una fusión de subsecuencias N-terminales o C-terminales de las enzimas que se proporcionan en la presente (por ejemplo, secuencias de señal, secuencias prepro) con otros polipéptidos , proteínas activas o fragmentos de proteína. La producción de una enzima que se proporciona en la presente (por ejemplo, una hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) también puede lograrse expresando la enzima como una proteína de fusión inactiva que más tarde se activa mediante un evento de escisión proteolítica (utilizando ya sea una actividad de proteasa endógena o exógena, por ejemplo, tripsina) que da como resultado la separación del socio o compañero de la proteína de fusión y la enzima madura, pór ejemplo, la hidrolasa que se proporciona en la presente. En un aspecto, la proteína de fusión que se proporciona en la presente se expresa a partir de un constructo de nucleótido híbrido que codifica un solo marco de lectura abierta que contiene los siguientes elementos: la secuencia de nucleótidos para la proteina de fusión, una secuencia de enlace (definida como una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos flexible que une dos dominios de proteina flexibles) , sitio de reconocimiento de escisión de proteasa, y la secuencia de enzima madura (por ejemplo, cualquier enzima que se proporciona en la presente, por ejemplo, una hidrolasa) . En aspectos alternativos, la proteina de fusión puede comprender una secuencia de pectato liasa, una secuencia de xilanasa, una secuencia de fosfatasa de ácido fosfatidico, u otra secuencia, por ejemplo, una secuencia que previamente ha mostrado sobre-expresarse en un sistema hospedero de interés. Se puede utilizar cualquier sistema hospedero (ver discusión, más adelante), por ejemplo, E. coli ó Pichia pastoris. El arreglo de las secuencias de nucleótido en la construcción de nucleótidos quiméricos se puede determinar en base a los niveles de expresión de proteina logrados con cada constructo de fusión. Procediendo desde el extremo 5' del constructo de nucleótido al extremo 5' cebador del constructo, en un aspecto, las secuencias de nucleótidos se ensamblan como sigue: Secuencia de señal/proteína de fusión/secuencia de enlace/sitio de reconocimiento 'de escisión de proteasa/enzima madura (por ejemplo, cualquier enzima que se proporcione en la presente, por ejemplo, una hidrolasa) o Secuencia de señal/secuencia pro/enzima madura/secuencia de enlace/proteina de fusión. La expresión de la enzima (por ejemplo, cualquier que se proporcione en la presente, por ejemplo, una hidrolasa) es una proteina de fusión inactiva que puede mejorar la expresión total de la secuencia de la enzima, puede reducir cualquier toxicidad potencial asociada con la sobreproducción de enzima activa y/o puede incrementar la vida de almacenamiento de la enzima antes de utilizarse debido a que la enzima podría inactivarse hasta que la proteína de fusión, por ejemplo la pectato liasa se separe de la enzima, por ejemplo, la hidrolasa que se proporciona en la presente.
En una modalidad, se proporcionan en la presente formulaciones para la activación de una hidrolasa que se proporciona en la presente, expresada como una proteína de fusión. En un aspecto, la activación de la actividad de la hidrolasa inicialmente expresada como una proteína de fusión inactiva se logra utilizando una actividad proteolítica o potencialmente una actividad proteolítica en combinación con una peptidasa amino-terminal o carboxil-terminal (la peptidasa puede ser una enzima que se proporcione en la presente, u, otra enzima) . Este evento de activación puede lograrse en una variedad de maneras y en una variedad de puntos en el proceso de fabricación/almacenamiento antes de su aplicación en el desgomado de petróleo. Los procesos ejemplares que se proporcionan en la presente incluyen: escisión mediante una actividad endógena expresada por el hospedero de fabricación en la secreción del constructo de fusión en los medios de fermentación; escisión mediante una actividad proteasa endógena que se activa o entra en contacto con el constructo de fusión expresado intracelularmente en la ruptura de las células hospederas; paso del constructo de fusión crudo o purificado sobre una columna de actividad de proteasa inmovilizada para lograr la escisión y activación de enzima (por ejemplo, la hidrolasa que se proporciona en la presente, por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa) antes de la formulación de la enzima; tratamiento del constructo de fusión crudo o purificado con una fuente soluble de actividad proteolítica; activación de un hidrolasa (por ejemplo, una hidrolasa que se proporciona en la presente) en la refinería de petróleo utilizando ya sea una fuente soluble o insoluble de actividad proteolítica inmediatamente antes de usarse en el proceso; y/o, activación de la actividad de hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa y/o estearatasa que se proporciona en la presente) circulando continuamente la formulación del constructo de fusión a través de una columna de actividad de proteasa inmovilizada a temperatura reducida (por ejemplo, cualquiera entre a polipéptido 4°C y 20°C) . Este evento de activación puede lograrse antes de su suministro al sitio de uso o puede ocurrir en las instalaciones en la refinería de petróleo.
Glicosilación Los péptidos y los polipéptidos como se proporcionan aquí (por ejemplo, hidrolasas, anticuerpos) también pueden se glicosilados , por ejemplo, en un aspecto, que comprenden al menos un sitio de glicosilación, por ejemplo, una glicosilación N-enlazada u O-enlazada. En un aspecto, el polipéptido puede ser glicosila'do después de ser expresado en P. pastoris o S. pomba . La glicosilación puede ser agregada después de la terminación ya sea químicamente o mediante mecanismos biosintéticos, en donde estos últimos incorporan el uso de motifs de glicosilación conocidos, los cuales pueden ser nativos a la secuencia o pueden ser agregados como un péptido o agregados en la secuencia que codifica el ácido nucleico .
Hidrolasas híbridas y genotecas de péptidos En ciertas modalidades, aquí se proporcionan hidrolasas híbridas (por ejemplo, proteínas sintéticas) y proteínas de fusión, que incluyen genotecas de péptidos, que comprenden las secuencias como se proporcionan aquí. Las genotecas de péptidos como se proporcionan aquí pueden ser usadas para aislar moduladores peptídicos (por ejemplo, activadores o inhibidores) de objetivos. Las genotecas de péptidos como se proporcionan aquí pueden ser usadas para identificar los asociados de enlace formales de los objetivos, tales como ligándoos, por ejemplo, citocinas, hormonas y los similares.
En un aspecto, las proteínas de fusión como se proporcionan aquí (por ejemplo, la porción peptídica) se estabilizan conformacionalmente (con relación a los péptidos lineales) para permitir una mayor afinidad de enlace para los objetivos. En otro aspecto, aquí se proporcionan fusiones de hidrolasas como se proporcionan aquí y otros péptidos, incluyendo los péptidos conocidos y aleatorios. Estos pueden ser fusionados en una manera tal que la estructura de la enzima o el anticuerpo (por ejemplo, la hidrolasa) , no se perturba significativamente y el péptido se estabiliza conformacionalmente, de manera metabólica o estructural. Esto permite la creación de una .genoteca de péptidos que se monitorea fácilmente por su presencia, dentro de las células y su cantidad.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos como se proporcionan aquí puede ser caracterizada por la naturaleza predeterminada de la variación, una característica que las diferencia de una forma de aparición natural, por ejemplo, una variación alélica o ínter especies de una secuencia de hidrolasa. En un aspecto, las variantes como se proporcionan aquí exhiben la misma actividad biológica cuantitativa que el análogo de formación natural. Alternativamente, las variantes pueden ser seleccionadas por tener características modificadas. En un aspecto, aunque el, sitio o la región para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos, la mutación per se no necesita ser determinada. Por ejemplo, con el fin de optimizar la eficiencia de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis puede ser conducida en el codon o la región objetivo y las variantes de hidrolasa expresadas seleccionadas por la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas en la técnica, como se discute aqui, por ejemplo, mutagénesis de cebador M13 y mutagénesis PCR. La selección de los mutantes se puede realizar usando ensayos de las actividades proteliticas . En aspectos alternativos, las sustituciones de aminoácidos pueden ser de residuos individuales; las inserciones pueden ser del orden desde aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, aunque se pueden realizar inserciones considerablemente más grandes. Las eliminaciones pueden variar desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70 residuos o más. Para obtener un derivado final con las propiedades, óptimas se pueden usar sustituciones, eliminaciones, inserciones, o cualquier combinación de los mismos. Por lo general, estos cambios se realizan en unos cuantos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula. Sin embargo, en ciertas circunstancias se pueden tolerar cambios más grandes.
En ciertas modalidades, aqui se proporcionan hidrolasas donde la estructura del esqueleto polipeptidico, la estructura secundaria o terciaria, por ejemplo, en la estructura alfa-helicoidal o beta-helicoidal, ha sido modificada. En aspecto, la carga o la hidrofobicidad ha sido modificada. En un aspecto, el volumen de una cadena lateral ha sido modificado. Los cambios sustanciales en la función o la identidad inmunogénica se realizan seleccionando las sustituciones que son menos conservativas. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones las cuales afectan más significativamente: la estructura del esqueleto polipeptidico en el área de la alteración, por ejemplo, una estructura alfa-helicoidal o beta-helicoidal; una carga o un sitio de hidrofobicidad de la molécula, los cuales pueden ser un sitio activo; o una cadena lateral. En otras modalidades, aqui se proporcionan proteínas que comprenden sustituciones de la secuencia, como se proporcionan aquí, por ejemplo, donde (a) los residuos hidrofílieos , por ejemplo, serilo o threonilo, se sustituyen por (o con) residuos hidrofóbicos, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o con) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histidilo, se sustituye por (o con) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o con) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina. Las variantes pueden exhibir la misma actividad biológica cuantitativa (es decir, actividad de hidrolasa) aunque las variantes pueden ser seleccionadas para modificar las características de las hidrolasas según sea necesario.
En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí comprenden epítopos o etiquetas de purificación, secuencias de señalización y otras secuencia de fusión, etc. En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser fusionadas a un péptido aleatorio para formar un polipéptido de fusión. Por "fusionado" o "enlazado operativamente" aquí se quiere decir que el péptido aleatorio y la hidrolasa se enlazan juntas de manera tal que se minimizan las alteraciones a la estabilidad de la estructura de la hidrolasa, por ejemplo, estas retienen la actividad de hidrolasa. El péptido de fusión (o los polinucleótidos de fusión que codifican el polipéptido de fusión) puede comprender además otros componentes así como, incluir múltiples péptidos y múltiples asas.
En un aspecto, los péptidos (por ejemplo, las sub-secuencias de hidrolasa) y los ácidos nucleicos que las codifican se aleatoriza, ya sea completamente aleatorizadas o estas se sesgan en su aleatorización, por ejemplo, en la frecuencia de los nucleótidos/residuos en general o según su posición. "Aleatorizado" significa que cada ácido nucleico y péptido consiste esencialmente de nucleótidos y aminoácidos aleatorios, respectivamente. En un aspecto, los ácidos nucleicos los cuales dan lugar a los péptidos pueden ser sintetizados químicamente, y por lo tanto, pueden incorporar cualquier nucleótido en cualquier posición. Por lo tanto, cuando los ácidos nucleicos se expresan para formar péptidos, cualquier residuo de aminoácido puede ser incorporado en cualquier posición. El proceso de síntesis puede ser diseñado para generar ácidos nucleicos aleatorizados, para permitir la formación de todos o la mayoría de las combinaciones sobre la longitud del ácido nucleico, formando por ello una genoteca de ácidos nucleicos aleatorizados. La genoteca puede proporcionar una población de manera suficientemente diversa estructuralmente de productos de expresión aleatorizados para afectar un rango probabilísticamente suficiente de respuestas celulares para proporcionar uno o más tipos de células que exhiben una respuesta deseada. Aquí se proporcionan genotecas de interacción suficientemente grandes de modo tal que al menos uno de sus miembros tendrá una estructura que les proporcione afinidad por alguna molécula, proteína, y otro facto .
Metodologías de Selección y Dispositivos de Monitoreo "En Linea" Para practicar los métodos como se proporcionan aquí se puede usar, una variedad de aparatos y metodologías, en conjunción con los polipéptidos y los ácidos nucleicos como se proporcionan aquí, por ejemplo, para seleccionar los polipéptidos para la actividad de hidrolasa, para seleccionar los compuestos como activadores o inhibidores potenciales de una actividad de hidrolasa (por ejemplo, para la selección potencial de fármacos) , para anticuerpos que se enlazan a un polipéptido como se proporciona aquí, para ácidos nucleicos que se hibridan con un ácido nucleico como se proporciona aquí, para celular que expresan un polipéptido como se proporciona aquí, y los similares. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,337,187.
Arreglos de Capilaridad Los arreglos de Capilaridad, tales como el GIGAMATRIX™, Diversa Corporation, San Diego, CA, pueden ser usados en los métodos como se proporcionan aquí. Los ácidos nucleicos o los polipéptidos como se proporciona aquí, pueden ser inmovilizados o aplicados a un arreglo, incluyendo arreglos de capilaridad. Los arreglos pueden ser usados para seleccionar o para monitorear genotecas de composiciones (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos, ácido nucleicos, etc.) por su habilidad para enlazarse a, o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido como se proporciona aquí. Los arreglos de capilaridad proporcionan otro sistema para conservar y seleccionar muestras. Por ejemplo, un aparato de selección de muestras puede incluir una pluralidad de capilares formados en un arreglo de capilares adyacentes, en donde cada c apilar comprende al menos una pared que define una cavidad para retener una muestra. El aparato puede incluir además, material intersticial dispuesto entre los capilares adyacentes en el arreglo, y uno o más símbolos de referencia formados dentro del material intersticial. Un capilar para seleccionar una muestra, en donde el capilar se adapta para ser unido en un arreglo de capilares, puede incluir una primera pared que define una cavidad para retener la muestra, y una segunda pared formada de un material filtrante, para filtrar la energía de excitación proporcionada a la cavidad para excitar la muestra.
Un polipéptido o ácido nucleico, por ejemplo, un ligando o un sustrato, puede ser introducido en un primer componente en al menos una porción de un capilar o un arreglo de capilares. Cada capilar del arreglo de capilares puede comprender al menos una pared que define una cavidad para retener el primer componente. Se puede introducir una burbuja de aire en el capilar detrás del primer componente. Se puede introducir un segundo componente en el capilar, en donde el segundo componente se separa del primer componente por la burbuja de aire. Una muestra de interés puede ser introducirá como un primer líquido etiquetado con una partícula detectable en un capilar de un arreglo de capilares, en donde cada capilar del arreglo de capilares comprende al menos una pared que define una cavidad para retener el primer líquido y las partículas detectables, y en donde la al menos una pared se reviste con un material de adhesión para enlazar las partículas detectables a la al menos una pared. El método puede incluir además extraer el primer líquido del tubo capilar, en donde las partículas detectables adheridas se mantienen dentro de capilar, de introducir un segundo líquido en el tubo capilar.
El arreglo de capilares puede incluir una pluralidad de tubos capilares individuales que comprenden al menos una pared externa que define una cavidad. La pared externa de los tubos capilares puede ser una o más paredes fusionadas. De manera similar, la pared puede definir una cavidad que es cilindrica, cuadrada, hexagonal, o cualquier otra forma geométrica siempre y cuando las paredes formen una cavidad para la retención de un líquido o muestra. Los tubos capilares del arreglo de tubos capilares pueden ser mantenido juntos muy cercanos unos a otros para formar una estructura plana. Los tubos capilares pueden ser unidos, al ser fusionados (por ejemplo, cuando los tubos capilares se fabrican de vidrio) , adheridos, unidos, o fijados lado con lado. El arreglo de tubos capilares puede ser formado de cualquier número de tubos capilares individuales, por ejemplo, un rango desde 100 a 4, 000, 000 de tubos capilares. Un arreglo de tubos capilares puede formar una placa de microtitulación que tiene aproximadamente 100,000 o más tubos capilares individuales unidos.
Arreglos o "Biochips" Los ácidos nucleicos o los polipéptidos como se proporcionan aqui puede inmovilizados o aplicados a un arreglo. Los arreglos pueden ser usados para investigar o monitorear las genotecas de composiciones (por ejemplo, de moléculas pequeñas, anticuerpos, ácidos nucleicos, etc.) por su habilidad para enlazarse a o modular la actividad de un ácido nucleico o un polipéptido como se proporcionan aqui. Por ejemplo, en un aspecto como se proporciona aqui, un parámetro monitoreado es la expresión de transcriptos de un gen de hidrolasa. Uno o más, o todos los transcriptos de un tipo de células pueden ser medidos por hibridación de una muestra que comprende transcriptos de las células, o ácidos nucleicos representativos de o complementarios a los transcriptos de un tipo de células, mediante hibridación a los ácidos nucleicos inmovilizados sobre un arreglo, o "bio-circuito integrado". Usando un "arreglo" de ácidos nucleicos sobre un circuito integrado, algunos o todos los transcriptos de un tipo de células pueden ser cuantificados simultáneamente. Alternativamente, también se pueden usar arreglos que comprenden ácido nucleico genómico, para determinar el genotipo de una cepa recién diseñada por ingeniería mediante los métodos proporcionados aquí. Los "arreglos de polipéptidos" también pueden ser usados para cuantificar simultáneamente una pluralidad de proteínas. La presente invención puede ser practicada con cualquier "arreglo" conocido, llamado también un "micro arreglo" o "arreglo de ácidos nucleicos" o "arreglo de polipéptidos" o "arreglo de anticuerpos" o "bio-circuito integrado" o variaciones de los mismos, los arreglos son de manera genérica una pluralidad de "puntos" o "elementos objetivos", cada elemento objetivo que comprende una cantidad definida de una o más moléculas biologiotas, por ejemplo, oligonucleótidos , inmovilizados sobre un área definida de una superficie de substrato para enlazarse específicamente a un tipo de moléculas de muestra, por ejemplo, transcriptor de ARNm.
Los "arreglos" o "microarreglos" o "bio-circuitos integrados" como se proporcionan aquí, pueden comprender una pluralidad de elementos objetivo, cada elemento objetivo que comprenden una cantidad definida de uno o más polipéptidos /(incluyendo anticuerpos) o ácidos nucleicos inmovilizados sobre un área definida de una superficie de sustrato.
En un aspecto, las hidrolasas se usan como formas inmovilizadas. Se puede usar cualquier método de inmovilización, por ejemplo, inmovilización sobre un soporte inerte, tales como, por ejemplo, dietilaminoetil-celulosa, vidrio poroso, quitina o células. Las células que expresan las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser inmovilizadas por entrecruzamiento, por ejemplo, con glutaraldehído a una superficie de sustrato. Para practicar los métodos como se proporcionan aquí, cualquier arreglo conocido y/o método para preparar usar los arreglos puede ser incorporado en su totalidad o en parte, o variaciones de los mismos, como se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,277,628; 6,277,489; 6,261,776; 6,258,607; 6,054,270; 6,948,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,965,453; 5,959,098; 5,856,174; 5,830,645; 5,770,456; 5,632,957; 5,556,752; 5,143,854; 5,807,522; 5,800,992; 5,744,305; 5, 700,673; 5,556,752; 5,434,049, véase también, por ejemplo O 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; véase también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; CERN (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cáncer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32. Véase también las Publicaciones de patentes Norteamericanas publicadas Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 2001008765.
Anticuerpos y Métodos de Selección Basados en Anticuerpos En ciertas modalidades, aquí se proporcionan anticuerpos aislados, sintéticos o recombinantes que se enlazan específicamente a una hidrolasa como se proporcionan aquí. Estos anticuerpos pueden ser usados para aislar, identificar o cuantificar las hidrolasas como se proporcionan aquí o los polipéptidos relacionados. Estos anticuerpos pueden ser usados para aislar otros polipéptidos de aquí u otras hidrolasa relacionadas.
Los "anticuerpos" como se proporcionan aquí pueden comprender péptidos o polipéptidos derivados de, modelados después o codificados sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos, capaces de enlazarse específicamente a un antígeno o epítopo, véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, Tercera Edición, W.E. Paul ed, Raven Press N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) Biochem. Biophys . Methods 25:85-97. El término anticuerpo incluye porciones de enlace al anticuerpo, es decir, "sitios de enlace del antígeno", (por ejemplo, fragmentos, sub-secuencias, regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ) , que retienen la capacidad de enlazarse al antígeno, incluyendo (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, Cl y CHl; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHl; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VK y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento DAB ( ard et al, (1989) Nature 341:544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) . Los anticuerpos de cadena simple también están incluidos como referencia en el término "anticuerpo". Aquí se proporcionan anticuerpos, incluyendo sitios de enlace al antigeno y anticuerpos de cadena simple que se enlazan específicamente a una hidrolasa como se proporciona aquí. Para practicar los métodos como se proporcionan aquí, también se pueden usar los polipéptidos que tienen una actividad de hidrolasa.
Los anticuerpos pueden ser usados en inmunoprecipitacion, tinción, columnas de inmunoafinidad, y los similares. Si se desea, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para antígenos específicos pueden ser generadas por inmunización seguida por aislamiento del polipéptido o el ácido nucleico, amplificación o clonación de inmovilización del polipéptido sobre un arreglo como se proporciona aquí. Alternativamente, los métodos como se proporcionan aquí pueden ser usados para modificar la estructura de un anticuerpo producir por un tipo de células a ser modificadas, por ejemplo, la afinidad de un anticuerpo puede ser aumentada o reducida. Además, la habilidad para preparar o modificar anticuerpos puede ser un fenotipo diseñado por ingeniería en un tipo de células mediante los métodos como se proporcionan aquí.
Los métodos de inmunización, producción y aislamiento de anticuerpos (policlonales y monoclonales ) son bien conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica y se describen en la literatura científica y de patentes, por ejemplo, véase Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN INMMUNOLOGY, iley/Greene, NY (1991); Stites (eds. BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"; Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES AND PRACTICE (2a ed.) Academic Press, Nueva York (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbour Publications, Nueva York. Los anticuerpos también puedne ser generados in vitro, por ejemplo, usando genotecas de expresión en fago que expresan sitios de enlace a anticuerpos recombinantes, además de los métodos in vivo tradicionales usando animales. Véase, por ejemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Reivindicación. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.
Los polipéptidos o péptidos pueden ser usados para generar anticuerpos, los cuales se enlazan específicamente a los polipéptidos como se proporcionan aquí. Los anticuerpos resultantes pueden ser usados en procedimientos de cromatografía de inmunoafinidad para aislar o purificar el polipéptido o para determinar si el polipéptido está presente en una muestra biológica. En tales procedimientos, una preparación de proteínas, tal como un extracto, o una muestra biológica, se pone en contacto con un anticuerpos capaz de enlazarse específicamente a uno de los polipéptidos como se proporcionan aquí.
En los procedimientos de inmunoafinidad, el anticuerpo se fija a un soporte sólido, tales como perlas y otras matrices de columna. La preparación de proteínas se pone en contacto con el anticuerpo bajo las condiciones en las cuales el anticuerpo se enlaza específicamente a uno de los polipéptidos como se proporcionan aquí. Después de un lavado para eliminar las proteínas no enlazadas específicamente, se eluyen los polipéptidos enlazados específicamente.
La habilidad de las proteínas en una muestra biológica para enlazarse al anticuerpo puede ser determinada usando alguno de una variedad de procedimientos familiares para aquellas personas experimentadas en la técnica. Por ejemplo, el enlazamiento puede ser determinado etiquetando el anticuerpo con una etiqueta detectable, tales como un agente fluorescente, una etiqueta enzimática, o un radioisótopo. Alternativamente, el enlazamiento del anticuerpo a la muestra puede ser detectado usando un anticuerpo secundario que tenga tal etiqueta detectable en el mismo. Los ensayos particulares incluyen ensayos ELISA, ensayos sándwich, radioinmunoensayos , y Transferencias Western.
Los anticuerpos policlonales generados contra los polipéptidos como se proporcionan aquí, pueden ser obtenidos por inyección directa de los polipéptidos en un animal o administrando los polipéptidos a un animal no humano. El anticuerpo así obtenido se enlaza entonces al polipéptido en si. De esta manera, aun una secuencia que codifica solo un fragmento del polipéptido puede ser usada para generar anticuerpos los cuales pueden enlazarse al polipéptido nativo completo. Tales anticuerpos pueden ser usados entonces para aislar el polipéptido de células que expresan tal polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede usar cualquier técnica la cual proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de lineas celulares. Los ejemplos incluyen, la técnica del hibridoma, la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma EBV (véase, por ejemplo, Colé (1985) en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc, pp. 77-96) .
Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,946,778) pueden ser adaptados para producir anticuerpos de cadena simple para los polipéptidos • como se proporcionan aquí. Alternativamente, se pueden usar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para estos polipéptidos o fragmentos de los mismos.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos como se proporcionan aquí (incluyendo los anticuerpos anti-idiotipo) pueden ser usados para seleccionar polipéptidos similares de otros organismos y muestras. En tales técnicas, los polipéptidos del organismo se ponen en contacto con el anticuerpo y aquellos polipéptidos los cuales se enlazan específicamente al anticuerpo se detectan. Cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente puede ser usado para detectar el enlazamiento de anticuerpos.
Hidrolasas inmovilizadas En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí, por ejemplo, las lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas , se usan como formas inmovilizadas, por ejemplo, para procesar lípidos, en las síntesis estructuradas de lípidos, para digerir proteínas y las similares. Las lipasas inmovilazas como se proporcionan aquí pueden ser usadas, por ejemplo, para la hidrólisis de triglicéridos , diacilglicéridos o ésteres o para la esterificación o transesterificación de ácidos grasos, diacilglicéridos, o triacilglicéridos, o en la interesterificación de grasas. En un aspecto, la lipasa es específica para la esterificación de ácidos grasos con alcoholes, 1 , 3-específieos o específicos para la hidrólisis de glicéridos parciales, ésteres o triacilglicéridos. Las lipasas inmovilizadas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en un lecho empacado para transesterificación continua de grasas libres de solvente. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,818,695; 5,569,594.
Se puede usar cualquier método de inmovilización o forma de soporte, por ejemplo, arreglos, perlas, soportes de tubos capilares, y los similares, como se describen anteriormente. En un aspecto, la inmovilización de las hidrolasas puede ocurrir sobre un soporte inerte tal como dietilaminoetil-celulosa, vidrio poroso, quitina o células. Las células que expresan las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden se inmovilizadas mediante entrecruzamiento a una superficie de sustrato, por ejemplo, con glutaraldehído . Las hidrolasas inmovilizadas como se proporcionan aquí pueden ser preparadas conteniendo hidrolasa enlazada a un soporte hidrofobito particulado, poroso, con un surfactante, tal como polioxietilen sorbitan ácido graso éster o un poliglicerol ácido graso éster. El soporte puede ser un polímero olefínico alifático, tal como un polietileno o un polipropileno, un homo o copolímero de estireno o una mezcla de los mismos o un soporte inorgánico pre-tratado. Estos soportes pueden ser seleccionados de polímeros olefínicos alifáticos, polímeros de oxidación, mezclas de estos polímeros o soportes inorgánicos pre-tratados con el fin de preparar estos soportes hidrofóbicamente . Este pre-tratamiento puede comprender la silanización con un compuesto de silicio orgánico. El material inorgánico puede ser una sílice, una alúmina, o un vidrio o una cerámica. Los soportes pueden ser fabricados de poliestireno, copolímeros de estireno, polietileno, polipropileno o de co-polímeros derivados de (met ) acrilatos . Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,773,266.
Las enzimas de hidrolasa, los fragmentos de las mismas y los ácidos nucleicos que codifican las enzimas y los fragmentos pueden ser fijados a un soporte sólidos. Esto frecuentemente es económico y eficiente en el uso de las hidrolasas en procesos industriales. Por ejemplo, un consorcio o cóctel de enzimas hidrolasa (o fragmentos activos de las mismas), los cuales se usan en una reacción química específica, puede ser fijado a un soporte sólido y se sumerge en una cuba de procesamiento. La reacción enzimática puede ocurrir. Entonces, el soporte sólido puede ser sacado de la cuba, junto con las enzimas fijadas al mismo, para uso repetido. En una modalidad como se proporciona aquí, un ácido nucleico aislado como se proporciona aquí, se fija a un soporte sólido. En otra modalidad como se proporciona aquí, el soporte sólido se selecciona del grupo de un gel, resina, un polímero, una cerámica, un vidrio, un microeléctrodo, y cualquier combinación de los mismos.
Por ejemplo, los soportes sólidos proporcionados aquí incluyen geles. Algunos ejemplos de los geles incluyen SEPHAROSE™ (GE Healtcare, Piscataway, NJ) , gelatina, glutaraldehido, glutaraldehido tratado con quitosano, albúmina-glutaraldehido, quitosano-xantano, gel de toyopearl (gel polimérico) , alginato, alginato-polilisina , carragenano, agarosa, glioxil agarosa, agarosa magnética, dextrano-agarosa, hidrogel de poli ( sulfonato de carbamoilo) , hidrogel de BSA-PEG, alcohol polivinílico fosforilado (PVA) , monoaminoetil-N-aminoetil (MANA), amino o cualquier combinación de los mismos.
Otros soportes sólidos proporcionados aquí comprenden resinas o polímeros, algunos ejemplos de resinas o polímeros incluyen celulosa, acrilamida, nylon rayón, poliéster, resina de intercambio aniónico, AMBERLITE™ XAD-7, AMBERLITE™ IRA-94, AMBERLITE™ IRC-50 (Rohm and Hass, Philadelphia , PA) , polivinilo, poliacrílico, polimetacrilato, o cualquier combinación de los mismos.
Otro tipo de soporte sólido proporcionado aquí comprende cerámica. Algunos ejemplos incluyen cerámica no porosa, cerámica porosa, SÍO2, AI2O3. Otro tipo de soportes sólidos útiles en la presente invención es vidrio. Algunos ejemplos incluyen vidrio no poroso, vidrio poroso, vidrio de aminopropilo o cualquier combinación de los mismos. Otro tipo de soporte sólido que puede ser usado es un microeléctrodo . Un ejemplo es una magnetita revestida con polietilenimina . Se pueden usar partículas grafiticas como el soporte sólido.
Otro tipo de soporte sólido proporcionado aquí comprende productos de tierra diatomácea y silicatos. Algunos ejemplos incluyen diatomitas de CELITE®, KENITE®, DIACTIV®, PRIMISIL®, DIAFIL® y calcio sintético y silicatos de magnesio de MICRO-CEL®, CALELO®, SILASORB™, y CELKATE® (World Minerals Inc, Santa Barbara, CA) .
Otro ejemplo de un soporte sólido es, o comprende células, tales como glóbulos rojos.
Paquetes En ciertas modalidades, aquí se proporcionan paquetes que comprenden las composiciones, por ejemplo, ácidos nucleicos, cartuchos de expresión, vectores, células, semillas transgénicas o plantas o partes de plantas, polipéptidos (por ejemplo, hidrolasas) y/o anticuerpos como se proporcionan aquí. Los paquetes pueden contener materiales pedagógicos que enseñan las metodologías y los usos industriales como se proporcionan aquí, como se describe aquí.
Aplicaciones Industriales y Médicas Las hidrolasas (por ejemplo, las lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas) proporcionadas aquí tienen muchos usos industriales y aplicaciones médicas, y unos cuantos usos y composiciones ejemplificantes de describen a continuación. Los procesos como se proporcionan aquí comprenden convertir un fosfolípido no hidratable a una forma hidratable, desgomado de aceites, procesamiento de alimentos, procesamiento de aceites (por ejemplo, preparar un aceite de baja saturación) de plantas, pescado, algas, y los similares, por nombrar solo algunas aplicaciones.
Procesamiento de alimentos y forrajes En ciertas modalidades, aquí se proporcionan procesos para preparación de quesos usando hidrolasas (por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas) como se proporcionan aquí. En otra modalidad, aquí se proporcionan quesos que comprenden hidrolasas. En un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí (por ejemplo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas o una combinación de las mismas, se usan para procesar quesos, para mejoramiento el sabor, para aumentar el rendimiento y/o para "estabilizar" los quesos, por ejemplo, reduciendo la tendencia de "eliminación de aceite" o, en un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí se usan para producir queso de leche de queso. Estos procesos como se proporcionan a aquí pueden incorporar cualquier método, por ejemplo, como se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,551,635, y 6,399,212, WO 03/070013, WO 00/054601. Por ejemplo, en un aspecto, las hidrolasas (por ejemplo, lipasas, saturases, palmitasas, y/o estearatos) como se proporcionan aquí, se usan para estabilizar la emulsión de grasas en la leche o las composiciones que comprenden leche, por ejemplo, crema, y se usan para estabilizar las composiciones lácteas, por ejemplo, para la fabricación de cremas o licores de crema. En una modalidad, aquí se proporcionan procesos para mejorar el sabor de un queso, usando al menos una enzima como se proporciona aquí, los procesos que comprenden incubar una proteína, una grasa y una proteasa y una lipasa (por ejemplo, como se proporciona aquí) en un medio acuoso bajo las condiciones que producen un sabor mejorado del queso (por ejemplo, amargura reducida) , por ejemplo, como se describe en WO 99/66805. En un aspecto, las lipasas como se proporcionan aquí, se usan para aumentar el sabor en un queso (por ejemplo, un requesón) mezclando con agua una proteasa, y una fosfolipasa a una temperatura elevada, por ejemplo, entre aproximadamente 75°C a 95°C, como se describe por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 4,752,483. En un aspecto, las lipasas como se proporcionan aquí se usan para acelerar el envejecimiento del queso al agregar una enzima como se proporciona aquí a un queso (por ejemplo, una leche de quesería) antes de agregar un coagulante a la leche, o agregar una enzima (por ejemplo, una lipasa) como se proporciona aquí, a un requesón con sal antes del prensado, por ejemplo, como se describe en las Patente Norteamericana No. 4,707,364. En un aspecto, una lipasa como se proporciona aquí, se usa para degradar el triacilglicérido en la grasa de la leche para liberar los ácidos grasos libres, que resulta en el mejoramiento del sabor. Una enzima como se proporciona aquí, también puede ser usada en cualquier de estos procesos como se proporcionan aquí, véase, por ejemplo, (2001) J. Food Sci. 66:1100-1107.
Síntesis Estructurada y procesamiento de aceites En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos para la síntesis estructurada de aceites, lípidos y los similares, usando hidrolasas (por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas ) como se proporcionan aquí. Los métodos como se proporcionan aquí comprenden una síntesis biocatalítica de lípidos estructurados, es decir, lípidos que contienen un conjunto definido de ácidos grasos distribuidos en una manera definida sobre el esqueleto, por ejemplo, un esqueleto de glicerol. Los productos generados usando las hidrolasas y practicando los métodos como se proporcionan aquí, incluyen aceites de baja saturación, por ejemplo, aceites de vegetales (por ejemplo, soya, colza) , animales, plantas, pescado, algas, las cuales aceites han sido procesadas o tratadas con un polipéptido, como se proporciona aquí, y alimentos o piensos, suplementos, productos farmacéuticos y los similares que comprenden aceites saturados producidos poniendo en práctica los métodos y/o las composiciones (por ejemplo, enzimas) como se proporcionan aquí. Los productos generados usando las hidrolasas y practicando los métodos como se proporcionan aquí, también incluyen alternativas a la manteca de cacao, lipidos que contienen ácidos grasos poli-insaturados PUFAs) , lipidos que contienen ácido grasos esenciales, lipidos que contienen ácidos grasos monoinsaturados , lipidos que contienen fosfo-colina y fosfo-serina, lipidos que contienen fitoesteroles , 1,3-diacil glicéridos (DAGs) 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs) .
Los métodos proporcionados aquí permiten la síntesis de lipidos de ácidos grasos con regioselectividades y estereoselectividades definidas. Aquí se proporcionan aceites, lipidos, y los similares y aceites que pueden ser usados en alimentos y materiales de cocina (por ejemplo, aceites de cocina, aceites de freír, aceites de horneado, salsas, marinadas, condimentos, aceites para rociar, margarinas, mayonesa, aderezos que se pueden untar y que se pueden verter, alternativas de manteca de cacao, y los similares) que han sido procesados o tratados con polipéptidos o repetidos (por ejemplo, hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas ) como se proporcionan aquí. En ciertas modalidades, aquí se proporcionan productos farmacéuticos, productos nutracéuticos , y productos cosméticos que comprenden polipéptidos (por ejemplo, hidrolasas, tales como lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas; o péptidos o anticuerpos) como se proporcionan aquí.
En ciertas modalidades, aquí se proporciona métodos para procesar (modificar) aceites, lipidos y los similares usando las hidrolasas como se proporcionan aqui . Los métodos pueden ser usados en la síntesis estructurada de aceites similares a aquellos encontrados en plantas, animales, y microorganismos. Los lipidos y los aceites pueden ser procesados para tener una característica deseada. Los lipidos y los aceites que pueden ser procesados mediante los métodos como se proporcionan aquí (usando las hidrolasas como se proporcionan aquí) incluyen alternativa de manteca de cacao, lipidos que contienen ácidos grados poli-insaturados (PUFAs), lipidos que contienen ácidos grasos esenciales, lipidos que contienen ácidos grasos monoinsaturados , lipidos que contienen fosfo-colina y fosfo-serina, lipidos que contienen fitoesteroles, 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , 2-monoacilglicéridos (MAGs) y triacilglicéridos (TAGs) . En un aspecto, los aceites y las grasas, procesados y sintéticos como se proporcionan aquí (por ejemplo, alternativas a las mantecas de cacao y aceites vegetales) pueden ser usados en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, en la producción de alimentos (por ejemplo, golosinas, pasteles) y en la formulación de productos farmacéuticos, productos nutracéuticos , y productos cosméticos. Aquí se proporcionan métodos para procesar grasas y aceites, por ejemplo, oleaginosas, de plantas, incluyendo, por ejemplo, colza, ricino, coco, cilantro, maíz, semillas de algodón, avellana, cáñamo, linaza, Limnanthes alba, olivo, aceite de palma, palmiste, cacahuate, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, cebo, tsubaki, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, vía Organismos Modificados Genéticamente (GMO) o de crianza tradicional tales como aceites con alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linoleico, o de baja saturación (colza con alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con bajo contenido de ácido linoleico, o aceite de girasol con alto contenido de ácido esteárico) o mezclas de cualquiera de los anteriores usando una hidrolasa como se proporciona aquí.
En ciertas modalidades, a'qui se proporciona métodos para procesar aceites de animales, por ejemplo, de peces (pez vela, hígado de bacalao, Hoplostethus atlanticus, sardina, arenque, lacha tirana, y las similares), mamíferos (cerdo, carne bovina y los similares) , y aves de corral (pollos, y las similares) usando las hidrolasas como se proporcionan aquí. En ciertas modalidades aquí se proporcionan métodos para la sintáis estructurada de aceites similares a aquellos encontrados en animales, por ejemplo, peces, aves de corral, y mamíferos, y microorganismos, usando las hidrolasas como se proporcionan aquí. En un aspecto, estos aceites procesados o sintéticos se usan como aditivos de forrajes, alimentos, . como ingredientes en las formulaciones farmacéuticas, composiciones nutracéuticas o en productos cosméticos. Por ejemplo, en un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí se usan para separar por hidrólisis los ácidos grasos de los aceites de pescado de modo tal que los ácidos grasos pueden ser recuperados y se usan como un aditivo de forraje. En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para procesar aceites ! de desecho de restaurantes y grasas animales recuperadas.
En otras modalidades, aquí se proporcionan métodos para el procesamiento de grasas y aceites, por ejemplo, de aceites de algas, incluyendo, por ejemplo, aceite de Neochloris oleoabundans , aceite de Scenedesmus dimofphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricormutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta aceite de la especie Nannochloris , aceite de la especie Spirulina, aceite de Chlorophycease (alga verde) , y aceite de Bacilliarophy y mezclas de cualquiera de dichas grasas y aceites .
En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí, son biocatalizadores versátiles en las síntesis orgánicas, por ejemplo, en la síntesis estructurada de aceites, lípidos y los similares. Las enzimas como se proporcionan aquí (incluyendo las hidrolasas, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas) pueden aceptar un amplio rango de sustratos, incluyendo alcoholes secundarios y terciarios, por ejemplo, de un producto natural tal como alfa-terpineol , linalool y los similares. En algunos aspectos, las hidrolasas como se proporcionan aquí tienen buena a excelente enantioespecificidad (por ejemplo, estereoespecificidad) .
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan un proceso de conversión de aceites (por ejemplo, aceites vegetales, mantecas de cacao, y los similares) que comprende al menos una enzima (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) como se proporcionan aquí. En un aspecto, un proceso de conversión de aceites comprende una hidrólisis controlada y acilación, por ejemplo, una acilación de glicerol, la cual puede resultar en alta pureza para una amplia gama de productos. En un aspecto, las hidrolasas (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) como se proporcionan aquí, se usan para producir aceites de diacilglicerol y aceites nutricionales estructurados. En ciertas modalidades, aqui se proporcionan procesos para la esterificación de propilenglicol usando una enzima como se proporciona aqui, por ejemplo, una lipasa regio y/o quimioselectiva para la esterificación mono-sustituida de la posición Sn-1. Aqui se proporcionan procesos para la sintáis estructurada de aceites con perfiles de ácidos grasos saturados de insaturados buscados como objetivo, usando una enzima como se proporciona aqui, por ejemplo, una lipasa regio y/o quimio-selectiva, para la eliminación de un ácido graso saturado, para la adición focalizada de un ácido graso a un esqueleto de glicerol.
En un aspecto, los métodos como se proporcionan aqui comprenden además procesos para la eliminación selectiva de ácidos grasos (por ejemplo, ácidos grasos indeseables) de los aceites, por ejemplo, separar los ácidos grasos saturados y/o insaturados de los aceites, usando una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) como se proporciona aqui. El proceso como se proporciona aqui puede separar los ácidos grasos saturados y/o insaturados de cualquier aceite, por ejemplo, un aceite de soya, la enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva. En un aspecto, estos procesos generan alta estabilidad de grasas y aceites, por ejemplo, aceites de freír "saludables". Este proceso e emplificante como se proporciona aquí puede ser usado para generar petróleo con menos azufre, por ejemplo, usando un proceso que comprende la eliminación del azufre del aceite crudo. Las enzimas como se proporcionan aquí también pueden ser usadas en procesos de Interesterificación para estos y otros propósitos.
En un aspecto, una enzima como se proporcionan aquí se usa para generar un aceite graso "no trans". En un aspecto, un aceite "no trans" se genera a partir de una pluralidad de aceites hidrogenados parcialmente para producir un aceite solo cis. La enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva.
En otras modalidades, aquí se proporcionan procesos para modificar las mantecas de cacao usando una enzima como se proporciona aquí. Aproximadamente 80% de las mantecas de cacao comprenden triglicéridos POP, SOS y POS (P es ácido graso palmitito, O es ácido graso oleico, se es ácido graso esteárico) . La estructura del ácido graso saturado-insaturado-saturado de las mantecas de cacao imparte sus perfiles de fusión característicos, por ejemplo, en los chocolates. En un aspecto, los procesos de síntesis estructurada y directa como se proporcionan aquí, se usan en las mantecas de cacao para reducir las variaciones de la manteca de cacao o para producir mantecas de cacao sintéticos ("alternativas de manteca de cacao") . En un aspecto, una hidrolasa (por ejemplo, una lipasa, saturasa, palmitasa, y/o estearatasa) quimioselectiva y/o enantioselectiva (por ejemplo, una regio-selectiva) como se proporciona aquí, se usa para preparar una alternativa de manteca de cacao, por ejemplo, un sustituto de manteca de cacao, un reemplazo de manteca de cacao y/o un equivalente de manteca de cacao. Aquí se proporcionan alternativas de manteca de cacao, incluyendo sustitutos de manteca de cacao, reemplazadotes de manteca de cacao, y equivalentes de manteca de cacao, y sus intermediarios de fabricación que comprenden una enzima como se proporcionan aquí. Un proceso como se proporciona aquí (que usa una enzima como se proporcionan aquí) para preparar alternativas de manteca de cacao, puede comprender mezclar un aceite vegetal, por ejemplo, un aceite de palma con karité o sus equivalentes, ilipé o sus equivalentes, y Sal esterinas o sus equivalentes, y tratar los aceites mezclados con los polipéptidos como se proporcionan aquí. En un aspecto, los procesos como se proporcionan aquí comprenden el uso de Interesterificación . El proceso como se proporciona aquí puede generar formas composicionales o cristalinas que imitan la manteca de cacao "natural".
En ciertas modalidades, aquí se proporciona proceso (que usando una enzima como se proporciona aquí) para producir un diacilglicerol (DAG) , por ejemplo, 1 , 3-diacilglicerol , usando un aceite vegetal, por ejemplo un aceite de bajo costo. La enzima puede ser quimioselectiva y/o enantioselectiva . El proceso como se proporciona aquí puede resultar en una composición que comprende DAG que tiene buena estabilidad, vida media de almacenamiento larga y buen rendimiento a alta temperatura .
Las enzimas (hidrolasas, por ejemplo, lipasas, saturaras palmitasas, y/o estearatasas) como se proporcionan aquí, y los métodos como se proporcionan aquí, pueden ser usados en el tratamiento enzimático de aceites comestibles, como se describe, por ejemplo en la Patente Norteamericana No. 6,025,171. en este método ejemplificante, las enzimas como se proporciona aquí se inmovilizan preparando una emulsión que contiene una fase hidrofóbica continua, tal como un aceite de triacilglicérido, y una fase acuosa dispersada que contiene una enzima anfifílica, tal como una lipasa como se proporciona aquí, y un material portador que está disuelto parcialmente y no disuelto parcialmente en la fase acuosa, y extraer el agua de la fase acuosa hasta que la fase regrese partículas portadores revestidas con la enzima sólida. La parte no disuelta del material portador puede ser un material que es insoluble en agua, y un aceite, o un material soluble en agua en forma no disuelta, puesto que la fase acuosa ya esta saturada con el material soluble en agua. La fase acuosa puede ser formada con un líquido de fermentación de lipasa cruda que contiene residuos de fermentación y biomasa que puede servir como materiales potadores. La lipasa inmovilizada es útil para el re-arreglo de éster y la desacidificación en aceites. Después de una reacción, la enzima inmovilizada puede ser regenerada para una reacción posterior agregando agua para obtener la disolución parcial de portador, y con la enzima resultante y la fase acuosa que contiene el portador dispersada en una fase hidrofóbica, evaporar el agua para formar otra vez las articulas de portador revestidas con las enzima.
Las enzimas (por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas) como se proporciona aquí, y los métodos como se proporcionan aquí también pueden ser usados para preparar aceites transesterificados, como se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,288,619. Aquí se proporcionan métodos para la transesterificación enzimática para preparar un aceite de margarina que tiene contenido tanto contenido de ácidos trans y bajo contenido de ácidos grasos de cadena intermedia. El método incluye los pasos de: proporcionan una mezcla de reacción de transesterificación que contiene un material fuente de ácido esteárico y un aceite ' vegetal comestible líquido, transesterificar el material fuente de ácido esteárico y el aceite vegetal usando una lipasa 1-, 3-posicionalmente específica, y después hidrogenar finalmente la mezcla de ácidos grasos para proporcionar un material fuente de ácido esteárico reciclado para una reacción de reciclado con el aceite vegetal. Aquí se proporcionan métodos a contracorriente para preparar un aceite transesterificado . El método incluye los pasos de: proporcionar una zona de reacción de transesterificación que contiene una lipasa 1-1, 3-posicionalmente especifica, introducir un aceite vegetal en la zona de transesterificación, introducir un material fuente de ácido esteárico, conducir a contra-corriente un fluido de gas supercritico o gas subcritico licuado, llevar a cabo una reacción de transesterificación del flujo de triacilglicérido con la corriente de ácido esteárico o ácido esteárico monoéster en la zona de reacción, retirar una corriente de aceite de margarina de triacilglicérido transesterificado, sacar una fase fluido a contra-corriente, hidrogenar el ácido esteárico o el monoéster de ácido esteárico transesterificado para proporcionar un material fuente de ácido esteárico reciclado, hidrogenado, de introducir en la zona de reacción la fuente de ácido esteárico de reciclado, hidrogenado.
En un aspecto, para permitir que actúe la enzima como se proporciona aquí, ambas fases, la fase de aceite y la fase acuosa que contiene la enzima, deben ser mezcladas intimamente. Puede no ser suficiente solo agitarlas. La buena dispersión de la enzima en el aceite se favorece si esta se disuelve en una pequeña cantidad de agua, por ejemplo, 0.5-5 % en peso (con relación al aceite) , y se emulsifica en el aceite en esta forma, para formar gotitas de menos de 10 micrómetros de diámetro (peso promedio) . Las gotitas pueden ser menores a 1 micrómetro. Se puede llevar a cabo la agitación turbulenta con velocidades radiales superiores se 10 cm/seg. El aceite también se puede hacer circular en el reactor usando una bomba giratoria externa. La fase acuosa que contiene la enzima también puede ser dispersada finamente por medio de acción de ultrasonido. Se puede usar un aparato de dispersión.
En un aspecto, una reacción enzimática como se proporciona aqui tiene lugar en la superficie limite entre la fase aceitosa y la fase acuosa. El objetivo de todas estas medidas para el mezclado, es crear la mayor superficie posible para la fase acuosa, la cual contiene la enzima. La adición de surfactantes aumenta la microdispersión de la fase acuosa. En algunos casos, por lo tanto, los surfactantes con valores HLB superiores a 9, tales como dodecil sulfato de Na, se agregan a la solución de enzima, como se describe, por ejemplo, en EP-A 0 513 709. Un método efectivo similar para mejorar la emulsificación, es la adición de lisolecitina . Las cantidades agregadas pueden estar en el rango de 0.001% a 1%, con referencia al aceite. La temperatura durante el tratamiento de la enzima no es critica. Se pueden usar temperaturas entre 20°C y 80°C, pero la última puede ser aplicada solamente por un corto tiempo. En este aspecto, se usa una lipasa como se proporciona aqui, que tiene una buena temperatura y/o tolerancia a pH bajo. Las temperaturas de aplicación de entre 30°C y 50°C son óptimas. El periodo de tratamiento depende de la temperatura y puede ser acortado con un aumento de la temperatura. Los tiempos de 0.1 a 10 horas o, 1 a 5 horas por lo general son suficientes. La reacción tiene lugar en un reactor, el cual puede ser dividido en etapas. Por lo tanto, es posible la operación continua, además de la operación por lotes. La reacción puede ser llevada a cabo a diferentes etapas de temperatura. Por ejemplo, la incubación puede tener lugar por 3 horas a 40°C, después por 1 hora a 60°C. Si la reacción procede en etapas, esto también abre la posibilidad de ajustar los diferentes valores de pH en las etapas individuales. Por ejemplo, en la primera etapa el pH de la solución puede ser ajustado a 7, por ejemplo, y en una segunda etapa a 2.5, al agregar ácido cítrico u otros ácidos adecuados. En al menos una etapa, sin embargo, el pH de la solución de enzima debe ser inferior a 4 o inferior a 3. Si el pH se ajusta posteriormente por debajo de este nivel, se puede encontrar el deterioro del efecto. Por lo tanto, el ácido cítrico puede ser agregado a la solución de enzima antes que este último se mezcle en el aceite.
Las enzimas (hidrolasas, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas ) como se proporcionan aquí, y los métodos como se proporciona aquí, también pueden ser útiles para preparar aceites, como se describe, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 11/567,318, incorporada aquí como eferencia en su totalidad. Aquí se proporcionan procesos continuos para el tratamiento enzimático de lipidos. El método se refiere a un proceso y un aparato para la interesterificación enzimática continua de composiciones que contienen lipidos usando una pluralidad de reactores de lecho fijo, en donde el flujo de la composición que contiene lipidos a través del aparato puede permanecer sustancialmente constante aun cuando la actividad enzimática de un lecho fijo se reduce con respecto al tiempo, y aun cuando un lecho fijo sea sacado de la linea para reparación, reemplazo, o reaprovisionamiento.
En una modalidad, aquí se proporciona un método para hidrolizar un aceite o grasa haciendo reaccionar el aceite o la grasa con una enzima palmitasa. En una modalidad, la hidrólisis se conduce en presencia de un emulgente que tenga un, valor HLB mayor a 12. En una modalidad, la enzima palmitasa se codifica por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.5% o 100% de identidad de la secuencia con la SEQ IN NO:l y que tiene i) un cambio de nucleótidos (o el equivalente al mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la posición 85 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o equivalentes de los mismos) que codifican los residuos de aminoácidos en las posición es 85 y 172 (o los equivalentes de los mismos) como se establece en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la posición 83 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico es la secuencia de la SEQ IN N0:1 y que tiene i) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la posición 95 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o los equivalentes de los mismos) que codifican los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (los equivalentes de los mismos) como se establece en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la poción 83 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una modalidad, la enzima palmitasa tiene acierto en tolerancia térmica 29 como se describe en la Tabla 9, y que tiene i) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la posición 95 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente del mismo () que codifica los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o los equivalentes de los mismos) como se establece en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácido en la posición 83 (o el equivalente del mismo) como se establece en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG. En una modalidad, la enzima palmitasa usada en los métodos proporcionados aquí es la enzima 29 SM con las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG, como se describe en el Ejemplo 12.
En ciertas modalidades, el emulgente tiene un HLB mayor que 12, 14, 16, o 18. En ciertas modalidades, el emulgentes se selecciona de oleato de sodio, oleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, laureato de sodio, laureato de potasio, estearato de sodio, estearato de potasio, palmitato de sodio, palmitato de potasio, oleato de sodio de palma o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, la mezcla de reacción comprende aproximadamente 1 a 20% de agua con base en el peso total de los reactivos. En una modalidad, la mezcla de reacción comprende aproximadamente 1, 2, 5, 7, 10, 15, 17, o 20% con base en el peso total de los reactivos.
En ciertas modalidades, el aceite o la grasa se mezclan con el emulgente antes de la adición de la enzima palmitasa. En ciertas modalidades, la mezcla de aceite/grasa y el emulgente se homogenizan antes y/o después de la adición de la enzima palmitasa para asegurar la emulsificación uniforme.
En ciertas modalidades, la reacción se conduce a aproximadamente 20 a 70°C. En ciertas modalidades, la reacción se conduce a aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, o 70 °C. En ciertas modalidades, la enzima palmitasa proporcionada aquí reduce el contenido de palmitato del aceite/grasa a aproximadamente 5% o menos. En ciertas modalidades, la enzima palmitasa proporcionada aquí reduce el contenido de palmitasa del aceite/grasa a aproximadamente 5, 4, 3, 1% o menos. En ciertas modalidades, la reducción deseada en el contenido de palmitato tiene lugar en aproximadamente o menos de aproximadamente 48h, 24h, 20h, 16h, 12h, lOh, 5h, o 3h. En ciertas modalidades, el método comprende además un pre-tratamiento o el aceite/grasa para eliminar la goma y la fase acuosa y para reducir los ácidos grasos libres. Cualquier pre-tratamiento considerado adecuado por una persona experimentada en la técnica puede ser usado. En ciertas modalidades, el método comprende además la adición de una base (adición cáustica) para formar jabones.
En ciertas modalidades, el aceite usado en la reacción es aceite refinado o aceite crudo, en una modalidad, la reacción comprende además la adición de un fosfolipido. Cualquier fosfolipido considerado adecuado por una persona experimentada en la técnica puede ser usado en las reacciones.
En una modalidad, el fosfolipido es lecitina. En una modalidad, el aceite usado en las reacciones proporcionadas aquí es un aceite refinado y la reacción comprende la adición de un fosfolipido.
Nutracéuticos En un aspecto, las composiciones y los métodos como se proporcionan aquí pueden ser usados para preparar nutracéuticos , procesando o sintetizando lipidos y aceites usando las enzimas como se proporcionan aquí, por ejemplo, hidrolasas, por ejemplo, las lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas como se proporcionan aquí, en un aspecto, los lipidos o los aceites procesados o sintetizados incluyen ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs), diacilglicéridos , por ejemplo, 1,3-diacil glicéridos (DAGs) , monoacilglicéridos , por ejemplo, 2-monoacilglicéridos ( AGs) y triacilglicéridos (TAAGs) . En un aspecto, los nutracéuticos se fabrican procesando diacilglicéridos, por ejemplo, 1,3-diacil glicéridos (DAGs), monoacilglicéridos, por ejemplo, 2-monoacilglicéridos (MAGs) y/o triacilglicéridos (TAGs) de fuentes vegetales (por ejemplo, oleaginosas) o de fuentes animales (por ejemplo, aceite de pescado) . En ciertas modalidades, aquí se proporciona nutracéuticos (por ejemplo, composiciones dietéticas) que comprenden polipéptidos (por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos como se proporcionan aquí.
En un aspecto, las composiciones y los métodos como se proporcionan aquí pueden ser usados para composiciones dietéticas fortificantes, en especial productos a base de leche de vaca, formulas infantiles a base de leche de vaca, con hidrolasas activadas por sales bilires. Las composiciones preparadas mediante los métodos y las composiciones como se proporcionan aquí pueden ser usadas para alimentar recién nacidos de infantes prematuros, incluyendo la administración de una hidrolasa activada por sales biliares como se proporcionan aquí, para aumentar la digestión de la grasa y por lo tanto, la tasa de crecimiento. En ciertas modalidades, aquí se proporcionan composiciones y métodos para tratar sujetos por la producción inadecuada de enzimas pancreáticas, mediante la administración de hidrolasa activada por sales biliares en conjunción con la ingestión de grasas; véase también la siguiente discusión.
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan composiciones dietéticas que comprenden una hidrolasa, por ejemplo, una hidrolasa activada por las sales biliares como se proporciona aquí. En ciertas modalidades, aquí se proporciona composiciones dietéticas que comprenden una base nutricional que comprenden una grasa y , una cantidad efectiva de la hidrolasa activada por las sales biliares como se proporciona aquí. En una modalidad, aquí se proporcionan formulas infantiles basadas en leche de vaca que comprenden una hidrolasa, por ejemplo, una hidrolasa activada por sales biliares como se proporciona aquí, en un aspecto, la hidrolasa como se proporciona aquí es activa en la digestión de los ácidos grasos de cadena larga, por ejemplo, de Ci2 a C22Í las cuales constituyen un porcentaje muy alto de la mayoría de las leches, por ejemplo, 99% de la leche materna humana. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,000,975.
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan composiciones dietéticas que comprenden una grasa de aceite vegetal y una hidrolasa como se proporciona aquí. En otras modalidades, aquí se proporcionan métodos para el procesamiento de productos basados en leche y/o composiciones que comprenden aceite vegetal para preparar composiciones dietéticas. En un aspecto, las composiciones procesadas comprenden aceite de ácido láurico, un aceite de ácido oleico, un aceite de ácido palmitito, y/o un aceite de ácido linoleico. En un aspecto, un aceite de salvado de arroz, un aceite oleico de girasol, y/o un aceite de colza se pueden usar como aceites de ácidos oleicos. En un aspecto, las grasas y aceites, por ejemplo, oleaginosas, de plantas, incluyendo, colza, ricino, coco, cilantro, maíz, semillas de algodón, avellana, cáñamo, linaza, Limnanthes alba, olivo, aceite de palma, palmiste, cacahuate, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, cebo, tsubaki, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, vía Organismos Modificados Genéticamente (GMO) o de "crianza tradicional" tales como aceites con alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linoleico, o de baja saturación (colza con alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con bajo contenido de ácido linoleico, o aceite de girasol con alto contenido de ácido esteárico) , mezclas de las anteriores para se usadas en los nutracéuticos y las composiciones dietéticas se procesan o se fabrican usando una hidrolasa como se proporciona aquí. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,944,944.
En un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí se proporcionan en una forma que se estable para almacenamiento en la fórmula y/o el estomago, pero activa cuando la formulación alcanza la porción del tracto gastrointestinal donde la fórmula debe ser digerida normalmente. Las formulaciones (por ejemplo, microcápsulas) para liberación en el intestino son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, polímeros biodegradables tales como poliláctido y poliglicólido, como se describen, por ejemplo, en la Patentes Norteamericanas Nos. 4,767,628; 4,897,268; 4,925,673; 5, 902, 617.
Golosinas, manteca de cacao (cocoa) y alimentos En un aspecto, las composiciones y los métodos como se proporcionan aquí pueden ser usados para preparar y procesar mantecas duras, tales como manteca de cacao. En otro aspecto, aquí se proporcionan golosinas, manteca de cacao y alimentos que comprenden polipéptidos (por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos) como se proporcionan aquí. las composiciones y los métodos como se proporcionan aquí, pueden ser usados para preparar alternativas de manteca de cacao mediante técnicas de síntesis "estructurada" usando las enzimas, por ejemplo, las hidrolasas, por ejemplo, las lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas como se proporcionan aquí. Por ejemplo, en un aspecto, los métodos como se proporciona aquí procesan o sintetizan triacilglicéridos , diacilglicéridos y/o monoacilglicéridos para ser usados, por ejemplo, como alternativas de manteca de cacao. En un aspecto, los métodos como se proporcionan aquí generan una manteca dura con una "región plástica definida" para mantener la dureza suficiente por debajo de o a la temperatura ambiente. En un aspecto, el lípido procesado o sintetizado se diseña para tener una "región plástica" muy estrecha, por ejemplo, en un aspecto, donde este se funde rápidamente a aproximadamente la temperatura corporal. La manteca de cacao natural comienza a ablandarse a aproximadamente 30°C a 32°C, y se funde completamente a aproximadamente 36°C. La manteca de cacao natural contiene 70% en peso o más de tres 2-oleolil gliceroles 1 , 3-disaturados , los cuales son 1 , 3-dipalmitoil-2-oleil glicerol (POP), 1-palmitoil-2-oleil-3-estearoil glicerol (POSt) y 1,3-diesterearoil-2-oleil glicerol (StOSs) . Esto tres gliceroles muestran comportamiento de fusión similar entre si y son responsables de las propiedades de fusión de la manteca de cacao, que exhibe una región plástica muy estrecha. En ciertas modalidades, aquí se proporcionan mantecas de cacao sintéticas o mantecas de cacao procesadas (sintetizadas o procesadas usando una hidrolasa como se proporciona aquí, todas las posibles composiciones se conocen como alternativas de manteca de cacao) con porcentajes variables de 1 , -3-dipalmitoil-2-oleolil glicerol (POP), l-palmitoil-2-oleoil glicerol (POSt) y 1, 3-diestearoil-2-oleoil glicerol (StOSt) , dependiendo de las propiedades deseadas de la manteca de cacao sintética, y, las mantecas de cacao sintéticas con más o menos 70% en peso de tres 2-oleoil gliceroles 1 , 3-disaturados . Las mantecas de cacao sintéticas proporcionadas aquí pueden reemplazar parcialmente o completamente las mantecas de cacao, naturales o no procesadas y pueden mantener o mejorar las propiedades esenciales de la manteca dura.
En ciertas modalidades, aqui se proporcionan mantecas de cacao sintéticas o mantecas de cacao procesadas (sintetizadas o procedas usando una hidrolasa como se proporciona aqui) con las propiedades deseadas para ser usadas en golosinas, panadería, y productos farmacéuticos. En otras modalidades, aquí se proporcionan productos de confitería, panadería y farmacéuticos, y los similares, que comprenden una hidrolasa como se proporciona aquí. En un aspecto, los métodos como se proporcionan aquí fabrican o procesan un lípido (una grasa) de una golosina (por ejemplo, un chocolate) o para ser usado en una golosina. En un aspecto, un lípido de fabrica o se procesa de modo tal que el chocolate muestre menos impresión de de los dedos que el chocolate de manteca de caco natural, en tanto que tiene aun características de fusión de la forma en la boca. En un aspecto, un lípido de prepara o se procesa de modo tal que una golosina (por ejemplo, un chocolate) se puede preparar a una temperatura ambiente comparativamente alta, o se prepara usando agua de enfriamiento a una temperatura comparativamente alta. En un aspecto, el lípido se preparar o se procesa de modo tal que una golosina (por ejemplo, chocolate) puede ser almacenada bajo condiciones relativamente más calientes, por ejemplo, condiciones tropicales o semi-tropicales o en edificios calentados centralmente. En un aspecto, los lípidos se preparan o se procesan de modo tal que una golosina (por ejemplo, chocolate) tendrá un contenido de lipido (grasa) de composición de calidad consistente. Las enzimas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para proporcionar una composición sustituta para la manteca de cacao, la cual pueden mejorar significativamente su estabilidad térmica y la reemplaza en un rango amplio de aplicaciones.
Producción de margarina y manteca En ciertas modalidades, aquí se proporcionan grasas sintéticas o procesadas, por ejemplo, margarina y manteca, sintetizadas o procesadas usando una hidrolasa como se proporciona aqui. En otras modalidades, aquí se proporcionan grasas sintéticas o procesadas, por ejemplo margarina y manteca, que comprenden polipéptidos (por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos) como se proporcionan aqui.
En una modalidad, aqui se proporcionan grasas procesadas que comprenden un aceite vegetal, tal como aceite de colza, ricino, coco, cilantro, maíz, semillas de algodón, avellana, cáñamo, linaza, Limnanthes alba, olivo, aceite de palma, palmiste, cacahuate, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, cebo, tsubaki, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, vía Organismos Modificados Genéticamente (GMO) o de crianza tradicional tales como aceites con alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linoleico, o de baja saturación (colza con alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con bajo contenido de ácido linoleico, o aceite de girasol con alto contenido de ácido esteárico) tipos de aceites sintetizados o procesados usando una hidrolasa como se proporciona aqui. Las grasas sintéticas o procesadas, por ejemplo, margarina y manteca, se diseñan para tener una "plasticidad" deseada. Muchos de los productos de gasa plásticos, tales como margarina y manteca, se producen a partir de materiales duros y aceites líquidos como materias primas. Por ejemplo, aceites líquidos tales como colza, ricino, coco, cilantro, maíz, semillas de algodón, avellana, cáñamo, linaza, Limnanthes alba, olivo, aceite de palma, palmiste, cacahuate, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, cebo, tsubaki, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, vía Organismos Modificados Genéticamente (GMO) o de crianza tradicional tales como aceites con alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linoleico, o de baja saturación (colza con alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con bajo contenido de ácido linoleico, o aceite de girasol con alto contenido de ácido esteárico) , se mezclan con sus aceites endurecidos (materiales duros), y la mezcla se ajusta para tener una consistencia apropiada (plasticidad) . Los productos de grasa plástica tales como margarina y manteca así producidos tienden a provocar la formación de cristales relativamente gruesos ya que las grasas y los aceites usados como las materias primas se descomponen de ácidos grasos que tienen casi la misma longitud de la cadena de carbonos. En otras palabras, estos tienen una composición altamente no unificada de ácidos grasos. Por esta razón, la plasticidad de estos productos puede ser mantenida a un grado apropiado solo dentro de un rango de temperatura estrecho, de modo tal que los aceites líquidos contenidos en las mismas tienen una tendencia a oxidarse. Aquí se proporcionan métodos para preparar o procesar grasas diseñadas de modo tal que estas tienen una composición variada (y definida) de ácidos grasos. El aceite resultante, por ejemplo, margarina o manteca, puede tener un amplio rango de plasticidad.
En un aspecto, los métodos y las composiciones como se proporcionan aqui, se usan para preparar o procesar tipos de aceites vegetales, tales como colza, ricino, coco, cilantro, maíz, semillas de algodón, avellana, cáñamo, linaza, Limnanthes alba, olivo, aceite de palma, palmiste, cacahuate, colza, salvado de arroz, cártamo, sasanqua, soya, girasol, cebo, tsubaki, variedades de aceites "naturales" que tienen composiciones alteradas de ácidos grasos, vía Organismos Modificados Genéticamente (GMO) o de crianza tradicional tales como aceites con alto contenido de ácido oleico, bajo contenido de ácido linoleico, o de baja saturación (colza con alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con bajo contenido de ácido linoleico, o aceite de girasol con alto contenido de ácido esteárico) usando las hidrolasas como se proporcionan aqui, incluyendo la inter-esterificación y transesterificación enzimática, véase, por ejemplo, la Publicación de la Patente Norteamericana No. 5,288,619 y la Solicitud de Patente Norteamericana con Número de Serie 11/567,318. Los métodos y las composiciones como se proporcionan aqui pueden ser usadas en lugar de la ínter-esterificación aleatoria como se describe por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 3,949,105. En un aspecto, los métodos y las composiciones como se proporcionan aquí se usan en la transesterificación enzimática para preparar un aceite, por ejemplo, un aceite de margarina, que tiene tanto bajo contenido de ácido trans- y bajo contenido de ácido graso de cadena intermedia.
En un aspecto, la estructura simétrica de un aceite, por ejemplo, los tipos de aceites de palma o láurico se modifica, por ejemplo, en una estructura al azar. Por lo tanto, los métodos como se proporciona aquí pueden ser usados para modificar las propiedades de los productos de grasa plástica. En un aspecto, la modificación de los aceites mediante los métodos como se proporcionan aquí puede ser diseñada para evitar o detener el endurecimiento gradual del aceite con el tiempo, en particular cuando los productos deben ser almacenados.
En un aspecto, los métodos y las composiciones como se proporcionan aqui en una mezcla de reacción de trans-esterificación que comprende un material fuente de ácido esteárico y un aceite comestible vegetal, liquido, trans-esterificar el material de fuente de ácido esteárico, y el aceite vegetal usando una lipasa especifica posicionalmente de 1,3- como se proporciona aqui, y después hidrogenar la mezcla de ácidos grasos para proporcionar un material de fuente de ácido esteárico reciclado para una reacción de reciclamiento con el aceite vegetal. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,288,619.
En un aspecto, una reacción de inter-esterificación se conduce con una lipasa como se proporciona aquí. En un aspecto, la lipasa como se proporciona aquí tiene selectividad por las posiciones 1- y 3- del triacilglicérido para detener o inhibir un aumento en la cantidad de los triacilglicéridos tri-saturados en el aceite. En esta reacción como se proporciona aquí, las deficiencias de la inter-esterificación aleatoria convencional y la dificultad de las inter-esterificación con una lipasa no específica, pueden ser superadas, puesto que la inter-esterificación se conduce por una enzima como se proporciona aquí, que tiene especificidad por las posiciones 1 y 3 de los triacilglicéridos. En un aspecto, la exudación de los aceites líquidos contenidos en los productos se detiene o se evita con un aumento de la temperatura en la reacción, para inhibir una elevación en el punto de fusión provocado por un aumento en la cantidad de triacilglicéridos tri-saturados. Esto soluciona el problema del endurecimiento de los productos durante el almacenamiento a largo plazo.
Composiciones farmacéuticas y tratamiento de deficiencias de hidrolasa En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos y composiciones (enzimas como se proporcionan aqui, por ejemplo, las estearasas, acilasas, lipasas, fosfolipasas o proteasas como se proporcionan aqui) que pueden ser usadas en el tratamiento de una deficiencia de hidrolasa en un animal, por ejemplo, un mamífero tal como un humano. Por ejemplo, en un aspecto, los métodos y las composiciones como se proporcionan aquí se usan para tratar pacientes que sufren de una deficiencia de una lipasa pancreática. En un aspecto, la lipasa se administra oralmente. Una enzima como se proporciona aquí puede ser administrada en lugar de o con una preparación de enzima de páncreas de cerdo.
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos (por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos) como se proporcionan aquí. Estas composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de tabletas, pildoras, geles, cápsulas, hidrogeles, rociadores, polvos, aerosoles, implantes, liposomas, cremas, ungüentos, líquidos, microesferas, micropartículas, partículas núcleo, emulsiones, suspensiones, nanoestructuras y los similares. Las composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos (por ejemplo, enzimas, péptidos, anticuerpos) como se proporcionan aquí, pueden ser administradas en cualquier forma, por ejemplo, oralmente, intradérmicamente, intraperitonealmente , por I.V., tópicamente y las similares. En un aspecto, las composiciones farmacéuticas como se proporcionan aquí se formulan para administración tópica, sublingual, oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intraarterial, intraarticular , o intradérmica .
En un aspecto, las composiciones como se proporcionan aquí usadas para estos tratamientos son activas bajo condiciones acidas. En un aspecto, las composiciones como se proporcionan aquí se administran oralmente en formulaciones (por ejemplo tabletas, pildoras, geles, cápsulas, hidrogeles, rociadores, polvos, aerosoles) que pasan a través de las regiones acidas del estomago y descargan la enzima solo en el ambiente relativamente alcalino del yeyuno. En un aspecto, una hidrolasa como se proporciona aquí se formuela con un portador tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, derivados de celulosa o gelatina o cualquier otro de tales excipientes. También se puede agregar un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio o cera de polietilenglicol . Una solución concentrada de azúcar, la cual puede contener aditivos tales como talco, dióxido de titanio, gelatina o goma Arábiga, 1 se puede agregar como un revestimiento. Las cápsulas suaves y rígidas pueden ser usadas para encapsular una hidrolasa como un líquido o como una preparación sólida. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,691,181; 5;, 858, 755.
Detergentes En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos y composiciones (enzimas, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas como se proporcionan aquí) que pueden ser usadas en la preparación y uso de detergentes. Una hidrolasa como se proporciona aquí, puede ser agregada a, por ejemplo, mezclada con, cualquier composición de detergente, sólida o liquida, con o sin cambios de la composición de la composición de detergente. Por ejemplo, una hidrolasa como se proporciona aquí puede ser agregada a cualquier jabón, por ejemplo, sulfatos alifáticos tales como sulfataos de alquilo o alquenilo, de cadena lineal o ramificada, sulfatos de amida, sulfatos de alquil o alquenil éster que tienen grupo alquilo alquenilo de cadena lineal o ramificada al cual se agrega uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, sulfonatos alifáticos, tales como sulfonatos de alquilo, sulfonatos de amida, sulfosuccinatos de dialquilo, sulfonatos de alfa-olefinas , de olefinas tipo vinilideno y de olefinas internas, sulfonatos aromáticos tales como alquilbecenosulfonatos de cadena lineal o ramificada, carbonatos de alquil o alquenil éter o amidas que tienen un grupo alquilo alquenilo de cadena lineal o ramificada al cual se agrega uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, o amidas, sales de ácidos o ésteres alfa-sulfa-grasos , surfactantes de tipo aminoácidos, surfactantes de sulfato tales como fosfatos ácidos de alquilo o alquenilo, y fosfatos de alquilo alquenilo, surfactantes anfóteros de tipo ácido sulfónico, surfactantes anfóteros de tipo betaina, éteres o alcoholes de alquilo alquenilo que tienen grupos alquilo o alquenilo de ' cadena lineal o ramificada a los cuales se agrega uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, polioxi-etilenalquil fenil éteres que tienen un grupo alquilo de cadena linea o ramificada al cual se agrega uno o más de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno, alcanolamidas de ácido graso superior o aductos de óxido de alquileno de los mismos, sacarosa ácido graso ésteres, ácido graso glicerol monoésteres, óxidos de alquil o alquenilamina, surfactantes catiónicos del tipo sal de tetraalquilamonio, o combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,827,718.
En algunas modalidades, aqui se proporcionan composiciones de detergente que comprenden uno o más polipéptidos (hidrolasas) como se proporcionan aqui. Las formas tensioactivas y/o no tensioactivas pueden ser usadas. En un aspecto, la cantidad total de hidrolasa, tensioactiva y/o no tensioactiva, puede ser desde aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 1.0%, o desde aproximadamente 0.0002% a aproximadamente 0.5% en peso, de la composición de detergente. En un aspecto, de la composición de detergente, la hidrolasa tensioactiva es desde aproximadamente 5% a aproximadamente 67% y la hidrolasa no tensioactiva es desde aproximadamente 335 a aproximadamente 95% de la actividad total de la hidrolasa en la mezcla enzimática. En un aspecto, el pH óptimo de la mezcla enzimática total es entre aproximadamente 5 a aproximadamente 10.5.
En un aspecto, las composiciones detergentes como se proporcionan aquí incluyen hidrolasas alcalinas como se proporcionan aquí las cuales funcionan a valores de pH alcalino, ya que el pH de una solución de lavado puede estar en un rango de pH alcalino bajo las condicione de pH ordinarias. Véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,454,971.
Los polipéptidos como se proporcionan aquí (encimas como se proporcionan aquí) pueden ser usadas en cualquier composición detergente, las cuales son bien conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,069,810; 6,322,595; 6,313,081. Por ejemplo, en un aspecto, se proporciona una composición de detergente de lavandería. Esta puede comprender 0.8 ppm a 80 ppm de una lipasa como se proporciona aquí.
Cualquier método para preparar y usar composiciones detergentes se puede usar con las enzimas como se proporcionan aquí, véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,413,928; 6,399,561; 6,365,561; 6,380,147. Las composiciones detergentes pueden ser composiciones acuosas de uno y dos componentes, una composición líquida no acuosa, un sólido moldeado, una forma granular, una forma particulada, una tableta comprimida, una forma de gel, un polvo, un gel, un hidrogel, un liposoma, un aerosol, una pasta y/o una forma de espuma. Las hidrolasas como se proporcionan aquí, también pueden ser usadas como un producto aditivo de detergente en una forma sólida o líquida. Tales productos aditivos tienen la intención se complementar o potenciar el rendimiento de las composiciones detergentes convencionales y pueden ser agregados en cualquier etapa del proceso de limpieza.
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos capaces de eliminar manchas gruesas de comida, películas de residuos de comisa y otras composiciones alimenticias menores usando estas composiciones detergentes. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden facilitar la eliminación de manchas por medio de la hidrólisis catalítica de lípidos, grasas o aceites. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en detergentes de lavado de vajillas y en detergentes de lavandería de textiles.
El contenido real de la enzima depende del método de fabricación de una composición detergente y no es crítico, asumiendo que la composición detergente tiene la actividad enzimática deseada. En un aspecto, la cantidad de hidrolasas presentes en la composición final varía desde aproximadamente 0.001 mg a 0.5 mg por gramo de la composición detergente. La 'enzima particular elegida para ser usada en el proceso y los productos proporcionados aquí depende de las condiciones de utilidad final, incluyendo la forma física del producto, el pH de uso, la temperatura de uso, y los tipos de manchas a ser degradadas o alteradas. La enzima puede ser elegida para proporcionar la actividad y la estabilidad óptimas para cualquier conjunto dado de condiciones de utilización. En un aspecto, las hidrolasas proporcionadas aquí son activas en los rangos de pH desde aproximadamente 4 a aproximadamente 12 y en el rango de temperatura desde aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C. Los detergentes como se proporcionan aquí pueden comprender surfactantes catiónicos, aniónicos semi-polares o zwitterionicos , o mezclas de los mismos.
En una modalidad, las enzimas como se proporcionan aquí pueden ser formuladas en detergentes pulverulentos y líquidos que tienen un pH entre 4.0 y 12.0 a niveles de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5% (/alternativamente 0.1% a 0.5%) en peso. Estas composiciones detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como proteasas, celulasas, lipasas o endoglicosidadas , endo-beta-1, 4-glucanasas, beta-glucanasas , endo-beta-1 , 3 ( 4 ) -glucanasas , cutinasas, peroxidasas, lactasas, amilasas, glucoamilasas, pectinasas, reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , liginasas, pululanasas, arabinasas, hemicelulasas , manasas, xiloglucanasas , xilanasas, pectina acetil estearasas, rhamnogalacturonan acetil esterasas, poligalacturonasas , rhamnogalacturonasas , galactanasas , pectin liasas, pectin metilesterasas, celobiohidrolasas y/o transglutaminasas . Estas composiciones detergentes también pueden incluir mejoradores y estabilizadores.
La adición de las hidrolasas como se proporcionan aquí, a las composiciones de limpieza no crea ninguna limitación especial de uso. En otras palabras, cualquier temperatura y pH adecuados para el detergente también son adecuados para las composiciones como se proporcionan aquí, siempre y cuando la enzima sea activa a, o tolerada al pH y/o la temperatura del uso pretendido. Además, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en una composición de limpieza sin detergentes, otra vez ya sea individualmente o en combinación con mejoradores y estabilizadores.
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan composiciones de limpieza que incluyen composiciones detergentes para limpiar superficies duras, composiciones detergentes para limpiar telas, composiciones para lavado de vajillas, composiciones de limpieza oral, composiciones de limpieza dental, y soluciones de limpieza de lentes de contacto .
En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos para lavar objetos que comprenden objetos con un polipéptido, como se proporcionan aquí, bajo las condiciones suficientes para el lavado. Una hidrolasa como se proporciona aquí puede ser incluida como un aditivo detergente. La composición detergente como se proporciona aqui puede, por ejemplo, ser formulada como una composición detergente de lavandería a mano o en máquina que comprende un polipéptido como se proporciona aquí. Un aditivo de lavandería adecuado para el pre-tratamiento de telas teñidas puede comprender un polipéptido como se proporciona aquí. Una composición suavizante de telas puede comprender una hidrolasa como se proporciona aquí. Alternativamente, una hidrolasa como se proporciona aquí puede se formulada como una composición detergente para ser usada en operaciones generales de limpieza de superficies duras, doméstica. En aspectos alternativos, los aditivos detergentes y las composiciones detergentes como se proporcionan aquí pueden comprender una o más enzimas distintas tales como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, otra proteasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una manasa, una arabinasa, una galactonasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lactasa, y/o una peroxidasa (véase también, lo anterior) . Las propiedades de las enzimas como se proporcionan aquí se eligen para ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otras enzimas y los ingredientes no enzimáticos, etc.) y las enzimas están presentes en cantidades efectivas. En un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí se usan para eliminar materiales malolientes de las telas. Varias composiciones detentes y los métodos para prepararlas que pueden ser usados se describen por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,333,301; 6,329,333; 6,326,341; 6,297,038; 6,309,871; 6,204,232; 6,197,070; 5,856,164.
Cuando se formulan como composiciones para ser usadas en un método de lavado en máquinas de lavandería, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden comprender tanto un surfactante y un compuesto mejorador. Estos pueden comprender adicionalmente uno o más componentes detergentes, por ejemplo, compuestos poliméricos orgánicos, agentes de blanqueamiento, enzimas adicionales, supresores de agua jabonosa, dispersantes, dispersantes de jabón de cal, suspensiones de suciedad y agentes anti-redeposición de inhibidores de corrosión. Las composiciones de lavandería como se proporcionan aquí también pueden contener agentes de ablandamiento, como componentes detergentes adicionales. Las composiciones que contienen hidrolasas como se proporcionan aquí pueden comprender composiciones de limpieza de telas, remoción de tintes, mantenimiento de la blancura, ablandamiento, apariencia del color, inhibición de la transferencia del color y esterilización, cuando se formulan como composiciones detergentes de lavandería.
La densidad de las composiciones detergentes de lavandería como se proporcionan aquí pueden variar desde aproximadamente 200 a 1500 g/litro, o aproximadamente 400 a 1200 g/litro, o aproximadamente 500 a 950 g/litro, o 600 a 800 g/litro, de la composición, esto puede ser medido a aproximadamente 20°C.
La forma "compacta" de las composiciones detergentes de lavandería como se proporciona aquí se refleja mejor por la densidad y, en términos de la composición, por la cantidad de la sal de relleno inorgánica. Las sales de relleno inorgánicas son ingredientes convencionales de las composiciones detergentes en forma de polvo. En las composiciones detergentes convencionales, las sales de relleno están presentes en cantidades sustanciales, típicamente 17% a 35% en peso de la composición final. En un aspecto de las composiciones compactas, la sal de relleno está presente en cantidades que no exceden 15% de la composición total, o, que no exceden 10%, o que no exceden 5% en peso de la composición. Las sales de relleno inorgánicas pueden ser seleccionadas de sales de metales alcalinos y alcalinotérreos de sulfatos y cloruros, por ejemplo, sulfato de sodio., Las composiciones detergentes líquidas como se proporcionan aquí también pueden estar en una "forma concentrada". En un aspecto, las composiciones detergentes líquidas pueden contener una cantidad menor de agua, en comparación con los detergentes líquidos convencionales. En aspectos alternativos, el contenido de agua de los detergentes líquidos concentrados es menor que 40%, o menor que 30%, o menor que 20%, en peso de la composición detergente. Los compuestos detergentes como se proporcionan aquí pueden comprender las formulaciones como se describen en O 97/01629.
Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser útiles para formular varias composiciones de limpieza. Un número de compuestos conocidos son surfactantes adecuados que incluyen detergentes no iónicos, aniónicos, catiónicos, o zwitterionicos , por ejemplo, como se describe en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,404,128; 4,261,868; 5,204,015. Además, las enzimas como se proporcionan aquí pueden ser usadas, por ejemplo, en aplicaciones de jabones en barra o líquidos, formulaciones para el cuidado de platos, soluciones o productos para limpieza de lentes de contacto, hidrólisis de péptidos,' tratamiento de desechos, aplicaciones textiles, como enzimas de fusión-escisión en la producción de proteínas, y los similares. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden proporcionar rendimiento mejorado en una composición detergente en comparación con otras proteasas detergentes, es decir, el grupo enzimático puede aumentar la limpieza de ciertas manchas sensibles enzimas, tales como pasto o sangre, cuando se determina por la evaluación usual después de un ciclo de lavado estándar. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser formuladas en detergentes en polvo y líquidos conocidos, que tienen un pH entre 6.5 y 12.0 a niveles de aproximadamente 0.01 a 5% (por ejemplo, aproximadamente 0.1% a 0.5%) en peso. Estas composiciones de limpieza detergentes también pueden incluir otras enzimas, tales como otras esterases, fosfolipasas, proteasas, -amilasas, celulasas, lipasas o endoglicosidasas conocidas, así como mejoradores y estabilizadores .
Tratamiento de alimentos y procesamiento de alimentos Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para la separación de 1 componentes de las células de plantas. Por ejemplo, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en la separación de materiales ricos en proteínas (por ejemplo, las células de plantas) en sus componentes, por ejemplo, sacarosa de la remolacha de azúcar o almidón o azucares de la papa, la pulpa de las fracciones de cáscara. En un aspecto, las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para separar los cultivos ricos en proteínas o ricos en aceites, en proteínas y aceites valiosos y fracciones de cáscara. El proceso de separación puede ser llevado a cabo mediante el uso de los métodos conocidos en la técnica .
Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en la preparación de jugos de frutas o vegetales, jarabes, extractos y los similares par aumentar el rendimiento. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas en el tratamiento enzimático (por ejemplo, hidrólisis de proteínas) de varios materiales derivados de la pared de células de plantas o materiales de desecho, por ejemplo, de la producción del vino o jugo, o residuos agrícolas tales como cáscaras de vegetales, cáscaras de frijoles, pulpa de remolacha dé azúcar, pulpa de olivo, pulpa de papa y los similares. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para modificar la consistencia y la apariencia de frutas o vegetales procesados. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para tratar materiales de plantas para facilitar el procesamiento de materiales de plantas, incluyendo alimentos, facilitar la purificación o la extracción de componentes de plantas. Las hidrolasas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para mejorar el valor alimenticio, aumentar la capacidad de enlazamiento de agua, mejorar la capacidad de degradación en' plantas de aguas residuales y/o mejorar la conversión del material vegetal a ensilage, y los similares.
Forrajes y alientos para animales y aditivos de forrajes En ciertas modalidades, aquí se proporcionan métodos para tratar forrajes y alimentos animales y aditivos de forrajes y alimentos usando hidrolasas como se proporcionan aquí, los animales que incluyen mamíferos (por ejemplo, humanos), aves, peces y los similares. En otras modalidades, aquí se proporcionan forrajes de animales, alimentos, y suplementos alimenticios, y aditivos que comprenden las hidrolasas como se proporcionan aquí.
En ciertas modalidades aquí se proporcionan hidrolasas para ser usadas en la modificación de forrajes animales o un alimento, por ejemplo, para procesar el alimento o el forraje ya sea in vitro (modificando los componentes del forraje o el alimento) o in vivo. En otro aspecto, las hidrolasa. como se proporciona aquí puede ser suministrada expresando las enzima se directamente en los cultivos de forraje transgénicos (como, por ejemplo, plantas transgénicas , semillas y las similares) , tales como maíz, soya, semillas de colza, altramuzes y los similares. En un aspecto, aquí se proporciona plantas transgénicas, partes de plantas y célula s de plantas que comprenden una secuencia dé acido nucleico que codifica un polipéptido como se proporciona aquí. En un aspecto, el ácido nucleico se expresa de modo tal que la Hidrolasa como se proporciona aquí se produce en cantidades recuperables, la hidrolasa puede ser recuperada de cualquier planta o partes de plantas. Alternativamente, la planta o parte de la planta que contiene el polipéptido recombinante pueden ser usadas como tales para mejorar la cantidad de un alimento o forraje, por ejemplo, mejorar el valor nutricional, la apetibilidad, y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
Interesterificación En un aspecto, los métodos y las composiciones proporcionadas aquí pueden ser usados para modificar las propiedades de una mezcla de triacilglicéridos , y en un aspecto, su consistencia. En un aspecto, una enzima como se proporciona aquí puede ser usada en la presencia de un catalizador tal como sodio metálico o metóxido de sodio para promover la migración de acilo entre las moléculas de glicérido de modo tal que los - productos consistan de mezclas de glicérido en las cuales los residuos de acilo graso se distribuyen de forma aleatoria entre las moléculas de glicérido .
En un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para producir productos de transesterificación bajo las condiciones de reacción en las cuales la hidrólisis de la grasa se minimiza, de modo tal que la Interesterificación catalizada por lipasa se vuelve la reacción dominante. Estas condiciones pueden incluir, por ejemplo, restringir la cantidad de agua en el sistema.
En un aspecto, las enzimas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para catalizar las reacciones de interesterificación usando mezclas de triacilglicéridos y ácidos grasos libres, como se describe, por ejemplo en EP 0 093 602 Bl- En estos casos, el ácido graso libre puede ser intercambiado con los grupos acilo de los triacilglicéridos para producir nuevos triacilglicéridos enriquecidos en el ácido graso agregado. En un aspecto, las lipasas 1,3-específicas como se proporcionan aquí pueden ser usadas para confinar la reacción a las posiciones 1 y 3 de los glicéridos, lo cual permite obtener una mezcla de triacilglicéridos que se pueden obtener mediante la interesterificación química o la reacción con una lipasa no específica. En un aspecto, las lipasas no especiitas se usan para obtener resultados similares a la Interesterificación química.
La habilidad para producir nuevas mezclas de triglicéridos usando lipasas específicas posicionalmente como se proporcionan aquí es útil para la industria de los aceites y grasas puesto que algunas de estas mezclas tienen propiedades valiosas. Un ejemplo, es la Interesterificación catalizada por la lipasa 1 , 3-especí fica de 1 , 3-dipalmitoil-2-monoleína (POP) , la cual es el triglicérido principal de la media reacción del aceite de palma, ya sea con ácido esteárico o tristearina para dar productos enriquecidos en la 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) y 1 , 3-distearoil-2-monoleína (StOSt) valiosas. La POSt y la StOSt sin los componentes importantes de la manteca de cacao. Por lo tanto, un aspecto como se proporciona aquí, proporciona una reacción de interesterificación para producir equivalentes de manteca de cacaote materias primas baratas.
En un aspecto, aquí se proporcionan métodos para la producción de un reemplazo de grasa dura usando las lipasas 1 , 3-especí ficas como se proporcionan aquí. En un aspecto, un reemplazado de grasa dura comprende una mezcla de la fracción media de plasma y StOSt, POSt, o StOSt/POSt de al menos 85% de pureza.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se debe entender que la invención no se limita a tales ejemplos.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Ensayos ejemplifican es de lipasa-saturasa El siguiente ejemplo describe ensayos para investigar la actividad de una hidrolasa, por ejemplo, una lipasa, una saturasa, una palmitasa, y/o una estearatasa. En un aspecto, estos ensayos ejemplificantes pueden ser usados como análisis para determinar si un polipéptido está dentro del ámbito como se proporciona aquí. Tales ensayos pueden incluir el uso de compuestos indicadores de pH para detectar la escisión de los ácidos grasos de los triacilglicéridos, métodos espectrofotométricos, HPLC, GC, MC TLC otros. Jaeger (1994) FEMS Microbiol. Rev. 15:29-63; Ader (1997) Methods Enzymol. 286:35 1-386; Voderwülbecke (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:63 1-639; Renard (1987) Lipids 22: 539- 541.
Investigación por la Actividad de la Lipasa/Estearasa Las colonias se recogen con palillos estériles y se usan para inocular de manera individual cada uno de los pozos de placas de microtitulacion de 96 pozos. Los pozos contenían 250 ]i de medio LB con 100 µg/mL de ampicilina, 80 yg/mL de meticilina, y 10% v/v de glicerol (LB Amp/Meth, glicerol) . Las células se cultivaron a 37°C durante toda la noche con agitación. Cada pozo contiene por lo tanto un cultivo base de células de E. coli, cada uno de los cuales contiene un pBLUESCRIPT™ con un inserto de ADN único.
Las placas de 96 pozos se usaron para inocular por multiplicado una placa única (la "placa condesada") que contenia en cada pozo 200 µL de LB Amp/Meth, glicerol. Este paso se llevó a cabo usando la Herramienta de Replicación de Alta Densidad (HDRT) de BIOMEK™ (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA) con un blanqueo de 1%, agua, isopropanol, un ciclo de esterilización de aire seco entre cada inoculación, cada pozo de la placa condensada contenia 10 a 12 diferentes clones pBLUESCRIPT™ de cada una de las placas de genoteca fuente. La placa condensada se cultivo por 16 horas a 37°C, y después se uso para inocular dos placas microtituladoras hijas de 96 pozos de blanco ( Polyfiltronics , Inc., Rockland MA) conteniendo en cada pozo 250 L de LB Amp/Meth (sin glicerol). La placa condensada original se puso en almacenamiento a -80°C. Las dos placas hijas condensadas se incubaron a 37°C por 18 horas.
La solución base de substrato de estearasa de cadena corta 600 µ? se preparó como sigue: 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos se disolvieron en el volumen apropiado de DMSO para dar una solución 25.2 mM. Los compuestos usados fueron propionato de 4-metilumbeliferilo, butirato de 4-metilumbeliferilo, y heptanoato de 4-metilumbeliferilo . Doscientos cincuenta microlitros de cada solución de DMSO se agregaron a más o menos 9 mL de amortiguador HEPES 50 mM pH 7.5 el cual contiene 0.6% de Tritón X-100 y 0.6 mg por mL de dodecil maltosido (Anatrace, Maumee, OH) . El volumen se llevó a 10.5 mL con el amortiguador HEPES anterior para dar una suspensión ligeramente turbia. ' La solución base de sustrato 600 µ? de cadena larga se preparó como sigue: 25 mg de cada uno de los siguientes compuestos se disolvieron en DMSO a 25.2 mM como anteriormente. Los compuestos usados fueron elaidato de 4-metilumbeliferilo, palmitato de 4-metilumbeliferilo, oleato de 4-metilumbeliferilo, y estearato de 4-metilumbeliferilo . Todos requieren un breve calentamiento en un baño a 70 °C para lograr la disolución. Doscientos cincuenta microlitros de cada solución de DMSO se agregaron al amortiguador de HEPES y se disolvieron en 10.5 mL como anteriormente. Los siete derivados de umbeliferilo se obtuvieron de Sigma Chemical Co . (St Louis, MO) .
Cincuenta L de la ^solución base de sustrato 600 µ?' de la esterasa de cadena larga o la esterasa de cadena corta se agregaron a cada uno de los pozos de una placa condensada en blanco usando el BIOMEK™ para dar una concentración final de sustrato de aproximadamente 100 µ?. Los valores de fluorescencia se registraron (excitación=326 nm, emisión=450 nm) en un fluorómetro de lectura de placas inmediatamente después de la adición del sustrato. La placa se incubó a 70°C por 60 minutos en el caso de los sustratos de cadena larga, y 30 minutos a TA en el caso de los sustratos de cadena corta. Los valores de fluorescencia se registraron otra vez. Los valores iniciales y finales de fluorescencia se compararon para determinar si estaba presente un clon activo.
Para aislar los clones individuales los cuales contienen la actividad, las Placas GenBank de Fuente se descongelaron y los pozos individuales se usaron para inocular de manera individual una nueva placa conteniendo LB Amp/Meth. Como anteriormente, la placa se incubó a 37 °C para cultivar las células, 50 ]i de solución base de sustrato 600 µ? se agregaron usando BIOMEK™ y se determinó la fluorescencia. Una vez que se identifico el pozo activo de la placa fuente, las células de este pozo activo se cultivaron en estrias sobre agar con LB/Amp/Meth y se cultivaron durante toda la noche a 37°C, para obtener colonias individuales. Se seleccionaron ocho colonias con un palillo estéril y se usaron para inocular individualmente los pozos de una place de microtitulación de 96 pozos. Los pozos contenían 250 µL de LB Amp/Meth. Las células se cultivaron durante toda la noche a 37°C sin agitación. Se extrajo una alícuota de 200 ]i de cada pozo y se analizó con los sustratos de cadena larga o corta apropiados como arriba. El clon más activo se identifico y los restantes 50 µL de cultivo se usaron para cultivar en estrías una placa de agar con LB/Amp/Meth. Se, seleccionaron ocho colonias individuales y se analizaron como anteriormente. El clon más activo se uso para inocular cultivos de 3 mL de LB/Amp/Meth, los cuales se cultivaron durante toda la noche. El ADN de plásmido se aisló de los cultivos y se utilizaron para el secuenciamiento .
Ejemplo 2 : Protocolos E emplificantes para la Determinación por LCMS del Perfil de Ácidos Grasos Liberados que Resulta de la Hidrólisis Enzimática de Aceite Vegetal El siguiente ejemplo describe los métodos (protocolos) ejemplificantes para conducir la hidrólisis enzimática de aceite vegetal, tal como aceite de soya (usada en este ejemplo) , (incluyendo la preparación de a enzima) usando, por ejemplo, las enzimas como se proporcionan aqui . Este ejemplo también describe métodos (protocolos) ejemplificantes para detectar y cuantificar los ácidos grasos liberados del aceite. El método se describe usando la lipasa SEQ ID NO: 2, pero se puede aplicar a otras enzimas, incluyendo las enzimas como se proporcionan aqui, por ejemplo, las enzimas ejemplificantes que tienen una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2 y que tiene una, dos , tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, o doce o más o y todas las modificaciones de residuos de aminoácidos descritas en la Tabla 3, la Tabla 4, la Tabla 9, la Tabla 10, la Tabla 11, la Tabla 16 o la Tabla 23.
Expresión de Proteínas en la Placa de 96 Pozos Profundos: 1. Cultivar los clones de lipasa de E. coli durante toda la noche a 30°C en 1 mL de medio TB que contiene carbenicilina (100 g/mL) en placas de 96 pozos profundos, con. Registrar la ubicación y la identidad de los clones. 2. Inocular placas de 96 pozos profundos que contienen medio TB (1 mL; 100 pg/mL) de carbenicilina) con los líquidos de cultivo (100 L/pozo) . 3. Incubar el cultivo durante toda la noche a 30°C mientras que se agita a 200 rpm. 4. Inducir la expresión de la proteína mediante la transferencia de 500 µ?. de cada uno de los cultivos durante toda la noche a una placa de 96 pozos fresca que contiene el medio TB (500 yL/pozo; 100 g/mL de carbenicilina) y tetraciclina anhidra (200 ng/mL) . 5. Incubar a 30°C por 2 horas con agitación a 200 rpm. 6. Cosechar las células por centrifugación de cada placa por 10 minutos a 3000 x g. Extraer el sobrenadante. Las pelotillas de células pueden ser usadas inmediatamente para los ensayos de aceite o se almacenan a -20°C para su uso posterior.
Reacción de hidrólisis Enzimática del Aceite: 1. Agregar 100 µL de B-PER™ (Pierce Chemical, Rockford, IL) a cada pelotilla de células. Si las pelotillas se almacenan a -20°C, permitir la descongelación por 10 min a la * TM temperatura ambiente antes de la adición de B-PER . 2. Agregar 400 µ?, de aceite de soya a cada pozo de la placa de 96 pozos profundos. 3. Agregar varias perlas . (vidrio 710-1180 µp?) por pozo. Sellar las placas con CAPMATS™ (Whatman, Florham Park, NJ) . 4. Las células se someten a lisis y la emulsión de aceite/enzima/amortiguador se genera usando un molino Mixer Mili y agitación por 30 segundos a una frecuencia de 30 ciclos/segundo . 5. Reemplazar los sellos CAPMATS™ con un sello permeable a gases. 6. Incubar las placas por 2 horas a 37°C mientras que se agita a 200 rpm.
Extracción de Ácidos Grasos 1. Agregar 1 mL del solvente de extracción (CHCl3:MeOH:HCl 4N (2:1:0.075)) a cada pozo de la placa de 96 pozos profundos. 2. Succionar y dejar caer, la mezcla varias veces con una pipeta hasta que esta parezca homogénea. 3. Cubrir las placas con un sello de papel aluminio. 4. Centrifugar por 5 minutos a 3000 x g. Cortar los sellos usando una navaja de rasurar. 5. Insertar la punta de la pipeta a través de la fase superior y transferir 5 µL de la fase inferior a una nueva placa de 96 pozo profundos conteniendo 995 L/pozo de MeOH (es decir, dilución 1/200 de la fase inferior) . Se debe ser cuidadoso para no contaminar con la fase superior. Almacenar a 4°C las mezclas de extracción separadas. 6. Transferir 150 L de la dilución 1/200 de todas las muestras a un placa de 96 pozos de poliestireno . 7. Para evitar la evaporación, sellar por calor las placas. Se debe asegurar que los sellos no entren en contacto con el MeOH ya que esto evitaría la adhesión apropiada. 8. Analizar las muestras por LC/MS.
Análisis de LC/MS 1. Las muestras enviadas en formato de placa de 96 pozos se inyectan por medio de un muestreador automático HTCPAL™ (LEAP Technologies, Carrboro, NC) en una mezcla isocrática de H20/MeCN (10/90, v/v) y 0.1% de ácido fórmica, suministrado por bombas LC-10ADVP™ (Shimadzu, Tokio, Japón) a 1.2 mL/min. 2. La separación se logra con una columna SYNERGI MAX-RP™ (Phenomenex, Sutter Creek CA) 150 x 2.00 mm, y detección. La cuantificación se completa con un espectrómetro de masas triple-quad (Applied Biosystems, Foster, CA) usando ionización por electro-rociado (ESI) y monitoreo de iones mucho calor par alas masas 277, 279,281, 255, 283 en el modo de iones negativos . 3. El control de la instrumentación y la generación de datos se logra con el programa ANALYST 1.3™ (Applied Biosystems, Foster, CA) . 4. La LC/MS se calibra para cada acético graso en el rango de 0 0.5 a 50 yg usando muestras estándar (Sigma) . Este rango se ajusta a una curva estándar de regresión cuadrática la cual se usa para calcular la cantidad de cada acético graso liberado en las muestras de enzima.
Ejemplo 3: Protocolos Ejemplificantes para la Selección HTP de Genotecas de Evolución de Lipasa por Selectividad aumentada por Hidrólisis de Palmitato o Estearato Esteres versus Oleato Esteres El siguiente ejemplo describe los métodos (protocolos) ejemplificantes para la selección de genotecas de "evolución de lipasa" de alta eficiencia por la selectividad aumentada por hidrólisis de palmitato o estearato ésteres versus oleato ésteres. Este método ejemplificante (protocolo/selección HTP) describe la- selección de genotecas de evolución de lipasa derivadas de la SEQ ID NO: 2, pero se puede aplicar a otras enzimas, incluyendo las enzimas como se proporcionan aquí, por ejemplo, las enzimas ejemplificantes que tiene una secuencia como se establece en las SEQ ID NO:2 y que tienen una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más o todas las modificaciones de residuos de aminoácidos descritos en la Tabla 3 o la Tabla 4; y este método (protocolo) ejemplificante se puede aplicar a todo los tipos de genotecas.
Estas selecciones HTP ejemplificantes se conducen utilizando dos sustratos fluorogénicos : Palmitato o estearato metilumbeliferil ésteres versus oleato metilumbeliferil éster.
Flujo de Selección HTP: 1. Los clones de la genoteca se disponen en placas de microtitulación y se analizan en una selección HTP primaria.
Los clones identificados por tener selectividad mejorada se designan como éxitos primarios. 3. Los éxitos primarios se vuelven a analizar en placas de microtitulación, y se analizan en una selección HTP secundaria. 4. Los clones confirmados por tener selectividad mejorada se designan como éxitos secundarios. 5. Los éxitos secundarios se someten a secuenciamiento para identificar las mutaciones de la secuencia presentes y se analizan en aceite (véase el protocolo separado) .
Protocolo del Ensayo HTP 1. Placas de ensayo de 384 pozos negras, etiquetadas con código de barras; placas de cultivo de 384 pozos etiquetadas con código de barras y llenadas con 30 yL/pozo de medio LB (100 g/mL carbenicilina) . 2. Los clones Pintol o cherry-pick se colocan en placas de cultivo y se cultivan durante toda la noche a 30°C en un incubador humidificado . 3. Inducir la expresión de lipasa mediante la adición de 30 µ1?/????> de medio LB (100 yg/mL de carbenicilina) conteniendo 4 pg/mL de tetraciclina anhidra de incubar 2 horas a 30°C. 4. Someter a lisis las células agregando 20 L/pozo de B-PERT™ (Pierce Chemical, Rockford, IL) ; mantener a la temperatura ambiente hasta que se coloquen en robot. 5 Correr el ensayo de actividad de lipasa (véase a continuación) . 6. Los clones identificados por tener actividad aumentada por el palmitato o estearato MeUMB éster se designan como éxitos. 7. Los clones Cherry-pick se colocan en placas de 96 pozos conteniendo medio LB (1 mL/pozo; 100 pg/mL de carbenicilina) y cultivan durante toda la noche a 30°C. 8. Para los éxitos primarios, volver a disponerlos en placas de 384 pozos y repetir los pasos 1-8 en la selección secundaria; designan los clones éxito como éxitos secundarios. 9. Para los éxitos secundarios, después del paso 8 enviarlos a secuenciamiento .
Protocolo Ejemplificante de Selección HTP Automatizada 1. Apricot: Mezclar y transferir una alícuota (10 \i ) de células aisladas de la "placa de cultivo" (véanse los Pasos 1-4 de arriba) a cada una de dos placas de ensayo separadas (1 y 2) . 2. MULTIDROP™ (Thermo Electron Corporation, Milford, MA) : Agregar 70 \xL del sustrato 1 (UMB-16:0) a la placa de ensayo 1; agregar 70 de sustrato 2 (UMB-18 : 1 ) a la placa de ensayo 2. 3. incubar las placas de ensayo por 20 minutos a 37°C. 4. Leer en el fluorómetro: Excitación 360 nm y Emisión 465 nm.
Los clones éxitos secundarios los cuales se determinó que tenían secuencias únicas se disponen y se cultivan en placas de 96 pozos y se analizan en aceite de soya (véase a continuación) .
Estructuras de los Sustratos Fluorogénicos usados en la Selección HTP estearato de 4-metilumbeliferilo palmitato de 4-metilumbeliferilo oleato de 4-metilumbeliferilo Ejemplo 4: Evolución Ejemplificante para la Hidrólisis Mejorada del Palmitato o Estearato Esteres Usando la Tecnología GSSM3* El siguiente ejemplo describe y resume los resultados de los protocolos ejemplificantes de "evolución enzimática" y selección que identifican las enzimas ejemplificantes como se proporcionan aquí, por ejemplo, las enzimas que tienen una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también tienen una modificación de residuos como se establece en la Tabla 3 o la Tabla 4; o las enzimas codificadas por un ácido nucleico que tiene una secuencia como se establece en la SEQ ID N0:1 pero que también tienen una modificación de residuos como se establece en la Tabla 3 o la Tabla 4. En un aspecto, un ensayo de selección e emplificante para identificar estas enzimas ejemplificantes como se proporcionan aquí usando aceite de soya como un sustrato, y los ácidos grasos liberados (hidrolizados) del aceite de soya, se caracterizaron, por ejemplo, como ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico o ácido esteárico.
El aceite de soya tiene la siguiente distribución de ácidos grasos: Linolénico=8% ; Linoleico=53% ; Oleico=23%; Palmitito=12%; Esteárico=4 % . Por lo tanto, si el porcentaje de ácido palmitico liberado (hidrolizado) del aceite de soya por una enzima ejemplificante como se proporciona aquí, es mayor a 12%, entonces esa enzima tiene una preferencia para hidrolizar (liberar) el ácido palmitico.
Selección de Palmitasa: preparación de una "Genoteca de Palmi asa" Una genoteca de palmitasa de las variante de la SEQ ID NO: 2 se preparó mediante la tecnología GSS SM (número de patente 6,171,820). Se introdujeron mutaciones puntuales usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, de modo tal que cada codon se sustituye con cada uno de los 20 aminoácidos de formación natural. Las variantes mutadas se transformaron en Escherichia coli hospederas TOP10 (Invitrogen, EUA) para la expresión y la selección. La genoteca se construyó en un vector de expresión pASK-5, el cual se modificó del vector PASK-IBA (IBA GMBH, Alemania) . Para construir el vector pASK-5, el enlazador de clonación original se reemplazó con nuevos sitios de clonación, específicamente, la secuencia de Xbal a HindIII de pASK-IBA se reemplazó con la siguiente secuencia: RBS ArgSerHisHisHisHisHisHis TCTAGATAACGAGGGCAAAACCATGGGAGGATCCAGATCTCATCACCATCACCATCACTAAGCTT (SEC ID NO: 21) Xbal Ncol BamHI BglII HindIII La expresión de las variantes GSSMSM se indujo con anhidrotetraciclina después que se alcanzaron las densidades óptimas de las bacterias hospederas.
Las enzimas que tienen las secuencias de aminoácidos generadas por la tecnología GSSMSM se identificaron mediante el protocolo de identificación de alto rendimiento (HTP) , por ejemplo, el protocolo descrito en el Ejemplo 3, que determina qué ácido graso se hidroliza preferiblemente de una grasa-aceite de soya en este ensayo. El objetivo del proyecto de evolución fue mejorar la selectividad del palmitato de la secuencia original, SEQ ID NO:, en el aceite. El ensayo comprende poner en contacto la nueva/enzima con secuencia modificada con el aceite de soya, la cual comprende varios ácidos grasos, incluyendo, ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico, y ácido esteárico (véase la distribución del %, listada anteriormente) y medir la cantidad de cada ácido graso hidrolizado por cada enzima modificada. Se identificó una "genoteca" de las secuencias que permiten que una enzima hidrolice preferiblemente un ácido palmitico (o un ácido esteárico, véase a continuación) , del aceite de soya (la asi llamada "Genoteca de Palmitato") : • Las identificaciones primaria y secundaria se llevaron a cabo usando una identificación HTP, por ejemplo, el método descrito en el Ejemplo 3; • El secuenciamiento de los éxitos secundarios identifica las mutaciones que resultan en la selectividad mejorada para la hidrólisis del palmitato versus la del oleato en la selección HTP en comparación con, por ejemplo, la secuencia original, SEQ ID NO: 2.
• Para cada variante del codon que codifica una mutación de aminoácidos, un clon cherry-picked se dispone en placas de 96 pozos para analizar un aceite; • De los ensayos se obtuvo la selectividad de las enzimas mutadas para el palmitato o el estearato u otros ácidos grasos (Tabla 3) · El palmitato producido con más alto acierto como 59% de los ácidos grasos liberados (FAs) versus (vs) 43% de la SEQ ID NO: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un aumento en el factor de selectividad de 3.6 a 4.9; • Varios clones también mostraron aumentos en la selectividad el estearato.
La tabla 1, a continuación, resume las mutaciones GSSMSM (véase arriba) seleccionadas para la inclusión en la "genoteca de palmitato" para ser combinadas por la tecnología GeneReassemblySM (véase el Ejemplo 5) . En un ensayo ejemplificante, catorce (14) mutaciones individuales de aminoácidos se identificaron por dar los mayores aumentos en la hidrólisis del palmitato en los ensayos en aceite (véase también las Tablas 1, 3, y 4, a continuación) . Los residuos se etiquetan de acuerdo con el orden en que estos aparecen en la SEQ ID NO: 2 original (véase la Figura 7), entre los residuos que proporcionan aumentos significativos en la hidrólisis del palmitato o el estearato en los ensayos en aceite. Se proporcionan la "AA original" en la SEQ ID NO: 2 y las mutaciones benéficas ("Nuevos Aminoácidos") , es decir, las secuencias ejemplificantes como se proporcionan aquí. En un aspecto, las mutaciones individuales para la arginina (R) en las posiciones de los residuos 163 y 164 pueden ser incluidas alternativamente de modo tal que esta genoteca ejemplificante incluirá clones con las secuencias 163V-164D (SEC ID N0:2), 163R-164D, y 163V-164R, pero no la secuencia 163R-164R.
Tabla 1 La Figura 6a ilustra los efectos de las mutaciones GSSM ejemplificantes de palmitasa sobre la hidrólisis del palmitato y el estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 original. Para cada una de las catorce (14) mutaciones individuales seleccionadas para la inclusión en la genoteca GeneReassemblySM de palmitasa se gráfica el cambio porcentual en el palmitato y el estearato liberados, con relación a la SEQ ID NO: 2 original. Muchas de estas mutaciones dieron aumentos significativos en la hidrólisis del palmitato, acompañada por aumentos pequeños a significativos en la hidrólisis del estearato. Sin embargo, varias mutaciones provocan aumentos ligeros en la hidrólisis del estearato. Los asteriscos denotan las mutaciones identificadas por transportar selectividad de tipo saturasa aumentada.
Identificación de Estearato: preparación de una "Genoteca de Estearato (Estearatasa) " Una genoteca de estearatasa de las variantes de las SEQ ID NO: 2 se construyó mediante la tecnología GSSMSM (número de patente 6,171,820). Se introdujeron mutaciones puntuales usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, de modo tal que cada codon original podría ser sustituido con cada uno de los 20 aminoácidos de formación natural. Las variantes mutadas se transformaron en las bacterias hospederas Escherichia coli TOP 10 (Invitrogen, EUA) para la expresión y la selección. La genoteca se construyó en el vector de expresión pASK-5 (como se describe arriba) . La expresión de las variantes GSSMSM se indujo con anhidrotetraciclina después que se alcanzaron las densidades óptimas de las células hospederas Las enzimas que tienen las secuencias de aminoácidos generadas por la tecnología GSSMSM se identificaron mediante el protocolo de identificación de alto rendimiento (HTP) , por ejemplo, el protocolo descrito en el Ejemplo 3, que determina qué ácido graso se hidroliza preferiblemente de una grasa-aceite de soya en este ensayo. El ensayo comprende poner en contacto la nueva/enzima con secuencia modificada con el aceite de soya, la cual comprende varios ácidos grasos, incluyendo, ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico, y ácido esteárico (véase la distribución del %, listada anteriormente) y medir la cantidad de cada ácido graso hidrolizado por cada enzima modificada. Se identificó una "genoteca" de las secuencias que permiten que una enzima hidrolice preferiblemente un ácido esteárico (o un ácido palmitico, véase arriba) , del aceite de soya (la asi llamada "Genoteca de Estearato") : • Las identificaciones primaria y secundaria se llevaron a cabo usando una identificación HTP, por ejemplo, el método descrito en el Ejemplo 3/ • El secuenciamiento de los éxitos secundarios identifica las mutaciones que resultan en la selectividad mejorada para la hidrólisis del estearato versus la del oleato en la selección HTP en comparación con, por ejemplo, la secuencia original, SEQ ID NO: 2.
• Para cada variante del codon que codifica una mutación de aminoácidos, un clon cherry-picked se dispone en placas de 96 pozos para el ensayo sobre el aceite; · Los ensayos en aceite de los éxitos secundarios secuenciados dieron la selectividad de las enzimas imitantes para el palmitato el estearato y otros ácidos grasos (Tabla 3) .
• El estearato producido con más alto acierto como 22% de los FAs liberados versus 9% de la SEQ ID NO: 2 en el mismo ensayo; esto corresponde a un aumento en el factor de selectividad de 2.3 a 5.5; • Varios clones también mostraron aumentos en la selectividad del palmitato.
La Tabla 2 siguiente, resume las mutaciones GSSMSM (véase arriba) seleccionadas para la inclusión en la "genoteca de estearatasa" para ser combinadas mediante la tecnología GeneReassemblySM. En un Ensayo ejemplificante se identificaron veintidós (22) mutaciones de aminoácidos individuales por dar los aumentos más grandes en la hidrólisis de estearato en ensayos de aceite (véanse también las Tablas 2, 3, y 4, a continuación) . Los residuos se etiquetan de acuerdo con el orden en que estos aparecen en la SEQ ID NO: 2 original, entre los residuos que dan aumentos significativos en la hidrólisis de palmitato o estearato en ensayos de aceite. Se proporciona el "Aminoácido Original" en la SEQ ID NO: 2 y las mutaciones benéficas ("Nuevos Aminoácidos"), es decir, las secuencias ejemplificantes como se proporcionan aquí. En un aspecto, la mutación individual para la alanina (A) en la posición del residuo 23 se incluye como una mutación fija de modo tal que cada clon en esta genoteca ejemplificante contiene esta mutación .
Tabla 2 La Figura 6b (véase también arriba) ilustra los efectos de doce (12) de los veintidós (22) mutaciones principales GSSMSM de estearatasa sobre la hidrólisis del palmitato y el estearato con relación a la SEQ ID NO: 2 original. Para cada una de las doce (12) mutaciones de aminoácidos dadas en la Figura 6b y seleccionadas para la inclusión en la genoteca de estearatasa de GeneReassemblySM se gráfica el cambio porcentual en el palmitato y el estearato liberados, con relación a la SEQ ID NO: 2. La mayoría de estas mutaciones proporciona aumentos significativos en la hidrólisis de estearato, pero reducciones ligeras a significativas en la hidrólisis del palmitato. Los asteriscos denotan las mutaciones identificadas por acarrear selectividad tipo saturasa aumentada, es decir, aumentos en la selectividad por la hidrólisis del palmitato y el estearato versus la hidrólisis de los ácidos grasos saturados en el aceite, por ejemplo, oleato, linoleato y linoleato .
· Resumen • La selección de la "genoteca GSSMSM" (véase arriba donde se describe en detalle la tecnología GSSMSM) con base en al SEQ ID NO: 2 original proporciona mutantes de aminoácidos con aumentos significativos en la selectividad del palmitato y el estearato, y en la selectividad del saturado, es decir, la selectividad para la hidrólisis del palmitato y el estearato (por ejemplo, la hidrólisis selectiva del palmitato y/o el estearato del aceite de soya) ; • Se encontraron clones con aumentos significativos en la selectividad del estearato (hidrólisis selectiva del ácido esteárico sobre otros ácidos grasos) ; • Se descubrieron mutantes GSSMSM con selectividad aumentada por el palmitato (hidrólisis selectiva de ácido palmítico sobre otros ácidos grasos) con relación a la enzima de la SEQ ID NO: 2 original.
La Tabla 3 y la Tabla 4, a continuación, describen (y además resumen) las secuencias de las enzimas hidrolasas ejemplificantes como se proporcionan aquí, por ejemplo, las enzimas e emplificantes que tienen una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 2 y que tienen al menos uno (uno, varios o todos) los cambios de los residuos de aminoácidos descritos en las tablas. La Tabla 3 y la Tabla 4 también resumen los datos de actividad para las enzimas ejemplificantes seleccionadas, los datos que incluyen la correspondencia de las enzimas ejemplificantes particulares con sui actividad de hidrolasa positiva que comprende la catálisis de la hidrólisis de (liberación de) un ácido graso de palmitato de estearato de aceite de · soya, como se identifica por un protocolo de selección de alto rendimiento (HTP) , como se describe aquí.
En la Tabla 3 y la Tabla 4, el término "Aminoácido Original" indica el residuo de aminoácido objetivo (indicado bajo "Resido de Aminoácido" en la SEQ ID NO: 2 de la enzima "original" ("que se busca como objetivo" para el cambio"; y los términos "Nuevos Aminoácidos" indica los residuos de aminoácidos recién diseñados (los cuales reemplazan el residuo "objetivo" correspondiente en la "secuencia anterior") en la (nueva) enzima ejemplificante como se proporciona aquí, el litado del "Nuevo Residuo de Aminoácido" bajo la columna de "estearato" versus "palmitato" indica cual de las dos selecciones de ácido graso de alto rendimiento (HTP) (es decir, liberación de ácido palmitico en una selección y liberación de ácido esteárico en la otra selección, véase el Ejemplo 3) se uso para detectar (identificar) una enzima particular con la variación del residuo indicado (nueva secuencia de la enzima, "nuevo Residuo de Aminoácido").
Por ejemplo, en la primera linea de la Tabla 3, en el residuo de aminoácido 7, el residuo de aminoácido tirosina (o "Y") de la enzima original SEQ ID NO : 2 se reemplaza por una residuo de aminoácido arginina (o "R") y esta nueva enzima (Y7R) tiene actividad que difiere de la de la enzima original (véase la Tabla 3) ; por ejemplo, los "Datos del Aceite" resumen la preferencia del sustrato (ácido graso) de la nueva enzima (por ejemplo, la enzima Y7R) listando los ácidos grasos liberados (hidrolizados ) generados cuando la enzima se expone a (se pone en contacto con) aceite de soya (los ensayos descritos anteriormente) , notando que el aceite de soya de sustrato tiene varios posibles grupos constituyentes que son ácidos grasos hidrolizables, incluyendo ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico, ácido esteárico .
Por ejemplo, en la primera linea, para la enzima Y7R, 8.3% de los ácidos grasos liberados (del aceite de soya que de hace reaccionar) fueron ácido linolénico, 22.1% de los ácidos grasos liberados fueron ácido linoleico; 19.7% de los ácidos grasos liberados fueron ácido oleico; 41.5% de los ácidos grasos liberados fueron ácido palmítico; 8.4% de los ácidos grasos liberados fueron ácido esteárico (estos cuatro números suman el 100% ) .
La columna P + S suma tanto los puntos de datos P y S para resumir cuantos de los ácidos grasos liberados eran ácido palmitico y ácido esteárico (41.5% más 8.4% = 49.9% de los ácidos grasos hidrolizados fueron ácido palmitico y ácido esteárico, o "P+S") .
Tabla 3 Éxitos de Selección HT Residuo Nuevo Nuevo de Aminoácido Aminoácido Residuo de Am¡noácido del del Aminoácido original Palmitato Estearato P+S V 55.7% T 33.60% 54 S H 55.6% 61 D A 60.5% E 55.0% S 49.8% 62 V E E 53.0% A 56.6% G 56.5% M 51.9% N 49.7% Q 52.4% s 55.5% T 50.7% D 52.5% L W 50.2% 66 A N 54.2% R 52.1% 72 R E 58.3% K 61.0% P 27.2% s 55.3% T 55.9% Y 50.1% 74 F I 53.8% L 54.8% P 52.3% R 50.5% Éxitos d< : Selección H G? Residuo Nuevo Nuevo Residuo (je Aminoácido Aminoácido, de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato Estearato P+S 77 G P 38.1% 78 I D 47.1% E 37.1% P 40.9% 80 G P 51.9% 82 L P 37.3% 83 V c 47.7% M 59.3% 84 D V 40.2% 87 V A 49.2% C 46.1% D 43.9% E 46.6% G P 53.3% S 45.2% T 42.8% H 52.9% N 50.3% 88 D E 44.6% F 50.3% H 45.9% L 49.1% P 59.6% P 48.9% Q 47.1% 89 R S 54.5% 92 A D 47.3% E 59.3% Éxitos de Selección ?? P Residuo Nuevo Nuevo Residuo de Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato Estearato P+S R 42.6% S 48.7% T 52.1% V 57.5% 93 V M 48.2% 96 A C c 51.4% I I escala s s 46 /o 98 G A 45.0% L escala 101 K A 49.8% 103 I L 36.8% 107 W P 46.20% A 39.5% C 39.4% G 47.5% H 42.0% R 68.0% S 36.8% L 64.8% P. E217Q 46.2% V 37.8% V, E217Q 44.80% 108 S paro 19.0% A 43.0% C 26.0% G 47.5% 57.8% L 44.0% Éxitos de Selección H G? Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato Estearato P+S P 56.9% Q 58.6% R 54.7% V 53.4% T, A218T E. E217Q 46.50% 109 L M 49.0% 1 10 G L 54.4% 1 13 Y E 35.8% G 39.8% F 36.5% 1 16 E A 66.6% F 54.7% G 53.8% H 57.9% L 58.5% L 55.1% P 58.0% Q 59.6% Q 60.5% R, H140R 60.6% R 61.8% S 58.6% S 59.7% T 67.6% V 67.8% R, H140R 1 17 L R. I161L 54.1% R 51.6% Éxitos de í selección HT P Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Pal mi tato Estearato P+S 120 I 46.7% L L 60.8% F 52.6% 49.9% S S 53.3% 132 G D, S212A 56.2% 133 S A 53.2% A 55.8% G 45.6% P 56.0% R 51.7% T 54.9% V, L139,H 53.2% 134 P G 7.2% R 135 F K 51.8% 139 L H, S 133V 53.2% 140 H K 45.5% R. E1 16R 141 A R 40.2% T 43.3% 142 N M 46.1% R 53.8% S 43.2% T 64.3% 144 A T. N 142K 33.9% 146 S 50.2% G 49.4% L 51.6% Éxitos de Selección Hl P Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato P+S Estearato A 52.2% 147 I F 56.5% F 50.5% L 52.2% 150 A L 59.7% L 53.3% 151 I A 48.6% G 53.0% H 60.0% P 33.7% S 52.2% T 49.2% 152 N E 28.0% G 53.0% H 46.7% M 35.7% R 21.1% 155 T c 51.1% 157 D s 50.4% G 48.7% T 54.7% 158 N A 51.2% 159 L M 51.5% 160 P T 52.8% 161 I L. L1 17R 54.1% L 51.6% 162 P K escala R escala 163 V E 55.7% Éxitos de Selección H' P Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato P+S Estearato R 63.9% T 49.7% 164 D A 42.1% E escala H 39.8% 49.4% L escala R 61.3% S 47.9% T 53.0% V 42.3% w escala 166 Q G 49.9% N 41.3% R escala 167 I R R 53.3% S S 47.3% 170 P Q 45.6% A 52.5% A, S212H 34.7% 171 V 34.1% 172 R P 51 .7% Q 54.9% s 40.2% 178 S K 50.6% 180 L E 54.0% H 44.6% Q escala F, G32D 44.6% Éxitos de Selección ?? P Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato Estearato P+S 183 V I escala 193 P 49.4% 194 E A escala 47.9% Q escala D. P193S 49.4% 197 D K 39.4% 198 E stop 56.1% 200 L V 55.3% 204 V L 45.9% R 45.7% 210 A V 50.2% 21 1 A E 35.3% H 48.1% K 39.4% L 45.0% Q 50.3% F 32.6% N 46.1% P 49.2% R 55.2% W 47.8% Y 48.9% T 50.8% S 52.7% S 52.7% I I 49.8% T, E217A 46.2% 212 S C 49.3% Éxitos de Selección ?? P Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del Aminoácido Original Palmitato Estearato P+S R 50.3% A. G132D 53.2% A 36.8% E 36.6% G 44.3% H 46.5% L 53.2% P 12.2% Q 41.8% R 50.2% T 53.7% V 38.7% W 48.4% Y 47.1 % H. P170A 34.7% 213 I 47.9% G 57.7% T 56.7% T 55.5% stop 214 T C 51.6% G 53.0% V V 52.2% V 54.5% P 51.9% N 56.9% R 55.1% Y 62.7% Y 62.7% Éxitos de Selección H G? Nuevo Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del r+s Aminoácido Original Palmitato Estearato 215 G A A 56.6% I 54.1% L 29.9% H 50.2% S 52.1% M 47.9% V 55.6% P 47.3% c 60.4% w 52.8% stop 53.9% V, T22M 52.1% 216 A T T 50.9% R 41 .9% Y 34.8% V V 56.9% c 59.7% s S 55.0% L 55.6% 217 E Q 36.6% R 59.4% S 53.5% A 46.2% G 44.8% P 46.2% 218 A M 42.5% H H 49.1% Q Q 47.7% R 53.4% Éxitos de Selección HTP Nuevo : Nuevo Residuo Aminoácido Aminoácido de Aminoácido del del P+S Aminoácido Original Palmitato Estearato w 51.9% s 51.1% T 50.0% K 52.4% R, G8E R, 228 223 V A 48.8% M 31.6% R 23.4% T escala 224 A F 49.5% G 58.2% G 48.4% I 41.7% Q 46.4% Y 43.7% 225 A G 49.3% L 54.3% M 49.0% Q 45.8% T 43.2% 226 R H 48.3% T 41.2% 227 L R 41.4% Tabla 3 (Continuación) Ácidos Grasos Liberados del Aceite Por la Enzima Residuo de Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico P+S 7 8.3% 22.1% 19.7% 41.5% 8.4% 49.9% 8 12 11.5% 13.0% 27.7% 38.5% 9.3% 47.8% 5.2% 22.1 % 18.5% 47.2% 7.1 % 54.2% 14.7% 13.9% 26.0% 34.4% 1 1.0% 45.4% 10.3% 12.8% 33.6% 34.0% 9.4% 43.3% 16 7.2% 25.1% 24.6% 36.1% 7.1% 43.2% 18 12.5% 20.0% 25.7% 36.2% 5.6% 41.8% 20 . 8.2% 21.2% 20.3% 38.5% 11.7% 50.3% 12.2% 23.2% 20.0% 40.1% 4.5% 44.6% 22 8.0% 19.5% 20.4% 47.1% 5.0% 52.1 % 27 7.5% 17.6% 17.6% 47.4% 9.8% 57.2% 9.1% 23.2% 24.0% 35.8% 7.8% 43.6% 29 9.0% 19.9% 19.6% 40.9% 10.7% 51.5% 32 19.8% 29.1% 34.0% escala 17.1% escala 14.6% 12.1% 28.7% 36.6% 7.9% 44.6% 34 5.6% 31.0% 17.5% 40.9% 4.9% 45.8% 21.1% 35.3% 37.1% escala 6.5% escala 36 7.1 % 22.1% 19.9% 43.8% 7.1 % 51.0% 8.7% 22.9% 17.6% 48.2% 2.7% 50.9% 40 0.0% 51.4% 16.4% 22.4% 9.7% 32.2% 42 14.8% 12.1% 25.8% 34.6% 12.6% 47.2% 7.7% 13.9% 30.7% 34.8% 13.0% 47.8% 43 8.9% 19.9% 19.7% 44.4% 7.1% 51.5% 45 10.3% 23.8% 21.5% 38.5% 5.9% 44.4% 5.9% 22.3% 19.1% 49.7% 3.0% 52.7% 48 15.0% 18.0% 21.7% 38.1% 7.2% 45.4% . 4.3% 11.5% 14.2% 61.0% 9.1% 70.1% 7.6% 17.3% 19.4% 43.8% 12.0% 55.7% 23.6% 13.4% 29.3% 22.5% 1 1.1% 33.60% 54 8.1% 19.3% 17.0% 48.4% 7.3% 55.6% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 61 5.6% 19.8% 14.1% 53.9% 6.6% 60.5% 6.4% 20.1% 18.5% 47.3% 7.7% 55.0% 7.7% 19.9% 22.6% 41.5% 8.3% 49.8% 62 7.6% 18.8% 20.7% 44.6% 8.3% 53.0% 9.2% 17.6% 16.6% 45.6% 11.0% 56.6% 6.7% 20.3% 16.5% 47.6% 8.8% 56.5% 7.7% 20.9% 19.5% 44.9% 6.9% 51.9% 7.9% 21.7% 20.7% 40.7% 9.0% 49.7% 8.5% 20.8% 18.4% 42.6% 9.8% 52.4% 5.4% 26.0% 13.1% 37.0% 18.5% 55.5% 10.0% 21.9% 17.5% 40.2% 10.5% 50.7% 6.1% 23.2% 18.2% 47.1% 5.4% 52.5% 9.9% 21.3% 18.6% 46.7% 3.6% 50.2% 66 7.5% 16.8% 21.5% 48.0% 6.2% 54.2% 1 1.4% 18.0% 18.5% 47.2% 4.8% 52.1% 72 7.9% 16.5% 17.3% 54.2% 4.1% 58.3% 4.4% 20.7% 13.9% 52.2% 8.7% 61.0% 6.8% 44.6% 21.4% 20.2% 7.0% 27.2% 8.6% 17.3% 18.8% 45.7% 9.6% 55.3% 7.5% 17.4% 19.3% 45.1% 10.7% 55.9% 6.7% 23.1% 20.1% 40.2% 9.9% 50.1% 74 7.4% 19.6% 19.3% 45.4% 8.4% 53.8% 8.0% 19.3% 18.0% 44.8% 10.0% 54.8% 8.7% 20.5% 18.6% 42.2% 10.1% 52.3% 7.1% 21.7% 20.7% 41.1% 9.4% 50.5% 77 10.3% 41.0% 10.6% 17.8% 20.4% 38.1% 78 9.8% 22.5% 20.6% 43.8% 3.4% 47.1% 26.2% 23.0% 13.8% 15.4% 21.7% 37.1% Acidos Crasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de .
P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 14.4% 13.2% 31.4% 32.3% 8.6% 40.9% 80 7.4% 21.0% 19.7% 42.9% 9.0% 51.9% 82 13.0% 28.3% 21.4% 33.3% 4.0% 37.3% 83 7.5% 20.0% 24.7% 31.1% 16.6% 47.7% 6.8% 18.6% 15.3% 51.5% 7.8% 59.3% 84 0.0% 32.4% 27.4% 21.0% 19.2% 40.2% 87 12.7% 1 1.9% 26.2% 39.7% 9.5% 49.2% 14.5% 1 1.8% 27.6% 33.1% 13.0% 46.1 % 9.3% 12.3% 34.5% 32.7% 1 1.2% 43.9% 12.2% 10.5% 30.8% 33.6% 13.0% 46.6% 10.6% 9.9% 26.2% 40.6% 12.7% 53.3% 14.4% 12.4% 27.9% 36.0% 9.2% 45.2% 6.7% 25.8% 24.7% 39.5% 3.3% 42.8% 4.4% 23.2% 19.4% 48.5% 4.5% 52.9% 1 1.7% 1 1.3% 26.7% 31.5% 18.8% 50.3% 88 14.1% 13.4% 27.9% 34.7% 9.9% 44.6% 13.4% 15.2% 21,0% 36.7% 13.6% 50.3% 13.3% 12.5% 28.3% 32.5% 13.4% 45.9% 13.0% 9.2% 28.7% 40.3% 8.8% 49.1% 2.9% 22.5% 15.0% 59.0% 0.7% 59.6% 4.2% 35.5% 11.4% 35.6% 13.3% 48.9% 14.7% 9.7% 28.5% 34.9% 12.2% 47.1% 89 0.0% 35.4% 10.1% 39.0% 15.5% 54.5% 92 13.1% 16.1% 23.5% 36.4% 10.9% 47.3% 12.0% 10.4% 18.2% 48.0% 1 1.4% 59.3% 13.5% 1 1.3% 32.6% 34.8% 7.7% 42.6% 8.3% 25.1% 17.9% 46.1% 2.6% 48.7% 13.7% 9.8% 24.4% 39.6% 12.5% 52.1% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 4.9% 20.0% 17.5% 51.7% 5.8% 57.5% 93 1 1.7% 9.3% 30.8% 40.8% 7.4% 48.2% 96 10.3% 12.4% 25.9% 37.8% 13.6% 51.4% 17.5% 35.4% 35.5% escala 1 1.6% escala 12.5% 12.0% 28.7% 33.3% 13.6% 46.8% 98 13.4% 19.9% 21.7% 39.7% 5.3% 45.0% 18.5% 30.8% 36.8% escala 13.9% escala 101 9.8% 12.5% 27.9% 39.7% 10.1% 49.8% 103 9.1% 36.6% 17.5% 26.0% 10.8% 36.8% 107 1 1.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.20% 0.0% 20.4% 40.1% 12.1% 27.4% 39.5% 0.0% 29.6% 30.9% 6.8% 32.6% 39.4% 0.0% 29.6% 22.9% 9.5% 38.0% 47.5% 2.2% 12.0% 43.9% 22.0% 19.9% 42.0% 30.4% 12.5% 46.2% 10.9% 57.1% 68.0% 12.0% 20.5% 30.7% 5.2% 31.6% 36.8% 5.0% 16.0% 14.2% 62.2% 2.6% 64.8% 1 1.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.2% 0.0% 15.6% 46.5% 10.2% 27.6% 37.8% 13.2% 21.6% 20.4% 31.3% 13.5% 44.80% 108 9.0% 49.0% 23.0% 12.3% 6.7% 19.0% 0.0% 51.0% 6.1 % 33.1% 9.9% 43.0% 1 1.0% 18.4% 44.6% 4.1 % 21.9% 26.0% 0.0% 29.6% 22.9% 9.5% 38.0% 47.5% 0.0% 32.0% 10.2% 53.5% 4.3% 57.8% 0.0% 45.6% 10.4% 38.2% 5.8% 44.0% 0.0% 28.4% 14.7% 1.2% 5.7% 56.9% 5.4% 18.9% 17.2% 52.8% 5.8% 58.6% 0.0% 10.6% 34.7% 5.9% 48.8% 54.7% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Pal mítico Esteárico 0.0% 21.9% 24.7% 32.7% 20.8% 53.4% 12.1% 13.9% 27.6% 33.8% 12.7% 46.50% 109 10.9% 8.8% 31.3% 37.7% 1 1.3% 49.0% 1 10 0.4% 21.4% 23.9% 54.4% 0.0% 54.4% 1 13 5.0% 44.1% 15.1 % 21.0% 14.8% 35.8% 13.6% 14.6% 32.0% 15.2% 24.6% 39.8% 13.9% 25.9% 23.7% 36.5% 0.0% 36.5% 1 16 4.8% 17.4% 11.2% 55.5% 11.1% 66.6% 7.8% 17.7% 19.8% 47.0% 7.7% 54.7% 3.3% 26.7% 16.1% 33.1% 20.7% 53.8% 7.3% 18.3% 16.5% 47.8% 10.1% 57.9% 4.3% 22.9% 14.2% 54.3% 4.2% 58.5% 4.6% 26.8% 13.5% 41.6% 13.5% 55.1% 0.0% 32.4% 9.6% 38.3% 19.8% 58.0% 8.1% 16.1% 16.2% 50.4% 9.3% 59.6% 7.3% 20.5% 11.7% 49.2% 11.2% 60.5% 6.9% 19.6% 12.9% 52.1% 8.5% 60.6% 5.4% 17.4% 15.4% 50.8% 11.0% 61.8% 8.7% 18.7% 13.9% 49.1% 9.5% 58.6% 6.7% 22.8% 10.8% 46.3% 13.4% 59.7% 6.4% 17.2% 8.8% 50.3% 17.2% 67.6% 5.6% 17.6% 9.0% 59.0% 8.8% 67.8% 1 17 6.2% 21.4% 18.3% 46.0% 8.0% 54.1% 8.9% 21.8% 17.7% 40.6% 11.0% 51.6% 120 15.3% 17.9% 20.1 % 44.4% 2.3% 46.7% 7.5% 15.4% 16.3% 51.3% 9.5% 60.8% 17.3% 4.4% 25.7% 44.0% 8.6% 52.6% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linolcico Oleico Palmítico Esteárico 4.1% 25.5% 20.5% 36.9% 13.0% 49.9% 15.7% 10.1% 20.9% 36.8% 16.5% 53.3% 132 0.0% 32.8% 10.9% 56.2% 0.0% 56.2% 133 6.6% 20.7% 19.5% 49.9% 3.3% 53.2% 9.3% 18.3% 16.5% 45.1% 10.8% 55.8% 3.3% 30.4% 20.7% 45.6% 0.0%) 45.6% 0.0% 34.3% 9.6% 56.0% 0.0% 56.0% 13.2% 12.9% 22.2% 42.7% 9.0% 51.7% 10.1% 1 1.6% 23.3% 46.5% 8.4% 54.9% 0.0% 35.9% 10.9% 46.9% 6.3% 53.2% 134 0.0% 56.2% 36.6% 7.2% 0.0% 7.2% 135 0.0% 41.1% 7.2% 51.8% 0.0% 51.8% 139 0.0% 35.9% 10.9% 46.9% 6.3% 53.2% 140 9.7% 23.4% 21.4% 32.7% 12.8% 45.5% 141 1 1.2% 12.1% 36.5% 28.2% 12.1% 40.2% 14.7% 13.9% 28.1% 38.3% 5.0% 43.3% 142 16.3% 18.8% 18.8% 10.3% 35.7% 46.1% 0.0% 34.5% 1 1.7% 43.4% 10.5% 53.8% 8.6% 15.8% 32.5% 22.8% 20.4% 43.2% 2.4% 9.6% 23.7% 47.7% 16.7% 64.3% 144 0.0% 14.9% 51.2% 13.4% 20.4% 33.9% 146 13.6% 10.3% 26.0% 31.4% 18.7% 50.2% 12.6% 12.4% 25.5% 36.5% 12.9% 49.4% 6.6% 22.4% 19.5% 48.2% 3.4% 51.6% 9.0% 19.7% 19.0% 41.7% 10.5% 52.2% 147 8.0% 17.9% 17.6% 48.8% 7.7% 56.5% 7.2% 24.5% 17.9% 33.0% 17.4% 50.5% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 9.5% 20.6% 17.7% 42.2% 9.9% 52.2% 150 7.7% 15.1% 17.5% 50.4% 9.2% 59.7% 7.5% 20.6% 18.6% 41.3% 12.0% 53.3% 151 7.8% 26.1% 17.5% 46.4% 2.2% 48.6% 5.0% 29.6% 12.4% 48.9% 4.1% 53.0% 0.0% 25.5% 14.5% 55.5% 4.5% 60.0% 0.0% 14.2% 52.1 % 20.0% 13.7% 33.7% 0.0% 17.3% 30.5% 43.3% 8.9% 52.2% 8.0% 22.7% 20.2% 44.0% 5.1% 49.2% 152 0.0% 56.3% 15.7% 23.6% 4.4% 28.0% 8.0% 12.7% 26.3% 22.5% 30.5% 53.0% 0.0% 27.1% 26.2% 26.2% 20.5% 46.7% 0.0% 20.1% 44.2% 24.8% 10.8% 35.7% 9.5% 31.2% 38.3% 2.2% 18.9% 21.1% 155 18.4% 4.9% 25.6% 41 .5% 9.6% 51.1 % 157 7.9% 19.5% 22.2% 41.2% 9.2% 50.4% 9.6% 21.7% 20.1% 39.1% 9.6% 48.7% 7.2% 25.2% 13.0% 34.9% 19.8% 54.7% 158 14.0% 1.2% 33.5% 42.8% 8.5% 51.2% 159 6.3% 28.4% 13.8% 36.7% 14.8% 51.5% 160 5.6% 20.8% 20.8% 46.6% 6.2% 52.8% 161 6.2% 21.4% 18.3% 46.0% 8.0% 54.1% 8.9% 21.8% 17.7% 40.6% 11.0% 51.6% 162 10.2% 45.6% 38.4% escala 5.7% escala 22.1% 39.2% 32.7% escala 6.0% escala 163 5.9% 22.9% 15.5% 47.4% 8.3% 55.7% 8.6% 17.1% 10.4% 61.4% 2.5% 63.9% 6.4% 23.5% 20.4% 45.7% 4.0% 49.7% 164 8.4% 26.9% 22.6% 39.2% 2.9% 42.1% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 13.0% 38.4% 37.5% escala 1 1.2% escala 9.6% 29.5% 21.1% 35.1% 4.7% 39.8% 17.8% 12.3% 20.5% 38.7% 10.7% 49.4% 23.3% 23.1% 39.1% escala 14.5% escala 6.5% 15.2% 17.1% 58.0% 3.3% 61.3% 9.1 % 23.1% 19.8% 40.1 % 7.8% 47.9% 9.2% 20.1% 17.7% 41.2% 11.8% 53.0% 15.6% 17.7% 24.4% 29.9% 12.4% 42.3% 15.9% 37.0% 35.5% escala 1 1.7% escala 166 5.5% 21.8% 22.8% 44.5% 5.4% 49.9% 14.6% 22.3% 21.8% 33.2% 8.1% 41.3% 22.3% 33.3% 36.8% escala 7.6% escala 167 7.2% 19.4% 20.1% 44.8% 8.4% 53.3% 10.0% 21.9% 20.7% 36.3% 11.0% 47.3% 170 12.5% 12.4% 29.4% 37.8% 7.8% 45.6% 8.5% 18.2% 20.8% 43.0% 9.5% 52.5% 3.5% 22.0% 39.8% 8.9% 25.9% 34.7% 171 8.0% 22.4% 35.5% 33.4% 0.7% 34.1% 172 8.0% 18.8% 21.4% 43.6% 8.1 % 51 .7% 7.4% 19.1% 18.6% 45.1% 9.8% 54.9% 22.5% 0.0% 37.3% 40.2% 0.0% 40.2% 178 14.5% 12.9% 22.0% 32.3% 18.3% 50.6% 180 8.6% 19.0% 18.5% 42.1% 11.8% 54.0% 1 1.8% 14.2% 29.3% 32.1% 12.5% 44.6% 1 1.5% 40.0% 36.3% escala 12.2% escala 14.6% 12.1% 28.7% 36.6% 7.9% 44.6% 183 10.6% 35.4% 40.7% escala 13.3% escala 193 3.0% 32.4% 15.2% 49.4% 0.0% 49.4% 194 10.9% 38.7% 42.0% escala 8.4% escala Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 9.6% 21.8% 20.7% 34.6% 13.2% 47.9% 12.6% 31.0% 37.8% escala 18.6% escala 3.0% 32.4% 15.2% 49.4% 0.0% 49.4% 197 9.8% 0.0% 50.9% 39.4% 0.0% 39.4% 198 7.7% 19.7% 16.6% 46.8% 9.3% 56.1 % 200 8.5% 16.8% 19.3% 48.7% 6.7% 55.3% 204 13.7% 12.8% 27.6% 32.2% 13.7% 45.9% 9.9% 14.0% 30.5% 23.2% 22.5% 45.7% 210 7.2% 22.0% 20.7% 39.0% 1 1.2% 50.2% 21 1 9.0% 16.2% 39.4% 24.0% 11.2% 35.3% 10.2% 17.0% 24.7% 35.7% 12.4% 48.1% 13.8% 10.4% 36.5% 24.1% 15.3% 39.4% 6.5% 12.2% 36.3% 30.5% 14.5% 45.0% 6.9% 26.6% 16.1% 32.7% 17.7% 50.3% 3.4% 36.2% 27.7% 32.6% 0.0% 32.6% 6.9% 26.5% 20.5% 28.9% 17.3% 46.1 % 0.0% 35.1% 15.6% 39.6% 9.7% 49.2% 0.0% 25.3% 19.5% 46.8% 8.4% 55.2% 6.6% 19.7% 25.9% 37.2% 10.6% 47.8% 7.7% 22.8% 20.7% 36.6% 12.3% 48.9% 16.3% 4.6% 28.2% 49.1% 1.7% 50.8% 8.0% 22.1 % 17.2% 41.2% 1 1.5% 52.7% 8.0% 22.1% 17.2% 41.2% 1 1.5% 52.7% 18.2% 3.2% 28.7% 42.4% 7.5% 49.8% 1 1.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.2% 212 7.5% 25.6% 17.6% 36.5% 12.8% 49.3% 19.1 % 0.9% 29.7% 46.8% 3.5% 50.3% 8.8% 28.4% 9.6% 33.7% 19.5% 53.2% 19.4% 24.8% 18.9% 33.5% 3.3% 36.8% Ácidos Crasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleico Palmítico Esteárico 19.1% 26.9% 17.5% 31.6% 4.9% 36.6% 5.5% 42.3% 7.9% 30.8% 13.5% 44.3% 4.6% 23.9% 25.1% 35.5% 11.0% 46.5% 8.8% 28.4% 9.6% 33.7% 19.5% 53.2% 0.0% 65.4% 22.4% 10.5% 1.7% 12.2% 3.3% 14.2% 40.6% 30.7% 11.1% 41.8% 1 1.2% 13.6% 25.0% 40.3% 9.9% 50.2% 10.6% 16.6% 19.1% 42.7% 1 1.0% 53.7% 21.1% 22.7% 17.4% 17.5% 21.2% 38.7% 7.6% 24.0% 20.0% 38.9% 9.5% 48.4% 10.3% 20.4% 22.2% 33.7% 13.4% 47.1% 3.5% 22.0% 39.8% 8.9% 25.9% 34.7% 213 7.6% 28.2% 16.3% 30.4% 17.5% 47.9% 5.3% 18.8% 18.1% 41.3% 16.4% 57.7% 7.5% 21.0% 14.8% 48.5% 8.2% 56.7% 8.3% 17.8% 18.5% 44.6% 10.9% 55.5% 214 9.1% 20.2% 19.1% 47.0% 4.5% 51.6% 8.3% 19.8% 18.9% 44.6% 8.4% 53.0% 7.7% 20.5% 19.6% 45.3% 7.0% 52.2% 7.1% 21.5% 16.9% 42.4% 12.1% 54.5% 7.0% 25.9% 15.1% 39.9% 12.0% 51.9% 6.9% 18.0% 18.3% 48.5% 8.4% 56.9% 7.4% 19.2% 18.2% 45.6% 9.5% 55.1% 5.3% 21.1% 10.9% 47.3% 15.4% 62.7% 5.3% 21.1% 10.9% 47.3% 15.4% 62.7% 215 7.8% 19.8% 15.8% 46.4% 10.2% 56.6% 7.9% 20.2% 17.7% 40.6% 13.6% 54.1% 20.0% 24.8% 25.4% 25.7% 4.1% 29.9% Ácidos Grasos Liberados del Aceite por la Enzima Residuo de P+S Aminoácido Linolénico Linoleico Oleicó Palmítico Esteárico 4.4% 26.2% 19.2% 45.1 % 5.1 % 50.2% 8.1% 19.6% 20.1% 42.7% 9.4% 52.1% 2.3% 30.1% 19.7% 31.8% 16.1% 47.9% 5.9% 23.7% 14.8% 39.3% 16.3% 55.6% 9.6% 26.0% 17.0% 36.5% 10.9% 47.3% 4.7% 20.8% 14.1% 42.2% 18.2% 60.4% 4.2% 31.0% 12.0% 40.7% 12.1% 52.8% 6.7% 21.3% 18.1% 41.7% 12.3% 53.9% 8.0% 19.5% 20.4% 47.1% 5.0% 52.1% 216 8.3% 21.9% 18.9% 40.9% 10.0% 50.9% 0.0% 28.0% 30.1% 22.8% 19.1% 41.9% 34.6% 0.0% 30.6% 33.7% 1.1 % 34.8% 7.3% 17.8% 17.9% 47.0% 10.0% 56.9% 6.6% 16.6% 17.2% 50.0% 9.7% 59.7% 7.7% 18.1% 19.2% 44.5% 10.5% 55.0% 7.5% 20.3% 16.5% 45.0% 10.6% 55.6% 217 0.0% 42.3% 21.0% 24.3% 12.3% 36.6% 6.8% 16.7% 17.1% 50.1% 9.3% 59.4% 7.4% 20.5% 18.7% 44.1% 9.4% 53.5% 1 1.9% 10.1% 31.8% 30.5% 15.7% 46.2% 13.2% 21.6% 20.4% 31.3% 13.5% 44.8% 12.1% 13.9% 27.6% 33.8% 12.7% 46.2% 218 0.7% 39.0% 17.8% 30.3% 12.1% 42.5% 4.7% 26.8% 19.4% 30.5% 18.7% 49.1% 7.1 % 22.8% 22.4% 38.3% 9.4% 47.7% 7.2% 19.9% 19.6% 44.1% 9.2% 53.4% 8.5% 19.7% 19.9% 42.2% 9.7% 51.9% 7.2% 25.9% 15.8% 37.6% 13.5% 51.1% 8.0% 21.1% 20.9% 41.9% 8.2% 50.0% Fatty Acids Released from Oil by Enzyme Amino Acid Stearic P+S Residue Linolenic Linoleic Oleic Palmitic 8.7% 19.9% 19.0% 42.9% 9.4% 52.4% 223 4.5% 29.5% 17.2% 15.8% 33.0% 48.8% 0.0% 38.4% 30.1% 31.6% 0.0% 31.6% 20.2% 22.8% 33.6% 17.3% 6.0% 23.4% 19.0% 37.0% 34.9% escala 9.1% escala 224 8.0% 20.5% 22.1% 41.0% 8.4% 49.5% 6.6% 18.2% 17.1% 51.4% 6.8% 58.2% 7.9% 22.1% 21.6% 37.0% 11.4% 48.4% 14.4% 19.0% 24.9% 33.1% 8.5% 41.7% 3.1% 26.3% 24.2% 40.8% 5.6% 46.4% 10.3% 20.1% 25.8% 38.1% 5.7% 43.7% 225 9.7% 22.2% 18.8% 41.8% 7.5% 49.3% 4.3% 23.5% 17.8% 47.9% 6.4% 54.3% 12.0% 21.9% 17.1% 39.1% 9.9% 49.0% 12.9% 23.8% 17.5% 34.1% 11.7% 45.8% 15.9% 22.6% 18.3% 38.0% 5.2% 43.2% 226 4.9% 24.9% 21.9% 45.8% 2.5% 48.3% 6.5% 29.5% 22.8% 32.4% 8.8% 41.2% 227 13.6% 23.1% 21.9% 38.3% 3.2% 41.4% La tabla 4 es un resumen u otra compilación de los datos mostrados en la tabla 3 (anterior) . Por ejemplo, el término "posición" indicado en la posición del residuo de aminoácido en la SEQ ID NO: 2 el término "Aminoácido Original", como en la Tabla 3, indica el residuo "original" no alterado, en tanto que el término "Nuevo Aminoácido" como en la Tabla 3, indica el residuo de aminoácido alterado (nuevo) en esa posición. Los términos, "WT_P" y "WT_S" indican la preferencia del sustrato (liberación del ácido graso) de la enzima "original", por ejemplo, la SEQ ID. NO: 2 por un sustrato (ácido graso particular indicando la cantidad de ácido graso liberado (hidrolizado) del aceite de soya (como en la Tabla 3) , donde "P" es ácido palmitico y "S" es ácido esteárico.
Las columnas de "palmitato" y "estearato" indican la cantidad de ácido palmitico y ácido esteárico liberadas (por la hidrólisis enzimática) del aceite de soya, la cual comprende ácido linolénico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmitico, ácido esteárico, como se discute aquí. "P+S" muestra las cantidades combinadas de ácidos grasos hidrolizados que fueron el ácido palmitico y el ácido esteárico, o "P+S". Los términos "delta_P" y "delta_S" indican el cambio en la preferencia de una enzima ejemplificante como se proporciona aquí (por ejemplo, D61A de la primera linea) para hidrolizar el ácido palmitico y el ácido esteárico, respectivamente, en comparación con la actividad correspondiente de la SEQ ID NO: 2. El término "delta P+S" indica el cambio total o sumado en la preferencia de una enzima ejemplificante como se proporciona aqui (por ejemplo, D61A de a primera linea) para hidrolizar el ácido palmitico y el ácido esteárico en comparación con la actividad correspondiente de la SEQ ID NO: 2.
La sección "mutaciones de palmitasa" resume las enzimas ejemplificantes como se proporcionan aquí que tienen una preferencia de actividad (hidrólisis de ácidos grasos) para liberar el ácido palmítico versus otros ácidos grasos. La sección "mutaciones de estearato" resume la enzima ejemplificante como se proporciona aqui, que tiene una preferencia de actividad para liberar el ácido esteárico versus otros ácidos grasos (del ensayo de aceite de soya, descrito anteriormente) .
TABLA 4 Mutaciones de Palmitato Ejemplificantes Aminoácido Nuevo Posición WT P Original Aminoácido WT_S Palmitato Estearato 61 D A 45% 6% 54% 7% 61 D E 45% 6% 47% 8% 72 R E 45% 6% 54% 4% 72 R K 45% 6% 52% 9% 1 16 E A 45% 6% 56% 1 1% 116 E Q 45% 6% 50% 9% 116 E R 45% 6% 52% 9% 1 16 E T 45% 6% 50% 17% 1 16 E V 45% 6% 59% 9% 133 S A 45% 6% 45% 11% 151 I G 45% 6% 49% 4% 151 I A 45% 6% 46% 2% 163 V R* 45% 6% 61% 2% 164 D R* 45% 6% 58% 3% TABLA 4 (CONTINUACIÓN) Mutaciones de Estearato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido WT P WT s Palmitato Estearato 20 I L 45% 6% 39% 12% 62 V S 45% 6% 37% 18% 77 G P 45% 6% 18% 20% 83 V c 45% 6% 31% 17% 88 D H 45% 6% 33% 13% 113 Y G 45% 6% 15% 25% 116 E T 45% 6% 50% 17% 1 16 E G 45% 6% 33% • 21% 140 H K 45% 6% 33% 13% 146 s 45% 6% 31% 19% TABLA 4 (continuación) Mutaciones de Palmitato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido P + S delta P delta S delta P+S 61 D A 60% 9% 1% 9% 61 D E 55% 2% 2% 4% 72 R E 58% 9% -2% 7% 72 R K 61% 7% 3% 10% 1 16 E A 67% 1 1% 5% 16% 1 16 E Q 60% 5% 3% 9% 116 E R 61% 7% 3% 10% 116 E T 68% 5% 1 1% 17% 1 16 E V 68% 14% 3% 17% 133 S A 56% 0% 5% 5% 151 I G 53% 4% -2% 2% 151 I A 49% 1% -4% -2% 163 V R* 64% 16% -4% 13% 164 D R* 61% 13% -3% 10% TABLA 4 (CONTINUACIÓN) Mutaciones de Estearato Aminoácido Nuevo Posición Original Aminoácido P + S delta_P delta_S de!ta_P+S 20 I L 51% -6% 6% 0% 62 V S 55% -8% 12% 4% 77 G P 38% -27% 14% -13% 83 V C 48% -14% 11% -3% 88 D H 46% -12% 7% -5% 113 Y G 40% -30% 19% -11% 116 E T 68% 5% 11% 17% 116 E G 54% -12% 15% 3% 140 H K 46% -12% 7% -5% 146 K S 50% -14% 13% -1% 167 I S 47% -9% 5% -4% 180 L E 54% -3% 6% 3% 194 E M 48% -10% 7% -3% 211 A Q 50% -12% 12% -1% 212 S Y 47% -11% 7% -4% 215 G c 60% -3% 12% 9% 215 G V 56% -6% 10% 5% 215 G w 53% -4% 6% 2% 218 A H 49% -15% 13% -2% 218 A S 51% -7% 8% 0% 223 V A 49% -29% 27% -2% 225 A M 49% , -6% 4% -2% Q 46% -11% 6% -5% Ejemplo 5: Evolución Ejemplificante para Hidrólisis Mejorada de Palmitato Usando la Tecnología GeneReassemblySM Catorce (14) mutaciones de aminoácidos individuales identificados por la selección GSSMSM las cuales cubren siete (7) posiciones de aminoácidos se combinaron mediante la tecnología GeneReassemblySM (número de patente 6,605,449). Las secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa generadas por la fase GeneReassembly se clonaron en un vector de expresión pASK-5 (véase la descripción arriba) para la expresión en bacterias hospederas Escherichia coli HMS175 (Noageb, EUA) . La expresión de las variantes GeneReassembly se indujo con anhidrotetraciclina después que se alcanzaron las densidades óptimas de las células hospederas.
Las 14 mutaciones que dieron los aumentos más grandes en la hidrólisis de palmitato, identificadas en la Tabla 2, se seleccionaron para la inclusión en una genoteca GeneReassembly de Palmitato generada mediante los métodos descritos anteriormente, los clones iniciales se seleccionaron en palmitato de umbeliferilo por la actividad, dando aproximadamente 145 clones de secuencia única, los cuales se analizaron por su actividad sobre aceite de soya, como se describe anteriormente.
La Figura 8 muestra los datos de la selección primaria y secundaria para los ensayos de aceite de soya sobre los clones seleccionados de la genoteca de palmitasa. Los clones que dieron palmitato a más de 70% de FAs hidrolizados en el ensayo primario (bajo las condiciones estándar iniciales de velocidad del método de ensayo) se seleccionaron para ser abalizadas otra vez sobre el aceite de soya. Para cada ensayo de aceite de soya, las FAs extraídas se diluyeron 50 veces y 100 veces para el análisis por LC/MS o GC. Cuando se encontraron mutaciones no objetivo adicionales, esto también se indica. Las velocidades de hidrólisis de FA detectadas y las cantidades de cada FA detectado se presentan. En la Figura, "alto" y "bajo" indican los valores que estaban fuera del rango de la curva de calibración. Las líneas se ordenan en el orden de porcentaje de palmitato liberado en el ensayo secundario, y después por el palmitato total liberado. Varios clones mostraron un aumento significativo en al selectividad del palmitato (hasta 100%), en comparación con la SEQ ID N0:2 original (61.2%) .
Los 25 éxitos de palmitasa superiores seleccionados con base en el ensayo secundario descrito anteriormente se sub-clonaron en sistemas de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc, Solicitud Pública de Patente Norteamericana NO. 2005130160 y Dow Global Technologies Inc, Solicitud Pública de Patente No. 20050186666) . El ácido nucleico que codifica la enzima o el polipéptido se insertó ya sea en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc, Solicitud Pública de Patente NO. 20050130160) o en el vector pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc, Solicitud Publica de Patente Norteamericana No. 20080058262) y después se introdujo en las células hospederas de Pseudomonas fluorescens por electroporación . Las células transformadas se seleccionaron ya sea por cultivo en medio mínimo para los constructor pDOW1169 o en medio rico más tetraciclina para los constructor pMYC. La expresión de la enzima o el polipéptido se indujo con IPTG después que de alcanzaron las densidades óptimas de células hospederas.
La Tabla 5 muestra los datos de los ensayos sobre aceite de soya, corridos en duplicado, de los 25 éxitos superiores expresados en los sistemas de Pseudomonas. Los 4 éxitos construidos en el vector pDOW1169 se listan en subrayados en negritas, todos los otros éxitos se construyen en el vector pMYC. La enzima de agregó a 5 g de aceite crudo resultando en un contenido final de agua de 20%. La mezcla se homogeneizó entonces con una sonda de 7 mm y se incubó por 40 horas a 25°C con agitación mediante una varilla de agitación. Se extrajeron alícuotas y se analizaron por los FA convirtiendo los FA a FAME y cuantificando los FAME 'por GC como se describe en el Ejemplo 8. Las 25 enzimas se cargaron en los 5 gramos de aceite de soya con base en unidades de actividad de UMB-palmitato iguales. En estas reacciones el palmitato en el aceite se redujo significativamente de 11% en el aceite no tratado a 5% o menos en los aceites y tratados con la enzima indicando una preferencia aumentada para la hidrólisis del palmitato en comparación con la enzima original SEQ ID NO: 2. ra ND (No determinado) La tabla 6 a continuación muestra los datos para la termoestabilidad de los 25 éxitos superiores de palmitasa seleccionados con base en el ensayo secundario descrito anteriormente. Estos datos se obtuvieron usando los éxitos expresados en células hospederas de E. coli HMS174. Los clones se dispusieron en placas de 96 pozos y se incubaron por 10 minutos a la temperatura ambiente (TA) , 45, 50 o 55°C después se analizaron a TA en eUMB-palmitato . El porcentaje de actividad residual se determina dividiendo la actividad después de la incubación a cada temperatura entre la actividad después de la incubación a TA. También se muestran para cada palmitasa las mutaciones presentes, y los ejemplos de la selectividad y la actividad del palmitato sobre aceite de soya. La SEQ ID NO: 2 retuvo aproximadamente 15% de su actividad después de la incubación por 10 min a 50°C, pero no tuvo actividad después de la incubación a 55°C.
Tabla 6 % de Estabilidad Posiciones de aminoácidos y aminoácidos presentes Enzima 5SC 50C 45C 61 72 116 133 151 163 164 Otros 27 23.0% 62.7% E K V 28 22.8% 62.1% E K V R 29 55.9% E K R 30 24.1% 68.8% 75.6% E E V A 31 22.0% 68.1% 82.5% E E V A R 32 27.1% 58.4% E E V R 33 26.1% 56.6% E E V A R 34 24.7% 54.0% E E V A R 35 8.1% 64.1% 67.6% E E T R 36 10.3% 53.8% 75.7% E E A A R 37 9.2% 54.8% 61.5% E E A R 38 45.4% 68.4% E E A A A 39 22.9% 61.9% E E A A R 40 35.3% 77.1% E V A R 41 30.6% 70.2% E V A 42 20.3% 71.8% 79.3% E A A G R 43 64.2% E A A 44 63.2% A K V % de Estabilidad Posición de aminoácidos y aminoácidos presentes Enzima 55C 50C 4SC 61 72 116 133 151 163 164 Otros 45 56.0% A K V A A R 46 80.7% A K A R 47 22.2% 71.8% 88.1% A E V A R 48 60.6% 83.2% A E V A R 49 50.7% 68.0% A E V 50 50.2% 77.2% A E V R 51 21.1% 53.6% A E V A R 52 56.5% A E Q A A R 53 73.6% 118.3% A E A A 54 69.2% 110.7% A E A A R 55 82.2% A V 56 51.4% A A A 57 82.8% K V A G 58 60.1% K V R 59 58.3% K V A P162S 60 57.9% K V A R V62F 61 56.3% V A R 62 51.9% Q A R 63 74.8% K A 64 58.8% K A A % de Estabilidad Posición de amnoácidos y aminoácidos presentes Enzima 55C 50C 45C 61 72 116 133 151 163 164 Otros 65 49.6% 72.0% E V R 66 46.3% 66.0% E V 67 55.1% E V A R 68 51.7% E V A A 69 23.6% 54.6% E A 70 76.2% E A R 71 59.2% V A 72 51.8% V A R Ejemplo 6: Protocolo de Laboratorio para la Evaluación de las Enzimas Palmitasa, Estearatasa o Saturasa Candidatas Las enzimas y los polipéptidos ejemplificantes como se proporcionan aquí se expresaron en el sistema de Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc, SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20050130160) . El ácido nucleico que codifica la enzima o el polipéptido se insertó en el vector pMYC (Dow Global Technologies Inc, SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20050130160) y después se introdujo en las células hospederas auxotróficas de Pseudomonas fluorescens mediante electroporación . Las células transformadas se seleccionaron mediante cultivo en medio mínimo. La expresión de la enzima o el polipéptido se indujo con IPTG después de alcanzar las densidades óptimas de las células hospederas.
El siguiente procedimiento se debe usar para evaluar la habilidad de una enzima y otro polipéptido como se proporcionan aquí, para hidrolizar una muestra de aceite. La enzima palmitasa se agrega a 1 kg del aceite crudo resultando en un contenido final de agua de 20%. La mezcla se homogeniza entonces con un mezclador de varilla y se incubó a la temperatura ambiente con mezclado constante usando un mezclador de paletas. Se extrajeron alícuotas (0.5 mL) a las Oh, 21h, 43h, 65h y 72h y se trataron para al conversión a FÁME y el análisis GC como se describe en el Ejemplo 8.
El procedimiento anterior se uso con la SEQ ID NO: 2, la muestra de aceite fue un aceite de soya crudo. Después de 72 h, las muestras tanto del aceite no tratado y del aceite tratado con la enzima dieron los resultados mostrados en la Tabla 7.
Tabla 7 Los resultados muestran una reducción significativa en la cantidad de ácido palmítico (C16:0), tal reducción se considera deseable.
Ejemplo 7: Evaluación las Lipasas, Saturasas o Palmi asas con homología de la secuencia con el polipeptido ejemplificante SEQ ID NO: 2 Varias secuencias de lipasa homologas se sub-clonaron en el vector pMAL-c2x (New England Biolabs, EUA) mediante el método de clonación xi (Genlantis, EUA) . Los constructor que contiene la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID N0:14, o la SEQ ID NO: 16 se transformaron en células hospederas de Escherichia coli ArcticExpress RP (Stratagene, EUA) para la expresión. La expresión de las lipasas está bajo de control de un promotor el cual se índice con IPTG después que se alcanzan las densidades óptimas de las células hospederas, las enzimas recombinantes se evaluaron sobre aceite de soya en cuanto a al selectividad de los FA (Tabla 8) . Las lipasas que comprende la SEQ ID N0:2, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 16 se expresaron y se escindieron de la etiqueta de fusión MBP usando las condiciones estándar. Una colonia única se inoculó en medio LB que contenia 20 g/mL de gentamicina y se agitó a 200 RPM durante toda la noche a 30DC. Este cultivo durante toda la noche se inoculó en medio LB fresco conteniendo 20 g/mL de gentamicina a una lectura OD600 de 0.05. Este cultivo se agitó a 200 RPM y 30°C hasta que se obtuvo una lectura de OD600 de 0.5. Los cultivos se transfirieron a 12°C se agitaron a 200 RPM y se les permitió equilibrarse a la temperatura ambiente antes de la inducción de la expresión de lipasa mediante la adición de IPTG 0.5 mM, seguido por cultivo adicional por 24 horas. Las células se recolectaron mediante centrifugación, se suspendieron en amortiguador de Tris pH 8, conteniendo NaCl, CaCl2, DNasal, y lisozima, y después se sometieron a lisis mediante sonificación . Los Usados de células de clarificaron mediante centrifugación. Las enzimas se escindieron del MBP mediante incubación de la fusión lipasa-MBP con FactorXa por 6 horas a la temperatura ambiente, seguido por 18 horas adicionales a 12°C. Los Usados clarificados con enzimas recombinantes activas, intactas mostraron todos preferencias fuertes y similares para la hidrólisis del palmitato sobre otros FA cuando se analizan sobre aceite de soya (Tabla Tabla 8 Método para la conversión de ácidos grasos libres o triglicéridos a ácidos graso metil ésteres (FAME) y cuantificación de los FAME mediante Cromatografía de Gases Los ácidos grasos liberados de lipidos, triglicéridos, grasas u aceites mediante la acción de las lipasas, por ejemplo, las saturasas, palmitasas, y/o estearatasas , pueden ser cuantif icados directamente mediante LC/MS usando el método descrito en el Ejemplo 2. Alternativamente, estos ácidos grasos hidrolizados pueden ser convertidos a Ácido Graso Metil Esteres (FAME) usando metanolisis catalizada por ácido, y después se cuantifican mediante Cromatografía de Gases (GC) . En este ejemplo: • El aceite después de la reacción con las lipasas, por ejemplo, saturasas, palmitasas y/o estearatasas se trata mediante la adición de 1 mL de solvente de extracción (CHCl3:MeOH:HCl 4N (2:1:0.075)) por un volumen de reacción de 0.5 mL.
• Una alícuota de 45 µL del aceite extraído se transfiere a un frasco de tapa con rosca de 4 mL. A cada frasco se agrega una pequeña barra de agitación, seguido por 2 mL de hexano y 400 µL de MeOH al 20% (v/v) en HC1.
• Los frascos se sellan entonces y se calientan con agitación por 15 minutos. Los frascos se retiran entonces del calor y se les permite enfriarse antes de agregar 800 L de H20.
La mezcla se somete entonces a un vórtice y una muestra (500 i ) de la capa superior de hexano que contiene los FAMES se transfiere a un frasco de muestreador automático para la GC. A cada muestra se agregan 0.5 mg/mL de FAME C15:0 como un estándar interno.
Los FAME sintetizados usando este método se analizan entonces mediante Cromatografía de Gases usando los siguientes parámetros operacionales: • El quipo es un GC Serie 6890 de Hewlett Packard con muestreador automático • La columna usada es una Columna Capilar de sílice Fusionado Supelco SP-2380 de 30 x 0.25 mm y 0.2 µp? de espesor de película • El inyector y el detector se ajustan a 260°C; el flujo del gas Helio portador se ajusta a 0.6 mL/min; el horno se ajusta a una temperatura inicial de 150°C.
• Las muestras (1 mL) se inyectan con una división de inyección de 10:1. El método de GC usado tiene: - Rampa 1: 4C/min por 10 min = 190°C - Rampa 2: 15C/min por 4 min = 250°C - Retención: 250°C por 2 min Los Fa de triglicéridos también pueden ser analizados mediante la conversión a FAME, aun en presencia de ácido grasos hidrolizados . Usando el método anterior y los métodos siguientes en combinación esto se puede usar para determinar la selectividad de los ácidos grasos de una lipasa, por ejemplo, una saturasa, palmitasa, y/o estearatasa, y el efecto de la enzima sobre el aceite. El método para el análisis de FA enlazados a glicerol (y otros alcoholes) utiliza metanolisis catalizada por bases: • El aceite después de la reacción con lipasas, por ejemplo, saturasas, palmitasas, y/o estearatasas se trata mediante la adición de 1 mL de solvente de extracción (CHCl3:MeOH:HCl 4N (1:1:0.075) por 0.5 mL de volumen de reacción.
• Una alícuota del aceite extraído se transfiere a un tubo para microcentrifugadora . Los 500 \i~L de heptano se agregan seguidos por 50 ]iL de KOH metanolico 2 N.
• La mezcla se somete a un vórtice vigorosamente por 30 segundos después se somete a centrifugación.
• Una alícuota (50 yL) de la capa superior de heptano que contiene los FAME se transfiere a un frasco de muestreador automático y se combina con 450 yL del hexano que contiene el estándar interno C15:0.
· El análisis del FAME por GC es como se indica anteriormente .
Ejemplo 9: Evolución Ejemplificante para la Tolerancia Térmica Mejorada de la Palmitasa Usando la Tecnología 6SSMSM La palmitasa e emplificante de la invención que incluye las mutaciones D61E, R72K y V163R de la SEQ ID NO: 2 (Enzima 17, Tabla 5, anteriormente) se eligió como al mutante de selectividad líder de las rondas previas de evolución (Ejemplos 4 y 5, anteriormente) . Además, se realizo la evolución para mejorar la tolerancia térmica de la enzima selectiva líder (SEC ID NO: 2 con las mutaciones D61E, R72K y V163R) , usando la tecnología GSSM (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,171,820) .
En pocas palabras, la evolución GSSM se llevó a cabo introduciendo mutaciones puntuales usando oligonucleótidos degenerados, una posición de aminoácido a la vez, de modo tal que cada codon original podría ser sustituido con cada uno de los 20 aminoácidos de formación natural. La genoteca se construyó en el vector pDOW-Kan, se analizó mediante gel de agarosa, se trato con DPNI y después se transformó en células competentes de E. coli XLlBlue. Las colonias se cultivaron, se seleccionaron y se sometieron a secuenciamiento . Las colonias se reunieron y se preparó el ADN usando el equipo Qiagen mini-prep (# de Catalogo 27106, Qiagen, Valencia, CA) . Las células competentes de Pseudomonas fluorescens se transformaron entonces con el ADN. Las células hospederas de Pseudomonas fluorescens se obtuvieron de Dow Global Technologies Inc. (SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20050130160, SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20050186666 y SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 2006110747) . El vector pDOW-Kan se construyó agregando una marcador de resistencia a la canamicina para pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20080058261) . Las células se cultivaron en medio mínimo M9 (Dow Global Technologies Inc., SOLICITUD PÚBLICA DE PATENTE NO. 20050186666) suplementado con uracilo y canamicina. Todos los ejemplos que siguen, que describen el uso del vector pDO -kan, Pseudomonas fluorescens, y medio M9, se refieren al mismo vector pDOW-kan, Pseudomonas fluorescens, y medio M9 descritos anteriormente.
La genoteca GSSM se selecciono en el formato de 384 pozos. Las selecciones HTP primaria y secundaria se realizaron usando UMB-Palmitato (como se describe anteriormente en el Ejemplo 3) . Con el fin de identificar las mutaciones que mantiene la actividad en tanto que la enzima está a una temperatura elevada el ensayo se llevó a cabo incubando el sustrato fluorogénico con el lisado de células completo a 54 °C por 30 minutos, precedido por uha incubación de 30 minutos del lisado de células completo con amortiguador por 30 minutos a 54°C para asegurar que la enzima haya alcanzado 54°C antes de cargar el sustrato. La fluorescencia de cada mutante se midió (véase la columna 2, Tabla 9) y todos los imitantes con una lectura de fluorescencia mayor a 2 desviaciones estándar arriba del control se determinaron como un "éxito" - es decir, un mutante con tolerancia térmica suficientemente aumentada. 117 éxitos con cambios de aminoácidos únicos se identificaron de la selección de U B-palmitato véase la Tabla 9 a continuación) . Los cambios de aminoácidos en los 117 éxitos de mutación única ocurrieron en 50 residuos, 22% de las proteínas mostraron cambios de aminoácidos. Los 117 éxitos se evaluaron además por su eficiencia sobre el aceite crudo en ensayos estándar de 5g (véase el Ejemplo 5) a 25°C y 45°C. Los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Tabla 9 TT33 19889 GCC TCG A S 97 TT3 . 17199 AAG CGT K R 101 TT35 33316 GTG TTG V L 104 TT36 45591 TAT CTT Y L 113 TT37 3 I618 GAG GCG E A 116 TT38 65535 GAG TGT E C 116 TT39 65535 GAG GAT E p 116 TT40 36485 GAG TTT E 116 TT 1 65535 GAG ATT E 1 116 (TTC)135(TTT) TT42 48338 GAG ATT E 1 116 TT43 38696 GAG CTT E L 116 TT44 58069 GAG AAT E N 116 TT45 65535 GAG CAG E Q 116 TT46 42681 GAG AGT E S 116 TT47 65535 GAG ACT E T 116 TT48 65535 GAG GTT E V 116 TT49 60385 GAG TGG E w 116 TT50 42924 GAG TAT E Y 116 TT51 18591 CTG ATG L M 117 TT52 65535 AAG AGG K R 120 TT53 50984 AGT GCT S A 133 TT54 65535 GCG TCG A S 136 TT55 32933 GGC TTT G F 137 TT56 65535 CTC ATG L M 139 TT57 54461 CAC AGG H R 140 TT58 20741 AAC TGG N W 142 TT59 25491 GCG ATT A 1 144 TT60 19150 GCG TTG A L 144 TT61 54979 GCG ATG A M 144 TT62 33234 GCG GTG A V 144 TT63 51208 GAG CAT E H 149 TT64 21503 GCG ATT A 1 150 TT65 51405 GCG ATG A M 150 TT66 65535 GCG TGG A W 150 TT67 25795 AGC AAT S N 153 TT68 18156 AGC GGT S G 153 TT69 65535 AAC GAC N D 158 TT70 65535 CCG GGT P G 162 TT71 18622 CCG AAG P K 162 TT72 55639 CCG TCG P S 162 R163F TT73 26167 CCG TCG P S 162 I167L TT74 20774 CCG TCG P S 162 TT75 65535 GTG ATT V 1 183 TT76 20029 CAG GCG Q A 166 TT77 21399 CAG GAG Q ? 166 TT78 32863 CAG ACG Q ? 166 TT79 25576 ATT TTT 1 F 167 TT80 16567 ATT AAG 1 ? 167 TT81 26239 ATT CTG 1 L 167 TT82 19330 ATT CGT 1 R 167 TT83 31994 ATT TAT 1 Y 167 TT84 65535 CGC CAT R ? 172 TT85 38603 CGC AAG R 172 TT86 24428 CGC CTT R L 172 TT87 37581 CGC TAT R Y 172 TT88 30655 CTC AAG L ? 180 TT89 65535 CTC AGG L R 180 TT90 64023 GCG TGT A C 185 TT91 41225 GCG AAT A ? 185 TT92 65535 GAA GCG E A 190 TT93 65535 GAA AAG E ? 190 TT94 65535 GAA ATG E ? 190 TT95 65535 GAA CAG E Q 190 TT96 65535 GAA AGG E R 190 TT97 17914 CTA ATT L 1 200 TT98 18910 CTA GTA L V 200 ?201? TT99 35222 CTA GTT L V 200 TT100 38817 GAG TAT E Y 201 TT101 65535 GCG CAT A ? 203 TT102 65535 GCG CCG A ? 203 TT103 65535 GCG AGG A R 203 TT104 47048 ATG CTT M L 207 TT105 65535 ACC CAT T ? 214 TT106 65535 ACC AAG T ? 214 TT107 48095 ACC AGG t R 214 ??? 08 35774 ACC TCG t S 214 TT109 65535 ACC GTT t V 214 TT110 53546 GGG GCG G A 215 Tabla 10 Un cambio de codon en un residuo dado que no resulta en un cambio de aminoácido se conoce como una mutación silenciosa. Las mutaciones silenciosas se obtienen como éxitos debido a la expresión aumentada con relación a la enzima original, y se observaron en 37 sitios en la selección GSSM (Tabla 11, a continuación) .
Tabla 11 CTG CTT L L 202 GCG GCT A A 203 ACC ACT T T 205 CAC CAT H H 206 GGC GGT G G 208 TCG TCT S S 212 CTG CTT L L 222 GTC GTG V V 223 CGG AGG R R 226 CTC TTG L L 227 Ejemplo 10: Evolución Ejemplificante para la Tolerancia Térmica Mejorada de la Palmitasa usando la Tecnología TMCASM Las mutaciones con mejores resultados identificadas durante la evolución GSSM (Ejemplo 9, anteriormente) se evaluaron en ensayos de aceite primario y secundario para su inclusión en la evolución TMCA. Se realizaron ensayos en 5g de aceite crudo como se describe en el Ejemplo 5, pero con 10% de contenido de agua, con los 117 éxitos únicos a 25°C y 45°C. El perfil de aceite se evaluó enseguida de 24 y 48 horas de la reacción. Los éxitos primarios se sometieron a ensayos secundarios de aceite a 25°C, 45°C y 55°C. Se extrajeron alícuotas a las 3, 24, y 48 horas, para evaluar los perfiles del aceite. Los mejores resultados se muestran en la Tabla 12 a continuación con el palmitato restante en el aceite listado como un porcentaje de los ácidos grasos enlazados totales. Pare evaluar el impacto de una refinación cáustica intermedia, los ensayos a 45°C se refinaron mediante una base mediante la adición de 11% de NaOH (estimado para 7% de FFA) y se calentaron a 60°C con agitación continua. La enzima fresca se agregó al aceite refinado a un contenido de agua de 20%, se homogeneizó y la reacción del aceite procedió con agitación por 24 horas adicionales a 45°C. El contenido final de palmitato en las muestras refinadas cáusticas se muestran en a última columna, "CR 24H" De los mejores resultados mostrados en la Tabla 12, 15 mutantes (mostrados en negritas itálicas en la Tabla 12) se seleccionaron para la combinación usando la tecnología TMCA. La genoteca TMCA se construyó como se describe en la Publicación PCT Número O 2009/018449 y como se describe adicionalmente a continuación. Esta genoteca comprende 9216 variantes únicas .
Tabla 12 La tecnología de Ensamblaje Combinatorio de Sitios Múltiples, Personalizado (TMCA) , tecnología TMCA (ver la Publicación PCT No. WO 09/018449), comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos de progenie que tienen diferentes combinaciones de varias mutaciones en múltiples sitios. El método se puede realizar, en parte, por medio de una combinación de al menos una o más de las siguientes etapas: Obtención de información de secuencia de un polinucleotido ("primero" o "de plantilla") . Por ejemplo, la primera secuencia o secuencia de- plantilla pueden ser de una cepa natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) o una secuencia mutada. La información de secuencia puede ser del polinucleotido completo (por ejemplo, un gen o un marco de lectura abierto) o de regiones parciales de interés, tal como una secuencia que codifica un sitio para unión, especificidad de unión, catálisis, o especificidad de substrato .
Identificación de tres o más mutaciones de interés a lo largo de la secuencia del primer polinucleotido o polinucleotido de plantilla. Por ejemplo, las mutaciones pueden ser en 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 ó más posiciones dentro de la primera secuencia o secuencia de plantilla. Las posiciones se pueden predeterminar mediante posición absoluta o mediante el contexto de residuos circundantes u homología. Por ejemplo, para TMCA de polipéptidos de palmitasa, se incluyeron los cambios de aminoácidos termotolerantes , superiores, que dan como resultado un funcionamiento de enzima mejorado como mutaciones de interés. Las secuencias que flanquean las posiciones de mutación en cualquier lado pueden ser conocidas. Cada posición de mutación puede contener dos o más mutaciones, tal como para diferentes aminoácidos. Tales mutaciones se pueden identificar utilizando la tecnología de MutagénesisSM de Saturación de Sitios de Gen (GSSMSM) , como se describe en la presente y en polipéptido, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,171,820; 6,562,594; y 6,764,835.
Provisión de cebadores (por ejemplo, oligonucleótidos sintéticos) que comprenden las mutaciones de interés. En una modalidad, se proporciona un cebador para cada mutación de interés. Por consiguiente, se puede utilizar un primer polinucleótido o polinucleótido de plantilla que tiene 3 mutaciones de interés en esa posición. El cebador también se puede proporcionar como un agrupamiento o agregado de cebadores que contienen una posición degenerada de modo que la mutación de interés es el rango de cualquier nucleótido o aminoácido de origen natural, o un subconjunto de ese rango. Por ejemplo, se puede proporcionar un agrupamiento de cebadores que favorezca las mutaciones de residuos de aminoácidos alifáticos. Los cebadores se pueden preparar como cebadores delanteros o inversos, o los cebadores se pueden preparar como al menos un cebador delantero y al menos un cebador inverso. Cuando se coloquen mutaciones estrechamente juntas, puede ser conveniente utilizar cebadores que contengan mutaciones para más de una posición o combinaciones diferentes de mutaciones en posiciones múltiples.
Provisión de un polinucleotido que contiene la secuencia de plantilla. El polinucleotido primero o polinucleotido de plantilla puede ser circular, o puede ser super-enroscado, tal como un plásmido o vector para clonación, secuenciación o expresión. El polinucleotido puede ser de una sola hebra ("ADNss"), o puede ser de doble hebra ("ADNds"). Por ejemplo, el método TCMA somete la plantilla de ADNds super-enroscado ("se") a una etapa de calentamiento a 95°C durante 1 min (ver Levy, Nucleic Acid Res. , 28 (12) : e57 (i-vii) (2000)).
Adición de los cebadores al polinucleotido de plantilla en una mezcla de reacción. Los cebadores y el polinucleotido de plantilla se combinan bajo condiciones que permiten recombinar los cebadores al polinucleotido de plantilla. En una modalidad del protocolo T CA, los cebadores se agregan al polinucleotido en una sola mezcla de reacción, aunque se pueden agregar en reacciones múltiples.
Preformación de una reacción (es) de extensión de polimerasa.
Los productos de extensión (por ejemplo, como una "progenie" o "polinucleotido extendido modificado") pueden amplificarse mediante medios convencionales. Puede analizarse la longitud, secuencia, propiedades deseadas de ácido nucleico, o expresados como polipéptidos de los productos. Otros métodos de análisis incluyen hibridación in situ, selección de secuencias o selección de expresión. El análisis puede incluir una o más rondas de detección y selección para una propiedad deseada .
Los productos también se pueden transformar en una célula u otro sistema de expresión, tal como un sistema libre de células. El sistema libre de células puede contener enzimas relacionadas con replicación, reparación, recombinación, transcripción de ADN, o para traducción. Los hospederos e emplificantes incluyen células y lineas celulares de bacterias, levaduras, plantas y animales, e incluyen E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pichia pastoris y Aspergillus niger. Por ejemplo, se pueden utilizar cepas XLl-Blue o Stbl2 de E. coli como hospederos.
El método de la invención puede utilizarse con cebadores iguales o diferentes bajo condiciones de reacción para promover productos que tienen diferentes combinaciones o números de mutaciones.
Al realizar el método ejemplificante descrito anteriormente, este protocolo también proporciona uno o más polinucleótidos producidos mediante este método de evolución TMCA, el cual se puede detectar o seleccionar por una propiedad deseada. Uno o más de los polinucleótidos de progenie se pueden expresar como polipéptidos , y opcionalmente detectarse o seleccionarse por una propiedad deseada. Por consiguiente, esta modalidad del protocolo de evolución TMCA proporciona polinucleótido y los polipéptido codificados, asi como genotecas de tales polinucleótido que codifican tales polipéptidos. Esta modalidad del protocolo de evolución TMCA proporciona además la detección de genotecas detectando o seleccionando la genoteca para obtener uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen la actividad deseada.
Otra modalidad del protocolo de evolución TMCA descrito en la Publicación PCT No. WO 2009/018449 comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados. Tales métodos generalmente incluyen (a) agregar al menos tres cebadores a un polinucleótido plantilla de doble hebra en una sola mezcla de reacción, en donde al menos los tres cebadores no se superponen, y en donde cada uno de al menos tres cebadores comprende al menos una mutación diferente de los otros cebadores, en donde al menos un cebador es un cebador delantero que se puede aparear o recombinar a una hebra menos de la plantilla y al menos un cebador es un cebador inverso que se puede aparear a una hebra más de la plantilla, y (b) sometiendo la mezcla de reacción a una reacción de extensión de polimerasa para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos de al menos los tres cebadores.
Otra modalidad del protocolo de evolución TMCA descrito en la Publicación PCT No. 2009/018449 comprende un método en donde una célula se transforma con la pluralidad de productos extendidos que no han sido tratados con una ligasa. En otra modalidad de la invención, la pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos, se recupera de la célula. En otra modalidad, la pluralidad recuperada de polinucleótidos modificados extendidos se analiza, por ejemplo, expresando al menos uno de la pluralidad de polinucleótidos modificados extendidos y analizando el polipéptido expresado de la misma. En , otra modalidad, se selecciona la pluralidad de polinucleotido modificados extendidos que comprende las mutaciones de interés. En otra modalidad del protocolo de evolución TMCA, se obtiene información de secuencia respecto al polinucleotido de plantilla, y se pueden identificar tres o más mutaciones de interés a lo largo del polinucleotido de plantilla. En otra modalidad, los productos obtenidos mediante la extensión de polimerasa se puede analizar antes de transformar la pluralidad de productos modificados extendidos en una célula.
En una modalidad del protocolo de evolución TMCA, los productos obtenidos mediante la extensión de polimerasa se tratan con una enzima, por ejemplo, una enzima de restricción, tal como una enzima de restricción Dpnl, destruyendo asi la secuencia de polinucleotido de plantilla. Los productos tratados se pueden transformar en una célula, por ejemplo, una célula de E. coli. En una modalidad el protocolo de evolución TMCA, se pueden utilizar al menos dos, o al menos tres, o al menos cuatro, o al menos cinco, o al menos seis, o al menos siete, o al menos ocho, o al menos nueve, o al menos diez, o al menos once, o al menos doce, o más cebadores. En una modalidad, cada cebador comprende una sola mutación puntual. En otra modalidad, dos cebadores delanteros o dos cebadores inversos comprenden un cambio diferente en la misma posición en el polinucleotido templado. En otra modalidad, al menos un cebador comprende al menos dos cambios en diferentes posiciones en el polinucleotido templado. En aún otra modalidad, al menos un cebador comprende al menos dos cambios en diferentes posiciones y al menos dos cebadores delanteros o dos cebadores inversos comprenden un cambio diferente en la misma posición en el polinucleotido de plantilla. En una modalidad del protocolo de evolución TMCA, los cebadores delanteros se agrupan en un grupo delantero y los cebadores inversos se agrupan en un grupo inverso, independiente uno de otro, se normalizan para ser de igual concentración en el correspondiente grupo independientemente de las posiciones en el polinucleotido de plantilla, y en donde después de la normalización se agrega una cantidad igual de los cebadores delanteros e inversos a la reacción. En este método de normalización, puede predisponerse una combinación de algunas posiciones. La predisposición se puede deber a, por ejemplo, una concentración de cebador relativamente baja en una posición que contiene un solo cebador en comparación con una posición que contiene múltiples cebadores. "Predisposición posicional" se refiere a los polinucleótidos resultantes que muestran una fuerte preferencia a la incorporación de cebadores en una sola posición en relación a otras posiciones dentro de su grupo de cebadores delanteros e inversos. Esto da como resultado una combinación de polinucleótidos modificados los cuales pueden tener un alto porcentaje de mutaciones dentro de una sola posición del cebador aunque un bajo porcentaje de mutaciones en otra posición esté dentro de su grupo de cebadores delanteros o inversos. Es predisposición es desfavorable cuando la metal del TMCA es generar polinucleótidos de progenie que comprenden todas las posibles combinaciones de cambios a la plantilla. La predisposición se puede corregir, por ejemplo, normalizando los cebadores cuando un agrupamiento en cada posición es igual.
En una modalidad del protocolo de evolución TMCA, la normalización de cebadores se realiza organizando los cebadores en múltiples grupos dependiendo de su ubicación en el polinucleótido de plantilla, en donde los cebadores que cubren la misma región seleccionada en la plantilla están en un grupo; normalizando los cebadores agrupados dentro de cada grupo que sea de igual concentración; agrupando los cebadores dentro de un grupo en un grupo inverso y normalizando la concentración entre cada grupo de los cebadores inversos que sea igual; y agregando una cantidad igual de los cebadores delanteros e inversos agrupados en la reacción. No se ha observado ninguna predisposición para combinaciones de posiciones. En una modalidad del protocolo de evolución TMCA, se proporciona un conjunto de cebadores degenerados cada uno comprende una posición degenerada; en donde la mutación de interés es un rango de diferentes nucleótidos en la posición degenerada. En otra modalidad, se proporciona un conjunto de cebadores degenerados que comprende al menos un codón degenerado que correspondiente al menos a un codón del polinucleotido de plantilla y al menos una secuencia adyacente que es homologa a una secuencia adyacente al codón de la secuencia de polinucleótidos de plantilla. En otra modalidad, el codón degenerado es ?,?,? y codifica cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural. En otra modalidad, el codón degenerado codifica menos de 20 aminoácidos de origen natural.
Otra modalidad del protocolo de evolución TMCA descrito en la Publicación PCT No. WO 2009/018449 comprende un método para producir una pluralidad de polinucleótidos modificados que comprenden las mutaciones de interés. Tales métodos generalmente incluyen (a) agregar al menos dos cebadores a un polinucleotido de plantilla de doble hebra en una sola mezcla de reacción, en donde los al menos dos cebadores no se superponen, y en donde cada uno de los al menos dos cebadores comprenden al menos una mutación diferente de (los) otro(s) cebador (es), en donde al menos un cebador es un cebador delantero que se puede aparear o recombinar a una hebra menos de la plantilla y al menos un cebador es un cebador inverso que se puede aparear o recombinar a una hebra más de la plantilla, (b) someter la mezcla de reacción a una reacción de extensión de polimerasa para dar una pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos de los al menos dos cebadores, (c) tratar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos con una enzima, destruyendo asi el polinucleótido de plantilla, (d) transformar los polinucleotidos modificados extendidos que no han sido tratados con una ligasa en una célula, (e) recuperar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos de la célula, y (f) seleccionar la pluralidad de polinucleotidos modificados extendidos que comprende las mutaciones de interés .
En este ejemplo, las 15 mutaciones seleccionadas para su inclusión en la genoteca TMCA tolerante térmica, se muestran en la Tabla 13, más adelante. Se utilizaron seis plantillas de ADN: SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R (parental) , parental con mutación E95K, parental con mutación P162G, parental con mutación P162K, parental con mutación E95K & P162G, y parental con mutaciones E95K & P162G, y parental con mutación E95K & P162K. Los plásmidos del parental con mutación E95K, parental con mutación P162G, parental con mutación P162K, se pasaron a través de células competentes XLlBlue de E. coli para metilar el ADN . Se realizaron seis evoluciones TMCA separados, una para cada una de las seis plantillas en combinación con los oligos listados en la Tabla 14 posterior.
Tabla 13: Tabla 14: Se amplificaron miembros de genotecas en el vector pDOW-kan, analizado mediante gel de agarosa, y tratado con DPNI. Las muestras se transformaron entonces en células competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y secuenciaron . Los resultados de secuenciación indicaron que la mutación E116L y las mutaciones en los aminoácidos 144, 149 y 150 estuvieron poco representados en comparación con el máximo teórico. Por lo tanto, se creó otra genoteca TMCA utilizando una mezcla normalizada de todas las seis plantillas. Las reacciones TMCA se repitieron utilizando todos los oligos listados en la Tabla 14, excepto aquéllos para las mutaciones E116I y E116N. La cantidad de cebadores utilizados para la mutación E116L y para la región 4 (aminoácidos 144, 149 & 150) se duplicó. Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa, y se trataron con DPNI. El ADN muestra se transformó en células competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y se secuenciaron. La incorporación de mutaciones en los aminoácidos 144 , 149, y 150 se mejoró aunque el E116L estuvo todavía poco representado en comparación con el máximo teórico. El ADN de ambas genotecas se transformó en las células competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se agruparon y el ADN se preparó utilizando el kit mini-prep Qiagen. El ADN se utilizó entonces para transformar células pompetentes de Pseudomonas fluorescens . Las células se hicieron crecer en medios LB suplementados con uracilo (750 µ?/ml) y kanamicina (50 pg/ml) . Se obtuvo un número suficiente de colonias para sobre-muestrear la genoteca 10 veces. La genoteca se sobre-muestreó diez veces para explicar la sub-representación .
La genoteca TMCA termotolerante resultante se hizo crecer en medios mínimos M9 suplementados con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 pg/ml) y se detectó utilizando el modelo HTP descrito en el Ejemplo 3, anterior. La genoteca se incubó a 60°C durante 30 minutos antes y después de la adición de UMB-Palmitato. Las placas de 384 pozos se leyeron entonces con excitación a 365 nm y emisión a 460 nm. Cada placa se enfrió rápidamente mediante centri ugación y el espectrofotómetro se pre-calentó para minimizar artefactos en las lecturas. Los valores de fluorescencia a través de cada placa de 384 pozos se muestran. Se identificaron modelos como aquéllos que tienen >2 desviaciones estándar por arriba del control positivo (mutación única E116L) . Un HTP secundario detecta los modelos de un HTP primario evaluado a dos temperaturas de 60°C y 63°C. Los modelos secundarios se definieron como >4 desviaciones estándar por arriba del control positivo promedio en la placa a 63°C y mantiene >50% de actividad entre 60°C y 63°C.
Se identificaron 318 modelos del HTP secundario únicos de secuencias. Estos modelos contienen entre 2 y 9 mutaciones. Se realizaron ensayos estándar con 5 g de petróleo crudo (como se describe en el Ejemplo 5) con Usados clarificados de las 318 modelos. Uno de los 318 modelos de HTP secundario, aquéllos que reducen el palmitato más efectivamente en las temperaturas elevadas (45°C ó 60°C) que a 25°C en el ensayo de petróleo, se eligieron como "modelos de petróleo" de tolerancia térmica. Se identificaron 57 modelos de petróleo de tolerancia térmica primaria y se caracterizaron mediante ensayos de petróleo adicionales (ver las Tablas 15 y 16, más adelante) . Además se realizaron ensayos de petróleo de 5 g en 9 modelos de petróleo que tuvieron perfiles preferidos de desempeño de temperatura además de niveles variables de actividad total (ver la Tabla 17, más adelante) .
Tabla 15: « Aciertos en tolerancia térmica 29, 40, 41 y 74 también contienen mutaciones adicionales (ver las mutaciones adicionales listadas en la Tabla 16, abajo) Tabla 16: Las mutaciones adicionales también contenidas en los aciertos en tolerancia térmica 29, 40, 41 y 74 Tabla 17: Ejemplo 11: Evolución Ejemplificante para la Expresión Mejorada de Palmitasa utilizando Tecnología TMCASM Las 37 mutaciones silenciosas individuales identificadas durante la detección GSSM (ver la Tabla 11, Ejemplo 9, anterior) se evaluaron para expresión (Ver Tabla 18, más adelante) . Se expresaron cultivos de 50 mL en medios M9, suplementados con uracilo y kanamicina, en matraces de 250 mL. Se hicieron crecer modelos a 30°C durante 16 a 20 horas antes y después de la inducción con IPTG 0.3 mM. Las células se recolectaron mediante centrifugación y se Usaron con B-PER™ (número de catálogo 78248, Pierce Protein Research Products, Rockford, IL) . Una porción del lisado completo se centrifugó hasta clarificarse. Tanto el lisado de células completo como los Usados clarificados se ensayaron para una concentración de proteina total utilizando el Ensayo de Proteina Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) basado en el método Bradford, y para actividad en el substrato fluorogénico UMB-Palmitato, y por consiguiente SDS-PAGE. Los valores se normalizaron con el valor parental establecido a 100%. Se identificaron 16 modelos que demuestran actividad incrementada sobre el progenitor) .
Tabla 18 5 10 15 20 25 Las 11 mutaciones silenciosas individuales superiores (Tabla 19, más adelante) se combinaron utilizando tecnología TMCA, como se describe en la Publicación PCT Número WO 2009/018449 y descrita aú i más posteriormente) .
Tabla 19 Para la evolución TMCA, se utilizaron cuatro plantillas de ADN: (1) Palmitasa "Parental A" (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) , (2) Palmitasa "Parental B" (Parental A con mutaciones adicionales (GGC)45(GGA) y (CTG) 117 (CTT) ) , (3) Palmitasa "Parental C" (Parental A con mutación adicional (GGC) 5 (GGA) ) , y (4) "Parental D" (Parental A con mutación adicional (CTG) 117 (CTT) ) . Nota: Las mutaciones se listan proporcionando el codón original, seguido por el número de posición del aminoácido modificado, seguido por el nuevo codón. Por ejemplo, (GGC)45(GGA) indica que el codón para la posición de aminoácido 45 de la SEQ ID NO: 2, se cambió de (GGC) a (GGA) .
Una primera ronda de reacciones TMCA se completó con cada una de las cuatro plantillas de ADN y los cebadores para regiones 1 y 4 (ver la Tabla 20, posterior; región 1: aminoácido 35; región 4: aminoácidos 183 y 188) creando asi cuatro sub-genotecas. Los productos de la sub-genoteca se purificaron utilizando el kit de limpieza Qiagen PCR. Cada sub-genoteca, que contiene una mezcla de productos purificados y por lo tanto, que contiene múltiples plantillas, se utilizó entonces en una sola segunda reacción TMCA por sub-genoteca con cebadores para regiones 2 y 3 (ver la Tabla 21, posterior; región 2: aminoácidos 102 y 108; región 3: aminoácidos 124, 126, 128 y 133) .
Tabla 20 Tabla 21 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizan mediante gel de agarosa, se tratan con DPNI y luego se transforman en células competentes de E. coli XLIBlue. Las colonias se hicieron crecer, se recolectaron y se secuenciaron . Las colonias se agruparon y se preparó ADN para cada sub-genoteca utilizando el kit mini-prep Qiagen (Catálogo # 27106, Qiagen, Valencia, CA) . Las células competentes de Pseudomonas fluorescens se transformaron entonces con el ADN. Las células se hicieron crecer en medios LB suplementados con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 pg/ml) . Se obtuvo un número suficiente de colonias para un sobre-muestreo de siete veces de la genoteca (al menos 14,000 colonias).
La genoteca se colocó en filas, se hizo crecer en medios mínimos M9 suplementados con uracilo (750 µg/ml) y kanamicina (50 µg ml) y se ensayaron con palmitato de 4-metilumbeliferilo 400 µ? en HEPES 80 mM a pH 7.5. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 54 °C antes y después de la adición del substrato. La fluorescencia se leyó a Ex360nm & Em465nm. Las 46 muestras de mutación silenciosa produjo secuencias únicas (ver la Tabla 22, más adelante) . La lectura de fluorescencia para cada una de las 46 muestras de mutación silenciosa también se lista en la Tabla 22, primera columna "Actividad UMB". Las muestras 2, 7, 9, 10, 13, 16, 23, 25, 40, y 44 de mutación silenciosa tuvieron cambios de aminoácidos (AA) además de las mutaciones silenciosas (ver la Tabla 23, más adelante) .
Tabla 22 (continuación) Tabla 23 Las 46 muestras de mutación silenciosa únicas se hicieron crecer en matraces de agitación de 250 mL. Se cuantificaron los lisados clarificados utilizando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) basado en el método Bradford y luego se normalizaron para expresión de proteína total. La expresión se analizó mediante SDS-PAGE.
El control negativo parental (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) , y 4 modelos de mutación silenciosa superiores se expresaron a escala 1L. Cada muestra se lisó mediante un microfluidificador o en la presencia del detergente BPER. Se cuantificaron los lisados crudos y clarificados de la concentración de proteina utilizando el Ensayo de Proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) basado en. el método Bradford. Cada línea del gel SDS-PAGE se cargó entonces con proteína total igual. Se observaron niveles similares de palmitasa bajo todas las condiciones de solubilidad y lisis analizadas. Los modelos 26, 34, 35 y 37 de mutación silenciosa (Tablas 22 y 23, anteriores) muestran un mayor porcentaje de expresión de la palmitasa, en comparación con el progenitor (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) . El modelo 35 de mutación silenciosa tuvo el porcentaje más alto de expresión de palmitasa. El modelo o acierto 35 de mutación silenciosa tuvo las siguientes siete mutaciones silenciosas en comparación con el progenitor: (GCG) 35 (GCT) , (GTG) 102 (GTT) , (AGC) 108 (AGT) , (CTG) 117 (CTT) , (CGG) 126 (AGG) , (AGT) 133 (TCT) , y (ACC) 188 (ACG) . Ejemplo 12 : Evolución Ejemplificante para Expresión Mejorada de Palmitasas Tolerantes Térmicas Para evaluar la expresión de los 9 candidatos de palmitasas tolerantes, térmicas, líderes (Ejemplo 10, Tablas 15, 16, y 17), las 7 mutaciones silenciosas superiores (Ejemplo 11) se incorporaron en cada líder tolerante térmico como se describe más adelante. El resultado fue que cada líder tolerante térmico (Modelos o aciertos 29, 40, 41, 74, 81, 202, 204, 238, y 244 de tolerancia térmica) tuvo las siguientes mutaciones silenciosas incorporadas (35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, ¦ 126AGG, 133TCT, 188ACG) en cada una. Con las mutaciones silenciosas incorporadas, cada líder tolerante térmico se renombró agregando "SM" al extremo del número de modelo o acierto tolerante térmico. Por ejemplo, el modelo 29 tolerante térmico con las mutaciones silenciosas incorporadas se renombró "29 SM" . Asimismo, el modelo 40 se volvió "40 SM", el modelo 41 se volvió "41 SM", el modelo 74 se volvió "74 SM", el modelo 81 se volvió "81 SM", el modelo 202 se volvió "202 SM", el modelo 238 se volvió "238 SM", y el modelo 244 se volvió "244 SM".
Con el fin de incorporar las 7 mutaciones silenciosas superiores en los 9 líderes tolerantes térmicos, se utilizó la tecnología TMCA que se describe en la Publicación PCT Número WO 2009/018449 y que se describe posteriormente.
Para la primera ronda de evolución TMCA, los 9 líderes tolerantes térmicos superiores y el modelo de expresión líder (mutación silenciosas modelo #35) se pasaron a través de células competentes XLIBlue de E. colí con el fin de metilar el ADN. La mutación silenciosa modelo #35 se utilizó como la plantilla de ADN. Los oligos listados en la Tabla 24 posterior se utilizaron para incorporar combinaciones de mutaciones en la plantilla de ADN.
Las muestras se amplificaron en el vector pDO -kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en células competentes XLIBlue de E. coli. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y se secuenciaron . La secuenciación identificó varias combinaciones de mutaciones. Sin embargo, algunas combinaciones estuvieron poco representadas. Por lo tanto, alguno de los nuevos constructos de la primera ronda de evolución TMCA se seleccionó para utilizarse como plantillas para la siguiente ronda de evolución TMCA. Las plantillas utilizadas se listan Las combinaciones de plantillas y oligos utilizados en la segunda ronda de evolución TMCA se listan en la Tabla 26 posterior. Una reacción TMCA separada se corrió para cada hilera en la Tabla 26, creando una genoteca individual para cada hilera. Por ejemplo, una corrida consistió de la plantilla F8 y los cebadores 2For y 7 Rev. Una segunda corrida consistió de la plantilla F8 y los cebadores 2For y 6 Rev. Nota, se utilizaron varios de los mismos cebadores como en la primera ronda. Dos cebadores adicionales se ordenaron para la segunda ronda de PCR. Estos oligos se nombraron 116LF y 162F. El oligo 116LF tiene la secuencia inversa y complementaria del oligo 4-Alt2-RevJC . El oligo 162F tiene la secuencia inversa y complementaria de 5-RevJC.
Tabla 26 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI . Las muestras se transformaron en células competentes XLlBlue de E. coli. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y se secuenciaron . La secuenciación identificó una representación suficientemente alta de 7 de los 9 constructos deseados. Sin embargo, como los otros dos constructos estuvieron poco representados, y se requirió una ronda adicional de evolución TMCA para obtener los líderes tolerantes térmicos en combinación con las siete mutaciones silenciosas. Se utilizaron dos nuevos constructos como plantillas para la tercera ronda de evolución TMCA. Estas plantillas utilizadas se listan en la Tabla 27 posterior. Las combinaciones de plantillas y oligos utilizados en la tercera ronda se listan en la Tabla 28 posterior. Se corrió una reacción TMCA separada para cada hilera en la Tabla 28, creando una genoteca individual para cada hilera. Por ejemplo, una corrida consistió de la plantilla F3 y cebadores 162F y 7 Rev. La segunda corrida consistió de la plantilla B5 y los cebadores 162F y 6 Rev.
Tabla 27 Tabla 28 Las muestras se amplificaron en el vector pDOW-kan, se analizaron mediante gel de agarosa y se trataron con DPNI. Las muestras se transformaron en células competentes XLlBlue de E. coli. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y se secuenciaron . Se obtuvo suficiente representación de los dos constructos restantes. Se preparó ADN para todos los constructos XLlBlue de E. coli deseados y se transformaron en células competentes de Pseudomonas fluorescens. Las células se hicieron crecer en medios LB suplementados con uracilo (750 g/ml) y kanamicina (50 µ?/???) . Las muestras se confirmaron mediante secuenciación .
Para la detección, la genoteca se hizo crecer en medios mínimos M9 suplementados con uracilo (750 µ?/p??) y kanamicina (50 pg/ml). Se realizaron ensayos de petróleo estándar cargando lisados clarificados en contenido de agua del 10% utilizando amortiguador de fosfato en ensayos de petróleo crudo a los niveles de actividad de UMB-Palmitasa listados en la columna izquierda de la Tabla 29. Los ensayos de petróleo se cargaron, se homogeneizaron y subsecuentemente se mezclaron de manera continua como para reacciones estándar, a 25°C, 45°C, y 60°C. Se agregaron alícuotas de 50 pL de NaOH al 11% en 3 y 20 horas para cada reacción de petróleo luego se homogeneizaron. Las alícuotas se removieron en 20, 44 y 68 horas y se sometieron a la extracción estándar de metanol y cloroformo y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, anterior) . El palmitato restante en el petróleo se lista para cada alícuota en la Tabla 29. El modelo o acierto 29 SM de mutación silenciosa tolerante térmica redujo dramáticamente el palmitato en todo el transcurso tiempo a 25°C (Tabla 29) .
Tabla 29 Ejemplo 13: Sal de potasio de ácido oleico que como emulsionante que permite a la enzima generar 1% de aceite de palmitato Se incubaron muestras de petróleo con oleato de potasio al 10% para evaluaron el impacto de este emulsionante en reacciones de petróleo con la palmitasa. Se cargaron lisados clarificados del Modelo 29SM o control negativo en contenido de agua del 5% en aceite pre-tratado (A y B) y ensayos de petróleo crudo (C) . Se realizó un pre-tratamiento mediante el tratamiento, calentamiento, centrifugación de la enzima y luego filtrando el petróleo para remover la goma y la fase acuosa y para reducir los ácidos grasos libres, como se describe en el Ejemplo 14, para generar un aceite de palmitato al <5% libre de goma. El aceite se homogeneizó antes y después de la adición de enzimas para asegurar emulsiones uniformes. Se pesaron 0.5 g de sal de potasio obtenido comercialmente de ácido oleico en 5 g de aceite, se mezclaron a 60°C para solubilizarse, y luego homogeneizarse . Se agregó adición caustica para la neutralización de FFA al 1% a las reacciones listadas "cauticas". Se cargaron .ensayos de petróleo con enzima, se re-homogenei zaron y subsecuentemente se mezclaron de manera continua para reacciones estándar. Las alícuotas se removieron en 3, 24, 48, 72, y 120 horas. Las alícuotas se sometieron a extracción con metanol de cloroformo y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, anterior) . El palmitato restante en el aceite se lista para cada alícuota en la Tabla 30 posterior . Los aceites pre-tratados se manipularon exitosamente a un nivel de palmitato del 1%.
Tabla 30 Ejemplo 1 : 2 kg de petróleo con centrifugación intermediaria y emulsificación de oleato logra 1% de aceite de palmitato El impacto combinado de polipéptido, una etapa de filtración intermedia, y adición de oleato de potasio para lograr 1% de aceite de palmitato, se evaluó a escala de banco. 2 kg de petróleo crudo se hizo reaccionar con 29 SM en contenido de agua del 5%. La reacción de aceite se homogeneizó durante 1 minuto con un IKA a velocidad 6 alcanzando una temperatura de 25°C. Un mezclador superior se equipó con un aparato de paletas mezclador de pintura y se mezcla la reacción del petróleo a 390 rpm. Después de 1 hora de reacción, la velocidad de mezclado se aceleró a 530 rpm. La temperatura de reacción se monitoreó y fluctuó de 21°C a 29°C con calentamiento intermitente desde un bloque de calor. Las muestras se removieron para seguir los cambios en el perfil de petróleo. Después de 28 horas, la reacción de petróleo se calentó a 66°C y se centrifugó en un analizador giroscópico (gyrotester) . La fracción de petróleo se enfrió a temperatura ambiente durante toda la noche con mezclado en aparato de paletas luego se enfrió con baño de hielo a menos de 10°C. Se agregó tierra diatomácea y los TAGS y DAGS se separaron de los ácidos grasos libres mediante filtración a través de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman. 1 kg de este aceite de palmitato reducido se utilizó para iniciar las reacciones con oleato de potasio como un emulsionante. Se agregaron 100 g de oleato de potasio al aceite. Las reacciones se calentaron a 60°C con agitación para asegurar la solubilidad. El aceite se enfrió a 23°C luego se agregaron 50 mis de enzima para lograr 5% de contenido de agua. Este aceite se homogeneizó antes y después de la adición de la enzima 29 SM para asegurar emulsiones uniformes. Las alícuotas se removieron a 6, 21, 24, 28, post-filtración, post-adición de oleato, al inicio de un nuevo ensayo y 3, 20, y 22 horas en el segundo ensayo. Las alícuotas se sometieron a extracción con metanol de cloroformo estándar y. metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, anterior) . Se listan los ácidos grasos restantes unidos en el aceite para cada alícuota en la Tabla 31, posterior. El Modelo 29 SM permitió manipular niveles de palmitato al 1% en el aceite.
Tabla 31 Ejemplo 15 : Doble Centrifugación y Filtración que produce aceite de palmitato bajo La capacidad de separar el oleato de potasio después de las reacciones de petróleo se demostró posteriormente. Se hicieron reaccionar 2 kg de petróleo crudo con 29 SM en contenido de agua del 5%. La reacción de petróleo se homogeneizó durante 1 minuto con un IKA a la velocidad 6 que logra una temperatura de 25 °C. Un mezclador superior se eguipó con un aparato de paletas mezclador de pintura y se mezcló la reacción del petróleo a 390 rpm. Después de 1 hora de reacción, la velocidad de mezclado se aceleró a 530 rpm. La temperatura de reacción se monitoreó y fluctuó de 21 °C a 29°C con calentamiento intermitente desde un bloque de calor. Las muestras se removieron para seguir los cambios en el perfil de petróleo. Después de 28 horas, la reacción de petróleo se calentó a 80°C y se centrifugó en un analizador giroscópico (gyrotester) . La fracción de petróleo se enfrió a temperatura ambiente durante toda la noche con mezclado en aparato de paletas luego se enfrió con baño de hielo a menos de 10°C. Se agregó tierra diatomácea y los TAGS y DAGS se separaron de los ácidos grasos libres mediante filtración a través de un embudo Buchner enfriado con papel Whatman. 1 kg de este aceite tratado se utilizó para iniciar las reacciones con oleato de potasio como un emulsionante. Se agregaron 50 g de oleato de potasio para lograr 5%. Esto se mezcló y se homogeneizó, se cargaron 50 mis de enzima para lograr 5% de contenido de agua y se homogeneizaron durante 1 minuto a 6 en el IKA que alcanza 26.6°C. Esta reacción de aceite se mezcló con un agitador de paletas de mezclador de pintura equipado con un mezclador superior a 400 rpm. Se utilizó bloque de calentamiento intermitente. Las alícuotas se removieron en 3, 20, 24 y en 8, 28, y 48 horas después del inicio del segundo ensayo. Las alícuotas se sometieron a extracción con metanol de cloroformo estándar y metanólisis total, seguido por análisis GC de FAME (como se describe en el Ejemplo 8, anterior) . Se listan los ácidos grasos restantes unidos en el aceite para cada alícuota en la Tabla 32, posterior. El 29 SM manejó niveles de palmitato al 1.5%. Este aceite se calentó a 85°C y se centrifugó removiendo los desechos de proteína. La fracción se enfrió a 6°C con mezclado en aparato de paletas, se agregó tierra diatomácea y el material se separó en un embudo Buchner. La filtración se continuó a 25°C.
Tabla 32 Ejemplo 16: Optimización de Codones Se diseñaron versiones optimizadas de codones para expresión en Pseudomonas fluorescens del modelo 29 SM de mutación silenciosa tolerante, térmica, líder (Ejemplo 12) mediantes dos métodos diferentes. La primera versión codones de optimizados reemplazó todos los codones en el modelo 29SM con aquéllos preferidos por la Pseudomonas fluorescens, incluyendo las 7 mejores mutaciones silenciosas incorporadas (Ejemplo 12) . Esta versión se nombró 29SM-PÍ (SEQ ID NO: 22) . El uso de codones preferidos para Pseudomonas fluorescens se determinó mediante la revisión de la Base de Datos Codon Usage disponible en línea en el sitio de internet azusa DNA Research Institute (2-6-7 Kazusa-kamatari , isarazu, Chiba 292-0818 JAPÓN, recuperada en 2009 de la dirección de internet <URL : htt : //www . kazusa . or . jp/codon/index . html>) . En particular, los patrones de uso de codones para Pseudomonas fluorescens PfO-1 (recuperada en 2009 de la dirección de internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon . cgi?species=205922>) y Pseudomonas fluorescens Pf-5 (recuperada en 2009 de la dirección de internet <URL: http: //www. kazusa . or. jp/codon/cgi-bin/showcodon . cgi ?species=220664>) , se utilizaron en el diseño de la secuencia de codones optimizados, SEQ ID NO: 22.
La segunda versión optimizada de codones también reemplazó todos los codones en el modelo 29SM con los preferidos por la Pseudomonas fluorescens, excepto los que mantuvo las 7 mutaciones silenciosas líderes (Ejemplo 11) . Esta versión se nombró 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23) . La 29S -Pf+SM (SEQ ID NO: 23) es el candidato superior por encima de la 29SM-Pf (SEQ ID NO: 22) .
SEQ ID NO: 22: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGATATCCC GGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCA GATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGACGACAACGCGA CCAGCGTGCTGCGGAAGACCTTCGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTG GGAAAAGGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCG ACCGCCTGCGCGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTAATCGTGG TCGGCTGGTCCCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGTTGGGCCACAAGGCCCC CGAACTGATCCGTATGGTCGTCACGCTCGGCTCCCCGTTCGCCGGCGACCTCC ACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCATCAACTCCCACACGGTCGAC AACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGC CGTGTGGAGCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAG CCCCGAGCAGAGCGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTT GCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA SEQ ID NO: 23: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGATATCCC GGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCT GATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGACGACAACGCGA CCAGCGTGCTGCGGAAGACCTTCGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTG GGAAAAGGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCG ACCGCCTGCGCGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTTATCGTGG TCGGCTGGAGTCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGCTTGGCCACAAGGCCCC CGAACTGATCAGGATGGTCGTCACGCTCGGCTCTCCGTTCGCCGGCGACCTCC ACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCATCAACTCCCACACGGTCGAC AACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGC CGTGTGGAGCCCGCTCGACGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAG CCCCGAGCAGAGCGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTT GCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGC CTCTGA Las secuencias de ambas versiones optimizadas de codones del gen se enviaron a DNA 2.0 Incorporated (Menlo Park, CA) para síntesis de ADN . Los genes se sintetizaron en el vector pJ201 con un sitio de restricción Spel y Xhol en cualquier lado del gen. Cuando los genes sintetizados se suministraron, las plásmidos se cortaron con enzimas de restricción. El ADN del vector pDOW- an también se cortó con las mismas enzimas de restricción y luego se trataron con fosfatasa alcalina, intestinal de ternera (New England Biolabs Product #M0290L) . Todas las muestras se purificaron con gel y se extrajeron utilizando el kit de extracción con gel QIAquick (Qiagen, Product #28706) . Los vectores e insertos se ligaron entonces utilizando el kit Roche Rapíd Ligation (Roche, Product # 11635379001) . Los productos de ligación se transformaron entonces en células competentes XLIBlue de E. coli. Las colonias se recolectaron, se hicieron crecer y se preparó ADN utilizando el kit mini-prep de Qiagen. Se confirmó la secuencia de las muestras de ADN y el ADN se utilizó entonces para transformar la Pseudomonas fluorescens .
La 29SM-Pf (SEQ ID NO: 22), 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO: 23), 29SM, el progenitor (SEQ ID NO: 2 con mutaciones D61E, R72K, y V163R) y el control de hospedero/vector se hicieron crecer entonces e indujeron en matraces de agitación de 250 mL. La concentración de Proteina en los Usados clarificados se cuantificó utilizando el Ensayo de Proteina Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) basado en el método Bradford y luego se normalizó para la expresión de proteina total. La expresión se analizó mediante SDS-PAGE, con cada linea del gel SDS-PAGE cargado con proteina total igual. Las 29SM-PÍ y 29SM-PÍ+SM tuvieron un mayor porcentaje de proteina de palmitasa expresada en comparación con 29SM y el progenitor. La 29S -Pf+SM tuvo un porcentaje ligeramente más alto de expresión de palmitasa que 29SM-Pf. La mejora en la expresión por lo tanto fue ligeramente más pronunciada en la presencia de las mutaciones silenciosas.
Se ha descrito una serie de modalidades que se proporcionan en la presente. No obstante, se entenderá que pueden hacerse varias modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance que se proporcionan en la presente. De acuerdo con esto, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (67)

REIVINDICACIONES
1. Un método para hidrolizar un aceite o grasa, caracterizado en que comprende las etapas de: (a) obtener una composición que comprende un aceite o grasa, en donde el aceite o grasa se puede hidrolizar mediante un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215 ; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; agregar el polipéptido de la etapa (a) a la composición que comprende dicho aceite o grasa en una cantidad suficiente y bajo condiciones suficientes para causar la hidrólisis del aceite o grasa, hidrolizando por consiguiente el aceite o grasa.
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha grasa o aceite hidrolizado tiene un contenido más bajo de grasas saturadas que dicho aceite o grasa antes de la hidrólisis .
3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado en que dicha grasa o aceite hidrolizado tiene un contenido más bajo de grasas trans que dicho aceite o grasa antes de la hidrólisis .
4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado en que dicho aceite o grasa comprende una aceite de algas, un aceite animal, un aceite vegetal, un aceite que tiene una composición de ácidos grasos alterados, un aceite bajo saturado, aceite de pescado o una combinación de los mismos.
5. El método de la reivindicación 4, caracterizado en que dicho aceite comprende aceite de Neochloris oleoabundans , aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de Nannochloris species, aceite de Spirulina species, aceite de Chlorophycease, aceite de Bacilliarophy, aceite de cañóla, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de avellana, otros aceites de frutos secos, aceite de cáñamo, aceite de linaza, aceite de hierba de la pradera, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de semilla de palma, aceite de cacahuate, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cártamo, aceite de sasanqua, aceite de sésamo, aceite de soya, aceite de semilla de girasol, aceite de bogol, aceite de camelia, sebo, manteca de cerdo, grasa de la mantequilla, grasa de pollo, o una mezcla de cualquiera de dichas grasas o aceites .
6. El método de la reivindicación 4, caracterizado en que el ácido graso alterado comprende aceite con un alto contenido de ácido oleico, aceite con un bajo contenido de ácido linolénico o una combinación de los mismos.
7. El método de la reivindicación 4, caracterizado en que el aceite con baja saturación comprende aceite de cañóla con un alto contenido de ácido oleico, aceite de soya con un bajo contenido de ácido linolénico, aceite de girasol con un alto contenido de ácido esteárico o una combinación de los mismos.
8. El método de la reivindicación 4, caracterizado en que el aceite de pescado comprende aceite de eulacón (Thaleichthys pacificus) , aceite de hígado de bacalao, aceite de reloj anaranjado (Hoplostethus atlanticus), aceite de sardina, aceite de arenque, y aceite de lacha (B. Tyrannus) .
9. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas grasas o aceites comprenden moléculas que tienen una estructura principal del triacilglicérido, y en donde durante dicha hidrólisis los ácidos grasos se remueven de al menos algunas de las estructuras principales del triacilglicérido.
10. El método de la reivindicación 9, caracterizado en que dichos ácidos grasos comprenden uno o más de ácido acético, butírico, caproico, caprilico, undecanoico, láurico, miristico, pentadecanoico, palmitico, margárico, esteárico, araquidico o behénico.
11. El método de la reivindicación 9, caracterizado en que dichos ácidos grasos se remueven selectivamente de una posición Snl, Sn2 o Sn3 sobre la estructura principal del triacilglicérido.
12. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho aceite o grasa está presente en un forraje o un alimento y dicha hidrólisis se realiza antes del consumo de dicho forraje o alimento por un animal o un individuo.
13. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho aceite o grasa comprende uno o más de un triacilglicerol, un diacilglicerol, o un monoacilglxcerol, y en donde dicho polipéptido de , la etapa (a) se contacta con dicho aceite o grasa bajo condiciones en donde dicho polipéptido hidroliza uno o más de dichos triacilglicerol, diacilglicerol o monoacilglicerol .
14. El método de la reivindicación 13 caracterizado en que dicha hidrólisis provoca que disminuya la cantidad de triacilglicerol , diacilglicerol o monoacilglicerol en la composición.
15. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que el aceite o grasa comprende un éster de glicerol de un ácido graso poliinsaturado.
16. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha grasa o aceite hidrolizado comprende cualquiera o más de un aceite o grasa bajo saturada, un aceite o grasa no trans, un lipido que contiene ácidos grasos esenciales, un lipido que contiene ácidos grasos monoinsaturados , un lipido que contiene fosfo-colina , un lipido que contiene fosfo-serina, un lipido que contiene un fitosterol, un 1,3-diacilglicérido, un 2-monoacilglicérido, y un triacilglicérido.
17. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicha composición comprende una composición de dieta basada en leche o vegetales, en donde el polipéptido puede hidrolizar el aceite o grasa en la composición, reduciendo por consiguiente su contenido de grasa.
18. Un método para la síntesis biocatalítica de un lipido estructurado caracterizado en que comprende las siguientes etapas: proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q E116 ; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; poner en contacto el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Sn2 del triacilglicérido (TAG) , produciendo por consiguiente un 1 , 3-diacilglicérido (DAG) ; (d) proporcionar un éster Rl; (e) proporcionar una hidrolasa especifica a Rl, y (f) poner en contacto el 1,3-DAG de la etapa (c) con el éster Rl de la etapa (d) y la hidrolasa especifica a Rl de la etapa (e) bajo condiciones en donde la hidrolasa especifica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente el lipido estructurado.
19. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que la hidrolasa especifica a Rl es una lipasa especifica a Sn2.
20. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que el lipido estructurado se selecciona del grupo que consiste de un alternativo de manteca de cacao (CBA) , una manteca de cacao sintética, una manteca de cacao natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1, 3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS) , l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) y l-oleoil-2, 3-dimiristoilglicerol (OMM) .
21. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que dicho éster Rl comprende un ácido graso de menor saturación que dicho residuo de acilo hidrolizado.
22. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que dicho éster Rl puede comprender uno o más de un ácido graso omega-3, un ácido graso omega-6, un ácido graso omega-9, un ácido graso mono-insaturado, un f"osf"o-grupo, un éster de fitosterol, u orizanol.
23. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que dicho éster Rl comprende un radical seleccionado del grupo que consiste de ácido alfa-linolénico, ácido estearidónico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol, coumestrol, y dietilstilbestrol .
24. El método de la reivindicación 18, caracterizado en que dicho lipido estructurado sintetizado tiene un contenido más bajo de grasas saturadas que dicho triacilglicérido .
25. El método de la reivindicación 18 caracterizado en que dicho lipido estructurado sintetizado tiene un contenido más bajo de grasas trans que dicho triacilglicérido.
26. Un método para la síntesis biocatalítica de un lipido estructurado, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225 ; A225Q, o una combinación de las mismas; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG) , produciendo por consiguiente un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover la migración del acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, produciendo por consiguiente un 1,3-DAG.
27. El método de la reivindicación 26 caracterizado en que comprende la etapa adicional de proporcionar un éster Rl y una lipasa específica a Rl, y contactar el 1,3-DAG de la etapa (d) con el éster Rl y la lipasa específica a Rl bajo condiciones en donde la lipasa específica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente un lipido estructurado.
28. El método de la reivindicación 27, caracterizado en que dicha lipasa especifica a Rl es una lipasa especifica a Snl o una lipasa especifica a Sn3.
29. El método de la reivindicación 27, caracterizado en que dicho lipido estructurado se selecciona del grupo que consiste de un alternativo de manteca de cacao (CBA) , una manteca de cacao sintética, una manteca de cacao natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1 , 3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS) , l-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) o l-oleoil-2, 3-dimiristoilglicerol (OMM) .
30. El método de la reivindicación 27, caracterizado en que dicho éster Rl comprende un ácido graso de menor saturación que dicho residuo de acilo hidrolizado.
31. El método de la reivindicación 30, caracterizado en que dicho éster Rl puede comprender uno o más de un ácido graso omega-3, un ácido graso omega-6, un ácido graso mono-insaturado, un fosfo-grupo, un éster de fitosterol, y orizanol .
32. El método de la reivindicación 30, caracterizado en que dicho éster Rl comprende un radical seleccionado del grupo que consiste de ácido alfa-linolénico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosahexaenoico, ácido gamma-linolénico, ácido dihomo-gamma-linolénico, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol, coumestrol, dietilstilbest rol , y orizanol.
33. El método de la reivindicación 26, caracterizado en que la etapa (d) comprende además utilizar resinas de intercambio iónico.
34. El método de la reivindicación 26, caracterizado en que dichas condiciones cinéticamente controladas de la etapa (d) comprenden condiciones de no equilibrio que dan como resultado la producción de un producto terminado que tiene mayor que una proporción 2:1 de 1,3-DAG a 2,3-DAG.
35. El método de la reivindicación 27, caracterizado en que dicho lipido estructurado sintetizado tiene un contenido más bajo de grasas saturadas que dicho triacilglicérido .
36. El método de la reivindicación 27, caracterizado en que dicho lipido estructurado sintetizado tiene un contenido más bajo de grasas trans que dicho triacilglicérido.
37. Un método para catalizar una reacción de interesterificación para producir nuevos triacilglicéridos , caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de lipasa 1,3- especifica, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que tiene una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S L180E; E194M; A211Q S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; (b) proporcionar una mezcla de triacilglicéridos y ácidos grasos libres; (c) tratar la composición de la etapa (b) con el polipéptido bajo condiciones en donde el polipéptido puede catalizar el intercambio de ácidos grasos libres con los grupos acilo de los triacilglicéridos, produciendo por consiguiente nuevos triacilglicéridos enriquecidos en dichos ácidos grasos.
38. El método de la reivindicación 37, caracterizado en que dicha composición de la etapa (b) comprende 1,3-dipalmitoil-2-monoleina (POP) y los nuevos triacilglicéridos de la etapa (c) comprenden una o ambas de l-palmitoil-3-estearoil-2-monoleina (POSt) y 1, 3-distearoil-2-monoleina (StOSt) .
39. El método de la reivindicación 37, caracterizado en que dichos nuevos triacilglicéridos de la etapa (c) tienen un contenido más bajo de grasas saturadas que dicho triacilglicéridos de la etapa (b) .
40. El método de la reivindicación 37, caracterizado en que dichos nuevos triacilglicéridos de la etapa (c) tienen un contenido más bajo de grasas trans que dicho triacilglicéridos de la etapa (b) .
41. Un método de interesterificación para preparar un alimento, forraje o un aceite, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una mezcla de reacción de interesterificación que comprende un material fuente de ácido esteárico seleccionado del grupo que consiste de ácido esteárico, monoésteres del ácido esteárico de alcoholes monohidricos de bajo peso molecular y mezclas de los mismos, (b) proporcionar un alimento, forraje o un aceite que contiene un triacilglicérido; (c) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194 ; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W A218H; A218S; V223A; A225M; ¦ A225Q, o una combinación de las mismas; (d) interesterificar el material fuente de ácido esteárico y el triacilglicérido del alimento, forraje, o aceite, y (e) separar los componentes de ácidos grasos libres de los componentes del glicérido interesterificado de la mezcla de interesterificación para proporcionar un producto de aceite interesterificado y una mezcla de ácidos grasos que comprende ácidos grasos, monoésteres de ácidos grasos, o mezclas de los mismos liberados del alimento, forraje o aceite.
42. El método de la reivindicación 41, caracterizado en que dicha reacción de interesterificación se continúa hasta que haya un equilibrio sustancial de los grupos éster en las posiciones 1-, 3- del componente glicérido con componentes del ácido graso no glicérido de la mezcla de reacción.
43. El método de la reivindicación 41, caracterizado en que comprende la etapa adicional de hidrogenar la mezcla de ácidos grasos.
44. El método de la reivindicación 41, ' caracterizado en que dichos triacilglicéridos interesterificados tienen un contenido más bajo de grasas saturadas que dicho triacilglicéridos de la etapa (b) .
45. El método de la reivindicación 41, caracterizado en que dichos triacilglicéridos interesterificados tienen un contenido más bajo de grasas trans que dicho triacilglicéridos de la etapa (b) .
46. Un método para producir un DAG, el método caracterizado en que comprende las etapas de (a) proporcionar una composición de aceite que comprende una cantidad de TAG, (b) proporcionar un' polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3 o Tabla 4, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116 ; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; (c) poner en contacto dicha composición de aceite de la etapa (a) con dicho polipéptido de la etapa (b) bajo condiciones suficientes para que el polipéptido hidrolice un residuo de acilo en el TAG para formar un DAG.
47. El método de la reivindicación 46, caracterizado en que dicho polipéptido es especifico a Sn2 y dicho DAG es un 1,3-DAG.
48. El método de la reivindicación 46 caracterizado en que dicho polipéptido es especifico a Snl o Sn3 y dicho DAG es un 1,2-DAG o un 2,3-DAG.
49. El método de la reivindicación 46, caracterizado en que dicho residuo de acilo comprende un ácido graso saturado y dicho DAG es una grasa menos saturada que dicho TAG.
50. El método de la reivindicación 46, caracterizado en que dicho residuo de acilo comprende un ácido graso trans y dicho DAG es una grasa trans más baja que dicho TAG.
51. Una composición caracterizada en que comprende un aceite o grasa hidrolizada mediante el método de la reivindicación 1.
52. La composición de la reivindicación 51, caracterizada en que dicha composición se selecciona de una margarina, una materia grasa, una mayonesa, un aderezo vertible, un aderezo aplicable con cuchara, una salsa, un adobo, un condimento, un aceite en aerosol, un aceite de cocina, un aceite de freidura, una aceite para ensaladas, golosinas, un alternativo de manteca de cacao, un sustituto de manteca de cacao, un sustituto de manteca de cacao, un equivalente de manteca de cacao, un alimento, un aditivo para alimentos, o cualquier intermedio de fabricación para cualquiera de lo anterior.
53. Un método para hidrolizar un aceite o grasa caracterizado en que comprende reaccionar el aceite o grasa con una enzima palmitasa en presencia de un emulsificador que tiene HLB mayor que 12, en donde la enzima palmitasa se codifica mediante una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 y que tiene i) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácidos en la posición 95 (o el equivalente de la misma) como se establece en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) que codifican los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o el equivalente de las mismas) como se establece en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácidos en la posición 83 (o el equivalente de la misma) como se establece en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG.
54. El método de la reivindicación 53, caracterizado en que la secuencia de ácidos nucleicos es la secuencia de la SEQ ID N0:1 y que tiene i) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácidos en la posición 95 (o el equivalente de la misma) como se establece en la Tabla 9, ii) cambios de nucleótidos (o el equivalente de los mismos) que codifican los residuos de aminoácidos en las posiciones 85 y 172 (o el equivalente de las mismas) como se establece en la Tabla 15, iii) un cambio de nucleótido (o el equivalente del mismo) que codifica el residuo de aminoácidos en la posición 83 (o el equivalente de la misma) como se establece en la Tabla 16, y iv) las siguientes mutaciones silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, y 188ACG.
55. El método de la reivindicación 53 o 54, caracterizado en que el emulsificador se selecciona de oleato de sodio, oleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, linolenato de sodio, linolenato de potasio, laureato de sodio, laureato de potasio, estearato de sodio, estearato de potasio, palmitato de sodio, palmitato, de potasio, palma oleato de sodio, palma oleato de potasio o una combinación de los mimos.
56. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53-55, caracterizado en que la reacción se conduce en aproximadamente 20 hasta 70°C.
57. El método de la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 53-56, caracterizado en que la mezcla de reacción comprende aproximadamente 1 hasta 20% de agua con base en el peso total de los reactantes.
58. El método de la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 53-57, caracterizado en que la reacción produce un aceite o grasa que comprende aproximadamente 5% de palmitato con base en el peso total del aceite o grasa.
59. El método de la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 53-57, caracterizado en que la reacción produce un aceite o grasa que comprende aproximadamente 1% de palmitato con base en el peso total del aceite o grasa.
60. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53- 59, caracterizado en que el aceite es aceite refinado.
61. El método de cualquiera de las reivindicaciones 53- 60, caracterizado en que la reacción comprende además la adición de un fosfolipido.
62. Un método para hidrolizar un aceite o grasa caracterizado en que comprende las etapas de: (a) obtener una composición que comprende un aceite o grasa, en donde el aceite o grasa se puede hidrolizar mediante un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recorabinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, , Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q E116 ; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; agregar el polipéptido de la etapa (a) a la composición que comprende dicho aceite o grasa en una cantidad suficiente y bajo condiciones suficientes para provocar la hidrólisis del aceite o grasa, hidrolizando por consiguiente el aceite o grasa.
63. Un método para la síntesis biocatalítica de un lipido estructurado, caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) poner en contacto el polipeptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Sn2 del triacilglicérido (TAG) , produciendo por consiguiente un 1 , 3-diacilglicérido (DAG) ; (d) proporcionar un éster Rl; (e) proporcionar una hidrolasa especifica a Rl, y (f) contactar el 1,3-DAG de la etapa (c) con el éster Rl de la etapa (d) y la hidrolasa específica a Rl de la etapa (e) bajo condiciones en donde la hidrolasa específica a Rl cataliza la esterificación de la posición Sn2, produciendo por consiguiente el lípido estructurado.
64. Un método para la síntesis biocatalítica de un lípido estructurado caracterizado en que comprende las siguientes etapas : (a) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194 ; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; (b) proporcionar una composición que comprende un triacilglicérido (TAG) ; (c) contactar el polipéptido de la etapa (a) con la composición de la etapa (b) bajo condiciones en donde el polipéptido hidroliza un residuo de acilo en la posición Snl o Sn3 del triacilglicérido (TAG) , produciendo por consiguiente un 1,2-DAG o 2,3-DAG; y (d) promover la migración del acilo en el 1,2-DAG o 2,3-DAG de la etapa (c) bajo condiciones cinéticamente controladas, produciendo por consiguiente un 1,3-DAG.
65. Un método para catalizar una reacción de interesterificación para producir nuevos triacilglicéridos caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una composición que comprende un polipéptido que tiene una actividad de lipasa 1, 3-especifica, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes que tiene una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, ¦ Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO : 1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P;V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; proporcionar una mezcla de triacilglicéridos y ácidos grasos libres; tratar la composición de la etapa (b) con el polipéptido bajo condiciones en donde el polipéptido puede catalizar el intercambio de ácidos grasos libres con los grupos acilo de los triacilglicéridos, produciendo por consiguiente nuevos triacilglicéridos enriquecidos en dichos ácidos grasos.
66. Un método de interesterificación para preparar un alimento, forraje o un aceite caracterizado en que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una mezcla de reacción de interesterificación que comprende un material fuente de ácido esteárico seleccionado del grupo que consiste de ácido esteárico, monoésteres del ácido esteárico de alcoholes monohidricos de bajo peso molecular y mezclas de los mismos, (b) proporcionar un alimento, forraje o un aceite que contiene un triacilglicérido; (c) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:l y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E1.16V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; (d) interesterificar el material fuente de ácido esteárico y el triacilglicérido del alimento, forraje, o aceite, y (e) separar los componentes de ácidos grasos libres de los componentes del glicérido interesterificado de la mezcla de interesterificación para proporcionar un producto de aceite interesterificado y una mezcla de ácidos grasos que comprende ácidos grasos, monoésteres de ácidos grasos, o mezclas de los mismos liberados del alimento, forraje o aceite.
67. Un método para producir un DAG, el método caracterizado en que comprende las etapas de (a) proporcionar una composición de aceite que comprende una cantidad de TAG, (b) proporcionar un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, dicho polipéptido que se selecciona del grupo que consiste de polipéptidos aislados, sintéticos y recombinantes que tienen una actividad de hidrolasa y dicho polipéptido ya sea i. que se codifica mediante ya sea (1) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más, o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica al menos un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa, o (2) un ácido nucleico que comprende una secuencia que hibridiza bajo condiciones rigurosas a un ácido nucleico que comprende la SEQ ID N0:1 y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos base establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una actividad de hidrolasa; o ii. que tiene al menos 50% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 2 sobre una región de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o más o todos los cambios de residuos de aminoácidos establecidos en la Tabla 3, Tabla 4, Tabla 9, Tabla 10, Tabla 11, Tabla 16 o Tabla 23, o iii. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de las modificaciones del residuo de aminoácidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinación de las mismas, o iv. que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 pero que también comprende al menos una de .las modificaciones del residuo de aminoácidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194 ; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215 ; A218H; A218S; V223A A225M; A225Q, o una combinación de las mismas; poner en contacto dicha composición de aceite de la etapa (a) con dicho polipéptido de la etapa (b) bajo condiciones suficientes para que el polipéptido hidrolice un residuo de acilo en el TAG para formar un DAG. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan hidrolasas, incluyendo lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas, y polinucleotidos que las codifican, y métodos para producir y utilizar estos polinucleotidos y polipéptidos . Se proporcionan además polipéptidos , por ejemplo, enzimas, que tienen una actividad de hidrolasa, por ejemplo, lipasas, saturasas, palmitasas y/o estearatasas y métodos para preparar aceites con bajas grasas saturadas o bajas grasas trans, tales como aceites vegetales o animales con bajas grasas saturadas o bajas grasas trans, por ejemplo, aceites de soya o de cañóla.
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