MX2010008847A - Metodos para el tratamiento y prevencion de disfuncion retinal relacionada con la edad. - Google Patents

Abstract

Un método de tratamiento o prevención de disfunción retinal relacionada con la edad involucra la administración a un paciente de una cantidad farmacéuticamente efectiva de un derivado de retinal sintético, repetidamente en una duración de por lo menos aproximadamente tres meses. Los derivados de retinal sintéticos efectivos incluyen ésteres de 9-cis-retinilo, ésteres de 11-cis-retinilo, derivados y congéneres de los mismos, y combinaciones de los mismos. Los sustituyentes adecuados de éster incluyen carboxilatos de ácidos monocarboxilicos de C1 a C10 y ácidos policarboxílicos de C2 a C22.

Description

Golczak, M.,, Moise, A.R. & Palczewski, K. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2006),. Como jen el envejecimiento, la regeneración de la rodopsina después de la exposición a la luz es más retrasada en humanos y ratones privados de vitamina A debido ya sea a deficiencia en la dieta o absorción inadecuada en el intestino (Lamb, T.D. & Pugh, E.N., Jr. Prog Retiri Eye Res 23, 307-380 (2004)). Además, el ? I i tratamiento con vitamina A y sus derivados puede tener efectos benéficos en él envejecinjiiento (Jacobson, S.G., et al. Nat. Genet. 11, 27-32 (1995)) y, enfermedades de la retina tales como distrofia fundus de Sorbsby (Jacobson, S.G., et al. Nat. Genet. 11, 27-32 (1995)) y retinitis pigmentosa (Berson, E.L., et al. Arch. Ophthalmol. 111, 761- 772 (1993)). ¡ , , i : í La absorción, almacenamiento y reciclado retinoide, después del blanqueado de pigmentos retínales están afectados en ratones que carecen de lecitina:retin!ol acetilfransferasa (LRAT) (Imanishi, Y., Batten, M.L., Pistón, .D.V^., Baehr, W. & Palczewski, K. J Cell. Biol. 164, 373-383 (Í2Q04); Batten, M.L., et al. PLoS medicine 2, e333 (2005); Batten, M.L., et ,al. J. Biol. Chem. 279, 10422-10432 (2004); O'Byrne, S.M., et al. J..iB,iol. Chem 280, 35647-35657 (2005)) y una mutación i 1 i nula en el gen .humano LRAT resulta en el comienzo temprano de distrofia de bastones-conos (Thompson, D.A., et al. Nat. Genet. 28, '·> '·. ¦ i 123-124 (2001);)., Lo último parece una forma de amaurosis congénita humana de Leber (LCA) e la cual las mutaciones inhabilitantes en el gen específico , de epitelio de pigmento retinal de 65 kDa (RPE65) causa también disfunción severa de fotorreceptores de bastones y se manifiesta jmediantej una o más de las siguientes condiciones clínicas: un problema en la adaptación a la obscuridad mediada por bastones después de la ¡exposición a la luz, un problema en la visión nocturna, un' ¡problémaj en la sensibilidad de contrastes, y la degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

En otra¡ modalidadj aun, la presente invención proporciona un método para mejorar la proporción de regeneración de rodopsina en un mamífero, que; comprende administrar al mamífero una cantidad '; 1 ' i farmacéuticamente efectiva de un derivado retinal sintético, en donde el derivado retinal sintético se administra al mamífero durante un periodo de por lo menos tres meses. 1 i ' I Breve Descripción dé los Dibujos :: i > i Figura . ¡ Línea de, tiempo experimental para tratamiento de dosis única de ratones de 10 meses de edad con 9-czs-R-Ac y protocolos experimentales! para tratamientos de largo plazo. (A) Ratones de 1 0 meses de edad, adaptados completamente a la oscuridad (48 hr), fueron alimentados conj sonda con 9-c/s-R-Ac (-80 mg/kg de peso ; i 1 i corporal) o solución de vehículo de control . Una hora después de la aplicación de la sohda.j los ratones fueron expuestos a luz fuerte continua a 500 cd-m2 dorante 20 min (-90% rodopsina blanqueada) seguido por ¡16| hr de adaptación a la oscuridad. Los ratones fueron examinados . mediante ERG, y se analizaron para contenido de rodopsina y , retinoide. También se registraron ERGs antes del trata m iento con 9-c/s-R-Ac. Los números de ratones usados en cada l ' i uno de los análisis se muestran en la Tabla 1 . (B) Se alimentaron ratones con sonda con 9-c/s-R-Ac (-80 mg/kg de peso corporal) o I solución vehículo (aceite vegetal) una vez al mes durante 6 o 1 0 meses ' j como se describe en Métodos. (C) Un grupo de ratones fueron i examinados 2 ¡ semanas después del último tratamiento con sonda ya sea mediante : ERG o p¡ara contenido de rodopsina y retinoide, y i morfología retinal . Los números de ratones usados para cada análisis se muestran en la Tabla 1 ;.

Figura 2. Caracterización de rodopsina/opsina purificada de ratones tratados con 9-c/s-R-Ac y de control. Rodopsina y opsi na fueron co-eluidas como se describe en Métodos a partir de ratones tratados como , se describe en la Figura 1 . El nivel de regeneración de la rodopsina se calculó a partir de la proporción de absorbancia a 498 nm (opsina con el cromóforo)/280 nm (opsina total). Antes. Se muestran los espectros jde absorbencia representativos de rodopsina purificada de rátón (a) dé 10 meses de edad tratado con 9-c/s-R-Ac y ratón de control (b). La barra indica 0.02 AU. Más adelante. La proporción d;e , regeneración del grupo tratado con 9-c/s-R-Ac fue ! ligeramente mayor que la del grupo de control, indicando que el grupo tratado tenía un menor ¡nivel de opsina (a) sin ligando (libre). Se indican las medias ± S.D.

Figura 3. , Niveles de retinoide en ojos de ratones alimentados I con sonda con 9-c/'s-R-|Ac expuestos a luz intensa seguido por adaptación a';! ojscuridad ¡completa. (A) Separación por HPLC de retinoides de ratones tratados con 9-c/s-R-Ac y de control. Esteres todo-frans/retiriilo de ácidos grasos eluyeron primero (pico 1), seguidos por sin-11-c/s-retinal oxim'a (2), sin-todo-írans-retinal oxima (3), sin-9-c/'s-retinal oxima! (4), y tojdo írans-retinol (5). Las sin-retinal oximas son picos menores en el cromatograma, y un asterisco (*) indica una punta relacionada con un¡ cambio de solvente. Inset(a), una escala expandida del cromatograma muestra picos 3 y 4 que corresponden a niveles de sn-itodo-frans-retinal y s/n-9-c s-retinal oximas. Espectros en-línea de estaos oximasj se muestran más adelante (3 y 4). Se analizaron los niveles de retinoides en los ojos de ratones tratados y I de control (Figura 1A) médiante HPLC. En Métodos se describen procedimientos de extracción y derivación con hidroxilamina para : ' , i mejorar la recuperación de retínales. (B y C) Cuantificación de j retínales y éstére's. Las cantidades de ésteres 1 -c/s-retinal y todo- de edad de blanqueado retinal intenso. Grupos diferentes de ratones adaptados a la oscuridadipor 48 hr fueron blanqueados con iluminación intensa constante (500 Jd-m"2) durante 3 minutos y se monitoreó una recuperación dé amplitud de onda-a registrando ERGs instantáneos i . ; i sencillos (-0.2 log cd s m"2)en el curso de un periodo de adaptación a la i! i oscuridad de 60min. El régimen de recuperación fue significativamente mayor en ratones tratados (NI) que en los ratones de control (Cl) a los 10 meses de e : .da \ d. A 'dem iás, el tratamiento con 9-c/s-R-Ac restauró el ' j régimen de recuperación a aquel visto en ratones de 4 meses de edad. (B) Recuperación de ratones de 14 meses de edad de blanqueado 11 ' i retinal intenso.1 Un régimén de recuperación significativamente mayor ocurrió en ratones tratados (N2 y N3) versus no tratados (c2) (*, n = 5; P<0.01 y P<0.00,01, respectivamente). Otra vez, los ratones tratados mostraron la misma respuesta como lo hicieron los ratones jóvenes de 4 meses de edad! Barra dé errores están indicados (n = 5). i Figura 6. Acumulación A2E en los ojos de ratones de control y ' ! ' I tratados con 9rC/'s-R-Ac a | largo plazo. (A) Se muestran separación cromatográfica y, espectros de A2E e iso-A2E. Se muestra un cromatograma de'HPLC representativo de A2E e iso-A2E eluido de un grupo de ratones NI (panel; izquierdo en A). Inset. Áreas de elución magnificadas dé1 A2E e isoj-A2E están destacadas. Los espectros de estos picos (I y, II) representan A2E e iso-A2E, respectivamente (arriba ¦ 1 ¦ i a la derecha). (B) Se muestran cantidades de A2E (barras negras) e iso-A2E (barras grises) de diferentes grupos experimentales. Las cantidades de A2E no difieren significativamente entre todos los grupos con la excepción de N3,¡ dondé fueron ligeramente menores (P<0.05). Los niveles de iso-A2E fueron similares entre todos los grupos. Ningún compuesto fue detectado! en niveles significativos en ratones jóvenes sin tratar (C0)J Están indicadas las medias ±S.D.

Figura 7. Morfología retinal de ratones alimentados con sonda con 9-c/s-R-Ac. ' (A) Se maestra una sección transversal representativa de un ratón (CO) de 4 mesjes de edad sin tratar. RPE, epitelio pigmento retinal; PR, fpítorreceptores, ROS, segmento externo de bastón; I S , segmento inte'rnp; ONL, capa nuclear externa; OPL, capa plexiforme externa; INL, capa nuclear! interna; IPL, capa plexiforme interna; y GCL, , ' i capa celular gáriglionar. |(B) Se muestran espesores de ROS e IS y ' ' ! I número de núcleo de ONU de ratones de control y tratados a 10 y 14 meses de edad. Se g !rafic Ian puntos de datos como una función de la distancia de la cabeza del'nervio óptico (ONH). Las longitudes de los ROS e IS de ratones jóvenes de control (C0) fueron significativamente mayores que aquellas én todos los otros grupos (*, n = 5; P<0.01). No i se detectaron otras diferencias significativas. Están indicadas las medias ±S.D.

Figura 8. Análisis dé arreglos de ARN de ratones de control y tratados con 9-c/s-R-Ac aj largo, plazo. Se examinaron niveles de expresión de 37,364 genes del ojo, hígado y riñon de los dos grupos de anticuerpos cómo se describe en Métodos.

Descripción detallada dé la invención Los términos "tratar", "tratamiento" y los similares se usan en la presente para dar a entender generalmente la obtención de un efecto farmacológico fisiológico deseado. Más específicamente, los : i . i derivados retínales y sintéticos descritos en la presente que se usan para tratar un sujeto con! disfunción retinal relacionada con la edad se I proporcionan generalmente en una cantidad terapéuticamente efectiva para lograr ui 'a mejoría e!n la dísfunción retinal relacionada con la edad i o un desarrolló inhibido d'e la disfunción retinal relacionada con la edad en el sistema visual de un sujeto de edad avanzada, según comparación con un sistema visual comparable que no recibe el i derivado retinal sintético. Una mejoría en la disfunción retinal relacionada con la edad 'incluye mejoría o restauración a largo plazo (por ejem plo, medido en sjemanas o meses) de la función fotoreceptora en un sistema visual, i en comparación con un sistema visual i comparable qué 'no recibej el derivado retinal sintético. Mejoría incluye también la estabilización jde o minimización de degradación adicional en un sistema , visual de j/ertebrado, en comparación con un sistema visual de vertebrado que no recibe el derivado retinal sintético. 1 Los términos "que previene", "prevención" y los similares se usan generalmente para dar a entender que previene o que inhibe la I deterioración o deterioración adicional del sistema visual de un sujeto de edad avanzada, en comparación con un sistema visual comparable que no recibe él derivado retinal sintético.

El término "farmacéuticamente efectivo" como se usa en la presente se refiere a; la I efectividad de un régimen particular del I tratamiento o, prevención'. La eficacia farmacéutica se puede medir con - 1 I base en táles características como, por ejemplo, un régimen ' 1 incrementado o estabilizado de adaptación a la obscuridad, una proporción mayor o estabilizada de rodopsina/opsina, una proporción de regeneración de rodopsina mayor o estabilizada, u otras mejorías en respuestas eleótroretinog áficas (ERG).

En los ^presentes ¡métodos, se administra un derivado retinal sintético a un sujeto. Cor tno se usa en la presente, el término "sujeto" o "paciente" se. > rjsfiere> a un vertebrado, por ejemplo un mamífero tal como un humano. En urja modalidad, el sujeto es un sujeto de edad avanzada, tal como uni humano, que sufre de disfunción retinal relacionada con la edad! Como se usa en la presente, un sujeto : ' i ' ¡ t humano de edad avanzada es de típicamente por lo menos 45, o por lo menos 50, o por lo mends 60, o por lo menos 65 años de edad. El sujeto tiene un ojo envejecido, el cual está caracterizado por tener disfunción retinal relacionada con la edad. La disfunción retinal relacionada co'n la edad jpuede manifestarse por una o más de las siguientes condiciones clínicas: un problema en la adaptación a la obscuridad mediada por bastones después de la exposición a la luz, un problema en la visión nocturna, un problema en la sensibilidad al ,¡ ; ¦ i contraste, y degeneración macular relacionada con la edad (AMD).

El derivado: retinal sintético se administra usando regímenes de Í' ' ! dosificación a largo plazoj (crónico). En una modalidad, el derivado retinal sintético se administra de manera intermitente durante tres ' i ' 1 ! meses o más y, en otra modalidad, durante seis meses o más. El derivado retinal sintético! se puede administrar, por ejemplo, durante un periodo de aproximadamente tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o docej meses, o más prolongado. El derivado retinal sintético se p'uede administrar de manera intermitente al sujeto aproximadamente de una vez al día hasta aproximadamente una vez cada dos meses. La administración intermitente incluye administración al sujeto aproximadamente una vez cada tercer día; aproximadamente cuatro veces pór semana, tres .veces por semana y dos veces por semana; aproximadamente una vez cada dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho y hueve séma'nas; y aproximadamente una vez al mes. En una modalidad, el derivado retinal sintético se administra aproximadamente una vezjcada tres a seis semanas durante un periodo de aproximadamente tres meses o más; y en otra modalidad, se administra aproximadamente una vez al mes durante aproximadamente seis a diez meses. I La cantidad de derivado retinal sintético administrado por dosis puede ser incrementada conforme aumenta el periodo de tiempo entre las dosis. Por ejemplo, si el derivado retinal sintético se administra menos de una ez por día, jla dosis por administración puede ser mayor que la dosis diaria efectiva. Como se usa en la presente, una "dosis diaria efectiva"! se refiere a una dosis diaria efectiva para obtener un efecto farmacológico y fisiológico deseado (es decir, una dosis diaria efectiva para "tratar" y/ó "prevenir" la disfunción retinal relacionada con , ' i la edad en un sujeto como s'e describió antes).

Además, el ; derivado} retinal sintético puede ser liberado de aproximadamente 1 000 |mg del derivado retinal sintético. En otras modalidades,' se pueden administrar desde aproximadamente 1 .0 hasta aproximadamente 300 mg de derivado retinal sintético por dosis.

En ciértás modalidades, la dosis es una dosis oral de ' ' · ' I • ! I aproximadamente 0.01 mg hasta aproximadamente 1 0 mg/kg de peso corporal; de aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 7.5 mg/kg ¦ I de peso corporal ; de aproximadamente 0. 1 hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal; o de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 2. 5 mg/kg de peso corporal . Por ejemplo, el derivado retinal sintético puede ser administrado en una dosis oral de aproximadamente 6.4 j mg/kg de peso corporal (es decir, aproximadame "nl te 1 240 mg^ 1fm , de área superficial del cuerpo). En otra modalidad, la dosis es una dosis oral diaria de aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 1 mg/kg ide peso corporal , tal como una dosis oral de aproximadamente 0. 1 , 0.2 ,| 0. 3 , 0.4 , 0. 5 , 0.6 , 0.7 , 0. 8 , 0. 9 o 1 mg/kg de peso corporal . ' ' ¡ j Los derivados retínales sintéticos adecuados para los métodos de ; . ! ¡ . la presente invención se han descrito en las Publicaciones ¦ , ' I I nternacionales WO 2004/082622 A2 y WO 2006/002097 A2 y en la US 2004/0242704 A Í ' ! ' i Un derivado retinal sintético adecuado para los métodos de la ' I ' presente invención es un derivado de 9-c/s-retinal u 1 1 -c/s-retinal en ! 1 j donde el grupo aldehídico én la cadena de polieno está modificado. El derivado retinaü sintéticó puede ser convertido directa o indirectamente en un retinal o análogo de retinal sintético. Así, en algunos aspectos, · ': i ;í i cis-retinoide y/o un agonista de opsina. El derivado retinal sintético i también puede paliar los efectos de una deficiencia retinoide en el sistema visual de un yert'pbradó. El derivado retinal sintético puede ser administrado profilácticaj o terapéuticamente a un vertebrado. Los vertebrados adecuados incluyen, por ejemplo, mamíferos, tales como perros (caniríp), gatos (felino), caballos (equino) y otros animales domésticos.

En un aspecto de la invención, los derivados retí nales sintéticos son derivados de 9-c/s-retinal u 1 1 -c/s-retinal en los cuales el grupo aldehídico en : la cadenaj de polieno se convierte a un éster, éter, alcohol, hemi-acetal, acetal u oxima, como se describe además en la : : - i presente. Tales derivadas retíñales sintéticos incluyen ésteres 9-c/s-retinílícos, éteres 9-c/s-retinílicos, 9-c/s-retinol, oximas de 9-c/s-retinal, acétales 9-c/s-retinílicos, l hemi-acetales 9-c/s-retinílicos, ésteres 1 1 -c/s-retinílicos, "éteres 1 1 -c/s-retin ílicos, 1 1 -c/s-retinol , oximas 1 1 -c/s-retinílicas, acétales 1 l -c/sl-retinílicos y hemi-acetales 1 1 -c/s-retinílicos, como se describen adi¡ciorialmente en la presente. El derivado retinal , I sintético puedé ser metabolizado para liberar un retinal natural o : i i i sintético, tal como por ejemplo 9-c/s-retinal, 1 1 -c/s-retinal o un análogo de retinal sintético de los ! mismos, tal como aquellos descritos en la presente o en l :a',s ; Publi ¡caci iones Internacionales WO 2004/082622 A2 y i ' ¦ i WO 2006/002097 A2. I i ; l ' I l i . I En un aspecto, el derivado retinal sintético es un éster de retinilo, : ; I j el éster de retiri ?ilo ; es u : n é ister de 9-c/s-retinilo o un éster de 1 1 -c/s-retinilo que tiene a. El éster sustituyente puede ser, por ejemplo, un un éster de 1 1 ^c/s-retinilo q ue incluye u n sustituyente de ácido i carboxílico de C2-C22 o C3-C22. El sustituyente de ácido carboxílico i ser también un grupo aldehídico de a C 2 de cadena recta o ramificada, tal como, por ejemplo, acetaldehído, propionaldehído, butiraldehído, valeráldehído, hexanal, heptanal, octanal, nonanal, decanal, undécanal , dodécanal. R puede ser un grupo aldehídico de a C10 de cadena recta o ramificada, un grupo aldehídico de a C8 de cadena recta o ramificada o un grupo aldehídico de Ci a C6 de cadena recta o ramificada.

R puede ser además un grupo carboxilato de un ácido dicarboxílico u otro ácido carboxílico (por ejemplo, un ácido hidroxílico) para formar un éster de retinilo (algunos de los cuales se aluden también como ésteres de retinoilo). El ácido carboxílico puede ser, por ejemplo, ácido oxálico (ácido etanodioico), ácido malónico (ácido propanodioico), ácido succínico (butanodioico), ácido fumárico (ácido butenodioico), ácido málico (ácido 2-hidroxibutenodioico), ácido glutárico (ácido pentanodioico), ácido adípico (ácido hexanodioico), ácido pimélico (heptanodioico), ácido subérico (octanod ioico), ácido azeláico ((ácido nonanodioico), ácido sebásico (ácido decanodioico), ácido cítrico, ácido oxaioacético, ácido cetoglutárico o los similares.

R puede ser también un grupo alcano, para formar un éter de retinil de alcano. Grupos de alcano adecuados incluyen , por ejemplo, alquilos de a C24 de cadena recta o ramificada, tales como, por ejemplo, metano, etano, butano, isobutano, pentano, isopentano, hexano, heptano, octano o los similares. Por ejem plo, el grupo alcano puede ser un alquilo inferior lineal , iso-, sec-, ter-, u otro ramificado que fluctúa desde hasta C6. El grupo alcano puede ser tam bién un alquilo de cadena de longitud mediana, lineal, iso-, sec-, ter-, u otro ramificado qué fluctúa desde C8 hasta C14. El grupo alcano puede ser también un alcjg ito de cadena de longitud larga, lineal, iso-, sec-, ter-, u otro ramificado que fluctúa desde C16 hasta C24.

R puede ser también un grupo alcohol, para formar un éter de retinil de alcohol. Grupo is de alcohol adecuados pueden ser alcoholes ¦ i ¦ 1 i inferiores lineales iso, se'c, ter, u otros ramificados que fluctúan desde C a C6, alcoholes de cadena de longitud mediana, lineales, iso-, sec-, 1 , ¡ ter-, u otros ramificados que fluctúan desde C8 hasta C14, o alquilo de cadena de longitud larga, | lineal, iso-, sec-, ter-, u otro ramificado que fluctúa desde ' ie hasta 024. El grupo alcohol puede ser, por ejemplo, metanol, etariol:, butanolj, isobutanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol o los similares. ; R puede ser tambiért un ácido carboxílico, para formar un éter de retinilo de ácido, carboxílico. Grupos alcohol adecuados pueden ser ácidos carboxílicos infer'iores, lineales, iso-, sec-, ter-, u otros i ramificados que1 fluctúan! desde Ci hasta C6, ácidos carboxílicos ' ¡ lineales, iso-, ¡sec-, ter-, u otros ramificados de cadena de longitud mediana que fluctúan de|sde C8 hasta C14, o ácidos carboxílicos lineales, iso-, séc-, ter-, ú otros ramificados de cadena de longitud ; : i larga que fluctúan desde G16 hasta C Grupos de ácido carboxílico ' ' ' ' I adecuados incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido, yalérico, J ácido caproico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácjdó cáprico, |ácido láurico, ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico,; ', ácido mirístico, ácido linoleico, ácido succínico, ácido puede ser un retinil hemi-acetal, donde A ser cualquiera de los grupos R antes R es típicamente un alcano inferior, tal , o un alcano cíclico o acíclico de C-¡ a C7, saturado e insaturado, con o sin heteroátomos, como se describe en la presente. :'¦ ¡ i ¡ : I j El derivado de retijnilo puede ser un retinil acetal, donde A es CH(ORa)ORb. ! , Cada uno de Ra y Rb se pueden seleccionar independientémente de cüalesquier de los grupos R antes expuestos en la Fórmula Ra y Rb son típicamente un alcano cíclico o acíclico, saturado e insaturado de C, a C7, con o sin heteroátomos, como se describe en lá presente. J i El derivado de retiriilo puede ser también típicamente un retinil oxima, donde A es CH:NOH o CH:NOR. R puede ser cualquier de los grupos R antes expuestos en la Fórmula I. R es típicamente, un hidrógeno o un alcano. ¡ Ejemplos' de derivados de retinal sintéticos incluyen, por ejemplo, acetato de 9-c/s-retinilo formato de 9-c/s-retinilo, succinato de 9-c/s- retinilo, citrato de 9-c/s-retinilo, cetoglutarato de 9-c/s-retinilo, fumarato de 9-c/s-retiniló, malato dé 9-c/s-retinilo, oxaloacetato de 9-c/s-retinilo, oxima de 9-c/s;-retinal, oximas de 9-c/s-retinal O-metilo, oximas de 9- c/s-retinal O-etiló y acétales de 9-c/s-retinal metilo y hemiacetales, éter 9-c/s-retinil me !t';íli ;co, ét '·er 9 ij-c/s- retinil etílico y éter 9-c/s-retinil fenílico.

En un aspecto relacionado, el derivado de retinal puede ser un ¦ i i ¡ ¡ I l l o cicloalqueno sustituidos.

El derivado de reljinal sintético puede ser un éster o éter de retinilo de la siguiente fórmula III: A puedé¡ ser cualquiera de los grupos antes expuestos para la ' , ¡ i Fórmula (I). JR.$ y R2 s pueden seleccionar independientemente de grupos alquilo, lineales, ¡so-, sec-, ter-, y otros ramificados asi como ' I también grupos alquilo sustituidos, alquilo ramificado sustituido, hidroxilo, hidrpalquilo, amina, amida o los similares. R y R2 pueden ser independientemente alquilo inferior, lo que significa alquilo resto o ' I ' ] ramificado con' 1 a 6 átómo(s) de carbono tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo! isobutilo, ter-butilo, pentilo, hexilo o los 'i ! ' ' ! similares. Alqüilos sustituidos y alquilos sustituidos ramificados adecuados incluyen, por ejemplo, alquilos, alquilos ramificados y cicloalquilos sustituidos con oxígeno, hidroxilo, nitrógeno, amida, amina, halóge '¦n'o¦, hete 'roá itomo u otros grupos. Los heteroátomos adecuados incluyen, por ejemplo, azufre, silicio y fluoro- o bromo- ? . í sustituciones. ;¡ ¡ | Ri o R2 pueden ser tJmbién un cicloalquilo tal como, por ejemplo, hexano, ciclohéxeno, ben¡ceno así como también un cicloalquilo sustituido. Los i cicloalqujilos sustituidos adecuados incluyen, por ejemplo, cicloalquilos sustituidos con oxígeno, hidroxilo, nitrógeno, '' ¦ ¦ I amida, amina, halógeno, ¡ heteroátomo y/u otros grupos. Los heteroátomos adecuados' incluyen, por ejemplo, azufre, silicio y fluoro-o bromo-sustituciones. | El derivado de retirjial sintético puede tener también una longitud Soc. 119:5758 59 (1997); J. Am. Chem. Soc. 121:5803-04 (1999); J. American Chem. Soc. 123:10024-29 (2001); J American Chem. Soc. · ! i 124:7294-302 (2002); J¡. Biol. Chem. 276:26148-53 (2001); J. Biol Chem. 277:42315-24 (2004); J. Chem. Soc. - Perkin T. 1:1773-77 (1997); J. Chem. Sóc. - Perkin T. 1:2430-39 (2001); J. Org. Chem. 49:649-52 (1984); J. Org. Chem. 58:3533-37 (1993); J. Physical I Chemistry B¡¡ '102:2787-1806 (1998); Lipids 8:558-65; Photochem. Photobiol. 13:259-83 (1986); Photochem. Photobiol. 44:803-07 (1986); Photochem. Photobiol. 54:969-76 (1991); Photochem. Photobiol. 60:64-68 (1994); Photochem. \ Photobiol. 65:1047-55 (1991); Photochem. i Photobiol. 70 111-15 (200Í2); Photochem. Photobiol. 76:606-615 (2002); Proc. Nati Aóaú. Sci. USA 88:9412-16 (1991); Proc. Nati Acad. Sci. USA 90:4072-76 (1993); fjroc. Nati Acad. Sci. USA 94:13442-47 (1997); y Proc. R. Soc. Lond. ¿eries B, Biol. Sci. 233(1270): 55-76 1988) (cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia).

¦ I Los éstéres de retinilo se pueden formar mediante métodos conocidos en! la técnica, tales como, por ejemplo, mediante I esterificación catalizada j con ácido de un retinol con un ácido carboxílico, mediante reacción de un haluro de acilo con un retinol, mediante tran^esterificacion de un éster de retinilo con un ácido carboxílico, mediante reacción de un haluro primario con una sal de carboxilato de, un ácido rletinoico, mediante reacción catalizada con ácido de un anhídrido con un retinol o los similares. En un ejemplo, los esteres de retinilo se puedan formar mediante esterificación catalizada con ácido de úri retinol con un ácido carboxílico, tal como, ácido i 1 ' i Los derivados de retinal sintéticos pueden ser formulados para admi nistrador! usando vehículos farmacéuticamente aceptables así como también técnicas usadas de manera rutinaria en la técnica. U n vehículo puede ser seleccionado de acuerdo con la solubilidad del derivado de 1 r,etinal sirjtético. Las composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen aquellas que se pueden administrar localmente al I ojo, tal como mediante gptas para los ojos, inyección o los similares.

En el caso de gotas para los ojos, la formulación puede incl uir también, opcionalmenté', ¡por ejem plo, agentes oftalmológicamente compati bles tales como agentes de jisotonización tales como cloruro de sod io, glicerina concentrada, y los similares; agentes de amortiguación tales como fosfato de, sodio : , ac Ietato de sodio y los sim ilares; tensoactivos tales como mo'no-oleato de polioxietilen sorbitán (aludido también como Polisorbato 80), polioxil estearato 40, aceite de ricino polioxietilen hidrogenado, y los similares; agentes de estabilización tales como citrato de sod io;, edentato le sodio y los similares; conservadores tales como cloruro ¡ de benzalconio, parabenos y los similares; y otros ingredientes. Se pueden 'emplear conservadores, por ejemplo, en un nivel desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 1 .0% en peso/volumen. . El pH de l'a formulación está usualmente en el rango ¡ ; : ' i acepta ble para las formulaciones oftalmológicas, tal como en el rango ¦ ; ¡ i de pH desde aproxi madamente 4 hasta 8.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen tam bién : . · ' i aquellas form uladas para inyección . Por ejemplo, el derivado de retinal sintético puede , ser proporcionado en una solución salina grado (Ver, por ejemplo, Remington "Pharmaceutical Sciences", 17 Ed., Gennaro (ed.), Mack Pubjishing Co., Easton, Pennsylvania (1985).

Los siguientes ej'emplos se proporcionan meramente como ilustrativos de varios aspLctos de la invención y no deben interpretarse como limitación de la invención en cualquier manera. 6. Ejemplos j Resultados j Introducción ' i * 1 1 1 Se usaron ambos regímenes de dosificación de dosis sencilla y •? ! ¡ mensualmente a largo plazo con 9-c/s-R-Ac para evaluar el efecto del aumento artifi 'c 'ia !l de , crom ?óforo en la función visual de ratones. El ¦ . · ? cromóforo usado fue 9-c/s-R-Ac, un profármaco que se metaboliza y convierte a 9-c/s-retinal para formar isorrodopsin (Batten, M.L. et al., PLoS mediciné\2, e333 (2005)). Se emplearon veinte ratones para los experimentos de dosis única (Figura 1A, Tabla 1), mientras que se usaron 210 para los tratamientos mensuales a largo plazo (Figura 1A, ¦ I 1B, Tablal). También sej alimentaron con sonda ratones con todo-trans-R-Ac (n = 10) y se evaluaron sus efectos a largo plazo mediante análisis seleccionados. ! Abreviaturas 9-c/s-R-Ac, acetato ¿le 9-c/s-retinil; A2E, A-retiniliden-A-retinil etanolamina; ERG, electrorretinograma; LRAT, lecitina:retinol acetiltransferasá; ROS, segmentos de bastón externos; RPE, epitelio de pigmento retinal; RPE65,] una proteína RPE-específica de 65 kDa. , i Ejemplo 1. ' tratamiento con dosis única de 9-c/s-R-Ac de ratones y ocho horas adaptados da con una dosis única vehículo de control y se in (500 cd m2, rodopsina fueron adaptados a la obscuridad durante dieciséis horas después de las cuales se realizaron varios análisis (Figura I|A). ERG instantáneo-sencillo conducido en ratones tratados y no tratados mostraron que amplitudes de a- y b-ondas funcionales de rato'nes tratados se incrementaron ligeramente en ¦ ? comparación con las amplitudes en ratones de control (a-ondas, ¦ ' ' I P<0.01; datos nó mostrados). Para investigar si se utilizó 9-c/s-retinal í para formar isorrodopsina y para evaluar cuánta opsina sin ligando estuvo presenté, en los j ojos del ratón, se purificaron rodopsina, :' : ¦ I isorrodopsina y opsiná mediante cromatografía de inmunoafinidad de grupos de rajones tratados y de control. La proporción de ¦ i regeneración de rodopsina se calculó mediante la proporción de rodopsina e isorrodopsina (absorbancia a 498 nm) para proteina purificada (absorbancia I a 280 nm) en cada fracción, fue '¦ ; i significativamente mayor en ojos de ratones tratados que en los de control mientras que la cantidad total de proteína purificada no difirió significativamente; (Figura |l). Cuando se extrajeron retinoides de ' i proteínas purificadas para I identificar el cromóforo unido, se detectó una cantidad significativa j de 9-c/s-retinal en muestras de ratones tratados, lo que ¡sugiere que se utilizó 9-c/s-retinal para regenerar examinaron los ratones Jmediánte métodos de ERG no invasivos. El primer grupo de análisis' se hizo a los meses 4 y 10 de edad. Bajo condiciones éscotópicas.j las amplitudes de a-ondas disminuyeron con : i ¦ i la edad, especialmente en altas intensidades instantáneas (grupo C1 ? ' versus C0, Figura 4A, ¡panel superior izquierdo), mientras que los cambios en brohdas fueron menos evidentes (Figura 4A, panel superior i I derecho). BájO condiciones fótópicas, no se observaron diferencias I para cualquiera de las á- o b-ondas (Figura 4A, paneles inferiores).

Cuando se compararon grupos tratados y no tratados (N1 versus C1) se ? ' ' I observó una mejoría ligera para el grupo N1 con respecto a a- o b-ondas a altas , resistencias instantáneas (p<0.01, ANOVA un sentido) : ; i bajo ambas condiciones j iópica y escotópica con la excepción de a-ondas bajo condiciones fótópicas (Figura 4A, paneles interiores de la izquierda). 1 ! El segundo; grupo de análisis se hizo a los 14 meses de edad. No ' I ! se encontraron diferencias significativas en amplitudes de a- y b-ondas entre grupos de ratones de control (C2) y tratados (N2 y N3) bajo I cualesquiera condiciones escotópicas y fótópicas (Figura 4B). A partir de respuestas;1, máximas |de a-onda en ratones adaptados a la obscuridad, se estimaron las sensibilidades y amplitudes máximas de a-onda y se encontró que !estos parámetros no son significativamente diferentes tampoco (datos no mostrados).

Ejemplo 4. Cambios en1 la adaptación a la obscuridad. i La recuperación del la respuesta ERG (adaptación a la obscuridad) que! sigue al blanqueado se midió mediante monitoreo de la l ' amplitud de a-ondas después de exposición retinal a iluminación muy intensa constante (500 cd-nr, rodopsina blanqueada -90%) durante 3 ' ' ' i min. La recuperación dé las respuestas puede significativamente más rápida en los grupos trajtados con 9-c/s-R-Ac en comparación con los grupos de control de ratones a los 1 0 meses ambos (N 1 vs C1 , Figura 5A) y 14 meses de edad |(N2 y N3 vs C2, Figura 5B) (p<0.001 , ANOVA un sentido). La cinética' de retinoides en los ojos de cada grupo se evaluó cuantitativamente jdurante 60 min de adaptación a la obscuridad después de 3 min de ' blanqueado en cuatro puntos de tiempo subsiguientes de la adaptación a la obscuridad (0, 1 0, 30 y 60 min). A los 1 0 meses de edad , eH nivel de regeneración de 1 -c/s-retinal en un grupo tratado ''!(N 1 ) fue s Iignificativamente mayor que en el grupo de 1 control (C1 ) (p<0.01 ) 60 min después del blanqueado. Pero no hubo diferencia significativa en jla cinética de todo-frans-retinal y ésteres de todo-írans-retiñilo entre estos grupos y entre ratones tratados y no i tratados a los 14; meses de edad. Ni el 9-c/s-retinal ni los ésteres de 9-c/s-retinilo fueron encontrados en ojos de grupos no tratados (datos no mostrados). ! Ejemplo 5. Efectos de la administración a largo plazo de todo-frans-R-Ac en la función visual . j Además de los experimentos de control , se les dio con sonda a los ratones un : isómero inactivo, todo-frans-R-Ac (n = 10) durante 1 0 ; ' i meses y se evaluaron a los 14 meses de edad. El examen de ERG no mostró diferencia1 significativa en comparación con el control (C2) en análisis de a- y b-jonda con ERG instantánea sencilla o en recuperación retinilo podría producir niveles elevados de ácido retinoico mitogénico en el hígado, los niveles de ácido retinoico hepático estuvieron por debajo de niveles detectables en todos los grupos (datos no i mostrados). j Ejemplo 7. Cría y mórfoliog ía de retinas de ratones tratados con 9-c/s- : I R-Ac. ; ; ! i Semanalmente se eyaluaron anímales para actividades y cam bios , ¦ i en apariencia de pelaje y piel. No se observaron cambios en estos parámetros durante el período experimental además de aquellos debidos al envejecimiento natural. Los pesos corporales de ratones evaluados en pretratamiento, a 1 0 meses y 14 meses no mostraron diferencias significativas jentre grupos de control (C 1 -2) y tratados . ' i (N 1 -3) (datos no 'mostrados).

La microscopía con luz no reveló anormalidades mayores en las I retinas de ratones tratados con vehículo, 9-c/s-R-Ac o todo-írans-R-Ac (n = 2) a 1 0 y 1,4 meses ¡de edad y las retinas de estos dos grupos tratados con 9-c/s-R-Ac futeron indistinguibles. Las longitudes de los segmentos externos de; bastones (ROS) fueron similares en grupos de control y tratados! a 1 0 y 14 meses de edad (Figura 7B, n = 5), pero se disminuyeron significativamente en comparación con longitudes de ROS de ratones de 4 meses de edad (C0) cuya histolog ía retínal se I muestra en la Figura 7A. El espesor de cada capa mayor en la retina fue similar también entre grupos de control y tratados. El análisis de EM de la retina externa y capa RPE no reveló diferencias grandes entre ratones de control y tratados. La resolución mayor de la interfase entre RPE y ROS tampoco mostró anormalidades (datos no mostrados).

Ejem plo 8. , , Cambios en perfiles de expresión de ADN con la administración de 9-c/'s-R-Ac. ,. ; ! i Se uso , análisis dé microarreglo de ADN para documentar los ? I I cambios posibles en perfiles de expresión de genes después del tratamiento a largo plazo! con 9-c/s-R-Ac. Se determinaron los niveles de expresión idé ARNm e i el ojo, hígado y riñón y se compararon entre grupos tratados (N2)' y de control (C2) usando un arreglo de 37,364 i . , ; I genes proporcionando p¡or NimbleGen System Inc. En el ojo, el tratamiento con 9-c/'s-R-Kc elevó la expresión de 290 genes en un factor de 2 o m;ás y atenuó la expresión de más de 1057 genes en un factor de 0.5 : o imenos (Figura 8, Tabla S 1 ). En el hígado de ratones tratados, se incrementó la' expresión de solamente 7 genes en un factor de 2 o más y| se suprimió la expresión de solamente 20 genes en un I factor de 0.5 ó menos (Figura 8, Tabla S2). En el riñón de ratones tratados, 90 gienes incrementaron su expresión en un factor de 2 o más y 3 genes la suprimieron en un factor de 0.5 o menos (Figura 8; Tabla ! S2). Los genes dé procesamiento retinoide, de fototransducción específica, y función categorizada cuyas expresiones fueron afectadas ! : i I en el ojo se enlistan en las Tablas S2. Los niveles de proteína de transducción : (!G :t), ro :dops ? ina cinasa, proteína 1 de activación de : i guanilato ciclasa y prote¡ína 2 de activación de guanilato ciclasa, guanilato cicla : :sa : 1 , :. retin I ol dehidrogenasa 12 y LRAT no fueron i afectados en todos los grupos de ratones según evaluación mediante i I ¡nmunomanchado (datos no mostrados).

Tabla 1. Números de ratones utilizados para análisis experimentales en los estud 'ios : de d ,osif ijcación sencilla y a largo plazo de tratamiento con 9-c/s-R-Ác. ! a Se usaron ratones después de pruebas ERG para estos experimentos.; ¡ Se usó un ojo de; un ratón para microscopía con luz y el otro para microscopía electrónica.

— Dis—cu—s -ió—n i Como se ¡ muestra en estos estudios, la deterioración de la adaptación a la oscuridad relacionada con la edad en ratones se atenúa mediante i trata 1mie into con cis-retinoide artificial. Este hallazgo es análogo a la declinación de la visión humana relacionada con la edad manifes ada por la ralentización dramática de la adaptación a la oscuridad mediada i porj bastones atribuida directamente a la regeneración .retrasada d,e rodopsina (Jackson, G.R., Owsley, C. & McGwin, G., Jr. Visión Résearch 39, 3975-3982 (1999)). Se hicieron dos tipos diferentes de ¡estudios. Los estudios de dosis sencilla revelaron que 'los 9-c/s-re!tinoides podrían entrar al ojo y un segundo grupo de experimentos móstraron que la administración a largo plazo de 9-c/s-R-Ac mejoró significativamente la deterioración de la función : I retinal en ratones envejecidos.

Experimentos de dosis sencilla ¡ Estos éxperimento's se diseñaron para probar si los 9-c/s-retinoides entran a los oj'os de ratones de 10 meses de edad y mejoran i la función visual. La respuesta de ERG declinó mesurablemente con la edad y cantidades pequeñas, pero mesurables de opsina libre estuvieron presentes en ¡estos ratones viejos. El 9-cs-retinal entró al ojo cuando estos rat !one is tratados fueron expuestos a luz intensa y ! probados 18 hr más tárdej. Los precursores de 9-c/s-retinal, ésteres de 9-c/s-retinilo, fueron detectables fácilmente en los ojos de estos i-ratones y la rela !ción d¦e r idopsiha/opsina mejoró también. , i Tratamiento de ratones a largo plazo con 9-c/s-R-Ac.

Las respuestas de ERG a un destello de luz sencillo se mejoraron significativamé;nte en ratones de 10 meses de edad que fueron tratados con 9-c/s-R-Ac durante 6 meses en comparación con los controles ! tratados con aceite (Figur|a 4A). Este efecto terapéutico desapareció grandemente ém ratones |de 14 meses de edad tratados durante 10 meses (Figura, , 4 !B), po .sib Ilemente debido al efecto de ocultación del debilitamiento en los ratones más viejos. Sin embargo, estos ratones más viejos exh(ibieron un efecto significativo que involucra adaptación a la oscuridad (F gura 5B, grupos N2 y N3). Ese sondeo a largo plazo de • I ' I i ratones de 14 meses cón tódo-rrans-R-Ac no tuvo efecto en parámetros i de ERG medidos ;no es sorprendente porque solamente la forma cis del cromóforo puede recorribinarse con opsina (revisado en Palczewski, K.

Annual review of bioehemistry 75, 743-767 (2006); Filipek, S., Stenkamp, R¡E., Teller, & Palczewski, K. Annu Rev Physiol 65, 851-879 (2003)). Así, todo-frans-retinoide solamente agregaría sustrato para la reacción de isomerización, pero no suplementa el cromóforo activo si la j isomerización fue atenuada. De manera importante, los ;ratonés en cautiverio son mantenidos con una dieta alta i en vitamina A, entonces los efectos observados de c s-retinoides están i ya en la parte superior de' süpleméntación con todo-frans-retinoides.

: : : ' I El tratamiento a largo plazo (6 a 10 meses) fue bien tolerado por ratones hembra C57BL/6. i Los cambios morfológicos detectables en la i retina relacionados con la'edad que fueron observados en ratones tanto tratados como de control ¡no fueron afectados por el tratamiento. Los subproductos tóxicos potenciales del tratamiento con retinoide, A2E y '¦ ¦ i ácido retinoico, no se acumularon en estos ratones. En este estudio, G., Jr., Phillips, J.M., Klein, R. & Owsley, C. Vision research 46, 1422- 1431 (2006)); ¡ Una declinación en la función visual se manifiesta l funcionalmente ' por la deducción en la habilidad para realizar t actividades tales como manejar en la noche y leer en entornos oscuros (Schilling, O.K.¦ & Wahl, H. W. Psychology and aging 21, 703-714 (2006)). Tales I síntomas| se hacen más debilitantes con la edad y . I pueden resultar en independencia y actividad reducidas en los mayores. El problema se jhace más agudo a medida que la gente vive ¡M . 1 más. Los resultados de nuestros experimentos demostraron que el 9- i c/s-retinoide es útil co 'mo i jun agente profiláctico a largo plazo y como un compuesto terapéutico. J Los efectos: benéficos y la seguridad relativa de 9-c s-retinoide se i extiende a la degeneración' macular relacionada con la edad, la causa principal de la '¦ c'e ¡guera I e g i'a I en los E. U. y Europa (Zack, D.J., et al. Mol Vis 5, 30; (1999)). ¡Aquí, hemos mostrado que hay cambios bioquímicos en el cicló visual que ocurren con la edad, a saber un incremento en óp?ina libre |y la relación de opsina/rodopsina. Cuando i i I tales cambios bioquímicos son excesivos pueden conducir a degeneraciones de la retina tales como se ven en LCA (Fan, J., Woodruff, MX., Cilluffo, M.C., Crouch, R.K. & Fain, G.L. J Physiol 568, 83-95 (2005)). Además, la opsina libre y resulta en la iniciación espontánea de la Cascada visual en fotorreceptores de bastones (Lisman, J. & Fain, G. ; Nat ed 1, 1254-1255 (1995); Fain, G.L., Matthews, H.R., Cornwall', M.C. & Koutalos, Y. Physiol Rev 81, 117-151 (2001); Surya, A., Foster¡, K. W. & Knox, B.E. J Biol Chem 270, 5024-5031 (1995); Hofmann, K.P., Pulvermuller, A., Buczylko, J., Van Hooser, P. & Palczewski, K. J Biol Chem 267, 15701-15706 (1992); Palczewski, K., et al. Biochemistry 33, 13741- 13750 (1994); Jager, S., Palczewski, K. & Hofmanri, K.P. Biochemistry 35, 2901- 2908 (1996)). Esto resulta en una proporción disminuida de señal a ruido en el sistema visual, sobrecarga metabólica incrementada en RPE, lo que resulta en la formación de más productos de desecho, radicales libres y, eventualmente, drusen.J La disminución de opsina libre con terapia con 9-c/s-retinoide conducirá por lo tanto a una reducción en los precursores que se cree que inician la AMD. i Métodos Animales ' Ratones hembra C57BL/6 pigmentados de edades iguales obtenidos de Charles River Laboratories se mantuvieron en una dieta normal en oscuridad completa o en un ciclo de luz/oscuridad de 12 hr.

Todos los experimentos ; con animales utilizaron procedimientos aprobados por la University of Washington y Case Western Reserve I ; : i Purificación de rodopsina ! ' i La purificación! de la rodopsina se hizo bajo luz roja tenue como se describió previamente (Zhu, et al. J Biol Chem 279, 53828-53839 (2004)). Anticuerpo dje término C anti-rodopsina purificado 1D4 (MacKenzie, ,D., Are dt,|A., Hargrave, P., McDowell, J.H. & Molday, " ' ! R.S. Biochemistry 23, 65:44-6549 (1984)) fue inmovilizado en sefarosa 4B activada con CNBr y se empacó una columna de 4.6 x 12 mm con 2 mg de anticuerpo 1D4/m;l de perlas de sefarosa. Se homogenizaron ojos completos !de ratón ¡en NaCI 137 mM, Na2HP04 5.4 mM, KCI 2.7 mM y KH2P04; 1;8 mM (pH 7.5) con un homogenizador de vidrio a vidrio. Se removieron ¡las proteínas solubles en el sobrenadante mediante centrifugación 1 a 14,000 x g durante 5 min y la granza se disolvió en búfer que contiene dodecil-p-maltoside 1% en Bis-Tris-propano 10 mM I i (pH 7.5) que 1 contiene r>JaCI 500 mM. El sobrenadante se aclaró mediante centrifugación a 125,000 x g durante 20 min y se cargó en i ¦ ! una columna de: inmunoafinidad empacada con anticuerpo 1D4 la cual se lavó después perfectamente a un régimen de flujo de 0.5 ml/min con Bis-Tris-propano! 10 mM (pH 7.5) que contiene NaCI 500 mM y dodecil-ß-maltoside 0!l°o. La rodopsina purificada de ratón se eluyó con nonapéptido 100 µ? (TETSQVAPA) en Bis-Tris-propano 10 mM (pH 7.5) conteniendo NaCI 500 mM y dodecil- -maltoside 0.1% a temperatura arnbiente. Se determinó la concentración de rodopsina purificada a 500 hm y la cantidad total de opsina y rodopsina a 280 nm con un espectrpfotómetrp de UV visible Hewlett-Packard 8452A (Palczewski, K., Carruthj M.E., Adamus, G., McDowell, J.H. & Hargrave, P.A. Vision research 30, 1129-1137 (1990)).

Análisis de retinoides ' i ' . I Todos los procedimientos experimentales relacionados con extracción, derivación y ¡separación de retinoides se llevaron a cabo bajo luz roja tenue proporcionada por un filtro de luz segura Kodak No. 1 (transmitanciá >56Ó nm|) como se describe previamente (Van Hooser, J.P., et al. Proceedings jof the National Academy of Sciences of the United States pf America 'p7, 8623-8628 (2000); Van Hooser, J.P., et al. J Biol Chem 277, 19173-¡19182 (2002); Maeda, A., et al. J Biol Chem 280, 18822-18832 (2005);! Van Hooser, J.P., Garwin, G.G. & Saari, J.C. Methods Enzymol 316, 5:65-575 (2000)). Las fracciones eluidas de rodopsina purificada de ojos de 6 ratones se combinaron (total 3.0 mi) y se mezclaron con un volumen igual de metanol 100%. La mezcla se ! revolvió a vórtice y se incubó en hielo durante 15 min. Se extrajeron los retinoides dós veces con un volumen igual de hexano 100% (6 mi total). Los extractos c'pmbinados se secaron bajo argón y los '' ': ! retinoides se 's pararpn mediante HPLC de fase normal (Beckman, Ultrasphere-Si, 5 pm, 4-6 x 250 mm) con acetato de etilo 10% y hexano 90% a un rég'i.mjen de flujo de 1.4 ml/min y detectados a 325 nm mediante una HRLC HPIl'pO con un detector de arreglo de diodos y i software HP Chemstation A.03.03. Se analizó A2E como se describió ¡ I previamente (Maeda, A., et'¡al. J Biol Chem 280, 18822-18832 (2005)).

El análisis de ácido o ret¡noico en el hígado se llevó a cabo como se describió antes (Batten, j M.L., et al. PLoS Medicine 2, e333 (2005)) mediante una HPLC Agilentj 1100 con dos columnas de fase normal en tándem: una columna yarian Microsorb Silica 3 µ? , 4.6 x 100 mm (Varían, Palo Alto, CA) yj una columna Ultrasphere-Si, 5 µ?t?, 4.6 x 250 mm. Se usó1 ún sistema ¡socrático de solventes de 1000:4:3:0:0.675 hexano:2-propa,nol:ácido jacético glacial (v/v) a un régimen de flujo de 1 ml/min a 20o(C ¡con detección a 355 nm. La calibración se hizo con estándares de ' todo fran¡s-R-Ac y 9-c/'s-R-Ac comprados de Sigma-Aldrich. i¦ · Inmunomanchado j El inmunomanchado se hizo de acuerdo con protocolos estándar usando Imn-iob iilon-P 1 para absorber proteínas (difloruro de polivinilideno: ¡ Millipóre |Corp.). El anticuerpo monoclonal anti-rodopsina (1D4) fue proporcionado por Dr. R. Molday. El anti-LRAT (mAb) (Moise,1 A.R., Golczak, M., Imanishi, Y. & Palczewski, K. J Biol '' ' ' I Chem (2006)),1 anti-transducin (Gt) (mAb) (no publicada), anti-guanilato ? ¦ I ciclasa 1 (1S4:,! mAb); Haiije, S. E., et al. Investigative ophthalmology & visual science! '4,7, 3745-3¡753 (2006)), proteina anti-guanilato ciclasa- ;.' 1 i activada 1 (UW14 pAb) (Gorczyca, W.A., et al. J Biol Chem 270, 22029- 22036 (1995))¡; proteina 2\ anti-guanilato ciclasa-activada (UW50 pAb) ;. i ' i Otto-Bruc, A., ét'al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United S',tates of America 94, 4727-4732 (1997)), anti-rodopsina :i : cinasa (Zhao, X.,, Huan 1g, J i., Khani, S.C. & Palczewski, . J Biol Chem i: 273, 5124-5131 (1998)), y ¡anti-rétinol dehidrogenasa 12 (pAb) (Maeda, A., et al J Biol, Chem 281 ] 37697-37704 (2006)) fueron generados en i i : i nuestro laboratorio. lgG| anti-ratón de cabra fosfatasa-conjugada alcalina o IgG, anti-conej'o de cabra (Promega) se usaron como Alícuotas de' ARN total aislado de los diferentes tejidos y de ratones que experimentan varios tratamientos fueron etiquetados para detección e hibridizados jen el microarreglo genómico del ratón usando un servicio proporcionad'p por NimbleGen System I nc. (Madison, Wl ). El microarreglo contenía los 37,364 genes y cubría el transcriptoma entero del ratón como ;se representa por la base de datos de la I University of 1 California, i Santa Cruz (construcción HG 17) con un mínimo de 1 í sondas por; gen. La expresión de genes se normalizó de acuerdo con la señal de la sonda, y la señal promedio para cada gen fue normalizada! para bada réplica de muestra.

El arreglo de datos para muestras en todo el estudio fue normalizado por NimbleGen System Inc. (Madison, Wl) que empleó la característica dé análisis! robusto de chips múltiples del paquete de i análisis de datos contenido en la fuente abierta Bioconductor y proyecto de software abierto de desarrollo para el análisis y la comprensión de datos genpmicos. Hojas de cálculo am plio de proyecto de resultados de análisis robusto de chips múltiples fueron exportados a MICROSOFT® EXEL® <j las proporciones de niveles de expresión fueron calculadas para todas las comparaciones posibles por pares que comprenden una muestra le control y una tratada. Las proporciones por pares fueron importadas de Microsoft Access y extraídas para cambios de incorporación j creíble en expresión de genes. Cambios mayores que o iguales a 2 ¡veces de incremento o menos que o igual a 0.5 veces de disminución fueron considerados significativos. Los genes expresado difereneialmente fueron exportados después de Access como1 archivos de Excel y fueron asignados con anotaciones funcionales mediante software LUCIDYX SEARCHER™ de Lucidyx LLC.

Análisis estadístico Los análisis estadísticos se realizaron mediante análisis de variancia de unisentido (>f\NOVA).

Los ejemplos previos fueron proporcionados para ilustrar, pero no limitar, el alcanpe de las ¡invenciones reivindicadas. Otras variantes de las invenciones! serán apjarentes rápidamente para aquellos de pericia ordinaria en ,1a técnica jy están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otras referencias citadas en la presente se incorporan en la presente por referencia. ' !

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método de tratamiento o prevención de disfunción retinal relacionada con la edad en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad farmacéuticamente efectiva de un derivado de retinal sintético, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra a dijcho sujeto durante un periodo de por lo menos tres meses. ' ? 1 2. El método de laj reivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra a dicho sujeto durante un periodo de por lo menos seis meses. j " ¦ l 3. El método de la ¡reivindicación 2, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra a dicho sujeto aproximadamente una vez cada dos semanas a aproximadamente una vez cada seis semanas '¦ ¡ durante un periodo de porjlo menos seis meses. comprende un radical carboxilato de un ácido monocarboxílico de C a C10 o un ácidp policarboxjílico de C2 a C22- 7. El método de laj reivindicación 6, en donde dicho sustituyente de éster comprende un radical carboxilato de un ácido policarboxílico 8. El método de la reivindicación 6, en donde dicho derivado de retinal sintético' se selecciona del grupo que consiste de: acetato de 9-c/'s-retinilo, succinato de 9-c/s-retinilo, citrato de 9-c/s-retinilo, cetoglutarato ide 9-c/s-retjinilo, fumarato de 9-c/s-retinilo, malato de 9-c/s-retínilo y oxáloacetatoj de 9-c/s-retinilo. 9. El métódo de la reivindicación 8, en donde dicho derivado de retinal sintético ¡es acetato de 9-c/s-retinilo. 10. El método de lá reivindicación 6, en donde dicho derivado de retinal sintético ' se selecciona del grupo que consiste de: acetato de 11-c/s-retiniloj1 succinato ¡de 11 -c/s-retinilo, citrato de 11 -c/s-reti ni lo, cetoglutarato de; 11-c/s-retinilo, fumarato de 11-c/s-retinilo, malato de 11 -c/s-retinilo y bxaloacetáto de 11 -c/s-retinilo. 11. El método de la| reivindicación 8, en donde dicho derivado de retinal sintético s acetato^ de 11 -c/s-retinilo. '¦ ' I 12. El método de lá reivindicación 1, en donde dicha disfunción retinal relacionada con la' edad se manifiesta por una o más de las . : ¡ siguientes condiciones clínicas: un problema en la adaptación a la oscuridad mediada por bastones después de exposición a la luz, un problema en lá visión no'cturna, un problema en la sensibilidad de contraste y degeneración macular relacionada con la edad (AMD). I 13. El método de la reivindicación 1, en donde dicho sujeto es un mamífero. < j 14. El método de lia reivindicación 13, en donde dicho mamífero es un humanó: ¡ j l 15. El método de la reivindicación 1, en donde dicho derivado de 1 ; ¦ i retinal sintético se administra vía sonda. 16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho derivado de retinal sintético Je administra en una dosificación de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. 17. El método de lal reivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra de manera oral. .. | i 18. El método de lajreivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético, se adminis'tra de manera local al ojo del sujeto. 19. El método de la reivindicación 18, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra vía gotas para los ojos, una solución inyectable ¡ntrápcular q una solución inyectable periocular. 20. El método dé la reivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético1 es un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I a XII ;I ! I como se describe en PCT/US2005/021812 (WO 2004/082622). 21. El método de la Reivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético sé administra menos de una vez por día y en donde la dosificación por administración es mayor que la dosis diaria efectiva. 22. El método de la réivindicación 1, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra aproximadamente una vez cada día o una vez cada tercer, día; aproximadamente cuatro veces por semana, tres (b) el süstituyente del éster de dicho derivado de retinal sintético comprende un', radical carboxilato de un ácido monocarboxílico de Ci a C10 o un ácido, policarbox lico de C2 a C22- j 29. Él método de la reivindicación 28, en donde dicho i sustituyente de éster comprende un radical carboxilato de un ácido policarboxílico1 de C3 a Ci]. 30. El rñétodo de la reivindicación 28, en donde dicho derivado de retinal se ' sele icciona del grupo que consiste de: acetato de 9-c s-retinilo, súccinato jde 9-c/s-retinilo, citrato de 9-c/s-retinilo, cetoglutarato de^ 9-c/s÷ret¡'nilo, fumarato de 9-c/s-retinilo, malato de 9-c/s-retinilo y oxaíoacetato de 9-c/s-retinilo. 31. El m ¦ét :odo d :e la i reivindicación 30, en donde dicho derivado de retinal sintético es acetato de 9-c/s-retinilo. ; i , , ' ¡ 32. El método de la. reivindicación 28, en donde dicho derivado I de retinal sintético se selecciona del grupo que consiste de: acetato de 1 -c/s-retinilo, súccinato de 11-c/s-retinilo, citrato de 11-c/s-retinilo, cetoglutarato de 1-c/s-retinilo, fumarato de 11-c/s-retinilo, malato de '.. : t 11-c/s-retinilo y oxaíoacetato de 11-c/s-retinilo. ' I 33. El método de la [reivindicación 32, en donde dicho derivado de retinal sintético es acetato de 11-c/s-retinilo. : ' I 34. El método de la reivindicación 23, en donde dicha disfunción retinal relacionada con la edad se manifiesta por una o más de las ¦ * ' I I siguientes condiciones clínicas: un problema en la adaptación a la oscuridad mediada por bastones después de exposición a la luz, un problema en la (vjsión nocturna, un problema en la sensibilidad de contraste y degeneración! macular relacionada con la edad (AMD). i · 35. El .método de la reivindicación 23, en donde dicho sujeto es un mam ífero. j 36. El método de la reivindicación 35, en donde dicho mamífero es un humano.1 37. El método de la reivindicación 23, en donde dicho derivado 1 I de retinal sintético se administra vía sonda. I 38. El método de lá reivindicación 37, en donde dicho derivado de retinal sintético sje administra en una dosificación de aproximadamente 0.01, a aproximadamente 1 0 mg/kg de peso corporal. . ' i 39. El método de la reivindicación 23, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra de manera oral. 1 1 i 40. El método de la¡ reivindicación 23, en donde dicho derivado , ' '; i de retinal sintético se administra de manera local al ojo del sujeto. 41 . El método dé laj reivindicación 40, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra vía gotas para los ojos, una solución ' i inyectable infraocular o una solución inyectable periocular. 42. El método de la ¡reivindicación 23, en donde dicho derivado de retinal sintético es ün co i mpuesto de cualquiera de las Fórmulas I a XI I como se describe en PC|T/US2005/02181 2 (WO 2004/082622). 43. El método de la reivindicación 23, en donde dicho derivado de retinal sintético se administra menos de una vez por d ía y en donde la dosificación por administración es mayor que la dosis diaria efectiva. 44. El método de la reivindicación 23, en donde dicho derivado de retinal sintético! se administra aproximadamente una vez cada día o ; I i! ! i 1 66 una vez cada tercer día; aproximadamente cuatro veces por semana, tres veces por semana, p dos veces por semana; o aproximadamente una vez cada dos, 1 tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve semanas. '< :