MX2008016083A - Metodo para modular la excrecion de neuritas por el uso de un antagonista del receptor de galanina-3. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para modular la excrecencia de neuritas en un animal. Los métodos comprenden una administración general de antagonistas del receptor de galanina-3 bajo condiciones suficientes para producir excrecencia de neuritas.

Description

METODO PARA MODULAR LA EXCRECION DE NEURITAS POR EL USO DE UN ANTAGONISTA DEL RECEPTOR DE GALANINA-3 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona la acción de los antagonistas del receptor de galanina-3 para modular la excrecencia de neuritas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La galanina es un neuropéptido que contiene de 29 hasta 30 aminoácidos involucrado en una variedad de procesos patológicos y fisiológicos centrales y periféricos, que incluyen movilidad gastrointestinal, contracción cardiovascular, función neuroendocrina, conducta alimenticia, percepción del dolor, aprendizaje, memoria, ansiedad y depresión. El neuropéptido de galanina media su efecto a través de tres subtipos de receptores acoplados a la proteina G conocidos, GalRl, GalR2 y GalR3, y se ha implicado en muchos procesos fisiológicos que incluyen conducta alimenticia, dolor y depresión. La distribución del mARN del receptor de Galanina-3 central (GalR3) es discreta con una representación prominente en el hipotálamo y los niveles inferiores en algunas regiones limbicas que incluyen el locus cerúleo, el rafé posterior y el mesencéfalo gris central.

Diversos estudios han demostrado que la habilidad de la Galanina para modular la función central de 5-hidroxitriptamina (5-HT) (Fuxe et al. Ann N Y Acad Sci. 21 de diciembre de 1998; 863:274-90; Kehr et al. Neuropsychopharmacology. Septiembre 2002; 27 ( 3) : 341-56; Yoshitake et al. Neurosci Lett. 27 de marzo de 2003; 339 (3) : 239-42) . El HT-2157, un antagonista GalR3 selectivo ha demostrado antagonizar el efecto inhibidor de la Galanina en la transmisión de 5-HT (Rowley et al. Br J Pharmacol 2005, Winter Meeting, P125) y por lo tanto para incrementar los niveles extracelulares de 5-HT en diversas regiones del cerebro (Rowley et al. Br J Pharmacol 2005, Winter Meeting, P 127) . La mención de cualquier documento no se pretende como una admisión que sea técnica previa pertinente. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación para el contenido de estos documentos se basa en la información disponible para al solicitante y no constituye ninguna admisión en cuanto a lo correcto de las fechas o contenidos de los documentos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la administración de los antagonistas del receptor de galanina-3 (GalR3) para modular la excrecencia de neuritas.

En una modalidad el método se dirige a la modulación de la excrecencia de neuritas por la administración de un antagonista del receptor de galanina-3 a un animal. En una modalidad la excrecencia de neuritas se aumenta o incrementa por la administración de un antagonista del receptor de galanina-3 a un animal relativo al crecimiento normal en la ausencia del antagonista del receptor de galanina-3. En otra modalidad el método se dirige a tratar un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto un antagonista del receptor de galanina-3. En una modalidad el método se dirige a tratar un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto una cantidad del antagonista del receptor de galanina-3 efectivo para tratar la lesión o trauma nervioso del sujeto, en donde el antagonista del receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada uno de Ylf Y2, Y3, y Y4 es independientemente -H; alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo ; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, o cicloalquenilo Cs-C7; -F, -Cl, -Br, o -I; -N02; -N3; -CN; -0R4, -SR4, -OCOR4, -COR4, -NCOR , -N(R4)2, -CON(R4)2, ó -COOR4; arilo o heteroarilo; o cualquiera de dos de Yi, Y2, Y3 y Y4 presentan un átomo de carbono adyacente que pueden constituir un grupo metilendioxi; en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o arilalquilo (Ci-C6) ; en donde A es A', alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, arilo, heteroarilo, arilalquilo ( i- e) o heteroarilalquilo (Ci-Cg) ; en donde A' es en donde Ri y R2 son cada uno independientemente -H, alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, Br, -I, -NO2, o -CN; en donde R3 es -H, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -CN, -0R6, arilo o heteroarilo; en donde R5 es alquilo Ci~C de cadena lineal o ramificada, -N(R4)2, -0R6 o arilo; en donde R6 es alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada o arilo; en donde B es arilo, o heteroarilo; con la condición sin embargo, si B es arilo o heteroarilo el átomo de carbono o átomos de carbono orto al átomo de nitrógeno del enlace imina puede solamente substituirse con uno o más de los siguientes: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, metilo, etilo o metoxi; en donde cada n es independientemente un entero desde 1 hasta 4 inclusive; en donde el compuesto es un isómero imina Z puro, un isómero imina E puro, o una mezcla de los isómeros imina Z y E; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del antagonista del receptor de galanina-3, en donde el antagonista del receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada R24 es independientemente uno o más de los siguientes: H, F, Cl, Br, I, CF3 o 0CH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo es opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o 0R4; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci- C? de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7/ arilo o arilalquilo (Ci-C6) . La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un compuesto antagonista del receptor de galanina-3, en donde el compuesto antagonista del receptor de galanina-3 tiene la estructura : en donde cada R24 es independientemente uno o más de los siguientes: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo es opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o 0R4; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o arilalquilo (Ci-C6) . Como se describe en la presente, la administración de los compuestos antagonistas del receptor de galanina-3 (Gal3R) pueden hacerse sola o con la administración de otros compuestos por ejemplo, benzodiazepina o inhibidores de la reabsorción de serotonina selectivos (SSRI) . Se contempla que en las diversas modalidades, el antagonista del receptor Gal-3 sea HT-2157 ( 1 , 3-dihidro-l-fenil-3 [ [ 3-trifluorometil ) fenil] imino] -2H-indol-2-ona; CAS No. 303149-14-6. los isómeros E/Z o mezclas de los mismos. La presente invención proporciona un método para tratar, inhibir o aliviar los efectos de lesiones o enfermedades que resultan en la degeneración neuronal o un método para promover la neurogénesis . Estos métodos involucran administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad efectiva del al menos una indolona. Se ha encontradoO que las indolonas de la presente invención promueven la excrecencia de las neuritas y neurogénesis. Alternativamente, al menos una indolona de la presente invención se usa para tratar las células madre o células progenitoras neuronales previo a que las células se administren a un paciente por implantación al sitio de degeneración neuronal. El método de la presente invención el cual promueve la neurogénesis se involucra en la renovación celular en el sistema nervioso central (SNC) e incluye todos los tipos de células del SNC. Una modalidad de la presente invención se usa para tratar la lesión del sistema nervioso primario, por ejemplo, lesiones de la cabeza cerrada y traumatismos, incluyendo pero no limitado a aquellas causadas por la participación en deportes peligrosos, trauma penetrante, incluyendo pero no limitado a aquellas causadas por heridas de bala, apoplejía hemorrágica, apoplejía isquémica, glaucoma, isquemia cerebral, o daños incluyendo pero no limitado a aquellas causadas por cirugía tales como extirpación de tumores. Los compuestos de la invención pueden promover la regeneración de nervios con objeto de aumentar o acelerar la curación de tales lesiones. Además, el método puede usarse para tratar, inhibir o aliviar los efectos de la enfermedad o trastorno que resulta en un proceso degenerativo. Una modalidad de la presente invención es un método para la administración de un antagonista del receptor de galanina-3 para inhibir la degeneración secundaria la cual puede de otra manera seguir con la lesión del sistema nervioso primario. Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar diversas enfermedades o trastornos del sistema nervioso periférico o central, incluyendo pero no limitando a neuropatía diabética, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) . Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar lesiones nerviosas periféricas y neuropatías periféricas o localizadas incluyendo, pero no limitando a, porfiria, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, complicaciones de diversos fármacos y toxinas, polineuropatía amiloide, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, pueden tratarse por este método. Además los compuestos pueden usarse para los tratamientos post-operatorios tales como por la remoción de tumor del SNC y otras formas de cirugía en el SNC. Los compuestos pueden usarse para el tratamiento de trauma de la médula espinal. En otra modalidad, la invención se dirige a un kit para el tratamiento de lesión y/o trauma celular neuronal que comprende un antagonista del receptor de galanina-3. Otros ejemplos de los antagonistas del receptor de galanina-3 pueden encontrarse en la publicación de E.U.A. No. US2003/078271A1; y Publicación internacional No. WO2004/093789 las cuales se incorporan para referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 muestra los gráficos de 4 características de salida generadas del análisis cuantitativo de las imágenes de las células NS-1 por la Bioaplicación de la Excrecencia de Neuritas Extendida. Los datos graficados son el valor medio de cada característica ± la desviación estándar de los 2 pozos por concentración del compuesto. Las definiciones para las características de salida son como siguen: Conteo de neuritas: el número de neuritas asociadas con las neuronas seleccionadas. Longitud total de neuritas: la longitud total de las neuritas para una neurona seleccionada. Longitud promedio de neuritas: la longitud total de neuritas se divide por el conteo de neuritas para las neuronas seleccionadas. Punto de ramificación: la unión de los tres segmentos de neuritas. La FIG. 2 muestra el análisis qPCR de los efectos en la expresión de Hes5 por el tratamiento con HT-2157 en las células NS-1. Los datos graficados son. el valor medio del nivel de ARN relativo de las células en 2 pozos ± desviación estándar. La FIG. 3 muestra la longitud promedio de neuritas analizada por la Bioaplicación de la Excrecencia de Neuritas de las imágenes de las neuronas del hipocampo del ratón. Los datos graficados son el valor medio ± la desviación estándar de los 2 pozos por concentración del compuesto.

La FIG. 4 es una fotografía de la técnica Western blot que muestra el efecto de HT-2157 en la expresión GalR3 en las células Neuroscreen 1 (NS1) como se desempeña por el Análisis Western blot de la expresión GalR3 en las células NS1 24 horas después del tratamiento con el vehículo (V) , HT-2157. La FIG. 5 es un diagrama que muestra el efecto del tratamiento con HT-2157 en la expresión del Hes5 en las células NS1 por el análisis qPCR de la expresión Hes5 en las células NS1. Las células NS1 se trataron con el vehículo (Veh) o HT-2157 durante 2 horas, 4 horas, o 24 horas . La FIG. 6A muestra el efecto de Hes5 desmontable por el siARN en la excrecencia de neuritas en las células NS1. La longitud de las neuritas en las células NS1 no tratadas y en las células NS1 tratadas con el vehículo, siARN de control, siARN de Hes5. La FIG. 6B muestra los puntos de ramificación de neuritas en las células NS1 no tratadas y en las células NS1 tratadas con el Vehículo, siARN de control, siARN de Hes5. La FIG. 7 muestra el efecto de HT-2157 en la excrecencia de neuritas en las células NS1. Los datos son representativos de la media +/- la desviación estándar de dos experimentos. Para cada experimento, se midió la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células. La cuantificación del efecto de HT-2157 en la excrecencia de neurita en las células NS1, 3µ? y ??µ? de HT-2157 facilitan la excrecencia de neuritas como se indica por un incremento en: i) el número de neuritas por célula (conteo de neuritas) , ii) la longitud de neuritas total por célula, iii) la longitud promedio de neuritas por célula, iv) el número de puntos de ramificaciones de neuritas por célula. La FIG. 8 muestra el efecto de HT-2157 en la expresión de mARN del factor neurotrófico derivado del cerebro con neurotrofinas (BDNF) y factor ß del crecimiento del nervio (NGFb) , y en la expresión del Hes5 en las neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. La media ± desviación estándar de 2 replicaciones experimentales se muestran. La FIG. 8A muestra el efecto de ??µ? de HT-2157 en la expresión BDNF. La FIG. 8B muestra el efecto de ??µ? de HT-2157 en la expresión NGF . La FIG 8C muestra el efecto de ??µ? de HT-2157 en la expresión Hes5. La FIG.9 muestra el efecto de NGF en la excrecencia de neuritas en las neuronas del hipocampo de ratón cultivadas. La media ± sem de las 8 replicaciones experimentales se muestra. Para cada experimento, se midió la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células. Las neuronas del hipocampo se trataron con 100ng/ml de GF durante 24 horas y el crecimiento de neuritas se midió en el Cellomics Arrayscan II. El NGF aumenta la excrecencia de neuritas como es evidente por el número creciente de las neuritas por células, la longitud creciente de neuritas y los puntos crecientes de ramificaciones. La FIG. 10 muestra la cuantificación del efecto de HT-2157 en la excrecencia de neuritas en las neuronas del hipocampo cultivadas. La media ± sem de las 8 replicaciones experimentales (96-pozos) por dosis de fármaco y 16 replicaciones por vehículo se muestran. Para cada experimento, se midió la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células. La FIG. 10A muestra la cuantificación de los efectos del HT-2157 en la excrecencia de neuritas en las neuronas del hipocampo como se determina por el efecto en el número de neuritas por célula. La FIG. 10B muestra la cuantificación de los efectos del HT-2157 en la excrecencia de neuritas en las neuronas del hipocampo como se determina por el efecto en la longitud total de neuritas por célula. La FIG. 10C muestra la cuantificación de los efectos del HT-2157 en la excrecencia de neuritas en las neuronas del hipocampo como se determina por el efecto en los puntos de ramificación de neurita por célula.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que las neuronas continúan proliferándose en el cerebro adulto (Arsenijevic, Y. et al., Exp. Neurol, 170: 48-62 (2001); Vescovi, A. L. et al, Biomed. Pharmacother . , 55:201-205 (2001); Cameron, H. A. and McKay, R. D. , J. Comp. Neurol, 435:406-417 (2001); and Geuna, S. et al, Anat . Rec, 265: 132-141 (2001)). Estrategias experimentales se están realizando ahora para transplantar el tallo neuronal en el cerebro adulto para diversas indicaciones terapéuticas (Kurimoto, Y. et al., Neurosci. Lett., 306:57-60 (2001); Singh, G., Neuropathology, 21: 110-114 (2001); y Cameron, H. A. and McKay, R. D., Nat . Neurosci., 2:894-897 (1999)). Mucho ya se sabe acerca de la neurogénesis en etapas embriónicas del desarrollo (Saitoe, M. and Tully, T., "Making connections between synaptic and behavioral plasticity in Drosophila", In Toward a Theory of Neuroplasticity, J. McCadaem and C. Shaw, Eds . (New York: Psychology Press.), pp. 193-220 (2000)). La diferenciación neuronal, extensión de neuritas y reconocimiento objetivo sináptico inicial, todos parecen presentarse en una manera independiente de la actividad. Los recientes estudios muestran que la activación de un receptor 5-HT1 incrementa la neurogénesis del hipocampo (Santarelli et al. Science. 8 de Agosto de 2003; 301 (5634): 805-9.) y la excrecencia de neuritas (Fricker et al. Brain Res Mol Brain Res. 18 Agosto de 2005; 138(2): 228-35) . En este estudio, se examinaron los efectos del HT-2157 en el aumento de la excrecencia de neuritas y los mecanismos fundamentales para la modulación de la excrecencia de neuritas se exploraron tanto en cultivos neuronales de un sub-clon PC12 y de ratón primario. Los resultados demuestran que el HT-2157 aumenta significativamente la excrecencia de neuritas de las células PC12 y neuronas de ratón primarias. Además, el HT-2157 subregula la expresión del Hes5, un homólogo vertebrado de la proteina vellosa de hélice-rizo-hélice básica de Drosophila (bHLH) , el cual es conocido por ser un represor transcripcional que regula negativamente la diferenciación neuronal. Tomados juntos, estos hallazgos indican que el aumento de la excrecencia de neuritas por HT-2157 se media a través del control del avance de la diferenciación neuronal. Como se usa en la presente, el término "animal" o "sujeto" incluye mamíferos, así como otros animales, vertebrados e invertebrados (por ejemplo, aves, pescados, reptiles, insectos (por ejemplo, Especies de Drosophila) , moluscos (por ejemplo, Aplisia) . Los términos "mamífero" y "mamíferos", como se usan en la presente, se refieren a cualquier animal vertebrado, incluyendo monotremas, marsupiales y placentarios, que amamantan a sus crías y ya sea dan a luz a las crías vivas (mamíferos eutarianos o placentarios) o son ovíparos (mamíferos metatarianos o no placentarios) . Los ejemplos de especies mamíferas incluyen humanos y primates (por ejemplo, monos, chimpancés) , roedores (por ejemplo, ratas, ratones, conejillos de indias) y rumiantes (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos) .

El animal o sujeto puede ser un animal con alguna forma o grado de deterioro de neuritas. El término "célula madre" o célula madre neuronal (NSC) ) como se usa en la presente, se refiere a una célula no diferenciada que es capaz de auto-regeneración y diferenciación en las neuronas, astrocitos y/o oligodendrocitos . El término "célula progenitora" (por ejemplo, célula progenitora neuronal) como se usa en la presente se refiere a una célula derivada de una célula madre que no es por si misma una célula madre. Algunas células progenitoras pueden producir progenie que son capaces de diferenciar más de un tipo celular. Como se usa en la presente "tratar" incluye prevención, aminoración, alivio y/o eliminación de la enfermedad, trastorno o condición a tratarse o uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o condición a ser tratada así como la mejora general de un paciente cuando se mide por el criterio objetivo y/o subjetivo. En algunas modalidades, tratar se usa para invertir, atenuar, minimizar, suprimir o interrumpir los efectos no deseados o nocivos o efectos del avance de una enfermedad, trastorno o condición del sistema nervioso periférico y/o central. En otras modalidades, el método de tratamiento puede ser ventajosamente usado en casos donde la neurogénesis adicional o excrecencia de neuritas reemplazaría, repondría o incrementaría el número de las células perdidas debido a la lesión o enfermedad. La presente invención se refiere a la administración de los antagonistas del receptor de galanina-3 (GalR3) para modular la excrecencia de neuritas. En una modalidad el método se dirige a la modulación de la excrecencia de neuritas por la administración de un antagonista del receptor de galanina-3 a un animal. En una modalidad la excrecencia de neuritas se aumenta o incrementa por la administración de un antagonista del receptor de galanina-3 a un animal relativo al crecimiento normal en la ausencia del antagonista del receptor de galanina-3. En otra modalidad el método se dirige a tratar a un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto un antagonista del receptor de galanina-3. En una modalidad el método se dirige a tratar un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto una cantidad del compuesto antagonista del receptor de alanina-3 efectivo para tratar la lesión nerviosa o trauma del sujeto, en donde el compuesto antagonista del receptor de Galanina-3 tiene la estructura: en donde cada uno de Yi, Y2, Y3, y Y es independientemente -H; alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada o alquinilo; cicloalquilo C3-C7, o cicloalquenilo C5-C7; -F, -Cl, -Br, o -I; -N02; -N3; -CN; -OR4, -SR , -OCOR4, -COR4, -NCOR4, -N(R4)2, -CON(R4)2, o -COOR4; arilo o heteroarilo; o cualquiera de dos de Yi, Y2, Y3 y Y4 presentes en un átomo de carbono adyacentes pueden constituir un grupo metilenodioxi ; en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo ??- ' C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o arilalquilo (Ci-C6) ; en donde A es A', alquilo Ci~C7 de cadena lineal o ramificada, arilo, heteroarilo, arilalquilo (Ci-C6) o heteroarilalquilo en donde ?' ? en donde Rx y R2 son cada uno independientemente H, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, - Br, -I, -N02, o -CN; en donde R3 es H, alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -OR5, arilo o heteroarilo; 'en donde R5 es alquilo C1-C7 de cadena lineal' o ramificada, -N(R4)2, -OR6 o arilo; en donde R6 es alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada o arilo; en donde B es arilo, o heteroarilo; con la condición sin embargo, si B es arilo o heteroarilo el átomo de carbono o átomos de carbono orto para el átomo de nitrógeno del enlace imina pueden solamente substituirse con uno o más de los siguientes: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, metilo, etilo o metoxi; en donde cada n es independientemente un entero desde 1 hasta 4 inclusive; en donde el compuesto es un isómero imina Z puro, un isómero imina E puro, o una mezcla de los isómeros imina Z y E; En la presente invención, el término "alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada" se refiere a una porción de hidrocarburos saturados que tienen uno hasta siete átomos de carbono inclusive. Los ejemplos de tales substituyentes incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, 1-propilo, 2-propilo, 1-butilo, 2-butilo, 2-metil-2-propilo y 2-metil-1-propilo. El término "alquenilo C2-C7" se refiere a una porción de hidrocarburos mono-insaturados que tiene dos hasta siete átomos de carbono inclusive. Los ejemplos de tales substituyentes incluyen, pero no se limitan a, etenilo, prop-l-en-l-ilo, prop-l-en-2-ilo, prop-2-en-l-ilo, but-3-en-2-ilo y hept-2-en-l-ilo . El término "alquinilo C3-C7" se refiere a una porción de hidrocaburos que tiene desde tres hasta siete átomos de carbono y que contiene un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos de tales substituyentes incluyen, pero no se limitan a, prop-1-inilo, prop-2-inilo, pent-2-inilo, , -dimetilpent-2-inilo, 5-metilhex-3-in-2-ilo y hept-3-inilo . Como se usa en la presente invención, el término "cicloalquilo" incluye porciones cicloalquilo C3-C7 las cuales pueden substituirse con uno o más de los siguientes: -F, -NO2, -CN, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, polifluoroalquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo C3-C7, monofluorocicloalquilo C3-C-7, polifluorocicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, -N(R4)2, -0R4, -COR4, -NCOR , -C02R4, -CON(R4)2 o (CH2)n-0- (CH2)m-CH3, en donde cada m es independientemente un entero desde 0 hasta 2 inclusive. Como se usa en la presente invención, el término "cicloalquenilo" incluye las porciones cicloalquenilo C5-C7 las cuales pueden substituirse con uno o más de los siguientes: -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, alquilo Ci-C de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, polifluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo C3-C7, monofluorocicloalquilo C3-C7, polifluorocicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, -N(R4)2, -OR4, -COR4, -NCOR4, -C02R4, -CON(R4)2 O (CH2) n-O- (CH2)m-CH3, en donde cada m es independientemente un entero desde 0 hasta 2 inclusive. En la presente invención, el término "heteroarilo" se usa para incluir anillos no saturados de cinco y seis miembros que pueden contener uno o más átomos de oxigeno, azufre o nitrógeno. Los ejemplos de los grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, y triazinilo. Además el término "heteroarilo" se usa para incluir sistemas de anillos biciclicos fusionados que pueden contener uno o más heteroátomos tales como oxigeno, azufre y nitrógeno. Los ejemplos de tales grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, indolizinilo, indolilo, isoindolilo, benzo [b] furanilo, benzo [b] tiofenilo, indazolilo, benzimidazolilo, purinilo, benzoxazolilo, benzisoxazolilo, benzo [b] tiazolilo, imidazo[2,l-b] tiazolilo, cinolinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo , 1,8-naftiridinilo, pteridinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, ftalimidilo y 2 , 1 , 3-benzotiazolilo . El término "heteroarilo" también incluyen aquellas porciones químicas mencionadas arriba, las cuales pueden substituirse con uno o más de los siguientes: -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, polifluoroalquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo C3-C7, monofluorocicloalquilo C3-C7, polifluorocicloalquilo 03-07, cicloalquenilo C5-C7, -N(R4)2, -0R4, -COR4 -NCOR4, -C02R4, -CON(R4)2 o (CH2) n-0- (CH2)m-CH3, en donde cada m es independientemente un entero desde 0 hasta 2 inclusive. El término "heteroarilo" además incluye los N-óxidos de aquellas porciones químicas mencionadas arriba las cuales incluyen al menos un átomo de nitrógeno. En la presente invención el término "arilo" es fenilo o naftilo. El término "arilo" también incluye fenilo y naftilo los cuales pueden substituirse con uno o más de los siguientes: -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, polifluoroalquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo C3-C7, monofluorocicloalquilo C3-C7, polifluorocicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, -N(R4)2, -OR4, -SR4, -OCOR4, -COR4, -NCOR4, -C02R4, -CON(R4)2 o (CH2)n-0- (CH2) m-CH3, en donde cada m es independientemente un entero desde 0 hasta 2 inclusive. La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que necesita del tratamiento para una lesión y/o trauma celular nervioso el cual comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un Compuesto antagonista del receptor de galanina-3, en donde el compuesto antagonista del receptor de galanina-3 tiene la estructura : en donde cada í es independientemente uno o más de los siguientes: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo es opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o OR4 ; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci~ C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo ; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o arilalquilo (C1-C6) . En los métodos descritos en la presente, el compuesto contiene un enlace imina, el cual puede potencialmente tener una estereoconfiguración Z o E. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es un isómero imina Z puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es un isómero imina E puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es una mezcla de los isómeros imina Z y E. En los métodos descritos en la presente, el compuesto pueden contener un enlace alqueno, el cual puede potencialmente tener una esteroconfiguración Z o E. Por ejemplo, el compuesto puede contener un grupo Y2 enlazado a la posición 5 de un sistema del anillo de indolona, en donde Y2 es but-2-en-l-ilo . Tal grupo butenilo puede potencialmente tener una estereoconfiguración Z o E. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es un isómero de alqueno Z puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es un isómero de alqueno E puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es una mezcla de los isómeros alqueno Z y E. En los métodos descritos en la presente, el compuesto puede contener una o más porciones que son capaces de la quiralidad. Tales porciones pueden incluir, pero no se limitan a, átomos quirales tetravalentes o sistemas de anillos con limitación de rotación que dan lugar a los planos disimétricos perpendiculares. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es enantioméricamente o diastereoméricamente puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es enantioméricamente o diastereoméricamente puro. En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es una mezcla de los enantiómeros . En una modalidad de cualquiera de los métodos descritos en la presente, el compuesto es una mezcla de diastereómeros . En una modalidad, el compuesto se administra oralmente . En una modalidad, el compuesto tiene la estructura: en donde ca 2, Y3, y Y4 es independientemente -H; alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, -CF3, -F, -Cl, -Br, -I, -OR4, -N(R4)2, o -CON(R4)2; en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, -CF3, o fenilo; en donde A es A', alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, arilo, heteroarilo, arilalquilo (Ci-C6) o heteroarilalquilo (Ci-C6) ; y en donde ?' es En una modalidad, B es heteroarilo. En otra modalidad, B es arilo. En una modalidad, B es fenilo y el fenilo está opcionalmente substituido con uno o más de los siguientes: -H, -F, -Cl, -Br, -CF3, alquilo Ci-C de cadena lineal o ramificada, -N(R )2, -0R4, -COR4, -NC0R4, -C02R , o -CON(R4)2.

En una modalidad, A es arilo. En otra modalidad, A es heteroarilo . En una modalidad, el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: En una modalidad, el compuesto se selecciona del grupo En una modalidad, A es A' y A' es En una modalidad, el compuesto es una modalidad, A es arilo. En otra modalidad, arilo . En una modalidad, A es heteroarilalquilo (Ci-Ge) · En una modalidad, el compuesto es: En las modalidades particulares, el antagonista del receptor de galanina-3 es HT-2157 ( 1, 3-dihidro-l-fenil-3 [ [3-trifluorometil) fenil] imino] -2H-indol-2-ona; CAS No. 303149-14-6.

Otros ejemplos de antagonistas del receptor de galanina-3 pueden encontrarse en la Patente de E.U.A. No. 7,081,470, Publicación de E.U.A. No. US2003/078271A1; y Publicación internacional No. WO2004/093789, las cuales se incorporan para referencia en su totalidad. Los compuestos pueden prepararse usando la metodología proporcionada en la Patente de E.U.A. No. 7,081,470, Publicación de E.U.A. No. US2003/078271 Al; y Publicación internacional No.

WO2004/093789, las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Se contempla que la administración de los compuestos antagonistas del receptor de galanina-3 (Gal3R) pueden ser solos o con la administración de otros compuestos por ejemplo, benzodiazepina o inhibidores de la reabsorción de serotonina selectiva (SSRI) . El método o tratamiento puede comprender administrar una combinación de las medicaciones primarias para las afecciones dirigidas para el tratamiento y un antagonista-del receptor de galanina-3. En algunos casos el antagonista del receptor de galanina-3 tiene un efecto sinérgico con un agente terapéutico adicional para tratar la enfermedad objetivo para el tratamiento. Cuando se administra como una combinación, los compuestos terapéuticos pueden formularse como composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o secuencialmente en tiempos diferentes o los compuestos terapéuticos pueden darse como una composición sencilla . El modo de administración es preferiblemente en la ubicación de las células objetivo. En una modalidad particular, el modo de administración es a las neuronas. La presente invención proporciona un método para tratar, inhibir o aminorar los efectos de las lesiones o enfermedades que resultan en la degeneración neuronal o un método para promover la neurogénesis o excrecencia de neuritas. Estos métodos involucran administrar a un paciente que necesita del mismo una cantidad efectiva de al menos un antagonista del receptor de galanina-3. Se encuentra que el antagonista del receptor de galanina-3 de la presente invención promueve la excrecencia de neuritas y la neurogénesis. Alternativamente, al menos un antagonista del receptor de galanina-3 de la presente invención se usa para tratar las células madre o células progenitores neuronales previo a las células administradas al paciente por la implantación en el sitio de la degeneración neuronal. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente involucran modular la neurogénesis o excrecencia de neuritas ex vivo con el compuesto antagonista del receptor de galanina-3 tal que una composición que contiene las células madre neuronales, células progenitoras neuronales y/o células neuronales diferenciadas puedan posteriormente administrarse a un individuo para tratar una enfermedad o condición. En algunas modalidades, el método de tratamiento comprende las etapas de poner en contacto una células madre neuronal o célula progenitora neuronal con uno o más compuestos de la invención para modular la excrecencia de neuritas y transplantar las células en un paciente que necesite del tratamiento. Los métodos de transplante de las células madre y progenitoras son conocidos en la técnica. En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten el tratamiento de las enfermedades o condiciones por reemplazar directamente o reponer neuronas dañadas o disfuncionales. El método de la presente invención el cual promueve la neurogénesis se involucra en la renovación celular en el sistema nervioso central (SNC) e incluye todos los tipos de células del SNC. Una modalidad de la presente invención se usa para tratar las lesiones del sistema nervioso central, por ejemplo, lesiones de cabeza cerrada y traumatismo, tales como aquellas causadas por la participación en los deportes peligrosos, trauma penetrante, tales como heridas de bala, apoplejía hemorrágica, apoplejía isquémica, glaucoma, isquemia cerebral, o daños causados por la cirugía tales como extirpación de tumores o pueden aun promover la regeneración del nervio con objeto de aumentar o acelerar la curación de tales lesiones o de las enfermedades neurodegenerativas tales como aquellas discutidas a continuación. Además, el método puede usarse para tratar, inhibir o aminorar los efectos de la enfermedad o trastorno que resulta en un proceso degenerativo. Una modalidad de la presente invención se usa para inhibir la degeneración secundaria la cual por otro lado sigue las lesiones del sistema nervioso primario. Los compuestos de la invención pueden usarse para tratar diversas enfermedades o trastornos del sistema nervioso central- o periférico, incluyendo neuropatía diabética, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) . Las lesiones del nervio periférico y neuropatías localizadas o periféricas incluyen, pero no se limitan a, porfiria, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, complicaciones de diversos fármacos y toxinas, polineuropatía amiloide, adrenomieloneuropatía, neuropatía axonal gigante, pueden ser tratadas por este método. Además los compuestos pueden usarse para los tratamientos post-operativos tales como la remoción de tumores del SNC y otras formas de cirugía en el SNC. Los compuestos pueden usarse para el tratamiento de trauma de la médula espinal. El antagonista del receptor Gal-3 puede administrarse junto con otros componentes de los agentes biológicamente activos, tales como tensoactivos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, glicéridos) , excipientes (por ejemplo, lactosa), estabilizadores, conservadores, humectantes, emolientes, antioxidantes, portadores, diluyentes y vehículos. Si se desea, ciertos agentes edulcorantes, saborizantes y/o colorantes pueden también agregarse.

El antagonista del receptor Gal-3 puede formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de tales vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, solución de dextrosa, y albúmina de suero humano al 5%. Las liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos también se pueden usar. El vehículo o el polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, manitol) y estabilidad química (por ejemplo, soluciones amortiguadoras y conservadores) . La formulación puede esterilizarse por técnicas comúnmente usadas. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences. Las dosis del antagonista del receptor de Gal-3 que se administran a un animal es aquella cantidad requerida para efectuar un cambio en la excrecencia de neuritas. La dosis administrada a un animal, incluyendo frecuencia de administración, variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo características farmacodinámicas del antagonista del receptor Gal-3 particular, modo y ruta de administración, tamaño, edad, sexo, salud, peso corporal y dieta del receptor; naturaleza y extensión de los síntomas a ser tratados o naturaleza y extensión de las funciones cognitivas que se aumentan o modulan, tipo de tratamiento paralelo, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. En la aplicación al sujeto de una "cantidad terapéuticamente efectiva", es cualquier cantidad de un compuesto la cual, cuando se administra a un sujeto que padece de una enfermedad contra la que los compuestos son efectivos, causa la modulación de la excrecencia de neuritas . El antagonista del receptor Gal-3 puede administrarse en una dosis sencilla o dividida (por ejemplo, una serie de dosis separada por intervalos de días, semanas o meses) o en una forma de liberación sostenida, dependiendo de los factores tales como la naturaleza y extensión de los síntomas, tipo de tratamiento actual y el efecto deseado. Otros regímenes terapéuticos o agentes pueden usarse en conjunto con la presente invención. Por ejemplo, el antagonista del receptor Gal-3 puede administrarse diariamente durante un periodo de tiempo. La presente invención ahora se ilustrará por el siguiente ejemplo, el cual no se considera como limitante de ninguna manera.

DETALLES EXPERIMENTALES Síntesis de los Compuestos Químicos La siguiente descripción ilustra los métodos que pueden usarse para sintetizar los compuestos de indolona de esta invención. La síntesis de los compuestos se describe en la patente de E.U.A. No. de serie 11/608,746, presentada el 6 de Diciembre de 2006, la cual se incorpora para referencia en su totalidad. Métodos Generales Todas las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de argón y los reactivos, puros o en solventes apropiados, se transfirieron al recipiente de reacción por medio de técnicas de jeringa y cánula. Los solventes anhidros se adquirieron de la compañía química Aldrich y se usaron como se recibieron. Los compuestos descritos a continuación se nombraron usando el programa ACD/Name (versión 4.01, Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario, M5H2L3, Canadá) . Los espectros XH RMN y 13C RMN se registraron en ya sea 300 MHz (GEQE Plus) o 400 MHz (Bruker Avance) en el CDC13 como solvente y tetrametilsilano como el estándar interno a menos que se indique de otra manera. Los giros químicos (d) se expresaron en ppm, constantes de acoplamiento (J) se expresaron en Hz, y los patrones de división se describen como sigue: s = singlete; d = doblete; t = triplete; q = cuarteto; quinteto; sexteto; septeto; br = ancho; m = mutiplete; dd = doblete de dobletes; dt = doblete de triplete. Los análisis elementales se realizaron por Robertson Microlit Laboratories, Inc. A menos de que se indique de otra manera, los espectros de masas se obtuvieron usando ionización de electrorocío (ESI, Micromass Platform II) y el MH+ se reportó. La cromatografía de capa delgada (CCD) se realizó en placas de cristal pre-cubiertas con gel de sílice 60 F254 (0.25 mm, E Separations Tech.). La CCD preparativa se llevó a cabo en láminas de vidrio pre-cubiertas con gel de sílice GF (2 mm, Analtech) . La cromatografía de columna instantánea se realizo en gel de sílice 60 de Merck (malla 230-400) . Los puntos de fusión (p.f.) se determinaron en tubos capilares abiertos en un aparato Mel-Temp y no se corrigieron. Las siguientes abreviaturas adicionales se usaron: HOAc, ácido acético; DIPEA, diisopropiletilamina ; DMF, N,N-dimetilformamida ; EtOAc, acetato de etilo; MeOH, metanol; TEA, trietilamina; THF, tetrahidrofurano; todas las relaciones de solventes están en volumen/volumen a menos de que se indique de otra manera.

I. Procedimiento General para Preparar las Indolonas Los métodos que siguen demuestran los procedimientos útiles para sintetizar los compuestos de esta invención (ilustrados en los Esquemas de reacción 1-5). Las isatinas substituidas útiles para sintetizar los compuestos de esta invención pueden alternativamente obtenerse usando los procedimientos descritos en las siguientes referencias: Garden, S. J.; Da Silva, L. E.; Pinto, A.C.; Synthetic Communications, 1998, 28, 1679 - 1689. Coppola, G.M.; Journal of Heterocyclic Chemistry, 1987, 24, 1249. Hess, B. A. Jr; Corbino, S . ; Journal of Heterocyclic Chemistry, 1971, 8, 161. Bryant, W. ?. III; Huhn, G.F.; Jensen, J.H.; Pierce, M. E . ; Stammbach, C; Synthetic Communications, 1993, 23, 1617 - 1625.

Procedimiento General para la Síntesis de Iminoisatinas La isatina apropiadamente substituida (10 mg - 10 g) se colocó en un matraz y la anilina apropiada (1.0 - 1.1 equivalentes) se agregó y la mezcla se agitó hasta homogeneidad. La mezcla luego se calentó hasta 110°C durante 2-7 horas y luego se enfrió. Los sólidos se cristalizaron del metanol caliente y se filtraron, dando los productos deseados (usualmente como una mezcla de interconversión inseparable de los isómeros E/Z) . Procedimie o A: 1- (3-tienil) -lH-indol-2, 3-diona: Trietilamina (56.9 mL, 0.408 mol), se agregó a una mezcla de 1H-INDOL-2 , 3-DIONA (15.0 g, 0.102 mol), acetato de cobre (II) (46.0 g, 0.255 mol), y ácido 3-tienilborónico (19.6 g, 0.153 mol) en CH2Cl2 (500 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante la noche,- se filtró a través de Celite®, se enjuagó con EtOAc/hexano (1:1, 300 mL) , y se concentró in vacuo. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna en sílice usando Hexano/EtOAc (1:1), dando el producto deseado (1.1 g, 50 %) . Procedimiento B: (3E) -3- [ (4-metilfenil) imino] -1- (3-tienil) -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una solución de 1- ( 3-tienil ) -lH-indol-2 , 3-diona (20 mg, 0.087 mmol) en 1% de HOAc/MeOH (8 mL) se agregó a una solución de p-toluidina (19 mg, 0.18 mmol) en 1% de HOAc/MeOH (8 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a temperatura ambiente, se calentó a 50°C durante 1 h, y se concentró in vacuo. El residuo se purificó por CCD preparativa en sílice usando EtOAc/hexanos (3:7, 0.1 % TEA) dando el producto deseado (14 mg, 50%). Procedimiento C: ( 3Z ) -5-bromo- 3- { { 3- ( trifluorometil ) fenil ] imino } -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de 5-bromo-lH-INDOL-2,3-DIONA (1.0 g, 0.442 mmol) y 3-trifluorometilanilina (0.993 g, 6.2 mmol) en una solución de 1% de ácido acético en metanol se agitó a 50°C durante 12 h. El producto crudo se concentró in vacuo, dando el producto crudo deseado (640 mg, 40%) .

Procedimiento D: (3Z) -5-bromo-l-fenil-3-{ [3-trifluorometil ) fenil ] imino } -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de ( 3Z ) -5-bromo-3- { [ 3- (trifluorometil ) fenil] imino}-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona (100 mg, 0.272 mmol), acetato de cobre (II) (54 mg, 0.33 mmol) , trietilamina (82.8 mg, 0.817 mmol) y ácido bencen borónico (40 mg, 0.325 mmol) en 5 mL de CH2C12 se agitó a temperatura ambiente durante 12 h. La mezcla cruda se concentró in vacuo y se purificó por CCD preparativa usando EtOAc:hexano (3:7, 1% de Trietilamina), dando el producto deseado (22 mg, 20%) . Procedim ento E; (3Z)-l,5-difenil-3-{ [3- (trifluorometil ) fenil ] imino } -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de ( 3Z ) -5-bromo-l-fenil-3-{ [3-( trifluorometil ) fenil ] imino }-l,3-dihidro-2H-indol-2-ona (22 mg, 0.05 mmol), tetraquis ( t rifenilfosfina ) paladio (O) (12.0 mg, 0.01 mmol), ácido bencen borónico (10 mg, 0.08 mmol) en THF (5 mL) , y Na2C03 acuoso (2M, 100 yL) se calentó a 67°C durante 24 h. El producto crudo se concentró in vacuo y el residuo se extrajo con CH2C12 (3 x 1 mi), se concentró, y se purificó por CCD preparativa usando 10% de metanol en CHC13, dando el producto deseado (4 mg, 18%) .

Proced miento F: 1- [ (5-cloro-l-benzotien-3-il)metil] -2H-indol-2, 3-diona: Una solución de isatina (125mg, 0.85 mmol) en dioxano anhidro (10 mL) se agregó gota a gota a una solución de hidruro de sodio (60% en dispersión en aceite mineral, 25 mg, 0.62 mmol) en dioxano anhidro (10 mL) a 0°C bajo argón. La mezcla se permitió agitar durante 5 minutos y luego una solución de 3- (bromometil ) -5-clorobenzo [b] tiofeno (267 mg, 1.02 mmol) en dioxano (10 mL) se agregó gota a gota a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se calentó a reflujo bajo argón durante 16 h y se concentró in vacuo. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando 1:24 metanol en cloroformo como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (125 mg, 0.38 mmol, 45%). Proced miento G: 1- [ ( 5-cloro-l-benzotien-3-il') metil ] -3- { [3-( trifluorometil ) fenil ] imino } -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de 1- [( 5-cloro-l-benzotien-3-il) metil] -2H-indol-2 , 3-diona (50 mg, 0.15 mmol) y 3-trifluoromet ilanilina (0.020 mL, 0.15 mmol) se calentó puro a 140°C durante 2 h. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando una mezcla 1:3 de acetato de etilo y hexano como eluyente dando el producto deseado como un sólido amarillo (13 mg, 0.030 mmol, 18%) .

Procedimiento H: 6-metoxi-l-fenil-lH-indol-2 , 3-diona : Una solución de N- ( 3-metoxifenil) -N-fenilamina (1.14 g, 5.72 en éter (3 mL) se agregó a una solución de cloruro de oxalilo (728 g, 5.75 mmol) y se calentó a reflujo durante 1 h. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente, se concentró hasta secarse, y se volvió a disolver en nitrobenceno (35 mL) . La solución se agregó a una solución de A1C13 en nitrobenceno (0.762 g, 5.72 mmol), y la mezcla resultante se calentó a 70°C durante 16 h. El producto crudo se concentró in vacuo y se purificó por cromatografía de columna usando EtOAc/hexano (1:1), dando el producto deseado 60, mg, 50 %) . Los Compuestos 2-17, inclusive, se adquirieron de Bionet Research Ltd., 3 Highfield Industrial Estate, Camelford, Cornwall PL32 9QZ, UK. Estos compuestos pueden también sintetizarse usando el procedimiento general descrito arriba. Compuesto 1: 3- [ ( 2-metoxifenil ) imino] -1-fenil-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 2: 1-fenil-3- [ [ 3- ( trifluorometil ) fenil] imino] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 3: 3- [ (3-metilfenil) imino] -1-fenil-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 4: 3- [ ( 3-clorofenil ) imino] -1-fenil-1 , 3- dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 5: 1-fenil-3- [ [ 4 (trifluorometil) fenil] imino] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 6: 3- [ ( 4-metilfenil ) imino] -1-fenil-1 , 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 7: 3- [ ( 4-clorofenil ) imino] -1-fenil-l, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 8: 3- [ (4-bromofenil) imino] -1-fenil-l, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 9: 3- [ ( 4-fluorofenil ) imino] -1-fenil-l, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 10: 3- [( 4-fenoxifenil ) imino] -1-fenil-1 , 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 11: 3- [ (4-etoxifenil) imino] -1-fenil-l, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 12: 3- [ ( 4-metoxifenil ) imino] -1-fenil-l, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 13: 3- [( 3 , 5-diclorofenil ) imino] -1-fenil-1 , 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 14: 3- [ (3, 5-dimetilfenil ) imino] -1-fenil-1, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 15: l-alilo-3- [ (3, 4-diclorofenil) imino] -1, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 16:. l-alilo-3- [ (3, 5-diclorofenil) imino] -1, 3 dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 17: 3- [ (4-bromofenil) imino] -1-isopropil-l , 3-dihidro-2H-indol-2-ona Compuesto 18j 1- [ ( 5-cloro-2-tienil) metil] -3- ( { 3- ( trifluorometil ) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de 1- [ (5-cloro-2-tienil)metil] -2H-indol-2, 3-diona (25 mg, 0.09 mmol) (preparado como se describe a continuación) y 3-trifluorometilanilina (11.3 µ??, 0.09 mmol) se calentó puro a 140°C durante 2 h. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando una mezcla de 3:7 acetato de etilo en hexano como eluyente, dando el producto deseado (23 mg, 0.05 mmol, 61 %) . ?? RMN (400 MHz): d (isómero mayor) 7.57 (t, J = 7.7, 1H) , 7.53 (t, J = 7.8, 1H), 7.33 (t, J = 7.8, 1H) , 7.28 (s, 1H) , 7.19 (d, J = 7.6, 2H), 6.94 - 6.72 (m, 4H) , 6.56 (d, J = 7.7, 1H) , 5.02 (s, 2H) ; ESI-EM m/z encontrado 421 (MH+) . 1- [ (5-cloro-2-tienil) metil] -2H-indol-2, 3-diona : Una solución de isatina (125 mg, 0.85 mmol) en dioxano anhidro (10 mL) se agregó gota a gota a una solución de hidruro de sodio (60% en dispersión en aceite mineral, 24 mg, 0.62 mmol) en dioxano anhidro (10 mL) a 0°C bajo argón. La mezcla se permitió agitar durante 5 minutos y luego 2-cloro-5- (clorometil) tiofeno (0.12 mL, 1.02 mmol) en dioxano (10 mL) se agregó gota a gota a la mezcla resultante. La mezcla de reacción se calentó a reflujo bajo argón durante 16 h y se concentró in vacuo. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando 1:24 metanol en cloroformo como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (53 mg, 0.19 mmol, 22 %). 1H RMN (400 MHz) : d 7.62 (d, J = 7.4, 1H) , 7.56 (t, J = 7.8, 1H) , 7.14 (t, J = 7.7, 1H) , 6.94 (d, J = 8.0, 1H) , 6.90 (d, J = 3.2, 1H) , 6.78 (d, J = 3.7, 1H) , 4.90 (s, 2H) . Compuesto 19j 1- (3-tienil) -3-{ [3- ( trifluorometil ) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Una mezcla de 1- (3-tienil) -2H-indol-2, 3-diona (25 mg, 0.11 mmol) (preparado como se describe a continuación) y 3-trifluorometilanilina (14 uL, 0.11 mmol) se calentó puro a 140°C durante 2 h. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando una mezcla de 3:7 acetato de etilo y hexano como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (7.3 mg, 0.02 mmol, 22 %) . 1 RMN (400 MHz) d 7.62 - 7.19 (m, 9H) , 6.94 (d, J = 8.0, 1H) , 6.76 (t, J = 7.6, 1H) ; ESI-EM m/z encontrado 373 (MH+) . 1- (3-tienil) -2H-indol-2, 3-diona: Monohidrato de acetato de cobre (II) (4.25 g, 23.4 mmol) se calentó a reflujo en anhídrido acético (30 mL) durante 2 h. La mezcla se filtró y se lavó con éter anhidro (500 mL) . El sólido se secó in vacuo a 55°C durante 16 h. Diclorometano (1 mL) se agregó a una mezcla de acetato de cobre (II) (62 mg, 0.34 mmol), isatina (50 mg, 0.34 mmol), y ácido tiofeno-3-borónico (87 mg, 0.68 mmol), seguido por Trietilamina (0.10 mL, 0.68 mmol) bajo argón. La solución resultante se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción luego se recargó con 0.10 mmol de acetato de cobre (II), 0.10 mmol de ácido 3-tiofeno borónico y 1 gota de Trietilamina, y la mezcla se calentó a 50°C durante 6 h. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando 3:97 metanol en Cloroformo como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (25 mg, 0.11 mmol, 33 %)s. 1H RMN (400 MHz): d 7.70 (d, J = 7.5, 1H) , 7.58 (t, J = 7.8, 1H), 7.50 (d, J = 5.1, 1H) , 7.48 (s, 1H) , 7.24 (d, J = 5.1, 1H), 7.18 (t, J = 7.51, 1H), 7.05 (d, J = 8.0, 1H) . Compuesto 20: 2-metil-5- [ ( 2-oxo-l-fenil-1 , 2-dihidro-3H-indol-3-ilideno) amino] -2H-isoindol-l, 3 (2H) -diona : Una mezcla de 1-fenilisatina (50 mg, 0.22 mmol) y 4-amino-N-metilftalimida (40 mg, 0.22 mmol) se calentó puro a 215°C durante 2 h. El material crudo se purificó por CCD preparativa usando una mezcla de 3:7 acetato de etilo y hexano como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (8 mg, 0.02 mmol, 10 %). XH RMN (400 MHz): d 7.88 (d, J = 7.8, 1H) , 7.83 - 7.80 (m, 1H) , 7.51 (t, J = 7.5, 1H), 7.47 - 7.18 (m, 6H) , 7.02 (t, J = 8.0, 1H) , 6.91 - 6.79 (m, 2H), 6.58 (d, J = 7.5, 1H) , 3.22 (s, 3H) ; ESI-EM m/z encontrado 382 (MH+) . Compuesto 21: 1- [ (5-cloro-l-benzotien-3-il)metil] -3-{ [3- (trifluorometil) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2- ona: 1- [ ( 5-cloro-l-benzotien-3-il ) metil] -2H-indol-2, 3-diona Se preparó por el procedimiento F. 1ti RMN (400 MHz) : d 7.89 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.5, 1H) , 7.65 (d, J = 7.5, 1H) , 7.54 (t, J = 8.0, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.38 (d, J = 8.5, 1H) , 7.14 (t, J = 7.5, 1H), 6.88 (d, J = 7.8, 1H) , 5.13 (s, 2H) . A partir de este intermediario, 1- [ (5-cloro-l-benzotien-3-il) metil] -3-{ [3- ( trifluorometil ) fenil] -imino}-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona se preparó por el procedimiento G. XH RMN (400 MHz): d 7.98 (d, J = 2.0, 1H) , 7.80 (d, J = 8.6, 1H) , 7.58 (t, J = 7.7, 1H), 7.52 (d, J = 8.1, 1H) , 7.43 (s, 1H) , 7.38 (dd, J = 8.6, 1.9, 1H) , 7.31 (singlete traslapado y dt, J = 1.2, 7.8, 2H) , 7.24 (d, J = 7.8, 1H) , 6.87 (d, J = 7.9, 1H) , 6.77 (t, J = 7.7, 1H) , 6.59 (d, J = 7.7, 1H) , 5.20 (s, 2H) . ESI-EM m/z encontrado 471 (MH+ con 35C1), 473 (MH+ con 37C1) . Compuesto 22 : 3- (lH-indol-5-ilimino) -1-fenil-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : 1-Fenilisatina (51.8 mg, 0.23 mmol) y 5-aminoindol (31 mg, 0.23 mmol) se mezclaron y se calentaron a 140°C durante 2 h. El producto crudo resultante se purificó por CCD preparativa usando acetato de etilo/hexano (6:4) como eluyente, dando el producto deseado como, un sólido amarillo (10.8 mg, 14%). 1H RMN (400 MHz): d 8.28 (s, 1H) , 7.57 (t, J = 7.7, 2H) , 7.49 - 7.40 (m, 6H) , 7.29 - 7.23 (m, 1H) , 7.03 (dd, J = 8.5, 1.7, 1H) , 6.98 (d, J = 7.6, 1H), 6.83 (d, J = 8.0, 1H) , 6.74, J = 7.6, 1H), 6.59 (s, 1H) ; ESI-EM m/z encontrado 338 (MH+) . Compuesto 23: 3- [ ( 6-cloro-3-piridinil ) imino] -1-fenil-1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : 1-Fenilisatina (23.0 mg, 0.10 mmol) y 5-amino-2-cloropiridina (12.8 mg, 0.10 mmol) se mezclaron y se calentaron a 140°C durante 7 h. El producto crudo resultante se purificó por CCD preparativa usando hexano/acetato de etilo (8:2) como eluyente, dando el producto deseado como un sólido amarillo (19.7 mg. 59%) . 1H RMN (400 Hz ) d 8.15 (d, J = 8, 1H) , 7.6 - 7.2 (m, 9H) , 6.85 - 6.75 (m, 2H) ; ESI-EM m/z encontrado 334 (MH+) . Compuesto 24: 3- [ (2-metil-l, 3-benzotiazol-5-il ) imino] -1-fenil-l, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : El 5-Amino-2-metilbenzotiazol (52.2 mg, 0.31 mmmol) se mezcló con 1-fenilisatina (69.7 mg, 0.31 mmol) y se calentó a 140°C durante 3 h. El producto crudo resultante se purificó por CCD preparativa usando acetato de etilo/hexano (6:4) como eluyente para dar el producto deseado como un sólido amarillo (36.9 mg, 32.3 %). 1H RMN: d 7.9-6.7 (m, 12H) , 2.9 (s, 3H) . ESI-EM m/z encontrado 370 (MH+) . Compuesto 25: ( 3Z ) -3- [ ( 3 , -diclorofenil ) imino] -1- ( 2-piridinilmetil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos F (para la substitución de cloruro de 2-picolilo) y G . ?? RMN (400 MHz , CDC13) d 8.51 - 8.46 (m, 1H), 7.87 - 7.78 (m, 1H) , 7.64 (d, 1H, J = 7.1), 7.53 -7.31 (m, 5H) , 7.28 (d, 1H, J = 4.1), 7.12 (d, 1H, J = 8.1), 6.58-6.53 (m, 1H) , 5.51 (s, 2H) ; ESI-EM m/z 381 (MH+) . Compuesto 2_6j (3Z) -3- [ (3, 4-diclorofenil ) imino] -1- [ (3, 5-dimetil-4-isoxazolil)metil] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos F (para la substitución de 4-clorometil-3, 5-dimetilisoxazol) y B (calentamiento en microondas) . 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 7,63 (d, 1H, J = 9.1), 7.46 (dt, 1H, J = 8.1, 2.0), 7.28 (d, 1H, J = 2.1), 7.02 (d, 1H, J= 2.0), 6.88 (dt, 1H, J 8.0, 2.1), 6.74 - 6.72 (m, 1H) , 6.72 - 6.70 (m, 1H) , 5.53 (s, 2H) , 2.50 (s, 3H) , 2.24 (s, 3H) ; ESI-EM m/z 399 (MH+) . Compuesto 27: ( 3Z ) -3- [( 3, -diclorofenil ) imino] -1- [ 3-( trifluorometil ) fenil] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos A y B. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.90 - 7.87 (m, 1H) , 7.83 - 7.79 (m, 1H) , 7.67 (d, 1H, J = 8), 7.46 - 7.40 (m, 1H) , 7.33 (d, 1H, J = 2), 7.08 - 7.05 (m, 1H) , 6.96 - 6.80 (m, 5H) ; ESI-EM m/z 435 (MH+) . Compuesto 28: (3Z) -1- (3, 5-diclorofenil) -3- [(3,4-diclorofenil ) imino] -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos A y B. XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.93 (d, 1H, J = 8.1), 7.79 (d, 1H, J = 6.0), 7.72 - 7.68 (m, 1H), 7.59 - 7.45 (m, 1H) , 7.46 (d, 1H, J = 8.1), 7.32 (dt, 1H, J = 8.0, 2.1), 7.23 (d, 1H, J = 2.5), 6.97 (dd, 1H, J = 8.0, 2.1), 6.92 - 6.87 (m, 1H) , 6.85 - 6.81 (m, 1H) ; ESI-EM m/z 435 (MH+) . Compuesto 29: (3Z) -3- [ (3, 4-diclorofenil) imino] -6- metoxi-l-fenil-1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos H y B. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.69 - 7.54 (m, 1H) , 7.53 - 7.38 (m, 3H) , 7.29 (d, 1H, J = 2.0), 7.17 (d, 1H, J = 8.1), 7.12 (d, 1H, J = 8.0), 6.84 (d, 1H, J = 2.5), 6.78 (d, 1H, J = 8 ), 6.6 (dd, 2H, J = 8.0, 2.0), 6.55 (dd, 2H, J = 8.1, 2.5); ESI-EM m/z (398 MH+) . Compuesto 30: (3Z) -3- [ (4-cloro-3-metilfenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos A y B (80°C). XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.69 - 7.62 (m, 2H), 7.49 (s, 1H) , 7.47 (s, 1H) , 7.41 (dt, 1H, J = 7.1, 1.6), 7.3 (dd, 1H, J = 5.0, 1.6), 7.05 - 6.97 (m, 1H, 6.93 - 6.86 (m, 1H) , 6.77 (m, 1H) , 6.56 (m, 1H) , 2.53 (s, 3H) ; ESI-EM m/z 353 (MH+) . Compuesto 31: ( 3Z ) -3- ( 2-naftilimino) -1- ( 3-tienil ) -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos A y B (80°C) . ? RMN (400 MHz, CDC13) d 8.15 (d, 1H, J = 9.1), 8.06 - 7.99 (m, 1H) , 7.89 - 7.80 (m, 1H) , 7.78 - 7.71 (m, 1H), 7.71 - 7.47 (m, 4H) , 7.41 - 7.35 (m, 1H) , 7.33 (d, 1H, J = 5.2), 7.28 (d, 1H, J = 6.8.1), 7.00 (d, 1H, J = 8.0), 6.76 (t, 1H, J = 7.8), 6.67 (d, 1H, J = 7.9); ESI-EM m/z 355 (MH+) . Compuesto 32 : (3Z)-3-[ (4-clorofenil) imino] -1- ( 3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los procedimientos A y B (80°C). H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.69 - 7.56 (m, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 1H) , 7.41 (dt, 1H, J = 8, 2), 7.32 - 7.28 (m, 1H) , 7.11 - 6.99 (m, 3H) , 6.89 (dt, 1H, J = 8), 6.77 - 6.73 (m, 1H) , 6.66 - 6.33 (m, 1H) ; ESI-EM m/z 339 (MH+) . Compuesto 33j (3Z) -3- [ ( -yodofenil ) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH) . XH RMN (400 MHz, CDC13) d 7.79 - 7.74 (m, 2H) , 7.53 - 7.48 (m, 2H) , 7.35 (dt, 1H, J = 8.0, 1.2), 7.29 - 7.24 (m, 1H) , 6.98 (d, 1H, J = 8.0), 6.89 - 6.75 (m, 4H) ; ESI-EM m/z 431 (MH+) . Compuesto 34: · ( 3Z ) -3- [ ( 4-metilfenil ) imino] -1- ( 3-tienil) 1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH) . XH RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.52 - 7.44 (m, 2H) , 7.35 - 7.22 (m, 4H) , 6.99 -6.93 (m, 3H) , 6.87 - 6.78 (m, 2H) , 2.42 (s, 3H) ; ESI-EM m/z 319 (MH+) . Compuesto 35: (3Z) -3- [ (3, 5-difluorofenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH). XH RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.54 - .7.16 (m, 4H) , 6.99 (dt, 1H, J = 8.2, 0.8), 6.89 (dt, 1H, J = 7.7, 1.1), 6.76 (d, 1H, J = 7.5), 6.71 (tt, 1H, J = 9.3, 2.3), 6.64 - 6.57 (m, 2H) ; ESI-EM m/z 341 (MH+) . Compuesto 36: 3- { [ ( 3Z ) -2-oxo-l- ( 3-tienil ) -1 , 2-dihidro-3H-indol-3-ilideno] amino } benzoato de etilo: Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH) . 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.96 (d, 1H, J = 7.4), 7.75 - 7.17 (m, 6H) , 6.98 (d, 1H, J = 8.0), 6.87 - 6.78 (m, 2H) , 6.63 (d, 1H, J = 7.8), 4.45 - 4.32 (m, 2H) , 1.43 - 1.33 (m, 3H) ; ESI-EM m/z 377 (MH+) . Compuesto 37: (3Z) -3- [ (6-cloro-3-piridinil) imino] -1-(3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH) . 1R RMN (400 MHz, CDCI3) d 8.21 - 6.81 (m, 10H) ; ESI-EM m/z 340 (MH+) . Compuesto 38: (3Z) -3- [ (4-fenoxifenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH). 1ti RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.85 - 6.70 (m, 16H) ; ESI-EM m/z 397 (MH+) . Compuesto 39 : (3Z) -3- [ (4-bromofenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidrú-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y G. XH RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.82 - 6.55 (m, 11H) ; ESI-EM m/z 383 (MH+) . Compuesto 4_0j (3Z) -3- [ (3-clorofenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y G. 1H RMN (400 MHz, CDC13) d 7.55 - 6.50 (m, 11H) ; ESI-EM m/z 339 (MH+) . Compuesto 41 : (3Z) -3- [ ( 3-metilfenil ) imino] -1- (3-tienil ) -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH). 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d 7.67 - 6.78 (m, 11H) , 2.39 (s, 3H) ; ESI-EM m/z 319 (MH+) . Compuesto 42: (3Z) -3- [ (3, 4-diclorofenil ) imino] -1- (3-tienil ) -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (1% HOAc en MeOH) . 1ti RMN (400 MHz, CDC13) d 7.82 - 6.80 (m, 10H) ; ESI-EM m/z 373 (MH+) . Compuesto 43j (3Z) -1- ( 2-piridinilmetil ) -3- { [3- (trifluorometil) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 382 (MH+) . Compuesto 44: (3Z) -3- [ (3, 5-diclorofenil ) imino] -1- (2-piridinilmetil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 382 (MH+) . Compuesto 45j (3Z) -1- [ ( 3 , 5-dimetil-4-isoxazolil)metil] -3-{ [3- (trifluorometil) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 400 (MH+) . Compuesto 46: ( 3Z ) -3- [ ( 3 , 4-difluorofenil ) imino] -1- ( 3-piridinilmetil ) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos F (por substitución de cloruro de 3-picolilo) y B. ESI-EM m/z 350 (MH+) . Compuesto 47 ( 3Z ) -1- ( 3-piridinilmetil ) -3- { [3- (trifluorometil) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 382 ( (MH+) . Compuesto 48: (3Z) -3- [ (3, 4-difluorofenil) imino] -1- (2-piridinilmetil ) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 350 (MH+) .

Compuesto 49: (3Z) -3- [ (3, 5-diclorofenil ) imino] -1- (3-piridinilmetil ) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 384 ( H+) . Compuesto 50j (3Z) -3- [ (3, 5-diclorofenil ) imino] -1-[ (3, 5-dimetil-4-isoxazolil) metil] -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona: Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 402 (MH+) .

Compuesto 51: ( 3Z ) -1-fenil-3- ( 5-quinolinilimino ) 1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento G. 1H RMN (400 MHz , CDC13) d 9.38 - 9.32 (m, 1H) , 8.55 - 8.50 (m, 1H) , 8.01 - 6.62 (m, 12H) , 6.43 - 6.35 (m, 1H) ; ESI-EM m/z 350 (MH+) . Compuesto 52: ( 3Z ) -3- [( 4-yodofenil ) imino] -1-fenil-1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B (0.1% HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq RNH2, mallas moleculares 3 A). ESI-EM m/z 425 (MH+) . Compuesto 53: (3Z) -3- [ (3, 4-difluorofenil ) imino] -1-fenil-1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B (0.1% HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq RNH2, mallas moleculares 3 Á) . ESI-EM m/z 335 (MH+) . Compuesto 54: (3Z) -3- [ (2-cloro-4-metilfenil) imino] -1-fenil-1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B (0.1% HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq de RNH2, mallas moleculares 3 Á) . ESI-EM m/z 347 (MH+ con 35C1), 349 (MH+ con 37C1) . Compuesto 55: (3Z) -3- [ (2, 4-dimetoxifenil ) imino] -1- fenil-1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B (0.1 % HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq RNH2, mallas moleculares 3 Á) . ESI-EM m/z 359 (MH+) . Compuesto 56: 3-{ [ (3Z) -2-oxo-l-fenil-1 , 2-dihidro-3H-indol-3-ilideno] amino }benzonitrilo : Preparado por ' el Procedimiento B (0.1% HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq RNH2, mallas moleculares 3 Á) . ESI-EM m/z 324 (MH+) . Compuesto 57j (3Z) -3-{ [2-metil-5- ( trifluorometil) fenil] imino } -1-fenil-l , 3-dihidro-2H-indol-2-ona: Preparado por el Procedimiento B (0.1% HOAc, 80°C, 92 h, 4 eq RNH2, mallas moleculares 3 Á) . ESI-EM m/z 381 (MH+) . Compuesto 58: (3Z) -3- [ ( 4-cloro-3-metilfenil) imino] -1- (3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (80°C) . ESI-EM m/z 353 (MH+) . Compuesto 59: ( 3Z ) -3- ( 6-quinolinilimino) -1- ( 3-tienil ) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (80°C) . ESI-EM m/z 356 (MH+) . Compuesto 60j ( 3Z ) -3- [ ( 4-clorofenil ) imino] -1- ( 3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (80°C) . ESI-EM m/z 339 (MH+) . Compuesto 61: ( 3Z ) -3- [ ( 3-isopropilfenil ) imino] -1- ( 3-tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (80°C). ESI-EM m/z 347 (MH+) . Compuesto 62: ( 3Z ) -3- [ ( 4-ciclohexilfenil ) imino] -1- ( 3- tienil) -1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos A y B (80°C) . ESI-EM m/z 387 (MH+) . Compuesto 63: (3Z) -3- (1, 3-benzotiazol-6-ilimino) -1-fenil-1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento G. ESI-EM m/z 356 (MH+). Compuesto 64: ( 3Z ) -3- ( !H-indazol-6-ilimino ) -1-fenil-1, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento G. ESI-EM m/z 339 (MH+) . Compuesto 65: (3Z) -3- [ ( 3-clorofenil ) imino] -6-metoxi-l-fenil-1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos H y G. ESI-EM m/z 363 (MH+) . Compuesto 66j ( 3Z ) -6-metoxi-l-fenil-3- { [3- (trifluorometil) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos H y G. ESI-EM m/z 397 (MH+) . Compuesto 67: (3Z) -3- [ ( 3-bromofenil ) imino] -1-fenil-1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento B. ESI-EM m/z 378 (MH+) . Compuesto 68_: ( 3Z ) -1 , 5-difenil-3- { [3- ( trifluorometil ) fenil ] imino } -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos C, D, y E. ESI-EM m/z 443 (MH+) . Compuesto 69j ( 3Z ) -1- ( -hidroxifenil ) -3- { [3-(trifluorometil ) fenil] imino}-!, 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por los Procedimientos G (6 eq de anilina) y D. ESI-EM m/z 383 (MH+) . Compuesto 70: (3Z) -3- [ (3, -diclorofenil ) imino] -1- (3-piridinilmetil ) -1 , 3-dihidro-2H-indol-2-ona : Preparado por el Procedimiento G (75°C, 2 h) . ESI-EM m/z 383 (MH+) . Los compuestos 1-70 como se describieron anteriormente son meramente ilustrativos de compuestos de indolona que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención. Compuestos de indolona adicionales se pueden obtener usando los métodos mostrados en los Esquemas de Reacción 1-5 y procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Puede ser necesario incorporar estrategias de protección y desprotección para substituyentes tal como grupos amino, amido, ácido carboxilico, y hidroxilo en los métodos sintéticos descritos anteriormente para formar derivados de indolona. Los métodos para protección y desprotección de tales grupos son bien conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo en Green, T. W. and uts, P. G. M. (1991) Protection Groups in Organic Synthesis, 2da Edición John Wiley & Sons, New York. Las estructuras de los compuestos 1-70 se ilustran en las Tablas 1 y la.

Tabla 1. Estructuras Químicas de Compuestos Substitución Compuesto Rl R2 R3 R4 R5 1 Ph OMe H H H 2 Ph H CF3 H H 3 Ph H Me H H 4 Ph H Cl H H 5 Ph H H CF3 H 6 Ph H H Me H 7 Ph H H Cl H 8 Ph H H Br H 9 Ph H H F H 10 Ph H H OPh H 1 1 Ph H H OEt H 12 Ph H H OMe H 13 Ph H Cl H Cl 14 Ph H Me H Me 15 Alilo H Cl Cl H 16 Alilo H Cl H Cl 17 Isopropilo H H Br H Ph = Fenilo OMe= Metoxi OEt Me = metilo OPh = Fenoxi Tabla la. Estructuras químicas de Compuestos ?? Esquema de reacción 2a aYi, Y2, Y3, Y4, A y B se definen como se describe en la especificación. X es un grupo de partida tal como Cl, Br, I, o OTs. R es un ácido bórico o grupo dialquilborato.

Esquema de reacción 3a. Sintesis de Isatinas aYi, Y2, Y3, Y4 y A se definen como se describe especificación .

Esquema de reacción 4a. Sintesis de Iminoindolonas Substituidas NaH ó aYi Y¿/ ^3r Y-*, A, y B se definen como se describe en la especificación. X es un grupo de partida tal como Cl, Br, I, o OTs. R es un ácido bórico o grupo dialquilborato .

Esquema de reacción 5a. Sintesis de Iminoindolonas Substituidas de Arilo o Heteroarilo Ar = arilo o heteroarilo aA y B se definen como se describe en la especificación.

Composiciones y Equipos Farmacéuticos Como una modalidad especifica de una composición oral de un compuesto de esta invención, 100 mg de uno de los compuestos descritos en la presente se formulan con suficiente lactosa finamente dividida para proporcionar una cantidad total de 580 hasta 590 mg para llenar una cápsula de gel dura de tamaño O. Los compuestos de antagonista de receptor de galanina-3 se pueden administrar por cualquier medio conocido. Por ejemplo, los compuestos se pueden formular como una cápsula, supositorio, crema, inhalador, o parche transdérmico . Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas, tales como pildoras, cápsulas, gránulos, comprimidos, y polvos, y formas liquidas, tales como soluciones, jarabes, elixires, y suspensiones. Las formas útiles para administración parenteral incluyen soluciones estériles, emulsiones, y suspensiones . Las dosis óptimas a administrarse se pueden determinar por aquellos expertos en la técnica, y variarán con el compuesto particular en uso, la fuerza de la preparación, el modo de administración, y la mejoría de la condición de la enfermedad. Los factores adicionales dependiendo del sujeto en particular siendo tratado resultarán en una necesidad de ajustar dosis, incluyendo edad del sujeto, peso, género, dieta, y tiempo de administración. En la solicitud objeto, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es cualquier cantidad de un compuesto que, cuando se administra a un sujeto que padece de una enfermedad contra la cual los compuestos son efectivos, causa reducción, remisión, o regresión de la enfermedad. En la presente solicitud, un "sujeto" es un vertebrado, un mamífero o un humano . Los materiales para usar en los métodos de la presente invención son adecuados para la preparación de kits producidos de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los kits pueden comprender recipientes, cada uno con uno o más de los diversos compuestos utilizados en los métodos.

EJEMPLOS Ejemplo 1; Ensayo de excrecencia de neuritas Las neuronas de hipocampo de ratón crioconservadas se formaron en placas en una placa de 96 pozos recubierta con poli-l-lisina (BD BioCoat) a 35,000 células por pozo en medio Neurobasal/B27 ( Invitrogen) . 24 horas más tarde las neuronas se trataron con HT-2157 en diversas concentraciones y se fijaron posteriormente 48 horas posteriores al tratamiento. Las células del sub-clon PC12, Neuroscreen-1 (NS-1) se formaron en placas en una placa de 96 pozos recubierta de colágeno I (BD BioCoat) a 5,000 células por pozo en medio completo RPMI con NGF 200 ng/mL. 48 horas más tarde las células NS-1 se trataron con HT-2157 en diversas concentraciones y se fijaron posteriormente 24 horas posteriores al tratamiento. Después de la fijación, el kit de reactivos de Excrecencia de Neuritas de Cellomics se usó para etiquetar células por un anticuerpo primario especifico para neuronas. Los núcleos celulares se etiquetaron por Hoechst 33342. Las células etiquetadas fluorescentemente luego se formaron en imágenes y analizaron usando Excrecencia de Neuritas Cellomics y Bioaplicaciones de Excrecencia de Neuritas Extendidas en el Lector ArrayScan HCS. Las imágenes para análisis HCS cuantitativo se recolectaron en el Lector ArrayScan HCS usando un objetivo de microscopio 10X ó un 20X. PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) Las células NS-1 se formaron en placas en una placa de 6 pozos recubierta con colágeno I (BD BioCoat) a 150,000 células por pozo. 48 horas posteriores al tratamiento con NGF a 200 ng/mL células NS-1 se trataron con HT-2157 durante 2 horas, 4 horas ó 24 horas en concentraciones como se indica seguido por aislamiento de ARN usando equipo ARN acuoso 4PCR Ambion. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron con reactivos de transcripción inversa Taqman (Applied Biosystems) . La qPCR se realizó en una máquina PCR de tiempo real 7900 usando placas de reacción de 96 pozos Optical (Applied Biosystems) . Los niveles de expresión se normalizaron a niveles de transcripción de TBP de ratón. Resultados En las células NS-1 tratadas con HT-2157, las neuritas demostraron aumentar en su cantidad, longitud, y punto de ramificación en una forma dependiente de dosis. La FIG. 1A muestra una imagen de células NS-1 adquirida por un lente objetivo 10X en el Lector ArrayScan HCS. La imagen superior es la imagen en bruto y la imagen inferior es el mismo campo con un revestimiento de color que delinea las diferentes características identificadas por la Bioaplicación de Excrecencia de Neuritas Extendida. En la imagen de revestimiento de color, los núcleos celulares se etiquetan en azul, los cuerpos de las células se etiquetan en rojo, las neuritas se etiquetan en verde, y el punto de ramificación en color rojo púrpura. Las células rechazadas se etiquetan en anaranjado. Las FIG. IB hasta 1E muestran los gráficos de 4 características de salida generadas del análisis cuantitativo de imágenes de células NS-1 por la Bioaplicación de Excrecencia de Neuritas Extendida. Los datos graficados son el valor medio de cada característica ± desviación estándar de 2 pozos por concentración del compuesto. Las definiciones para las características de salida son como siguen: cantidad de neuritas: el número de neuritas asociado con las neuronas seleccionadas; longitud total de neuritas: la longitud total de neuritas para una neurona seleccionada; longitud promedio de neuritas: la longitud total de neuritas dividida por la cantidad de neuritas para las neuronas seleccionadas; y punto de ramificación: el cruce de tres segmentos de neuritas. Las neuritas se observan para aumentar en su longitud, cantidad y punto de ramificación. El aumento similar de excrecencia de neuritas por HT- 2157 se observó también en las neuronas de hipocampo de ratón crio-conservadas. La FIG 3A muestra imágenes de las neuronas de hipocampo de ratón crio-conservadas adquiridas por un lente objetivo 20X en el Lector ArrayScan HCS. La imagen superior es la imagen en bruto y la imagen inferior es el mismo campo con un revestimiento verde que rastrea las neuritas identificadas por la Bio-Aplicación de Excrecencia de Neuritas. La FIG. 3B muestra la longitud promedio de neuritas analizada por la Bio-Aplicación de Excrecencia de Neuritas de las imágenes de las neuronas de hipocampo de ratón. Los datos graficados son el valor medio ± desviación estándar de 2 pozos por concentración del compuesto . El tratamiento con HT-2157 aumenta significativamente la longitud de neuritas en las neuronas de hipocampo de ratón crio-conservadas. Tomados en conjunto, se demostró en este estudio el aumento en la excrecencia de neuritas de las células NS-1 y las neuronas de hipocampo de ratón primarias por HT-2157. Además, los resultados indican que HT-2157 ejerció sus papeles en modular la excrecencia de neuritas a través de Hes5, un represor de la transcripción que regula negativamente la diferenciación neuronal. La expresión Hes5 se sub-reguló por tratamiento HT-2157 en 2 hr y 4 hr en células NS-1. Las células NS-1 tratadas por HT-2157 se sometieron a análisis PCR en tiempo real cuantitativo en Hes5, un represor transcripcional que regula negativamente la diferenciación neuronal. Hes5 se sub-reguló por tratamiento HT-2157 en una forma dependiente de tiempo y dosis, sugiriendo el mejoramiento de excrecencia de neuritas por HT-2157 se media a través del control de progresión de diferenciación neuronal. La FIG. 2 muestra el análisis qPCR de los efectos en la expresión Hes5 por tratamiento HT-2157 en células NS-1. Los datos agrupados es el valor medio del nivel de ARN relativo de las células en 2 pozos ± desviación estándar. Ejemplo 2 - Ensayos de Excrecencia de Neuritas Cultivo celular neuronal Las neuronas de hipocampo (E17.5) embriónicas de ratón C57B1/6 o CD1 se adquirieron de QBM Cell Science (University of Ottawa, Ontario, Canadá) . Las neuronas se cultivaron en poli-D-lisina recubierta de placas de 96 ó 24 pozos en medio Neurobasal libre de suero complementado con 2% B27, 500µ? L-glutamina, y piruvato 1 mM. Las células se formaron en placas a una densidad de 20, 000 por pozo en placas de 96 pozos (por ensayo de excrecencia de neuritas), y a 100, 000 por pozo en placas de 48 pozos (para análisis qPCR) . Para ensayos de excrecencia de neuritas, las neuronas se cultivaron durante 2 días y luego estimularon durante 24 horas. Para ensayos de expresión de genes, las neuronas se cultivaron durante 8 días y luego estimularon con HT-2157 o Vehículo. Cultivo celular NS1 Las células de Neuroscreen 1 (NS1) (Cellomics Inc.) se cultivaron en matraces de plástico de 75 cm2 recubiertos con colágeno tipo I (Biocoat, Becton Dickinson) en un incubador humidificado a 37 °C en CO2 al 5%. Las células se cultivaron en medio de cultivo celular completo RPMI (Cambrex) complementado con suero de caballo inactivado por calor al 10% ( Invitrogen) , suero de bovino fetal inactivado por calor al 5% (Cellgro) , y L-glutamina 2 mM (Cambrex) . Para la expansión, las células se tripsinizaron y dividieron en confluencia 80%. El medio de cultivo celular se cambió cada 2 a 3 días. Las células NS1 se estimularon con factor de crecimiento de nervios para inducir diferenciación en un fenotipo neuronal. Las células NS1 se cosecharon como si se pasaran y luego contaran usando un contador Coulter (Becton Dickinson Coulter Zl) . Las células se sembraron en placas recubiertas con colágeno I de 96 pozos en una densidad de 2000 células por pozo en volumen de 200 µ?. El medio RPMI se complementó con factor de crecimiento de nervio 200 ng/ml (?T?ß, Sigma) . Las células NS1 se incubaron durante 72 horas para permitir la diferenciación a un fenotipo neuronal. El NGF se diluyó luego hasta 50 ng/ml y las células se trataron con siARN ó HT-2157, respectivamente. Ensayo de excrecencia de neuritas Los ensayos de excrecencia de neuritas se realizaron usando el escáner Cellomics Arrayscan II Vti HCS. Las células se tiñeron usando el kit de reactivos HitKit™ HCS (Cellomics) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El ensayo se basa en inmunoflourescencia usando un anticuerpo que se ha validado para etiquetar específicamente ambos las neuritas y cuerpos de células neuronales. Brevemente, las células se fijaron en formaldehído al 3.7% y núcleos manchados con pigmento Hoechst. Las células se lavaron luego en solución amortiguadora de excrecencia de neuritas y neuritas manchadas con anticuerpo primario propiedad de Cellomics para cribado de alto contenido de excrecencia de neuritas.

Después de 1 hora de incubación con el anticuerpo primario, las células se lavaron nuevamente y luego se incubaron con solución de anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente durante 1 hora. Placas de 96 pozos teñidas con anticuerpo se almacenaron a 4°C en la oscuridad hasta la exploración. Las placas se exploraron usando explorador Cellomics ArrayScan II Vti HCS. El ensayo de excrecencia de neuritas usa dos canales para llevar a cabo la exploración. El Canal 1 detecta el pigmento Hoechst y se usa por el software para identificar células y para centrar en automático. El canal 2 detecta la fluorescencia FITC del anticuerpo secundario y se usa por el software para calcular todos los datos generados con referencia a neuritas . La Fig. 7: muestra el efecto de HT-2157 en excrecencia de neuritas en células NS1. Para cada experimento, se midió la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células. La cuantificación del efecto de HT-2157 en excrecencia de neuritas en células NS1. 3µ? y ??µ? HT-2157 facilita la excrecencia de neuritas como se indica por un aumento en: i) el número de neuritas por célula (cantidad de neuritas) , ii) la longitud total de neuritas por célula, iii) la longitud promedio de neuritas por célula, iv) el número de punto de ramificaciones de neurita por célula.

Análisis qPCR El ARN se aisló de neuronas cultivadas en el tiempo indicado después del tratamiento con HT-2157. Por pozo, una preparación ARN se realizó usando el equipo QIAgen RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes. El cADN se generó usando el kit de transcriptasa inversa TaqMan (Applied Biosystems) . Las 2 reacciones PCR en tiempo real por replicación ARN/cADN se realizaron usando el software ABI prism y SDS 2.1. Los ensayos ABI a pedido (Applied Biosystems) se usaron para probar los niveles mARN de BDNF, NGF , y Hes5. El valor CT promedio para cada muestra de cADN se determinó. El dato se normalizó luego a proteina de enlace TATA (TBP) y se determinaron los valores ACT . Los niveles mARN se normalizaron a un grupo control tratado con vehículo (DMSO 0.2%) . La Figura 4 muestra el efecto de HT-2157 en expresión de GalR3 en células Neuroscreen 1 (NS1) . Las células NS1 expresan el receptor GalR3. La expresión de GalR3 no se afecta por tratamiento HT-2157 en células NS1. La Fig. 5: muestra el efecto de tratamiento HT-2157 en la expresión de Hes5 en células NS1. Las células NS1 se trataron con Vehículo (Veh) o HT-2157 durante 2 horas, 4 horas, o 24 horas. Cuando se compara con controles tratados con vehículo, los niveles de mARN de Hes5 se redujeron 2 horas y 4 horas después del tratamiento con 3 ó 10 µ de HT-2157. El mARN de Hes5 regresa a los niveles de linea base a 24 horas después de tratamiento. La Fig. 8 muestra el efecto de HT-2157 en la expresión de mARN de las neutrofinas cerebrales derivadas de factor neurotrófico (BDNF) y factor de crecimiento de nervio ß (NGFb) , y en expresión de Hes5 en neuronas de hipocampo de ratón cultivadas. La media ± desviación estándar de 2 replicaciones experimentales se muestran. La Fig. 8A muestra el efecto de HT-2157 en la expresión de BDNF. Las neuronas de hipocampo se trataron con vehículo o HT-2157 10 µ? y niveles de mARN de BDNF determinados por análisis qPCR. HT-2157 aumenta significativamente los niveles de mARN de BDNF en neuronas cultivadas. La Fig. 8B muestra el efecto de HT-2157 en la expresión de NGF . Las neuronas de hipocampo se trataron con vehículo o HT-2157 10 µ? y los niveles de mARN en NGFß fueron determinados por análisis qPCR. HT-2157 aumenta significativamente los niveles de mARN en NGF en neuronas cultivadas. La Fig. 8C muestra el efecto de HT-2157 en la expresión de Hes5. Las neuronas de hipocampo se trataron con vehículo o HT-2157 10 µ? y los niveles de mARN en Hes5 determinados por análisis qPCR. HT-2157 significativamente reduce los niveles de mARN en Hes5 en neuronas cultivadas, similar a su efecto en células NS1 (ver Fig. 5) . Estos resultados indican que HT-2157 tiene un efecto trófico en neuronas de hipocampo. BDNF y NGF se han implicado en la supervivencia neuronal y crecimiento sináptico. Adicionalmente, el HT-2157 inhibe Hes5 en ambas neuronas de hipocampo y células NSl. La Fig. 9 muestra el efecto de NGF en excrecencia de neuritas en neuronas de hipocampo de ratón cultivadas. La media ± sem de 8 replicaciones experimentales se muestran. Para cada experimento, se midió la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células. Las neuronas de hipocampo se trataron con 100 ng/ml de NGFb durante 24 horas y crecimiento de neurita se mide en el Cellomics Arrayscan II. GF aumenta la excrecencia de neuritas como es evidente por el número aumentado de neuritas por célula, aumento de longitud de neuritas, y aumento de puntos de ramificación. La Fig.10 es una cuantificación del efecto de HT-2157 en la excrecencia de neuritas en neuronas de hipocampo cultivas. La media ± sem de 8 replicaciones experimentales (96 pozos) por dosis de fármaco y 16 replicaciones por vehículo se muestran. Para cada experimento, la excrecencia de neuritas en un mínimo de 100 células se midió. La Fig 10A muestra la cuantificación de los efectos de HT-2157 en excrecencia de neuritas en neuronas de hipocampo como se determina por el efecto en el número de neuritas por célula. La Fig 10B muestra la cuantificación de los efectos de HT-2157 en la excrecencia de neuritas en neuronas de hipocampo como se determina por el efecto en la longitud de neuritas totales por célula. La Fig. 10C muestra la cuantificación de los efectos de HT-2157 en excrecencia de neurita en neuronas de hipocampo como se determina por el efecto en punto de ramificacións de neurita por célula. Expresión reducida (knockdown) del siABN inactivado de Hes5 Las células NS1 se prepararon para desarrollar en un fenotipo neuronal con NGFp durante 72 horas, y luego se transfectaron usando 100 nM de siGENOME siARN y Dharmafect 3. Se usaron grupos de siGENOME siARN contra Hes5 y un siARN de control no dirigido al propietario (Dharmacon, Lafayette, USA) . Las células se incubaron con siARN o Dharmafect 3 solamente (vehículo) durante 48 horas y luego teñido por ensayo de excrecencia de neuritas como se describe . La Fig 6 muestra el efecto de la expresión reducida de Hes5 por siARN en excrecencia de neuritas en células NS1. La Fig. 6a muestra la longitud de neurita en células NS1 no ' tratadas, y en células NS1 tratadas con Vehículo, siARN de control, siARN de Hes5. Las células NS1 tratadas con siARN Hes5 tienen significativamente neuritas más grandes que las células NS1 tratadas con siARN de control o con vehículo. La Fig 6b muestra puntos de ramificación de neuritas en células NS1 no tratadas, y en células NS1 tratadas con vehículo, siARN de control, siARN de Hes5. Las células NS1 tratadas con siARN de Hes5 tuvieron significativamente más puntos de ramificación de neuritas que las células NS1 tratadas con siARN de control o vehículo. p<0.001 por Hes5 vs . siARN de control. Esto indica que la inhibición de Hes5 es suficiente para aumentar la excrecencia de neuritas en células NS1. La inhibición de Hes5 aumenta la longitud de neuritas y el número de puntos de ramificación por neuritas. HT-2157 reduce Hes5 en células NS1 y puede así facilitar la excrecencia de neuritas. Técnica Western blot Las células NS1 cultivadas se homogenizaron en solución amortiguadora RIPA (Upstate Biotechnology) que contiene inhibidores de proteinasa (Roche) . Las concentraciones de proteína se determinaron usando el equipo de ensayo de proteína Biorad DC (Biorad) . 20 ]iq de lisado de proteína se separaron por electroforesis de gel SDS poli-acrilamida (SDS-PAGE) y se tiñeron sobre membranas de nylon. Los Western blot se bloquearon con leche seca sin grasa al 5% en solución salina amortiguada con Tris que contiene 0.05% Tween 20 (TBS-T) y los anticuerpos primarios aplicados a 4o Celsius durante la noche. Las tinciones se colocaron en sondas con anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de raíz de rábano (HRP) a temperatura ambiente durante 1 h, y se desarrollaron usando el SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) . Se usó un anticuerpo policlonal contra GalR3 (Alpha Diagnostics) . Los manchados se normalizaron a ß-actina (Sigma) . Análisis Estadístico Los medios y desviaciones estándar de diversas replicaciones experimentales (48 pozos ó 96 pozos) se determinaron. Los datos se analizaron por prueba t de Student o ANOVA de una vía. A menos que se indique de otra manera, los valores mostrados en las gráficas representan la media ± SD. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia al mismo grado como si cada publicación individual, patente o solicitud de patente se incorporara específicamente e individualmente como referencia . Aunque esta invención se ha mostrado particularmente y descrito con referencias a modalidades preferidas del mismo, se entenderá por aquellos expertos en la técnica que diversos cambios en forma y detalles se pueden hacer en la presente sin apartarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION
2. Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
3. REIVINDICACIONES 1. Un método caracterizado porque es para modular la excrecencia de neuritas en un animal por la administración de un antagonista receptor de galanina-3 a un animal. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal es un humano. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el animal tiene una enfermedad o condición neurodegenerativa.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el animal tiene manipulación de célula madre neuronal.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor antagonista del receptor de galanina-3 es HT-2157 los isómeros E/Z o mezclas de los mismos.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 se administra una vez.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 se administra repetidamente durante un periodo de tiempo.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada uno de Yi, Y2, Y3, y Y es independientemente -H; alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, o cicloalquenilo C5-C7; -F, -Cl, -Br, o -I; -N02; -N3; -CN; -OR4, -SR4, -OCOR4, -COR4, -NCOR4, -N(R4)2, -CON(R4)2, O -COOR4; arilo o heteroarilo; o cualquiera de los dos de Yi, Y2, Y3 y Y4 presentes en átomos de carbono adyacentes puede constituir un grupo metilendioxi ; en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C , arilo o aril (Ci-C6) alquilo; en donde A es A' , alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, arilo, heteroarilo, aril (Ci-C6) alquilo o heteroaril (Ci-C6) alquilo; en donde A' es en donde Ri y R2 son independientemente cada uno -H, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, o -CN; en donde R3 es -H, alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -0R6, arilo o heteroarilo; en donde R5 es alquilo C1-C7 de cadena lineal o ramificada, -N(R4)2, -0R6 ó arilo; en donde R6 es alquilo C1-C7 o arilo de cadena lineal o ramificada; en donde B es arilo, o heteroarilo; con la condición sin embargo, si B es arilo o heteroarilo el átomo de carbono o átomos de carbono orto al átomo de nitrógeno del enlace imina puede solamente substituirse con uno o más de lo siguiente: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, metilo, etilo o metoxi ; en donde cada n es independientemente un entero desde 1 hasta 4 incluso; en donde el compuesto es un isómero imina Z puro, un isómero imina E puro, o una mezcla de isómeros de imina Z y E; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada R24 es independientemente uno o más de lo siguiente: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo esta opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o 0R4; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci~ C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo C2-C7 o alquinilo de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o aril (Ci-C6) alquilo .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 compuesto tiene la estructura: R. en donde cada R2^ es independientemente uno o más de lo siguiente: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde í½s es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo está opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, ó 0R ; y en donde R4 es independientemente -H; alquilo Ci-C de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o aril (Ci-Ce) alquilo .
11. 11. Un método de tratamiento de un sujeto que necesita del tratamiento por una lesión y/o trauma celular nervioso caracterizado porque comprende administrar al sujeto un antagonista receptor de galanina-3.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el animal tiene manipulación de célula madre neuronal.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor antagonista del receptor galanina-3 es HT-2157 los isómeros E/Z o mezclas de los mismos.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 se administra una vez.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 se administra repetidamente durante un periodo de tiempo.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada uno de Yi, Y2, Y3, y Y4 es independientemente -H; alquilo Ci~C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, o cicloalquenilo Cs-C7; -F, -Cl, -Br, o -I; -N02; -N3; -CN; -OR4, -SR4, -OCOR4, -COR , -NCOR4, -N(R4)2, -CON(R4)2, o -COOR4; arilo o heteroarilo; o cualquiera de los dos de Yi, Y2, Y3 y Y4 presente en átomos de carbono adyacente puede constituir un grupo metilendioxi; en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci~ C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada o alquinilo; cicloalquilo C3~C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o aril (Ci-C6) alquilo; en donde A es A' , alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, arilo, heteroarilo, aril (Ci-Ce) alquilo o heteroarilo (Ci-C6) alquilo; en donde A' es en donde Ri y R2 son independientemente cada uno -H, alquilo Ci~C de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, Br, -I, -N02, o -CN; en donde R3 es -H, alquilo Ci-C7 de cadena lineal o ramificada, -F, -Cl, -Br, -I, -N02, -CN, -OR6, arilo o heteroarilo; en donde R5 es de cadena lineal o ramificada alquilo C 1-C7, -N(R4)2, -OR6 o arilo; en donde R6 es de cadena lineal o ramificada alquilo Ci-C7 o arilo; en donde B es arilo, o heteroarilo; con la condición sin embargo, si B es arilo o heteroarilo el átomo de carbono o átomos de carbono orto al átomo de nitrógeno del enlace imina puede solamente substituirse con uno o más de lo siguiente: -H, -F, -Cl, -Br, -I, -CN, metilo, etilo o metoxi ; en donde cada n es independientemente un entero desde 1 hasta 4 incluso; en donde el compuesto es un isómero de imina Z puro, un isómero imina E puro, o una mezcla de isómeros imina Z y E; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el antagonista receptor de galanina-3 en donde cada R24 es independientemente uno o más de lo siguiente: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo está opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o OR4 ; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci- C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo C2-C7 de cadena lineal o ramificada o alquinilo; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o aril (Ci-C6) alquilo .
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el compuesto antagonista receptor de galanina-3 tiene la estructura: en donde cada R24 es independientemente uno o más de lo siguiente: H, F, Cl, Br, I, CF3 o OCH3; en donde R25 es metilo, etilo, alilo o fenilo y el fenilo esta opcionalmente substituido con un F, Cl, Br, CF3, o OR4; y en donde cada R4 es independientemente -H; alquilo Ci~ C7 de cadena lineal o ramificada, monofluoroalquilo o polifluoroalquilo; alquenilo o alquinilo C2~C7 de cadena lineal o ramificada; cicloalquilo C3-C7, cicloalquenilo C5-C7, arilo o aril (??-?d) alquilo .
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la lesión o trauma celular nervioso es lesión del sistema nervioso primario seleccionado del grupo que consiste de lesiones encerradas de la cabeza y trauma directo, trauma penetrante, apoplejía hemorrágica, apoplejía isquémica, glaucoma, isquemia cerebral, o daños causados por cirugía tal como extirpación de tumor.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la lesión o trauma celular nervioso es enfermedades o trastornos primarios del sistema nervioso central o periférico seleccionado del grupo que consiste de neuropatía diabética y esclerosis lateral amiotrófica (ALS) .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la lesión o trauma celular nervioso es lesiones del nervio periférico y neuropatías periféricas o localizadas seleccionadas del grupo que consiste de porfiria, neuropatía sensorial aguda, neuropatía atáxica crónica, complicaciones de diversos fármacos y toxinas, polineuropatías amiloides, adrenomieloneuropatía , o neuropatía axonal gigante.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la lesión o trauma celular nervioso es trauma de médula espinal.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque además comprende tratar células madre o células progenitoras neuronales antes de que las células se administren al paciente por implante en el sitio de degeneración neuronal.
24. 24. Un kit para el tratamiento de lesión celular neuronal y/o trauma que comprende un antagonista receptor de galanina-3.