AGENTE PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE ENFERMED BES HEPÁTICAS QUE CONTIENEN EL DERIVADO DE PIRAZOLOPIRIMIDIS.A CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de enfermedad hepática que contiene derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo, más precisamente, una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de fibrosis hepática, cirrosis hepática causada por fibrosis hepática, hipertensión portal y varias complicaciones conducidas por la hipertensión portal que contiene el derivado de pirazolopirimidina como ingrediente activo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hígado tiene más funciones bioquímicas que cualquier otro órgano. Es un órgano esencial a través del cual se absorben los alimentos, las medicinas y se hacen pasar otros materiales foráneos, y el hígado tiene la función de eliminar los materiales adquiridos o tóxicos innatos después de la transformación de esos materiales tóxicos en una forma soluble en agua. Y, generalmente está involucrado en las funciones metabólicas de varios órganos. Los tejidos del hígado sintetizan el suministro de las proteínas esenciales tales como albúmina para el cuerpo humano, y al mismo tiempo, generan y descargan los materiales activos in vivo . Como se explicó anteriormente, el hígado es un órgano
Ref. 188238 crucial que controla las funciones metabólicas humanas, en donde toman lugar numerosos procedimientos químicos. Se ha confirmado hasta la fecha que aproximadamente 500 procedimientos químicos ocurren en el hígado en un corto periodo de tiempo. Los hepatocitos son las células funcionales principales y cada hepatocito individual es de 15-30 mieras en diámetro. El hígado humano contiene aproximadamente 250 billones de hepatocitos. El daño a los hepatocitos da como resultado la necrosis de la célula. Después de la necrosis, sin embargo, los hepatocitos se regeneran debido a su excelente habilidad de regeneración innata. Sin embargo, la repetición de la necrosis y la regeneración activan la fibrosis hepática, y como resultado, cirrosis hepática, hipertensión portal y complicaciones por lo tanto ocurrirán. Una serie de enfermedades relacionadas todas se desarrollan después de la fibrosis hepática. La fibrosis hepática es causada por la acumulación de colágeno, una sustancia fibrogenética, en el hígado. Las células hepática están compuestas de hepatocitos, células endoteliales sinusoidales (SEC, por sus siglas en inglés), células de Kupper, y células estrelladas hepáticas (HSC, por sus siglas en inglés), y entre estos 4 tipos de células, las células estrelladas hepáticas juegan el papel más importante en la fibrosis hepática (American Journal of Physiology.
Gastrointestinal & Liver Physiology, 279(1), G7, 2000). Las células estrelladas hepáticas comprenden el 15% de las células hepática totales y normalmente tiene la función de almacenar el retinoide que es un precursor de la vitamina A. Sin embargo, una vez que se dañan los hepatocitos, las células Kupper empiezan a consumir los hepatocitos dañados y a secretar citocinas (TGF-betas, PDGF, FGF, HGF, PAF y ET-1) para proliferar las células estrelladas hepáticas. Las células estrelladas hepáticas se diferencian en miofibroblastos . Los miofibroblastos sintetizan el colágeno, que se acumula en la matriz extracelular y conduce a la fibrosis hepática. Esto significa que la activación de las células estrelladas hepáticas juega un papel esencial en el desarrollo de fibrosis hepática. Más precisamente, la activación de las células estrelladas hepáticas se logra en las tres siguientes etapas, la etapa pre-inflamatoria, la etapa inflamatoria y la etapa post-inflamatoria . En la etapa pre-inflamatoria, el daño del hepatocito induce a la secreción de la hormona lesionada, un estimulador de la proliferación de la célula estrellada hepática, una proliferación de células estrelladas hepáticas a través de la reducción de arginasa, un inhibidor de la proliferación celular. En la mayor parte de los casos, el alcohol causa la generación de acetaldehído o peróxido lípido, dando como resultado la promoción de una matriz de expresión de gen. En la etapa inflamatoria, las células estrelladas hepáticas se proliferan a través de las citocinas (TGF-beta, PDGF, FGF, HGF, PAF y ET-1) en las células Kupper y plaquetas activadas, las cuales después se diferencian en miofibroblastos capaces de generar fibrocitos (Seminars in Liver Disease, 16(4), 357, 1996; Journal of Hepatology, 26(6), 1220, 1997). En la etapa post-inflamatoria, las citocinas y los factores de crecimiento se secretan en miofibroblastos completamente diferenciados para activar las células estrelladas hepáticas no-diferenciadas y para secretar matrices extracelulares. Los miofibroblastos activados y diferenciados de las células estrelladas hepáticas sintetizan el colágeno, el cual después se acumula en la matriz extracelular. El monómero de colágeno es muy inestable y se descompone fácilmente en la temperatura del cuerpo, y los monómeros descompuestos se polimerizan para inducir la fibrosis hepática (American Journal of Physiology, 264(4 Pt 1) , G589, 1993) . La cirrosis hepática se atribuye a la fibrosis hepática, que se desarrolla a través de la polimerización del colágeno continuamente acumulado, cambiando el colágeno acumulado en fibra insoluble. La cirrosis hepática también se puede inducir continuando la inflamación en el hígado que acompaña la destrucción de hepatocitos, regeneración y cicatrización, causada por el abuso de alcohol a largo plazo, hepatitis, exposición a sustancias tóxicas, etc. Como resultado, el tamaño del hígado se reducen y la superficie del hígado se hace abollada. La cirrosis hepática severa es una enfermedad seria causada por complicaciones letales tales como hipertensión del portal, hemorragia (especialmente en el esófago y estómago) , hepatoma, intoxicación por la acumulación de material de desperdicio, coma, etc., (N. Engl. J. Med. 350:1646-1654) . La hipertensión portal está estrechamente relacionada con la activación de las células estrelladas hepáticas, la fibrosis hepática y la cirrosis hepática. Los miofibroblastos diferenciados a través de la activación de las células estrelladas hepáticas reducen la elasticidad de los hepatocitos, y por lo tanto se incrementa la resistencia intra-hepática y se desarrolla la hipertensión portal (Semin Liver Dis 2001; 21:337-349). A diferencia de otros órganos, el tejido del hígado característicamente tiene una doble trayectoria de flujo sanguíneo, la cual es una sangre arterial con mucho oxígeno que fluye dentro del tejido del hígado a través de la arteria hepática, y la sangre venosa que contiene nutrientes absorbidos del estómago o intestinos fluye a través de la vena del portal hepático. La cantidad de flujo sanguíneo a través de la arteria hepática es de aproximadamente 400 ml por minuto, y la cantidad de sangre que fluye a través de la vena del portal hepático es de aproximadamente 1200 ml por minuto, significando que 1/4 de la sangre total que fluye dentro del hígado toma la vía de la arteria hepática, mientras los 3/4 restantes toman la vía del portal hepático. La presión sanguínea del portal, similar a las otras presiones venosas, es sólo de aproximadamente 1/10 de la presión arterial, y esto puede fácilmente conducir a trastornos en la circulación sanguínea. La repetición del daño y regeneración de los hepatocitos por la continuación de la inflamación da como resultado la acumulación de materiales fibrosos y el desarrollo de nodos de regeneración. Los nodos de regeneración ponen presión sobre las trayectorias de la sangre en el tejido del hígado o estrechan el vaso sanguíneo mismo, causando una alteración en la circulación sanguínea. Mientras el flujo sanguíneo a través de la vena portal no cambia, el flujo sanguíneo a través del tejido del hígado disminuye a través del trastorno de circulación sanguínea. Como resultado, la presión sanguínea del portal se incrementa, causando la hipertensión del portal. La vena portal es una clase de vena sin la válvula anti-reflujo, por lo que el reflujo sanguíneo puede ocurrir en cualquier momento en que la presión sanguínea del portal se incremente a través de un trastorno en la circulación, y después la sangre busca una desviación en la circulación. Como resultado, se desarrollan los vasos sanguíneos colaterales en el tracto digestivo (en particular esófago y estómago) , por lo tanto causando el hiperesplenismo. Los vasos sanguíneos colaterales generalmente se desarrollan en áreas de baja presión tales como la submucosa del esófago, la pared abdominal anteriolateral, el recto, etc., sin síntomas consecuentes de la várice esofágica, el fluido ascítico, hemorroides y alargamiento esplénico. La complicación más común de la hipertensión portal son las varices esofágicas que necesitan por lo menos 12 mmHg de presión para formarse. Aproximadamente un tercio de los pacientes con cirrosis hepática muestran várices en el esófago y en el estómago, que cuentan para aproximadamente 30% de las causas de muerte (American Family Physician, 55(5), 1851, 1997). Hasta ahora, los factores involucrados en el sangrado a través de las varices esofágicas y las várices gástricas no son completamente entendidos, pero el tamaño de las varices se cree que estará asociado con la severidad de la hipertensión portal (Pharmacotherapy: a phathophysiologic approach, 1996) . Para tratar la hipertensión del portal, las operaciones quirúrgicas tales como esplenectomía o derivación del portal de la vena cava han sido desarrolladas para reducir el flujo del lecho del portal. Los medicamentos para la hipertensión portal se ejemplifican a través de la vasopresina generalmente utilizada para hemorragia de várice aguda, somatostatina, el bloqueador beta-adrenérgico no específico, el bloqueador alfa-adrenérgico, y preparaciones de nitrato. Estos medicamentos disminuyen la presión en la vena portal reduciendo el flujo arterial hacia el hígado. Como resultado, la corriente sanguínea del portal completa hacia el hígado, la cual ya está gravemente afectada, se deteriora aún más. Por consiguiente, durante muchos años ha existido la necesidad del desarrollo de una sustancia que disminuya la presión de la vena portal selectivamente. Se ha comprobado que el inhibidor de fosfodiesterasa de tipo-5 (de aquí en adelante referido como "PDE 5") , ya conocido como un ingrediente activo en la medicación para la disfunción eréctil, también es efectivo en el tratamiento de hipertensión portal y enfermedades relacionadas con el mismo. Por ejemplo, el uso de los inhibidores PDE 5 para la prevención y el tratamiento de hipertensión portal se describe en PCT/EP2004/006014. Precisamente, los inhibidores PDE 5, sildenafil y vardenafil, tienen efectos preventivos y terapéuticos en la hipertensión portal y sus complicaciones disminuyendo la presión sanguínea de portal a través del incremento del diámetro del vaso sanguíneo del portal y el flujo sanguíneo del portal. Sin embargo, la relajación de la vena del portal no automáticamente significa que el incremento en el flujo sanguíneo a través del hígado y la disminución en la presión sanguínea del portal, y de hecho, el efecto de un inhibidor PDE 5 específico en la sangre fluya a través del hígado y la presión sanguínea del portal es impredecible. De acuerdo con un reporte anterior que investiga el efecto de sildenafil sobre hemodinámicos sistémicos y viscerales en modelos de cirrosis experimental, el sildenafil reduce la presión arterial promedio, causando hipotensión sistémica, e incrementa el flujo sanguíneo a través del mesenterio y la presión sanguínea de portal dependiente de la dosis (Liver International, 24(1), 63, 2004; Digestive Disease Week, Abs S1553, 2003). De esta forma, los investigadores que llevaron a cabo los experimentos anteriores concluyeron en que son requeridos estudios adicionales para prescribir sildenafil para un paciente con cirrosis, porque el incremento en la presión sanguínea del portal por medio del sildenafil podría traer complicaciones de sangrado. En el caso de cirrosis hepática, se observa la relajación vascular esplácnica a través de la superproducción de NO. De acuerdo con un reporte, sildenafil incrementa el efecto de NO, dando como resultado la disminución de la tonicidad angiomesentérica y el incremento del flujo sanguíneo del portal (Liver International, 24(1): 63, 2004; Digestive Disease Week, Abs S1553, 2003) . Más o menos, la función metabólica del hígado se reduce en pacientes con enfermedad hepática tales como cirrosis hepática, la hipertensión de portal, etc., de tal forma que el área por debajo de la curva de concentración-tiempo (AUC, por sus siglas en inglés) y la vida útil del medicamento se incrementa (Alimentary Pharmacology Therapeutics, 20(1), 29, 2004; Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 25(8), 625, 2003). Sin embargo, un paciente con la enfermedad hepática crónica necesita administración a largo plazo y múltiples descripciones. Si el paciente es prescrito con medicina que tiene una vida media corta, disminuye el grado de la aceptación del paciente e inhibe el tratamiento efectivo. Por consiguiente, se han llevado a cabo estudios para preparar una medicina para el tratamiento de enfermedad hepática crónica que mantiene su efecto farmacéutico continuamente, e incrementa el grado de la aceptación del paciente. Y se ha reportado que cuando se administró una vez al día octreotido de tipo somatostatina sintética como una preparación de liberación sostenida, el efecto de la reducción de la presión sanguínea del portal fue de larga duración (Hepatology Research, 19(2), 108, 2001). Además, cuando se administró una vez al día lanreotida de liberación sostenida a través inyección intramuscular a un ratón con la hipertensión portal indujo la esclerosis hepatoportal, la vasodilatación periférica y la circulación sanguínea excesiva se pospuso y la hipertensión portal y la congestión visceral, además de averiguación sistémica del portal, se evitaron (Journal of Hepatology, 31(3), 482, 1999). Considerando los problemas anteriores, existe la necesidad de desarrollar una nueva medicina que puede incrementar el flujo sanguíneo hepático sin efectos secundarios, reducir la presión sanguínea de portal, e incrementar la aceptación con una vida media larga. Los presentes inventores sintetizaron un nuevo compuesto, derivados de pirazolopirimidina 5- [2-propiloxi-5-(1-metil-2-pirrolidiniletilamidosulfonil) fenil] -1-metilpropil-1, 6-dihidro-7H-pirazólo (4 , 3-d) pirimidin-7-ona, y reportaron su efecto inhibidor PDE 5 en un estudio previo (Patente Coreana No. 377,782). Después, los presentes inventores siguieron estudiando el derivado de pirazolopirimidina, con un inhibidor PDE 5, y completaron esta invención a través de la confirmación de que el derivado de pirazolopirimidina tiene un excelente efecto inhibidor de la síntesis de colágeno, y puede mejorar en la aceptación medicinal de pacientes con enfermedad hepática crónica ya que el derivado de pirazolopirimidina tiene una vida media larga y reduce la presión sanguínea del portal. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema Técnico Es un objetivo de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de enfermedades hepáticas que contiene el derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo. Es otro objetivo de la presente invención proporcionar un inhibidor de fibrosis hepática. Es un objetivo más de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de cirrosis hepática a través de la inhibición de fibrosis hepática. Es también un objetivo de la presente invención proporcionar un inhibidor de la hipertensión del portal. Es otro objetivo de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de complicaciones generadas por el avance de la hipertensión del portal. Solución técnica Para lograr los objetos anteriores, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de fibrosis hepática, cirrosis hepática, hipertensión de portal, y las complicaciones causadas por la misma, que contiene el derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo. A continuación, la presente invención se describe con detalle. La presente invención proporciona una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de fibrosis hepática, cirrosis hepática, hipertensión del portal, y las complicaciones causadas por éstas, que contiene el derivado de pirazolopirimidina 5- [2-propiloxi-5- (l-metil-2-pirrolidiniletilamidosulfonil ) fenil] -1-metil-propil-l , 6-dihidro-7H-pirazolo (4, 3-d)pirimidin-7-ona) , representado por la siguiente fórmula química 1 como ingrediente activo. Fórmula química 1
El derivado de pirazolopirimidina es una clase de inhibidor PDE 5. Tiene una excelente actividad inhibidora PDE 5 y selectividad. El derivado de pirazolopirimidina se absorbe rápido debiendo esto a su solubilidad mejorada, y tiene una alta biodisponibilidad y una amplia biodistribución. Además, se caracteriza por al menos tres veces una vida media más larga que aquellos de sildenafil y del vardenafil. Las propiedades fisicoquímicas del derivado de pirazolopirimidina son como siguen; es insoluble en agua pero soluble en ácido acético, metanol y cloroformo. Su punto de fusión es de 158-161°C y tiene valores pKai y pKa2 de 6.5 y 12.5 respectivamente. Es un polvo blanco o amarillo pálido que no es hidrato ni tampoco solvato. El derivado de pirazolopirimidina se puede sintetizar a través de los siguiendo tres pasos, como se particulariza a continuación: En el paso 1, se prepara 4- [2-propiloxi-5-(clorosulfonil) benzamido] -1-metil-3-propil-5-carbamoil pirazol. Precisamente, la cantidad apropiada de 4- [2-propiloxi benzamido] -l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazol se agrega a la solución de la cantidad apropiada de ácido clorosulfónico empleado a 0°C. La mezcla se agita, se filtra, se lava y se seca para dar 4- [2-propiloxi-5-(clorosulfonil) benzamido] -l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazolo En el paso 2, se prepara 4- [2-propiloxi-5- (1-metil-2-pirrolidiniletil amidosulfonil) benzamido] -l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazolo del compuesto pirazol producido en el paso 1 anterior. Precisamente, la cantidad apropiada de 2- (2-aminoetil) -1-metilpirrolidina se agrega a 0°C a la solución de diclorometano que contiene la cantidad apropiada de 4- [2-propiloxi-5- (clorosulfonil) benzamido] -l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazolo del paso 1, seguido por agitación. Después de la finalización de la reacción, la solución de reacción se diluye con diclorometano. La capa orgánica se lava, se seca, se concentra y se filtra para dar 4- [2-propiloxi-5- (1-metil-2-pirrolidiniletil amidosulfonil) benzamido] -l-metil-3-propil-5-carbamoil pirazolo. En el paso 3, se prepara 5- [2-propiloxi-5- (1-metil-2-pirrolidiniletil amidosulfonil) fenil] -l-metil-3-propil-l, 6-dihidro-7H-pirazolo (4 , 3-d) pirimidin-7-ona, que es el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención, a partir del compuesto obtenido en paso 2. Precisamente, la cantidad apropiada del compuesto pirazol sintetizado en el paso 2 se disuelve en t-butanol, al cual se agrega la cantidad apropiada de t-butóxido de potasio, seguido por reflujo durante el tiempo requerido. Después de la finalización de la reacción, la solución de reacción se enfría, se diluye, se lava y se seca. Después, la destilación a presión reducida, la eliminación de un disolvente y cromatografía de columna de gel de sílice se llevan a cabo para dar el nuevo derivado de pirazolopirimidina de la invención. La presente invención se refiere con una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de enfermedad hepática, y se describe como sigue.
1) La presente invención proporciona un inhibidor de fibrosis hepática. 2) La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de cirrosis hepática que inhibe la fibrosis hepática. 3) La presente invención además proporciona un inhibidor de hipertensión del' portal. 4) La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de complicaciones causadas por la hipertensión de portal. Con el incremento de depósito de colágeno en células estrelladas hepáticas en el hígado, se desarrolla la fibrosis hepática. Después, las células del hígado que permanecen entre las fibras inician la proliferación para mantener las funciones del hígado, a través de las cuales se forman los nodos de regeneración. La vena central del lóbulo hepático se presiona a través de la fibrosis y los nodos de regeneración, dando como resultado el bloqueo del flujo sanguíneo a través de la vena del portal en el hígado, causando la hipertensión del portal. De esa forma, la presión sanguínea del portal podría reducirse con la inhibición de la fibrosis hepática. El flujo sanguíneo a través del hígado se puede mejorar con la disminución de la presión sanguínea del portal y el incremento del flujo sanguíneo del portal, conduciendo a la protección del hígado.
Como se mencionó aquí anteriormente, el control de la fibrosis hepática y la presión sanguínea del portal están estrechamente relacionados con la protección del hígado. La composición de la presente invención que contiene el derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo puede prevenir el avance de la fibrosis hepática inhibiendo la síntesis de colágeno en las células estrelladas hepáticas, tiene un efecto protector sobre el hígado, puede reducir la presión sanguínea del portal trabajando directamente hacia la vena del portal, e incrementa el flujo sanguíneo a través de la vena del portal, todas sugiriendo que la presente invención tiene un excelente efecto terapéutico sobre enfermedades hepáticas crónicas relacionadas con fibrosis hepática e hipertensión del portal. El derivado de pirazolopirimidina de la presente invención tiene de 10-16 veces un efecto inhibidor de síntesis de colágeno excelente sobre otros inhibidores PDE 5 convencionales. Se confirmó a través de dicho efecto excelente que el derivado de pirazolopirimidina de la invención puede inhibir la fibrosis hepática causada por el depósito de colágeno en las células estrelladas hepáticas en el hígado, y proteger el hígado (ver Tabla 1) . Además, el derivado de pirazolopirimidina de la invención reduce la presión sanguínea del portal dependiente de dosis pero incrementa el diámetro del portal y el flujo sanguíneo del portal. A diferencia de sildenafil que se reportó que más bien incrementa la presión sanguínea del portal, el derivado de pirazolopirimidina de la invención puede efectivamente utilizarse para el tratamiento de hipertensión portal y de varias complicaciones inducidas a través del mismo (ver Tabla 2) . La enfermedad hepática crónica incluye varias complicaciones causada por cirrosis hepática dando como resultado fibrosis hepática e hipertensión portal (Rubin Farber Pathology, 1999). Dichas complicaciones se ejemplifican a través de las várices esofágicas (American Family Physician, 55(5), 1851, 1997), el alargamiento esplénico y el hiperesplenismo, los ascitos, el síndrome hepatorrenal (Gastroenterology Vol. 120, No. 3), peritonitis bacteriana espontánea (Curr Opinión in Gastroenterology 2004,20:254-263), síndrome hepatopulmonar (Dig Dis Sci 2003, 48:556-560), encefalopatía hepática (Neuroreport 2003, 14:2379-2382), etc. Dichas complicaciones se describen con detalle más adelante. Las varices esofágicas significan la generación de venas anormales en esófago o estómago. Cuando la condición se intensifica se agrava, esas venas se revientan y sangran. La presión sanguínea alta del portal causa la alteración del flujo sanguíneo, incrementando el tamaño de las células del bazo, a través de lo cual se desarrolla el alargamiento esplénico, otra causa de sangrado interno. Los ascitos indican hidropesía abdominal. La presión de portal alta incrementa la presión hidrostática en el plasma sanguíneo y la linfa, dando como resultado la estasis linfática que induce la descarga de humedad dentro de la cavidad abdominal. Los ascitos presionan al pulmón, causando la difícil respiración, y la presión a largo plazo sobre el pulmón aún causando la sepsis fatal. La peritonitis bacteriana idiopática (autógena) , también se activa a través de alta presión del portal, por lo general observada en pacientes con ascitos, a diferencia de otras peritonitis (peritonitis secundaria) que tiene una causa anticipada tal como enterrohexis y gastrorrhexis interna o trauma. El síndrome hepatorrenal indica una depresión severa del riñon por cirrosis hepática, activada por una falta de balance del fluido corporal. El síndrome hepatopulmonar es una enfermedad de hipoxia, observada en pacientes con enfermedad hepática crónica, aunque esos pacientes no tengan una enfermedad cardiaca o de pulmón específica. Como la cirrosis hepática, la encefalopatía hepática es otra complicación severa que se desarrolla del mal funcionamiento en la conversión de amonio, un material tóxico interno, dentro de la urea como declinación de las funciones del hígado, por lo tanto afectando el sistema neuronal y aún conduciendo a un coma fatal. Como se explicó aquí anteriormente, la alteración en la circulación sanguínea presiona las venas del portal y después ocurre el reflujo de la sangre en las venas de portal, de tal forma que el flujo sanguíneo encuentra una desviación sin pasar a través del hígado. Como resultado, los vasos sanguíneos colaterales se generan particularmente en áreas de baja presión del tracto alimenticio tal como por debajo de la capa de mucosa del esófago, o las paredes abdominales anteriolaterales y en el recto, etc. De esta forma, el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención puede efectivamente utilizarse como una composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de las complicaciones antes mencionadas a través de la supresión fundamental de la presión del portal en incremento. Una composición farmacéutica para la prevención y tratamiento de enfermedad hepática, que contiene el derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo de la presente invención, se puede administrar oral o parenteralmente, y puede utilizarse en formas generales de formulación farmacéutica. En esta invención, se prefiere la administración oral. La composición farmacéutica de la presente invención se puede preparar para administración oral o parenteral mezclándose con llenadores, extensores, aglutinantes, agentes humectantes, agentes disgregantes, diluyentes tales como el agente tensioactivo, o excipientes generalmente utilizados.
Las formulaciones sólidas para administración oral son tabletas, pildoras, polvos, granulos y cápsulas. Estas formulaciones sólidas se preparan a través del mezclado de uno o más excipientes adecuados tales como almidón, carbonato de calcico, sacarosa, lactosa, gelatina, etc. Excepto por los excipientes simples, los lubricantes, por ejemplo estearato de magnésico, talco, etc., se pueden utilizar. Las formulaciones líquidas para administración oral son suspensiones, soluciones, emulsiones y jarabes, y las formulaciones antes mencionadas pueden contener varios excipientes tales como agentes de humectación, edulcorantes, aromáticos y conservadores además de los diluyentes simples generalmente utilizados tales como agua y parafina líquida. Las formulaciones para administración parenteral son soluciones acuosas esterilizadas, excipientes insolubles al agua, suspensiones, emulsiones, y supositorios. Los excipientes insolubles en agua y las suspensiones pueden contener, además del compuesto o compuestos activos, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal como el aceite de olivo, éster inyectable de tipo etiolato, etc. Los supositorios pueden contener, además del compuesto o compuestos activos, witepsol, macrogol, tween 61, mantequilla del cacao, manteca de laurina, glicerogelatina, etc. La dosis efectiva de las composiciones que contiene el derivado de pirazolopirimidina como un ingrediente activo de la presente invención se puede determinar de acuerdo con el peso, edad, sexo, condición de la salud, dieta, frecuencia de la administración, método de administración, excreción y severidad de la enfermedad. La dosis preferible y la frecuencia de administración para un adulto son de 50 - 200 mg por día y de una a tres o cuatro veces al día. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1-4 son un grupo de fotomicrografías que muestran los efectos inhibidores de la síntesis de colágeno, de acuerdo con el Ejemplo 2 de la invención, de control del tipo silvestre (Figura 1), control de solvente (Figura 2) , el grupo tratado con sildenafil (Figura 3) y grupo tratado con derivado de pirazolopirimidina (Figura 4). DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades prácticas y actualmente preferidas de la presente invención se ilustran como se muestra en los siguientes ejemplos. Sin embargo, se apreciará por lo expertos en la técnica, en consideración de esta descripción, que se pueden hacer muchas modificaciones y mejoras dentro del espíritu y del alcance de la presente invención. Ejemplo 1. Investigación del efecto inhibidor del derivado de pirazolopirimidina sobre la sintesis de colágeno utilizando células estrelladas hepáticas Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para investigar el efecto de inhibición del derivado de pirazolopirimidina de la presente invención sobre la síntesis de colágeno. Se aislaron células estrelladas hepáticas de ratas macho blancas Sprague Dawley (de aproximadamente 300 g en peso, n=10) . Primero, se inyecto cetamina dentro de la cavidad abdominal para anestesiar las ratas. El abdomen se abrió y se inyecto heparina en la vena del portal. Después, se bombeó una solución de regulador de pH de Hank que contiene 0.02% de pronasa y 0.015% de colagenasa a través del hígado durante un tiempo requerido para preparar el hígado en secciones. El hígado extraído se trituró en un plato petri esterilizado, después se puso en una solución reguladora de pH que contiene pronasa y DNase, y después el hígado triturado se homogeneizó en un plato petri esterilizado. La muestra preparada se filtró con una malla de nylon de 100 µm en un tubo 50 ml . Se llevó a cabo la centrifugación con 50 g durante 2 minutos para separar las células no parenquimales en el sobrenadante. La centrifugación se llevó a cabo de nuevo con 450 g a 4°C durante 10 minutos. El precipitado se hizo flotar en una solución reguladora de pH que contiene 25 µg/ml de DNase, seguido por centrifugación con 450 g a 4°C durante 10 minutos, lo cual se repitió dos veces. El precipitado final se hizo flotar en 21 ml de solución reguladora de pH, la cual después se mezcló con 17 ml de 25% de OptiPrep para preparar la solución final de 11.2% OptiPrep (1.058 g/cm3). La solución de suspensión celular mezclada con OptiPrep se distribuyó cuidadosamente en cuatro tubos de 15 ml que contiene 3 ml de 17% de OptiPrep, para lo cual se agregó 1 ml de solución reguladora de pH. La centrifugación se llevó a cabo con 1400 g en 4°C durante 17 minutos, y como resultado, se obtuvieron las células estrelladas hepáticas de la capa opaca entre la solución reguladora de pH y los 11.8% de OptiPrep. Las células estrelladas hepáticas separadas se suspendieron en DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) , seguido por lavado. Las células se volvieron a suspender en DMEM suplementado con 10% de FBS (suero de bovino fetal) y antibióticos, después se inoculó en un matraz de cultivo, el cual se cultivó en un incubador con C02 al 5% a 37°C. El medio de cultivo primero se reemplazó 24 horas después, y después se reemplazó cada 48 horas para un sub-cultivo. Las células estrelladas hepáticas sub-cultivadas 8 veces se agruparon en 2xl05, las cuales después se pre-trataron con 25 ng/ml de PDGF (Factor de Crecimiento Derivado de Plaqueta) durante 24 horas. En ese momento, se agregó el derivado de pirazolopirimidina, sildenafil y vardenafil a concentraciones diferentes de 0, 3, 5, y 10 ng/ml para la reacción. El ARN total se extrajo y se llevó a cabo el RT-PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa de Transcriptasa Inversa) para el colágeno. Con base en la configuración relativa para la beta-actinia, se comparó un material objetivo con otras muestras de prueba. Con el fin de determinar el efecto inhibidor de una muestra objetivo sobre la síntesis de colágeno, se investigó la concentración inhibidora de 50% (IC50), y después el resultado se muestra en la Tabla 1. Tabla 1 Efecto inhibitorio de los inhibidores PDE 5 sobre la síntesis del colágeno
Como se muestra en la Tabla 1, el IC50 del derivado de pirazolopirimidina fue de 0.8±0.2 nM, el cual fue 16 veces y 10 veces más alto en el efecto inhibidor de la síntesis de colágeno que aquellos de sildenafil y vardenafil, respectivamente. Por consiguiente, se confirmó que el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención tiene un efecto inhibidor de síntesis más excelente que los otros inhibidores PDE 5, sildenafil y vardenafil, y por consiguiente tiene un excelente efecto inhibidor sobre la 6
fibrosis hepática que resulta en excesivo depósito de colágeno, y excelente efecto protector del hígado por lo tanto. Ejemplo 2. Investigación del efecto protector del hígado del derivado de pirazolopirimidina utilizando un modelo de animal con fibrosis hepática Se llevaron a cabo los siguientes experimentos para investigar el efecto inhibidor de la síntesis de colágeno in vivo del derivado de pirazolopirimidina de la presente invención. Se dividieron ratas hembra blancas Sprague Dawley
(teniendo aproximadamente 300 g en peso) en 4 grupos (5 ratas por grupo), y se indujo la fibrosis hepática en los grupos experimentales excepto en el grupo de control de tipo silvestre (Toxicology, 2001) . Se inyectó DMN (dimetilnitrosamina) en la cavidad abdominal en una dosis de 10 mg/kg serial durante 2 semanas con una frecuencia de dosis de tres veces por semana. El derivado de pirazolopirimidina y sildenafil en un regulador de pH de triazol (Merch) se administraron oralmente a 10 mg/kg/día durante 2 semanas (periodo de inducción DMN) . Solamente se administró el regulador de pH de triazol al grupo de control de solvente. Dos semanas después, se extrajo el hígado, se fijó en 10% de formalina neutral, se embebió en parafina y se cortó en 4 m. Cada sección se trató con xileno para eliminar la parafina, seguido por tratamiento con alcohol y 0.1% de peróxido de hidrógeno (H202) . Después del tratamiento con PBS, las secciones se trataron con antisuero policlonal (Chemicon) contra colágeno de tipo I diluido en 1:500 y antisuero policlonal (BioGenesis) contra colágeno de tipo III diluido 1:100, a 37°C durante una hora. Después de lavado, las muestras se trataron con 1:200 de IgG de anti-conejo de cabra conjugado con biotina. La tinción immunohistológica se llevó a cabo a través de la reacción de las muestras con el complejo avidina-biotina (Vector Laboratories) . Después el complejo de antígeno-anticuerpo se marcó con 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) , cuya imagen se tomó a través de microscopio óptico ahora mostrado en las Figuras 1-4. El grupo de control se trató con suero de caballo no inmunizado en lugar del anticuerpo principal. Como se muestra en las Figuras 1-4, se observó un alto nivel de síntesis de colágeno de las venas de portal hepáticas y alrededor de vena portal del grupo de control de solvente, comparado con los animales de tipo silvestre, indicando que la síntesis de colágeno se inhibe remarcadamente a través del derivado de pirazolopirimidina y sildenafil. La inhibición de la síntesis de colágeno en el grupo tratado con el derivado de pirazolopirimidina fue mayor que en el grupo tratado con sildenafil.
Ejemplo 3. investigación del efecto del derivado de pirazolopirimidina con modelos de animal con hipertensión portal Se llevaron a cabo los siguientes experimentos para investigar el efecto del derivado de pirazolopirimidina sobre la hipertensión del portal. Doce perros sabuesos pesando aproximadamente 10 kg se dividieron en 4 grupos (3 perros para cada grupo seleccionados aleatoriamente) , y se llevó a cabo la ligación del ducto biliar en ellos. Después de dos semanas de la operación, se administró oralmente el derivado de pirazolopirimidina, sildenafil y vardenafil en dosis de 10 mg/kg/día y a 3 de ellos se administró solo solvente. Los animales estuvieron en ayunas durante 4 horas, después se inyecto intravenosa pentobarbital para anestesiarlos. Se insertó un tubo a través de la vena mesentérica hacia la vena portal para medir la presión sanguínea del portal. También se llevó a cabo la ultrasonografía Doppler para medir el diámetro de la vena del portal. El flujo sanguíneo a través de la vena portal se midió utilizando la siguiente fórmula química matemática 1 y el resultado se muestra en la Tabla 2.
Fórmula Matemática 1
V Lccida? de Flojo ?Jánetro de la vena portal, Vs •velocidad de f ujo í?spgaá?ie ) 2
Tabla 2 El efecto del derivado de pirazolopirimidina sobre la hipertensión portal
Como se muestra en la Tabla 2, la presión sanguínea de portal tuvo una disminución del 21% en el grupo tratado con derivado de pirazolopirimidina, disminución de 7% en el grupo tratado con sildenafil y disminución del 9% en el grupo tratado con vardenafil, comparado con el del grupo de control tratado con solvente. A partir de la comparación del diámetro de vena portal, se confirmó que el diámetro de las venas de portal de cada uno de los grupos tratados con derivado de pirazolopirimidina, sildenafil y vardenafil fue de 6-9% de incremento, lo cual se cree que no fue estadísticamente significativo. Las velocidades de flujo sanguíneo a través de las venas de portal también se compararon. Como resultado, la velocidad de flujo sanguíneo en el grupo tratado con derivado de pirazolopirimidina tuvo un incremento 59.9%, comparado con el del grupo tratado con el solvente, y las velocidades de flujo sanguíneo en los grupos tratados con sildenafil y vardenafil tuvieron 29.1% y 24.8% de incremento respectivamente . A partir de los resultados obtenidos, se confirmó que el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención, a diferencia de sildenafil que se sabe que más bien incrementa la presión sanguínea de portal, marcadamente reduce la presión sanguínea de portal pero significativamente incrementa el flujo sanguíneo a través de la vena portal, haciéndolo un candidato muy efectivo para una composición farmacéutica terapéutica para la hipertensión portal y complicaciones de la misma, sin efectos laterales que incluyen hemorragia de la várices esofágica, etc. Ejemplo 4. Investigación de los farmacocinéticos in vivo del derivado de pirazolopirimidina Nueve voluntarios entre los pacientes con hipertensión en portal que estuvieron en el criterio de edad de 19-45 y un peso arriba de 45 kg (dentro de una desviación de 15% del peso corporal ideal) participaron en los experimentos. Todos fueron voluntarios que aceptaron suscribirse para unirse a los experimentos y por lo tanto dignos de confianza, cooperadores y que deseaban seguir la regla. Estos se dividieron en tres grupos aleatoriamente; tres de ellos fueron administrados con derivado de pirazolopirimidina, tres con sildenafil y los restantes tres se administraron con vardenafil a diferentes concentraciones de 100, 50, y 10 mg, respectivamente. Se utilizó un método doble ciego para los experimentos. A las 8-9 am en el día de la prueba, se les dieron medicinas de prueba con 240 ml de agua a los voluntarios. Después de 4 horas de la administración, estuvieron en ayunas, y se les dio un almuerzo 4 horas después y una comida después de 9 horas. Las muestras sanguíneas se tomaron antes de la administración en el día de prueba y en la 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24 y 32 horas después de la administración. El plasma en la sangre se aisló, seguido por HPLC. Se agregaron 100 µl de 0.1 M de carbonato de sódico y 1.0 ml de éter dietílico a 0.5 ml de plasma de la sangre, después se mezclaron bien durante 1 minuto, seguido por centrifugación a 12,000 rpm durante 3 minutos. Se obtuvo el sobrenadante y el solvente orgánico se volatilizó utilizando un aspirador de velocidad. Después, se agregaron 100 µl de la fase en movimiento, seguido por agitación. El producto resultante se inyectó en un inyector de HPLC, y el resultado se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3. Comparación de las vidas medias del derivado de pirazolopirimidina, sildenafil y vardenafil en pacientes con hipertensión portal
Como se muestra en la Tabla 3, la vida media del derivado de pirazolopirimidina fue de 15.1 ± 3.5 horas, la cual fue tres y dos veces más larga que la de sildenafil (4.5 ± 1.2) y vardenafil (6.3 ± 2.1), respectivamente. De esta forma, el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención no sólo tiene un excelente efecto terapéutico sobre la fibrosis hepática y la hipertensión de portal, sino también reduce la frecuencia de administración debido a su media vida más larga que otros inhibidores PDE-5, sugiriendo que el derivado de pirazolopirimidina puede mejorar la aceptación en los paciente con enfermedad hepática crónica . Se describen a continuación Ejemplos preparativos de la composición de la presente invención. Ejemplo Preparativo . Preparación de las composiciones farmacéuticas para administración oral 1. Preparación de polvos Derivado de pirazolopirimidina 2 g Lactosa 1 g Los ingredientes antes mencionados se mezclaron juntos, y se rellenó una bolsa hermética con la mezcla para preparar los polvos. 2. Preparación de tabletas Derivado de pirazolopirimidina 100 mg
Almidón de maíz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg Los ingredientes antes mencionados se mezclaron juntos, y las tabletas se prepararon a través de la formación de tabletas de acuerdo con el método de tabletas convencional . 3. Preparación de las cápsulas Derivado de pirazolopirimidina 100 mg
Almidón de maíz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg
Los ingredientes antes mencionados se mezclaron juntos, y las cápsulas de gelatina se rellenaron con la mezcla para preparar cápsulas de acuerdo con el método de producción de cápsulas convencional. Aplicabilidad Industrial Como se explicó aquí anteriormente, el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención tiene un excelente efecto inhibidor sobre la síntesis de colágeno en células estrelladas hepáticas, incrementa el flujo sanguíneo a través de la vena portal y expande el diámetro de la vena portal a través de la afección directa de la vena portal, y reduce la presión sanguínea del portal. De esta forma, el derivado de pirazolopirimidina puede efectivamente utilizarse para la prevención y tratamiento de fibrosis hepática, cirrosis hepática resultando de la fibrosis hepática de larga duración, hipertensión portal y varias complicaciones causadas por lo mismo. Además, el derivado de pirazolopirimidina de la presente invención tiene una vida media más larga in vivo, sugiriendo que puede mejorar la aceptación en pacientes con enfermedad hepática crónica recortando la frecuencia de administración. Los expertos en la técnica apreciarán que los conceptos y modalidades específicas descritas en la descripción anterior pueden fácilmente utilizarse como las bases para modificar o diseñar otras modalidades para llevar a cabo los mismos propósitos de la invención. Los expertos en la técnica también apreciarán que dichas modalidades equivalentes no se apartan del espíritu y alcance de la invención como se establece en las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.