ANÁLOGOS DE 17,20(E)-PESHIPRO VITAMINA D Y SUS USOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos de vitamina D, y más particularmente a análogos de 17,20(E)-des idro-vitamina D y sus usos farmacéuticos, y en especial a 17(E)-1a .25-dihidroxi-17(20)-deshidrs-2-metilen-19-norvitamina D3l sus actividades biológicas y sus usos farmacéuticos. La hormona natural, 1 a ,25-dihidroxivitamína D3 y su análogo en la serie ergosterol, es decir 1 ,25-dihidroxivitamina Oz se conocen como reguladores altamente potentes de la homeostasis de calcio en animales y humanos, y su actividad en diferenciación celular también se ha establecido, Ostrem et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84. 2610 (1987). Muchos análogos estructurales de estos metabolitos se han preparado y probado incluyendo 1 a -hidroxivitamina D3, 1 or-hidroxivitamina D2l diversas vitaminas homologadas de cadena lateral y análogos fluorados. Algunos de estos compuestos exhiben una separación interesante de actividades en diferenciación de células y regulación de calcio. Esta diferencia en actividad puede ser útil en el tratamiento de una variedad de enfermedades tales como osteodistrofia renal, raquitismo resistente a vitamina D, osteoporosis, psoriasis, y ciertas malignidades. Otra clase de análogos de vitamina D, es decir los así denominados 19-nor-vitamina D se caracteriza por el reemplazo del grupo metileho exocíclico de anillo A (carbono 19), típico deí sistema de vitamina D, por dos átomos de hidrógeno. Prueba biológica de estos 19-nor-anáIogos (por ejemplo, 1 ar ,25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3) reveló un perfil de actividad selectivo con alta potencia para inducir diferenciación celular y muy baja actividad de movilización de calcio. De esta manera, estos compuestos son potencialmente útiles como agentes
terapéuticos para el tratamiento de malignidades o el tratamiento de diversos desordenes de la piel. Dos métodos diferentes de síntesis de estos análogos 19-nor-vitamina D se han descrito (Períman et al., Tetrahedron Lett. 31, 1823 (1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991), y DeLuca et al., en la Patente de los E.U.A. No. 5,086,191). En la Patente de los E.UA. No. 4,666,634, análogos 2/?-hidroxi y alcoxi (por ejemplo, ED-71) de 1 a ,25-dihidroxivitamina D3 se han descrito y examinado por el grupo Chugai como drogas potenciales para osteoporosis y como agentes antitumor. Ver también Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 1444 (1989). Otros análogos de anillo-A 2-substituidos (con grupos hidroxialquilo, por ejemplo, ED-120, y fluoroalquilo) de 1 a ,25-dihidroxivitamina D también se han preparado y probado (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull. 41, 1111 (1993); Nishii et al., Osteoporosis Int. Suppl. I, 190 (1993); Posner et di., J. Org. Chem. 59, 7855 (1994), y J. Org. Chem.60, 4617 (1995)). Análogos 2-substituidos de 1a ,25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3 también se han sintetizado, es decir compuestos substituidos en la posición 2 con grupos hidroxi o alcoxi (DeLuca et al., U.S. Patente de los E.U.A. No. 5,536,713), con grupos 2-alquiIo (DeLuca et ai Patente de los E.UA. No. 5,945,410), y con grupos 2-aIquilideno (DeLuca et al Patente de los E.U.A. No. 5,843,928), que exhiben perfiles de actividad interesantes y selectivos. Todos estos estudios indican que sitios de enlace en receptores de vitamina D pueden permitir diferentes substituyentes en C-2 en los análogos de vitamina D sintetizados. En un esfuerzo continuo por explorar ia clase 19-nor compuestos de vitamina D farmacológicamente importantes, análogos que se caracterizan por la presencia de un substituyente metileno en el carbono 2 (C-2), un grupo hidroxilo en
el carbono 1 (C-1), y una cadena lateral recortada conectada al carbono 20 (C-20) también se han sintetizado y probado, 1 a-hidroxi-2-metilen-19-nor-pregnacalciferoI se describe en la Patente de los E.U.A. No. 6,566,352 mientras que 1 a -hidroxi-2-metilén-19-nor-hornopregnacalciferol se describe en la Patente de los E.U.A. No. 6,579,861 y 1a-hidroxi-2-metilen-19-nor-bishomopregnacafciferol se describe en la Patente de los E.U?. No.6,627,622. Todos estos tres compuestos tienen actividad de enlace relativamente alta a receptores de vitamina D y actividad de diferenciación celular relativamente alta, pero poca de haber actividad calcémica en comparación con 1 a ,25-dihidroxivitamina Ds. Sus actividades biológicas hacen a estos compuestos excelentes candidatos para una variedad de usos farmacéuticos, como se establece en las Patentes '352, '861 y '622. COMPENDIO PE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a análogos de 17,20(E)-deshidro vitamina D, y sus usos farmacéuticos, y más específicamente a 17(E)-1 ,25-dihídroxi-17(20)-deshidro-2-metilen-19-norvitamina D3, su actividad biológica y diversos usos farmacéuticos para estos compuestos. Estructuralmente, estos análogos de 17,20(E)-deshidro-vitamina D se caracterizan por la fórmula general I mostrada a continuación:
en donde Yi y Y2, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno se elige del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo hidroxi protector, en donde Rn y R?2 son cada uno hidrógeno o tomados en conjunto son un grupo metileno, en donde R6y R7, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno se elige del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, h?droxialquilo, fluoroalquilo, hidroxi y alcoxi, o R6 y R7 cuando se toman juntos pueden representar el grupo -(CH2)?- en donde x es un entero de 2 a 5, o R6y R7 cuando se toman juntos pueden representar el grupo =CR8R9 en donde ß y g, que pueden ser ¡guales o diferentes, cada uno se eligen del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo, fluoroalquilo, hidroxi y alcoxi, o cuando se toman juntos R8 y g pueden representar el grupo -(CH2)?- en donde x es un entero de 2 a 5, y en donde el grupo R representa cualquiera de las cadenas laterales típicas conocidas para compuestos de tipo vitamina D. Más específicamente, R puede representar un radical hidrocarburo saturado o insaturado de 1 a 35 átomos de carbono, que puede ser de cadena recta, ramificada o cíclica y que puede contener uno o más substituyentes adicionales, tales como grupos h?droxi- o hidroxi protegido, flúor, carbonilo, éster, epoxi, amino u otros grupos heteroatómicos. Cadenas laterales preferidas de este tipo se representan por la siguiente estructura
en donde la cadena lateral y el doble enlace 17-eno está en la configuración E y en
donde 2 en la estructura de cadena lateral anterior se elige de Y, -OY, -CH2OY, -C=CY y -CH=CHY, en donde el doble enlace en la cadena lateral puede tener la geometría cis o trans, y en donde Y se elige de hidrógeno, metilo, -COR5 y un radical de la estructura:
en donde m y n, independientemente representan los enteros de 0 a 5, en donde R1 se elige de hidrógeno, deuterio, hídroxi, hidroxi protegido, flúor, trifluorometilo, y C1.5-alquilo, que puede ser de cadena recta o ramificada y opcionalmente contener un substituyente hidroxi o hidrox? protegido y en donde cada uno de R2, R3 y R4, independientemente se eligen de deuterio, deuteroalquilo, hidrógeno, flúor, trifluorometilo y C1-5 alquilo, que puede ser de cadena recta o ramificada y opcionalmente contener un substituyente hidroxi o hidroxi protegido y en donde R1 y R2, juntos representan un grupo oxo, o un grupo alquilideno que tiene una fórmula general -C?H2K- en donde k es un entero, el grupo =CR2R3, o el grupo -(CH2)p-, en donde p es un entero de 2 a 5, en donde R3y R4, tomados en conjunto, representan un grupo oxo, o el grupo -(CH2)q-, en donde q es un entero de 2 a 5, y en donde R5 representa hidrógeno, hidroxi, hidroxi protegido, o C1-5 alquilo y en donde cualquiera de los grupos CH en las posiciones 20, 22, o 23 en la cadena lateral pueden ser reemplazados por un átomo de nitrógeno, o en donde cualquiera de los grupos -CH(CH3)-, -(CH2)m-, -CR1R2- o -(CH )„- en ias posiciones 20, 22, y 23, respectivamente pueden ser reemplazados por un átomo de oxígeno o azufre. El análogo preferido es 17(E)-1e¡. ,25-dihidroxi-17(20)-deshidro-2-
metilen-19-norvitamina I^ que tiene la siguiente fórmula la:
Los compuestos anteñores de .a fórmula ?, en especial la fórmula la, exhiben un patrón deseado y altamente ventajoso de actividad biológica. Estos compuestos se caracterizan por un enlace relativamente alto a receptores de vitamina D, pero muy baja actividad de transporte de calcio intestinal, en comparación con la de 1 ,25-dihídro>avitamína D3, y tiene muy baja habilidad para movilizar calcio de hueso, en comparación con 1ar ,25-díhídroxivífamína Oz. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser caracterizados porque tienen muy poca, de haber acfividad caícémica. Es indeseable elevar ef calcio en suero a niveles supra-fisiológicos cuando se suprime el gen de hormona pre pro para tiroide (Darwish & DeLuca, Arch. Biochem. Bíophys. 365, 123-130,1999) y proliferación de glándula paratiroide. Estos análogos tienen poca o nula actividad calcémica mientras que son muy activos en diferenciación cefufar y también se espera que sean útiles como una terapia para supresión de hiperparatiroidismo secundario de osteodistrofia renal. Los compuestos l, y particularmente la, de la invención también se
han descrito especialmente adecuados para el tratamiento y profilaxis de desordenes humanos que se caracterizan por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo en enfermedades autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, rechazo de anfitrión contra injerto, y rechazo de transplante de órganos; y adicionalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como artritis reumatoide, asma, y enfermedad inflamatoria de intestino, tal como enfermedad ciiíaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Acné, alopecia e hipertensión son otras condiciones que pueden ser tratadas como los compuestos de la invención. Los compuestos anteriores I, y particularmente la, también se caracterizan por actividad de diferenciación celular relativamente alta. De esta manera, estos compuestos también proporcionan agentes terapéuticos para el tratamiento de psoriasis, o como un agente anti-cáncer, en especial contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata. Además, debido a su actividad de diferenciación celular relativamente alta, estos compuestos proporcionan agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas condiciones de la piel incluyendo arrugas, falta de hidratación dérmica adecuada, es decir piel seca, falta de firmeza adecuada de la piel, es decir piel holgada, e insuficiente secreción de sebo. El uso de estos compuesfos de este manera no solo resulta en humectación de la piel sino también mejora la función barrera de la piel. Los compuestos de la de ia invención de la fórmula I, y particularmente la fórmula la, también son útiles para evitar o tratar obesidad, incluyendo diferenciación de adipocitos, inhibir transcripciones del gen SCD-1 y/o reducir grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para evitar o tratar obesidad, inhibir diferenciaciones de adipocitos,
inhibir transcripciones del gen SCD-1 y/o reducir grasa corporal en un sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal, una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de la fórmula l, y en particular el compuesto de la fórmula la. Administración de uno o más de los compuestos o las composiciones farmacéuticas al sujeto, inhibe la diferenciación de adipocitos, inhibe transcripción de genes y/o reduce grasa corporal en el sujeto animal. Uno o más de los compuestos puede ester presente en una composición para tratar o evitar las enfermedades y desordenes anteriormente anotados, en una cantidad desde aproximadamente 0.01 µgfgm a aproximadamente 1000 /¿ g/gm de la composición, de preferencia de aproximadamente 0.1 µ g/gm a aproximadamente 500 µ g/gm de la composición, y pueden administrarse en forma tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o parenteral, en dosis desde aproximadamente 0.01 µ g/día a aproximadamente 1000 µ g/día, de preferencia de aproximadamente 0.1 / g día a aproximadamente 500 µ g/día. BREVE DESCRIPCIÓN PE LOS P1BUJOS Las Figuras 1-5 ¡lustran diversas actividades biológicas de 17(E)-1 a ,25-dihidroxi-17(20)-deshidro-2-metilen-19-norvítamina D3, a continuación referido como "VIT-lll," en comparación con la hormona nativa 1or ,25-dihidroxivitamina D3, a continuación "1,25(OH)2 D3." La Figura 1 es una gráfica que ilustra la actividad relativa de VIT-III y 1 ,25(OH)2D3 para competir por enlace con [3H]-1,25-(OH)2-D3 al receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud íntegra; La Figura 2 es una gráfica que ilustra el por ciento de diferenciación
celular HL-60, como una función de la concentración de VIT-lll y 1,25(OH)2D3; La Figura 3 es una gráfica que ilustra ia actividad de transcripción in vitro de 1,25(OH)2D3 en comparación con VIT-lll; La Figura 4 es una gráfica de barras que ilustra ia actividad de movilización de calcio en huesos de 1,25(01 )205 en comparación con VIT-lll; y La Figura 5 es una gráfica que ilustra la actividad de transporte y calcio intestinal de 1,25(OH)2D3 en comparación con VIT-lll. PESCRIPCIÓN PETALLAPA PE LA INVENCIÓN La preparación de análogos 17,20(E)-deshidro-vitamina D que tiene la estructura I puede lograrse por un método general común, es decir la condensación de una cetona tipo Windaus-Grundmann bicíclica (I con fosfina óxido alílico lll al análogo correspondiente 17,2G(E)-deshidro-v¡tamina D análogo IV seguido por desprotección en C-1 y C-3 para proporcionar l:
En las estructuras lll y IV, los grupos Y-, y Y2 son grupos protectores hidroxi, de preferencia t-butildimetilsililo, entendiéndose también que cualesquiera funcionalidad que puedan ser sensibles o que interfieran con la reacción de
condensación, se protejan convenientemente como es bien conocido en la técnica. El proceso mostrado anteriormente representa una aplicación del concepto de síntesis convergente, que se ha aplicado efectivamente para la preparación de compuestos de vitamina D [por ejemplo Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev. 9, 49 (1983); Toh et al., J. Org. Chem. 48,
1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem. 51. 3098 (1986); Sardina et al,. J. Org. Chem. 51, 1264 (1986); J. Org. Chem.51, DeLuca et al., Patente de los E.U.A. No. 5,536,713]. Las hidrindanonas de la estructura general li no se conocen. Pueden prepararse por el método mostrado en los esquemas presentes (ver la preparación de compuesto VIT-lll). Para la preparación de fosfina óxidos requeridos de la estructura general lll, una ruta sintética se ha desarrollado partiendo de un derivado metil quinicato que se obtiene fácilmente a partir del ácido (IR,3R,4S,5R)-(-)-quínico comercial como se describe por Perlman et al., Tetrahedron Lett. 32, 7663 (1991) y
DeLuca etal., Patente de los E.U.A. No. 5,086,191. El proceso total de la síntesis de los compuestos I y la, se ilustra y describe más completamente en la Patente de los E.U.A. No. 5,843,928 con título "2-Alkylidene-19-Nor-V¡tamina D compounds" La especificación de la cual aquí se incorpora por referencia específicamente. Análogos de 17,20(E)-deshidro-vitamina D particularmente preferidos, son aquellos abarcados por la fórmula general I en donde el carbono-2 en el anillo A está substituido con un grupo alquilideno o un grupo alquilo, o son compuestos de liberación lenta hidrolizables (ya sea substituidos en el carbono-2 o no substituidos en el carbono-2).
Compuestos 2-Alquilideno Estructuralmente, estos análogos 2-alquilideno se caracterizan por la fórmula general V mostrada a continuación:
en donde Yi, Y2, f^n, R12 y Z son como se describió previamente y Rs y Rg, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno se eligen del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, hidroxialquilo y fluoroalquilo, o, cuando se toman juntos representan el grupo -(CH2)?- en donde x es un entero de 2 a 5. Compuestos 2-AIquilo Estructuralmente, estos análogos 2-alquilo se caracterizan por la fórmula general VI mostrada a continuación:
en donde Y-j, Y2, Rn, R12 y Z son como se definió previamente y R10 se elige del grupo que consiste de alquilo, hidroxialquilo y fluoroalquilo. Compuestos de Liberación Lenta Compuestos de vitamina D modificados que exhiben un patrón deseable y altamente ventajoso de actividad biológica in vivo, es decir el inicio más gradual y duración de actividad más prolongada, también pueden emplearse aquí. Estructuralmente, la característica clave de los compuestos de vitamina D modificados que tienen estos atributos biológicos deseables, es que son derivados de análogos 17,20(E)-deshidro-vitemina D, en donde un grupo hidrolizable se conecte al grupo hidroxi en el carbono 25 y opcionalmente a cualquier otro de los grupos hidroxi presentes en la molécula. Dependiendo de diversos factores estructurales - por ejemplo el tipo, tamaño complejidad estructural - del grupo conectado, estos derivados hidrolizan al análogo 17,20(E)-deshidro-vitamina D activo a diferentes velocidades in vivo, proporcionando de esta manera la
"liberación lenta" del compuesto de vitamina D biológicamente activo en el cuerpo. Los perfiles de actividad en vivo "liberación lenta" de estos compuestos, por supuesto puede ser adicionalmente modulados por el uso de mezclas de derivados o el uso de mezclas que consisten de uno o más de derivados de vitamina D junto con compuestos de vitamina D sin derivar. Es importante resaltar que la característica estructural crítica de los derivados de vitamina identificados anteriormente es la presencia de un grupo hidrolizable conectado al grupo conectado al grupo hidroxi en el carbono 25 de la molécula. La presencia de un grupo hidrolízable en esta posición imparten los derivados resultantes el perfil de actividad biológico "de liberación lenta" conveniente anteriormente mencionado. Otras funciones hidroxi que ocurren en la molécula (por ejemplo funciones hidroxi en los carbonos 1 o 3) pueden estar presentes como grupos hidroxi libres, o uno o más de ellos también pude derivarse con un grupo hidrolizable. El "grupo hidrolizable" presente en los derivados anteriormente mencionados, de preferencia es un grupo acilo, es decir de un grupo del tipo Q?CO-, en donde Q representa hidrógeno o un radical hidrocarburo de 1 a 18 átomos de de carbono que puede ser de cadena recta, cíclico, ramificado, saturado o insaturado. De esta manera, por ejemplo el radical hidrocarburo puede ser un grupo alquilo de cadena recta o ramificada, o un grupo alquenilo de cadena recta o ramificada con uno o más dobles enlaces, o puede ser un grupo cicloalquilo o cicloalquenilio opcionalmente substituido, o un grupo aromático tal como substituidos o sin sustituir fenilo, benzilo, naftilo. Grupos acilo especialmente preferidos son grupos alcanoilo o alquenoilo, de los cuales algunos ejemplos típicos son formilo, acetilo, propanoilo, hexanoilo, isobutiriio, 2-butenoilo, palmitoilo u oléílo. Otro tipo conveniente de grupo
hidrolizable es el grupo hidrocarbiloxicarboniio es decir de un grupo del tipo Q2-O-CO-, en donde Q2 es un radical hidrocarburo de Ci a Cía como se definió anteriormente. Ejemplos de estos radicales hidrocarburo son metilo, etilo, propilo y radicales alquilo y alquenilo de cadena recta a ramificada superiores, así como radicales hidrocarburos aromáticos teles co o fenilo o benzoilo. Estos compuestos de vitamina de D modificados son hidrolizable in vivo al análogo activo sobre un periodo de tiempo después de administración, y como consecuencia regulan la disponibilidad in vivo del análogo activo, de esta manera también modulando su perfil de actividad in vivo. El término "perfil de actividad" se refiere a la respuesta biológica con el tiempo de compuestos de vitamina D. Compuestos modificados individuales, o mezclas de estos compuestos administrarse para hacer "ajuste fino" de un curso de respuesta en tiempo deseado. Como se emplea aquí el término "compuesto de vitamina D modificado" abarca cualquier compuesto de vitamina D en donde uno más de los grupos hidroxi presentes en este compuesto, se modifican por derivatización con un grupo hidrolizable. Un "grupo hidrolizable" es un grupo de modificación hidroxi que puede ser hidrolizado ¡p vivo, para regenerar la son fundones hidroxi libres. En el contexto de esta descripción, el término grupo hidrolizable de preferencia incluye grupos acilo e hidrocarbíloxicarbonilo, es dedr grupos del grupo tipo Q^O- y Q2-O-CO, respectivamente en donde Qf y Q2 tienen el significado anteriormente definido. Estructuraimente, los compuestos de vitamina D modificados abarcados pueden representarse por la fórmula Vil mostrada continuación:
en donde t, Y2, Rn, R12, Rs, r y Z son como se defínió previamente aquí respecto a la fórmula l, excepto porque R5 en la cadena lateral es -OY3 e Y3 es un grupo acilo o un grupo hidrocarbüoxicarbonilo, se definió previamente aquí. Algunos ejemplos específicos de dichos compuestos de vitamina D modificados incluyen derivados 2-sustffuklos tafes como: 1 ,3,25-Tñacetatos en donde Y,=Y2=Y3 y es CH3CO; 1,3,25-Trihexapoafos en donde Y?=?2=?Z y es CH3(CH2)4CO; 1 ,3,25-Trinonanoatos en donde Y^Y^Ys y es CH3(CH^7CO; y 25-Acetatos en dónete Yt=Y2y es H eY3 es CH CO. Estos compuestos puedan prepararse por métodos conocidos. Ver por ejemplo WO97/11053 publicada en marzo 27, 1999, y fa descripción previa aquí. 17(E)-1 ,25-dihidro)d-17(20)-deshidro-2-metiIen-19-nor-vitamina D3 (aquí referido como VJT-.H} se sintetizó y probó. Estructuralmente, este análogo 19-nor se caracteriza por la fórmula general la previamente ilustrada aquí. La preparación de 17(E}-1a,2&d?hidrOxi-17(20}-des idro-2-metilen-
19-nor-vitamina D3que tiene la estructura la puede lograrse por recondensación de una cetona tipo Windaus-Grundmann bicídica Ha con fosfina óxido alílico Illa al correspondiente a análogo 17(20)-deshidro-vitamina D IVa seguido por desprotección en C-l y C-3 para proporcionar (a:
En las estructuras Illa y IVa los grupos Y y Y2son grupos protectores hidroxi, de preferencia t-butildimetiisililo, también extendiéndose que cualquier funcionalidad es que puede ser sensibles o que interfieran con la reacción de condensación, se protejan convenientemente como es bien conoddo en las técnicas. El proceso mostrado anteriormente representa una aplicación específica del concepto de síntesis convergente, que se refirió previamente aquí y se ha aplicado efectivamente para la preparación de compuestos de vitamina D. La hidridanona de la estructura general lia no se conoce. Puede prepararse por el método mostrado en los esquemas presentes (ver preparación del compuesto VIT-lll). Como se emplea en la descripdón y en las reivindicaciones, el término "grupo hidroxi protector" significa cualquier grupo componente empleado
para la protección temporal de funciones hidroxi, tales como por ejemplo grupos alcoxicarbonilo, adío, alquilsililo o alquiiarilsiliio (a continuación referidos simplemente como grupos "sililo"), y grupos alcoxyalquilo. Grupos protedores alcoxicarbonilo son agrupamientos alquil-O-CO- tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, ter-butoxicarbonilo, benzifox?carbonilo o alliloxicarbonilo. El término "acilo" significa un grupo alcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, entra sus formas isoméricas, o un grupo carboxialcanoilo de 1 a 6 átomos de carbono, tal como un grupo oxalilo, malonilo, succ?nilo, glutarilo, o un grupo acilo aromático tal como benzo?lo, o un grupo benzoilo substituido con halo, nitro o alquilo. La palabra
"alquilo", se emplea en la descripdón o las reivindicadones denota por radical aquilo de cadena recta ramificada con un 1 a 10 átomos de carbono en todas sus formas isoméricas. "Alcoxi" se refiere a cualquier radical alquilo que se coneda por oxígeno, es dedr un grupo-alquil-o-. Grupos protedores alcoxialquilo son agrupamientos tales como metoximetilo, etoximetilo, metoxietoximetilo, o tetrahidrofuranilo y tetrah?dropiranilo. De preferenda grupos protedores sililo son trimetilosililo, trietilsililo, t-butildimetilosililo, dibutilmetilosililo, difenilmetilosililo, fenildimetilosililo, difenil-t-butilsililo y radicales sililo alquilados análogos. El término "arilo" especifica un grupo fenilo, o fenilo substituido con -alquilo, -nitro o -halo. Un grupo "hidroxi protegido" es un grupo hidroxi derivado o protegido por cualquiera de los grupos anteriores, comúnmente empleado para la protección temporal o permanente de funciones hidroxi, por ejemplo los dos grupos sililo, alcoxialquilo, adío alcoxicarbonyl como se definió previamente. Los términos "hidroxialquilo", "deuteroalquilo" y "fluoroalquilo" se refieren a un grupo alquilo substituido por uno o más grupos hidroxi, deuterio o fluoro, respectivamente. Un
grupo "alquilideno" se refiera un radical que tienen la fórmula general CkH2(r en donde k es un entero. Más específicamente, deberá hacerse referenda a la siguiente descrípción así como a los presentes esquemas para una ilustración detallada de la preparación del compuesto VIT-III. SÍNTESIS Des-A,B-23,24-dinorcolan-8/?,22-diol (2). Un matraz de dos cuellos con capacidad de 1000 mL secado a la flamante cargo con ergocalciferol 1 (5 g, 12.6 mmoles), piridina (5 mL), y MeOH anhidro (400 L). la solución se enfrio a -78 grados C en una atmósfera de argón. O3 se burbujeó a través de la solución hasta que se desarrolló y persistió un color azul intenso (aproximadamente 1 hora). La solución se trató con O2 hasta que el color azul se desvaneció (15 min). Después NaBH4 (1.5 g, 39.7 mmoles) se agrega. Después de 15 minutos una segunda porción de NaBH (1.5 g, 39.7 mmoles) se agrega y se deja que la reacción caliente a temperatura ambiente Después, la tercer porción de NaBH4 (1.5 g, 39J mmoles) se agrega y la reacción se agita durante la noche. La reacción se neutralizó al agregar agua (50 mL). Se evaporó metanol al vacío y se disolvió residuo en etil acetato. La fase orgánica se lavó con solución acuosa 1N de HCl (100 mL), solución NaHCO3 saturada (100 mL) y salmuera (100 L). La fase orgánica se secó (Na2SO4) ministro y evaporó. Purificación por cromatografía en gel de sílice (25% etil acetato/hexano) dio por resultado 2.18 g (10.3 mmol, 81%) del diol 2 como sólido blanco. P.f. 110-111 grados C; fH RMN (400 MHz, CDCI3)
0.96 (3H, s), 1.03 (3H, d, J = 6.6 Hz), 3.38 (1H, dd, J = 10.5, 6.7 Hz), 3.64 (1H, dd, J = 10.5, 3.2 Hz), 4.09 (1H, m); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) d: 69.2, 67.8, 52.9, 52.4, 41.8, 40.2, 38.2, 33.6, 26.6, 22.6, 17.4, 16.6, 13.6; MS m/z (intensidad relativa): 212 (WT, 2), 194 (M+-H2O,
), 179 (M+-H2O-CH3, 18), 125 (43), 111 (100); masa exacta calculada para C13H22O [M-H2Of es 194.1671, medida es 194.1665. Des-A,B-22-(p-toIuensuIfoniloxi)-23J24-dinorcoIan-8^-oI (3). Una solución del diol 2 (1 g, 4.71 mmoles) en piridina anhidra (12 mL) se enfría a -25 grados C y una solución pre-enfriada de cloruro de tocilo (1.08 g, 5.66 mmoles) en piridina anhidra (2 mL) se agrega por gotas. La mezda de reac?ón se agita de esta temperatura por 4 horas y se deja que caliente al 0 grados C y agita esta temperatura por 20 horas adicionales. La mezda se diluye con CH2CI2 (50 mL) y lava con solución CuSO4 saturada (30 mL), 1N HCl (30 mL), y agua (50 mL). La fase orgánica se seca (Na2SO4) filtra y concentra. Purificación por cromatografía en gel de sílice (25% etil acetato hexano) dio por resultado 1.7 g (4.64 mmol, 98%) de hidroxil tosilato 3.1H RMN (400 MHz, CDCI3) d: 0.89 (3H, s), 0.96 (3H, d, J= 6.6Hz), 2.45 (3H, s), 3.8 (IH, dd, J= 9.2, 6.2 Hz), 3.95 (1H, dd, J= 9.2, 3.0 Hz), 4.06 (1H, m), 7.35 (2H, d, J= 8.2 Hz), 7.78 (2H, d, J= 8.2 Hz); 13C RMN (100MHz, CDCI3) d: 144J, 133.0, 129.8, 127.9, 75.6, 69.0, 60.4, 52.2, 41.9, 40.1, 35J, 33.5, 26.4, 22.4,
21.6, 17.3, 16.7, 13.4; MS m z (integradón relativa): 366 (WT, 6), 194(14), 179(16), 125(30), 111(100); masa exacta calculada para C20H30S?4 a (M + a4) es 389.1763, medida es 389.1768. Des-AJB-8/),-[(íer-butildimetilsilil)oxi]-22-(p-toluensulfoniloxi)-23,24-dinorcolano (4). A una soludón enfriada a 0 grados C de hidroxil tosilato 3
(1.5 g, 4.09 mmoles) en DMF anhidro (20 mL), se agrega 2,6-Iutidina (0.580 mL, 0.52 g, 4.92 mmoles) seguido por TBSOTf (1.13 mL, 1.30 g, 4.92 mmoles). La solución se agita a 0 grados C por 15 minutos y se agrega agua (10 mL). La mezcla se contrae con etil acetato (3 x 40 L), y las dases orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa 1N de NaOH, (40 mL) secó (Na2SO4), filtró y concentró.
El residuo se purifico por cromatografía en columna de gel de sílice (5% etil acetato/hexano) para dar 1.94 g (4.04 mmoles, 99%) de 4. fH RMN (400 MHz, CDCI3) d: 0.01 (6H, s), 0.88 (12H, s), 0.96 (3H, d, J= 6.8Hz), 2.45 (3H, s), 3.81 (1H, dd, J = 9.2, 6.4Hz), 3.97 (1H, dd, J = 9.7, 3.0Hz), 3.99 (1H, m), 7.34 (2H, d, J = 8.08Hz), 7J9 (2H, d, J= 8.2Hz). ttC RMN (100MHz, CDCÍ3) d: 114.5, 133.4, 129.8,
127.9, 74.8, 69.3, 52.3, 52.6, 42.2, 40.5, 35.8, 34.4, 26.6, 25.9, 23.0, 21.6, 18.0, 17.6, 16.8, 13.7, -4.8, -5.1. Des-A,B-8>9-[(íer-butildimetiIsilil)oxi]-23,24-dinorcolan-22-al (5). Una solución de 4 (1.9 g, 3.96 mmoles) en DMSO (5 mL) se agrega una suspensión de NaHCO3 (1.5 g, 17.9 mmoles) en DMSO (20 mL) a temperatura ambiente La mezcla se caliente a 150 grados C bajo argón por 15 minutos y en fría a temperatura ambiente Agua (50 mL) seguido por etil acetato (50 mi) se agrega y la fase acuosa se extrae con etil acetato (3 x 30 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) filtraron y concentraron. El residuo se purifico por cromatografía en columna (2% etil acetato/hexano) para dar por resultado 0.93 g (2.87 mmoles, 76%) de aldehido 5. H RMN (400 MHz, CDCI3) d: 0.01 (6H, 2s), 0.89 (9H, s), 0.97 (3H, s), 1.09 (3H, d, J= 6.8Hz), 2.35 (1H, m), 4.03 (1H, m), 9.58 (1H, d, J = 3.2Hz). t3C RMN (100MHz, CDCl3) d: 205.2, 69.1, 52.4, 51.8, 49.1, 42.7, 40.5, 30.8, 34.3, 26.2, 25.8, 23.3, 17.6, 14.1, 13.3, -4.7, -5.1. Pes-A,B-8 7[(fer-butild¡metilsilil)oxQ-pregnan-20-ona (6). Un matraz secado a la flama se cargó con f-BuOK (1.55 g, 13.9 mmoles) y anhidro t-BuOH (30 mL) a temperatura ambiente. O2, se burbujeo a través de la solución por 15 minutos. Una solución de al debido 5 (0.9 g, 2.78 mmoles) en f-BuOH anhidro (15 mL) se agrega la mezcla de reacdón y se burbujea O2 a través de la solución por 10 minutos adicionales. La reacdón se neutralizó con agua (15 mL) y extrajo con éter
(3 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) filtraron y concentraron. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (3% etil acetato/hexano) para dar 0.61 g (1.97 mmol, 71%) de la acetona 6. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d: 0.01 (6H, s), 0.84 (3H, s), 0.87 (9H, s), 2.08 (3H, s), 2.46 (1H, t, J = 9.1Hz), 4.03 (1H, m). t3C RMN (100MHz, CDCI3) d: 209.5, 69.0, 64.5, 53.2,
43J, 39.8, 34.2, 31.6, 25.8, 23.2, 21.8, 17.6, 15.5, -4.8, -5.2. 5-Brsmo-2-metil-2-pentanoI (8). A soludón enfriada a -20 grados C de etil-4-bromobutirato 7 (5g, 25.6 mmoles) en dietil éter anhidro (50 mL) se agrega a solución 3M de bromuro de metilmagnesio en dietil éter (17.1 mL, 6.11 g, 51.3 mmoles) bajo una atmósfera de argón durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción se agita a temperatura durante la noche. Solución de cloruro de amonio saturada se agrega para hidrolizar la mezda de reacdón seguido por soludón HCl 1N para disolver la sales inorgánicas formadas. La fase acuosa se extrae con éter (3 x 50 ml). Los extrartos combinados se lavaron con agua (100 L) soludón NaCI saturada (100 mL) secaron (Na2SO4), filtraron y concentraron. El residuo se purifico por cromatografía en columna de gel de sílice (20/80 etil acetato/hexano) para dar por resultado 3.1 g g (17.1 mmol, 67%) de alcohol terciario. fH RMN (400 MHz, CDCI3) d: 1.27 (6H, s), 1.64 (2H, m), 1.96 (2H, m), 3.44 (2H, t, J= 6.68 Hz). 5-Bromo-2-metil-2[(íer-butildimetilsilil)oxi]-pentano (9). A una solución enfriada a -50 grados C de alcohol 8 (3 g, 16.6 mmoles) en CH2CI2 anhidro
(50 mL) se agrega 2,6-lutidina (2.32 mL, 2.13 g, 19.89 mmoles) seguido por TBSOTf (4.57 mL, 5.26 g, 19.9 mmoles). La soludón se agite a 0 grados C por 15 minutos y se agrega agua (10 mL). La mezcla se extrae con CH2CI2 (3 x 40 mL), y las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa 1N de NaOH (40 mL) secaron (Na2SO4), filtraron y concentraron. El residuo se purificó por cromatografía
en columna de gel de sílice (1% etil acetets/hexano) para dar 3.9 g (13.2 mmol, 80%) de 9. *H RMN (400 MHz, CDCl3) d: 0.07 (6H, s), 0.85 (9H, s), 1.21 (6H, s), 1.55 (2H, m), 1.95 (2H, m), 3.41 (2H, t, J = 6.8Hz). Des-A,B-colest-17(20)-desh?dro-8^,25-dioIes (15a y 15b): A una solución de 5-bromo-2-metil-2[(ter-butildimetilosilil)ox?|pentano 9 (2.84g, 9.68 mmoles) en éter anhidro (20 mL, que contiene cantidad catalítica de yodo) se agrega por gotas a una suspensión agitada de polvo de magnesio (0.23 g, 9.68 mmoles) en dietil éter anhidro (5 mL) a temperatura ambiente, con calentamiento ocasional a 35 grados C bajo una atmósfera de argón. Después de completarse la generación del reactivo Grignard la mezcla se agita por 1 hora a temperatura ambiente y por 1 hora a 40 grados C. Después se enfriada a 0 grados C y una solución de cetona 6 (0.6 g, 1.94 mmoles) en dietil éter anhidro (10 mL) se agrega por gotas durante un período de 30 minutos. Después de agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente por 3 horas se hidrolizó con solución acuosa de NH4CI (20 mL). La capa orgánica se separa y la fase acuosa se extrae con etil acetato (3 x 50 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavan con agua (40 mL) cercan (Na2SO4) y evaporan. Cromatografía en columna de gel de silice de residuo dio 0.95 g (94%) de la mezcla de alcoholes 10. Oxicloruro de fósforo (3 mL) se agrega por gotas a una solución de la mezda de alcoholes 10 (0.95 g) en piridina anhidra (20 mL) bajo una atmósfera de argón. La reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche y vacía en hielo-agua y extrae con éter (3 x 20 mL). La capa orgánica se lava con solución CuSO4 saturada (30 mL), HCl 1N (30 mL), agua (50 mL). La fase orgánica se secó (NaSO4), filtró y concentró. Cromatografía en columna de la mezcla cruda proporciono 0.72 g (78%) de la mezcla de ólefinas 11a, 11b, 12a, 12b, 13. La mezcla de olefinas sin mayor purificadón se disolvió en
metanol (20 mL) ácido de monoh?drato de p-Toluensulfónico (p-TSA) (0.100 g) se agrega a 0 grados C. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente por 3 días [cantidades adicionales de p-TSA se agregaron sucesivamente (100 mg, 24 horas; 75 mg, 36 horas; 50 mg, 48 horas)]. Se evaporó metanol y el residuo se diluyó con etil acetato (30 mL). La fase orgánica se lavó con solución con NaHCO3 acuosa saturada (20 mL) agua (20 ml), secó (NaHCOs) V evaporó. El residuo se purifico en cromatografía en columna para dar por resultado 0.284 g (79%) para dar por resultado la mezda de alcoholes de olefinas 14a, 14b, 15a, 15b, 16. Los halcones de vecina se separaron en HPLC. 17(E)-Des-A,B-colestan-17(2Q}-deshidro-8/?,25-dioI (15a). Los alcoholes de olefinas se separaron en HPLC (columna zorbax-sil, de 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/min) utilizando sistemas solvente IPA/hexano (4/96). Diol puro 17-20E 15a 70 mg (250 µ mol, 25%) se eluye a Rv = 50 mL. l ] -16.5 grados (c 1.02, CHCl3); 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d: 1.09 (3H, s), 1.20 (6H, s), 1.67 (3H, t, J = 1.84Hz), 4.14 (1H, m). Í3C RMN (100 MHz, CDCIs) d: 143.2, 123J, 71.0, 69.8, 52.4, 43.9,
43J, 38.3, 36.8, 33.4, 29.2, 28.5, 23.5, 22.2, 19.1, 17.9, 17.2. MS m/z (intensidad relativa): 280 (WT, 16), 262 (M-H2O* 7), 229 (M-2xH2O-CHs*, 16) 179(54), 161(100); Masa exada calculada para CisHa . [M+Na es 303.2300, encontrada 303.2297. 17(E)-25-(Triet?ls?l¡Ioxi)-des-AJB-colestan-17(20)-deshidro-8-ona (17a). A una soludón del alcohol 15a (20 mg, 71 /¿mol) en CH2Cl2 anhidro (5 mL) se agrega PDC (40 mg, 107 µ mol) a temperatura ambiente. Después de agitar la reacción por 3 horas bajo atmósfera de argón ia soludón se pasa a través de un cojín de celite con etil acetato. El filtrado se concentró y aplicó en un cartucho Sep-Pak y eluyó con etil aceteto/hexano (20/80) para dar 17 mg, (61.1 µ mol, 86%) de cetona cómo un aceite incoloro. A una soludón enfriada a -50 grados C de cetona
17 mg, 61.1 / mol) en CH2CI2 anhidro (5 mL) se agrega 2,6-Iutidina (9 µ L, 7.86 mg, 73.3 µ mol) seguido por TESOTf (17 µ L, 19.4 mg, 73.3 µ mol). La solución se agita a 0 grados C por 15 minutos y agua (5 mL) se agrega. La mezcla se extrae con CH2CI2 (3 x 5 mL), y fases orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) filtraron y concentraron. La acetona se purificó en HPLC (columna Zorbax-Sil 9.4-mm x 25-cm, 4 ml/min) utilizando sistema solvente etil acetato/hexano al 10%. Acetona pura 17a 14.4 mg (36.7 µ mol, 60%) se eluye a Rv = 20 L como aceite incoloro. 0.56 (6H, q, J= 7JHz), 0.84 (3 H, s), 0.94 (9H, t, J= 4.76Hz), 1.18 (6H, s), 1.71 (3H, t, J = 1.84Hz), 2.57 (1H, dd, J= 12, 6.2 Hz).13C RMN (100MHz, CDCI3) d: 212.2, 141.2, 126.1, 73.3, 61.8, 50.5, 44.7, 40.6, 36.9, 36.7, 29.9, 29.8, 28J, 23.9, 22.1, 20.2,
17.8, 17.6, 7.1, 6.8. MS m/z (intensidad relativa): No M\ 377([M-CH3f , 3) 363([M-CzHgf, 9), 204(100), 189((18), 161(45). Masa exacta calculada para C24H44O2SÍ tM+Na]+ es 415.3008, encontrado 415.3016. 17(E)-1 ,25 Dihidroxi-17(20)-deshidro-2-metilen-19-norvitamina P3 (20a). A una soludón de óxido de fosfina 18 (0.051 g, 87.6 µ moles) en THF anhidro (500 µ L) a - 25 grados C se agrega lentamente PhLi 1.2M en ciclohexano/éter (70/30) (80 µ L, 8.1 mg, 96.4 µ moles) bajo argón con agitación. La solución viró a naranja intenso. La mezda se agitó a esa temperatura por 20 min y enfrió a -78 grados O Una soludón pre-enfriada (-78 grados C) de cetona 17a (14 mg, 35.7 µ moles) en THF anhidro (100 µ L) se agrega lentamente. La mezcla se agitó bajo atmósfera de argón a -78 grados C por 3 horas y a 0 grados C por 18 horas. Se agrega etil acetato y la fase orgánica se lava con salmuera, seca (Na2SO4) y evapora. El residuo se aplica en un cartucho Sep-Pak, y eluye con etil acetato/hexano 1% para dar 19-nor derivado de vitamina protegido 19a (8 mg de cetona sin reacdonar 17a se recupera). La vitamina protegida se purifica
adicionalmente por HPLC (columna Zorbax-Sil 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/min) utilizando sistema solvente hexano/IPA (99.95/0.05). Compuesto puro 19a, 7.7 mg (10.2 µ moles, 29%) se eluye a Rv = 20 mL como un aceite incoloro. UV (en hexano) 2 max 243.1, 252, 262.2 nm; ? RMN (400 MHz, CDCI3) d: 0.03, 0.05, 0.07, 0.08 (cada 3H, cada s), 0.56 (6H, q, J= 7.8 Hz), 0.74 (3H, s), 0.87 y 0.91 (cada 9H, cada s), 0.96 (9H, t, J= 7.8 Hz), 1.19 (6H, s), 1.68(3H, t, J = 1.86 Hz), 2.18 (1H, dd, J = 12.6, 8.3 Hz), 2.33 (1H, m) 2.46 (1H, dd, 12.6, 4.6 Hz), 2.53 (1H, dd, 13.3, 5.88 Hz), 2.80 (1H, m), 4.43 (2H, m), 4.93 y 4.97 (1H y 1H, cada s), 5.88 y 6.21 (1H y 1H, cada d, J - 11.2 Hz); MS m/z (intensidad relativa): No Wf, 624(59), 366(32), 91(100); masa exada calculada para C45H84?3Si3 [M+Na] + es 779.5626, encontrado
779.5648. La vitamina protegida 19a (7.7 mg, 10.2 µ moles) se disuelve en THF anhidro (500 µ L) y trata con TBAF (0.102 mL, 26.7 mg, 102 // moles) y agita a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. El solvente se retira al vacío y el residuo se aplica en cartucho Sep-Pak y eluye con etil acetato/hexano al 30% para obtener la vitamina desprotegida 20a. La vitamina además se purificó por HPLC (columna Zorbax-Sii 9.4-mm x 25-cm, 3 mL min) utilizando hexano/IRA (90/10) como un sistema solvente. Vitamina pura 20a, 2.9 mg (7 µ moles, 69%) se recoleda a Rv = 42 mL como un sólido blanco: UV (en EtOH) 2,^ 242.9, 251, 261.2 nm; 1 RMN (500 MHz, CDCI3) d: 0.74 (3H, s), 1.22 (6H, s), 1.69 (3H, t, J =
1.94 Hz,), 2.29 (1H, dd, J= 13.0, 8.39 Hz), 2.32 (1H, dd, J= 13.9, 7.0 Hz), 2.57 (1H, dd, J = 13.4, 3.49 Hz), 2J9 (1H, br d) 2.87(1H, dd, J= 13.0, 4.59 Hz), 4.49 (2H, m), 5.09 y 5.11 (1H y 1H, cada s), 5.92 y 6.35 (1H y 1H, cada d, J= 11.29 Hz); MS m/z (intensidad relativa): 414 (M+, 36), 396([M- H2O]+, 6), 381([M-H2O- CH3]+, 8) 285(70), 149(61), 69(100).
17(Z)-Pes-A,B-coIest-17(20)-deshidro-8/?,25-diol (15b). Los alcoholes de olefina se separaron en HPLC (columna Zorbax-Sil 9.4mm x 25cm, 4 ml/min) utilizando sistema solvente IPA/hexano (5/95). Diol 17-20Z 15b y Diol 20-21 16 eluyen juntos a Rv = 45 mL. Los alcoholes se oxidaron en conjunto. 17(Z)-25-(TrietiIsilHoxi)-des-A,B-colest-17(20)-desh¡dro-8-ona
- (17b). A una soludón de la mezcla de alcoholes 15b y 16 (34 mg, 121 µ moles) en CH2Cl2 anhidro (5 mL), se agrega PDC (55 mg, 145.7 moles) a temperatura ambiente. Después de agitar la reacción por 3h bajo atmósfera de argón, la solución se pasa a través de un cojín de celite con etil acetato. El filtrado se concentra y aplica en un cartucho Sep-Pak y eluye con etil acetato/hexano (20/80) para dar una mezcla de cetonas 17b y 16b 30.2 mg (108.6 µ moles, 89%) como un aceite incoloro. A una solución enfriada a -50 grados C de cetonas 30.2 mg (30.2 mg, 108.6 µ moles) en CH2CI2 anhidro (10 mL) se agrega 2,6-lutidina (16 µ L, 13.9 mg, 130.3 // moles) seguido por TESOTf (30 µ L, 34.5 mg, 130.3 // moles). La solución se agita a 0 grados C por 15 minutos y se agrega agua (10 mL). La mezcla se extrae con CH2CI2 (3 x5 L), y las fases orgánicas combinadas secan (Na2SO4), filtran y concentran. El residuo se purifica por HPLC (columna Zorbax-Sil 9.4 mm x 25 cm, 4 ml/min) utilizando sistema solvente etil aceteto/hexano (5/95). Cetona pura 17b 7.7 mg (19.6 µ moles, 18%) se eluye a Rv = 34 mL como aceite incoloro. H RMN (400.13 MHz, CDCI3) d: 0.56 (6H, q, J= 7.78 Hz), 0.83 (3H, s), 0.94 (9H, t, J =
7.9 Hz), 1.2 (6H, s), 1.57 (3H, br s), 2.57 (1H, dd, J = 11.8, 6.3 Hz); Í3C RMN (100 MHz, CDCI3) d: 212.18, 141.1, 126.8, 73.2, 62.0, 50.5, 45.3, 40.7, 37.1, 34.5, 29.9, 29.8, 24.0, 23.8, 20.2, 20.1, 18.7, 7.1, 6.8. MS m/z (intensidad relativa): No M*. 363 ([M - C2H5r, 10), 334 ([M - 2x0^, 1), 204 (100). 17(Z)-1 ar,25 Dihidroxi-17(20)-deshidro-2-metilen-19-norvitamina
D3 (20b). A una soludón de gosfina óxido 10 (62 mg, 106.5 // moles) en THF anhidro (750 µ L) a - 25 grados C se agregó lentamente PhLi 1.8 M en Di-n-butil éter (59 µ L, 8.9 mg, 106.5 / moles) bajo argón con agitación. La soludón viró a naranja intenso. La mezda se agitó a esa temperatura durante 20 min y enfrió a -78 grados O Una solución pre-enfriada (-78 grados C) de cetona 17b (7.7 mg, 19.6 µ moles) en THF anhidro (100 µ L) se agregó lentamente. La mezcla se agitó bajo atmósfera de argón a -78 grados C durante 3h y a 0 grados C durante 18 h. Se agregó etil acetato y la fase orgánica se lavó con salmuera, secó (Na2SO4) y evaporó. El residuo se aplicó en un cartucho Sep-Pak, y eluyó un con etil acetato/hexano al 1% para dar el derivado Vitamina 19-nor protegido. La vitamina se purificó adicionalmente por HPLC (columna Zorbax-Sil 9.4-mm x 25-cm, 4 ml/min) utilizando sistema solvente hexano/IPA (99.95:0.05). El compuesto puro 19b, 12.8 mg (16.9 µ moles, 86%) se eluyó a R¥ = 19 L como un aceite incoloro. [ar]25D -9.35 (c 0.64, CDCl3); UV (en hexano): ?^ 244.4, 253.2, 263.2 nm; 1 RMN (400 MHz, CDC13) d: 0.026, 0.050, 0.067, 0.082 (cada 3H, cada s), 0.56 (6H, q, J = 7.84
Hz), 0J4 (3H, s), 0.86, 0.89 (cada 9H, cada s), 0.94 (9H, t, J = 7.96 Hz), 1.19 (6H, s), 1.56 (3H, br s), 2.14 (1H, dd, J = 12.5, 4.8 Hz), 2.33 (1H, dd, J = 13.1, 2.8 Hz), 2.46 (1H, dd, J= 12.7, 4.4 Hz), 2.53 (1H, dd, J= 13.3, 6.0 Hz), 2.80 (1H, br d, J = 13.5 Hz), 4.43 (2H, m), 4.92 y 4.97 (cada 1H, cada s), 5.88 y 6.21 (cada 1H, cada d, J = 11. IHz); Í3C RMN (100 MHz, CDCl3) d: 152.9, 142.2, 140.8, 132.8, 125.9,
122.3, 116.3, 106.2, 73.3, 72.5, 71.6, 56.7, 47.6, 46.8, 45.4, 30.1, 29.8, 28.5, 25.8, 257, 23.9, 23.6, 23.0, 19.9, 18.2, 18.1, 17.8, 7.1, 6.8, -4.8, -5.0; MS m/z (intensidad relativa): No M+, 366(2), 263(100); Masa exacta calculada para C45H84?3Si3[M+Na] + es 779.5624, encontrado 779.5647. La vitamina protegida 19b (12.8 mg, 16.9 mmoles) se disolvió en THF
anhidro (500 µ L) y trató con TBAF (170 µ L, 44.2 mg, 169 // moles) y agitó a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. El solvente se retiró al vacío y el residuo se aplicó en cartucho Sep-Pak, y eluyó con etil acetato/hexano AL 30% para obtener la vitamina desprotegida. La vitamina se purificó adicionalmente por HPLC (columna Zorbax-Sii 9.4-mm x 25-cm, 4 mf mín) utilizando hexano/lPA (85/15) como sistema solvente. Vitamina pura 20b, 4.3mg (10.3 // mol, 62%) se eluyó a Rv = 33 mL. UV (en etanol): 2^ 244.1, 252.5, 262. Inm; 1H RMN (400 MHz, CDCI3) d: 0J4 (3H, s), 1.21 (6H, s), 1.57 (3H, br s), 2.30 (2H, m), 2.57 (1H, dd, J = 13.3, 3.6 Hz), 2.79 (1H, dd, J= 11.6, 2.52 Hz), 2.85 (1H, dd, J= 13.1, 4.44Hz), 4.48 (2H, m), 5.09 y 5.11 (IH y 1H, cada s), 5.92 y 6.35 (IH y 1H, cada d, J = 11.3 Hz); MS m/z (intensidad relativa) :414 (ht, 90), 399 (M- CH3 , 17), 381
18), 363 ([M-CH3-2 x H2Of , 7), 285 (86), 243 (35), 91 (100); masa exacta calculada para C27H42?3 ([M+Na]*) es 437.3032, medida es 437.3026. ESQUEMAS
Esquema 1
Esquema ll
OTBS
Esquema lll
Esquema V
ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE 17(E)-1a S-DIHIDROXI-^OJ- DESHIDRO^-METILEN-IS-NORVITA INA D3 La introducción de un grupo metíleno a la 2-posición, la introducción de un doble enlace entre las posiciones 17 y 20, y orientación de la cadena lateral de 1 QG ,25-dihidroxi-19-nor-vitamina D3 en su configuración Z tiene poco o ningún efecto en enlace al receptor de vitamina D de rata recombinante de longitud íntegra, en comparación con 1 ,25-dihidroxivitamina D3. El compuesto VIT-III ligó igualmente bien al receptor en comparación con el estándar 1,25-(OH)2D3 (Figura 1). Puede esperarse de estos resultados que el compuesto VIT-lll tuviera actividad biológica equivalente. De manera sorprendente, sin embargo, el compuesto VIT-lll es un análogo altamente selectivo con actividad biológica única. La Figura 5 muestra que VIT-lll tiene actividad relativamente alta en comparación con la de 1,25-dihidroxivitamina Ds (1.25(OH)2D3), la hormona natural, para estimular transporte de calcio intestinal. La Figura 4 demuestra que VIT-ífí tiene acíividad de movilización de calcio en huesos relativamente alta en comparación con 1,25(OH)2D3. Las Figuras 4-5 ilustran de esta manera que VIT-lll puede caracterizarse porque tiene poca actividad calcém?ca. de tener.** La Figura 2 ilustra que VIT-ill es tan potente como 1,25(OH)2D3 en diferenciación de células HL-60, haciéndolo un candidato excelente para el tratamiento de psoriasis y cáncer, en especial contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata. Además, debido a su actividad de diferenciación celular relativamente alta, este compuesto proporciona un agente terapéutico para el tratamiento de diversas condiciones de la piel, incluyendo arrugas, falta de hidratación dérmica adecuada, es decir piel seca, falta
de firmeza adecuada de la piel, es decir piel holgada e insuficiente secreción de sebo. El uso de este compuesto de esta manera no solo resulte en humectación de la piel sino también mejora la función barrera de la piel. La Figura 3 ilustra que el compuesto VIT-III tiene aproximadamente la misma actividad de transcripción que 1 ,25-dihidroxivitamina D3 en células de hueso. Este resultado, junto con la actividad de diferenciación celular de la Figura 2, sugiere que VIT-lll será muy efectivo en psoriasis, debido a que tiene actividad celular directa para provocar diferenciación celular y en suprimir el crecimiento celular. Estos datos también indican que VIT-lll puede tener actividad significante como un agente anticáncer, en especial contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata.** La fuerte actividad de V1T-II1 en diferenciación de HL-60 sugiere que será activo para suprimir el crecimiento de glándulas paratiroides y para suprimir el gen preproparatiroide. ** MÉTODOS EXPERIMENTALES Los compuestos de la invención se prepararon y estudiaron utilizando los siguientes métodos. Enlace de Receptor de Vitamina D Material de Prueba Fuente de Proteína Receptor de rata recombinante de longitud íntegra se expresó en células E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RIL y purificó a homogeneidad utilizando dos sistemas de cromatografía en columna diferentes. El primer sistema una resina de afinidad de níquel que utiliza la etiqueta histidina C-terminal en esta proteína. La proteína que se eluyó de esta resina, se purificó adicionalmente utilizando
cromatografía de intercambio de iones (S-Sepharose Fast Flow). Alícuotas de la proteína purificada se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y almacenaron a -80 grados C hasta utilizar. Para uso en ensayos de enlace, la proteína se diluyó en TEDKso (Tris 50 mM, EDTA 1.5 mM, pH7.4, DTT 5 mM, KCl 150 mM) con detergente Chaps 0.1%. La proteína receptora y concentración de ligando se optimizaron de manera tal que no más del 20% del ligando radioetiquetado agregado se liga al receptor. Drogas de Estudio Ligandos no etiquetados se disolvieron en etanol y las concentraciones determinadas utilizando espectrometría de UV (1,25(OH)2D3: coefiente extinción molar = 18,200 y ? „ « = 265 nm). Ligando radioetiquetado (3H-1,25(OH)2D3, ~159 Ci/mmoles) se agregó en etanol a una concentración final de 1 nM. Condiciones de Ensayo Ligandos radtoetiquetados y no etiquetados se agregan a 100 mcl de la proteína diluida a una concentración de etanol final de =10%, mezclaron e incubaron durante la noche en hielo para alcanzar equilibrio de enlace. El día siguiente, 100 mcl de fango de hidroxilapatita (50%) se agregan a cada tubo y mezclan a intervalos de 10 minutos por 30 minutos. La hidroxilapaptita se recolecta por centrifugación y después lava tres veces con amortiguador Tris-EDTA (Tris 50 mM, EDTA 1.5 mM, pH 7.4) que contiene 0.5% Titron X-100. Después de lavado final, los precipitados o granulos se transfirieron a ampolletas de destelleo que contienen 4 ml de cóctel de destelleo Biosafe II, mezclaron y colocaron en un contador de destelleo. Enlace total se determinó a partir de los tubos que contienen solo ligando radioetiquetado.
Diferenciación HL-60 Material de Prueba Drogas de Estudio Las drogas de estudio se disolvieron en etanol y las concentraciones se determinaron utilizando espectrofotometpa de UV. Diluciones en serie se prepararon de manera tal que se pudo probar un rango de concentraciones de droga, sin cambiar la concentración final de etanol (< 0.2%) presente en los cultivos celulares. Células Células de leucemia prom?efscítica humana (HL60) se desarrollaron en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal 10%. Las células se incubaron a 37 grados C en la presencia de CO2 al 5%. Condiciones de Ensayo Células HL60 se revistieron a 1.2 x 105 células/ml. Dieciocho horas después de revestir, células en duplicado se trataron con droga. Cuatro días después, las células se cosecharon y se realizó un ensayo de reducción de nitro-azul tetrazolio (Collins et al., 1979; J. Exp. Med. 149:969-974). El por ciento de células diferenciadas se determina al contar un total de 200 células y registrar el número que contiene depósitos de formazan negro-azul intracelular. Verificación de diferenciación a células monocít?cas se determina al medir la actividad de fagocítica
(datos no mostrados). Ensayo de Transcripción In Vítm Actividad de transcripción se mide en células ROS 17/2.8 (hueso) que se transfectaron en forma estable con promotor de gen de 24-hidroxilasa (24Ohase) corriente arriba de un gen reportero luciferasa (Arbour et al., 1998). A las
células se les dió un rango de dosis. Dieciséis horas después de dosificar las células se recolectaron y se midieron las actividades de luciferasa utilizando un luminómetro. RLU = unidades de luciferasa relativas. Antagonismo se probó al agregar una combinación de 1 ,25(OH)2D3 y 5 el compuesto en el mismo pozo manteniendo igual la concentración final de etanol. Transporte de Calcio Intestinal y Movilización de Calcio en Huesos Ratas, Sprague-Dawley destetadas macho se colocaron bajo Dieta 11 (Suda et al, J. Nutr. 100: 1049, 1970) (0.47% Ca) + vitaminas AEK por una semana, seguido por la Dieta 11 (0.02% Ca) + vitaminas AEK por 3 semanas. Las o ratas después se cambiaron a la misma dieta que contiene Ca a 0.47% por una semana seguido por dos semanas en la misma dieta que contiene Ca a 0.02%. Administración de dosis empezó durante la última semana en la dieta de calcio de 0.02%. Cuatro dosis ?p consecutivas, se suministraron aproximadamente separadas 24 horas. Veinticuatro horas después de la última dosis, se recolectó sangre del 5 cuello cortado y la concentración de calcio en suero se determinó por espectrometría de absorción atómica como una medida de movilización de calcio en huesos. Los primeros 10 cm de intestino también se recolectaron para análisis de transporte de calcio intestinal utilizando el método de saco intestinal evertido. Se probó el antagonismo por administración al animal de una o combinación de 1 ,25(OH)2D3 y el compuesto, en forma simultánea. INTERPRETACIÓN DE DATOS Enlace VDR. diferenciación celular HL60, y actividad de transcripción.
VIT-lll (K¡=3.8x10"10M) es equivalente a la hormona natural 1 a ,25-dihidroxivitamina
D3 (K¡=1-1x10"10M) en su habilidad para competir con [3HJ- 1,25(OH)2D3 para enlace 5 al receptor de vitamina D de rata recombfnante de longitud íntegra (Figura 1). Hay
también poca diferencia entre VIT-I1I (EC50=1.7x10'sM) en su capacidad (eficacia o potencia) para promover diferenciación HL60 en comparación con 1 o: ,25-díhidroxivitamina D3 (ECa^.dxIO^M) (Ver Figura 2). También, el compuesto VIT-lll
tiene aproximadamente la misma actividad de transcripción en células de hueso que 1 ,25-dihidroxivitamina Ds (EC5o=2.3x10"toM) (Ver Figura 3).
Estos resultados sugieren que VIT-ill será muy efectivo en psoriasis debido a que tiene actividad celular directa para provocar diferenciación celular y para suprimir crecimiento celular. Estos datos también indícant que VIT-lll tendrá actividad significante como un agente anti-cáncer, especialmente contra leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de piel y cáncer de próstata, así como contra condiciones de la piel tales como piel seca (falta de hidratación dérmica), indebida holgura de la piel (insuficiente firmeza de la piel), insuficiente secreción de sebo y arrugas. También se esperaría que es muy activo para suprimir hiperparatiroidismo secundario. Movilización de calcio en huesos y absorción intestinal de calcio en animales deficientes en vitamina D. Utilizando ratas deficientes en vitamina D en una dieta de bajo contenido de calcio (0.02%), se probaron las actividades de VIT-lll y 1,25(OH)2D3 en intestino y huesos. Como se espera, la hormona nativa (1,25(OH)2D3) aumentó los niveles de calcio en suero a la dosis probadas (Figura 4). La Figura 4 tiene poca de haber actividad para movilizar calcio de huesos que
1,25(OH)2D3. La administración de VIT-III a 260 pmoles/día por 4 días consecutivos resultó en significante movilización de calcio en huesos, y aumentó la cantidad de VIT-lll a 2340 pmoles/día y después a 7020 pmoles/día tampoco tuvo efecto sustancial. Transporte de calcio Intestinal se evaluó en los mismos grupos de
animales utilizando el método de saco intestinal evertido (Figura 5). Estos resultados muestran que el compuesto V1T-III promueve un aumento significante en actividad de transporte de calcio intestinal cuando se administra a 260 pmoles/día, y tiene ligera actividad a 2340 pmoles/día y muestra algo de actividad a 7020 pmoles/día, mientras que 1,25(OH)2D3 promueve un efecto significante a la dosis de 260 pmoles/día. De esta manera, puede concluirse que VIT-lll esencialmente está carente de transporte de calcio intestinal a las dosis probadas. Estos resultados ilustran que VIT-lll es un candidate excelente para numerosas terapias en humanos como se describe aquí, y puede ser particularmente útil en una cantidad de circunstancias tales como supresión de hiperparatiroidisms secundario de osteodrstrofia renal, enfermedades autoinmunes, cáncer y psoriasis. VIT-lll es un excelente candidato para tratar psoriasis debido a que: (1) tiene significante enlace VDR, actividad de transcripción y actividad de diferenciación celular; (2) está carente de riesgo hipercalcémico a diferencia de 1 ,25(OH)2D3; y (3) áe sintetiza fácilmente. Ya que VIT-lll tiene significante actividad de enlace al receptor de vitamina D, pero tiene poca habilidad para elevar el calcio en suero-sangre, también puede ser particularmente útil para el tratamiento de hiperparatiroid?smo secundario de osteodistrof?a renal. Estos datos también indican que eí compuesto Vll-lll de la invención puede ser especialmente adecuada para tratamiento y profilaxis de desórdenes humanos que se caracterizan por un desequilibrio en el sistema inmune, por ejemplo en enfermedades auto inmunes, incluyendo esclerosis múltiple, lupus, diabetes mellitus, rechazo de anfitrión contra injerto y rechazo de transplante de órganos; y adicionalmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, asma y en enfermedades inflamatorias intestinales tales
como enfermedades cilíaca, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn. Acné, alopecia e hipertensión son otras condiciones que puedan ser tratadas con el compuesto Vll-lll de la invención. Los compuestos de la invención de ia fórmula 1, y particularmente de la fórmula la también son útiles para evitar o tratar obesidad, incluyendo diferenciación de adípoc?tss, e inhibir la transcripción de gen SCD-l y/o reducir la grasa corporal en sujetos animales. Por lo tanto, en algunas modalidades, un método para evitar o tratar obesidad, inhibir diferenciación de adipocitos, inhibir la transcripción de gen SCD-1 y/o reducir grasa corporal en sujeto animal, incluye administrar al sujeto animal una cantidad efectiva de uno o más de los compuestos o una composición farmacéutica que incluye uno o más de los compuestos de la fórmula I. Administración de uno o más de los compuestos o las composiciones farmacéuticas al sujeto y inhibe la diferenciación de adipósitos, inhibe transcripción de genes y/o reduce la grasa corporal en el sujeto animal. El animal puede ser I, un animal doméstico tal como un perro o un gato, o un animal agrícola, en especial aquellos que proporcionan carne para consumo humano, aves teles como pollos, pavos, faisanes o perdices, así, animales bovinos, o bovinos, caprinos o porcinos. Para propósitos de prevención y/o tratamiento, los compuestos de la invención de dineros por la fórmula I y la puedan formularse para aplicaciones farmacéuticas como unas soluciones solventes inocuos o como una emulsión, suspensión o dispersión en solventes o portadores convenientes o como pildoras, tabletas o cápsulas, junto con poríadores sólidos, de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la especialidad. Cualquiera de estas formulaciones también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, tales como estabilizantes, ant?oxidantes, aglutinante, agentes colorantes o
agentes emulsificantes o modificado del sabor. Los compuestos de la fórmula I y particularmente VIT-lll de la fórmula la pueden administrarse en forma oral, tópica, parenferaí. rectal, nasal, sublingual o transdérmica. El compuesto se administra ventajosamente por inyección o por infusión intravenosa de soluciones de estériles convenientes o en la forma de dosis líquidas o sólidas mediante el canal alimentario o en la forma de cremas, ungüentos, parches y vehículos similares adecuados para aplicaciones transdérmicas. Una dosis desde 0.01 g a 1000 / g por día de los compuestos I, particularmente VIT-III, de preferencia a aproximadamente 0.1 µ a aproximadamente 500 µ g por día, es apropiada para propósitos de prevención y/o tratamiento, está dosis se ajusta de acuerdo con enfermedad, a tratar su severidad y la respuesta del sujeto como es bien comprendido en la técnica. Ya que el compuesto exhibe especificidad de acción, cada uno puede ser administrado convenientemente solo o junto con dosis graduadas de otros compuestos de vitamina D activo - por ejemplo a-hidroxivitamina D2 o D3, o 1 a ,25-dihidroxivítamína Ds - en situaciones en donde diferentes grados de movilización de minerales en huesos y estímulo de transporte de calcio se encuentran ventajosos. Composiciones para utilizar en los tratamientos anteriormente mencionados comprenden una cantidad efectiva de los compuestos I, particularmente VIT-HI. como se define por las fórmulas anteriores I y la, como el ingrediente activo y un portador conveniente. Una cantidad efectiva de este compuesto para utilizar de acuerdo con esta invención es de aproximadamente 0.01 µ g a aproximadamente 1000 / g por gm de composición, de preferencia de aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 500 µ g por gramo de composición y pueden administrarse en forma tópica, transdérmica, oral, rectal, nasal, sublingual o
parenteral en dosis desde aproximadamente 0.01 / g/día a aproximadamente 1000 g/día, y de preferencia aproximadamente 0.1 /g/día a aproximadamente 500 µ g/día. Los compuestos l, particularmente VIT-líi, pueden formularse como cremas, lociones, ungüentos, parches tópicos, pildoras, cápsulas o tabletas, supositorios, aerosoles o en forma líquida como soluciones, emulsiones, dispersiones o suspensiones en solventes o aceites farmacéuticamente inocuos y aceptables y estas preparaciones pueden contener además otros componentes benéficos o inocuos farmacéuticamente tales como estabilizantes, antioxidantes, emulsificantes, agentes colorantes, aglutinantes o agentes modificadores del sabor. Los compuestos 1, particularmente VIT-lll, pueden ser administrados ventajosamente en cantidades suficientes para efectuar la diferenciación de promielocitos en macrófagos normales. Dosis como se describió anteriormente son adecuadas, entendiéndose que las cantidades suministradas se deberán ajustar de acuerdo con la severidad del enfermedad y la condición y respuesta del sujeto como es bien comprendido en la técnica. Las formulaciones de la presente invención comprenden un ingrediente activo en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El portador puede ser "aceptable" en el sentido hacer compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no nocivo al receptor del mismo. Formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar en la forma de unidades discretas como cápsulas, saquitos, tabletas o pastillas, cada una que contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o granulos; en la forma de una
solución o una suspensión en un líquido acuoso o en un líquido no acuoso, o en la forma de una emulsión de aceite-en-agua o en una emulsión de agua-en-aceite. Formulaciones para administración rectal pueden estar en la forma de un supositorio que incorpora el ingrediente activo y portador tal como manteca de cacao, o en la forma de un enema. Formulaciones adecuadas para administración parenteral, convenientemente comprenden una preparación acuosa o aceitosa estéril del ingrediente activo que de preferencia isotónico con el receptor. Formulaciones adecuadas para administración tópica, incluyen preparaciones líquidas o semilíqu?das tales como linimentos, medios de aplicación, emulsiones de aceite-en-agua o agua-en-agua tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones tales como gotas, o como rocíos. Para administración nasal, inhalación de polvo, formulaciones de rocío o auto propulsoras, surtidas con una lata de rocío, puede emplearse un nebulizador o un atomizador. Las formulaciones cuando se surten, de preferencia tienen un tamaño de particulares en el rango de 10 a 100/ . Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosis unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Por el término "unidad de dosis" se entiende una dosis unitaria, por ejemplo una sola dosis que es capaz de ser administrada a un paciente como una dosis unitaria física y químicamente estable que comprende ya sea el ingrediente activo como tal o una mezcla de sus diluyentes o portadores farmacéuticos sólidos o líquidos.