MX2007001449A - Hai-1 y hai-2 en terapia de cancer. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a una nueva composicion terapeutica para tratar cancer, y particularmente cancer de seno y de prostata, la composicion comprende la mezcla de dos inhibidores del activador del factor de crecimiento de hepatocitos HAI-1 y HAI-2.

Description

HAI-1 y HAI-2 EN TERAPIA DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a una nueva composición terapéutica para tratar cáncer, y más particularmente, pero no exclusivamente, cáncer de seno y de próstata. La composición comprende inhibidores del activador del factor de crecimiento de hepatocitos HAI-1 y HAI-2. Además, la invención concierne a un método para producir dicha composición y a su uso para tratar cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es un proceso de múltiples etapas que incluye la desintegración de la membrana del basamento, desprendimiento de células de cáncer del tumor primario, invasión en la capa estromal, intravasación en células sanguíneas, extravasación a través de vasos sanguíneos de órganos objetivo, y el establecimiento y la proliferación de células de cáncer en tejidos remotos. A fin de que tengan lugar estos eventos, las células de cáncer deben de adquirir la habilidad de migrar a través de y de degradar los componentes de la matriz extracelular. Un grupo de factores de crecimiento y de movilidad secretados por células estromales ha sido implicado en este proceso, de los cuales el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es uno. HGF es un factor pleiotrópico identificado inicialmente como un factor de crecimiento para hepatocitos (Nakamura y colaboradores, 1987, Gohda y colaboradores, 1988 y Zamegar y colaboradores, 1989) . Es indistinguible del factor de dispersión (SF, "Scatter Factor") , y al enlazar al receptor de c-Met sobre las superficies de células epiteliales, HGF puede disociar colonias epiteliales y células de dispersión. Se piensa que esta actividad es importante en la modulación de la motilidad e invasión de células cancerosas, y numerosos de los estudios recientes ha probado que HGF/SF y Met tienen papeles importantes en la tumorogénesis, invasividad de células tumorales, la diferenciación y la angiogénesis tumoral (Belusci y colaboradores, 1994, Rong y colaboradores, 1994, Lamszus y colaboradores, 1997, Nakamura y colaboradores, 1997 y Abounader y colaboradores, 1999). Parr y colaboradores (2004) han mostrado también que HGF y su receptor están ligados a la agresividad de cánceres en situaciones clínicas, tales como cáncer de seno y cáncer de próstata, y altos niveles de HGF en tumores están asociados con resultados clínicos pobres de pacientes. HGF es secretado por células mesenquimales como una forma precursora, de cadena única, inactiva (scHGF) con un peso molecular de alrededor de 94 kilodaltones. Para exhibir su función biológica, la conversión proteolitica extracelular de HGF de cadena única a una forma activa heterodimérica de dos cadenas es esencial (Naka y colaboradores, 1992 y Gak y colaboradores, 1992) . A la fecha, se han implicado cinco proteinasas en la activación de HGF. Entre ellas, el activador de HGF (HGFA) exhibe la actividad más potente en el procesamiento de HGF de cadena única a HGF activa (Shimomura y colaboradores, 1992, Shimomura y colaboradores, 1995 y Miyazawa y colaboradores, 1993) . Se ha mostrado que HGFA es expresada a niveles aberrantemente altos en cánceres tales como cáncer de seno humano, y esta expresión está asociada con resultados clínicos pobres en pacientes. Dado que la activación de HGF es un evento critico en la regulación de la actividad de este factor in vivo y, por consiguiente en la motilidad de células, se ha sugerido que inhibidores de HGFA podrían desempeñar un papel importante en la regulación de la acción de HGF en cáncer. El primer inhibidor de HGFA endógeno (HAI) fue purificado a partir del medio de condiciones de cultivo de una linea celular de carcinoma gástrico MKN 45 (Shimomura y colaboradores, 1997). Subsecuentemente, un segundo tipo de HAI fue purificado a partir de las mismas células (Kawaguchi y colaboradores 1997). Estos inhibidores han sido designados como HAI-1 y HAI-2, respectivamente . Ambos HAI-1 y HAI-2 tienen dos dominios inhibidores de tipo Kunitz bien definidos (KD1 y KD2) los cuales comparten un alto grado de identidad de secuencia de aminoácidos, y el primer dominio parece ser responsable de la inhibición de HGFA (Shimomura y colaboradores, 1997). Adicionalmente, cada HAI tiene un presunto dominio transmembrana (TM) cerca del extremo C-terminal, que sugiere que las HAI's son proteinas transmembrana de tipo I (Shimomura y colaboradores, 1997, Kawaguchi y colaboradores, 1997 y Marlor y colaboradores, 1997) (ver la Figura 1) y se piensa que esta estructura asegura que su actividad biológica está destinada a la superficie celular de tejidos locales. No obstante, aunque la estructura completa de los dominios característicos son similares entre HAI-1 y HAI-2, la molécula de HAI-1 tiene un dominio similar a receptor de lipoproteina de baja densidad (LDL) que está ausente en HAI-2 y HAI-2 tiene un exon especifico de testículo que está ausente en HAI-1. Adicionalmente, estas dos proteinas son mapeadas en diferentes cromosomas; HAI-1 está localizada sobre el cromosoma 15 (q 15), y HAI-2 sobre el cromosoma 19 (q 13.11) . Aparentemente, no se encontraron regiones homologas entre HAI-1 y HAI-2 en la región de flanqueo 5' , y sitios de enlace potencial para factores de transcripción conocidos diferentes de Spi y GATAs, son marcadamente diferentes entre si (Hoh y colaboradores, 2000) (ver la Figura 2) . Las secuencias genómicas totales para HAI-1 y HAI-2 han sido sometidas a GenBank (AC 012476, AC 022086, AC 025166, y AC 022835 para HAI-1 y AC 011479 para HAI-2) . A pesar de esto, los análisis de tinción de RNA indican que la distribución de tejido de HAI-1 es muy similar a la de HAI-2, y que ambos genes son expresados abundantemente en la placenta, riñon, páncreas y tracto gastro-intestinal (Shimomura y colaboradores, 1997 y Kawaguchi y colaboradores, 1997). No obstante, el mARN de HAI-1 es solo débilmente detectado en los testículos y en el ovario, mientras que HAI-2 es abundantemente expresado en estos tejidos. Inmunohistoquimicamente, la proteina HAI-1 está localizada sobre la superficie lateral y basolateral de células epiteliales columnares simples que cubren los ductos, túbulos y superficies mucósicas de varios órganos, incluyendo el tracto gastro-intestinal (Kataoka y colaboradores, 1999) . La expresión de HAI-1 en epitelio colónico ha sido también confirmada por hibridización in si tu (Kataoka y colaboradores, 1999) . En contraste, la proteina HAI-2 ha sido detectada en el citoplasma de células epiteliales y en células inflamatorias monociticas similares a macrófagos de varios tejidos (Itoh y colaboradores, 2000). HAI-2 es también sobre expresado en cáncer pancreático (Müller-Pillasch y colaboradores, 1998). La diferencia en la localización estructural y celular de HAI-1 y HAI-2 sugiere que pueden tener distintos papeles in vivo . Oberst y colaboradores (2002) han sugerido que HAI-1 puede suprimir el crecimiento y la motilidad de células de carcinoma por inhibición de la generación de HGFA activo. De manera adicional, Kawaguchi y colaboradores (1997) han sugerido que HAI-1 y HAI-2 pueden inhibir simultáneamente a HGFA in vivo . No obstante, recientemente, Kataoka y colaboradores (2001), han mostrado que la forma activa de HGFA enlaza a HAI-1 pero no a HAI-2, como se juzgó por un análisis de reticulación por afinidad riguroso. Este enlace especifico de HGFA a la forma de membrana de HAI-1 fue confirmado adicionalmente en un sistema diseñado usando células de ovario de hámster chino, en las cuales solamente células que expresan a la forma de membrana de HAI-1 retenidas exógenamente añadieron HGFA maduro. Kataoka y colaboradores concluyeron que HAI-1 es un inhibidor celular de HGFA activo, pero la forma de membrana de HAI-2 no lo es. En apoyo de esto, los estudios han mostrado también que la expresión de superficie celular de HAI-1 es significativamente sobre regulada en células epiteliales en respuesta a daño y regeneración de tejido, en las cuales HGFA está involucrado, pero la expresión de HAI-2 permanece sin alteración (Itoh y colaboradores, 2000). Los estudios en la expresión de HAI-1 y HAI-2 en células de cáncer han proporcionado también resultados conflictivos. Por ejemplo, Kang y colaboradores (2003) han reportado que altos niveles de expresión de HAI-1 están asociados con resultados pobres en pacientes en cáncer de seno, mientras que Parr y colaboradores (2004) encontraron que HAI-1 y HAI-2 fueron expresadas a un nivel significativamente más bajo en tumores de seno pobremente diferenciados, y que globalmente un bajo nivel de HAI-2 en tejidos de cáncer de seno estaban asociados con pobres resultados en pacientes. Además, Kataoka y colaboradores encontraron que la expresión tanto de HAI-1 como de HAI-2 comparadas a los tejidos normales correspondientes se conservó en adenocarcinomas colon rectales, pero más baja en carcinomas gastrointestinales (2000, 1998) . Aunque la información estructural, datos de expresión y localización celular son conocidos para HAI-1 y HAI-2 la función de estas proteinas, diferentes de su habilidad variable para enlazar a HGFA, permanecen sin determinar. Una vez que los detalles de su función sean elucidados será posible especular sobre las trayectorias celulares que estas proteinas participan en y comienzan asi a proporcionar una explicación de porqué, en algunos casos, bajos niveles de expresión están asociados con pobres resultados clínicos. Sin embargo, a pesar de la falta de conocimiento alrededor de la función de estas proteinas fortuitamente, se seleccionaron para usarlas en uno de nuestros estudios sobre cáncer. Sorprendentemente, se encontró que HAI-1 y HAI-2 actúan sinérgicamente para inhibir el crecimiento tumoral. En particular, se mostró que la inyección peritoneal ya sea de HAI-1 o HAI-2 recombinantes en ratones con tumor de próstata reduce el crecimiento de tumor, mientras que la inyección de estas proteinas inhiben simultánea o completamente el crecimiento de tumor (ver la Figura 14) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN A nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se ha mostrado que el efecto sinérgico de HAI-1 y HAI-2, y que estas proteinas han sido co-administradas para tratar cáncer. Como puede verse con referencia a la Figura 14, la co-administración de HAI-1 y HAI-2 dio como resultado ningún cambio en el volumen del tumor, o al menos, relativamente ningún cambio en el volumen del tumor ya que el volumen del tumor permaneció entre 0 y 10 mm3 mientras que tumores sin tratar, aproximadamente 7 dias después de comenzado el estudio, incrementaron en crecimiento hasta 150 veces, es decir desde 0 a 150 mm3. Esta reducción disminuida y sostenida en el volumen del tumor que siguió a la co-administración de HAI-1 y HAI-2 demuestra el efecto sinérgico notable de estas dos proteinas para prevenir o, al menos, reducir significativamente el crecimiento de tumor. Por consiguiente, la referencia en la presente al efecto sinérgico de estas dos proteinas incluye la referencia a estos efectos notables sobre el crecimiento de tumor y asi sobre la habilidad de estas dos proteinas para prevenir o reducir significativamente el crecimiento de tumor cuando se compara a tumores que no han sido tratados ya sea con HAI-1 o bien con HAI-2 o cuando se compara a tumores que han sido tratados solamente con uno de HAI-1 o HAI-2. Adicionalmente, se cree que los resultados son sorprendentes porque dado que hay evidencia de que HAI-2 no interactúa con HGFA y que estudios previos han mostrado que HAI-1 y/o HAI-2 son sobre-expresadas en algunos cánceres, se esperarla que administrar HAI-1 y HAI-2 a un modelo de tumor ya sea: a) tiene poco o ningún efecto sobre el crecimiento de tumor en comparación con administrar HAI-1 sobre el mismo, o b) aumenta el crecimiento de tumor, respectivamente.

Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición terapéutica que comprende : (a) una molécula de ácido nucleico, aislada, purificada o recombinante, que codifica a HAI-1 o a una proteina que es homologa a ésta o que la enlaza bajo condiciones de hibridización severas; y (b) una molécula de ácido nucleico aislada, purificada o recombinante, que codifica a HAI-2 o una proteina que es homologa a ésta o que enlaza a ésta bajo condiciones de hibridización severas. En una modalidad preferida de la invención dicha molécula de ácido nucleico homólogo es al menos 80 % homologa con dicha molécula de ácido nucleico aislada, purificada o recombinante que codifica ya sea a HAI-1 o a HAI-2. En una modalidad preferida de la invención dicha composición terapéutica es para, o adaptada para, uso en el tratamiento de cáncer. Más particularmente, la composición terapéutica está adaptada para tratar cáncer de seno o de próstata o, más preferiblemente aún, cáncer de la placenta, riñon, páncreas, tracto gastrointestinal (Gl), testículos u ovario . En una modalidad preferida de la invención la molécula de ácido nucleico pude ser ADN o ARN, incluyendo cADN o mARN y puede estar en la forma de un vector que comprenda una construcción recombinante. Cuando la molécula de ácido nucleico es incorporada en un vector, HAI-1 y HAI-2 pueden estar bajo el control de una secuencia promotora única, o de dos secuencias promotoras diferentes. De manera adicional, las secuencias promotoras pueden ser inducibles diferencialmente.

Alternativamente ya sea uno o ambos de dichos promotores se pueden proporcionar para LA expresión constitutiva de dichas proteinas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición terapéutica que comprende: (a) un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprenda la proteina HAI-1 o un fragmento activo funcionalmente de la misma o un polipéptido que sea al menos 80 % homólogo a ésta, y (b) un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprenda la proteina HAI-2 o un fragmento activo funcionalmente la misma o un polipéptido que sea al menos 80 % homólogo a ésta. En una modalidad preferida de la invención esta composición terapéutica es para, o está adaptada para, uso en el tratamiento de cáncer. Preferiblemente el cáncer a ser tratado es cáncer de seno o cáncer de próstata. Más preferiblemente aún, la composición es para, o está adaptada para, tratar cáncer del páncreas, riñon, placenta, tracto Gl, testículos u ovario. En las modalidades anteriormente mencionadas de la invención dichas moléculas de ácido nucleico que codifican a HAI-1 o HAI-2 y dichas proteinas HAI-1 y HAI-2 son proporcionadas en cantidades relativamente iguales. No obstante, los dos productos pueden ser proporcionados en cantidades desiguales a condición de que ambas estén presentes en la composición. De conformidad con un aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprenda la composición terapéutica anteriormente mencionada en combinación con un excipiente o portador adecuado y adicionalmente la composición puede ser formulada para una aplicación particular tal como aplicación tópica, inyección intravenosa, administración oral o administración como un pesario. Las formulaciones que son adecuadas para estos propósitos son bien conocidas por los expertos en el arte. Conforme a una modalidad adicional de la invención se proporciona una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica a HAI-1 y una molécula de ácido nucleico que codifica a HAI-2. En aún otra modalidad preferida adicional de la invención dicha construcción genética es adaptada para la expresión de HAI-1 y HAI-2 en un sistema seleccionado. Por ejemplo, dicha construcción puede ser adaptada para la expresión selectiva de las proteinas HAI-1 y HAI-2 en un sistema de mamífero y por consiguiente se proporcionan secuencias de control (tales como promotores y los similares) que son adecuadas para facilitar la expresión de dichas proteinas en el sistema de mamífero. Dichas secuencias son bien conocidas por los expertos en el arte . Alternativamente, dicha construcción genética puede ser adaptada para expresión en un sistema bacteriano o de levadura y por consiguiente la construcción incluye secuencias de control que son adaptadas para estos propósitos. Dichas secuencias son bien conocidas por los expertos en el arte. En una modalidad preferida de la invención dicha construcción genética comprende al menos una secuencia promotora que está operacionalmente ligada a al menos una de dichas moléculas de ácido nucleico y, más idealmente, un promotor único es ligado a ambas de dichas moléculas de ácido nucleico. En una modalidad alternativa, cada molécula de ácido nucleico puede ser proporcionada con su propia secuencia promotora. En cualquier caso, la secuencia promotora puede ser expresada ya sea inductiva o constitutivamente de modo que las proteinas HAI-1 y HAI-2 sean producidas controlable o constitutivamente. Más preferiblemente aún cada molécula de ácido nucleico es proporcionada con una señal de secreción, por medio de la cual, después de expresión, la proteina relevante es destinada para secreción y por consiguiente el producto de expresión puede ser cosechado a partir del medio de cultivo celular. Si este sistema de secreción-expresión no es adoptado entonces, alternativamente, las proteinas expresadas son purificadas extrayéndolas a partir del sistema celular relevante usando medios convencionales . De acuerdo a aún otro aspecto adicional de la invención se proporciona una célula huésped trasformada o transfectada con la construcción genética de la invención. En una modalidad preferida de la invención dicha célula huésped es de origen de mamífero o de origen bacteriano o de un sistema celular de levaduras. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar una composición como se describe en la presente, dicho método comprende expresar, individualmente o juntas, HAI-1 y HAI-2 en una célula huésped y aislar y/o purificar los productos de expresión. En aún una modalidad alternativa adicional de la invención, dicha composición terapéutica puede ser producida aislando HAI-1 y HAI-2 a partir de una fuente adecuada y, en el caso en el que cada proteina sea producida a partir de una fuente separada, las proteinas aisladas son entonces mezcladas juntas a fin de proporcionar la composición terapéutica. La invención también proporciona un método para el tratamiento de cáncer por administración a un individuo a ser tratado una composición como se describe en la presente. En un método preferido de la invención dicho cáncer a ser tratado es cáncer de seno o cáncer de próstata y por consiguiente dicho individuo a ser tratado es un paciente con una u otra de estas condiciones. Alternativamente, el cáncer a ser tratado es cáncer de la placenta, riñon, páncreas, tracto Gl, testículos u ovario. En una modalidad alternativa de la invención, la invención puede ser trabajada causando la expresión, o preferiblemente la sobre expresión, de HAI-1 y HAI-2 endógenos. Esto puede ser realizado seleccionando el promotor de estos genes de modo de asegurar que las proteinas endógenas sean sobre expresadas. Por consiguiente un instrumento para este propósito puede comprender una construcción genética que comprenda un promotor constitutivo, o inducible que se caracterice por asegurar que el gen al cual está fijado sea expresado ya sea constitutiva o intermitentemente a relativamente altos niveles y ciertamente a niveles suficientemente altos para asegurar que una combinación de HAI-1 y HAI-2 sea eficiente para tratar cáncer y, adicionalmente, dicha construcción es adaptada para acoplar a la molécula de ácido nucleico que codifica a HAI-1 y/o a HAI-2. Conforme a aún un aspecto adicional de la invención se proporciona un oligonucleótido que está adaptado para hibridizar con al menos una parte de la molécula de ácido nucleico que codifica ya sea a HAI-1 o a HAI-2 o a ambas y, más preferiblemente aún, se proporciona una pluralidad de oligonucleótidos para hibridizar a HAI-1 o a HAI-2.

Más preferiblemente aún, se proporciona un oligonucleótido tres prima y cinco prima para enlazar a HAI-l'o a HAI-2 a fin de lograr la amplificación efectiva del mismo para fabricar un suministro de HAI-1 o HAI-2 con el propósito de producir una composición terapéutica como se describe en la presente. Será obvio para los expertos en el arte que los oligonucleótidos proporcionados por esta invención comprenden oligonucleótidos que son capaces de enlazar a ADN recombinante de tipo salvaje que codifica a HAI-1 o HAI-2. En resumen nuestro estudio actual ha mostrado que una combinación de HAI-l y HAI-2 es un inhibidor efectivo del crecimiento de tumor y asi estas substancias, cuando son co-administradas, tiene particular aplicación en el tratamiento de cáncer. Conforme a un aspecto adicional de la invención se proporciona un anticuerpo cultivado junto a HAI-1 o HAI-2. Los anticuerpos de conformidad con la invención tienen particular uso en el suministro de un factor promotor de crecimiento. Como se dará cuenta un experto en la materia, a partir de la presente descripción, una combinación de HAI-1 y HAI-2 inhibe completamente el crecimiento de tumor y por consiguiente se sigue que anticuerpos, o una combinación de anticuerpos cultivados junto a HAI-1 o HAI-2 tienen utilidad en el bloqueo de la actividad de estos dos agentes y asi en la promoción del crecimiento celular. En consecuencia el uso de anticuerpos para HAI-1 y HAI-2 en una suspensión, o más idealmente, solución tiene aplicación particular en el desarrollo de un medio de cultivo promotor de crecimiento. Conforme a un aspecto adicional' de la invención se proporciona un factor promotor de crecimiento que comprende un anticuerpo cultivado junto a HAI-1 y un anticuerpo cultivado junto a HAI-2. En una modalidad preferida de la invención dichos anticuerpos son monoclonales o más preferiblemente aún anticuerpos monoclonales humanizados. La invención se describirá ahora por medio del ejemplo siguiente y con referencia a las siguientes figuras en donde: DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1, muestra la organización de los genes de HAI-1 (porción superior) y de HAI-2 (porción inferior) con cADNs correspondientes. Las localizaciones de los exones se indican por medio de un cuadro negro con el número de exón. Las porciones de cADNs correspondientes a cada exón con tamaños aproximados de ADN se indican también. (Tomados de Itoh y colaboradores 2000) ; La Figura 2, muestra las secuencias de nucleótidos de la región de flanqueo 5' de los genes de HAI-1 (A) y de HAI-2 (B) humanas. Los residuos de nucleótidos se muestran en números menos (-) a partir del sitio de inicio de transcripción. Los sitios de inicio de transcripción posibles que incluyen menos unos se indican en flechas verticales. Los sitios de enlaces potenciales de factores de transcripción conocidos se indican por flechas horizontales con sus nombres. HAI-1 tiene un primer intrón en la región de flanqueo 5' en la posición mostrada por la linea obscurecida (Tomada de Itoh y colaboradores, 2000) ; La Figura 3 (a) , muestra un mapa de pcADN 4/HisMax-TOPO. Este diagrama muestra las características de este vector de 5.27 Kb. El sitio de clonación está localizado entre las bases 1184-1185; La Figura 3 (b) , muestra un mapa de pCR-T7/VP-22-l-TOPO. Este diagrama resume las características del vector VP-22. El vector es de 4.9 Kb de tamaño, y el sitio de clonación está localizado entre las bases 597-598. La Figura 4 (a) , muestra la digestión y detalles de expresión de HAI-1 y HAI-2. Los productos de PCR que representan las secuencias objetivo de HAI-1 y HAI-2 amplificadas, fueron fuertemente sacudidos/depurados en las muestras de LN-CAP y ECV-304, respectivamente. Estos productos de PCR fueron usados directamente para clonación por TA; La Figura 4 (b) : Los plásmidos de HisMax purificados, que contienen los insertos HAI apropiados (1 y 3) , fueron digeridos con las enzimas de restricción Hind III y Eco RV para liberar la secuencia de HAI clonada (2 y 4) . (Nota: Hind para la secuencia de HAI = 275 pb, y Eco RV para HAI = 45 pb, asi, 0.32 Kb extra): 1. HisMax (5.27 Kb) + HAI-1 (0.8 Kb) = 6.07 Kb 2. HAI-l (0.8 Kb) + 0.32 Kb extras = 1.12 Kb 3. HisMax (5.27 Kb) + HAI-2 (0.76 Kb) = 6.03 Kb 4. HAI-2 (0.76 Kb) + 0.32 Kb extra = 1.08 Kb) ; La Figura 4 (c) , expresión libre de células de HAI-1 y HAI-2. El vector HisMax, que contiene HAI-1, produce una proteina de 300 aminoácidos (900 pb) , con un peso molecular de 32.5 kDa. Una proteina de 286 aminoácidos (860 pb) es producida con HAI-2, a 31 kDa; La Figura 5 (a) muestra un mapa del vector de pRevTRE; La Figura 5 (b) muestra un mapa del vector de pRevTet-On; La Figura 6, muestra el mecanismo de expresión genética de RevTet-On. El elemento de respuesta de tet (TRE) está localizado desde el carboxi libre hacia el extremo amino libre del promotor precoz inmediato minimo de citomegalovirus (PCMV), el cual es silencioso en la ausencia de activación. El transactivador en sentido contrario controlado por tetraciclina (rtTA) enlaza al TRE, activando asi la transcripción de HAI, en la presencia de Doxiciclina (Dox) ; La Figura 7 muestra la amplificación de secuencias objetivo ya sea con los cebadores de pRevTRE, VP-22, HisMax o HAI (como se muestra en la Tabla 9.1), genera productos de PCR de tamaños variables. Por ejemplo, el uso de los cebadores de sentido directo y contrario de VP-22 para HAI-1, da como resultado productos de 1467 pb (536 + 795 + 136). (Nota: TE es el mejorador de traslación especifica, mientras que, PH representa la posición de la marca de polihistidina) ; La Figura 8 (a) muestra amplificaciones del sistema Herculasa, usando los grupos de cebadores de HisMax y VP-22 (ver la Tabla 9.1). Las bandas producidas fueron del tamaño esperado (ver la Figura 9.3 para explicación de los tamaños) : 1. VP-22 + HAI-1 (672 + 795) = 1.47 Kb 2. VP-22 + HAI-2 (672 + 759) = 1.43 Kb) 3. HisMax + HAI-1 (220 + 795) = 1.02 Kb 4. HisMax + HAI-2 (220 + 759) = 0.98 Kb; La Figura 8 (b) muestra la verificación de la colonia bacteriana de pRevTRE + HAI-1 (HisMax) , con el grupo de cebadores de pRevTRE. 5 bandas producidas. Tamaño esperado (260 pb + 1.02 Kb) = 1.28 Kb; La Figura 8 (c) muestra la confirmación de la orientación correcta de la secuencia de HAI-1 en el vector de pRevTRE. Cebador en sentido directo de pRevTRE y cebador en sentido contrario de HAI-1 de usuarios. Solamente 1 de las 5 colonias anteriores, contuvo HAI-l correctamente integrada en pRevTRE. Tamaño esperado (105 + 175 + 795) = 1.08 Kb; La Figura 8 (d) , muestra la verificación de la colonia bacteriana de pRevTRE + HAI-2 (VP-22), con el grupo cebador de pRevTRE. 3 colonias produjeron bandas en el intervalo correcto. Tamaño esperado (1.43 Kb + 260 pb) = 1.69 Kb; La Figura 8 (e) , muestra la confirmación de la orientación correcta de HAI-2 en el vector de pRevTRE. Examinado con el cebador en sentido directo de pRevTRE y el cebador en sentido contrario de HAI-2. Solamente 1 de las 3 colonias anteriores contuvieron HAI-2 integrada en el vector de pRevTRE en la posición correcta. Tamaño esperado (105 + 536 + 759) = 1.4 Kb; La Figura 9 (a) , muestra la verificación de control de calidad de ß-actina; La Figura 9 (b) , muestra el grupo cebador de pRevTRE usado para confirmar la transducción de fibroblastos de MRC5 con las construcciones de pRevTRE + HAI; La Figura 9 (c) El grupo de cebadores de HAI-1 muestra que HAI-1 solamente presente en células MRC5, transducido con pRevTRE + HAI-1; La Figura 9 (d) El grupo de cebadores de HAI-2 muestra que HAI-2 está presente a un nivel alto en las células transducidas de HAI-2. Los fibroblastos transducidos de HAI-2 y de tipo salvaje revelan una banda muy ligera para HAI-2; La Figura 10 (a) muestra una reacción de PCR de alta fidelidad para amplificar las secuencias objetivo, a partir de ADN secuenciado previamente. Esto asegura amplificación libre de error de las hebras de ADN, debido a la presencia de una enzima correctora de pruebas; La Figura 10 (b) muestra una reacción de PCR de alta fidelidad para amplificar las secuencias objetivo, a partir de ADN previamente secuenciado. Esto asegura una amplificación libre de error de las hebras de ADN, debido a la presencia de una enzima correctora de pruebas; La Figura 10 (c) , muestra que el vector Pic9 fue abierto con la enzima Sna Bl. Las hebras de ADN de HAI a ser insertadas tuvieron ambos extremos de las hebras centradas con las enzimas SnaBl y EcoRV. Estas enzimas reconocen y fragmentan sitios específicos sobre las hebras de ADN, que dan como resultado extremos obtusos cerrados ligables. La Figura 10 (d) , Ligado de HAI's en PIC9. El método de ligado requiere la presencia de una enzima conocida como T4 ADN ligasa, que cataliza la unión de dos hebras de ADN entre los grupos 5' -fosfato y 3' hidroxilo de nucleótidos adyacentes; La Figura 11 (a) , muestra la identificación de colonias positivas de la construcción. Se usó PCR sobre 20 - 30 colonias bacterianas para identificar las que contenían la PIC9 con la secuencia de HAI insertada. Usando el grupo de AOX de cebadores del plásmido de PIC9: Sin inserto = 500 pb y con inserto = 1300 pbJ La Figura 11 (b) , muestra la amplificación, purificación de plásmido y digestión de las construcciones de PIC9-HAI. (1) plásmido purificado, (2) HAI-l digerida con Pmel y Notl y (3) HAI-2 digerido con Pmel y Notl. Todo el resto son verificaciones de la orientación del inserto; La Figura 11 (c) , muestra la transformación, seguida por la selección y subsecuente identificación de colonias adecuadas para amplificación. Una selección de clones de levaduras positivas; La Figura 11 (d) , las proteinas HAI-2 y HAI-1 recombinantes fueron colectadas a partir del medio de cultivo de levaduras y fueron detectadas usando anticuerpos desarrollados en el Laboratorio, lo cual fue seguido por amplificación, inducción de la secreción de la proteina HAI-1 y análisis por tinción Western de la inducción de la proteina HAI-1 y HAI-2; La Figura 11 (e), muestra la sintesis de las proteina HAI-1 y HAI-2 detectada con anticuerpos desarrollados en el Laboratorio; La Figura 12 (a) es un análisis por bioensayo de SF/HGF bioactivo; La Figura 12 (b) , muestra el bioensayo MDCK; La Figura 13 (a) muestra un ensayo de invasión de células de cáncer de seno por co-cultivo. Los fibroblastos de MRC5 transducidos y de tipo salvaje fueron cultivados en una placa de 24 pocilios, y fueron utilizados como una fuente de HGF/SF para mejorar la invasión de células de cáncer de seno MDA-MB-231. Los fibroblastos de tipo salvaje incrementaron el grado de invasión comparado con el control. No obstante, el nivel de HGF/SF activo producido por los fibroblastos transducidos fue significativamente más bajo, como se muestra por la disminución en el número de células invadidas; La Figura 13, (b) muestra un ensayo de invasión de la proteina HAI de levadura; y La Figura 14, muestra el efecto de la exposición de un tumor a HAI-1, HAI-2 o ambas (B) durante un periodo de 17 dias. Amplificación de HAIs humanas cADN de HAI-1 y HAI-2 humanas fueron amplificados a partir de ARN aislado de tejidos mamarios humanos y piel humana normal, usando PCR por transcripción en sentido contrario. La secuencia correcta de estos productos fue confirmada usando la secuenciación de ADN directa. Construcción de "cassettes" de expresión de HAIs Las HAIs asi aisladas fueron clonadas en un vector de expresión de mamífero, pCR3/HisMax (ver la Figura 3) , la cual fue entonces usada para transformar células de mamífero (pcDNA4/HisMax TOPO) o E. Coli competente químicamente (pCRT7VP22-l-TOPO) , respectivamente. La presencia de los insertos de ADN y la dirección en colonias bacterianas fueron verificadas usando PCR en dirección especifica. Los "cassettes" de expresión a partir de lo anterior fueron digeridos usando enzimas de restricción de ADN (ver la Figura 4) . Los fragmentos de expresión de ADN fueron extraídos y purificados a partir de gel de agarosa usando un equipo de extracción de ADN. Los fragmentos fueron insertados en un vector retroviral (ver las Figuras 5, 6, 7), pRevLXSN y pRev-TRE, las cuales fueron digeridas de manera similar y purificadas usando las enzimas de registro acopladas, usando T4 DNA ligasa (ver las Figuras 8, 9). Los productos ligados fueron usados para transformar la cepa JM109 de E. coli , fueron hechos competentes químicamente in si tu . La presencia de los insertos fue verificada similarmente usando PCR en dirección especifica. Preparación del plásmido bacteriano y transfección de células de cáncer Después de amplificación del plásmido en E. coli, se extrajo el ADN del plásmido y se purificó usando un equipo de preparación de plásmido. El plásmido purificado que codifica a HAI-1 y a HAI-2 fue electroporado en células de cáncer de seno o CHO y células transfectadas establemente fueron seleccionadas usando antibióticos G4 18. Preparación de solución concentrada de HAI retroviral pLXSN-HAI-1 o HAI-2, fue primero amplificada en E. coli. Después de extracción y purificación, el plásmido retroviral fue electroporado en una linea celular de empaque, PT67. Se preparó una PT67 transfectada establemente que produjo HAI-1 y HAI-2 retroviral después de selección con G418. Estas células fueron entonces usadas para las soluciones concentradas retrovirales generadas, las cuales fueron subsecuentemente usadas para infectar fibroblastos estromales, en los cuales la linea celular de fibroblastos humana, MRC5, fue infectada por 3 dias con intercambio diario de solución concentrada viral recientemente preparada. Desarrollo de un sistema de expresión de levaduras para ambas HAI-1 y HAI-2 Los "cassettes" de expresión de HAI-l/HAI-2 fueron modificados establemente y re-insertados en un vector de expresión de levaduras (ver la Figura 10, 11) usando la T4 DNA ligasa. Los plásmidos ligados fueron usados para transformar E. coli, como ya se dio anteriormente. Las colonias correctas fueron seleccionadas y amplificadas similarmente. El plásmido purificado fue elctroporado en una cepa de levadura, usando el electroporador . Las colonias exitosas fueron seleccionadas y verificadas de manera similar. La levadura fue desarrollada en medio de levadura, suplementada con metanol bajo una condición especial. La condición óptima para la cepa fue desarrollada y usada para la amplificación subsecuente a volúmenes mayores. El medio de crecimiento d elevadura fue centrifugado a 4 °C. Después de la remoción de la levadura, el medio acondicionado con HAI-1 o HAI-2 recombinantes fue concentrado usando un sistema de ultrafiltración que permite retener y concentrar el tamaño especifico de proteinas . Bioensayo de HGF Se usó un bioensayo de HGF (ver las Figuras 12a y 12b) , conocido como ensayo de dispersión de MDCK, el cual es, en nuestra opinión, la mejor manera para probar la bioactividad de HAI-1 y HAI-2. Células MDCK, que produjeron pequeños conglomerados, fueron tratadas ya sea con HAI-1, HAI-2 recombinantes o su combinación, junto con células MRC5. Células MRC5 transfectadas en pLXSN/HAI-1 o HAI-2 fueron también co-cultivadas con células MDCK. Después de 24 horas, se evaluó la dispersión de células MDCK, con la ayuda de tinción usando cristales violeta. Ensayo de migración celular y ensayo de invasión celular Se usaron dos métodos para evaluar los efectos de fibroblastos sobre células de cáncer, ensayo d emigración celular y ensayos in vi tro, usando un sistema de cocultivo. Para el ensayo de migración, se plaquearon células de cáncer en el fondo de una cámara y se dejó que alcanzaran confluencia. Las células confluentes fueron entonces heridas usando una aguja. En la cámara superior del sistema, se añadieron células MRC5 retrovirales manipuladas (pLXSN-HAI-1 o HAI-2. La migración de células de cáncer heridas se monitoreó entonces usando un video con lapso de tiempo, cuya velocidad fue calculada usando el programa para análisis de movimiento en Óptimas. Las células de cáncer fueron también tratadas con HAI-1, HAI-2 recombinante, su combinación, sobrenadante a partir de células MRC5 retrovirales manipuladas. Se determinó de manera similar la migración celular (ver la Figura 13 A y 13 B) . En el ensayo de invasión in vi tro, las células de cáncer fueron añadidas a una cámara superior que fue pre-recubierta con Matrigel, a la cámara del fondo, se añadió ya sea, HAI-1 HAI-2 recombinantes, su combinación, sobrenadante a partir de células MRC5 retrovirales, manipuladas, o células MRC5 como tales. Después de 3 dias, se evaluó la invasividad de las células. Detección de la proteina HAI usando tinción Western y desarrollo de anticuerpos anti-HAI-1 y anti-HAI-2 Primero se sintetizaron péptidos cortos específicos para HAI-1 y HAI-2 humano y se conjugaron a KLH. El conjugado fue inyectado subsecuentemente en conejos usando un procedimiento estándar para cultivar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos purificados se encontró que fueron específicos para HAI-1 y HAI-2 humanas, respectivamente. Estos anticuerpos se usaron para probar la presencia y la cantidad de HAI-1 y HAI-2 recombinantes a partir de los sistemas anteriores. Los efectos de HAI-1 y HAI-2 recombinates en modelos de tumor Células MDA MD 231 de cáncer de seno o células PC-3 de cáncer de próstata fueron inyectadas subcutáneamente en ratones desnudos atimicos (de 4 a 6 semanas de edad, hembras), usando una mezcla especial para ayudar al crecimiento de tumores. Después de una semana, los ratones comenzaron a recibir HAI-1, HAI-2 recombinante concentradas o su combinación, diariamente, via la ruta intraperitoneal. Se midieron el tamaño de los tumores y el peso de ratones dos veces por semana (ver la Figura 14). Resultados Como puede verse en las Figuras 12 y 13, células MRC5 de cáncer hablan reducido la motilidad y la invasividad cuando se trataron ya sea con HAI-1 o HAI-2, pero estas fueron reducidas adicionalmente cuando HAI-1 y HAI-2 fueron administradas juntas. Finalmente, la Figura 14, muestra los resultados de una inyección peritoneal de HAI-1 y/o HAI-2 recombinantes en un modelo de tumor de ratón. Los resultados para HAI-1 y HAI-2 solos mostraron una pequeña reducción en el crecimiento de tumor, mientras que la co-administración de estas proteinas dio como resultado una inhibición absoluta del crecimiento de tumor.

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Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende: (a) Una proteina/polipéptido aislada, purificada o recombinante, caracterizada porque comprende HAI-1, o un fragmento de la misma activo funcionalmente, o un polipéptido/proteina que sea al menos 80 % homologa a éstos; y (b) una proteina/polipéptido aislada, purificada o recombinante, que comprende HAI-2, o un fragmento de la misma activo funcionalmente, o un polipéptido que sea al menos 80 % homólogo a éstos.

2. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los componentes (a) y (b) están presentes en cantidades iguales.

3. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los componentes (a) y (b) están presentes en cantidades desiguales.

4. Una composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque se proporciona también un excipiente o portador adecuado.

5. Una composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque la composición está adaptada para uso en el tratamiento de cáncer.

6. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el cáncer es uno cualquiera de los siguientes: cáncer de seno, cáncer de próstata, cáncer pancrático, cáncer de riñon, cáncer de placenta, cáncer del tracto Gastrointestinal, cáncer de los testículos o cáncer de los ovarios.

7. Una composición terapéutica caracterizada porque comprende: (a) Una molécula de ácido nucleico aislada, purificada o recombinante, que codifica a HAI-1, o a una proteina que sea al menos 80 % homologa a ésta, o que enlaza a ésta bajo condiciones de hibridización severas; y (b) Una molécula de ácido nucleico aislada, purificada o recombinante, que codifica a HAI-2, o a una proteina que sea al menos 80 % homologa a ésta, o que enlaza a ésta bajo condiciones de hibridización severas; y

8. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha molécula de ácido nucleico es una cualquiera de las siguientes: ADN, ARN, o una construcción recombinante.

9. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico está incorporada en un vector.

10. Una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 a 9 caracterizada porque las moléculas de ácidos nucleicos comprenden un promotor asociado que se proporciona ya sea para expresión constitutiva o bien inducible de dichas proteinas.

11. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque HAI-1 y HAI-2 están bajo el control del (de los) mismo (s) promotor (es) y/o factor (es) de transcripción y por consiguiente son ambos expresados ya sea constitutivamente o bien expresados indeciblemente.

12. Una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11, caracterizada porque la expresión de HAI-1 y HAI-2 está bajo el control ya sea de un promotor único del mismo promotor está operablemente ligado a cada una de las secuencias que codifican a HAI-1 y HAI-2.

13. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque cada molécula de ácido nucleico que codifica a HAI-1 o HAI-2 tiene su propio promotor diferente.

14. Una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 a 13 caracterizada porque dichas moléculas de ácido nucleico que codifican a HAI-1 y HAI-2 están adaptadas o diseñadas para expresión en un sistema huésped seleccionado.

15. Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque dicho sistema huésped es mamífero, bacteriano o de levadura.

16. Una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 a 15, caracterizada porque la molécula que codifica a HAI-1 y/o HAI-2 es proporcionada con una señal de secreción con la cual, después de expresión de la proteina relevante, la proteina es seleccionada para secreción.

17. Una célula huésped caracterizada porque es transformada o transfectada con la composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 a 16.

18. Un método para la producción de una composición terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque: (a) una célula huésped es transformada o transfectada con una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 7 a 16; (b) la célula huésped es cultivada bajo condiciones que faciliten la expresión de la mencionada composición terapéutica; y (c) los productos de expresión HAI-1 y HAI-2 son entonces cosechados.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque dicha célula huésped es transformada o transfectada con una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 16 y asi la parte (c) de la metodología involucra cosechar los productos de expresión a partir del medio de cultivo celular.

20. Un método para preparar una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque comprende: (a) obtener la proteina HAI-l y/o HAI-2 a partir de una fuente adecuada de tejido de mamífero y, donde cada proteina es aislada a partir de una fuente separada, mezclar juntos los dos productos aislados .

21. Un método para la preparación de una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende: (a) iniciar, facilitar o mejorar la expresión endógena de HAI-1 y HAI-2 ya sea en tejido canceroso, tejido pre-canceroso o tejido adyacente o en la región de cualquiera de los tejidos anteriormente mencionado.

22. Un método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque dicha expresión es iniciada, facilitada o mejorada por activación del promotor del gen de HAI-1 y/o HAI-2.

23. Un método de conformidad con las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico que codifica a HAI-1 y/o HAI-2, es amplificada, usando técnicas convencionales, a fin de incrementar la producción de HAI-l y/o HAI-2.

24. Cebadores para el uso en el método de conformidad con la reivindicación 23.

25. Un método de tratar cáncer caracterizado porque comprende administrar a un individuo a ser tratado una composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 16.

26. Un anticuerpo cultivado contra el componente HAI-2, o una combinación de los componentes HAI-l, HAI-2 de la composición terapéutica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6.