CN101010097A - 癌症治疗中的hai－1和hai－2 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的新治疗组合物，特别是用于治疗前列腺癌和乳癌，该组合物包含两种肝细胞生长因子激活物抑制剂HAI－1和HAI－2的混合物。

Description

癌症治疗中的HAI-1和HAI-2
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的新治疗组合物，更具体地、但不是排他地用于治疗前列腺癌和乳癌。该组合物包含肝细胞生长因子激活物抑制剂HAI-1和HAI-2。此外，本发明涉及生产所述组合物的方法及其治疗癌症的用途。
背景技术
癌症是一个多步过程，包括基膜的破坏、癌细胞从原发性肿瘤的脱离、侵入基质层中、内渗入血细胞中、通过靶器官血管外渗以及癌细胞在远距离组织中的建立和增殖。为了使这些事件发生，癌细胞必须获得迁移过并降解胞外基质成分的能力。由基质细胞分泌的一系列生长和运动因子都参与该过程，肝细胞生长因子(HGF)是其中之一。
HGF是最初鉴定为肝细胞的生长因子的多效性因子(Nakamura等，1987，Gohda等，1988和Zarnegar等，1989)。它与分散因子(SF)难以区分，并在结合上皮细胞表面上的c-Met受体时，HGF可以使上皮细胞集落和分散细胞分离。认为这种活性在癌细胞运动和入侵的调节中是重要的，且最近许多研究已经证明了HGF/SF和Met在肿瘤形成、肿瘤细胞侵入、分化和肿瘤血管生成中具有重要作用(Bellusci等，1994，Rong等，1994，Lamszus等，1997，Nakamura等，1997和Abounader等，1999)。Parr等(2004)也已经表明HGF及其受体与临床情况中的癌症侵占性相关，如乳癌和前列腺癌，且肿瘤中高水平的HGF与患者差的临床结果相关。
HGF是作为具有约94千道尔顿分子量的无活性、单链、前体形式(scHGF)由间充质细胞分泌的。为了呈现其生物学功能，单链HGF胞外蛋白水解转化成双链杂二聚体活性形式是必要的(Naka等，1992和Gak等，1992)。迄今为止，已经有五种蛋白酶参与HGF的激活。其中，HGF激活物(HGFA)在单链HGF加工成活性HGF中呈现出最有效的活性(Shimomura等，1992，Shimomura等，1995和Miyazawa等，1993)。已经表明在癌症如人乳癌中以异常高的水平表达HGFA，且这种表达与患者差的临床结果相关。
已知HGF的激活是该因子活性体内调节且因此细胞运动中的关键事件，已经表明HGFA抑制剂在调节HGF在癌症中的作用中起着重要作用。
从MKN45胃癌细胞系的培养物-条件培养基中纯化出第一种内源HGFA抑制剂(HAI)(Shimomura等，1997)。随后，从相同细胞中纯化出第二种类型的HAI(Kawaguchi等，1997)。已经将这些抑制剂分别命名为HAI-1和HAI-2。
HAI-1和HAI-2都具有两个定义明确的Kunitz-型抑制剂结构域(KD1和KD2)，它们共有高度氨基酸序列同一性，并且第一个结构域看来负责HGFA的抑制(Shimomura等，1997)。此外，每个HAI具有推定的接近C-末端的跨膜结构域(TM)，表明HAI是I型跨膜蛋白(Shimomura等，1997，Kawaguchi等，1997和Marlor等，1997)(参见图1)，并认为这种结构确保了它们的生物活性以局部组织的细胞表面为目标。然而，尽管HAI-1和HAI-2之间特征性结构域的整体结构是相似的，但HAI-1分子具有HAI-2中不存在的低密度脂蛋白(LDL)受体样结构域，而HAI-2具有HAI-1中不存在的睾丸-特异性外显子。
此外，测定这两种蛋白在不同的染色体中的位置：HAI-1位于染色体15(q15)，而HAI-2位于染色体19(q13.11)。显然，发现在5’侧翼区中HAI-1和HAI-2之间没有同源区，且Sp1和GATA以外的已知转录因子的可能结合位点彼此间显著不同(Hoh等，2000)(参见图2)。已经向基因库提交了HAI-1和HAI-2的全基因组序列(对于HAI-1为AC 012476，AC 022086，AC 025166和AC 022835，对于HAI-2为AC 011479)。
尽管这样，RNA印迹分析仍表明HAI-1的组织分布与HAI-2的非常相似，且这两个基因在胎盘、肾脏、胰腺和胃肠道中充分表达(Shimomura等，1997和Kawaguchi等，1997)。然而，HAI-1mRNA在睾丸和卵巢中只是微弱地检测到，而HAI-2在这些组织中充分表达。在免疫组织化学上，HAI-1蛋白位于覆盖各种器官包括胃肠道的导管、细管和粘膜表面的单层柱状上皮细胞的外侧表面或基底外侧表面(Kataoka等，1999)。还通过原位杂交证实了HAI-1在结肠上皮中的表达(Kataoka等，1999)。相反，在各种组织的上皮细胞和巨噬细胞样单核炎症细胞的细胞质中已经检测到HAI-2蛋白(Itoh等，2000)。HAI-2在胰腺癌中也是超表达的(Müller-Pillasch等，1998)。
HAI-1和HAI-2结构和细胞定位的差异表明它们在体内可能具有截然不同的作用。Oberst等(2002)已经表明HAI-1通过抑制活性HGFA的产生可以抑制癌细胞的生长和运动。此外，Kawaguchi等(1997)已经表明HAI-1和HAI-2在体内可以同时抑制HGFA。
然而，最近，Kataoka等(2001)已经表明HGFA的活性形式结合HAI-1而不结合HAI-2，如通过严格的亲和交联分析来判定。在工程系统中使用中国仓鼠卵巢细胞进一步证实了这种HGFA与膜形式HAI-1的特异性结合，其中只有表达膜形式HAI-1的细胞保留着外源加入的成熟HGFA。Kataoka等推断HAI-1是活性HGFA的细胞抑制剂，但膜形式的HAI-2不是。为了支持这一论断，研究还表明在上皮细胞中响应组织损伤和再生HAI-1的细胞表面表达显著上调，其中涉及HGFA，但HAI-2表达保持未改变(Itoh等，2000)。
对癌细胞中HAI-1和HAI-2表达的研究还提供了矛盾的结果。例如，Kang等(2003)报道了HAI-1的高水平表达与差的乳癌患者结果相关，而Parr等(2004)发现HAI-1和HAI-2在分化差的乳房肿瘤中以显著较低的水平表达，且总的来说乳癌中HAI-2的低水平与差的患者前景相关。此外，Kataoka等发现HAI-1和HAI-2两者的表达与相应的正常组织相比较，在结肠直肠腺癌中是恒定不变的，但在胃肠道癌中较低(2000，1998)。
发明内容
尽管对于HAI-1和HAI-2的结构信息、表达数据和细胞定位是已知的，但除了它们结合HGFA的可变能力以外，这些蛋白的功能尚待确定。一旦它们的功能的详细情况得到阐明，则可以推测这些蛋白参与的细胞途径，并因此开始提供对于为什么在某些情况下低水平表达与差的临床结果相关的解释。
然而，尽管缺乏对这些蛋白功能的了解，但是我们在一个对癌症的研究中偶然地选择了使用这些蛋白。令人惊讶地，我们发现HAI-1和HAI-2协同作用来抑制肿瘤生长。特别是，我们证实了在患有前列腺肿瘤的小鼠中腹膜注射重组HAI-1或HAI-2使肿瘤生长减少，而同时注射这两种蛋白完全抑制肿瘤生长(参见图14)。
据我们所知，这是第一次证明了HAI-1和HAI-2的协同作用，以及将这些蛋白共同给药来治疗癌症。
通过参照图14可以看到，HAI-1和HAI-2的共同给药导致肿瘤体积没有改变，或至少相对地肿瘤体积没有改变，因为肿瘤体积保持在0至10mm3，而未治疗的肿瘤，在研究开始后约7天，生长增加高达150倍，即从0增至150mm3。这种共同给药HAI-1和HAI-2后肿瘤体积减小和持续的减小表明了这两种蛋白阻止或至少显著减少肿瘤生长的显著协同作用。因此，在此提及的这两种蛋白的协同作用包括与没有用HAI-1或HAI-2治疗的肿瘤相比较或与只用HAI-1或HAI-2之一治疗的肿瘤相比较时，这些对肿瘤生长的显著作用和因此这两种蛋白阻止或至少显著减少肿瘤生长的能力。
因此，我们相信我们的结果是令人惊讶的，因为已知存在HAI-2不与HGFA相互作用的证据且以前的研究已经表明HAI-1和/或HAI-2在一些癌症中是超表达的，本领域技术人员能够预期将HAI-1和HAI-2给药于肿瘤模型将会：
(a)与单独给予HAI-1相比较，对肿瘤生长几乎没有或没有效果，或
(b)各自增加了肿瘤生长。
因此，本发明的一方面中，提供了治疗组合物，包含：
(a)分离的、纯化的或重组的核酸分子，其编码HAI-1或与其同源的蛋白质或在严格杂交条件下与其结合的核酸分子；和
(b)分离的、纯化的或重组的核酸分子，其编码HAI-2或与其同源的蛋白质或在严格杂交条件下与其结合的核酸分子。
本发明的优选实施方案中，所述同源核酸分子与所述分离、纯化或重组的编码HAI-1或HAI-2的核酸分子至少80％同源。
本发明的优选实施方案中，所述治疗组合物用于或适用于治疗癌症。
更具体地，治疗组合物适用于治疗乳癌或前列腺癌，或更优选地，用于治疗胎盘、肾脏、胰腺、胃肠(GI)道、睾丸或卵巢的癌症。
本发明的优选实施方案中，核酸分子可以是DNA或RNA，包括cDNA或mRNA，且可以是包含重组构建体的载体形式。在将核酸分子掺入载体中的情况下，HAI-1和HAI-2可以在单个启动子序列或两个不同启动子序列的控制下。此外，启动子序列可以是差别诱导型的。或者，所述启动子之一或两者可以提供所述蛋白的组成型表达。
本发明的另一方面中，提供了治疗组合物，包含：
(a)包括HAI-1蛋白的分离的、纯化的或重组的多肽或其功能活性片段或与其至少80％同源的多肽，和
(b)包括HAI-2蛋白的分离的、纯化的或重组的多肽或其功能活性片段或与其至少80％同源的多肽。
本发明的优选实施方案中，所述治疗组合物用于或适用于治疗癌症。
优选待治疗的癌症是乳癌或前列腺癌。再更优选地，组合物用于或适用于治疗胰腺、肾脏、胎盘、GI道、睾丸或卵巢的癌症。
本发明的上述实施方案中，以相对等量来提供所述编码HAI-1或HAI-2的核酸分子以及所述HAI-1和HAI-2蛋白。然而，可以以不相等的量来提供这两种产物，只要二者都存在于组合物中。
根据本发明的再一方面，提供了药物组合物，包含上述的治疗组合物并与合适的赋形剂或载体组合，此外，可以将组合物配制成适合于特定的应用，如局部施用、静脉内注射、口服或作为阴道栓剂给药的形式。适用于这些用途的制剂是本领域技术人员公知的。
根据本发明的另一实施方案，提供了包含编码HAI-1的核酸分子和编码HAI-2的核酸分子的遗传构建体。
本发明另一优选实施方案中，所述遗传构建体适用于在选定的系统中表达HAI-1和HAI-2。例如，所述构建体可以适用于在哺乳动物系统中HAI-1和HAI-2蛋白的选择性表达，因此包括适于能够使所述蛋白在哺乳动物系统中表达的控制序列(如启动子等)。这样的序列是本领域技术人员公知的。
或者，所述遗传构建体可以适用于在细菌或酵母系统中表达，因此该构建体包括适用于这些用途的控制序列。这样的序列是本领域技术人员公知的。
在本发明的优选实施方案中，所述遗传构建体包含至少一个可操作地连接至少一个所述核酸分子的启动子序列，更理想地，单个启动子连接两个所述的核酸分子。备选的实施方案中，可以给每个核酸分子提供其自己的启动子序列。在任何情况下，该启动子序列可以是诱导型或组成型表达的，使得HAI-1和HAI-2蛋白可控制地或组成型地产生。
再更优选地，给每个所述核酸分子提供分泌信号，借此在表达后，以分泌相关蛋白为目标，并因此可以从细胞培养基中收获表达产物。如果不采用这种分泌-表达系统，则，可替换地，通过使用常规方法从相关细胞系统中提取来纯化表达的蛋白。
根据本发明的再一方面，提供了用本发明的遗传构建体转化或转染的宿主细胞。
本发明的优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物来源的或细菌来源的或是酵母细胞系统。
本发明的另一方面中，提供了制备在此所述的组合物的方法，该方法包括：在宿主细胞中单独或一起表达HAI-1和HAI-2，并分离和/或纯化表达产物。
本发明再一备选的实施方案中，可以通过从合适的来源分离HAI-1和HAI-2来制备所述治疗组合物，在从单独的来源制备每种蛋白的情况下，为了提供治疗组合物，然后将分离的蛋白质混合在一起。
本发明还提供了治疗癌症的方法，该方法包括将在此所述的组合物给药于待治疗的个体。
本发明的优选方法中，所述待治疗的癌症是乳癌或前列腺癌，因此所述待治疗的个体是患有这些病症之一的患者。或者，待治疗的癌症是胎盘、肾脏、胰腺、GI道、睾丸或卵巢的癌症。
本发明备选的实施方案中，可以通过引起内源HAI-1和HAI-2的表达或优选超表达来进行本发明。这可以通过靶向这些基因的启动子来进行，以便确保该内源蛋白质被超表达。因此，用于该目的的工具可以包括遗传构建体，该构建体包含组成型或诱导型启动子，所述启动子的特征在于确保与其连接的基因以相对高的水平组成型或间歇地表达并确定地处于足以确保HAI-1和HAI-2的组合能有效治疗癌症的高水平，此外，使所述构建体适于与编码HAI-1和/HAI-2的核酸分子连接。
根据本发明的再一方面，提供了适于与编码HAI-1或HAI-2的核酸分子的至少一部分杂交的寡核苷酸，再更优选，提供了多个适于与HAI-1或HAI-2杂交的寡核苷酸。再更优选，为了制备HAI-1或HAI-2补给品用于生产在此所述的治疗组合物，提供了适于结合HAI-1或HAI-2的五引物和三引物寡核苷酸，以便获得HAI-1或HAI-2的有效扩增。
本领域技术人员清楚的是本发明提供的寡核苷酸包括能够结合编码HAI-1或HAI-2的野生型或重组DNA的寡核苷酸。
总而言之，我们目前的研究表明了HAI-1和HAI-2的组合是肿瘤生长的有效抑制剂，因此这些物质共同给药时在治疗癌症中具有特殊的用途。
根据本发明的再一方面，提供了针对HAI-1或HAI-2而产生的抗体。
根据本发明的抗体在提供促生长因子中具有特殊的用途。本领域技术人员从在此公开的内容将得知HAI-1和HAI-2的组合完全抑制了肿瘤生长，因此断定针对HAI-1或HAI-2而产生的抗体或抗体的组合在抑制这两种物质的活性中是有效的，因此促进细胞生长。因此得出的结论是在悬浮液中或更理想地在溶液中使用HAI-1和HAI-2的抗体，在促生长培养基的研发中具有特殊的用途。
因此根据本发明的再一方面，提供了促生长因子，包括针对HAI-1而产生的抗体和针对HAI-2而产生的抗体。
本发明的优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，或更优选是人源化单克隆抗体。
附图说明
现在通过以下的实施例并参照以下的附图来描述本发明，其中：
图1显示了具有相应cDNA的HAI-1(上部)和HAI-2(下部)的组构。由带有外显子编号的黑框来表示外显子的位置。还显示了对应于具有近似DNA大小的每个外显子的cDNA部分(摘自Itoh等，2000)。
图2显示了人HAI-1(A)和HAI-2(B)基因的5′侧翼区的核苷酸序列。从转录起始位点以负数来表示核苷酸残基。以垂直箭头来表示可能的转录起始位点，包括次要位点。由具有它们的名称的水平箭头来表示已知转录因子可能的结合位点。HAI-1在5’侧翼区中在加黑线所示的位置具有第一个内含子(摘自Itoh等，2000)；
图3(a)显示了pcDNA 4/HisMax-TOPO的图谱。该图显示了这种5.27kb载体的特征。克隆位点位于碱基1184-1185之间；
图3(b)显示了pCR-T7/VP-22-1-TOPO的图谱。该图概括了VP-22载体的特征。该载体为4.9kb大小，且克隆位点位于碱基597-598之间；
图4(a)显示了HAI-1和HAI-2消化和表达的详细情况。表示扩增的HAI-1和HAI-2靶序列的PCT产物分别在LN-CAP和ECV-304样品中最强烈/最纯净。将这些PCR产物直接用于TA克隆；
图4(b)用Hind III和Eco RV限制酶消化含有合适HAI插入片段(1&3)的纯化HisMax质粒来释放克隆的HAI序列(2&4)。(注释：Hind III至HAI序列＝275bp，Eco RV至HAI＝45bp，因此，额外的为0.32Kb)：
1.HisMax(5.27Kb)+HAI-1(0.8Kb)＝6.07Kb
3.HisMax(5.27Kb)+HAI-2(0.76Kb)＝6.03Kb
2.HAI-1(0.8Kb)+额外的0.32Kb＝1.12Kb
4.HAI-1(0.76Kb)+额外的0.32Kb＝1.08Kb；
图4(c)HAI-1和HAI-2的无细胞表达。含有HAI-1的HisMax载体产生了300个氨基酸(900bp)的蛋白质，其具有32.5kDa的分子量。用HAI-2产生了286个氨基酸(860bp)的蛋白质，为31kDa；
图5(a)显示了pRevTRE载体的图谱；
图5(b)显示了pRevTet-On载体的图谱；
图6显示了RevTet-On基因表达的机理。Tet效应元件(TRE)位于巨细胞病毒最小立即早期启动子(PCMV)的上游，它在缺乏激活时是沉默的。在强力霉素(Dox)存在下，反向四环素-控制的反式激活蛋白(rtTA)结合TRE，由此激活HAI转录；
图7显示了靶序列的扩增，使用pRevTRE、VP-22、HisMax或HAI引物(如表9.1中所示的)，产生了不同大小的PCR产物。例如，对于HAI-1，使用VP-22正向和反向引物，形成了1467bp(536+795+136)的产物。(注释：TE是特异性翻译增强子，而PH表示多组氨酸标记物的位置)；
图8(a)显示了Herculase系统扩增，使用HisMax和VP-22系列的引物(参见表9.1)。所产生的条带具有预期的大小(参见图9.3对于大小的解释)：
1.VP-22+HAI-1(672+795)＝1.47Kb
2.VP-22+HAI-2(672+759)＝1.43Kb
3.HisMax+HAI-1(220+795)＝1.02Kb
4.HisMax+HAI-2(220+759)＝0.98Kb
图8(b)显示了pRevTRE+HAI-1(HisMax)细菌菌落检查，使用pRevTRE系列的引物。产生了5个条带。预期大小(260bp+1.02Kb)＝1.28Kb；
图8(c)显示了pRevTRE载体内HAI-1序列正确取向的证实。使用了pRevTRE正向引物和HAI-1反向引物。以上5个菌落中只有1个含有正确整合至pRevTRE的HAI-1。预期大小(105+175+795)＝1.08Kb；
图8(d)显示了pRevTRE+HAI-2(VP.22)细菌菌落检查，使用pRevTRE引物系列。3个菌落产生了正确范围内的条带。预期大小(1.43Kb+260bp)＝1.69Kb；
图8(e)显示了pRevTRE载体内HAI-2正确取向的证实。用pRevTRE正向引物和HAI-2反向引物来检验。以上3个菌落中只有1个含有整合至pRevTRE载体的正确位置上的HAI-2。预期大小(105+536+759)＝1.4Kb；
图9(a)显示了β-肌动蛋白质量控制检查；
图9(b)显示了用于证实使用pRevTRE+HAI构建体转导MRC5成纤维细胞的pRevTRE引物系列；
图9(c)HAI-1引物系列显示了HAI-1只存在于用pRevTRE+HAI-1转导的MRC5细胞中；
图9(d)HAI-2引物系列显示了HAI-2以高水平存在于HAI-2转导的细胞中。野生型和HAI-1转导的成纤维细胞显示出非常细小的HAI-2条带；
图10(a)显示了从预先测序的DNA扩增靶序列的高保真PCR反应。由于校对酶的存在，这确保了DNA链的无误差扩增；
图10(b)显示了从预先测序的DNA扩增靶序列的高保真PCR反应。由于校对酶的存在，这确保了DNA链的无误差扩增；
图10(c)显示了用Sna B1酶打开Pic9载体。待插入的HAI DNA链具有用SnaB1和EcoRV酶修整的两个链末端。这些酶识别并切割DNA链上的特异性位点，形成可连接的平端。
图10(d)HAI连接到PIC9中。该连接方法需要称为T4 DNA连接酶的酶存在，这种酶催化在邻近核苷酸5’-磷酸酯与3’-羟基基团之间DNA两条链的连接；
图11(a)显示了构建体阳性菌落的鉴定。对20-30个细菌菌落使用了PCR来鉴定含有插入了HAI序列的PIC9的菌落。使用AOX系列的PIC9质粒引物：没有插入片段＝500bp而具有插入片段＝1300bp；
图11(b)显示了PIC9-HAI构建体的扩增、质粒纯化和消化。(1)纯化的质粒，(2)用Pme1和Not1消化的HAI-1和(3)用Pme1和Not1消化的HAI-2。其余的全部是插入片段取向检查；
图11(c)显示了用于扩增的合适菌落的转化，接着选择和随后的鉴定。阳性酵母克隆的选择；
图11(d)从酵母培养基收集重组HAI-1和HAI-2蛋白，并使用在实验室中研发的抗体来检测，接着扩增，诱导HAI-1蛋白分泌以及对HAI-1和HAI-2蛋白诱导进行蛋白质印迹分析；
图11(e)显示了用在实验室中研发的抗体检测的HAI-1和HAI-2蛋白的合成。
图12(a)是生物活性HGF/SF的生物测定分析；
图12(b)显示了MDCK生物测定；
图13(a)显示了共培养乳癌细胞侵入测定。将野生型和转导的MRC5成纤维细胞在24孔平板中培养，并用作HGF/SF的来源来增强MDA-MB-231乳癌细胞的侵入。与对照相比较，野生型成纤维细胞显著提高了侵入的程度。然而，转导的成纤维细胞产生的活性HGF/SF水平显著较低，如通过侵入的细胞数量的降低所显示的；
图13(b)显示了酵母HAI蛋白侵入测定；和
图14显示了在17天的时间段内肿瘤暴露于HAI-1、HAI-2或两者(■)的效果。
具体实施方式
人HAI的扩增
使用逆转录PCR从分离自正常人皮肤和人乳腺组织的RNA扩增人HAI-1和HAI-2 cDNA。使用直接DNA测序来证实这些产物的正确序列。
HAI表达盒的构建
将如此分离的HAI克隆至哺乳动物表达载体pCR3/His-Max中(参见图3)，然后将其用于分别转化哺乳动物细胞(pcDNA4/HisMax TOPO)或化学感受态大肠杆菌(pCRT/VP22-1-TOPO)。使用方向特异性PCR来证实DNA插入片段的存在和在细菌菌落中的方向。
使用DNA限制酶消化以上得到的表达盒(参见图4)。使用DNA提取试剂盒从琼脂糖凝胶提取和纯化DNA表达片段。使用T4 DNA连接酶(参见图8、9)将该片段插入逆转录病毒载体(参见图5、6、7)中，pRev-LXSN和pRev-TRE，使用相适的限制酶来相似地消化并纯化这些载体。将连接的产物用于转化大肠杆菌的JM109菌株，使该菌株本身变成了化学感受态的。相似地使用方向特异性PCR来证实插入片段的存在和方向。
细菌质粒的制备和癌细胞的转染
质粒在大肠杆菌中扩增后，使用质粒制备试剂盒提取并纯化质粒DNA。将编码HAI-1和HAI-2的纯化质粒电穿孔至CHO或乳癌细胞中，并使用G418抗生素来选择稳定转染的细胞。
逆转录病毒HAI储液的制备
首先在大肠杆菌中扩增pLXSN-HAI-1或HAI-2。提取和纯化后，将逆转录病毒质粒电穿孔至包装细胞系PT67中。用G418选择后获得产生逆转录病毒HAI-1或HAI-2的稳定转染的PT67。然后将这些细胞用于产生逆转录病毒储液，随后将其用于感染基质成纤维细胞，其中每天更换新鲜病毒储液将人成纤维细胞系MRC5连续感染3天。
用于HAI-1和HAI-2的酵母表达系统的研发
将HAI-1/HAI-2表达盒进行合适的修饰并使用T4 DNA连接酶重新插入酵母表达载体中(参见图10、11)。将连接的质粒用于转化大肠杆菌，如上已经给出的。相似地选择和扩增正确的菌落。使用电穿孔仪将纯化的质粒电穿孔至酵母菌株中，相似地选择并证实成功的菌落。
使酵母在补充了甲醇的酵母培养基中在特定条件下生长。建立适用于该菌株的最佳条件并用于随后扩增至更大的体积。
将酵母生长培养基在4℃离心。除去酵母后，使用超滤系统浓缩具有重组HAI-1或HAI-2的条件培养基，使其保留并浓缩特定大小的蛋白质。
HGF生物测定
我们使用了称为MDCK分散测定的HGF生物测定(参见图12A和12b)，依照我们的见解，这是测试HAI-1和HAI-2生物活性的最好方法。用重组HAI-1、HAI-2或其组合和MRC5细胞一起来处理产生小丛的MDCK细胞。还用MDCK细胞共培养了pLXSN/HAI-1或HAI-2转染的MRC5细胞。24小时后，借助使用结晶紫的染色来评定MDCK细胞的分散。
细胞迁移测定和细胞侵入测定
将两种方法用于评定成纤维细胞对癌细胞的作用，细胞迁移测定和体外测定，使用共培养系统。对于迁移测定，将癌细胞平板接种于室的底部并使其达到汇合。然后用针刺伤汇合的细胞。在系统的上部室中，加入逆转录病毒操纵的MRC5细胞(pLXSN-HAI-1或HAI-2)。然后使用延时视频来监视癌细胞伤口的迁移，使用Optimas的运动分析软件来计算迁移的速度。还用重组HAI-1、HAI-2、它们的组合、逆转录病毒操纵的MRC5细胞的上清液处理了癌细胞。相似地确定了细胞迁移(参见图13A和13B)。
在体外侵入测定中，将癌细胞加入预先涂敷了Matrigel的上部室中，向底部室中加入重组HAI-1、HAI-2、它们的组合、逆转录病毒操纵的MRC5细胞的上清液或MRC5细胞自身。3天后，评定细胞的侵入性。
使用蛋白质印迹分析检测HAI蛋白和抗HAI-1和HAI-2抗体的产生
我们首先合成了对人HAI-1和HAI-2具有特异性的短肽并与KLH缀合。随后使用标准程序将该缀合物注射至兔子中来产生单克隆抗体。发现纯化的抗体分别对人HAI-1和HAI-2是特异性的。将这些抗体用于测试来自以上系统的重组HAI-1和HAI-2的存在和数量。
重组HAI-1和HAI-2在肿瘤模型中的效果
将乳癌细胞MDA MD231或前列腺癌细胞PC-3皮下注射至无胸腺裸鼠(4-6周大，雌性)中，使用特定混合物来辅助肿瘤的生长。一周后，小鼠开始每日通过腹膜内途径接受浓缩的重组HAI-1、HAI-2或其组合。每周两次测量小鼠的肿瘤大小和体重(参见图14)。
结果
如图12和13中可以看出的，用HAI-1或HAI-2处理时，癌MRC5细胞已经降低了运动性和侵入性，但一起给予HAI-1和HAI-2时这得到了进一步的降低。
最后，图14显示了在小鼠肿瘤模型中腹膜注射重组HAI-1和/或HAI-2的结果。单独给予HAI-1和HAI-2的结果显示出微弱的肿瘤生长减少，而这些蛋白质的共同给予导致了肿瘤生长的绝对抑制。
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Claims (28)

1.一种治疗组合物，包含：
(a)包括HAI-1的分离的、纯化的或重组的多肽/蛋白质，或其功能活性片段，或与其至少80％同源的多肽/蛋白质；和
(b)包括HAI-2的分离的、纯化的或重组的多肽/蛋白质，或其功能活性片段，或与其至少80％同源的多肽/蛋白质。
2.根据权利要求1的治疗组合物，其中成分(a)和(b)以等量存在。
3.根据权利要求1的治疗组合物，其中成分(a)和(b)以不等量存在。
4.根据之前任一项权利要求的治疗组合物，其中还提供了合适的赋形剂或载体。
5.根据之前任一项权利要求的治疗组合物，其中该组合物适用于治疗癌症。
6.根据权利要求5的治疗组合物，其中癌症是以下的任何一种：乳癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胎盘癌、胃肠道癌、睾丸癌或卵巢癌。
7.一种治疗组合物，包含：
(a)分离的、纯化的或重组的核酸分子，其编码HAI-1或与其至少80％同源的蛋白质，或在严格杂交条件下与其结合的核酸分子；和
(b)分离的、纯化的或重组的核酸分子，其编码HAI-2或与其至少80％同源的蛋白质，或在严格杂交条件下与其结合的核酸分子。
8.根据权利要求7的治疗组合物，其中所述核酸分子是以下的任何一种：
DNA、RNA或重组构建体。
9.根据权利要求8的治疗组合物，其中将核酸分子掺入载体中。
10.根据权利要求7-9的治疗组合物，其中核酸分子包含提供所述蛋白质组成型或诱导型表达的相关启动子。
11.根据权利要求10的治疗组合物，其中HAI-1和HAI-2在相同启动子和/或转录因子的控制下，因此两者都得到组成型表达或诱导型表达。
12.根据权利要求10或11的治疗组合物，其中HAI-1和HAI-2的表达在可操作地连接HAI-1和HAI-2各自编码序列的单个启动子或相同启动子的控制下。
13.根据权利要求10的治疗组合物，其中编码HAI-1或HAI-2的每个核酸分子具有其自己的不同的启动子。
14.根据权利要求7-13的治疗组合物，其中所述编码HAI-1和HAI-2的核酸分子适于或经设计用于在选定的宿主系统中表达。
15.根据权利要求14的治疗组合物，其中所述宿主系统是哺乳动物的、细菌的或酵母。
16.根据权利要求7-15的治疗组合物，其中给编码HAI-1和/或HAI-2的分子提供分泌信号，借此在相关蛋白表达后，以分泌所述蛋白为目标。
17.用根据权利要求7-16的治疗组合物转化或转染的宿主细胞。
18.生产根据之前任一项权利要求的治疗组合物的方法，其中：
(a)用根据权利要求7-16的治疗组合物转化或转染的宿主细胞；
(b)在能够表达所述治疗组合物的条件下培养宿主细胞；和
(c)然后收集表达产物HAI-1和HAI-2。
19.根据权利要求18的方法，其中用根据权利要求16的治疗组合物转化或转染所述宿主细胞，因此该方法的步骤(c)涉及从细胞培养基中收集表达产物。
20.制备根据权利要求1-6的治疗组合物的方法，包括：(a)从合适来源的哺乳动物组织获得HAI-1和/或HAI-2蛋白，其中从单独的来源分离各个蛋白，将两种分离的产物混合在一起。
21.制备根据权利要求1-6的治疗组合物的方法，包括：
(a)在癌组织、癌前组织或邻近上述任一种组织的组织或在上述任一种组织的区域中启动、促进或提高HAI-1和HAI-2的内源表达。
22.根据权利要求21的方法，其中通过激活HAI-1和/或HAI-2基因的启动子来启动、促进或提高所述表达。
23.根据权利要求18-20的方法，其中为了增加HAI-1和/或HAI-2的产生，使用常规技术进一步扩增编码HAI-1和/或HAI-2的核酸分子。
24.用于根据权利要求23的方法中的引物。
25.治疗癌症的方法，包括将根据权利要求1-16的治疗组合物给药于待治疗的个体。
26.针对根据权利要求1-6的治疗组合物的HAI-2成分或HAI-1、HAI-2成分的组合而产生的抗体。
27.促生长培养基，包含针对HAI-1而产生的抗体和针对HAI-2而产生的抗体。
28.促生长因子，包含针对对抗HAI-1而产生的抗体和针对HAI-2而产生的抗体。
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