MD705Z

MD705Z - Procedeu de multiplicare microclonală a viţei-de-vie

Info

Publication number: MD705Z
Application number: MDS20130071A
Authority: MD
Inventors: Светлана СМЕРЯ; Лариса АНДРОНИК; Анатол РОТАРУ
Original assignee: Институт Генетики И Физиологии Растений Академии Наук Молдовы
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2014-07-31
Also published as: MD705Y

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologiile agricole şi poate fi utilizată pentru multiplicarea microclonală a viţei-de-vie.Procedeul, conform invenţiei, constă în aceea că se selectează lăstari cu lungimea de 6…10 cm, se spală, se clătesc în apă curgătoare, se sterilizează, se excizează apexuri cu mărimea de 0,5…1,0 mm, ce conţin meristeme cu 2…3 frunzuliţe primordiale, care se inoculează în mediul nutritiv Murashige-Skoog suplimentat cu 5 µM de 6-benzilaminopurină, 0,5 µM de acid naftalinacetic, 2% de zaharoză, 0,7% de agar, având pH-ul 5,7; după 2…3 săptămâni de la inoculare apexurile se iradiază în regim periodic, timp de 20…25 min, cu unde milimetrice de intensitate joasă cu lungimea de undă de 5,6 mm şi frecvenţa de 53,8 GHz, după ce regeneranţii proliferează şi se dezvoltă ei se transferă pe mediul Murashige-Skoog, se subcultivă pe parcursul a 6…7 cicluri şi se efectuează microbutăşirea lor in vitro, regeneranţii cu 3…4 internoduri se transferă pe mediul Murashige-Skoog suplimentat cu 0,4 µM de acid naftalinacetic, apoi regeneranţii cu sistem radicular bine dezvoltat se transferă în amestec de sol şi turbă, iar ulterior pe substrat de sol.

Description

Invenţia se referă la biotehnologiile agricole şi poate fi utilizată pentru multiplicarea microclonală a viţei-de-vie.

Recunoscând cerinţele de certificare a materialului săditor la viţa-de-vie, metodele de multiplicare microclonală a plantulelor de viţă-de-vie capătă o aplicabilitate în practică. Tehnica dată este justificată prin eficienţă şi beneficiul economic. Multiplicarea microclonală se aplică în propagarea rapidă a materialului devirusat sau a formelor reprezentate prin exemplare unice, permiţând crearea într-un interval scurt de timp a unui număr suficient de plantule pentru crearea de plantaţii-mamă.

Este cunoscut procedeul de multiplicare microclonală a plantulelor de viţă-de-vie, care cuprinde şase etape: 1- selectarea lăstarului, 2- inocularea in vitro a apexului, 3- obţinerea regeneranţilor, 4- subcultivarea şi microbutăşirea in vitro, 5- înrădăcinarea regeneranţilor, 6- adaptarea ex vitro şi transferul în substrat de sol a plantulelor. Conform celei mai apropiate soluţii pentru multiplicarea in vitro a viţei-de-vie se selectează lăstari în perioada iunie-iulie, care se spală în soluţie apoasă de 0,1% Tween 20 şi se sterilizează în soluţie de 1,2% hipoclorit de sodiu timp de 10 min, după care se spală şi se clătesc în apă sterilă; apexurile cu mărimea de 0,5…1 mm (ce conţin 2…4 frunzuliţe primordiale) se excizează şi se inoculează pe mediul nutritiv Murashige- Skoog (1962) suplimentat cu 5µM 6-benzilaminopurină (BAP), 0,5µM acid naftalinacetic (ANA); la 6…8 săptămâni de cultivare regeneranţii ce deţin 3…4 internoduri (cu o lungime de 1,5 cm) sunt butăşiţi, iar fiecare fragment este subcultivat pe durata a 3…6 săptămâni până la formarea de noi regeneranţi, procedura fiind repetată până la 6 cicluri de subcultivare; pentru inducerea rizogenezei regeneranţii obţinuţi sunt transferaţi pe mediul nutritiv Murashige-Skoog suplimentat cu 0,4 µM ANA, iar după formarea rădăcinilor, plantulele se transferă în substrat autoclavat constituit din sol:turbă [1].

Însă acest procedeu are şi dezavantaje, determinate de rata de multiplicare redusă după primele 3…4 pasaje. Ponderea mai sporită de reproducere a microbutaşilor se atestă după pasajul 6, care corespunde duratei de cca 333 zile de cultivare in vitro, ceea ce este urmat de cheltuieli majore suplimentare, totodată există riscul inducerii variaţiilor somaclonale generate pe durata îndelungată de subcultivare în condiţii in vitro.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în mărirea ratei de plantule obţinute de la o clonă după primele pasaje de cultivare in vitro (3…4 subcultivări).

Esenţa procedeului nou de majorare a ratei de plantule de viţă-de-vie obţinute de la o microclonă constă în aceea că se selectează lăstari cu lungimea de 6…10 cm, se spală, se clătesc în apă curgătoare, se sterilizează, se excizează apexuri cu mărimea de 0,5…1,0 mm, ce conţin meristeme cu 2…3 frunzuliţe primordiale, care se inoculează în mediul nutritiv Murashige & Skoog suplimentat cu 5 µM de 6-benzilaminopurină, 0,5 µM de acid naftalinacetic, 2% de zaharoză, 0,7% de agar, având pH-ul 5,7; după 2…3 săptămâni de la inoculare apexurile se iradiază în regim periodic, timp de 20…25 min, cu unde milimetrice de intensitate joasă cu lungimea de undă de 5,6 mm şi frecvenţa de 53,8 GHz, după ce regeneranţii proliferează şi se dezvoltă ei se transferă pe mediul Murashige & Skoog, se subcultivă pe parcursul a 6…7 cicluri şi se efectuează microbutăşirea lor in vitro, regeneranţii cu 3…4 internoduri se transferă pe mediul Murashige-Skoog suplimentat cu 0,4 µM de acid naftalinacetic, apoi regeneranţii cu sistem radicular bine dezvoltat se transferă în amestec de sol şi turbă, iar ulterior pe substrat de sol.

Noutatea invenţiei constă în utilizarea undelor milimetrice de intensitate joasă pentru mărirea ratei de multiplicare a plantelor de viţă-de-vie derivate de la o clonă.

Rezultatul invenţiei rezidă în posibilitatea obţinerii în urma a 3 subcultivări conform invenţiei a 321 lăstari, iar conform celei mai apropiate soluţii se obţin 120 lăstari, ceea ce denotă sporirea ratei de microbutăşire de 1,53…3,26 ori pentru soiurile analizate ale speciei Vitis vinifera, precum şi mărirea numărului de plantule într-un interval de timp mai scurt, astfel reducându-se cheltuielile aferente acestei proceduri.

Exemplu de realizare a invenţiei

Pentru micropropagarea in vitro au fost selectate 6 genotipuri de viţă-de-vie de interes ameliorativ aflate în Colecţia Institutului Ştiinţifico-Practic de Horticultură şi Tehnologii Alimentare: 1-15-15, 1-5-71, Apiren roz, Apiren extratimpuriu, Gen Moldova şi Prezentabil.

De la tufele genotipurilor de viţă-de-vie selectate în perioada creşterii intensive (iunie-iulie) au fost preluaţi lăstări (6…10 cm), care au fost spălaţi în soluţie apoasă de 0,1% Tween 20 şi clătiţi în apă curgătoare timp de 15 min.

Pentru aseptizare, fragmentele de lăstari au fost plasate pentru 2…3 s în etanol de 70% şi ulterior trecute în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% pentru 5…7 min, apoi clătite în 3 băi de apă sterilă, a câte 5 min fiecare, pentru înlăturarea totală a clorului.

Toate operaţiunile de sterilizare a lăstarilor, precum şi excizarea apexurilor cu mărimea de 0,5…1 mm (ce conţin meristeme cu 2…3 frunzuliţe primordiale) şi inocularea lor pe medii de cultură s-au desfăşurat în condiţii aseptice, în interiorul hotei cu flux laminar de aer steril. Vitrocultura a fost iniţiată în eprubete, conţinând câte 2 ml de mediul nutritiv Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu BAP (5 µM), ANA (0,5 µM), 2% zaharoză şi 0,7% agar, care s-a dovedit a fi optim pentru toate genotipurile analizate (tab. 1). Valoarea pH-ului mediului nutritiv a fost ajustată înainte de autoclavare la 5,7. Pentru inducerea regenerării eprubetele au fost incubate în condiţii controlate cu o fotoperioadă de 16 ore-lumină, la temperatura de 27°C şi iluminarea de 2000 lx. La 2…3 săptămâni de la inoculare, după stabilirea răspunsului pozitiv apexurile au fost iradiate timp de 20…25 min cu unde milimetrice de intensitate joasă cu lungimea de undă λ=5,6 mm şi frecvenţa de 53,8 GHz în regim periodic emise de dispozitivul „Iavi-1” (densitatea fluxului 1...10 mW/cm2). După tratare apexurile au fost replasate în camera de cultivare în aceleaşi condiţii controlate.

Schema multiplicării microclonale a viţei-de-vie este prezentată în figură, unde: 1 - selectarea lăstarului, 2 - inocularea in vitro a apexului, 3 - iradierea cu unde milimetrice, 4 - obţinerea regeneranţilor, 5 - subcultivarea şi microbutăşirea in vitro, 6 - înrădăcinarea regeneranţilor, 7 - adaptarea ex vitro şi transferul în substrat de sol al plantelor.

În primele 25…35 zile de la inoculare s-a atestat proliferarea şi dezvoltarea regeneranţilor, care ulterior au fost transferaţi pe medii nutritive pentru multiplicare (tabelul 1) în vase Magenta ce conţineau 10…12 ml mediu. La fiecare 4…5 săptămâni lăstăraşii ce deţineau 3…4 internoduri au fost butăşiţi şi inoculaţi pe medii nutritive proaspete pentru multiplicare, fiind realizate până la 6…7 cicluri de subcultivare. Plantulele cu 3…4 internoduri rezultate din fiecare ciclu de subcultivare au fost transferate pentru rizogeneză pe mediul Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu ANA (0,4 µM). La 6…7 zile după pasajul pe acest substrat regeneranţii care prezentau un sistem radicular cu perişori absorbanţi bine dezvoltaţi au fost transferaţi în vase de plastic de 500 ml cu amestec de sol:turbă (1:3). Vasele cu regeneranţi au fost acoperite cu peliculă de polietilenă şi transferate în camera de cultivare la 25…27°C şi la iluminarea de 2000 lx cu o fotoperioadă de 16 ore-lumină. La apariţia a 2…3 frunzuliţe noi plantulele au fost transferate în substrat de sol conform tehnicilor standarde.

Tabelul 1

Compoziţia mediului nutritiv folosit pentru proliferarea in vitro a plantulelor de viţă-de-vie

Nr MS (Murashige-Skoog, 1962) Componentele mediului Cantitatea (mg/l) Cantitatea (µM) Macroelemente 1 KNO3 1900 18,8 2 NH4NO3 1650 20,6 3 CaCl2 * 2H2O 440 3,0 4 MgSO4 * H2O 370 1,5 5 KH2PO4 170 1,25 6 FeSO4 * 7H2O 28 0,1 7 Na2EDTA 37 0,1 Microelemente 8 MnSO4 * 4H2O 22,3 100,0 9 H3BO3 6,2 100,0 10 ZnSO4 * 7H2O 8,6 30,0 11 KI 0,83 5,0 12 Na2MoO4 * 2H2O 0,25 1,0 13 CuSO4 * 5 H2O 0,025 0,1 14 CoCl2 * 6H2O 0,025 0,1 Vitamine 15 Mioinozitol 100 55,5 16 Tiamină (B1) 0,5 3 17 Piridoxină (B6) 0,5 5 18 Ac. nicotinic (PP) 0,5 8 Alţi factori 19 Zaharoză 2% 20 Agar 0,7% pH 5,7

Conform rezultatelor obţinute, aplicarea schemei de multiplicare cu utilizarea undelor milimetrice, comparativ cu cea de referinţă, a condus la reducerea nesemnificativă a numărului de explante care au supravieţuit sau la majorarea acestora (tab. 2). Pentru cele 6 genotipuri analizate procentul explantelor ce au format lăstăraşi a variat în varianta de referinţă de la 8,39 la Apiren extratimpuriu până la 46,04 pentru genotipul 1-1-15. Potrivit datelor expuse în sursa de referinţă, reacţia de răspuns a explantelor la condiţiile de cultivare in vitro şi numărul de lăstăraşi formaţi sunt dependenţi prioritar de genotip, ceea ce este confirmat şi de rezultatele obţinute.

Tabelul 2

Proliferarea lăstăraşilor de viţă-de-vie în condiţii in vitro

Genotip Varianta experimentală Numărul de apexuri inoculate Explante supravieţuite (număr) Explante cu lăstăraşi (%) Număr de lăstăraşi/explant 1-15-15 martor 21 19 46,04 5,98 unde milimetrice 18 17 75,00 9,88 1-5-71 martor 16 14 38,89 5,67 unde milimetrice 12 11 52,78 27,83 Gen Moldova martor 40 37 23,99 2,64 unde milimetrice 31 29 55,83 3,92 Apiren Roz martor 13 12 16,67 1,00 unde milimetrice 13 12 25,00 2,75 Apiren extratimpuriu martor 25 24 8,39 2,00 unde milimetrice 19 18 18,83 9,75 Prezentabil martor 9 8 25,00 1,00 unde milimetrice 14 14 27,50 3,50

Iradierea apexurilor a contribuit la sporirea semnificativă a cotei explantelor cu lăstăraşi. Cea mai mare creştere a fost atestată la soiul Apiren extratimpuriu, fiind remarcată o sporire de 2,24 ori, iar cea mai mică influenţă a fost înregistrată la soiul Prezentabil (o creştere cu 10%).

De asemenea, la toate cele 6 genotipuri de viţă-de-vie cercetate a fost constatată o majorare semnificativă a numărului de lăstăraşi derivaţi de la un explant. Potenţa creşterii acestui indice a fost cuprinsă între 1,48 pentru soiul Gen Moldova şi 4,91 la genotipul 1-5-71.

Factorul aplicat conform invenţiei (undele milimetrice de intensitate joasă) deţine o putere de influenţă de 11,4 %, ceea ce corespunde unor diferenţe semnificative (tab. 3).

Tabelul 3

Analiza variaţiei numărului de lăstăraşi per explant

Sursa variaţiei Suma pătratelor Grade de libertate Dispersia Test F Puterea de influenţă, % Genotip (A) 930,348 5 186,07 3,90** 30,87 Unde milimetrice (B) 343,904 1 343,904 7,20* 11,41 Interacţiunea AB 501,2 5 100,24 2,10 16,63 Rezidual 1242,03 26 47,7704 Total 3014,04 37

**; *- diferenţe semnificative pentru P≤ 0,01 şi P≤ 0,05

Deosebiri semnificative între rezultatele obţinute conform celei mai apropiate soluţii şi invenţiei propuse se constată între numărul de lăstăraşi per explant în corespundere cu ciclul de subcultivări (tab. 4).

Dacă la martor potenţa de multiplicare se atestă după ciclul trei de subcultivare în condiţii in vitro, iradierea cu unde de intensitate joasă a explantelor a dus la obţinerea unui spor al numărului de lăstăraşi după prima subcultivare, eficienţa de multiplicare fiind cea mai mare după ciclul 2…3 de subcultivare.

Accelerarea multiplicării este însoţită de asemenea de o rată majoră de reproducere microclonală, ca rezultat se obţine un număr sporit de lăstăraşi într-un interval de timp mai redus.

Reducerea duratei de subcultivare în condiţii in vitro este însoţită de diminuarea semnificativă a cheltuielilor legate de costul componentelor mediului nutritiv de cultivare, condiţiile de întreţinere, numărul de zile-om lucrătoare, totodată preîntâmpină riscul inducerii variaţiilor somaclonale şi vitrifierii culturii, ceea ce poate fi remarcat pe măsura creşterii duratei de aflare în condiţii in vitro.

Tabelul 4

Proliferarea lăstăraşilor cu 3 şi mai multe internoduri în corespundere cu ciclul subcultivării în condiţii in vitro

Ciclul subcultivării Numărul de lăstăraşi per explant Gen Moldova 1-5-71 1-15-15 martor unde milimetrice martor unde milimetrice martor unde milimetrice Prima multiplicare - 1 - - 0,67 1 I subcultivare 0 4 0 12,33 0 8 II subcultivare 0 4,33 0 19,67 0 14,75 III subcultivare 1,33 4,33 1 12,33 1,33 10,5 IV subcultivare 2,33 - 4,33 15 4,25 4 V subcultivare 3 - 5,5 - 2,5 - VI subcultivare 7 - 2 - 2 - VII subcultivare 3 - - - 1 -

În corespundere cu rezultatele obţinute efectul factorului aplicat se remarcă atât prin accelerarea multiplicării, cât şi prin sporirea ratei de reproducere microclonală. Astfel, dacă la variantele martor valoarea coeficientului de multiplicare microclonală a variat între 2,38 şi 3,63 la genotipurile Gen Moldova şi 1-5-71, atunci ca rezultat al iradierii cu unde milimetrice s-a constatat majorarea acestui indice până la 4,2 şi 14,8 respectiv la aceleaşi genotipuri (tab. 5).

Tabelul 5

Potenţa teoretică a procedeului de multiplicare microclonală a viţei-de-vie

prin cultivare in vitro

Ciclul subcultivării Zile de cultivare Numărul de lăstăraşi cu 3 şi mai multe internoduri Gen Moldova 1-5-71 1-15-15 martor unde milimetrice martor unde milimetrice martor unde milimetrice Explante subcultivate 13 15 8 10 9 12 Coeficientul de multiplicare 2,38 4,2 3,63 14,8 2,77 10,75 Explante multiplicate * 18 28 45 15 31 90 I subcultivare* 60 32,9 78,4 204,3 222 95,5 806,4 II subcultivare * 90 60,3 219,5 927,5 3285,6 294,1 7225,3 III subcultivare* 120 110,3 614,7 4210,9 48626,9 905,8 64739,1 IV subcultivare* 150 201,9 1721 19117,7 719677,8 2789,8 580062,2 V subcultivare* 180 369,4 4818,9 86794,4 10651231,8 8592,4 5197357,1 VI subcultivare* 210 676,1 13492,9 394046,7 157638230,6 26464,6 46568319,7

* - potenţa teoretică de multiplicare raportată la zece regeneranţi subcultivaţi

În baza rezultatelor obţinute putem constata că potenţa de multiplicare microclonală, conform invenţiei, ar putea permite obţinerea pe parcursul a 6 subcultivari a unui număr de zeci şi mii de ori mai mare decât schema de referinţă (la Gen Moldova de 19,9 ori, genotipul 1-5-71 - de 400, iar la genotipul 1-15-15 - de peste 1759 ori).

Din punct de vedere practic procedeul este mai eficient în scopul accelerării multiplicării după 3…4 subcultivări, ceea ce este asigurat de un număr suficient de clone pentru fondarea unor plantaţii-mamă de viţă-de-vie pentru soiurile de interes ameliorativ.

1. Chee R., Pool R. M. and Bucher D. A method for large scale in vitro propagation of Vitis. New York's food and life sciences bulletin. Nr. 109, 1984, p.1-9

Claims

Procedeu de multiplicare microclonală a viţei de vie care constă în aceea că se selectează lăstari cu lungimea de 6…10 cm de la plante în perioada creşterii lor intensive, se spală cu soluţie apoasă de 0,1% de Tween 20, se clătesc în apă curgătoare timp de 15 min, se sterilizează în etanol de 70% timp de 2…3 s şi în soluţie de hipoclorit de sodiu de 5,2% timp de 5…7 min, apoi se clătesc de 3 ori cu apă sterilă, a câte 5 min fiecare, în condiţii aseptice se excizează apexuri cu mărimea de 0,5…1,0 mm, ce conţin meristeme cu 2…3 frunzuliţe primordiale, care se inoculează în eprubete ce conţin 2 ml de mediu nutritiv Murashige-Skoog suplimentat cu 5 µM de 6-benzilaminopurină, 0,5 µM de acid naftalinacetic, 2% de zaharoză, 0,7% de agar, având pH-ul 5,7, şi se cultivă în condiţii de iluminare de 2000 lx, timp de 16 ore, la temperatura de 27°C, după 2…3 săptămâni de la inoculare apexurile se iradiază în regim periodic, timp de 20…25 min, cu unde milimetrice de intensitate joasă cu lungimea de undă de 5,6 mm şi frecvenţa de 53,8 GHz, apoi apexurile se plasează în camera de cultivare, după ce regeneranţii proliferează şi se dezvoltă ei se transferă pe mediul Murashige-Skoog, se subcultivă pe parcursul a 6…7 cicluri şi se efectuează microbutăşirea lor in vitro, regeneranţii care posedă 3…4 internoduri se transferă pe mediul Murashige-Skoog suplimentat cu 0,4 µM de acid naftalinacetic, apoi cei cu sistem radicular bine dezvoltat se transferă în vase care conţin amestec de sol şi turbă în raport de 1:3, vasele se plasează în camera de cultivare la temperatura de 25…27 °C în condiţii de iluminare de 2000 lx timp de 16 ore, ulterior se transferă plantulele pe substrat de sol.