MD4898C1 - Compoziţie, în particular o compoziţie farmaceutică preventivă şi curativă pe bază de peroxometalat - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un amestec sau o compoziţie, de preferinţă terapeutic activă administrată topic, care conţine cel puţin o sare a unui metal, unde metalul este selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin o sursă de radicali de peroxidare; cel puţin un agent tampon; precum şi la compoziţii farmaceutice, formate din acest amestec sau conţinându-l, metode de producere şi aplicare a acestuia, şi anume pentru o metodă de tratament terapeutic a unei infecţii virale, în particular implicând un virus din familiaHerpesviridae, sau ca un antiinflamator.

Description

Prezenta invenţie se referă la un amestec activ într-un tratament terapeutic, amestecul menţionat conţinând un peroxometalat, precum de exemplu un peroxomolibdat şi/sau, ca de exemplu un peroxolantanat.

În particular, prezenta invenţie se referă la un amestec activ pentru tratamentul preventiv şi curativ al infecţiilor cuHerpesviridaeşi în particular, al infecţiilor cuHerpes simplex1 (HSV-1 sau HHV-1) şi cuHerpes simplex2 (HSV-2 sau HHV-2). Prezenta invenţie de asemenea se referă la compoziţii farmaceutice conţinând un astfel de amestec activ, la metodele de preparare precum şi la utilizările sale, în particular cu scopul unui tratament terapeutic.

Stadiul anterior

Printre patologiile infecţioase, cele datorate viruşilor, în plus la gravitatea lor variabilă în funcţie de tipul lor, care pot conduce chiar la moartea pacientului, şi cu o rată a morbidităţii foarte inegală în funcţie de populaţie şi de vremuri, prezintă o problemă terapeutică majoră. Acest agent cauzal necesită o celulă gazdă metabolismul şi constituenţii căreia îi foloseşte pentru multiplicare, de unde dificultatea iradierii prin tratamentul respectiv al ţesutului sănătos în raport cu unul infectat, sau chiar un tratament preventiv.

Printre infecţiile virale care pot afecta oamenii, cele cuHerpesviridaesunt curente, extrem de contagiose şi endemice. Această familie de viruşi cu ADN constă din opt tipuri de viruşi. Printre aceştia, HHV-1 sau HSV-1 şi HHV-2 sau HSV-2 sunt responsabili pentru herpes orofacial-labial şi vaginal-anal.

Toţi viruşii de herpes, prezintă proteinele clinice şi proprietăţile structurale ale genomului precum latenţa, recurenţa sau activarea litică. Ca şi în cazul tuturor infecţiilor virale, mijloacele terapeutice sunt complexe şi frecvent limitate. Invenţia este destinată să soluţioneze problema tehnică ce constă în furnizarea unei compoziţii farmaceutice oferind posibilitatea de a acţiona împotriva unei infecţii virale, în special a unei infecţii virale implicândHerpesviridaeşi în particular HSV-1 şi HSV-2.

Infecţiile cu HSV-1 şi HSV-2 sunt foarte contagioase (în special prin contact) şi endemice (Organizatia Mondială a Sănătăţii (OMS), Ianuarie 2016, "The herpes viruses", memorandum No. 400, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs400/fr/#). Sursa este omul, fără nicio zoonoză sau orice vector. Prevalenţa infecţiilor HSV-1 responsabile pentru herpesul orofacial-labial, pentru anumite forme de herpes genital şi a paronichiei herpetice, este variabilă în funcţie de continente, metode şi posibilităţi de diagnostic. Ea este estimată să fie în medie de la 84 la 99% în Africa, de la 50 la 100% în Asia, de la 65 la 98% în Europa şi de la 57 la 68% în America de Nord. Prevalenţa infecţiilor cu HSV-2, responsabile pentru herpesul genital şi anal, este variabilă în funcţie de gen, profilul etnic şi sociologic, vârsta şi continent. De exemplu (Centrul pentru prevenirea şi controlul deceselor (CCD). MMW R Morb Mortal Wkly Rep., no 59(15), 2010, p. 456-459), seroprevalenţa în Statele Unite pentru intervalul de vârstă de la 40 la 49 de ani este estimată să fie 32% la femei şi 20% la bărbaţi.

Luând în considerare rata de morbiditate, infecţiile HSV-1 şi HSV-2 au un anumit impact social mondial. Într-adevăr, nici un tratament curativ total eficient nu există în ceea ce priveşte eradicările, dacă administrarea medicamentelor antivirale este per os sau pe cale parenterală, dacă aceasta este un analog pirofosfat (foscarnet, de exemplu), analogi nucleozidelor neactivabile sau activabilein situ(precum fiacitabin, vidarabin, aciclovir şi promedicamentul lor valaciclovir, de exemplu) sau a unui inhibitor al complexului enzimatic helicaz-primazic (pritelivir). Ei contribuie la reducerea seriozităţii şi frecvenţei simptomelor, dar nu iradiază infecţia. Cel mai des, conform solubilităţii joase a acestor molecule şi în particular cele ale familiei «ciclovir» (1,3 mg/mL în apă la 25°C pentru aciclovir) precum şi a absorbţiei lor intestinale limitate (este de ordinul 20% pentru aciclovirper os), doze consecvente trebuie să fie administrate la pacienţi.

Spre deosebire de medicamentele topice oftalmice, substanţele anti-HSV folosite în dermatologie (precum ciclofovir, ibacitabin, aciclovir, de exemplu) au eficienţă clinică care rămâne modestă şi nu constantă.

În plus, formele achiziţionate de rezistenţe la viruşi deHerpes simplexla tratamente convenţionaleper ossau pe cale parenterală sunt descrise în creştere. Ele sunt cele mai des conectate la mutaţiile genomului viral [1] (Bisa fost S. et al., Antiviral Res., vol. 80(1), 2008, p. 81-85).

În plus la dimensiunile infectării, durerii şi aspectului inestetic recurent al pacientului pe durata reactivării virale, aceste infecţii pot deveni complicate prin patologii serioase şi complexe deşi rămân destul de rare, precum encefalita herpetică sau cheratita. Contaminarea neonatală maternală poate fi 60% mortală în absenţa tratamentului. Infecţiile herpetice şi dezvoltarea lor poate fi asociată cu alte patologii din cauza imunodepresiei, de fapt, (fie indusă sau patologică) sau imunosupresiei pacientului precum de exemplu, în cazul unor cancere sau după o grefă. HSV-2 este parte din cele mai frecvente infecţii (de la 60 la 90%) printre persoanele purtătoare HIV. Riscul contactului unei infecţii noi HIV este înmulţit la trei în prezenţa unei infecţii HSV-2. Purtătorii ambelor infecţii au un risc mai înalt de transmitere a HIV-ului.

Din acest motiv obiectul invenţiei este să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei metode de prepararea a unei astfel de compoziţii farmaceutice.

Obiectul invenţiei este de asemenea să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care este topic acceptabilă.

Obiectul invenţiei este de asemenea să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care este uşor solubilă în solvenţi hidrofilici.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active pe durata pasaj trans-epidermal.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice care este dezactivată pe durata pasajului trans-cutanat.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice, biofaza căreia este bine delimitată şi atinsă.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice pentru care biodisponibilitatea este minimă.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active având un efect anti-replicant asupra unui virus, şi în particular asupra HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active având citotoxicitate înaltă pentru celulele infectate cu un virus, şi în particular cu HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active având citotoxicitate mică pentru celulele sănătoase.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care are o eficienţa profilactică şi în particular pentru HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care are o eficienţa profilactică în special pe durata fazei prodromice a infecţiei şi în particular pentru HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care are eficienţa profilactică în special prin scurtarea fazei acute şi în particular pentru HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active care poate preveni sau limita procesul infecţios şi în particular cel al HSV.

Obiectul invenţiei este în plus să rezolve problema tehnică ce constă în oferirea unei compoziţii farmaceutice active având stabilitate bună pe durata păstrării sale la temperatura camerei şi până la 45°C.

Descrierea invenţiei

Inventatorii au descoperit, că a fost posibil să rezolve problemele tehnice menţionate mai sus prin oferirea unei compoziţii sau unui amestec terapeutic activ pentru cale topică, conţinând cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin o sursă de radicali de peroxidare; cel puţin un agent tampon;

unde compoziţia sau amestecul are un potenţial redox de la 250 la 550 milivolţi; sau un potenţial redox de la 300 la 450 milivolţi şi chiar mai de preferinţă de la 300 la 420 milivolţi.

Prin „farmaceutic activ” se subînţelege faptul că amestecul sau compoziţia au o activitate benefică cu scopul unui tratament terapeutic.

Termenul de „amestec” se referă la o compoziţie şi nu limitează compoziţia pe care o desemnează la un preparat particular sau metodă de preparare. Termenul de „amestec” aici oferă posibilitatea de a distinge mai uşor din punct de vedere semantic „amestecul” de „compoziţie” în particular când de exemplu „amestecul” este integrat într-o «compoziţie» care include alţi ingredienţi.

Invenţia mai exact se referă conform unui prim aspect, la o compoziţie sau amestec, de preferinţă terapeutic activ printr-o cale topică, conţinând:

- cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), volfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan;

- cel puţin un agent de chelare;

- cel puţin o sursă de radicali de peroxidare;

- cel puţin un agent tampon,

unde amestecul sau compoziţia specificată are un potenţial redox de la 250 la 550 milivolţi.

Invenţia se referă în mod avantajos la o compoziţie sau amestec, de preferinţă terapeutic activ prin calea topică, conţinând:

- cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind ales dintre molibden (Mo), volfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan;

- cel puţin un agent de chelare;

- cel puţin o sursă de radicali de peroxidare;

- cel puţin un agent tampon;

- amestecul menţionat sau compoziţia de preferinţă având un potenţial redox de 250 la 550 milivolţi, şi de preferinţă 300 la 450 milivolţi şi din nou de preferinţă 300 la 420 milivolţi.

Amestecul conform prezentei invenţii oferă avantajos posibilitatea de a forma un medicament, şi mai exact un medicament stabil şi activin situ.

Amestecul conform prezentei invenţii constă într-un echilibru al compusului menţionat mai sus, formând avantajos un complex peroxometalic inclusiv sărurile sale. Conform inventatorilor, fără a avea intenţia de a fi legat de teorie, amestecul conform prezentei invenţii oferă posibilitatea de a forma o structură supermoleculară de tip zăbrele într-un echilibru stabil nepermanent, care oferă posibilitatea de promovare la nivelul extracelular şiin situa unui catalizator pentru reacţii precum Fenton şi Haber-Weiss. Aceste reacţii se spune că sunt „precum” când ele au loc din cauza metalului din amestecul din invenţie sau din cauza altui metal care nu este fierul. O porţie de substanţă reactivă generată extemporaneu prin substanţa activă ce penetrează celula, şi mai avantajos celula infectată.

Conform unei variante compoziţia include mai multe săruri de metale, metalul fiind ales dintre molibden (Mo), volfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan.

În funcţie de metoda de producere, sarea metalului este o sare a molibdenului sau conţinând molibden.

Conform unei metode de producere, sarea metalului este sarea lantanidei sau conţinând o lantanidă.

Conform unei metode de producere, sarea metalului este un amestec a unei sări a molibdenului şi a unei sări a lantanidei.

Invenţia se referă în mod avantajos la o compoziţie sau amestec, de preferinţă terapeutic activă prin calea topică, conţinând:

- cel puţin o sare de molibden (Mo), opţional în combinaţie cu cel puţin o sare a unui metal ales dintre volfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan;

- cel puţin un agent de chelare;

- cel puţin o sursă de radicali peroxidanţi;

- cel puţin un agent tampon;

- amestecul menţionat sau compoziţia de preferinţă având un potenţial redox de 250 la 550 milivolţi, şi de preferinţă 300 la 450 milivolţi şi din nou de preferinţă 300 la 420 milivolţi.

De preferinţă, sarea metalului este prezentă ca oxid(oxizi) sau peroxid(peroxizi) într-un amestec. Avantajos, oxizii metalici a amestecului din invenţie oferă posibilitatea de a forma un intermediar care este un metal acid, şi mai exact un acid Lewis.

Conform unei alternative, este preferat un compus metalic pentru care gradul de oxidare a metalului este compatibil cu reacţia «precum» Fenton-Haber-Weiss şi Fenton-Haber-Weiss (o reacţie de oxido-reducere care implică alţi ioni metalici precum fierul, care, în cazul nostru, este într-un context de chelare) metastabil, adică, în special metale de tranziţie şi în particular Mo(VI), W(IV) la (VI), V(III) la (V), Au(I) la (III).

Conform unei alternative, un compus lantanic este preferat care poate forma un oxid hexavalent de tip LnO3, pentru care gradul de oxidare este compatibil cu metastabilul Fenton-Haber-Weiss şi Fenton-Haber-Weiss «precum» şi în particular La(III), Ce(III) şi (IV), Nd(III) şi (IV), Sm(III) şi (IV), Gd(IV).

Avantajos, metalul din metalat este de valenţă maximă.

Avantajos, metalul este oxidat până la gradul său maxim de oxidare.

Conform unei alternative preferate, sarea metalului include molibden. Prin urmare, conform unei alternative, sarea metalului este o sare a molibdenului sau conţinând molibden. Mai exact, amestecul conform prezentei invenţii de preferinţă include molibdat de sodiu. Conform invenţiei, utilizarea unei sări ai molibdenului este preferată, în care valenţa molibdenului este de ordinul VI. Această sare oferă avantajos posibilitatea de oferire a stabilităţii semnificative amestecului din compoziţie. În plus, molibdenul, în special ca o sare şi de exemplu ca o sare de sodiu, cu valenţă sa reactivă (VI), electronegativitatea sa compatibilă, citotoxicitatea sa foarte joasă, posibilitatea sa de reacţie Fenton-Haber-Weiss reacţie care poate fi „precum”, este în particular preferată.

Conform unei alternative, sarea metalului formată include un peroxometalat, şi mai exact care poate fi găsită ca o formă intermediară hidro-peroxometalat.

Avantajos, sarea molibdenului este de preferinţă o unitate peroxo sau hidroperoxo. Încă în mod avantajos, substanţa activă este de tipul MoO4 2-sau forma sa hidroperoxo (Oyerinde Oyeyemi F. et al., Solution structure of molybdic acid from Raman spectroscopy and DFT analysis, Inorganica Chimica Acta 361, 2008, p. 1000-1007. Doi:10.1016/j.ica.2007.06.025), de exemplu, un complex intermediar cu formula de tipul Na4[Mo2O6(chelare)].10H2O într-un amestec din invenţie.

Conform unei alternative, metalul este sarea lantanidei sau conţinând o lantanidă.

Conform unei alternative, sarea metalului formată include un peroxolantanat, şi mai exact care poate fi dinnou găsit în forma unui intermediar hidro-peroxolantanat. De exemplu, el poate fi din nou găsit ca un intermediar complex cu o formulă de tip NaLn(chelare).xH2O2.yH2O (cu x şi y care depinde de tipul lantanidei (Ln) folosite într-un amestec din invenţie.

Avantajos, sarea molibdenului şi lantanidei, şi mai exact lantan, este de preferinţă o unitate peroxo sau hidroperoxo (Suponitskiy, Y.L., Proshina, O.P., Dyunin, A.G. et al.. Thermodynamic properties of lanthanum Molybdates, Russ. J. Phys. Chem. 2016, vol. 90, p. 267. Required: 10.1134/S00360244160202031X).

Avantajos, utilizarea unei sări ai molibdenului oferă posibilitatea de a limita citotoxicitatea amestecului conform invenţiei, în particular asupra corpurilor roşii şi limfocitelor, epiteliului, fibroblastelor, osteoblastelor.

Un avantaj al utilizării molibdenului reiese din prezenţa sa naturală ca factori enzimatici (precum de exemplu xantin oxidaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza cu feredoxin, etc.).

Avantajos, utilizarea sării de lantan oferă posibilitatea de a limita citotoxicitatea amestecului conform invenţiei.

Conform unei alternative preferate, metalul în forma sa de substanţă activă joacă un rol a unui catalizator pentru producerea substanţelor reactive HO2·, şi opţional HO· şi O2·.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include de la 0.1 la 500 µM, şi de preferinţă de la 1 la 200 µM, şi încă de preferinţă de la 5 la 150 µM de sare a metalului.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include de la 0,1 la 100 µM, şi de preferinţă de la 1 la 50 µM, şi în plus de preferinţă de la 5 la 30 µM de sare metalică a molibdenului.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include de la 0,1 la 100 µM, şi de preferinţă de la 1 la 50 µM, şi în plus de preferinţă de la 5 la 30 µM sare metalică a lantanului.

Termenii «agenţi de chelare» (sau „chelatani”) copespund la compuşii chimici capabili de a forma un complex coordinativ stabil cu unul sau câţiva ioni şi mai exact cu formele ionice ale metalului prezent în compoziţie. Metalul poate fi prezent în orice formă inclusiv într-o formă peroxidat sau hidroperoxidat. Aceast complex se spune că este un „chelat”.

Agenţii de chelare pot fi potriviţi pentru amestec conform prezentei invenţii avantajos ar putea cataliza extracelular, producerein situa radicalilor reactivi HO2· pe de o parte; în special dar de asemenea O2· şi OH· şi permit chelarea ionilor de calciu şi metalici inclusiv ionilor de fier (Fe(II) sau Fe2+) şi ioni fierici (Fe(III) sau Fe3+) care sunt extracelulari, legaţi sau liberi. Eliberarea acestor reagenţi este cu atât mai eficientă cu cât afinitatea chelaţilor pentru ionii extracelulari Ca2+şi Fe2+/Fe3+este semnificativă. Aceşti chelaţi sunt compuşi stabili prezenţi în amestecul farmaceutic activ din invenţie şi participă în plus la producerea preferenţială a radicalului HO2·, în activitatea farmaceutică sau terapeutică a amestecului conform prezentei invenţii, în special prin chelarea preferenţialăin situa ionilor de calciu şi fier. Aceasta chelarein situar de asemenea permite reglarea la un nivel extracelular al influxurilor celulare de calciu, în particular indus de infecţia virală pe de o parte, precum de exemplu prinHerpesviridae, şi prin stresul oxidativ datorită prezenţei radicalilor sau peroxo compuşilor din altă parte.

Avantajos, agenţii de chelare nu penetrează celula şi rămân extracelulari.

Conform unei alternative preferate, agenţii de chelare stabilizează complecşii peroxo şi hidro-peroxomolibdat conţinuţi în formulare. Asemenea peroxo- şi hidro-peroxomolibdaţi pot fi de tip (Mo2O6)4+şi [Mo4O12(O2)2]4+.

Avantajos, conform unei alternative, agentul de chelare permite stabilizarea prin chelare a substanţei active ion MoO4 2-, care în forma sa sodică are o masă moleculară de 205,937 gpermol sau peroxomolibdat (de exemplu în formă de MoO3-BAPTAH22- şi/sau MoO3-EGTAH22-).

Conform unei alternative, compoziţia sau amestecul conform invenţiei include cel puţin doi agenţi de chelare.

Avantajos, agentul(agenţii) de chelare leagă prin coordonare metalatul oxidat sau peroxidat în soluţie.

Conform unei alternative, agentul de chelare formează un complex cu metalatul oxidat sau peroxidat pentru a forma un dimer intermediar complex [Mo2O6(chelatant)]4+.10H2O şi/sau al formei peroxotetramolibdat(VI) [Mo4O12(O2)2]4+-chelatant, apoi sarea metalului este o sare de molibden.

Conform unei alternative, agentul de chelare formează un complex cu metalatul oxidat sau peroxidat pentru a forma un complex [W2O6(chelatant)]4+.8H2O, unde sarea metalului este o sare a volframului.

Conform unei alternative, agentul de chelare formează un complex cu un lantanat oxidat sau peroxidat cu scopul de a forma în special un complex [La(O2)-Chelatant]2+.6H2O unde sarea de lantanidă este o sare a lantanului.

Avantajos, agentul de chelare este compatibil cu captarea sterică a complecşilor oxidaţi şi/sau peroxidaţi din metalat. Mai exact, mărimea «buzunarului» său N---N care separă resturile carboxilice implicate în coordonare precum şi pliarea sterică a catenei carbonice în aceast buzunar care ar trebui avantajos să fie compatibil cu capturarea complecşilor metalici intermediari, în special într-o formă oxidată peroxidată. Avantajos, agentul de chelare este compatibil cu sarcinile electronice din metalat şi cu structura orbitalilor săi atomici externi.

Conform unui aspect, agentul(agenţii) de chelare sunt selectaţi din poliacizii organici şi sărurile acestora, în special acizi amino-carboxilici. Tipic, acizi amino-carboxilici includ unul sau câţiva atomi de azot ai unei funcţii amino de preferinţă o amină secundară sau terţiară legată de cel puţin două grupe ale acizilor carboxilici, prin atomi, în general carbon şi opţional atomi de oxigen.

Conform unei alternative, agentul(agenţii) de chelare are(au) cel puţin trei grupe de coordonare, de preferinţă grupe ale acizilor carboxilici, la trei capete ale moleculei(moleculelor) formând agentul(agenţii) de chelare, grupele de coordonare menţionate fiind separate printr-o catenă din cel puţin trei atomi inclusiv cel puţin un atom de azot.

Avantajos, agentul(agenţii) de chelare are(au) cinci grupe de coordonare, de preferinţă grupe ale acizilor carboxilici, la cinci capete ale moleculei(moleculelor) formând agentul(agenţii) de chelare, grupele de coordonare menţionate fiind separate printr-o catenă din cel puţin şase atomi şi de preferinţă nouă atomi, inclusiv un atom de azot şi de preferinţă doi atomi de azot separaţi prin cel puţin doi atomi.

Conform unei alternative, agentul(agenţii) de chelare are(au) patru grupe de coordonare, de preferinţă grupe ale acizilor carboxilici, la patru capete ale moleculei(moleculelor) formând agentul(agenţii) de chelare, grupele de coordonare menţionate fiind separate printr-o catenă din cel puţin şase atomi şi de preferinţă doisprezece atomi, inclusiv doi atomi de azot separaţi prin cel puţin opt atomi.

Conform unei alternative, atomii ce separă grupele de coordonare menţionate şi/sau atomii de azot ai agentului(agenţilor) de chelare sunt selectat dintre atomii de carbon, azot şi de oxigen. Unii atomi ce separă grupele de coordonare menţionate şi/sau atomii de azot ai agentului(agenţilor) de chelare pot fi incluşi în unul sau câteva inele atomice identice sau diferite, precum de exemplu inele nearomatice, aromatice sau heteroaromatice, de exemplu un fenil sau un piridil.

Avantajos, agentul de chelare este selectat dintre BAPTA (acid 1,2-bis(o-aminofenoxi)etan-N,N,N',N'-tetraacetic), EGTA: (acid etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacetic)), DTPA (acid dietilentriaminepentaacetic), şi orice amestecuri ai acestora.

Conform unei alternative, agentul de chelare este selectat dintre BAPTA, EGTA şi orice amestecuri ai acestora.

Avantajos, BAPTA şi/sau EGTA permit o stabilitate mai bună a precursorilor precum şi un randament de sinteză mai bun.

pKas-ul a patru grupe carboxil ale BAPTA sunt: pK1 şi pK2 <4 (BAPTA insolubil), pK3 = 5,47, şi pK4 = 6,36; şi a EGTA sunt: pK1 = 2,00, pK2 = 2,65, pK3 = 8,85, şi pK4 = 9,46.

Avantajos, pKas-le agentului(agenţilor) de chelare sunt compatibile cu pH-ul soluţiei din invenţie.

Avantajos, pKas-le agentului(agenţilor) de chelare sunt compatibile cu pKa-ul metalului acid sau metal peracid intermediar format în soluţia din invenţie.

Avantajos, pKas-le agentului(agenţilor) de chelare sunt compatibile cu pH-ul regiunilor infectate, precum de exemplu a epiteliului.

Avantajos, agentul(agenţii) de chelare selectaţi sunt puţin citotoxici. Acest lucru este în mod special notabil în cazul BAPTA şi EGTA.

Sarea metalului şi agenţii de chelare sunt prezenţi într-o cantitate şi raport suficient pentru producerea complecşilor {peroxo-metalat - chelare} agentul(agenţii)}.

De preferinţă, cel puţin unul din agenţii de chelare prezent are o afinitate mai mare pentru calciu decât pentru metalul folosit într-un amestec din invenţie. Aceasta oferă avantajos posibilitatea substituţiei complecşilor de chelare a amestecului din invenţie cu un agent de chelare-calciu complexin vivo. Avantajos, concentraţia chelatului(chelaţilor) este compatibilă cu concentraţia Ca2+extracelular (2-3mM într-o plasmă umană), adică agentul(agenţii) de chelare prezenţi într-un amestec din invenţie sunt în cantităţi suficiente pentru formarea eficientă a unui complex din punct de vedere terapeutic cu cantitatea prezentă de calciu extracelular.

Avantajos, chelatul(chelaţii) prezenţi au mai mare afinitate pentru fier (Fe2+/Fe3+) decât pentru metalele folosite într-un amestec din invenţie. Aceasta avantajos permite substituţia complecşilor de chelare a amestecului din invenţie cu un agent de chelare-Fe2+/Fe3+complex,in vivo.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include de la 0,0001 la 1 mM agenţi de chelare.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include de la 0,1 la 100 µM, şi de preferinţă de la 1 la 50 µM, şi încă de preferinţă de la 5 la 20 µM BAPTA. Conform unei variante, amestecul conform invenţiei include de la 1 la 80 µM, şi de preferinţă de la 20 la 80 µM BAPTA.

Conform altei alternative, amestecul din invenţie include de la 0,1 la 1 mM, şi de preferinţă de la 50 la 800 µM, şi încă de preferinţă de la 200 la 700 µM of EGTA. Conform unei variante, amestecul din invenţie include 200 la 2,000 µM, şi de preferinţă 600 la 1,400 µM EGTA.

Conform altei alternative, amestecul din invenţie include BAPTA şi EGTA prezenţi într-o concentraţie de la 0,0001 la 1 mM, şi de preferinţă de la 5 la 20 µM şi de la 200 la 700 µM, respectiv.

Conform unei alternative, sarea molibdenului şi agenţii de chelare sunt prezenţi conform unui raport de la 10/1 la 1/100 (raport: Mo sare/agent de chelare, exprimată în concentraţii molare).

Conform unei alternative, sarea de lantan şi agenţii de chelare sunt prezenţi conform unui raport de la 10/1 la 1/100 (raport: Mo sare/agent de chelare, exprimată în concentraţii molare).

Conform unei alternative, sarea molibdenului şi BAPTA sunt prezenţi conform unui raport de la 3/1 la 1/10, exprimat în concentraţii molare.

Conform unei alternative, sarea molibdenului şi EGTA sunt prezenţi conform unui raport de la 1/10 la 1/70, exprimat în concentraţii molare.

Conform unei alternative, sarea de lantan şi BAPTA sunt prezenţi conform unui raport de la 3/1 la 1/10, exprimat în concentraţii molare.

Conform unei alternative, sarea de lantan şi EGTA sunt prezenţi conform unui raport de la 1/10 la 1/70, exprimat în concentraţii molare.

Conform unei alternative, sursa de radicali este în special H2O2.

Conform unei alternative, una sau câteva surse secundare de radicali pot fi adăugate sau sintetizate în minoritatein situ.

Conform unei alternative, H2O2este o soluţie apoasă conţinând H2O2la 110 volume sau 30% sau 8,82M.

Avantajos, sursa de H2O2nu include nici un agent de stabilizare selectat dintre: acizi piridin-carboxilici, precum de exemplu acid picolinic; acizi fosfonici şi amino fosfonici; amide sau amine substituite; acizi alchil sulfonici; şi amestecuri ale acestora.

Conform unei alternative, sursa principală de radicali de peroxidaze este peroxidul de hidrogen. Prin urmare, conform aceastei alternative, sursa principală de radicali de peroxidaze este prezentă la o concentraţie variind de la 200 la 600 mM, de preferinţă de la 300 la 500 mM, şi în plus de preferinţă de la 340 la 450 mM.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei include o proporţie de peroxid de hidrogen variind de la 30 mM la 4,4 M, şi de preferinţă de la 150 mM la 3 M, şi de preferinţă de la 235 mM la 1,8 M, şi încă de preferinţă de la 260 mM la 440 mM. Conform unei alternative, amestecul din invenţie nu include nici un fel de adiţie extemporană de peracid.

Avantajos, cantitatea (sau concentraţia) de peroxid de hidrogen (H2O2) este testată prin titrare. Tipic, este posibilă utilizarea unei testări prin intermediul soluţiei de permanganat de potasiu.

Concentraţia peroxidului de hidrogen poate de asemenea fi testată prin spectroscopie UV.

Avantajos, un agent de tamponare este folosit pentru controlul specific al pH-ului amestecului conform invenţiei.

Avantajos, un agent tampon este folosit cu scopul controlulului specific al pH-ului pe durata aplicăriiin situa soluţiei conform invenţiei.

Dintre agenţii de tamponare, un acid carboxilic este preferat.

De preferinţă, agentul de tamponare nu include următorii acizi: acizi carboxilici hidroxilaţi (de ex., acid malic) sau acizi policarboxilici (de ex., acizi citrici şi isocitrici, acid malonic); acizi carboxilici cu o greutate moleculară mai mare decât 100 g/mol şi în particular acizi carboxilici cu catenă lungă (mai mare decât C6) din cauza destabilizărilor membranei celulare pe care le pot induce, precum şi acizi carboxilici alifatici nesaturaţi (acid sorbic, de exemplu) din cauza posibilităţii lor de peroxidare de tip alchenoic care este citotoxic.

Conform unei alternative, prezenta invenţie include prezenţa anumitor acizi generaţiin situpe durata sintezei, de preferinţă într-o cantitate mică (precum de exemplu acidul peracetic). Ei sunt folosiţi ca o sursă accesorie de radicali la producerea invenţiei şi utilizarea terapeutică a invenţie.

Conform unei alternative, un agent tampon având pKa la pH-ul fiziologic (piele şi mucoase), adică un pH de exemplu inclus între 4,4 şi 5,0 şi compatibil cu pKa a acidului metalic oxidat şi/sau peroxidat, forma căreia este ionizată (pentru ex. MoO4H2, pk1 = 3,61 şi pKa2 = 3,89) este preferat.

De preferinţă, agentul de tamponare este prezent într-un amestec din invenţie la o concentraţie inclusă între 1 şi 500 mM, şi de preferinţă între 10 şi 200 mM, încă de preferinţă între 50 şi 100 mM.

Raportul concentraţiilor molare ale peroxidului de hidrogen şi agentului de tamponare este inclus între 2 şi 9 şi de preferinţă între 3 şi 8.

Avantajos, amestecul este tamponat pentru a obţine un pH de la 4,4 la 5,0 care este compatibil i) pentru un contact al invenţiei cu membranele pielii şi mucoasei, ii) stabilitatea substanţei active MoO4 2-în prezenţa H2O2, iii) reacţia catalitică Fenton-Haber-Weiss fie «precum» sau nu, şi, iv) producereain situa speciilor de radicali în special de tipul HOO·.

Conform unei alternative, compoziţia sau amestecul include un agent tampon permiţând un pH de la 4,0 la 5,2, de preferinţă de la 4,4 la 5,0, de exemplu un acid carboxilic, şi de preferinţă acid acetic.

Avantajos, compoziţia sau amestecul are un potenţial redox de la 350 la 420 mV.

Eficienţa redox a amestecului din invenţie poate de asemenea fi estimată prin oxidareain vitroa quercitinei prin ioni de fier(III) sau Fe3+. Este deosebit de posibil să se folosească pentru aceasta aşa-numita metodă de testarea «metoda quercitinei», (adaptată de exemplu de la studiile lui El Hajji H. et al. Interactions of quercetin with iron and copper ions: Complexation and autoxidation. Free Radic. Res., 2006, vol. 40(3), p. 303-320 and Balcerzak M. et al. Selective determination of Fe(III) in Fe(II) samples by UV-spectrophotometry with the aid of quercetin and morin, Acta Pharm., 2008, vol. 58, p. 327-334).

Prezenta invenţie de asemenea se referă la o metodă de preparare a unui amestec sau a unei compoziţii precum este definit conform prezentei invenţii. Mai exact, prezenta invenţie se referă la o metodă de preparare a unui amestec sau a unei compoziţii conform invenţiei care include (i) prepararea unei soluţi tampon (ST) conţinând un agent tampon având un pH acid, (ii) prepararea unei soluţii a unui complex metalic (SC) conţinând sarea unui oxid metalic, (iii) prepararea unei prime soluţii iniţiale (Si1) conţinând peroxid de hidrogen, (iv) prepararea unei soluţii iniţiale secundare (Si2) prin amestecarea soluţiei ST cu soluţia Si1, (v) prepararea unei soluţii (S1) conţinând un compus peroxo-metalic prin amestecarea soluţiei SC cu soluţia Si2, (vi) prepararea unei soluţii S2 prin ajustarea pH-ului soluţiei S1 cu o bază, pH-ul soluţiei S2 fiind mai bazic decât pH-ul unei soluţiei ST, (vii) adăugarea la soluţia S2 a unuia sau a câtorva agenţi de chelare, (viii) optional ajustarea pH-ului, (ix) ajustarea optională a volumului soluţiei finale, obţinerea unui amestec sau a unei compoziţii precum este definit conform invenţiei.

În funcţie de o variantă, când două sau mai multe săruri de oxid metalic sunt folosite, cu diferiţi oxizi metalici, prepararea unei soluţii a unui complex metalic (SC) poate consta în pregătirea unor soluţii separate pentru fiecare sare de oxid metalic şi apoi amestecarea acestor soluţii simultan sau succesiv cu soluţia Si2 pentru a prepara o soluţie S1.

De preferinţă, prepararea amestecului conform prezentei invenţii este realizată conform unei metode de sinteză catalitică. Sinteza catalitică a amestecului conform invenţiei este tipic secvenţială. Avantajos, metodă din invenţie include secvenţa de ETAPE (iii) => (iv) => (v) => (vi) => (vii) => (viii) => (ix).

Avantajos, metoda de prepararea este urmată de analiza spectrală (de exemplu prin analiza spectrului IR, UV şi/sau vizibil) a unei sau a mai multor etape de preparare, şi de preferinţă pe parcursul tuturor etapelor de preparare.

Conform unei alternative, prima soluţie iniţială Si1 are un prim potenţial redox mai mare decât potenţialul redox al amestecului conform invenţiei.

De preferinţă, ulterior pasului (ix), unde nu este o diluare a volumului amestecului pentru evitarea deplasări echilibrului chimic a amestecului conform prezentei invenţii.

Desigur, este avantajos să se utilizeze substanţe sau compuşi cu o puritate suficient de satisfăcătoare ca materie primă. În mod deosebit, este necesar ca diferitele substanţe sau compuşi să aibă compatibilitate cu utilizarea terapeutică.

Conform unei alternative, este posibil să se folosească IR-FT, şi/sau spectrometrie de masa RMN-H a amestecului produs conform invenţiei cu scopul de a fi siguri de conformitatea compoziţiei amestecului cu cerinţele industriale, şi în special pentru utilizarea farmaceutică terapeutică. De asemenea, de preferinţă se efectuează o spectrometrie IR-FT asupra componentelor precursoare ale amestecului conform invenţiei.

Conform unei alternative, pH-ului poate fi controlat la una sau câteva, sau chiar în toate etapele de preparare.

Conform unei alternative, potenţialul redox poate fi controlat la una sau câteva, sau chiar în toate etapele de preparare.

Conform unei alternative, amestecul invenţiei poate fi controlat prin densitometrie şi/sau spectrofotometrie UV, la una sau câteva, sau chiar în toate etapele de preparare.

Conform unei alternative, este posibilă testarea eficienţa redox a amestecului din invenţie prin intermediul metodei quercitinei (analiza spectrofotometrică UV a oxidării in vitro a quercetinei prin Fe3+prezent sau produs in vitro).

Avantajos, peroxidul de hidrogen este prezent în soluţia Si1 la o concentraţie variind de la 200 la 600 mM, de preferinţă de la 300 la 500 mM, şi de preferinţă de la 330 la 460 mM.

Conform unui exemplu de realizare, materialul folosit este metal şi este de preferinţă în oţel inovidabil, opţional metal pasivat.

Conform unui exemplu de realizare, materialul poate fi re-pasivizat după prepararea amestecului conform invenţiei, de exemplu prin punerea materialului (care va fi în contact cu amestecul sau cu precursorii acestuia) în contact cu o soluţie de peroxid de hidrogen.

Este de preferat să se efectueze o analiză a sursei de peroxid de hidrogen pentru a se asigura cantitatea de peroxid de hidrogen prezent şi a se aloca în prepararea amestecului conform invenţiei. Această analiză poate fi efectuată, de exemplu, prin titrare sau prin spectrofotometrie UV (în general la 240 nm).

Avantajos, pH-ul soluţiei tampon ST este de la 4,4 la 5,0, şi de preferinţă de la 4,7 la 4,8.

Avantajos, agentul tampon a soluţiei ST este un tampon acid carboxilic/carboxilat şi soluţia ST are un raport peroxid de hidrogen/carboxilat cuprins între 20/1 şi 1/1, şi de preferinţă de aproximativ 5/1.

Avantajos, raportul dintre acidul acetic (AcOH) şi sarea sa adăugată în cantitate limitată, permite obţinerea celei mai mici producţii de acid peracetic (AcOOH). Avantajos, într-o metodă de preparare conform invenţiei, producţia de acid peracetic este minimă şi influenţa catalitică a acestuia este foarte mică.

Prepararea primei soluţii initiale Si1 include prepararea unei soluţii apoase de acid carboxilic, şi de preferinţă a acidului acetic şi apoi adăugarea peroxidului de hidrogen.

De preferinţă, prima soluţie iniţială Si1 are un pH de la 2,5 la 4,6, şi de preferinţă de la 2,7 la 4,2. Avantajos, prima soluţie iniţială Si1 are un potenţial redox de la 400 la 550 mV, şi de preferinţă de la 420 la 500 mV.

Avantajos, metoda include o măsurare a potenţialului redox în etapele (iii) la (ix), şi de preferinţă de asemenea include o măsurare a pH-ului în etapele (iii) la (ix).

Conform unei alternative, a doua soluţie iniţială Si2 are un pH de la 2,5 la 3,2, şi de preferinţă de aproximativ 2,9. Conform unei alternative, soluţia iniţială Si2 are un potenţial redox mai mare decât potenţialul redox al primei soluţii iniţiale Si1. Potenţialul redox al celei de a doua soluţii iniţiale Si2 poate fi de la 420 la 570 mV, şi de preferinţă de la 440 la 520 mV.

Conform unei alternative, soluţia tampon ST este introdusă în prima soluţie iniţială Si1.

Conform unui exemplu de realizare, concentraţia de peroxid de hidrogen în a doua soluţie iniţială Si2 variază de la 300 la 500 mM, şi de preferinţă de la 260 la 440 mM.

Avantajos, în etapa (iv), pH-ul este menţinut mai jos de limita admisibilă a pH-ului reacţiei de sinteză catalitică pentru amestec conform invenţiei. Un agent tampon este avantajos folosit în etapa (iv).

Avantajos, în etapa (iv) producerea generatăin situde acid peracetic este minimă.

Avantajos, în etapa (iv) potenţialul redox al soluţiei Si1 a etapei (iii) este crescut, de exemplu prin trecerea valorii de la 440 la 460mV la o valoare de 460 la 480mV în etapa (iv).

Prin monitorizarea concentraţiei peroxidului de hidrogen prezent pe durata preparării amestecului din invenţie, producerea peroxidului este observată pe durata introduceri acestuia, adică punerea peroxidul de hidrogen în contact cu soluţia tampon (etapa (iv)). Avantajos, adăugarea de peroxid de hidrogen este realizată într-o soluţie apoasă tamponată preventiv la un pH acid. Prin urmare, pentru prepararea primei soluţii iniţiale Si1, peroxidul de hidrogen este adăugat într-o soluţie cu un pH acid, şi de exemplu cu un pH de la 2,7 la 4,2.

Avantajos, etapa (iv) duce la deplasarea echilibrului către producereain situa H2O2cu distrugerea acidului peracetic eventual generat de echilibrul chimic.

Conform unei alternative, soluţia tampon SC este introdusă în soluţia S1.

Conform unei alternative, soluţia S1 conţinând un complex peroxometalic are un pH de la 2,5 la 3,5, şi de preferinţă de la 2,8 la 3,0.

Conform unui exemplu de realizare, potenţialul redox al soluţiei S1 conţinând un complex peroxometalic variază de la 400 la 550 mV, şi de preferinţă de la 440 la 500mV.

Conform unui exemplu de realizare, concentraţia peroxidului de hidrogen în soluţia S1 conţinând un complex peroxometalic variază de la 250 la 500 mM, şi de preferinţă de la 320 la 450 mM.

În etapa (v), sarea molibdat adăugată este în forma de acid molibdenic MoO3.H2O şi MoO3.2H2O.

În condiţii non-inventive, sinteza la echilibrul substanţei active MoO4 2-, la temperatura camerei, fără nici un catalizator şi fără adăugarea oricărui acid puternic (H2SO4, de exemplu) ar necesita mai multe zile.

Conform unui exemplu de realizare, pH-ul soluţiei S2 este tamponat la o valoare cuprinsă, de preferinţă inclusă între 4,4 şi 5,0, şi de exemplu de la 4,5 la 5,0. Avantajos, la acest pH tamponat, este forma instabilă MoO4 2-cea care predomina (starea de oxidare Mo(VI)) şi peroxidul de hidrogen este stabilizat. Peroxidul de hidrogen este adesea stabilizat industrial printr-un tampon fosfat. Se poate forma un compus intermediar instabil de fosfomolibdat (galben) care dispare la echilibru, făcând H2O2mai reactiv.

Conform unei alternative, potenţialul redox al soluţiei S2 variază de la 300 la 450 mV, şi de preferinţă de la 360 la 410 mV.

Oxizii de molibden Mo(VI) într-o soluţie apoasă şi la pH pentru sintetiza amestecului conform invenţiei pot exista sub structuri moleculare diferite: MoO4 2-şi [MoO6 2-], [Mo2O3(O2)4(H2O)2]2-, dar şi în formele polinucleare reactive (cum ar fi structurile complexe binucleare oxo-Mo(VI) (Dement'ev I.A. et al. Mononuclear, polynuclear, and cluster complexes of molybdenum and their reactions as models of biochemical systems and processes. Russ. J. Gen. Chem., 2007, vol. 77(5), p. 822-843).

Avantajos, condiţiile de preparare permit formareain situa peroxo- şi hidro-polioxomolibdatului când sarea de metal utilizată este o sare de molibden. Acestea din urmă fac parte din: tipul [Mo2O3(O2)4(H2O)2]2-. Conform unei alternative, un exces molar de peroxid de hidrogen de mai mult de 1000 de ori şi de sare de metal şi în particular de mai mult de 10,000 de ori şi încă preferabil de 15,000 de ori, relativ la Mo(VI) este preferat.

Avantajos, agentul(agenţii) de chelatare, precum şi pH-ul de sinteză limitează deplasările reacţiei tipului „reducător Jones” constând în reducerea ionului metalat, avantajos adică molibdat, într-o stare de oxidare scăzută corespunzătoare molibdenului metalic. Conform unei alternative, această deplasare este limitată într-un mediu apos uşor acid, în mod tipic cu un pH cuprins între 4,4 şi 5,0, şi de exemplu de la 4,5 la 4,7.

De preferinţă, apoi câţiva agenţi de chelare sunt prezenţi, se prepară soluţii independente de agenţi de chelare, fiecare soluţie cuprinzând un agent de chelare specific.

Conform unei alternative preferate, adăugarea agenţilor de chelare este realizată cu o ordine de creştere a pKas.

De exemplu este posibil să se prepare o soluţie cuprinzând un agent de chelare de tip BAPTA pe de o parte şi o soluţie de agent de chelare de tip EGTA pe de altă parte. Preferabil se adaugă BAPTA şi apoi EGTA.

Avantajos, agentul(ţii) de chelare oferă posibilitateain situ, adică după aplicarea topică, în special reacţia Fenton-Haber-Weiss, cu o constantă de disociere remarcabilă Kdchelat: Fe2+/Fe3+> Ca2+.

Avantajos, agentul(agenţii) de chelare permit posibilităţi extracelularein situ, auto-susţinerea producţiei radicale reactive HOO· în principal şi în minoritate O2· şi HO·.

Conform unei alternative, este mai întâi posibil să se adauge BAPTA la soluţia S2 pentru a obţine o soluţie S3 rezultată. Soluţia S3 are, de exemplu, un pH cuprins între 4,0 şi 5,0 şi preferabil între 4,3 şi 4,8. De exemplu, soluţia S3 are un potenţial redox identic cu cel al soluţiei S2. Cu alte cuvinte, potenţialul redox nu variază după adăugarea agentului de chelare de tip BAPTA. Conform unei alternative, potenţialul redox al soluţiei S3 variază de la 250 la 450 mV şi, de preferinţă, de la 300 la 400 mV. Avantajos, dizolvarea preliminară a BAPTA într-un volum mic de soluţie S2 este realizată înainte de punerea ei în contact cu restul soluţiei S2.

De preferinţă, concentraţia BAPTA este într-un raport molar de la 1/1 la 1/3 şi de preferinţă 1/2, relativ la sarea de molibden.

De exemplu, soluţia S3 are o concentraţie de peroxid de hidrogen de la 250 la 500 mM şi de preferinţă de la 320 până la 440 mM.

Avantajos, este posibil să se adauge cel puţin un alt agent de chelare de tip EGTA în soluţia S3 pentru a obţine o soluţie rezultată S4. Conform unei alternative, soluţia S4 are un pH care variază de la 4,0 la 5,0 şi preferabil de la 4,3 până la 4,7. Conform unei alternative, potenţialul redox al soluţiei variază de la 300 la 400 mV şi de preferinţă de la 350 la 390 mV.

De preferinţă, concentraţia EGTA este într-un raport molar de la 10/1 la 50/1 şi de preferinţă de aproximativ 25/1, relativ la sarea de molibden.

De exemplu, soluţia S4 are o concentraţie de peroxid de hidrogen de la 250 la 550 mM şi de preferinţă de la 320 până la 470 mM.

Conform unei alternative, pH-ul din etapa (viii) este ajustat cu o soluţie bazică, de exemplu de tip hidroxid de sodiu, preferabil concentrat, de exemplu la o concentraţie de la 8 la 15 M. Avantajos, pH-ul din etapa (viii) poate fi ajustat la o valoare de la 4,4 până la 5,0 şi de preferinţă de aproximativ 4,6.

Conform unei alternative, pH-ul amestecului conform invenţiei este cuprins între 4,50 la 4,70. Avantajos, potenţialul redox al amestecului conform invenţiei variază de la 320 la 390 mV.

Conform unei alternative preferate, metoda cuprinde o reducere a potenţialului redox în etapa (vi). O reducere a potenţialului redox poate de exemplu fi de la 50 la 150 mV, şi tipic de aproximativ 90 mV.

De preferinţă, potenţialul redox este în mod substanţial constant după reducerea potenţialului redox al etapei (vi).

Avantajos, amestecul conform prezentei invenţii este stabil pe decursul depozitării, de exemplu la temperatura camerei sau până la o temperatură de 45°C timp de şase luni. Se recomandă menţinerea amestecului în întuneric şi la distanţă de umiditate.

pH-ul este măsurat cu ajutorul unui pH-metru calibrat şi compensat la temperatură, cu un electrod combinat KCl 4M/AgCl.

Potenţialul redox este măsurat cu un pH-metru combinat de pH/redox, echipat cu un electrod Platină/calomel calibrat. În mod tipic, această măsurare este efectuată la temperatura camerei, adică 20°C şi la presiunea ambiantă, adică 101325 Pa.

Concentraţia de peroxid de hidrogen este de preferat evaluată în soluţiile menţionate mai sus prin spectroscopie UV conform ecuaţiei derivate din legea Beer-Lambert: A240nm = 43,6 x l x [H2O2] cu l în centimetru şi [H2O2] în moli (Noble R.W. et al. The reaction of ferrous horseradish peroxidase with hydrogen peroxide. J. Biol. Chem., 1970, vol. 245(9), p. 2409-2413).

Conform unei alternative specifice, compusul peroxo-metalic al soluţiei S1 este un compus peroxo-molibdenic.

Amestecul conform invenţiei cuprinde, prin urmare, în conformitate cu această alternativă un compus peroxometal. Conform unei alternative preferate, amestecul conform invenţiei cuprinde un complex peroxo-molibdenic.

Conform unei alternative, soluţia conţine molibdat de sodiu în forma Mo(VI). Avantajos, pentru pH-ul soluţiilor conform invenţiei, sarea este în principal în formă catalitică MoO3-BAPTA3-în special şi MoO3-EGTA3-în special, ambele surse ale substanţei active MoO4 2-.

Conform unei variante de realizare particulare, amestecul conform invenţiei cuprinde o sare, de preferinţă sodiu, de molibden, un amestec din doi agenţi de chelare, de preferinţă de tip BAPTA şi EGTA, peroxid de hidrogen şi un agent de tamponare acetat (acid acetic/acetat de sodiu, de exemplu).

Conform unei alternative specifice, amestecul conform prezentei invenţii include:

- Sare de molibdat, şi de exemplu molibdat de sodiu;

- BAPTA;

- EGTA;

- H2O2;

- CH3COOH/CH3COONa;

- Eredox de la 250 la 550 mV, şi de preferinţă de la 300 la 450 mV, şi din nou de preferinţă de la 300 la 420mV;

- pH 4,4 - 5,0.

Conform unei variante specifice, amestecul conform prezentei invenţii include:

- Sare de molibdat, şi de exemplu molibdat de sodiu;

- Sare de lantan, şi de exemplu nitrat de lantan;

- BAPTA;

- EGTA;

- H2O2;

- CH3COOH/CH3COONa;

- Eredoxde la 250 la 550 mV, şi de preferinţă de la 300 la 450 mV, şi din nou de preferinţă de la 300 la 420 mV;

- pH 4,4 - 5,0.

Avantajos, compuşii din amestec sunt în cantităţi necesare şi condiţii pH şi condiţii de potenţial redox pentru formarea unui complex peroxomolibdat sau complex hidroperoxomolibdat în care molibdenul are valenţa VI.

Conform unui exemplu de realizare particular, amestecul conform invenţiei cuprinde cel puţin un agent de chelare şi în cel mai bun caz şi cel puţin doi agenţi de chelare şi, de preferinţă, la o concentraţie de la 5 la 20 µM şi 200 la 700 µM, respectiv.

Conform unui exemplu de realizare particular, amestecul din invenţie include 340 mM la 450 mM din principalul donator radical ca H2O2.

Invenţia se referă în special la o compoziţie farmaceutică pentru uz extern, conform invenţiei ca un amestec sau a compoziţie terapeutic activă, respectiva compoziţie sau amestec cuprinzând cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin un agent tampon şi o sursă de radicali peroxidare, unde amestecul sau compoziţia specificată are un potenţial redox de la 250 la 550 milivolţi. O astfel de compoziţie conform invenţiei este utilă într-o metodă de tratament terapeutic.

Invenţia se referă, de asemenea, la o metodă de tratament terapeutic conţinând administrarea, mai avantajos prin aplicare topică, la un subiect ce are nevoie de o cantitate terapeutic eficientă a unei compoziţii farmaceutice conţinând cel putin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin un agent tampon si o sursă de radicali peroxidanţi, unde compoziţia are un potenţial redox de la 250 până la 550 milivolţi.

Invenţia se referă, de asemenea, la un procedeu pentru prepararea unei compoziţii farmaceutice conform invenţiei pentru utilizare într-o metodă de tratament terapeutic.

Invenţia în particular se referă la compoziţii farmaceutice conţinând sau ce constă dintr-un amestec conform invenţiei.

Invenţia se referă astfel la o compoziţie farmaceutică pentru utilizare locală, caracterizată prin aceea că ea cuprinde un amestec terapeutic activ, aşa cum este definit conform invenţiei sau care poate fi obţinut conform unei metode definite în conformitate cu invenţia.

În mod avantajos, compoziţia farmaceutică pentru uz extern conform invenţiei cuprinde de la 0,001 până la 5 mM, de preferinţă de la 0,01 până la 2 mM şi încă preferabil de la 0,02 la 1 mM de un amestec farmaceutic activ.

Invenţia se referă în special la o compoziţie farmaceutică pentru uz extern, conform invenţiei, pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic a unei infecţii virale, şi în particular implicând un virus din familiaHerpesviridae.

Invenţia se referă în special la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei pentru utilizarea ei într-o metodă de tratament terapeutic a unei infecţii implicând HSV-1 şi/sau HSV-2.

Invenţia se referă în special la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei pentru utilizarea ei într-o metodă de tratament terapeutic antiinflamator.

Invenţia se referă în special la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, pentru utilizarea ei într-o metodă de tratament terapeutic preventiv sau curativ.

Invenţia se referă, de asemenea, la o compoziţie farmaceutică, având un potenţial redox de la 250 până la 550 milivolţi şi conţinând molibden, cel puţin un agent de chelare, cel puţin un agent tampon şi o sursă de radicali de peroxidare pentru utilizarea ei într-o metodă de tratament terapeutic al herpesului.

Termenul „conform invenţiei” face referire la oricare dintre exemplele de realizare, alternative, avantaje, preferinţe sau exemple ale invenţiei, luate singure sau în conformitate cu oricare dintre combinaţiile lor.

În mod tipic, compoziţiile farmaceutice pentru uz topic conform invenţiei conţin excipienţi şi în special excipienţi aprobaţi pentru farmacopee.

Prin tratament terapeutic antiinfecţios se înţelege atât un tratament terapeutic preventiv, un tratament profilactic şi un tratament curativ, care dă posibilitatea de a limita, de exemplu, infecţia în cazul contactului contaminant, apariţia unei boli, faza acută cu, fie parţial eradicarea sau nu a agentului cauzal şi/sau limitarea diseminării sale.

În mod avantajos, amestecul activ sau compoziţia farmaceutică conform prezentei invenţii este activăin situîn timpul aplicării sale.

În mod avantajos, amestecul activ sau compoziţia farmaceutică conform prezentei invenţii este activ în timpul trecerii trans-epiteliale şi, de preferinţă, nu permite sau numai într-un mod limitat trecerea transcutanată.

Avantajos, amestecul activ sau compoziţia farmaceutică conform prezentei invenţii este dezactivată în timpul trecerii transcutanate.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei sau o compoziţie care îl conţine este aplicată pe cale topică la nivelul orofacial.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei sau o compoziţie care îl conţine este aplicată pe cale topică la nivel genital sau anal.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei sau o compoziţie care îl conţine se aplică pe cale topică pe piele.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei sau o compoziţie care o conţine este aplicată pe cale topică pe o mucoasă.

Conform unei alternative, excipienţi aprobaţi de Farmacopeea Europeană (Ph. Eur.), Farmacopeea Naţională (USP, JP, IP, Ph. Helv., Ph.Belg., Ph Fr., BP, DAB, OAB, în special) şi Farmacopeea Internaţională (Ph. Int.; WHO), pot fi introduşi în timpul fabricării invenţiei şi/sau în „amestecul” menţionat ca „Amestec 1”.

Amestecurile şi compoziţiile conform invenţiei sunt în mod special adecvate pentru activitatea farmaceutică la fiinţele umane.

Avantajos, amestecul activ al invenţiei dă posibilitatea de a aplica reacţii de tip Fenton-Haber-Weiss şi precum cele de tip Fenton-Haber-Weiss şi de a genera preferenţial radicalul HO2· şi în minoritate radicalii O2·, HO·.

Conform inventatorilor, permearea substanţei reactive HOO·, este suficientă pentru a induce într-o manieră limitată şi controlată apoptoza celulelor.

Conform inventatorilor, permeaţia substanţei reactive HOO·, este suficientă pentru a avea într-un mod eficient şi controlat un efect anti-replicare viral.

Conform invenţiei, potenţialul redox al amestecului conform invenţiei este de preferinţă utilizat pentru limitarea într-un domeniu restrâns a concentraţiilor precursorilor substanţelor active radicale astfel încât să genereze un echilibru de sunet între: un efect anti-replicare/citotoxicitate moderată pentru celulă sănătoasă/citotoxicitate semnificativă pentru celula infectată/efect de prevenire a infecţiei.

Avantajos, amestecul terapeutic sau farmaceutic activ, conform invenţiei, dă posibilitatea producerii, în principal şi preferenţial, a speciilor radicale reactive HOO·.

Prin urmare, conform prezentei invenţii, calciul extracelular in vivo este principalul factor de declanşare a producerii de HOO·. De exemplu, aceasta este în principal o acţiune la complex 2Mo(VI)-BAPTA2(H2O2) când sarea de molibden şi BAPTA sunt introduse în amestecul din invenţie. De exemplu, aceasta este în principal o acţiune la complexul 2Mo(VI)-EGTA2(H2O2) când sarea de molibden şi EGTA sunt puse în joc în amestecul conform invenţiei.

Avantajos, producerea în mediu extracelular a HOO· permite modificări extracelulare (de exemplu, oxidarea reziduurilor de aminoacizi extra-membranare) care pot limita astfel infecţia virală prin modificarea recunoaşterii celulare.

Avantajos, producerea în mediul extracelular a HOO· precum şi permeaţia sa celulară sunt compatibile cu durata lungă de viaţă (≥ 1 s) şi cu penetrarea mare a celulei în raport cu OH· sau O2· (1 ms şi penetrarea de ordinul 1 nm). Avantajos, această substanţă HOO· este implicată în reacţia Haber-Weiss şi reacţia Fenton („precum” sau nu) la nivelul extracelular şi intracelular şi permite auto-susţinerea acesteia din urmă.

Avantajos, amestecul care conţine Mo (IV) conform prezentei invenţii are un pH de la 4,4 până la 5,0. Acest lucru permite în special optimizarea constantei ratei kobs (M-1.s-1) de descompunere HO2·/O2·.

Avantajos, modificarea potenţialului redox intracelular prin contactarea cu compoziţia conform invenţiei permite un echilibru apoptotic/anti-apoptotic. Mai exact, acest echilibru apoptotic/antiapoptotic depinde în mod deosebit de existenţa unei infecţii cu HSV şi în principal de HSV-1 şi -2.

Conform unei alternative, amestecul conform invenţiei este selectiv activ asupra celulele infectate cu HSV şi în principal de HSV-1 şi -2.

Astfel, există un echilibru apropiat între căile stresului indus de infecţia cu HSV, incluzând influxul de calciu şi reglarea apoptozei.

Acest echilibru este perturbat de prezenţa radicalilor intra-citoplasm şi de modificările potenţialului redox celular. Acesta induce aceleaşi căi celulare de stres ca o infecţie cu HSV, aceleaşi influxuri de calciu şi aceleaşi inducţii ale căilor metabolice, aceleaşi căi fiind reglate înapoi spre un alt echilibru antiapoptotic. Acesta susţine efectul terapeutic al amestecului conform invenţiei sau al compoziţiilor care îl compun.

Conform unei alternative, compoziţia farmaceutică sau amestecul conform invenţiei este utilizată într-o metodă terapeutică de tratament pentru herpesul labial şi orofacial.

Conform unei alternative, compoziţia farmaceutică sau amestecul conform invenţiei este utilizată într-o metodă terapeutică de tratament a herpesului genital şi anal.

Conform unui exemplu de realizare, amestecul activ conform invenţiei are o eficienţă antiinfecţioasă (acţiune directă moderată până la scăzută asupra virusului, receptorii virali la celulă ca posibili candidaţi), anti-recunoaştere şi internalizare (acţiune semnificativă, receptorii celulei la virus). Aceste eficienţe sunt externe celulei şi limitează infecţiozitatea virale. Astfel, amestecul activ conform invenţiei are o acţiune profilactică. Astfel, din nou, amestecul activ conform invenţiei are o eficienţă antiinfecţioasă.

Conform unei alternative, compoziţia farmaceutică sau amestecul conform invenţiei este utilizată într-un tratament terapeutic al unei populaţii care exprimă HSV său pliat, replicativ sau infecţios.

Conform unei alternative, compoziţia farmaceutică conform invenţiei sau amestecul este utilizat într-un tratament terapeutic al unei populaţii celulare sau al unui ţesut care prezintă HSV-1 (Kessler H.H. et al. Detection of Herpes Simplex Virus DNA by real-time PCR. J. Clin. Microbiol., 2000, vol. 38(7), p. 2638-2642).

Conform unei alternative, compoziţia farmaceutică sau amestecul conform invenşiei este utilizat într-un tratament terapeutic al unei populaţii celulare sau al unui ţesut care prezintă HSV-2 (Kessler H.H. et al. Detection of Herpes Simplex Virus DNA by real-time PCR. J. Clin. Microbiol., 2000, vol. 38(7), p. 2638-2642).

Avantajos, amestecul activ conform invenţiei are o eficacitate anti-replicare indusă de faptul că există un contact preliminar cu infecţia cu o celulă sau ţesut sănătoasă. Amestecul activ conform invenţiei poate fi utilizat pentru prevenirea unei infecţii prin limitarea replicării virale intracelulare şi / sau prin limitarea penetrării virusului în celulă.

Avantajos, amestecul activ conform invenţiei are o eficienţă pre-anti-replicare asupra metabolismului celular al celulei infectate (căi de stres oxidativ şi canale de calciu). Amestecul activ conform invenţiei poate fi utilizat în mod specific pentru a acţiona direct împotriva replicării virale intracelulare şi împotriva unei infectări a celulelor cu HSV-1 şi/sau HSV-2 ale aceluiaşi ţesut infectat sau a unui ţesut sănătos apropiat de cel precedent.

Conform unei alternative, amestecul activ conform invenţiei induce în mod eterogen o inhibare a producţiei de interleukină-6 (IL-6) a unui fragment cutanat uman şi are astfel o eficienţă antiinflamatorie.

În figuri:

Fig. 1 - reprezintă variaţiile potenţialului redox şi ale concentraţiei de H2O2în timpul preparării Amestecului 1.

Fig. 2 - ilustrează un calcul Fe3+ utilizat pentru analiza eficienţei redox a Amestecului 1.

Fig. 3 - este o ilustrare a eficienţei redox a Amestecului 1 la diferite concentraţii ale acestuia (absorbanţa quercetinei de către Fe (III) într-un mediu plasmatic uman după contact (2 minute) cu Amestecul 1 (în nM MoO4 2-).

Fig. 4 - ilustrează un calcul al eficienţei redox a Amestecului 1 la diferite concentraţii ale acestuia din urmă

Fig. 5 - ilustrează influenţa Amestecului 1 la o concentraţie diferită de MoO4 2-asupra produceriiin situîn plasmă umană a Fe3+, i) care rezultă din complexul transferin-Fe3+după contactarea cu formularea, ii) asupra echilibrului Fe2+/Fe3+şi iii ) asupra oxidării quercitinei.

Fig. 6 - ilustrează producţia de interleucină-6 (IL-6) în supernatantele culturii biopsiilor neopatologice ale pielii umane (2 minute) stimulate de Amestecul 1 (24,3 pM de substanţă activă) sau NaCI (100 mM) ca control. (D1-5: donatorul 1 până la 5, B1 sau 2: biopsia 1 sau 2).

Fig. 7 - ilustrează media producţiei la 6 ore şi 24 ore după contactul cu interleucina-6 (IL-6) în supernatantele de cultură ale biopsiei cutanate umane stimulate non-patologic (2 min.) prin Amestecul 1 (24,3 µM de substanţă activă) sau NaCI (100 mM) drept control.

Fig. 8 - este o reprezentare a eficienţei redox a Amestecului 1 şi a Amestecului 2 la concentraţii diferite (absorbţia quercetinei de către Fe(III) în plasmă umană după contactul (2 min.) cu Amestecul 1 (în nM MoO4 2-) sau cu amestecul 2 în (în nM La(MoO4)1-).

Exemple

Exemplul 1- Exemplul unui amestec activ conform invenţiei

Exemplul prezent este realizat cu o sare de molibden. O compoziţie cu o formulă conform tabelului 1 (“Amestec 1”), exprimată în concentraţia iniţială a constituienţilor este preparată:

Tabelul 1

Componenţi Amestec conform invenţiei Molibdat de sodiu 20,7 µM BAPTA 12,6 µM EGTA 526 µM H2O2 353 mM CH3COOH/CH3COONa 70 mM Ph (cu NaOH) 4,4 - 5,0 Eredox 300 la 420 Mv

Compoziţia se spune că este o compoziţie „iniţială” deoarece ea corespunde la concentraţiile reagenţilor adăugaţi fără a lua în considerare procesul catalitic aplicat.

Toţi constituienţii folosiţi pentru sinteză precum şi produsele finale sunt confirmate prin spectrele lor IR-FT.

Tabelul 1a

Produs Puritate Formulă brută CAS No. Molibdat de sodiu dihidrat 98-103% Na2MoO4 .2H2O 10102-40-6 BAPTA: acid (1,2-bis(o-aminofenoxi)etan-N,N,N',N'-tetraacetic) ≥98% C22H24N2O10 85233-19-8 EGTA: acid (etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N′,N′-tetraacetic) ≥99% C14H24N2O10 67-42-5 Peroxid de hidrogen 29-31% H2O2 722-84-1 Acid acetic glacial 99,8-100,5% CH3COOH 64-19-7 Acetat de sodiu trihidrat 99-101% C2H3NaO2.3H2O 5010524 Hidroxid de sodiu 10N NaOH 1310-73-2 Apă demineralizată 1µS H2O 7732-18-5

Figurile măsurărilor realizate pe durata şi după sinteză sunt mediile a trei repetări.

Cantităţile indicate mai jos sunt pentru prepararea unui litru de Amestec 1.

A -ETAPA (i): pregătirea soluţiei tampon (soluţia ST)

CH3COOH (100%; d: 1,05g.cm-3(lichid, 20°C)) 4,0 ml (final 70 mM)

CH3COONa.3H2O (100%): 8 g (final 59 mM)

Apă: qsp 1L

Verificarea pH-ului: 4,7-4,8

Temperatura camerei (20°C)

B -ETAPA (ii): pregătirea soluţiei complexului metalic (soluţia SC)

Na2MoO4 .2H2O (sursă de Mo(VI); 100%): 200 mg (final 2,4 mM)

Apă: qsp 340 ml

Agitare uşoară, Temperatura camerei

C -ETAPA (iii): pregătirea soluţiei iniţiale (Si1)

Apă: 900 mL

CH3COOH (100%): 4 mL (70 mM)

Adăugaţi foarte lent şi la agitare foarte uşoară (250 rpm),

pH: 2,9 - 3,8

Eredox: 470 - 490 mV

şi apoi,

H2O2(30%) qsp pentru 1,2% final după masă şi conform testelor preliminare

La 45 min:

pH: 2,70 - 2,90

Eredox: 440 - 460 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 380-410 mM (Soluţia Si1)

D -ETAPA (iv): pregătirea soluţiei iniţiale (Si2)

Introduce „Soluţia ST” în soluţia Si1 12 mL (≈1mM acetat)

Adaugă la o agitare uşoară.

La 45 min:

pH: ≈ 2,90

Eredox: 460 - 480 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 360 - 410 mM (Soluţia Si2)

E -ETAPA (v): pregătirea soluţiei peroxomolibdenice S1

Introduce „Soluţia SC” în soluţia Si2 10 mL

La 45 min:

pH: 2,80 - 3,00

Eredox: 450 - 480 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 370 - 400 mM (Soluţia S1)

F -ETAPA (vi): pregătirea soluţiei S2

Ajustarea pH-ului la agitare uşoară:

NaOH 9,9-10,1M 3,6 mL pentru = 0,9 L de Amestec 1

pH 4,5 - 5,0

La 45 min:

pH: 4,60

Eredox: 380 - 390 mV (Soluţia S2)

G -ETAPA (vii): Adăugarea agenţilor de chelare - Pregătirea soluţiei S4

Introducerea BAPTA (98,8%) 6 mg/L,

după dizolvarea foarte lentă a BAPTA la agitare uşoară într-o alicotă de formulare S2 (1,4 L) echilibrată în prealabil la 25°C (aşa numită soluţie „S3.1”).

Uneşte soluţia S3.1 cu soluţia S2 pentru a forma soluţia S3.2.

La 45 min:

pH: 4,40-4,70

Eredox: 380 - 390 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 370 - 390 mM

Introduce EGTA (99,1%) 200mg/L în soluţia S3.2 pentru a forma soluţia S4

Dizolvă la agitare uşoară.

La 45 min:

pH: 4,40 - 4,60

Eredox: 380 - 390 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 370 - 420 mM

H -ETAPA (viii): Ajustarea pH-ului

Ajustarea pH-ului (NaOH 9, 9-10,1M, adică ≈400g/L) => pH: 4,60 ± 0,2

I -ETAPA (ix): ajustarea volumului soluţiei finale (FS)

Ajustarea volumului cu apă demineralizată qsp 1 L

La 12-18 ore:

pH: 4,50 - 4,70

Eredox: 380 - 390 mV

Prin ecuaţia lui Noble: [H2O2] = 350 - 380 mM

Prin titrare: [H2O2] = 400 - 430 mM

Densitatea: δ = 1,004 g/ml

Amestecul gata pentru uz, conform invenţiei, este stabil la întuneric mai mult de 6 luni la temperatura camerei sau la 45°C.

Hidro-peroxomolibdatul de sodiu este la o concentraţie de 24,3 µM în amestecul final 1.

Exemplul 2- Semnătura prin variaţia potenţialului redox

Semnătura amestecului activ conform prezentei invenţii este evaluată prin variaţia potenţialului redox pe durata sintezei unei compoziţii preparate conform Exemplului 1.

Conform Fig. 1, faţă de soluţia iniţială (≈470 mV; ETAPA 3), reducerea potenţialului redox la ≈90mV (≈380mV) în ETAPA 6 (ajustarea pH-ului cu soda). Potenţialul redox rămâne constant până la sfârşitul sintezei (ETAPA 9). Acelaşi lucru este valabil pe durata îmbătrânirii formulelor amestecului din invenţie conform Exemplului 1 timp de 6 luni la temperatura camerei (389 mV ± 5 mV) şi la 45°C (389 mV ± 8 mV) la un pH de 4,56 ± 0,40 şi 4,53 ± 0,41, respectiv.

Exemplul 3- Semnătura de consum şi producere a H2O2- generarea echilibrului peroxo-reagentului şi a potenţialului redox al Amestecului 1.

Semnătura amestecului activ conform prezentei invenţii este evaluată de consumul şi producerea H2O2pe durata sintezei unei compoziţii preparate conform Exemplului 1.

Conform Fig. 1, privind concentraţia inţială a H2O2(353 mM; ETAPA 3 la 10), o producţie bruscă (≈42 mM; inclusiv o fracţie mică de acid peracetic) este observată din cauza adăugării H2O2în soluţia tampon (acid acetic/acetat). Dacă adăugarea H2O2nu este realizată într-o soluţie apoasă tamponată iniţial cu acid (ETAPA 3; pH = 2,84 ± 0,1), degradarea sa spontană şi rapidă ar rezulta din cauza pH-ului prea mare (Apă) (pKaHO2·-/O2·-: 4.8).

De la ETAPA 4 până la ETAPA 7, un consum limitat de H2O2este observată (10 mM ± 6 mM), până la stabilizarea sa la 381 mM ± 5 mM (ETAPA 7; +BAPTA).

Adăugarea EGTA deplasează echilibrul peroxidic («precum» reacţia Fenton) prin degradarea peroxidului, adică 393 mM ± 29 mM în ETAPA 7, la 357 mM ± 26 mM în ETAPA 9, şi 365 mM ± 15 mM în ETAPA 9 + 12 ore.

În ETAPA 6, a scădere bruscă a potenţialului redox este observată (de la 463 mV ± 15 mV la 392 mV ± 17 mV) prin ajustarea pH-ului. Adăugarea (ETAPA 7) agenţilor de chelare BAPTA şi apoi EGTA contribuie succesiv la stabilizarea potenţialului redox (386 mV ± 5 mV şi 383 mV ±6 mV) prin stabilizarea echilibrului chimic.

Exemplul 4- Testarea eficienţei redox a amestecului din invenţie: metode quercitinice.

A - Soluţiile reactivilor

1 - Quercitina

O soluţie a quercitinei dihidrat (2-(3,4-dihidroxifenil)-3,5,7-trihidroxi-4H-1-benzopiran-4-ona dihidrat, 3,3′,4′,5,7-pentahidroxiflavonă dihidrat; (C15H10O7.2H2O) la 10-3mol/L este preparată în metanol.

2 - Soluţie hidroclorică

Prima soluţie de acid clorhidric 1M este preparată în metanol. A doua soluţie este preparată de 0.3 M în metanol. Soluţia reactivă este preparată prin adăugarea 343µl soluţie de 1M la 1,357µl la soluţia de 0.3 M.

3 - Soluţii de Fe3+(calcul de referinţă)

O soluţie de Fe3+(Fe2(SO4)3.xH2O) la 2 mg/ml este preparată în apă HPLC. Ea este apoi diluată pentru a obţine opt soluţii de referinţă la: 20, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000 şi 1,500 µg/ml. Aceste soluţii sunt la final diluate de 20 de ori în plasmă umană sau în apă HPLC pentru a obţine la final concentraţiile de: 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50 şi 75 µg/ml.

4 - Soluţii de Fe2+(calcul de referinţă, controlul activităţii)

O soluţie de Fe2+(FeSO4.7H2O) de 89 mg/ml este preparată în apă HPLC. Ea este apoi diluată pentru a obţine trei soluţii de referinţă la: 0.445, 4.45 şi 44.5 mg/ml. Aceste soluţii sunt la final diluate de 10 ori în apă HPLC pentru a obţine la final concentraţiile de: 0, 0.0445, 0.445 şi 4.45 mg/ml.

B - Testările prin metoda quercitinică

Prezenţa Fe3+(calcul) sau producerea sa (Fe2+calcul şi eficienţa amestecului din invenţie după 2 min de contact) sunt cuantificate prin metoda quercitinică.

Conform condiţiilor de analiză sau folosire a Amestecului 1:

„amestecox” se referă la un amestec conform invenţiei ca un oxidant.

„amestecred” se referă la un amestec conform invenţiei ca un agent de reducere.

Producerile de Fe3+sunt următoarele:

Transferrin-2Fe3++ amestecred+ 3H+→ Transferrinred+ 2Fe3+ (aq)+ amestecox(1)

Fe3+ (aq)+ amestecred+ e-⇄ Fe2+ (aq)+ amestecox(2)

Fe3+ (aq)+ quercitinared→ quercitinaox+ Fe2+ (aq)(3)

Reacţia (1) este într-un mediu de plasmă.

Reacţia (2) este într-un mediu de plasmă sau în apă HPLC şi corespunde la echilibrul reacţiei Fenton-Haber-Weiss.

Reacţia (3) este reacţia de oxidare a quercitinei pentru evaluarea potenţialului redox al Amestecului1.

Într-un mediu acid şi la 70°C, quercitina este oxidată specific de către ionul feric (Fe3+; El Hajji et al. 2006 şi Balcerzak et al., 2008) născut de transferrin într-un mediu de plasmă şi nu de ionul feros (Fe2+). Ionul Fe3+este solubil în aceste condiţii.

30 µl de soluţie de quercitină sunt adăugate la 170 µl soluţie reactivă hidroclorică. După omogenizare, 50 µl de probă (Fe3+în plasmă umană sau în apă HPLC, Fe2+în apă HPLC, amestecul din invenţie după 2 min de contact cu plasmă umană) sunt adăugate. Soluţiile sunt agitate intens şi pe o durată scurtă şi apoi incubate pentru 1 oră la 70°C. După incubare, probele sunt centrifugate pentru 15 min. la 14,000 rpm şi la temperatura camerei. 100 µl de supernatante sunt eşantionate. Spectrul UV al fiecărei probe este achiziţionat de la 230 la 500 nm. Blank-urile: apă, Fe2+, Fe3+, plasma sunt scăzute în conformitate cu tipul experimentului. Peak-ul de absorbţie a quercitinei oxidate de Fe3+produs de transferinul din plasmă şi reacţia Fenton-Haber-Weissin situeste reţinut (de la 285-305 nm).

Peak-ul curbei este centrat la 292 nm apoi experimentul este realizat în apă HPLC sau în plasmă. El poate fi deplasat cu un maxim de 10 nm apoi blank-urile experimentale sunt scăzute.

1 - Fe3+calcul.

Un calcul pentru ionul de Fe(III) este produs de exemplu prin măsurarea absorbanţei UV (în intervalul 250-330nm) a quercitinei oxidate pentru diferite concentraţii ale Fe3+(compar.Fe3+intervalul de mai sus) în plasmă umană, şi prin raportarea densităţii optice la lungimea de undă.

De la spectrul regiunii 250-330 nm, aria de sub curbă (AUC) între 285 şi 305 nm este calculat cu formula:

Prin urmare, fiecare arie a suprafeţe picului 285-305 nm pentru fiecare punct din intervalul lui Fe3+este plotat pentru ilustraţia grafică. Tendinţa curbei este plotată (Excel), ecuaţia (corelaţia coeficientului R2pentru care cea mai apropiată valoare de 1 validează experimentul) este dedusă (Excel).

Ea poate fi o formă lineară sau polinomială de tipul: y = ax2+ bx +c. Prin experiment, această relaţie poate fi de tipul y = -0,0021x2+ 0,4819x + 0,4521; R² = 0,9966 (Fig. 2) (4). Pentru un amestec conform invenţiei, concentraţia echivalentului Fe3+produs într-un mediu de plasmă sau de Fe2+este reflecţia potenţialului de oxidare din invenţie şi este calculat prin ecuaţie (4). Aceasta este o metodă indirectă pentru măsurarea eficienţei redox a Amestecului 1 prin testarea în lumina UV a quercitinei oxidate de Fe3+. Prin urmare, o concentraţie a Fe3+«echivalent» este menţionata. De asemenea, este posibil de comparat potenţialul redox a unei soluţii conform invenţiei de testat, în raport cu o soluţie de referinţă conform invenţiei, cu alte cuvinte de a face o comparaţie cu cuantificarea eficienţei redox a unui amestec conform invenţiei.

2 - Fe2+calcul.

În acelaşi mod ca şi pentru ionul de Fe(III), un calcul este produs pentru ionul de Fe(II). De exemplu, absorbanţa UV (230 - 500 nm) al picului quercitinei oxidate de către Fe3+obţinut dintr-un amestec din invenţie la 1,22 µM de substanţă activă (250 µg/L) şi 2 min de contact cu Fe2+este de exemplu măsurat pentru şirul descris mai sus. Aceleaşi analize matematice a AUC precum cele descrise pentru ionul de Fe(III) pot fi realizate.

3 - Testarea eficienţei redox a amestecului din invenţie de exemplu la 1,22 µM (250 µg/L)de substanţă activă MoO4 2-.

Conform procedurii descrise în B-, eficienţa redox a unui amestec conform invenţiei (1,22 µM de MoO4 2-în plasmă umană) este testată pentru: i) evaluarea îmbătrânirea sa la temperatura camerei şi la 45°C, ii) validarea producerii sale şi evaluarea comparativă a formulărilor, iii) cuantificarea pasajului său transcutanat, iv) biodisponibilitatea sa şi, v) biofaza sa.

Conform ecuaţiei (4), aria specifică a picului de absorbanţă UV este calculată (ca un AUC) între 285 şi 305 nm al picului quercitinei oxidate de către Fe3+liber produs după contactul cu plasma pentru 2 min a amestecului din invenţie (ecuaţiile (1), (2) şi (3)) la o concentraţie finală de 1,22 µM cu complexul transferin-Fe3+. În medie, producerea echivalentului de Fe3+(Fe3+ eq) este de ordinul de la 30 la 50 µg/ml de plasmă.

4 - Calcul de estimare într-un mediu de plasmă a concentraţiei eficiente a amestecului conform invenţiei.

Fierul din plasmă nu este liber. Ea este legat de transferrin (sau siderofilin) în forma sa fierică (Fe3+) într-o cantitate de la 1 la 2 resturi per moleculă. Fierul în forma sa fieroasă (Fe2+) nu circulă în afara complexării sale cu hemoglobina. Se consideră că plasma umană folosită nu este hemolizată. Reacţia quercitinei din amestecul din invenţie cu cuprul din plasmă este considerată neglijabilă.

Un şir de concentraţii a amestecului din invenţie (15,2, 7,6, 3,8 şi 1,9 nM al MoO4 2-final) a fost incubat în plasma umană. Reacţia cu quercitina a fost realizată precum cele descrise în B-. Picul de absorbţie specifică (scăderea blank-ului plasmei + quercitina) a fost integrat precum cele descrise în B-1 (Fig. 3).

Calculul a fost plotat (Excel) la o scală polinomială şi tendinţa ecuaţiei a fost calculată (y = 0,0144x2+ 0,5863x + 0,4511 cu R2= 0,9934 (5); Fig. 4).

O relaţie de proporţionalitate (ecuaţia 5) este constatată între cantitatea din invenţie într-o concentraţie adăugată în plasma umană şi cantitatea de echivalent de Fe3+(ecuaţia 4) detectat prin reacţia de oxidare a quercitinei, adică 28,95, 12,19, 3,97, 3,12 µg de Fe3+ eq/mL de plasmă umană, conform şirului amestecului din invenţie descris mai sus.

Exemplul 5- Evaluarea eficienţei oxidării-reducerii din invenţie asupra plasmei umane

După adăugare amestecul conform invenţiei (Exemplul 1 - Amestec 1”) la plasma umană şi după un contact timp de 2 min, până la o concentraţie de 0,03038 µM de MoO4 2, reacţia de oxidare a quercitinei pentru producerea Fe3+eliberat de la transferinul din complexul plasmă-Fe3+şi reacţia Fenton-Haber-Weiss este optimum şi linear (compar. Exemplul 4).

După scăderea blank-urilor experimentale, o creştere a concentraţiei din invenţie generează o reducere a produceriiin situa quercitinei oxidate de Fe3+din cauza deplasării echilibrului reacţiei Fenton-Haber-Weiss (Fe3+⇄ Fe2+). Concentraţiile finale testate de MoO4 2-au fost apoi 0,00, 1,22, 4,05, 12,15, 24,30 şi 30,38 µM (Fig. 5).

Exemplul 6- Eficienţa antireplicării

A - Modelele

- Patru modele de contact de amestec conform Exemplului 1 („Amestec 1”) au fost testate. Ele reprezintă patru posibilităţi fiziologice că Amestecul 1 poate fi întâlnit pe durata unei aplicaţii terapeutice topice, adică:

Model 1: Amestec 1 pe celule infectate cu HSV-1.

Model 2: Amestec 1 pe celule incă neinfectate cu HSV-1.

Model 3: Amestec 1 pe celule incă neinfectate şi amestec 1 asupra HSV-1 liber (neinfecţios încă).

Model 4: Amestec 1 pe HSV-1 înainte de infectare.

- Doi timpi de contact a Amestecului 1 au fost testaţi, adică 2 min sau 1,5 min, şi apoi îndepărtarea amesteculuiui 1.

- Două concentraţii de amestec 1 au fost testate: 0,81 şi 2,03 µM de substanţă activă, adică 167 şi 417 µg/L, respectiv.

- Metodă pentru cuantificarea eficienţelor este qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction;Mullis K. et al. Specific Enzymatic Amplification of DNAIn vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, vol. 51 (Pt 1), p. 263-273.)

- Eficienţa antireplicare (AE) a Amestecului 1 asupra HSV 1 a fost evaluată în qPCR cu primerii specifici ai genomului viral (Kessler H.H. et al. Detection of Herpes simplex virus DNA by real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 2000, vol. 38(7), p. 2638-2642).

- Citotoxicitatea Amestecului 1 (C) asupra liniei BHK-21 a fost evaluată în qPCR cu primeri specifici ai genei sununităţii ribosomale mici 18S (Texcell - Evry, France).

- Multiplicitatea infecţiei (MOI): 1, adică 5,105TCID50(Doza inefectivă a culturii tisulare 50%).

- Experimentele qPCR au fost realizate la t0h (2 ore după contact între BHK-21 şi HSV-1, şi apoi îndepărtarea lui HSV-1), t2h- , t4h- şi t8h-post-infecţie.

- Rapotul AE/C ne oferă Indicile de Eficienţăin vitro(IE) a Amestecului 1 corespunzător la un model de studii.

Modelul 1:

BHK-21 + HSV-1 (2 ore; infecţie) => spălare (PBS) pentru îndepărtarea virală => probe t0h => + Amestec 1 (2 min) => spălare (mediu de cultură) pentru îndepărtarea Amestecului 1 => incubarea celulelor la 37°C => probe t2h-, t4h- şi t8h-post-infecţie.

Modelul 2:

BHK-21 + Amestec 1 (1,5 şi 2 min) => spălare (PBS) pentru îndepărtarea Amestecului 1 => celule + HSV-1 (2 ore; infecţie) => spălare (mediu de cultură) pentru îndepărtarea HSV-1 => probe t0h => incubarea celulelor la 37°C => probe t2h-, t4h- şi t8h-post-infecţie.

Modelul 3:

BHK-21 + Amestec 1 (1,5 şi 2 min) => spălare (PBS) pentru îndepărtarea Amestecului 1.

HSV-1 + Amestec 1 (1,5 şi 2 min) => spălare (PBS) pentru îndepărtarea Amestecului 1.

Amestecarea celulelor şi a viruşilor a fost în contact preliminar cu Amestecul 1 (2 ore; infecţie) => spălare (mediu de cultură) pentru îndepărtarea HSV-1 => probe t0h => incubarea celulelor la 37°C => probe t2h-, t4h- şi t8h-post-infecţie.

Modelul 4:

HSV-1 + Amestec 1 (2 min) => spălare (PBS) pentru îndepărtarea Amestecului 1 => + BHK-21 (2 ore; infecţie) => spălare (mediu de cultură) pentru îndepărtarea HSV-1 => probe t0h => incubarea celulelor la 37°C => probe t2h-, t4h- şi t8h-post-infecţie.

B -Rezultate

Reducerea la 8 ore al multiplicării celulelor HSV-1 în BHK-21 după contactul cu Amestecul 1 (în µg/L de substanţă activă) sau al aciclovirului (ACV); Indice de eficienţăin vitro(IE).

Tabelul 2

Reducerea replicării HSV-1 la t8h (%)* IE la t8h /model** Substanţă Amestec 1 ACV Amestec 1 Amestec 1 ACV Amestec 1 Timp de contact (min.) 2 2 2 1,5 1,5 2 2 2 1,5 1,5 Concentraţie (µg/L) 167 417 103 167 417 167 417 103 167 417 Modelul 1 -97 -98 -12 NT NT 37 48 2 NT NT Modelul 2 -72 -96 -1 -70 -86 4 23 1 3 7 Modelul 3 -93 -97 -6 -78 -90 14 35 1 4 10 Modelul 4 -56 -69 -52# NT NT 2 3 2# NT NT

* Reducerea replicării HSV (RR) de către substanţele testate (Amestec 1, control aciclovir) este exprimată ca procentaj şi corespunde la raportul cuantificărilor qPCR al genomurilor HSV-1 şi al citotoxicităţii care este evaluată prin cuantificarea sub-unităţii 18S al celulei gazdă: RR = {(100 x ([HSV-1]test/[18S]test)) / ([HSV-1]control+/[18S]control+)} - 100.

** Indicele Eficienţei Antireplicarein vitro(IE) al substanţelor testate este reprezantat prin ([HSV-1]/ [18S] evaluată pe qPCR specific) al controlului pozitiv infectat cu HSV ([HSV-1]control+/[18S]control+) faţă de cel al substanţelor testate (Amestec 1, control aciclovir): IE = ([HSV-1]control+/[18S]control+) / ([HSV-1]test/[18S]test).

# [ACV]: 1 g/L

- Cei mai buni EIs (Tabel 2) sunt obţinuţi după 2 minute de contact al Amestecului 1 şi cu o concentraţie de 417 µg/L. Observăm o influienţă semnificativă a timpului de contact asupra EIs (1,5 min şi 2 min; modelele 2 şi 3).

Els-urile obţinute cu modelele1 şi 3 la un contact timp de 2 min şi o concentraţie a Amestecului 1 de 167 µg/L, sunt deosebit de semnificative.

- Indiferent de model, Eis-ul obţinut cu aciclovir (“ACV”) nu sunt semnificative (Tabel 2).

Cuantificări procentuale prin qPCR (genă 18S sau HSV; la 8 ore post-contact de 2 min): i) al multiplicării liniei BHK-21 (control: linie neinfectată) şi, ii) al replicării HSV-1 (control: linie infectată).

Tabelul 3

Genă/genom 18S (%) HSV (%) Control Linie + (PBS - HSV) Linie + (PBS + HSV) Substanţă test Amestec 1 ACV mg/L Amestec 1 ACV mg/L Amestec 1 ACV mg/L [Substanţă activă] 167 µg/L 417 µg/L 167 µg/L 417 µg/L 167 µg/L 417 µg/L Model 1 45 27 108 (1) 49 30 118 (1) 1 < 1 76 (1) Model 2 62 41 57 (1) 68 44 62 (1) 19 2 61 (1) Model 3 118 70 111 (1) 98 58 92 (1) 7 2 86 (1) Model 4 120 107 97 (103) 139 123 111 (103) 64 38 54 (103) Teste 1 2 3 4 5 6 7 8 9

- Pentru Amestecul 1 (la 167 la 417 µg/L) sau ACV (la 1 sau 103mg/L), indiferent de controlul folosit (linie + PBS - HSV sau linie + PBS + HSV), cuantificarea rezultatelor lui 18S sunt comparabile pentru acelaşi model (Tabel 3, test 1vs.4,2vs.5,3vs.6).

- Pentru Amestecul 1, o eficienţă anti-replicare remarcabilă în funcţie de doză (Tabel 3, testele 7 şi 8) este constatată pentru modelele 1, 2 şi 3. Aceasta nu este observată pentru ACV (Tabel 3, test 9).

- O citotoxicitate comparabilă a Amestecului 1 (167 µg/L) şi a ACV (1mg/L) (Tabel 3) se observă Conform modelelor2 şi 3 (Tabel 3, teste 1, 3, 4 şi 6).

- O absenţa a eficienţei anti-HSV (Tabel 2 şi Tabel 3, test 9) pentru ACV (1 mg/L sau 1g/L) se observă. Modelele introduse pentru studiul Amestecului 1 nu pot corespunde la un studiu realizat cu ACV.

Pentru modelul1 (Amestecul 1 pe celule infectate).

- Cel mai bun IE (Tabel 2) cu două concentraţii de amestec 1 (2 min de contact, 167 şi 417 µg/L, IE: 37 şi 48, respectiv).

- Amestecul 1 are eficienţă directă (Tabelele 2 şi 3) asupra replicării virale intranucleare, asupra metabolismului celular probabil.

- Amestecul 1 are specificitate bună asupra celulelor infectate (Tabel 3, teste 4 şi 5; model 1vs.2).

Pentru modelul2 (Amestecul 1 pe o celulă înainte de infectare).

- Un IE interesant (Tabel 2; contact pentru 2 min şi 417 µg/L, IE: 23).

- Amestecul 1 are o acţiune asupra celulei care devine puţin receptivă la infecţie şi/sau dobândeşte un metabolism incompatibil cu replicarea virusului (Tabel 3, teste 7 şi 8).

Pentru modelul 3 (Amestecul 1 asupra celulei neinfectate şi HSV-1, separat şi înainte de amestecare).

- Un IE interesant (Tabel 2) cu două concentraţii de amestec 1 (2 min de contact, 167 şi 417 µg/L, IE: 14 şi 35, respectiv).

- În funcţie de doza aplicată (167 sau 417 µg/L) zero citotoxicitate (Tabel 3, test 4) sau citotoxicitate limitată (Tabel 3, test 5) pentru eficienţă antivirală foarte bună (Tabel 3, testele 7 şi 8, respectiv).

- Noi avem o eficienţă a Amestecului 1 care ar fi o acumulare a modelului2cu o acţiune semnificativă asupra celulei şi a modelului4cu o acţiune limitată doar asupra virusului (Tabelele 2 şi 3).

Pentru modelul 4 (Amestecul 1 asupra HSV-1).

- Un IE jos (timp de contact: 2 min, 167 şi 417 µg/L, IE: 2 şi 3, respectiv; Tabel 2) care este confirmat prin absenţa toxicităţii dar replicare virală semnificativă (Tabel 3, teste 8 şi 9).

C - Concluzii.

Asupra liniei BHK-21, principalele eficiente ale Amestecului 1 sunt: i) de a avea o toxicitate preferenţială asupra celulelor infectate, ii) de a inhiba replicarea virală în celula infectată şi, iii) de a limita infecţia celulei sănătoase.

Ţinta poate fi o membrană (receptori pentru viruşi, de exemplu) şi/sau metabolică (reglarea stresului şi căilor apoptotice, de exemplu).

Recunoaşterea virală şi internalizarea.

Conform modelului4, Amestecul 1 are o eficienţă scăzută anti-replicare directă la viruşi. În aceste condiţii experimentale, apropiate de utilizarea terapeutică topică, această observaţie este în favoarea unei alterări limitate a receptorilor virali la celulă: gB (HSV-2), gC (HSV-1), gD şi gH/gL (HSV-1 şi -2). Amestecul 1 ar schimba doar într-un mod limitat glicoproteinele virale prin reacţia sa Fenton-Haber-Weissin vitro.

Similar, nu am observat influienţă semnificantă a Amestecului 1 asupra membranei fosfolipidice a HSV care poate perturba penetrarea şi fuziunea membranei.

În aceste condiţii experimentale, Amestecul 1 nu este un virucid.

Replicarea virală şi metabolismul celular.

Tehnica qPCR foloseşte lizatul celular la 8 ore post-infecţie. O reducere în replicarea virală poate rezulta de la recunoaşterea slabă şi/sau internalizarea şi/sau replicarea (modificarea metabolismului celular indus de infecţie şi/sau Amestecul 1).

Dacă calea de desalinizare virală a fost modificată de Amestecul 1 fără modificare altor rute şi indiferent de model, Els-ul rezultat ar fi mult mai mic din cauza acumulării citoplasmatice a virionilor.

Conform modelului2(IE: 23 cu 2 min de timp de contact şi 417 µg/L), replicarea virală joasă după contactul preliminar al celulei cu Amestecul 1 (Tabel 2 şi Tabel 3, test 8) este observată.

Conform acestui model, celula BHK-21 a fost în contact timp de 2 min cu Amestecul 1. Timpul de contact cu HSV într-un mediu complet şi nutritiv de cultură a fost 2 ore. Amestecul 1 a indus modifcările celulelor având o durată de viaţă ce durează mai mult de 2 ore şi anticipând în continuare eficienţa profilactică a Amestecului 1.

În plus la recunoaşterea lui HSV-1 de către celulele parţial afectate de Amestecul 1 din cauza acţiunii probabile şi limitate asupra glicoproteinei virale gD (38% din replicare; Tabel 2), Această recunoaştere poate de asemenea fi afectată printr-o acţiune asupra receptorilor celulari la gD (HVEM şi nectin) precum şi asupra altor doi receptori celulari de suprafaţă la gB şi gH/gL care are heparan sulfaţi şi integrine.

Din cauza pătrunderei radicalice (modificarea potenţialului redox intracelular şi transmembranic, reglarea căilor de stres oxidativ), influxurile celulare de calciu pot fi mişcate. Aceste influxuri celulare de calciu sunt de asemenea induse de infecţia HSV. În orice caz ultimile pot fi demobilizate imediat din cauza introducerii în Amestecul 1 a agenţilor de chelare liberi şi non-permeabili (limitarea citotoxicităţii celulare). Alte modificări celulare majore din altă parte nu trebuie excluse şi pot corespunde reducerilor şi oxidărilor proteinelor (punţi cisteinil, de exemplu) şi în particular a proteinelor structurale care pot decurge în endocitozele virale.

Conform modelului3 (Tabel 2 şi Tabel 3, teste 7 şi 8), o reducere semnificativă în replicarea virală este observată (IE: 14 şi 35 pentru 2 min de timp de contact, 167 şi 417 µg/L, respectiv).

Ambele fenomene se acumulează. Primul este o acţiune limitată la viruşi (compar. modelul 4), al doilea mai semnificativ (compar. modelul 2) este la celulă.

Adăugarea Els-ului al modelelor2 şi 4 (2 min şi 417 µg/L), adică 23 şi 3, respectiv, oferă o sumă (26) mai puţin decât dar apropiată de cea obţinută experimental pentru modelul3, adică 35.

O acumulare potenţială i) de recunoaştere slabă a partenerilor HSV şi celule este contemplată şi ii) o internaţionalizare inhibată şi/sau replicarea în special prin modificarea metabolismului celular.

Modelul 1 (IE: 48 cu 2 min de timp de contact şi 417 µg/L) este cel mai performat.

Acţiunea amestecului antiinfecţios 1 este preferential asupra celulei decât asupra viruşilor. Această acţiune este cu atât mai mult performantă, deoarece celula este infectată în prealabil.

În acest model care corespunde cu cea mai bună problemă terapeutică, este evident că Amestecul 1 are o eficienţă farmacologică intracelulară specifică majoră. Pentru 417 µg/L de substanţă activă, Tabelul 3 arată că cantitatea de sub-unităţi ribozomale 18S este joasă (în funcţie de controlul folosit, 27 şi 30%, teste 2 şi 5) în acest model ca în modelul2 (în funcţie de controlul folosit, 41 şi 44%, teste 2 şi 5) şi în modelul 3 (în funcţie de controlul folosit, 70 şi 58%, teste 2 şi 5) care este un argument pentru specificitatea celulelor infectatevs.celulele sănătoase.

Ţintele Amestecului 1 în acest model nu pot fi nici recunoaşterea sau internalizarea, dar de fapt modificările metabolice. Ultimile sunt plasate într-un echilibru nou, în special din cauza pasajului radicalic transmembranic, modificarea potenţialului redox al celulelor şi prezenţa agenţilor de chelare externi, între căile de stres oxidativ (deja indus de infecţie), fluxurile de calciu (deja indus de infecţie), inhibarea eliberării dependentă de calciu a virionilor, modificările prin oxidare a proteinelor direct sau indirect implicate în replicarea virală.

Exemplul 7- Evaluareaex vivoa producerii interleucinelor

Biopsiile nepatologice (8 biopsii şi 4 donori) a pielei umane provenite de la operaţiile chirurgicale pentru reducerea greutăţii au fost tratateex vivocu Amestecul 1 (5 mg/L de substanţă activă; 2 min). Supernatanţii în care biopsiile au fost găsite au fost eşantionate la 6 ore şi 24 ore post-contact cu scopul de a cuantifica interferonii-α (IFN-α; inhibition of the infection with HSV; Mikloska Z. et al. Alpha and Gamma Interferons Inhibit Herpes Simplex Virus Type 1 Infection and Spread in Epidermal Cells after Axonal Transmission. J. Virol., 2001, vol. 75(23), p. 11821-11826), - β(IFN-β; inhibition of HSV replication; Sainz Jr. B. et al. Alpha/Beta Interferon and Gamma Interferon Synergize To Inhibit the Replication of Herpes Simplex Virus Type 1. J. Virol., 2002, vol. 76(22), p. 11541-11550) şi interleucin 6 (IL-6; inflammation marker).

Controlul experimental pozitiv este un solut fiziologic (NaCl 100mM).

Nicio modificare a nivelului de bază celular al IFN-a şi IFN-b nu a fost observat.

În funcţie de biopsii şi de donori şi prin urmare de trauma operaţiei chirurgicale şi manipulării experimentale.

La 6 ore post-contact (Fig. 6 şi 7):

- cu NaCl ca un control, producerea de IL-6 bazal de 277 pg/mL ± 11 la 2,866 pg/mL ± 206.

- cu Amestecul 1, inhibiţia al producerii IL-6 în raport cu controlul NaCl, de la 0 pg/mL la 1,015 pg/mL ± 17.

La 24 ore post-contact (Fig. 6 şi 7):

- cu NaCl control, producerea bazală a IL-6 de 1,485 pg/mL ± 37 la 7,454 pg/mL ± 199.

- cu Amestecul 1, inhibiţia producerii IL-6 în raport cu controlul NaCl, de 84 pg/mL ± 15 la 5,910 pg/mL ± 29.

Concluzii:

- producerea şi heterogenitatea supraproducerii (6 ore şi 24 ore, respectiv) pentru IL-6 post-contact NaCl şi Amestecul 1 (Fig. 6).

- o inhibiţie heterohenă a producerii IL-6 post-contact cu Amestecul 1 (5 mg/L de substanţă activă) care este în medie 28% la 6 ore şi 19% la 24 ore, în raport cu controlul NaCl (Fig. 6).

Prin această inhibiţie a producerii, Amestecul 1 are proprietatea de a fi un antiinflamator (Fig. 7).

Exemplul 8- Degradarea plasmei şi 1⁄2 viaţă.

Unul din donorii de radicali (în special HO2 ·, care are o durată de viaţă până la câteva secunde şi un indice de penetrare a celulelor notabil) printr-o reacţie de tip Fenton-Haber-Weiss a substanţei active MoO4 2-a Amestecului 1 este H2O2. Degradarea acestui traser a fost urmată pentru evaluarea ratei de consum a Amestecului 1 sau dezactivării lui.

Tehnica.

Amestecul 1 (68,9 µM sau final 14,2 µg/L) a fost incubat în plasmă umană proaspătă. Cinetica disparitiei H2O2a fost urmată de o reacţie peroxidazică asupra alicotelor eşantionate la timpi succesivi.

Rezultate.

- În medie (n = 10), procentajul degradării a substanţei traser a Amestecului 1 în plasmă umană la temperatura camerei după un contact timp de 2 min este de 85.3 ± 9.4%, 74% ± 15.2 % din care în primul minut.

- În primul minut, „Timpul de Degradare 50%” sau DT50= 0,812 min pentru o soluţie de amestec 1 la un iniţial de 68,9 µM de substanţă activă şi initial 1mM de H2O2.

- Rata de degradare KcH2O2: ≈ 740 µmoli de Amestec 1 la un iniţial de 1mM de H2O2/min./L de plasmă sau KcMoO42-: ≈ 51,0 µmoli de Amestec 1 la initial 68,9 µM de substanţă activă MoO4 2-/min/L de plasmă, în primul minut de incubare la temperatura camerei.

- Pentru o probă de 200 µL a Amestecului 1 la 24,3 µM (5,0 mg/L) de substanţă activă sau 353 mM (12 g/L) de traser H2O2, cu scopul unei aplicaţii terapeutice topice, unde sunt ≈ 5 nmoli de substanţă activă MoO4 2-sau 70 µmoli de traser H2O2. Aceasta probă, în 1L de plasmă, este degradată în ≈ 0,1 minute.

Exemplul 9- Hematoxicitate limitată asupra sângelui periferic.

Scopul acestui studiu este de a evalua hematoxicitatea Amestecului 1 (24,3 µM sau final 5,0 mg/L) după incubare de 2, 3 şi 5 minute în sânge periferic uman. Toxicitatea pentru care hematoliza este evaluată urmând principalii parametri ai sângelui, adică numărarea eritrocitelor, leucocitelor, hematociteelor, a trombocitelor, volumul mediul al globulelor şi nivelul hemoglobinei.

Concluzii.

Parametrii hematologici referitori la numărul de eritrocite, leucocite, hematocite, volumul mediu al globulelor şi nivelul hemoglobinei nu sunt modificate prin incubare timp de până la 5 minute cu amestecul conform invenţiei.

Numărul de trombocite este modificat prin contactul cu Amestecul 1 de la -35% imediat după adăugarea acestuia, la -69% la 5 minute.

Exemplul 10- Pasajul transcutanat limitat al amestecului conform invenţiei, absorbţia, biofaza şi biodisponibilitatea (OECD 428; EMEA, Uman Guideline, 2001).

Amestecul 1 utilizat a fost de cinci ori mai concentrat (Amestec 1 x 5) pentru a arăta cele mai mici pasaje substanţelor. Scopul acestui studiu a fost de a evalua (referinţă t0, t 2min., până la t60min) trecerea Amestecului 1 x 5, precum şi a markerului H2O2prin biopsiile neopatologice ale pielii umane.

Această procedură se aplică la trei tipuri de substrat: biopsie totală, biopsie disecată în epidermă pe de o parte şi în dermă pe de altă parte.

Tehnica.

Au fost testate 12 biopsiile de la 2 donatori (măsurători în picătură depuse pe fragmente [30 µL]) şi în mediu sub acestea (800 µL), conform ambelor metode (Tabelul 4): i) quercetina care evaluează eficienţa redox a Amestecului 1x5 şi, ii) peroxidaza care măsoară concentraţia H2O2a markerului.

Picătura (30 µL) depusă deasupra biopsiilor şi a fragmentelor epidermale şi dermice este de 5 ori mai concentrată în substanţa activă (121,5 µM sau 25,02 mg/L) şi în marker (1,77 M sau 60 g / L) decât formularea terapeutică. În 30 µL de depuneri de Amestec 1x5, există 3,65 nmoli sau 750 ng substanţă activă şi 53 µmol sau 1,8 mg marker.

Rezultate:

Tabel 4

Test Trial Biopsie* Epidermă* Dermă* Picătură 1 Eficienţă redox -1,4 la -10,5 -5,7 la -23,9 NT 2 marker H2O2 -16,5 la -57,7 -72,5 la -99,9 -99,6 Mediu 3 Eficienţă redox +3,7 la +9,0 +0,8 la +80,6 +44,5 la +100 4 H2O2marker < +0,001** la +0,09 +0,38 la +1,7 +0,16 la +0,46

* în % în raport cu t 0 (-: descreştere, +: creştere)

** limite de detecţie.

Se observă o scădere de ka joasă până la moderată (testul 1) a eficienţei redox a Amestecului 1 în picătură deasupra fragmentului (de la -1,4 la -23,9%).

Se observă o scădere moderată până la semnificativă (testul 2) a cantităţii de marker H2O2din Amestecul 1 în picătură deasupra fragmentului (de la -16,5 la -99,9%).

Se observă o creştere uşoară până la semnificativă (testul 3) a eficienţei redox a mediului sub fragment. Ea depinde de fragment şi de tipul acestuia. Când aceasta este o biopsie completă, această creştere datorată trecerii transcutanate este scăzută. În medie, acesta este de 6,35% şi corespunde trecerii a 232 pmoli (47,6 ng) de substanţă activă din Amestecul 1. Când aceasta este epiderma sau derma, această creştere este foarte variabilă (de la 0,8 la 100%). Acest lucru se datorează probabil diferenţelor în structurile histologice (porii, irigarea dermică a sângelui, terminarea nervilor epidermici, de exemplu).

O creştere de la nedetectabilă la uşoară (testul 4) a cantităţii de marker H2O2în mediu sub fragment este observată indiferent de tipul său (de la <+ 0,001 la 1,7%). Atunci când aceasta este o biopsie completă, această creştere datorată trecerii transcutanate este deosebit de scăzută (<0,53 până la 47,7 nmoli, adică <0,018 până la 1,62 µg). Când aceasta este epiderma sau dermul, în medie, această creştere este scăzută (1,04 şi 0,31%, adică 0,55 µmoli şi 0,16 µmoli sau 18,7 µg şi 5,6 µg respectiv).

Concluzii.

Există independenţă tisulară (absorbţie, dezactivare, permeaţie) a celor doi parametri consideraţi ca fiind tipici pentru Amestec 1, care sunt eficienţa redox datorită substanţei active şi dozei de marker peroxid, un donator de radicali.

Luând în considerare biopsia totală, indicele de penetrare a Amestecului 1 corespunde grosimii fragmentului, adică 1 mm (grosime medie a epidermei) până la 2 mm.

Epiderma conţine multe terminaţii nervoase care pot fi centrul desalinizării axonului de virioni herpetici la pacient. Acestea sunt ţintele Amestecului 1 în acelaşi mod ca celulele epidermice infectate sau înainte de o posibilă infecţie. Luând în considerare succesiunea ambelor ţesuturi, biofaza Amestecului 1 este cvasi-strict cea a grosimii epidermei (1 mm) şi este atinsă în totalitate pentru absorbţia ţesutului ţintă maxim.

Luînd în considerare că doar derma este vascularizată, cel mult 80,6% din eficienţa redox a Amestecului 1 poate fi găsită din nou la contactul său şi la 1,7% din marker. În aceste condiţii experimentale, biodisponibilitatea Amestecului 1 x 5 este de 2,94 nmol sau 605 ng substanţă activă şi 0,9 µmol sau 30,6 µg de marker peroxid.

Într-un studiu de genotoxicitatein vitro, cu testul Ames, amestecul conform invenţiei şi metaboliţii săi nu este mutagenic în prezenţa activatorului S9 (5/5 tulpini de Salmonella), este mutagenic la 1/5 tulpină în absenţa sa.

La aplicarea locală pe piele, fie stimulată sau nu, amestecul conform invenţiei (24,3 µM sau 5,0 mg /L de substanţă activă) nu are asociată nici o toxicitate legată iritare.

Într-un studiu a iritaţiei bucale şi vaginale, amestecul conform invenţiei (24,3 µM sau 5,0 mg/L) nu este iritant (scor 0/16) şi foarte slab (scor 1/16), respectiv.

Într-un studiu extrem de sensibil al iritaţiei membranei chorioalantoice a unui ou de găină, Amestecul 1 (18,23 şi 24,3 µM sau 3,75 şi 5,0 mg/L) este moderat iritant (Indice de iritare sau II = 6,8 ± 0,4 şi 6,3 ± 0/21 , respectiv).

Într-un studiu de toxicitate acută prin aplicare dermică, amestecul conform invenţiei la doze de 25,0 şi 31,3 µg/kg de substanţă activă conţinută în 60 şi respectiv 75 mg/kg de marker H2O2este bine tolerat fără nici un simptom, pentru o doză maximă tolerabilă (DMT) şi o doză maximă fără efecte dăunătoare observate (DMFEDO) sau "NOEEL" de 31,3 µg/kg de substanţă activă şi 75 mg/kg de marker.

Într-un studiu de toxicitate acută cu injecţie intravenoasă, amestecul conform invenţiei la doze de 10,4 şi 12,5 µg/kg de substanţă activă conţinute în 25 şi respectiv 30 mg/kg de marker de H2O2, este tolerat fără simptome notabile pentru o "Doză maximă tolerantă" (DMT) de 12,5 µg/kg substanţă activă.

Exemplul 11 -Toxicitate acceptabilă a amestecului conform invenţiei

I - Mutagenitatein vitro(Test Ames- OECD 471)

Scopul acestui studiu a fost evaluarea activităţii mutagene a amestecului activ conform invenţiei (Amestecul 1) şi a metaboliţilor săi (produsi de fracţia S9 a unui ficat de şobolan) pe tulpinile deSalmonella typhimuriumTA97a, TA98, TA100, TA102 şi TA1535.

Concluzii.

- Fără nici un sistem de activare S9, amestecul activ (7,7 µM sau 2,43 µM, adică 1,58 mg/L sau 0,50 mg/L) conform invenţiei şi metaboliţii săi nu au efecte mutagene asupra liniilor TA97a, TA98, TA100 şi TA1535.

- Cu un sistem de activare S9, amestecul activ (Amestec 1 x 5: 121,5 µM sau 25,02 mg/L) conform invenţiei şi metaboliţii săi nu au efecte mutagene asupra liniilor TA97a, TA98, TA100, TA102 şi TA1535.

- Fără nici un sistem de activare S9, amestecul activ conform invenţiei nu este mutagenic asupra liniei TA102 la 0.50 mg/L.

În acest testin vitro, efectul mutagen al amestecului activ şi al metaboliţilor săi, conform invenţiei, este limitat pentru utilizarea sa (tulpina TA102).

II - Dermato-sensibilizarea după inducţie (femela de hamster, OECD 406, ISO 10993-10: 2013 şi Memorandumul ICH SCCP 2005)

Conform protocolul Magnusson & Kligman (Magnusson B. et al. The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test", J. Invest. Dermatol., 1969, vol. 52(3), p. 268-276), potenţialităţile de sensibilizare ale pielii femelelor de hamster au fost studiate în conformitate cu trei protocoale.

Protocolul 1: Determinarea dozei limită tolerate.

Concentraţiile Amestecului 1 de la 1,25 mg/L la 20,00 mg/L de substanţă activă conţinute în 3 g/L până la 48 g/L de marker H2O2, respectiv într-un „plasture” de 1 ml au fost aplicate timp de 24 de ore pe flancul animalelor, iar apoi animalele au fost observate.

Concentraţia Amestecului 1 la 10 mg/L substanţă activă în 24 g/L de marker este bine tolerată şi provoacă iritaţii moderate.

Concentraţia Amestecului 1 la 5,0 mg/L de substanţă activă conţinută în 12 g/L de marker H2O2este bine tolerată şi este considerată ca doza maximă neiritantă.

Protocolul 2: Determinarea dozei limită tolerate după inducţie prin injectare subcutanată.

Concentraţii de la 5 mg/L la 10 mg/L de substanţă activă conţinute în 12 g/L la 24 g/L de marker H2O2, respectiv, a Amestecului 1 au fost injectate (100 µL) printr-o cale subcutanată. La 8 zile (prima provocare), a fost realizată o primă aplicare locală ca un plasture de 1 ml. La 27 zile (a doua provocare) a fost realizată o a doua aplicaţie locală ca un "plasture" de 1 ml. Observaţiile au fost făcute la 29 de zile.

Concentraţia Amestecului 1 la 5 mg/L de substanţă activă, conţinută în 12 g/L de marker, este bine tolerată şi nu produce iritaţii.

Protocolul 3: Studiul iritaţiei induse de stimulare şi aplicare topică a Amestecului 1 la 5 mg / l de substanţă activă conţinută în 12 g/L de marker H2O2.

Au fost injectate 100 µl de amestec 1 la 5,0 mg/L pe cale subcutanată. La 4 zile, zona injectată a fost stimulată cu o soluţie de dodecil sulfat de sodiu (SDS) la 10% înainte de aplicarea topică a Amestecului 1 (1 ml) într-un „plasture”. La 6 zile, a fost realizată o a doua aplicare topică. La 21 zile (provocare) s-a obţinut o aplicare topică a Amestecului 1 (1 ml) într-un "plasture" cu concentraţii de 6,26 până la 10 mg/L de substanţă activă conţinută în 15 până la 24 g/L de marker.

Amestecul 1 la 5,0 mg/L de substanţă activă conţinut în 12 g/L de marker este bine tolerat şi scorul sensibilizării cutanate de către formulare este egal cu 0/3.

Concluzii: Amestecul 1 la 5,0 mg/L de substanţă activă nu este iritant. Nu a fost observată nici o modificare macroscopică a pielii animalelor. În consecinţă, nu este nevoie de nici un studiu anatomo-patologic.

III - Iritare bucală şi vaginală (iepure femelă, OECD (99) 20, -21, -23 -24, - (95) 115, - (02) 9 şi ISO-10993-10.

Scopul acestui studiu a fost de a evalua toleranţa vaginală şi bucală a Amestecului 1 la 5,0 mg/L de substanţă activă conţinută în 12 mg/L de marker conform unei expuneri compatibile cu o utilizare terapeutică umană de 5 zile.

De la ziua 0 la ziua 6, la fiecare 24 ore, animalele sunt tratate (1 ml) printr-o cale bucală şi vaginală. La ziua 7, animalele sunt observate şi măsurată greutatea acestora.

Concluzii: Concentraţia Amestecului 1 la 5,0 mg/L substanţă activă este bine tolerată. Indicele iritatiei bucale si vaginale este de 0/16, respectiv de 1/16. În consecinţă, nu este nevoie de un studiu anatomo-patologic.

IV - Test de iritare ocular (ICCVAM App B).

Testul de iritare oculară a folosit testul de substituţie HET-CAM (Testul de ouă de găină - Membrana Chorioalantoică), publicat în Jurnalul Oficial din 26/12/1996. Ea este recomandată de ICCVAM.

Deşi această metodă deosebit de sensibilă nu este validată oficial de U.E., aceasta este acceptată pentru o utilizare care are ca scop localizarea substanţelor chiar uşor iritante, inclusiv a celor care ar fi iritante ocular, pentru a le atribui eticheta R41 (2002)

Pe scurt, metoda constă în aplicarea unei substanţe de testat a Amestecului 1 la 3,75 şi 5,00 mg/L dintr-o substanţă activă în 9 şi respectiv 12 g/L de marker pe membrana chorioalantoică a unui ou fertilizat de găină. La 0.5, 2 şi 5 minute după contact, se observă şi se notează următoarele trei criterii: hemoragie, coagulare şi hiperemie.

Rezultate şi concluzii.

Amestecul 1 la 3,75 mg/L sau 5,00 mg/L de substanţă activă poate fi clasificat ca fiind moderat iritant (indice de iritare sau II = 6,8 ± 0,4 şi respectiv 6,3 ± 0/21), adică induce o uşoară liză (severitate = 1/3) imediat după introducere sau la 30 de zile după contact, fără hemoragie sau coagulare.

Având în vedere valoarea Q (raportul dintre indicii între substanţele de referinţă pozitive NaOH 0,1M [ESTE = 15 ± 3] şi 1% SDS [10 ± 2]vs.Amestecul 1), Qvs.NaOH = 0,51 la 0,54 şi Qvs.SDS = 1,10 la 1,18 pentru Amestecul 1 la 3,75 şi 5,00 mg/L de substanţă activă, respectiv.

Prin urmare, în ceea ce priveşte acest test de sensibilitate extremă, care este mult mai semnificativ decât testul de iritare a vaginului deja desfăşurat asupra iepurilor de sex feminin, Amestecul 1 este considerat ca fiind o substanţă de la uşor (3,75 mg / l) până la moderat (5,00 mg / l) iritantă.

V - Studiul toxicităţii acute prin aplicarea cutanată şi injectarea intravenoasă - Dozele maxime tolerate (DMT) şi doza fără efect toxic observabil (NOAEL) (şobolan, OECD 474, ICH M3 (R2) şi S6 (R1)).

Scopul acestui studiu este de a determina doza maximă tolerantă (DMT) a Amestecului 1 prin aplicare cutanată (1 ml) sau prin injecţie intra-caudală (5 ml/kg). Observaţiile clinice sunt raportate până în ziua 14.

Concluziile protocolului aplicării cutanate.

Amestecul 1 are o doză de 50 µg/kg de substanţă activă (1 ml până la 10 mg/L), care este bine tolerată. Se observă un uşor eritem al zonei tratate, precum şi apariţia unor cruste mici care dispare în decurs de 2 zile. Nu se observă iritaţii.

Aceleaşi simptome în mod proporţional mai reduse sunt observate pentru o aplicare a Amestecului 1 de 37,5 µg/kg substanţă activă (1 ml la 7,5 mg/L).

Amestecul 1 la doze de 25,0 şi 31,3 µg/kg de substanţă activă (1 ml la 5,0 şi 6,26 mg / l) este bine tolerat. Nu se observă simptome cutanate, metabolice sau fiziologice la D14.

DMT a Amestecului 1 la o aplicare cutanată la şobolani este de 31,3 µg / kg de substanţă activă (1 ml la 6,26 mg/L).

NOAEL (doză fără efect toxic observabil) a Amestecului 1 în administrare cutanată la şobolani este de 31,3 µg/kg de substanţă activă (1 ml la 6,26 mg/L).

Concluziile protocolului de injectare intra-caudală.

Dificultatea administrării intravenoase a Amestecului 1 nu se află într-o toxicitate intrinsecă a invenţiei, ci pe descompunerea sa în contact cu sângele care generează în mod special oxigen molecular care poate fi responsabil pentru embolie. Doza limită etică (3 şobolani) care au demonstrat un stop respirator reversibil este de 14,6 µg/kg de substanţă activă (5 ml/kg din Amestecul 1 la 2,92 mg/L). Nu s-au înregistrat semne de toxicitate până la D14.

Amestecul 1 este tolerat după injectarea intravenoasă la 12,5 µg/kg substanţă activă (5 ml/kg din Amestecul 1 la 2,5 mg/L). Dificultăţi fiziologice (mişcări şi dificultăţi respiratorii) au fost observate la animale la momentul injectării. Nu s-au înregistrat semne de toxicitate până la D14.

Aceleaşi simptome, proporţional mai puţin semnificative, au fost observate după o injecţie intravenoasă la 10,4 µg/kg de substanţă activă (5 ml/kg din Amestecul 1 la 2,1 mg/L). Nu a fost nini un semnal clinic sau modificare a curbei de greutate. Nu s-au înregistrat semne de toxicitate până la D14. Observarea macroscopică a organelor la D14 după autopsie nu a dezvăluit nimic.

DMT a Amestecului 1 într-o injecţie intra-caudală este 12,5 µg/kg de substanţă activă (5 ml/kg de Amestecului 1 la 2,5 mg/L).

VI - Studiul genotoxicităţiiin vivoprin căutarea generării micronucleilor după injectarea intravenoasă a Amestecului 1 (masculi şi femele de şobolan, OECD 474 şi ICH S2 (R1)).

Au fost injectate femele de şobolan (n=5) şi şobolani masculi (n=5) (două tratamente la un interval de 22-26 ore, 5 ml / kg) cu transportorul de apă HPLC (cale intravenoasă) şi 10 mg / kg, cale intravenoasă şi metansulfonat de etil la 100 şi 150 mg / kg (cale intraperitoneală) şi Amestecul 1 la 1,46, 4,17 şi 12,5 µg / kg substanţă activă (cale intravenoasă).

Au fost observate morbiditatea, mortalitatea, greutatea animalelor şi parametrii clinici (temperatura, pielea, părul, ochii, membranele mucoase, secreţiile şi excreţiile, funcţia respiratorie şi neurologică, mersul şi postura). 36 ore la 48 ore după cel de-al doilea tratament, sângele animalelor a fost colectat şi analizat în citometrie în flux (controlul toxicităţii: reducerea proporţiei eritrocitelor imature (CD-71-pozitive). Proporţia de eritrocite imature micro-nucleate (reticulocite) a fost evaluată pe 4.000 de observaţii pe probă de sânge. Fiecare populaţie de şobolani (n = 10) pentru fiecare substanţă testată reprezintă 40.000 de observaţii (Tabelul 5).

Tabelul 5

Substanţă mg/kg Sex n Reticulocite (%) Reticulocitele micronucleate (%) Înainte de tratament # mascul 5 4,39±0,92 0,15±0,09 femelă 5 2,60±0,57 0,17±0,07 Controlul negativ Apă # mascul 5 5,17±1,47 0,32±0,31 femelă 5 3,82±0,29 0,12±0,04 Control pozitiv 1 ciclofosfamida 5 mascul 5 3,99±0,49 0,56±0,17 femelă 5 2,41±0,54 0,40±0,13 10 mascul 5 1,95±0,59 1,62±0,29 femelă 5 1,30±0,43 1,02±0,26** Control pozitiv 2 Metansulfonat 100 mascul 5 1,41±0,32 0,68±0,35** femelă 5 1,86±0,25 0,48±0,16** 150 mascul 5 1,33±0,34 0,81±0,48** femelă 5 0,45±0,33 0,59±0,26** Amestecul 1 1,46 .10-3# mascul 5 5,32±0,76 0,10±0,02 femelă 5 3,35±0,46 0,09±0,03 4,17 .10-3# mascul 5 4,82±0,41 0,11±0,03 femelă 5 3,35±0,83 0,09±0,02 12.5 .10-3# mascul 5 - 3* 4,79±0,16 0,22±0,12 femelă 5 - 1* 3,40±0,19 0,09±0,02

* animalele moarte în timpul primului tratament prin embolie datorită eliberării oxigenului molecular din Amestecul 1 în contact cu sângele.

** statistic diferit de grupul de control.

#în substanţă activă MoO4 2-

Conclusion: În comparaţie cu grupurile de control (pozitive şi negative), Amestecul 1 nu are nicio genotoxicitate prin inducerea producţiei de reticulocite micro-nucleate după injecţia intravenoasă la şobolani (n = 10, incluzând 5 masculi şi 5 femele) cu un interval de 1,46, 4,17 şi 12,5 µg/kg substanţă activă.

Exemplul 12- Comparaţie cu alte compoziţii.

Prezentul exemplu arată în mod deosebit influenţa compoziţiei, în special a potenţialului redox asupra:

1 - rolulului calciului în cataliza Fenton/Haber-Weiss "precum" formulărilor testate;

2 - existenţei unei diferenţe între trei formulări de substanţă activă de 5,0 mg/L.

S1: Amestecul 1,

S2: compoziţie conform US 6,660,289,

S3: compoziţie conform WO/2010/004161.

Protocolul 1 (Tabele 6 şi 7):

- 2 parametri măsuraţi: i) pH, ii) potenţial redox.

- catalizator CaCl2(1M, în H20): Adăugarea într-o concentraţie finală de 24 mM

- cinetică: iniţială (T0), 1, 2, 3 minute (T1, T2, T3) după adăugarea de CaCl2cu agitare.

Rezultate şi descriere.

Tabelul 6

Soluţia S1 T0 CaCl224mM T1 T2 T3 Medie (între T1 şi T3) D / T0 pH 4,70 ↓ la T0 4,58 4,59 4,59 4,59 timp de 3 min. -0,11 Pot. Redox E° (mV) 359 383 383 383 383 timp de 3 min. +24 Soluţia S2 T0 CaCl224mM T1 T2 T3 Medie (între T1 şi T3) D / T0 pH 2,85 ↓ la T0 2,65 265 2,66 2,65 timp de 3 min -0,20 Pot. Redox E° (mV) 437 479 475 474 476 timp de 3 min +39 Soluţia S3 T0 CaCl224mM T1 T2 T3 Medie (între T1 şi T3) D / T0 pH 3,01 ↓ la T0 2,86 2,87 2,87 2,87 timp de 3 min. -0,14 Pot. Redox E° (mV) 414 465 464 464 464 timp de 3 min +50

pH-ul pielii este de la 4,93 +/- 0,45 până la 5,12 +/- 0,56. pH-ul vaginal este în mod normal de ordinul 4,50 şi poate varia până la 6,00 la menopauză.

- Soluţia S1 este tamponată şi la un pH de ordinul unuia dintre pielea umană şi membranele mucoase. Acest pH rămâne relativ constant până la 3 minute de contact după adăugarea a 24 mM CaCl2final. Se observă o creştere moderată a E°, care poate proveni parţial din adăugarea clorului din CaCl2.

- Un pH acid amplifică peroxidarea citotoxică a lipidelor mediată de fier.

Soluţia S2 nu este tamponată. pH-ul său nu este foarte compatibil pentru contactul cu pielea sau mucoasa (inclusiv distrugerea probabilă a florei comensale într-o utilizare terapeutică). Acest pH rămâne relativ constant până la 3 minute de contact după adăugarea de CaCl2la o valoare finală de 24 mM. Se observă o creştere cel puţin un pic mai moderată faţă de S1 din E°, care poate proveni parţial din adăugarea clorului din CaCl2.

Soluţia S3 nu este tamponată. pH-ul său nu este foarte compatibil pentru contactul cu pielea sau membranele mucoase (inclusiv distrugerea probabilă a florei comensale într-o utilizare terapeutică). Acest pH rămâne relativ constant până la 3 minute de contact după adăugarea a 24 mM CaCl2final. Se observă o creştere semnificativă (+ 50mV) a E°, care poate proveni parţial din adăugarea clorului din CaCl2, dar cu privire la diferenţa de creştere potenţială faţă de S1 şi S2, probabil că nu ar fi acest singur factor.

În ceea ce priveşte ionii Fein situ, la un pH acid (<2,33), potenţialul redox este de ordinul 400 mV şi Fe în forma (III), adică în forma sa cea mai citotoxică. La un pH de ordinul 4,5, potenţialul redox este de ordinul a 300 mV, hemoglobina Fe în forma (II) şi plasma Fe complexată cu transferină în forma (III).

La pH-ul soluţiilor S2 şi S3, oxidul de fier formează Fe(OH)3foarte dezavantajat. În consecinţă, reacţiile Fenton-Haber-Weiss nu sunt foarte eficiente.

Valoarea potenţialului perechii Fe(OH)3/Fe2+(tip Fenton) este: E'° = 1,19 - 0,18 x pH.

Tabelul 7

Subst. act. (mg/L) pH E°Fe(OH)3/Fe2+ (mV)* E°Soluţia(mV) S1 5,0 4,70 344 354 S2 5,0 2,80 686 428 S3 5,0 3,00 650 418

* nivel celular cu fierin situ

Conform acestui studiu, există o confirmare a faptului că perechea Fe(OH)3/Fe2+este dezavantajată. Chiar dacă potenţialul redox al acestei perechi este îmbunătăţit (418 - 428 mV), acesta rămâne prea semnificativ pentru contactul celular.

- potenţialul transmembranar al unei celule animale este negativ (≈ -70 mV). Cu cât este mai semnificativ potenţialul de reducere a oxidării soluţiei, cu atât mai mare va fi modificarea potenţialului transmembranar şi mai mare va fi inducerea stresului oxidativ celular (inducerea genetică a apoptozei, a rutelor eNOS, ...) cu inducerea concomitentă a unui influx de calciu care potenţează stresul celular semnificativ deja indus de soluţiile 2 şi 3.

În consecinţă, pH-ul şi potenţialul redox al formulării S2 şi mai ales potenţialul redox al formulării S3 sunt cel mai probabil citotoxice. Ambele soluţii S2 şi S3 nu pot fi adecvate pentru utilizare terapeutică.

Protocolul 2 (Tabelul 8).

Concentraţiile de calciu în celule şi plasmă sunt de ordinul a 2 până la 3 mM. Acest protocol se bazează pe utilizarea terapeutică a formulărilor.

- 1 parametru măsurat: cantitate reziduală de peroxizi (H2O2, acid peracetic, interval de test Quantofix între 0 şi 25 mg/L).

- catalizator CaCl2(1M, în H2O): adăugare într-o concentraţie finală de 1,25, 2,5, 10, 25 şi 50 mM.

- volumul final: 1 ml = 0,950 µL de soluţie testată + 0,05 µL din diluţia de CaCl2. Factorul de diluare al soluţiei testate: 1.05. Concentraţia finală a soluţiei testate 11,4 g/L (iniţial 12 g/L) de marker H2O2conţinând 4,76 mg/L substanţă activă (iniţial 5,00 mg/L).

- cinetică: la 5 minute după adăugarea de CaCl2cu agitare.

Rezultate.

Tabelul 8

Test Soluţia testată [CaCl2] Final (mM) [peroxizi]final(mg/L) 1 S1 50 >>25 2 S1 25 10-25 3 S1 10 10 4 S1 2,5 5-10 5 S1 1,25 ≈25 6 S2 2,5 >25 7 S3 (WO/2010/004161) 2,5 >25 8 S3 (WO/2010/004161) 1,25 ≈25

Dezactivarea formulării S1 la 5 minute de contact cu CaCl22,5 mM (concentraţie fiziologică) corespunde unei scăderi a peroxidului cu un factor de 1,500 (Testul 4), adică de la 12 g/L la 8 mg/L de marker şi 5.00 mg/L la 3,33 µg/L de substanţă activă).

Concluzii comparative privind formulările S2 şi S3

Soluţia S2, indiferent de metalul utilizat, nu este compatibilă cu o aplicaţie terapeutică, prin:

- pH-ul acesteia ne-tamponat pentru menţinerea potenţialităţilor sale,

- potenţialul acesteia redox citotoxic,

- independenta relativa faţă de cataliza calciului,

- citotoxicitatea acesteia în condiţii fiziologice datorită H2O2şi a acidului peracetic (în plus faţă de prezenţa ionilor Ag+, de exemplu, având o citotoxicitate ireversibilă),

- în condiţiile experimentale utilizate, nu există o cataliză asemănătoare cu Fenton-Haber-Weiss, prin urmare nu există o producţie radicală reactivă pentru utilizarea terapeutică.

Soluţia S3, indiferent de metalul utilizat şi de perechea de chelatizare descrisă în cererea de brevet WO2010/004161, nu este compatibilă cu o aplicaţie terapeutică, prin:

- pH-ul acesteia nu este compatibil cu BAPTA,

- potenţialul redox citotoxic al acesteia,

- independenta relativă la cataliza cu calciu,

- citotoxicitatea acesteia în condiţii fiziologice datorate la H2O2şi acidul peracetic,

- în condiţiile experimentale utilizate, nu există o cataliză asemănătoare cu Fenton-Haber-Weiss, prin urmare nu există o producţie radicalică reactivă pentru utilizare terapeutică.

Dimpotrivă, modelul chimic de reacţie al formulării S1 conform invenţiei este corect din cauza destabilizării sale prin calciu.

Pentru formularea S1, selecţiile:

- pH-ului,

- perechii de tamponare (adăugarea unui singur element al perechii: acid acetic, deoarece acidul peracetic este uşor produsin situ),

- metalului de tranziţie şi a valenţelor sale compatibile cu reacţiile de tip Fenton-Haber-Weiss sau nu,

- perechii de agenţi de chelare (compatibilitate între acestea cu KdCa2+şi KdMo, KdFe2+/Fe3+într-o "cascadă"),

- penetrarea non-celulară a agenţilor de chelare,

- activării complexului soluţiei S1 prin calciu sau de alţi ioni metalici existenţiin situ, la doze fiziologice şi pH (importanţa selecţiei agenţilor de chelare), la un potenţial redox care limitează în special oxidarea lipidelor (producţia mică de Fe (III)) şi generarea instantanee a radicalilor reactivi permeabili într-un interval scurt, fără acumulare, fac ca această formulare să fie compatibilă cu utilizarea terapeutică.

Soluţia S1 este foarte puternic degradată la concentraţii fiziologice de calciu cu un minim la 2,5 mM. O reducere (1,25 mM) sau o creştere (de la 10 la 50 mM) a acestei concentraţii non-fiziologice de calciu modifică puternic această degradare a peroxizilor datorită reacţiilor asemănătoare cu Fenton-Haber-Weiss prin înlocuirea echilibrelor. Complexul chimic corespunzător soluţiei S1 este complet adaptat la o reacţie specifică în constanta calciului în celule şi plasmă.

Exemplul 13- Exemplu de amestec activ conform invenţiei cu o combinaţie de Mo şi La.

Acest exemplu de compoziţie ("Amestecul 2") conform acestei invenţii este realizat cu o sare de molibden şi o sare de lantan. Se prepară o compoziţie cu formula conform Tabelului 9, exprimată ca concentraţia iniţială a componentelor:

Tabelul 9

Compoziţia este denumită "iniţială" deoarece corespunde concentraţiilor reactivilor adăugaţi fără a lua în considerare procesul catalitic utilizat.

Toate substanţele utilizate în sinteză şi produsul finit sunt validate prin spectrul IR-FT.

Tabelul 10

Produs Puritate Formulă Moleculară N° CAS Molibdat de sodiu dihidrat 98-103% Na2MoO4 .2H2O 10102-40-6 Nitrat de lantan hexahidrat ≥99% La(NO3)3 .6H2O 10277-43-7 BAPTA: acid (1,2-bis(o-aminofenoxi)etan-N,N,N',N'-tetraacetic) ≥98% C22H24N2O10 85233-19-8 EGTA: acid (etilen glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N′,N′-tetra acetic) ≥99% C14H24N2O10 67-42-5 Peroxid de hidrogen 29-31% H2O2 722-84-1 Acid acetic glacial* 99,8-100,5% CH3COOH 64-19-7 Acetat de sodiu trihidrat 99-101% C2H3NaO2 .3H2O 5010524 Hidroxid de sodiu 10N NaOH 1310-73-2 Apă demineralizată 1µS H2O 7732-18-5

Substanţa activă este: (MoO4)1-, Na+(hidroperoxo-molibdat de lantan).

Greutate moleculară: 481,81 g/mol.

Proces de fabricaţie.

Procesul de fabricaţie este identic cu cel al Amestecului 1 din Exemplul 1, cu excepţia modificărilor descrise mai jos.

- Două soluţii SC sunt pregătite.

Soluţia A - Na2MoO4 .2H2O (sursă de Mo(VI); 100%) 200 mg (final 2,4 mM)

Apă: qsp 340 ml

Agitare uşoara, temperatura camerei

Soluţia B - La(NO3)3 .6H2O (sursă de La(III); 100%) 200 mg (1,4 mM final)

Apă: qsp 340 ml

Agitare uşoara, temperatura camerei.

- Soluţia A (10 mL) şi apoi Soluţia B (10 mL) sunt introduse treptat în soluţia de Si2 pentru a prepara o soluţie S1 de hidroperoximolibdat de lantan.

- ETAPA (vii): Adăugarea agenţilor de chelare - Pregătirea unei soluţii S4

Introducerea BAPTA (98,8%): 20 mg/L,

Introducerea EGTA (99,1%): 400 mg/L

- pH-ul soluţiei finale este ajustat prin NaOH la 4,67

- Eredoxfunal este: 380 mV.

În Amestecul 2, concentraţia finală de La(MoO4)1-, Na+este: 20,8µM.

Exemplul 14- Evaluarea eficienţei de oxido-reducere a invenţiei în complex dublu molibdat şi lantanat asupra plasmei umane.

Pentru a compara eficienţa oxidativă a formulărilor (MoO4)2-(Amestecul 1) şi La(MoO4)1-(Amestecul 2) cu concentraţii comparabile cu cele descrise în Fig. 3 şi mai mici decât cele descrise în Fig. 5 au fost contactate cu plasmă umană timp de 2 minute. După scăderea blanku-rilor experimentale, în special în această zonă de concentrare, Amestecurile 1 şi 2, conform invenţiei, generează o creştere a producţieiin situde quercetină oxidată. Concentraţiile finale de MoO4 2-şi La(MoO4)1-testate au fost apoi: 0,00, 3,80, 7,59, 1215 nM and 0.00, 3,25, 6,50, 1,040 nM respectiv (Fig. 8).

Diferenţa dintre producerea de quercetină oxidată (picul în jur de 295 nm) între cele două formulări (Amestec 1 şi Amestec 2) nu este semnificativă. Eficacitatea oxidoreductivă între cele două compoziţii conform invenţiei este comparabilă.

1. Bacon T.H. et al. Clin. Microbiol. Rev., no 16(1), 2003, p. 114-128

Claims (29)

1. Compoziţie sau amestec, terapeutic activ pentru cale topică, conţinând: - cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), lantanidă, în particular lantan; - cel puţin un agent de chelare; - cel puţin o sursă de radicali de peroxidare; - cel puţin un agent tampon; unde amestecul sau compoziţia specificată are un potenţial redox de la 250 la 550 milivolţi.

2. Compoziţie sau amestec, conform revendicării 1,caracterizată prin aceea căcompoziţia sau amestecul menţionat are un potenţial redox de la 300 la 450 milivolţi şi chiar mai de preferinţă de la 300 la 420 milivolţi.

3. Compoziţie sau amestec, conform revendicării 1 sau 2,caracterizată prin aceea cămetalul din metalat este de valenţă maximă.

4. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-3,caracterizată prin aceea cămetalul este oxidat până la gradul său maxim de oxidare.

5. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-4,caracterizată prin aceea căsarea metalului este o sare a molibdenului sau conţinând molibden.

6. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-5,caracterizată prin aceea căsarea metalului este sarea lantanidei sau conţinând o lantanidă.

7. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-6,caracterizată prin aceea căsarea metalului este un amestec a unei sări a molibdenului şi a unei sări a lantanidei.

8. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-7,caracterizată prin aceea căsarea molibdenului este de preferinţă o unitate peroxo sau hidroperoxo.

9. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-8,caracterizată prin aceea căsubstanţa activă este de tipul MoO4 2-sau forma sa hidroperoxo.

10. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-9,caracterizată prin aceea căea include cel puţin doi agenţi de chelare.

11. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-10,caracterizată prin aceea căagentul(agenţii) de chelare are(au) cel puţin trei grupe de coordonare, de preferinţă grupe ale acizilor carboxilici, la trei capete ale moleculei(moleculelor) formând agentul(agenţii) de chelare, grupele de coordonare menţionate fiind separate printr-o catenă din cel puţin trei atomi inclusiv cel puţin un atom de azot.

12. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-11,caracterizată prin aceea căagentul de chelare este selectat dintre BAPTA, EGTA şi orice amestecuri ai acestora.

13. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-12,caracterizată prin aceea căsursa principală de radicali de peroxidare este prezentă la o concentraţie variind de la 200 la 600 mM, de preferinţă de la 300 la 500 mM şi de preferinţă de la 340 la 450 mM.

14. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-13,caracterizată prin aceea căamestecul include un agent tampon permiţând un pH de la 4,0 la 5,2, de preferinţă de la 4,4 la 5,0 de exemplu un acid carboxilic şi de preferinţă acid acetic.

15. Compoziţie sau amestec, conform oricăreia din revendicările 1-14,caracterizată prin aceea căamestecul are un potenţial redox de la 350 la 420 milivolţi.

16. Metodă de preparare a unui amestec sau a unei compoziţii precum este definit, conform oricăreia din revendicările 1-15,caracterizată prin aceea căinclude (i) prepararea unei soluţii tampon (ST) conţinând un agent tampon având un pH acid, (ii) prepararea unei soluţii a unui complex metalic (SC) conţinând sarea unui oxid metalic, (iii) prepararea unei prime soluţii iniţiale (Si1) conţinând peroxid de hidrogen, (iv) prepararea unei soluţii iniţiale secundare (Si2) prin amestecarea soluţiei ST cu soluţia Si1, (v) prepararea unei soluţii (S1) conţinând un compus peroxo-metalic prin amestecarea soluţiei SC cu soluţia Si2, (vi) prepararea unei soluţii S2 prin ajustarea pH-lui soluţiei S1 cu o bază, pH-ul soluţiei S2 fiind mai bazic decât pH-ul soluţiei ST, (vii) adăugarea la soluţia S2 a unui sau câţiva agenţi de chelare, (viii) ajustarea opţională a pH-ului, (ix) ajustarea opţională a volumului soluţiei finale, obţinerea unui amestec sau a unei compoziţii precum este definit conform oricăreia din revendicările 1-15.

17. Metodă, conform revendicării 16,caracterizată prin aceea căperoxidul de hidrogen este prezent în soluţia Si1 la o concentraţie variind de la 200 la 600 mM, de preferinţă de la 300 la 500 mM şi de preferinţă de la 330 la 460 mM.

18. Metodă, conform revendicării 16 sau 17,caracterizată prin aceea căagentul tampon al soluţiei ST este un tampon acid carboxilic/carboxilat şi soluţia ST are un raport de peroxid de hidrogen/carboxilat inclus între 20/1 şi 1/1, si de preferinţă aproximativ 5/1.

19. Metodă, conform oricăreia din revendicările 16-18,caracterizată prin aceea cămetoda include o măsurare a potenţialului redox în etapele (iii) până la (ix), de preferinţă de asemenea include o măsurare a pH-ului în etapele (iii) până la (ix).

20. Metodă, conform oricăreia din revendicările 16-19,caracterizată prin aceea că,compusul peroxo-metalic al soluţiei S1 este un compus peroxo-molibdenic.

21. Compoziţie farmaceutică sau un amestec, conţinând cel puţin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin un agent tampon şi o sursă de radicali de peroxidare, unde amestecul sau compoziţia specificată are un potenţial redox de la 250 la 550 milivolţi.

22. Compoziţie farmaceutica pentru uz extern,caracterizată prin aceea căea include un amestec sau o compoziţie terapeutic activă, având un potenţial redox de la 250 până la 550 milivolţi, precum este definită conform oricăreia din revendicările 1-15, sau care poate fi obţinută conform unei metode precum este definită în oricare din revendicările 16-20.

23. Compoziţie farmaceutica pentru uz extern, conform revendicării 21 sau 22,caracterizată prin aceea căinclude de la 0,001 la 5 mM, de preferinţă de la 0,01 la 2 mM, de preferinţă de la 0,02 la 1 mM de un amestec farmaceutic activ.

24. Compoziţie farmaceutică pentru uz extern, conform oricăreia din revendicările 21-23, pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic a unei infecţii virale, şi în particular implicând un virus din familiaHerpesviridae.

25. Compoziţie farmaceutică, conform oricăreia din revendicările 21-24, pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic a unei infecţii implicând HSV-1 şi/sau HSV-2.

26. Compoziţie farmaceutică, conform oricăreia din revendicările 21-24, pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic antiinflamator.

27. Compoziţie farmaceutică, conform oricăreia din revendicările 21-26, pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic preventiv sau curativ.

28. Compoziţie farmaceutică, având un potenţial redox de la 250 până la 550 milivolţi şi conţinând molibden, cel puţin un agent de chelare, cel puţin un agent tampon şi o sursă de radicali de peroxidare pentru utilizarea sa într-o metodă de tratament terapeutic al herpesului.

29. Metodă de tratament terapeutic conţinând administrarea, mai avantajos prin aplicare topică, la un subiect ce are nevoie de o cantitate terapeutic eficientă a unei compoziţii farmaceutice conţinând cel putin o sare a unui metal, metalul fiind selectat dintre molibden (Mo), wolfram (W), vanadiu (V), aur (Au), o lantanidă, în particular lantan; cel puţin un agent de chelare; cel puţin un agent tampon si o sursă de radicali de peroxidare, unde compoziţia are un potenţial redox de la 250 până la 550 milivolţi