EA038115B1 - Терапевтически активная композиция для лечения инфекций hsv-1 и/или hsv-2, способ ее получения и способ терапевтического лечения инфекций hsv-1 и/или hsv-2 с ее помощью - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к терапевтически активным композициям, предназначенным для терапевтического лечения инфекций HSV-1 и/или HSV-2. Например, подобная композиция может включать по меньшей мере одну соль металла, выбранного из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V) и золота (Au), по меньшей мере один хелатирующий агент, по меньшей мере один источник пероксидирующих радикалов, по меньшей мере один буферный агент. При этом окислительно-восстановительный потенциал композиции составляет от 250 до 550 мВ. Также предложены фармацевтические композиции на основе подобной терапевтически активной композиции. Данные композиции находят применение в способе терапевтического лечения инфекций HSV-1 и/или HSV-2.

Description

Настоящее изобретение относится к активной смеси для терапевтического лечения, где указанная смесь содержит пероксометаллат, например, такой как пероксомолибдат и/или, например, пероксолантанат.

В частности, настоящее изобретение относится к активной смеси для профилактического и терапевтического лечения инфекций, вызванных Herpesviridae, и, в частности, инфекций, вызванных вирусами Herpes simplex I (HSV-1 или HHV-1) и Herpes simplex 2 (HSV-2 или HHV-2). Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим такую активную смесь, к способам приготовления, а также к их применению, в частности, в области терапевтического лечения.

Предшествующий уровень техники

Среди инфекционных патологий заболевания, обусловленные вирусами, в дополнение к их изменчивой тяжести в зависимости от их типов, которая может варьировать вплоть до смерти пациента, и с очень неравномерной заболеваемостью в зависимости от популяций и времени, представляют собой важную терапевтическую проблему. Для этого патогена требуется метаболизм клетки-хозяина и ее компоненты, которые он использует для размножения, поэтому уничтожение патогена затруднено из-за необходимости лечения без повреждения здоровой ткани по отношению к инфицированной ткани, или даже профилактического лечения.

Среди вирусных инфекций, которые могут поражать людей, инфекции, вызванные Herpesviridae, являются распространенными, высококонтагиозными и эндемичными. Это семейство ДНК-содержащих вирусов состоит из восьми типов вирусов. Среди них HHV-1 или HSV-1 и HHV-2 или HSV-2 вызывают орофациальный-лабиальный и вагинально-анальный герпес.

Все вирусы герпеса разделяют клинические белковые и геномные структурные свойства, такие как латентность, рекурренция или литическая активация. Как и для всех вирусных инфекций, терапевтические средства сложны и часто ограничены. Настоящее изобретение направлено на решение технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтической композиции, дающей возможность противодействия вирусной инфекции, в частности вирусной инфекции, включающей Herpesviridae, и, в частности, HSV-1 и HSV-2.

Инфекции, вызванные HSV-1 и HSV-2, являются высококонтагиозными (главным образом, при контакте) и эндемичными (Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), январь 2016 г., Вирус герпеса, меморандум № 400, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs400/fr/#). Резервуаром является человек, без какого-либо зооноза или какого-либо вектора. Распространенность инфекций, вызванных вирусом HSV-1, ответственным за орофациальный-лабиальный герпес, определенные формы генитального герпеса и герпетической паронихии, меняется в зависимости от континентов, методов и возможностей диагностики. Она составляет в среднем от 84 до 99% в Африке, от 50 до 100% в Азии, от 65 до 98% в Европе и от 57 до 68% в Северной Америке. Распространенность инфекций, вызванных HSV-2, ответственным за генитальный и анальный герпес, меняется в зависимости от пола, социологического и этнического профиля, возраста и континента. Например (в соответствии с данными Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC), 2010, MMW R Morb Mortal Wkly Rep., 59 (15): 456-459), серопревалентность в Соединенных Штатах в возрасте от 40 до 49 лет по оценкам составляет 32% у женщин и 20% у мужчин.

По результатам анализа уровня заболеваемости HSV-1 и HSV-2 инфекции оказывают определенное влияние во всем мире. Действительно, не существует абсолютно эффективного радикального лечения с точки зрения эрадикации патогена, независимо от того, осуществляют ли применение противовирусных препаратов пероральным или парентеральным путем, независимо от того, представляет ли это лекарственное средство аналог пирофосфата (например, фоскарнет), аналоги неактивируемых или активируемых нуклеозидов in situ (например, фиацитабин, видарабин, ацикловир и его пролекарство валацикловир), или ингибитор ферментативного комплекса геликаза-праймаза (прителивир). Они способствуют снижению тяжести и частоты симптомов, но не уничтожают инфекцию. Чаще всего из-за низкой растворимости этих веществ, и в частности, представителей семейства цикловир (1,3 мг/мл в воде при 25°С для ацикловира), а также их ограниченной абсорбции в кишечнике (порядка 20% для ацикловира при пероральном приеме), пациенты должны принимать последующие дозы.

В отличие от офтальмологических препаратов для местного применения анти-HSV вещества, используемые в дерматологии (например, циклофовир, ибацитабин, ацикловир), имеют клиническую эффективность, которая остается средней и непостоянной.

Кроме того, описано появление приобретенных форм резистентности у вируса простого герпеса при традиционных пероральных методах лечения или при парентеральном применении. Они чаще всего связаны с мутациями вирусного генома (Bacon Т.Н. et al., 2003, Clin. Microbiol. Rev., 16 (1), 114-128; Biswas S. et al., 2008, Antiviral Res., 80 (1), 81-85).

В дополнение к параметрам инфективности боли и рецидивирующему нарушению эстетичности у пациента во время вирусной реактивации эти инфекции могут осложняться тяжелыми и сложными патологиями, хотя и довольно редкими, например герпетическим энцефалитом или кератитом. Неонатальное заражение от матери связано с 60% смертностью при отсутствии лечения. Герпетические инфекции и их развитие могут быть связаны с другими патологиями из-за наличия иммунодепрессии (как индуцирован- 1 038115 ной, так и патологической) или иммуносупрессии у пациента, например, такой как при определенных видах рака или после трансплантации. HSV-2 является одной из наиболее распространенных инфекций (от 60 до 90%) среди ВИЧ-инфицированных лиц. Риск заражения новой ВИЧ-инфекцией возрастает в три раза при наличии HSV-2 инфекции. У носителей обеих инфекций отмечается более высокий риск передачи ВИЧ.

Таким образом, задачей изобретения является решение технической проблемы, заключающейся в обеспечении способа получения такой фармацевтической композиции.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая является приемлемой для местного применения.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая легко растворяется в гидрофильных растворителях.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении активной фармацевтической композиции для трансэпидермального переноса.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтической композиции, которая является дезактивированной при проникновении через кожу.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтической композиции, биофаза которой хорошо ограничена и достижима.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтической композиции с минимальной биодоступностью.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, обладающей эффектом противодействия репликации вируса, в частности HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, обладающей высокой цитотоксичностью для клеток, инфицированных вирусом, и, в частности, HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, обладающей низкой цитотоксичностью для здоровых клеток.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая обладает профилактической эффективностью, и в частности, против HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая обладает профилактической эффективностью, особенно во время продромальной фазы инфекции, и, в частности, HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая обладает профилактической эффективностью, в частности, путем сокращения острой фазы, и, в частности, для HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, которая может предотвращать или ограничивать инфекционный процесс, и, в частности, для HSV.

Задача изобретения также состоит в решении технической проблемы, заключающейся в обеспечении фармацевтически активной композиции, имеющей хорошую стабильность при ее хранении при комнатной температуре и до 45°С.

Описание изобретения

Авторы изобретения обнаружили, что можно решить технические проблемы, упомянутые выше, путем получения фармацевтически или терапевтически активной смеси, содержащей по меньшей мере один пероксометаллат.

Фармацевтически активная означает то, что смесь или композиция обладают полезной активностью в рамках терапевтического лечения.

Термин смесь относится к композиции и не ограничивает состав, предназначенный для конкретного препарата или способа изготовления. Термин смесь в настоящей заявке обеспечивает возможность более простого отличия с семантической точки зрения смеси от композиции, в частности, например, когда смесь интегрируют в композицию, которая содержит другие ингредиенты.

Изобретение более конкретно относится в соответствии с первым аспектом к композиции или смеси, предпочтительно терапевтически активной при местном применении, содержащей по меньшей мере одну соль металла, причем металл выбран из молибдена (Мо), вольфрама (W), ванадия (V), золота (Аи), лантаноида, в частности лантана;

по меньшей мере один хелатирующий агент;

по меньшей мере один источник пероксидирующих радикалов;

по меньшей мере один буферный агент.

Изобретение относится предпочтительно к композиции или смеси, предпочтительно терапевтиче- 2 038115 ски активной при местном применении, содержащей по меньшей мере одну соль металла, где металл выбран из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V), золота (Au), лантаноида, в частности лантана;

по меньшей мере один хелатирующий агент;

по меньшей мере один источник пероксидантных радикалов;

по меньшей мере один буферный агент;

где указанная смесь или композиция предпочтительно имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ, предпочтительно от 300 до 450 мВ и более предпочтительно от 300 до 420 мВ.

Смесь в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно дает возможность получения лекарственного средства и более конкретно стабильного и активного лекарственного средства in situ.

Смесь в соответствии с настоящим изобретением состоит из равновесия вышеупомянутых соединений, преимущественно образующих пероксометаллический комплекс, включающий его соли. Согласно авторам изобретения, не углубляясь в какую-либо теорию, смесь в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает возможность образования сверхмолекулярной структуры типа решетки в устойчивом меняющемся равновесии, что дает возможность обеспечить на внеклеточном уровне и in situ катализатор для реакций, подобным реакциям Фентона и Габера-Вейса. Эти реакции называются подобными, когда они происходят из-за металла из смеси по изобретению или другого металла, который не является железом. Часть реакционноспособных веществ, образующихся экстратемпорально активным веществом, проникает в клетку и более предпочтительно в инфицированную клетку.

В соответствии с одним вариантом осуществления композиция включает несколько солей металлов, причем металл выбран из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V), золота (Au), лантаноида, в частности лантана.

В зависимости от способа получения соль металла представляет собой молибденовую соль или соль, содержащую молибден.

Согласно способу получения соль металла представляет собой соль лантаноида или соль, содержащую лантаноид.

Согласно способу получения соль металла представляет собой смесь молибденовой соли и лантаноидной соли.

Изобретение относится предпочтительно к композиции или смеси, предпочтительно терапевтически активной при местном применении, содержащей по меньшей мере одну соль молибдена (Mo), при необходимости в комбинации по меньшей мере с одной солью металла, выбранного из вольфрама (W), ванадия (V), золота (Au), лантаноида, в частности лантана;

по меньшей мере один хелатирующий агент;

по меньшей мере один источник пероксидантных радикалов;

по меньшей мере один буферный агент;

где указанная смесь или композиция предпочтительно имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ, предпочтительно от 300 до 450 мВ и более предпочтительно от 300 до 420 мВ.

Предпочтительно соль металла присутствует в виде оксида(ов) или пероксида(ов) в смеси. Предпочтительно оксиды металлов в смеси по изобретению дают возможность образования промежуточного соединения, которое представляет собой металлическую кислоту и более конкретно кислоту Льюиса.

В соответствии с альтернативным вариантом предпочтительным является соединение металла, для которого состояние окисления металла совместимо с реакцией Фентона-Габера-Вейса и реакцией, подобной реакции Фентона-Габера-Вейса (реакции окисления-восстановления, которая включает другие ионы металлов, такие как железо, которое в нашем случае является в контексте хелатирования метастабильным, т.е. преимущественно ионы переходных металлов, и в частности Mo(VI), W(IV)-(VI), V(III)(V), Au(I)-(III)).

В соответствии с альтернативным вариантом предпочтительным является соединение лантаноида, которое может формировать полуторный оксид типа LnO₃, для которого состояние окисления совместимо с метастабильными типами Фентона-Габера-Вейса и Фентона-Габера-Вейса-подобными, и особенно La(III), Ce(III) и (IV), Nd(III) и (IV), Sm(III) и (IV), Gd(IV).

Предпочтительно металл из металлата или лантаната имеет максимальную валентность.

Предпочтительно металл или лантаноид окисляются до максимальной степени окисления.

В соответствии с предпочтительной альтернативой соль металла содержит молибден. Таким образом, согласно альтернативе соль металла является солью молибдена. Более конкретно смесь в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит молибдат натрия. В соответствии с изобретением предпочтительным является использование молибденовой соли, в которой валентность молибдена имеет степень VI. Эта соль выгодно дает возможность обеспечить значительную стабильность смеси композиции. Кроме того, молибден, особенно в виде соли и, например, в виде натриевой соли, с его реактивной валентностью (VI), его совместимой электроотрицательностью, его очень низкой цитотоксичностью, возможностью реакции Фентона-Габера-Вейса или реакции, подобной типу Фентона-ГабераВейса, является особенно предпочтительным.

- 3 038115

В соответствии с альтернативой образующаяся соль металла содержит пероксометаллат, и более конкретно, который может находиться в виде промежуточной гидропероксометаллатной промежуточной формы.

Предпочтительно молибденовая соль представляет собой пероксо- или гидропероксоединицу. Еще более предпочтительно активное вещество относится к типу МоО₄ ²- или к его гидропероксоформе (см. Oyerinde Oyeyemi F. et al., Solution structure of molybdic acid from Raman spectroscopy and DFT analysis, Inorganica Chimica Acta 361 (2008) 1000-1007. Doi:10,1016/j.ica,2007,06,025); например, является промежуточным комплексом формулы типа Na₄[Mo₂O₆ (хелатирующим)] ·10Η₂0 в смеси по изобретению.

Согласно альтернативе металл и его соль представляют собой лантаноид или его соль.

В соответствии с альтернативой образующаяся соль металла содержит пероксолантанат и более конкретно вновь может находиться в виде промежуточного соединения гидропероксолантаната. Например, соль вновь может находиться в виде промежуточного комплекса формулы типа NaLn (хелатирующий)-xH₂O₂-yH₂O (где x и y зависят от типа лантаноида (Ln), используемого в смеси по изобретению.

Предпочтительно молибденовая и лантаноидная соль и более конкретно лантан предпочтительно представляют собой перокси- или гидроперокси единицу (см. Suponitskiy, Y.L., Proshina, О.Р., Dyunin, A.G. et al. Thermodynamic properties of lanthanum Molybdates, Russ. J. Phys. Chem. (2016) 90:267. Required: 10.1134/S00360244160202031X).

Предпочтительно использование соли молибдена дает возможность ограничить цитотоксичность смеси в соответствии с изобретением, в частности для эритроцитов и лимфоцитов, эпителия, фибробластов, остеобластов.

Преимущество использования молибдена заключается в его естественном присутствии в качестве кофакторов ферментов (например, таких как ксантиноксидаза, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа с ферредоксином и т.д.).

Предпочтительно использование соли лантана дает возможность ограничения цитотоксичности смеси в соответствии с изобретением.

В соответствии с предпочтительной альтернативой металл в форме его активного вещества играет роль катализатора для получения активных веществ HO₂· и при необходимости HO· и O₂·.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению содержит от 0,1 до 500 мкМ, предпочтительно от 1 до 200 мкМ и более предпочтительно от 5 до 150 мкМ соли металла.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению содержит от 0,1 до 100 мкМ, предпочтительно от 1 до 50 мкМ и более предпочтительно от 5 до 30 мкМ металлической соли молибдена.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению содержит от 0,1 до 100 мкМ, предпочтительно от 1 до 50 мкМ и более предпочтительно от 5 до 30 мкМ металлической соли лантана.

Термины хелатирующие агенты (или хелаторы) соответствуют химическим соединениям, способным формировать стабильный координационный комплекс с одним или несколькими ионами, и более конкретно с ионными формами металла, присутствующего в композиции. Металл может присутствовать в любой форме, в том числе в пероксидированной или гидропероксидированной форме. Этот комплекс считается хелатом.

Хелатирующие агенты могут быть пригодными для смеси в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно если они должны внеклеточно катализировать, с одной стороны, продукцию in situ реактивных радикалов, главным образом HO₂·, но также O₂·, и ОН·, и обеспечивать хелатирование кальция и ионов металлов, включая ионы двухвалентного железа (Fe(II) или Fe²⁺), и ионы трехвалентного железа (Fe(III) или Fe³⁺), которые являются внеклеточными, связанными или свободными. Высвобождение этих реагентов является еще более эффективным, поскольку аффинность хелатов к Ca²⁺ и Fe²⁺/Fe³⁺ экстрацеллюлярным ионам является значительной. Эти хелаты являются стабильными соединениями, присутствующими в фармацевтически активной смеси по изобретению, и участвуют, в дополнение к преимущественной продукции радикала HO₂·, в фармацевтической или терапевтической активности смеси в соответствии с настоящим изобретением, особенно за счет предпочтительного хелатирования in situ ионов кальция и железа. Это хелатирование in situ также позволяет регулировать внеклеточный уровень притоков кальция в клетки, в частности, индуцированный вирусной инфекцией, с одной стороны, такой как, например, Herpesviridae, и с другой стороны, окислительным стрессом из-за присутствия радикалов или пероксосоединений.

Предпочтительно хелатирующие агенты не проникают в клетку и остаются внеклеточными.

В соответствии с предпочтительной альтернативой хелатирующие агенты стабилизируют пероксои гидропероксомолибдатные комплексы, содержащиеся в препарате. Такие пероксо- и гидропероксомолибдаты могут быть типа (Mo₂O₆)⁴⁺ и [Mo₄Oi₂(O₂)₂]⁴⁺.

Предпочтительно в соответствии с альтернативным вариантом хелатирующий агент позволяет стабилизировать путем хелатирования ион МоО₄ ^2- действующего вещества, который в его натриевой форме имеет молекулярную массу 205,937 г на моль, или пероксомолибдат (например, в форме MoO3BAPTAH2^2- и/или MoO3-EGTAH₂ ^2-).

Согласно альтернативному варианту смесь согласно изобретению содержит по меньшей мере два

- 4 038115 хелатирующих агента.

Предпочтительно хелатирующий агент (агенты) связывается путем координации окисленного или пероксидированного металлата в растворе.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент образует комплекс с окисленным или пероксидированным металлатом для образования промежуточного димерного комплекса [Mo₂O₆(хелатор)]⁴⁺·10Н₂О и/или формы пероксотетрамолибдата (VI) [Мо₄О₁₂(O₂)₂]⁴⁺·хелатор, где соль металла является солью молибдена.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент образует комплекс с окисленным или пероксидированным металлатом для образования комплекса [W₂O₆(хелатор)]⁴⁺·8Н₂О, где соль металла является вольфрамовой солью.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент образует комплекс с окисленным или пероксидированным лантанатом для формирования, в частности комплекса [La(O₂)-Хелатор] +-6H2O, где соль лантаноида является солью лантана.

Предпочтительно хелатирующий агент совместим со стерическим захватом окисленных и/или пероксидированных комплексов металлата. Более конкретно размер его N-N кармана, который отделяет карбоксильные остатки, включен в координацию, а также стерическое свертывание углеродной цепи этого кармана, которое должно преимущественно быть совместимым с захватом промежуточных металлических комплексов, особенно в окисленной пероксидированной форме. Предпочтительно хелатирующий агент совместим с электронными зарядами металлата и его внешней атомной орбитальной структурой.

В соответствии с одним аспектом хелатирующий агент (агенты) выбирают из органических поликислот и их солей, особенно аминокарбоновых поликислот. Как правило, аминокарбоновые поликислоты содержат один или несколько атомов азота аминогруппы, предпочтительно вторичный или третичный амин, связанный по меньшей мере с двумя группами карбоновой кислоты через атомы, как правило, углерод, и при необходимости атомы кислорода.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент (агенты), например, имеют по меньшей мере три координационные группы, предпочтительно группы карбоновых кислот, на трех концах молекулы (молекул), образующих хелатирующий агент (агенты), причем указанные координационные группы разделены цепью по меньшей мере из трех атомов, включая по меньшей мере один атом азота.

Предпочтительно хелатирующий агент (агенты) имеет пять координационных групп, предпочтительно групп карбоновых кислот, на пяти концах молекулы (молекул), образующих хелатирующий агент (агенты), причем указанные координационные группы разделены цепью по меньшей мере из шести атомов и предпочтительно девяти атомов, включая один атом азота и предпочтительно два атома азота, разделенных по меньшей мере двумя атомами.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент (агенты) имеет четыре координационные группы, предпочтительно группы карбоновых кислот, на четырех концах молекулы (молекул), образующих хелатирующий агент (агенты), причем указанные координационные группы разделены цепью по меньшей мере из шести атомов и предпочтительно двенадцати атомов, включая два атома азота, разделенных по меньшей мере восьмью атомами.

В соответствии с альтернативой атомы, разделяющие указанные координационные группы и/или атомы азота из хелатирующего агента (агентов), выбранные из атомов углерода, азота и кислорода. Некоторые атомы, разделяющие указанные координационные группы и/или атомы азота хелатирующего агента (агентов), могут быть включены в одно или несколько одинаковых или разных атомных колец, таких как, например, как неароматические, ароматические или гетероароматические кольца, например фенил или пиридил.

Предпочтительно хелатирующий агент выбран из группы из BAPTA (1,2-бис-(оаминофенокси)этан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты), EGTA (этиленгликоль-бис-(2-аминоэтилэфир)Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусной кислоты)), DTPA (диэтилентриаминпентауксусной кислоты) и любой из их смесей.

В соответствии с альтернативой хелатирующий агент выбран из BAPTA, EGTA и любой из их смесей.

Предпочтительно BAPTA и/или EGTA обеспечивают лучшую стабильность предшественников, а также лучший выход синтеза.

Значения pKa для 4 карбоксильных групп BAPTA: pK1 и pK2<4 (BAPTA нерастворима), pK3=5,47 и pK4=6,36; а для EGTA pK1=2,00, pK2=2,65, pK3=8,85 и pK4=9,46.

Предпочтительно значения pKa хелатирующего агента(ов) совместимы с pH раствора согласно изобретению.

Предпочтительно значения pKa хелатирующего агента(ов) являются совместимыми с pKa металлической кислоты или надкислоты металла, промежуточно образованной в растворе согласно изобретению.

Предпочтительно значения pKa хелатирующего агента(ов) совместимы с pH инфицированной области, например, такой как эпителий.

Предпочтительно выбранный хелатирующий агент(ы) обладает слабой цитотоксичностью. Это осо- 5 038115 бенно относится к BAPTA и EGTA.

Соль металла и хелатирующие агенты присутствуют в достаточном количестве и отношении для получения комплексов (пероксометаллат-хелатирующий агент(ы)).

Предпочтительно по меньшей мере один из присутствующих хелатирующих агентов имеет большую аффинность к кальцию, чем к металлу, используемому в смеси по изобретению. Это выгодно, поскольку дает возможность замещения хелатных комплексов смеси по изобретению комплексом хелатирующего агента и кальция in vivo. Предпочтительно концентрация хелата(ов) совместима с концентрацией внеклеточного Ca²⁺ (2-3 мМ в плазме человека), то есть хелатирующий агент (агенты), присутствующий в смеси по изобретению, находится в достаточных количествах для эффективного формирования комплекса, с терапевтической точки зрения, с присутствующим количеством внеклеточного кальция.

Предпочтительно присутствующий хелат(ы) имеют большую аффинность к железу (Fe²⁺/Fe³⁺), чем к металлу, используемому в смеси по изобретению. Это выгодно позволяет замещать хелатные комплексы смеси по изобретению комплексом хелатирующего агента - Fe²⁺/Fe³⁺ in vivo.

Согласно альтернативе смесь в соответствии с изобретением содержит от 0,0001 до 1 мМ хелатирующих агентов.

Согласно альтернативе смесь в соответствии с изобретением содержит от 0,1 до 100 мкМ, предпочтительно от 1 до 50 мкМ и более предпочтительно от 5 до 20 мкМ BAPTA. Согласно варианту смесь в соответствии с изобретением включает от 1 до 80 мкМ и предпочтительно от 20 до 80 мкМ BAPTA.

Согласно другому варианту смесь по изобретению содержит от 0,1 до 1 мМ, предпочтительно от 50 до 800 мкМ и более предпочтительно от 200 до 700 мкМ EGTA. Согласно варианту смесь по изобретению включает от 200 до 2000 мкМ и предпочтительно от 600 до 1400 мкМ EGTA.

Согласно другому варианту смесь по изобретению содержит BAPTA и EGTA, присутствующие в концентрации от 0,0001 до 1 мМ, и предпочтительно от 5 до 20 мкМ и от 200 до 700 мкМ соответственно.

Согласно альтернативе молибденовая соль и хелатирующие агенты присутствуют в отношении от 10/1 до 1/100 (отношении соль молибдена/хелатирующий агент, выраженном в молярных концентрациях).

Согласно альтернативе соль лантана и хелатирующие агенты присутствуют в отношении от 10/1 до 1/100 (отношении соль La/ хелатирующий агент, выраженном в молярных концентрациях).

Согласно альтернативе молибденовая соль и BAPTA присутствуют в отношении от 3/1 до 1/10, выраженном в молярных концентрациях.

Согласно альтернативе молибденовая соль и EGTA присутствуют в отношении от 1/10 до 1/70, выраженном в молярных концентрациях.

Согласно альтернативе соль лантана и BAPTA присутствуют в отношении от 3/1 до 1/10, выраженном в молярных концентрациях.

Согласно альтернативе соль лантана и EGTA присутствуют в отношении от 1/10 до 1/70, выраженном в молярных концентрациях.

Согласно альтернативе источником радикалов является в основном H₂O₂.

Согласно альтернативе один или несколько вторичных источников радикалов могут быть добавлены или синтезированы в меньшинстве in situ.

Согласно альтернативе H₂O₂ представляет собой водный раствор, содержащий Н₂О₂ в объеме 1:10 или 30% или 8,82 М.

Предпочтительно источник Н2О2 не содержит какого-либо стабилизатора, выбранного из: пиридинкарбоновых кислот, например, таких как пиколиновая кислота; фосфоновой и аминофосфоновой кислот; замещенных амидов или аминов; алкилсульфоновых кислот и их смесей.

Согласно альтернативе основным источником пероксидирующих радикалов является перекись водорода. Таким образом, согласно этой альтернативе перекись водорода присутствует в концентрации от 200 до 600 мМ, предпочтительно от 300 до 500 мМ и более предпочтительно от 340 до 450 мМ.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению содержит долю перекиси водорода в диапазоне от 30 мМ до 4,4 М, предпочтительно от 150 мМ до 3 М, предпочтительно от 235 мМ до 1,8 М и более предпочтительно от 260 до 440 мМ. Согласно альтернативе смесь по изобретению не включает какого-либо дополнительного добавления перкислоты.

Предпочтительно количество (или концентрацию) перекиси водорода (Н₂О₂) анализируют титрованием. Как правило, можно использовать анализ с помощью раствора перманганата калия.

Концентрацию перекиси водорода можно также анализировать с помощью УФ-спектроскопии.

Предпочтительно буферный агент используют для специфического контроля pH смеси в соответствии с изобретением.

Предпочтительно буферный агент используют для специфического контроля pH во время нанесения in situ раствора в соответствии с изобретением.

Из буферных агентов предпочтительной является карбоновая кислота.

Предпочтительно буферный агент не включает следующие кислоты: гидроксилированные карбоновые кислоты (например, яблочную кислоту) или поликарбоновые кислоты (например, лимонную и изо- 6 038115 лимонную кислоты, малоновую кислоту); карбоновые кислоты с молекулярной массой более 100 г/моль, и в частности, длинноцепочечные карбоновые кислоты (более C₆) из-за возможности индукции дестабилизации клеточных мембран, а также ненасыщенные алифатические карбоновые кислоты (например, сорбиновую кислоту), из-за их возможности перекисного окисления алкенового типа, которое является цитотоксичным.

В соответствии с альтернативой настоящее изобретение включает присутствие определенных кислот, образующихся in situ во время синтеза, предпочтительно в небольшом количестве (например, таких как перуксусная кислота). Они используются в качестве вспомогательного источника радикалов при осуществлении изобретения и терапевтическом использовании изобретения.

В соответствии с альтернативой предпочтительным является буферный агент, имеющий pKa при физиологическом значении pH (на коже и слизистой оболочке), т.е. pH, например, составляющий от 4,4 до 5,0 и совместимый с pKa окисленной и/или пероксидированной металлической кислоты, форма которой является ионизированной (например, МоО₄Н2, pk1=3,61 и pKa2=3,89).

Предпочтительно буферный агент присутствует в смеси по изобретению при концентрации от 1 до 500 мМ, предпочтительно от 10 до 200 мМ, более предпочтительно от 50 до 100 мМ.

Отношение молярных концентраций перекиси водорода и буферного агента составляет от 2 до 9 и предпочтительно от 3 до 8.

Предпочтительно в смесь добавляют буфер, чтобы получить pH от 4,4 до 5,0, который является пригодным (i) для контакта по изобретению с кожей и слизистыми оболочками, (ii) для стабильности активного вещества МоО₄ ^2- в присутствии Н₂О₂, (iii) для каталитической реакции Фентона-Габера-Вейса или подобной и (iv) для продукции in situ разновидностей радикалов, в основном типа HOO.

В соответствии с альтернативой смесь содержит в качестве буферного агента, обеспечивающего pH от 4,0 до 5,2, предпочтительно от 4,4 до 5,0, например карбоновую кислоту и предпочтительно уксусную кислоту.

Предпочтительно смесь имеет окислительно-восстановительный потенциал от 350 до 450 мВ и предпочтительно от 350 до 420 мВ.

Окислительно-восстановительная эффективность смеси по изобретению также может быть оценена по окислению in vitro кверцетина ионами трехвалентного железа (III) или Fe³⁺. В частности, для этого можно использовать так называемый кверцетиновый метод (адаптированный, например, из исследований El Hajji H. et al. (2006) Interactions of quercetin with iron and copper ions: Complexation and autoxidation, Free Radic. Res., 40(3), 303-320 и Balcerzak M. et al. (2008) Selective determination of Fe(III) in Fe(II) samples by UV-spectrophotometry with the aid of quercetin and morin, Acta Pharm., 58, 327-334).

Настоящее изобретение также относится к способу получения смеси, как определено в соответствии с настоящим изобретением. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу получения смеси в соответствии с изобретением, включающему (i) получение буферного раствора (BS), содержащего буферный агент, имеющий кислый pH; (ii) получение раствора металлического комплекса (CS), содержащего соль оксида металла; (iii) получение первого исходного раствора (Si1), содержащего перекись водорода; (iv) получение второго исходного раствора (Si2) путем смешивания раствора BS с раствором Si1; (v) получение раствора (S1), содержащего пероксометаллическое соединение, путем смешивания раствора CS с раствором Si2; (vi) получение раствора S2 путем регулирования pH раствора S1 основанием, где pH раствора S2 является более основным, чем pH раствора BS; (vii) добавление к раствору S2 одного или нескольких хелатирующих агентов; (viii) необязательную регуляцию pH; (ix) необязательную регуляцию объема конечного раствора, получение фармацевтически активной смеси, как определено в соответствии с изобретением.

В зависимости от варианта, когда используют две или более соли оксида металла, с различными оксидами металлов, получение раствора металлического комплекса (SC) может состоять из получения отдельных растворов для каждой соли оксида металла и последующего смешивания этих растворов одновременно или последовательно с раствором Si2 для получения раствора S1.

Предпочтительно получение смеси в соответствии с настоящим изобретением достигается в соответствии с методом каталитического синтеза. Каталитический синтез смеси в соответствии с изобретением обычно является последовательным. Преимущественно способ согласно изобретению включает последовательность этапов (iii)^(iv)^(v)^(vi)^(vii)^(viii)^(ix).

Предпочтительно способ получения включает последующий спектральный анализ (например, путем анализа ПК, УФ и/или видимых спектров) на одном или нескольких этапах приготовления и предпочтительно на всех этапах приготовления.

Согласно альтернативе первый исходный раствор Si1 имеет первый окислительновосстановительный потенциал, превышающий окислительно-восстановительный потенциал смеси в соответствии с изобретением.

Предпочтительно после этапа (ix) не проводят разбавления объема смеси, чтобы избежать смещений химических равновесий смеси в соответствии с настоящим изобретением.

Конечно, предпочтительно использовать вещества или соединения с достаточно удовлетворительной чистотой в качестве сырья. В частности, необходимо, чтобы различные вещества или соединения

- 7 038115 были пригодны для терапевтического применения.

В соответствии с альтернативой можно провести ИК-Фурье спектроскопию, ЯМР-H и/или массспектрометрию полученной смеси в соответствии с изобретением, чтобы убедиться в соответствии состава смеси промышленным требованиям, и в особенности для фармацевтического терапевтического применения. Также предпочтительно проводить ИК-Фурье спектрометрию для компонентовпредшественников смеси по изобретению.

В соответствии с альтернативой pH можно контролировать на одном или нескольких или даже на всех этапах приготовления.

Согласно альтернативе окислительно-восстановительный потенциал можно контролировать на одном или нескольких или даже на всех этапах приготовления.

В соответствии с альтернативой смесь по изобретению можно контролировать методом денситометрии и/или УФ-спектрофотометрии на одном или нескольких или даже на всех этапах приготовления.

В соответствии с альтернативой можно проанализировать окислительно-восстановительную эффективность смеси по изобретению с помощью кверцетинового метода (УФ-спектрофотометрического анализа окисления in vitro кверцетина с помощью Fe³⁺, присутствующего или полученного in vitro).

Предпочтительно перекись водорода присутствует в растворе Si1 в концентрации от 200 до 600 мМ, предпочтительно от 300 до 500 мМ и более предпочтительно от 330 до 460 мМ.

Согласно варианту осуществления используемый материал представляет собой металл и предпочтительно из нержавеющей стали, при необходимости пассивированного металла.

Согласно варианту осуществления материал может быть повторно пассивирован при приготовлении смеси по изобретению, например, путем помещения материала (который будет контактировать со смесью или ее предшественниками) в контакт с раствором перекиси водорода.

Предпочтительно проводить анализ источника перекиси водорода, чтобы обеспечить количество присутствующей перекиси водорода и ввести ее в действие при приготовлении смеси по изобретению. Этот анализ может быть проведен, например, путем титрования или с помощью УФ-спектрофотометрии (обычно при 240 нм).

Предпочтительно pH буферного раствора BS составляет от 4,4 до 5,0 и предпочтительно от 4,7 до 4,8.

Предпочтительно буферный агент BS раствора представляет собой буфер карбоновой кислоты/карбоксилата, а раствор BS имеет отношение перекись водорода/карбоксилат от 20/1 до 1/1 и предпочтительно около 5/1.

Предпочтительно отношение уксусной кислоты (AcOH) и ее добавленной ацетатной соли в предельном количестве позволяет получить наименьшую продукцию перуксусной кислоты (AcOOH). Предпочтительно в способе получения согласно изобретению продукция перуксусной кислоты является минимальной, и ее каталитическое воздействие очень мало.

Получение первого исходного раствора Si1 включает получение водного раствора карбоновой кислоты и предпочтительно уксусной кислоты, а затем добавление перекиси водорода.

Предпочтительно первый исходный раствор Si1 имеет pH от 2,5 до 4,6 и предпочтительно от 2,7 до 4,2. Предпочтительно первый исходный раствор Si1 имеет окислительно-восстановительный потенциал от 400 до 550 мВ и предпочтительно от 420 до 500 мВ.

Предпочтительно способ включает измерение окислительно-восстановительного потенциала на этапах (iii)-(ix) и предпочтительно также включает измерение pH на этапах (iii)-(ix).

В соответствии с альтернативой второй исходный раствор Si2 имеет pH от 2,5 до 3,2 и предпочтительно около 2,9. Согласно альтернативе исходный раствор Si2 имеет окислительно-восстановительный потенциал, превышающий окислительно-восстановительный потенциал первого исходного раствора Si1. Окислительно-восстановительный потенциал второго исходного раствора Si2 может составлять от 420 до 570 мВ и предпочтительно от 440 до 520 мВ.

В соответствии с альтернативой буферный раствор BS вводят в первый исходный раствор Si1.

Согласно одному варианту осуществления концентрация перекиси водорода во втором исходном растворе Si2 составляет от 300 до 500 мМ и предпочтительно от 260 до 440 мМ.

Предпочтительно на этапе (iv) pH поддерживают ниже допустимого предела pH для реакции каталитического синтеза для смеси согласно изобретению. Буферный агент предпочтительно используют на этапе (iv).

Предпочтительно на этапе (iv) генерированная продукция in situ перуксусной кислоты является минимальной.

Предпочтительно на этапе (iv) окислительно-восстановительный потенциал раствора Si1 на этапе (iii) повышают, например, путем перехода от значения от 440-460 мВ до значения 460-480 мВ с этапа (iv).

Отслеживая концентрацию перекиси водорода, присутствующей во время приготовления смеси по изобретению, продукцию перекиси наблюдают во время ее введения, то есть введения перекиси водорода в контакт с буферным раствором (этап (iv)). Предпочтительно добавление перекиси водорода осуществляют в водном растворе, предварительно забуференном до кислого pH. Таким образом, для получения

- 8 038115 первого исходного раствора Si1 перекись водорода добавляют в раствор с кислым значением pH и, например, с pH от 2,7 до 4,2.

Предпочтительно этап (iv) приводит к смещению равновесия в сторону продукции in situ H₂O₂ с разрушением по возможности генерированной перуксусной кислоты при химическом равновесии.

В соответствии с альтернативой буферный раствор CS вводят в раствор S1.

В соответствии с альтернативой раствор S1, содержащий пероксометалллический комплекс, имеет pH от 2,5 до 3,5 и предпочтительно от 2,8 до 3,0.

В соответствии с вариантом осуществления окислительно-восстановительный потенциал раствора S1, содержащий пероксометаллический комплекс, составляет от 400 до 550 мВ и предпочтительно от 440 до 500 мВ.

Согласно одному варианту осуществления концентрация перекиси водорода в растворе S1, содержащем пероксометаллический комплекс, составляет от 250 до 500 мМ и предпочтительно от 320 до 450 мМ.

На этапе (v) добавленная соль молибдата находится в форме молибденовой кислоты MoO₃-H₂O и MoO₃-2H2O.

В условиях, не соответствующих изобретению, синтез при равновесии активного вещества MoO₄ ² при комнатной температуре без какого-либо катализатора и без добавления какой-либо сильной кислоты (например, H2SO4) потребовал бы нескольких дней.

Согласно варианту осуществления pH раствора S2 доводят с помощью буфера до значения, предпочтительно составляющего от 4,4 до 5,0 и например от 4,5 до 5,0. Предпочтительно при этом забуференном значении pH преобладает нестабильная форма MoO₄ ^2- (состояние окисления Mo(VI)), и перекись водорода является стабилизированной. Перекись водорода часто промышленно стабилизируют фосфатным буфером. Может формироваться нестабильное промежуточное соединение фосфомолибдата (желтое), которое исчезает при равновесии, делая H2O2 более реакционноспособным.

Согласно альтернативе окислительно-восстановительный потенциал раствора S2 составляет от 300 до 450 мВ и предпочтительно от 360 до 410 мВ.

Оксиды молибдена Mo(VI) в водном растворе и при pH для синтеза смеси по изобретению могут существовать в разных молекулярных структурах: MoO₄ ^2- и [MoO6^2-], [Мо2О₃(О₂)₄(Н₂О)₂]^2-, а также в реакционных многоядерных формах (таких как двуядерные комплексные структуры okco-Mo(VI) (Dement'ev L.A. et al. (2007) Mononuclear, polynuclear and cluster complexes of molybdenum and their reactions as models of biochemical systems and processes, Russ. J. Gen. Chem., 77(5), 822-843)).

Предпочтительно условия получения обеспечивают формирование in situ пероксо- и гидропероксомолибдата, когда солью металла является соль молибдена. Последняя относится к типу: [Mo₂O₃(O₂)₄(H₂O)₂]^2-. Согласно альтернативе предпочтительным является молярный избыток перекиси водорода более 1000 раз и соли металла, и в частности, более 10000 раз и более предпочтительно в 15000 раз относительно Мо (VI).

Предпочтительно хелатирующий агент (агенты), а также pH синтеза ограничивают смещения реакции типа восстановителя Джонса, состоящей в восстановлении иона металлата, т.е. преимущественно молибдата, до состояния низкого окисления, соответствующего металлическому молибдену. Согласно альтернативе это смещение ограничено в слабокислой водной среде, обычно с pH, составляющим от 4,4 до 5,0 и, например, от 4,5 до 4,7.

Предпочтительно, когда присутствуют несколько хелатирующих агентов, готовят независимые растворы хелатирующих агентов, причем каждый раствор содержит специфический хелатирующий агент.

Согласно предпочтительной альтернативе добавление хелатирующих агентов достигают в порядке повышения pKa.

Например, можно приготовить раствор, включающий хелатирующий агент типа BAPTA, с одной стороны, и раствор хелатирующего агента типа EGTA, с другой стороны. Предпочтительно добавляют BAPTA, а затем EGTA.

Предпочтительно хелатирующий агент(ы) дает возможность проведения in situ, то есть особенно после местного применения, реакции Фентона-Габера-Вейса, особенно с константой диссоциации Kd хелата: Fe²⁺/Fe³⁺>Сa²⁺.

Предпочтительно хелатирующий агент(ы) внеклеточно обеспечивает in situ автономность продукции реактивных радикалов, в основном HOO· и в меньшей степени О2· и НО·.

Согласно альтернативе сначала можно добавить BAPTA в раствор S2, чтобы получить итоговый раствор S3. Раствор S3, например, имеет pH от 4,0 до 5,0 и предпочтительно от 4,3 до 4,8. Например, раствор S3 имеет окислительно-восстановительный потенциал, по существу, идентичный потенциалу раствора S2. Другими словами, окислительно-восстановительный потенциал не меняется при добавлении хелатирующего агента типа BAPTA. Согласно альтернативе окислительно-восстановительный потенциал раствора S3 составляет от 250 до 450 мВ и предпочтительно от 300 до 400 мВ. Предпочтительно предварительное растворение BAPTA в небольшом объеме раствора S2 осуществляют до того, как он вступит в контакт с остальной частью раствора S2.

- 9 038115

Предпочтительно концентрация BAPTA находится в молярном отношении от 1/1 до 1/3 и предпочтительно 1/2 относительно молибденовой соли.

Например, раствор S3 имеет концентрацию перекиси водорода от 250 до 500 мМ и предпочтительно от 320 до 440 мМ.

Предпочтительно, чтобы получить итоговый раствор S4, можно добавить по меньшей мере один другой хелатирующий агент типа EGTA в раствор S3. В соответствии с альтернативой раствор S4 имеет pH от 4,0 до 5,0 и предпочтительно от 4,3 до 4,7.

Согласно альтернативному варианту окислительно-восстановительный потенциал раствора составляет от 300 до 400 мВ и предпочтительно от 350 до 390 мВ.

Предпочтительно концентрация EGTA находится в молярном отношении от 10/1 до 50/1 и предпочтительно около 25/1 относительно соли молибдена.

Например, раствор S4 имеет концентрацию перекиси водорода от 250 до 550 мМ и предпочтительно от 320 до 470 мМ.

В соответствии с альтернативой pH на этапе (viii) регулируют с помощью основного раствора, например, типа гидроксида натрия, предпочтительно концентрированного, например, до концентрации от 8 до 15 М. Предпочтительно pH на этап (viii) может быть скорректирован до значения от 4,4 до 5,0 и предпочтительно около 4,6.

Согласно альтернативе pH смеси по изобретению составляет от 4,50 до 4,70. Предпочтительно окислительно-восстановительный потенциал смеси по изобретению находится в диапазоне от 320 до 390 мВ.

В соответствии с предпочтительной альтернативой способ включает снижение окислительновосстановительного потенциала на этапе (vi). Уменьшение окислительно-восстановительного потенциала может составлять, например, от 50 до 150 мВ и обычно составляет около 90 мВ.

Предпочтительно окислительно-восстановительный потенциал является, по существу, постоянным после уменьшения окислительно-восстановительного потенциала на этапе (vi).

Предпочтительно смесь в соответствии с настоящим изобретением является стабильной в течение времени хранения, например, при комнатной температуре или до температуры 45°С в течение шести месяцев. Рекомендуется хранить смесь в темноте и защищая от воздействия влаги.

Величину pH измеряют с помощью калиброванного pH-метра и с компенсацией температуры, с комбинированным электродом KCl 4M/AgCl.

Окислительно-восстановительный потенциал измеряют комбинированным pH-метром/ОВПметром, оснащенным откалиброванным платиновым/каломельным электродом. Как правило, это измерение проводят при комнатной температуре, то есть при 20°С и при атмосферном давлении, то есть 101325 Па.

Концентрацию перекиси водорода предпочтительно оценивают в вышеупомянутых растворах с помощью УФ-спектроскопии в соответствии с уравнением, полученным из закона Бера-Ламберта: А₂₄о_нм=43,6х1х[Н₂О₂] с 1 в сантиметрах и [Н₂О₂] в молях (Noble R.W. et al. (1970) The reaction of ferrous horseradish peroxidase with hydrogen peroxide, J. Biol. Chem., 245(9), 2409-2413).

В соответствии с конкретной альтернативой соединение пероксометалла из раствора S1 представляет собой пероксомолибденовое соединение.

Таким образом, смесь по изобретению содержит в соответствии с этой альтернативой пероксометаллическое соединение. Согласно предпочтительному варианту смесь по изобретению содержит комплекс пероксомолибдена.

В соответствии с альтернативой раствор содержит молибдат натрия в форме Mo(VI). Предпочтительно при pH растворов по изобретению соль находится, главным образом, в каталитической форме MoO₃-BAPTA^3- и, главным образом, MoO3-EGTA^3-, для обоих источников активного вещества MoO4^2-.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления смесь в соответствии с изобретением содержит соль молибдена, предпочтительно натриевую, смесь двух хелатирующих агентов, предпочтительно типа BAPTA и EGTA, перекись водорода и ацетатный буферный агент (например, уксусную кислоту/натрия ацетат).

В соответствии со специфической альтернативой смесь в соответствии с настоящим изобретением включает молибдатную соль, например натрия молибдат;

BAPTA;

EGTA;

Н2О2;

CH3COOH/CH3COONa;

Eo/в от 250 до 550 мВ, предпочтительно от 300 до 450 мВ и также предпочтительно от 300 до 420 мВ;

pH 4,4-5,0.

В соответствии со специфическим вариантом смесь в соответствии с настоящим изобретением включает

- 10 038115 молибдатную соль, например натрия молибдат;

лантановую соль, например лантана нитрат;

BAPTA;

EGTA;

H2O2;

СНзСООН/СНзСООЖ

Е_о/в от 250 до 550 мВ, предпочтительно от 300 до 450 мВ и также предпочтительно от 300 до 420 мВ;

pH 4,4-5,0.

Предпочтительно соединения из смеси находятся в требуемых количествах и условиях pH и условиях окислительно-восстановительного потенциала для образования комплекса пероксомолибдата или комплекса гидропероксомолибдата, где молибден имеет валентность VI.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления смесь по изобретению содержит по меньшей мере один хелатирующий агент и в лучшем случае и по меньшей мере два хелатирующих агента и предпочтительно в концентрации от 5 до 20 мкМ и от 200 до 700 мкМ соответственно.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления смесь по изобретению содержит от 340 до 450 мМ основного донора радикалов, такого как H₂O₂.

Изобретение относится, в частности, к композиции в соответствии с изобретением в качестве фармацевтической композиции, причем указанная композиция содержит по меньшей мере одну соль металла, причем металл выбран из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V), золота (Au), лантаноида, в частности лантана; по меньшей мере один хелатирующий агент и источник пероксидантных радикалов. Такая композиция согласно изобретению полезна в способе терапевтического лечения.

Изобретение также относится к способу терапевтического лечения, включающему применение, преимущественно посредством местного применения у субъекта, нуждающегося в лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.

Изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции в соответствии с изобретением для использования в способе терапевтического лечения.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтическим композициям, содержащим или состоящим из смеси в соответствии с изобретением.

Таким образом, изобретение относится к фармацевтической композиции для местного применения, отличающейся тем, что она содержит терапевтически активную смесь, как определено в соответствии с изобретением, или может быть получена в соответствии со способом, определенным в соответствии с изобретением.

Предпочтительно фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит от 0,001 до 5 мМ, предпочтительно от 0,01 до 2 мМ и более предпочтительно от 0,02 до 1 мМ фармацевтически активной смеси.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтической композиции для местного применения в соответствии с изобретением для ее использования в способе терапевтического лечения вирусной инфекции, и в частности, с участием вируса семейства Herpesviridae.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтической композиции для местного применения в соответствии с изобретением для ее использования в способе терапевтического лечения инфекции, вызванной HSV-1 и/или HSV-2.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтической композиции для местного применения в соответствии с изобретением для ее использования в способе противовоспалительного терапевтического лечения.

Изобретение, в частности, относится к фармацевтической композиции для местного применения в соответствии с изобретением для ее использования в способе профилактического или радикального терапевтического лечения.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей молибден, по меньшей мере один хелатирующий агент и источник пероксидирующих радикалов, для ее использования в способе терапевтического лечения герпеса. Эта композиция определяется в соответствии с любым из вариантов осуществления, альтернатив, преимуществ, предпочтений или примеров изобретения, взятых отдельно или в соответствии с любой их комбинацией.

Термин согласно изобретению ссылается на любой из вариантов осуществления, альтернативы, преимущества, предпочтения или примеры изобретения, взятые отдельно или в соответствии с любой их комбинацией.

Как правило, фармацевтические композиции для местного применения в соответствии с изобретением содержат вспомогательные вещества, и в частности, вспомогательные вещества, утвержденные фармакопеей.

Под противоинфекционным терапевтическим лечением подразумевается как превентивное терапевтическое лечение, так и профилактическое лечение и терапия, направленная на излечение, дающие возможность, например, ограничить инфекцию в случае контакта с инфекцией, частоту возникновения за- 11 038115 болевания, его острую фазу, с частичной эрадикацией или без эрадикации возбудителя заболевания и/или ограничением его распространения.

Предпочтительно активная смесь или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением активна in situ во время ее применения.

Предпочтительно активная смесь или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением активна во время трансэпителиального проникновения и предпочтительно не допускает или допускает лишь ограниченное чрескожное проникновение.

Предпочтительно активная смесь или фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением дезактивируется во время чрескожного проникновения.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению или композицию, содержащую ее, наносят местным способом на область лица и рта.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению или композицию, содержащую ее, наносят местным способом на генитальную или анальную область.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению или композицию, содержащую ее, наносят местным способом на кожу.

В соответствии с альтернативой смесь согласно изобретению или композицию, содержащую ее, наносят местным способом на слизистую оболочку.

Согласно альтернативе вспомогательные вещества, одобренные Европейской Фармакопеей (Ph. Eur.), Национальными Фармакопеями (особенно USP, JP, IP, Ph. Helv., Ph.Belg., Ph Fr., BP, DAB, OAB), а также Международными Фармакопеями (Ph. Int., ВОЗ) могут быть введены во время осуществления изобретения и/или в смесь, обозначенную как смесь 1.

Смеси и композиции по изобретению особенно подходят для фармацевтической активности у людей.

Предпочтительно активная смесь по изобретению дает возможность применения реакций типа Фентона-Габера-Вейса и подобных этому типу и предпочтительно генерации радикала HO2· и в меньшей степени радикалов O2*, НО·.

Согласно авторам настоящего изобретения проникновение реакционноспособного вещества HOO· является достаточным для ограниченной и контролируемой индукции апоптоза клеток.

Согласно авторам настоящего изобретения проникновение реакционноспособного вещества НОО· является достаточным для эффективного и контролируемого подавления вирусной репликации.

В соответствии с изобретением окислительно-восстановительный потенциал смеси по изобретению предпочтительно используют для ограничения в узком диапазоне концентраций предшественников радикальных активных веществ, чтобы обеспечить хорошее равновесие между эффектом подавления репликации/умеренной цитотоксичностью для здоровой клетки/значительной цитотоксичностью для инфицированной клетки профилактическим эффектом в отношении инфекции.

Предпочтительно терапевтически или фармацевтически активная смесь в соответствии с изобретением дает возможность главным образом и преимущественно генерировать реакционноспособные радикальные виды HOO·

Таким образом, согласно настоящему изобретению внеклеточный кальций in vivo является основным фактором запуска продукции HOO· Например, это в основном является действием на комплекс 2Mo(vi)-BAPTA₂(H2O2), когда соль молибдена и BAPTA вводят в смесь по изобретению. Например, это в основном является действием на комплекс 2Mo(vi)-EGTA₂(H₂O₂), когда соль молибдена и EGTA вводят в смесь по изобретению.

Предпочтительно продукция во внеклеточной среде НОО· обеспечивает внеклеточные модификации (например, окисление внемембранных аминокислотных остатков), которые могут таким образом ограничивать вирусную инфекцию путем изменения распознавания клеток.

Предпочтительно продукция во внеклеточной среде HOO^·, а также его проникновение в клетки совместимы с его длительным временем жизни (>1 с) и его большим проникновением в клетки по сравнению с ОН· или O₂· (1 мс и проникновение порядка 1 нм). Преимущественно это вещество HOO· участвует в реакции Габера-Вейса и реакции Фентона (подобной или нет) на внеклеточном и внутриклеточном уровне и обеспечивает автономность последних.

Предпочтительно смесь, содержащая Mo(IV) в соответствии с настоящим изобретением, имеет pH от 4,4 до 5,0. Это, в частности, позволяет оптимизировать константы скорости kb (M^-1<^-1) разложения HO2W.

Предпочтительно модификация внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала при контакте с композицией согласно изобретению обеспечивает апоптотическое/антиапоптотическое равновесие. В частности, это апоптотическое/антиапоптотическое равновесие особенно зависит от наличия инфекции HSV, и главным образом HSV-1 и -2.

В соответствии с альтернативой смесь по изобретению избирательно активна на клетках, инфицированных HSV и главным образом HSV-1 и -2.

Таким образом, существует тесное равновесие между путями стресса, вызванного HSV инфекцией,

- 12 038115 включая приток кальция и регуляцию апоптоза.

Это равновесие нарушается из-за наличия радикалов внутри цитоплазмы и модификаций клеточного окислительно-восстановительного потенциала. Это индуцирует те же пути клеточного стресса, что и инфекция HSV, те же притоки кальция и те же самые индукции метаболических путей, и те же самые пути подвергаются обратной регуляции в направлении другого антиапоптотического равновесия. Это поддерживает терапевтический эффект смеси в соответствии с изобретением или композиций, содержащих ее.

В соответствии с альтернативой фармацевтическую композицию или смесь по изобретению используют в способе терапевтического лечения для лабиального и орофациального герпеса.

В соответствии с альтернативой фармацевтическую композицию или смесь в соответствии с изобретением используют в способе терапевтического лечения генитального и анального герпеса.

Согласно варианту осуществления активная смесь в соответствии с изобретением обладает противоинфекционной эффективностью (оказывает умеренное или низкое прямое действие на вирус, вирусные рецепторы в клетке как возможные кандидаты), препятствует распознаванию и интернализации (значительное действие, клеточные рецепторы к вирусу). Эти эффективности являются внешними по отношению к клетке и ограничивают вирусную инфективность. Таким образом, активная смесь в соответствии с изобретением имеет профилактическое действие. Таким образом, активная смесь в соответствии с изобретением обладает противоинфекционной эффективностью.

В соответствии с альтернативой фармацевтическую композицию или смесь в соответствии с изобретением используют в терапевтическом лечении популяции клеток, экспрессирующих HSV в его оболочечной, репликативной или инфекционной форме.

В соответствии с альтернативой фармацевтическую композицию согласно изобретению или смесь использую при терапевтическом лечении популяции клеток или ткани, экспрессирующей HSV-1 (Kessler H.H. et al. (2000) Detection of Herpes Simplex Virus DNA by real-time PCR, J Clin Microbiol, 38(7), 26382642).

В соответствии с альтернативой фармацевтическую композицию согласно изобретению или смесь используют при терапевтическом лечении популяции клеток или ткани, экспрессирующей HSV-2 (Kessler H.H. et al. (2000) Detection of Herpes Simplex Virus DNA by real-time PCR, J Clin Microbiol., 38(7), 2638-2642).

Предпочтительно активная смесь в соответствии с изобретением обладает антирепликационной эффективностью, вызванной фактом предварительного контакта с инфекцией здоровой клетки или ткани. Активная смесь в соответствии с изобретением может быть использована для предотвращения инфекции путем ограничения внутриклеточной вирусной репликации и/или путем ограничения проникновения вируса в клетку.

Предпочтительно активная смесь в соответствии с изобретением обладает преимущественной эффективностью против репликации при клеточном метаболизме инфицированной клетки (пути окислительного стресса и каналы кальция). Активная смесь в соответствии с изобретением может быть специально использована для прямого действия против внутриклеточной вирусной репликации и против суперинфекции клеток HSV-1 и/или HSV-2 той же инфицированной ткани или здоровой ткани, близкой к ней.

Согласно альтернативе активная смесь в соответствии с изобретением гетерогенно индуцирует ингибирование продукции интерлейкина-6 (IL-6) кожного лоскута человека, и следовательно, обладает противовоспалительной эффективностью.

Описание фигур

На фиг. 1 представлены изменения окислительно-восстановительного потенциала и концентрации Н₂О₂ при приготовлении смеси 1.

На фиг. 2 показан график Fe³⁺, используемый для анализа окислительно-восстановительной эффективности смеси 1.

На фиг. 3 показана окислительно-восстановительная эффективность смеси 1 при различных ее концентрациях (поглощение кверцетина по Fe(III) в плазме человека после контакта (2 мин) со смесью 1 (в нМ MoO₄ ^2-).

Фиг. 4 иллюстрирует номограмму окислительно-восстановительной эффективности смеси 1 при различных концентрациях последней.

Фиг. 5 иллюстрирует влияние смеси 1 при разной концентрации MoO₄ ^2- на продукцию in situ в плазме человека Fe^{3 +}, (i) на выделение из комплекса трансферрин-Fe³⁺ после контакта с препаратом, (ii) на равновесие Fe²⁺/Fe³⁺ и (iii) на окисление кверцетина.

Фиг. 6 иллюстрирует продукцию интерлейкина-6 (IL-6) в надосадочной жидкости культур биоптатов здоровой кожи человека (2 мин), стимулированных смесью 1 (24,3 мкМ активного вещества) или NaCl (100 мМ) в качестве контроля, (D1-5: донор 1-5, В1 или 2: биоптат 1 или 2).

Фиг. 7 иллюстрирует среднее значение продукции в течение 6 и 24 ч после контакта с интерлейкином-6 (IL-6) в надосадочной жидкости культуры здорового стимулированного биоптата кожи человека (2 мин) с помощью смеси 1 (24,3 мкМ активного вещество) или NaCl (100 мМ) в качестве контроля.

- 13 038115

На фиг. 8 представлена окислительно-восстановительная эффективность смеси 1 и смеси 2 при различных концентрациях (поглощение кверцетина Fe(III) в плазме человека после контакта (2 мин) со смесью 1 (в нМ MoO4^2-) или со смесью 2 (в нМ La(MoO4)^1-).

Примеры

Пример 1. Пример активной смеси в соответствии с изобретением.

Данный пример получен с солью молибдена. Готовили композицию формулы в соответствии с табл. 1 (смесь 1), выраженную в виде исходной концентрации компонентов.

Таблица 1

Компоненты	Смесь в соответствии с изобретением
Натрия молибдат	20,7 мкМ
ВАРТА	12,6 мкМ
EGTA	526 мкМ
Н2О2	353 мМ
CH3COOH/CH3COONa	70 мМ
pH (с NaOH)	4,4 - 5,0
ро окислительно-восстановительный	300 - 420 мВ

Композиция считается исходной композицией, так как она соответствует концентрациям добавленных реагентов без учета применяемого каталитического процесса.

Все компоненты, используемые для синтеза, а также готовый продукт, подтверждаются их спектром ИК-Фурье.

Таблица 1а

Продукт	Чистота	Формула соединения	CAS No.
Натрия молибдат дигидрат	98-103%	Na2MoO4.2H2O	10102-40-6
ВАРТА: (1,2-бис(о-аминофенокси)этан- Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусная кислота)	>98%	C22H24N2O10	85233-19-8
EGTA: (этиленгликоль-бис(2- аминоэтилэфируХ.Х.Х'.Х'-тстрауксусная кислота)	>99%	C14H24N2O10	67-42-5
Перекись водорода	29-31%	Н2О2	722-84-1
Ледяная уксусная кислота	99,8-100,5%	СНзСООН	64-19-7
Натрия ацетат тригидрат	99-101%	C2H3NaO2.3H2O	5010524
Натрия гидроксид	Юн	NaOH	1310-73-2
Деминерализованная вода	1 мкС	Н2О	7732-18-5

Цифры измерений, проведенных во время и после синтеза, являются средними значениями от трех продукций.

Указанные ниже количества предназначены для приготовления одного литра смеси 1.

А - этап (i): приготовление буферного раствора (раствор BS).

CH3COOH (100%; 5: 1,05 г/см³ (жидкость, 20°С)) - 4,0 мл (итоговая 70 мМ).

CH3COONa-3H₂O (100%) - 8 г (итоговая 59 мМ).

Вода - до 1 л.

Проверка pH 4,7-4,8.

Комнатная температура (20°С).

В - этап (ii): приготовление раствора комплекса металла (раствора CS).

Na₂MoO₄-2H₂O (источник Mo(VI); 100%) - 200 мг (в итоге 2,4 мМ).

Вода - до 340 мл.

Умеренное перемешивание при комнатной температуре.

С - этап (iii): приготовление исходного раствора (Si1).

Вода - 900 мл.

CH3COOH (100%) - 4 мл (70 мМ).

Добавляли очень медленно, а затем очень слабо перемешивали (250 об/мин), pH 2,9-3,8.

Еокислительно-восстановительный ^470-490 мВ, а затем

Н₂О₂(30%) до конечной концентрации 1,2 мас.% и в соответствии с предварительными анализами.

На 45 мин:

pH 2,70-2,90.

Еокислительно-восстановительный ^440-460 мВ.

По уравнению Нобля [Н₂О₂]=380-410 мМ (раствор Si1).

D - этап (iv): приготовление исходного раствора (Si2).

Вводили раствор BS в раствор Si1 - 12 мл (> 1 мМ ацетат).

Добавляли при умеренном перемешивании.

На 45 мин:

pH-2,90.

Еокислительно-восстановительный ^460-480 мВ.

- 14 038115

По уравнению Нобля [H2O2]=360-410 мМ - (раствор Si2).

Е - этап (v): приготовление раствора пероксомолибдена S1.

Вводили раствор CS в раствор Si2 - 10 мл.

На 45 мин:

pH 2,80-3,00.

Еокислительно-восстановительный ^450-480 мВ.

По уравнению Нобля [Н₂О₂]=370-400 мМ - (раствор S1).

F - этап (vi): приготовление раствора S2.

Доведение pH при умеренном перемешивании:

NaOH 9,9-10,1 М 3,6 мл для 0,9 л смеси 1.

pH 4,5-5,0.

На 45 мин:

pH 4,60.

Еокислительно-восстановительный ^380-390 мВ ^- (раствор S2).

G - этап (vii): добавление хелатирующих агентов - приготовление раствора S4.

Введение BAPTA (98,8%) - 6 мг/л, после очень медленного растворения BAPTA при умеренном перемешивании в аликвоте композиции S2 (1,4 л), предварительно уравновешенной при 25°С (так называемый раствор S3,1).

Объединяли раствор S3,1 с раствором S2 для получения раствора S3,2.

На 45 мин:

pH 4,40-4,70.

Еокислительно-восстановительный ^380-390 мВ.

По уравнению Нобля [Н₂О₂]=370-390 мМ.

Введение EGTA (99,1%) - 200 мг/л в раствор S3,2 для получения раствора S4.

Растворяли при умеренном перемешивании.

На 45 мин:

pH 4,40-4,60.

Еокислительно-восстановительный ^380-390 мВ.

По уравнению Нобля [Н₂О₂]=370-420 мМ.

H - этап (viii): доведение pH.

Доведение pH (NaOH 9,9-10,1 М, т.е.»400 г/л) ^ pH: 4,60±0,2.

I - этап (ix): доведение объема итогового раствора (FS).

Доведение объема деминерализованной водой - до 1 л.

На 12-18 ч:

pH 4,50-4,70.

Еокислительно-восстановительный: ^380-390 мВ.

По уравнению Нобля [Н₂О₂]=350-380 мМ.

По титрованию [Н₂О₂]=400-430 мМ.

Плотность: δ=1,004 г/мл.

Смесь в соответствии с изобретением, готовая к применению, стабильна в темноте в течение более 6 месяцев при комнатной температуре или при 45°С.

Концентрация Na гидропероксомолибдата составляет 24,3 мкМ в итоговой смеси 1.

Пример 2. Характеристики при вариации окислительно-восстановительного потенциала.

Характеристики активной смеси в соответствии с настоящим изобретением оценивали при вариации окислительно-восстановительного потенциала во время синтеза композиции, приготовленной в соответствии с примером 1.

В соответствии с фиг. 1 относительно исходного раствора (»470 мВ, этап 3) восстановление окислительно-восстановительного потенциала составило »90 мВ (»380 мВ) на этапе 6 (доведение pH гидроксидом натрия). Окислительно-восстановительный потенциал оставался постоянным до конца синтеза (этап 9). То же самое относится к выдерживанию составов смеси по изобретению в соответствии с примером 1 в течение 6 месяцев при комнатной температуре (389±5 мВ) и при 45°С (389±8 мВ) при pH 4,56±0,40 и 4,53±0,41 соответственно.

Пример 3. Характеристики потребления и продукции Н₂О₂ - генерация равновесия пероксо-реагента и окислительно-восстановительный потенциал смеси 1.

Характеристики активной смеси в соответствии с настоящим изобретением оценивали по потреблению и продукции Н2О2 во время синтеза композиции, полученной в соответствии с примером 1.

В соответствии с фиг. 1 относительно концентрации исходного раствора H₂O₂ (353 мМ, этапы 3-10) наблюдалась внезапная продукция перекиси (»42 мМ, включая небольшую фракцию перуксусной кислоты) из-за добавления Н2О2 в буферный раствор (уксусная кислота/ ацетат). Если добавление H2O2 не проводят в забуференном кислотой водном растворе (этап 3, pH 2,84±0,1), его спонтанное и быстрое разложение происходит из-за слишком высокого pH (воды) (pKa_HO2·_-/О2·_-: 4,8).

- 15 038115

С этапа 4 до этапа 7 наблюдалось ограниченное потребление H2O2 (10±6 мМ) до его стабилизации при 381±5 мМ (этап 7+BAPTA).

Добавление EGTA смещало перекисное равновесие (фентонподобной реакции) путем деградации перекиси, то есть от 393±29 мМ на этапе 7, до 357±26 мМ на этапе 9 и 365±15 мМ на этапе 9 +12 ч.

На этапе 6 наблюдалось внезапное падение окислительно-восстановительного потенциала (от 463±15 до 392±17 мВ) при доведении pH. Добавление (этап 7) хелатирующих агентов BAPTA, а затем EGTA последовательно способствовало стабилизации окислительно-восстановительного потенциала (386±5 и 383±6 мВ) путем стабилизации химических равновесий.

Пример 4. Определение окислительно-восстановительной эффективности смеси по изобретению; кверцетиновые методы.

А. Реактивные растворы.

1. Кверцетин.

Готовили раствор кверцетина дигидрата (2-(3,4-дигидроксифенил)-3,5,7-тригидрокси-4Н-1бензопиран-4-он дигидрат, 3,3',4',5,7-пентагидроксифлавон дигидрат; (C₁₅H₁₀O₇,₂H₂O) с концентрацией 10^-3 моль/л в метаноле.

2. Раствор соляной кислоты.

Первый раствор соляной кислоты 1 М готовили в метаноле. Второй раствор готовили с концентрацией 0,3 М в метаноле. Реактивный раствор готовили путем добавления 343 мкл 1 М раствора к 1,357 мкл 0,3 М раствора.

3. Растворы Fe³⁺ (справочный график).

Раствор Fe³⁺ (Fe₂(SO₄)₃-H₂O) с концентрацией 2 мг/мл готовили в воде ВЭЖХ качества. Затем его разбавляли для получения восьми растворов сравнения 20, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000 и 1,500 мкг/мл. Эти растворы в итоге разбавляли в 20 раз плазмой человека или водой ВЭЖХ качества для итогового получения концентраций 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50 и 75 мкг/мл.

4. Растворы Fe²⁺ (справочная номограмма, контроль активности).

Раствор Fe²⁺ (FeSO₄,7H₂O) с концентрацией 89 мг/мл готовили в воде ВЭЖХ качества. Затем его разбавляли для получения трех растворов сравнения: 0,445, 4,45 и 44,5 мг/мл. Эти растворы в итоге разбавляли в 10 раз водой ВЭЖХ качества для итогового получения концентраций: 0, 0,0445, 0,445 и 4,45 мг/мл.

В. Количественные анализы кверцетиновым методом.

Присутствие Fe³⁺ (номограмма) или его продукцию (Fe²⁺ номограмма и эффективность смеси по изобретению спустя 2 мин контакта) рассчитывали кверцетиновым методом.

В соответствии с условиями анализа или применением смеси 1:

смесь_окисл означает смесь в соответствии с изобретением в качестве окислителя.

смесь_восст означает смесь в соответствии с изобретением в качестве восстановителя.

Продукция Fe³⁺ является следующей:

Трансферрин-2Ре³⁺+смесьВОсст+ЗН⁺—► ТрансферринВОсст + 2Fe³⁺(_aq) + смесь_0Кисл(1)

Fe (aq) + СМССЬвосст + 6 F6 (aq) + СМССЬокисл (2)

Fe³⁺(aq) + кверцетинвосст —> кверцетинокисл + Fe²⁺(_aq) (3)

Реакция (1) происходит в среде плазмы.

Реакция (2) происходит в среде плазмы или воде ВЭЖХ и соответствует равновесию реакции Фентона-Габера-Вейса.

Реакция (3) является окислительной реакцией кверцетина для оценки окислительновосстановительного потенциала смеси 1.

В кислой среде и при 70°С кверцетин специфически окисляется ионом трехвалентного железа (Fe³⁺; El Hajji et al., 2006 и Balcerzak et al., 2008) из трансферрина в среде плазмы, а не ионом двухвалентного железа (Fe²⁺). Ион Fe³⁺является растворимым в этих условиях.

мкл раствора кверцетина добавляли к 170 мкл реактивного раствора соляной кислоты. После гомогенизации добавляли 50 мкл образца (Fe³⁺ в плазме человека или в воде ВЭЖХ качества, Fe²⁺ в воде ВЭЖХ качества, смесь по изобретению через 2 мин контакта с плазмой человека). Растворы интенсивно перемешивали в течение непродолжительного времени, а затем инкубировали в течение 1 ч при 70°С. После инкубации образцы центрифугировали в течение 15 мин при 14000 об/мин и при комнатной температуре. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости. УФ-спектр каждого образца получали от 230 до 500 нм. Вычитали показания холостой пробы: воды, Fe²⁺, Fe³⁺, плазмы в зависимости от типа эксперимента. Сохраняется пик поглощения кверцетина, окисленного Fe³⁺ из трансферрина плазмы и в реакции Фентона-Габера-Вейса in situ (от 285 до 305 нм).

Вершина кривой центрирована в направлении 292 нм, когда эксперимент проводили в воде ВЭЖХ или в плазме. Он может перемещаться на максимум 10 нм при вычитании экспериментальных холостых проб.

1. Номограмма для расчета Fe³⁺.

- 16 038115

Номограмму для иона Fe(III) получают, например, путем измерения УФ-поглощения (в диапазоне

250-330 нм) окисленного кверцетина для различных концентраций Fe³⁺ (см. диапазон Fe³⁺ выше) в плазме человека и путем построения оптической плотности в зависимости от длины волны.

Из спектра области 250-330 нм рассчитывают площадь под кривой (AUC) между 285 и 305 нм по формуле

1* 305 нм Л 305 нм

305 нм I I

АУС = I f(x)dx = I Поглощение 4(Л) 285 нм I I

J 285 нм »1 285 нм

Соответственно каждую площадь поверхности пика 285-305 нм для каждой точки диапазона Fe³⁺ наносили на график. Строили кривую тенденции (Excel), вычитали уравнение (коэффициент корреляции R², для которого самое близкое значение к 1 проверяет эксперимент) (Excel).

Оно может быть линейной или полиномиальной формой типа y=ах²+bx+c. При эксперименте это соотношения может быть типа у = -0,0021х² + 0,4819х + 0,4521; R² = 0,9966 (фиг. 2). (4)

Для смеси согласно изобретению концентрация эквивалента Fe³⁺, полученного в плазменной среде или из Fe²⁺, является отражением окислительного потенциала из изобретения и рассчитывается из уравнения (4). Это непрямой метод измерения окислительно-восстановительной эффективности смеси 1 путем анализа УФ-поглощения кверцетина, окисленного Fe³⁺. Соответственно упоминается концентрация в Fe³⁺ эквиваленте. Кроме того, можно сравнить окислительно-восстановительный потенциал раствора в соответствии с изобретением, подлежащего испытанию, с показателями эталонного раствора в соответствии с изобретением, другими словами, путем сравнения с количественной оценкой окислительновосстановительной эффективности смеси в соответствии с изобретением.

2. Номограмма Fe²⁺.

Таким же способом, как для иона Fe(III), получали график для иона Fe(II). Например, пик УФпоглощения (230-500 нм) кверцетина, окисленного Fe³⁺, полученным из смеси по изобретению при 1,22 мкМ активного вещества (250 мкг/л) и через 2 мин контакта с Fe²⁺, измеряли в диапазоне, описанном выше. Можно провести такие же математические анализы AUC, как описано для Fe(III) иона.

3. Количественное определение окислительно-восстановительной эффективности смеси по изобретению, например, для 1,22 мкМ (250 мкг/л) активного вещества MoO₄ ^2-.

В соответствии с процедурой, описанной в пункте В, окислительно-восстановительную эффективность смеси по изобретению (1,22 мкМ MoO₄ ^2- в плазме человека) тестировали для (i) оценки ее старения при комнатной температуре и при 45°С; (ii) валидации ее производства и сравнительной оценки составов; (iii) количественного определения ее чрескожного проникновения; (iv) оценки ее биодоступности и (v) оценки ее биофазы.

Согласно уравнению (4) удельную площадь пика поглощения УФ рассчитывали (как AUC) между 285 и 305 нм пика кверцетина, окисленного свободным Fe³⁺, полученным после контакта плазмы в течение 2 мин со смесью по изобретению (уравнения (1), (2) и (3)) при итоговой концентрации 1,22 мкМ с комплексом трансферрин- Fe³⁺. В среднем продукция эквивалента Fe³⁺ (Fe^X составила порядка 30-50 мкг/мл плазмы.

4. Определение с помощью номограммы эффективной концентрации смеси по изобретению в среде плазмы.

Железо плазмы не является свободным. Оно связано с трансферрином (или сидерофилином) в его трехвалентной форме (Fe³⁺) в количестве от 1 до 2 остатков на молекулу. Железо в его двухвалентной форме (Fe²⁺) не циркулирует вне его комплекса с гемоглобином. Считается, что используемая плазма человека не гемолизирована. Кверцетиновая реакция смеси по изобретению с медью плазмы считается незначительной.

Ряд концентраций смеси по изобретению (15,2; 7,6; 3,8 и 1,9 нМ итогового MoO₄ ^2-) инкубировали в плазме человека. Реакцию с кверцетином проводили, как описано в пункте B. Пик удельного поглощения (за вычетом холостой пробы плазмы+кверцетин) был интегрирован, как описано в В-1 (фиг. 3).

Строили график (Excel) в полиномиальной форме, и рассчитывали уравнение тенденции (y=0,0144x²+0,5863x+0,4511 c R²=0,9934 (5); фиг. 4).

Соотношение пропорциональности (уравнение 5) установлено между количеством по изобретению в добавленной концентрации к плазме человека и количеством эквивалента Fe³⁺ (уравнение 4), обнаруженным по реакции окисления кверцетина, то есть 28,95; 12,19; 3,97; 3,12 мкг Fe³⁺ _эkв/мл плазмы человека, в соответствии с диапазоном смеси по изобретению, описанной выше.

Пр имер 5. Оценка окислительно-восстановительной эффективности по изобретению на плазме человека.

После добавления смеси в соответствии с изобретением (пример 1 - смесь 1) в плазму человека и после времени контакта 2 мин до концентрации 0,03038 мкМ MoO₄ ^2-, реакция окисления кверцетина для продукции Fe³⁺ из комплекса трансферрин Fe³⁺ плазмы и реакция Фентона-Габера-Вейса является оптимальной и линейной (см. пример 4).

- 17 038115

После вычитания значений экспериментальных холостых проб увеличение концентрации по изобретению приводило к уменьшению продукции in situ кверцетина, окисленного Fe³⁺, из-за смещения равновесий реакции Фентона-Габера-Вейса (Fe³VFe²'). Итоговые испытанные концентрации MoO₄ ^2- составили 0,00; 1,22; 4,05; 12,15; 24,30 и 30,38 мкМ (фиг. 5).

Пример 6. Антирепликационная эффективность.

А. Модели.

Испытывали четыре контактных модели смеси в соответствии с примером 1 (Смесь 1). Они представляют четыре физиологических возможности, с которыми смесь 1 может столкнуться при местном терапевтическом применении, т.е.

модель 1: смесь 1 на клетках, инфицированных HSV-1;

модель 2: смесь 1 на клетках, не инфицированных HSV-1;

модель 3: смесь 1 на клетках, еще не инфицированных, и смесь 1 на свободных от HSV-1 (еще не инфицированных) клетках;

модель 4: смесь 1 на HSV-1 перед инфекцией.

Анализировали два времени контакта смеси 1, т.е. 2 мин или 1,5 мин, с последующим удалением смеси 1.

Анализировали две концентрации смеси 1: 0,81 и 2,03 мкМ активного вещества, т.е. 167 и 417 мкг/л соответственно.

В качестве метода количественного определения эффективности использовали кПЦР (количественную полимеразную цепную реакцию: Mullis K. et al. (1986) Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol, 51 (Pt 1), 263-273.)

Антирепликационную эффективность (АЭ) смеси 1 для HSV-1 оценивали с помощью кПЦР со специфическими праймерами вирусного генома (Kessler H.H. et al. (2000) Detection of Herpes simplex vims DNA by real-time PCR J. Clin. Microbiol, 38(7), 2638-2642).

Цитотоксичность смеси 1 (Ц) на линии ВНК-21 оценивали посредством кПЦР со специфическими праймерами гена малой рибосомной субъединицы 18S (Texcell - Evry, Франция).

Множественность заражения (MOI): 1, т.е. 5,10⁵ ТСШ₅₀(дозы заражения 50% культуры тканей).

Эксперименты с количественной ПЦР проводили на 0 ч (2 ч после контакта ВНК-21 и HSV-1 с последующим удалением HSV-1), 2, 4 и 8 ч после инфекции.

Отношение АЭ/Ц дает индекс эффективности in vitro (ИЭ) смеси 1, соответствующий модели исследования.

Модель 1.

BHK-21+HSV-1 (2ч; инфекция)^промывание (PBS) для удаления вируса^образцы t0 ч^+смесь 1 (2 мин)^промывание (культуральная среда) для удаления смеси 1 ^инкубация клеток при 37°С^образцы t2, t4 и t8 ч после инфекции.

Модель 2.

BHK-21+смесь 1 (1,5 и 2 мин)^промывание (PBS) для удаления смеси 1^клетки+HSV-1 (2 ч; инфекция)^промывание (культуральная среда) для удаления HSV-1^образцы t0 ч^инкубация клеток при 37°С^образцы t2, t4 и t8 ч после инфекции.

Модель 3.

BHK-21+смесь 1 (1,5 и 2 мин)^промывание (PBS) для удаления смеси 1.

HSV-1+смесь 1 (1,5 и 2 мин) ^-промывание (PBS) для удаления смеси 1.

Пул клеток и вирусов, имевших предварительный контакт со смесью 1 (2ч; инфекция) ^промывание (культуральная среда) для удаления HSV-1 ^образцы t0 ч^инкубация клеток при 37°С^образцы t2, t4 и t8 ч после инфекции.

Модель 4.

HSV-1+смесь 1 (2 мин)^промывание (PBS) для удаления смеси 1^+ВНК-21 (2ч ; инфекция) ^промывание (культуральная среда) для удаления HSV-1 ^образцы t0 ч^инкубация клеток при 37°С^образцы t2, t4- и t8 ч после инфекции.

В. Результаты.

- 18 038115

Таблица 2

Уменьшение до 8 ч размножения HSV-1 в ВНК-21 клетках после контакта со смесью 1 (в мкг/л активного вещества) или ацикловиром (АЦВ); Индекс эффективности in vitro (ИЭ)

	Уменьшение репликации HSV-1 на t8n (%)*	ИЭ на 18ч / модель**
Вещество	Смесь 1	АЦВ	Смесь 1	Смесь 1	АЦВ	Смесь 1
Время контакта (мин)	2	2	2	1,5	1,5	2	2	2	1,5	1,5
Концентрация (мкг/л)	167	417	103	167	417	167	417	103	167	417
Модель 1	-97	-98	-12	НТ	нт	37	48	2	нт	нт
Модель 2	-72	-96	-1	-70	-86	4	23	1	3	7
Модель 3	-93	-97	-6	-78	-90	14	35	1	4	10
Модель 4	-56	-69	-52#	нт	нт	2	3	2#	нт	нт

* - уменьшение репликации HSV (УР) анализируемыми веществами (смесь 1, контроль ацикловир) выражено в процентах и соответствует подсчетам с помощью количественной ПЦР отношения геномов HSV-1 и цитотоксичности, которую оценивали по количественному определению субъединицы 18S клеткой-хозяином: УР={(100x([HSV-1]оn_ЬIT/[18SU_IT))/([HSV-1]_Kон^ * * - индекс эффективности для подавления репликации in vitro (ИЭ) анализируемых веществ представлен ([HSV-1]/[18S] при оценке в специфической кПЦР) положительного контроля, инфицированного HSV ([HSV-1]конmроль+/[18S]конmроль+) против значений для анализируемых веществ (смесь 1, контроль ацикловир): ИЭ=([HSV-1]конmроль+/[18S]конmроль+)/([HSV-1]оnьIm/[18S]оnьIm);

# - [АЦВ]: 1 г/л.

Наилучшие значения ИЭ (табл. 2) получены спустя 2 мин контакта смеси 1 и при концентрации 417 мкг/л. Мы отметили значительное влияние времени контакта на ИЭ (1,5 и 2 мин, модели 2 и 3).

ИЭ, полученные на моделях 1 и 3 со временем контакта 2 мин и концентрацией смеси 1 167 мкг/л, являются особенно значительными.

Независимо от модели ИЭ, полученные с ацикловиром (ACV), не были значительными (табл. 2). Таблица 3

Процентное значение при количественном определении посредством количественной ПЦР (гены 18S или HSV; спустя 8 ч после контакта в течение 2 мин): (i) размножения линии BHK-21 (контроль: не инфицированная линия) и (ii) репликации HSV-1 (контроль: инфицированная линия)

Ген/геном	18S (%)	HSV (%)
Контроль	Линия+ (PBS	-HSV)	Линия + (PBS + HSV)
Анализируемое вещество	Смесь 1	АЦВ (мг/л)	Смесь 1	АЦВ (мг/л)	Смесь 1	АЦВ (мг/л)
[активное вещество]	167 pg/L	417 pg/L		167 pg/L	417 pg/L		167 pg/L	417 pg/L
Модель 1	45	27	108(1)	49	30	И8(1)	1	< 1	76(1)
Модель 2	62	41	57(1)	68	44	62(1)	19	2	61(1)
Модель 3	118	70	1И(1)	98	58	92(1)	7	2	86(1)
Модель 4	120	107	97 (103)	139	123	111 (103)	64	38	54 (103)
Анализы	1	2	3	4	5	6	7	8	9

Для смеси 1 (при концентрации 167-417 мкг/л) или АЦВ (в концентрации 10³ мг/л) независимо от используемого контроля (линия+PBS-HSV или линия+PBS+HSV) результаты количественного определения 18S являются сопоставимыми для одной и той же модели (табл. 3, опыт 1 против 4, 2 против 5, 3 против 6).

Для смеси 1 достигалась дозозависимая значительная антирепликационная эффективность (табл. 3, опыты 7 и 8) для моделей 1, 2 и 3. Она не достигалась для АЦВ (табл. 3, опыт 9).

Сопоставимая цитотоксичность смеси 1 (167 мкг/л) и АЦВ (1 мг/л) (табл. 3) отмечена в соответствии с моделями 2 и 3 (табл. 3, опыты 1, 3, 4 и 6).

Отмечено отсутствие анти-HSV эффективности (табл. 2 и 3, опыт 9) для АЦВ (1 мг/л или 1 г/л). Модели, введенные для исследования смеси 1, не соответствуют исследованию, связанному с АЦВ.

Для модели 1 (смесь 1 на инфицированных клетках):

наилучший ИЭ (табл. 2) с двумя концентрациями смеси 1 (2 мин контакта, 167 и 417 мкг/л, ИЭ: 37 и 48 соответственно).

Смесь 1 оказывала прямой эффект (табл. 2 и 3) на внутриядерную репликацию вируса, вероятно, на клеточный метаболизм.

Смесь 1 обладала хорошей специфичностью в отношении инфицированных клеток (табл. 3, опыты 4 и 5; модель 1 против 2).

Для модели 2 (смесь 1 на клетках перед инфицированием):

интересующий ИЭ (табл. 2; контакт в течение 2 мин и 417 мкг/л; ИЭ: 23).

Смесь 1 оказывала влияние на клетки, которые становились менее восприимчивыми к инфекции и/или приобретали метаболизм, несовместимый с репликацией вируса (табл. 3, опыты 7 и 8).

Для модели 3 (смесь 1 на не инфицированных клетках и HSV-1, по отдельности и перед объединением в пул):

- 19 038115 интересующий ИЭ (табл. 2) с двумя концентрациями смеси 1 (2 мин контакта, 167 и 417 мкг/л, ИЭ:

и 35 соответственно).

В зависимости от используемой дозы (167 или 417 мкг/л) нулевая цитотоксичность (табл. 3, опыт 4) или ограниченная цитотоксичность (табл. 3, опыт 5) при очень хорошей антивирусной эффективности (табл. 3, опыты 7 и 8 соответственно).

Мы отметили эффективность смеси 1, что является аккумуляцией модели 2 со значительным действием на клетки, и модели 4 с ограниченным действием на вирус по отдельности (табл. 2 и 3).

Для модели 4 (смесь 1 на HSV-1):

низкий ИЭ (время контакта: 2 мин, 167 и 417 мкг/л, ИЭ: 2 и 3 соответственно; табл. 2), что подтверждалось отсутствием цитотоксичности, но значительной репликацией вируса (табл. 3, опыты 8 и 9).

С. Выводы.

На линии ВНК-21 основная эффективность смеси 1 заключалась в (i) наличии предпочтительно цитотоксичности для инфицированных клеток; (ii) ингибировании вирусной репликации инфицированных клеток и (iii) ограничении инфицирования здоровых клеток.

Мишенью может быть мембрана (например, рецепторы для вируса) и/или метаболизм (например, регуляция стресса и путей апоптоза).

Распознавание и интернализация вируса.

В соответствии с моделью 4 смесь 1 обладает низкой прямой антирепликационной эффективностью в отношении вируса. В этих экспериментальных условиях, близких к терапевтическому применению, это наблюдение согласуется с ограниченным изменением вирусных рецепторов на клетке: gB (HSV-2), gC (HSV-1), gD и gH/gL (HSV-1 и -2). Смесь 1 меняет только ограниченным образом вирусные гликопротеины посредством реакции Фентона-Габера-Вейса in vitro.

Подобным образом, мы не отметили существенного влияния смеси 1 на фосфолипидную мембрану HSV, которое может нарушать слияние и пенетрацию мембраны.

В этих условиях эксперимента смесь 1 не является вируцидной.

Вирусная репликация и метаболизм клеток.

Методика количественной ПНР использует клеточный лизат спустя 8 ч после инфекции. Снижение репликации вируса может быть результатом плохого распознавания и/или интернализации и/или репликации (модификации метаболизма клеток, вызванной инфекцией и/или смесью 1).

Если бы вирусный путь распространения был изменен смесью 1 без изменения других путей и независимо от модели, то полученные ИЭ были бы намного меньше из-за накопления вирионов в цитоплазме.

В соответствии с моделью 2 (ИЭ: 23 со временем контакта 2 мин и 417 мкг/л) наблюдается низкая вирусная репликация после предварительного клеточного контакта со смесью 1 (табл. 2 и 3, опыт 8).

В соответствии с этой моделью клетки ВНК-21 находились в контакте в течение 2 мин со смесью 1. Время контакта с HSV в полной питательной культуральной среде составило 2 ч. Клеточные модификации, индуцированные смесью 1, имеют продолжительное время действия более 2 ч и дополнительно прогнозируют профилактическую эффективность смеси 1.

В дополнение к распознаванию HSV-1 клеткой, частично подвергнутой влиянию смеси 1, из-за ее вероятного и ограниченного действия на вирусный гликопротеин gD (38% репликации, табл. 2), на это распознавание также может влиять действие на рецепторы клеток к gD (HVEM и нектину), а также на два других рецептора поверхности клеток к gB и gH/gL, которые представляют собой гепарансульфаты и интегрины.

Из-за проникновения радикалов (модификации внутриклеточного или трансмембранного окислительно-восстановительного потенциала, регуляции путей окислительного стресса) потоки кальция клеток могут перемещаться. Эти притоки кальция клеток также индуцируются инфекцией HSV. Однако последнее может быть немедленно демобилизовано из-за введения в смесь 1 свободных и непроникающих хелатирующих агентов (ограничение клеточной цитотоксичности). Другие основные модификации клеток, с другой стороны, не должны исключаться и могут соответствовать окислениям или восстановлениям белков (например, цистеинильных мостиков), и в частности, структурных белков, которые могут возникать при вирусном эндоцитозе.

В соответствии с моделью 3 (табл. 2 и 3, опыты 7 и 8) наблюдается значительное снижение репликации вируса (ИЭ: 14 и 35 для времени контакта 2 мин, 167 и 417 мкг/л соответственно).

Оба феномена накапливаются. Первый - это ограниченное действие на вирус (см. модель 4), второй - более значимое действие на клетку (см. модель 2).

Добавление ИЭ моделей 2 и 4 (2 мин и 417 мкг/л), т.е. 23 и 3 соответственно, дает сумму (26) меньшую, но более близкую к экспериментально полученной для модели 3, т.е. 35.

Предполагается потенциальное накопление (i) плохого распознавания партнеров HSV и клеток и (ii) ингибирования интернализации и/или репликации, в частности, путем изменения клеточного метаболизма.

Модель 1 (ИЭ: 48 с 2 мин времени контакта и 417 мкг/л) является наиболее эффективной.

Действие противоинфекционной смеси 1 проявляется предпочтительнее в отношении клетки, чем

- 20 038115 вируса. Это действие тем более заметно, поскольку клетка предварительно заражена.

На этой модели, которая лучше соответствует терапевтической проблеме, очевидно, что смесь 1 имеет специфическую значительную внутриклеточную фармакологическую эффективность. Для 417 мкг/л активного вещества табл.3 показывает, что количество рибосомальных субъединиц 18S меньше (в зависимости от используемого контроля, 27 и 30%, опыты 2 и 5) в этой модели, чем на модели 2 (в зависимости от используемого контроля, 41 и 44%, опыты 2 и 5) и на модели 3 (в зависимости от используемого контроля, 70 и 58%, опыты 2 и 5), что является аргументом в пользу специфичности для инфицированной клетки по сравнению со здоровой клеткой.

Мишени смеси 1 в этой модели не могут быть либо распознаванием, либо интернализацией, а фактически являются метаболическими модификациями. Последние помещаются в новое равновесие, особенно из-за трансмембранного перехода радикалов, модификации окислительно-восстановительного потенциала клетки и наличия внешних хелатирующих агентов, между маршрутами окислительного стресса (уже вызванными инфекцией), потоками кальция (уже вызванными инфекцией), ингибирования кальцийзависимого высвобождения вирионов, окислительных модификаций белков, прямо или косвенно вовлеченных в репликацию вируса.

Пример 7. Оценка продукции интерлейкинов ex vivo.

Биоптаты непатологических тканей (8 биоптатов от 4 доноров) кожи человека, полученные при хирургических операциях по поводу снижения массы тела, обрабатывали ex vivo смесью 1 (5 мг/л активного вещества, 2 мин). Надосадочные жидкости от биоптатов отбирали спустя 6 и 24 ч после контакта для количественного определения интерферона-α (IFN-α, ингибирование инфекции HSV, Mikloska Z. et al. (2001) Alpha and Gamma Interferons Inhibit Herpes Simplex Virus Type 1 Infection and Spread in Epidermal Cells after Axonal Transmission, J. Virol, 75(23), 11821-11826), -β (IFN-β; inhibition of HSV replication; Sainz Jr. B. et al. (2002) Alpha/Beta Interferon and Gamma Interferon Synergize To Inhibit the Replication of Herpes Simplex Virus Type 1, J. Virol, 76(22), 11541-11550) и интерлейкина 6 (IL-6, маркер воспаления).

Положительным контролем эксперимента был физиологический раствор (NaCl 100 мМ).

Не отмечено отсутствия изменения базового уровня IFN-α и IFN-β в клетках.

В зависимости от биоптатов и доноров и соответственно от травмы при хирургической операции и экспериментальной манипуляции:

Через 6 ч после контакта (фиг. 6 и 7) с NaCl в качестве контроля, продукция базового IL-6 277±11 до 2,866±206 пг/мл.

со смесью 1, ингибирование продукция IL-6 относительно контроля NaCl, от 0 до 1,015±17 пг/мл.

Через 24 ч после контакта (фиг. 6 и 7):

с контролем NaCl, базовая продукция IL-6 - 1,485±37 до 7,454±199 пг/мл.

со смесью 1, ингибирование продукции IL-6 относительно контроля NaCl, 84±15 до 5,910±29 пг/мл.

Выводы:

гетерогенность продукции и избыточной продукции (6 и 24 ч соответственно) для IL-6 после контакта NaCl и смеси 1 (фиг. 6), гетерогенное ингибирование продукции IL-6 после контакта со смесью 1 (5 мг/л активного вещества), которое составляет в среднем 28% спустя 6 ч и 19% спустя 24 ч, относительно контроля NaCl (фиг. 6).

По этому ингибированию продукции смесь 1 обладает противовоспалительными свойствами (фиг. 7).

Пример 8. Разложение в плазме и время полужизни.

Одним из доноров радикалов (в основном HO2·, который имеет продолжительность жизни до нескольких секунд и заметный индекс проникновения в клетки) в реакции типа Фентона-Габера-Вейса активного вещества MoO₄ ^2- смеси 1 является Н₂О₂. Деградацию этого индикатора отслеживают для оценки скорости потребления смеси 1 или ее дезактивации.

Методика.

Смесь 1 (68,9 мкМ или конечная концентрация 14,2 мкг/л) инкубировали в свежей человеческой плазме. Кинетику исчезновения Н₂О₂ наблюдали по пероксидазной реакции на аликвотах, отобранных в последующие моменты времени.

Результаты:

В среднем (n=10) процент деградации вещества-индикатора смеси 1 в плазме человека при комнатной температуре после времени контакта 2 мин составляет 85,3±9,4%, 74±15,2% в первую минуту.

В первую минуту Время деградации 50% или DT₅₀=0,812 мин для раствора смеси 1 при исходной концентрации 68,9 мкМ активного вещества и исходном содержании 1 мМ H₂O₂.

Скорость деградации Kc_H2O2: «740 мкмоль смеси 1 при начальной концентрации 1 мМ Н₂О₂/мин/л плазмы или K_cMoO42-: «51,0 мкмоль смеси 1 при начальной концентрации 68,9 мкМ активного вещества МоО₄ ^2-/мин/л плазмы, в первую минуту инкубации при комнатной температуре.

Для образца 200 мкл смеси 1 при 24,3 мкМ (5,0 мг/л) активного вещества или 353 мМ (12 г/л) индикатора Н₂О₂ в рамках местного терапевтического применения имеется «5 нмоль активного вещества

- 21 038115

MoO4^2- или 70 мкмоль индикатора Н₂О₂. Этот образец в 1 л плазмы деградирует в пределах «0,1 мин.

Пример 9. Ограниченная гематотоксичность в периферической крови.

Целью данного исследования является оценка гематотоксичности смеси 1 (24,3 мкМ или конечная концентрация 5,0 мг/л) после инкубации 2, 3 и 5 мин в периферической крови человека. Токсичность, при которой наблюдается гемолиз, оценивали по основным параметрам крови, то есть количеству эритроцитов, лейкоцитов, гематокриту, тромбоцитов, среднему объему глобулы и уровню гемоглобина.

Выводы:

Гематологические параметры, относящиеся к количеству эритроцитов, лейкоцитов, гематокрита, среднему объему глобулы и уровню гемоглобина, не изменялись после инкубации в течение 5 мин со смесью согласно изобретению.

Количество тромбоцитов изменялось при контакте со смесью 1 от -35% сразу же после добавления, составив -69% через 5 мин.

Пример 10. Ограниченное чрескожное проникновение смеси в соответствии с изобретением; абсорбция, биофаза и биодоступность (OECD 428, ЕМЕА, Human Guideline, 2001).

Используемая смесь 1 была в пять раз более концентрированной (смесь 1x5), чтобы показать наименьшее проникновение веществ. Целью этого исследования была оценка (контроль, t0, t2 мин, Т60 мин) проникновения смеси 1x5, а также индикатора Н₂О₂ через непатологические биоптаты кожи человека.

Эту процедуру применяли к трем типам субстратов: общие биоптаты, рассеченные биоптаты в эпидермисе, с одной стороны, и в дерме, с другой стороны.

Методика:

Были протестированы 12 биоптатов от 2 доноров (измерения в каплях, нанесенных на лоскут [30 мкл] и в среде ниже последней [800 мкл]) в соответствии с обоими методами (табл. 4): (i) кверцетиновым методом, который оценивает окислительно-восстановительную эффективность смеси 1x5; и (ii) пероксидазным, который определяет концентрацию индикатора H₂O₂.

Капля (30 мкл), нанесенная на биоптаты и эпидермальные и дермальные лоскуты, в 5 была раз более концентрированной по содержанию активного вещества (121,5 мкМ или 25,02 мг/л) и индикатора (1,77 М или 60 г/л), чем терапевтический состав (24,3 мкМ или 5,0 мг/л и 352,8 мМ или 12 г/л соответственно). В 30 мкл нанесенной смеси 1x5 содержалось 3,65 нмоль или 750 нг активного вещества и 53 мкмоль или 1,8 мг индикатора.

Результаты.

Таблица 4

	Опыт	Анализы	Биоптат*	Эпидермис*	Дерма*
Капля	1	Окислительновосстановительная эффективность	От -1,4 до -10,5	От -5,7 до -23,9	НТ
2	Н2О2 индикатор	От -16,5 до -57,7	От -72,5 до -99,9	-99,6
Среда	3	Окислительновосстановительная эффективность	От +3,7 до +9,0	От +0,8 до +80,6	От +44,5 до +100
4	Н2О2 индикатор	От < +0,001** до +0,09	От +0,38 до +1,7	От +0,16 до +0,46

* - в % по отношению к t0 (-: снижение, +: повышение);

** - предел обнаружения.

Низкое или умеренное снижение (опыт 1) окислительно-восстановительной эффективности смеси 1 наблюдалось в капле поверх лоскута (от -1,4 до -23,9%).

Умеренное или значительно снижение (опыт 2) количества индикатора Н₂О₂ из смеси 1 наблюдалось в капле поверх лоскута (от -16,5 до -99,9%).

Наблюдалось легкое или значительное повышение (опыт 3) окислительно-восстановительной эффективности среды под лоскутом. Оно зависело от лоскута и от его типа. В полном биоптате это повышение из-за чрескожного проникновения было низким. В среднем оно составляло 6,35% и соответствовало проникновению 232 пмоль (47,6 нг) активного вещества из смеси 1. В случае эпидермиса или дермы это увеличение сильно меняется (от 0,8 до 100%). Это, скорее всего, связано с различиями в гистологических структурах (например, из-за пор, орошения кожи кровью, окончаний эпидермальных нервов).

Увеличение от не определяемого до незначительного (опыт 4) количества индикатора Н₂О₂ в среде под лоскутом наблюдалось независимо от типа лоскута (от <+0,001 до 1,7%). В случае полного биоптата это увеличение из-за чрескожного прохождения было особенно низким (от 0,53 до 47,7 нмоль, то есть от <0,018 до 1,62 мкг). В случае эпидермиса или дермы это увеличение в среднем было низким (1,04 и 0,31%, т.е. 0,55 и 0,16 мкмоль или 18,7 и 5,6 мкг соответственно).

Выводы:

Существует независимость тканей (поглощения, дезактивации, проникновения) от двух параметров, которые считаются типичными для смеси 1, являющихся окислительно-восстановительной эффективностью, обусловленной активным веществом, и дозой пероксидного индикатора, донора радикалов.

При анализе полного биоптата показатель проникновения смеси 1 соответствует толщине лоскута, то есть от 1 мм (средняя толщина эпидермиса) до 2 мм.

- 22 038115

Эпидермис содержит много нервных окончаний, которые могут быть центром аксонального высвобождения герпетических вирионов у пациента. Они являются мишенями смеси 1 так же, как инфицированные эпидермальные клетки или клетки до потенциальной инфекции. Учитывая последовательность двух тканей, биофаза смеси 1 почти строго зависит от толщины эпидермиса (1 мм) и полностью достигается для максимального поглощения тканью-мишенью.

Принимая во внимание, что только одна дерма васкуляризована, вновь самое большее 80,6% окислительно-восстановительной эффективности смеси 1 можно найти при ее контакте и при 1,7% индикатора. В этих экспериментальных условиях биодоступность смеси 1x5 составляет 2,94 нмоль или 605 нг активного вещества и 0,9 мкмоль или 30,6 мкг пероксидного индикатора.

В исследовании генотоксичности in vitro с тестом Эймса смесь по изобретению и ее метаболиты не были мутагенными в присутствии активатора S9 (5/5 штаммов Salmonella), она была мутагенной на 1 штамме из 5 при его отсутствии.

При местном применении на коже, при стимуляции или без стимуляции, смеси согласно изобретению (24,3 мкМ или 5,0 мг/л активного вещества) не отмечено какой-либо токсичности, связанной с высвобождением.

При изучении буккального и вагинального раздражения смесь согласно изобретению (24,3 мкМ или 5,0 мг/л) не вызывала раздражения (оценка 0/16) или вызывала очень слабое раздражение (оценка 1/16) соответственно.

В высокочувствительном исследовании раздражения на хориоаллантоисной мембране куриного яйца смесь 1 (18,23 и 24,3 мкМ или 3,75 и 5,0 мг/л) вызывала умеренное раздражение (индекс раздражения или ИР=6,8±0,4 и 6,3±0,21 соответственно).

В исследовании острой токсичности при нанесении на кожу смесь в соответствии с изобретением в дозах 25,0 и 31,3 мкг/ кг активного вещества с содержанием 60 и 75 мг/кг Н₂О₂ индикатора соответственно хорошо переносилась без каких-либо симптомов с Максимальной переносимой дозой (MTD) и Максимальной дозой без какого-либо наблюдаемого отрицательного эффекта (MDWNODE) или Максимальной дозой, не вызывающей обнаруживаемого вредного воздействия на здоровье человека (NOAEL) 31,3 мкг/кг активного вещества и 75 мг/кг индикатора.

В исследовании острой токсичности с внутривенным введением смесь в соответствии с изобретением в дозах 10,4 и 12,5 мкг/кг активного вещества, содержащегося в 25 и 30 мг/кг Н₂О₂ индикатора соответственно, переносилась без каких-либо заметных симптомов с Максимальной переносимой дозой (MTD) 12,5 мкг/кг активного вещества.

Пример 11. Приемлемая токсичность смеси в соответствии с изобретением.

I. Мутагенность in vitro (тест Эймса - OECD 471).

Целью данного исследования была оценка мутагенной активности активной смеси согласно изобретению (смеси 1) и ее метаболитов (продуцированных S9 фракцией печени крысы) на штаммах Salmonella typhimurium ТА97а, ТА98, ТА100, ТА102 и ТА1535.

Выводы:

Без какой-либо системы активации S9 активная смесь (7,7 или 2,43 мкМ, то есть 1,58 или 0,50 мг/л) в соответствии с изобретением и ее метаболиты не оказывали мутагенного воздействия на линии ТА97а, ТА98, ТА100 и ТА1535.

С системой активации S9 активная смесь (смесь 1x5: 121,5 мкМ или 25,02 мг/л) в соответствии с изобретением и ее метаболиты не оказывали какого-либо мутагенного воздействия на линии ТА97а, ТА98, ТА100, ТА102 и ТА1535.

Без системы активации S9 активная смесь в соответствии с изобретением не являлась мутагенной для штамма ТА102 при 0,50 мг/л.

В этом тесте in vitro мутагенный эффект активной смеси и ее метаболитов в соответствии с изобретением ограничен для ее использования (штамм ТА102).

II. Тест кожной сенсибилизации после индукции (на самках хомяков, OECD 406, ISO 10993-10: 2013 и ICH Memorandum SCCP 2005).

Согласно протоколу Magnusson & Kligman (Magnusson В. et al. (1969) The identification of contact allergens by animal assay. The guinea pig maximization test, J. Invest. Dermatol., 52(3), 268-276) исследовали сенсибилизирующий потенциал на коже самок хомяков в соответствии с тремя протоколами.

Протокол 1: Определение предельной переносимой дозы.

Концентрации смеси 1 от 1,25 до 20,00 мг/л активного вещества, содержащегося в 3-48 г/л Н₂О₂ индикатора соответственно, в 1 мл пластыря наносили на 24 ч на боковую поверхность животных, а затем наблюдали животных.

Концентрация смеси 1 при 10 мг/л активного вещества, содержащегося в 24 г/л индикатора, хорошо переносится и вызывает умеренное раздражение.

Концентрация смеси 1 при 5,0 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 г/л Н2О2 индикатора, хорошо переносится и считается максимальной дозой, не вызывающей раздражения.

Протокол 2. Определение предельной переносимой дозы после индукции путем подкожной инъек- 23 038115 ции.

Концентрации смеси 1 от 5 до 10 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 до 24 г/л Н₂О₂ индикатора соответственно, вводили (по 100 мкл) подкожно. Через 8 дней (первая индукция) осуществляли первое местное применение в виде пластыря размером 1 мл. Спустя 27 дней (вторая индукция) осуществляли второе местное применение в виде пластыря размером 1 мл. Наблюдения проводились через 29 дней.

Концентрация смеси 1 5 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 г/л индикатора, хорошо переносится и не вызывает раздражения.

Протокол 3. Изучение раздражения, вызванного стимуляцией и местным применением смеси 1 с 5 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 г/л Н2О2 индикатора.

100 мкл смеси 1 с 5,0 мг/л вводили подкожно. Через 4 дня область инъекции стимулировали 10%ным раствором додецилсульфата натрия (SDS) перед местным применением смеси 1 (1 мл) в пластыре. Через 6 дней проводили второе местное применение. На 21 день (индукция) осуществляли местное применение смеси 1 (1 мл) в пластыре с концентрациями от 6,26 до 10 мг/л активного вещества, содержащегося в 15-24 г/л индикатора.

Смесь 1 при 5,0 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 г/л индикатора, хорошо переносится, а показатель сенсибилизации кожных покровов композицией составил 0/3.

Выводы.

Смесь 1 при 5,0 мг/л активного вещества не обладает раздражающим эффектом. Макроскопического изменения кожи животных не наблюдалось. Соответственно нет необходимости в каком-либо патологоанатомическом исследовании.

III. Буккальное и вагинальное раздражение (на самках кроликов, OECD(99)20, -21, -23 -24, -(95)115, -(02) 9 и ISO-10993-10: 2013)

Целью этого исследования была оценка вагинальной и буккальной переносимости смеси 1 при 5,0 мг/л активного вещества, содержащегося в 12 г/л индикатора, в соответствии с воздействием, соответствующим 5-дневному терапевтическому применению у человека.

С 0 до 6 дней, каждые 24 ч, у животных применяли смесь (1 мл) буккально и вагинально. На 7-й день животных осматривали и измеряли их массу тела.

Выводы.

Концентрация смеси 1 5,0 мг/л активного вещества хорошо переносится. Индекс раздражения при буккальном и вагинальном применении составляет 0/16 и 1/16 соответственно. Следовательно, нет необходимости в патологоанатомическом исследовании.

IV. Тест на раздражение глаз (ICCVAM App В).

Используемый тест на раздражение глаз был тестом, заменяющим НЕТ-САМ (тест на хориоаллантоисной мембране куриного яйца), опубликованным в Official Journal от 26/12/1996. Рекомендован ICCVAM.

Хотя этот особо чувствительный метод не был официально утвержден EC, он принят для использования с целью нахождения веществ даже со слабым раздражающим эффектом, включая те, которые являются глазными раздражителями, для того, чтобы присвоить им маркировку R41 (2002).

Вкратце, способ состоит в применении испытуемого вещества смеси 1 при 3,75 и 5,00 мг/л активного вещества в 9 и 12 г/л индикатора соответственно на хориоаллантоисной мембране оплодотворенного куриного яйца. Через 0,5; 2 и 5 мин после контакта наблюдают и оценивают три следующих критерия: кровоизлияние, коагуляцию и гиперемию.

Результаты и выводы.

Смесь 1 при 3,75 или 5,00 мг/л активного вещества может быть классифицирована как умеренно раздражающая (индекс раздражения или HPS=6,8±0,4 и 6,3±0/21 соответственно), то есть она вызывает небольшой лизис (показатель тяжести=1/3) сразу после введения или через 30 с после контакта, без кровоизлияния или коагуляции.

С учетом значения Q (отношения индексов между показателями для положительных веществ эталонного NaOH 0,1М [ИР=15±3] и 1% SDS [10±2] по сравнению со смесью 1), Q против NaOH=0,51-0,54, и Q против SDS=ot 1,10 до 1,18 для смеси 1 с содержанием активного вещества 3,75 и 5,00 мг/л соответственно.

Соответственно, что касается этого теста с повышенной чувствительностью, который намного более значителен, чем уже имеющийся высокоэффективный тест на вагинальное раздражение у самок кроликов, смесь 1 считается слегка (3,75 мг/л) или умеренно (5,00 мг/л) раздражающим веществом.

V. Исследование острой токсичности путем кожного применения и внутривенной инъекции - максимальные переносимые дозы (MTD) и доза без какого-либо наблюдаемого токсического эффекта (NOAEL) (крысы, OECD 474, ICH M3(R2) и S6(R1)).

Целью данного исследования является определение максимальной переносимой дозы (МПД) смеси 1 путем кожного применения (1 мл) или инъекции в хвостовую вену (5 мл/кг). Клинические наблюдения проводили до 14 дня.

- 24 038115

Выводы протокола кожного применения.

Смесь 1 имеет дозу 50 мкг/кг активного вещества (1 мл-10 мг/л), которая хорошо переносится. Наблюдалась небольшая эритема обработанной области, а также появление мелких корочек, которые исчезали в течение 2 дней. Никакого раздражения не наблюдалось.

Такие же пропорционально более легкие симптомы наблюдались при применении смеси 1 из 37,5 мкг/кг активного вещества (от 1 мл до 7,5 мг/л).

Смесь 1 в дозах 25,0 и 31,3 мкг/кг активного вещества (1 мл при 5,0 и 6,26 мг/л) хорошо переносится. На 14 день не наблюдалось кожных, метаболических или физиологических симптомов.

МПД смеси 1 при кожном применении у крыс составляет 31,3 мкг/кг активного вещества (от 1 мл до 6,26 мг/л).

NOAEL (доза без какого-либо наблюдаемого токсического эффекта) смеси 1 при кожном применении у крыс составляет 31,3 мкг/кг активного вещества (1 мл при 6,26 мг/л).

Выводы протокола инъекции в хвостовую вену:

Трудность внутривенного введения смеси 1 связана не с собственной токсичностью по изобретению, а с ее разложением при контакте с кровью, особенно приводящему к продукции молекулярного кислорода, который может вызвать эмболию. Этическая предельная доза (3 крысы), демонстрирующая обратимую остановку дыхания, составляет 14,6 мкг/кг активного вещества (5 мл/кг смеси 1 при 2,92 мг/л). Никаких признаков токсичности не было зарегистрировано до 14 суток.

Смесь 1 переносится после внутривенной инъекции при 12,5 мкг/кг активного вещества (5 мл/кг смеси 1 при 2,5 мг/л). Физиологические затруднения (движения и проблемы с дыханием) наблюдались у животных в момент инъекции. Никаких признаков токсичности не было зарегистрировано до 14 суток.

Те же симптомы, пропорционально менее значимые, наблюдались после внутривенной инъекции при 10,4 мкг/кг активного вещества (5 мл/кг смеси 1 при 2,1 мг/л). Не сообщалось о клинических признаках или изменении кривой массы. Никаких признаков токсичности не было зарегистрировано до 14 суток. Макроскопическое наблюдение органов спустя 14 суток после вскрытия ничего не выявило.

MTD смеси 1 при инъекции в хвостовую вену составляет 12,5 мкг/кг активного вещества (5 мл/кг смеси 1 при 2,5 мг/л).

VI. Изучение генотоксичности in vivo путем поиска генерации микроядер после внутривенной инъекции смеси 1 (самцы и самки крыс, OECD 474 и ICH S2(R1)).

Самкам крыс (n=5) и самцам крыс (n=5) вводили (две обработки с интервалом 22-26 ч, 5 мл/кг) контроль на основе воды ВЭЖХ качества (внутривенно), положительный контроль - циклофосфамид при 5 и 10 мг/кг, внутривенно, этилметансульфонат при 100 и 150 мг/кг (интраперитонеально) и смесь 1 при 1,46; 4,17 и 12,5 мкг/кг активного вещества (внутривенно).

Отмечалась заболеваемость, смертность, масса тела животных и клинические параметры (температура, состояние кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, секреция и экскреция, респираторная и неврологическая функции, движения и позы). Спустя 36 и 48 ч после второго применения кровь животных собирали и анализировали посредством проточной цитометрии (контроль токсичности: снижение доли незрелых эритроцитов (CD-71-позитивных). Долю микроядерных незрелых эритроцитов (ретикулоцитов) оценивали по 4000 наблюдений на образец крови. Каждая популяция крыс (n=10) для каждого испытуемого вещества представляла собой 40000 наблюдений (табл. 5).

Таблица 5

Вещество	Мг/кг	Пол	η	Ретикулоциты (%)	Микроядерные ретикулоциты (%)
До лечения	#	Самцы	5	4,39±0,92	0,15±0,09
Самки	5	2,60±0,57	0,17±0,07
Отрицательный контроль, вода	#	Самцы	5	5,17±1,47	0,32±0,31
Самки	5	3,82±0,29	0,12±0,04
Положительный контроль 1 Циклофосфамид	5	Самцы	5	3,99±0,49	0,56±0,17
Самки	5	2,41±0,54	0,40±0,13
10	Самцы	5	1,95±0,59	1,62±0,29
Самки	5	1,30±0,43	1,02±0,26**
Положительный контроль 2 Метансульфонат	100	Самцы	5	1,4Н0,32	0,68±0,35**
Самки	5	1,86±0,25	0,48±0,16**
150	Самцы	5	1,33±0,34	0,81±0,48**
Самки	5	0,45±0,33	0,59±0,26**
Смесь 1	1,46 х 10’3#	Самцы	5	5,32±0,76	0,10±0,02
Самки	5	3,35±0,46	0,09±0,03
4,17 х 10’3#	Самцы	5	4,82±0,41	0,1 НО,03
Самки	5	3,35±0,83	0,09±0,02
12,5 х 10’3#	Самцы	5-3*	4,79±0,16	0,22±0,12
Самки	5- 1*	3,40±0,19	0,09±0,02

* - животные, умершие при первом применении из-за эмболии, обусловленной высвобождением молекулярного кислорода из смеси 1 в контакте с кровью;

** - статистически отличающиеся от контрольной группы; # - в активном веществе MoO₄ ².^-

Вывод: по сравнению с контрольными группами (положительными и отрицательными) смесь 1 не обладает какой-либо генотоксичностью за счет индукции выработки микроядерных ретикулоцитов после внутривенной инъекции у крыс (n=10, включая 5 самцов и 5 самок) в диапазоне 1,46; 4,17 и 12,5 мкг/кг

- 25 038115 активного вещества.

Пример 12. Сравнение с другими композициями.

В настоящем примере явно показано влияние композиции, в частности, окислительновосстановительного потенциала на

- роль кальция в катализе, подобном реакции Фентона/Габера-Вейса, для тестируемых композиций;

- наличие разницы между тремя композициями 5,0 мг/л активного вещества.

S1: смесь 1,

S2: композиция согласно US 6660289,

S3: композиция согласно WO 2010/004161.

Протокол 1 (табл. 6 и 7):

измеренных параметра: (i) pH, (ii) окислительно-восстановительный потенциал;

катализатор CaCl₂ (1 М, в H₂O): добавление в конечной концентрации 24 мМ;

кинетика: начальная (Т0), 1, 2, 3 мин (T1, T2, T3) после добавления CaCl₂ при перемешивании.

Результаты и обсуждение.

Таблица 6

Раствор S1	ТО	СаС12 24 мМ	Т1	Т2	ТЗ	Среднее значение (между Т1 и ТЗ)	Δ/Τ0
pH	4,70	latTO	4,58	4,59	4,59	4,59 за 3 мин	-0,11
Окислительно-восст. потенциал Е° (мВ)	359	383	383	383	383 за 3 мин	+24
Раствор S2	ТО	СаС12 24 мМ	Т1	Т2	ТЗ	Среднее значение (между Т1 и ТЗ)	Δ/Τ0
pH	2,85	latTO	2,65	265	2,66	2,65 за 3 мин	-0,20
Окислительно-восст. потенциал Е° (мВ)	437	479	475	474	476 за 3 мин	+39
Раствор S3	ТО	СаС12 24 мМ	Т1	Т2	ТЗ	Среднее значение (между Т1 и ТЗ)	Δ/Τ0
pH	3,01	latTO	2,86	2,87	2,87	2,87 за 3 мин	-0,14
Окислительно-восст. потенциал Е° (мВ)	414	465	464	464	464 за 3 мин	+50

Значение pH кожи составляет от 4,93±0,45 до 5,12±0,56. Вагинальное значение pH обычно составляет порядка 4,50 и может достигать до 6,00 при менопаузе.

В раствор S1 добавлен буфер для pH порядка показателей, характерных для кожи человека и слизистых оболочек. Это значение pH остается относительно постоянным до 3 мин контакта после итогового добавления 24 мМ CaCl₂. Наблюдается умеренное увеличение Е°, которое частично может быть связано с добавлением хлора CaCl;

кислое значение pH усиливает цитотоксическое перекисное окисление липидов, опосредованное железом.

В раствор S2 не добавлен буфер. Его значение pH не очень подходит для контакта с кожей или слизистой оболочкой (включая вероятное разрушение симбиотической микрофлоры в терапевтическом применении). Это значение pH остается относительно постоянным до 3 мин контакта после добавления итогового 24 мМ CaCl₂. Наблюдается увеличение, по меньшей мере, до менее умеренного значения по сравнению с Е° S1, которое частично может быть связано с добавлением хлора CaCl₂.

В раствор S3 не добавлен буфер. Его значение pH не очень подходит для контакта с кожей или слизистыми оболочками (включая вероятное разрушение симбиотической микрофлоры в терапевтическом применении). Это значение pH остается относительно постоянным до 3 мин контакта после добавления итогового 24 мМ CaCl₂. Наблюдается значительное увеличение Е° (+50 мВ), которое частично может быть связано с добавлением хлора CaCl₂, но с учетом разницы в увеличении потенциала по сравнению с S1 и S2, вероятно, это не является единственным фактором.

Что касается ионов Fe in situ, то при кислом pH (<2,33) окислительно-восстановительный потенциал составляет порядка 400 мВ, и Fe находится в трехвалентной форме, то есть в самой цитотоксичной форме. При pH порядка 4,5 окислительно-восстановительный потенциал имеет величину порядка 300 мВ, Fe гемоглобина находится в двухвалентной форме, Fe плазмы образует комплекс с трансферрином в трехвалентной форме.

При pH растворов S2 и S3 оксид железа из Fe(OH)₃ является очень неблагоприятным. Соответственно реакции Фентона-Габера-Вейса являются не очень эффективными.

Величина потенциала пары Fe(OH)₃/Fe²⁺ (тип Фентона) равна E°=1,19-0,18xpH.

Таблица 7

	Активное вещество (мг/мл)	pH	E°Fe(OH)3/Fe2+	Е°раствора (мВ)
S1	5,0	4,70	344	354
S2	5,0	2,80	686	428
S3	5,0	3,00	650	418

* - уровень клеток с железом in situ.

Согласно этому исследованию есть подтверждение, что пара Fe(OH)₃/Fe²⁺ является неблагоприятной. Даже если окислительно-восстановительный потенциал этой пары улучшен (418-428 мВ), он остается слишком значительным для контакта с клеткой.

- 26 038115

- трансмембранный потенциал клетки животного является отрицательным («-70 мВ). Чем более значительным является окислительно-восстановительный потенциал раствора, тем больше будет изменений трансмембранного потенциала и больше будет индукция клеточного окислительного стресса (генная индукция апоптоза, маршрутов eNOS и т.д.) с одновременной индукцией притока кальция, который усиливает значительный клеточный стресс, уже вызванный растворами 2 и 3.

Соответственно pH и окислительно-восстановительный потенциал композиции S2 и особенно окислительно-восстановительный потенциал композиции S3 являются, скорее всего, цитотоксическими. Оба этих раствора S2 и S3 не могут быть пригодны для терапевтического использования.

Протокол 2 (табл. 8).

Концентрация кальция в клетке и в плазме составляет от 2 до 3 мМ. Этот протокол основан на терапевтическом использовании композиций.

1-й измеренный параметр: остаточное количество пероксидов (Н2О2, перуксусная кислота; диапазон испытаний Quantofix от 0 до 25 мг/л);

катализатор CaCl₂ (1 М, в H2O): добавление в конечной концентрации 1,25; 2,5; 10; 25 и 50 мМ;

конечный объем: 1 мл=0,950 мкл тестируемого раствора+0,05 мкл разведения CaCl₂. Коэффициент разбавления тестируемого раствора 1,05. Конечная концентрация тестируемого раствора 11,4 г/л (исходная 12 г/л) индикатора Н₂О₂, содержащего 4,76 мг/л активного вещества (исходная 5,00 мг/л);

кинетика: через 5 мин после добавления CaCl₂ при перемешивании.

Результаты

Таблица 8

Опыт	Испытуемый раствор	Итоговый [СаС12] (мМ)	[перекисп]итоговые (мг/л)
1	S1	50	»25
2	S1	25	10-25
3	S1	10	10
4	S1	2,5	5-10
5	S1	1,25	«25
6	S2	2,5	>25
7	S3 (WO/2010/004161)	2,5	>25
8	S3 (WO/2010/004161)	1,25	«25

Дезактивация композиций S1 за 5 мин контакта с 2,5 мМ CaCl₂ (физиологическая концентрация) соответствует снижению перекиси в 1,500 раз (опыт 4), т.е. от 12 г/л до 8 мг/л индикатора и от 5,00 мг/л до 3,33 мкг/л активного вещества.

Сравнительные выводы относительно составов S2 и S3.

Раствор S2 независимо от используемого металла несовместим с терапевтическим применением по причине его не поддающегося действию буфера pH для сохранения его возможностей;

его цитотоксического окислительно-восстановительного потенциала;

его относительной независимости от кальциевого катализа, его цитотоксичности в физиологических условиях из-за Н₂О₂ и перуксусной кислоты (в дополнение к присутствию, например, ионов Ag⁺, обладающих необратимой цитотоксичностью);

из-за того, что при использованных экспериментальных условиях не существует катализа, подобного реакции Фентона-Габера-Вейса, поэтому нет продукции реакционноспособных радикалов для терапевтического использования.

Раствор S3 независимо от используемого металла и хелатирующей пары, описанной в заявке на патент WO 02010/004161, непригоден для терапевтического применения по причине его pH, несовместимого с BAPTA;

его цитотоксического окислительно-восстановительного потенциала;

его относительной независимости от кальциевого катализа;

его цитотоксичность в физиологических условиях из-за Н₂О₂ и перуксусной кислоты;

из-за того, что при использованных экспериментальных условиях не существует катализа, подобного реакции Фентона-Габера-Вейса, поэтому нет продукции реакционноспособных радикалов для терапевтического использования.

Напротив, химическая модель реакции композиции S1 в соответствии с изобретением является правильной из-за ее дестабилизации кальцием.

Для композиции S1 выбор pH, буферной пары (добавление одного элемента пары: уксусной кислоты, поскольку перуксусная кислота в небольшом количестве продуцируется in situ), переходного металла и его валентности, совместимых с реакциями, подобными реакциям ФентонаГабера-Вейса или нет, пары хелатирующих агентов (совместимость между ними с Kd_Ca2+ и Kd_Mo, Kd_Fe2+/Fe3+ в каскаде), отсутствия проникновения в клетки хелатирующих агентов, активации комплекса раствора S1 кальцием или другими существующими ионами металлов in situ, в физиологических дозах и pH (важность выбора хелатирующих агентов), при окислительно- 27 038115 восстановительном потенциале, существенно ограничивающем окисление липидов (незначительная продукция Fe(III)) и мгновенную генерацию проникающих реактивных радикалов в небольшом диапазоне без накопления, делают эту композицию совместимой с терапевтическим использованием.

Раствор S1 очень сильно деградирует при физиологических концентрациях кальция с минимальным значением 2,5 мМ. Уменьшение (1,25 мМ) или увеличение (от 10 до 50 мМ) этой нефизиологической концентрации кальция сильно изменяет эту деградацию перекисей из-за реакций Фентона-Габера-Вейса путем смещения равновесий (закон массового действия). Химический комплекс, соответствующий раствору S1, полностью адаптирован к конкретной реакции при постоянном содержании кальция в клетке и плазме.

Пример 13. Пример активной смеси в соответствии с изобретением с комбинацией Мо и La.

Этот пример композиции (смесь 2) в соответствии с настоящим изобретением получен с использованием молибденовой соли и соли лантана. Готовят композицию с составом согласно табл. 9, выраженным в виде начальной концентрации компонентов.

Таблица 9

Вещества	Смесь по изобретению
Натрия молибдат	20,7 мкМ
Лантана нитрат	11,5 мкМ
ВАРТА	42 мкМ
EGTA	1051,6 мкМ
Н2О2	353 мМ
CH3COOH/CH3COONa	70 мМ
pH (с помощью NaOH)	4,4 - 5,0
Е ОКИСЛ.-БОССТ.	300 - 420 мВ

Композиция называется исходной, поскольку она соответствует концентрациям добавленных реагентов без учета используемого каталитического процесса.

Все вещества, используемые в синтезе и присутствующие в готовом продукте, проверены по спектру ИК-Фурье.

Таблица 10

Продукт	Чистота	Молекулярная формула	№ CAS
Натрия молибдат дигидрат	98-103%	Na2MoO4,2H2O	10102-40-6
Лантана нитрат гексагидрат	>99%	La(NO3)3,6H2O	10277-43-7
ВАРТА: (1,2-бис(о-аминофенокси)этан- Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусная кислота)	>98%	C22H24N2O10	85233-19-8
EGTA: (этиленгликоль-бис (2-аминоэтилэфир)Ν,Ν,Ν',Ν'-тетрауксусная кислота)	>99%	C14H24N2O10	67-42-5
Перекись водорода	29-31%	Н2О2	722-84-1
Ледяная уксусная кислота*	99,8- 100,5%	СНзСООН	64-19-7
Натрия ацетат тригидрат	99-101%	C2H3NaO2,3H2O	5010524
Натрия гидроксид	Юн	NaOH	1310-73-2
Деминерализованная вода	1 мкС	H2O	7732-18-5

Действующим веществом является: (MoO4)^1-, Na⁺ (лантана гидропероксомолибдат).

Молекулярная масса 481,81 г/моль.

Способ получения.

Способ получения идентичен способу для смеси 1 в примере 1, за исключением описанных ниже модификаций:

Готовят два раствора SC:

раствор А - Na₂MoO₄, 2H2O (источник Mo(VI), 100%) 200 мг (итоговая 2,4 мМ), вода до 340 мл.

Осторожное перемешивание при комнатной температуре.

Раствор В - La(NO₃)₃, 6Н₂О (источник La(III), 100%) 200 мг (итоговая 1,4 мМ).

Вода до 340 мл.

Осторожное перемешивание при комнатной температуре.

Раствор А (10 мл) и затем раствор В (10 мл) постепенно вводят в раствор Si2 для получения раствора лантана гидропероксомолибдата S1.

Этап (vii): добавление хелатирующих агентов - получение раствора S4.

Введение BAPTA (98,8%) - 20 мг/л, введение EGTA (99,1%) - 400 мг/л.

Значение pH итогового раствора регулируют с помощью NaOH до 4,67.

Итоговое значение Е_о/в: 380 мВ.

В смеси 2 итоговая концентрация La(MoO₄)^1-, Na⁺ составляет 20,8 мкМ.

Пример 14. Оценка окислительно-восстановительной эффективности по изобретению в двойном комплексе молибдата и лантаната на плазме человека.

Чтобы сравнить окислительную эффективность композиций (MoO₄)^2- (смесь 1) и La(MoO₄)^1- (смесь 2), обеспечивали контакт композиций с концентрациями, сопоставимыми с концентрациями, описанными на фиг. 3, и ниже тех, которые описаны на фиг. 5, с плазмой человека в течение 2 мин. После вычитания значений экспериментальных холостых проб, особенно в этой зоне концентрации, смеси 1 и 2 со- 28 038115 гласно изобретению приводили к увеличению продукции in situ окисленного кверцетина. Итоговые концентрации MoO₄ ^2- и La(MoO₄)^1- при анализе составили: 0,00; 3,80; 7,59; 1215 нМ и 0,00; 3,25; 6,50; 1,040 нМ соответственно (фиг. 8).

Разница продукции окисленного кверцетина (максимум около 295 нм) между двумя композициями (смесь 1 и смесь 2) незначительна. Окислительно-восстановительная эффективность двух композиций в соответствии с изобретением является сопоставимой.

Claims (44)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтически активная композиция для терапевтического лечения инфекций HSV-1 и/ или HSV-2, указанная композиция включает по меньшей мере одну соль металла, где металл выбран из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V) и золота (Au);

   по меньшей мере один хелатирующий агент;

   по меньшей мере один источник пероксидирующих радикалов;

   по меньшей мере один буферный агент, где указанная композиция имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ.
2. 2. Композиция по п.1, где указанная композиция является композицией для местного применения.
3. 3. Композиция по п.1, имеющая окислительно-восстановительный потенциал от 300 до 450 мВ.
4. 4. Композиция по п.1, имеющая окислительно-восстановительный потенциал от 300 до 420 мВ.
5. 5. Композиция по любому из пп.1 -4, где металл из металлата имеет максимальную валентность.
6. 6. Композиция по любому из пп.1-5, где металл является окисленным до максимальной степени окисления.
7. 7. Композиция по любому из пп.1-6, где соль металла является солью молибдена или включает молибден.
8. 8. Композиция по любому из пп.1-7, где соль металла дополнительно содержит соль лантаноида или лантаноид.
9. 9. Композиция по любому из пп.1-8, где соль металла является смесью соли молибдена и соли лантаноида.
10. 10. Композиция по любому из пп.8 и 9, где лантаноид является лантаном.
11. 11. Композиция по любому из пп.1-10, где соль молибдена является пероксо- или гидропероксоединицей.
12. 12. Композиция по любому из пп.1-11, где активное вещество относится к МоО₄ ^2-типу или его гидропероксоформе.
13. 13. Композиция по любому из пп.1-12, включающая по меньшей мере два хелатирующих агента.
14. 14. Композиция по любому из пп.1-13, где хелатирующий агент (агенты) имеет по меньшей мере три координационных группы на трех концах молекулы (молекул), образующей хелатирующий агент (агенты), где указанные координационные группы разделены цепью по меньшей мере из трех атомов, включающих по меньшей мере атом азота.
15. 15. Композиция или смесь по любому из пп.1-14, где хелатирующий агент (агенты) имеет по меньшей мере три карбоновокислых группы.
16. 16. Композиция по любому из пп.1-15, где хелатирующий агент выбран из BAPTA, EGTA и любых их смесей.
17. 17. Композиция по любому из пп.1-16, где основной источник пероксидирующих радикалов присутствует в диапазоне концентраций от 200 до 600 мМ.
18. 18. Композиция по любому из пп.1-16, где основной источник пероксидирующих радикалов присутствует в диапазоне концентраций от 300 до 500 мМ.
19. 19. Композиция по любому из пп.1-16, где основной источник пероксидирующих радикалов присутствует в диапазоне концентраций от 340 до 450 мМ.
20. 20. Композиция по любому из пп.1-19, где композиция включает буферный агент, обеспечивающий pH от 4,0 до 5,2.
21. 21. Композиция по любому из пп.1-19, характеризующаяся тем, что композиция включает буферный агент, обеспечивающий pH от 4,4 до 5,0.
22. 22. Композиция по любому из пп.1-19, характеризующаяся тем, что композиция включает карбоновую кислоту в качестве буферного агента.
23. 23. Композиция по любому из пп.1-19, характеризующаяся тем, что композиция включает уксусную кислоту в качестве буферного агента.
24. 24. Композиция по любому из пп.1-23, имеющая окислительно-восстановительный потенциал от 350 до 420 мВ.
25. 25. Способ приготовления композиции, как описано выше в соответствии с любыми из пп.1-24, включающий (i) приготовление буферного раствора (BS), включающего буферный агент, имеющий кислое значение pH; (ii) приготовление раствора комплекса металла (SC), включающего соль оксида метал

    - 29 038115 ла; (iii) приготовление первого исходного раствора (Si1), включающего перекись водорода; (iv) приготовление второго исходного раствора (Si2) путем смешивания раствора BS с раствором Si1; (v) приготовление раствора (S1), включающего пероксометаллическое соединение, путем смешивания раствора CS с раствором Si2; (vi) приготовление раствора S2 путем доведения pH раствора S1 основанием, где pH раствора S2 является более щелочным, чем pH раствора BS; (vii) добавление в раствор S2 одного или нескольких хелатирующих агентов; получение композиции, как определено в любом из пп.1-24.
26. 26. Способ приготовления композиции по п.25, где способ также включает стадию (viii) доведение pH.
27. 27. Способ приготовления композиции по п.25 или 26, где способ также включает стадию (ix) доведение объема итогового раствора.
28. 28. Способ по любому из пп.25-27, где перекись водорода присутствует в растворе Si1 в диапазоне концентрации от 200 до 600 мМ.
29. 29. Способ по любому из пп.25-27, где перекись водорода присутствует в растворе Si1 в диапазоне концентрации от 300 до 500 мМ.
30. 30. Способ по любому из пп.25-27, где перекись водорода присутствует в растворе Si1 в диапазоне концентрации от 330 до 460 мМ
31. 31. Способ по любому из пп.25-30, где буферный агент в растворе BS является буфером из карбоновой кислоты/карбоксилата, а раствор BS имеет отношение перекись водорода/карбоксилат от 20/1 до 1/1.
32. 32. Способ по любому из пп.25-31, где буферный агент в растворе BS является буфером из карбоновой кислоты/карбоксилата, а раствор BS имеет отношение перекись водорода/карбоксилат примерно 5/1.
33. 33. Способ по любому из пп.25-32, включающий измерение окислительно-восстановительного потенциала на этапах (iii)-(ix) и предпочтительно также включающий измерение pH на этапах (iii)-(ix).
34. 34. Способ по любому из пп.25-33, где пероксометаллическое соединение в растворе S1 является пероксомолибденовым соединением.
35. 35. Фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере одну соль молибдена (Mo), по меньшей мере один хелатирующий агент; по меньшей мере один буферный агент и источник пероксидантных радикалов, где указанная композиция имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ.
36. 36. Фармацевтическая композиция по п.35, где соль металла дополнительно содержит соль лантаноида или лантаноид.
37. 37. Фармацевтическая композиция по п.36, характеризующаяся тем, что лантаноид является лантаном.
38. 38. Фармацевтическая композиция для местного применения, включающая терапевтически активную композицию, как определено в любом из пп.1-24, или терапевтически активную композицию, полученную в соответствии со способом по любому из пп.25-34.
39. 39. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.38, включающая от 0,001 до 5 мМ терапевтически активной композиции.
40. 40. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.38 или 39, включающая от 0,01 до 2 мМ терапевтически активной композиции.
41. 41. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.38 или 39, включающая от 0,02 до 1 мМ терапевтически активной композиции.
42. 42. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.38-41 в способе терапевтического местного лечения вирусных инфекций HSV-1 и/или HSV-2.
43. 43. Применение фармацевтической композиции, включающая молибден, по меньшей мере один хелатирующий агент, меньшей мере один буферный агент и источник пероксидирующих радикалов, в способе терапевтического местного лечения вирусных инфекций HSV-1 и/или HSV-2, где указанная композиция имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ.
44. 44. Способ терапевтического лечения инфекций HSV-1 и/или HSV-2, включающий применение посредством местного применения субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну соль металла, где металл выбран из молибдена (Mo), вольфрама (W), ванадия (V) и золота (Au); по меньшей мере один хелатирующий агент; по меньшей мере один буферный агент и источник пероксидантных радикалов, где указанная композиция имеет окислительно-восстановительный потенциал от 250 до 550 мВ.