MD4845C1

MD4845C1 - Procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar

Info

Publication number: MD4845C1
Application number: MDA20220008A
Authority: MD
Inventors: Чеслав ЧУХРИЙ
Original assignee: Чеслав ЧУХРИЙ
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2024-05-31
Also published as: MD4845B1; WO2023149794A1

Abstract

Invenţia se referă la domeniul farmaceutic, şi anume la procedee de obţinere a preparatelor cu efect antiinflamator, destinate tratamentului hiperplaziei benigne de prostată asociată sau nu cu prostatită cronică.Procedeul de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar, conform invenţiei, include creşterea insectelor Lymantria dispar până la vârsta a 4-a în condiţii controlate pe un mediu standardizat, ce conţine, g/kg: făină de grâu 80-95, făină de porumb 82-87, masă vegetală uscată 110-120, lapte uscat degresat 2,5-3,5, miere de albine 17-19, glicerol 10-12, pinobanksin 0,01-0,02, pinocembrin 0,01-0,02, zinc acetat dihidrat 0,03-0,05, apă purificată restul, congelarea larvelor la temperatura de -18°C, spălarea larvelor, mărunţirea primară, liofilizarea, mărunţirea la temperatura de -55°C, ambalarea şi păstrarea complexului activ la temperatura de -18°C.Rezultatul tehnic al invenţiei constă în sporirea cantităţii de biomasă cu o activitate biologică şi o cantitate de zinc şi de aminoacizi proteinogeni, inclusiv cei esenţiali, mai mare.

Description

Invenţia se referă la domeniul farmaceutic, şi anume la procedee de obţinere a preparatelor cu efect antiinflamator, destinate tratamentului hiperplaziei benigne de prostată asociată sau nu cu prostatită cronică.

Este cunoscut un procedeu de obţinere a unui complex activ din biomasa larvelor insectei Tenebrio molitor în ulei de vaselină. Complexul activ entomologic obţinut conform acestui procedeu conţine 45-80% de extract entomologic şi 55-20% de ulei de vaselină. Acest complex activ se caracterizează prin activitate antioxidantă specifică înaltă şi este eficient în afecţiunile de prostată. Activitatea complexului activ în procesul de inhibiţie cu 50% a peroxidării lipoproteinelor (CI50%) se manifestă la o concentraţie de 16 mg/ml, iar în procesul de inhibiţie cu 50% a radicalului oxidului nitric - la o concentraţie de 20 mg/ml. Procedeul de obţinere a complexului activ include mai multe etape, prima dintre care este obţinerea larvelor de Tenebrio molitor. În acest scop insectele sunt crescute în crescătorie pe mediu artificial standardizat cu respectarea etapelor specifice. Cea de a doua etapă constă în colectarea şi prelucrarea larvelor. Larvele obţinute sunt spălate de 4 ori cu 4 volume de apă distilată la fiecare spălare. Dezinfectarea larvelor se face cu ajutorul razelor UV. După aceasta larvele sunt congelate la temperatura de -18°C. Următoarea etapă constă în decongelarea treptată a larvelor în condiţiile unei temperaturi de 20-22°C. După aceasta se produce omogenizarea şi mărunţirea biomasei în omogenizator cu cuţite de inox la viteza de 5000 rotaţii pe minut până la obţinerea particulelor cu dimensiuni de 9-12 µm. Următoarea etapă constă în extragerea fracţionată (fracţia hidrosolubilă şi fracţia liposolubilă) a componentelor bioactive din biomasa de larve. La prima etapă se realizează extragerea componentelor hidrosolubile din biomasa entomologică, după care extractul obţinut se separă de restul de biomasă prin filtrare în vid. Extractul hidric se concentrează prin evaporare în vid. Extragerea fracţiei liposolubile se face cu alcool etilic de 70%. După aceasta extractul obţinut se separă prin filtrare, după care extractul se concentrează prin evaporare în vid la 40°C. Ambele extracte se combină, iar extractul total se liofilizează. Extractul total se formulează ca complex entomologic activ în ulei de vaselină cu următoarea componenţă: extract entomologic total liofilizat 45-80%, ulei de vaselină 55-20%. Complexul entomologic activ este formulat într-un produs farmaceutic în formă de supozitoare, care conţin 250 mg de complex entomologic activ şi 1750 mg de gliceride semisintetice [1].

Neajunsul acestui procedeu de obţinere a complexului activ entomologic constă în existenţa în componenţa etapelor de realizare a procedeului a evaporării în vid a extractului hidric şi etanolic cu încălzirea extractelor, ceea ce poate duce la deteriorarea componentelor termolabile ale acestora.

Mai este cunoscut un procedeu de obţinere a preparatului entomologic antiinflamator şi antioxidant, destinat tratamentului hiperplaziei benigne de prostată, din larvele de insecte din ordinul Lepidoptera, genul Lymantria prin mărunţirea lor în soluţie fiziologică până la formarea unei mase omogene, filtrarea acesteia şi eliminarea apei prin liofilizare. Acest preparat conţine următoarele componente: proteine 265,0-292,0 mg/g; lipide 140,0 mg/g, colesterol 0,1 mg/g; trigliceride 90,0 mg/g, amilază 5,1 UI/g, lipază 100,0 mUI/g, antioxidanţi 16,86 mg/g, aminoacizi esenţiali şi semiesenţiali 379,7 mg/g. Preparatul are efect în inhibarea peroxidării lipidelor [2].

Brevetul nu include descrierea procedurii de creştere a insectelor în scopul obţinerii biomasei de larve, substanţa activă este extrasă cu soluţie fiziologică, ceea ce nu permite extragrea tuturor componentelor bioactive.

Un alt procedeu de obţinere a unui preparat entomologic din biomasa larvelor de prima vârstă de Lymantria dispar constă în extracţie hidroetanolică a componentelor bioactive ale biomasei. Larvele sunt crescute în condiţii de crescătorie pe un mediu compus din făină de grâu, mălai, masă vegetală uscată, lapte praf, drojdii uscate, glicerol şi miere. Biomasa colectată de larve de Lymantria dispar de prima vârstă se spală de 4 ori, de fiecare dată cu un volum de apă care depășește de 4 ori volumul de larve. Larvele se congelează-decongelează. Utilizând un mojar cu cuţite de inox biomasa se amestecă cu viteza de 5000 de rotaţii pe minut şi se fărâmiţează până la obţinerea particulelor cu dimensiuni de 9-12 µm. Masa obţinută este în continuare supusă extragerii timp de 60 min a principiilor bioactive cu soluţie hidroetanolică de 20%. Extragerea se face la temperatură constantă (18-20°C) şi agitaţie permanentă pe un agitator orbital cu viteza de rotaţie de 280 rotaţii/min (alternativ 240-320 rotaţii/min). Biomasa se separă prin filtrare în vid, după care urmează liofilizarea extractului [3]. În continuare se obţine produsul farmaceutic sub formă de supozitoare rectale, care conţine 60% de extract liofilizat.

Dezavantajul procedeului constă în faptul că acesta permite obţinerea unui preparat, care constă doar din componentele biomasei, care pot fi extrase cu soluţia hidroetanolică de 20%, ceea ce omite o bună parte a componentelor liposolubile. Un alt dezavantaj al acestui procedeu constă în aceea că în calitate de materie primă pentru extragere se utilizează biomasa larvelor de prima vârstă, care se caracterizează prin masă şi dimensiuni mici, ceea ce implică scumpirea tehnologiei finale; se efectuează o singură extracţie hidroetanolică cu o durata de 60 min, din care cauză rămân nevalorificate unele dintre componentele active ale biomasei.

De asemenea, mai este cunoscut un procedeu de obţinere a unui preparat entomologic din pupe, larve de ultima vârstă (a 5-a sau a 6-a în dependenţă de gen) şi ouă de Lymantria dispar, care este inclus într-o compoziţie farmaceutică sub formă de supozitoare sau ovule, pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostată, fibromului uterin [4]. Conform sursei indicate, procedeul include următoarele etape de lucru: colectarea pupelor şi larvelor de ultima vârstă ale omizii păroase a stejarului Lymantria dispar, începând cu luna iunie, şi a ouălor în lunile august-septembrie de pe tulpinile stejarilor şi plopilor afectaţi sau creşterea larvelor şi pupelor în condiţii speciale de laborator; spălarea materialului biologic şi resuspendarea lui în soluţie fiziologică; filtrarea şi stoarcerea materialului biologic; opţional - congelarea materialului până la utilizarea ulterioară; măcinarea materialului până la obţinerea particulelor cu dimensiuni de 9-12 µm; filtrarea prin filtrul Bucker cu placă având 200 de orificii pe cm2; atomizarea în vid a extractului obţinut la temperatura de 130-140°C la intrare şi 85-90°C la ieşire sau liofilizarea lui timp de 24-30 ore - substanţa activă pentru producerea formei farmaceutice; executarea compoziţiei farmaceutice ce constă din 1% substanţă biologic activă sub formă de extract de Lymantria dispar, 82% unt de cacao, 10% apă distilată, 2,68% helix, 2% laurat, 1,3% 2-bromo-2-nitropropan, 1% poligliceril-4 izostearat cetil PEG/PPG dimeticon 10/1 şi 0,02% dial; condiţionarea acestei formule prin topirea şi omogenizarea amestecului obţinut, cu temperatura de 60°C şi turnarea în forme de supozitoare sau ovule şi ambalarea lor pentru stocarea ulterioară.

Dezavantajul acestui procedeu constă în aceea că în calitate de materie primă biologică se utilizează trei dintre fazele de dezvoltare a insectei - ouă, larve de ultima vârstă şi pupe. Componenţa biochimică a larvelor, pupelor şi ouălor diferă semnificativ. Activitatea biologică a acestor tipuri de biomasă de asemenea diferă esenţial. De exemplu, activitatea antiradicalică a extractului din larve este de 5-7 ori mai mare comparativ cu activitatea ouălor şi a pupelor.

De asemenea, a fost demonstrat, că cu înaintarea în vârstă activitatea biologică a larvelor scade, de exemplu activitatea antiradicalică a larvelor de ultimă vârstă este cu cel puţin 30% mai joasă comparativ cu activitatea larvelor de vârsta I. Astfel, un alt dezavantaj este utilizarea larvelor de ultima vârstă, caracterizate prin cea mai joasă activitate antioxidantă.

În acelaşi timp sursa selectată nu indică nişte proporţii pentru obţinerea amestecului de larve şi pupe. Pornind de la activitatea lor diferită, în cazul aplicării diferitor proporţii de larve şi pupe, se vor obţine produse cu activitate biologică diferită. De asemenea, sursa selectată nu include descrierea procesului de creştere a larvelor şi pupelor în condiţii de laborator, ceea ce poate fi un factor de variere a cantităţii şi proprietăţilor biologice ale materialului biologic obţinut. Cele expuse fac imposibil controlul asupra componenţei substanţei active.

Cea mai apropiată soluţie de obiectul revendicat constituie un procedeu de obţinere a complexului activ din larvele de Lymantria dispar de vârsta 3-4, care include creşterea insectelor Lymantria dispar în crescătorie pe un mediu standardizat, congelarea larvelor la -18°C, spălarea larvelor, mărunţirea primară a larvelor cu obţinerea complexului activ, liofilizarea complexului activ, mărunţirea la temperatură extrem de joasă (-55°C), omogenizarea complexului activ, ambalarea şi păstrarea complexului activ in condiţii de congelator (-18°C). Aplicarea acestui procedeu asigură obţinerea unui preparat cu acţiune antiinflamatoare, care asigură scăderea eliberării interleucinei 8 cu 42% de la valoarea acestui indiciu în lipsa preparatului [5].

Dezavantajul acestui procedeu constă în activitatea antiinflamatoare şi antioxidantă scăzută a preparatului obţinut.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în sporirea acţiunii antiinflamatoare şi antioxidante a complexului activ de origine entomologică, eficient în afecţiunile de prostată.

Problema se rezolvă prin procedeul de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar care include creşterea insectelor Lymantria dispar până la vârsta a 4-a în condiţii controlate pe mediu standardizat cu următoarea componenţă, g/kg:

făină de grâu 80-95 făină de porumb 82-87 masă vegetală uscată 110-120 lapte uscat degresat 2,5-3,5 miere de albine 17-19 glicerol 10-12 pinobanksin 0,01-0,02 pinocembrin 0,01-0,02 acetat de zinc dihidrat 0,03-0,05 apă purificată restul,

congelarea larvelor la temperatura de -18°C, spălarea larvelor; mărunţirea primară, liofilizarea, mărunţirea la temperatură extrem de joasă (-55oC), ambalarea şi păstrarea complexului activ in condiţii de congelator (-18oC).

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în sporirea cantităţii de biomasă cu o activitate biologică şi o cantitate de zinc şi de aminoacizi proteinogeni, inclusiv cei esenţiali, mai mare.

Rezultatul tehnic al invenţiei se datorează efectelor benefice ale dietei cu conţinut de zinc, care este un stimulator recunoscut a multor procese metabolice în celulele vii.

Exemplu de realizare a invenţiei

Creşterea insectelor din specia Lymantria dispar include următoarele etape:

1. Pregătirea condiţiilor pentru realizarea ciclului vital în crescătorie. Crescătoria de insecte prezintă camere cu suprafaţa de 15-20 m2. Pereţii sunt vopsiţi cu o răşina specială care oferă posibilitatea dezinfectării cu soluţii dezinfectante. Pe perimetrul camerei sunt amplasate rafturi cu cutii Rubbermaid obscure. Temperatura în crescătorie se menţine la 27oC, iar umiditatea - 75%. Se asigură condiţii de fotoperiodism.

2. Creşterea insectelor. Insectele mature în număr de 300-500 de indivizi sunt plasate în cutia Rubbermaid. Odată cu începutul ecloziunii, larvele de prima vârstă sunt colectate şi plasate în cutii Rubbermaid cu mediu nutritiv, care are următoarea componenţă:

făină de grâu 91,45 g făină de porumb 85,55 g masă vegetală uscată 117,99 g lapte uscat degresat 2,95 g miere de albine 17,70 g glicerol 11,80 g pinobanksin 0,015 g pinocembrin 0,015 g acetat de zinc (Zn(CH3CO2)2·2H2O) 0,030 g apă purificată 627,54 ml.

Larvele sunt crescute până când majoritatea larvelor ating vârsta a 4-a (ziua a 21-23-a din momentul ecloziunii), cu transferuri succesive pe mediu nutritiv proaspăt.

3. Obţinerea complexului entomologic activ din larve de vârsta a 4 de Lymantria dispar. Larvele sunt colectate cu ajutorul pensei şi sunt transferate în recipiente speciale pentru congelare. Larvele sunt congelate la temperatura de -18oC. În această formă materia primă poate fi păstrată timp de 24 luni şi utilizată în dependenţă de necesitate.

Înainte de utilizare larvele sunt spălate de 2 ori cu câte patru volume de solutie fiziologică şi încă de două ori cu câte 4 volume de apă purificată. Această procedură permite înlăturarea perişorilor de pe învelişurile exterioare ale larvelor.

În continuare biomasa este supusă mărunţirii într-un tocător cu cuţite de inox, astfel ca particulele obţinute să nu depăşească dimensiunea de 2 mm. Complexul activ obţinut, numit Adenoprosin Plus, este supus în continuare procesului de liofilizare.

Ultima etapă constă în mărunţirea complexului activ lioflizat în moară criogenă la o temperatură extrem de joasă, ceea ce asigură obţinerea particulelor disperse cu dimensiunea de până la 200 µm.

Complexul activ obţinut în modul descris mai sus este ambalat ermetic în pungi de aluminiu şi păstrat până la utilizare (pana la 24 luni) în condiţii de congelator (t - 18±3oC).

Rezultatele obţinute în cadrul procedeului revendicat au fost comparate cu rezultatele obţinute conform celei mai apropiate soluţii. În ultimul caz (soluţia apropiată) larvele au fost crescute în condiţii de laborator, au fost colectate larve de vârsta a 4-a.

Tabel

Cantitatea de biomasă, conținutul de zinc, conţinutul de aminoacizi şi activitatea antiinflamatoare a complexului activ conform procedeului revendicat şi conform celei mai apropiate soluţii* ; Parametrul monitorizat Conform celei mai apropiate soluţii Conform procedeului propus Cantitatea de biomasă de larve, mg, la 1g de mediu utilizat 53,96±1,87 68,40±2,07 Cantitatea de zinc în biomasă, µg la 1 g de biomasă 35,22±0,54 122,85±2,12 Cantitatea aminoacizilor proteinogeni, mg/g biomasă 332,36±13,11 507,08±9,43 Cantitatea aminoacizilor esenţiali, mg/g biomasă 149,45±6,18 238,26±21,08 Scăderea cantităţii de IL8 eliberată (% de reducere de la valoarea martor) 42,02±2,63 53,62±0,94 Activitatea antioxidantă Echivalent mg TROLOX /g biomasă 35,64±1,06 41,83±1,38;*Diferenţele dintre valorile parametrilor conform celei mai apropiate soluţii şi conform procedeului propus sunt statistic semnificative, p<0,005.

Din tabel se vede că procedeul propus este mai eficient din punct de vedere al acumulării de biomasă la un gram de hrană utilizată. Astfel, conform procedeului propus cantitatea de biomasă obţinută la o unitate de mediu utilizată este cu 26,8% mai mare ca în cazul celei mai apropiate soluţii. De asemenea, calitatea biomasei obţinute conform procedeului propus este superioară celei obţinute conform celei mai apropiate soluţii: conţinutul de zinc creşte de 3,5 ori, cantitatea aminoacizilor proteinogeni creşte cu 52,6%, inclusiv a celor esenţiali cu 59,4%. Activitatea biologică a biomasei obţinute conform procedeului propus este mai mare. Astfel, reducerea cantităţii de IL8 eliberată a fost redusă faţă de martor cu 27,6% mai eficient de complexul activ obţinut conform procedeului revendicat comparativ cu cel obţinut conform celei mai apropiate soluţii. Activitatea antioxidantă a complexului activ obţinut conform procedeului propus este cu 17,4% mai mare comparativ cu activitatea complexului obţinut conform celei mai apropiate soluţii.

Claims

Procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar, care include creşterea insectelor Lymantria dispar până la vârsta a 4-a în condiţii controlate pe un mediu standardizat, ce conţine, g/kg:

făină de grâu 80-95 făină de porumb 82-87 masă vegetală uscată 110-120 lapte uscat degresat 2,5-3,5 miere de albine 17-19 glicerol 10-12 pinobanksin 0,01-0,02 pinocembrin 0,01-0,02 acetat de zinc dihidrat 0,03-0,05 apă purificată restul, congelarea larvelor la temperatura de -18°C, spălarea larvelor, mărunţirea primară, liofilizarea, mărunţirea la temperatura de -55°C, ambalarea şi păstrarea complexului activ la temperatura de -18°C.