MD4713C1 - Procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la domeniul farmaceutic şi anume la preparatele cu efect antiinflamator, destinate tratamentului hiperplaziei benigne de prostată asociată sau nu cu prostatita cronică.Esenţa invenţiei constă în aceea că se propune un procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar, care include creşterea insectelor de Lymantria dispar până la vârsta 3...4-a în condiţii artificiale pe mediu standardizat cu următoarea componenţă (la 1 kg de mediu):făină de grâu80...95 gfăină de porumb82...87 gmasă vegetală uscată110...120 glapte uscat degresat2,5...3,5 gmiere de albine17...19 gglicerol10...12 gpinobanksin0,01...0,02 gpinocembrină0,01...0,02 gapă purificată696,5...663,5 ml, apoi larvele se congelează la temperatura de -18°C, după care larvele se spală, se mărunţesc primar pentru obţinerea complexului activ, care se liofilizează, complexul activ obţinut se mărunţeşte la temperatura de - 55°C, se omogenizează complexul activ, se ambalează şi se păstrează la temperatura de -18°C.

Description

Invenţia se referă la domeniul farmaceutic şi anume la preparatele cu efect antiinflamator, destinate tratamentului hiperplaziei benigne de prostată asociată sau nu cu prostatita cronică.

Este cunoscut un procedeu de obţinere a unui complex activ în ulei de vaselină, de origine entomologică - biomasa larvelor de Tenebrio molitor, care conţine 45...80% extract total entomologic şi 55...20% ulei de vaselină, eficient în afecţiunile de prostată, caracterizat prin activitate antioxidantă specifieă înaltă: la raportul de inhibiţie a peroxidării lipoproteinelor (C150% - 16 mg/ml) şi inhibiţie a radicalului oxidului nitric (CI50% - 20 mg/ml). Obţinerea complexului activ prezintă un process tehnologic complex, care include: creşterea insectelor de Tenebrio molitor în crescătorie pe mediu artificial standardizat; spălarea larvelor cu 4 volume de apă distilată, repetând procedura de 4 ori; dezinfectarea larvelor cu raze UV; congelarea larvelor la temperatura de -18°C; decongelarea larvelor prin creşterea treptată a temperaturii până la nivelul temperaturii camerei; omogenizarea biomasei în omogenizator cu cuţite de inox la viteza de 5000 rot./min până la obţinerea particulelor cu dimensiuni de 9...12 µm; extragerea cu apă distilată a componentelor hidrosolubile din biomasa entomologică; separarea extractului de biomasă prin filtrare în vid; concentrarea extractului prin evaporare în vid până la volumul rezultant de 250 ml; extragerea cu alcool etilic de 70% a componentelor solubile în alcool; separarea extractului prin filtrare în vid, concentrarea extractului prin evaporare în vid la temperatura de 40°C până la volumul restant de 100 ml; combinarea ambelor extracte; liofilizarea extractului total; condiţionarea extractului total în formă de complex entomologic activ în ulei de vaselină cu urmatoarea componenţă: extract entomologic total liofilizat - 45...80%; ulei de vaselină - 55...20%.

Complexul entomologic activ este formulat într-un produs farmaceutic ăn formă de supozitoare, care conţin 250 mg de complex entomologic activ şi 1750 mg [1].

Dezavantajul acestui complex şi a tehnologiei de obţinere a lui constă în faptul, că pe durata fluxului tehnologic sunt mai multe puncte critice, care pot compromite calitatea complexului.

Acestea sunt: concentrarea prin evaporare în vid a extractului hidric şi concentrarea prin evaporare în vid a extractului etanolic. În ambele cazuri are loc o încălzire esenţială, ceea ce duce la deteriorarea componentelor termolabile ale extractelor entomologice.

Mai este cunoscut un preparat entomologic antiinflamator şi antioxidant, destinat tratamentului hiperplaziei benigne de prostată şi procedeul de obţinere a lui. Conform celor indicate în descriere, preparatul entomologic antiinflamator şi antioxidant, obţinut din larvele de insecte din ordinul Lepidoptera, genul Lymantria prin mărunţirea for în soluţie fiziologică până la formarea unei mase omogene, filtrarea acesteia şi eliminarea apei prin liofilizare, care conţine următoarele componente: proteine - 265,0...292,0 mg/g; lipide - 140,0 mg/g, colesterol - 0,1 mg/g; trigliceride - 90,0 mg/g, amilază - 5,1 Ul/g, lipază - 100,0 mUl/g, antioxidanţi - 16,86 mg/g, aminoacizi esenţiali şi semiesenţiali - 379,7 mg/g. Acţiunea antioxidantă a preparatului este determinată de compuşii antioxidanţi hidrosolubili ce se manifestă prin inhibarea peroxidării lipidelor [2].

Dezavantajul acestui procedeu constă în faptul că nu este indicat procedura de cultivare a insectelor în scopul obţinerii biomasei de larve, substanţa activă este extrasă cu apă, din care cauză preparatul conţine doar componente antioxidante hidrosolubile.

Mai este cunoscut un procedeu de obţinere a unui preparat entomologic obţinut din biomasa larvelor de prima vârstă de Lymantria dispar prin extracţie hidro - etanolică. Larvele de Lymantria dispar sunt crescute în condiţii de laborator pe un mediu compus din făină de grau, mălai, masă vegetală uscată, lapte praf, drojdii uscate, glicerol şi miere. Biomasa colectată de larve de Lymantria dispar de prima vârstă se spală cu 4 volume de apă distilată, repetând procedura de 4 ori. După aceasta biomasa se dispersează timp de 15 min într-o soluţie de NaCl de 0,9%. Larvele se congelează. Biomasa congelată se supune decongelării prin aducerea treptată la temperatura camerei. Utilizând un mojar cu cuţite de inox, biomasa se amestecă la viteza de 5000 rot./min şi se fărâmiţează până la particule cu dimensiuni de 9...12 µm. Masa obţinută este în continuare supusă extragerii substanţelor bioactive cu soluţie hidro-etanolică de 20%. Extragerea durează 60 min în condiţii de temperatură constantă (18...20°C) la agitaţie permanentă pe un agitator orbital cu viteza de 280 rot./min (alternativ 240...320 rot./min), se separă de biomasă prin filtrare în vid, după care urmează liofilizarea extractului [3]. În continuare se obţine produsul farmaceutic sub formă de supozitoare rectale, care conţin 60% extract liofilizat.

Dezavantajul procedeului constă în faptul, că acesta permite obţinerea unui preparat, care constă doar din componente ale biomasei, care pot fi extrase cu soluţie hidro-etanolică de 20%, ceea ce omite majoritatea componentelor liposolubile.

Un alt dezavantaj al acestui procedeu constă în aceea, că în calitate de materie primă pentru extragere se utilizează biomasa larvelor de prima vârstă, care se caracterizează prin masă şi dimensiuni mici, ceea ce duce la scumpirea tehnologiei finale; se efectuează o singură extracţie hidro-etanolică cu o durată de 60 min, din care cauză rămân nevalorificate unele dintre componentele active ale biomasei.

Cea mai apropiată soluţie constituie un procedeu de obţinere a unui preparat entomologic din pupe, larve de ultima vârstă (a 5-a sau a 6-a în dependenţă de gen) ouă de Lymantria dispar, care este inclus într-o compoziţie farmaceutică sub formă de supozitoare sau ovule, pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostată, fibromului uterin.

Conform sursei indicate, procedeul include următoarele etape de lucru: colectarea pupelor, larvelor de ultima vârstă ale omizii păroase a stejarului (Lymantria dispar) începând cu luna iunie şi a ouălor în lunile august şi septembrie de pe tulpinile stejarilor şi plopilor afectaţi, sau creşterea larvelor şi pupelor în condiţii speciale de laborator; spălarea materialului biologic şi resuspendarea lui în soluţie fiziologică; filtrarea şi esorarea materialului biologic; opţional - congelarea materialului până la utilizarea ulterioară; măcinarea materialului până la obţinerea particulelor cu dimensiuni de 9...12µm; filtrarea prin filtrul Bucker cu placa având 200 orificii pe cm2; atomizarea în vid a extractului obţinut la temperatura de 130...140°C la intrare şi 85...90°C la ieşire cu liofilizarea lui timp de 24...30 ore - substanţa activă pentru producerea formei farmaceutice; executarea compoziţiei farmaceutice ce include 1% de substanţă biologic activă sub formă de extract de Lymantria dispar, 82% unt de cacao, 10% apă distilată, 2,68% helix, 2% laurat, 1,3% 2-bromo-2-nitropropan, 1% poligliceril-4 izostearat cetil PEG/PPG dimetican 10/1 şi 0,02% dial; condiţionarea acestei formule prin topirea şi omogenizarea amestecului obţinut la temperatura de 60°C şi turnarea în forme de supozitoare sau ovule şi ambalarea lor pentru stocarea ulterioară [4].

Dezavantajul acestui procedeu constă în aceea, că în calitate de materie primă biologică se utilizează trei dintre fazele de dezvoltare a insectei - ouă, larve de ultima vârstă şi pupe. Componenţa biochimică a larvelor, pupelor şi ouălor diferă semnificativ. Activitatea biologică a acestor tipuri de biomasă de asemenea diferă esenţial. De exemplu, activitatea antiradicalică a extractului din larve este de 5...7 ori mai mare comparativ cu activitatea oualor şi a pupelor.

De asemenea, a fost demonstrat, că cu înaintarea în vârstă activitatea biologică a larvelor scade, de exemplu activitatea antiradicalică a larvelor de ultima vârstă este cu cel putin 30% mai joasă comparativ cu activitatea larvelor de vârsta 1. Astfel, un alt dezavantaj al celei mai apropiate soluţii este utilizarea larvelor de ultima vârstă, caracterizată prin cea mai joasă activitate antioxidantă.

În acelaşi timp, sursa selectată în calitate de cea mai apropiată soluţie nu indică nişte proporţii pentru obţinerea amestecului de larve şi pupe. Pornind de la activitatea lor diferită, în cazul aplicării diferitor proporţii de larve şi pupe, se vor obţine produse cu activitate biologică diferită. De asemenea, sursa selectată nu include descrierea procesului de creştere a larvelor şi pupelor în condiţii de laborator, ceea ce poate fi un factor de variere a cantităţii şi proprietaţilor biologice ale materialului biologic obţinut. Cele expuse fac imposibil controlul asupra componenţei substanţei active.

Problema pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în elaborarea unui procedeu de obţinere a unui complex activ nou de origine entomologică, care asigură calitatea şi eficienţa produsului, realizând succesiv toate etapele tehnologice: creşterea insectelor, obţinerea complexului activ, în baza utilizării unei cantităţi rezonabile ale complexului activ, cu acţiune antiinflamatoare, eficientă în afecţiunile de prostată.

Esenţa invenţiei constă în aceea că se propune un procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar, care include creşterea insectelor de Lymantria dispar până la vârsta 3...4-a în condiţii artificiale pe mediu standardizat cu următoarea componenţă (la 1 kg de mediu):

făină de grâu 80...95 g făină de porumb 82...87 g masă vegetală uscată 110...120 g lapte uscat degresat 2,5...3,5 g miere de albine 17...19 g glicerol 10...12 g pinobanksin 0,01...0,02 g pinocembrină 0,01...0,02 g apă purificată 696,5...663,5 ml,

apoi larvele se congelează la temperatura de -18°C, după care larvele se spală, se mărunţesc primar pentru obţinerea complexului activ, care se liofilizează, complexul activ obţinut se mărunţeşte la temperatura de - 55°C, se omogenizează complexul activ, se ambalează şi se păstrează la temperatura de -18°C.

Rezultatul tehnic al invenţiei în comparaţie cu cea mai apropiată soluţie constă în faptul că procedeul de obţinere a complexului activ permite valorificarea componenţei biochimice totale a larvelor de Lymantria dispar de vârsta 3...4-a, iar efectuarea procesului de mărunţire a biomasei de larve după liofilizare se realizează în condiţii de temperaturi extrem de joase (- 55°C), care asigură păstrarea componenţei biochimice integrale a materiei prime cu obţinerea unui produs cu un grad foarte înalt de omogenitate.

Rezultatul tehnic al invenţiei se datorează valorificării integrale a complexului de substanţe bioactive din componenţa biomasei larvelor de vârsta 3...4-a şi evitării procedurilor, care pot provoca degradarea componentelor termolabile ale complexului activ.

Exemplu de realizare a invenţiei

Creşterea insectelor din specia Lymantria dispar include următoarele etape:

1. Pregătirea condiţiilor pentru realizarea ciclului vital în crescătorie. Crescătoria de insecte prezintă camere cu suprafaţa de 15...20 m2. Pereţii sunt vopsiţi cu o răşină specială care oferă posibilitatea dezinfectării cu soluţii dezinfectante. Pe perimetrul camerei sunt amplasate rafturi cu cutii Rubbermaid obscure. Temperatura în crescătorie se menţine la 27°C, iar umiditatea - 75%. Se

asigură condiţii de fotoperiodism.

2. Creşterea insectelor. Insectele mature în număr de 300...500 de indivizi sunt plasate în cutia Rubbermaid şi sunt hrănite exclusiv cu tărâţe de grâu de calitate superioară. Odată cu începutul ecloziunii, larvele de prima vârstă sunt colectate şi plasate în cutii Rubbermaid cu mediu nutritiv, care are următoarea componenţă:

făină de grâu 91,45 g făină de porumb 85,55 g masă vegetală uscată 117,99 g lapte uscat degresat 2,95 g miere de albine 17,70 g glicerol 11,80 g pinobanksin 0,015 g pinocembrină 0,015 g apă purificată 627,57 ml.

Larvele sunt crescute timp de 21 zile din momentul ecloziunii, cu transferuri succesive pe mediu nutritiv proaspăt.

3. Obţinerea complexului entomologic activ din larve de vârsta 3...4-a de Lymantria dispar.

Larvele sunt colectate cu ajutorul pensei şi sunt transferate în recipiente speciale pentru congelare. Larvele sunt congelate la temperatura de -18°C. În această formă materia prima poate fi păstrată timp de 24 luni şi utilizată în dependenţă de necesitate.

Înainte de utilizare larvele sunt spălate de 2 ori cu câte patru volume de solutie fiziologică de 0,9% şi apoi de doua ori cu a câte 4 volume de apă purificată. Această procedură permite înlăturarea perişorilor de pe învelişurile exterioare ale larvelor.

În continuare biomasa este supusă mărunţirii într-un tocator cu cutite de inox, astfel, ca particulele obţinute sţ nu depăşească dimensiunea de 2 mm. Complexul activ obţinut este supus în continuare procesului de liofilizare.

Ultima etapă constă în mărunţirea complexului activ lioflizat în moara criogenă la o temperatură extrem de joasă, ceea ce asigură obţinerea particulelor disperse cu dimensiunea de până la 200 µm.

Complexul activ obţinut în modul descris mai sus este ambalat ermetic în pungi de aluminiu şi păstrat până la utilizare (până la 24 luni) în condiţii de congelator (t = - 18±3°C).

Rezultatele obţinute în cadrul procedeului revendicat au fost comparate cu rezultatele obţinute conform celei mai apropiate soluţii. În ultimul caz (soluţia apropiată) larvele au fost crescute în condiţii de laborator pe mediul revendicat (p.2 din exemplu), au fost colectate larve de vârsta 5...6-a (ultima), în cea de-a 35 zi după ecloziunea larvelor din ouă.

Cantitatea de biomasă şi activitatea antiinflamatoare a complexului activ conform procedeului revendicat şi conform celei mai apropiate soluţii

Tabel

Parametrul monitorizat Conform celei mai apropiate soluţii Conform procedeului propus în invenţie Cantitatea de biomasă de larve, mg, la 1 g de mediu utilizat 51,07±0,74 53,96±1,87* Scăderea cantităţii de IL8 eliberată (% de reducere de la valoarea martor) 27,75±3,15 42,02±2,63**

*P=0,047 (<0,05)

**P=0,004 (<0,005)

Din tabel se vede, că procedeul propus este mai eficient din punct de vedere a acumulării de biomasă la un gram de hrană utilizată. Astfel, la 1 g de hrană în procedeul revendicat s-au obţinut 53,96±1,87 mg larve, iar în soluţia cea mai apropiată - 51,07±0,74.

Cantitatea de IL8 eliberată a fost redusă de către complexul activ obţinut conform procedeului revendicat cu 42,02±2,63%, iar în cazul complexului activ obţinut conform celei mai apropiate soluţii - cu doar 27,75±3,15% faţă de nivelul martor.

1. MD 4296 B1 2014.08.31

2. MD 2788 F1 2005.06.30

3. Ciuhrii V. Biotehnologia obţinerii formei medicamentoase pentru tratarea hiperplaziei benigne de prostată. Teza de doctor în biologie. Chişinău, 2010, 129 p.

4. RO 122332 B1 2009.04.30

Claims (1)

1. Procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar, care include creşterea insectelor de Lymantria dispar până la vârsta 3...4-a în condiţii artificiale pe mediu standardizat cu următoarea componenţă (la 1 kg de mediu):

   făină de grâu 80...95 g făină de porumb 82...87 g masă vegetală uscată 110...120 g lapte uscat degresat 2,5...3,5 g miere de albine 17...19 g glicerol 10...12 g pinobanksin 0,01...0,02 g pinocembrină 0,01...0,02 g apă purificată 696,5...663,5 ml, apoi se congelează larvele la temperatura de -18°C, după care larvele se spală, se mărunţesc primar pentru obţinerea complexului activ, care se liofilizează, complexul activ obţinut se mărunţeşte la temperatura de -55°C, se omogenizează complexul activ, se ambalează şi se păstrează la temperatura de -18°C.