RO130740B1 - Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine - Google Patents

Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine Download PDF

Info

Publication number
RO130740B1
RO130740B1 ROA201500208A RO201500208A RO130740B1 RO 130740 B1 RO130740 B1 RO 130740B1 RO A201500208 A ROA201500208 A RO A201500208A RO 201500208 A RO201500208 A RO 201500208A RO 130740 B1 RO130740 B1 RO 130740B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
complex
standardized
entomology
extraction
biomass
Prior art date
Application number
ROA201500208A
Other languages
English (en)
Other versions
RO130740A0 (ro
Inventor
Liliana Mânzatu
Veaceslav CIUHRII
Laura Olariu
Original Assignee
Biotehnos S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotehnos S.A. filed Critical Biotehnos S.A.
Priority to ROA201500208A priority Critical patent/RO130740B1/ro
Publication of RO130740A0 publication Critical patent/RO130740A0/ro
Publication of RO130740B1 publication Critical patent/RO130740B1/ro

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

Orice persoană are dreptul să formuleze în scris și motivat, la OSIM, o cerere de revocare a brevetului de invenție, în termen de 6 luni de la publicarea mențiunii hotărârii de acordare a acesteia
RO 130740 Β1
Prezenta invenție se referă la un complex entomologie standardizat, îmbogățit în acizi grași ω-3 și ω-6, un procedeu de preparare a acestuia și o compoziție medicamentoasă sub formă de cremă, unguent, capsule, ovule și supozitoare pe baza acestuia, cu efecte antiinflamatoare, antioxidante, antiproliferative asupra celulelor displazice, și de reducere a permeabilității vaselor de sânge pentru celulele proinflamatorii.
Conform invenției, se obțin:
- un complex entomologie nou, standardizat, îmbogățit cu acizi grași totali de 1 ...3%, dintre care acizii a-linolenic (ω-3) și linoleic (ω-6) în proporție de minimum 25% din total și proteine solubile de minimum 20%, cu efect de inhibare a eliberării citokinelor proinflamatorii, asociată cu factorii de semnalizare intracelulară care modulează proliferarea aberantă a celulelor displazice; complexul entomologie standardizat se obține sub forma unei pulberi omogene de culoare galben-cafenie, în cantitate de 50...60 g/100 g biomasa entomologică brută;
- compoziții medicamentoase sub formă de cremă, unguent, capsule, ovule sau supozitoare, cu un conținut de 0,1... 10% complex entomologie standardizat, condiționat cu ingrediente specifice uzuale.
Insectele reprezintă un grup foarte mare de organisme caracterizate printr-o productivitate uriașă și populații mari. Se estimează că peste un milion de specii de insecte au fost descrise, alcătuind aproximativ 70% din totalul organismelor. Bogăția și diversitatea acestora a determinat utilizarea lor de către oameni atât ca hrană, cât și în medicina tradițională. Astfel, de peste 2000 de ani, medicina tradițională chineză utilizează atât corpul întreg al insectei, cât și ouăle, produsele și secrețiile insectelor pentru tratarea a diferite boli. De aceea, obținerea din insecte a unor extracte cu proprietăți terapeutice este considerată o direcție importantă pentru descoperirea de noi medicamente [Ying FENG, Min ZHAO, Zhao HE, Zhiyong CHEN and Long SUN; Research and utilization of medicinal insects in China; Entomological Research; September 2009; Voi. 39, Issue 5 (pp. 313-316)].
începând cu anii 1970, s-a pus problema evaluării capacității nutriționale a diferitelor specii de insecte, în principal ca sursă importană de proteine [Encyclopedia of Entomology Springer 200410.1007/0-306-483 80-7_2920; Nutrient Content of Insects; MarkD. Finke1(1) Scottsdale, Arizona, USA], Literatura științifică zoologică conține diferite date despre valoarea nutritivă a insectelor ce evidențiază o compoziție complexă al cărei conținut procentual variază în principal în funcție de specie. Astfel, proteinele totale care, în mare parte, formează exoscheletul insectelor se pot găsi între 21 % la larvele Oileus rimatorși 80% la femelele adulte de Lymantria dispar, lipidele - constituente majore ale acestor organisme - pot fi regăsite în proporție de la 2,2% la termitele Nasuititermes corniger\a 60% la larvele Galleria mellonella (L.); fibrele - care, datorită similarității structurale dintre chitină (polimer de N-acetil glucozamina legate beta 1-4) și celuloză (polimer obținut prin legarea beta 1-4 a beta D-glucopiranozei) sunt asimilate chitinei sau proteinelor sclerotizate - se pot găsi între 0,12...3,89%, dar și 7,5...19% în funcție de specie; mineralele totale pot varia între 2...21 mg % g; dintre acestea, calciul se poate regăsi între 0,93 mg % g la pupa de Musca domestica și 5,1 mg % g la pupa de Musca autumnalis', regăsim, de asemenea, în cantități apreciabile și fosfor, magneziu, sodiu, potasiu, clor, precum și aminoacizi esențiali: izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofan, valina. în ultima perioadă de timp, au apărut articole în reviste entomologice ce evidențiază preocuparea cercetătorilor de a utiliza insectele ca surse de medicamente noi, obținute prin bioinginerie pentru realizarea de produse antimicrobiene, anti-cancer, anti-angiogeneza, factori anti-coagulanți și de vindecare a rănilor [Virginia Melo, Matriza Garcia; „Quality proteins from edible indigenous insect food of Latin America and Asia Emir. J. Food Agric. 2011, 23(3): 283-289; Robert W. Pemberton; Insects and other arthropods used
RO 130740 Β1 asdrugsInKorean tradiționalmedlclne” Journal of Ethnopharmacology Volume 65, Issue 3, June 1999, Pages 207-216]. Numeroase insecte și artropode aparîn farmacopeea medicinei tradiționale coreene, dar puține sunt cunoscute pentru utilizare în medicina modernă. Dintre acestea, printre cele mai prescrise sunt Scolopendra spp, utilizate pentru tratarea artritei. Majoritatea artropodelor sunt colectate sau crescute în peninsula Coreea sau sunt importate, în principal, din China. Tradiția utilizării reprezintă baza prescripțiilor medicale, fiind susținută și de atitudinea pozitivă a oamenilor față de insecte, în comparație cu cea a celorlalte culturi (vestice, europene) [Ratcliffe NA; Mello CB; „Insect Biochem.Mol Biol 2011 oct;42( 10): 747-69],
Literatura entomologică cuprinde, în marea majoritate a cazurilor, doar articole și studii experimentale la nivel de laborator, referitoare la biologia, biochimia, metabolismul, fiziologia insectelor și tratamentele tradiționale asiatice în care se folosesc. Până în prezent, se cunosc puține brevete ce valorifică insectele pentru obținerea de preparate cu aplicații în medicina umană.
Astfel, brevetul coreean KR 20130041863 (A)/2013-04-25 propune o metodă de obținere a unui derivat de heparină din insecte, ce presupune: imersarea insectelor într-un solvent organic, îndepărtarea lipidelor, filtrarea și uscarea reziduului. Rezidul obținut se supune hidrolizei enzimatice a proteinelor, îndepărtarea acestora, colectarea zaharurilor și obținerea glucozaminoglicanilor.
Brevetul CH 603162 (A5)/1978-08-15 propune utilizarea unui extract hormonal uleios din insecte în produse cosmetice creme, unguente, emulsii, obținut din crisalida lepidopterelor. Extractul se referă la un preparat ce conține hormonul juvenil, obținut printr-o metodă ce presupune parcurgerea mai multor etape: uscarea insectelor, pulverizarea acestora, amestecarea cu un material poros, extragerea uleiului sub presiune, amestecarea cu alte grăsimi lichide; extractul este utilizat pentru stimularea creșterii.
RO118114B1 se referă la un procedeu de obținere a unei substanțe farmaceutic active și a unei compoziții farmaceutice pentru tratarea infecțiilor hepatice obținute din insecta Galleria mellonella', substanța activă este reprezentată de un complex de aminoacizi esențiali.
RO 122332 B1 se referă la o compoziție farmaceutică sub formă de supozitoare sau ovule pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostată sau a fibromului uterin în care se realizează o asociere a extractului uscat 1 % de Lymantria dispar cu 82% unt de cacao, 10% apă distilată, 2,68% hexil, și alți aditivi. Substanța activă este reprezentată de o pulbere atomizată sau liofilizată, fără să se precizeze compoziția chimică, fiind obținută din Lymantria disparco\ectată din mediul natural.
R0123617 B1 revendică un procedeu de preparare a unei substanțe biologic active din țesuturile de Lepidoptere, în special Lymantria dispar și Galleria mellonella, și o compoziție farmaceutică sub formă de ovule sau supozitoare pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostată, infecții virale, bacteriene, micotice, formațiuni tumorale. Substanța activă este reprezentată de proteinele inhibitoare de sinteză specifice, ce conțin 15 aminoacizi esențiali, și se prezintă ca o pulbere atomizată de culoare gri deschis cu o umiditate de 4...5%.
Brevetele MD 2787 (13) F1-2004.07.28, MD 2788 (13) F1-2004.07.28 și MD 2789 (13) F1-2004.07.28 propun 3 preparate entomologice cu efecte hepatoprotectoare și imunomodulatoare, antiinflamatoare și antioxidante, și imunomodulatoare și antioxidante, obținute din Lepidoptere din diferite stadii de dezvoltare: ouă cu pupe, larve, pupe, având o compoziție asemănătoare, dar diferite procentual. Procedeul de obținere este comun, presupunând aceleași etape: mărunțirea omogenă a materialului entomologie, filtrarea, eliminarea apei prin liofilizare.
RO 130740 Β1
Preparatele entomologice obținute conțin proteine, lipide, colesterol, trigliceride, amilaza, lipaza, antioxidanti, aminoacizi. în niciunul dintre brevete nu se evidențiază cărui component i se datorează efectul presupus.
Brevetul MD 4296 (13) B1 se referă la un preparat din larve de Tenebrio molitor cu acțiune antioxidantă și la un produs farmaceutic pe baza acestuia. Preparatul obținut prin extracția apoasă, urmată de extracția cu etanol 70% și reunirea acestora, conține 45...80% extract hidroalcoolic liofilizat din Tenebrio molitor ș\ restul până la 100% vaselină. Preparatul farmaceutic, sub formă de supozitoare rectale, conține 0,25 g extract în ulei de vaselină și 1,75 g gliceride sintetice/supozitor.
Din datele prezentate cu privire la stadiul tehnicii în domeniul obținerii unor substanțe sau produse bioactive entomologice, rezultă următoarele:
- domeniile terapeutice către care se adresează aceste preparate sunt: cosmetica pentru stimularea creșterii părului; în terapeutica infecțiilor hepatice, virale, bacteriene, micotice sau pentru efectele hepatoprotectoare, imunomodulatoare, antiinflamatoare, anticoagulante, în tratarea formațiunilor tumorale, hemoroizilor, adenomului de prostată și a fibromului uterin;
- în brevetele prezentate în stadiul tehnicii nu sunt prezentate date referitoare la standardizarea în substanțele active și nici testele ce dovedesc eficacitatea terapeutică;
- procedeele de obținere a extractelor entomologice sunt diferite față de cel din invenția propusă: KR 20130041863 (A) 2013-04-25 extracția cu un solvent organic și îndepărtarea lipidelor; MD 4296 (13) B1 extracția apoasă urmată de extracția cu etanol 70% și reunirea celor două tipuri de extracte; CH 603162 (A5) 1978-08-15 extract hormonal uleios cu utilizări cosmetice.
Invenția propusă spre brevetare reprezintă o îmbunătățire a brevetului MD 4296 (13) B1 - „Complex bioactiv din larvele de Tenebrio Molitor în ulei de vaselină, procedeu de obținere a acestuia și produs farmaceutic pe baza lui. Conform brevetului MD 4296 (13) B1, complexul activ din biomasa entomologică brută se obține în 2 trepte de extracție: prima apoasă, urmată de extracția cu etanol 70%, reunirea acestor extracte și liofilizarea lor.
Problema tehnică pe care o rezolvă prezenta invenție este obținerea din biomasă entomologică brută a larvelor din insecte aparținând claselor Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc.) și Coleoptere (Tenebrio Molitor, Tenebrio opacus, etc.) a unei compoziții farmaceutice cu efect terapeutic antioxidant, antiproliferativ asupra celulelor displazice, și de reducere a permeabilității vaselor de sânge pentru celulele proinflamatorii, dovedite prin teste specifice.
Soluția propusă constă într-un complex entomologie standardizat și un procedeu de preparare a acestuia în care, prin utilizarea unor solvenți de polarități diferite, se realizează extracția componentelor lipidice bioactive, alături de cele hidroalcoolice și hidrosolubile, valorificându-se toate substanțele biologic active din biomasa entomologică.
Astfel, într-un prim aspect, invenția se referă la un complex entomologie standardizat, care se prezintă sub forma unei pulberi omogene de culoare galben-cafenie cu un conținut total de acizi grași de 1...3% dintre care acizii a-linolenic (ω-3) și linoleic (ω-6), în proporție de minimum 25% din total, și proteine solubile de minimum 20%, procentele fiind exprimate în greutate.
De asemenea, invenția se referă la un procedeu de preparare a unui complex entomologie standardizat, definit mai sus, în care biomasa de larve de insecte din ordinul Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc.) și Coleoptere (Tenebrio Molilor, Tenebrio opacus, etc.), decongelată și omogenizată, se supune operației de extracție cu apă purificată, în raport 1:20...1:30 în greutate, timp de 1...2 h, extractul apos se colectează prin decantare și filtrare,
RO 130740 Β1 iar biomasa rămasă se supune în continuare extracției cu alcool etilic 70% în raport 1:10...1:20, timp de 1...2 h, extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare și filtrare, iar biomasa rămasă se supune extracției cu un solvent organic de tipul acetonă, hexan, ciclohexan, alcool etilic 96% în raport 1:5...1:10 în greutate, timp de 2...4 h, după care extractul organic se colectează, pulberea rămasă se consideră reziduu, iar extractele selective obținute în cele trei etape ale procesului și prelucrate separat prin concentrare sub vid se reunesc în instalația de concentrare, sub formă de extracte moi, urmată de etapa de uscare protejată sub vid, obținându-se complexul entomologie standardizat sub formă de pulbere galben-cafenie.
De asemenea invenția se referă la o compoziție medicamentoasă cu efect de inhibare a eliberării citokinelor proinflamatorii, asociată cu factori de semnalizare intracelulară care modulează proliferarea aberantă a celulelor displazice, care are un conținut de 0,1 ...10% complex entomologie standardizat, definit în revendicarea 1, condiționată sub formă de cremă, unguent, capsule, ovule sau supozitoare cu ingrediente specifice uzuale.
Procedeul de obținere a complexului entomologie îmbogățit constă în extracția selectivă în trei trepte a biomasei entomologice obținute din larvele insectelor decongelate și omogenizate: prima etapă de extracție se realizează cu apă purificată, urmată de extracția cu alcool etilic 70% și extracția a treia cu alcool etilic 96% sau cu alt solvent organic de tipul acetonă, hexan, ciclohexan pentru extracția fracției lipidice. Cele trei extracte obținute se concentrează separat cu recuperarea solvenților și se reunesc în final înainte de a se supune operației de uscare protejată, sub vid, liofilizare sau atomizare. Complexul entomologie îmbogățit se prezintă sub forma unei pulberi ușor higroscopice, galben-cafenii, și este standardizat în acizi grași totali de minimum 3%, din care ω-3 și ω-6 de minimum 25% și proteine totale de minimum 20%.
Conform invenției, procedeul de obținere a complexului entomologie îmbogățit constă în: biomasa decongelată și omogenizată de larve de insecte aparținând claselor Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc.) și Coleoptere (Tenebrio Molitor, Tenebrio opacus, etc.), se supune operației de extracție cu apă purificată, în raport 1:20...1:30, timp de 1 ...2 h, extractul apos se colectează prin decantare și filtrare, iar biomasa rămasă se supune în continuare extracției cu alcool etilic 70% în raport 1:10...1:20, timp de 1...2 h, extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare și filtrare, iar biomasa rămasă se supune extracției cu alcool etilic 96% în raport 1:5...1:10, timp de 2...4 h, după care extractul organic se colectează, iar pulberea rămasă se consideră reziduu. Extractele selective obținute în cele trei etape ale procesului se prelucrează separat prin concentrare sub vid, și se reunesc în instalația de concentrare, sub formă de extracte moi, urmată de etapa de uscare protejată sub vid. Complexul entomologie îmbogățit se prezintă sub formă de pulbere galben-cafenie standardizată, în conținutul de acizi grași totali de minimum 3%, din care ω-3 și ω-6 de minimum 25% din total și proteine solubile de minimum 20%. Compozițiile medicamentoase sub formă de cremă, capsule, ovule sau supozitoare conform invenției sunt constituite din asocierea în proporție de 0,1...10% a complexului entomologie îmbogățit standardizat, cu ingredienți specifici.
Comparativ cu produsele obținute conform stadiului tehnicii, noul produs prezintă un potențial terapeutic ridicat, datorat asocierii componentelor existente în cele 3 tipuri de extracte: apos, hidroalcoolic și lipofil, valorificându-se toate substanțele solubile, biologic active, din biomasa entomologică. Complexul entomologie îmbogățit, obținut conform invenției prin extracția cu solvenți selectivi, este standardizat în componente biologic active a căror activitate a fost evidențiată prin teste specifice.
Procedeul de obținere a complexului entomologie îmbogățit cu fracția lipidică este reproductibil și se poate aplica și la nivelul industriei farmaceutice.
RO 130740 Β1
Datorită standardizării complexului în componente biologic active, și compozițiile medicamentoase sunt reproductibile în ceea ce privește compoziția chimică.
Activitatea biologică in vitro în ceea ce privește demonstrarea activității biologice a complexului entomologie standardizat, aceasta vizează aportul fracției lipidice la îmbunătățirea acțiunii terapeutice.
Testele de evidențiere a acțiunii biologice pentru complexul lipidic entomologie au constat în analiza profilului citotoxic și de acțiune specifică in vitro, prin studii ale metabolismului celular, statusului proliferativ, și ale acțiunii antiproliferative, de inducere a apoptozei celulare, și mecanisme moleculare, antiinflamatoare și antioxidante.
Determinarea efectelor componentelor bioactive a fost efectuată pe linii standardizate de celule umane de tip hiperplazie de prostată, respectiv, adenocarcinom de prostată și celule endoteliale vasculare. Aceste materiale biologice reprezintă modele adecvate pentru investigarea desfășurării proceselor fiziologice și surprinderea declanșării/inhibării unor parametri celulari și moleculari, ca urmare a acțiunii complexelor entomologice în afecțiunile țintă.
După determinări de citotoxicitate specifică, comportamentul celular a fost evaluat printr-o serie de teste și analize care susțin efectele produsului revendicat conform invenției:
1. Studii de activitate metabolică - au evidențiat că fracția lipidică manifestă efectul citotoxic începând cu concentrația 100 pg/ml.
2. Monitorizarea secvențialității ciclului celular prin marcarea ADN în vederea analizei prin citometrie în flux a ciclului celular (kitul Cycle Test™ Plus) și a stadiilor timpurii și târzii ale apoptozei, prin marcare cu iodură de propidiu și anexină (kit Annexin V-Fitc Apoptosis Detection, BD Pharmingen).
a) Ciclu Celular - Acțiunea antitumorală a unui compus se manifestă și prin inhibarea secvențialității ciclului celular, reducând fazele de diviziune (faza G0/G1, în care are loc duplicarea conținutului celular, cu excepția cromozomilor; faza S, sinteza ADN și replicarea materialului genetic, și faza G2/M). Probele biologice au constat în fracție lipidică în intervalul de concentrații 1 ...10 pg/ml, analizate față de martorul de cultură și martorul pozitiv de inhibiție a proliferării și diviziunii celulare, metotrexat (6 pM).
Fracția lipidică reduceîn maniera doză-efect procentul celular în punctele cheie ale procesului de diviziune (Faza S - preponderent și G2/M), astfel încât indicele de proliferare scade față de martorul de cultură cu 25%, 18% și, respectiv, 14%. Prin această acțiune este încetinit procesul de diviziune celulară a liniei DU 145 de adenocarcinom de prostată.
Tabelul 1
Secvențialitatea ciclului celular, indusă de extractul entomologie pe linia DU145
G0/G1 % S % G2/M indicele de proliferare față de martor (%)
Martor de cultură 71,8 18,8 9,25 100
Methotrexat 6 pM 72,03 26,7 0,24 96,42
Fracție lipidică 10 pg/ml 76,54 14,1 7,29 75
Fracție lipidică 5 pg/ml 77,11 15,6 7,45 82
Fracție lipidică 1 pg/ml 75,34 16,1 8,68 86
CES 10 pg/ml 76,26 15,4 8,51 82,14
CES 5 pg/ml 78,75 14,7 6,67 75
CES = Complex entomologie standardizat
RO 130740 Β1
b) Apoptoza - Inducerea apoptozei în disfuncțiile hiperproliferative este unul dintre principalele mecanisme de intervenție terapeutică. Modelul experimental de testare a acțiunii fracției lipidice evidențiază procesul apoptotic de la inițiere (externaiizarea fosfatidil-serinei membranare) și până în etapele târzii, caracterizate de dezintegrarea membranei celulare.
Tabelul 2
Apoptoza linie DU 145, indusă de extract entomologie
Celule vii (%) Celule apoptoza timpurie (%) Celule apoptoza târzie (%) Celule necroză (%) Indice de variație a celulelor apoptotice față de martor
Martor de cultură 95,35 1,32 3,06 0,27 100
Martor pozitiv 81,34 9,91 6,71 2,03 379
Fracție lipidică 10 pg/ml 86,83 3,74 8,58 0,84 281
Fracție lipidică 5 pg/ml 90,09 3,78 5,58 0,54 213
CES 30 pg/ml 92,03 2,19 5,36 0,4 172,37
CES 10 pg/ml 91,37 3,21 4,87 0,54 184,47
CES 5 pg/ml 92,33 2 4,95 0,72 158,67
Acțiunea extractului lipidic, deși inferioară martorului pozitiv, se manifestă în maniera doză-efect, inducând trecerea celulelor în apoptoza timpurie și târzie depășind dublul celulelor induse în apoptoză de către martorul de cultură, conform indicelui de variație din tabelul 2.
3) Evaluarea activității antiinflamatorii prin determinarea nivelului de eliberare de citokine (IL6 și IL8) în mediul extracelular, utilizând DU-145 (kitul CB A - Human Soluble Protein Flex Set, prin tehnica de multiplexare).
Citokinele IL6 și IL8 sunt factori de semnalizare a statusului proinflamator. IL6 este o pleiotropică implicată în progresia neoplazică a diferitelor categorii de tumori, ca mediator al morbidității în cancerul de prostată. IL6 este secretată de celulele de prostată normale și tumorale. în timpul progresiei tumorale, IL6 suferă o tranziție funcțională de la rolul de indicator al dezvoltării inflamației la cel de stimulator pentru proliferarea tumorală, astfel încât inhibiția acestei citokine este o cale terapeutică de încetinire sau stopare a invaziei metastatice. IL8 este responsabilă de creșterea tumorală androgen-independentă, asociată în cancerul de prostată cu chemorezistență, creșterea tumorii și progresia angiogenică.
S-a realizat un model experimental care mimează procesul inflamator „in vitro, prin stimularea celulelor tumorale, timp de 24 h, cu un agent pro-inflamator sistemic, TNFa de concentrație 15 ng/ml. Efectul va fi estimat procentual, ca variație față de martorul de cultură. Dexametazona 200 ng/ml este martorul pozitiv cu acțiune antiinflamatorie.
Tabelul 3
Nivelul de eliberare a citokinelor proinflamatorii sub influența extractului entomologie
IL8 (pg/ml) IL6 (pg/ml)
Nestimulate Stimulate TNFa 15 ng/ml Indice de variație față de martor (%) Nestimulate Stimulate TNFa 15 ng/ml Indice de variație față de martor (%)
Martor de cultura 39151,09 213199,28 100 2309,72 3964,19 100
Colchicina 1pM 13798,97 14740,99 6,91 908,94 1237,16 31,20
Colchicina 0,5 pM 9816 11240,15 5,27 1060,23 1217,16 30,70
RO 130740 Β1
Tabelul 3 (continuare
IL8 (pg/ml) IL6 (pg/ml)
Nestimulate Stimulate TNFa 15 ng/ml Indice de variație față de martor (%) Nestimulate Stimulate TNFa 15 ng/ml Indice de variație față de martor (%)
Fracție lipidică 10 pg/ml 7117,51 7867,66 3,69 799,38 440,16 11,10
Fracție lipidică 5 pg/ml 8395,15 25984,89 12,18 1546,74 2484,53 62,67
Fracție lipidică 1 pg/ml 8521,49 31860,89 14,94 2532,81 3854,77 97,23
CES 30 pg/ml 8058,47 17619,25 8,26 1940,62 2613,83 65,93
CES 10 pg/ml 9153,25 41818,09 19,61 2597,57 5977,67 150
EP 79,78
EP* extract hidric și hidroetanolic obținut conform invenției MD 4296 (13) B1
Se remarcă acțiunea antiinflamatorie în maniera doza-efect a fracției lipidice, care la concentrația de 10 pg/ml inhibă semnificativ eliberarea de citokine extracelulare în mediul de cultură și anume, cu 88% pentru nivelul IL6 și 94% pentru IL8. Valorile obținute pentru aceste citokine, în corelație cu martori de sinteză cunoscuți pentru activitățile biologice antitumorale, susțin efectul in vitro al produsului entomologie asupra moleculelor ce induc progresia celulară și mecanisme auxiliare în tumorile de prostată.
4) Evaluarea VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) - factor pro-angiogenic de inducere și dezvoltare a proceselor metastatice.
Neovascularizația tumorii este considerată a fi mediată de factori solubili eliberați de celulele tumorale ce pot deveni markeri utili de monitorizarea activității celulelor tumorale. Conceptul de tratare a tumorilor prin inhibiția angiogenezei a luat o mare amploare după descoperirea moleculelor pro-angiogenice de tipul VEGF și, prin urmare, utilizarea lor ca potențiale ținte terapeutice. Există o semnalizare pro-angiogenică a celulelor tumorale, bazată pe eliberarea extracelulară a factorului VEGF, și un răspuns la acest stimul al celulelor endoteliale vasculare normale care încep să prolifereze și să formeze o microvasculatură ce va servi la hrănirea tumorii într-un nou situs metastatic. Modelul experimental de testare a inhibiției VEGF de către fracția lipidică în celulele de adenocarcinom de prostată DU 145 a avut la bază mimarea procesului inflamator „in vitro, asociat cu invazia tumorală prin stimulare cu TNFa 15 ng/ml timp de 24 h.
Tabelul 4
Eliberarea VEGF sub acțiunea produsului entomologie
VEGF (pg/ml)
nestimulate stimulate TNF alfa 15 ng/ml Indice de variație față de martor %
Martor de cultură 555,61 686,25 100
Colchicina 1 pM 245,25 102,19 14,9
Colchicina 0,5 pM 179,3 78,55 11,44
Dexamethazona 200 ng/ml 369,12 285,1 41,54
Fracție lipidică 10 pg/ml 493,25 152,59 22,23
Fracție lipidică 5 pg/ml 728,04 481,58 70,17
Fracție lipidică 1 pg/ml 793,63 552,67 80,53
CES 30 pg/ml 754,1 336,96 49,10
CES 10 pg/ml 874,26 567,22 82,65
CES 5 pg/ml 793,63 606,93 88,44
RO 130740 Β1
Studiile efectuate, rezumate în tabelul 4 evidențiază efectul remarcabil al fracției lipidice, direct proporțional cu concentrația testată, prin scăderea pregnantă cu 77%, 30%, respectiv,
20%, a concentrației de VEGF față de martorul de cultură. Acestea dovedesc acțiunea specifică antiangiogenică in vitro a produsului, prin care se inhibă propagarea procesului tumoral până la nivel de mecanisme de metastazare a adenocarcinomului de prostată.
5) Model de expresie genică pentru molecule implicate în mecanismele de inițiere și propagare a afecțiunilor prostatei.
Acțiunea fracției lipidice (10 pg/ml) a fost evaluată și prin metoda RT-PCR din punct de vedere al profilului anti-proliferativ cuantificat prin nivelul expresiei genelor codificatoare a 92 de molecule responsabile de mecanismele implicate în perturbările patologice ale prostatei. Din multitudinea de gene analizate, cu impact asupra căilor de propagare a semnalelor proliferative ce au loc în etapele de inițiere/propagare a afecțiunilor prostatei, fracția lipidică manifestă efect semnificativ de supresare a expresiei unor oncogene care participă la declanșarea proceselor tumorale: FZD-1- frizzled family receptor 1 cu rol în creșterea celulelor prostatice cu proliferare anormală; MDM2 - cu rol în carcinogeneza prostatei, prin inhibarea activării transcripționale a genelor corelate cu blocarea ciclului celular și declanșarea apoptozei, fiind frecvent detectată și asociată cu proliferarea celulară și creșterea în volum a prostatei; VEGFA - factorul de creștere a endoteliului vascular A este implicat în promovarea proliferării celulelor endoteliale, în permeabilitatea vasculară și angiogeneza care reprezintă etape critice în creșterea și dezvoltarea aberantă a volumului prostatei displazice. VEGFA este secretat de celulele adenocarcinomatoase de prostată, ceea ce reflectă un nivel crescut la nivel sangvin de VEGF - fiind considerat un potențial marker pentru anomaliile proliferative de prostată; LEF1 - factorul de legarea enhancerului limfoid 1 determină expresia receptorilorandrogeni și, implicit, creșterea și invazia celulelor de prostată aberant proliferative. Se remarcă efectul fracției lipidice de supresare a expresiei genelor cu potențial oncogen, în special a VEGFA, ceea ce sugerează acțiunea de blocare a transmiterii unor semnale proliferative în celulele de prostată displazice ca urmare a implicațiilor fiziopatologice ale oncogenelor supresate.
Pe de altă parte, complexul entomologie standardizat are efect de suprareglare a unor gene cu rol de supresor tumoral, evidențiind un sinergism de acțiune cu funcțiile genelor supresor tumorale de tipul: CDKN1B - cyclin-dependent kinase inhibitor 1B care funcționează ca un punct de control pentru ciclul celular G1-S; APC - adenomatous polyposis coli, are un rol critic în căile de semnalizare proliferative; TP53 codifică o moleculă cheie cu rol de supresor tumoral, care are potențial de reacție la diferite forme de stres celular prin activarea genelor implicate în blocarea creșterii celulare aberante și inducerea apoptozei.
Acțiunea fracției lipidice de suprareglare asupra principalei proteine cu rol de supresor tumoral TP53 demonstrează profilul inhibitor asupra proliferării aberante a celulelor de prostată.
Concluzii privind activitatea biologică in vitro a complexului entomologie standardizat:
Fracția lipidică are o activitate biologică in vitro care se înscrie în algoritmul proceselor proliferative, antioxidante și antiinflamatorii, care susține utilizarea materiei entomologice în terapeutica farmaceutică și dermatocosmetică.
în contextul proliferării celulare cu transformări hiperplazice și aberante, complexul entomologie standardizat are efect antitumoral prin acțiune antiproliferativă, încetinind procesul de multiplicare a materialului genetic și astfel procesul de diviziune, fiind și un inductor de apoptoză. Produsul are intervenție pronunțată în procese inflamatorii asociate cu factori de semnalizare extracelulară, inițiere și dezvoltare tumorală, și dovedește efect antiinflamator semnificativ prin inhibiția interleukinelor până la nivelul inflamației cronicizate, asociată cu un prognostic negativ în tumorile de prostată. Acțiunea produsului se remarcă și prin efectul antiangiogenic, prin inhibarea factorului VEGF, asociată cu progresia tumorii de la nivel local, la cel metastatic.
RO 130740 Β1
Toate aceste acțiuni demonstrate la nivel celular sunt susținute de răspunsul molecular al fracției lipidice, la nivel de genă, constând în modularea expresiei acestora către un status metabolic ameliorat, cu reducerea efectelor displazice ale dezvoltării aberant proliferative a celulelor de prostată.
Exemplul 1
Obținerea complexului entomologie standardizat în acizi grași ω-3 și ω-6 kg biomasă decongelată și omogenizată, de larve Lymantria dispar, se supune operației de extracție într-un omogenizator anti-ex, în raport 1:25, timp de 1 h, cu agitare ușoară la 50 rpm; extractul apos se colectează prin decantare și filtrare pe filtru de hârtie industrială și biomasa rămasă se supune, în continuare, extracției cu alcool etilic 70%, în raport 1:15, timp de 2 h, cu agitare ușoară la 50 rpm; extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare și filtrare, și biomasa rămasă se supune extracției cu hexan în raport 1:7, cu agitare la 50 rpm, timp de 4 h, după care extractul organic se colectează, iar biomasa rămasă pe filtru în cantitate de 320 g se consideră reziduu. Extractele selective obținute în cele trei etape ale procesului se prelucrează separat prin concentrare sub vid, se reunesc sub formă de extract moale, și se supun operației de uscare protejată sub vid, la 80 mbari și 40°C. Complexul entomologie standardizat obținut în cantitate de 650 g are aspectul unei de pulberi galben-cafenii, standardizată în conținutul de acizi grași totali de minimum 3%, din care ω-3 și ω-6 de 29% din total și proteine solubile de 24%.
Exemplul 2
Obținerea produsului medicamentos sub formă de ovule
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat în acizi grași ω-3 și ω-6, în concentrație 1,00%, condiționat sub formă de ovule.
Formula de condiționare: ........................................ g/100 g
- Propilenglicol ..................................................... 5
- Polietilenglicol 400 ................................................ 3,2
- Complex entomologie standardizat ...................................0,1
- Suppocire AM...................................................87,5
- Polisorbat 80.....................................................3,9
- Metilparaben.....................................................0,2
- Propilparaben....................................................0,1 într-un vas de omogenizare, se dizolvă baza de ovule, la viteza de rotație de 1000 rpm, timp de 10 min, la temperatura 50°C; se adaugă conservanții și se continuă agitarea la o viteză de rotație de 100 rpm, timp de 60 min. Se răcește amestecul la 25°C și se adaugă complexul entomologie standardizat sub agitare, la viteza de rotație de 100 rpm, timp de 60 min. La sfârșitul procesului, masa de ovule se ambalează în ambalaj primar pentru ovule.
Exemplul 3
Obținerea produsului medicamentos sub formă de supozitoare
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat, îmbogățit în acizi grași ω-3 și ω-6, în concentrație 1,00%, condiționat sub formă de supozitoare.
Formula de condiționare: ........................................ g/100 g
- Masa Witepsol S 55 ............................................... 95
- Glicerol.......................................................... 3
- Aerosil........................................................... 2
- Complex entomologie standardizat ...................................0,1
RO 130740 Β1 într-un vas de omogenizare se dizolvă baza de supozitoare la viteza de rotație de aproximativ 1300 rpm, timp de 10 min, la temperatura 50°C; se adaugă glicerolul și se continuă agitarea la o viteză de rotație de aproximativ 500 rpm, timp de 5 min. în masa fluidificată se adaugă complexul entomologie standardizat, sub agitare, la viteza de rotație de 200 rpm, timp de 20 min. La final, se adaugă aerosilul și se continuă agitarea la o viteză de rotație de aproximativ 500 rpm, timp de 15 min. Masa fluidificată și omogenizată se toarnă în forme. După răcire, masa omogenă obținută se ambalează în ambalaj primar pentru supozitoare.
Exemplul 4
Obținerea produsului medicamentos sub formă de unguent
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat, îmbogățit în acizi grași ω-3 și ω-6, în concentrație 1,00%, condiționat sub formă de unguent.
Formula de condiționare: ........................................ g/100 g
- Ceară albă ....................................................... 5
- Vaselina albă .................................................... 59
- Parafina lichidă................................................... 25
- Sesquioleat de sorbitan ............................................ 10
- Complex entomologie............................................... 1
Baza de unguent se prepară prin topirea componentelor pe baia de apă la o temperatură de 60°C. Se adaugă complexul entomologie standardizat în masa fluidificată, se amestecă și se omogenizează până la răcire.

Claims (3)

1. Complex entomologie standardizat, caracterizat prin aceea că se prezintă sub forma unei pulberi omogene de culoare galben-cafenie, cu un conținut total de acizi grași de 1 ...3%, dintre care acizii α-linolenic (ω-3) și linoleic (ω-6) în proporție de minimum 25% din total, și proteine solubile de minimum 20%, procentele fiind exprimate în greutate.
2. Procedeu de preparare a unui complex entomologie standardizat definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că biomasa de larve de insecte din ordinul Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc.) și Coleoptere (Tenebrio Molilor, Tenebrio opacus, etc.), decongelată și omogenizată, se supune operației de extracție cu apă purificată, în raport 1:20...1:30 în greutate, timp de 1...2 h, extractul apos se colectează prin decantare și filtrare, iar biomasa rămasă se supune, în continuare, extracției cu alcool etilic 70%, în raport 1:10...1:20, timp de 1 ...2 h, extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare și filtrare, iar biomasa rămasă se supune extracției cu un solvent organic de tipul acetonă, hexan, ciclohexan, alcool etilic 96% în raport 1:5...1:10 în greutate, timp de 2...4 h, după care extractul organic se colectează, pulberea rămasă se consideră reziduu, iar extractele selective obținute în cele trei etape ale procesului și prelucrate separat prin concentrare sub vid se reunesc în instalația de concentrare, sub formă de extracte moi, urmată de etapa de uscare protejată sub vid, obținându-se complexul entomologie standardizat, sub formă de pulbere galben-cafenie.
3. Compoziție medicamentoasă cu efect de inhibare a eliberării citokinelor proinflamatorii asociată cu factori de semnalizare intracelulară care modulează proliferarea aberantă a celulelor displazice, caracterizate prin aceea că are un conținut de 0,1...10% complex entomologie standardizat definit în revendicarea 1, condiționat sub formă de cremă, unguent, capsule, ovule sau supozitoare cu ingrediente specifice uzuale.
ROA201500208A 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine RO130740B1 (ro)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RO130740A0 RO130740A0 (ro) 2015-12-30
RO130740B1 true RO130740B1 (ro) 2017-07-28

Family

ID=54979977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Country Status (1)

Country Link
RO (1) RO130740B1 (ro)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4062903A4 (en) * 2018-07-19 2023-05-03 Ciuhrii, Ceslav ACTIVE COMPLEX OF LYMANTRIA DISPAR LARVAE AND METHOD OF PRODUCTION THEREOF

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4062903A4 (en) * 2018-07-19 2023-05-03 Ciuhrii, Ceslav ACTIVE COMPLEX OF LYMANTRIA DISPAR LARVAE AND METHOD OF PRODUCTION THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
RO130740A0 (ro) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sharifi‐Rad et al. Phytochemical constituents, biological activities, and health‐promoting effects of the genus Origanum
Premratanachai et al. Review of the anticancer activities of bee products
Fan et al. Trilobatin attenuates the LPS-mediated inflammatory response by suppressing the NF-κB signaling pathway
Zhang et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Chaetoglobosin Vb in LPS-induced RAW264. 7 cells: Achieved via the MAPK and NF-κB signaling pathways
KR20120065276A (ko) 지질 조성을 조정하기 위한 조성물 및 방법
Fallah-Rostami et al. Immunomodulatory activity of aged garlic extract against implanted fibrosarcoma tumor in mice
CA2555296A1 (en) Composition of labdane diterpenes extracted from andrographis paniculata, useful for the treatment of autoimmune diseases, and alzheimer disease by activation of ppr-gamma receptors
Yang et al. Inhibitory effect of litchi (Litchi chinensis Sonn.) flower on lipopolysaccharide-induced expression of proinflammatory mediators in RAW264. 7 cells through NF-κB, ERK, and JAK2/STAT3 inactivation
KR102182724B1 (ko) 풀무치 추출물을 함유하는 항염증용 조성물
Afroz et al. Physical properties of honey
Kapare et al. Nutritional and therapeutic potential of propolis: a review
Wang et al. Inhibitory effect of polysaccharides isolated from Angelica sinensis on hepcidin expression
Li et al. Houttuynia cordata polysaccharide alleviates chronic vascular inflammation by suppressing calcium-sensing receptor in rats
CN105440103A (zh) 从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途
KR20210053575A (ko) 며느리배꼽을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 및 치료용 조성물
RO130740A0 (ro) Procedeu de obţinere a unui complex entomologic standardizat şi compoziţii medicamentoase pe baza acestuia
Cui et al. Aqueous extract of Zanthoxylum schinifolium elicits contractile and secretory responses via β1-adrenoceptor activation in beating rabbit atria
Tawfik Anti-aggregatory effect of boswellic acid in high-fat fed rats: involvement of redox and inflammatory cascades
KR20210011051A (ko) 풀무치 추출물을 함유하는 신경염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20180064103A (ko) 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물
Khosravi et al. Immunomodulatory efficacy of ethanol extract of propolis on tumor-bearing mice with disseminated candidiasis
JP2010202569A (ja) 抗アレルギー及び抗炎症用組成物
Lampronti et al. Inhibitory effects of medicinal plant extracts on interactions between DNA and transcription factors involved in inflammation
JP5548379B2 (ja) 花粉荷を含有する抗ヒスタミン剤
Kim et al. Evaluation of anti-inflammatory activities and mechanisms of microalga Phaeodactylum tricornutum