RO130740A0 - Procedeu de obţinere a unui complex entomologic standardizat şi compoziţii medicamentoase pe baza acestuia - Google Patents

Procedeu de obţinere a unui complex entomologic standardizat şi compoziţii medicamentoase pe baza acestuia Download PDF

Info

Publication number
RO130740A0
RO130740A0 ROA201500208A RO201500208A RO130740A0 RO 130740 A0 RO130740 A0 RO 130740A0 RO A201500208 A ROA201500208 A RO A201500208A RO 201500208 A RO201500208 A RO 201500208A RO 130740 A0 RO130740 A0 RO 130740A0
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
complex
standardized
entomology
collected
biomass
Prior art date
Application number
ROA201500208A
Other languages
English (en)
Other versions
RO130740B1 (ro
Inventor
Liliana Mânzatu
Veaceslav CIUHRII
Laura Olariu
Original Assignee
Biotehnos S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotehnos S.A. filed Critical Biotehnos S.A.
Priority to ROA201500208A priority Critical patent/RO130740B1/ro
Publication of RO130740A0 publication Critical patent/RO130740A0/ro
Publication of RO130740B1 publication Critical patent/RO130740B1/ro

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui complex entomologic standardizat, şi la o compoziţie medicamentoasă pe baza acestuia. Procedeul conform invenţiei constă în extracţia cu apă purificată a unei biomase decongelate şi omogenizate de larve de insecte din ordinul Lepidoptere şi Coleoptere, timp de 1...2 h, în raport biomasă apă de 1:20...30, extractul apos se colectează şi biomasa rămasă se supune succesiv extracţiei cu alcool etilic 70%, în raport 1:10...20, urmată de extracţie cu un solvent organic în raport 1:5...10, timp de 2...4 h, după care extractul organic se colectează, iar extractele obţinute se reunesc şi se concentrează sub formă de extracte moi, care se usucă sub vid, din care rezultă un complex standardizat de pulbere galben-cafenie. Compoziţia conform invenţiei are un conţinut de 0,1...10% complex standardizat şi ingrediente acceptabile farmaceutic pentru condiţionare.

Description

PROCEDEU DE OBȚINERE A UNUI COMPLEX ENTOMOLOGIC STANDARDIZAT SI COMPOZIȚII MEDICAMENTOASE PE BAZA ACESTUIA
Prezenta invenție se refera la o un procedeu de obținere a unui complex entomologie standardizat, imbogatit in acizi grași ω-3 si ω-6 prin extracție cu solventi selectivi de polaritati diferite, si la compoziții medicamentoase sub forma de crema, unguent, capsule, ovule si supozitoare pe baza acestuia cu efecte antiinflamatoare, antioxidante, antiproliferative asupra celulelor displazice si de reducere a permeabilității vaselor de sânge pentru celulele proinflamatorii.
Conform invenției se obțin :
- complex entomologie nou, standardizat, imbogatit cu acizi grași totali de 1-3% dintre care acizii α-linolenic (ω-3) si linoleic (ω-6) in proporție de minim 25% din total si proteine solubile de minim 20%, cu efect de inhibare a eliberării citokinelor proinflamatorii asociata cu factori de semnalizare intracelulara care modulează proliferarea aberanta a celulelor displazice; complexul entomologie standardizat se obține sub forma unei pulberi omogene de culoare galben-cafenie in cantitate de 50-60 g/100 g biomasa entomologica bruta,;
- compoziții medicamentoase sub forma de crema, unguent, capsule, ovule sau supozitoare, cu un continui de 0,1-10% complex entomologie standardizat condiționat cu ingrediente specifice uzuale.
Insectele reprezintă un grup foarte mare de organisme caracterizat printr-o uriașa productivitate si populații mari. Se estimează ca peste un milion de specii de insecte au fost descrise, alcătuind aproximativ 70% din totalul organismelor. Bogatia si diversitatea acestora a determinat utilizarea lor de către oameni atat ca hrana cat si in medicina tradiționala. Astfel, de peste 2000 de ani, medicina tradiționala chineza utilizează atat corpul insectei întreg cat si oualele, produsele si secrețiile insectelor pentru tratarea a diferite boli. De aceea obținerea din insecte a unor extracte cu proprietăți terapeutice se considera o direcție importanta pentru descoperirea de noi medicamente [1], începând cu anii 1970, s- a pus problema evaluării capacitatii nutriționale a diferitelor specii de insecte, in principal ca sursa importanta de proteine [2], Literatura științifica zoologica conține diferite date despre valoarea nutritiva a insectelor ce evidențiază o compoziție complexa al cărei continui procentual variaza in principal in funcție de specie. Astfel, proteinele totale care in mare parte formează exoscheletul insectelor se pot găsi intre 21% la larvele Oileus rimator si 80% la femelele adulte de Lymantria dispar, lipidele - constituente majore ale acestor organisme - pot fi regăsite in proporție de la 2,2% la termitele Nasuititermes comiger la 60% la/jXrvele ό\- 2 0 1 5 - - 0 0 2 0 8 2 4 -03* 2015
Galleria mellonella (L.); fibrele - care datorita similarității structurale dintre chitina (polimer de N-acetil glucozamina legate betal-4) si celuloza (polimer obtinut prin legarea beta 1-4 a beta Dglucopiranozei) sunt asimilate chitinei sau proteinelor sclerotizate - se pot găsi intre 0,12 3,89%, dar si 7,5 - 19% in funcție de specie; mineralele totale pot varia intre 2-21 mg % g; dintre acestea, calciul se poate regăsi intre 0,93 mg % g la pupa de Musca domestica si 5,1 mg % g la pupa de Musca autumnalis; regăsim de asemenea in cantitati apreciabile si fosforul, magneziu, sodiu, potasiu, clor, precum si aminoacizi esențiali: izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofan, valina. In ultima perioada de timp au aparat articole in reviste entomologice ce evidențiază preocuparea cercetătorilor de a utiliza insectele ca surse de medicamente noi, obținute prin bioinginerie pentru realizarea de produse antimicrobiene, anti-cancer, anti-angiogeneza, factori anti-coagulanti si de vindecare a rănilor [31 [4]. Numeroase insecte si artropode apar in farmacopeea medicinei tradiționale coreene, dar puține sunt cunoscute pentru utilizare in medicina moderna. Dintre acestea printre cele mai prescrise sunt Scolopendra spp utilizate pentru tratarea artritei. Majoritatea artropodelor sunt colectate sau crescute in peninsula Corea sau sunt importate in principal din China. Tradiția utilizării reprezintă baza prescripțiilor medicale, fiind susținuta si de atitudinea pozitiva a oamenilor fata de insecte in comparație cu celelalte culturi (vestice, europene) [5],
Literatura entomologica cuprinde in marea majoritate a cazurilor doar articole si studii experimentale la nivel de laborator, referitoare la biologia, biochimia, metabolismul, fiziologia insectelor si tratamentele tradiționale asiatice in care se folosesc. Pana in prezent se cunosc puține brevete ce valorifica insectele pentru obținerea de preparate cu aplicații in medicina umana.
Astfel, brevetul corean KR 20130041863 (A)-2013-04-25 propune o metoda de obținere unui derivat de heparina din insecte, ce presupune: imersarea insectelor intr-un solvent organic, îndepărtarea lipidelor, filtrarea si uscarea reziduului. Rezidul obtinut se supune hidrolizei enzimatice a proteinelor, îndepărtarea acestora, colectarea zaharurilor si obținerea glucozaminoglicanilor.
Brevetul CH603162 (A5) / 1978-08-15- propune utilizarea unui extract hormonal uleios din insecte in produse cosmetice creme, unguente, emulsii, obtinut din crisalida lepidopterelor. Extractul se refera la un preparat ce conține hormonul juvenil, obtinut printr-o metoda ce presupune parcurgerea mai multor etape: uscarea insectelor, pulverizarea acestora, amestecarea cu un material poros, extragerea uleiului sub presiune, amestecarea cu alte grăsimi lichide ; extractul este utilizat pentru stimularea creșterii. / \· * Ο 1 5 - - 0 0 2 0 8 2 4 -03- 2015
RO 118114Β1 se refera la un procedeu de obținere a unei substanțe farmaceutic active si a unei compoziții farmaceutice pentru tratarea infecțiilor hepatice obținute din insecta Galleria mellonella, substanța activa este reprezentata de un complex de aminoacizi esențiali.
RO 122332 Bl se refera la o compoziție farmaceutica sub forma de supozitoare sau ovule pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostata sau a fibromului uterin in care se realizează o asociere a extractului uscat 1% de Lymantria dispar cu 82% unt de cacao, 10% apa distilata, 2,68% hexil, si alti aditivi. Substanța activa este reprezentata de o pulbere atomizata sau liofilizata, fara sa se precizeze compoziția chimica, fiind obtinuta din Lymantria dispar colectata din mediul natural.
RO 123617 Bl revendica un procedeu de preparare a unei substanțe biologic active din țesuturile de Lepidoptere, in special Lymantria dispar si Galleria mellonella, si o compoziție farmaceutica sub forma de ovule sau supozitoare pentru tratarea hemoroizilor, adenomului de prostata, infecții virale, bacteriene, micotice , formațiuni tumorale. Substanța activa este reprezentata de proteinele inhibitoare de sinteza specifice, ce conțin 15 aminoacizi esențiali, si se prezintă ca o pulbere atomizata de culoare gri deschis cu o umiditate de 4-5%.
Brevetele MD 2787 (13) FI-2004.07.28, MD 2788 (13) Fl-2004.07.28 si MD 2789 (13) Fl-2004.07.28 propun 3 preparate entomologice cu efecte hepatoprotectoare si imunomodulatoare, antiinflamatoare si antioxidante si imunomodulatoare si antioxidante , obținute din Lepidoptere din diferite stadii de dezvoltare: oua cu pupe, larve, pupe, avand o compoziție asemanatoare, dar diferite procentual. Procedeul de obținere este comun, presupunând aceleași etape: maruntirea omogena a materialului entomologie, filtrarea, eliminarea apei prin liofilizare. Preparatele entomologice obținute conțin proteine, lipide, colesterol, trigliceride, amilaza, lipaza, antioxidanti, aminoacizi. In nici unul dintre brevete nu se evidențiază cărui component i se datoreaza efectul presupus.
Brevetul MD 4296 (13) Bl- se refera la un preparat din larve de Tenebrio molitor cu acțiune antioxidanta si la un produs farmaceutic pe baza acestuia. Preparatul obtinut prin extracția apoasa urmata de extracția cu etanol 70% si reunirea acestora, conține 45-80% extract hidroalcoolic liofilizat din Tenebrio molitor si restul vaselina pana la 100%. Preparatul farmaceutic, sub forma de supozitoare rectale conține 0,25 g extract in ulei de vaselina si 1,75 g gliceride sintetice/supozitor.
Din datele prezentate cu privire la stadiul tehnicii în domeniul obținerii unor substanțe sau produse bioactive entomologice rezultă următoarele: λ ί\-2 Ο 1 5 - - O 0 2 0 8 2 < -03- 2015
- domeniile terapeutice către care se adreseaza aceste preparate sunt: cosmetica - pentru stimularea creșterii parului; in terapeutica infecțiilor hepatice, virale, bacteriene, micotice sau pentru efectele hepatoprotectoare, imunomodulatoare, antiinflamatoare, anticoagulanta, in tratarea formațiunilor tumorale, hemoroizilor, adenomului de prostata si a fibromului uterin;
- in brevetele prezentate in stadiul tehnicii nu sunt prezentate date referitoare standardizarea in substanțele active si nici testele ce dovedesc eficacitatea terapeutica;
- procedeele de obținere a extractelor entomologice sunt diferite fata de cel din invenția propusa: KR 20130041863 (A)-2013-04-25 extracția cu un solvent organic si îndepărtarea lipidelor; MD 4296 (13) Bl extracția apoasa urmata de extracția cu etanol 70% si reunirea celor doua tipuri de extracte; CH603162(A5) 1978-08-15- extract hormonal uleios cu utilizări cosmetice.
Invenția propusa spre brevetare reprezintă o îmbunătățire a brevetului MD 4296 (13) Bl „Complex bioactiv din larvele de Tenebrio Molitor in ulei de vaselina, procedeu de obținere a acestuia si produs farmaceutic pe baza lui” . Conform brevetului MD 4296 (13) Bl complexul activ din biomasa entomologica bruta se obține in 2 trepte de extracție: prima apoasa, urmata de extracția cu etanol 70%, reunirea acestor extracte si liofîlizarea lor.
Problema tehnica pe care o rezolva prezenta invenție este obținerea din biomasa entomologica bruta a larvelor din insecte apartinand claselor Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc) si Coleoptere {Tenebrio Molitor, Tenebrio opacus, etc) a unei compoziții farmaceutice noi.
O alta problema tehnica pe care o rezolva invenția este imbunatatirea calitatii complexului entomologie prin aceea ca, prin utilizarea solventilor de polaritati diferite se realizează si extracția componentelor lipidice bioactive, alaturi de cele hidroalcoolice si hidrosolubile valorificandu-se toate substanțelor biologic active din biomasa entomologica.
Ca o consecința a îmbunătățirii calitatii complexului cu fracția lipidica, o alta problema tehnica pe care o rezolva aplicarea invenției este lărgirea gamei efectelor terapeutice antioxidante cu efecte antiproliferative asupra celulelor displazice si de reducere a permeabilității vaselor de sânge pentru celulele proinflamatorii, dovedite prin teste specifice.
Procedeul de obținere a complexului entomologie imbogatit consta in extracția selectiva in trei trepte a biomasei entomologice - obținute din larvele insectelor decongelate si omogenizate -: prima etapa de extracție se realizează cu apa purificata, urmata de extracția cu alcool etilic 70% si extracția a treia cu alcool etilic 96% sau cu alt solvent organic/de tipul yfn / 4
4- 2 0 1 5 -- 0 0 2 0 8 2 < -03- 2015 acetona, hexan, ciclohexan pentru extracția fracției lipidice. Cele trei extracte obținute se concentrează separat cu recuperarea solventilor si se reunesc in final înainte de a se supune operației de uscare protejata, sub vid, liofilizare sau atomizare. Complexul entomologie imbogatit se prezintă sub forma unei pulberi ușor higroscopice, galben-cafenii si este standardizat in acizi grași totali de minim 3% din care ω- 3 si ω-6 de minim 25% si proteine totale de min. 20%.
Conform invenției procedeul de obținere a complexului entomologie imbogatit consta in: biomasa decongelată si omogenizata de larve de insecte apartinand claselor Lepidoptere (Lymantria dispar, Bombyx mori, etc) si Coleoptere (Tenebrio Molitor, Tenebrio opacus, etc), se supune operației de extracție cu apa purificata, in raport 1:20...1:30 timp de 1...2 ore, extractul apos se colectează prin decantare si filtrare si biomasa ramasa se supune in continuare extracției cu alcool etilic 70% in raport 1:10...1:20, timp de 1...2 ore, extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare si filtrare si biomasa ramasa se supune extracției cu alcool etilic 96% in raport 1:5...1:10, timp de 2...4 ore după care extractul organic se colectează iar pulberea ramasa se considera reziduu. Extractele selective obținute in cele trei etape ale procesului se prelucrează separat prin concentrare sub vid, si se reunesc in instalația de concentrare, sub forma de extracte moi, urmata de etapa de uscare protejata sub vid. Complexul entomologie imbogatit se prezintă sub forma de pulbere galben-cafenie standardizata in conținutul de acizi grași totali de minim 3% din care ω-3 si ω-6 de minim 25% din total si proteine solubile de minim 20%. Compozițiile medicamentoase sub forma de crema, capsule, ovule sau supozitoare conform invenției sunt constituite din asocierea in proporție 0,1...10% a complexului entomologie imbogatit standardizat, cu ingredienti specifici.
Comparativ cu produsele obținute conform stadiului tehnicii noul produs prezintă un potențial terapeutic ridicat datorat asocierii componentelor existente in cele 3 tipuri de extracte apos, hidroalcoolic si lipofil, valorifîcandu-se toate substanțele solubile, biologic active, din biomasa entomologica. Complexul entomologie imbogatit, obtinut conform invenției prin extracția cu solventi selectivi este standardizat in componente biologic active a căror activitate a fost evidențiata prin teste specifice.
Procedeul de obținere al complexului entomologie imbogatit cu fracția lipidica este reproductibil si se poate aplica si la nivelul industriei farmaceutice.
Datorita standardizării complexului in componente biologic active si compozițiile medicamentoase sunt reproductibile in ceea ce privește compoziția chimica. // ^ 2 0 1 5 -- 0 0 2 0 8 2 4 -03- 2015
ACTIVITATEA BIOLOGICA IN VITRO
In ceea ce privește demonstrarea activitatii biologice a complexului entomologie standardizat, aceasta vizeaza aportul fracției lipidice la imbunatatirea acțiunii terapeutice.
Testele de evidențiere a acțiunii biologice pentru complexul lipidic entomologie au constat in analiza profilului citotoxic si de acțiune specifica in vitro prin studii ale metabolismului celular, statusului proliferativ si al acțiunii antiproliferative, de inducere a apoptozei celulare si mecanisme moleculare, antiinflamatoare si antioxidante.
Determinarea efectelor componentelor bioactive a fost efectuata pe linii standardizate de celule umane de tip hiperplazie de prostata, respectiv adenocarcinom de prostata si celule endoteliale vasculare. Aceste materiale biologice reprezintă modele adecvate pentru investigarea desfășurării proceselor fiziologice si surprinderea declanșării / inhibării unor parametri celulari si moleculari, ca urmare a acțiunii complexelor entomologice in afecțiunile tinta.
După determinări de citotoxicitate specifica, comportamentul celular a fost evaluat printro serie de teste si analize care susțin efectele produsului revendicat conform invenției:
1) Studii de activitate metabolica - au evidențiat ca fracția lipidica manifesta efectul citotoxic începând cu concentrația 100 pg/ml.
2) Monitorizarea secventialitatii ciclului celular prin marcarea ADN în vederea analizei prin citometrie în flux a ciclului celular (kitul “Cycle Test™ Plus”) si a stadiilor timpurii si târzii ale apoptozei prin marcare cu iodura de propidiu si anexina (kit Annexin V-Fitc Apoptosis Detection, BD Pharmingen)
a) Ciclu Celular - Acțiunea antitumorala a unui compus se manifesta si prin inhibarea secventialitatii ciclului celular, reducând fazele de diviziune (faza G0/G1 in care are loc duplicarea conținutului celular cu excepția cromozomilor, faza S, sinteza ADN si replicarea materialului genetic si faza G2/M). Probele biologice au constat in fracție lipidica in intervalul de concentrații: lpg/ml-lO pg/ml, analizate fata de martorul de cultura si martorul pozitiv de inhibiție a proliferării si diviziunii celulare, metotrexat (6μΜ).
Fracția lipidica reduce in maniera doza - efect procentul celular in punctele cheie ale procesului de diviziune (Faza S - preponderent si G2/M), astfel incat indicele de proliferare scade fata de martorul de cultura cu 25%, 18% si respectiv 14%. Prin aceasta acțiune este încetinit procesul de diviziune celulara a liniei DU 145 de adenocarcinom de prostata.
<ν 2 Ο15 - - ο Ο 2 Ο 8 I < -03- 20Κ
Tabel 1. Secventialitatea ciclului celular indusa de extractul entomologie pe linia DU145
G0/G1 %S %G2/M indicele de proliferare fata de martor (%)
Martor de cultura 71,8 18,8 9,25 100
Methotrexat 6μΜ 72,03 26,7 0,24 96,42
Fracție lipidica 10pg/ml 76,54 14,1 7,29 75
Fracție lipidica 5pg/ml 77,11 15,6 7,45 82
Fracție lipidica lpg/ml 75,34 16,1 8,68 86
CES lOpg/ml 76,26 15,4 8,51 82,14
CES 5pg/ml 78,75 14,7 6,67 75
CES = Complex entomologie standardizat
b) Apoptoza- Inducerea apoptozei in disfunctiile hiperproliferative este unul dintre principalele mecanisme de intervenție terapeutica. Modelul experimental de testare a acțiunii fracției lipidice evidențiază procesul apoptotic de la inițiere (extemalizarea fosfatidil-serinei membranare) si pana in etapele târzii caracterizate de dezintegrarea membranei celulare:
Tabel 2: Apoptoza linie DU145 indusa de extract entomologie
Celule vii (%) Celule apoptoza timpurie (%) Celule apoptoza târzie (%) Celule necroza (%) Indice de variație a celulelor apoptotice fata de martor
Martor de cultura 95,35 1,32 3,06 0,27 100
Martor pozitiv 81,34 9,91 6.71 2,03 379
Fracție lipidica 10pg/ml 86,83 3,74 8,58 0,84 281
Fracție lipidica 5pg/ml 90,09 3,78 5,58 0,54 213
CES 30ug/ml 92,03 2,19 5,36 0,4 172,37
CES 10 ug/ml 91,37 3,21 4,87 0,54 184,47
CES 5ug/ml 92,33 2 4,95 0,72 158,67
Acțiunea extractului lipidic, deși inferioara martorului pozitiv, se manifesta in maniera doza -efect, inducând trecerea celulelor in apoptoza timpurie si târzie depășind dublul celulelor induse in apoptoza de către martorul de cultura, conform indicelui de variație din tabelul 2.
3) Evaluarea activitatii antiinflamatorii prin determinarea nivelului de eliberare de citokine (IL6 si IL8) in mediul extracelular utilizând DU-145.(kitul CBA - Human Soluble Protein Flex Set prin tehnica de multiplexare)
Citokinele IL6 si IL8 sunt factori de semnalizare a statusului proinflamator. IL6 este o pleiotropica implicata in progresia neoplazica a diferitelor categorii de tumori, ca mediator al morbidității in cancerul de prostata. IL6 este secretata de celulele de prostata normale si tumorale. In timpul progresiei tumorale, IL-6 suferă o tranziție funcționala de la rolul de indicator al dezvoltării inflamatiei Ia cel de stimulator pentru proliferarea tumorala, astferincat
Ο 1 5 - - 0 0 2 0 8 2 4 -03-2015 inhibiția acestei citokine este o cale terapeutica de încetinire sau stopare a invaziei metastatice. IL8 este responsabila de creșterea tumorala androgen-independenta, asociata in cancerul de prostata cu chemorezistenta, creșterea tumorii si progresia angiogenica.
S-a realizat un model experimental care mimeaza procesul inflamator „in vitro” prin stimularea celulelor tumorale timp de 24 ore cu un agent pro-inflamator sistemic, TNFa de concentrație 15ng/ml. Efectul va fi estimat procentual, ca variație fata de martorul de cultura. Dexametazona 200ng/ml este martorul pozitiv cu acțiune antiinflamatorie
Tabel 3. Nivelul de eliberare a citokinelor proinflamatorii sub influenta extractului entomologie
IL8 (pg/ml) IL6 (pg/ml)
nestimulate stimulate TNFa 15ng/ml Indice de variație fata de martor (%) nestimulate stimulate TNFa 15ng/ml Indice de variație fata de martor (%)
Martor de cultura 39151,09 213199,28 100 2309,72 3964,19 100
Colchicina ΙμΜ 13798,97 14740,99 6,91 908,94 1237,16 31,20
Colchicina 0,5μΜ 9816 11240,15 5,27 1060,23 1217,16 30,70
Dexamethazona 200ng/ml 793,3 3488,38 1,63 252,82 740,04 18,66
Fracție lipidic 10gg/ml 7117,51 7867,66 3,69 799,38 440,16 11,10
Fracție lipidica 5gg/ml 8395,15 25984,89 12,18 1546,74 2484,53 62,67
Fracție lipidica lgg/ml 8521,49 31860,89 14,94 2532,81 3854,77 97,23
CES 30 pg/ml 8058,47 17619,25 8,26 1940,62 2613,83 65,93
CES 10 gg/ml 9153,25 41818,09 19,61 2597,57 5977,67 150
EP 79,78
EP* extract hidric si hidroetanolic obtinut conform invenției MI) 4296 (13) Bl
Se remarca acțiunea antiinflamatorie in maniera doza efect a fracției lipidice, care la concentrația de 10 pg/ml inhiba semnificativ eliberarea de citokine extracelulare in mediul de cultura si anume, cu 88 % pentru nivelul IL6 si 94% pentru IL8. Valorile obținute pentru aceste citokine, in corelare cu martori de sinteza cunoscuti pentru activitățile biologice antitumorale, susțin efectul in vitro al produsului entomologie asupra moleculelor ce induc progresia celulara si mecanisme auxiliare in tumorile de prostata.
4) Evaluarea VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) - factor pro-angiogenic de inducere si dezvoltare a proceselor metastatice
Neovascularizatia tumorii este considerata a fi mediata de factori solubili eliberați de celulele tumorale ce pot deveni markeri utili de monitorizare a activitatii celulelor tumorale. Conceptul de tratare a tumorilor prin inhibiția angiogenezei a luat o mare amploare după descoperirea /7 /1 8 i
¢-2015-- 002082 4 -03- 2015 moleculelor pro-angiogenice de tipul VEGF si prin urmare, utilizarea lor ca potențiale tinte terapeutice. Exista o semnalizare pro-angiogenica a celulelor tumorale bazata pe eliberarea extracelulara a factorului VEGF, si un răspuns la acest stimul al celulelor endoteliale vasculare normale care încep sa prolifereze si sa formeze o microvasculatura ce va servi la hranirea tumorii intr-un nou situs metastatic. Modelul experimental de testare a inhibiției VEGF de către fracția lipidica in celulele de adenocarcinom de prostata DU145 a avut la baza mimarea procesului inflamator „in vitro”, asociat cu invazia tumorala prin stimulare cu TNFa 15ng/ml timp de 24h.
Tabel 4: Eliberarea VEGF sub acțiunea produsului entomologie
,--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- VEGF (pg/ml)
nestimulate stimulate TNF alfa 15ng/ml Indice de variație fata de martor %
Martor de cultura 555,61 686,25 100
Colcbicina ΙμΜ 245,25 102,19 14,9
Colchicina 0,5 μΜ 179,3 78,55 11,44
Dexamethazona 200ng/ml 369,12 285,1 41,54
Fracție lipidica lOpg/ml 493,25 152,59 22,23
Fracție lipidica 5pg/ml 728,04 481,58 70,17
Fracție lipidica lpg/ml 793,63 552,67 80,53
CES 30pg/ml 754,1 336,96 49,10
CES lOpg/ml 874,26 567,22 82,65
CES 5pg/ml 793,63 606,93 88,44
Studiile efectuate rezumate in Tabel 4 evidențiază efectul remarcabil al fracției lipidice direct proporțional cu concentrația testata, prin scăderea pregnanta cu 77 %, 30%, respectiv 20%, a concentrației de VEGF fata de martorul de cultura. Acestea dovedesc acțiunea specifica antiangiogenica in vitro a produsului prin care se inhiba propagarea procesului tumoral pana la nivel de mecanisme de metastazare a adenocarcinomului de prostata.
5) Model de expresie genica pentru molecule implicate in mecanismele de inițiere si propagare a afecțiunilor prostatei
Acțiunea fracției lipidice (10pg/ml) a fost evaluata si prin metoda RT-PCR din punct de vedere al profilului anti-proliferativ cuantificat prin nivelul expresiei genelor codificatoare a 92 de molecule resposabile de mecanismele implicate in perturbările patologice ale prostatei. Din multitudinea de gene analizate cu impact asupra cailor de propagare a semnalelor proliferative ce au loc in etapele de inițiere/ propagare a afecțiunilor prostatei, fracția lipidica manifesta efect semnificativ de supresare a expresiei unor oncogene care participa la declanșarea proceselor tumorale: FZD-1 - ffizzled family receptor 1 cu rol in creșterea celulelor prostatice cu proliferare
Λ- 2 Ο 1 6 - - 0 0 2 0 8 2 4 -03-2025
3(3 genelor corelate cu blocarea ciclului celular si declanșarea apoptozei. fiind frecvent detectata si asociata cu proliferarea celulara si creșterea in volum a prostatei; VEGFA - factorul de creștere a endoteliului vascular A este implicat in promovarea proliferării celulelor endoteliale, in permeabilitatea vasculara si angiogeneza care reprezintă etape critice in creșterea si dezvoltarea aberanta a volumului prostatei displazice. VEGFA este secretat de celulele adenocarcinomatoase de prostata ceea ce reflecta un nivel crescut la nivel sangvin de VEGF - fiind considerat un potențial marker pentru anomaliile proliferative de prostata; LEFI - factorul de legare a enhancer-ului limfoid 1 determina expresia receptorilor androgeni si implicit creșterea si invazia celulelor de prostata aberant proliferative. Se remarca efectul fracției lipidice de supresare a expresiei genelor cu potențial oncogen, in special a VEGFA, ceea ce sugerează acțiunea de blocare a transmiterii unor semnale proliferative in celulele de prostata displazice ca urmare a implicațiilor fiziopatologice ale oncogenelor supresate.
Pe de alta parte, complexul entomologie standardizat are efect de suprareglare a unor gene cu rol de supresor tumoral evidențiind un sinergism de acțiune cu funcțiile genelor supresor tumorale de tipul: CDKN1B - cyclin-dependent kinase inhibitor 1B care funcționează ca un punct de control pentru ciclu celular Gl-S; APC- adenomatous polyposis coli, are un rol critic in caile de semnalizare proliferative; TP53 codifica o molecula cheie cu rol de supresor tumoral care are potențial de reacție la diferite forme de stres celular prin activarea genelor implicate in blocarea creșterii celulare aberante si inducerea apoptozei.
Acțiunea fracției lipidice de suprareglare asupra principalei proteine cu rol de supresor tumoral TP53 demonstrează profilul inhibitor asupra proliferării aberante a celulelor de prostata.
Concluzii privind activitatea biologica in vitro a complexului entomologie standardizat: Fracția lipidica are o activitate biologica in vitro care se înscrie in algoritmul proceselor proliferative, antioxidante si antiinflamatorii care susține utilizarea materiei entomologice in terapeutica farmaceutica si dermatocosmetica.
In contextul proliferării celulare cu transformări hiperplazice si aberante, complexul entomologie sstandardizat are efect antitumoral prin acțiune antiproliferativa, încetinind procesul de multiplicare a materialului genetic si astfel procesul de diviziune, fiind si un inductor de apoptoza. Produsul are intervenție pronunțata in procese inflamatorii asociate cu factori de semnalizare extracelulara, inițiere si dezvoltare tumorala si dovedește efect antiinflamator semnificativ prin inhibiția interleukinelor pana la nivelul inflamatiei cronicizate asociata cu un prognostic negativ in tumorile de prostata. Acțiunea produsului se remarca si prin efectul ^“2015·- D Ο 2 Π R 2 4 -03- 2015 antiangiogenic, prin inhibarea factorului VEGF asociata cu progresia tumorii de la nivel local, la cel metastatic.
Toate aceste acțiuni demonstrate la nivel celular sunt susținute de răspunsul molecular al fracției lipidice, la nivel de gena, constând in modularea expresiei acestora către un status metabolic ameliorat cu reducerea efectelor displazice dezvoltării aberant proliferative a celulelor de prostata.
Exemplul nr 1. Obținerea complexului entomologie standardizat in acizi grași ω-3 si ω-6.
kg biomasa decongelată si omogenizata, de larve Lymantria dispar se supune operației de extracție intr-un omogenizator anti-ex, in raport 1:25 timp de lora, cu agitare ușoara 50 rpm; extractul apos se colectează prin decantare si filtrare pe filtru de hârtie industriala si biomasa ramasa se supune in continuare extracției cu alcool etilic 70% in raport 1:15 timp de 2 ore, cu agitare ușoara 50 rpm; extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare si filtrare si biomasa ramasa se supune extracției cu hexan in raport 1:7 cu agitare la 50 rpm timp de 4 ore după care extractul organic se colectează iar biomasa ramasa pe filtru in cantitate de 320 g se considera reziduu. Extractele selective obținute in cele trei etape ale procesului se prelucrează separat prin concentrare sub vid , se reunesc sub forma de extract moale si se supune operației de uscare protejata sub vid la 80 mbari si 40°C. Complexul entomologie standardizat obtinut in cantitate de 650 g are aspectul unei de pulberi galben-cafenii standardizata in conținutul de acizi grași totali de minim 3% din care ω- 3 si ω-6 de 29% din total si proteine solubile de 24%.
Exemplul nr 2. Obținerea produsului medicamentos sub forma de ovule.
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat in acizi grași ω-3 si ω-6 in concentrație 1.00 %, condiționat sub formă ovule.
Formula de condiționare: g/100 g
- Propilenglicol5
- Polietilenglicol 4003,2
- Complex entomologie standardizat0,1
- Suppocire AM87,5
- Polisorbat 803,9
- Metilparaben0,2
- Propilparaben0,1
Intr-un vas de omogenizare se dizolva baza de ovule, la viteza de rotatie de 1000 rpm, timp de 10 minute, la temperatura 50 °C; se adauga conservantii si se continua agitarea la o viteza de rotatie de 100 rpm, timp de 60 minute. Se răcește amestecul la 25 °C si se adauga complexul entomologie standardizat sub agitare, la viteza de rotatie de 100 rpm, timp de 60 minute. La sfârșitul procesului masa de ovule se ambaleaza in ambalaj primar pentru ovine.
Λ-1 ί 1 5 - - 0 0 2 0 8 2 < -03- 2015
Exemplul nr 3 Obținerea produsului medicamentos sub forma de supozitoare.
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat, imbogatit in acizi grași ω-3 si ω-6, in concentrație 1.00 %, condiționat sub formă supozitoare.
Formula de condiționare: g/100g
- Masa Witepsol S 5595
- Glicerol3
- Aerosil2
- Complex entomologie standardizat0,1
Intr-un vas de omogenizare se dizolva baza de supozitoare la viteza de rotatie de aprox. 1300 rpm, timp de 10 minute, la temperatura 50 °C; se adauga glicerolul si se continua agitarea la o viteza de rotatie de aprox. 500 rpm, timp de 5 minute In masa fluidificata se adauga complexul entomologie standardizat sub agitare, la viteza de rotatie de 200 rpm, timp de 20 minute. La final, se adauga aerosilul si se continua agitarea la o viteza de rotatie de aprox. 500 rpm, timp de 15 minute. Masa fluidificata si omogenizata se toama in forme. După răcire, omogena obtinuta se ambaleaza in ambalaj primar pentru supozitoare.
«r 4. Obținere?. produsului medicamentos sub forma de unguent:
Produs medicamentos, conținând ca substanțe biologic active complexul entomologie standardizat, imbogatit in acizi grași ω-3 si ω-6, in concentrație 1 00 %, condiționat sub formă unguent.
Formula de condiționare g/100 g
- Ceara alba 5
- Vaselina alba59
- Parafina lichida25
- Sesquioleat de sorbitan10
- Complex entomologie1
Baza de unguent se prepara prin topirea componentelor pe baia de apa la o temperatura de 60grade C. Se adauga complexul entomologie standardizat in masa fluidificata, se amesteca si se omogenizează pana la răcire.

Claims (3)

  1. REVENDICĂRI
    1. Procedeu de obținere a unui complex entomologie standardizat caracterizat prin aceea ca biomasa de larve de insecte din ordinul Lepidoptere (Iymantria dispar, Bombyx mori, etc) si Coleoptere (Tenehrio Molitor, Tenehrio opacus, etc) decongelată si omogenizata se supune operației de extracție cu apa purificata, in raport 1:20... 1:30 timp de 1...2 ore, extractul apos se colectează prin decantare si filtrare si biomasa ramasa se supune in continuare extracției cu alcool etilic 70% in raport 1:10. .1:20, timp de 1...2 ore, extractul hidroalcoolic se colectează prin decantare si filtrare si biomasa ramasa se supune extracției cu un solvent organic de tipul acetona, hexan, ciclohexan, alcool etilic 96% in raport 1:5 .1:10, timp de 2...4 ore după care extractul organic se colectează, pulberea ramasa se considera reziduu, iar extractele selective obținute in cele trei etape ale procesului si prelucrate separat prin concentrare sub vid se reunesc in instalația de concentrare, sub forma de extracte moi, urmata de etapa de uscare protejata sub vid, obtinandu-se complexul entomologie standardizat sub forma de pulbere galben-cafenie.
  2. 2. Complex entomologie standardizat, obtinut conform revendicării 1, caracterizat prin aceea ca se prezintă sub forma unei pulberi omogene de culoare galben-cafenie cu un continui total de acizi grași de 1-3% dintre care acizii α-linolenic (ω-3) si linoleic (ω-
    6) in proporție de minim 25% din total si proteine solubile de minim 20%, cu efect de inhibare a eliberării citokinelor proinflamatorii asociata cu factori de semnalizare intracelulara care modulează proliferarea aberanta a celulelor displazice.
  3. 3. Compoziții medicamentoase caracterizate prin aceea ca au un continui de 0,1... 10% complex entomologie standardizat definit in revendicarea 1, condiționate sub forma de crema, unguent, capsule, ovule sau supozitoare cu ingrediente specifice uzuale.
ROA201500208A 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine RO130740B1 (ro)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RO130740A0 true RO130740A0 (ro) 2015-12-30
RO130740B1 RO130740B1 (ro) 2017-07-28

Family

ID=54979977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA201500208A RO130740B1 (ro) 2015-03-24 2015-03-24 Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine

Country Status (1)

Country Link
RO (1) RO130740B1 (ro)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD4713C1 (ro) * 2018-07-19 2021-04-30 Чеслав ЧУХРИЙ Procedeu de obţinere a complexului activ din larve de Lymantria dispar

Also Published As

Publication number Publication date
RO130740B1 (ro) 2017-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Miao et al. The anti-inflammatory potential of Portulaca oleracea L.(purslane) extract by partial suppression on NF-κB and MAPK activation
Zhang et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Chaetoglobosin Vb in LPS-induced RAW264. 7 cells: Achieved via the MAPK and NF-κB signaling pathways
Yang et al. Induction of Nrf2-mediated genes by Antrodia salmonea inhibits ROS generation and inflammatory effects in lipopolysaccharide-stimulated RAW264. 7 macrophages
Lee et al. Aqueous extract of Codium fragile suppressed inflammatory responses in lipopolysaccharide-stimulated RAW264. 7 cells and carrageenan-induced rats
Hu et al. Senkyunolide I attenuates oxygen-glucose deprivation/reoxygenation-induced inflammation in microglial cells
CA2555296A1 (en) Composition of labdane diterpenes extracted from andrographis paniculata, useful for the treatment of autoimmune diseases, and alzheimer disease by activation of ppr-gamma receptors
Fallah-Rostami et al. Immunomodulatory activity of aged garlic extract against implanted fibrosarcoma tumor in mice
Wang et al. Stevioside inhibits inflammation and apoptosis by regulating TLR2 and TLR2-related proteins in S. aureus-infected mouse mammary epithelial cells
Zhang et al. Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats
Shen et al. Low-dose salinomycin inhibits breast cancer metastasis by repolarizing tumor hijacked macrophages toward the M1 phenotype
WO2019128498A1 (zh) 一种银杏二萜内酯组合物
Mumcuoglu et al. Ankaferd Blood Stopper induces apoptosis and regulates PAR1 and EPCR expression in human leukemia cells
Gao et al. Effect of spider venom on cell apoptosis and necrosis rates in MCF-7 cells
CN105440103A (zh) 从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用途
CN105120880B (zh) 包含含有大量活性成分的从东北婆婆纳中分离的纯化提取物或从此分离的化合物作为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病的活性成分的组合物及其用途
KR20210053575A (ko) 며느리배꼽을 포함하는 알레르기성 질환의 예방 및 치료용 조성물
Cui et al. Aqueous extract of Zanthoxylum schinifolium elicits contractile and secretory responses via β1-adrenoceptor activation in beating rabbit atria
JP2024504263A (ja) 敗血症を治療するための薬物組成物及びその使用
RO130740B1 (ro) Complex entomologic, procedeu de preparare a acestuia şi compoziţie medicamentoasă care îl conţine
CN111356468A (zh) 包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物
KR20180064103A (ko) 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물
JP5717129B2 (ja) ウィザノライド成分を組み合わせた抗癌剤
Khosravi et al. Immunomodulatory efficacy of ethanol extract of propolis on tumor-bearing mice with disseminated candidiasis
Lampronti et al. Inhibitory effects of medicinal plant extracts on interactions between DNA and transcription factors involved in inflammation
KR20090082739A (ko) 코디세핀을 유효성분으로 하는 혈관 평활근 세포의 이동 및증식 억제용 조성물