MD4663C1 - Aplicare a 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat în calitate de remediu contra bacteriilor fitopatogene - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la aplicarea compuşilor coordinativi de cupru în bază de izotiosemicarbazone în calitate de remediu antibacterian şi poate fi utilizată în agricultură.Conform invenţiei, compusul binuclear de cupru(II) hidrosolubil 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat manifestă o activitate bactericidă faţă de bacteriile fitopatogene şi poate fi utilizat sub formă de soluţii apoase cu concentraţii minime de 0,007% mas. pentru combaterea bacteriozei la plante.

Description

Invenţia se referă la aplicarea compuşilor coordinativi de cupru în bază de izotiosemicarbazone în calitate de remediu antibacterian şi poate fi utilizată în agricultură.

Speciile de bacterii fitopatogene pot provoca diferite boli ale plantelor agricole (bacterioze). De exemplu, Erwinia amylovora, bacteria gram-negativă din familia Enterobacteriaceae, este agentul cauzal al focului bacterian, o boală devastatoare a plantelor care afectează o gamă largă de specii din cadrul genului Rosaceae şi este o ameninţare globală majoră pentru producţia comercială de mere şi pere (Piqué N., Miñana-Galbis D., Merino S. M. Tomás J.. Virulence Factors of Erwinia amylovora: A Review. Int. J. Mol. Sci., Jun. 2015, 16(6), p. 12836-12854). Altă specie E. carotovora cauzează putregaiul moale la culturile economico-importante, aşa ca cartofi, roşii, castraveţi. În cazul cartofului se produce putregaiul moale al tulpinii şi tuberculilor până şi după recoltare, astfel reducând considerabil randamentul roadei (Benada M., Boumaaza B., Boudalia S., Khaladi O., Guessas B. Variability of aggressiveness and virulence of Erwinia carotovora subsp. Carotovorum causing the soft rot on potato tubers in the western of Algeria. Int. J. of Plant Biology 2018, vol. 9:7568, p. 52-56). Xanthomonas campestris pv. vesicatoria este o bacterie gram-negativă biotrofică şi este agentul care provoacă pătarea bacteriană a tomatelor (Solanum lycopersicum L.) şi a ardeiului (Capsicum annuum), o boala prezentă la nivel mondial. Simptomele infectării bacteriene includ defolierea şi leziunile necrotice clorotice pe frunze, tulpini, fructe şi flori, care conduc ulterior la un randament redus al roadei (Tamir-Ariel D., Navon N. and Burdman S. Identification of Genes in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Induced during Its Interaction with Tomato. J. Bacteriol., Sep. 2007, 189(17), p. 6359-6371).

Tiosemicarbazonele şi complecşii lor cu unele metale de tranziţie în unele cazuri manifestă un spectru larg de acivitate biologică, inclusiv antibacteriană, în special în domeniul medical [1,2,3].

Pentru combaterea microorganismelor fitopatogene, inclusiv bacterii, au fost propuse compoziţii biocide care cuprind tiosemicarbazone nealchilate pe sulf în baza diverşilor derivaţi ai 2-acetil- şi 2-formilpiridină, cât şi compuşii lor coordinativi (complecşi) cu cupru şi alte metale [4]. Dezavantajul acestor agenţi antimicrobieni constă în faptul că sunt insolubili sau foarte puţin solubili în apă, fapt ce necesită introducerea în compoziţii a aditivilor de solubilizare sau umectare a prafului de tiosemicarbazonă sau respectiv de complex.

Activitatea biologică a tiosemicarbazonelor şi complecşilor lor variază foarte puternic în funcţie de metal, structura ligandului sau a complexului, natura substituenţilor atât din nucleul carbonilic cât şi la fragmentul tiosemicarbazidic. Acest fragment poate fi derivatizat prin substituţie la atomii de azot.

Ca o ilustrare a dependenţei activităţii biologice de structura ligandului şi a complexului de metal pot servi complecşii binucleari de cupru(II) cu tiosemicarbazonele N4-substituite a hidroxiacetofenonei. Dimerii de cupru nu posedă o activitate de inhibare faţă de Aspergillus niger, dar în schimb sunt activi faţă de Paecilomyces variotii [5].

Complecşii binucleari (dimeri) de cupru(II) în baza ligandului binucleabil bis(4-feniltiosemicarbazona) 2,6-diformil-4-metilfenolului sunt inactivi faţă de diferite specii de bacterii sau fungi [6].

O altă cale de derivatizare a tiosemicarbazidelor constă în alchilarea atomului de sulf tionic cu obţinerea S-alchilizotiosemicarbazidelor. Din datele din stadiul tehnicii reiese că alchilarea sulfului din fragmentul tiosemicarbazidic nu contribuie la ridicarea activităţii biologice a tiosemicarbazonelor şi complecşilor lor. De exemplu, pentru derivaţii S-alchilaţi ai 1,4-benzochinon-izotiosemicarbazon-guanilhidrazona s-a stabilit că alchilarea sulfului duce la micşorarea activităţii antibacteriene [7].

Având în vedere că apa reprezintă mediul biologic de bază din componenţa organismelor vii, inclusiv a plantelor, şi reieşind din considerentele practice de pregătire şi aplicare a remediilor antimicrobiene, este de dorit de a elabora ingredienţi activi hidrosolubili. Aceasta ar permite de a utiliza efectiv remediile antibacteriene sub formă de soluţii apoase, evitând folosirea solvenţilor organici, agenţilor de solubilizare sau umectare, cu toate consecinţele pozitive pentru mediu, tehnica securităţii, costuri economice, etc. Majoritatea absolută de tiosemicarbazone şi complecşii lor sunt insolubili în apă. O metodă de a conferi hidrosolubiltate constă în introducerea în ligandul organic a unor grupe hidrofile ca grupa sulfonică (-SO3H) sau carboxilică (-COOH). Aceste grupe uşor se ionizează în mediul bazic cu formarea sărurilor respective ale metalelor alcaline sau de amoniu, care de regulă conferă solubilitate în apă ligandului sau complexului respectiv.

Pe această cale au fost obţinuţi complecşi de cupru, zinc şi nichel hidrosolubili cu unele tiosemicarbazone ale aldehidelor aromatice sulfonate [8]. Solubilitatea lor în apă a permis testarea in vivo a activităţii biologice, în special a citotoxicităţii contra celulelor de leucemie cronică mieloidă umană. Un dezavantaj al acestor compuşi este că introducerea grupei sulfonice necesită stadii suplimentare de sinteză organică, în plus grupa sulfonică poate influenţa negativ asupra activităţii biologice.

În scopul de a obţine tiosemicarbazone heteroaromatice şi complecşi de cupru(II) hidrosolubili cu activitate antiproliferativă contra celulelor anticanceroase, în nucleul heteroaromatic s-a introdus grupa morfolinică, care poate conferi hidrosolubilitate şi o activitate biologică compuşilor pe care o conţin [9].

Au fost sintetizate diverse tiosemicarbazone pe bază de 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidă (HL1-HL6) şi complecşii respectivi de cupru hidrosolubili (1-6):

S-a determinat că o parte de complecşi formează dimeri slabi (asociaţi) în stare solidă, care în soluţie apoasă se scindează în monomerii reprezentaţi mai sus. Totodată liganzii şi complecşii lor de cupru au fost testaţi şi pentru activitate antibacteriană faţă de microorganismele Gram-pozitive S.aureus şi Gram-negative P. aeruginosa. HL1-HL5 împreună cu complecşii 1-5 au arătat o activitate antibacteriană considerabilă faţă de bacteriile S.aureus.

Complexul hidrosolubil de cupru 6 pe bază de S-metilizotiosemicarbazidă poate fi considerat cel mai aproape din punct de vedere structural de compusul utilizat în invenţia revendicată. Dezavantajul analogului proxim constă în faptul că ligandul HL6 şi complexul 6, spre deosebire de ceilalţi compuşi, au arătat un nivel foarte redus de activitate antibacteriană. Alt dezavantaj este că sinteza 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidei, care conferă în final hidrosolubilitate complecşilor, este destul de anevoiasă şi necesită şapte stadii de sinteză.

Problema soluţionată de invenţie constă în extinderea gamei de remedii antibacterieni contra speciilor fitopatogene în bază de complecşi hidrosolubili ai cuprului(II) cu tiosemicarbazone.

Problema s-a soluţionat printr-o analiză şi selecţie neevidentă dintre compuşi complecşi binucleari (dimeri) ai cuprului hidrosolubili cu derivaţi de tiosemicarbazone aromatice binucleabile, urmată de sinteza şi investigaţii microbiologice corespunzătoare.

Rezultatul atins de invenţie constă în faptul că pentru un compus binuclear al cuprului(II) hidrosolubil în bază de derivat S-alchilat al tiosemicarbazidei, şi anume pentru dimerul cuprului coordonat cu bis(S-metilizotiosemicarbazona)-2,6-diformil-4-metilfenolului (H3DF-T1), s-a depistat o activitate antibacteriană faţă de speciile fitopatogene în soluţii apoase cu concentraţii minime bactericide de 0,007% mas. (130 µM).

Ligandul H3DF-T1 din componenţa complexului este unul binucleabil, adică poate coordona doi ioni de cupru cu utilizarea punţii de fenolat şi a patru atomi donori de azot N1 şi N4 ale ambelor „braţe” tiosemicarbazidice, totodată în medii neutre ligandul se coordonează monodeprotonizat, iar în medii bazice trideprotonizat. Structura lui este redată mai jos:

.

Compusul se obţine la interacţiunea H3DF-T1 cu clorură de cupru(II) în mediu alcoolic, reprezintă un dimer de cupru, conţine trei ioni de clor şi o moleculă de apă de cristalizare - 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru hidrat. Conform datelor analizei elementale, spectrale şi proprietăţilor chimice şi magnetochimice dimerul de cupru foarte probabil că are următoarea structură [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O, unde H2DF-T1 reprezintă ligandul iniţial monodeprotonizat la atomul punte de oxigen fenolic, iar µ-Cl denotă faptul că un ion de clor are rolul de a doua punte între ionii de Cu(II). Conform regulilor de nomenclatură chimică denumirea desfăşurată a compusului poate fi {µ-cloro-[2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-N1,N4,N ́1,N ́4,µ-O]dicupru(II)}-dicloro-hidrat. Din considerente practice dimerul de cupru utilizat în continuare va fi notat prin C1.

Complexul C1 este cunoscut din stadiul tehnicii (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, Nr. 8, p. 2017-2022), iar activitatea lui biologică nu a fost cercetată.

[Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O este solubil în apă şi formează soluţii verde-intens la concentraţii relativ mici. Această hidrosolubilitate este una mai puţin obişnuită, deoarece dimerul analog de cupru cu tiosemicarbazona nealchilată, tot cu trei ioni de clor în componenţa sa este insolubil în apă.

În calitate de microorganisme-test pentru evaluarea activităţii antimicrobiene au fost selectate tulpinile fitopatogene de Erwinia amylovora, Erwinia carotovora şi Xanthomonas campestris. Pentru a confirma posibilitatea extinderii activităţii antibacteriene a dimerului de cupru au fost incluse în testări şi tulpinile nepatogene de bacterii de Bacillus subtilis CNMN BB-01, Pseudomonas fluorescens CNMN-PFB-01. Evaluarea activităţii antibacteriene s-a efectuat prin metoda diluţiilor succesive duble.

Pentru evaluarea corectă a efectului antibacterian s-a testat şi activitatea unor compuşi de referinţă. În calitate de compuşi de referinţă s-au selectat compuşii iniţiali (precursorii) din care s-a sintetizat complexul binuclear de cupru - clorura de cupru dihidrat şi ligandul binucleabil bis(S-metilizotiosemicarbazon)-2,6-diformil-4-metilfenolul (H3DFT1). Ligandul, fiind insolubil în apă, a fost dizolvat iniţial în dimetilsulfoxid (DMSO), care s-a supus ulterior diluţiilor succesive duble cu apă distilată.

După cum reiese din rezultatele testării activităţii antibacteriene soluţiile apoase puternic diluate ale dimerului de cupru selectat posedă o activitate antibacteriană înaltă faţă de bacteriile fitopatogene, concentraţia minimă bactericidă fiind de 130 µM (0,007%). Pentru speciile nepatogene concentraţia minimă bactericidă este la nivelul de 520 µM. Faptul că C1 este activ şi faţă de bacteriile nepatogene indică la aceea că acţiunea antibacteriană a C1 nu se limitează doar la speciile fitopatogene testate în invenţie.

Precursorul clorura de cupru(II) manifestă un efect bactericid la concentraţii de 2100...4200 µM, iar activitatea bactericidă a ligandului precursor H3DFT1 se află la nivelul solventului DMSO. Datele obţinute pentru compuşii de referinţă indică univoc că apariţia proprietăţilor antibacteriene la C1 se datorează efectului sinergetic în urma coordonării dintre cupru şi această izotiosemicarbazonă specifică.

Din stadiul tehnicii se cunoaşte că S-alchilarea tiosemicarbazidei diminuiază activitatea antibacteriană a izotiosemicarbazonelor. De aceea activitatea bactericidă faţă de bacteriile fitopatogene a C1, care face parte din grupa de complecşi cu izotiosemicarbazone, este una neaşteptată.

În concluzie din cercetările microbiologice rezultă că dimerul de cupru C1 poate fi aplicat în agricultură sub formă de soluţii apoase diluate la combaterea bacteriozelor la plante.

În continuare invenţia se explică prin fotografiile reprezentative din figură, care se referă la acţiunea antibacteriană asupra tulpinii de Erwinia carotovora la patru diluţii în jurul concentraţiei minime bactericide (% mas.) a C1 (“Cu2LCl3”) şi a sării precursoare CuCl2·2H2O.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1: Sinteza compuşilor investigaţi

Ligandul bis(S-metilizotiosemicarbazona) de 2,6-diformil-4-metilfenol (H3DF-T1) şi complexul de cupru testaţi au fost descrişi anterior (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, Nr. 8, p. 2017-2022). Conform procedeului cunoscut a fost sintetizată hidroiodura de S-metilizotiosemicarbazidă prin alchilarea tiosemicarbazidei cu iodmetan în mediu de etanol. În continuare hidroiodura de izotiosemicarbazidă a fost condensată în mediu etanol-apă, în prezenţă de carbonat de sodiu, cu 2,6-diformil-4-metilfenol.

Ligandul este insolubil în apă, solubil în DMSO sau DMF şi se caracterizează prin următoarele caracteristici. P.t. 208...211 °C, benzi reprezentative în spectrul IR înregistrat cu spectrometrul FT-IR PerkinElmer Spectrum 100 (disc KBr, cm-1): 3484s, 3404s, asc, 3081s, 1636p, asc, 1607p, 1517fp, asc, 1299p, asc, 1016m, asc, 757p, asc, 691m, asc (unde s semnifică slab, m - mediu, p - puternic, fp - foarte puternic şi asc - ascuţit).

Complexul de cupru s-a obţinut conform unui procedeu modificat.

La suspensia de H3DFT1 (1,70 g, 5 mmoli) în metanol (100 mL) se adaugă la temperatura camerei CuCl2·2H2O (1,70 g, 10 mmoli). Amestecul se agită magnetic timp de cca 15 min până dispare ligandul iniţial de culoare galbenă, apoi se încălzeşte la temperatura de 50...60°C timp de 0,5 ore. După răcire, peste 4...6 ore produsul cristalin verde se filtrează, se spală cu metanol, apoi cu eter şi se usucă la aer. Se obţin 2,86 g (97%) de produs cristalin (microace) de culoare verde.

Produsul este solubil în apă, DMSO sau DMF cu formarea unor soluţii limpezi de culoare verde-intens. Soluţiile apoase peste 24 de ore încep să capete o nuanţă nucărie fără a se forma un careva precipitat în decurs de 6 luni.

Spectrul IR (disc KBr, cm-1): 3503s, 3419s, asc., 3300s, 2797m, 1555fp, asc, 1315p, asc, 1144p, asc, 904m, asc, 713m.

Exemplul 2: Evaluarea activităţii antibacteriene a compuşilor

Pentru evaluarea activităţii antibacteriene a fost utilizată metoda diluţiilor succesive duble, care constă în aceea că la etapa iniţială se iau şiruri de 10 eprubete în care se introduc câte 1 ml de bulion peptonat. Ulterior se picură 1 mL de preparat în prima eprubeta (din şirul de 10 eprubete), după care 1 mL din aceasta se transferă în eprubeta următoare, astfel că procedura se repetă până la eprubeta nr.10 a şirului. În aşa mod, concentraţia preparatului iniţial se micşorează de 2 ori în fiecare eprubetă următoare. În acelaşi timp, se prepară culturi de 24 de ore de bacterii-test. Se prepară iniţial suspensii de culturi bacteriene cu densităţile optice de 2,0 în conformitate cu indicele McFarland. Ulterior, se transferă 1 mL de suspensie bacteriană obţinută într-o eprubetă ce conţine 9 mL de apă distilată sterilă. Se amestecă conţinutul obţinut, după care se transferă 1 mL în eprubeta cu nr.2 din şirul de 5 eprubete ce conţin câte 9 mL de apă distilată sterilă. Din eprubeta cu nr.5 a şirului se ia câte 0,1 mL de suspensie bacteriană, ceea ce reprezintă doza de însămânţare, şi se adaugă în fiecare eprubetă care conţine preparatele titrate. Ulterior, eprubetele cu preparatele titrate în care s-au introdus dozele de însămânţare ale bacteriilor se plasează în termostat la temperatura de 35°C timp de 24 de ore. A 2-a zi se analizează preliminar rezultatele obţinute. Ultima eprubetă din şir în care nu se atestă o creştere vizibilă a bacteriilor se consideră a fi concentraţia minimă inhibitorie (CMI) a preparatului. Pentru aprecierea concentraţiei minime bactericide (CMB), conţinutul eprubetelor cu CMI şi a eprubetelor cu concentraţii mai înalte ale preparatelor se însămânţează pe agarul peptonat solid din cutiile Petri cu ajutorul ansei bacteriologice. Cutiile însămânţate se plasează în termostat la temperatura de 35°C pentru 24 de ore. Concentraţia preparatelor care nu permit creşterea nici a unei colonii bacteriene se consideră a fi concentraţia minimă bactericidă a compusului.

Pentru evaluare s-au pregătit soluţii proaspete de C1 în apă distilată de 0,5% (8400 µM ). În calitate de compuşi de referinţă s-au selectat compuşii iniţiali (precursori) din care s-a sintetizat C1: clorura de cupru dihidrat şi ligandul binucleabil H3DFT1. Ligandul, fiind insolubil în apă, a fost dizolvat iniţial în dimetilsulfoxid (DMSO), concentraţia fiind de 0,40% (0,012 M), care s-a supus ulterior diluţiilor succesive duble cu apă distilată.

Este bine cunoscut că solvenţii organici utilizaţi la pregătirea soluţiilor iniţiale de compuşi pentru testare, de exemplu, etanolul sau DMSO, însuşi posedă o activitate antimicrobiană. Pentru a evalua corect activitatea bactericidă a ligandului dizolvat iniţial în DMSO şi apoi diluat cu apă s-a determinat concentraţia minimă bactericidă a DMSO pur în apă distilată.

Valorile concentraţilor molare (µM) minime bactericide în apă distilată pentru dimerul de cupru testat (C1) şi compuşii de referinţă sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Tabel

Tulpina CuCl2·2H2O H3DFT1 C1 E. carotovora 4100 n/a 130 E. amylovora 2100 n/a 130 X. campestris 4100 n/a 130 P. fluorescens 4100 n/a 520 B. subtilis 4100 n/a 520

n/a - la nivelul solventului DMSO (formal >1500 µM)

Activitatea bactericidă a ligandului H3DFT1 din care se obţine complexul este foarte joasă, de fapt ea practic lipseşte deoarece efectul bactericid se observă la aceeaşi diluţie (a treia) ca şi pentru DMSO, adică efectul bactericid al DMSO se manifestă la concentraţii mai mari de 12,5%. De aici rezultă că în cazuri speciale C1 poate fi utilizat şi sub formă de soluţie iniţială în DMSO pentru diluţia ulterioară cu apă, deoarece în soluţiile apoase finale aportul bactericid al DMSO va fi neglijabil.

În concluzie, compusul dimer de cupru cu formula [Cu2(H2DFT1)-µ-Cl]Cl2·H2O (C1) poate fi aplicat în agricultură sub formă de soluţii apoase cu o concentraţie nu mai mică de 130 µM (0,007%) la combaterea bolilor cauzate de bacteriile fitopatogene.

1. Lobana T.S., Sharma R., Bawa G., Khanna S. Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals - An overview. Coordination Chemistry Revs, 2009, 253, p. 977-1055

2. Pelosi G. Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity. The Open Crystallography Journal, 2010, vol. 3, p. 16-28

3. West D.X., Liberta A.E., Padhye S.B., Chikate R.C., Sonawane P.B., Kumbhar A.S., Yerande R.G. Thiosemicarbazone complexes of copper(II): structural and biological studies. Coordination Chemistry Revs., 1993, 123, p. 49-71

4. WO 8500955 A1 1985.03.14

5. West D.X., Yang Y., Klein T.L., Goldberg K.I., Liberta A.E., Valdes-Martinez J., Toscano R.A. Binuclear copper(II) complexes of 2-hydroxyacetophenone 4N-substituted thiosemicarbazones. Polyhedron, 1995, vol. 14, nr. 12, p. 1681-1693

6. Naik A.D., Revankar V.K. Exchange coupled dicopper(II) complexes of thiosemicarbazones. Indian J. Chem. Vol. 43A, July 2004, p. 1447-1453

7. Schulze W., Gutsche W., Wohlrabe K., Fleck W., Tresselt D. Zur Synthese und biologischen Wirksamkeit von Analogen des 1,4-Benzochinon-guanylhydrazon-thiosemicarbazons. Farmazie, 1985, 40(8), p. 540-541

8. Hosseini-Yazdi S., Mirzaahmadi A., Khandar A.A., Eigner V., Dušek M., Lotfipour F., Mahdavi M., Soltani S., Dehghan G. Synthesis, characterization and in vitro biological activities of new water-soluble copper(II), zinc(II), and nickel(II) complexes with sulfonato-substituted Schiff base ligand. Inorganica Chimica Acta, 2017, v. 458, p. 171-180

9. Ohui K., Afanasenko E., Bacher F., Ting R., Zafar A., BlancoCabra N., Torrents E., Domotor O., May N.V., Darvasiova D., Enyedy E.A., Popovic-Bijelic A.D., Reynisson J., Rapta P., Babak M., Pastorin G. and Arion V.B. New Water-Soluble Copper(II) Complexes with Morpholine-Thiosemicarbazone Hybrids: Insights into the Anticancer and Antibacterial Mode of Action. J. Med. Chem., Publication Date (Web): 03.12.2018, p. 512-530

Claims (2)

1. Aplicare a compusului 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat în calitate de remediu contra bacteriilor fitopatogene.

2. Aplicare, conform revendicării 1, în care compusul se utilizează sub formă de soluţie apoasă cu concentraţie nu mai joasă de 0,007% mas.