MD4663C1 - Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria - Google Patents
Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria Download PDFInfo
- Publication number
- MD4663C1 MD4663C1 MDA20190004A MD20190004A MD4663C1 MD 4663 C1 MD4663 C1 MD 4663C1 MD A20190004 A MDA20190004 A MD A20190004A MD 20190004 A MD20190004 A MD 20190004A MD 4663 C1 MD4663 C1 MD 4663C1
- Authority
- MD
- Moldova
- Prior art keywords
- copper
- water
- bis
- complexes
- ligand
- Prior art date
Links
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
Invenţia se referă la aplicarea compuşilor coordinativi de cupru în bază de izotiosemicarbazone în calitate de remediu antibacterian şi poate fi utilizată în agricultură. The invention refers to the application of isothiosemicarbazone-based copper coordination compounds as an antibacterial remedy and can be used in agriculture.
Speciile de bacterii fitopatogene pot provoca diferite boli ale plantelor agricole (bacterioze). De exemplu, Erwinia amylovora, bacteria gram-negativă din familia Enterobacteriaceae, este agentul cauzal al focului bacterian, o boală devastatoare a plantelor care afectează o gamă largă de specii din cadrul genului Rosaceae şi este o ameninţare globală majoră pentru producţia comercială de mere şi pere (Piqué N., Miñana-Galbis D., Merino S. M. Tomás J.. Virulence Factors of Erwinia amylovora: A Review. Int. J. Mol. Sci., Jun. 2015, 16(6), p. 12836-12854). Altă specie E. carotovora cauzează putregaiul moale la culturile economico-importante, aşa ca cartofi, roşii, castraveţi. În cazul cartofului se produce putregaiul moale al tulpinii şi tuberculilor până şi după recoltare, astfel reducând considerabil randamentul roadei (Benada M., Boumaaza B., Boudalia S., Khaladi O., Guessas B. Variability of aggressiveness and virulence of Erwinia carotovora subsp. Carotovorum causing the soft rot on potato tubers in the western of Algeria. Int. J. of Plant Biology 2018, vol. 9:7568, p. 52-56). Xanthomonas campestris pv. vesicatoria este o bacterie gram-negativă biotrofică şi este agentul care provoacă pătarea bacteriană a tomatelor (Solanum lycopersicum L.) şi a ardeiului (Capsicum annuum), o boala prezentă la nivel mondial. Simptomele infectării bacteriene includ defolierea şi leziunile necrotice clorotice pe frunze, tulpini, fructe şi flori, care conduc ulterior la un randament redus al roadei (Tamir-Ariel D., Navon N. and Burdman S. Identification of Genes in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Induced during Its Interaction with Tomato. J. Bacteriol., Sep. 2007, 189(17), p. 6359-6371). Species of phytopathogenic bacteria can cause different diseases of agricultural plants (bacteriosis). For example, Erwinia amylovora, the gram-negative bacterium of the Enterobacteriaceae family, is the causative agent of fire blight, a devastating plant disease that affects a wide range of species within the genus Rosaceae and is a major global threat to commercial apple and pear production. (Piqué N., Miñana-Galbis D., Merino S. M. Tomás J.. Virulence Factors of Erwinia amylovora: A Review. Int. J. Mol. Sci., Jun. 2015, 16(6), p. 12836-12854) . Another species, E. carotovora, causes soft rot in economically important crops, such as potatoes, tomatoes, cucumbers. In the case of potatoes, the soft rot of the stem and tubers occurs even after harvesting, thus considerably reducing the yield of the fruit (Benada M., Boumaaza B., Boudalia S., Khaladi O., Guessas B. Variability of aggressiveness and virulence of Erwinia carotovora subsp . Carotovorum causing the soft rot on potato tubers in the western of Algeria. Int. J. of Plant Biology 2018, vol. 9:7568, p. 52-56). Xanthomonas campestris pv. vesicatoria is a biotrophic gram-negative bacterium and is the agent that causes bacterial spotting of tomatoes (Solanum lycopersicum L.) and pepper (Capsicum annuum), a worldwide disease. Symptoms of bacterial infection include defoliation and chlorotic necrotic lesions on leaves, stems, fruits and flowers, which subsequently lead to reduced fruit yield (Tamir-Ariel D., Navon N. and Burdman S. Identification of Genes in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Induced during Its Interaction with Tomato. J. Bacteriol., Sep. 2007, 189(17), p. 6359-6371).
Tiosemicarbazonele şi complecşii lor cu unele metale de tranziţie în unele cazuri manifestă un spectru larg de acivitate biologică, inclusiv antibacteriană, în special în domeniul medical [1,2,3]. Thiosemicarbazones and their complexes with some transition metals in some cases show a wide spectrum of biological activity, including antibacterial, especially in the medical field [1,2,3].
Pentru combaterea microorganismelor fitopatogene, inclusiv bacterii, au fost propuse compoziţii biocide care cuprind tiosemicarbazone nealchilate pe sulf în baza diverşilor derivaţi ai 2-acetil- şi 2-formilpiridină, cât şi compuşii lor coordinativi (complecşi) cu cupru şi alte metale [4]. Dezavantajul acestor agenţi antimicrobieni constă în faptul că sunt insolubili sau foarte puţin solubili în apă, fapt ce necesită introducerea în compoziţii a aditivilor de solubilizare sau umectare a prafului de tiosemicarbazonă sau respectiv de complex. To combat phytopathogenic microorganisms, including bacteria, biocidal compositions containing non-alkylated sulfur thiosemicarbazones based on various 2-acetyl- and 2-formylpyridine derivatives, as well as their coordinating compounds (complexes) with copper and other metals, have been proposed [4]. The disadvantage of these antimicrobial agents is that they are insoluble or very slightly soluble in water, a fact that requires the introduction of additives for solubilizing or wetting the thiosemicarbazone powder or the complex respectively.
Activitatea biologică a tiosemicarbazonelor şi complecşilor lor variază foarte puternic în funcţie de metal, structura ligandului sau a complexului, natura substituenţilor atât din nucleul carbonilic cât şi la fragmentul tiosemicarbazidic. Acest fragment poate fi derivatizat prin substituţie la atomii de azot. The biological activity of thiosemicarbazones and their complexes varies greatly depending on the metal, the structure of the ligand or the complex, the nature of the substituents both in the carbonyl nucleus and in the thiosemicarbazide fragment. This fragment can be derivatized by substitution at the nitrogen atoms.
Ca o ilustrare a dependenţei activităţii biologice de structura ligandului şi a complexului de metal pot servi complecşii binucleari de cupru(II) cu tiosemicarbazonele N4-substituite a hidroxiacetofenonei. Dimerii de cupru nu posedă o activitate de inhibare faţă de Aspergillus niger, dar în schimb sunt activi faţă de Paecilomyces variotii [5]. Binuclear complexes of copper(II) with N4-substituted thiosemicarbazones of hydroxyacetophenone can serve as an illustration of the dependence of biological activity on the structure of the ligand and the metal complex. Copper dimers do not possess inhibitory activity against Aspergillus niger, but instead are active against Paecilomyces variotii [5].
Complecşii binucleari (dimeri) de cupru(II) în baza ligandului binucleabil bis(4-feniltiosemicarbazona) 2,6-diformil-4-metilfenolului sunt inactivi faţă de diferite specii de bacterii sau fungi [6]. The binuclear complexes (dimers) of copper(II) based on the binucleable ligand bis(4-phenylthiosemicarbazone) 2,6-diformyl-4-methylphenol are inactive against different species of bacteria or fungi [6].
O altă cale de derivatizare a tiosemicarbazidelor constă în alchilarea atomului de sulf tionic cu obţinerea S-alchilizotiosemicarbazidelor. Din datele din stadiul tehnicii reiese că alchilarea sulfului din fragmentul tiosemicarbazidic nu contribuie la ridicarea activităţii biologice a tiosemicarbazonelor şi complecşilor lor. De exemplu, pentru derivaţii S-alchilaţi ai 1,4-benzochinon-izotiosemicarbazon-guanilhidrazona s-a stabilit că alchilarea sulfului duce la micşorarea activităţii antibacteriene [7]. Another way of derivatizing thiosemicarbazides consists in the alkylation of the ionic sulfur atom to obtain S-alkylisothiosemicarbazides. From the state-of-the-art data, it appears that the alkylation of sulfur from the thiosemicarbazide fragment does not contribute to increasing the biological activity of thiosemicarbazones and their complexes. For example, for S-alkylated derivatives of 1,4-benzoquinone-isothiosemicarbazone-guanylhydrazone it was established that alkylation of sulfur leads to a decrease in antibacterial activity [7].
Având în vedere că apa reprezintă mediul biologic de bază din componenţa organismelor vii, inclusiv a plantelor, şi reieşind din considerentele practice de pregătire şi aplicare a remediilor antimicrobiene, este de dorit de a elabora ingredienţi activi hidrosolubili. Aceasta ar permite de a utiliza efectiv remediile antibacteriene sub formă de soluţii apoase, evitând folosirea solvenţilor organici, agenţilor de solubilizare sau umectare, cu toate consecinţele pozitive pentru mediu, tehnica securităţii, costuri economice, etc. Majoritatea absolută de tiosemicarbazone şi complecşii lor sunt insolubili în apă. O metodă de a conferi hidrosolubiltate constă în introducerea în ligandul organic a unor grupe hidrofile ca grupa sulfonică (-SO3H) sau carboxilică (-COOH). Aceste grupe uşor se ionizează în mediul bazic cu formarea sărurilor respective ale metalelor alcaline sau de amoniu, care de regulă conferă solubilitate în apă ligandului sau complexului respectiv. Considering that water represents the basic biological environment in the composition of living organisms, including plants, and arising from the practical considerations for the preparation and application of antimicrobial remedies, it is desirable to develop water-soluble active ingredients. This would allow to effectively use the antibacterial remedies in the form of aqueous solutions, avoiding the use of organic solvents, solubilizing or wetting agents, with all the positive consequences for the environment, safety techniques, economic costs, etc. The absolute majority of thiosemicarbazones and their complexes are insoluble in water. A method to confer water solubility consists in the introduction of hydrophilic groups such as sulfonic (-SO3H) or carboxylic (-COOH) groups into the organic ligand. These groups easily ionize in the basic environment with the formation of the respective alkali metal or ammonium salts, which usually give solubility in water to the respective ligand or complex.
Pe această cale au fost obţinuţi complecşi de cupru, zinc şi nichel hidrosolubili cu unele tiosemicarbazone ale aldehidelor aromatice sulfonate [8]. Solubilitatea lor în apă a permis testarea in vivo a activităţii biologice, în special a citotoxicităţii contra celulelor de leucemie cronică mieloidă umană. Un dezavantaj al acestor compuşi este că introducerea grupei sulfonice necesită stadii suplimentare de sinteză organică, în plus grupa sulfonică poate influenţa negativ asupra activităţii biologice. In this way, water-soluble copper, zinc and nickel complexes were obtained with some thiosemicarbazones of sulfonated aromatic aldehydes [8]. Their solubility in water allowed the in vivo testing of biological activity, especially cytotoxicity against human chronic myeloid leukemia cells. A disadvantage of these compounds is that the introduction of the sulfonic group requires additional stages of organic synthesis, in addition the sulfonic group can negatively influence the biological activity.
În scopul de a obţine tiosemicarbazone heteroaromatice şi complecşi de cupru(II) hidrosolubili cu activitate antiproliferativă contra celulelor anticanceroase, în nucleul heteroaromatic s-a introdus grupa morfolinică, care poate conferi hidrosolubilitate şi o activitate biologică compuşilor pe care o conţin [9]. In order to obtain heteroaromatic thiosemicarbazones and water-soluble copper(II) complexes with antiproliferative activity against anticancer cells, the morpholine group was introduced into the heteroaromatic nucleus, which can confer water solubility and a biological activity to the compounds they contain [9].
Au fost sintetizate diverse tiosemicarbazone pe bază de 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidă (HL1-HL6) şi complecşii respectivi de cupru hidrosolubili (1-6): Various thiosemicarbazones based on 5-methylmorpholine-pyridine-2-carboxaldehyde (HL1-HL6) and the respective water-soluble copper complexes (1-6) were synthesized:
S-a determinat că o parte de complecşi formează dimeri slabi (asociaţi) în stare solidă, care în soluţie apoasă se scindează în monomerii reprezentaţi mai sus. Totodată liganzii şi complecşii lor de cupru au fost testaţi şi pentru activitate antibacteriană faţă de microorganismele Gram-pozitive S.aureus şi Gram-negative P. aeruginosa. HL1-HL5 împreună cu complecşii 1-5 au arătat o activitate antibacteriană considerabilă faţă de bacteriile S.aureus. It was determined that some of the complexes form weak (associated) dimers in the solid state, which in aqueous solution split into the monomers represented above. At the same time, their copper ligands and complexes were also tested for antibacterial activity against Gram-positive S.aureus and Gram-negative P. aeruginosa microorganisms. HL1-HL5 together with complexes 1-5 showed considerable antibacterial activity against S.aureus bacteria.
Complexul hidrosolubil de cupru 6 pe bază de S-metilizotiosemicarbazidă poate fi considerat cel mai aproape din punct de vedere structural de compusul utilizat în invenţia revendicată. Dezavantajul analogului proxim constă în faptul că ligandul HL6 şi complexul 6, spre deosebire de ceilalţi compuşi, au arătat un nivel foarte redus de activitate antibacteriană. Alt dezavantaj este că sinteza 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidei, care conferă în final hidrosolubilitate complecşilor, este destul de anevoiasă şi necesită şapte stadii de sinteză. The water-soluble copper complex 6 based on S-methylisothiosemicarbazide can be considered the closest structurally to the compound used in the claimed invention. The disadvantage of the proxim analogue lies in the fact that the HL6 ligand and complex 6, unlike the other compounds, showed a very low level of antibacterial activity. Another disadvantage is that the synthesis of 5-methylmorpholine-pyridine-2-carboxaldehyde, which ultimately gives water solubility to the complexes, is quite difficult and requires seven stages of synthesis.
Problema soluţionată de invenţie constă în extinderea gamei de remedii antibacterieni contra speciilor fitopatogene în bază de complecşi hidrosolubili ai cuprului(II) cu tiosemicarbazone. The problem solved by the invention consists in expanding the range of antibacterial remedies against phytopathogenic species based on water-soluble complexes of copper(II) with thiosemicarbazones.
Problema s-a soluţionat printr-o analiză şi selecţie neevidentă dintre compuşi complecşi binucleari (dimeri) ai cuprului hidrosolubili cu derivaţi de tiosemicarbazone aromatice binucleabile, urmată de sinteza şi investigaţii microbiologice corespunzătoare. The problem was solved by a non-obvious analysis and selection of binuclear complex compounds (dimers) of water-soluble copper with binucleable aromatic thiosemicarbazone derivatives, followed by the corresponding synthesis and microbiological investigations.
Rezultatul atins de invenţie constă în faptul că pentru un compus binuclear al cuprului(II) hidrosolubil în bază de derivat S-alchilat al tiosemicarbazidei, şi anume pentru dimerul cuprului coordonat cu bis(S-metilizotiosemicarbazona)-2,6-diformil-4-metilfenolului (H3DF-T1), s-a depistat o activitate antibacteriană faţă de speciile fitopatogene în soluţii apoase cu concentraţii minime bactericide de 0,007% mas. (130 µM). The result achieved by the invention consists in the fact that for a water-soluble copper(II) binuclear compound based on the S-alkylated derivative of thiosemicarbazide, namely for the copper dimer coordinated with bis(S-methylisothiosemicarbazone)-2,6-diformyl-4- methylphenol (H3DF-T1), an antibacterial activity against phytopathogenic species was detected in aqueous solutions with minimum bactericidal concentrations of 0.007% mass. (130 µM).
Ligandul H3DF-T1 din componenţa complexului este unul binucleabil, adică poate coordona doi ioni de cupru cu utilizarea punţii de fenolat şi a patru atomi donori de azot N1 şi N4 ale ambelor „braţe” tiosemicarbazidice, totodată în medii neutre ligandul se coordonează monodeprotonizat, iar în medii bazice trideprotonizat. Structura lui este redată mai jos: The H3DF-T1 ligand in the composition of the complex is a binucleate one, i.e. it can coordinate two copper ions with the use of the phenolate bridge and four nitrogen donor atoms N1 and N4 of both thiosemicarbazide "arms", at the same time in neutral environments the ligand coordinates monodeprotonated, and trideprotonated in basic environments. Its structure is shown below:
. .
Compusul se obţine la interacţiunea H3DF-T1 cu clorură de cupru(II) în mediu alcoolic, reprezintă un dimer de cupru, conţine trei ioni de clor şi o moleculă de apă de cristalizare - 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru hidrat. Conform datelor analizei elementale, spectrale şi proprietăţilor chimice şi magnetochimice dimerul de cupru foarte probabil că are următoarea structură [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O, unde H2DF-T1 reprezintă ligandul iniţial monodeprotonizat la atomul punte de oxigen fenolic, iar µ-Cl denotă faptul că un ion de clor are rolul de a doua punte între ionii de Cu(II). Conform regulilor de nomenclatură chimică denumirea desfăşurată a compusului poate fi {µ-cloro-[2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-N1,N4,N ́1,N ́4,µ-O]dicupru(II)}-dicloro-hidrat. Din considerente practice dimerul de cupru utilizat în continuare va fi notat prin C1. The compound is obtained by the interaction of H3DF-T1 with copper(II) chloride in an alcoholic medium, it is a copper dimer, it contains three chlorine ions and one molecule of water of crystallization - 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4 -methylphenolato-trichloro-dicuprous hydrate. According to the elemental, spectral analysis and chemical and magnetochemical properties data, the copper dimer very likely has the following structure [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O, where H2DF-T1 represents the initial monodeprotonated ligand at the phenolic oxygen bridge atom , and µ-Cl denotes the fact that a chlorine ion has the role of a second bridge between Cu(II) ions. According to the rules of chemical nomenclature, the common name of the compound can be {µ-chloro-[2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-N1,N4,N ́1,N ́4,µ-O]dicopper(II) }-dichloro-hydrate. For practical reasons the copper dimer used in the following will be denoted by C1.
Complexul C1 este cunoscut din stadiul tehnicii (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, Nr. 8, p. 2017-2022), iar activitatea lui biologică nu a fost cercetată. The C1 complex is known from the state of the art (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, No. 8, p. 2017-2022), and its biological activity was not investigated.
[Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O este solubil în apă şi formează soluţii verde-intens la concentraţii relativ mici. Această hidrosolubilitate este una mai puţin obişnuită, deoarece dimerul analog de cupru cu tiosemicarbazona nealchilată, tot cu trei ioni de clor în componenţa sa este insolubil în apă. [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O is soluble in water and forms intense green solutions at relatively low concentrations. This water solubility is less common, because the copper analog dimer with non-alkylated thiosemicarbazone, also with three chlorine ions in its composition, is insoluble in water.
În calitate de microorganisme-test pentru evaluarea activităţii antimicrobiene au fost selectate tulpinile fitopatogene de Erwinia amylovora, Erwinia carotovora şi Xanthomonas campestris. Pentru a confirma posibilitatea extinderii activităţii antibacteriene a dimerului de cupru au fost incluse în testări şi tulpinile nepatogene de bacterii de Bacillus subtilis CNMN BB-01, Pseudomonas fluorescens CNMN-PFB-01. Evaluarea activităţii antibacteriene s-a efectuat prin metoda diluţiilor succesive duble. Phytopathogenic strains of Erwinia amylovora, Erwinia carotovora and Xanthomonas campestris were selected as test microorganisms for the evaluation of antimicrobial activity. To confirm the possibility of expanding the antibacterial activity of the copper dimer, the non-pathogenic strains of Bacillus subtilis CNMN BB-01, Pseudomonas fluorescens CNMN-PFB-01 were also included in the tests. The evaluation of the antibacterial activity was carried out by the method of double successive dilutions.
Pentru evaluarea corectă a efectului antibacterian s-a testat şi activitatea unor compuşi de referinţă. În calitate de compuşi de referinţă s-au selectat compuşii iniţiali (precursorii) din care s-a sintetizat complexul binuclear de cupru - clorura de cupru dihidrat şi ligandul binucleabil bis(S-metilizotiosemicarbazon)-2,6-diformil-4-metilfenolul (H3DFT1). Ligandul, fiind insolubil în apă, a fost dizolvat iniţial în dimetilsulfoxid (DMSO), care s-a supus ulterior diluţiilor succesive duble cu apă distilată. For the correct evaluation of the antibacterial effect, the activity of some reference compounds was also tested. As reference compounds, the initial compounds (precursors) from which the binuclear copper complex was synthesized - copper chloride dihydrate and the binucleable ligand bis(S-methylisothiosemicarbazone)-2,6-diformyl-4-methylphenol (H3DFT1) were selected . The ligand, being insoluble in water, was initially dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), which was subsequently subjected to successive double dilutions with distilled water.
După cum reiese din rezultatele testării activităţii antibacteriene soluţiile apoase puternic diluate ale dimerului de cupru selectat posedă o activitate antibacteriană înaltă faţă de bacteriile fitopatogene, concentraţia minimă bactericidă fiind de 130 µM (0,007%). Pentru speciile nepatogene concentraţia minimă bactericidă este la nivelul de 520 µM. Faptul că C1 este activ şi faţă de bacteriile nepatogene indică la aceea că acţiunea antibacteriană a C1 nu se limitează doar la speciile fitopatogene testate în invenţie. As it can be seen from the results of the antibacterial activity testing, highly diluted aqueous solutions of the selected copper dimer possess a high antibacterial activity against phytopathogenic bacteria, the minimum bactericidal concentration being 130 µM (0.007%). For non-pathogenic species, the minimum bactericidal concentration is at the level of 520 µM. The fact that C1 is also active against non-pathogenic bacteria indicates that the antibacterial action of C1 is not limited only to the phytopathogenic species tested in the invention.
Precursorul clorura de cupru(II) manifestă un efect bactericid la concentraţii de 2100...4200 µM, iar activitatea bactericidă a ligandului precursor H3DFT1 se află la nivelul solventului DMSO. Datele obţinute pentru compuşii de referinţă indică univoc că apariţia proprietăţilor antibacteriene la C1 se datorează efectului sinergetic în urma coordonării dintre cupru şi această izotiosemicarbazonă specifică. The precursor copper(II) chloride exhibits a bactericidal effect at concentrations of 2100...4200 µM, and the bactericidal activity of the precursor ligand H3DFT1 is at the level of the DMSO solvent. The data obtained for the reference compounds unequivocally indicate that the appearance of antibacterial properties at C1 is due to the synergistic effect following the coordination between copper and this specific isothiosemicarbazone.
Din stadiul tehnicii se cunoaşte că S-alchilarea tiosemicarbazidei diminuiază activitatea antibacteriană a izotiosemicarbazonelor. De aceea activitatea bactericidă faţă de bacteriile fitopatogene a C1, care face parte din grupa de complecşi cu izotiosemicarbazone, este una neaşteptată. It is known from the state of the art that S-alkylation of thiosemicarbazide decreases the antibacterial activity of isothiosemicarbazones. That is why the bactericidal activity against phytopathogenic bacteria of C1, which is part of the group of complexes with isothiosemicarbazones, is unexpected.
În concluzie din cercetările microbiologice rezultă că dimerul de cupru C1 poate fi aplicat în agricultură sub formă de soluţii apoase diluate la combaterea bacteriozelor la plante. In conclusion, the microbiological research results show that the C1 copper dimer can be applied in agriculture in the form of diluted aqueous solutions to combat bacterioses in plants.
În continuare invenţia se explică prin fotografiile reprezentative din figură, care se referă la acţiunea antibacteriană asupra tulpinii de Erwinia carotovora la patru diluţii în jurul concentraţiei minime bactericide (% mas.) a C1 (“Cu2LCl3”) şi a sării precursoare CuCl2·2H2O. Next, the invention is explained through the representative photos in the figure, which refer to the antibacterial action on the strain of Erwinia carotovora at four dilutions around the minimum bactericidal concentration (% wt.) of C1 ("Cu2LCl3") and the precursor salt CuCl2·2H2O.
Exemple de realizare a invenţiei Examples of realization of the invention
Exemplul 1: Sinteza compuşilor investigaţi Example 1: Synthesis of the investigated compounds
Ligandul bis(S-metilizotiosemicarbazona) de 2,6-diformil-4-metilfenol (H3DF-T1) şi complexul de cupru testaţi au fost descrişi anterior (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, Nr. 8, p. 2017-2022). Conform procedeului cunoscut a fost sintetizată hidroiodura de S-metilizotiosemicarbazidă prin alchilarea tiosemicarbazidei cu iodmetan în mediu de etanol. În continuare hidroiodura de izotiosemicarbazidă a fost condensată în mediu etanol-apă, în prezenţă de carbonat de sodiu, cu 2,6-diformil-4-metilfenol. The bis(S-methylisothiosemicarbazone) ligand of 2,6-diformyl-4-methylphenol (H3DF-T1) and the tested copper complex were previously described (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper (II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg. Chem. USSR), 1986, 31, No. 8, p. 2017-2022). According to the known procedure, S-methylisothiosemicarbazide hydroiodide was synthesized by alkylating thiosemicarbazide with iodomethane in ethanol medium. Next, isothiosemicarbazide hydroiodide was condensed in ethanol-water medium, in the presence of sodium carbonate, with 2,6-diformyl-4-methylphenol.
Ligandul este insolubil în apă, solubil în DMSO sau DMF şi se caracterizează prin următoarele caracteristici. P.t. 208...211 °C, benzi reprezentative în spectrul IR înregistrat cu spectrometrul FT-IR PerkinElmer Spectrum 100 (disc KBr, cm-1): 3484s, 3404s, asc, 3081s, 1636p, asc, 1607p, 1517fp, asc, 1299p, asc, 1016m, asc, 757p, asc, 691m, asc (unde s semnifică slab, m - mediu, p - puternic, fp - foarte puternic şi asc - ascuţit). The ligand is insoluble in water, soluble in DMSO or DMF and is characterized by the following characteristics. p.t. 208...211 °C, representative bands in the IR spectrum recorded with the PerkinElmer Spectrum 100 FT-IR spectrometer (KBr disk, cm-1): 3484s, 3404s, asc, 3081s, 1636p, asc, 1607p, 1517fp, asc, 1299p , asc, 1016m, asc, 757p, asc, 691m, asc (where s means weak, m - medium, p - strong, fp - very strong and asc - sharp).
Complexul de cupru s-a obţinut conform unui procedeu modificat. The copper complex was obtained according to a modified procedure.
La suspensia de H3DFT1 (1,70 g, 5 mmoli) în metanol (100 mL) se adaugă la temperatura camerei CuCl2·2H2O (1,70 g, 10 mmoli). Amestecul se agită magnetic timp de cca 15 min până dispare ligandul iniţial de culoare galbenă, apoi se încălzeşte la temperatura de 50...60°C timp de 0,5 ore. După răcire, peste 4...6 ore produsul cristalin verde se filtrează, se spală cu metanol, apoi cu eter şi se usucă la aer. Se obţin 2,86 g (97%) de produs cristalin (microace) de culoare verde. To a suspension of H3DFT1 (1.70 g, 5 mmol) in methanol (100 mL) was added CuCl2·2H2O (1.70 g, 10 mmol) at room temperature. The mixture is magnetically stirred for about 15 min until the initial yellow ligand disappears, then it is heated to a temperature of 50...60°C for 0.5 hours. After cooling, after 4...6 hours, the green crystalline product is filtered, washed with methanol, then with ether and air-dried. 2.86 g (97%) of a green crystalline product (microneedles) are obtained.
Produsul este solubil în apă, DMSO sau DMF cu formarea unor soluţii limpezi de culoare verde-intens. Soluţiile apoase peste 24 de ore încep să capete o nuanţă nucărie fără a se forma un careva precipitat în decurs de 6 luni. The product is soluble in water, DMSO or DMF with the formation of clear deep green solutions. Aqueous solutions after 24 hours begin to take on a nutty hue without forming any precipitate within 6 months.
Spectrul IR (disc KBr, cm-1): 3503s, 3419s, asc., 3300s, 2797m, 1555fp, asc, 1315p, asc, 1144p, asc, 904m, asc, 713m. IR spectrum (KBr disk, cm-1): 3503s, 3419s, asc., 3300s, 2797m, 1555fp, asc, 1315p, asc, 1144p, asc, 904m, asc, 713m.
Exemplul 2: Evaluarea activităţii antibacteriene a compuşilor Example 2: Evaluation of the antibacterial activity of the compounds
Pentru evaluarea activităţii antibacteriene a fost utilizată metoda diluţiilor succesive duble, care constă în aceea că la etapa iniţială se iau şiruri de 10 eprubete în care se introduc câte 1 ml de bulion peptonat. Ulterior se picură 1 mL de preparat în prima eprubeta (din şirul de 10 eprubete), după care 1 mL din aceasta se transferă în eprubeta următoare, astfel că procedura se repetă până la eprubeta nr.10 a şirului. În aşa mod, concentraţia preparatului iniţial se micşorează de 2 ori în fiecare eprubetă următoare. În acelaşi timp, se prepară culturi de 24 de ore de bacterii-test. Se prepară iniţial suspensii de culturi bacteriene cu densităţile optice de 2,0 în conformitate cu indicele McFarland. Ulterior, se transferă 1 mL de suspensie bacteriană obţinută într-o eprubetă ce conţine 9 mL de apă distilată sterilă. Se amestecă conţinutul obţinut, după care se transferă 1 mL în eprubeta cu nr.2 din şirul de 5 eprubete ce conţin câte 9 mL de apă distilată sterilă. Din eprubeta cu nr.5 a şirului se ia câte 0,1 mL de suspensie bacteriană, ceea ce reprezintă doza de însămânţare, şi se adaugă în fiecare eprubetă care conţine preparatele titrate. Ulterior, eprubetele cu preparatele titrate în care s-au introdus dozele de însămânţare ale bacteriilor se plasează în termostat la temperatura de 35°C timp de 24 de ore. A 2-a zi se analizează preliminar rezultatele obţinute. Ultima eprubetă din şir în care nu se atestă o creştere vizibilă a bacteriilor se consideră a fi concentraţia minimă inhibitorie (CMI) a preparatului. Pentru aprecierea concentraţiei minime bactericide (CMB), conţinutul eprubetelor cu CMI şi a eprubetelor cu concentraţii mai înalte ale preparatelor se însămânţează pe agarul peptonat solid din cutiile Petri cu ajutorul ansei bacteriologice. Cutiile însămânţate se plasează în termostat la temperatura de 35°C pentru 24 de ore. Concentraţia preparatelor care nu permit creşterea nici a unei colonii bacteriene se consideră a fi concentraţia minimă bactericidă a compusului. To evaluate the antibacterial activity, the method of double successive dilutions was used, which consists in the fact that at the initial stage rows of 10 test tubes are taken into which 1 ml of peptone broth is inserted. Afterwards, 1 mL of the preparation is dropped into the first test tube (from the row of 10 test tubes), after which 1 mL of it is transferred to the next test tube, so the procedure is repeated until test tube no. 10 of the row. In this way, the concentration of the initial preparation is reduced by 2 times in each subsequent test tube. At the same time, 24-hour cultures of test bacteria are prepared. Bacterial culture suspensions with optical densities of 2.0 according to the McFarland index are initially prepared. Afterwards, transfer 1 mL of the obtained bacterial suspension into a test tube containing 9 mL of sterile distilled water. Mix the content obtained, after which transfer 1 mL to the test tube with no. 2 from the row of 5 test tubes containing 9 mL of sterile distilled water. Take 0.1 mL of the bacterial suspension from test tube no. 5 of the row, which represents the seeding dose, and add it to each test tube containing the titrated preparations. Afterwards, the test tubes with the titrated preparations in which the seeding doses of the bacteria were introduced are placed in the thermostat at a temperature of 35°C for 24 hours. On the 2nd day, the obtained results are preliminarily analyzed. The last test tube in the row in which there is no visible growth of bacteria is considered to be the minimum inhibitory concentration (MIC) of the preparation. To assess the minimum bactericidal concentration (MBC), the contents of the test tubes with MIC and of the test tubes with higher concentrations of the preparations are seeded on the solid peptone agar in the Petri dishes with the help of the bacteriological loop. The seeded boxes are placed in the thermostat at a temperature of 35°C for 24 hours. The concentration of preparations that do not allow the growth of any bacterial colony is considered to be the minimum bactericidal concentration of the compound.
Pentru evaluare s-au pregătit soluţii proaspete de C1 în apă distilată de 0,5% (8400 µM ). În calitate de compuşi de referinţă s-au selectat compuşii iniţiali (precursori) din care s-a sintetizat C1: clorura de cupru dihidrat şi ligandul binucleabil H3DFT1. Ligandul, fiind insolubil în apă, a fost dizolvat iniţial în dimetilsulfoxid (DMSO), concentraţia fiind de 0,40% (0,012 M), care s-a supus ulterior diluţiilor succesive duble cu apă distilată. Fresh solutions of C1 in distilled water of 0.5% (8400 µM) were prepared for the evaluation. The initial compounds (precursors) from which C1 was synthesized were selected as reference compounds: copper chloride dihydrate and the binucleable ligand H3DFT1. The ligand, being insoluble in water, was initially dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO), the concentration being 0.40% (0.012 M), which was subsequently subjected to successive double dilutions with distilled water.
Este bine cunoscut că solvenţii organici utilizaţi la pregătirea soluţiilor iniţiale de compuşi pentru testare, de exemplu, etanolul sau DMSO, însuşi posedă o activitate antimicrobiană. Pentru a evalua corect activitatea bactericidă a ligandului dizolvat iniţial în DMSO şi apoi diluat cu apă s-a determinat concentraţia minimă bactericidă a DMSO pur în apă distilată. It is well known that the organic solvents used in the preparation of initial solutions of test compounds, for example, ethanol or DMSO, themselves possess antimicrobial activity. To correctly evaluate the bactericidal activity of the ligand initially dissolved in DMSO and then diluted with water, the minimum bactericidal concentration of pure DMSO in distilled water was determined.
Valorile concentraţilor molare (µM) minime bactericide în apă distilată pentru dimerul de cupru testat (C1) şi compuşii de referinţă sunt prezentate în tabelul de mai jos: The values of the minimum bactericidal molar concentrations (µM) in distilled water for the tested copper dimer (C1) and the reference compounds are presented in the table below:
Tabel Table
Tulpina CuCl2·2H2O H3DFT1 C1 E. carotovora 4100 n/a 130 E. amylovora 2100 n/a 130 X. campestris 4100 n/a 130 P. fluorescens 4100 n/a 520 B. subtilis 4100 n/a 520 Strain CuCl2·2H2O H3DFT1 C1 E. carotovora 4100 n/a 130 E. amylovora 2100 n/a 130 X. campestris 4100 n/a 130 P. fluorescens 4100 n/a 520 B. subtilis 4100 n/a 520
n/a - la nivelul solventului DMSO (formal >1500 µM) n/a - at the DMSO solvent level (formally >1500 µM)
Activitatea bactericidă a ligandului H3DFT1 din care se obţine complexul este foarte joasă, de fapt ea practic lipseşte deoarece efectul bactericid se observă la aceeaşi diluţie (a treia) ca şi pentru DMSO, adică efectul bactericid al DMSO se manifestă la concentraţii mai mari de 12,5%. De aici rezultă că în cazuri speciale C1 poate fi utilizat şi sub formă de soluţie iniţială în DMSO pentru diluţia ulterioară cu apă, deoarece în soluţiile apoase finale aportul bactericid al DMSO va fi neglijabil. The bactericidal activity of the H3DFT1 ligand from which the complex is obtained is very low, in fact it is practically absent because the bactericidal effect is observed at the same dilution (third) as for DMSO, i.e. the bactericidal effect of DMSO is manifested at concentrations higher than 12, 5%. From this it follows that in special cases C1 can also be used as an initial solution in DMSO for subsequent dilution with water, because in the final aqueous solutions the bactericidal contribution of DMSO will be negligible.
În concluzie, compusul dimer de cupru cu formula [Cu2(H2DFT1)-µ-Cl]Cl2·H2O (C1) poate fi aplicat în agricultură sub formă de soluţii apoase cu o concentraţie nu mai mică de 130 µM (0,007%) la combaterea bolilor cauzate de bacteriile fitopatogene. In conclusion, the copper dimer compound with the formula [Cu2(H2DFT1)-µ-Cl]Cl2·H2O (C1) can be applied in agriculture in the form of aqueous solutions with a concentration not lower than 130 µM (0.007%) to combat diseases caused by phytopathogenic bacteria.
1. Lobana T.S., Sharma R., Bawa G., Khanna S. Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals - An overview. Coordination Chemistry Revs, 2009, 253, p. 977-1055 1. Lobana T.S., Sharma R., Bawa G., Khanna S. Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals - An overview. Coordination Chemistry Revs, 2009, 253, pp. 977-1055
2. Pelosi G. Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity. The Open Crystallography Journal, 2010, vol. 3, p. 16-28 2. Pelosi G. Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity. The Open Crystallography Journal, 2010, vol 3, pp 16-28
3. West D.X., Liberta A.E., Padhye S.B., Chikate R.C., Sonawane P.B., Kumbhar A.S., Yerande R.G. Thiosemicarbazone complexes of copper(II): structural and biological studies. Coordination Chemistry Revs., 1993, 123, p. 49-71 3. West D.X., Liberta A.E., Padhye S.B., Chikate R.C., Sonawane P.B., Kumbhar A.S., Yerande R.G. Thiosemicarbazone complexes of copper(II): structural and biological studies. Coordination Chemistry Revs., 1993, 123, pp. 49-71
4. WO 8500955 A1 1985.03.14 4. WO 8500955 A1 1985.03.14
5. West D.X., Yang Y., Klein T.L., Goldberg K.I., Liberta A.E., Valdes-Martinez J., Toscano R.A. Binuclear copper(II) complexes of 2-hydroxyacetophenone 4N-substituted thiosemicarbazones. Polyhedron, 1995, vol. 14, nr. 12, p. 1681-1693 5. West D.X., Yang Y., Klein T.L., Goldberg K.I., Liberta A.E., Valdes-Martinez J., Toscano R.A. Binuclear copper(II) complexes of 2-hydroxyacetophenone 4N-substituted thiosemicarbazones. Polyhedron, 1995, vol. 14, no. 12, pp. 1681-1693
6. Naik A.D., Revankar V.K. Exchange coupled dicopper(II) complexes of thiosemicarbazones. Indian J. Chem. Vol. 43A, July 2004, p. 1447-1453 6. Naik A.D., Revankar V.K. Exchange coupled dicopper(II) complexes of thiosemicarbazones. Indian J. Chem. Vol. 43A, July 2004, pp. 1447-1453
7. Schulze W., Gutsche W., Wohlrabe K., Fleck W., Tresselt D. Zur Synthese und biologischen Wirksamkeit von Analogen des 1,4-Benzochinon-guanylhydrazon-thiosemicarbazons. Farmazie, 1985, 40(8), p. 540-541 7. Schulze W., Gutsche W., Wohlrabe K., Fleck W., Tresselt D. Zur Synthese und biologischen Wirtschaftlich von Analogen des 1,4-Benzoquinone-guanylhydrazone-thiosemicarbazons. Pharmacy, 1985, 40(8), pp. 540-541
8. Hosseini-Yazdi S., Mirzaahmadi A., Khandar A.A., Eigner V., Dušek M., Lotfipour F., Mahdavi M., Soltani S., Dehghan G. Synthesis, characterization and in vitro biological activities of new water-soluble copper(II), zinc(II), and nickel(II) complexes with sulfonato-substituted Schiff base ligand. Inorganica Chimica Acta, 2017, v. 458, p. 171-180 8. Hosseini-Yazdi S., Mirzaahmadi A., Khandar A.A., Eigner V., Dušek M., Lotfipour F., Mahdavi M., Soltani S., Dehghan G. Synthesis, characterization and in vitro biological activities of new water- soluble copper(II), zinc(II), and nickel(II) complexes with sulfonato-substituted Schiff base ligand. Inorganica Chimica Acta, 2017, v. 458, p. 171-180
9. Ohui K., Afanasenko E., Bacher F., Ting R., Zafar A., BlancoCabra N., Torrents E., Domotor O., May N.V., Darvasiova D., Enyedy E.A., Popovic-Bijelic A.D., Reynisson J., Rapta P., Babak M., Pastorin G. and Arion V.B. New Water-Soluble Copper(II) Complexes with Morpholine-Thiosemicarbazone Hybrids: Insights into the Anticancer and Antibacterial Mode of Action. J. Med. Chem., Publication Date (Web): 03.12.2018, p. 512-530 9. Ohui K., Afanasenko E., Bacher F., Ting R., Zafar A., BlancoCabra N., Torrents E., Domotor O., May N.V., Darvasiova D., Enyedy E.A., Popovic-Bijelic A.D., Reynisson J., Rapta P., Babak M., Pastorin G. and Arion V.B. New Water-Soluble Copper(II) Complexes with Morpholine-Thiosemicarbazone Hybrids: Insights into the Anticancer and Antibacterial Mode of Action. J. Med. Chem., Publication Date (Web): 03.12.2018, p. 512-530
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| MDA20190004A MD4663C1 (en) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| MDA20190004A MD4663C1 (en) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MD4663B1 MD4663B1 (en) | 2019-12-31 |
| MD4663C1 true MD4663C1 (en) | 2020-07-31 |
Family
ID=69057885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MDA20190004A MD4663C1 (en) | 2019-01-28 | 2019-01-28 | Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| MD (1) | MD4663C1 (en) |
-
2019
- 2019-01-28 MD MDA20190004A patent/MD4663C1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MD4663B1 (en) | 2019-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hough-Troutman et al. | Ionic liquids with dual biological function: sweet and anti-microbial, hydrophobic quaternary ammonium-based salts | |
| Olar et al. | N, N-dimethylbiguanide complexes displaying low cytotoxicity as potential large spectrum antimicrobial agents | |
| Andrejević et al. | Silver (I) complexes with different pyridine-4, 5-dicarboxylate ligands as efficient agents for the control of cow mastitis associated pathogens | |
| Indoria et al. | Synthesis, spectroscopy, structures and antimicrobial activity of mixed-ligand zinc (II) complexes of 5-nitro-salicylaldehyde thiosemicarbazones | |
| Kasumbwe et al. | Antimicrobial and antioxidant activities of substituted halogenated coumarins | |
| MD4127C1 (en) | Use of di(m-S)-bis{chloro-[1-(pyridine-2-yl)ethanone-4-methylthiosemicarbazonato(1-)]copper} as substance with antimicrobial activity against Staphylococcus aureus | |
| Đurić et al. | Silver (I) complexes with 1, 10-phenanthroline-based ligands: The influence of epoxide function on the complex structure and biological activity | |
| CN115768517B (en) | Antimicrobial agent for non-human animals | |
| Kalia et al. | Antimicrobial and toxicological studies of some metal complexes of 4-methylpiperazine-1-carbodithioate and phenanthroline mixed ligands | |
| CN107118142A (en) | Mancopper compound and preparation method and application | |
| EP2681996A1 (en) | Biocidal compositions | |
| MD4663C1 (en) | Use of 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate as an agent against phytopathogenic bacteria | |
| WO2008078723A1 (en) | Antibacterial agent and bactericidal agent | |
| Novais et al. | New fluorescent rosamine chelator showing promising antibacterial activity against Gram-positive bacteria | |
| Corrado et al. | Comparison of the effectiveness of several commercial products and two new copper complexes to control Pseudomonas syringae pv. actinidiae | |
| Gausman et al. | Fungicidal properties of some carbonic and thiocarbonic acid derivatives of hydrazine | |
| JP5398709B2 (en) | Antibacterial and bactericidal agents | |
| CN102037964B (en) | Application of farrerol in preparing bactericides | |
| KR100893065B1 (en) | Antimicrobial composition containing chlorogenic acid as an active ingredient | |
| Al-Bari et al. | In vitro Antimicrobial Properties and Cytotoxic Activities of (Two Novel Deleted) Chromium Complexes | |
| MD4687C1 (en) | Water-soluble compound 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate for use as a selective pharmaceutical agent against Gram-positive bacteria | |
| US3265563A (en) | Phenyl nu-alkyl thiolcarbamate microbiocide | |
| MD4696C1 (en) | Water-soluble compound 2,6-bis(S-methylisothiosemicarbazidomethylidene)-4-methylphenolato-trichloro-dicopper-hydrate for use as an antifungal agent | |
| KR20120124084A (en) | Eugenol derivatives and its use | |
| Saranya et al. | Novel Schiff base metal (II) complexes with azide as coligands: A study on antimicrobial, larvicidal and antioxidant activities |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG4A | Patent for invention issued | ||
| TC4A | Change of name of proprietor (patent for invention) |
Owner name: INSTITUTIA PUBLICA UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA, MD STR. A. MATEEVICI NR. 60, MD-2009, CHISINAU, REPUBLICA MOLDOVA Free format text: PREVIOUS NAME OF PROPRIETOR: INSTITUTUL DE CHIMIE, MINISTERUL EDUCATIEI, CULTURII SI CERCETARII, MD STR. ACADEMIEI NR. 3, MD-2028, REPUBLICA MOLDOVA |
|
| KA4A | Patent for invention lapsed due to non-payment of fees (with right of restoration) | ||
| MM4A | Patent for invention definitely lapsed due to non-payment of fees |