MD4687C1 - Compus hidrosolubil 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat pentru utilizare în calitate de remediu farmaceutic selectiv contra bacteriilor Gram-pozitive - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la utilizarea unui compus coordinativ de cupru în bază de izotiosemicarbazone aromatice în calitate de remediu antibacterian şi poate fi aplicată în medicină.Compusul binuclear de cupru(II) hidrosolubil cu formula [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O, unde H3DF-T1 reprezintă bis(S-metilizotiosemicarbazona) 2,6-diformil-4-metilfenolului: ,posedă o activitate bactericidă selectivă până la concentraţii minime de 1...2 µg/mL faţă de bacteriile patogene Gram-pozitive.Compusul binuclear de cupru sus-menţionat poate fi aplicat sub formă de soluţii apoase diluate pentru combaterea diferitor bacterioze.

Description

Invenţia se referă la utilizarea unui compus coordinativ de cupru în bază de izotiosemicarbazone aromatice în calitate de remediu antibacterian şi poate fi aplicată în medicină.

Tiosemicarbazonele şi compuşii coordinativi respectivi cu unele metale de tranziţie, în special cupru, pot manifesta în unele cazuri un spectru larg de acivitate farmacologică [1, 2, 3]. Activitatea biologică a tiosemicarbazonelor şi compuşilor lor coordinativi variază foarte larg în funcţie de natura metalului, structura ligandului sau a complexului, natura substituenţilor atât din fragmentul carbonilic cât şi la fragmentul tiosemicarbazidic. Ultimul poate fi derivatizat prin substituţie la atomii de azot sau la sulful din gruparea tiocarbonilică.

Ca o ilustrare a dependenţei activităţii biologice de structura ligandului sau a compusului coordinativ de metal pot servi complecşii binucleari de cupru(II) cu tiosemicarbazonele N4-substituite a hidroxiacetofenonei. Dimerii de cupru nu posedă o activitate de inhibare faţă de Aspergillus niger, dar în schimb sunt activi faţă de Paecilomyces variotii [4].

Alţi complecşi binucleari (dimeri) de cupru(II), şi anume în baza ligandului binucleabil - bis(4-feniltiosemicarbazona) 2,6-diformil-4-metilfenolului, sunt inactivi faţă de diferite specii de bacterii sau fungi [5].

O cale relativ mai puţin utilizată pentru derivatizarea tiosemicarbazidelor constă în alchilarea atomului donor de sulf tionic cu obţinerea S-alchilizotiosemicarbazidelor. În urma alchilării atomului de sulf, se reduce drastic capacitatea de coordinare a atomului tioeteric format cu majoritatea metalelor de tranziţie. Ca urmare, atomul de sulf din fragmentul izotiosemicarbazidic nu mai participă la coordinare, iar locul lui în setul de atomi donor ai izotiosemicarbazidei este ocupat de atomul terminal N4. Din datele din Stadiul tehnicii reiese că alchilarea sulfului din fragmentul tiosemicarbazidic în multe cazuri nu contribuie la ridicarea activităţii biologice a tiosemicarbazonelor şi compuşilor coordinativi. De exemplu, pentru derivaţii S-alchilaţi ai 1,4-benzochinon-izotiosemicarbazon-guanilhidrazonei s-a stabilit că un rezultatul alchilării sulfului se micşorează activitatea antibacteriană comparativ cu tiosemicarbazona iniţială [6]. Alt exemplu poate servi tiosemicarbazona aldehidei benzoice, care posedă o activitate antituberculoasă. Dar derivatul S-substituit S-alchilizotiosemicarbazona aldehidei benzoice nu mai este activ contra bacilului tuberculos [7]. Din studiul comparativ al activităţii antiproliferative al complecşilor metalelor, inclusiv al cuprului, cu tiosemicarbazone hidroxiaromatice nealchilate şi S-metilizotiosemicarbazonele respective reiese că alchilarea sulfului reduce drastic capacitatea complecşilor de a inhiba proliferarea celulelor canceroase [8]. Efectul tiometilării atomului de sulf tiosemicarbazidic asupra activităţii biologice poate fi divergent. De exemplu, analogul S-metilic H2L6 este mai citotoxic decât compusul nealchilat H2L1:

,

pe de altă parte compusul dimer [Cu2L6 Cl3] posedă o activitate mai redusă faţă de liniile de celule canceroase decât [Cu2HL1Cl3] [9].

În unele cazuri coordinarea izotiosemicarbazonelor cu metale poate să mărească activitatea biologică a S-metilizotiosemicarbazonelor. De exemplu, S-alchilizotio-semicarbazonele aldehidei 5-metilsalicilice posedă o activitate antibacteriană redusă faţă de tulpinile S. aureus, B. cereus ş.a., concentraţia minimă inhibitoare fiind la nivelul de 400 µg/mL. În schimb compuşii binucleari ai fierului trivalent (µ-oxodimeri) cu N1,N4-bis(saliciliden)-S-metil-izotiosemicarbazida sunt activi faţă de tulpinile sus-menţionate la concentraţii de 10...50 µg/mL, totodată compuşii mononucleari sunt considerabil mai puţin activi, concentraţia minimă inhibitoare situându-se în intervalul 100...500 µg/mL [10]. Pe de altă parte sunt cunoscute date că unele tiosemicarbazone, necoordinate la ionii de metal, manifestă o activitate antimicrobiană semnificativ mai mare decât compuşii respectivi dinucleari ai cuprului(II) [4].

Dezavantajul acestor compuşi biologic activi constă în faptul că foarte mulţi din ei sunt insolubili sau foarte puţin solubili în apă. Având în vedere că apa reprezintă solventul biologic natural din componenţa organismelor vii, şi reieşind din considerentele practice de pregătire şi aplicare a remediilor antimicrobiene, este foarte de dorit de a elabora ingredienţi activi solubili în apă (hidrosolubili). Aceasta ar permite de a mări eficacitatea remediilor antibacteriene utilizate sub formă de soluţii apoase, evitând folosirea solvenţilor organici, diferitor adjuvanţi de solubilizare sau umectare, cu toate consecinţele pozitive şi pentru toxicitate, costuri economice etc. Majoritatea absolută de tiosemicarbazone şi complecşii lor sunt insolubili în apă. O metodă de a conferi hidrosolubiltate constă în introducerea în ligandul organic a unor grupe hidrofile ca grupa sulfonică (-SO3H) sau carboxilică (-COOH). Aceste grupe uşor se ionizează în mediul bazic cu formarea sărurilor respective ale metalelor alcaline sau amoniu, care de regulă conferă solubilitate în apă ligandului sau complexului respectiv.

Pe această cale au fost obţinuţi complecşi hidrosolubili de cupru, zinc şi nichel cu tiosemicarbazone ale aldehidelor aromatice sulfonate [11]. Solubilitatea lor în apă a permis testarea in vivo a activităţii biologice, în special a citotoxicităţii contra celulelor de leucemie cronică mieloidă umană. Un dezavantaj al acestor compuşi constă în aceea că introducerea grupei sulfonice necesită stadii suplimentare de sinteză organică, în plus grupa sulfonică poate influenţa negativ asupra activităţii biologice.

În scopul de a obţine tiosemicarbazone heteroaromatice şi complecşi de cupru(II) hidrosolubili cu activitate antiproliferativă contra celulelor anticanceroase, în nucleul heteroaromatic s-a introdus grupa morfolinică, care poate conferi o hidrosolubilitate şi spori activitatea biologică a compuşilor rezultaţi [12].

Au fost sintetizate diverse tiosemicarbazone pe bază de 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidă (HL1-HL6) şi complecşii respectivi de cupru (1-6), care s-a dovedit că sunt deja hidrosolubili:

S-a determinat că o parte din compuşii coordinativi formează dimeri slabi (asociaţi) în stare solidă, care în soluţie apoasă se scindează în monomerii reprezentaţi mai sus. Totodată liganzii şi complecşii lor de cupru au fost testaţi şi pentru activitate antibacteriană faţă de microorganismele Gram-pozitive S.aureus şi Gram-negative P. aeruginosa. HL1-HL5 împreună cu complecşii 1 - 5 au arătat o activitate antibacteriană considerabilă faţă de bacteriile S.aureus. În schimb ligandul HL6 în bază de S-metilizotiosemicarbazidă şi complexul 6, spre deosebire de ceilalţi compuşi, au manifestat un nivel foarte redus de activitate antibacteriană. Alt dezavantaj constă că sinteza 5-metilmorfolin-piridin-2-carboxaldehidei, care conferă în final hidrosolubilitate complecşilor, este destul de anevoioasă şi necesită şapte stadii de sinteză.

Pentru compuşii coordinativi ai Cu cu derivaţii S-metilizotiosemicarbazonelor hidroxiaromatice, structural destul de apropiaţi de compusul utilizat de solicitanţi în revendicări, anume cu 4-alil-S-metilizotiosemicarbazona 3,5-dibromosalicilaldehidei, s-a depistat că ei posedă o activitate antibacteriană [13]. Dezavantajul acestor compuşi constă în faptul că nu sunt solubili în apă.

Recent au fost descrişi compuşii coordinativi ai cuprului(II) cu 4-alil-S-metilizotiosemicarbazona aldehidei salicilice care manifestă proprietăţi antibacteriene pronunţate [14]. Aceşti compuşi pot fi consideraţi ca cei mai apropiaţi din punct de vedere structural şi după activitatea antibacteriană în raport cu compusul propus pentru utilizare în invenţia revendicată. Dezavantajul compuşilor din analogul proxim constă în faptul că ei nu sunt solubili în apă, iar activitatea antibacteriană nu este destul de înaltă.

Problema soluţionată de invenţie constă în extinderea gamei de remedii antibacteriene contra speciilor patogene în bază de compuşi coordinativi (combinaţii complexe) ai cuprului(II) cu izotiosemicarbazone aromatice şi care să fie solubile în apă (hidrosolubile).

Problema s-a soluţionat printr-o analiză şi o selecţie neevidentă dintre compuşii coordinativi binucleari (dimeri) ai cuprului hidrosolubili cu derivaţi de izotiosemicarbazone aromatice binucleabile, urmată de sinteza şi investigaţii microbiologice corespunzătoare. Totodată pentru referinţă au fost sintetizaţi doi compuşi coordinativi hidrosolubili ai cuprului cu izotiosemicarbazone aromatice apropiate structural, dar pentru care solicitanţii au depistat că ultimii nu posedă o activitate antibacteriană înaltă. De aici rezultă că între activitatea antibacteriană şi hidrosolubilitatea compuşilor coordinativi ai cuprului(II) cu izotiosemicarbazone nu există o legătură cauzală univocă.

Esenţa invenţiei constă în aceea că pentru un compus binuclear al cuprului(II) hidrosolubil în bază de derivat S-alchilat al tiosemicarbazidei, şi anume 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat, s-a depistat că în soluţii apoase el posedă o activitate pronunţată contra bacteriilor patogene Gram-pozitive. În rezultat compusul dat se propune pentru utilizare în calitate de remediu antibacterian selectiv faţă de tulpinile patogene Gram-pozitive.

Rezultatul atins de invenţie constă în faptul că în soluţii apoase combinaţia complexă binucleară 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat posedă o activitate antibacteriană faţă de tulpinile patogene Gram-pozitive la concentraţii minime inhibitorii sau bactericide în intervalul de valori de 0,5...2 µg/mL.

Ligandul (H3DF-T1) din componenţa compusului cordinativ este unul binucleabil, adică poate coordona simultan doi ioni de cupru cu utilizarea punţii de fenolat şi a patru atomi donori de azot N1 şi N4 ale ambelor „braţe” izotiosemicarbazidice, deoarece, ca urmare a alchilării atomilor donor de sulf, ultimii nu se mai pot coordina la ionii de cupru(II). În medii neutre ligandul se coordonează în formă monodeprotonizată în urma disocierii grupei fenolice, iar în medii bazice - în formă trideprotonizată, datorită disocierii suplimentare a câte un proton de la grupele amino terminale din braţele izotiosemicarbazidice. Structura H3DF-T1 este redată mai jos:

.

Compusul coordinativ se obţine la interacţiunea H3DF-T1 cu clorură de cupru(II) în mediu alcoolic şi reprezintă un dimer de cupru coordinat cu ligandul monodeprotonizat, mai conţine trei ioni de clor şi o moleculă de apă de cristalizare - 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat. Reieşind din datele analizei elementale, spectrale şi proprietăţilor chimice şi magnetochimice dimerul de cupru foarte probabil că are următoarea structură [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O, unde H2DF-T1 reprezintă ligandul iniţial monodeprotonizat la atomul punte de oxigen fenolic, iar notarea µ-Cl denotă faptul că un ion de clor are rolul de a doua punte între ionii de Cu(II):

.

Nu este exclus că ceilalţi doi anioni de clor să coordineze apical la fiecare ion de cupru, iar la dizolvarea dimerului în apă să disocieze uşor din sfera internă a compusului coordinativ cu formarea electroliţilor de tipul 1:2, fapt ce ar contribui la hidrosolubilitatea dimerului de cupru. Conform regulilor de nomenclatură chimică denumirea desfăşurată a compusului poate fi {µ-cloro-[2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-N1,N4,N ́1,N ́4,µ-O]dicupru(II)}-dicloro-hidrat. Din considerente practice dimerul de cupru utilizat în continuare va fi notat prin C1.

Complexul C1 este cunoscut din Stadiul tehnicii (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, No. 8, pp. 2017-2022), dar activitatea lui biologică nu a fost cercetată.

[Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O este solubil în apă şi formează soluţii verde-intens la concentraţii relativ mici. Această hidrosolubilitate este una mai puţin obişnuită, deoarece dimerul analog de cupru cu tiosemicarbazona nealchilată, tot cu trei ioni de clor în componenţa sa, este insolubil în apă.

Rezultatul neevident al invenţiei este evidenţiat de faptul că pentru comparaţie au fost sintetizaţi compuşi coordinativi ai cuprului(II) cu liganzi structural foarte apropiaţi cu grupa funcţională carboxilică legată de inelul aromatic, care după analogie cu grupa sulfonică [11] pot forma săruri hidrosolubile a compuşilor coordinativi ai cuprului. Pentru aceasta au fost utilizaţi următorii liganzi polifuncţionali şi binucleabili - tiosemicarbazona acidului 3-formilsalicilic (H3FSA-T):

şi S-metilizotiosemicarbazona acidului 3-formilsalicilic (H3FSA-T1):

.

În rezultatul condensării template în mediu bazic dintre H3FSA-T şi acidul 3-formilsalicilic, a fost sintetizată sare hidrosolubilă de potasiu a compusului mononuclear de cupru (în continuare C2). Sinteza s-a efectuat în esenţă analogic cu sinteza compusului de nichel(II), similar după structură şi hidrosolubilitate, descris anterior în literatura nonbrevet (Zhovmir F.K., Gerbeleu N.V. Template synthesis and properties of coordination compounds of nickel(II) with binucleating ligands based on thiosemicarbazide and 3-formylsalicylic acid. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1984, 29, No. 9, pp. 2304-2308). Compusul C2 are următoarea formulă:

.

La interacţiunea H3FSA-T1 cu clorură de cupru(II) în mediu etanol-apă, în prezenţa unui exces mic de hidroxid de potasiu, s-a obţinut compusul mononuclear (în continuare C3), în care grupa carboxilă este ionizată, fapt ce-i conferă hidrosolubilitate:

.

Ambii compuşi C2 şi C3, deşi sunt solubil în apă, în urma testărilor microbiologice au arătat că posedă o activitate antibacteriană cu mult mai redusă faţă de C1 - aproximativ de 100 de ori mai mică.

În calitate de microorganisme-test pentru evaluarea activităţii antibacteriene au fost selectate tulpinile patogene Gram-pozitive de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 11778, tulpinile patogene Gram-negative: Escherichia coli ATCC 25922 şi Acinetobacter baumannii ATCC BAA-747.

Evaluarea activităţii antibacteriene s-a efectuat in vitro prin metoda diluţiilor succesive duble, conform protocolului standard.

După cum reiese din rezultatele testării activităţii antibacteriene soluţiile apoase puternic diluate a dimerului de cupru selectat posedă o activitate antibacteriană înaltă şi selectivă faţă de bacteriile Gram-pozitive. Concentraţia minimă bactericidă fiind în jur de 1µg/mL. Faţă de bacteriile Gram-negative compusul C1 posedă o activitate antibacteriană redusă de aproximativ de 100 de ori. Totodată, pentru comparaţie, compusul coordinativ al cuprului(II) din analogul proxim clorura de [diaqua-4-alil-S-metilizotiosemicarbazidosalicilidenato(-)-cupru(II)] manifestă o activitate antibacteriană semnificativ mai redusă faţă de Staphylococcus aureus ATCC 25923 [14]. Concentraţia minimă inhibitorie sau bactericidă este de 120 µg/mL, adică mai mare cu două ordine faţă de C1.

Din Stadiul tehnicii se cunoaşte că S-alchilarea tiosemicarbazidei diminuează activitatea antibacteriană a izotiosemicarbazonelor [6, 7, 12]. De aceea activitatea bactericidă faţă de bacteriile patogene a C1, care face parte din grupa de compuşi coordinativi cu izotiosemicarbazone, este una neaşteptată.

Avantajele invenţiei constau în următoarele:

- compusul coordinativ binuclear de cupru cu bis(S-metilizotiosemicarbazona) 2,6-diformil-4-metilfenolului este solubil în apă - mediul natural celular (in vivo);

- posedă o activitate bactericidă la concentraţii mici, de ordinul unui µg/mL;

- sinteza compusului coordinativ este una relativ simplă şi se realizează din precursori accesibili comercial.

În concluzie din cercetările microbiologice rezultă că compusul binuclear de cupru C1 poate fi aplicat în farmaceutică sub formă de soluţii apoase diluate la combaterea diferitor bacterioze.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1: sinteza compusului C1: [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O

Ligandul precursor bis(S-metilizotiosemicarbazona) de 2,6-diformil-4-metilfenol (H3DF-T1) şi compusul de cupru C1 testat au fost descrişi anterior (Gerbeleu N.V., Revenko M.D., Zhovmir F.K., Kuyavskaia B.Ya. Binuclear compounds of copper(II) with ligands based on chalcogensemicarbazides and 2,6-diformyl-4-methylphenol. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1986, 31, No. 8, pp. 2017-2022). Conform procedeului bine cunoscut a fost sintetizată hidroiodura de S-metilizotiosemicarbazidă prin alchilarea tiosemicarbazidei cu iodmetan în mediu de etanol. În continuare hidroiodura de izotiosemicarbazidă a fost condensată în mediu etanol-apă, în prezenţă de carbonat de sodiu, cu 2,6-diformil-4-metilfenol.

Ligandul este insolubil în apă, solubil în DMSO sau DMF şi se caracterizează prin următoarele caracteristici. P.t. 208...211°C.

Benzile reprezentative în spectrul IR înregistrat cu spectrometrul FT-IR PerkinElmer Spectrum 100 (disc KBr, cm-1): 3484s, 3404s, asc, 3081s, 1636p, asc, 1607p, 1517fp, asc, 1299p, asc, 1016m, asc, 757p, asc, 691m, asc (unde s semnifică slab, m - mediu, p - puternic, fp - foarte puternic şi asc - ascuţit).

Compusul coordinativ de cupru C1 s-a obţinut conform unui procedeu modificat:

La suspensia de H3DF-T1, (1,70 g, 5 mmoli) în metanol (100 mL) se adaugă la temperatura camerei CuCl2·2H2O (1,70 g, 10 mmoli). Amestecul se agită magnetic timp de cca 15 min până dispare ligandul iniţial de culoare galbenă, apoi se încălzeşte la temperatura de 50...60°C timp de 0,5 ore. După răcire, peste 4...6 ore produsul cristalin verde se filtrează, se spală cu metanol, apoi cu eter şi se usucă la aer. Se obţin 2,86 g (97%) de produs cristalin (microace) de culoare verde.

Produsul (C1) este solubil în apă (cca 1%), DMSO sau DMF, în care formează soluţii limpezi de culoare verde-intens. Soluţiile apoase peste 24 ore încep foarte lent să capete o nuanţă nucărie fără a se forma un careva precipitat în decurs de 6 luni.

La păstrare în flacoane închise etanş, ferite de lumină, C1 este stabil cel puţin 3 ani de zile.

Spectrul IR(disc KBr, cm-1): 3503s, 3419s, asc., 3300s, 2797m, 1555fp, asc, 1315p, asc, 1144p, asc, 904m, asc, 713m.

Exemplul 2: sinteza compusului C2: K3[Cu((fsa)2T)]·4H2O

Ligandul precursor tiosemicarbazona acidului 3-formilsalicilic (H3FSA-T), p.t. 211 °C, a fost descris anterior (Zhovmir F.K., Gerbeleu N.V. Template synthesis and properties of coordination compounds of nickel(II) with binucleating ligands based on thiosemicarbazide and 3-formylsalicylic acid. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1984, 29, No. 9, pp. 2304-2308).

Spectrul IR(disc KBr, cm-1): 3677s, 3442m asc., 3287m, 3168p, 2974s, 2902s, 1663p (νasCOOH), 1611p, 1600p, 1549p, 1450m, 1412p, 1380m, 1225fp, 1151fp, 1108p, 1079p, 1064p, 946m, 754p, 702m, 672m asc.

Complexul hidrosolubil K3[Cu((fsa)2T)]·4H2O a fost sintetizat prin condensarea templată pe matrice de Cu(II) a H3FSA-T cu acidul 3-formilsalicilic (H2FSA) în mediu bazic puternic. Soluţia de CuCl2·2H2O (1,70 g, 10 mmol) în metanol (100 mL) se adaugă cu picătura la agitare magnetică la o soluţie de metanol-apă (7:3, 100 mL), încălzită la 50...60°C, care conţine H3FSA-T (2,50 g, ~10,1 mmol), H2FSA (2,00 g, ~12 mmol) şi KOH (12,0 g, ~214 mmol). După finalizarea adăugării se menţine temperatura suspensiei cristaline formate de culoare cafenie-roşie aproximativ 0,5 ore şi se lasă amestecul să se răcească pentru aproximativ 24 ore. Se filtrează precipitatul cristalin (microace) cafeniu-întunecat cu nuanţă roşie, se spală cu metanol, apoi cu eter dietilic şi se usucă la aer. Randamentul constituie 5,05...5,39g (79...84%).

Produsul este solubil în apă, DMSO şi DMF, insolubil în etanol, acetonitril. Soluţiile apoase posedă o culoare cafenie-roş foarte intensă şi sunt stabile cel puţin o lună.

Rezultatele analizei elementale confirmă structura propusă:

Găsit, %: Cu - 10,45; C - 31,22; H - 2,28; N - 6,70.

Pentru C17H16CuK3N3O10S calculat, %: Cu - 10,00; C - 32,14; H - 2,54; N - 6,61.

Spectrul IR(disc KBr, cm-1): 3203m, f. larg, 1601fp, 1535fp, 1418p, 1374p, 1305p, 1222m asc, 1122p, 1083p, 1035m, 986m, 881sl asc, 870sl, 830sl, 798sl, 745m. f. asc, 671sl.

Exemplul 3: sinteza compusului C3: K[Cu(HFSA-T1)Cl]·2H2O

Ligandul precursor S-metilizotiosemicarbazona acidului 3-formilsalicilic- hemihidrat (H3FSA-T1·0,5H2O) a fost obţinut conform procedeului descris (Zhovmir F.K., Gerbeleu N.V. Template synthesis and properties of coordination compounds of nickel(II) with binucleating ligands based on thiosemicarbazide and 3-formylsalicylic acid. Zhurn. Neorg. Khimii (J. Inorg.Chem. USSR), 1984, 29, No. 9, pp. 2304-2308).

Spectrul IR(disc KBr, cm-1): 3541s, 3480s, 3241m, 2888m, 2681m, 1653p (νasCOOH), 1628p, 1615p, 1598p, 1553m, 1475p asc, 1432fp asc, 1393fp asc, 1353m, 1289fp, 1188m, 1141 asc, 1066m, 956s, 940s, 842p asc, 811p, 762m asc, 737s, 664s asc.

Complexul de cupru C3 s-a obţinut conform următorului procedeu:

Soluţia de CuCl2·2H2O (0,87 g, 5 mmol) în etanol (30 mL) se adaugă cu picătura la agitare magnetică la o soluţie de etanol-apă (20:8, 28 mL), la temperatura camerei, care conţine H3FSA-T1·0,5H2O (1,31 g, ~10,1 mmol) şi KOH (1,12 g, ~20 mmol). După finalizarea adăugării se menţine aproximativ o oră agitarea suspensiei cristaline formate de culoare verde-kaki. Se filtrează precipitatul cristalin (microace) verde-kaki, se spală cu etanol, apoi cu eter dietilic şi se usucă la aer. După uscare se obţine 1,10g (54%) de praf cristalin verde-baltă cu nuanţă surie.

Produsul este solubil în apă, DMSO sau DMF, insolubil în etanol, acetonitril.

Pentru C10H13ClCuKN3O5S găsit, %: Cu - 15,35; C - 29,59; H - 3,06; N - 9,24, 9,55;

calculat, %: Cu - 14,94; C - 28,23; H - 3,08; N - 9,87.

Spectrul IR(disc KBr, cm-1): 1604m, 1590m, 1540p, 1487fp, 1418p, 1357p, 1283m, 1133m, 916m asc, 870m asc, 754m asc, 673m.

Exemplul 4: evaluarea activităţii antibacteriene a compuşilor

Tulpinile de microorganisme selectate pentru testarea microbiologică au fost furnizate de Colecţia Naţională de Microorganisme Patogene. Au fost utilizate următoarele tulpini patogene Gram-pozitive: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 11778. În calitate de tulpini patogene Gram-negative au fost ultilizate Escherichia coli ATCC 25922 şi Acinetobacter baumannii ATCC BAA-747.

Evaluarea activităţii antibacteriene s-a efectuat in vitro prin metoda diluţiilor succesive duble, conform protocolului standard, care constă în aceea că la etapa iniţială se iau şiruri de 10 eprubete în care se introduc câte 1 mL de bulion peptonat de carne de 2%, pH=7,0. Ulterior se picură 1 mL de preparat în prima eprubetă (din şirul de 10 eprubete). Se pipetează amestecul obţinut, după care 1 mL din acesta se transferă în eprubeta următoare, astfel că procedura se repetă până la eprubeta nr.10 a şirului. În aşa mod, concentraţia preparatului iniţial se micşorează de 2 ori în fiecare eprubetă următoare. În acelaşi timp, se prepară culturi de 24 ore de bacterii-test. Se prepară iniţial suspensii de culturi bacteriene cu densităţile optice (D.O.) de 2,0 în conformitate cu indicele McFarland. Ulterior, se transferă 1 mL de suspensie bacteriană obţinută într-o eprubetă ce conţine 9 mL de apă distilată sterilă. Se amestecă conţinutul obţinut, după care se transferă 1 mL în eprubeta cu nr.2 din şirul de 5 eprubete ce conţin câte 9 mL de apă distilată sterilă. Din eprubeta cu nr.5 a şirului se ia câte 0,1 mL de suspensie bacteriană, ceea ce reprezintă doza de însămânţare, şi se adaugă în fiecare eprubetă care conţine preparatele titrate. Ulterior, eprubetele cu preparatele titrate în care s-au introdus dozele de însămânţare ale bacteriilor se plasează în termostat la temperatura de 35°C timp de 24 ore. A 2-a zi se analizează preliminar rezultatele obţinute. Ultima eprubetă din şir în care nu se atestă o creştere vizibilă a bacteriilor se consideră a fi concentraţia minimă inhibitorie (CMI) a preparatului. Pentru aprecierea concentraţiei minime bactericide (CMB), conţinutul eprubetelor cu CMI şi a eprubetelor cu concentraţii mai înalte ale preparatelor se însămânţează pe agarul peptonat solid din cutiile Petri cu ajutorul ansei bacteriologice. Cutiile însămânţate se plasează în termostat la temperatura de 35°C pentru 24 ore. Concentraţia preparatelor care nu permit creşterea nici a unei colonii bacteriene se consideră a fi concentraţia minimă bactericidă a compusului.

Pentru evaluare s-au pregătit soluţii proaspete de 0,5% ale compuşilor sintetizaţi C1, C2 şi C3 în apă distilată.

Rezultatele testării activităţii antibacteriene exprimate în valorile concentraţilor minime inhibitorii (CMI) şi concentraţiilor minime bactericide (CMB) în µg/mL pentru dimerul de cupru revendicat C1 şi compuşii de referinţă sintetizaţi (C2, C3) sunt prezentate în tabelul de mai jos. Totodată pentru comparaţie în tabel au fost incluse datele din Stadiul tehnicii privind activitatea antibacteriană a analogului proxim structural C4 - compusul [Cu(L)(H2O)2]Cl, (notat ca (1) în [14]), unde HL reprezintă 4-alil-S-metilizotiosemicarbazona aldehidei salicilice.

Tabel

Activitatea antibacteriană a compuşilor testaţi (concentraţiile minime sunt date în µg/mL)

Tulpina C1 C2 C3 C4 ([14]) CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB Staphylococcus aureus ATCC 25923 1 2 125 250 31 63 120 120 Bacillus cereus ATCC 11778 0,5 1 250 500 31 63 - - Bacillus subtilis ATCC 6633 0,5 1 125 250 31 63 - - Escherichia coli ATCC 25922 250 500 - - - - 120 120 Acinetobacter baumannii ATCC BAA-747 250 500 - - - - - -

Din datele prezentate în tabel rezultă că C1 posedă o activitate antibacteriană mai mare de peste 60...100 de ori, comparativ cu alţi complecşi hidrosolubili ai cuprului(II) cu S-metilizotiosemicarbazone hidroxiaromatice (C2, C3) sau cu C4 din analogul proxim. Totodată efectul antibacterian al C1 este unul selectiv - efectul este unul pronunţat doar pentru bacteriile Gram-pozitive.

Compusul C1, fiind solubil în dimetilsulfoxid (DMSO), poate fi utilizat în cazuri speciale şi sub formă de soluţii în DMSO pentru diluţia ulterioară cu apă, totodată în soluţiile apoase foarte diluate orice interferenţă a DMSO va fi neglijabilă.

În concluzie, compusul dimer de cupru cu formula [Cu2(H2DF-T1)-µ-Cl]Cl2·H2O (C1) poate fi aplicat în farmaceutică sub formă de soluţii apoase în concentraţii foarte mici, de ordinul miimelor de procent (0,001% = 10µg/mL) şi mai jos, pentru combaterea bacteriozelor provocate de bacteriile patogene Gram-pozitive.

1. Lobana T.S., Sharma R., Bawa G., Khanna S. Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals - An overview. Coordination Chemistry Revs, 253, 2009, pag. 977-1055

2. Pelosi G. Thiosemicarbazone Metal Complexes: From Structure to Activity. The Open Crystallography Journal, 2010, vol. 3, pag. 16-28

3. West D.X., Liberta A.E., Padhye S.B., Chikate R.C., Sonawane P.B., Kumbhar A.S., Yerande R.G. Thiosemicarbazone complexes of copper(II): structural and biological studies. Coordination Chemistry Revs, 123, 1993, pag. 49-71

4. West D.X., Yang Y., Klein T.L., Goldberg K.I., Liberta A.E., Valdes-Martinez J., Toscano R.A. Binuclear copper(II) complexes of 2-hydroxyacetophenone 4N-substituted thiosemicarbazones. Polyhedron, 1995, vol. 14 (12), pag. 1681-1693

5. Naik A.D., Revankar V.K. Exchange coupled dicopper(II) complexes of thiosemicarbazones. Indian Journal of Chemistry, vol. 43A, iulie 2004, pag.1447-1453

6. Schulze W., Gutsche W., Wohlrabe K., Fleck W., Tresselt D. Zur Synthese und biologischen Wirksamkeit von Analogen des 1,4-Benzochinon-guanylhydrazon-thiosemicarbazons. Farmazie, 1985, 40(8), pag. 540-541

7. Kitaev Iu. P., Buzikin B.I. Hydrazones (in Russian). Moscow, Nauka, 1974, pag. 383

8. Gulea A., Pourier D., Roy J., Stavila V., Bulimestru I., Ţapcov V., Bîrcă M., Popovschi L. In vitro antileukemia, antibacterial and antifungal activities of some 3d metal complexes: Chemical synthesis and structure-activity relationships. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2008, 23(6), pag. 806-818

9. Zaltariov M.F., Hammerstad M., Arabshahi H.L., Jovanovic K., Richter K.W., Cazacu M., Shova S., Balan M., Andersen N.H., Radulovic S., Reynisson J., Andersson K.K. and Arion V.B.. New Iminodiacetate-Thiosemicarbazone Hybrids and Their Copper(II) Complexes Are Potential Ribonucleotide Reductase R2 Inhibitors with High Antiproliferative Activity. Inorganic Chemistry, 2017, 56(6), pag. 3532-3549

10. Shleahov A.N., Malinovskii T.I., Shova S.G., Burdenko T.A., Simonova L.L. Antimicrobial activity of Fe3+ complexes with S-alkylisothiosemicarbazones of substituted salicylic aldehydes (In Russian). Khimiko-Farmatzevticheskii Zhurnal (Soviet Chemical Pharmaceutical Journal), 1984, vol. 18 (12), pag.1464-1466

11. Hosseini-Yazdi S., Mirzaahmadi A., Khandar A.A., Eigner V., Dušek M., Lotfipour F., Mahdavi M., Soltani S., Dehghan G. Synthesis, characterization and in vitro biological activities of new water-soluble copper(II), zinc(II), and nickel(II) complexes with sulfonato-substituted Schiff base ligand. Inorganica Chimica Acta, 458, 2017, pag. 171-180

12. Ohui K., Afanasenko E., Bacher F., Ting R., Zafar A., BlancoCabra N., Torrents E., Domotor O., May N.V., Darvasiova D., Enyedy E.A., Popovic-Bijelic A.D., Reynisson J., Rapta P., Babak M., Pastorin G. and Arion V.B. New Water-Soluble Copper(II) Complexes with Morpholine-Thiosemicarbazone Hybrids: Insights into the Anticancer and Antibacterial Mode of Action. Journal of Medicinal Chemistry, 03 decembrie 2018, pag. 512-530

13. Usataia I., Graur V., Tsapcov V., Vasîlca M., Bălan G., Burduniuc O., Gulea A. Antibacterial and antifungal activities or iron(III), cobalt(III), nickel(II) and copper(II) coordination compounds with 3,5-dibromosalicylaldehyde 4-allyl-S-metylizothiosemicarbazone. International Scientific Conference on Microbial Biotechnology (4th Edition). Chişinău, Moldova, 11-12 octombrie, 2018, pag. 57-58

14. Pahontu E., Usataia I., Graur V., Chumakov Y., Petrenko P., Gudumac V. and Gulea A. Synthesis, characterization, crystal structure of novel Cu(II), Co(III), Fe(III) and Cr(III) complexes with 2-hydroxybenzaldehyde-4-allyl-S-methylisothiosemicarbazone: Antimicrobial, antioxidant and in vitro antiproliferative activity. Applied Organometallic Chemistry (published on-line by John Wiley & Sons, Ltd), 2018; e4544

Claims (1)

1. Compus hidrosolubil 2,6-bis(S-metilizotiosemicarbazidometiliden)-4-metilfenolato-tricloro-dicupru-hidrat pentru utilizare în calitate de remediu farmaceutic selectiv contra bacteriilor Gram-pozitive.