MD3484913T2 - Metode și compoziții pentru tratamentul cancerului - Google Patents
Metode și compoziții pentru tratamentul cancerului Download PDFInfo
- Publication number
- MD3484913T2 MD3484913T2 MDE20190609T MDE20190609T MD3484913T2 MD 3484913 T2 MD3484913 T2 MD 3484913T2 MD E20190609 T MDE20190609 T MD E20190609T MD E20190609 T MDE20190609 T MD E20190609T MD 3484913 T2 MD3484913 T2 MD 3484913T2
- Authority
- MD
- Moldova
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- functionally equivalent
- cell
- equivalent variant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6445—Haemoglobin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la o polipeptidă cuprinzând sau constând din polipeptida din SECV ID NR: 1 în care restul X din poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină sau o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate în care restul X din poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină şi utilizarea lor în medicină, în special în prevenirea şi/sau tratamentul cancerului.
Description
Descriere
DOMENIUL INVENŢIEI
Invenţia se referă la domeniul cancerului şi, în mod deosebit, la polipeptide, compoziţii şi utilizarea lor în medicină, în special, pentru prevenirea şi/sau tratamentul cancerului.
CONTEXTUL INVENŢIEI
Medicamentul ideal pentru cancer ar trebui să ţintească o funcţie, care nu este redundantă, necesară în mod continuu pentru întreţinerea tumorii, dar care este neesenţială pentru întreţinerea şi funcţia oricăror ţesuturi normale. Prin urmare, logica cea mai obişnuită este de a ţinti produsele genetice care sunt mutate în mod specific în cancer, pe baza faptului că aceste molecule mutante ar fi „motoarele” probabile ale cancerului şi, poate, mai puţin critice pentru ţesuturi normale. Din aceste motive, multă atenţie s-a concentrat pe catalogarea leziunilor recurente în anumite tipuri de cancer. Din păcate, există mai multe probleme în această abordare. În primul rând, majoritatea cancerelor solide umane trec prin episoade de instabilitate genomică şi prezintă un zgomot mutaţional care poate ascunde mutaţiile „motoare” şi căile efectoare aferente acestora. În al doilea rând, cancerele sunt rezultatul final al unui proces care implică tranziţii prin mai multe blocaje evolutive. Fiecare blocaj poate necesita un tip specific de mutaţie a cărei funcţie este ulterior neesenţială pentru întreţinerea tumorii şi, în consecinţă, nu este o ţintă terapeutică bună după acel moment al evoluţiei tumorii.
Myc este o proteină de bază helix-buclă-helix cu fermoar de leucină (b-HLH-LZ) implicată în controlul creşterii şi în cancer, care funcţionează într-o reţea cu proteinele înrudite structural Max, Mad şi Mnt. Dimeri Myc/Max activează transcripţia genelor şi induc proliferare celulară sau apoptoză. Complexele Mad/Max şi Mnt/Max acţionează ca represori şi provoacă oprirea creşterii şi diferenţierii celulare. Toţi dimerii recunosc acelaşi situs consens de ADN, caseta E CACGTG.
Myc este strict reglementată în celulele normale, în care nivelurile sale sunt mai mari în celule care proliferează şi mai scăzute în celulele care nu proliferează. Activitatea Myc aberant de mare şi/sau dereglată este implicată cauzal în majoritatea cancerelor şi adesea este asociată cu tumori agresive, slab diferenţiate şi angiogene. Dereglarea expresiei Myc este provocată de supraexpresie prin amplificări ale genelor, pierderea controlului transcripţional, degradare afectată sau stabilizare crescută. Acest lucru are ca rezultat o proliferare aberantă, supravieţuire crescută, modificări ale metabolismului, angiogeneză şi inflamaţie, toate acestea fiind semne distinctive majore ale cancerului. Mai multe studii au fundamentat rolul crucial al Myc în guvernarea aspectelor intracelulare şi extracelulare ale tumorigenezei, sugerând că ţintirea funcţiei sale ar fi valoroasă din punct de vedere terapeutic.
Este cunoscut faptul că reglarea în sensul scăderii Myc cu un inhibitor de bromodomeniu BET are ca rezultat regresia mai multor tipuri de tumori. Deşi această abordare prezintă un potenţial bun, ea prezintă unele limitări, cum ar fi toxicitate şi numeroase efecte în afara ţintei. Multe molecule mici care perturbă interacţiunea Myc/Max au prezentat o specificitate scăzută in cellulo.
Cu toate acestea, un inhibitor de Myc nu a devenit încă disponibil clinic şi conceperea sa prezintă diverse avertismente: în primul rând, Myc este un factor de transcripţie nuclear, care este, în consecinţă, mai greu de atins decât moleculele membranare sau citoplasmatice; în al doilea rând, Myc nu are un „situs activ” enzimatic care să poată fi ţintit; în al treilea rând, familia Myc cuprinde 3 proteine diferite, c-, N şi L- Myc, care, în anumite condiţii sunt redundante funcţional, astfel încât toate necesită inhibare simultană. Mai mult, au existat îngrijorări că inhibarea lui Myc ar induce efecte secundare grave prin inhibarea proliferării ţesuturilor normale. Din toate aceste motive, fabricarea unui medicament inhibitor de Myc este o provocare.
Omomyc este un mutant MYC dominant-negativ care cuprinde domeniul b-HLH-LZ al lui Myc şi adăposteşte patru substituţii de aminoacizi în fermoarul de leucină al lui Myc (Soucek, L. şi colab., 1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. şi colab. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). Substituţiile de aminoacizi E61T, E68I, R74Q şi R75N conferă proteinei o specificitate de dimerizare modificată, ceea ce păstrează capacitatea de a lega partenerul său natural Max şi de a forma homodimeri cu ea însăşi, precum şi heterodimeri cu tipul sălbatic c-, N- şi L- Myc.
Datorită acestor proprietăţi, Omomyc este capabil să împiedice funcţiile de transactivare a genelor dependente de Myc atât în in vitro cât şi in vivo prin anularea capacităţii lui Myc de a se lega la situsul său de legare de recunoaştere a ADN-ului, caseta E. În acelaşi timp, Omomyc potenţează puternic apoptoza indusă de Myc într-o manieră dependentă de nivelul de expresie a Myc şi, prin urmare, întăreşte activitatea de transrepresie a Myc. Omomyc împiedică astfel legarea Myc la casetele E ale promotorului şi transactivarea genelor ţintă, păstrând în acelaşi timp legarea dependentă de Miz-1 la promotori şi transrepresia. În prezenţa lui Omomyc, interactomul Myc este canalizat spre represiune şi activitatea sa trece de la una prooncogenă la una supresoare tumorală.
În EP2801370 A1 şi WO 2014/180889 A1 a fost demonstrat că peptida Omomyc în sine este capabilă să transducă eficient prin membrana celulară şi să se transloce în nucleu, în care îşi exercită efectul de supresie tumorală.
Cu toate acestea, există încă o nevoie în stadiul tehnicii de a dezvolta noi abordări terapeutice îmbunătăţite pentru tratamentul cancerului.
EXPUNERE PE SCURT A INVENŢIEI
Într-un prim aspect, invenţia se referă la o polipeptidă care cuprinde polipeptida din SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate având un grad de identitate în raport cu SECV ID NR: 1, mai mare de 90% şi având o treonină în poziţia corespondentă poziţiei 61 din SECV ID NR: 1, o izoleucină în poziţia corespondentă poziţiei 68 din SECV ID NR: 1, o glutamină în poziţia corespondentă poziţiei 74 din SECV ID NR: 1 şi o asparagină în poziţia corespondentă poziţiei 75 din SECV ID NR: 1, şi în care reziduul X de la poziţia corespondentă poziţiei 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, în care varianta echivalentă funcţional menţionată păstrează activitatea supresoare de tumoră a SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
Într-un al doilea aspect, invenţia se referă la un conjugat care cuprinde:
a. polipeptida sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei şi
b. un fragment chimic care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei conform invenţiei sau a variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei.
Într-un al treilea aspect, invenţia se referă la o polinucleotidă care codifică o polipeptidă conform invenţiei sau un conjugat conform invenţiei.
Într-un al patrulea aspect, invenţia se referă la un vector care cuprinde o polinucleotidă conform invenţiei.
Într-un al cincilea aspect, invenţia se referă la o celulă gazdă care cuprinde o polipeptidă conform invenţiei, un conjugat conform invenţiei, o polinucleotidă conform invenţiei sau un vector conform invenţiei.
Într-un al şaselea aspect, invenţia se referă la o compoziţie farmaceutică care cuprinde o cantitate eficientă farmaceutic de o polipeptidă sau de o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, de un conjugat conform invenţiei, de o polinucleotidă conform invenţiei, de un vector conform invenţiei, sau de o celulă gazdă conform invenţiei, şi un excipient acceptabil farmaceutic.
Într-un al şaptelea aspect, invenţia se referă la o polipeptidă sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, la un conjugat conform invenţiei, la o polinucleotidă conform invenţiei, la un vector conform invenţiei, la o celulă gazdă conform invenţiei, sau la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, pentru utilizare în medicină.
Într-un al optulea aspect, invenţia se referă la o polipeptidă sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, la un conjugat conform invenţiei, la o polinucleotidă conform invenţiei, la un vector conform invenţiei, la o celulă gazdă conform invenţiei, sau la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul cancerului.
SCURTĂ DESCRIERE A DESENELOR
Figura 1. Testul de viabilitate celulară arată că OmoCS (care adăposteşte modificarea C89S) inhibă creşterea celulelor de gliom malign U87 (panoul A) şi a celulelor de adenocarcinom pulmonar A549 (panoul B) mai eficient decât Omomyc (la concentraţie mai mică). Lipofectamina (Lipo) nu produce niciun efect. Testul T a fost utilizat pentru a calcula semnificaţia statistică. ** = P < 0,01,*** = P < 0,001
Figura 2. Testul de densitate celulară arată că OmoCA (care adăposteşte modificarea C98A) inhibă creşterea celulelor de adenocarcinom pulmonar A549 la fel de eficient ca OmoCS (care adăposteşte modificarea C98S) la concentraţie mai mică. Lipofectamina (Lipo) nu produce niciun efect.
DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI
Autorii prezentei invenţii au descoperit că o polipeptidă cu SECV ID NR: 1, în care cisteina de la poziţia 89 este înlocuită cu o serină, denumită OmoCS, este capabilă să-şi exercite efectul de supresie tumorală mai eficient decât Omomyc (Exemplul 1) . Acest efect de supresie tumorală este menţinut atunci când cisteina de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este înlocuită cu alţi aminoacizi. Exemplul 2 arată că o polipeptidă cu SECV ID NR: 1, în care cisteina de la poziţia 89 este înlocuită cu o alanină, denumită OmoCA, are acelaşi efect de supresie tumorală ca şi OmoCS.
Polipeptidă conform invenţiei
Prin urmare, într-un prim aspect, invenţia se referă la o polipeptidă care cuprinde polipeptida din SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate având un grad de identitate, în raport cu SECV ID NR: 1, mai mare de 90% şi având o treonină în poziţia corespondentă poziţiei 61 din SECV ID NR: 1, o izoleucină în poziţia corespondentă poziţiei 68 din SECV ID NR: 1, o glutamină în poziţia corespondentă poziţiei 74 din SECV ID NR: 1 şi o asparagină în poziţia corespondentă poziţiei 75 din SECV ID NR: 1, şi în care reziduul X de la poziţia corespondentă poziţiei 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, în care varianta echivalentă funcţional menţionată păstrează activitatea supresoare de tumoră din SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
SECV ID NR: 1 îi corespunde
Polipeptida din secvenţei SECV ID NR: 1 corespunde secvenţei de proteină Omomyc, dar reziduul X de la poziţia 89 nu este o cisteină. Termenul "Omomyc", aşa cum este utilizat aici, se referă la o polipeptidă care constă dintr-o versiune mutantă a domeniului bHLHZip al proteinei Myc care poartă mutaţiile E61T, E68I, R74Q şi R75N (în care numerotarea poziţiilor mutante este dată în ceea ce priveşte secvenţa regiunii Myc corespunzătoare aminoacizilor 365-454 ai polipeptidei, aşa cum este definit la numărul de acces NP_002458 în baza de date NCBI, eliberat în 15 martie 2015). Secvenţa de c-Myc furnizată în baza de date NCBI sub numărul de acces NP_002458 este arătată mai jos (SECV ID NR: 5), în care regiunea din care provine Omomyc este arătată subliniat:
Termenul "Myc", aşa cum este utilizat aici, se referă la o familie de factori de transcripţie care include c-Myc, N-Myc şi L-Myc. Proteina Myc activează expresia multor gene prin legarea la secvenţa consens CACGTG (secvenţe casete amplificatoare sau casete E) şi prin recrutarea histonelor acetil-transferază sau HAT. Cu toate acestea, Myc poate acţiona şi ca un represor transcripţional. Prin legarea factorului de transcripţie Miz-1 şi înlocuirea coactivatorului p300, acesta inhibă expresia genelor ţintă Miz-1. Myc are, de asemenea, un rol direct în controlul replicării ADN-ului.
Domeniul b-HLH-LZ al lui Myc sau domeniul lui Myc de regiune de bază helix-buclă-helix cu fermoar de leucină se referă la o regiune care determină dimerizarea Myc cu proteina Max şi legarea la gene Myc-ţintă. Această regiune corespunde aminoacizilor 365-454 ai Myc uman şi este caracterizată prin două helix-uri alfa conectate printr-o buclă (Nair, S. K. şi Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).
Într-o variantă de realizare preferată, polipeptida care cuprinde polipeptida din SECV ID NR: 1 cuprinde, constă din sau constă, în principal, din SECV ID NR: 3 arătată mai jos.
În acest context, „constând, în principal, din” înseamnă că molecula specificată nu va conţine nicio secvenţă suplimentară care ar modifica activitatea SECV ID NR: 3.
Invenţia se referă la o polipeptidă care cuprinde, constă din, sau constă, în principal, din SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină. Polipeptida menţionată poate să provină din domeniul bHLHZip al oricărei proteine Myc cunoscute în domeniu, cu condiţia să fie păstrate mutaţiile care au ca rezultat efectul supresor tumoral. Astfel, polipeptida care poate fi utilizată în prezenta invenţie poate să provină de la orice specie de mamifer, incluzând, dar fără limitare la animale domestice şi de fermă (vaci, cai, porci, oi, capre, câini, pisici sau rozătoare), primate şi oameni. De preferinţă, polipeptida din invenţie provine din proteină Myc umană (număr de acces NP_002458, eliberat în 15 martie 2015).
Într-o variantă de realizare preferată, invenţia se referă la o polipeptidă constând din polipeptida din SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate având un grad de identitate, în raport cu SECV ID NR: 1, mai mare de 90% şi având o treonină în poziţia corespondentă poziţiei 61 din SECV ID NR: 1, o izoleucină în poziţia corespondentă poziţiei 68 din SECV ID NR: 1, o glutamină în poziţia corespondentă poziţiei 74 din SECV ID NR: 1 şi o asparagină în poziţia corespondentă poziţiei 75 din SECV ID NR: 1, şi în care reziduul X de la poziţia corespondentă poziţiei 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, în care varianta echivalentă funcţional menţionată păstrează activitatea supresoare de tumoră a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
Conform prezentei invenţii, reziduul de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 poate fi orice aminoacid cu excepţia cisteinei.
"Cisteină", aşa cum este utilizat aici, se referă la un aminoacid cu formula HO2CCH(NH2)CH2SH. Acesta este codificat de codonii UGU şi UGC. Termenul include, de asemenea, cisteină nenaturală
Cisteina poate forma legături disulfurice în forma homodimerică a Omomyc, prin urmare mutaţia sa pentru orice alt aminoacid va avea ca rezultat incapacitatea formării legăturilor disulfurice şi ar trebui să conducă la aceleaşi proprietăţi de eficacitate ca cele obţinute cu OmoCS. Prin urmare, reziduul de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 poate fi orice aminoacid natural, nenatural sau sintetic, cu excepţia cisteinei, şi, în special, orice aminoacid care nu ar putea fi reticulat cu alt monomer al polipeptidei din invenţie pentru a forma un homodimer.
Termenul "aminoacid" sau "reziduu" se referă la aminoacizi existenţi în mod natural şi sintetici, precum şi la analogi de aminoacizi şi mimetici de aminoacizi care funcţionează într-un mod similar cu aminoacizii existenţi în mod natural. Aminoacizii pot fi denumiţi aici, fie prin simbolurile lor de trei litere cunoscute în mod obişnuit, fie prin simbolurile cu o literă recomandate de Comisia de Nomenclatură Biochimică IUPAC-IUB.
Termenul aminoacid include aminoacizi existenţi în mod natural (Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), mai puţin obişnuiţi aminoacizi naturali şi aminoacizi nenaturali (sintetici). Aminoacizii sunt, de preferinţă, în configuraţia L, dar sunt avuţi în vedere, de asemenea, cei în configuraţie D, sau amestecuri de aminoacizi în configuraţiile D şi L.
Termenul "aminoacizi naturali" cuprinde aminoacizi alifatici (glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină), aminoacizi hidroxilaţi (serină şi treonină), aminoacizi sulfuraţi (metionină), aminoacizi dicarboxilici şi amidele acestora (acid aspartic, asparagină, acid glutamic şi glutamină), aminoacizi care au două grupări bazice (lizină, arginină şi histidină), aminoacizi aromatici (fenilalanină, tirozină şi triptofan) şi aminoacizi ciclici (prolină). Într-o variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid alifatic. Într-o altă variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid sulfurat. Într-o altă variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid dicarboxilic sau amidele acestuia. Într-o altă variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid care are două grupări bazice. Într-o altă variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid aromatic. Într-o altă variantă de realizare, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid ciclic. Într-o variantă de realizare preferată, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid hidroxilat, de preferinţă, serină. Într-o variantă de realizare preferată, reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este un aminoacid selectat dintre serină, treonină şi alanină, de preferinţă, este selectat dintre serină şi alanină.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "aminoacid nenatural" se referă la un acid carboxilic, sau un derivat al acestuia, substituit cu o grupare amină şi care este înrudit structural cu un aminoacid natural. Exemple ilustrative, nelimitative de aminoacizi modificaţi sau mai puţin obişnuiţi includ acid 2-aminoadipic, acid 3-aminoadipic, beta-alanină, acid 2-aminobutiric, acid 4-aminobutiric, acid 6-aminocaproic, acid 2-aminoheptanoic, acid 2-aminoizobutiric, acid 3-aminoizobutiric, acid 2-aminopimelic, acid 2,4-diaminobutiric, desmozină, acid 2,2'-diaminopimelic, acid 2,3-diaminopropionic, N-etilglicină, N-etilasparagină, hidroxilizină, aliohidroxilizină, 3-hidroxiprolină, 4-hidroxiprolină, izodesmozină, aloizoleucină, N-metilglicină, N-metilizoleucină, 6-N-metil-lizină, N-metilvalină, norvalină, norleucină, ornitină, etc.
Exemple ilustrative, nelimitative de aminoacizi mai puţin obişnuiţi sunt hidroxilizină şi hidroxiprolină, tiroxină, N-metilarginină şi n-acetillizină
Într-o variantă de realizare preferată, reziduul X de la poziţia 89 este orice alt aminoacid care nu ar putea fi reticulat cu celălalt monomer al polipeptidei din invenţie pentru a forma o pereche homodimerică.
Într-o variantă de realizare mai preferată a polipeptidei din invenţie, reziduul de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este aminoacidul serină.
"Serină", aşa cum este utilizată aici, se referă la acid 2-amino-3-hidroxipropanoic codificat la om de codonii UCU, UCC, UCA, UCG, AGU şi AGC. Termenul include, de asemenea, serine modificate, cum ar fi serine fosforilate sau sulfonate, cu titlu de exemplu ilustrativ nelimitativ, N-benzoil-(2R,3S)-3-fenilizoserină, D-cicloserină, L-izoserină, fenilserină,
Într-o variantă de realizare preferată, polipeptida din invenţie cuprinde secvenţa arătată în SECV ID NR: 2.
Într-o altă variantă de realizare preferată, polipeptida din invenţie constă sau constă, în principal, din SECV ID NR: 4.
Într-o variantă de realizare mai preferată a polipeptidei din invenţie, reziduul de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 este aminoacidul alanină.
"Alanină", aşa cum este utilizat aici, se referă la acid 2-aminopropanoic codificat la om de codonii GCU, GCC, GCA şi GCG. Termenul include, de asemenea, alanine modificate, cum ar fi N-acetil-L-alanină.
Într-o variantă de realizare preferată, polipeptida din invenţie cuprinde secvenţa arătată în SECV ID NR: 63.
Într-o altă variantă de realizare preferată, polipeptida din invenţie constă sau constă, în principal, din SECV ID NR: 64.
Termenul "variantă echivalentă funcţional", atunci când se referă la SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, se referă la orice polipeptidă care rezultă din eliminarea, inserarea sau adăugarea unuia sau mai multor aminoacizi în raport cu polipeptida din SECV ID NR: 1, sau care rezultă din modificarea chimică a polipeptidei din SECV ID NR: 1 şi care păstrează activitatea supresoare tumorală a SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, de preferinţă, care păstrează activitatea de supresor tumoral a OmoCS. Persoana de specialitate va înţelege că păstrarea activităţii supresoare tumorale necesită ca varianta să se poată dimeriza cu Myc şi/sau partenerul său obligatoriu p21/p22Max şi să inhibe activitatea Myc odată găsită în nucleu, că este capabilă să se transloce prin membrana celulară, şi că este capabilă să se transloce peste învelişul nuclear. În unele variante de realizare, varianta echivalentă funcţional a polipeptidei din invenţie homodimerizează mai puţin decât Omomyc sau nu este forţată în homodimeri prin formarea punţii disulfurice. În particular, formarea punţii disulfurice în forma homodimer a polipeptidei din invenţie este mai mică decât în polipeptida OmoMyc.
"Mai puţină homodimerizare", aşa cum este utilizat aici, se referă la capacitatea mai scăzută de a forma obligatoriu homodimeri ai polipeptidei din invenţie chiar şi în condiţii de reducere. Într-o variantă de realizare preferată, capacitatea este cu cel puţin 5%, cel puţin 10%, cel puţin 15%, cel puţin 20%, cel puţin 25%, cel puţin 30%, cel puţin 35%, cel puţin 40%, cel puţin 45%, cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95% mai mică decât capacitatea de a forma homodimeri ai Omomyc. Condiţii de reducere, aşa cum este utilizat aici, se referă la prezenţa unui agent reducător, un compus care donează un electron unei alte specii chimice într-o reacţie chimică redox. Exemple ilustrative, nelimitative de agenţi reducători sunt DTT (ditiotreitol), b-mercaptoetanol sau TCEP (tris(2-carboxietil)fosfină). Este posibil ca cantitatea de homodimeri să fie aceeaşi in vitro, şi ca diferenţa dintre polipeptida din invenţie şi Omomyc să fie prezentă numai în celule în prezenţa partenerilor de heterodimerizare, în care absenţa disulfurii permite o formare potenţial mai mare de heterodimeri.
Mai multe teste pot fi utilizate pentru a determina homodimerizarea unei peptide, cu titlu de exemplu ilustrativ, nelimitativ, prin denaturare termică monitorizată prin dicroism circular, astfel încât dimerizarea să poată fi detectată prin pliere şi cuantificarea stabilităţii termice.
Variante echivalente funcţional adecvate includ polipeptide constând, în principal, din polipeptida din SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
În acest context, "constând, în principal, din" înseamnă că molecula specificată nu va conţine nicio secvenţă suplimentară care ar modifica activitatea SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
Variante funcţionale adecvate ale peptidei de ţintire sunt cele care prezintă un grad de identitate în raport cu peptida cu SECV ID NR: 1 (de preferinţă OmoCS, SECV ID NR: 4) mai mare de 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98% sau 99%. Gradul de identitate între două polipeptide este determinat utilizând algoritmi şi metode computerizate care sunt larg cunoscute pentru persoanele de specialitate în domeniu. Identitatea dintre două secvenţe de aminoacizi este determinată, de preferinţă, prin utilizarea algoritmului BLASTP, aşa cum a fost descris anterior [BLAST Manual, Altschul, S., şi colab., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., şi colab., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. Într-o variantă de realizare preferată, identitatea secvenţei este determinată pe toată lungimea polipeptidei din SECV ID NR: 1 sau pe toată lungimea variantei sau a ambelor.
Variantele echivalente funcţional ale polipeptidei din invenţie pot include, de asemenea, modificări post-translaţionale, cum ar fi glicozilare, acetilare, izoprenilare, miristoilare, procesare proteolitică etc.
Ca alternativă, variante funcţionale adecvate ale peptidei de ţintire sunt acelea în care una sau mai multe poziţii din polipeptida din invenţie conţin un aminoacid care este o substituţie conservatoare a aminoacidului prezent în proteina menţionată mai sus. „Substituţii conservatoare de aminoacizi” rezultă din înlocuirea unui aminoacid cu altul având proprietăţi structurale şi/sau chimice similare. De exemplu, următoarele şase grupări conţin fiecare aminoacizi care sunt substituţii conservatoare unul pentru celălalt: 1) Alanină (A), Serină (S), Treonină (T); 2) Acid aspartic (D), Acid glutamic (E); 3) Asparagină (N), Glutamină (Q); 4) Arginină (R), Lizină (K); 5) Izoleucină (I), Leucină (L), Metionină (M), Valină (V); şi 6) fenilalanină (F), tirozină (Y), triptofan (W). Selectarea unor astfel de substituţii conservatoare de aminoacizi este de competenţa unui specialist cu cunoştinţe obişnuite în domeniu şi este descrisă, de exemplu, de către Dordo şi colab., (J. Mol. Biol, 1999, 217; 721-739) şi Taylor şi colab., (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218).
Într-o variantă de realizare preferată, întreaga secvenţă a variantei echivalente funcţional a SECV ID NR: 1 nu conţine un aminoacid cisteină. Se va înţelege că variantele echivalente funcţional ale SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, care conţine mutaţii la poziţiile corespondente mutaţiilor E61T, E68I, R74Q şi R75N găsite în Omomyc provin din c-Myc uman. Poziţia în care mutaţiile menţionate trebuie să apară în varianta echivalentă funcţional poate fi determinată printr-o aliniere de mai multe secvenţe a diferitelor secvenţe Myc şi este identificată prin alinierea acelor poziţii corespondente poziţiilor 61, 68, 74 şi 75 din secvenţa Omomyc provenită din c-Myc uman.
O aliniere de mai multe secvenţe este o extensie a alinierii în perechi pentru a încorpora mai mult decât două secvenţe simultan. Mai multe metode de aliniere aliniază toate secvenţele dintr-un set dat de interogări. Un program preferat de aliniere de mai multe secvenţe (şi algoritmul său) este ClustalW, Clustal2W sau ClustalW XXL (vezi Thompson şi colab. (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680). Odată ce secvenţele de c-Myc de la diferite organisme şi cele de variante sunt comparate (aliniate), aşa cum este descris aici, o persoană de specialitate în domeniu poate identifica cu uşurinţă poziţiile din fiecare dintre secvenţe corespondente poziţiilor E61T, E68I, R74Q şi R75N găsite în Omomyc, şi le poate introduce în varianta cu SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, mutaţiile corespondente mutaţiilor E61T, E68I, R74Q şi R75N găsite în Omomyc provin din c-Myc uman.
Teste adecvate pentru a determina dacă o polipeptidă poate fi considerată ca o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1, în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, includ, fără limitare:
- Teste care măsoară capacitatea polipeptidei de a forma complexe dimerice cu Max şi Myc, cum ar fi testele bazate pe expresia unei gene reporter, aşa cum este descris în Soucek şi colab. (Oncogene, 1998, 17: 2463 - 2472), precum şi PLA (testul de ligatură a proteinelor) sau Co-imunoprecipitarea.
- Teste care măsoară capacitatea polipeptidei de a se lega la situsul de recunoaştere Myc/Max din ADN (situsul CACGTG), cum ar fi testul de schimbare a mobilităţii electroforetice (EMSA) descris în Soucek şi colab. (de mai sus).
- Teste care măsoară capacitatea de a reprima transactivarea indusă de Myc, cum ar fi testul bazat pe expresia unei gene reporter sub controlul situsurilor de legare la ADN specifice pentru Myc/Max, aşa cum este descris de către Soucek şi colab. (de mai sus).
- Teste bazate pe capacitatea produsului genetic sau a polipeptidei de a inhiba creşterea celulelor care exprimă myc oncogenă, aşa cum este descris de către Soucek şi colab. (de mai sus).
- Teste care măsoară capacitatea polipeptidei de a spori apoptoza indusă de myc, cum ar fi testele descrise de către Soucek şi colab. (Oncogene, 1998: 17, 2463 - 2472). Mai mult, poate fi utilizat orice test cunoscut de obicei în domeniu pentru evaluarea apoptozei într-o celulă, cum ar fi colorarea Hoechst, colorarea cu iodură de propidiu (PI) sau cu anexină V, albastru tripan, desfacerea/fragmentarea AND-ului şi TUNEL.
Într-o variantă de realizare preferată, o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină include acele secvenţe care au una sau mai multe, de preferinţă, toate următoarele caracteristici: capacitatea de a dimeriza cu Myc şi inhibarea activităţii sale, translocarea prin membrana celulară, translocarea în nucleu, incapacitatea de a forma homodimeri sau capacitatea redusă de a forma homodimeri în comparaţie cu cea a Omomyc, o viabilitate celulară într-un test in vitro aşa cum este efectuat în Exemplul 1, mai mică decât cea cu Omomyc la o cantitate de ARNm de 12,5 nM care codifică polipeptida din invenţie. Într-o variantă de realizare preferată, varianta echivalentă funcţional din invenţie corespunde unei secvenţe care mediază o viabilitate celulară într-un test in vitro, aşa cum este efectuat în Exemplul 1, mai mică decât cea cu Omomyc la o cantitate de ARNm de 12,5 nM care codifică polipeptida din invenţie.
Într-o variantă de realizare preferată, o polipeptidă este considerată o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, dacă prezintă o activitate în unul sau în mai multe dintre testele de mai sus care este cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% din activitatea SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV. ID NR: 1 nu este o cisteină (de preferinţă, din activitateai OmoCS).
În plus, variantele echivalente funcţional ale SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sunt, de asemenea, capabile de a transduce celule după ce varianta intră în contact cu celula menţionată.
Într-o variantă de realizare preferată, o polipeptidă este considerată o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, dacă este capabilă să transducă o celulă ţintă cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% la fel de eficient ca SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină (de preferinţă, ca OmoCS, SECV ID NR: 4).
În plus, variantele echivalente funcţional ale SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sunt, de asemenea, capabile să se transloce în nucleul celulei tumorale ţintă.
Într-o variantă de realizare preferată, o polipeptidă este considerată o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, dacă este capabilă să se transloce în nucleul celulei tumorale ţintă cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% sau 100% la fel de eficient ca SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină (de preferinţă, ca OmoCS, SECV ID NR: 4).
Teste adecvate pentru a determina dacă o polipeptidă este o variantă echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, în ceea ce priveşte capacitatea sa de a se transloca prin membrana celulară şi către nucleu, includ marcarea dublă a unei celule cu un reactiv specific pentru polipeptidă şi cu un colorant care marchează în mod specific nucleul celulei (cum ar fi DAPI sau colorantul Hoechst). Într-o variantă de realizare preferată, detectarea polipeptidei conform invenţiei este realizată prin microscopie confocală sau prin microscopie de fluorescenţă.
Polipeptida, conform invenţiei, din SECV ID NR: 1 conţine, de asemenea, domeniul M2 al c-Myc, care are secvenţa RQRRNELKRSF (SECV ID NR: 55) (vezi, Dang şi Lee, Mol. Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054), şi care corespunde unui semnal de localizare nucleară.
Într-o altă variantă de realizare preferată, varianta echivalentă funcţional a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, cuprinde secvenţa SECV ID NR: 55.
Termenul "semnal de localizare nucleară", aşa cum este utilizat aici, se referă la o secvenţă de aminoacizi cu lungime de aproximativ 4-20 de reziduuri de aminoacizi, care serveşte la direcţionarea unei proteine către nucleu. De obicei, secvenţa de localizare nucleară este bogată în aminoacizi bazici şi secvenţe exemplificatoare sunt bine-cunoscute în domeniu (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7).
În unele variante de realizare, NLS este selectat din grupul constând din antigenul T mare SV40 NLS (PKKKRKV, SECV ID NR: 6); Nucleoplasmina NLS (KRPAATKKAGQAKKKK, SECV ID NR: 7); CBP80 NLS (RRRHSDENDGGQPHKRRK, SECV ID NR: 8); proteina HIV-I Rev NLS (RQARRRRRRRWE, SECV ID NR: 9); HTLV-I Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, SECV ID NR: 10); hnRNP A NLS (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, SECV ID NR: 11); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, SECV ID NR: 12). Într-o variantă de realizare a invenţiei, semnalul de localizare nucleară cuprinde motivul K (K/R) X (K/R) (SECV ID NR: 13).
În plus, variantele echivalente funcţional ale SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sunt, de asemenea, capabile să ajungă la nucleele celulelor transduse după ce varianta intră în contact cu celula menţionată. Se va înţelege că variantele echivalente funcţional ale SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, conţin NLS găsit în SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau un alt NLS funcţional. Într-o altă variantă de realizare, polipeptida din invenţie nu conţine NLS nativ găsit în SECV ID NR: 1 şi conţine un alt NLS funcţional care înlocuieşte NLS menţionat găsit în SECV ID NR: 1 sau în orice altă parte a polipeptidei din invenţie.
Conjugat al invenţiei
Într-un alt aspect, invenţia se referă la un conjugat care cuprinde:
a) polipeptida sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei şi
b) un fragment chimic care facilitează preluarea celulară a polipeptidei conform invenţiei sau a variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei.
Termenul "conjugat", aşa cum este utilizat aici, se referă la doi sau mai mulţi compuşi care sunt legaţi covalent împreună, astfel încât funcţia fiecărui compus este păstrată în conjugat.
În variantele de realizare preferate, conjugaţii conform invenţiei cuprind cel puţin 1, cel puţin 2, cel puţin 3, cel puţin 4, cel puţin 5, cel puţin 6, cel puţin 7, cel puţin 8, cel puţin 9, cel puţin 10 sau mai multe fragmente chimice care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei sau a variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate.
Într-o variantă de realizare, fragmentul chimic care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei este o lipidă sau un acid gras.
Un acid gras este, în general, o moleculă care cuprinde un lanţ de carbon cu un fragment acid (de ex., acid carboxilic) la un capăt al lanţului. Lanţul de carbon al unui acid gras poate fi de orice lungime, totuşi, este de preferat ca lungimea lanţului de carbon să fie de cel puţin 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau mai mulţi atomi de carbon şi orice interval care poate proveni din acestea. În anumite variante de realizare, lungimea lanţului de carbon este de la 4 până la 18 atomi de carbon în porţiunea de lanţ a acidului gras. În anumite variante de realizare, lanţul de carbon de acid gras poate cuprinde un număr impar de atomi de carbon, totuşi, în anumite variante de realizare poate fi preferat un număr par de atomi de carbon în lanţ. Un acid gras care cuprinde doar legături simple în lanţul său de carbon se numeşte saturat, în timp ce un acid gras care cuprinde cel puţin o legătură dublă în lanţul său se numeşte nesaturat. Acidul gras poate fi ramificat, deşi în variantele preferate de realizare a prezentei invenţii, este neramificat. Acizii graşi specifici includ, dar nu sunt limitaţi la, acid linoleic, acid oleic, acid palmitic, acid linolenic, acid stearic, acid lauric, acid miristic, acid arahidic, acid palmitoleic, acid arahidonic.
Într-o variantă de realizare preferată, fragmentul chimic care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei este o secvenţă de peptidă care pătrunde în celulă, caz în care, conjugatul este o proteină de fuziune care cuprinde o polipeptidă conform invenţiei sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate şi secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă.
Termenul "proteină de fuziune" se referă la proteine generate prin tehnologia genelor care constau din două sau mai multe domenii funcţionale provenite din proteine diferite. O proteină de fuziune poate fi obţinută prin mijloace convenţionale, de exemplu, cu ajutorul expresiei genei a secvenţei de nucleotide care codifică proteina de fuziune menţionată într-o celulă adecvată. Se va înţelege că peptida care pătrunde în celulă se referă la o peptidă care pătrunde în celulă, care este diferită de peptida care pătrunde în celulă care face parte din polipeptida din SECV ID NR: 1 sau din varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate.
Termenul "secvenţă de peptidă care pătrunde în celulă" este utilizat în prezenta specificaţie în mod interschimbabil cu "CPP", "domeniu de transducere a proteinei" sau "PTD". Acesta se referă la un lanţ peptidic de lungime variabilă care direcţionează transportul unei proteine în interiorul unei celule. Procesul de livrare în celulă are loc, în mod obişnuit, prin endocitoză, dar peptida poate fi de asemenea internalizată în celulă prin translocare directă a membranei. CPP-urile au, de obicei, o compoziţie de aminoacizi care, fie conţine o abundenţă relativă mare de aminoacizi încărcaţi pozitiv, cum ar fi lizină sau arginină, fie au secvenţe care conţin un model alternant de aminoacizi polar/încărcat şi aminoacizi nepolari, hidrofobi. Exemple de CPP-uri care pot fi utilizate în prezenta invenţie includ, fără limitare, CPP-ul găsit în proteină de Drosophila antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK; SECV ID NR:14), CPP-ul găsit în proteina de legare la ADN-ul VP22 de herpesvirus simplex 1 (HSV-1) (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE; SECV ID NR: 15), CPP al Bac-7 (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; SECV ID NR: 16), CPP-urile proteinei HIV-1 TAT constând din aminoacizii 49-57 (RKKRRQRRR; SECV ID NR: 17), aminoacizi 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ; SECV ID NR: 18), aminoacizi 47- 57 (YGRKKRRQRRR; SECV ID NR: 19), CPP-ul peptidei S413-PV (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; SECV ID NR: 20), CPP-ul penetratinei (RQIKWFQNRRMKWKK; SECV ID NR: 21), CPP al SynB 1 ((RGGRLSYSRRRFSTSTGR; SECV ID NR: 22), CPP-ul lui SynB3 (RRLSYSRRRF; SECV ID NR:23), CPP-ul lui PTD-4 (PIRRRKKLRRLK; SECV ID NR: 24), CPP-ul lui PTD-5 (RRQRRTSKLMKR; SECV ID NR: 25), CPP-ul stratului FHV-(35-49) (RRRRNRTRRNRRRVR; SECV ID NR: 26), CPP-ul lui BMV Gag-(7-25) (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; SECV ID NR: 27), CPP-ul lui HTLV -II Rex-(4-16) (TRRQRTRRARRNR; SECV ID NR:28), CPP al D-Tat (GRKKRRQRRRPPQ; SECV ID NR:29), CPP-ul lui R9-Tat (GRRRRRRRRRPPQ; SECV ID NR: 30), CPP-ul lui MAP (KLALKLALKLALALKLA; SECV ID NR: 31), CPP-ul lui SBP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; SECV ID NR: 32), CPP-ul lui FBP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SECV ID NR:33); CPP-ul lui MPG (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; SECV ID NR: 34), CPP-ul lui MPG(ENLS) (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; SECV ID NR: 35), CPP-ul lui Pep-1 (ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; SECV ID NR: 36), CPP-ul lui Pep-2 (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; SECV ID NR: 37), o secvenţă de poliarginină având structura RN (în care N este între 4 şi 17), secvenţa GRKKRRQRRR (SECV ID NR: 38), secvenţa RRRRRRLR (SECV ID NR: 39), secvenţa RRQRRTSKLMKR (SECV ID NR: 40); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SECV ID NR: 41); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SECV ID NR: 42); RQIKIWFQNRRMKWKK (SECV ID NR: 43), secvenţa YGRKKRRQRRR (SECV ID NR: 44); secvenţa RKKRRQRR (SECV ID NR: 45); secvenţa YARAAARQARA (SECV ID NR: 46); secvenţa THRLPRRRRRR (SECV ID NR: 47); secvenţa GGRRARRRRRR (SECV ID NR: 48).
Într-o variantă de realizare preferată, peptida menţionată care pătrunde în celulă nu este cea endogenă conţinută în SECV ID NR: 1.
Într-o variantă de realizare preferată, CPP-ul este CPP-ul proteinei TAT HIV-1 constând din aminoacizii 49-57 (RKKRRQRRR, SECV ID NR: 49). Într-o altă variantă de realizare preferată, CPP-ul este secvenţa GRKKRRQRRR (SECV ID NR: 50) sau RRRRRRRR (SECV ID NR: 51).
Într-o variantă de realizare, secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă este fuzionată la capătul N-terminal al polipeptidei conform invenţiei sau al variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate. Într-o altă variantă de realizare, peptida care pătrunde în celulă este fuzionată la capătul C-terminal al polipeptidei conform invenţiei sau al variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate.
În variante de realizare preferate, conjugatele sau proteinele de fuziune conform invenţiei cuprind, în plus faţă de propria peptidă care pătrunde în celulă găsită în polipeptida cu SECV ID NR: 1 sau în varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate, cel puţin 1, cel puţin 2 , cel puţin 3, cel puţin 4, cel puţin 5, cel puţin 6, cel puţin 7, cel puţin 8, cel puţin 9, cel puţin 10 sau mai multe peptide suplimentare care pătrund în celulă.
Proteine de fuziune din invenţie adecvate includ polipeptidele OmoCS*TAT şi OmoCS*LZArg, aşa cum este definit mai jos:
Denumire SECV ID NR: Secvenţă OmoCS*TAT 52 OmoCS*LZArg 53
Într-o altă variantă de realizare preferată, conjugatele sau proteinele de fuziune din invenţie cuprind polipeptida din invenţie sau o variantă echivalentă funcţional a acesteia şi cuprind, în pus, un semnal de localizare nucleară de capăt N-terminal sau C-terminal.
Persoana de specialitate va înţelege că poate fi de dorit ca proteina de fuziune să cuprindă în plus una sau mai multe peptide flexibile care conectează polipeptida din invenţie sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate, secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă, şi/sau NLS. Astfel, într-o variantă particulară de realizare, polipeptida din invenţie este conectată în mod direct la secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă. Într-o altă variantă particulară de realizare, polipeptida din invenţie este conectată la secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă printr-o peptidă flexibilă. Într-o variantă de realizare, polipeptida din invenţie este conectată în mod direct la NLS. Într-o altă variantă de realizare, polipeptida din invenţie este conectată la NLS printr-o peptidă flexibilă.
Într-o variantă particulară de realizare, polipeptida din invenţie este conectată în mod direct la secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă şi la NLS.
Într-o variantă de realizare, NLS-ul este unul dintre NLS-ul care apare endogen în secvenţa de Myc, cum ar fi peptida M1 (PAAKRVKLD, SECV ID NR: 54) sau peptida M2 (RQRRNELKRSF, SECV ID NR: 55).
Într-o altă variantă de realizare, NLS-ul suplimentar se referă la un NLS care este diferit de NLS-ul endogen găsit în polipeptida cu SECV ID NR: 1 sau în varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate.
În variante de realizare preferate, conjugatele sau proteinele de fuziune conform invenţiei cuprind, în plus faţă de NLS-ul endogen găsit în polipeptida din invenţie sau în varianta echivalentă funcţional a acesteia, cel puţin 1, cel puţin 2, cel puţin 3, cel puţin 4, cel puţin 5, cel puţin 6, cel puţin 7, cel puţin 8, cel puţin 9, cel puţin 10 NLS.
Într-o altă variantă particulară de realizare, polipeptida din invenţie este conectată la secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă printr-un prim linker peptidic flexibil, şi la NLS printr-un al doilea linker peptidic flexibil.
Aşa cum este utilizat aici, termenul „peptidă flexibilă”, „peptidă distanţier” sau „peptidă de legătură” se referă la o peptidă care leagă covalent două proteine sau fragmente, dar care nu face parte din niciuna dintre polipeptide, permiţând mişcarea uneia faţă de cealaltă, fără a provoca un efect dăunător substanţial asupra funcţiei, fie a proteinei, fie a fragmentului. Astfel, linkerul flexibil nu afectează activitatea supresoare tumorală a secvenţei polipeptidice, activitatea care pătrunde în celulă a peptidei care pătrunde în celulă sau capacitatea de localizare nucleară a NLS.
Peptida flexibilă cuprinde cel puţin un aminoacid, cel puţin doi aminoacizi, cel puţin trei aminoacizi, cel puţin patru aminoacizi, cel puţin cinci aminoacizi, cel puţin şase aminoacizi, cel puţin şapte aminoacizi, cel puţin opt aminoacizi, cel puţin nouă aminoacizi, cel puţin 10 aminoacizi, cel puţin 12 aminoacizi, cel puţin 14 aminoacizi, cel puţin 16 aminoacizi, cel puţin 18 aminoacizi, cel puţin 20 aminoacizi, cel puţin 25 aminoacizi, cel puţin 30 de aminoacizi, cel puţin 35 de aminoacizi, cel puţin 40 de aminoacizi, cel puţin 45 de aminoacizi, cel puţin 50 de aminoacizi, cel puţin 60 de aminoacizi, cel puţin 70 de aminoacizi, cel puţin 80 de aminoacizi, cel puţin 90 de aminoacizi sau aproximativ 100 de aminoacizi. În unele variante de realizare, peptida flexibilă va permite mişcarea unei proteine în raport cu cealaltă pentru a creşte solubilitatea proteinei şi/sau pentru a-şi îmbunătăţi activitatea. Regiuni linker adecvate includ o regiune poli-glicină, secvenţa GPRRRR (SECV ID NR: 56) a combinaţiilor de reziduuri de glicină, prolină şi alanină.
În unele variante de realizare, proteina de fuziune din invenţie poate cuprinde un fragment chimic suplimentar care include, printre altele, grupări de fluorescenţă, biotină, polietilenglicol (PEG), analogi de aminoacizi, aminoacizi nenaturali, grupări fosfat, grupări glicozil, etichete radioizotopice şi molecule farmaceutice. În alte variante de realizare, polipeptida heterologă poate cuprinde una sau mai multe grupări reactive chimic incluzând, printre altele, cetonă, aldehidă, reziduuri Cys şi reziduuri Lys.
Într-o variantă particulară de realizare, conjugatele sau proteinele de fuziune din invenţie cuprind o etichetă legată de conjugat sau de domeniul C-terminal sau N-terminal al proteinei de fuziune menţionate sau al variantei de polipeptidă menţionată. Eticheta menţionată este, în general, o secvenţă de peptidă sau de aminoacizi care poate fi utilizată în izolarea sau purificarea proteinei de fuziune menţionate. Astfel, eticheta menţionată este capabilă să se lege la unu sau mai mulţi liganzi, de exemplu, unu sau mai mulţi liganzi ai unei matrice de afinitate, cum ar fi un suport de cromatografie sau granulă cu afinitate mare. Un exemplu de etichetă menţionată este o etichetă de histidină (His-tag sau HT), cum ar fi o etichetă care cuprinde 6 reziduuri de histidină (His6 sau H6), care se poate lega cu afinitate mare la o coloană de nichel (Ni2+) sau de cobalt (Co2+). Eticheta His are caracteristica dorită, că îşi poate lega liganzii în condiţii care denaturază majoritatea proteinelor şi perturbă majoritatea interacţiunilor proteină-proteină. Astfel, poate fi utilizată pentru a elimina proteina de momeală marcată cu H6 în urma întreruperii interacţiunilor proteină-proteină cu care a participat momeala.
Exemple suplimentare ilustrative, nelimitative, de etichete utile pentru izolarea sau purificarea unei proteine de fuziune includ Arg-tag, FLAG-tag (DYKDDDDK; SECV ID NR: 57), Strep-tag (WSHPQFEK; SECV ID NR: 58), un epitop capabil să fie recunoscut de către un anticorp, cum ar fi eticheta c-myc (recunoscută de un anticorp anti-c-myc), eticheta HA (YPYDVPDYA; SECV ID NR: 59), eticheta V5 (GKPIPNPLLGLDST; SECV ID NR: 60 ), eticheta SBP, eticheta S, peptida de legare a calmodulină, domeniul de legare a celulozei, domeniul de legare a chitinei, eticheta glutation S-transferază, proteina de legare a maltozei, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag etc. (Terpe K., Apl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), o secvenţă de aminoacizi cum ar fi AHGHRP (SECV ID NR: 61) sau PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (SECV ID NR: 62), β-galactozidază.
Eticheta poate fi utilizată, dacă se doreşte, pentru izolarea sau purificarea proteinei de fuziune menţionate.
Polinucleotidă, vector şi celulă gazdă ale invenţiei
Într-un alt aspect, invenţia se referă la o polinucleotidă care codifică o polipeptidă conform invenţiei sau un conjugat conform invenţiei.
Termenii "polinucleotidă", "acid nucleic" şi "moleculă de acid nucleic" sunt utilizaţi interschimbabil pentru a se referi la forme polimerice de nucleotide de orice lungime. Polinucleotidele pot conţine dezoxiribonucleotide, ribonucleotide şi/sau analogi ai acestora. Nucleotidele pot avea orice structură tridimensională şi pot îndeplini orice funcţie, cunoscută sau necunoscută. Termenul "polinucleotidă" include, de exemplu, molecule monocatenare, dublu catenare şi triplu elicoidale, o genă sau un fragment de genă, exoni, introni, ARNm, ARNt, ARNr, ribozime, ADNc, polinucleotide recombinate, polinucleotide ramificate, plasmide, vectori, ADN izolat din orice secvenţă, ARN izolat din orice secvenţă, sonde de acid nucleic şi primeri. Pe lângă o moleculă de acid nucleic nativ, o moleculă de acid nucleic din prezenta invenţie poate cuprinde, de asemenea, molecule de acid nucleic modificate. Aşa cum este utilizat aici, ARNm se referă la un ARN care poate fi translatat într-o celulă.
În variantă de realizare preferată, polinucleotida din invenţie este un ARNm. ARNm poate fi sintetizat chimic, poate fi obţinut cu ajutorul transcrierii in vitro sau poate fi sintetizat in vivo în celula ţintă. Secvenţele de nucleotidă care formează polinucleotida care codifică proteina conjugată sau de fuziune conform invenţiei sunt în acelaşi cadru de citire corect pentru exprimarea acestora.
Într-un alt aspect, invenţia se referă la un vector care cuprinde o polinucleotidă din invenţie.
Termenul "vector", aşa cum este utilizat aici, se referă la o secvenţă de acid nucleic care cuprinde secvenţele necesare astfel încât, după transcrierea şi translatarea secvenţelor menţionate într-o celulă, să fie generată o polipeptidă codificată de polinucleotida din invenţie. Secvenţa menţionată este legată operaţional de segmente suplimentare care asigură replicarea sa autonomă într-o celulă gazdă de interes. De preferinţă, vectorul este un vector de expresie, care este definit ca un vector care, în plus faţă de regiunile de replicare autonomă într-o celulă gazdă, conţine regiuni legate operabil la acidul nucleic din invenţie şi care sunt capabile să îmbunătăţească expresia produselor acidului nucleic conform invenţiei. Vectorii din invenţie pot fi obţinuţi cu ajutorul tehnicilor larg cunoscute în domeniu.
Exemple de vectori includ, dar nu se limitează la, vectori virali, vectori de expresie a ADN sau ARN gol, vectori plasmidă, cosmidă sau fagi, vectori de expresie a ADN sau ARN asociaţi cu agenţi de condensare cationici, vectori de expresie a ADN sau ARN încapsulaţi în lipozomi, şi anumite celule eucariote, cum ar fi celulele producătoare. Vectori adecvaţi care cuprind o polinucleotidă din invenţie sunt vectori proveniţi din vectori de expresie în procariote, cum ar fi pUC18, pUC19, pBluescript şi derivaţii acestora, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl, RP4, fagi şi vectori „de transport”, cum ar fi pSA3 şi pAT28, vectori de expresie în drojdii, cum ar fi vectori de tip plasmidă de 2 microni, plasmide de integrare, vectori YEP, plasmide centromerice şi similare, vectori de expresie în celule de insectă, cum ar fi vectorii din seria pAC şi din seria pVL, vectorii de expresie în plante, cum ar fi vectori din seria pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE şi vectori similari şi de expresie în celule eucariote superioare pe baza vectorilor virali (adenovirus, virus asociat adenovirusului, precum şi retrovirusului şi, în particular, lentivirus), precum şi vectori nevirali, cum ar fi pSilencer 4.1-CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL, pKSV-10, pBPV-1, pML2d şi pTDT1. Într-o variantă de realizare preferată, polinucleotida conform invenţiei este cuprinsă într-un vector selectat din grupul constând din vectori retrovirali pEGFP sau pBabe şi vectori lentivirali pTRIPZ sau pSLIK.
Vectorul din invenţie poate fi utilizat pentru a transforma, transfecta sau infecta celulele care pot fi transformate, transfectate sau infectate de către vectorul menţionat. Aceste celule pot fi procariote sau eucariote.
Vectorul cuprinde, de preferinţă, polinucleotida din invenţie legată operaţional la secvenţe care reglează expresia polinucleotidei din invenţie. Secvenţele de reglare pentru utilizare în prezenta invenţie pot fi promotori nucleari sau, ca alternativă, secvenţe amplificatoare şi/sau alte secvenţe de reglare care măresc expresia secvenţei heterologe de acid nucleic. În principiu, orice promotor poate fi utilizat în prezenta invenţie cu condiţia ca promotorul menţionat să fie compatibil cu celulele în care polinucleotida urmează să fie exprimată. Astfel, promotori adecvaţi pentru realizarea prezentei invenţii includ, dar nu sunt neapărat limitaţi la, promotori constitutivi, cum ar fi derivaţi ai genomului virusului eucariotic, cum ar fi virusul poliomului, adenovirusul, SV40, CMV, virusul sarcomului aviar, virusul hepatitei B, promotorul genei metalotioneinei, promotorul genei timidin kinază a virusului herpes simplex, regiunile LTR ale retrovirusurilor, promotorul genei imunoglobulinei, promotorul genei actinei, promotorul genei EF-1alfa, precum şi promotorii inductibili în care expresia proteinei depinde de adăugarea unei molecule sau a unui semnal exogen, cum ar fi sistemele de tetraciclină, sistemul NFκB/lumină UV, sistemul Cre/Lox şi promotorul genelor de şoc termic, promotorii reglabili ai ARN polimerazei II descrişi în WO/2006/135436, şi promotori specifici ţesuturilor.
Într-un alt aspect, invenţia se referă la o celulă gazdă care cuprinde o polipeptidă din invenţie, un conjugat din invenţie, o polinucleotidă din invenţie sau un vector din invenţie.
Celule adecvate în prezenta invenţie includ, dar nu se limitează la, celule de mamifer, plantă, insectă, fungice şi bacteriene. Celulele bacteriene includ, dar nu se limitează la, celule de la bacterii Gram-pozitive, cum ar fi speciile din genurile Bacil, Streptomyces şi Stafilococ, şi celule de la bacterii Gram-negative, cum ar fi celule din genuri Escherichia şi Pseudomonas. Celulele fungice includ, de preferinţă, celule de drojdie cum ar fi Saccharomyces, Pichia pastoris şi Hansenula polymorpha. Celulele de insecte includ, dar nu se limitează la, celule Drosophila şi celule Sf9. Celulele vegetale includ, printre altele, celule vegetale de cultură, cum ar fi cereale, plante medicinale sau ornamentale sau din bulbi. Celulele de mamifer adecvate pentru prezenta invenţie includ linii celulare epiteliale (porcine etc.), linii celulare de osteosarcom (umane, etc.), linii celulare de neuroblastom (umane, etc.), carcinoame epiteliale (umane, etc.), celule gliale (murine etc.), linii celulare hepatice (de la maimuţă etc.), celule CHO (Ovar de hamster chinezesc), celule COS, celule BHK, celule HeLa, 911, AT1080, A549, 293 sau PER.C6, celule umane NTERA-2 ECC, celule D3 din linia mESC, celule stem embrionare non-umane, celule NIH3T3, 293T, REH şi MCF-7 şi celule hMSC.
Toţi termenii şi variantele de realizare descrise anterior sunt aplicabile în mod egal acestui aspect al invenţiei.
Compoziţie farmaceutică din invenţie
Într-un alt aspect, invenţia se referă la o compoziţie farmaceutică care cuprinde o cantitate eficientă farmaceutic de o polipeptidă sau de o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, la un conjugat conform invenţiei, la o polinucleotidă conform invenţiei, la un vector conform invenţiei, sau la o celulă gazdă conform invenţiei, şi un excipient acceptabil farmaceutic.
Aşa cum este utilizat în prezenta invenţie, expresia „compoziţie farmaceutică” se referă la o formulare care a fost adaptată pentru administrare a unei doze predeterminate de unu sau mai mulţi agenţi terapeutici utili, la o celulă, la un grup de celule, la un organ, la un ţesut, sau la un animal în care diviziunea celulară este necontrolată, cum ar fi cancer.
Expresia "cantitate eficientă farmaceutic", aşa cum este utilizat aici, este înţeleasă ca o cantitate capabilă să furnizeze un efect terapeutic şi care poate fi determinată de persoana de specialitate în domeniu prin mijloace utilizate în mod obişnuit. Cantitatea de polipeptidă din invenţie sau de variantă echivalentă funcţional a acesteia, de conjugat, de polinucleotidă, de vector sau de celulă gazdă din invenţie, sau de compus antitumoral care poate fi combinată în compoziţiile farmaceutice conform invenţiei va varia în funcţie de subiect şi de modul particular de administrare. Persoanele de specialitate în domeniu vor aprecia că dozele pot fi, de asemenea, determinate cu îndrumări din Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ediţia a IX-a (1996), Anexa II, pp. 1707-1711 şi din Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ediţia a zecea (2001), Anexa II, pp. 475-493.
Doza adecvată de principiu sau de principii active din compoziţia farmaceutică va depinde de tipul de cancer care urmează să fie tratat, de severitatea şi evoluţia bolii, de faptul că compoziţia este administrată în scop preventiv sau terapeutic, de terapia anterioară, de istoricul clinic şi răspunsul la peptidă sau polipeptidă ale pacientului, şi de decizia medicului curant. Cantitatea de polipeptidă din invenţie sau de variantă echivalentă funcţional a acesteia, de conjugat, de polinucleotidă, de vector sau de celulă gazdă din invenţie este administrată în mod adecvat pacientului la un moment dat sau pe parcursul unei serii de tratamente. În funcţie de tipul şi severitatea bolii, un nivel de doză adecvat va fi, în general, de aproximativ 0,01 până la 500 mg la fiecare kg de greutate corporală a pacientului pe zi, care pot fi administrate în doze unice sau multiple. De preferinţă, nivelul de doză va fi de la aproximativ 0,1 până la aproximativ 250 mg/kg pe zi; mai preferat, aproximativ 0,5 până la aproximativ 100 mg/kg pe zi. Un nivel de doză adecvat poate fi de aproximativ 0,01 până la 250 mg/kg pe zi, aproximativ 0,05 până la 100 mg/kg pe zi sau aproximativ 0,1 până la 50 mg/kg pe zi. În acest interval, doza poate fi de la 0,05 până la 0,5, de la 0,5 până la 5 sau de la 5 până la 50 mg/kg pe zi. Pentru administrare orală, compoziţiile sunt furnizate, de preferinţă, sub formă de tablete care conţin 1,0 până la 1000 miligrame de ingredient activ, în special, 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 şi 1000,0 miligrame de ingredient activ pentru ajustarea simptomatică a dozei la pacientul care urmează să fie tratat. Compuşii pot fi administraţi într-un regim de 1 până la de 4 ori pe zi, de preferinţă, o dată sau de două ori pe zi.
Compoziţiile farmaceutice din invenţie conţin, de asemenea, unu sau mai mulţi excipienţi suplimentari acceptabili farmaceutic. Prin „excipient acceptabil farmaceutic” se înţelege o substanţă inactivă terapeutic despre care se spune că este utilizată pentru încorporarea ingredientului activ şi care este acceptabilă pentru pacient din punct de vedere farmacologic/toxicologic şi, pentru chimistul farmaceutic care o produce, din punct de vedere fizico/chimic, în raport cu compoziţia, formularea, stabilitatea, acceptarea de către pacient şi cu biodisponibilitatea. Excipientul sau purtătorul include, de asemenea, orice substanţă care serveşte la îmbunătăţirea eliberării şi a eficacităţii principiului activ în compoziţia farmaceutică. Exemple de purtători acceptabili farmaceutic includ unul sau mai mulţi dintre apă, soluţie salină, soluţie salină tamponată cu fosfat, dextroză, glicerol şi etanol, precum şi combinaţii ale acestora. În multe cazuri, va fi de preferat să se includă în compoziţie agenţi izotonici, de exemplu, zaharuri, polialcooli cum ar fi manitol, sorbitol sau clorură de sodiu. Purtătorii acceptabili farmaceutic pot cuprinde în plus cantităţi minore de substanţe auxiliare, cum ar fi agenţi de umectare sau emulsionare, conservanţi sau tampon, care sporesc durata de valabilitate sau eficacitatea proteinei de fuziune sau a compoziţiilor care fac parte din compoziţiile farmaceutice. Exemple de purtători corespunzători sunt bine cunoscute în literatură (vezi de exemplu Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 19-a, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). Exemple de purtători, fără limitare, sunt o serie de zaharide, cum ar fi lactoză, dextroză, zaharoză, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol şi maltitol; o serie de amidon, cum ar fi amidon de porumb, amidon de grâu, amidon de orez şi amidon de cartof; o serie de celuloză, cum ar fi celuloză, metil celuloză, carboxi metil celuloză de sodiu şi hidroxil propilmetil celuloză; şi o serie de materiale de umplutură, cum ar fi gelatină şi polivinil pirolidonă. În unele cazuri, se poate adăuga un agent de dezintegrare, cum ar fi polivinil pirolidonă reticulată, agar, acid alginic sau alginat de sodiu.
Numărul şi natura excipienţilor acceptabili farmaceutic depind de forma de doză dorită. Excipienţii acceptabili farmaceutic sunt cunoscuţi de către persoana de specialitate în domeniu (Fauli y Trillo C. (1993) „Tratado de Farmacia Galénica”, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid). Compoziţiile menţionate pot fi preparate cu ajutorul metodelor convenţionale cunoscute în stadiul tehnicii ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, ediţia a 20-a (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).
Pentru compoziţii farmaceutice care cuprind un agent care este o moleculă de acid nucleic, molecula de acid nucleic poate fi prezentă în oricare dintre o varietate de sisteme de eliberare cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu, incluzând acid nucleic şi sisteme de expresie bacteriene, virale şi de mamifer, cum ar fi, de exemplu, constructe de expresie recombinante, aşa cum este furnizat aici. Tehnicile de încorporare a ADN-ului în astfel de sisteme de expresie sunt bine cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu. ADN-ul poate fi, de asemenea, „nud”, aşa cum este descris, de exemplu, în Ulmer şi colab., Science 259:1745-49, 1993 şi revizuit de Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Absorbţia ADN-ului nu poate fi crescută prin acoperirea ADN-ului pe granule biodegradabile, care sunt transportate eficient în celule.
Moleculele de acid nucleic pot fi livrate într-o celulă în conformitate cu oricare dintre mai multe metode descrise în domeniu (vezi, de ex., Akhtar şi colab., Trends Cell Bio. 2:139 (1992); Delivery Strategies for Antisens Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer şi colab., Mol. Membr. Biol. 16:129-40 (1999); Hofland şi Huang, Handb. Exp. Pharmacol. 137:165-92 (1999); Lee şi colab., ACS Symp. Ser. 752:184-92 (2000); brevetul U.S. Nr. 6,395,713; Publicaţia cererii internaţionale de brevet nr. WO 94/02595); Selbo şi colab., Int. J. Cancer 87:853-59 (2000); Selbo şi colab., Tumor Biol. 23:103-12 (2002); publicaţiile cererilor de brevet U.S. numerele 2001/0007666, şi 2003/077829). Astfel de metode de livrare cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu includ, dar nu se limitează la, încapsularea în lipozomi, prin iontoforeză sau prin încorporare în alte vehicule, cum ar fi polimeri biodegradabili; hidrogeluri; ciclodextrine (vezi, de ex., Gonzalez şi colab., Bioconjug. Chem. 10: 1068-74 (1999); Wang şi colab., publicaţiile cererilor internaţionale numerele WO 03/47518 şi WO 03/46185); microsfere de acid poli(lactic-co-glicolic) (PLGA) şi PLCA (utile, de asemenea, pentru livrarea de peptide şi polipeptide şi alte substanţe) (vezi, de ex., brevetul U.S. Nr. 6,447,796; publicaţia cererii de brevet U.S. Nr. 2002/130430); nanocapsule biodegradabile; şi microsfere bioadezive, sau prin vectori proteici (Publicaţia cererii internaţionale nr. WO 00/53722). Într-o altă variantă de realizare, moleculele de acid nucleic pentru utilizare în modificarea (suprimarea sau creşterea) unui răspuns imunitar într-o celulă imună şi pentru tratarea unei boli sau tulburări imunologice pot fi, de asemenea, formulate sau complexate cu polietilenimină şi derivaţi ai acesteia, cum ar fi derivaţi de polietilenimină-polietilenglicol-N-acetilgalactozamină (PEI-PEG-GAL) sau de polietilenimină-polietilenglicol-tri-N-acetilgalactozamină (PEI-PEG-triGAL) (vezi, de asemenea, de ex., publicaţie cererii de brevet U.S. Nr. 2003/0077829).
Într-o variantă de realizare preferată, compoziţia farmaceutică sau combinaţia farmaceutică conform invenţiei cuprinde, în plus, împreună sau separat, un agent antitumoral.
Aşa cum este utilizat aici, "agent antitumoral" este înţeles ca compusul biologic sau chimic menţionat care tratează tumorile sau previne formarea acestora. Într-o variantă de realizare preferată, agentul antitumoral menţionat este selectat din grupul constând din un agent citotoxic, un agent antiangiogenic, un agent antimetastatic şi un agent antiproliferativ.
Aşa cum este utilizat în prezenta invenţie, termenul "agent citotoxic" se referă la un agent care este capabil să promoveze moartea celulelor şi care are capacitatea de a reduce creşterea, de a opri creşterea sau de a distruge celulele şi, în special, celulele cu proliferare rapidă şi încă în mod deosebit, celulele tumorale. Moartea celulară poate fi cauzată de orice mecanism, cum ar fi, de exemplu, apoptoza, deşi nu se limitează la această cauză, prin inhibarea metabolismului, interferenţa cu organizarea citoscheletului, sau modificarea chimică a ADN-ului. Termenul agent citotoxic cuprinde orice agent de chimioterapie, incluzând molecule organice mici, peptide, oligonucleotide; toxine; enzime; citokine; radioizotopi sau agenţi de radioterapie.
"Agent antiangiogenic" este înţeles ca o substanţă chimică sau biologică care inhibă sau reduce formarea de noi vase de sânge, adică angiogeneza.
Agenţi antiangiogenici care pot fi utilizaţi cu polipeptida conform primului aspect al invenţiei, sau cu proteina de fuziune conform celui de-al doilea aspect al invenţiei, includ, fără limitare, un agent antiangiogenic selectat din grupul de paclitaxel, 2-metoxiestradiol, prinomastat, batimastat, BAY 12-9566, carboxiamidotriazol, CC-1088, acid dextrometorfan acetic, acid dimetilxantenon acetic, endostatină, IM-862, marimastat, penicilamină, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, lactat de squalamină, SU5416, talidomidă, combretastatină, tamoxifen, COL-3, neovastat, BMS-275291, SU6668, anticorpi anti-VEGF, Medi-522 (Vitaxin II), CAI, interleukin 12, IM862, amiloridă, angiostatină, Kl-3 angiostatină, Kl-5 angiostatină, Captopril, DL-alfa-difluorometilornitină, DL-alfa-difluorometilornitină HCl, endostatină, fumagilină, erbimicină A, 4-hidroxifenilretinamidă, juglonă, laminină, laminină hexapeptidă, laminină pentapeptidă, lavendustin A, medroxiprogesteron, minociclină, inhibitor de ribonuclează a placentei, suramin, trombospondin, anticorpi direcţionaţi împotriva factorilor proangiogenici (de exemplu, Avastin, Erbitux, Vectibix, Herceptin); inhibitori de tirozin kinază cu greutate moleculară mică ai factorilor de creştere proangiogenici (de exemplu, Tarceva, Nexavar, Sutent, Iressa); inhibitori de mTOR (de exemplu, Torisel); interferon alfa, beta şi gamma, IL-12, inhibitori ai metaloproteinazei matriceale (de ex., COL3, marimastat, batimastat); ZD6474, SU1248, vitaxin; inhibitori de PDGFR (de exemplu, Gleevec); NM3 şi 2-ME2; ciclopeptide, cum ar fi cilengitidă.
"Agent antimetastatic" este înţeles ca o substanţă chimică sau biologică care inhibă sau reduce metastazele, adică propagarea la distanţă, în mod fundamental prin fluxul limfatic sau sanguin, a celulelor cauzatoare de cancer şi a creşterii de noi tumori în situsurile de destinaţie a metastazelor menţionate..
"Agent antiproliferativ" este înţeles ca o substanţă chimică sau biologică care este capabilă să prevină sau să inhibe formarea sau creşterea tumorilor. Agenţi antiproliferativi includ, dar nu se limitează la (i) antimetaboliţi, cum ar fi antimetaboliţi ai acidului folic (aminopterină, denopterină, metotrexat, edatrexat, trimetrexat, nolatrexed, lometrexol, pemetrexed, raltitrexed, piritrexim, pteropterin, leucovorin, 10-propargil-5,8-dideazafolat (PDDF, CB3717)), analogi de purină (cladribină, clofarabină, fludarabină, mercaptopurină, pentostatin, tioguanină) şi analogi de pirimidină (capecitabină, citarabină sau ara-C, decitabină, fluorouracil, 5-fluorouracil, doxifluridină, floxuridină şi gemcitabină) (ii) produse naturale, cum ar fi antibiotice antitumorale şi inhibitori mitotici, cum ar fi alcaloizi vinca, cum ar fi vindesină, vincristină, vinblastină, vinorelbină; taxani, cum ar fi paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere™); colchicină (NSC 757), tiocolchicină (NSC 361792), derivaţi de colchicină (de ex., NSC 33410), şi alocolchicină (NSC 406042); halicondrină B (NSC 609395); dolastatină 10 (NSC 376128); maitansină (NSC 153858); rizoxină (NSC 332598); epotilonă A, epotilonă B; discodermolid; estramustină; nocodazol; (iii) hormoni şi antagonişti ai acestora, cum ar fi tamoxifen, toremifen, anastrozol, arzoxifen, lasofoxifen, raloxifen, nafoxidină, fulvestrant, aminoglutetimidă, testolactonă, atamestan, exemestan, fadrozol, formestan, letrozol, goserelin, leuprorelin sau leuprolidă, buserelin, histrelin, megestrol şi fluoximesteron; (iv) agenţi biologici, cum ar fi vectori virali, interferon alfa şi interleukine; (v) compuşi pe bază de platină, cum ar fi carboplatină, cisplatină [cis-diaminedicloroplatină, (CDDP)], oxaliplatină, iproplatină, nedaplatină, tetranitrat de triplatină, tetraplatină, satraplatină (JM216), JM118 [cis aminodicloro (II)], JM149 [cis aminodicloro (ciclohexilamină) trans dihidroxo platină (IV)], JM335 [trans aminodicloro dihidroxo platină (IV)], transplatină, ZD0473, cis, trans, cis-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl, malanat-1,2-diaminociclohexanoplatină(II), 5-sulfosalicilat-trans-(1,2-diaminociclohexan)platină (II) (SSP), poli-[(trans-1,2-diaminociclohexan)platină]-carboxiamiloză (POLY-PLAT) şi 4-hidroxi-sulfonilfenilacetat (trans-1,2- diaminociclohexan) platină (II) (SAP) şi (vi) medicamente de alchilare a ADN-ului, cum ar fi azot iperită, nitrozouree, derivaţi de etilenimină, alchil sulfonaţi şi triazeni, incluzând, dar fără limitare la, ciclofosfamidă (Cytoxan™), busulfan, improsulfan, piposulfan, pipobroman, melfalan (L-sarcolizină), clorambucil, mecloretamină sau mustină, uramustină sau uracil iperită, novembichin, fenesterină, trofosfamidă, ifosfamidă, carmustină (BCNU), lomustine (CCNU), clorozotocină, fotemustină, nimustină, ranimnustină, semustină (metil-CCNU), streptozocină, tiotepa, trietilenmelamină, trietilentiofosforamină, procarbazină, altretamină, dacarbazină, mitozolomidă şi temozolomidă.
În cazul compoziţiilor sau combinaţiilor farmaceutice conform invenţiei, care conţin un agent antitumoral, compoziţia poate fi prezentată ca o singură formulare (de ex., sub formă de tabletă sau capsulă care cuprinde o cantitate fixă din fiecare dintre componente) sau pot, pe de altă parte, să fie prezentate ca formulări separate pentru a fi ulterior combinate pentru administrare împreună, succesivă sau separată. Compoziţiile sau combinaţiile din invenţie includ, de asemenea, formularea ca un kit de constituenţi, în care componentele sunt formulate separat, dar sunt ambalate în acelaşi recipient. Persoanele de specialitate în domeniu vor aprecia că formularea diferitelor componente în cazul celei de-a doua compoziţii farmaceutice conform invenţiei poate fi similară, cu alte cuvinte, formulată în mod similar (în tablete sau pilule), ceea ce permite administrarea lor pe aceeaşi cale. În cazul în care diferitele componente din invenţie sunt formulate separat, cele două componente pot fi prezentate într-un blister. Fiecare blister conţine medicamentele care trebuie consumate în timpul zilei. Dacă medicamentele trebuie administrate de mai multe ori pe zi, medicamentele corespunzătoare fiecărei administrări pot fi plasate în diferite secţiuni ale blisterului, înregistrând, de preferinţă, în fiecare secţiune a blisterului momentul din zi în care trebuie administrate. Ca alternativă, componentele compoziţiei din invenţie pot fi formulate în mod diferit, astfel încât diferitele componente să fie administrate în mod diferit. Astfel, este posibil ca prima componentă să fie formulată ca tabletă sau capsulă pentru administrarea sa orală, iar a doua componentă să fie formulată pentru administrarea sa intravenoasă, sau invers. Raportul dintre componentele care fac parte din compoziţiile utilizate în a doua compoziţie farmaceutică din invenţie poate fi ajustat de către o persoană de specialitate în funcţie de agentul antitumoral utilizat în fiecare caz particular, precum şi de indicaţia dorită. Astfel, invenţia are în vedere compoziţii în care raportul dintre cantităţile celor două componente poate varia de la 50:1 până la 1:50, în particular, de la 20:1 până la 1:20, de la 1:10 până la 10:1 sau de la 5:1 până la 1:5.
Compoziţiile sau combinaţiile farmaceutice din invenţie pot fi administrate pe orice tip de cale adecvată, cum ar fi pe cale orală, pe cale locală, pe cale inhalatorie sau parenterală, astfel încât să fie incluşi excipienţii acceptabili farmaceutic necesari pentru formularea formei de doză dorite. Calea preferată de administrare a compoziţiilor farmaceutice menţionate este calea endovenoasă.
"Calea orală" este înţeleasă ca încorporarea în organism a compoziţiei farmaceutice după deglutiţie. Într-o variantă de realizare particulară, compoziţia farmaceutică din invenţie poate fi într-o formă de doză adecvată pentru administrarea sa pe cale orală, fie că este solidă sau lichidă. Formele de doză adecvate pentru administrarea lor pe cale orală pot fi tablete, capsule, siropuri sau soluţii, şi pot conţine orice excipient convenţional cunoscut în domeniu, cum ar fi lianţi, de exemplu, sirop, salcâm, gelatină, sorbitol sau polivinilpirolidonă; agenţi de umplere, de exemplu, lactoză, zahăr, amidon de porumb, fosfat de calciu, sorbitol sau glicină; lubrifianţi pentru comprimare, de exemplu, stearat de magneziu; agenţi de dezintegrare, de exemplu, amidon, polivinilpirolidonă, glicolat de sodiu de amidon sau celuloză microcristalină; sau agenţi de umectare acceptabili farmaceutic, cum ar fi lauril sulfat de sodiu. Compoziţiile solide orale pot fi preparate cu ajutorul procedeelor convenţionale de amestecare, umplere sau comprimare. Operaţiile de amestecare repetitivă pot fi utilizate pentru a distribui complet agentul activ în acele compoziţii care utilizează cantităţi mari de agenţi de umplere. Operaţiile menţionate sunt convenţionale în domeniu. Tabletele pot fi preparate, de exemplu, prin granulare umedă sau uscată, şi opţional cu acoperirea lor conform procedeelor cunoscute în practica farmaceutică obişnuită, în special, cu o acoperire enterică.
Pe de altă parte, "calea topică" este înţeleasă ca o administrare pe cale nesistemică, şi include aplicarea externă a unei compoziţii farmaceutice conform invenţiei pe epidermă, în cavitatea bucală, şi instilarea compoziţiei menţionate în urechi, ochi şi nas, şi care nu intră semnificativ în fluxul sanguin. "Calea sistemică" este înţeleasă ca administrarea pe cale orală, cale intravenoasă, cale intraperitoneală şi cale intramusculară. Prin "inhalare" se înţelege administrarea pe cale intranazală şi prin inhalare orală. Formele de doză adecvate pentru administrarea menţionată, cum ar fi o formulare în aerosol sau un inhalator cu doză măsurată, pot fi preparate cu ajutorul tehnicilor convenţionale. Într-o variantă de realizare, calea de administrare este calea intranazală.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "parenteral", include administrare pe cale intravenoasă, pe cale intraperitoneală, pe cale intramusculară sau pe cale subcutanată. Formele de doză subcutanată, intramusculară şi intravenoasă pentru administrare parenterală sunt în general preferate.
Într-o variantă de realizare, compoziţiile farmaceutice din invenţie pot fi adaptate pentru administrarea lor parenterală, cum ar fi soluţii sterile, suspensii sau produse liofilizate în forma unitară de doză corespunzătoare. Compoziţii farmaceutice adecvate pentru utilizarea lor prin injectare includ soluţii apoase sterile (atunci când sunt solubile în apă) sau dispersii şi pulberi sterile pentru prepararea extemporanee a soluţiilor sau a dispersiilor sterile injectabile. Pentru administrarea lor pe cale intravenoasă, unii purtători adecvaţi includ soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS). În toate cazurile, compoziţia trebuie să fie sterilă şi trebuie să fie fluidă până la punctul în care are o capacitate de a fi injectată cu uşurinţă. Aceasta trebuie să fie stabilă în condiţiile de preparare şi depozitare, şi trebuie protejată de acţiunea de contaminare a microorganismelor, cum ar fi bacterii şi fungi. Purtătorul poate fi un solvent sau un mediu de dispersare care conţine, de exemplu, apă, etanol, un poliol acceptabil farmaceutic, cum ar fi glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lichid şi amestecuri adecvate ale acestora. Fluiditatea adecvată poate fi menţinută, de exemplu, prin utilizarea unei acoperiri cum ar fi lecitină, prin menţinerea dimensiunii particulelor necesare, în cazul dispersiei, şi prin utilizarea surfactanţilor. Prevenirea acţiunii microorganismelor poate fi realizată cu ajutorul diverşilor agenţi antibacterieni şi antifungici, de exemplu, parabeni, clorbutanol, fenol, acid ascorbic şi tiomersal. În cele mai multe cazuri, va fi de preferat să se includă în compoziţie agenţi izotonici, de exemplu, zaharuri; polialcooli cum ar fi manitol, sorbitol; sau clorură de sodiu. Absorbţia prelungită a compoziţiilor injectabile poate fi cauzată de includerea unui agent care întârzie absorbţia, de exemplu, monostearat de aluminiu şi gelatină.
Soluţiile injectabile sterile pot fi preparate prin încorporarea compusului activ în cantitatea necesară într-un solvent adecvat cu unul sau cu o combinaţie de ingrediente menţionate mai sus, după cum este necesar, urmată de sterilizare prin filtrare prin membrane sterile. În general, dispersiile sunt preparate prin încorporarea compusului activ într-un vehicul steril care conţine un mediu bazic de dispersare şi restul de ingrediente necesare dintre cele enumerate anterior. În cazul pulberilor sterile pentru prepararea soluţiilor injectabile sterile, procedeele preferate de preparare sunt uscarea în vid şi liofilizarea care dau naştere la o pulbere cu ingredientul activ plus orice ingredient suplimentar dorit dintr-o soluţie a acestuia sterilă, filtrată anterior.
Compoziţiile farmaceutice din invenţie pot fi administrate în mod adecvat cu ajutorul perfuziei cu impulsuri, de exemplu, cu doze descrescătoare de compoziţie. De preferinţă, doza este administrată cu ajutorul injecţiilor, mai preferat, injecţii intravenoase sau subcutanate, în funcţie, parţial, de faptul că administrarea este acută sau cronică.
Într-o variantă de realizare, prima sau a doua compoziţie farmaceutică din invenţie este preparată cu purtători care vor proteja polipeptida menţionată faţă de o eliminare rapidă din organism, cum ar fi o formulare cu eliberare controlată, incluzând implanturi şi sisteme de administrare microîncapsulate. Pot fi utilizaţi polimeri biocompatibili biodegradabili, cum ar fi vinilacetat de etilenă, polianhidride, acid poliglicolic, colagen, poliortoesteri şi acid polilactic. Procedeele de preparare a formulărilor menţionate vor fi clare pentru persoanele de specialitate în domeniu. Materialele pot fi, de asemenea, obţinute comercial de la Alza Corporation şi Nova Pharmaceuticals, Inc.
Compoziţiile cu eliberare susţinută includ, de asemenea, preparate din cristale de anticorpi suspendate în formulări adecvate care pot menţine cristalele în suspensie. Aceste preparate, atunci când sunt injectate pe cale subcutanată sau intraperitoneală, pot produce un efect de eliberare susţinută. Alte compoziţii includ, de asemenea, anticorpi prinşi în lipozomi. Lipozomii care conţin astfel de anticorpi sunt preparaţi prin metode cunoscute, cum ar fi din Epstein şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. US, (1985) 82:3688-3692; Hwang şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. US, (1980) 77:4030-4034; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.
În ciuda faptului că polipeptida din invenţie şi conjugatele şi proteinele de fuziune care conţin polipeptida din invenţie sunt capabile să se transloce prin membrane biologice, persoana de specialitate va înţelege că poate fi, de asemenea, convenabil să formuleze în nanoparticule conjugatele sau proteinele de fuziune care cuprind polipeptidele din invenţie.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "nanoparticulă" se referă la orice material care are dimensiuni în intervalul 1-1000 nm. În unele variante de realizare, nanoparticulele au dimensiuni în intervalul 2-200 nm, de preferinţă, în intervalul 2-150 nm, şi chiar mai preferat, în intervalul 2-100 nm.
Nanoparticulele pot contribui la păstrarea integrităţii polipeptidei în fluidele biologice până când ajunge la organul ţintă. Mai mult, în cazul compoziţiilor care cuprind un agent antitumoral, încapsularea compoziţiei poate să scadă efectele secundare cauzate de agentul antitumoral. În final, nanoparticulele pot fi, de asemenea, modificate astfel încât să includă fragmente care permit direcţionarea nanoparticulei către un organ de interes.
Astfel, într-o altă variantă de realizare, compoziţiile farmaceutice din invenţie cuprind conjugaţii, proteinele de fuziune şi compoziţiile conform invenţiei care fac parte dintr-o nanoparticulă.
Nanoparticulele adecvate care pot fi utilizate în contextul prezentei invenţii includ astfel de materiale la scară nanometrică, cum ar fi o nanoparticulă pe bază de lipide, o nanoparticulă superparamagnetică, un nanoînveliş, un nanocristal semiconductor, un punct cuantic, o nanoparticulă pe bază de polimer, o nanoparticulă pe bază de siliciu, o nanoparticulă pe bază de silice, o nanoparticulă pe bază de metal, o fulerenă şi un nanotub.
Livrarea ţintită poate fi realizată prin adăugare de liganzi fără a compromite capacitatea nanoparticulelor de a-şi livra încărcăturile polipeptidice utile. Este avut în vedere că acest lucru va permite livrarea către anumite celule, ţesuturi şi organe. Specificitatea de ţintire a sistemelor de livrare pe bază de liganzi se bazează pe distribuţia receptorilor ligandului pe diferite tipuri de celule. Ligandul de ţintire poate fi asociat, fie necovalent, fie covalent cu o nanoparticulă şi poate fi conjugat la nanoparticule printr-o varietate de metode, aşa cum a fost discutat aici.
Exemple de proteine sau peptide care pot fi utilizate pentru nanoparticule de ţintire includ transferină, lactoferină, TGF-β, factor de creştere a nervilor, albumină, peptidă HIV Tat, peptidă RGD şi insulină, precum şi altele.
Se va înţelege că formularea produsului conform invenţiei într-o nanoparticulă nu este destinată sau nu este destinată exclusiv să faciliteze accesul produsului la interiorul celulei, ci să protejeze produsul de degradare şi/sau să faciliteze ţintirea nanoparticulei către organul de interes.
Compoziţiile farmaceutice din invenţie sunt adecvate pentru administrare la orice tip de mamifer, de preferinţă, la o fiinţă umană.
Toţi termenii şi variantele de realizare descrise anterior sunt aplicabile în mod egal acestui aspect al invenţiei.
Utilizări medicale
Într-un alt aspect, invenţia se referă la o polipeptidă sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, la un conjugat conform invenţiei, la o polinucleotidă conform invenţiei, la un vector conform invenţiei, la o celulă gazdă conform invenţiei, sau la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, pentru utilizare în medicină.
Într-un alt aspect, invenţia se referă la o polipeptidă sau la o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform invenţiei, la un conjugat conform invenţiei, la o polinucleotidă conform invenţiei, la un vector conform invenţiei, la o celulă gazdă conform invenţiei, sau la o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul cancerului.
"Prevenirea" este înţeleasă ca administrarea unui compus într-un stadiu iniţial sau timpuriu al bolii sau, de asemenea, pentru prevenirea apariţiei acesteia.
Termenul "tratament" este utilizat pentru a indica administrarea unui compus pentru a controla progresia bolii înainte sau după apariţia semnelor clinice. Controlul progresiei bolii este înţeles ca rezultatele clinice benefice sau dorite care includ, dar nu se limitează la, reducerea simptomelor, reducerea duratei bolii, stabilizarea afecţiunilor patologice (evitarea în mod specific a deteriorării suplimentare), întârzierea progresiei bolii, ameliorarea afecţiunii patologice şi remisiunea (atât parţială, cât şi completă). Controlul progresiei bolii presupune, de asemenea, o prelungire a supravieţuirii, în comparaţie cu supravieţuirea aşteptată dacă nu a fost aplicat tratamentul.
Un "subiect", aşa cum este utilizat aici, include orice animal care are un cancer sau prezintă un simptom sau cancer, sau este expus riscului de a avea un cancer sau de a prezenta un simptom de cancer. Subiecţii adecvaţi (pacienţi) includ animale de laborator (cum ar fi şoarece, şobolan, iepure sau cobai), animale de fermă şi animale domestice sau animale de companie (cum ar fi o pisică sau un câine). Sunt incluse primate non-umane şi, de preferinţă, pacienţi oameni.
Termenul "cancer" se referă la o boală caracterizată prin diviziune celulară necontrolată (sau printr-o creştere a supravieţuirii sau a rezistenţei la apoptoză), prin capacitatea celulelor menţionate de a invada alte ţesuturi învecinate (invazie) sau prin răspândirea în alte zone ale organismului în care celulele nu sunt localizate în mod normal (metastaze) prin vasele limfatice şi sanguine. În funcţie de faptul că tumorile se pot răspândi sau nu prin invazie şi metastază, ele sunt clasificate ca fiind, fie benigne, fie maligne: tumorile benigne sunt tumori care nu se pot răspândi prin invazie sau metastază, adică cresc doar local; în timp ce tumorile maligne sunt tumori care sunt capabile să se răspândească prin invazie şi metastaze. Polipeptidele conform prezentei invenţii sunt utile pentru tratamentul tumorilor locale şi maligne. Aşa cum este utilizat aici, termenul cancer include, dar nu se limitează la, următoarele tipuri de cancer: cancer de sân; cancer de căi biliare; cancer de vezică urinară; cancer cerebral, incluzând glioblastoame şi meduloblastoame; cancer de col uterin; coriocarcinom; cancer de colon; cancer endometrial; cancer esofagian; cancer gastric; neoplasme hematologice incluzând leucemie acută limfocitară şi mielogenă; leucemie/limfom limfoblastic acut cu celule T; leucemie cu celule păroase; leucemie mielogenă cronică, mielom multiplu; leucemii asociate cu SIDA şi leucemie/limfom cu celule T la adulţi; neoplasme intraepiteliale, incluzând boala Bowen şi boala Paget; cancer hepatic; cancer pulmonar; limfoame incluzând boala Hodgkin şi limfoame limfocitare; neuroblastoame; cancer oral, incluzând carcinom cu celule scuamoase; cancer ovarian incluzând pe cele care provin din celule epiteliale, celule stromale, celule germinale şi celule mezenchimale; cancer pancreatic; cancer de prostată; cancer rectal; sarcoame, incluzând leiomiosarcom, rabdomiosarcom, liposarcom, fibrosarcom şi osteosarcom; cancer de piele, incluzând melanom, carcinom cu celule Merkel, sarcom Kaposi, carcinom bazocelular şi cancer cu celule scuamoase; cancer testicular, incluzând tumori germinale, cum ar fi seminoame, non-seminoame (teratoame, coriocarcinoame), tumori stromale şi tumori cu celule germinale; cancer tiroidian, incluzând adenocarcinom tiroidian şi carcinom medular; şi cancer renal, incluzând adenocarcinom şi tumoră Wilms. Alte tipuri de cancer vor fi cunoscute unei persoane de specialitate în domeniu. Într-o variantă de realizare preferată, cancerul tratat este cancer pulmonar, de preferinţă, adenocarcinom pulmonar, mai preferat, un adenocarcinom pulmonar determinat de KRas.
Într-o variantă de realizare preferată, cancerul este o tumoră solidă.
Toate combinaţiile de compuşi din invenţie şi tipurile de cancer sunt incluse în prezenta invenţie.
Într-o variantă de realizare preferată, cancerul este selectat din grupul constând din glioblastom şi cancer pulmonar fără celule mici.
"Glioblastomul", cunoscut, de asemenea, cu denumirea de glioblastom şi astrocitom de gradul IV, este cel mai frecvent şi mai agresiv cancer care începe în creier.
Termenul "NSCLC" sau "cancer pulmonar fără celule mici", aşa cum este utilizat aici, se referă la un grup de boli eterogene grupate împreună, deoarece prognosticul şi gestionarea lor sunt aproximativ identice conform clasificării histologice a Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii/Asociaţiei Internaţionale pentru Studiul cancerului pulmonar (Travis WD şi colab. Histological typing of lung and pleural tumours, a 3-a ed. Berlin: Springer-Verlag, 1999):
1. carcinomul cu celule scuamoase (SCC), reprezentând 30% până la 40% din NSCLC, începe în tuburile respiratorii mai mari, dar creşte mai lent, ceea ce înseamnă că dimensiunea acestor tumori variază la diagnosticare.
2. adenocarcinomul este cel mai frecvent subtip de NSCLC, reprezentând 50% până la 60% din NSCLC, care începe în apropierea suprafeţei de schimb de gaze a plămânului şi care include un subtip, carcinomul bronşioalveolar, care poate avea răspunsuri diferite la tratament.
3. carcinomul cu celule mari este o formă cu creştere rapidă care creşte aproape de suprafaţa plămânului. Este, în principal, un diagnostic de excludere, iar atunci când se fac mai multe investigaţii, este de obicei reclasificat în carcinom cu celule scuamoase sau adenocarcinom.
4. carcinomul adenoscuamos este un tip de cancer care conţine două tipuri de celule: celule scuamoase (celule subţiri, plate care căptuşesc anumite organe) şi celule de tip glandular.
5. carcinoame cu elemente pleomorfe, sarcomatoide sau sarcomatoase. Acesta este un grup de tumori rare care reflectă un continuum în eterogenitatea histologică, precum şi diferenţiere epitelială şi mezenchimală.
6. tumora carcinoidă este o tumoră pulmonară neuroendocrină cu creştere lentă şi începe în celulele care sunt capabile să elibereze un hormon ca răspuns la un stimul furnizat de sistemul nervos.
7. carcinoamele de tip glandă salivară încep în celulele glandelor salivare situate în interiorul căilor respiratorii mari ale plămânului.
8. carcinoamele neclasificate includ cancere care nu se încadrează în niciuna dintre categoriile de cancer pulmonar menţionate mai sus.
Toţi termenii şi variantele de realizare descrise anterior sunt aplicabile în mod egal acestui aspect al invenţiei.
Invenţia este detaliată mai jos cu ajutorul următoarelor exemple care sunt doar ilustrative şi în niciun caz limitative pentru sfera de întindere a invenţiei.
EXEMPLE
Materiale şi metode
Transfecţia celulelor cu ARNm de Omomyc şi OmoCS
ARNm pentru mutanţi Omomyc şi OmoCS a fost achiziţionat de la Trilink Biotechnologies la concentraţii de 0,782 mg/mL şi, respectiv, 0,876 mg/mL (ARCA acoperit şi complet substituit cu 5-metil-C şi pseudo-U modificat).
Oricare dintre secvenţa de ADN de Omomyc sau OmoCS a fost introdusă într-un vector în aval de promotorul ARN polimerazei T7 şi de o coadă poli(T) situată la capătul 3p. 5-metilcitidin-5"-trifosfat şi ARN modificat cu pseudouridin-5'-trifosfat au fost produse prin transcriere in vitro folosind o ARN polimerază T7. ARN-ul a fost de asemenea acoperit utilizând analogul structurii capacului ARN [3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G]. Vectorul ADN şablon a fost degradat utilizând ADNază şi trifosfat rezidual a fost îndepărtat printr-un tratament cu fosfatază. Produsul ARN a fost apoi purificat, şi integritatea şi cantitatea au fost evaluate prin electroforeză pe gel de agaroză şi, respectiv, Nanodrop. ARN-ul a fost depozitat la -80°C. Reactivul de transfecţie Lipofectamine MessengerMAX a fost achiziţionat de la Thermo Fisher Scientific. Liniile de celule A549 şi U87 au fost însămânţate la 500 şi, respectiv, 1000 de celule în fiecare godeu, în plăci cu 96 de godeuri. Celulele au fost crescute în Mediu Eagle Modificat de Dulbecco (DMEM) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) şi 1% L-glutamină (mediu complet). După 24 de ore, celulele au fost transfectate cu complexe lipofectamină-ARNm. 3 µg de ARNm pentru fiecare 2 µl de lipofectamină au fost diluate separat în mediu fără ser şi au fost incubate timp de 10 minute. Diluţiile de ARNm şi lipofectamină au fost apoi amestecate şi incubate timp de 5 minute pentru a permite formarea complexelor. Godeurile au fost spălate de două ori cu mediu fără ser. Celulele au fost diluate în serie începând de la 1 µg până la 0,0625 µg de ARNm la fiecare godeu în 100 µl de mediu total fără ser. Pentru fiecare concentraţie, celulele de control au fost tratate numai cu lipofectamină şi au fost utilizate triplicate pentru fiecare condiţie. După 4 ore de transfecţie, mediile fără ser şi complexele mARN-lipofectamină au fost îndepărtate din godeuri şi au fost substituite cu medii complete. Celulele au fost incubate timp de 3 zile. Apoi, viabilitatea a fost evaluată folosind CellTiter-Blue de la Promega. Absorbanţa relativă la godeurile netratate a fost calculată pentru fiecare condiţie. Semnificaţia statistică a fost calculată prin test t.
Transfecţia celulelor cu ARNm de OmoCS şi OmoCA
ARNm pentru mutanţi OmoCS şi OmoCA a fost achiziţionat de la Trilink Biotechnologies (ARCA acoperit şi complet substituit cu 5-metil-C şi pseudo-U modificat). Concentraţiile de ARNm pentru OmoCS şi OmoCA au fost determinate la 0,845 mg/mL şi, respectiv, 0,832 mg/mL utilizând un Nanodrop. Reactivul de transfecţie Lipofectamine MessengerMAX a fost achiziţionat de la Thermo Fisher Scientific. Celulele A549 au fost însămânţate la 500 de celule în fiecare godeu, într-o placă cu 96 de godeuri. Celulele au fost crescute în mediu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) şi 1% L-glutamină (mediu complet). După 24 de ore, celulele au fost transfectate cu complexe lipofectamină-ARNm. 2 µg de ARNm pentru fiecare 1,5 µL de lipofectamină au fost diluate separat în mediu fără ser şi au fost incubate timp de 10 minute. Diluţiile de ARNm şi lipofectamină au fost apoi amestecate şi au fost incubate timp de 5 minute pentru a permite formarea complexelor. Godeurile au fost spălate de două ori cu mediu fără ser. Celulele au fost tratate cu diluţii seriale 1:2 începând cu 1 µg de ARNm la fiecare godeu în 50 µl de mediu total fără ser (200 nM). Pentru fiecare concentraţie, celulele au fost, fie netratate (fără tratare), fie tratate numai cu lipofectamină (doar Lipo) ca godeuri de control. Au fost efectuate triplicate pentru fiecare condiţie. După 4 ore de transfecţie, mediile fără ser şi complexele mARN-lipofectamină au fost îndepărtate din godeuri şi au fost substituite cu medii RPMI complete. Celulele au fost incubate timp de 3 zile. În acel moment, densitatea celulară a fost evaluată folosind colorarea cu violet cristal. Absorbanţa relativă în godeurile netratate a fost calculată pentru fiecare concentraţie.
Exemplul 1
În mod surprinzător, mutantul OmoCS prezintă o inhibare mai mare a creşterii celulare, în comparaţie cu secvenţa originală Omomyc la concentraţie scăzută (Figura 1). Această eficacitate îmbunătăţită, în comparaţie cu secvenţa originală Omomyc ar putea fi explicată, cel puţin parţial, prin ipoteza că cisteina interfacială oxidată a homodimerului Omomyc ar preveni heterodimerizarea Omomyc cu Myc sau cu Max, limitând activitatea Omomyc la simpla competiţie pentru legare la caseta E. În schimb, mutantul OmoCS ar favoriza alte activităţi biologice ale Omomyc prin promovarea formării populaţiilor heterodimerice.
Exemplul 2
În mod surprinzător, mutantul OmoCA se comportă exact ca OmoCS în acelaşi test de proliferare (Figura 2).
Claims (15)
1. O polipeptidă care cuprinde polipeptida din SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate având un grad de identitate, în raport cu SECV ID NR: 1, mai mare de 90% şi având o treonină în poziţia corespondentă poziţiei 61 din SECV ID NR: 1, o izoleucină în poziţia corespondentă poziţiei 68 din SECV ID NR: 1, o glutamină în poziţia corespondentă poziţiei 74 din SECV ID NR: 1 şi o asparagină în poziţia corespondentă poziţiei 75 din SECV ID NR: 1, şi în care reziduul X de la poziţia corespondentă poziţiei 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, în care varianta echivalentă funcţional menţionată păstrează activitatea supresoare tumorală a SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină.
2. Polipeptida conform revendicării 1, în care varianta echivalentă funcţional poate dimeriza cu Myc şi/sau cu partenerul său obligatoriu p21/p22Max şi poate inhiba activitatea Myc odată găsită în nucleu, fiind capabilă să se transloce prin membrana celulară şi prin învelişul nuclear.
3. Polipeptida conform oricăreia dintre revendicările 1 sau 2, în care polipeptida menţionată este selectată din grupul constând din:
a) o polipeptidă care constă din polipeptida din SECV ID NR: 1 în care reziduul X de la poziţia 89 din SECV ID NR: 1 nu este o cisteină, sau constă dintr-o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate, conform revendicării 1; şi
b) o polipeptidă care constă din polipeptida din SECV ID NR: 3 în care reziduul X de la poziţia 90 din SECV ID NR: 3 nu este o cisteină.
4. Polipeptida conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, în care reziduul X este serină sau alanină.
5. Polipeptida conform revendicării 4, care constă din SECV ID NR: 4.
6. Un conjugat care cuprinde:
a. polipeptida sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform oricăreia dintre revendicările 1-5 şi
b. un fragment chimic care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei conform oricăreia dintre revendicările 1-5 sau a variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate conform oricăreia dintre revendicările 1-5.
7. Conjugatul conform revendicării 6, în care fragmentul chimic care facilitează absorbţia celulară a polipeptidei sau a variantei echivalente funcţional a polipeptidei menţionate este o secvenţă de peptidă care pătrunde în celulă, şi în care secvenţa de peptidă menţionată care pătrunde în celulă şi polipeptida menţionată sau varianta echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate formează o proteină de fuziune, de preferinţă, secvenţa de peptidă care pătrunde în celulă este selectată din grupul constând din GRKKRRQRRR (SECV ID NR: 38) şi RRRRRRLR (SECV ID NR: 39).
8. Conjugatul conform oricăreia dintre revendicările 6 sau 7, care cuprinde, în plus, un alt semnal de localizare nucleară, în special, semnalul de localizare nucleară este selectat din grupul constând din PKKKRKV (SECV ID NR: 6), PAAKRVKLD (SECV ID NR: 54) şi KRPAATKKAGQAKKKK (SECV ID NR: 7).
9. O polinucleotidă care codifică o polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5 sau un conjugat conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 8.
10. Un vector care cuprinde o polinucleotidă conform revendicării 9.
11. O celulă gazdă care cuprinde o polipeptidă conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5, un conjugat conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 8, o polinucleotidă conform revendicării 9 sau un vector conform revendicării 10.
12. O compoziţie farmaceutică care cuprinde o cantitate eficientă farmaceutic de o polipeptidă sau de o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate, conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 5, de un conjugat conform oricăreia dintre revendicările 6 până la 8, de o polinucleotidă conform revendicării 9, de un vector conform revendicării 10, sau de o celulă gazdă conform revendicării 11, şi un excipient acceptabil farmaceutic.
13. O polipeptidă sau o variantă echivalentă funcţional a polipeptidei menţionate conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 5, un conjugat conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 8, o polinucleotidă conform revendicării 9, un vector conform revendicării 10, o celulă gazdă conform revendicării 11, sau o compoziţie farmaceutică conform revendicării 12, pentru utilizare în medicină.
14. O polipeptidă sau o variantă echivalentă funcţional a acesteia conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 5, un conjugat conform oricăreia dintre revendicările de la 6 până la 8, o polinucleotidă conform revendicării 9, un vector conform revendicării 10, o celulă gazdă conform revendicării 11, sau o compoziţie farmaceutică conform revendicării 12, pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul cancerului.
15. Polipeptida sau varianta echivalentă funcţional a acesteia, conjugatul, polinucleotida, vectorul, celula gazdă sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 14, în care cancerul este selectat din grupul constând din glioblastom şi cancer pulmonar fără celule mici.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP16382339.6A EP3269734A1 (en) | 2016-07-15 | 2016-07-15 | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| PCT/EP2017/067998 WO2018011433A1 (en) | 2016-07-15 | 2017-07-17 | Methods and compositions for the treatment of cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MD3484913T2 true MD3484913T2 (ro) | 2024-10-31 |
Family
ID=56497695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MDE20190609T MD3484913T2 (ro) | 2016-07-15 | 2017-07-17 | Metode și compoziții pentru tratamentul cancerului |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11427621B2 (ro) |
| EP (2) | EP3269734A1 (ro) |
| JP (1) | JP7090593B2 (ro) |
| KR (1) | KR102232500B1 (ro) |
| CN (1) | CN109563151B (ro) |
| AU (1) | AU2017295071B2 (ro) |
| BR (1) | BR112019000732A2 (ro) |
| CA (1) | CA3029781A1 (ro) |
| EA (1) | EA201990298A1 (ro) |
| ES (1) | ES2985967T3 (ro) |
| HR (1) | HRP20241153T1 (ro) |
| HU (1) | HUE067973T2 (ro) |
| IL (1) | IL264176B2 (ro) |
| MA (1) | MA45675B1 (ro) |
| MD (1) | MD3484913T2 (ro) |
| MX (1) | MX2019000346A (ro) |
| PL (1) | PL3484913T3 (ro) |
| RS (1) | RS65983B1 (ro) |
| SG (1) | SG11201900021PA (ro) |
| SM (1) | SMT202400360T1 (ro) |
| WO (1) | WO2018011433A1 (ro) |
| ZA (1) | ZA201900960B (ro) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101729826B1 (ko) * | 2015-01-09 | 2017-05-11 | 주식회사 동희산업 | 플라스틱 연료탱크의 제조방법 |
| KR101862239B1 (ko) * | 2016-07-07 | 2018-05-30 | 주식회사 동희산업 | 플라스틱 연료탱크의 제조방법 |
| KR101859583B1 (ko) * | 2016-07-07 | 2018-06-27 | 주식회사 동희산업 | 플라스틱 연료탱크의 제조방법 |
| EP3269734A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-17 | Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| WO2020041297A1 (en) * | 2018-08-20 | 2020-02-27 | Helix Nanotechnologies, Inc. | Methods and compositions for rna expression of myc inhibitors |
| TWI829893B (zh) * | 2019-03-19 | 2024-01-21 | 瓦爾希伯倫私人腫瘤研究基金會 | 診斷肺癌的方法 |
| JP7684947B2 (ja) * | 2019-03-19 | 2025-05-28 | フンダシオ プリバダ インスティトゥト ディンベスティガシオ オンコロジカ デ バル エブロン | 癌の治療のための併用療法 |
| KR102398339B1 (ko) * | 2020-01-09 | 2022-05-13 | 이화여자대학교 산학협력단 | 일산화질소 전달용 융합 펩타이드 및 이의 용도 |
| WO2021208787A1 (zh) * | 2020-04-15 | 2021-10-21 | 徐荣臻 | 用于筛选药物的靶标多肽和筛选方法 |
| EP4361633A1 (en) | 2022-10-25 | 2024-05-01 | Peptomyc, S.L. | Method for predicting response to a cancer treatment |
| EP4446742A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-16 | Peptomyc, S.L. | Method for assessing or monitoring the response to a cancer treatment |
| EP4473974A1 (en) * | 2023-06-07 | 2024-12-11 | Peptomyc, S.L. | Omomyc and kras inhibitors combination therapy for the treatment of cancer |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4263428A (en) | 1978-03-24 | 1981-04-21 | The Regents Of The University Of California | Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same |
| EP0052322B1 (de) | 1980-11-10 | 1985-03-27 | Gersonde, Klaus, Prof. Dr. | Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| DE3374837D1 (en) | 1982-02-17 | 1988-01-21 | Ciba Geigy Ag | Lipids in the aqueous phase |
| DE3474511D1 (en) | 1983-11-01 | 1988-11-17 | Terumo Corp | Pharmaceutical composition containing urokinase |
| WO1994002595A1 (en) | 1992-07-17 | 1994-02-03 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Method and reagent for treatment of animal diseases |
| US6447796B1 (en) | 1994-05-16 | 2002-09-10 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres |
| JPH11510389A (ja) | 1995-07-31 | 1999-09-14 | アメリカ合衆国 | 細胞タンパク質の機能を不活性化するためのタンパク質−タンパク質相互作用表面の拡張 |
| US6395713B1 (en) | 1997-07-23 | 2002-05-28 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for the delivery of negatively charged molecules |
| ES2356342T3 (es) | 1998-01-05 | 2011-04-07 | The University Of Washington | Mejora de transporte utilizando agentes de alteración de membrana. |
| WO2000053722A2 (en) | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Phogen Limited | Delivery of nucleic acids and proteins to cells |
| US20020130430A1 (en) | 2000-12-29 | 2002-09-19 | Castor Trevor Percival | Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products |
| US20030077829A1 (en) | 2001-04-30 | 2003-04-24 | Protiva Biotherapeutics Inc.. | Lipid-based formulations |
| US7060498B1 (en) | 2001-11-28 | 2006-06-13 | Genta Salus Llc | Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers |
| US7141540B2 (en) | 2001-11-30 | 2006-11-28 | Genta Salus Llc | Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof |
| WO2006135436A2 (en) | 2004-10-22 | 2006-12-21 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Inhibition of gene expression and therapeutic uses thereof |
| WO2013063560A2 (en) | 2011-10-27 | 2013-05-02 | New York University | INHIBITION OF c-MYC UBIQUITINATION TO PREVENT CANCER INITIATION AND PROGRESSION |
| EP2801370A1 (en) | 2013-05-07 | 2014-11-12 | Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall Hebron | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| EP3269734A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-17 | Fundació Privada Institut d'Investigació Oncològica de Vall-Hebron | Methods and compositions for the treatment of cancer |
-
2016
- 2016-07-15 EP EP16382339.6A patent/EP3269734A1/en not_active Withdrawn
-
2017
- 2017-07-17 SG SG11201900021PA patent/SG11201900021PA/en unknown
- 2017-07-17 HU HUE17746413A patent/HUE067973T2/hu unknown
- 2017-07-17 EA EA201990298A patent/EA201990298A1/ru unknown
- 2017-07-17 CA CA3029781A patent/CA3029781A1/en active Pending
- 2017-07-17 CN CN201780043683.0A patent/CN109563151B/zh active Active
- 2017-07-17 WO PCT/EP2017/067998 patent/WO2018011433A1/en not_active Ceased
- 2017-07-17 KR KR1020197004495A patent/KR102232500B1/ko active Active
- 2017-07-17 BR BR112019000732A patent/BR112019000732A2/pt unknown
- 2017-07-17 JP JP2019501644A patent/JP7090593B2/ja active Active
- 2017-07-17 RS RS20240929A patent/RS65983B1/sr unknown
- 2017-07-17 HR HRP20241153TT patent/HRP20241153T1/hr unknown
- 2017-07-17 MA MA45675A patent/MA45675B1/fr unknown
- 2017-07-17 US US16/317,850 patent/US11427621B2/en active Active
- 2017-07-17 EP EP17746413.8A patent/EP3484913B1/en active Active
- 2017-07-17 MX MX2019000346A patent/MX2019000346A/es unknown
- 2017-07-17 AU AU2017295071A patent/AU2017295071B2/en active Active
- 2017-07-17 SM SM20240360T patent/SMT202400360T1/it unknown
- 2017-07-17 MD MDE20190609T patent/MD3484913T2/ro unknown
- 2017-07-17 ES ES17746413T patent/ES2985967T3/es active Active
- 2017-07-17 PL PL17746413.8T patent/PL3484913T3/pl unknown
-
2019
- 2019-01-09 IL IL264176A patent/IL264176B2/en unknown
- 2019-02-14 ZA ZA2019/00960A patent/ZA201900960B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US11427621B2 (en) | 2022-08-30 |
| CA3029781A1 (en) | 2018-01-18 |
| EA201990298A1 (ru) | 2019-06-28 |
| KR20190032427A (ko) | 2019-03-27 |
| BR112019000732A2 (pt) | 2019-07-30 |
| IL264176B2 (en) | 2023-07-01 |
| ES2985967T3 (es) | 2024-11-08 |
| HRP20241153T1 (hr) | 2024-11-22 |
| US20200247857A1 (en) | 2020-08-06 |
| JP7090593B2 (ja) | 2022-06-24 |
| AU2017295071B2 (en) | 2022-06-09 |
| MX2019000346A (es) | 2019-04-01 |
| ZA201900960B (en) | 2020-05-27 |
| EP3269734A1 (en) | 2018-01-17 |
| CN109563151B (zh) | 2023-03-07 |
| WO2018011433A1 (en) | 2018-01-18 |
| SG11201900021PA (en) | 2019-01-30 |
| JP2019525753A (ja) | 2019-09-12 |
| MA45675A (fr) | 2021-04-21 |
| MA45675B1 (fr) | 2024-07-31 |
| EP3484913C0 (en) | 2024-07-03 |
| EP3484913A1 (en) | 2019-05-22 |
| RS65983B1 (sr) | 2024-10-31 |
| EP3484913B1 (en) | 2024-07-03 |
| SMT202400360T1 (it) | 2024-11-15 |
| IL264176A (en) | 2019-02-28 |
| CN109563151A (zh) | 2019-04-02 |
| HUE067973T2 (hu) | 2024-11-28 |
| AU2017295071A1 (en) | 2019-01-31 |
| PL3484913T3 (pl) | 2025-01-07 |
| IL264176B1 (en) | 2023-03-01 |
| KR102232500B1 (ko) | 2021-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11427621B2 (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| KR102324116B1 (ko) | 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 | |
| US10188699B2 (en) | CAPCNA peptide therapeutics for cancer | |
| HK40007694B (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| HK40007694A (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| EA042570B1 (ru) | Способы и композиции для лечения рака | |
| HK40014958A (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| HK1219756B (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
| EA047076B1 (ru) | Способы и композиции для лечения рака |