KR102324116B1 - 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR102324116B1
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Abstract

본 발명은 의약 및 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 Omomyc이라 불리는 Myc 우성 음성 돌연변이에 관한 것이다. 또한 본 발명은 Omomyc을 포함하는 융합 단백질 및 이의 약제학적 조성물 및 의약 및, 특히 암의 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

암의 치료를 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 암 분야에 관한 것이고, 보다 특이적으로는 Omomyc 폴리펩타이드를 이용하는 암의 치료를 위한 방법 및 조성물 그리고 암의 치료에 사용하기 위한 Omomyc 및 하나 이상의 항암제를 포함하는 조성물 및 이들의 용도에 관한 것이다.
이상적인 암 약물은 종양 유지를 위해 지속적으로 필요하지만 어떠한 정상 조직의 유지 및 기능에 필수불가결한 비-중복성(non-redundant) 기능을 타겟팅해야 한다. 따라서, 가장 일반적인 논리는 암에서 특이적으로 돌연변이된 유전자 산물을 타겟팅하는 것인데, 이러한 논리는 이들 돌연변이 분자들이 암의 "동인(drivers)"일 것 같고, 아마도 정상 조직에서는 덜 중요할 것 같다는 것에 기반한다. 이러한 이유들로 인해, 특이적 암 타입들에서 되풀이하여 발생하는 병소의 목록을 만드는 것에 많이 집중되어 왔다. 불행하게도, 이러한 접근방법에는 여러 가지 문제들이 있다. 첫째로, 대부분 고형 인간 암은 게놈 불안정성의 에피소드를 지나치며 상기 "동인" 돌연변이 및 이들의 수반하는 이펙터 경로를 모호하게 할 수 있는 돌연변이성 노이즈를 나타낸다. 둘째로, 암은 복수의 진화적 장애들(bottlenecks)을 통한 변이들을 포함하는 과정의 최종 결과이다. 각 장애는 이후 그 기능이 종양의 유지를 위해 필요하지 않아, 종양이 발달하는 시점 후에는 좋은 치료적 타겟이 아닌 특이적 타입의 돌연변이를 필요로 할 수 있다.
Myc는 성장 조절 및 암에 포함된 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 루이신 지퍼 (b-HLH-LZ) 단백질로서, 구조적으로 관계된 단백질인 Max, Mad 및 Mnt와 함께 네트워크에서 기능한다. Myc/Max 다이머는 유전자 전사를 활성화시키며 세포 증식 또는 아팝토시스를 유도한다. Mad/Max 및 Mnt/Max 복합체는 억제인자(repressors)로서 기능하고 세포 성장 어레스트 및 분화를 야기한다. 모든 다이머들은 동일한 DNA 보존 위치(consensus site)인 CACGTG E-박스를 인지한다.
Myc은 정상 세포에서 엄격하게 조절되는데, 이의 레벨은 증식 세포에서 더 높고 증식하지 않는 세포에서 더 낮다. 비정상적으로 높고/높거나 탈조절된(deregulated) Myc 활성은 대부분의 암에서 인과 관계적으로 포함되며 종종 공격적이고, 거의 분화되지 않으며 혈관형성적인 종양과 연관되어 있다. Myc 발현의 탈조절은 유전자 증폭을 통한 과다발현, 전사 조절의 상실, 손상된 분해 또는 증가된 안정화로 인한 것이다. 이러한 결과들은 비정상적 증식, 증가된 생존, 대사과정의 변화, 혈관형성 및 염증을 초래하고, 이 모든 것은 암의 주요 특질(hallmarks)을 나타낸다. 많은 연구들이 종양발생의 세포내 및 세포외 측면들을 지배하는 데 있어 Myc의 핵심적인 역할을 구체화시켰는데, 이는 이의 기능을 타겟팅하는 것이 치료적으로 가치있을 것이라는 것을 의미한다.
BET 브로모도메인 억제제에 의한 myc의 하향-조절이 복수의 종양 타입들의 퇴행을 초래한다는 것이 알려져 있다 (Delmore, J. E., et a., 2011, Cell, 146: 904-917). 이러한 접근방법은 훌륭한 가능성을 보이지만, 독성 및 수많은 오프 타겟 효과들(off targets effects) 같은 몇몇 한계점들을 제시한다.
Myc/Max 상호작용을 파괴하는 많은 작은 분자들은 인 셀룰로(in cellulo)에서 낮은 특이성을 나타냈다 (Prochownik, E. V. and Vogt, P. K., 2010, Genes Cancer 1, 650-659).
하지만, Myc 억제제는 임상적으로 이용가능하게 되어야만 하고 이의 고안은 다양한 경고(caveats)를 보여준다: 첫째로, Myc은 핵 전사 인자로서, 결과적으로 막 또는 세포질 분자보다 도달하기 더 어렵다; 둘째로, Myc은 타겟팅될 수 있는 효소적 "활성 위치(active site)"를 가지지 않는다; 셋째로, Myc 패밀리는 3개의 다른 단백질인 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc을 포함하는데, 어떤 조건에서 기능적으로 중복적이어서 이들 모두는 동시적인 억제를 필요로 한다. 더 나아가, Myc 억제가 정상 조직의 증식을 억제함으로써 심각한 부작용들을 유도할 것이라는 것이 고려되어야만 했었다. 이러한 모든 이유들로 인해, Myc 억제제 약물을 제조하는 것은 도전적인 문제이다.
Omomyc은 Myc의 b-HLH-LZ 도메인을 포함하고 Myc의 루이신 지퍼 내 4개의 아미노산 치환을 가지는 우성-음성 MYC 돌연변이다 (Soucek, L. et al., 1998, Oncogene 17, 2463-2472; Soucek, L. et al. (2002), Cancer Res 62: 3507-3510). 상기 아미노산 치환들인 E61T, E68I, R74Q, 및 R75N은, 자연적인 파트너 Max에 결합하며 야생형 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc과 호모다이머 및 헤테로다이머를 형성하는 능력을 보유하는 상기 단백질에 대해 변화된 다이머화(dimerization) 특이성을 부여한다.
이러한 특징들로 인해, Omomyc은 Myc의 DNA 인식 결합 위치인 E 박스에 결합하는 Myc의 능력을 무력하게 만들어서 인 비트로 및 인 비보 모두에서 Myc-의존적 유전자 트랜스활성화(transactivation) 기능을 억제할 수 있다 (Savino, M. et al., 2011, PLoS One 6, e22284; Soucek, L. et al. (2004), Cell Death Differ 11, 1038 1045). 동시에, Omomyc은 Myc 발현 레벨에 의존적인 방식에서 Myc-유도된 아팝토시스를 강력하게 증가시켜 Myc 트랜스억제(transrepression) 활성을 강하게 한다. 따라서 Omomyc은 프로모터에 Miz-1-의존적 결합 및 트랜스억제를 유지하면서 프로모터 E-박스로의 Myc 결합 및 타겟 유전자의 트랜스활성화를 억제한다. Omomyc의 존재 하에서, Myc 상호작용체(interactome)는 억제로 돌려지고 이의 활성은 암 유발성 활성으로부터 종양-억제적 활성으로 전환한다.
Omomyc 발현이 테트라사이클린-반응성 프로모터 엘리먼트에 의해 조절되고 폭넓게 발현된 rtTA 트랜스활성인자가 CMV 프로모터에 의해 추진되는 TRE-Omomyc;CMVrtTA 마우스는 독시사이클린의 투여 후 대부분의 조직들에서 높은 Omomyc 발현을 나타낸다 (Soucek et al., 2008, Nature, 455: 679-683). 이들 마우스들이 폐 종양형성의 잘-확립된 LSL-KrasG12D 마우스 모델과 교배되었다. 단지 3일 간의 Omomyc 발현이 종양의 현저한 축소를 야기하기에 충분했으며 1주의 발현은 상기 동물들에서 실질적인 종양 제거를 가능하게 한다. 중요하게도, 다른 분열 조직들, 예컨대 피부, 고환 및 장은 처리 동안 유의하게 감소된 증식률(proliferation rate)을 나타내고 일정 정도의 위축을 보였을지라도, 상기 마우스들은 고통 또는 질병의 명백한 징후를 나타내지 않았다. 더욱이, Omomyc 발현에 의해 야기되는 Myc 억제의 부작용들은 상기 처리의 중단으로 완전하게 되돌려지고 사라진다.
현재까지, Omomyc의 발현이 인 비보에서 효능있는 Myc 억제성 전략인 것으로 증명되었다는 사실에도 불구하고, 유전자 치료 접근방법을 이용해서만 적용되어왔었다. 실제로, Omomyc은 소망된 세포내 구획으로의 운반 시 너무 크고 적합하지 않은 펩타이드로 고려된다 (Montagne M. et al., PLoS One. 2012;7:e32172. doi: 10.1371/journal.pone.0032172), Savino M. et al., PLoS One. 2011;6:e22284. doi: 10.1371/journal.pone.0022284) 및 Genes Dev., 2011, 25:895-7. doi: 10.1101/gad.2053311).
더욱이, Omomyc의 내재적 물리-화학적 특성들 (예컨대, Kyte & Doolittle 소수성 분석 플롯을 이용하여 예측된 대로 소수성, Kyte J., Doolittle R.F. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132)로 인해 생리학적 장벽을 통과하는 데 안 좋은 능력을 나타낼 것으로 예측된다. 또한, Omomyc의 염기성 부위 내에 여러 아르기닌 잔기들의 존재에도 불구하고, 펩타이드의 자발적인 세포-투과능을 예측하는 가장 최근의 알고리즘은 Omomyc이 그러한 특성을 가지는 것으로 예측하지 않는다 (Gautam et al. Journal of Translational Medicine 2013, 11:74).
따라서, 진핵세포의 세포막을 가로질러 이동하고 Myc-의존적 유전자 트랜스활성화를 억제할 수 있는 b-HLH-LZ 도메인들에 기반된 암의 치료를 위한 치료적 접근방법을 제공하는 것이 유용할 것이다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 뿐 아니라 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 언급한다.
다른 양태에서 본 발명은
(i) 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 및
(ii) 세포-투과 펩타이드 서열 및/또는 핵 위치화 시그널을 포함하는 융합 단백질을 언급한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 뿐 아니라 의약에서 상기 융합 단백질의 이용 및 특히, 암의 치료를 위한 상기 융합 단백질의 이용을 언급한다.
다른 양태에서, 본 발명은
(i) 서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 본 발명에 따른 컨쥬게이트 및
(ii) 항종양제
를 함께 또는 개별적으로 포함하는 조성물을 언급한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물 뿐 아니라 의약에서 본 발명의 조성물의 이용, 및 특히, 암의 치료를 위한 상기 조성물의 이용을 언급한다.
본 발명의 저자들은, 놀랍게도 Omomyc이 세포막을 가로질러 효과적으로 이동하고 핵으로 이동할 수 있고, 이는 종양-억제 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다. 따라서, Omomyc은 진짜 단백질 전달 도메인 (Protein Transduction Domain, PTD)이다. 그러므로, 세포의 세포질로 폴리펩타이드의 운반을 위한 비히클을 이용하거나 또는 세포에 Omomyc을 인코딩하는 핵산을 운반하기 위한 유전자 치료 접근방법 중 어느 하나의 필요 없이 Omomyc은 최초로 항-Myc 약물 그 자체로 이용될 수 있다. 이것은 암 같은 탈조절된 세포 증식과 연관된 질병의 치료를 위해 Omomyc 폴리펩타이드의 사용을 가능하게 해 준다. 본 발명의 저자들은 놀랍게도 Omomyc이 Max의 bHLHZ 도메인 (Max*)과 비교하여 여러 장점들을 가진다는 것을 발견하였다:
· Omomyc은 다른 세포 타입들 및 다른 농도들에서 Max*와 비교하여 더 큰 세포 투과능을 보인다 (실시예 6)
· Omomyc은 Max*보다 더 열적으로 안정하고 이는 약물 고안에 있어서 큰 장점이다 (실시예 5)
· Omomyc은 세포의 성장을 억제하고 (실시예 8) 암세포의 증가된 사멸 (실시예 4) 모두에서 Max*보다 더 효과적이다.
또한, Omomyc은 뇌혈관장벽을 가로지를 수 있으며 (실시예 9 및 도 10B) 인 비보에서 이의 치료 효과를 나타낼 수 있다 (실시예 10).
Omomyc 을 이용한 치료방법
본 발명은 Omomyc에 해당하는 서열번호 1의 서열을 가진 폴리펩타이드, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 사용에 기반된 암의 치료를 위한 방법을 제공한다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 치료학적으로 효과적인 양을 치료를 요하는 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품 제조용 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 관한 것이다.
서열번호 1의 폴리펩타이드는 Omomyc 단백질 서열에 해당한다. 본 명세서에 사용되는 대로, 상기 용어 "Omomyc"은 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이들 (상기 돌연변이된 위치의 넘버링은 2012년 6월 27일에 알려진 NCBI 데이터베이스의 접근번호 NP_002458에 특정된 대로 폴리펩타이드의 365-454 아미노산에 해당하는 Myc 부위의 서열과 관련하여 주어진다)을 운반하는 Myc의 bHLHZip 도메인의 돌연변이된 형태로 이루어진 폴리펩타이드를 의미한다. NCBI 데이터베이스의 접근번호 NP_002458에 제공된 c-Myc의 서열은 하기에 보여지고, Omomyc이 유래된 부위는 밑줄쳐져 보여진다:
1 mdffrvvenq qppatmplnv sftnrnydld ydsvqpyfyc deeenfyqqq qqselqppap
61 sediwkkfel lptpplspsr rsglcspsyv avtpfslrgd ndggggsfst adqlemvtel
121 lggdmvnqsf icdpddetfi kniiiqdcmw sgfsaaaklv seklasyqaa rkdsgspnpa
181 rghsvcstss lylqdlsaaa secidpsvvf pyplndsssp kscasqdssa fspssdslls
241 stesspqgsp eplvlheetp pttssdseee qedeeeidvv svekrqapgk rsesgspsag
301 ghskpphspl vlkrchvsth qhnyaappst rkdypaakrv kldsvrvlrq isnnrkctsp
361 rssdteenvk rrthnvlerq rrnelkrsff alrdqipele nnekapkvvi lkkatayils
421 vqaeeqklis eedllrkrre qlkhkleqlr nsca(서열번호 2)
Omomyc (서열번호 3)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 상응하는 폴리펩타이드 서열 (서열번호 1)이 하기에 보여지며, 상기 밑줄쳐지고 굵은 트리플릿은 Myc과 관련하여 돌연변이된 위치들에 해당한다:
Figure 112015118537779-pct00001
Omomyc은 서열 RQRRNELKRSF (서열번호 49)를 가지는 c-Myc의 M2 도메인을 포함하며 (Dang and Lee, Mol.Cell. Biol., 1988, 8:4048-4054을 참조하라) (상기에 이중으로 밑줄쳐져 있음), 이는 핵 위치화 시그널에 해당한다.
Omomyc은 3개의 모든 종양형성 Myc 단백질 (c-Myc, N-Myc 및 L-Myc)과 증가된 다이머화 능력을 보인다는 점에서 특징화된다. 종양 억제 효과를 초래하는 돌연변이들이 보존되어 있다면, Omomyc은 당업계에 알려진 어떠한 Myc 단백질의 bHLHZip 도메인으로부터 유래할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 이용될 수 있는 Omomyc은, 가축 및 사육 동물 (소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 설치류), 영장류 및 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 어떠한 포유동물 종들로부터 유래할 수 있다. 좋게는, 상기 Omomyc 단백질은 인간 Myc 단백질 (2012년 6월 27일에 공지된 접근번호 NP_002458)으로부터 유래한다.
본 명세서에 사용되는 대로, 상기 용어 "Myc"은 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc을 포함하는 전사 인자들의 패밀리를 의미한다. Myc 단백질은 보존 서열 CACGTG (인핸서 박스 서열 또는 E-박스 및 히스톤 아세틸-트랜스퍼라제 또는 HATs를 회귀시킴)에 결합하여 많은 유전자들의 발현을 활성화시킨다. 하지만, Myc은 전사 억제인자로서 기능할 수도 있다. Miz-1 전사인자에 결합하고 p300 공동-활성인자를 대체함으로써, Miz-1 타겟 유전자들의 발현을 억제한다. 또한 Myc은 DNA 복제의 조절에 직접적으로 기능한다.
Myc b-HLH-LZ 또는 Myc 염기성 부위 헬릭스-루프-헬릭스 루이신 지퍼 도메인은 Max 단백질과의 Myc 다이머화 및 Myc-타겟팅된 유전자들과의 결합을 결정하는 부위를 의미한다. 이러한 부위는 인간 Myc의 365-454 아미노산들에 해당하고 루프에 의해 연결된 2개의 알파 헬릭스에 의해 특징화된다 (Nair, S. K., & Burley, S. K., 2003, Cell, 112: 193-205).
Omomyc을 언급하는 경우, 상기 용어 "기능적으로 동등한 변이체(functionally equivalent variant)"는 서열번호 1의 폴리펩타이드에 대해 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 부가로부터 초래되는 어떠한 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 화학적 변형으로부터 초래되는 어떠한 폴리펩타이드를 의미하며, 실질적으로 상기 Omomyc 폴리펩타이드의 종양 억제 활성을 보존하고 있다. 당업자는 Omomyc의 종양 억제 활성이 보존되기 위해서는 상기 변이체가 Myc과 다이머화하여 핵에서 발견된 Myc의 활성을 억제할 수 있을 것을 필요로 하고, 세포막을 가로질러 이동할 수 있으며 핵막(nuclear envelope)을 가로질러 이동할 수 있어야 함을 이해할 것이다.
Omomyc의 적합한 기능적으로 동등한 변이체들은 서열번호 1의 폴리펩타이드로 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 맥락에서, "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 상기 특화된 분자가 Omomyc의 활성을 변화시킬 어떠한 추가적인 서열을 포함하지 않을 것이라는 것을 의미한다.
상기 타겟팅 펩타이드의 적합한 기능성 변이체들은, 서열번호 1의 펩타이드에 대해 동일성의 정도, 약 25%보다 더 큰 아미노산 서열 동일성, 예컨대 25% 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 보이는 변이체들이다. 두 개의 폴리펩타이드 간의 동일성 정도는 당업자에게 폭넓게 알려진 컴퓨터 알고리즘 및 방법을 이용하여 결정한다. 두 개의 아미노산 서열 간의 동일성은 좋게는 이전에 기재된 대로 BLASTP 알고리즘을 이용하여 결정한다 [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 1990;215: 403-410]. 선호되는 구현예에서, 서열 동일성은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 전체 길이 또는 상기 변이체의 전체 길이 또는 양자를 통해 결정한다.
또한, 상기 Omomyc 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체들은 번역-후 변형, 예컨대 당화, 아세틸화, 이소프레닐화, 미리스토일화, 단백질 가수분해 과정, 등을 포함할 수 있다.
택일적으로, 상기 타겟 펩타이드의 적합한 기능성 변이체들은 Omomyc 폴리펩타이드 내 하나 이상의 위치들은 상기 언급된 Omomyc 단백질 내 존재하는 아미노산의 보존성 치환인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체들이다. "보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 가지는 다른 아미노산으로 대체하는 것에 의해 초래된다. 예를 들어, 다음 6개의 그룹은 각각 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소루이신 (I), 루이신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W). 그러한 보존성 아미노산 치환의 선택은 당업자에게 자명하고, 예를 들어 Dordo 등, (J. Mol. Biol, 1999, 217;721-739) 및 Taylor 등, (J. Theor. Biol., 1986, 119:205-218)에 의해 기재되어 있다.
Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체들은 인간 c-Myc으로부터 유래된 Omomyc에서 발견되는 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이들에 해당하는 위치들에서의 돌연변이를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 돌연변이들이 기능적으로 동등한 변이체에서 일어나야만 하는 위치는 다른 Myc 서열의 복수의 서열 정렬에 의해 결정하고 인간 c-Myc으로부터 유래된 Omomyc의 서열 내 61, 68, 74 및 75 위치들에 해당하는 이들 위치들의 정렬에 의해 동정될 수 있다.
복수 서열 정렬은 한번에 두 개의 서열 이상을 삽입시키는 서열 짝 정렬(pairwise alignment)의 연장이다. 복수 정렬 방법은 주어진 탐구 세트(query set) 내 모든 서열을 정렬한다. 선호되는 복수 서열 정렬 프로그램 (및 이의 알고리즘)은 ClustalW, Clusal2W 또는 ClustalW XXL (Thompson 등 (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680을 참고하라). 다른 생물체로부터 유래된 c-Myc의 서열 및 변이체의 서열을 본 명세서에 기재된 대로 비교(정렬)한다면, 당업자는 이미 위치에 해당하는 각 서열 내 위치들을 쉽게 동정할 수 있으며 인간 c-Myc으로부터 유래된 Omomyc에서 발견되는 E61T, E68I, R74Q 및 R75N 돌연변이들에 해당하도록 Omomyc 변이체 돌연변이들 내에 도입할 수 있다.
폴리펩타이드가 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체로서 고려될 수 있는 지를 결정하기 위한 적합한 어세이들은:
- Max 및 Myc과 다이머 복합체를 형성하는 상기 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 어세이들, 예컨대 Soucek 등 (Oncogene, 1998, 17: 2463-2472)에 기재된 대로 리포터 유전자의 발현에 기반된 어세이 뿐 아니라 PLA (protein Ligation assay) 또는 공동-면역침전.
- DNA 내 Myc/Max 인식 위치 (CACGTG 위치)에 결합하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 어세이들, 예컨대 Soucek 등 (상기 인용됨)에 기재된 전기영동 이동성 변화 분석 (EMSA).
- Myc-유도된 트랜스활성화를 억제하는 능력을 측정하는 어세이들, 예컨대 Soucek 등 (상기 인용됨)에 기재된 대로 Myc/Max에 특이적인 DNA 결합 위치들의 조절 하에서 리포터 유전자의 발현에 기반된 어세이.
- Soucek 등 (상기 인용됨)에 기재된 대로 myc 발암유전자를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 폴리펩타이드의 능력에 기반된 어세이.
- myc-유도된 아팝토시스를 증가시키는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 어세이들, 예컨대 Soucek 등 (Oncogene, 1998: 17, 2463-2472)에 의해 기재된 어세이들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 세포 내 아팝토시스를 평가하기 위한 당업계에 일반적으로 알려진 어떠한 어세이가 이용될 수 있는데, 예를 들어 Hoechst 염색, 프로피디움 이오다이드 (PI) 또는 아넥신 V 염색), 트립판 블루, DNA 사다리화/단편화 및 TUNEL을 포함한다.
선호된 구현예에서, 폴리펩타이드가 상기 어세이들 중 하나 이상에서 천연 Omomyc의 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 활성을 나타낸다면 폴리펩타이드는 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체로 고려된다.
또한, Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체들은 세포와 접촉한 후 상기 세포로 이동할 수도 있다. Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체들은 천연 Omomyc에서 발견되는 단백질 이동 도메인(protein transducing domain) 또는 다른 기능성 단백질 이동 도메인을 포함한다는 것이 이해될 것이다.
상기 용어 "세포 투과 펩타이드 서열(cell penetrating peptide sequence)"은 본 명세서에서 "CPP", "단백질 이동 도메인" 또는 "PTD"와 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 세포 내로 단백질의 운송을 지시하는 다양한 길이의 펩타이드 사슬을 의미한다. 일반적으로 세포 내로의 이동 과정은 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 일어나지만 상기 펩타이드도 직접적인 막 이동(translocation)을 통해 세포 내로 내재화될 수 있다. CPPs는 라이신 또는 아르기닌 같은 상대적으로 높은 양의 양적 전하된 아미노산들을 포함하거나 또는 극성/전하된 아미노산 및 비-극성, 소수성 아미노산의 교차성 패턴을 포함하는 서열을 가지는 아미노산 조성물을 전형적으로 가진다. 본 발명에서 이용될 수 있는 CPPs의 예들은 드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 단백질에서 발견되는 CPP (RQIKIWFQNRRMKWKK. 서열번호 4), 헤르페스 바이러스 심플렉스 1 (HSV-1) V22 DNA-결합 단백질에서 발견되는 CPP (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE, 서열번호 5), Bac-7의 CPP (RRIRPRPPRLPRPRPRPLPFPRPG; 서열번호 6), 아미노산 49-57 (RKKRRQRRR, 서열번호 7), 아미노산 48-60 (GRKKRRQRRRTPQ, 서열번호 8), 아미노산 47-57 (YGRKKRRQRRR; 서열번호 9)로 이루어진 HIV-1 TAT 단백질의 CPPs; S413-PV 펩타이드의 CPP (ALWKTLLKKVLKAPKKKRKV; 서열번호 10), 페네트라틴의 CPP (RQIKWFQNRRMKWKK; 서열번호 11), SynB1의 CPP (RGGRLSYSRRRFSTSTGR; 서열번호 12), SynB3의 CPP (RRLSYSRRRF; 서열번호 13), PTD-4의 CPP (PIRRRKKLRRLK; 서열번호 14), PTD-5의 CPP (RRQRRTSKLMKR; 서열번호 15), FHV Coat-(35-49)의 CPP (RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 16), BMV Gag-(7-25)의 CPP (KMTRAQRRAAARRNRWTAR; 서열번호 17), HTLV-II Rex-(4-16)의 CPP (TRRQRTRRARRNR; 서열번호 18), D-Tat의 CPP (GRKKRRQRRRPPQ; 서열번호 19), R9-Tat의 CPP (GRRRRRRRRRPPQ; 서열번호 20), MAP의 CPP (KLALKLALKLALALKLA; 서열번호 21), SBP의 CPP (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV; 서열번호 22), FBP의 CPP (GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; 서열번호 23), MPG의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 24), MPG(ENLS)의 CPP (ac-GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV-cya; 서열번호 25), Pep-1의 CPP (ac-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 26), Pep-2의 CPP (ac-KETWFETWFTEWSQPKKKRKV-cya; 서열번호 27), 구조적 RN (N은 4와 17 사이임)을 가지는 폴리아르기닌 서열, GRKKRRQRRR 서열 (서열번호 28), RRRRRRLR 서열 (서열번호 29), RRQRRTS KLMKR 서열 (서열번호 30); 트랜스포르탄 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (서열번호 31); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (서열번호 32); RQIKIWFQNRRMKWKK (서열번호 33), YGRKKRRQRRR 서열 (서열번호 34); RKKRRQRR 서열 (서열번호 35); YARAAARQARA 서열 (서열번호 36); THRLPRRRRRR 서열 (서열번호 37); GGRRARRRRRR 서열 (서열번호 38)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리펩타이드가 Omomyc의 세포막 이동 능력을 보존하는 지를 결정하기 위한 적합한 어세이는, 본 발명의 실시예 3에서 보여지는 어세이 같은 배양 중에 세포를 트랜스덕션하는 폴리펩타이드의 능력을 측정하는 어세이들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 어세이는 배양 세포와 폴리펩타이드를 접촉하는 단계 및 세포내 위치에서 상기 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계에 기반한다. 선호되는 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 검출은 형광 현미경을 이용하여 실시한다.
선호되는 구현예에서, 폴리펩타이드가 천연 Omomyc처럼 타겟 세포를 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 트랜스덕션시킬 수 있다면 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체로서 간주한다.
또한, Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체들은 상기 변이체가 상기 세포와 접촉한 후 상기 트랜스덕션된 세포의 핵에 도달할 수도 있다. Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체들은 천연 Omomyc에서 발견되는 NLS 또는 다른 기능성 NLS를 포함한다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "핵 위치화 시그널(nuclear localization signal)"은 핵으로 단백질을 지시하는 약 4-20개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 의미한다. 전형적으로, 상기 핵 위치화 시그널 서열은 염기성 아미노산이 풍부하고 예시적인 서열들이 당업계에 잘 알려져 있다 (Gorlich D. (1998) EMBO 5.17:2721-7). 몇몇 구현예들에서, NLS는 SV40 큰 T 항원 NLS (PKKKRKV, 서열번호 39); 뉴클레오플라스민 NLS (KRPAATKKAGQ AKKKK, 서열번호 40); CBP80 NLS (RRRHSDENDGGQPHKRRK, 서열번호 41); HIV-I Rev 단백질 NLS (RQARRNRRRWE, 서열번호 42); HTLV-I Rex (MPKTRRRPRRSQRKRPPT, 서열번호 43); hnRNP A NLS (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFKPRNQGGY, 서열번호 44); rpL23a NLS (VHSHKKKKIRTSPTFTTPKTLRLRRQPKYPRKSAPRRNKLDHY, 서열번호 45)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 핵 위치화 시그널은 모티프 K (K/ R) X (K/ R) (서열번호 46)을 포함한다.
세포막을 가로질러 이동하는 펩타이드의 능력의 측면에서 폴리펩타이드가 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체인 지를 결정하기 위한 적합한 어세이는, 상기 폴리펩타이드에 특이적인 시약 및 세포의 핵을 특이적으로 표지하는 염료 (예컨대 DAPI 또는 Hoechst 염료)를 이용하여 세포의 이중 표지(labelling)를 포함한다. 그러한 어세이들은 본 발명의 실시예 6에서 보여진다. 선호되는 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 검출은 공초점 현미경 또는 형광 현미경으로 실시한다.
선호되는 구현예에서, 폴리펩타이드가 천연 Omomyc처럼 타겟 종양 세포의 핵에 최소 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 효율로 이동시킬 수 있다면 Omomyc의 기능적으로 동등한 변이체로서 간주한다.
적합한 기능적으로 동등한 변이체들은 하기 특정된 대로 폴리펩타이드 Omomyc*TAT 및 Omomyc*LZArg을 포함한다:
Figure 112015118537779-pct00002
본 발명에 따르면, 상기 Omomyc 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 대상자에서 암의 예방 또는 치료를 위한 방법에 사용된다. 본 발명에 따른 예방 또는 치료적 방법이 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 직접적인 이용을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 예방 또는 치료적 방법은 Omomyc을 인코딩하는 핵산 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 투여를 포함하지 않는다.
"예방(prevention)"은 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 투여, 또는 질병의 시작 단계 또는 초기 단계에 첫 번째 양태에 따른 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 의약의 투여, 또는 질병의 개시를 예방하기 위한 폴리펩타이드 또는 의약의 투여로서 이해된다.
상기 용어 "치료(treatment)"는 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 투여, 또는 임상적 징후가 나타나기 전 또는 후에 질병의 진행을 조절하기 위해 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 의약의 투여를 지시하는 데 이용된다. 상기 질병 진행의 조절은 증상의 감소, 질병 기간의 감소, 병리학적 상태의 안정화 (특히 추가적인 손상의 회피), 질병 진행의 지연, 병리학적 상태 및 회복의 개선 (일부 및 완전한 개선 모두)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 유익하거나 소망되는 임상적 결과들로서 이해된다. 또한 상기 질병 진행의 조절은 치료가 적용되지 않은 경우 예측되는 생존율과 비교하여 생존율의 연장을 포함한다.
상기 용어 "암(cancer)"은 조절되지 않는 세포 분열 (또는 생존율 또는 아팝토시스 저항성에 따른 증가에 의한 조절되지 않는 세포 분열), 다른 이웃하는 조직을 침입하는 상기 세포의 능력 (침입) 또는 림프관 및 혈관을 통해 상기 세포가 정상적으로 위치되지 않는 몸체의 다른 영역으로의 전파 (전이)에 의해 특징화되는 질병을 의미한다. 종양이 침입 및 전이에 의해 전파할 수 있는 지 또는 아닌 지에 따라, 종양은 양성 또는 악성 중 어느 하나로 분류한다: 양성 종양은 침입 또는 전이에 의해 전파할 수 없는 종양, 즉 국소적으로만 성장한다; 반면에 악성 종양은 침입 또는 전이에 의해 전파할 수 있는 종양이다. 본 발명에 따른 방법들은 국소 및 악성 종양의 치료에 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 암은 다음 타입의 암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 유방암; 담도암; 방광암; 교모세포종 및 수모세포종을 포함하는 뇌암; 자궁경부암; 융모암종; 대장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 급성 림프구성 백혈병 및 골수성 백혈병을 포함하는 혈액학적 종양(neoplasms); T-세포 급성 아림프구성 백혈병/림프종; 모발세포 백혈병; 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종; AIDS-연관된 백혈병 및 성인 T-세포 백혈병/림프종; 보웬병 및 파제트병을 포함하는 상피내 종양; 간암; 폐암; 호질런병(Hodglun's disease) 및 림프구성 림프종을 포함하는 림프종; 심경아세포종; 편평세포암종을 포함하는 구강암; 상피세포, 기질세포, 생식세포 및 중간엽세포로부터 유래하는 암을 포함하는 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 평활근육종, 횡문근육종, 지방육종, 섬유육종, 및 골육종을 포함하는 육종; 흑색종, 메르켈 세포 암종, 카포시 육종, 기저세포 암종, 및 편평세포암을 포함하는 슬룬암(slun cancer); 정상피종(seminoma), 비-정상피종 (기형종, 융모암종), 기질 종양, 및 생식세포 종양을 포함하는 고환암; 갑상선 선암 및 수질암종을 포함하는 갑상선암; 및 선암 및 빌름스 종양을 포함하는 신장암. 다른 암들은 당업자에게 알려져 있을 것이다. 선호되는 구현예에서, 치료될 암은 폐암, 좋게는 폐 선암종, 보다 좋게는 KRas-유래된(driven) 폐 선암종이다.
본 발명의 저자들은 또한 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체가 암이 Myc 단백질의 증가된 발현 또는 활성을 나타내는 지에 관계없이 세포 증식을 감소시킬 수 있다는 것을 관찰하였다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "대상자(subject)"는 암을 가지거나 암의 증상을 나타내거나, 또는 암을 가지거나 암의 증상을 나타낼 위험 하에 있는 어떠한 동물을 포함한다. 적합한 대상자들 (환자들)은 실험실 동물 (예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 기니아 피그), 사육 동물, 및 가축 또는 애완동물 (예컨대 고양이 또는 개)를 포함한다. 비-인간 영장류 및, 좋게는 인간 환자들이 포함된다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 적절한 투여량은, 상기 조성물이 예방적 또는 치료적 목적, 이전 치료법, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 환자의 임상적 히스토리 및 반응, 그리고 담당의사의 재량에 따라 투여되는 지 여부에 따라 치료될 암의 타입, 상기 질병의 심각성 및 과정 같은 다른 인자들에 의존할 것이다.
서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체의 양은 한번에 또는 일련의 처리들에 따라 환자에 적합하게 투여된다. 상기 질병의 타입 및 심각성에 따라, 적절한 투여 레벨은 일반적으로 하루 당 환장 몸무게 kg 당 약 0.01 내지 500 mg일 것이며, 이는 단일 또는 복수의 투여량으로 투여될 수 있다. 좋게는, 상기 투여량 레벨은 하루 당 약 0.1 내지 약 250 mg/kg; 보다 좋게는 하루 당 약 0.5 내지 약 100 mg/kg일 것이다. 적합한 투여량 레벨은 하루 당 약 0.01 내지 약 250 mg/kg, 하루 당 약 0.05 내지 약 100 mg/kg, 또는 하루 당 약 0.1 내지 약 50 mg/kg일 수 있다. 이러한 범위 내에서 상기 투여량은 하루 당 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 50 mg/kg일 수 있다. 구강 투여를 위해, 상기 조성물은 좋게는 치료될 환자에 투여량의 대증 조정(symptomatic adjustment)을 위해 1.0 내지 1000 밀리그램의 활성성분, 특히 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, 및 1000.0 밀리그램의 활성성분을 포함하는 정제 형태로 제공된다. 상기 화합물은 하루 당 1 내지 4번의 치료 계획(regimen), 좋게는 하루 당 1번 또는 2번의 치료 계획으로 투여될 수 있다.
서열번호 1의 폴리펩타이드, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 폴리펩타이드는, 상기 소망된 투여량의 제형에 필요한 약제학적으로 허용가능한 부형제들이 포함되어 어떠한 타입의 적합한 경로, 예컨대 구강 경로, 국부 경로, 흡입 또는 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 투여의 선호되는 경로는 정맥내(endovenous) 경로이다. 다른 구현예에서, 투여 경로는 비강내 경로이다.
하나의 구현예에서, 상기 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 몸체로부터 빠른 제거로부터 상기 폴리펩타이드를 보호하는 담체와 함께 제조되는데, 예컨대 임플란트 및 미세포집된 투여 시스템을 포함하는 조절된 배출 제형으로 제조된다. 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리유산 같은 생체분해가능한 생체적합성 폴리머를 이용할 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 과정은 당업자에게 자명할 것이다. 또한 상기 물질들은 Alza사 및 Nova 제약회사에서 상업적으로 얻을 수 있다.
Omomyc 및 이의 기능적으로 동등한 변이체가 생물학적 막을 가로질러 이동할 수 있다는 사실에도 불구하고, 나노입자들 내로 Omomyc 또는 어떠한 이의 기능적으로 동등한 변이체들을 제형화시키는 것이 가능하다. 상기 나노입자들은 타겟 기관에 도달할 때까지 생물학적 유체 내에서 폴리펩타이드의 완전성(integrity)을 보존하는 데 기여할 것이다. 또한, 나노입자들은 목적 기관으로 상기 나노입자들의 타겟팅을 허용하는 모이어티를 포함하기 위해 변형될 수도 있다. 이러한 방식에서, Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 타겟 기관의 근처로 운반되어 생물학적 활성이 요구되는 세포의 내부로 Omomyc의 접근을 용이하게 할 것이다.
따라서, 다른 구현예에서, Omomyc 또는 어떠한 이의 기능적으로 동등한 변이체들은 나노입자의 일부를 형성하도록 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "나노입자(nanoparticle)"는 1-1,000 nm 범위의 크기를 가지는 어떠한 물질을 의미한다. 몇몇 구현예들에서, 나노입자들은 2-200 nm 범위의 크기, 좋게는 2-150 nm 범위의 크기, 및 보다 더 좋게는 2-100 nm 범위의 크기를 가진다. 본 발명에서 이용될 수 있는 나노입자들은 지질-기반된 나노입자, 초상자성 나노입자, 나노쉘, 반도체 나노크리스탈, 양자점, 폴리머-기반된 나노입자, 실리콘-기반된 나노입자, 실리카-기반된 나노입자, 금속-기반된 나노입자, 풀러린(fullerene) 및 나노튜브로서의 그러한 나노규모의(nanoscale) 물질을 포함한다.
타겟팅된 운반은 나노입자들의 폴리펩타이드 탑재량(payloads)을 운반하기 위한 나노입자들의 능력을 손상시킴이 없이 리간드의 부가에 의해 달성될 수 있다. 이것이 특이적 세포, 조직 및 기관으로의 운반을 가능하게 할 것이라는 것이 의도된다. 상기 리간드-기반된 운반 시스템의 타겟팅 특이성은 다른 세포 타입 상에 존재하는 리간드 수용체의 분포에 기반한다. 상기 타겟팅 리간드는 나노입자와 비-공유결합적이거나 또는 공유결합적으로 관련될 수 있으며, 본 명세서에서 논의되는 대로 다양한 방법들에 의해 나노입자에 컨쥬게이션될 수 있다.
나노입자를 타겟팅하는 데 이용될 수 있는 단백질 또는 펩타이드의 예들은 트랜스페린, 락토페린, TGF-β, 신경 성장인자, 알부민, HIV Tat 펩타이드, RGD 펩타이드, 및 인슐린, 뿐 아니라 다른 단백질 또는 펩타이드들을 포함한다.
나노입자 내 Omomyc의 제형 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 제형이 세포 내부로 Omomyc의 접근을 용이하게 하도록 의도되지 않거나 또는 상기 접근을 용이하게 하도록만 의도되지 않지만 분해로부터 Omomyc을 보호하도록 의도되고/의도되거나 목적 기관으로 상기 나노입자의 타겟팅을 용이하게 하도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.
Omomyc 컨쥬게이트 및 Omomyc 을 포함하는 융합 단백질
본 발명은 또한 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 첫 번째 부위 및 상기 폴리펩타이드의 세포내 흡수를 용이하게 하는 화학적 모이어티를 포함하는 두 번째 부위를 포함하는 컨쥬게이트를 제공한다. 세포내 흡수를 증가시키기 위한 모이어티의 예들은: 소수성 그룹 (예컨대, 지질 또는 지방산), 단백질 이동 도메인, 및 어떤 금속 킬레이트를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
Omomyc 분자 내 추가적인 화학적 모이어티의 존재는 변형되지 않은 Omomyc에 대해 생물학적 막을 가로질러 이동하는 증가된 능력을 보이는 컨쥬게이트를 초래하여, 증가된 종양 억제 활성을 야기한다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은:
(i) 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 및
(ii) 상기 폴리펩타이드의 세포내 흡수를 용이하게 하는 화학적 모이어티
를 포함하는 컨쥬게이트에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "컨쥬게이트(conjugate)"는 각 화합물의 기능이 컨쥬게이트 내에 유지되는 한 함께 공유결합적으로 결합된 2개 이상의 화합물들을 의미한다.
선호되는 구현예들에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트들은 상기 폴리펩타이드의 세포내 흡수 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포내 흡수를 용이하게 하는 최소 1개, 최소 2개, 최소 3개, 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개, 최소 10개 또는 이상의 화학적 모이어티들을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 세포내 흡수를 용이하게 하는 화학적 모이어티는 지질 또는 지방산이다.
일반적으로 지방산은 사슬의 말단에 산성 모이어티 (예컨대, 카르복실산)을 가진 탄소 사슬을 포함하는 분자이다. 지방산의 탄소 사슬은 어떠한 길이일 수 있지만, 상기 탄소 사슬의 길이는 최소 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 이상의 탄소 원자이고, 여기서 유추가능한 어떠한 범위인 것이 선호된다. 어떤 구현예들에서, 상기 탄소 사슬의 길이는 지방산의 사슬 부위에서 4개부터 18개의 탄소 원자이다. 어떤 구현예들에서, 상기 지방산 탄소 사슬은 홀수개의 탄소 원자들을 포함할 수 있지만, 사슬 내 짝수개의 탄소 원자들이 어떤 구현예들에서 선호될 수 있다. 탄소 사슬 내 단일 결합만을 포함하는 지방산은 포화되었다고 불리우는 반면에, 사슬 내에 최소 하나의 이중 결합을 포함하는 지방산은 불포화되었다고 명명된다. 본 발명의 선호가능한 구현예들에서는 가지쇄화되어 있지 않을 지라도, 상기 지방산은 가지쇄일 수 있다. 특이적인 지방산들은 리놀레산, 올레산, 팔미트산, 리놀렌산, 스테아르산, 라우르산, 미리스트산, 아라키드산, 팔미톨레산, 아라키돈산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
선호되는 구현예에서, 상기 폴리펩타이드의 세포내 흡수를 용이하게 하는 화학적 모이어티는 세포 투과 펩타이드 서열이고, 이러한 경우에 상기 컨쥬게이트는 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체 및 세포 투과 펩타이드 서열을 포함하는 융합 단백질이다.
상기 용어 "융합 단백질(fusion protein)"은 다른 단백질들로부터 유래된 2개 이상의 기능성 도메인으로 이루어진 유전자 기술에 의해 제조되는 단백질들에 관한 것이다. 융합 단백질은 종래의 방법들, 예를 들어 적합한 세포에서 상기 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 유전자 발현에 의해 얻을 수 있다. 상기 세포 투과 펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 일부 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 일부를 형성하는 세포 투과 펩타이드와 상이한 세포 투과 펩타이드를 의미한다는 것이 이해될 것이다.
상기 용어들 "서열번호 1의 폴리펩타이드", "서열번호 1의 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체" 및 "세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide)"는 본 발명의 의학적 용도의 맥락에서 상세하게 기재되었으며 상기 융합 단백질의 맥락에서 동일하게 적용가능하다.
선호되는 구현예에서, 상기 세포-투과 펩타이드는 내인성 Omomyc 세포 투과 펩타이드가 아니다.
하나의 구현예에서, 상기 세포-투과 펩타이드 서열은 서열번호 1의 폴리펩타이드의 N-말단 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 N-말단에 융합된다. 다른 구현예에서, 상기 세포-투과 펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드의 C-말단 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 C-말단에 융합된다.
선호되는 구현예들에서, 본 발명에 따른 융합 단백질들은, 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 자체의 세포 투과 펩타이드 외에도, 최소 1개, 최소 2개, 최소 3개, 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개, 최소 10개 또는 이상의 추가적인 세포 투과 펩타이드를 포함한다.
다른 선호되는 구현예에서, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질은 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 포함하며 추가적으로 N-말단 또는 C-말단 핵 위치화 시그널을 포함한다. 상기 용어 "핵 위치화 시그널 (NLS)"은 본 발명의 치료학적 용도의 맥락에서 상세하게 기재되었고 본 발명의 융합 단백질의 맥락에서 동일하게 적용가능하다. 상기 추가적인 NLS가 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS와 다른 NLS를 의미한다는 것이 이해될 것이다. 상기 추가적인 NLS는 Omomyc 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS와 동일하거나 또는 다를 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 NLS는 Myc 서열에서 내인적으로 보여지는 NLS 중 하나, 예컨대 M1 펩타이드 (PAAKRVKLD, 서열번호 50) 또는 M2 펩타이드 (RQRRNELKRSF, 서열번호 49)이다 (상기 인용된 Dang 및 Lee를 참조하라).
선호되는 구현예들에서, 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질은, 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 발견되는 내인성 NLS 외에도, 최소 1개, 최소 2개, 최소 3개, 최소 4개, 최소 5개, 최소 6개, 최소 7개, 최소 8개, 최소 9개, 최소 10개 또는 이상의 NLS를 포함한다.
당업자는 상기 융합 단백질이 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체와 연결된 하나 이상의 플렉서블 펩타이드, 세포 투과 펩타이드 서열 및/또는 NLS를 추가적으로 포함하는 것이 바람직할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서 본 발명의 폴리펩타이드는 세포 투과 펩타이드 서열과 직접적으로 연결된다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 세포 투과 펩타이드 서열과 플렉서블 펩타이드를 통해 연결된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 세포 투과 펩타이드 서열 및 NLS와 직접적으로 연결된다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 첫 번째 플렉서블 펩타이드 링커를 통해 세포 투과 펩타이드 서열과 연결되고 두 번째 플렉서블 펩타이드 링커를 통해 NLS와 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "플렉서블 펩타이드(flexible peptides)", "스페이서 펩타이드(spacer peptide)" 또는 "링커 펩타이드(linker peptide)"는 두 개의 단백질 또는 모이어티를 공유결합적으로 결합시키는 펩타이를 의미하지만, 상기 단백질 또는 모이어티 중 어느 하나의 기능에 실질적으로 해로운 효과를 야기함이 없이 다른 것에 대해 하나의 움직임을 허용하는 어떠한 폴리펩타이드의 일부는 아닌 펩타이드이다. 따라서, 상기 플렉서블 링커는 Omomyc 서열의 종양 억제 활성, 세포 투과 펩타이드의 세포 투과 능력 또는 NLS의 핵 위치화 능력에 영향을 미치지 않는다.
상기 플렉서블 펩타이드는 최소 1개의 아미노산, 최소 2개의 아미노산, 최소 3개의 아미노산, 최소 4개의 아미노산, 최소 5개의 아미노산, 최소 6개의 아미노산, 최소 7개의 아미노산, 최소 8개의 아미노산, 최소 9개의 아미노산, 최소 10개의 아미노산, 최소 12개의 아미노산, 최소 14개의 아미노산, 최소 16개의 아미노산, 최소 18개의 아미노산, 최소 20개의 아미노산, 최소 25개의 아미노산, 최소 30개의 아미노산, 최소 35개의 아미노산, 최소 40개의 아미노산, 최소 45개의 아미노산, 최소 50개의 아미노산, 최소 60개의 아미노산, 최소 70개의 아미노산, 최소 80개의 아미노산, 최소 90개의 아미노산, 또는 최소 100개의 아미노산을 포함한다. 몇몇 구현예들에서 상기 플렉서블 펩타이드는 단백질의 용해도(solubility)를 증가시키고/증가시키거나 이의 활성을 개선하기 위해 다른 것에 대해 하나의 단백질의 이동을 허용할 것이다. 적합한 링커 부위는 폴리-글라이신 부위인 글라이신, 프롤린 및 알라닌 잔기들의 조합으로 이루어진 GPRRRR 서열 (서열번호 51)을 포함한다.
몇몇 구현예들에서 본 발명의 융합 단백질은 추가적인 화학적 모이어티를 포함할 수 있는데, 이들 중에서 형광 그룹, 바이오틴, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 아미노산 유사체, 천연적이지 않은 아미노산, 포스페이트 그룹, 글라이코실 그룹, 방사성 동위원소 표지, 및 약제학적 분자들을 포함한다. 다른 구현예들에서, 이종성 폴리펩타이드는 하나 이상의 화학적으로 반응성 그룹을 포함할 수 있는데, 이들 중에서 케톤, 알데히드, Cys 잔기 및 Lys 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 컨쥬게이트 또는 융합 단백질은 상기 컨쥬게이트 또는 상기 융합 단백질 또는 이의 변이체의 C-말단 또는 N-말단 도메인에 결합된 택(tag)을 포함한다. 상기 택은 일반적으로 상기 융합 단백질의 분리 또는 정제에 이용될 수 있는 펩타이드 또는 아미노산 서열이다. 따라서, 상기 택은 하나 이상의 리간드들, 예를 들어 높은 친화도를 가진 크로마토그래피 지지체 또는 비드 같은 친화도 매트릭스의 하나 이상의 리간들에 결합할 수 있다. 상기 택의 예는, 니켈 (Ni2+) 또는 코발트 (Co2+)의 컬럼에 높은 친화도로 결합할 수 있는 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 택 (His6 또는 H6) 같은 히스티딘 택 (His-택 또는 HT)이다. His-택은 대부분의 단백질들이 변성하고 대부분의 단백질-단백질 상호작용이 깨지는 조건 하에서 이의 리간드들과 결합할 수 있는 바람직한 특징을 가진다. 따라서, 베이트 단백질이 참여하는 단백질-단백질 상호작용의 파괴 후 H6로 태깅된 베이트 단백질을 제거하는 데 이용될 수 있다.
융합 단백질을 분리 또는 정제하는 데 유용한 택의 추가적인 예시적 예들은 Arg-택, FLAG-택 (DYKDDDDK; 서열번호 52), Strep-택 (WSHPQFEK, 서열번호 53), c-myc-택 (항-c-myc 항체에 의해 인지됨) 같은 항체에 의해 인지될 수 있는 에피토프, HA 택 (YPYDVPDYA, 서열번호 54), V5 택 (GKPIPNPLLGLDST, 서열번호 55), SBP-택, S-택, 칼모듈린 결합 펩타이드, 셀룰로오스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-트랜스퍼라제-택, 말토오스 결합 단백질, NusA, TrxA, DsbA, Avi-tag, 등 (Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003, 60:523-525), AHGHRP (서열번호 56) 또는 PIHDHDHPHLVIHSGMTCXXC (서열번호 57) 같은 아미노산 서열, β-갈락토시다제 및 이와 유사한 것을 포함한다.
소망한다면, 상기 택은 상기 융합 단백질의 분리 또는 정제를 위해 이용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료용 의약품의 제조를 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상자에 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 투여를 포함하는 상기 대상자에서 암의 치료 및/또는 예방의 방법에 관한 것이다.
선호되는 구현예에서, 예방 또는 치료될 암은 Myc-유도된 암이다. 다른 선호되는 구현예에서, 예방 또는 치료될 암은 KRAS 유전자 내 돌연변이와 연관된 암이다. 하나의 구현예에서, KRAS 유전자 내 돌연변이는 12번째 위치의 글라이신, 13번째 위치의 글라이신 또는 61번째 위치의 글루타민에서의 돌연변이이다. 보다 선호되는 구현예에서, 상기 돌연변이는 G12S 돌연변이, G12V 돌연변이, G13D 돌연변이, G12C 돌연변이, G12R 돌연변이, G12F 돌연변이, G12I 돌연변이, G13C 돌연변이, G13R 돌연변이, 또는 Q61L 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 용어들 "의약품(medicament)", "예방(prevention)", "치료(treatment)", "암" 및 "Myc-유도된 암(Myc-induced cancer)"은 이전에 정의된 대로였으며 본 발명의 이러한 양태에 동일하게 적용된다.
항종양 조성물
Omomyc 폴리펩타이드가 생물학적 막을 가로질러 이동할 수 있고 폴리펩타이드로서 제공되는 경우 이의 종양 억제 활성을 나타낼 수 있다는 예측하지 못한 발견이 Omomyc을 다른 항종양 약물과 제형화시키는 가능성을 연다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은:
(i) Omomyc,
(ii) 이의 기능적으로 동등한 변이체,
(iii) 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질
로 이루어진 군으로부터 선택된 첫 번째 구성성분 및,
두 번째 구성성분으로서, 항종양 화합물을 함께 또는 개별적으로 포함하는 조성물도 제공한다.
본 발명에 따른 조성물의 첫 번째 구성성분은 서열번호 1에 따른 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다. 적합한 폴리펩타이드, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체 및 융합 단백질은 본 발명에 따른 치료학적 방법들의 맥락에서 상기 기재되었으며 본 발명에 따른 조성물에 동일하게 적용가능하다.
본 명세서에서 사용되는 대로, "항종양제(antitumoral agent)"는 종양을 치료하거나 또는 이의 형성을 예방하는 상기 생물학적 또는 화학적 화합물로서 이해된다. 선호되는 구현예에서 상기 항종양제는 세포독성제, 항혈관형성제, 항전이제 및 항증식제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 사용되는 대로, 상기 용어 "세포독성제(cytotoxic agent)"는 세포 사멸(cell death)을 촉진할 수 있고 성장을 감소시키거나, 성장을 멈추거나 또는 세포를 파괴하는 능력을 가질 수 있는 제제를 의미하며, 특히 빠르게 증식하는 세포 및 보다 더 특별하게는, 종양세포의 성장을 감소시키거나, 성장을 멈추거나 또는 세포를 파괴하는 능력을 가질 수 있는 제제를 의미한다. 세포 사멸은 어떠한 기작, 예컨대 비록 이러한 원인에 제한되지 않을 지라도 대사과정 억제, 세포 골격(cytoskeleton)의 구성을 방해 또는 DNA의 화학적 변형에 의한 아팝토시스 같은 기작에 의해 야기될 수 있다. 상기 용어 세포독성제는 작은 유기분자들, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 이와 유사한 것; 독소; 효소; 사이토카인; 방사성 동위원소 또는 방사선 치료제를 포함하는 어떠한 화학치료제를 포함한다.
"화학치료제(chemotherapy agents)"는 독소루비신 및 다우노루비신 같은 안트라사이클린 항생제, 탁솔TM 및 도세탁셀 같은 탁세인, 빈크리스틴 및 빈블라스틴 같은 빈카 알칼로이드, 5-플루오로우라실 (5-FU), 류코보린, 이리노테칸, 이다루비신, 미토마이신 C, 옥살리플라틴, 랄티트렉시드, 타목시펜, 시스플라틴, 카르보플라틴, 메토트렉세이트, 악티노마이신 D, 미톡산트론, 블레녹세인 또는 미트라마이신 같은 화학적 화합물로 이해되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"독소(toxin)"는 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 폴리펩타이드 또는 면역독소(immunotoxin)를 형성하는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 융합 단백질과 컨쥬게이션하는 독성제(toxic agent)로서 이해된다. 그렇지 않다면 결정된 독소는 너무 독성을 나타내기 때문에 상기 폴리펩타이드 또는 상기 융합 단백질과 결정된 독소의 컨쥬게이션은 전자의 독성을 감소시켜, 치료제로서의 이의 용도를 가능하게 한다. 상기 독소와 본 발명의 첫 번째 양태에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 융합 단백질 간의 결합은 이의 생물학적 활성을 보존하면서 화학적으로 이루어진다. 일반적으로 이들의 분리는 타겟 세포의 라이소좀에서 일어나는데, 상기 언급된 화학적 결합은 상기 라이소좀에 의해 제공되는 밀폐된 산성 세포내 환경에서만 파괴된다. 본 발명의 맥락에서 유용한 독소는 식물 독소, 박테리아 독소, 곰팡이 또는 동물 기원의 독소 및 이의 단편들인데, 예컨대 리신 A-사슬, 사포닌, 디프테리아 A-사슬, 디프테리아 독소의 활성 비-결합 단편, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 엑소독소(exotoxin) A-사슬, 아브린 A-사슬, 모데신 A-사슬, α-사르신(sarcin), 레우리테스 포르디(leurites fordii) A-단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 파이토라카 아메리카나(Phytolaca americana) (PAPI, PAPII 및 PAP-S) 단백질, 모모디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcine), 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(Saponaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"효소(enzymes)"는 본 발명의 맥락에서 독소 또는 약물 활성화 효소로서 이해되는데, 예컨대 에토포시드 및 독소루비신을 활성화시키는 알칼린 포스파타제; 질소 머스터드(nitrogen mustards)를 활성화시키는 카르복시펩티다제 G2; 독소루비신, 파클리탁셀 및 미토마이신을 활성화시키는 베타-락타마제이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"사이토카인"은 면역 반응을 조절하기 위해 면역 시스템의 세포를 합성하는 다른 크기 및 분자량을 가진 펩타이드로서 이해되고, 이들은 호르몬, 성장인자, 괴사 인자, 등일 수 있다. 사이토카인은 천연 기원이거나 또는 재조합 세포 배양 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적으로 활성 동등물(equivalents)로부터 유래할 수 있다. 항체와의 컨쥬게이션은 면역사이토카인을 발생시킨다. 본 발명에 유용한 사이토카인은 TNF 인자 알파, INF-감마, GM-GSF 인자 또는 IL-2이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"방사성 동위원소(radioisotopes)"는 131I, 90Y, 177Lu, 188Re, 67Cu, 211At, 213Bi, 125I, 111In 같은 방사성 동위원소로서 이해되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"항혈관형성제(antiangiogenic agent)"는 신생 혈관의 형성, 즉 혈관신생(angiogenesis)을 억제 또는 감소시키는 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다.
본 발명의 첫 번째 양태에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명의 두 번째 양태에 따른 융합 단백질과 컨쥬게이션될 수 있는 항혈관형성제는, 파클리탁셀, 2-메톡시에스트라디올, 프리노마스타트, 바티마스타트, BAY 12-9566, 카르복시아미도트리아졸, CC-1088, 덱스트로메토르판 아세트산, 디메틸크산테논 아세트산, 엔도스타틴, IM-862, 마리마스타트, 페니실라민, PTK787/ZK 222584, RPI.4610, 스쿠알라민 락테이트, SU5416, 탈리도마이드, 콤브레타스타틴, 타목시펜, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, SU6668, 항-VEGF 항체, Medi-522 (비탁신 II), CAI, 인터류킨 12, IM862, 아밀로라이드, 안지오스타틴, Kl-3 안지오스타틴, Kl-5 안지오스타틴, 캅토프릴, DL-알파-디플루오로메틸오르니틴, DL-알파-디플루오로메틸오르니틴HCl, 엔도스타틴, 푸마길린, 허비마이신 A, 4-히드록시페닐레티나미드, 주글론, 라미닌, 라미닌헥사펩타이드, 라미닌펜타펩타이드, 라벤두스틴 A, 메드록시프로게스테론, 미니사이클린, 태반 리보뉴클레아제 억제제, 수라민, 트롬보스폰딘, 전혈관형성 인자에 대해 지시된 항체 (예컨대, 아바스틴, 어비툭스, 벡티빅스, 허셉틴); 전혈관형성 성장인자의 저분자량 타이로신 키나제 억제제 (예컨대, 타르세바, 넥사바르, 수텐트, 이레사); mTOR 억제제 (예컨대 토리셀); 인터페론 알파, 베타 및 감마, IL-12, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 (예컨대, COL3, 마리마스타트, 바티마스타트); ZD6474, SUl1248, 비탁신; PDGFR 억제제 (예컨대 글리벡); NM3 및 2- ME2; 실렌기티드 같은 사이클로펩타이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"항전이제(antimetastatic agent)"는 전이, 즉 기본적으로 림프액 또는 혈액 흐름에 따라 암 유발 세포의 원거리 증식, 및 상기 전이의 목적 위치에서 신생 종양의 성장을 억제 또는 감소시키는 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다.
"항증식제(antiproliferative agent)"는 종양의 형성 또는 성장을 예방 또는 억제할 수 있는 화학적 또는 생물학적 물질로서 이해된다. 항증식제는 (i) 엽산 항대사제 (아미놉테린, 데놉테린, 메토트렉세이트, 에다트렉세이트, 트리메트렉세이트, 놀라트렉세드, 로메트렉솔, 페메트렉세드, 랄티트렉세드, 피리트렉심, 프테롭테린, 류코보린, 10-프로파르길-5,8-디데아자폴레이트 (PDDF, CB3717)), 퓨린 유사체 (클라드리빈, 클로파라빈, 플루다라빈, 머캅토퓨린, 펜토스타틴, 티오구아닌) 및 피리미딘 유사체 (카페시타빈, 시타라빈 또는 ara-C, 데시타빈, 플루오우라실, 5-플루오우라실, 독시플루리딘, 플록수리딘 및 겜시타빈) 같은 항대사제(antimetabolites) (ii) 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 같은 빈카 알칼로이드; 파클리탁셀 (탁솔TM), 도세탁셀 (탁소테레TM) 같은 탁세인; 콜치신 (NSC 757), 티오콜치신 (NSC 361792), 콜치신 유도체 (예컨대, NSC 33410), 및 알로콜치신 (NSC 406042); 할리콘드린 B (NSC 609395); 돌라스타틴 10 (NSC 376128); 마이탄신 (NSC 153858); 리족신 (NSC 332598); 에포틸론 A, 에포틸론 B; 디스코데르몰라이드; 에스트라머스틴; 노코다졸 같은 항종양 항생제 및 유사분열억제제(mitotic inhibitors) 같은 천연산물; (iii) 타목시펜, 토레미펜, 아나스트로졸, 아르족시펜, 라소폭시펜, 랄록시펜, 나폭시딘, 풀베스트란트, 아미노글루테티미드, 테스토락톤, 아타메스탄, 엑세메스탄, 파드로졸, 포르메스탄, 레트로졸, 고세렐린, 류프로렐린 또는 류프롤라이드, 부세렐린, 히스트렐린, 메게스트롤 및 플루옥시메스테론 같은 호르몬 및 이의 길항제; (iv) 바이러스 벡터, 인터페론 알파 및 인터류킨 같은 생물학적 제제; (v) 카르보플라틴, 시스플라틴 [cis-디아민디클로로플라티늄, (CDDP)], 옥살리플라틴, 이프로플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴테트라니트레이트, 테트라플라틴, 사트라플라틴 (JM216), JM118 [cis 아민 디클로로 (II)], JM149 [cis 아민 디클로로 (사이클로헥실아민) 트랜스 디히드록소 플라티늄 (IV)], JM335 [트랜스 아민 디클로로디히드록소 플라티늄 (IV)], 트랜스플라틴, ZD0473, cis, 트랜스, cis-Pt(NH3)(C6H11NH2)(OOCC3H7)2Cl, 말라네이트-l,2-디아미노시클로헥사노플라틴(II), 5-술포살리실레이트-트랜스-(l,2- 디아미노시클로헥세인)플라틴 (II) (SSP), 폴리-[(트랜스-l,2-디아미노시클로헥세인)플라틴]- 카르복시아밀로오스 (POLY-PLAT) 및 4-히드록시-술포닐페닐아세테이트 (트랜스- 1,2- 디아미노시클로헥세인) 플라티늄 (II) (SAP) 및 이와 유사한 것 같은 백금 기반된 화합물 및 (vi) 사클로포스파미드 (Cytoxan™), 부술판, 임프로술판, 피포술판, 피포브로만, 멜팔란 (L-사르콜리신), 클로람부실, 메클로레타민 또는 무스틴, 우라무스틴 또는 우라실 머스타드, 노벰비친, 페네스테린, 트로포스파미드, 이포스파미드, 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 클로로조토신, 포테무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 세무스틴 (메틸-CCNU), 스트렙토조신, 티오테파, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포라민, 프로카르바진, 알트레타민, 다카르바진, 미토졸로미드 및 테모졸로미드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 질소 머스타드, 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트 및 트라이젠 같은 DNA-알킬화 약물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
약제학적 조성물
본 발명은 본 발명의 컨쥬게이트 및 융합 단백질 또는 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 약제학적 조성물도 제공한다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 약제학적으로 활성 있는 양(active amount) 및 약제학적으로 활성 있는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 (본 발명의 첫 번째 약제학적 조성물)을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 약제학적으로 활성 있는 양의 조성물 및 약제학적으로 활성 있는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 (본 발명의 두 번째 약제학적 조성물)을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 대로, 상기 표현 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 전결정된 투여량의 하나 또는 여러 개의 치료학적으로 유용한 제제들을 세포, 세포의 그룹, 기관, 조직 또는 세포 분열이 조절되지 않는 동물, 예컨대 암을 가진 동물에 투여하기 위해 조정되었던 제형을 의미한다.
본 발명의 첫 번째 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 약제학적으로 효과적인 양을 포함한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 사용하기 위해 적합한 컨쥬게이트 및 융합 단백질은 본 발명의 Omomyc 컨쥬게이트 및 융합 단백질 단락에서 상기 언급된 융합 단백질의 어떠한 것을 포함한다.
본 발명의 두 번째 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 컨쥬게이트 또는 융합 단백질의 약제학적으로 효과적인 양 및 약제학적으로 활성 있는 담체를 포함한다. 본 발명의 두 번째 약제학적 조성물은 서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 본 발명에 따른 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따른 두 번째 약제학적 조성물에 사용하기 위한 서열번호 1의 폴리펩타이드의 적합한 기능적으로 동등한 변이체들 또는 적합한 융합 단백질들은 각각 본 발명의 치료학적 용도 또는 본 발명의 융합 단백질에 대해 상기 정의된 대로이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 표현 "약제학적으로 효과적인 양(Pharmaceutical effective amount)"은 치료학적 효과를 제공할 수 있는 양으로서 이해되며, 상기 양은 일반적으로 이용되는 방법에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다. Omomyc 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 융합 단백질의 양 또는 본 발명에 다른 약제학적 조성물에 조합될 수 있는 항종양 화합물의 양은 대상자 및 투여의 특정 모드에 따라 다양할 것이다. 당업자는 투여량이 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711 및 Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493의 가이드라인에 따라 결정될 수도 있다는 것을 이해할 것이다.
약제학적 조성물 내 유효 성분(active principle) 또는 유효 성분들의 적절한 투여량은, 상기 조성물이 예방적 또는 치료적 목적, 이전 치료법, 상기 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대한 환자의 임상적 히스토리 및 반응, 그리고 담당의사의 재량에 따라 투여되는 지 여부에 따라 치료될 암의 타입, 상기 질병의 심각성 및 과정에 의존할 것이다. 서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 융합 단백질의 양은 한번에 또는 일련의 처리들에 따라 환자에 적합하게 투여된다. 상기 질병의 타입 및 심각성에 따라, 적절한 투여 레벨은 일반적으로 하루 당 환장 몸무게 kg 당 약 0.01 내지 500 mg일 것이며, 이는 단일 또는 복수의 투여량으로 투여될 수 있다. 좋게는, 상기 투여량 레벨은 하루 당 약 0.1 내지 약 250 mg/kg; 보다 좋게는 하루 당 약 0.5 내지 약 100 mg/kg일 것이다. 적합한 투여량 레벨은 하루 당 약 0.01 내지 약 250 mg/kg, 하루 당 약 0.05 내지 약 100 mg/kg, 또는 하루 당 약 0.1 내지 약 50 mg/kg일 수 있다. 이러한 범위 내에서 상기 투여량은 하루 당 0.05 내지 0.5, 0.5 내지 5 또는 5 내지 50 mg/kg일 수 있다. 구강 투여를 위해, 상기 조성물은 좋게는 치료될 환자에 투여량의 대증 조정을 위해 1.0 내지 1000 밀리그램의 활성성분, 특히 1.0, 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 50.0, 75.0, 100.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 400.0, 500.0, 600.0, 750.0, 800.0, 900.0, 및 1000.0 밀리그램의 활성성분을 포함하는 정제 형태로 제공된다. 상기 화합물은 하루 당 1 내지 4번의 치료 계획, 좋게는 하루 당 1번 또는 2번의 치료 계획으로 투여될 수 있다.
서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 및 본 발명에 따른 융합 단백질로부터 선택된 첫 번째 구성성분 그리고 항종양제인 두 번째 구성성분을 포함하는 본 발명에 따른 두 번째 약제학적 조성물의 경우에서, 상기 조성물은 단일 제형 (예컨대, 고정된 양의 각각의 구성성분을 포함하는 정제 또는 캡슐)으로서 주어지거나 또는 한편으로는 공동(joint), 연속(sequential), 또는 개별(separate) 투여를 위해 조합되는 개별 제형으로서 제공될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 부품 키트(kit-of-parts)의 제형을 포함하고, 상기 구성성분들은 개별적으로 제형화되지만 동일한 컨테이너에 패키징된다. 당업자는 본 발명에 따른 두 번째 약제학적 조성물의 경우에서 다른 구성성분들의 제형이 유사할 수 있다는, 즉 유사하게 제형화 (정제 또는 알약)될 수 있어 동일한 경로에 의해 투여할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 다른 구성성분들이 개별적으로 제형화되는 경우에서, 2개의 구성성분들이 블리스터(blister) 내에 제공될 수 있다. 각 블리스터는 하루 동안 소모되어야만 하는 약물을 포함한다. 상기 약물이 하루에 여러 번 투여되야만 하는 경우, 각 투여에 상응하는 약물은 블리스터의 다른 섹션 내에 위치될 수 있고, 좋게는 투여되야만 하는 하루의 시간을 블리스터의 각 섹션 내에 기록할 수 있다. 택일적으로, 본 발명의 조성물의 구성성분들은 다른 구성성분들이 다르게 투여되기 위해 다르게 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 첫 번째 구성성분은 구강 투여를 위해 정제 또는 캡슐로서 제형화되며 두 번째 구성성분은 정맥내 투여를 위해 제형화되거나 또는 그 반대로 제형화된다. 본 발명에 따른 두 번째 약제학적 조성물에 이용되는 조성물의 일부인 구성성분들 간의 비율은 각 특정 경우에서 이용되는 항종양제 뿐 아니라 소망된 표시에 따라 당업자에 의해 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 두 개의 구성성분의 양들 간의 비율이 50:1부터 1:50까지, 특히 20:1부터 1:20까지, 1:10부터 10:1까지, 또는 5:1부터 1:5까지인 조성물을 예상한다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 또한 암 같은 조절되지 않은 세포 분열이 존재하는 병리학의 예방 및/또는 치료를 위한 하나 또는 여러 개의 추가적인 화합물들을 포함할 수도 있다. 항종양제 같은 상기 추가적인 화합물들은 독립적인 존재로서 약제학적 조성물의 부분을 형성할 수 있다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 또한 하나 또는 여러 개의 추가적인 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. "약제학적으로 허용가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)"는 상기 유효성분을 포함하는데 이용되고 약물학적/독성학적 견지에서 환자 및 조성물, 제형, 안정성, 환자의 용인 및 생체이용가능성에 대한 물리적/화학적 관점을 고려하여 제조하는 약제학적 약사에게 허용가능한 것으로 언급된 치료학적으로 불활성 물질로 이해된다.
상기 약제학적으로 허용가능한 부형제의 수 및 특성은 소망된 투여 형태에 의존한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제는 당업자에게 알려져 있다 (Fauli y Trillo C. (1993) "Tratado de FarmaciaGalenica", Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid). 상기 조성물은 당업계에 알려진 종래의 방법들을 이용하여 제조할 수 있다 ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, US).
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 어떠한 적합한 경로, 예컨대 구강 경로, 국소 경로, 흡입 또는 비경구 경로에 의해 투여될 수 있으며, 소망된 투여량의 제형에 필요한 약제학적으로 허용가능한 부형제들이 포함될 것이다. 상기 약제학적인 조성물의 투여의 선호되는 경로는 정맥내 경로이다.
"구강 경로(oral route)"는 삼킴 후 생물체 내로 삽입될 약제학적 조성물로서 이해된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은, 고체 또는 액체이건 간에 구강 투여에 의한 투여에 적합한 투여량 형태일 수 있다. 구강 투여에 의한 상기 조성물의 투여에 적합한 투여량 형태는 정제, 캡슐, 시럽 또는 용액일 수 있고, 당업계에 알려진 어떠한 종래의 부형제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소비톨 또는 폴리비닐피롤리돈 같은 바인더; 예컨대 락토오스, 당, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 소비톨 또는 글라이신 같은 충진제(filling agents); 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 같은 압축을 위한 윤활제; 예컨대 전분, 폴리비닐피롤리돈, 전분의 소듐 글리콜레이트 또는 미세결정성 셀룰루오스 같은 붕해제(disintegrating agents); 또는 소듐 라우릴 술페이트 같은 약제학적으로 허용가능한 습윤제를 포함할 수 있다. 상기 고체 구강 조성물은 혼합, 충진 또는 압착하는 종래의 과정들에 의해 제조할 수 있다. 반복적인 혼합 작업(operations)은 많은 양의 충진제를 이용하는 이들 조성물 내에 상기 활성제를 완전히 분포시키기 위해 이용할 수 있다. 상기 작업은 당업계에서 관례적이다. 정제는, 예를 들어 습식 또는 건식 과립화(granulation)에 의해 제조할 수 있고, 선택적으로 일반적인 약제학적 실행에서 알려진 공정들, 특히 장용성 제피(enteric coating)에 따라 코팅하여 제조할 수 있다.
한편, "국소 경로(topical route)"는 비-전신성 경로에 의한 투여로서 이해되며, 표피 상, 구강 내에서 외적으로 본 발명의 약제학적 조성물의 적용 및 귀, 눈 및 코 내로 상기 조성물의 적하(instillation)를 포함하고, 이 경로에서는 혈액 흐름을 유의하게 만나지 않는다. "전신성 경로(systemic route)"는 구강 경로, 정맥내 경로, 복강내 경로 및 근육내 경로에 의한 투여로서 이해된다. 치료적 또는 예방적 효과를 위해 요구되는 항체의 양은 선택된 항체, 치료되고자 하는 병의 특성 및 심각성, 및 환자에 따라 자연스럽게 다양할 것이다.
"흡입(inhalation)"은 비강내 경로 및 구강 흡입에 의한 투여로서 이해된다. 에어로졸 내 제형 또는 정량분무식 흡입기(meter dosed inhaler) 같은 상기 투여에 적합한 투여량 형태는 종래의 기술들에 의해 제조할 수 있다. 구현예에서, 투여 경로는 비강내 경로이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 상기 용어 "비경구(parenteral)"는, 정맥내 경로, 복강내 경로, 근육내 경로 또는 피하내 경로에 의한 투여를 포함한다. 비경구 투여의 피하내, 근육내 및 정맥내 투여량 형태가 일반적으로 선호된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위해 조정될 수 있는데, 예컨대 적절한 투여량 단위 형태로 멸균 용액, 현탁액 또는 동결건조된 산물로 조정될 수 있다. 주사가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 (물에 용해가능한 경우), 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 임시변통의 제조를 위한 분산액 및 멸균 파우더를 포함한다. 정맥내 경로에 의한 투여를 위해, 몇몇 적합한 담체들은 포스페이트 완충화된 염 용액 (PBS)를 포함한다. 모든 경우들에서, 상기 조성물은 멸균되어야만 하며, 주사되기 위한 능력을 용이하게 한다는 점에서 유체여야만 한다. 상기 조성물은 제조 및 저장 조건에서 안정적이여야만 하고, 박테리아 및 곰팡이 같은 미생물의 오염 활동으로부터 보호해야만 한다. 상기 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 글라이세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 적합한 혼합물 같은 약제학적으로 허용가능한 폴리올을 포함하는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 적합한 유체성(fluidity)은, 예를 들어 레시틴 같은 코팅에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기를 유지시킴에 의해 그리고 계면활성제를 이용하여 유지할 수 있다. 상기 미생물의 활동의 예방은 다양한 항박테리아 및 항곰팡이 제제, 예를 들어 파라벤, 클로로부타놀, 페놀, 아스코프브산, 티오메르살(thiomersal), 및 이와 유사한 것에 의해 달성할 수 있다. 대부분의 경우들에서, 조성물 내에 등장화제(isotonic agents), 예컨대 당; 만니톨, 소비톨 같은 폴리알코올; 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 선호될 것이다. 상기 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 및 젤라틴모노스테아레이트의 함유에 의해 야기될 수 있다.
상기 주사가능한 멸균 용액은 적합한 용매 내 필요한 양의 활성 화합물을 필요하다면 상기 언급된 유효성분 또는 이의 조합과 결합시킨 후 멸균 막을 이용한 여과에 의한 멸균화로 제조할 수 있다. 일반적으로, 상기 분산액은 염기성 분산 배지를 포함하는 멸균 비히클(vehicle)과 이전에 나열될 이들로부터 요구되는 나머지 성분들을 혼합시켜서 제조한다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우에서, 선호되는 제조 공정들은 활성성분 더하기 이전에 여과된 이의 멸균 용액으로부터 어떠한 소망된 추가적인 성분을 가진 파우더를 생성시키는 진공 건조 및 동결건조이다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 예컨대 조성물의 감소하는 투여량과 함께 펄스 주입(pulse infusion)에 의해 적합하게 투여할 수 있다. 좋게는, 상기 투여량은, 부분적으로 상기 투여가 급성 또는 만성이냐에 따라 주사, 보다 좋게는 정맥내 또는 피하내 주사에 의해 투여된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 첫 번째 또는 두 번째 약제학적 조성물은, 체내의 신속한 제거로부터 상기 폴리펩타이드를 보호할 담체, 예컨대 임플란트 및 미세포집된 투여 시스템을 포함하는 조절된 방출 제형 같은 담체와 함께 제조된다. 에틸렌 비닐아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리유산 같은 생체분해가능한 생체적합성 폴리머를 이용할 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 과정은 당업자에게 자명할 것이다. 또한 상기 물질들은 Alza사 및 Nova 제약회사에서 상업적으로 얻을 수 있다.
지속된 방출 조성물은 또한 현탁액 내 크리스탈을 유지할 수 있는 적합한 제형에 현탁된 항체 크리스탈의 제조물을 포함한다. 이러한 제조물들이 피하내 또는 복강내 경로에 의해 주입되는 경우, 상기 제조물들은 지속된 방출 효과를 생산할 수 있다. 다른 조성물들도 리포좀에 가둬진 항체를 포함한다. 그러한 항체를 포함하는 리포좀은 Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949 같은 알려진 방법들에 의해 제조된다.
Omomyc 및 Omomyc을 포함하는 컨쥬게이트 및 융합 단백질이 생물학적 막을 가로질러 이동할 수 있다는 사실에도 불구하고, 당업자는 나노입자 내에 Omomyc을 포함하는 컨쥬게이트 또는 융합 단백질을 제형화시키는 것이 편리할 수 있다는 것도 이해할 것이다. 상기 나노입자는 타겟 기관에 도달할 때까지 생물학적 유체 내에서 상기 폴리펩타이드의 완전성을 보존시키는 데 기여할 수 있다. 더욱이, 항종양제를 포함하는 조성물의 경우에서, 상기 조성물의 포집은 항종양제에 의한 2차 효과를 감소시킬 수 있다. 마지막으로, 나노입자는 또한 목적 기관으로 상기 나노입자의 타겟팅을 허용하는 모이어티를 포함시키기 위해 변형될 수도 있다.
따라서, 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 나노입자의 일부를 형성하는 본 발명에 따른 컨쥬게이트, 융합 단백질 및 조성물을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 이용될 수 있는 적합한 나노입자는 지질-기반된 나노입자, 초상자성 나노입자, 나노쉘, 반도체 나노크리스탈, 양자점, 폴리머-기반된 나노입자, 실리콘-기반된 나노입자, 실리카-기반된 나노입자, 금속-기반된 나노입자, 풀러린 및 나노튜브 같은 그러한 나노규모의 물질을 포함한다.
타겟팅된 운반은 나노입자들의 폴리펩타이드 탑재량(payloads)을 운반하기 위한 나노입자들의 능력을 손상시킴이 없이 리간드의 부가에 의해 달성될 수 있다. 이것이 특이적 세포, 조직 및 기관으로의 운반을 가능하게 할 것이라는 것이 고려된다. 상기 리간드-기반된 운반 시스템의 타겟팅 특이성은 다른 세포 타입 상에 존재하는 리간드 수용체의 분포에 기반한다. 상기 타겟팅 리간드는 나노입자와 비-공유결합적이거나 또는 공유결합적으로 결합될 수 있으며, 본 명세서에서 논의되는 대로 다양한 방법들에 의해 나노입자에 컨쥬게이션될 수 있다.
나노입자를 타겟팅하는 데 이용될 수 있는 단백질 또는 펩타이드의 예들은 트랜스페린, 락토페린, TGF-β, 신경 성장인자, 알부민, HIV Tat 펩타이드, RGD 펩타이드, 및 인슐린, 뿐 아니라 다른 단백질 또는 펩타이드들을 포함한다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 선호되는 구현예에서, 상기 담체는 세포의 세포질로 융합 단백질 또는 조성물의 직접적인 운반을 허용하지 않는데, 즉 상기 담체는 타겟 세포의 원형질막과 융합할 수 없다. 본 명세서에서 사용되는 대로 "담체(carrier)"는 상기 약제학적 조성물 내 유효성분의 운반 및 효과(effectiveness)를 개선시키는 데 이용하는 어떠한 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 예들은 하나 이상의 물, 염, 포스페이트 완충화된 염, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 및 이와 유사한 것, 뿐 아니라 이의 조합을 포함한다. 많은 경우들에서, 조성물 내에 등장화제(isotonic agents), 예컨대 당; 만니톨, 소비톨 같은 폴리알코올 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 선호될 것이다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 약제학적 조성물의 일부를 형성하는 융합 단백질 또는 조성물의 반감기(shelf life) 또는 효과를 증진시키는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액 같은 소량의 보조 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 적절한 담체의 예들은 문헌 내에 잘 알려져 있다 (예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995를 참고하라). 담체의 예들은 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 및 말티톨 같은 일련의 단당류; 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 및 감자 전분 같은 일련의 전분; 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시 메틸 셀룰로오스, 및 히드록실 프로필메틸 셀룰로오스 같은 일련의 셀룰로오스; 및 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈 같은 일련의 필러이지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 몇몇 경우들에서, 교차-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산, 또는 소듐 알기네이트 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 첫 번째 및 두 번째 약제학적 조성물은 어떠한 타입의 포유동물, 좋게는 인간으로의 투여에 적합하다.
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도 1. (A) Omomy-FITC와 37℃에서 2시간 동안 반응된 A549 세포의 형광 이미징은 Omomyc-FITC가 핵 및 세포질에 위치한다는 것을 보여준다. (B) 핵의 Hoescht 염색. (C) 위상차(phase contrast).
도 2. 10 μM의 Omomyc 또는 Max* 중 어느 하나와 반응된 세포를 카운트하고 아넥신(Annexin) V 및 PI로 염색하였다. (A) PBS, Omomyc- 또는 Max-처리된 A549의 총 세포수. (B) PI로 염색된 죽은 세포의 백분율. (C) 살아있는 (염색되지 않은) 세포의 백분율. (D) 아넥신 V 양성 세포의 백분율.
도 3. (A) c-Myc*, Max* 및 Omomyc 정제된 단백질들 (32 μM)에 대해 20℃에서 기록된 원편광이색성 (Circular dichroism, CD) 스펙트럼은 Omomyc이 Myc*보다 Max*의 폴딩 구조에 보다 유사한 폴딩 구조를 가진다는 것을 보여준다 (mdeg, 1000분의 1도). (B) c-Myc*, Max* 및 Omomyc 정제된 단백질들에 대해 1℃/분으로 원편광이색성에 의해 연구된 열적 분해는 Omomyc이 Max*의 폴딩 구조보다 더 열적으로 안정적인 폴딩 구조를 가진다는 것을 보여준다 (˚m, 222 nm의 특화된 파장에서 1000분의 1도).
도 4. 다른 펩타이드 농도 (5, 10 및 25 μM)에서 Omomyc 또는 Max*와 37℃에서 2시간의 반응 후 4% PFA로 고정된 A549 세포의 공초점 현미경 이미지들로부터 유래된 형광의 정량. AU, 임의적 단위(arbitrary units).
도 5. Omomyc 또는 Max* (20 μM)와 37℃에서 20분의 반응 후 살아있는 A549 세포의 공초점 현미경 이미지들로부터 유래된 형광의 정량. AU, 임의적 단위.
도 6. 지시된 시간 동안 25 μM의 Omomyc 또는 Max*로 처리된 A549 및 H1650 폐 선암(adenocarcinoma) 세포의 크리스탈 바이올렛 염색.
도 7. 지시된 시간 동안 25 μM의 Omomyc 또는 Max*로 처리된 A549 및 H1650 폐 선암 세포의 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 증식의 억제에 대한 정량.
도 8. 크리스탈 바이올렛 염색 정량에 의해 Omomyc 또는 Max*에 대한 A549 세포의 투여량 반응.
도 9. 25 μM의 Omomyc 또는 Max* 펩타이드로 처리된 U87 신경교종세포의 증식에 대한 정량.
도 10. (A) 형광성 펩타이드 Omomyc (37.5 mg/kg의 단일 투여량)의 비강내 투여 10분 후 비처리된 (왼쪽) 및 처리된 (오른쪽) 동물의 폐. (B) 형광성 펩타이드 Omomyc (37.5 mg/kg의 단일 투여량)의 비강내 투여 10분 후 비처리된 (왼쪽) 및 처리된 (오른쪽) 동물의 뇌.
도 11. PBS 또는 Omomyc의 비강내 투여에 의한 폐 선암의 치료. (A) 종양의 증식률. (B) 세포내 밀도.
도 12. PBS 또는 Omomyc의 비강내 투여에 의한 폐 선암의 치료 후 % 종양 면적의 측정.
본 발명은 단지 예시적이고 본 발명의 범위를 제한하는 수단이 아닌 다음의 실시예들에 의해 하기에 상세하게 기재된다.
실시예
실험재료 및 실험방법
실시예 1
풍부 배지 또는 최소 M9 배지에서 Omomyc 컨스트럭트의 발현
풍부 배지(rich medium)에서 Omomyc 생산을 위해, 암피실린을 포함하는 1 L의 2YT 배지에 Omomyc-pET-3a 컨스트럭트로 형질전환된 BL21-AI™ One Shot® 화학적으로 능력있는 대장균(Escherichia coli) (Life technologies)을 접종하여 OD600이 0.8에 도달할 때까지 250 rpm으로 교반 하에서 37℃로 성장시켰다. 단백질 발현을 10 mL의 아라비노오스 용액으로 유도하여, 12시간 동안 37℃로 배양시켰다. 택일적으로, 최소 M9 배지에서 Omomyc 생산을 위해, Omomyc-pET3a 컨스트럭트로 형질전화된 대장균을 BL21-CodonPlus (Strategene)와 함께 클로람페니콜 및 암피실린을 포함하는 1L의 M9 최소 배지에 접종하고 OD600이 0.8에 도달할 때까지 250 rpm으로 교반 하에서 37℃로 성장시켰다. 단백질 발현을 1 mL의 IPTG 1000X 용액으로 유도하였다. 상기 세포 배양물을 250 rpm으로 교반 하에서 37℃로 12시간 동안 성장시켰다.
상기 박테리아 배양물을 250 mL 용기(bottles)를 이용하는 SLA-1500 로터에서 5분 동안 10,000 rpm으로 4℃에서 원심분리시켰다. 배양물을 연속적으로 원심분리시켜 용기 당 1L의 배양물의 동등물을 합쳤다.
성공적인 단백질 발현을 확인하기 위해, 상기 배양물로부터 1 mL의 분취액을 수집하여 OD600을 측정하였다. 상기 분취액 800 μL를 16,060 xg로 1분 동안 회전시키고 상층액을 버렸다. 상기 펠렛을 (0.1 x OD600 값) μL와 동등한 IB 라엠리(Laemmli) 완충액의 부피에 현탁시켜 각 시료 내 용해된 세포 추출물의 동일한 양을 보장하고 단백질 발현 전 및 후의 비교를 용이하게 하였다. 이후 상기 시료를 볼텍스로 혼합하여 최대 파워에서 5초 동안 초음파처리하였고, 액체 질소에서 동결시켰으며, 마지막으로 2분 동안 끓인 후 (3번 반복함) 변성 16.5% 아크릴아미드 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 전기영동 후 쿠마시 블루 염색 또는 웨스턴 블랏을 실시하였다. 상기 IB 라엠리 완충액은 Omomyc의 발현을 시각화시키기 위해 봉입체(inclusion bodies)의 가용화를 허용하고 적합한 이동 및 단백질 분리를 보장하기 위해 최적화시켰다.
실시예 2
Omomyc b- HLH - LZ 의 정제
세포 펠렛을 펠렛 그램 당 3 mL의 용해 완충액에 볼텍싱으로 현탁시켰다. 배양 펠렛의 그램 당 150 μL의 트리톤 용액을 첨가하였다. 상기 현탁액의 점도는 얼음 하에서 초음파 균질기를 이용하여 6 x 15초 동안 파워 15에서 초음파 처리에 의해 감소시켰다.
이후, 배양물 펠렛의 그램 당 100 μL의 소 췌장 DNase I 동등물을 처리한 후 50 rpm에서 교반과 함께 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 시료를 4℃에서 12,000 xg (Sorvall RC 5B Plus 내 SS34 로터에서 13,000 rpm, 35 mL 원심분리 병을 이용)로 20분 동안 원심분리하여 봉입체 뿐 아니라 세포벽, 리보좀 및 비-분해된 게놈 DNA 같은 고분자량 복합체를 펠렛팅시켰다. 지질, 용해된 단백질, 아미노산, 당 및 핵산은 원심분리 후 버려졌던 상층액을 구성한다.
상기 펠렛팅된 봉입체는 15 mL의 불 크래커 완충액 파트 A(Bull cracker buffer part A)에 볼텍싱으로 가용화시켰다. 이러한 산성, 높은 이온 강도 및 변성 완충액은 상기 봉입체로부터 Omomyc 컨스트럭트의 완전한 가용화를 가능하게 하고 원심분리에 의한 고분자량 복합체 및 잔류 DNA의 제거를 가능하게 한다.
상기 봉입체 용액은 불 크래커 파트 B와 1:1로 희석시켰다. 그 이후, 시료는 4℃에서 30,000 xg (Sorvall RC 5B Plus 내 SS34 로터에서 19,000 rpm)로 30분 동안 원심분리시켰다.
상층액은 FPLC 시스템 상에 시리즈로 마운팅된 5 mL의 5, 양이온성 교환 컬럼 (GE Healthcare로부터 얻을 수 있는 HiTrap™ SP 세파로오스 HP 컬럼 또는 이와 동등물)의 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 먼저, 컬럼은 FPLC 완충액 B의 두 배의 컬럼 부피 (CV)로 5 mL/분의 흐름 속도로 세척하였다. 이후, 상기 컬럼은 5 CV (125 mL)의 FPLC 완충액 A로 2.5 mL/분의 흐름 속도로 평형화시켰다. 상기 상층액 (로드(load) 당 최대 9 g의 배양물 펠렛과 동등한)을 2.5 mL/분으로 로딩하였다. 상기 상층액의 로딩 후 바로, 컬럼을 75 mL (3 CV)의 U8 완충액으로 2.5 mL/분의 흐름 속도로 세척하였다. 1 CV의 완충액 A로 세척하였다. 이후, 3 CV의 10% 완충액 B를 컬럼에 첨가하였다. Omomyc 용출은 2.5 mL 분획들에서 2.5 mL/분으로 50 mL (0.5%/mL)의 10-35%의 완충액 B의 구배로 실시하였다. 이러한 조건들에서, Omomyc은 ~1.5 M NaCl (즉, ~30% v/v의 구배)에서 90%의 순도로 용출시켰다.
순수한 컨스트럭트를 포함하는 분획들을 풀링하고 GE Healthcare로부터 구매한 탈염 TFA 완충액으로 평형화된 5개의 연속적인 HiTrap™ 탈염 컬럼 (또는 이와 동등물)에서 3.0 mL/분의 흐름 속도로 탈염시켰다. 상기 풀링된 분획들을 주입하고 (주입 당 7.5 mL의 최대 용량) 용출은 OD280 검출기로 실시하였다. 상기 단백질은 주입 후 첫 15 mL 내에 용출되었다. 낮은 OD280 값 및 높은 전도성을 나타내는 다음의 분획들은 버려졌다. 이러한 방법은 98-99% 탈염된 단백질의 ~95% 회수를 가능하게 하였다.
상기 정제된 단백질은 Amicon®Ultra 원심분리 필터 Ultracel®-3K (Millipore™) 또는 동등물에서의 원심분리, 또는 동결건조 중 어느 하나에 의해 농축시킬 수 있다. Amicon®Ultra를 이용한 농축에 있어서, 제조자의 지시에 따랐다. 택일적으로, 동결건조에 있어서, 상기 탈염된 분획들에 50% v/v 아세토니트릴을 첨가하며, 액체 질소에 동결시킨 후 동결건조시켰다. 상기 얻어진 거품 같은 동결건조된 단백질을 측량하고 0.05% v/v TFA를 포함하는 50% v/v 아세토니트릴에서 100 μl/mg으로 재가용화시킨 후 에펜도르프 당 1 내지 10 mg으로 분취여 다시 동결건조시킬 수 있다. 수율은 풍부 배지에서 25 mg/L 배양에 최소 M9 배지에서 15 mg/L 배양에 이른다.
실시예 3
A549 세포 내로의 Omomyc 의 트랜스덕션
본 발명의 저자들은 Omomyc으로 처리된 세포들이 그러한 짧은 시간 후에도 Omomyc이 이미 핵에 도달했다는 것을 보이는 것을 증명하고자 하였다.
Omomyc의 발현 및 정제는 실시예 1 및 실시예 2에서 보여지는 대로 실시하였다.
A549 세포 (ATCC)는 5% CO2를 포함하는 습도조절된 분위기 하에서 37℃로 10% 소태아혈청이 보충된 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 유지하였다. 형광 현미경을 위해, 20.000개의 A549 세포가 0.5 인치 유리 커버 슬립에 분주되고 16시간 동안 배양되었다. Omomyc 펩타이드 (35 μM)가 보충된 신선한 배지를 첨가하고 2시간 동안 37℃로 배양시켰다. 세포들을 PBS로 3번에 걸쳐서 세척하고 3% 파라포름알데히드에 고정시킨 후 현미경 하에서 관찰하였다.
도 1은 Omomyc이 세포막을 가로질러 핵으로 이동시키는 단백질 이동 도메인으로서 기능할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
Omomyc 은 살아있는 A549 세포의 수를 감소시키고 아팝토시스를 유도한다
A549 세포를 24-웰 플레이트에서 10 μM Max* 또는 Omomyc과 함께 72시간의 기간 동안 배양하였다. Max*는 Montagne M. 등 (Montagne M. 등 2012. PLoS One, 7(2):e32172)에 기재된 대로 얻었다. 세포들을 수거하여 제조자의 프로토콜 (Tali® Apoptosis Kit A10788, Life technologies)에 따라 아넥신 V 및 PI로 염색하고 Tali® 이미지-기반된 세포계산기(cytometer)를 이용하여 형광을 정량하였다.
이러한 연구에서 본 발명의 저자들은 Omomyc이 Max의 bHLHZ 도메인보다 살아있는 A549 세포의 수를 감소시키는 데 더 효과적이라는 것을 보인다 (도 2 A 및 C). 일관되게, 죽거나/아팝토틱 세포의 백분율이 Max* 펩타이드의 처리보다 Omomyc 펩타이드의 처리 하에서 더 높다 (도 2 B 및 D).
실시예 5
Omomyc 은 c- Myc * 보다 더 폴딩되고 용액에서 Max * 및 c- Myc * 모두보다 더 열적으로 안정적이다
열적으로 안정적인 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 약제학적 조성물로서 제형화되어야만 하는 환경에서 유리하다. 그러므로, Omomyc 및 Max*의 비교적 열적 안정성을 결정하였다.
Omomyc 유전자는 실시예 1에 기재된 대로 발현하였으며 상기 실시예 2에서처럼 정제하였다. Max*의 정제는 Beaulieu M.E. 등, 2013 (Methods Mol Biol, 1012:7-20)에 상세하게 기재된 대로 실시하였다. 간략하게는, BL21-DE3-pLys 박테리아에 Max* 인서트를 포함하는 pET-3a 발현 벡터로 형질전화시킨 후 상기 기재된 대로 배양시켰다. IPTG (0.6 mM)로 4시간 동안 유도시킨 후, 세포를 수득하였다. 용해 완충액으로 용해하고 30 000 x g에서 원심분리한 후, 상기 가용화된 단백질 추출물을 양이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하고 상기 기재된 대로 탈염시켰다. 상기 정제되고 동결건조된 단백질들을 50 mM KH2PO4, 50 mMKCl, 5 mM DTT (pH는 1N KOH 또는 1N HCl을 이용하여 적정하였음)에 재현탁시켰다.
원편광 이색성(circular dichroism) 측정은, 32 μM의 단백질 농도를 이용하여 Beaulieu M.E. 등, 2012 (J MolRecognit, 25(7):414-26)에 기재된 대로 실시하였다. CD 스펙트럼은 20℃에서 기록하였고 열적 변성은 1℃/분으로 실시하였으며 (도 3A 및 3B), 222 nm의 파장에서 모니터링하여 상기 단백질의 나선함량(helical content) (폴딩되거나, 포화된 상태를 반영함)을 측정하였다.
실시예 6
Omomyc 은 Max * 보다 더 효율적으로 세포의 핵으로 침투한다
간략하게는, 상기 정제된 Omomyc 및 Max* 펩타이드는 조작된 C-말단 시스테인 잔기를 통해 플루오레세인-말레이미드 (FITC)로 표지하였다. 질량분석법에 의해 단백질 분자 당 단일 형광 표지의 존재의 정제 및 평가 후, 다른 농도의 단백질 (5 μM, 10 μM 또는 25 μM)을 0.5% 혈청을 포함하는 RPMI에서 배양된 A549 세포에 첨가하고 PBS로 3번에 걸쳐서 세척하기 전에 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며 10분 동안 4% PFA에서 고정시키고, 10분 동안 1.5 μg/mL의 Hoechst로 염색한 후, 현미경 슬라이드에 마운팅하였다. 공초점 현미경 이미지들은 Omomyc이 5, 10 및 25 μM의 농도에서 Max* 보다 더 효율적으로 A549 세포의 핵으로 침투한다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 핵 형광 강도는 이미지 당 카운팅된 30 내지 80개의 세포에서 ImageJ를 이용하여 정량하였다. 고정된 A549 세포에서 Omomyc 및 Max*에 대해 관찰된 세포 투과의 정량은 도 4에서 보여진다.
Max*보다 Omomyc의 우수한 세포 투과 능력은 20분의 반응 후 살아있는 세포 (고정의 잠재적인 잘못된 결과(artifacts)를 피하기 위해)로 20 μM의 농도에서 확인되었다. 간략하게는, FITC-표지된 Omomyc 및 Max*를 0.5% 혈청을 포함하는 RPMI 내 A549 배양 세포에 첨가하고 PBS에서 3번에 걸쳐서 세척하고 Hoechst-포함 마운팅 배지로 마운팅하기 전에 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 공초점 현미경 이미지들은 Omomyc이 25 μM의 농도에서 Max*보다 더 효율적으로 살아있는 A549 세포의 핵으로 침투한다는 것을 보여줬다 (데이터를 보이지 않음). 핵 형광 강도는 이미지 당 카운팅된 30 내지 80개의 세포에서 ImageJ를 이용하여 정량하였다. 살아있는 A549 세포에서 Omomyc 및 Max*에 대해 관찰된 세포 투과의 정량은 도 5에서 보여진다.
실시예 7
Omomyc 진입은 ATP -의존적 과정을 통해 일어난다
Max*는 ATP-의존적 과정을 통해 세포를 투과하는 것으로 알려졌는데, 이는 4℃의 온도로 낮춤으로써 차단할 수 있다. 유사한 기작이 Omomyc의 세포 투과 능력에 포함되어 있다. A549 세포를 20 μM FITC-표지된 펩타이드와 4℃에서 2시간 동안 반응시켰으며 PBS에서 3번에 걸쳐서 세척하고 Hoechst-포함 마운팅 배지로 현미경 슬라이드 위에 마운팅하기 전에 4% PFA로 고정시켰다. 공초점 현미경 이미지들은 Omomyc 진입(entry)이 4℃의 온도로 낮춤으로써 차단될 수 있음을 보였다.
실시예 8
Omomyc 은 Max * 보다 더 효율적으로 총 세포의 수를 감소시킨다
간략하게는, A549 및 H1650 폐 선암종 세포를 5% 혈청을 포함하는 RPMI에서 25 μM Omomyc 또는 Max* 펩타이드와 반응시키고 지시된 시간 (2일 또는 4일)에 4% PFA로 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛 염색 (25% 메탄올 내 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 10분 동안 염색)을 실시하며 물로 최소 3번에 걸쳐서 세척하였다. Omomyc 또는 Max* 모두 세포 성장을 억제하지만, Omomyc이 억제에 더 효율적이다 (도 6). 크리스탈 바이올렛 염색된 세포를 10% 아세트산에 녹였고 결과적인 용액을 H2Odd에 1:4로 희석시켰으며 OD595에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 크리스탈 바이올렛에 의한 증식 억제의 정량은 6일 이상 25 μM 농도를 사용하는 경우 H1650 세포 (EGFR-돌연변이 폐 선암종 세포)의 증식을 감소시킴으로써 명확하게 Omomyc이 Max*보다 더 효율적이라는 것을 보였다 (도 7).
Omomyc 및 Max의 IC50을 계산하기 위해, A549 세포에 5% 혈청을 포함하는 배양 배지에 지시된 펩타이드 농도로 처리하고 상기 기재된 대로 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 정량은 상기 기재된 대로 실시하였다. 도 8은 Omomyc이 Max*보다 더 낮은 IC50을 가진다 (즉, Omomyc은 세포의 수를 반으로 감소시키기 위해 Max*와 비교하여 더 낮은 투여량을 필요로 한다)는 것을 보여주는 Max*와 대비하여 Omomyc에 대한 A549 세포의 투여량 반응을 보여준다. 구체적으로, Omomyc의 IC50은 1.2 μM이며 Max*의 IC50은 2.6 μM이다.
세포 증식 상에 있어서 Omomyc의 효과는 U87 신경교종 세포에서 어세이하였다. U87 신경교종 세포를 5% 혈청을 포함하는 DMEM에서 Omomyc 또는 Max* 펩타이드 (25 μM 최종 농도)와 48시간 동안 반응시켰다. 세포를 트립신 처리하고 Tali 세포 측정기 (Life technologies Inc.)를 이용하여 카운팅하였다. 도 9는 Omomyc이 Max*보다 더 효율적으로 U87 신경교종 세포의 증식을 감소시킨다는 것을 보여준다.
실시예 9
Omomyc 은 비강내 투여 후 폐 및 뇌 조직에 도달한다
동물에 37.5 mg/kg의 Omomyc 단일 투여량 또는 좌측 비처리된 (PBS로 처리됨) 투여량으로 비강내 투여하였다. 비강내 투여 10분 후 형광 펩타이드가 검출되었다. 상기 처리된 동물의 폐는 Omomyc 위치화의 결과로서 형광을 나타낸다 (도 10A). 이것은 상기 Omomyc 펩타이드가 비강내 적하에 의해 동물로 투여될 수 있으며 효과적으로 폐에 도달한다는 것을 증명한다. 이전 도면에 기재된 동일한 동물의 뇌도 형광을 나타낸다 (도 10B). 상기 형광성 Omomyc 펩타이드가 뇌-혈관장벽 (BBB)를 지나 뇌에 도달할 수 있다는 것이 명확하다.
실시예 10
Omomyc 펩타이드는 인 비보 치료 효과를 가진다
펩타이드로서 비강내 투여된 후, Omomy은 KRas-추동된(driven) 폐 선암종 마우스 모델에서 증식을 감소시킨다. 본 발명자들은 KRas 추동된 종양형성(tumorigenesis)의 마우스 모델 (LSLKRasG12D 모델)을 이용하였다. 간략하게는, 8주령 마우스를 AdenoCre 바이러스를 적하시켜 폐에 특이적으로 KRas-G12D 돌연변이 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 마우스가 폐 선암종 (감염 18주 후)을 발생시켰을 때, 상기 동물에 하루에 한 번씩 3일 동안 Omomyc 펩타이드를 비강내 처리 (35 μL 부피로 15 mg/kg)하였다. Omomyc은 종양의 증식 속도를 감소시켰으며 (Ki67 염색; 도 11A) 세포내 밀도를 감소시켰다 (도 11B)
상기 Omomyc 펩타이드는 처리 1주 후에 종양 크기(tumor burden)도 감소시킨다. 동일한 마우스 모델 및 이전에 기재된 실험 조건을 이용하여, 상기 동물에 하루에 한 번씩 3일 동안 15 mg/kg의 펩타이드를 처리하였다. % 종양 면적을 ImageJ로 측정하였다. 도 12는 Omomyc이 KRas-유래된 폐 선암종 마우스 모델에서 종양 크기를 감소시킨다는 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> FUNDACI?PRIVADA INSTITUT D'INVESTIGACI?ONCOL?ICA DE VALL HEBRON <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER <130> P9495PC00 <150> EP 13382167 <151> 2013-05-07 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OMOMYC <400> 1 Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys Leu 50 55 60 Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys His 65 70 75 80 Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala 85 90 <210> 2 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met 1 5 10 15 Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp 20 25 30 Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln 35 40 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Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu 260 265 270 Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro 275 280 285 Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys 290 295 300 Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His 305 310 315 320 Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala 325 330 335 Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser 340 345 350 Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn 355 360 365 Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu 370 375 380 Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu 385 390 395 400 Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala 405 410 415 Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 420 425 430 Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln 435 440 445 Leu Arg Asn Ser Cys Ala 450 <210> 3 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding OMOMYC <400> 3 accgaggaga atgtcaagag gcgaacacac aacgtcttgg agcgccagag gaggaacgag 60 ctaaaacgga gcttttttgc cctgcgtgac cagatcccgg agttggaaaa caatgaaaag 120 gcccccaagg tagttatcct taaaaaagcc acagcataca tcctgtccgt ccaagcagag 180 acgcaaaagc tcatttctga aatcgacttg ttgcggaaac aaaacgaaca gttgaaacac 240 aaacttgaac agctacggaa ctcttgtgcg taa 273 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence found in Drosophila antennapedia protein <400> 4 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence found in the herpesvirus simplex 1 (HSV-1) VP22 DNA-binding protein <400> 5 Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30 Val Glu <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Bac-7 <400> 6 Arg Arg Ile Arg Pro Arg Pro 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12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SynB1 <400> 12 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SynB3 <400> 13 Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 1 5 10 <210> 14 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of PTD-4 <400> 14 Pro Ile Arg Arg Arg Lys Lys Leu Arg Arg Leu Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of PTD-5 <400> 15 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of the FHV Coat (amino acids 35-49) <400> 16 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of BMV Gag (amino acids 7-25) <400> 17 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of HTLV-II Rex (amino acids 4-16) <400> 18 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of D-Tat <400> 19 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of R9-Tat <400> 20 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MAP <400> 21 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Leu 1 5 10 15 Ala <210> 22 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of SBP <400> 22 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of FBP <400> 23 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MPG <400> 24 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 25 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of MPG(ENLS) <400> 25 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Pep-1 <400> 26 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence of Pep-2 <400> 27 Lys Glu Thr Trp Phe Glu Thr Trp Phe Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 28 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 29 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Arg 1 5 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 30 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transportan peptide <400> 31 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 1 5 10 15 Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 32 Lys Ala Leu Ala Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala 1 5 10 15 Leu Ala Lys His Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Cys Glu 20 25 30 Ala <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 33 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 34 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 35 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 36 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 37 Thr His Arg Leu Pro Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP sequence <400> 38 Gly Gly Arg Arg Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of SV40 large T Antigen <400> 39 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of Nucleoplasmin <400> 40 Lys Arg Pro Ala Ala Ile Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of CBP80 <400> 41 Arg Arg Arg His Ser Asp Glu Asn Asp Gly Gly Gln Pro His Lys Arg 1 5 10 15 Arg Lys <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of HIV-I Rev protein <400> 42 Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Trp Glu 1 5 10 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence of HTLV-I Rex <400> 43 Met Pro Lys Thr Arg Arg Arg Pro Arg Arg Ser Gln Arg Lys Arg Pro 1 5 10 15 Pro Thr <210> 44 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS of hnRNP A <400> 44 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Lys Pro Arg 20 25 30 Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 45 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS of rpL23a <400> 45 Val His Ser His Lys Lys Lys Lys Ile Arg Thr Ser Pro Thr Phe Thr 1 5 10 15 Thr Pro Lys Thr Leu Arg Leu Arg Arg Gln Pro Lys Tyr Pro Arg Lys 20 25 30 Ser Ala Pro Arg Arg Asn Lys Leu Asp His Tyr 35 40 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> /replace="R or K" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> /replace="R or K" <400> 46 Lys Xaa Xaa Xaa 1 <210> 47 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OMOMYC TAT <400> 47 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Gly Arg Lys Lys Arg 85 90 95 Arg Gln Arg Arg Arg 100 <210> 48 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OMOMYC LZArg <400> 48 Met Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln 20 25 30 Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Thr Gln Lys 50 55 60 Leu Ile Ser Glu Ile Asp Leu Leu Arg Lys Gln Asn Glu Gln Leu Lys 65 70 75 80 His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Asn Ser Cys Ala Arg Arg Arg Arg Arg 85 90 95 Arg Leu Arg <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M2 domain <400> 49 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe 1 5 10 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 peptide <400> 50 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 51 Gly Pro Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag <400> 52 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep tag <400> 53 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 54 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 55 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 tag <400> 55 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide tag <400> 56 Ala His Gly His Arg Pro 1 5 <210> 57 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 57 Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser Gly Met 1 5 10 15 Thr Cys Xaa Xaa Cys 20

Claims (25)

  1. a) 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는
    b) 서열번호 1에 대해 90%를 초과하는 동일성의 정도를 갖고, 세포막 및 핵막을 가로질러 이동할 수 있는, 이의 기능적으로 동등한 변이체
    를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 정맥내(endovenous) 경로 또는 비강내 경로로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 암은 폐암, 유방암 또는 뇌암인 약제학적 조성물.
  4. (i) a) 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는
    b) 서열번호 1에 대해 90%를 초과하는 동일성의 정도를 갖고, 세포막 및 핵막을 가로질러 이동할 수 있는, 이의 기능적으로 동등한 변이체, 및
    (ii) 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포내 흡수를 용이하게 하는 화학적 모이어티
    를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 세포내 흡수를 용이하게 하는 상기 화학적 모이어티는 세포 투과 펩타이드이고 상기 세포 투과 펩타이드와 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체는 융합 단백질을 형성하는 것인 컨쥬게이트.
  6. 제5항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 7)인 것인 컨쥬게이트.
  7. 제5항에 있어서, 상기 세포-투과 펩타이드 서열은 GRKKRRQRRR (서열번호 28) 및 RRRRRRLR (서열번호 29)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  8. 제4항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 추가 핵-위치화 시그널을 추가적으로 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 추가 핵 위치화 시그널은 PKKKRKV (서열번호 39), PAAKRVKLD (서열번호 50) 및 KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호 40)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  10. 제4항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 컨쥬게이트의 약제학적으로 활성 있는 양 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 나노입자의 일부를 형성하는 것인 약제학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 암은 폐암, 유방암 또는 뇌암인 것인 약제학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서 약제학적 조성물은 정맥내 경로 또는 비강내 경로로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  16. (i) a) 서열번호 1의 폴리펩타이드,
    b) 서열번호 1에 대해 90%를 초과하는 동일성의 정도를 갖고, 세포막 및 핵막을 가로질러 이동할 수 있는, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는
    c) 제4항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 컨쥬게이트 및
    (ii) 항종양제
    를 함께 또는 개별적으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항종양제는 세포독성제, 항혈관형성제 및 항전이 제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 항종양제는 탁세인, 백금 기반된 화합물, 안트라사이클린 항생제 및 DNA-알킬화 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 항종양제는 파클리탁셀, 시스플라틴, 독소루비신 및 테모졸로미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 항종양제는 파클리탁셀인 것인 조성물.
  21. 제16항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 서열번호 47 및 서열번호 48로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  22. 제16항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 조성물.
  23. 제16항에 있어서, 암은 폐암, 유방암 또는 뇌암인 것인 조성물.
  24. 제16항에 있어서, 약제학적 조성물은 정맥내 경로 또는 비강내 경로로 투여되는 것인 조성물.
  25. 제16항에 있어서, 서열번호 1의 폴리펩타이드, 이의 기능적으로 동등한 변이체 또는 컨쥬게이트가 투여되는 것인 조성물.
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